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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein therapeutische Verfahren,
die das chirurgische oder intravenöse Einführen von Bindungspartnern umfassen,
die auf bestimmte Ziel- bzw. Ziel-Zellpopulationen gerichtet sind,
wie etwa glatte Muskelzellen, Krebszellen, somatische Zellen, die
eine Regulierung bzw. Modulation zur Linderung eines Erkrankungszustands
erfordern, sowie Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere zur
Behandlung von Zuständen,
wie etwa Stenose infolge einer Gefäßverletzung oder -erkrankung,
Krebs, Erkrankungen, die von Hyperaktivität oder Hyperplasie somatischer
Zellen herrühren,
sowie Erkrankungen, die durch Immunsystem-Effektorzellen vermittelt
werden. Auch beschrieben wird das chirurgische oder intravenöse Einführen von
Mitteln, die in der Lage sind, die Proliferation oder Migration
oder Konzentration von Proteinen glatter Muskelzellen zu verändern. Die
Erfindung betrifft auch die gerichtete oder die gezielte Verabreichung
therapeutischer Mittel an Zellen vaskulärer glatter Muskulatur, was
zu einer Dilatation bzw. Ausweitung und Fixierung des Gefäßlumens
führt (biologischer
Stentingeffekt). Die kombinierte Verabreichung eines zytoziden bzw.
zellabtötenden
Konjugats und einer Retard-Dosierungsform eines Inhibitors vaskulärer glatter
Muskelzellen ist ebenfalls offenbart.
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Hintergrund
der Erfindung
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Perkutane
transluminale Coronarangioplastie (PTCA) wird häufig als primäre Behandlungsmodalität bei vielen
Patienten mit einer koronaren Herzerkrankung verwendet. PTCA kann
myokardiale Ischämie
bei Patienten mit einer Coronararterienerkrankung lindern, indem
sie die Lumenobstruktion vermindert und den koronaren Durchfluss
verbessert. Die Verwendung dieses chirurgischen Verfahrens ist schnell
gestiegen, mit 39.000 Verfahren, die 1983 durchgeführt wurden,
nahezu 150.000 in 1987, 200.000 in 1988, 250.000 in 1989 und für 1994 werden über 500.000
PTCAs pro Jahr geschätzt
(1, 2, 3). Stenose nach PTCA bleibt ein signifikantes Problem, wobei
von 25% bis 35% der Patienten innerhalb 1 bis 3 Monaten eine Restenose
entwicken. Restenose führt
zu signifikanter Morbidität
und Mortalität
und erfordert häufig
weitere Eingriffe, wie etwa eine wiederholte Angioplastie oder eine
Herzkranzbypassoperation. Keine chirurgischer Eingriff und keine
postoperative Behandlung hat sich (bis dato) als wirksam erwiesen,
Restenose zu verhindern.
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Die
Prozesse, die für
die Stenose nach einer PCTA verantwortlich sind, sind nicht vollständig verstanden,
könnten
jedoch aus einer komplizierten Wechselwirkung zwischen mehreren
unterschiedlichen biologischen Mitteln und (Stoffwechsel-) Wegen
herrühren.
In histologischen Schnitten betrachtet können restenotische Läsionen ein übermäßiges Wachstum
glatter Muskelzellen in den intimalen Lagen des Gefäßes aufweisen
(3). Mehrere mögliche
Mechanismen für
die glatte Muskelzellproliferation nach PTCA wurden vorgeschlagen
(1, 2, 4, 5).
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Verbindungen,
die Berichten zufolge Proliferation glatter Muskelzellen in vitro
unterdrücken
(4, 6, 7), haben ungewünschte
pharmakologische Nebenwirkungen, wenn man sie in vivo verwendet.
Heparin ist ein Beispiel einer solchen Verbindung, die Berichten
zufolge die Proliferation glatter Muskelzellen an vitro hemmt, aber,
wenn sie in vivo angewandt wird, die potenziell schädliche Nebenwirkung
hat, Blutgerinnung zu inhibieren. Während Heparinpeptide eine reduzierte
antikoagulante Aktivität
aufweisen, besitzen sie die unerwünschte pharmakologische Eigenschaft
einer kurzen pharmakologischen Halbwertszeit. Es sind Versuche unternommen
worden, solche Probleme zu lösen,
indem ein Doppelballonkatheter verwendet wurde, d.h. zur örtlichen Verabreichung
des therapeutischen Mittels am Ort der Angioplastie (z.B. 8; U.S.-Patent
4,824,436), und durch Verwenden bioabbaubarer Materialien, die mit
einem Medikament imprägniert
sind, d.h. um Probleme der kurzen Halbwertzeit zu kompensieren (z.B.
9; U.S. Patent 4,929,602).
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Verrucarine
und Roridine sind Trichothecen-Medikamente, die als sekundäre Metabolite
durch den Bodenpilz Myrothecium verrucaria und Myrothecium roridium
erzeugt werden. Verrucarin ist ein makrozyklischer Triester. Roridin
ist ein makrozyklischer Diester von Verrucarol (10). Als Gruppe
sind Trichothecene strukturell sesquiterpenoiden Mycotoxinen verwandt,
die von verschiedenen Pilzarten erzeugt werden und durch die 12,13-Epoxytrichothec-9-en-Grundstruktur gekennzeichnet
sind. Ihre zytotoxische Aktivität
bezogen auf eukaryontische Zellen ist eng mit ihrer Fähigkeit
verbunden, an die Zelle zu binden, aufgenommen zu werden und die
Protein- und Makromolekülsynthese
in der Zelle zu inhibieren.
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Mindestens
fünf Gesichtspunkte
würden
auf den ersten Blick die Verwendung inhibitorischer Medikamente
auszuschließen
scheinen, um eine Stenose zu verhindern, die aus übermäßigem Wachstum
glatter Muskelzellen resultiert. Erstens können inhibitorische Mittel
eine systemische Toxizität
aufweisen, die inakzeptables Risikopotential für Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen
erzeugen könnte.
Zweitens könnten
inhibitorischen Mittel die vaskuläre Wundheilung nach der Operation
stören,
und dies könnte
entweder die Heilung verzögern
oder die Struktur oder Elastizität
der neu verheilten Gefäßwand schwächen. Drittens
könnten inhibitorische
Mittel, die glatte Muskelzellen töten, umgebendes Endothel und/oder
andere mediale glatte Muskelzellen schädigen. Tote und sterbende Zellen
schütten
auch mitogene Mittel aus, die eine zusätzliche Proliferation glatter
Muskelzellen stimulieren und die Stenose verschlimmern könnten. Viertens
könnte
die Verabreichung therapeutisch wirksamer Mengen eines inhibitorischen
Mittels von mehreren Punkten her problematisch sein: nämlich a)
die Verabreichung einer großen
Anzahl an Molekülen
in die Intrazellularräume
zwischen den glatten Muskelzellen könnte notwendig sein, d.h. um
günstige
Bedin gungen zu schaffen, um es einer therapeutisch wirksamen Dosis
von Molekülen
zu ermöglichen,
die Zellmembran zu durchdringen; b) das Steuern eines inhibitorischen
Arzneimittels in den richtigen Intrazellulärraum, d.h. dorthin, wo dessen
Wirkung ausgeübt
wird, könnte
schwierig zu kontrollieren sein; und c) die Optimierung der Verbindung
des inhibitorischen Arzneimittels mit dessen intrazellulärem Ziel
bzw. Target, z.B. einem Ribosom, während eine intrazellulare Umverteilung
der Arznei in z.B. benachbarte Zellen minimiert wird, könnte schwierig
sein. Da fünftens
die Proliferation glatter Muskelzellen über mehrere Wochen stattfindet,
scheint es von vornherein notwendig, die inhibitorischen Medikamente über mehrere
Wochen hinweg verabreicht werden sollten, vielleicht fortwährend, um
eine günstige
Wirkung zu erzielen.
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Wie
aus dem Vorhergehenden ersichtlich bleiben bei der Verwendung inhibitorischer
Medikamente, einschließlich
zytotoxischer Mittel, um Proliferation glatter Muskulatur wirksam
zu behandeln, viele Probleme zu lösen. Es wäre sehr vorteilhaft, neue Methoden
zu entwickeln, um Stenose aufgrund von Proliferation glatter vaskulärer Muskelzellen
nach einer traumatischen Gefäßverletzung
zu unterbinden, wie sie etwa während
einer Gefäßoperation
stattfinden. Zudem wäre
die Verabreichung von Verbindungen, die inhibitorische Wirkung mit
längerer
Dauer bei vaskulären
glatten Muskelzellen hervorruft, vorteilhaft. Eine örtliche
Verabreichung solcher Retard-Verbindungen wäre auch bei der Behandlung
anderer Zustände
nützlich,
bei denen die Zielzellpopulation für diese Verabreichung zugänglich ist.
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Ein
Aspekt der Erfindung umfasst einen bevorzugt metallischen, Kunststoff- oder bioabbaubaren
intravaskulären
Stent, der eine Retard-Dosierungsform umfassend eine zytostatische
Menge eines therapeutischen Mittels umfasst, wie in Anspruch 1 definiert.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform
der Erfindung ist ein Stent, der ein therapeutisches Mittel umfasst,
wie es in Anspruch 8 definiert ist.
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Die
Stents können
eine bioabbaubare Beschichtung oder eine poröse oder permeable, nicht-bioabbaubare
Beschichtung aufweisen. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist
ein Stent, der eine bioabbaubare Beschichtung oder eine poröse/permeable
nicht-bioabbaubare Beschichtung aufweist, die das therapeutische
Mittel umfasst. Eine weiter bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist
ein Stent, der eine bioabbaubare Beschichtung oder eine poröse oder
nicht-bioabbaubare Beschichtung umfasst, die eine Retard-Dosierungsform
des therapeutischen Mittels umfasst.
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In
einer alternativen Ausführungsform
kann ein Stent, z.B. ein bioabbaubarer Stent, d.h. die Stentmatrix,
mit dem therapeutischen Mittel imprägniert sein. Ebenfalls wird
die Verwendung eines bioabbaubaren Stents, der mit dem therapeutischen
Mittel imprägniert
ist, und der ferner mit einer bioabbaubaren Beschichtung oder einer
porösen
oder permeablen nicht-bioabbaubaren Beschichtung beschichtet ist,
welche eine Retard-Dosierungsform eines therapeutischen Mittels
umfasst, vorgeschlagen. Diese Ausführungsform der Erfindung kann
unterschiedliche Ausschüttungsraten
des therapeutischen Mittels bereitstellen, d.h. es gäbe eine schnellere
Ausschüttung
des therapeutischen Mittels aus der Beschichtung, gefolgt von einer
verzögerten Ausschüttung des
therapeutischen Mittels, mit dem die Stentmatrix imprägniert ist,
auf den Abbau der Stentmatrix hin.
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Der
intravaskuläre
Stent stellt ein mechanisches Mittel für eine Erhöhung des Lumeninhalts eines
Gefäßes bereit,
zusätzlich
zur biologischen Stentingwirkung des in Anspruch 1 definierten therapeutischen
Mittels.
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Die
erfindungsgemäßen Dosierungsformen
sind bevorzugt entweder nicht abbaubare Mikropartikel oder Nanopartikel
oder bioabbaubare Mikropartikel oder Nanopartikel. Bevorzugter sind
die Mikropartikel oder Nanopartikel aus einem Polymer gebildet,
das eine Matrix enthält,
die durch zufällige,
nicht-enzymatische oder hydrolytische Spaltung biologisch abgebaut
wird. Eine besonders bevorzugte Struktur ist aus einem Gemisch thermoplastischer
Polyester gebildet (z.B. Polylactid oder Polyglycolid) oder einem
Copolymer aus Lactid- und Glycolid- Komponenten. Die Lactid-/Glycolid-
Struktur besitzt den zusätzlichen
Vorteil, dass deren Abbau Milchsäure
und Glycolsäure
bildet, beides normale metabolische Produkte von Säugern.
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Bevorzugte
therapeutische Mittel, die innerhalb der Mikropartikel oder Nanopartikel
dispergiert sind, sind jene, die eine Inhibierung einer therapeutisch
wesentlichen Zielzellaktivität
aufweisen, ohne die Zielzelle zu töten, oder ohne Zielzelltötungsaktivität. Für die Behandlung
von Restenose vaskulärer
glatter Muskelzellen inhibieren nützliche therapeutische Mittel
Zielzellaktivität
(z.B. Proliferation oder Migration) ohne die Zielzellen zu töten. Bevorzugte
therapeutische Gruppierungen für
diesen Zweck sind Proteinkinaseinhibitoren (z.B. Staurosporin oder ähnliche),
Inhibitoren der Migration und/oder Kontraktion von glatten Muskeln
(z.B. Cytochalasine, wie Cytochalasin B, Cytochalasin C, Cytochalasin
D oder ähnliche),
Suramin, und Stickoxid-freisetzende Verbindungen wie Nitroglycerin,
oder deren Analoga oder funktionelle Äquivalente. Bei der Krebstherapie
inhibieren nützliche
therapeutische Mittel die Proliferation oder sie sind für die Zielzellen
zytotoxisch. Bevorzugte therapeutische Gruppierungen für diesen
Zweck sind Roridin A und Pseudomonas Exotoxin, oder deren Analoga
oder funktionelle Äquivalente.
Für die
Behandlung von Erkrankungen, die vom Immunsystem beeinflusst werden,
wie Arthritis, transportieren nützliche
therapeutische Mittel zytostatische, zytozide oder Metabolismus-modulierende
therapeutische Mittel zu Zielzellen, die durch lokale Verabreichung
der Dosierungsform zugänglich
sind. Bevorzugte therapeutische Gruppierungen für diesen Zweck sind Roridin
A, Pseudomonas Exotoxin, Suramin und Proteinkinaseinhibitoren (z.B.
Staurosporin), Sphingosin, oder deren Analoga und funktionelle Äquivalente.
Für die
Behandlung von pathologisch-proliferierenden normalen Geweben (z.B.
proliferative Vitreoretinopathie, Pannus corneae und ähnlichen)
sind antiproliferative Mittel oder Antimigrationsmittel bevorzugt
(z.B. Cytochalasine, Taxol, Somatostatin, Somatostatinanaloga, N-Ethylmaleimid,
Antisense-Oligonukleotide und ähnli che).
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Die
erfindungsgemäßen Dosierungsformen
werden mittels eines Bindungsproteins oder -peptids gezielt auf
eine relevante Zielzellpopulation ausgerichtet. Bevorzugte Bindungsproteine/-peptide
der vorliegenden Erfindung sind Bindungsprotein für vaskuläre glatte
Muskelzellen, Tumorzellbindeprotein und Bindeprotein für Immunsystemeffektorzellen.
Bevorzugte Bindungsproteine für
vaskuläre
glatte Muskelzellen verbinden sich spezifisch mit Chondroitinsulfatproteoglykan
(CSPG), welches auf den Membranen von vaskulären glatten Muskelzellen exprimiert
wird, und in einer bevorzugten Ausführungsform besitzt dieses CSPG
ein Molekulargewicht von ungefähr
250 Kilodalton. In bevorzugten Ausführungsformen bindet das Bindeprotein
für vaskuläre glatte
Muskelzellen an ein CSPG-Target
auf der Zelloberfläche
mit einer Bindungskonstante von mindestens 10–4 M.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen
enthält
das Bindeprotein für
vaskuläre
glatte Muskelzellen eine Sequenz von Aminosäuren, die sich in der Fab,
Fv oder CDR ("complementarity
determining regions") von
monoklonalem Antikörper
NR-AN-01 oder dessen funktionellen Äquivalenten finden. Andere
bevorzugte Bindungspeptide, die in dieser Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung nützlich
sind, umfassen jene, die sich im interzellulären Stroma und der Matrix,
welche zwischen vaskulären
glatten Muskelzellen liegen, befinden. Bevorzugte Bindungspeptide
von diesem Typ sind spezifisch mit Kollagen, Retikulumfasern oder
anderen interzellulären
Matrixverbindungen assoziiert. Bevorzugte Tumorzellbindungsproteine
sind mit Oberflächenzellmarkern
assoziiert, die von der Ziel-Tumorzell-Population exprimiert werden,
oder deren zytoplasmatische Epitope. Bevorzugte Bindungsproteine
für vom
Immunsystem modulierte Zielzellen sind mit Zelloberflächenmarkern
der Zielimmunsystemeffektorzellen oder deren zytoplasmatischen Epitopen
assoziiert. Bindungspeptide/-proteine der vorliegenden Erfindung
zielen auch auf pathologisch-proliferierende normale Gewebe ab.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Stents bereit, welche die Verabreichung
von freiem (d.h. nicht-zielgerichtetem oder nicht an einen Bindungspartner
assoziiertem) therapeutischem Mittel an Zielzellen umfasst. Bevorzugt
sind die Zielzellen vaskuläre
Zellen glatter Muskulatur und das therapeutische Mittel ist ein Inhibitor
vaskulärer
glatter Muskelzellkontraktion, was es dem normalen hydrostatischen
Druck erlaubt, das Gefäßlumen zu
dilatieren. Solch eine Kontraktionsinhibition kann durch Actininhibition
erreicht werden, welche bevorzugt durch durch einen geringeren Dosisspiegel
erreichbar und aufrechtzuerhalten ist, als für die Inhibierung der Proteinsynthese
notwendig. Dementsprechend synthetisieren die vaskulären glatten
Muskelzellen Protein, welches notwendig ist, um geringe Zelltraumata
zu reparieren und interstitielle Matrix zu sezernieren, wobei die
Fixierung des Gefäßlumens
in einem dilatierten Zustand nahe dem maximalen systolischen Durchmesser
erleichtert wird. Dieses Phänomen
stellt einen biologischen Stentingeffekt dar, der den unerwünschten Recoil-Mechanismus
vermindert oder verhindert, welcher in bis zu 25% der Angioplastieverfahren
auftritt, welche basierend auf einem anfänglichen Angiogramm nach dem
Eingriff als erfolgreich eingestuft werden. Cytochalasine (welche
die Polymerisation von G- zu F-Actin inhibieren, was umgekehrt die
Migration und Kontraktion vaskulärer
glatter Muskelzellen inhibiert) sind die bevorzugten therapeutischen
Mittel zur Verwendung in dieser Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung. Protokolle mit freiem therapeutischem Mittel von diesem Typ
bewirken eine Verminderung, eine Verzögerung oder die Beseitigung
von Stenose nach Angioplastie oder anderen gefäßchirurgischen Verfahren. Bevorzugt
wird freies therapeutisches Mittel direkt oder im Wesentlichen direkt
an vaskuläres
Gewebe glatter Muskulatur verabreicht. Solch eine Verabreichung
wird bevorzugt durch einen Infusionskatheter vorgenommen, um eine
10–3 M
bis 10–12 M
Konzentration des therapeutischen Mittels am Verabreichungsort in
einem Blutgefäß zu erreichen.
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Beschreibung
der Figuren
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1 ist
eine mikrokopische Fotografie vaskulärer glatter Muskelzellen in einer
Arterie eines 24jährigen
männlichen
Patienten mit Bindungsprotein für
vaskulären
glatten Muskel, das an Zelloberfläche und Membran gebunden ist.
Der Patient erhielt das Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel durch Verabreichungn
i.v. 4 Tage bevor das arterielle Gewebe für die Histologie präpariert
wurde.
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1B ist eine mikrokopische Fotografie von Zellen
vaskulärer
glatter Muskulatur in einer Arterie eines 24jährigen männlichen Patienten mit einem
Bindungsprotein für
vaskulären
glatten Muskel, das an Zelloberfläche und Membran gebunden ist.
Der Schnitt wurde ex vivo mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG zur
Reaktion gebracht. Diese Reaktion wurde durch Zugabe von 4-Chlor-1-naphthol
sichtbar gemacht. Das Reaktionsprodukt des Substrats bildet ein
unlösliches
violettes oder dunkelbraunes Präzipitat
am Reaktionsort (bei #2 gezeigt). Eine Gegenfärbung wurde vorgenommen, um
Zellkerne sichtbar zu machen (bei # 1 gezeigt).
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2 zeigt
ein erstes Schema für
die chemische Kopplung eines therapeutischen Mittels mit einem Bindungsprotein
für vaskulären glatten
Muskel.
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3 zeigt
ein zweites Schema für
die chemische Kopplung eines therapeutischen Mittels mit einem Bindungsprotein
für vaskulären glatten
Muskel.
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4A zeigt graphisch experimentelle Daten, die schnelle
Bindung von Bindungsprotein für
vaskulären
glatten Muskel an Marker-positive Testzellen in vitro zeigen.
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4B zeigt graphisch experimentelle Daten, die schnelle
Bindung von Bindungsprotein für
vaskulären
glatten Muskel an vaskuläre
glatte Muskelzellen in vitro zeigen.
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5A stellt graphisch experimentelle Daten dar,
die die unerwünschte Zytotoxizität schon
geringer Spiegel eines therapeutischen Konjugats (d.h. RA-NR-AN-01) sowie des
freien RA therapeutischen Mittels zeigen, wenn vaskuläre glatte
Muskelzellen für
24 Stunden in vitro behandelt wurden.
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5B stellt graphisch experimentelle Daten dar,
die die Wirkungen von RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat auf die
metabolische Aktivität
von Merker-positiven und -negativen Zellen zeigen. Die Daten zeigen
die unerwünschte
nicht-spezifische Zytotoxizität
des Konjugats für
all diese Zellen in einer 24-Stunden-Behandlung in vitro. Die Nichtspezifität resultiert
aus der extrazellulären
Hydrolyse des Kopplungsliganden, welcher die getesteten Zellen freiem
Arzneimittel aussetzt.
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6A zeigt graphisch experimentelle Daten, die die
unerwünschte
nichtspezifische Zytotoxizität
von PE-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat für Marker-positive und -negative
Testzellen nach 24 Stunden Behandlung in vitro zeigen, obwohl den
24 Stunden Behandlung eine Erholungsperiode über Nacht folgte, bevor die
metabolische Aktivität
getestet wurde.
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6B zeigt experimentelle Daten, die die nicht-spezifische
Zytotoxizität
des freien PE therapeutischen Mittels auf Marker-positive und -negative
Testzellen nach 24 Stunden Behandlung an vitro zeigen.
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7A stellt graphisch experimentelle Daten dar,
die zeigen, dass eine kurze fünfminütige "Puls"-Behandlung, d.h.
anstelle von 24 Stunden, gefolgt von Aussetzen gegenüber [3H]
Leucin, mit freiem RA therapeutischem Mittel unspezifisch zytotoxisch
war, d.h. für
HT29-Marker-negative Kontrollzellen, aber im Gegensatz dazu das
RA-NR-AN-01 therapeutische Konjugat bei dieser "Puls"-Behandlung nicht
zytotoxisch ist.
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7B zeigt graphisch experimentelle Daten, die zeigen,
dass freies RA therapeutisches Mittel für HT29-Marker-negative Kontrollzellen
unspezifisch zyto toxisch ist, auch in einer 5' "Puls"-Behandlung, gefolgt von
einer 24-stündigen
Erholungsphase vor dem Aussetzen gegenüber [3H]-Leucin, aber im Gegensatz
dazu das RA-NR-AN-01 therapeutische Konjugat für Zeilen nicht zytotoxisch
ist.
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7C zeigt graphisch die Ergebnisse von Experimenten,
die zeigen, dass die "Puls"-Behandlung von Zellen
in vitro mit RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat die zelluläre Aktivität in Marker-positiven A375-Zellen
hemmt, gemessen mittels der Proteinsynthese.
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7D zeigt graphisch experimentelle Daten, die zeigen,
dass eine "Puls"-Behandlung von Zellen in vitro mit RA-NR-AN-01
therapeutischem Konjugat keine langanhaltenden inhibitorischen Wirkungen
auf die zelluläre
Aktivität
in Marker-positiven Zellen ausgeübt,
da die Proteinsynthese in A375-Zellen nicht inhibiert wurde, wenn
den Zellen eine Erholungsphase über
Nacht vor dem Test in vitro erlaubt wurde.
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8A zeigt graphisch experimentelle Daten, die zeigen,
dass das RA-NR-AN-01
therapeutische Konjugat keine langanhaltenden inhibitorischen Wirkungen
auf die zelluläre
Aktivität
in vaskulären
glatten Muskelzellen ausübte,
während
eine "Puls"-Behandlung von Zellen
in vitro mit freien RA therapeutischem Mittel unspezifisch zytotoxisch
war, wie sich durch die metabolische Aktivität in BO54 Zellen ergibt, denen
48 Stunden Erholungsphase vor dem Test erlaubt wurden.
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8B zeigt graphisch experimentelle Daten ähnlich jenen,
die in 8A oben gezeigt sind, jedoch unter
Verwendung eines zweiten markerpositiven Zelltyps, nämlich A375,
wobei die Daten zeigen, dass eine "Impuls"-Behandlung
mit dem RA-RN-AN-01 therapeutischen Konjugat keine langdauernden
inhibitorischen Effekte auf die zelluläre Aktivität ausgeübt hat, gemessen durch die
metabolische Aktivität
in A375-Zellen, denen eine 48-stündige
Erho lungsperiode vor dem Testen zugestanden wurde.
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8C stellt graphisch Ergebnisse dar ähnlich jenen,
die in 8A und 8B oben
dargestellt sind, jedoch unter Verwendung einer Markernegativen
Kontrollzelltyps, nämlich
HT29. Diese Ergebnisse zeigen, dass die "Puls"-Behandlung
mit RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat keine langanhaltenden inhibitorischen
Wirkungen auf die zelluläre
Aktivität
Markernegativer Kontrollzellen ausgeübte, gemessen durch die metabolische
Aktivität
in HT29-Zellen, denen eine 24stündige
Erholungsphase vor dem Test erlaubt wurde.
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9A zeigt eine Stenose aufgrund von Proliferation
intimaler glatter Muskelzellen in einem histologischen Schnitt einer
unbehandelten Arterie 5 Wochen nach Angioplastie in einem Tiermodell.
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9B zeigt die Hemmung der Stenose in einem Tiermodell
in einem histologischen Schnitt einer Arterie, die mit therapeutischem
Konjugat 5 Wochen nach der Angioplastie behandelt wurde.
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10A zeigt graphisch experimentelle Daten, die
Proteinsynthese- und DNA-Synthese-Inhibitionsfähigkeit von Suramin im Hinblick
auf vaskuläre
glatte Muskelzellen vergleichen.
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10B zeigt graphisch experimentelle Daten, die
Proteinsynthese- und DNA-Synthese-Inhibitionsfähigkeit von Staurosporin im
Hinblick auf vaskuläre
glatte Muskelzellen vergleichen.
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10C zeigt graphisch experimentelle Daten, die
Proteinsynthese- und DNA-Synthese-Inhibitionsfähigkeit von Nitroglycerin im
Hinblick auf vaskuläre
glatte Muskelzellen vergleichen.
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10D zeigt graphisch experimentelle Daten, die
Proteinsynthese- und DNA-Synthese-Inhibitionsfähigkeit von Cytochalasin B
im Hinblick auf vaskuläre
glatte Muskelzellen vergleichen.
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11 zeigt einen tangentialen Schnitt parallel zur
inneren Oberfläche
einer vaskulären
glatten Muskelzelle, die 62500fach vergrößert ist und durch zahlreiche
endozytotische Vesikel gekennzeichnet ist, von denen einige antikörperbeschichtete
Goldkügelchen
enthalten, die sich im Prozess befinden, durch die Zelle in vitro
aufgenommen zu werden.
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12 zeigt eine glatte Muskelzelle, die 62500fach
vergrößert ist
und durch eine bemerkenswerte Anhäufung von Goldkügelchen
in Lysosomen, 24 Stunden nachdem die Zellen in vitro den Kügelchen
ausgesetzt wurde, gekennzeichnet ist.
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13 zeigt eine glatte Muskelzelle, die 62500fach
vergrößert ist
und durch die Anhäufung
von Goldkügelchen
in Lysosomen in vivo gekennzeichnet ist.
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14 zeigt eine in vivo Dosis-Wirkungs-Studie der
Wirkungen von Cytochalasin B auf den Lumeninhalt von Oberschenkelarterien
von Schweinen.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Wie
hierin verwendet besitzen die folgenden Begriffe die unten ausgeführten Bedeutungen:
"Therapeutisches Konjugat" meint ein Bindungsprotein
für vaskulären glatten
Muskel oder interstitielle Matrix, das (z.B. wahlweise über einen
Linker) mit einem therapeutischen Mittel gekoppelt ist.
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"Target" bzw. "Ziel" und "Marker" werden bei der Beschreibung
der Konjugat-Aspekte
der vorliegenden Erfindung austauschbar verwendet und meinen ein Molekül, das auf
spezifische Weise durch das Bindungsprotein für Matrix oder vaskuläre glatte
Muskulatur erkannt wird, z.B. ein Antigen, ein Polypeptidantigen
oder ein Zelloberflächen-Kohlenhydrat
(z.B. ein Glykolipid, ein Glykoprotein oder ein Proteoglykan), das
auf den Zelloberflächenmembranen
einer glatten vaskulären
Muskelzelle oder einer Matrixstruktur exprimiert wird.
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"Epitop" wird in Bezug auf
eine spezifische Stelle innerhalb des "Ziel"-Moleküls verwendet,
das von dem Bindungsprotein für
Matrix oder glatten Muskel gebunden wird, z.B. eine Sequenz von
drei oder mehr Aminosäuren
oder Sacchariden.
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"Gekoppelt" wird so verwendet,
dass eine kovalente oder nichtkovalente chemischen Assoziierung (d.h.
hydrophob durch van der Waals-Kräfte
oder Ladungs-Ladungswechselwirkungen)
des Bindungsproteins für
Matrix oder vaskulären
glatten Muskel mit dem therapeutischen Mittel gemeint ist. Aufgrund
der Natur der verwendeten therapeutischen Mittel werden die Bindungsproteine
normalerweise mittels kovalenter Bindung mit den therapeutischen
Mitteln assoziiert bzw. mit diesen verbunden.
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"Linker" meint ein Mittel,
das das Bindungsprotein für
Matrix oder glatten Muskel an ein therapeutisches Mittel koppelt,
z.B. einen organischen chemischen Koppler.
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"Migration" glatter Muskelzellen
meint die Bewegung dieser Zellen in vivo aus den medialen Schichten eines
Gefäßes in die
Intima, wie sie auch in vitro durch Verfolgen der Bewegung einer
Zelle von einem Ort zu einem anderen studiert werden kann (z.B.
mittels Zeitverlauf-Filmaufnahmen oder eines Videorekorders oder manueller
Zählung
der glatten Muskelzellmigration aus einer definierten Fläche in der
Gewebekultur über
die Zeit).
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"Proliferation", d.h. glatter Muskelzellen
oder Krebszellen, bedeutet Ansteigen der Zellzahl, d.h. durch Mitose
der Zellen.
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"Exprimiert" meint mRNA-Transkription
und -Translation mit der daraus folgenden Synthese, Glykosylierung
und/oder Sekretion eines Polypeptids durch eine Zelle, z.B. CSPG,
das durch eine glatte Gefäßmuskelzelle
oder eine Perizyte synthetisiert wird.
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"Makrozyklisches Trichothecen" soll irgendeines
aus der Gruppe strukturell verwandter sesquiterpenoider makrozyklischer
Mycotoxine bedeuten, die durch verschiedene Pilzarten hergestellt
werden und die durch die 12,13-Epoxytrichothec-9-en-Grundstruktur
gekennzeichnet sind, z.B. Verrucarine und Roridine, welche die Produkte
von Sekundärmetabolismus
der Bodenpilze Myrothecium verrucaria und Myrothecium roridium sind.
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"Retard-" bzw. "Depot-" bzw. "Dauerfreisetzung-" meint eine Dosierungsform,
die so gestaltet ist, dass ein therapeutisches Mittel aus ihr über eine
Zeitspanne ausgeschüttet
wird bzw. aus dieser freigesetzt wird, die von ungefähr 3 bis
ungefähr
21 Tagen reicht. Die Ausschüttung über eine
längere
Zeitspanne wird auch als erfindungsgemäße "Retard"-Dosierungsform angesehen.
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"Dosierungsform" meint eine freie
(nicht-gezielte oder nicht mit einem Bindungspartner assoziierte) Formulierung
eines therapeutischen Mittels sowie therapeutische Retard-Formulierungen,
wie jene, die mikropartikuläres
oder nanopartikuläres,
bioabbaubares oder nicht-bioabbaubares polymeres Material enthalten, das
in der Lage ist, an ein oder mehrere Bindungsproteine oder -peptide
zu binden, um eine darin dispergierte therapeutische Gruppierung
zu einer Zielzellpopulation zu transportieren.
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"Staurosporin" umfasst Staurosporin,
einen Proteinkinase C-Inhibitor der folgenden Formel
sowie Diindoloalkaloide mit
einer der folgenden allgemeinen Strukturen:
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Genauer
umfasst der Begriff "Staurosporin" K-252 (siehe z.B.
japanische Patentanmeldung 62,164,626), BMY 41950 (US-Patent 5,015,578),
UCN-01 (US-Patent
4,935,415), TAN-999 (japanische Patentanmeldung 01,149,791), TAN-1030A (japanische
Patentanmeldung 01,246,288), RK-286C (japanische Patentanmeldung
02,258,724) und deren funktionelle Äquivalente und Derivate. Derivate
von Staurosporin umfassen jene, die in den japanischen Patentanmeldungen
03,72,485; 01,143,877; 02,09,819 und 03,220,194 besprochen sind,
sowie jene in den internationalen PCT-Anmeldungen WO8907105 und
WO9109034, und den europäischen
Patentanmeldungen
EP410,389 und
EP296,110 . Derivate von K-252,
einem natürlichen Produkt,
sind bekannt. Siehe z.B. japanische Patentanmeldungen 63,295,988;
62,240,689; 61,268,687; 62,155,284; 62,155,285; 62,120,388 und 63,295,589,
sowie die internationale PCT-Anmeldung WO8807045 und die europäische Patentanmeldung
EP 323,171 .
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"Cytochalasin" umfasst Pilzstoffwechselprodukte,
die eine inhibitorische Wirkung auf den Zielzellmetabolismus zeigen,
einschließlich
Verhinderung der Kontraktion oder Migration glatter vasculärer Muskelzellen. Bevorzugt
inhibieren Cytochalasine die Polymerisation von monomerem Actin
(G-Actin) zur polymeren Form (F-Actin), um hierdurch die Zellfunktionen
zu inhibieren, die zytoplasmatische Mikrofilamente erfordern. Cytochalasine
sind typischerweise von Phenylalanin (Cytochalasine), Tryptophan
(Chaetoglobosine) oder Leuzin (Aspochalasine) abgeleitet, was zu
einer Benzyl-, Indo-3-ylmethyl- oder Isobutylgruppe führt, und
zwar jeweils an der Position C-3 einer substituierten Perhydroisoindol-1-on-Gruppierung
(Formel V oder VI).
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Die
Perhydroisoindolgruppierung umfasst umgekehrt einen 11, 13 oder
14 Atome umfassenden carbozyklischen oder sauerstoffenthaltenden
Ring, der an Positionen C-8 und C-9 kondensiert ist. Alle natürlich auftretenden
Cytochalasine enthalten eine Methylgruppe bei C-5; eine Methyl-
oder Methylengruppe bei C-12; und
eine Methylgruppe bei C-14 oder C-16. Beispielhafte Moleküle umfassen
Cytochalasin A, Cytochalasin B, Cytochalasin D, Cytochalasin E,
Cytochalasin F, Cytochalasin G, Cytochalasin H, Cytochalasin J,
Cytochalasin K, Cytochalasin L, Cytochalasin M, Cytochalasin N,
Cytochalasin O, Cytochalasin P, Cytochalasin Q, Cytochalasin R,
Cytochalasin S, Chaetoglobosin A, Chaetoglobosin B, Chaetoglobosin
C, Chaetoglobosin D, Chaetoglobosin E, Chaetoglobosin F, Chaetoglobosin
G, Chaetoglobosin J, Chaetoglobosin K, Deoxaphomin, Proxiphomin,
Protophomin, Zygosporin D, Zygosporin E, Zygosporin F, Zygosporin
G, Aspochalasin B, Aspochalasin C, Aspochalasin D und ähnliche,
sowie deren funktionelle Äquivalente
und Derivate. Bestimmte Cytochalasin-Derivate sind in den japanischen
Patenten 72 01,925; 72 14,219; 72 08,533; 72 23,394; 72 01924; und 72
04,164 ausgeführt.
Cytochalasin B wird in dieser Beschreibung als Prototyp für ein Cytochalasin
verwendet.
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Glatte
Muskelzellen und Pericyten, umfassen, wenn hierin auf sie Bezug
genommen wird, jene Zellen, die aus den medialen Schichten der Gefäße und der
Adventitiengefäße abgeleitet
sind, welche in intimalen hyperplastischen vaskulären Stellen
infolge einer Verletzung proliferieren, wie jene, die während einer
PTCA verursacht werden.
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Die
Eigenschaften glatter Muskelzellen umfassen die histologische Morphhologie
(bei lichtmikroskopischer Untersuchung) einer Spindelform mit einem
verlängerten
Kern, der zentral in der Zelle liegt, mit vorhandenen Nucleoli und
Myofibrillen im Sarcoplasma. Bei elektronenmikroskopischer Untersuchung
weisen glatte Muskelzellen lange schlanke Mitochondrien in dem juxtanuklearen
Sarcoplasma auf, einige wenige tubuläre Elemente des granulären endoplasmatischen
Retikulums und zahlreiche Gruppen freier Ribosomen. Ein kleiner
Golgi-Komplex kann sich in der Nähe
eines Pols des Kerns befinden. Der Großteil des Sarcoplasma wird von
dünnen
parallelen Myofilamenten eingenommen, die zum größten Teil in der Längsachse
der Muskelzelle orientiert sein können. Diese Actin-haltigen
Myofibrillen können
in Bündeln
angeordnet sein, mit eingestreuten Mitochondrien. Verteilt durch
die kontraktive Substanz der Zelle können auch ovale dichte Bereiche
vorhanden sein, mit ähnlich
dichten Bereichen, die in Intervallen längs den Innenaspekten des Plasmalemma
verteilt sind.
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Eigenschaften
von Perizyten umfassen die histologische Morphologie (bei lichtmikroskopischer
Untersuchung), die durch eine unregelmäßige Zellform gekennzeichnet
ist. Perizyten findet man innerhalb der Basalmembran, die vaskuläre endotheliale
Zellen umgibt, und ihre Identität
kann durch eine positive Immunfärbung
mit Antikörpern,
die für
Alpha-Actin glatter Muskelzellen (bspw. Anti-Alpha-sm1, Biomakor,
Rehovot, Israel), HMW-MAA und Perizyten-Gangliosid-Antigene wie
MAb 3G5 (11) spezifisch sind bestätigt werden; und durch negative
Immunfärbung
mit Antikörpern
gegen Cytokeratine (d.h. epitheliale und Fibroblasten-Marker) und
van Willebrandt-Faktor (d.h. einen endothelialen Marker). Sowohl
vaskuläre
glatte Muskelzellen als auch Perizyten sind in der Immunfärbung mit
dem monoklonalen NE-AN-01-Antikörper
positiv.
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Die
erfindungsgemäßen Stents
sind nützlich
bei der Inhibierung der Aktivität
von vaskulären
glatten Muskelzellen, z.B. bei der Verminderung, Verzögerung oder
Beseitigung einer Stenose nach Angioplastie. Wie hierin verwendet
meint der Begriff "Verminderung" die Verringerung
der intimalen Verdickung, die aus der Stimulation der glatten Muskelzellproliferation
nach Angioplastie folgt, entweder in einem Tiermodell oder bei einem
Menschen. "Verzögern" meint die Verzögerung der
Zeit bis zum Einsetzen einer sichtbaren intimalen Hyperplasie (z.B.
histologisch beobachtet oder durch angiographische Untersuchung)
nach Angioplastie, und kann auch von einer "verminderten" Restenose begleitet sein. "Beseitigung" oder "Eliminieren" oder „Ausmerzen" der Restenose nach
Angioplastie bedeutet das vollständige "Vermindern" und/oder vollständige "Verzögern" der Intimahyperplasie
in einem Patienten in einem Ausmaß, das es nicht länger notwendig
macht, chirurgisch zu intervenieren, d.h. einen geeigneten Blutfluss
durch das Gefäß durch
wiederholte Angioplastie, Atherectomie oder Coronararterien-Bypassoperation
wiederherzustellen. Die Wirkungen des Vermindern, Verzögern oder
Beseitigen einer Stenose können
durch Verfahren bestimmt werden, die für den Fachmann Routine sind,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf, Angiographie, Ultraschalluntersuchung, fluoroskopische Bilddarstellung,
endoskopische Faseroptikuntersuchung oder Biopsie und Histologie.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen
Konjugate erzielen diese vorteilhaften Wirkungen, indem sie spezifisch
an die Zellmembranen glatter Muskelzellen und Pericyten binden.
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Therapeutische
Konjugate der Erfindung erhält
man durch Kopplung eines Bindungsproteins für vaskuläre glatte Muskeln an ein therapeutisches
Mittel. In dem therapeutischen Konjugat führt das Bindungsprotein für vaskuläre glatte Muskulatur
die Funktion der Zielführung
(bzw. des Targetings) des therapeutischen Konjugats zu den vaskulären glatten
Muskelzellen oder Pericyten aus, und das therapeutische Mittel führt die Funktion
aus, die Zellaktivität
der glatten Muskelzelle oder des Pericyts zu inhibieren.
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Erfindungsgemäße therapeutische
Dosierungsformen (vom Retardtyp) besitzen die Fähigkeit, den therapeutischen
Mittel über
eine langgezogene Zeitspanne an Zielzellen abzugeben. Therapeutische
Dosierungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung können in
irgendeiner Konfiguration vorliegen, die für diesen Zweck geeignet ist.
Bevorzugte therapeutische Retarddosierungsformen zeigen eine oder
mehrere der folgenden Eigenschaften:
- – eine mikropartikuläre (z.B.
von ungefähr
0,5 Mikrometer bis ungefähr
100 Mikrometer Durchmesser, wobei von ungefähr 0,5 bis ungefähr 2 Mikrometer
bevorzugt ist) oder nanopartikuläre
(z.B. von ungefähr
1,0 Nanometer bis ungefähr
1000 Nanometer Durchmesser, wobei von ungefähr 50 bis ungefähr 250 Nanometer
bevorzugt ist) freifließende
Pulverstruktur;
- – bioabbaubare
Struktur, die so gestaltet ist, dass sie über eine Zeitspanne zwischen
ungefähr
3 bis ungefähr
180 Tagen biologisch abgebaut wird, wobei von ungefähr 10 bis
ungefähr
20 Tagen bevorzugt ist, oder nicht-bioabbaubare Struktur, um eine
Diffusion eines therapeutischen Mittels über eine Zeitspanne zwischen
ungefähr
3 und ungefähr
180 Tagen zu ermöglichen,
wobei von ungefähr
10 bis ungefähr
21 Tagen bevorzugt ist;
- – biokompatibel
mit Zielgewebe und der lokalen physiologischen Umgebung, in welche
die Dosierungsform verabreicht wird, einschließlich biokompatiblen Bioabbauprodukten;
- – Erleichterung
einer stabilen und reproduzierbaren Verteilung eines therapeutischen
Mittels, bevorzugt unter Bildung einer therapeutisches Mittel-Polymer-Matrix, wobei
die Freisetzung des therapeutischen Mittels auf einer oder beiden
der folgenden Routen stattfindet: (1) Diffusion des therapeutischen
Mittels durch die Dosierungsform (wenn das therapeutische Mittel
in dem Polymer oder Polymergemisch löslich ist, das die Dosierungsform
bildet); oder (2) Freisetzung des therapeutischen Mittels als die
biologische Abbauprodukte der Dosierungsform; und
- – Fähigkeit,
an ein oder mehrere zelluläre
und/oder interstitielle Matrixepitope zu binden, wobei von ungefähr 1 bis
ungefähr
10.000 Bindungsprotein/-peptid-Dosierungsform-Bindungen
bevorzugt ist, und wobei ein Maximum von ungefähr einer Bindungspeptid-Dosierungsform
pro 150 Quadratångström der Partikeloberfläche mehr
bevorzugt ist. Die gesamte Bindungszahl ist von der eingesetzten
Partikelgröße abhängig. Die
Bindungsproteine oder -peptide sind in der Lage, die partikuläre therapeutische
Dosierungsform durch kovalente Ligandensandwichstrukturen oder nichtkovalente
Modalitäten
zu koppeln, wie hierin ausgeführt.
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Nanopartikuläre therapeutische
Retarddosierungsformen der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung sind bioabbaubar und binden an die vaskulären glatten
Muskelzellen und dringen in diese Zellen primär durch Endozytose ein. Der
biologische Abbau dieser Nanopartikel erfolgt über die Zeit (z.B. 10 bis 21
Tagen) in prälysosomischen
Vesikeln und Lysosomen. Die bevorzugten größeren therapeutischen mikropartikulären Dosierungsformen
der vorliegenden Erfindung binden an die Zielzelloberfläche oder
die interstitielle Matrix in Abhängigkeit
des gewählten
Bindungsproteins oder -peptids und gegeben die therapeutischen Mittel
zur anschließenden
Aufnahme durch die Zielzelle frei, wobei nur wenige der kleineren
Mikropartikel durch Phagozytose in die Zelle eindringen. Ein Fachmann
wird anerkennen, dass der präzise
Mechanismus, über
den eine Zielzelle eine Dosierungsform der vorliegenden Erfindung
aufnimmt und metabolisiert, von der Morphologie, Physiologie und
den metabolischen Prozessen dieser Zellen abhängig ist.
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Die
Größe der zielgerichteten
therapeutischen partikulären
Retarddosierungsformen ist auch im Hinblick auf die Art der zellulären Aufnahme
wichtig. Bei spielsweise können
die kleineren Nanopartikel mit der interstitiellen Flüssigkeit
zwischen die Zellen fließen
und in das infundierte Gewebe eindringen, bis sie an das normale
oder neoplastische Gewebe binden, welches für die Zielausrichtung durch
das Bindungsprotein/-peptid ausgewählt wurde. Dieses Merkmal ist
z.B. wichtig, weil die Nanopartikel den lymphatischen Drainagekanälen von
infundierten primären
neoplastischen Foci folgen, was eine Zielausrichtung auf metastatische
Zielfoci entlang des lymphatischen Systems bewirkt. Die größeren Nanopartikel
tendieren dazu, leichter in dem infundierten Primärgewebe
interstitiell festgehalten zu werden.
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Bevorzugte
Retarddosierungsformen der vorliegenden Erfindung sind bioabbaubare
Mikropartikel oder Nanopartikel. Bevorzugter sind bioabbaubare Mikropartikel
oder Nanopartikel aus einer polymerenthaltenden Matrix geformt,
die durch zufällige,
nicht-enzymatische, hydrolytische Spaltung biologisch abgebaut wird,
und zwar unter Freisetzung des therapeutischen Mittels, wobei Poren
innerhalb der Partikelstruktur gebildet werden.
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Polymere,
die aus der Kondensation von Alpha-Hydroxycarbonsäuren und
zugeordneten Lactonen abgeleitet sind, sind für die Verwendung in der vorliegenden
Erfindung bevorzugt. Eine besonders bevorzugte Gruppierung ist aus
einem Gemisch thermoplastischer Polyester (z.B. Polylactiden oder
Polyglycoliden) oder einem Copolymer aus Lactiden- und Glycoliden-Komponenten
geformt, wie ewta Poly(lactid-co-glycolid). Eine beispielhafte Struktur,
ein zufälliges
Poly-(DL-lactid-co-glycolid), ist unten gezeigt, wobei die Werte
von x und y vom Fachmann eingestellt werden können, um wünschenswerte Mikropatikel- und Nanopartikel-Eigenschaften
zu erreichen.
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Andere
Mittel, die für
die Bildung von Partikel-Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung
geeignet sind, umfassen Polyorthoester und Polyacetale (Polymer
Letters, 18: 293, 1980) und Polyorthocarbonate (U.S. Patent 4,093,709)
und ähnliche.
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Bevorzugte
erfindungsgemäße Milchsäure-/Glycolsäure-Polymere
enthaltende Matrixpartikel werden durch emulsionsbasierte Verfahren
hergestellt, die modifizierte Lösungsmittelxtraktionsprozesse
darstellen, wie jene beschrieben von Cowsar et al., "Poly(Lactide-Co-Glycolide)
Microcapsules for Controlled Release of Steroids", Methods Enzymology, 112: 101-116,
1985 (Steroideinschluss in Mikropartikeln); Eldridge et al., "Biodegradable and
Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide)
Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid
which enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies", Infection and Immunity, 59:
2978-2986, 1991 (Toxoid-Einschluss); Cohen et al., "Controlled Delivery
Systems for Proteins based on Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres", Pharmaceutical
Research, 8(6): 713-720, 1991 (Enzymeinschluss); und Sanders et
al., "Controlled
Release of a Luteinizing Hormone-Releasing
Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres", J. Pharmaceutical
Science, 73(9): 1294-1297, 1984 (Peptideinschluss).
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Allgemein
umfasst das Verfahren zur Bildung von Partikeldosierungsformen der
vorliegenden Erfindung das Lösen
des Polymers in einem halogenierten Kohlenwasserstofflösungsmittel,
Dispergieren einer (bevorzugt wässrigen)
Lösung
des therapeutischen Mittels in demselben, und Hinzufügen eines
zusätzlichen
Mittels, das als Lösungsmittel
für das
halogenierte Kohlenwasserstofflösungsmittel
wirkt, jedoch nicht für
das Polymer. Das Polymer fällt
aus der – halogenierten
Kohlenwasserstoff- Polymer -Lösung
in Tröpfchen
in die therapeutisches Mittel enthaltende Lösung aus und schließt das therapeutische
Mittel ein. Bevorzugt wird das therapeutische Mittel im Wesentlichen
gleichmäßig in der
Retarddosierungsform der vorliegenden Erfindung dispergiert. Nach
der Partikelbildung werden sie mit einem organischen Lösungsmittel
gewaschen und gehärtet. Es
folgen Waschschritte mit Wasser und mit wässrigem nichtionischem oberflächenaktiven
Mittel bevor bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet wird.
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Für Biokompatibilitätszwecke
werden Partikeldosierungsformen, gekennzeichnet durch darin in Matrixform
dispergiertes therapeutisches Mittel, vor der Verpackung, Lagerung
oder Verabreichung sterilisiert. Die Sterilisation kann auf jeder
hierfür
geeigneten Art und Weise voregnommen werden. Beispielsweise können die
Partikel mit Gammastrahlen bestrahlt werden, vorausgesetzt dass
das Aussetzen gegenüber
dieser Strahlung die Struktur oder Funktion des therapeutischen
Mittels, das in der Matrix aus therapeutischem Mittel und Polymer
dispergiert ist, oder des daran anhängenden Bindungsproteins/-peptids
nicht nachteilig beeinflusst. Wenn das therapeutische Mittel oder
das Bindungsprotein/-peptid
derart nachteilig beeinflusst werden, können die Partikeldosierungsformen
unter sterilen Bedingungen hergestellt werden.
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Die
Freisetzung des therapeutischen Mittels aus den erfindungsgemäßen Partikeldosierungsformen kann
als Ergebnis von sowohl Diffusion als auch Erosion der Partikelmatrix
geschehen. Die Bioabbaurate beeinflusst direkt die Freisetzungskinetik
des therapeutischen Mittels. Die biologische Abbaurate ist regelbar durch
Veränderung
der Zusammensetzung und der Struktur der Retarddosierungsform. Beispielsweise
kann eine Veränderung
des Lactid/Glycolid-Verhältnisses
in bevorzugten Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung vorgenommen
werden, wie beschrieben bei Tice et al., "Biodegradable Controlled-Release Parenteral Systems", Pharmaceutical
Technology, S. 26-35, 1984; durch Einschluss von Polymerhydrolyse-modifizierenden
Mitteln, wie etwa Zitronensäure
und Natriumcarbonat, wie beschrieben bei Kent et al., "Microencapsulation of
Water Soluble Active Polypeptides", U.S. Patent 4,675,189; durch Verändern der
Beladung des therapeutischen Mittels im Lactid/Glycolidpolymer,
wobei die Abbaurate umgekehrt proportional zur Menge des darin enthaltenen
therapeutischen Mittels ist, sowie durch sorgfältige Auswahl eines geeigneten
Analogons einer gemeinsamen Familie therapeutischer Mittel, die
unterschiedliche Wirksamkeiten aufweisen, um die Kernbeladungen
zu verändern;
und durch Verändern
der Partikelgröße, wie
beschrieben in Beck et al., "Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide)/Norethisterone
Microcapsules: An Injectable Biodegradable Contraceptive", Biol. Reprod., 28:
186-195, 1983, oder ähnliches.
Alle oben genannten Verfahren zur Regulation der Bioabbaurate beeinflussen
die intrinsische Viskosität
der Polymer-enthaltenden Matrix, wobei deren Hydrierungsrate verändert wird.
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Die
bevorzugte Lactid/Glycolid-Struktur ist mit der physiologischen
Umgebung eines Säugers
biokompatibel. Zudem haben die bevorzugten Retarddosierungsformen
den Vorteil, dass deren Bioabbau Milchsäure und Glycolsäure erzeugt,
beide normale Stoffwechselprodukte von Säuger.
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Funktionelle
Gruppen, die erforderlich sind, damit um Bindungen von Bindungsprotein/-peptid-Partikeldosierungsform
an die Partikel zu knüpfen,
sind wahlweise von der Partikelstruktur umfasst, zusammen mit den
nicht-abbaubaren
oder bioabbaubaren Polymereinheiten. Funktionelle Gruppen, die zu
diesem Zweck nützlich
sind, umfassen jene, die mit Peptiden reagieren können, wie
Carboxylgruppen, Amingruppen, Sulfhydrylgruppen und ähnliche.
Bevorzugte bindungsverstärkende
Gruppierungen umfassen die terminalen Carboxylgruppen der bevorzugten
(Lactid-Glycolid)-Polymer-enthaltenden Matrix oder ähnliche.
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Ein
nützliches
Bindungsprotein für
vaskulären
glatten Muskel ist eine Polypeptid-, peptidische oder mimetische
Verbindung (wie unten beschrieben), die in der Lage ist, an ein
Ziel oder einen Marker auf einer Oberflächenkomponente einer intakten
oder zerstörten
vaskulären
glatten Muskelzelle auf eine Weise zu binden, die entweder die Freisetzung
des therapeutischen Mittels extrazellulär untmittelbar in die interstitielle
Matrix mit anschließender
Diffusion des therapeutischen Mittels in die verbleibenden intakten
vaskulären
glatten Muskelzellen und/oder die Aufnahme durch die Zelle in ein
intrazelluläres
Kompartiment der gesamten zielgerichteten bioabbaubaren Komponente
erlaubt, was die Zuführung
des therapeutischen Mittels gestattet. Repräsentative Beispiele nützlicher
Bindungsproteine für
vaskulären
glatten Muskel umfassen Antikörper
(z.B. monoklonale oder polyklonale affinitätsgereinigte Antikörper), F(ab')2-,
Fab'-, Fab- und
Fv-Fragmente und/oder Komplementaritätsbestimmende Bereiche (CDRs)
von Antikörpern
oder funktionelle Äquivalenten
von diesen (z.B. Bindungspeptide und ähnliche); Wachstumsfaktoren,
Zytokine und Polypeptidhormone und ähnliche; und Makromoleküle, die
extrazelluläre
Matrixrezeptoren erkennen (z.B. Integrin- und Fibronectin-Rezeptoren
und ähnliche).
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Andere
bevorzugte Bindungspeptide, die für die Zielausrichtung der Dosierungsformausführung der vorliegenden
Erfindung nützlich
sind, umfassen jene, die im intrazellulären Stoma und der Matrix lokalisiert sind,
die sich zwischen und unter den vaskulären glatten Muskelzellen befinden.
Diese Bindungspeptide transportieren das therapeutische Mittel zu
dem interstitiellen Raum zwischen den Zielzellen. Das therapeutische Mittel
wird in solche interstitiellen Räume
zur anschließenden
Aufnahme durch die vaskulären
glatten Muskelzellen freigesetzt. Bevorzugte Bindungspeptide dieses
Typs sind Epitopen auf Kollagen, extrazellulären Glykoproteinen, wie etwa
Tenascin, Reticulum und elastischen Fasern und anderem interzellulären Matrixmaterial zugeordnet.
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Bevorzugte
Tumorzell-bindende Peptide sind Epitopen von myc-, ras-, bcr/Ab1-,
erbB und ähnlichen Genprodukten,
sowie Mucinen, Cytokinrezeptoren wie IL-6, EGF, TGF und ähnlichen,
zugeordnet, wobei die Bindungspeptide an bestimmten Lymphomen (myc),
Karzinomen wie Kolonkrebs (ras), Karzinomen (erbB), Adenokarzinomen
(Mucine), Brustkrebs und Hepatomen (IL-6-Rezeptor), bzw. Brustkrebs
(EGF und TGF) lokalisiert sind. Bevorzugte an Immunsystem- Effektorzellen bindende
Peptide sind anti-TAC, IL-2 und ähnliche, welche
an aktivierten T-Zellen bzw. Makrophagen lokalisiert werden. Andere
bevorzugte Bindungsproteine/-petide, die in der Durchführung der
vorliegenden Erfindung nützlich
sind, umfassen Gruppierungen, die in der Lage sind, sich an pathologisch
proliferierenden normalen Geweben zu platzieren, wie Perizyten des
intraokularen Gefäßnetzes,
das in degenerative Augenerkrankungen verwickelt ist.
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Erfindungsgemäße therapeutische
Mittel werden dazu ausgewählt,
die zelluläre
Aktivität
einer vaskulären
glatten Muskelzelle zu inhibieren, z.B. Proliferation, Migration,
Zunahme im Zellvolumen, Zunahme in der Synthese extrazellulärer Matrix
(z.B. Kollagene, Proteoglycane und ähnliche) oder Sezernieren extrazellulärer Matrixmaterialien
durch die Zelle. Das therapeutische Mittel wirkt als "zytostatisches Mittel', um die Zellteilung in
proliferierenden Zellen zu verhindern oder zu verzögern, indem
die DNA-Replikation inhibiert wird (z.B. durch ein Medikament, wie
Adriamycin, Staurosporin oder ähnliche)
oder durch Inhibieren der Spindelfaserbildung (z.B. ein Arzneimittel,
wie Colchicin) und ähnliche.
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Repräsentative
Beispiele "zytostatischer
Mittel" umfassen
z.B. modifizierte Toxine, Methotrexat, Adriamycin, Radionuklide
(z.B. etwa jene, die offenbart sind in Fritzberg et al., U.S. Patent
4,897,255), Proteinkinaseinhibitoren (z.B. Staurosporin), Inhibitoren
spezifischer Enzyme (z.B. wie die Kernenzyme DNA-Topoisomerase II und DNA-Polymerase,
RNA-Polymerase, Adenylguanylcyclase), Superoxiddismutaseinhibitoren, terminale
Desoxynucleotidyltransferase, reverse Transkriptase, Antisense-Oligonukleotide,
welche die Proliferation vaskulärer
glatter Muskelzellen und ähnliches
unterdrücken,
die, wenn sie in ein Zellkompartiment mit geeigneter Dosierung eingebracht
werden, die Wirkung haben, die Proliferation einer vaskulären glatten
Muskelzelle oder eines Pericyten zu beeinträchtigen, ohne die Zelle zu
töten.
Andere Beispiele für "zytostatische Mittel" umfassen peptidische
oder mimetische Inhibitoren (d.h. Antagonisten, Agonisten oder kompetitive
oder nicht-kompetitive Inhibitoren) zellu lärer Faktoren, die (z.B. in
Gegenwart extrazellulärer
Matrix) die Proliferation vasculärer
glatter Muskelzellen oder Pericyten auslösen können; z.B. Cytokine (z.B. Interleukine,
wie IL-1), Wachstumsfaktoren (z.B. PDGF, TGF-alpha oder -beta, Tumornekrosefaktor,
von glatten Muskeln und Endothel abgeleitete Wachstumsfaktoren,
z.B. Endothelin, FGF), Homingrezeptoren (z.B. für Blutplättchen oder Leukozyten) und
extrazelluläre
Matrixrezeptoren (z.B. Integrine). Repräsentative Beispiele nützlicher
therapeutischer Mittel in dieser Kategorie zytostatischer Mittel
für die
glatte Muskelproliferation umfassen: Unterfragmente von Heparin,
Triazolpyrimidin (Trapidil; ein PDGF-Antagonist), Lovastatin und
Prostaglandine E1 oder I2.
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Für die erfindungsgemäßten Ausführungsformen
von Retarddosierungsformen sind therapeutische Mittel bevorzugt
jene, die die Aktivität
vaskulärer
glatter Muskelzellen inhibieren, ohne die Zellen zu töten (d.h. zytostatische
therapeutische Mittel). Bevorzugte therapeutische Mittel für diesen
Zweck zeigen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: Inhibieren
der DNA-Synthese vor der Inhibierung der Proteinsynthese, oder Inhibierung
der Migration der vaskulären
glatten Muskelzellen in die Intima. Diese therapeutischen Mittel
inhibieren die Proteinsynthese nicht signifikant (d.h. sie töten die
Zielzellen nicht), und erleichtern daher die zelluläre Reparatur
und Matrixproduktion, um die Gefäßwandläsion zu
stabilisieren, die durch Angioplastie hervorgerufen wird, um hierdurch
die glatte Muskelzellproliferation zu vermindern.
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Beispiele
für solche
bevorzugten therapeutischen Mittel sind Proteinkinaseinhibitoren,
wie Staurosporin (Staurosporin ist erhältlich von Sigma Chemical Co.,
St. Louis, Missouri), Cytochalasine, wie Cytochalasin B (Sigma Chemical
Co.) und Suramin (FBA Pharmaceuticals, West Haven, Connecticut),
sowie Nitroglycerin (DuPont Pharmaceuticals, Inc. Manuti, Puerto
Rico) oder deren Analoga oder funktionelle Äquivalente. Diese Verbindungen
sind zytostatisch und es wurde von ihnen gezeigt, dass sie eine
minimale Inhibierung der Proteinsynthese und Zytotoxizität bei Konzentrationen
ausüben,
bei denen eine signifikante DNA-Synthesehemmung stattfindet (siehe
Beispiel 8 und 10A – 10D).
Ein nützliches
Protokoll für
die Identifikation therapeutischer Mittel, die in den Retarddosierungsformausführungsformen
der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
ist z.B. in Beispiel 8 ausgeführt.
Ein Fachmann ist in der Lage, im Wesentlichen entsprechende experimentelle
Protokolle zu gestalten, um eine solche Identifizierung unterschiedlicher
Zielzellpopulationen herbeizuführen,
wie etwa adhärente
einschichtige Zielzelltypen. Andere Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung umfassen Mittel, die für
Krebszellen zytotoxisch sind. Bevorzugte Mittel für diese
Ausführungsformen sind
Roridin A, Pseudomonas Exotoxin und ähnliche oder deren Analoga
oder funktionelle Äquivalente.
Eine Vielzahl dieser therapeutischen Mittel, einschließlich Radioisotope
und ähnliche,
ist identifiziert worden und ist im Stand der Technik bekannt. Zusätzlich sind
Protokolle für
die Identifikation zytotoxischer Gruppen bekannt und werden in der
Technik routinemäßig verwendet.
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Die
Modulierung von Immunsystem-vermittelten Krankheitseffektorzellen
kann ebenfalls unter Verwendung der erfindungsgemäßen Retarddosierungsformen
erreicht werden. Solch eine Modulation wird bevorzugt im Hinblick
auf Krankheiten vorgenommen, die eine Effektorzellpopulation aufweisen,
die über
eine lokale Verabreichung durch eine Retarddosierungsform zugänglich sind.
Therapeutische Gruppierungen mit der entsprechenden Modulationsaktivität, z.B.
zytozide, zytostatische, Metabolismus-modulierende oder ähnliche Aktivität bei lymphorektikularen
Zellen bei der Behandlung von Arthritis (intraarticuläre Verabreichung),
Sprue (Orale Verabreichung), Uveitis und Endophatalmitis (Intraoculare
Verabreichung) und Keratitis (Subkonjungtivale Verabreichung), sind
unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik bekannt
sind, identifizierbar. Diese Mittel können auch verwendet werden,
um die Hyperaktivität
von epithelialen Drüsen
und endokrinen Organen, die zu vielen Erkrankungen führt, zu
vermindern. Bevorzugte Mittel für
diese Ausführungsformen
umfassen Roridin A, Pseudomonas Exotoxin, Suramin, Proteinkinaseinhibitoren
(z.B. Staurosporin) und ähnliche,
oder deren Analoga oder funktionelle Äquivalente.
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Andere
bevorzugte therapeutische Mittel bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung
umfassen Gruppierungen, die in der Lage sind, pathologische Proliferation,
Migration oder Hyperaktivität
normaler Gewebe zu vermindern oder auszuschalten. Beispielhaft für solche
therapeutischen Mittel sind jene, die in der Lage sind, Hyperaktivität von Hornhautepithel
und Stroma, pathologische Proliferation oder verlängerte Kontraktion
von glatten Muskelzellen oder Perizyten des intraocularen Gefäßsystems,
das in degenerative Augenerkrankung als Ergebnis von Hyperplasie
oder vermindertem Gefäßlumeninhalt
verwickelt sind, zu reduzieren oder auszuschalten. Bevorzugte Mittel
für diesen
Zweck sind Staurosporin und Cytochalasin B.
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Erfindungsgemäße Bindungsproteine
für vaskulären glatten
Muskel binden an Targets auf der Oberfläche vaskulärer glatter Muskelzellen. Es
wird anerkannt werden, dass spezifische Targets, z.B. Polypeptide oder
Kohlenhydrate, Proteoglycane und ähnliche, die mit den Zellmembranen
vaskulärer
glatter Muskelzellen verbunden sind, zur Auswahl (z.B. durch Klonieren)
oder Konstruktion (z.B. durch gentechnische Verfahren oder chemische
Synthese) geeigneter spezifischer Bindungsproteine für vaskulären glatten
Muskel nützlich sind.
Besonders nützliche "Targets" werden durch die
glatten Muskelzellen aufgenommen, z.B. wenn der Antigenumsatz von
Membranbestandteilen bei der Erneuerung stattfindet. Die Aufnahme
durch Zellen kann auch durch Mechanismen erfolgen, die Phagolysosomen,
Clathrin-beschichtete Pits, Rezeptor-vermittelte Umverteilung oder
Endozytose und ähnliche
umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird solch ein "Target" hier beispielhaft
durch Chondroitinsulfatproteoglycane (CSPGs) vertreten, synthetisiert
durch die vaskulären glatten
Muskelzellen und Pericyten, und ein einzelner Teil (hier Epitop)
des CSPG-Moleküls
mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 250 kD ist besonders
bevorzugt. Dieses 250 kD-Target ist ein N-gekoppeltes Glycoprotein,
das eine Komponente eines größeren 400
kD-Proteoglycankomplexes ist (14). In einer derzeit bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung wird ein Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel durch einen
monoklonalen NR-AN-01-Antikörper
(eine Subkultur von NR-ML-05) breitgestellt, der an ein Epitop in einem
CSPG-Zielmolekül
von vaskulärem
glatten Muskel bindet. Berichten zufolge bindet der NR-ML-05 genannte
Antikörper
an ein 250 kD CSPG, das durch Melanomzellen synthetisiert wird (Morgan
et al., U.S. Patent 4,897,255). Glatte Muskelzellen und Pericyten
synthetisieren Berichten zufolge ebenfalls ein 250 kD CSPG und ebenso
andere CSPGs (11). NR-ML-05-Bindung an glatte Muskelzellen wurde
ebenfalls offenbart (Fritzberg et al., U.S. Patent 4,879,225). Monoklonaler
Antikörper
NR-ML-05 und Unterkultur
NR-ML-05 85-41-41-A2, Gefriercharge # A2106, wurden beide bei der
American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt und haben
die Hinterlegungsnummern HB-5350 bzw. HB-9350 zugewiesen bekommen.
NR-ML-05 ist der Verwandte von Subklon NR-AN-01, der hierin offenbart
ist, und dieser ist strukturell und funktionell zu jenem äquivalent.
Es wird anerkannt werden, dass NR-AN-01 nur ein Beispiel für ein Bindungsprotein
für vaskulären glatten
Muskel ist, das spezifisch an das 400 kD-CSPG-Target bindet, und dass auch andere
Bindungsproteine, die an dieses Target und andere Epitope in diesem
Target binden (14), auch für
die therapeutischen Konjugate und Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Im vorliegenden Fall wurden auch sechs andere monoklonale Maus-Antikörper und
zwei humane chimäre
monoklonale Antikörper
ausgewähl,
wie hierin beschrieben, die spezifisch auf das 250 kD-CSPG vaskulärer glatter
Muskelzellen abzielen. Die Antikörper
scheinen auch durch glatte Muskelzellen nach der Bindung an die
Zellmembran aufgenommen zu werden. Immunreaktivitätsstudien
haben auch die Bindung des murinen MAbs an das 250 kD Antigen in
45 humanen normalen Geweben und 30 verschiedenen Neoplasmen gezeigt,
und einige dieser Ergebnisse wurden bereits offenbart (U.S. Patent
4,879,225). In dieser Offenbarung und anderen humanen klinischen
Studien platzierten sich MAbs, die gegen CSPG-250 kD-Antigen gerichtet
waren, in vivo an vaskulären
glatten Muskelzellen. Ferner wird anerkannt werden, dass die Aminosäurereste,
die in der kinetischen Mehrpunktassoziation der monoklonalen NR-AN-01-Antikörper mit
einem CSPG-Markerantigenepitop
beteiligt sind (d.h. die Aminosäuren,
aus denen sich die Komplementaritäts-bestimmenden Regionen zusammensetzen),
durch computergestützte
molekulare Modellierung bestimmt werden und durch die Verwendung
von Mutanten, die eine geänderte
Antikörperbindungsaffinität besitzen.
Diese Aminosäuren
der Bindungsstelle und das dreidimensionale Modell des NR-AN-01
Antigenbindungsorts dienen als molekulares Modell zur Konstruktion
funktioneller Äquivalente,
z.B. kurzer Polypeptide ("Minimalpolypeptide"), die eine Bindungsaffinität für CSPG haben,
das durch vaskuläre glatte
Muskelzellen und Pericyten synthetisiert wird.
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In
einer derzeit bevorzugten Ausführungsform
zur Behandlung von Stenose nach gefäßchirurgischen Verfahren, z.B.
PTCA, besitzen ausgewählte
Bindungsproteine, z.B. Antikörper
oder Fragmente, zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung eine Bindungsaffinität von > 104 Liter/Mol
für das
250 kD CSPG von vaskulärem
glatten Muskel, und auch die Fähigkeit,
an glatte Muskelzellen oder Pericyten zu binden und von diesen aufgenommen
zu werden.
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Die
dreidimensionale Modellierung ist auch nützlich, um andere funktionelle Äquivalente
zu konstruieren, die die Bindung von NR-AN-01 an sein antigenes
Epitop nachahmen, z.B. "mimetische" chemische Verbindungen,
die die dreidimensionalen Aspekte von NR-AN-01-Bindung an sein Epitop
in einem CSPG Zielantigen nachahmen. Wie hier verwendet bezieht
sich "Minimalpolypeptid" auf eine Aminosäuresequenz
von mindestens sechs Aminosäuren
Länge.
Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff "mimetisch" auf ein organisches chemisches Polymer,
das so konstruiert ist, dass es den geeigneten Zwischenraum für die Bindung
an die Aminosäuren
von z.B. NR-AN-01-CSPG-Target
erreicht, das durch vaskuläre
glatte Muskelzellen oder Pericyten synthetisiert wurde.
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Es
wird anerkannt werden, dass die Erfinder auch den Nutzen humaner
monoklonaler Antikörper
oder "humanisierter" Mausantikörper als
Bindungsprotein für
vaskulären
glatten Muskel in therapeutischen Konjugaten ihrer Erfindung vorschlagen.
Zum Beispiel kann ein monoklonaler Mausantikörper "chimärisiert" werden, indem die
Nukleotidsequenz, welche die murine Fv-Region (d.h. die die Antigenbindungsstellen
enthält)
mit einer Nukleotidsequenz, die für eine humane konstante Domänenregion
und eine Fc-Region codiert, genetisch rekombiniert wird, z.B. auf ähnliche
Weise wie in der europäischen
Patentanmeldung
EP
0,411,893 A2 offenbart. Es ist erkennbar, dass humanisierte
Bindungspartner für
vaskuläre
glatte Muskelzellen den Vorteil besitzen, die Immunoreaktivität des Antikörpers oder
Polypeptids im Wirtsempfänger
zu senken, was nützlich
sein kann, um dabei in vivo die Halbwertszeit zu erhöhen und
die Möglichkeit
schädlicher
Immunreaktionen zu senken.
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Ebenfalls
werden als nützliche
Bindungspeptide für
Retarddosierungsformen für
Restenosebehandlung der vorliegenden Erfindung jene vorgeschlagen,
die im interzellulären
Stroma oder der Matrix lokalisiert sind, die sich zwischen und unter
den vaskulären
glatten Muskelzellen befinden. Solche Bindungspeptide transportieren
das therapeutische Mittel zu dem Interstitium zwischen den Zielzellen.
Das therapeutische Mittel wird in die interstitiellen Räume zur
anschließenden
Aufnahme durch die vaskulären
glatten Muskelzellen freigesetzt. Bevorzugte Bindungspeptide dieses
Typs binden an Epitope auf Kollagen, extrazellulären Glycoproteinen wie Tenascin,
Reticulum und elastischen Fasern, Cytokeratin und anderen intrazellulären Matrixkomponenten.
Minimalpeptide, mimetische organische chemische Verbindungen, humane
oder humanisierte monoklonale Antikörper und ähnliche, die zum intrazellularen
Stroma und der Matrix transportiert werden, sind auch als Bindungspeptide
in dieser Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung nützlich.
Diese Bindungspeptide können
gemäß bekannter
Techniken identifiziert und konstruiert oder isoliert werden. In
bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung bindet das interstitielle Matrixbindungsprotein
an ein Zielepitop mit einer Bindungskon stante von mindestens 10–4 M.
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Nützliche
Bindungspeptide für
erfindugnsgemäße Ausführungsformen
der Krebsbehandlung umfassen jene, die an Zellmembran- und zytoplasmatische
Epitope von Krebszellen binden und ähnliche. Diese Bindungpeptide
werden zur Oberflächenmembran
von intakten Zellen bzw. internen Epitopen von zerstörten Zellen
transportiert, und sie transportieren das therapeutische Mittel
für die
Aufnahme in die Zielzellen. Minimalpeptide, mimetische organische
Verbindungen und humane oder humanisierte Antikörper, die zu den entsprechenden
Tumorzelltypen transportiert werden, sind ebenfalls als erfindungsgemäße Bindungspeptide
nützlich. Solche
Bindungspeptide können
entsprechend bekannter Techniken identifiziert und konstruiert oder
isoliert werden. Bevorzugte Bindungsproteine dieser Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung binden an ein Zielepitop mit einer Bindungskonstante
von mindestens ungefähr
10–6 M.
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Bindungspeptide
für Membran-
und zytoplasmatische Epitope und ähnliche, die zu Immunsystem-vermittelten
Krankheitseffektorzellen, z.B. Zellen des lymphoretikularen Systems,
transportiert werden, sind ebenfalls nützlich, um Retarddosierungsformen
der vorliegenden Erfindung zu verabreichen. Das therapeutische Mittel
wird zu Zielzellen für
dessen Aufnahme in diese mittels solcher Retarddosierungsformen
transportiert. Minimalpeptide, mimetische organische Verbindungen
und humane oder humanisierte Antikörper, welche zu den entsprechenden
Effektorzelltypen transportiert werden, sind ebenfalls nützlich als
Bindungspeptide der vorliegenden Erfindung. Solche Bindungspeptide
können
entsprechend bekannter Techniken identifiziert und kontruiert oder
isoliert werden. Bevorzugte Bindungspeptide dieser Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung binden an ein Zielepitop mit einer Bindungskonstante
von mindestens 10–6 M.
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Andere
bevorzugte Bindungsproteine oder -peptide, die in der Durchführung der
vorliegenden Erfindung nützlich
sind, enthalten Gruppierungen, die in der Lage sind, zu pathologisch
proliferierenden normalen Geweben transportiert zu werden, wie etwa
Pericyten der intraokularen Gefäße, die
an regenerativer Augenerkrankung beteiligt sind. Das therapeutische
Mittel wird in Zielzellen zu dessen Aufnahme in diese mittels solcher
Retarddosierungsformen verabreicht. Minimalpeptide, mimetische organische
Verbindungen und humane oder humanisierte Antikörper, die an die entsprechenden
pathologisch proliferierenden normalen Zelltypen transportiert werden,
sind auch als Bindungspeptide der vorliegenden Erfindung nützlich.
Diese Bindungspeptide können
gemäß bekannten
Techniken identifiziert und konstruiert oder isoliert werden. Bevorzugte
Bindungspeptide dieser Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung binden an ein Zielepitop mit einer Bindungskonstante
von mindestens ungefähr
10–6 M.
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Repräsentative "Kopplungs"-Verfahren zum Verknüpfen des
therapeutischen Mittels durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen
mit dem Bindungsprotein für
vaskuläre
glatte Muskulatur umfassen chemische Verknüpfungen und heterobifunktionelle
Verknüpfungs-
(„Crosslinking")-verbindungen (d.h. "Linker"), die unter Bildung
einer Bindung zwischen reaktiven Gruppen (wie etwa Hydroxyl-, Amino-,
Amido- oder Sulfhydrylgruppen) in einem therapeutischen Mittel und
anderen reaktiven Gruppen (ähnlicher
Natur) im Bindungsprotein für vaskuläre glatte
Muskulatur reagieren. Diese Bindung kann z.B. eine Peptidbindung,
eine Disulfidbindung, eine Thioesterbindung, eine Amidbindung, eine
Thioetherbindung und ähnliches
sein. In einem veranschaulichenden Beispiel sind Konjugate monoklonaler
Antikörper
mit Arzneimitteln von Morgan und Foon zusammengefasst (Monoclonal
Antibody Therapy to Cancer: Preclinical Models and Investigations,
Basic and Clinical Tumor Immunology, Ausg. 2, Kluwer Academic Publishers,
Hingham, MA) und von Uhr, J. of Immunol. 133: i-vii, 1984). Ein
anderes veranschaulichendes Beispiel, bei dem das Konjugat ein radionukleides
zytostatisches Mittel enthält,
U.S. Patent 4,897,255, Fritzberg et al., auf das hierin expressis
verbis Bezug genommen wird, ist instruktiv im Hinblick auf Kopplungsverfahren,
die nützlich
sein könnten.
In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform enthält das therapeutische
Konjugat ein Bindungsprotein für
vaskulären
glatten Muskel, das kovalent an ein Trichothecen-Arzneimittel gebunden
ist. In diesem Fall kann die kovalente Bindung der Kopplung zwischen
einer oder mehreren Amino-, Sulfhydryl- oder Carboxylgruppen des
Bindungsproteins und a) dem Trichothecen selbst; b) einer Trichothecen-Hemisuccinatcarbonsäure; c)
einem Trichothecen-Hemisuccinat (HS)-N-hydroxysuccinimidatester; oder d) Trichothecenkomplexen
mit Poly-L-lysin oder irgend einem polymeren Träger gebildet sein. Repräsentative
Beispiele für
Kopplungsverfahren zur Herstellung therapeutischer Konjugate, welche
ein therapeutisches Trichothecenmittel enthalten, sind in den U.S.
Patenten 4,906,452 und 4,744,981 beschrieben. Andere Beispiele,
die ein Hydrazid zur Bildung einer Schiff'schen Basenkopplung zwischen Bindungsproteinen
und Trichothecenen verwenden, sind in der anhängigen U.S. Patentanmeldung 07/415,154
offenbart.
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Die
Auswahl des Kopplungsverfahrens wird durch die Auswahl des Bindungsproteins
oder -peptids für vaskulären glatten
Muskel, des Bindungsproteins oder -peptids für intestitielle Matrix und
des therapeutischen Mittels beeinflusst, und auch durch solche physikalischen
Eigenschaften wie z.B. Lagerstabilität und/oder solche biologischen
Eigenschaften wie z.B. Halbwertszeit in Zellen und Blut, interzellulärer Kompartimentierungsweg
und ähnliches.
Zum Beispiel haben in einem derzeit bevorzugten therapeutischen
Konjugat Hemisuccinatkonjugate des therapeutischen Roridin A-Mittels
eine längere
Serumhalbwertszeit als jene von Verrucarin A, und diese erhöhte Stabilität führt zu einer
signifikant erhöhten
biologischen Aktivität.
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Die
Retard-Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst ein thera peutisches Mittel, das
in einer biologisch nicht-abbaubaren oder bioabbaubaren Polymerstruktur
dispergiert ist. Solche eine Dispersion wird gemäß des Verfahrens, das von Cowsar
et al., "Poly(Lactide-Co-Glycolide)
Mirocapsules for Controlled Release of Steroids", Methods Enzymology, 112: 101-116,
1985; Eldridge et al., "Biodegradable
and Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant
for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level
of Toxin-Neutralizing Antibodies",
Infection and Immunity, 59: 2978-2986, 1991; Cohen et al., "Controlled Delivery
Systems for Proteins Based an Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres", Pharmaceutical
Research, 8(6): 7113-720, 1991; und Sanders et al., "Controlled Release
of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide)
Microspheres", J.
Pharmaceutical Science, 73(9): 1294-1297, 1984, beschrieben wurde, durchgeführt.
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Der
physikalische und chemische Charakter der Retarddosierungsform der
vorliegenden Erfindung ist verschiedenen alternativen Anbringungsarten
an Bindungsproteinen oder -peptiden zugänglich. Dosierungsformen (Retardtyp)
der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, an Bindungsproteine/-peptide
z.B. durch kovalente Bindungen, intermediäre Ligandensandwichanlagerung
oder nicht-kovalente Adsorption oder partiellen Einschluss zu binden.
Wenn die bevorzugten Polylaktid-/glycolid-Partikel mit dem darin
dispergierten therapeutischen Mittel gebildet werden, ist das ungeladene
Polymer-Rückgrat
sowohl einwärts
orientiert (mit dem darin enthaltenen quasilipophilen therapeutischen
Mittel) als auch auswärts
entlang einem Großteil
der terminalen Carboxylgruppen. Diese Oberflächencarboxylgruppen können als
kovalente Bindungsstellen (z.B. durch ein Carbodiimid aktiviert)
für nukleophile
Gruppen des Bindungsproteins/-peptids dienen. Solche nukleophilen Gruppen
enthalten Lysin-epsilonaminogruppen (Amidbindung), Serinhydroxylgruppen
(Esterbindung) oder Cysteinmercaptangruppen (Thioesterbindung).
Reaktionen mit bestimmten Gruppen sind vom pH-Wert und dem Reduktionszustand
der Reaktionsbedingungen abhängig.
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Zum
Beispiel werden Polymilchsäure-/Glycolsäurepartikel,
die terminate Carbonsäuregruppen
aufweisen, mit N-Hydroxybenztriazol in Gegenwart von wasserlöslichem
Carbodiimid der Formel R-N=C=N-R' zur Reaktion
gebracht (wobei R eine 3-Dimethylaminopropylgruppe oder ähnliches
ist und R' eine
Ethylgruppe oder ähnliches
ist). Die Benztriazol-derivatisierten Partikel (d.h. aktivierte
Imidat-tragende Gruppierungen) werden dann mit einer nukleophilen
Protein-/Peptidgruppe
zur Reaktion gebracht, wie etwa einer verfügbaren Epsilon-Aminokomponente.
Alternativ dazu sind p-Nitrophenol, Tetrafluorphenol, N-Hydroxysuccinimid
oder ähnliche
Moleküle
nützlich,
um einen aktiven Ester mit den terminalen Carboxylgruppen der Polymilchsäure-/Glycolsäurepartikel
in Gegenwart von Carbodiimid zu bilden. Andere nukleophile Bindungsprotein-/peptidgruppen umfassen
Hydroxylgruppen von Serin, endogene freie Thiole von Cystein, Thiolgruppen
aus der Reduktion von Bindungsprotein-/-peptiddisulfidbrücken unter Verwendung von Reduktionsmitteln,
die zu diesem Zweck allgemein verwendet werden (z.B. Cystein, Dithiotreitol,
Mercaptoethanol und ähnliche)
und ähnliche.
Zusätzlich sind
die terminalen Carboxygruppen der Polymilchsäure-/-glycolsäurepartikel
aktivierbar durch Reaktion mit Thionylchlorid, unter Bildung einer
Acrylchlorid-derivatisierten Gruppe. Die derivatisierten Partikel
werden dann mit nukleophilen Bindungspeptid-/-proteingruppen zur Reaktion gebracht,
unter Bildung von erfindungsgemäßen zielgerichteten
Dosierungsformen.
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Die
direkte Konjugation bzw. Verbindung von Retarddosierungsform und
Bindungsprotein oder -peptid kann die Erkennung zwischen Bindungsprotein/-peptid und Zielzellen
zerstören.
Ligandensandwich-Anheftungstechniken sind nützliche Alternativen, um eine
Retarddosierungsform-Bindungsprotein/-peptid-Anheftung zu erreichen. Solche
Techniken umfassen die Bildung einer primären Peptid- oder Proteinhülle unter
Verwendung eines Proteins, das an die Zielzellpopulation nicht bindet.
Das Bindungsprotein/-peptid wird dann an die primäre Peptid-
oder Proteinhülle
gebunden, um den daraus hervorgehenden Partikel mit funktionellem Bindungsprotein/-peptid
bereitzustellen. Ein beispielhafter Ligandensandwichansatz umfasst
das kovalente Binden von Avidin oder Streptavidin an die Partikel
durch funktionelle Gruppen, wie sie oben in Bezug auf den "direkten" Bindungsansatz beschrieben
sind. Das Bindungsprotein oder Peptid wird derivatisiert, bevorzugt
minimal, mit funktionalisiertem Biotin (z.B. durch aktiven Ester,
Hydrazid, Iodacetal, Maleimidyl oder ähnliche funktionelle Gruppen).
Liganden (d.h. Bindungspeptid oder -proteinfunktionalisiertes Biotin)-Bindung
an den verfügbaren
Biotinbindungsstellen der primären
Avidin/Streptavidin-Proteinhülle
erfolgt durch die Verwendung einer gesättigten Menge von biotinyliertem
Protein/Peptid.
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Beispielsweise
werden Polymilchsäure-/-glycolsäurepartikel,
die terminale Carbonsäuregruppen
aufweisen, mit Carbodiimid aktiviert und anschließend mit
Avidin oder Streptavidin zur Reaktion gebracht. Das Bindungsprotein
oder -peptid wird mit Biotinamidcaproat-N-hydroxysuccinimidester
bei einem 1-3 molaren Anbieten einer biotinhaltigen Verbindung zu
dem Bindungsprotein/-peptid
zur Reaktion gebracht, um ein biotinyliertes Bindungsprotein/-peptid
zu bilden. Ein molarer Überschuss
des biotinylierten Bindungsprotein/-peptids wird mit den Avidin-derivatisierten
Partikeln inkubiert, um eine zielgerichtete Dosierungsform der vorliegenden Erfindung
zu bilden.
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Alternativ
werden die Partikel- Carboxygruppen biotinyliert (z.B. durch Carbodiimidaktivierung
der Carboxygruppe und anschließende
Reaktion mit Aminoalkylbiotinamid). Die biotinylierten Partikel
werden dann mit einer gesättigten
Konzentration (d.h. molarem Überschuss)
an Avidin oder Streptavidin inkubiert, um proteinbeschichtete Partikel
zu bilden, die freie Biotinbindungsstellen auf weisen. Diese beschichteten
Partikel sind dann zu einer Reaktion mit einem molaren Überschuss
eines biotinylierten Bindungsproteins in der Lage, das wie oben
beschrieben gebildet ist. Eine andere Option umfasst ein Avidin-
oder Streptavidin-gebundenes Bindungsprotein oder eine Proteinbindung
mit biotinylierten Partikeln.
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Zusätzlich kann
die Bindungsprotein/-peptid-Partielanheftung durch Adsorption des
Bindungspeptids an dem Partikel erreicht werden, was aus dem nichtionischen
Charakter des teilweise freiliegenden Polymerrückgrats des Partikels folgt.
Unter Bedingungen hoher Ionenstärke
(z.B. 1,0 molares NaCl) sind Wasserstoff und hydrophobe partikelbindende
Protein/Peptidbindung bevorzugt.
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Außerdem kann
das Bindungsprotein/-peptid teilweise in der Partikelpolymermatrix
nach deren Bildung eingeschlossen werden. Unter diesen Umständen sorgt
das so eingeschlossene Bindungsprotein/-peptid für den selektiven Restbindungscharakter
an dem Partikel. Milde Partikelbildungsbedingungen, wie jene, die von
Cohen et al., Pharmaceutical Research, 8: 713-720 (1991) verwendet
werden, sind für
diese Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Dieses eingeschlossene Bindungsprotein
ist auch in der Neuanheftung eines teilweise abgebauten Partikels
nützlich,
das eine Exozytose durchgemacht hat. Andere polymere Partikeldosierungsformen
(z.B. nicht-bioabbaubare Dosierungsformen), die unterschiedliche
freiliegende funktionelle Gruppen aufweisen, können an Bindungsproteine oder
-peptide gemäß den oben
diskutierten Prinzipien gebunden werden.
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Beispielhafte
nicht-bioabbaubare Polymere, die in der Durchführung der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind, sind Polystyrole, Polypropylene, Styrolacrylcopolymere und ähnliche.
Solche nicht-bioabbaubaren Polymere umfassen funktionelle Gruppen
zum Anhängen
von Bindungsprotein/-peptid, einschließlich Carbonsäuregruppen,
aliphatische primäre
Aminogruppen, aromatische Aminogruppen und Hydroxylgruppen, oder sie
können
so derivatisiert werden, dass sie diese umfassen.
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Funktionelle
Carbonsäuregruppen
werden mit dem Bindungsprotein oder peptid gekoppelt, zum Beispiel
unter Verwendung der Reaktionsmechanismen, wie sie oben für bioabbaubare
Polymilchsäure/-glycolsäure-Polymerpartikel-
Dosierungsformen ausgeführt
sind. Zusätzlich
können
primäre
Aminogruppen mit Cyanogenbromid aktiviert werden und mit primären Aminogruppen
des Bindungsproteins/-peptids Guanidinbindungen bilden. Aromatische
funktionelle Aminogruppen werden zum Beispiel mit salpetriger Säure diazotiert, unter
Bildung von Diazoniumgruppierungen, die mit Bindungsprotein/-peptidtyrosinen
reagieren, unter Bildung einer Diazobindung zwischen dem nicht-bioabbaubaren
Partikel und dem Bindungsprotein/-peptid. Funktionelle Hydroxylgruppen
werden mit den primären
Aminogruppen des Bindungsproteins/-peptids z.B. dadurch gekoppelt,
dass die Hydroxylkomponente in eine terminale funktionelle Carbonsäuregruppe
umgewandelt wird. Eine solche Umwandlung kann z.B. durch Reaktion
mit Chloressigsäure
erreicht werden, gefolgt durch Reaktion mit Carbodiimid. Sandwich-,
Adsorptions- und Einschlusstechniken, wie sie oben in Bezug auf
bioabbaubare Partikel diskutiert sind, sind auf analoge Weise auf
nicht-bioabbaubare Partikel-Bindungsprotein/-peptidfixierung anwendbar.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Zielausrichtung für
potenziell proliferierende Zellen spezifisch, die in vergrößertem glatten
Muskel in der Intimaregion einer verletzten Gefäßstelle entstehen, z.B. infolge
Angioplastie, z.B. Pericyten und vaskuläre glatte Muskelzellen. Aspekte
der Erfindung beziehen sich auf therapeutische Modalitäten, bei
denen das therapeutische Konjugat der Erfindung verwendet wird,
um Proliferation glatter Muskelzellen nach Angioplastie, z.B. PTCA,
Atherektomie und perkutaner transluminaler Coronarrotationatheroblation
zu verzögern,
zu reduzieren oder zu beseitigen.
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Retarddosierungsformen
einer Ausführungsform
der Erfindung müssen
nur in einer antiproliferativen therapeutischen Dosierung verabreicht
werden, die ausreicht, um die proximalen (6 bis 9) Zelllagen der
glatten Tunica media Muskelzellen, die das Lumen begleiten, der
Dosierungsform auszusetzen. Die Dosierung ist empirisch bestimmbar,
z.B. durch a) Infundieren von Gefäßen aus geeigneten Tiermodellsystemen
unter Verwendung immunohistochemischer fluoreszenter oder elektronenmikroskopischer
Verfahren zum Erfassen der Dosierungsform und von deren Wirkungen;
und b) Durchführen
geeigneter in vitro Studien.
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In
einem repräsentativen
Beispiel wird diese therapeutisch wirksame Dosis erreicht, indem
in einer Gewebekultur glatter Muskelzellen die perizelluluäre Mitteldosis
bestimmt wird, was bei kontinuierlicher Exposition zu einer therapeutischen
Wirkung zwischen toxischen und minimal wirksamen Dosierungen führt. Dieser therapeutische
Spiegel wird an vivo erreicht, indem die Größe, Anzahl und die Konzentration
und Freisetzungsrate des therapeutischen Mittels bestimmt wird,
die für
Partikel erforderlich ist, die zwischen die glatten Muskelzellen
der Arterienwand infundiert wird, um diese perizelluluäre therapeutische
Dosis aufrecht zu erhalten. Die Dosierungsform sollte das therapeutische
Mittel mit einer Rate freisetzen, die ungefähr der perizellulären Dosis
der folgenden beispielhaften therapeutischen Mittel entspricht:
von ungefähr
0,01 bis ungefähr
100 Mikrogramm/ml Nitroglycerin, von ungefähr 1,0 bis ungefähr 1000
Mikrogramm/ml Suramin, von ungefähr 0,001
bis ungefähr
100 Mikrogramn/ml Cytochalasin, und von ungefähr 0,1 bis ungefähr 105 Nanogramm/ml Staurosporin.
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Es
wird vom Fachmann anerkannt werden, dass die erwünschten therapeutisch wirksamen
Dosierungen der erfindungsgemäßen Retarddosierungsformen
von verschiedenen Faktoren abhängig
sind, einschließlich
z.B.: a) Bindungsaffinität
des Bindungsproteins, das der Dosierungsform zugeordnet ist; b)
Atmosphärendruck
und Dauer der Infusion; c) Zeit, über die die verabreichte Dosierungs form
an dem Zielort verbleibt; d) Rate der Freisetzung des therapeutischen
Mittels aus der Partikeldosierungsform; e) Natur des verwendeten therapeutischen
Mittels; f) Natur der Verletzung und/oder der gewünschten
Therapie; und/oder g) interzellulären und/oder intrazellulären Lokalisierung
der Partikeldosierungsform. Ein Fachmann, die bezüglich der
Verabreichung von Medikamenten mit therapeutisch wirksamen Dosierungen
ausgebildet ist (z.B. durch Überwachung
der Spiegel therapeutischer Mittel und Beobachten der klinischen
Wirkungen bei Patienten) sind in der Lage, die optimale Dosierung
für einen
einzelnen Patienten auf der Basis von Erfahrung und professioneller Beurteilung
zu bestimmen.
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Es
wird auch anerkannt werden, dass die Auswahl eines therapeutischen
Mittels, das seine Wirkungen intrazellulär entfaltet, z.B. auf Ribosomen-
oder DNA-Stoffwechsel,
die Dosierung und die Zeit beeinflusst, die erforderlich sind, um
eine therapeutisch wirksame Dosis zu erreichen, und dass dieser
Prozess in vitro und in Tierstudien im Modell nachgestellt werden
kann, wie etwa jenen, die in den unten bereitgestellten Beispielen beschrieben
sind, um den Konzentrationsbereich herauszufinden, über den
das therapeutische Konjugat oder die Dosierungsform verabreicht
werden sollte, um ihre Wirkungen zu entfalten, eine Restenose nach
Angioplastie zu verzögern,
zu vermindern oder zu verhindern. Zum Beispiel sind therapeutische
Konjugate, die mit alpha-, beta- oder gamma-Strahlern bekannter spezifischer Aktivitäten radioaktiv
markiert sind (z.B. Millicurie pro Millimol oder Milligramm Protein)
nützlich,
um die therapeutisch wirksame Dosierung zu bestimmen, und zwar indem
diese in Tierstudien und in Humanversuchen verwendet werden, mit
quantitativer Bildauswertung oder Autoradiographie histologischer
Gewebeschnitte, um die Konzentration des therapeutischen Konjugats zu
bestimmen, die für
das therapeutische Protokoll erforderlich ist. Eine therapeutisch
wirksame Dosis des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform
wird erreicht, wenn zumindest drei Bedingungen erfüllt sind: nämlich (1)
das therapeutische Konjugat oder die Dosie rungsform wird an die
intimalen Schichten des traumatisch verletzten Gefäßes geliefert;
(2) das therapeutische Konjugat oder die Dosierungsform wird innerhalb
des gewünschten
intrazellulären
Kompartiments der glatten Muskelzellen verteilt; d.h. im Kompartiment,
das zur Wirkung des therapeutischen Mittels erforderlich ist, oder
das therapeutische Mittel, das extrazellulär von der Dosierungsform freigesetzt
wird, wird innerhalb des relevanten intrazellulären Kompartiments verteilt;
und (3) das therapeutische Mittel hemmt die gewünschte zelluläre Aktivität der vaskulären glatten
Muskelzelle, z.B. Proliferation, Migration, vergrößertes Zellvolumen,
Matrixsynthese, Zellkonzentration und ähnliche, wie oben beschrieben.
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Zusätzlich kann
ein zweites irrelevantes Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel einem Patienten
verabreicht werden, bevor ihm ein Stent verabreicht wird, um die
unspezifische Bindung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform
an Gewebe zu vermindern. In einer bevorzugten Ausführungsform kann
das irrelevante Bindungsprotein ein Antikörper sein, welcher nicht über antigenspezifische
Bindung an Stellen im Patienten bindet, sondern stattdessen auf
unspezifische Weise bindet, z.B. durch Fc-Rezeptor-bindende reticuloendotheliale
Zellen, Asialorezeptorbindung, und durch Bindung an Ubiquitinexprimierende
Zellen. Der irrelevante "Blocker" vermindert die unspezifische
Bindung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform und
vermindert daher Nebenwirkungen, z.B. Gewebetoxzität, die mit
der Verwendung des therapeutischen Konjugats oderder Dosierungsform
einhergehen. Der irrelevante "Blocker" wird vorteilhafterweise
5 Minuten bis 48 Stunden, insbesondere bevorzugt 15 Minuten bis
eine Stunde vor Verabreichung des therapeutischen Konjugats oder
der Dosierungsform verabreicht, obwohl die Zeitspanne in Abhängigkeit
von dem therapeutischen Konjugat und dem Weg oder der Methode der
Injektion unterschiedlich sein kann. Repräsentative Beispiele irrelevanter "Blocker" umfassen Antikörper, die
mit Humangewebe und Rezeptoren nicht reagieren, oder zelluläre und Serum-Proteine,
die aus tierischen Quellen präpariert
sind, so dass bei Tests herausgefunden wird, dass sie nicht in spezifischer Weise
(z.B. mit Ka < 103 M–1) an humane Zellmembranziele binden.
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Es
wird anerkannt werden, dass die erfindungsgemäßen Stents nicht auf die Verwendung
für die
Therapie nach Angioplastie beschränkt sind; vielmehr wird die
Nützlichkeit
der therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen durch ihre Fähigkeit
bestimmt, zelluläre
Aktivitäten
glatter Muskelzellen und Pericyten in der Gefäßwand zu inhibieren. Somit
umfassen andere Aspekte der Erfindung therapeutische Konjugate und
Dosierungsformen und Protokolle, die bei einem frühen therapeutischen
Eingriff für
die Verminderung, Verzögerung
oder Ausmerzung (oder sogar Umkehrung) atherosklerotisches Plaques
und Bereiche von Gefäßwandhypertrophie
nützlich
sind. Therapeutische Konjugate und Dosierungsformen der Erfindung
finden auch eine Anwendung bei einem frühen Eingriff bei präatherosklerotischen
Bedingungen, z.B. sind sie bei Patienten nützlich, die ein hohes Risiko
für die
Entwicklung von Atherosklerose und/oder Vorzeichen von Hypertension
aufweisen, als Ergebnis von atherosklerotischen Veränderungen
in Gefäßen oder
Gefäßstenose
aufgrund einer Hypertrophie der Gefäßwand.
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Zum
Beispiel können
in einer anderen Ausführungsform
der Erfindung die Stents in Situationen verwendet werden, in denen
Angioplastie nicht ausreicht, um eine verstopfte Arterie zu öffnen, wie
in jenen Situationen, die das Einsetzen eines intravaskulären Stents
erfordern. In dieser Ausführungsform
der Erfindung wird ein metallischer, Kunststoff- oder bioabbaubarer
intravaskulärer
Stent verwendet, der ein therapeutisches Mittel umfasst, wie in
Anspruch 1 definiert.
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Der
Stent umfasst bevorzugt eine bioabbaubare Beschichtung oder eine
poröse
oder permeable nicht-bioabbaubare Beschichtung, die das therapeutischen
Mittel umfasst. Eine bevorzugtere Ausführungsform der Erfindung ist
ein beschichteter Stent, wobei die Beschichtung eine Retarddosierungsform
des therapeutischen Mittels aufweist. In einer alternativen Ausführungsform
kann der biologisch abbaubbare Stent auch mit dem therapeutischen
Mittel imprägniert
sein, d.h. die Stentmatrix.
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Ein
bioabbaubarer Stent mit dem darin imprägnierten therapeutischen Mittel,
der außerdem
mit einer bioabbaubaren Beschichtung oder mit einer porösen nicht-bioabbaubaren Beschichtung
beschichtet ist, in der die Retarddosierungsform des therapeutischen
Mittels dispergiert ist, ist auch eine Ausführungsform der Erfindung. Dieser
Stent kann eine differentielle Freisetzungsrate des therapeutischen
Mittels bereitstellen, d.h. es kann eine schnellere Freisetzung
des therapeutischen Mittels von der Beschichtung vorliegen, gefolgt
durch eine verzögerte
Freisetzung des therapeutischen Mittels, das in die Stentmatrix
imprägniert
ist, bei der Zersetzung der Stentmatrix. Bevorzugt ist in dieser
Ausführungsform
der Erfindung das therapeutische Mittel in der Beschichtung ein
Cytochalasin oder Taxol und insbesondere bevorzugt Cytochalasin
B oder Taxol oder deren Analoga, die funktionell äquivalent
sind. Der intravaskuläre
Stent stellt somit ein mechanisches Mittel bereit, um für einen
vergrößerten Lumeninhalt
eines Gefäßes zu sorgen,
zusätzlich
zu dem, was über
die biologische Stentingwirkung des zytoskelettalen Inhibitors erreicht
wird, wie Cytochalasin B oder Taxol, das freisetzbar darein eingebettet
ist.
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Weiterhin
kann das Einsetzen intravaskulärer
Stents, die ein therapeutisches Mittel umfassen, das ein Inhibitor
der Proliferation glatter Muskelzellen ist, eine erhöhte Wirksamkeit
bieten, indem die intimale Proliferation vermindert oder verhindert
wird. Daher ist auch ein Stent, der außerdem ein Cytochalasin aufweist,
um die Proliferation und Migration von Pericyten zu inhibieren,
die sich in glatte Muskelzellen umwandeln und zur Intimaverdickung
beitragen können,
eine Ausführungsform
der Erfindung. Diese Inhibierung der intimalen glatten Muskelzellen
und des Stromas, das durch den glatten Muskel und die Pericyten
produziert wird, kann eine schnellere und eine vollständigere
Reendothelialisierung nach der Platzierung des vaskulären Stents
im Gefäß ermöglichen.
Die erhöhte
Rate der Reendothelisierung und Stabilisierung der Gefäßwand nach
dem Einsetzen des Stents kann den Verlust an Lumeninhalt und den
verminderten Blutdurchfluss reduzieren, welcher die primäre Ursache
für Fehler
bzw. Fehlfunktionen bei vaskulären
Stents ist.
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Bevorzugt
sind in der Durchführung
dieser Ausführungsform
der Erfindung die bioabbaubaren Mikropartikel, die das therapeutische
Mittel enthalten, ungefähr
1 bis 50 Mikron groß.
Es ist zudem bevorzugt, dass die Mikropartikel über eine Dauer von 30 bis 120
Tagen biologisch abgebaut werden, wobei in die Tunica media und
intima eine dauerhafte zelluläre
Konzentration von ungefähr
0,05 μg/ml
bis ungefähr
0,25 μg/ml
Cytochalasin B in das Zytosol freigesetzt wird, wodurch eine Diffusion
therapeutischer Spiegel von Cytochalasin B ermöglicht wird, ohne Toxizität für die Zellen,
die der Stent-/Gefäßwandfläche benachbart
sind.
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Die
therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen der Erfindung können auch
in therapeutischen Modalitäten
für die
Verstärkung
des Neuwachstums von endothelialen Zellen in verletzten vaskulären Geweben
und bei vielen Arten von Wunden einschließlich epithelialen Wunden verwendet
werden. Bei diesen therapeutischen Modalitäten finden die erfindungsgemäßen therapeutischen
Konjugate und Dosierungsformen eine Anwendung bei der Inhibition
der Migration und/oder Proliferation glatter Muskelzellen oder Perizyten. Glatte
Muskelzellen und Perizyten wurden in vitro mit der Produktion von
Faktoren in Verbindung gebracht, die endotheliale Zellproliferatin
inhibieren, und deren Proliferation kann auch zu einer physikalischen
Barriere führen,
um ein kontinuierliches Endothel zu bilden. Daher finden die erfindungsgemäßen therapeutischen
Konjugate und Dosierungsformen eine Anwendung bei der Förderung
von Neoangiogenese und erhöhter
Reendothelialisierung, z.B. während
Wundheilung, Gefäßtransplantaten
und Gefäßchirurgie.
Die Dosierungsformen können
auch therapeutische Modalitäten
ausschütten,
die Reendothelialisierung der zerstörten Gefäßwand stimulieren oder beschleunigen.
Ein beispielhaftes therapeutisches Mittel für diesen Zweck ist vaskulärer Permeabilitätsfaktor.
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Noch
weitere Aspekte der Erfindung beziehen sich auf therapeutische Modalitäten für die Verstärkung der
Wundheilung an einem vaskulären
Ort und für
die Verbesserung der strukturellen und elastischen Eigenschaften
von geheilten Gefäßgeweben.
Bei diesen therapeutischen Modalitäten werden unter Verwendung des
erfindungsgemäßen Konjugats
oder der Dosierungsformen die Stärke
und Qualität
der Heilung der Gefäßwand verbessert,
d.h. unter Inhibieren der Migration und Proliferation von glatten
Muskelzellen oder Perizyten in einer Gefäßwand. Glatte Muskelzellen
an der vaskulären
Wundstelle tragen zum normalen Prozeß Kontraktion der Wundstelle
bei, was die Wundheilung fördert.
Man glaubt derzeit, dass die Migration und Proliferation glatter
Muskelzellen und die Matrixsekretion durch transformierte glatte
Muskelzellen von diesem normalen Prozeß abweichen können und
die strukturellen und elastischen Langzeiteigenschaften des geheilten
Gefäßes stören können. Daher
stellen andere Aspekte der Erfindung therapeutische Konjugate und
Dosierungsformen bereit, die Proliferation und Migration von glatten
Muskelzellen und Perizyten sowie die morphologische Transformation
inhibieren, und die Qualität
des geheilten Gefäßsystems
verbessern.
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Es
ist dem normalen Fachmann bekannt, dass periphere Gefäße, die
für Gefäßimplantate
an anderen peripheren Stellen oder in Coronararterien-Bypassimplantaten
verwendet werden, häufig
aufgrund postchirurgischer Stenose Fehlfunktionen aufweisen. Da
eine Cytochalasin B-Infusion den Gefäßlumeninhalt in chirurgisch
traumatisierten Gefäßen aufgrund
der biologischen Stentingaktivität
aufrechterhalten kann, wird die Verabreichung in diesem Verfahren
die Kontraktionsfähigkeit
des Gefäßes verzögern, was
zu einem größeren Lumeninhalt
führt.
Weiterhin ist es ein Vorteil dieser Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung, dass die Verabreichung von Cytochalasin B auf diese Weise
die Konstruktion oder einen Spasmus verhindert, der häufig auftritt,
nachdem Gefäßimplantate
an ihren beiden proximalen und distalen Steilen anastomisiert wurden,
was zu einer beeinträchtigten
Funktion, wenn nicht dem totalen Aus fall, der Gefäßimplantate
führen
kann. Somit sollte das durch Cytochalasin B hervorgerufene Stenting
des Gefäßes das
Auftreten von Spasmen vermindern, welche innerhalb von einigen wenigen
Tagen bis zu mehreren Monaten nach dem Implantationsverfahren auftreten
können.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine kombinationstherapeutisches
Verfahren bereit, das ein zytozides therapeutisches Konjugat und
ein zytostatisches therapeutisches Mittel umfasst. Das zytozide
Konjugat umfasst einen Bindungspartner (wie ein Protein oder ein
Peptid), der in der Lage ist, sich spezifisch zu vaskulären glatten
Muskelzellen zu lokalisieren, sowie ein aktives Mittel, das in der
Lage ist, diese Zellen abzutöten.
Das zytozide Konjugat wird, bevorzugt intravenös oder durch irgend einen anderen
passenden Weg, verabreicht, begibt sich zu den glatten Ziel-Muskelzellen
und zerstört
proliferierende Zellen, die in stenotische oder restenotische Ereignisse
verwickelt sind. Diese zelluläre
Zerstörung
verursacht die Freisetzung von mitogenen und anderen metabolischen
Ereignissen, wobei wiederum diese Ereignisse im Allgemeinen zur
Proliferation vaskulärer
glatter Muskulatur führen.
Die antiproliferativen oder antikontraktilen Retarddosierungsformen
der vorliegenden Erfindung werden dann verabreicht, bevorzugt durch
einen Infusionskatheter oder irgend eine passende Dosierungsform.
Die Retarddosierungsform verzögert
die Proliferation und/oder Migration und Kontraktion vaskulärer glatter
Muskulatur, um hierdurch den Lumendurchmesser aufrecht zu erhalten.
Diese Behandlungsmethode stellt eine biologische Arteromyoectomie
dar, die in Stenotischen Gefäßen nützlich ist,
die aus Hyperplasie vaskulärer
glatter Muskelzellen und ähnlichem
resultiert.
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Noch
ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf
therapeutische Modalitäten
für die
Aufrechterhaltung eines erweiterten Lumenvolumens nach Angioplastie
oder anderen Gefäßtraumata. Eine
Ausführungsform
dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung umfasst die Verabreichung
eines therapeutischen Mittels, das in der Lage ist, die Kontraktionsfähigkeit
vaskulärer
glatter Muskelzellen zu inhibieren. Beispielhafte Mittel, die in
der Praxis dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
sind jene, die in der Lage sind, zu bewirken, dass eine traumatisierte
Arterie ihren Gefäßtonus verliert,
so dass der normale vaskuläre
hydrostatische Druck (d.h. Blutdruck) das schlaffe Gefäß bis auf
seinen oder bis in die Nähe
seines maximalen physiologischen Durchmesser erweitert. Der Verlust
des Gefäßtonus kann
durch Mittel hervorgerufen werden, die die Bildung oder Funktion
kontraktiler Proteine stören
(z.B. Actin, Myosin, Tropomyosin, Caldesmon, Calponin oder ähnliche).
Diese Störung
kann direkt oder indirekt auftreten, zum Beispiel durch Hemmung der
Calciummodulation, Phosphorylierung oder anderer metabolischer Stoffwechselwege,
die in die Kontraktion vaskulärer
glatter Muskelzellen verwickelt sind.
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Die
Inhibierung der zellulären
Kontraktion (d.h. Verlust des Gefäßtonus') kann über zwei Mechanismen wirken,
um den Grad der vaskulären
Stenose zu vermindern. Zum ersten begrenzt die Hemmung der zellulären Kontraktion über eine
verlängerte
Zeitspanne die Anzahl glatter Muskelzellen, die von der Tunica media
in die Intima wandern, deren Verdickung in luminaler Gefäßstenose
resultiert. Zweitens bewirkt die Hemmung der zellulären Kontraktion,
dass sich die glatte Muskelzellwand unter dem normalen hydrostatischen
Gefäßdruck (d.h.
Blutdruck) entspannt und erweitert. Therapeutische Mittel, wie etwa
Cytochalasine, inhibieren die glatte Muskelzellkontraktion, ohne
die Proteinsynthese aufzuheben, die für traumatisierte, postangioplastische
oder andere chirurgisch oder erkrankungsbedingt beschädigte glatte
Muskelzellen notwendig sind, um sich selbst zu reparieren. Die Proteinsynthese
ist für
die glatten Muskelzellen auch notwendig, um die Matrix abzuscheiden,
die das Lumen in einem Zustand nahe seinem maximalen systolischen
Durchmesser fixiert oder beibehält,
wenn sich die Gefäßläsion stabilisiert
(d.h. ein biologisch induzierter Stentingeffekt).
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Dieser
biologische Stentingeffekt führt
nicht nur zu einem erweiterten Gefäßlumeninhalt und einer erhöhten Blutdurchflussrate
durch das Gefäß, sondern
reduziert auch signifikant das elastische Zurückfedern nach einer Angioplastie.
Das elastische Zurückfedern
ist ein akuter Verschluss des Gefäßes, der mit einem Vasospasmus
oder einer frühen
Relaxation der Muskelwand einhergeht, und zwar aufgrund eines traumatischen
Schocks, der aus dem Überstrecken
des Gefäßes durch
einen Ballonkatheter während
der Angioplastie folgt. Dieser Spasmus der Tunica media, der zur
Verringerung des Lumenquerschnitts führt, kann innerhalb von Stunden,
Tagen oder Wochen nach der Ballondilatatation auftreten, wenn die
Wiederherstellung des Gefäßmuskelwandtonus
geschieht. Jüngere
Beobachtungen während
der mikroskopischen Untersuchung von Atherectomieproben deuten darauf
hin, dass das elastische Zurückfedern
in bis zu 25% der angioplastischen Verfahren auftreten kann, die,
auf der Basis des anfänglichen
Angiogramms nach der Behandlung als erfolgreich klassifiziert wurden.
Weil das biologische Stentingverfahren die Arterienwand nach der
Ballonangioplastie entspannt, kann der Arzt ein zu starkes Aufpumpen
und einen daraus herrührenden
traumatischen Schock als Mittel eliminieren, um den Gefäßspasmus
oder das elastische Zurückfedern
zu vermindern oder zu verzögern.
Das Vermindern oder Eliminieren des zu starken Aufpumpens senkt
die Verletzung der Muskelwand des Gefäßes, um hierdurch die Determinanten
der Glatten-Muskelzellproliferation
in der Intima zu reduzieren und dadurch das Auftreten oder die Ernsthaftigkeit
der Restenose zu reduzieren.
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Das
biologische Stenting setzt auch das Auftreten von Thrombusbildung
herab. Bei Oberschenkelarterien von Schweinen, die mit Cytochalasin
B behandelt wurden, wurde zum Beispiel das Auftreten muraler Mikrothrombi
im Vergleich zu Ballon-traumatisierten Arterien, die nicht mit dem
therapeutischen Mittel behandelt wurden, herabgesetzt. Dieses Phänomen scheint
ein Sekundärnutzen
zu sein, der aus dem verstärkten Blutfluss
durch das traumatisierte Gefäß resultieren
könnte,
wobei der Nutzen durch die Durchführung der vorliegenden Erfindung
erreicht wird.
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Cytochalasine
sind beispielhafte therapeutische Mittel, die in der Lage sind,
einen biologischen Stentingeffekt bei vaskulären glatten Muskelzellen zu
erzeugen. Man glaubt, dass Cytochalasine sowohl die Migration als
auch Kontraktion der vaskulären
glatten Muskelzellen durch Wechselwirkung mit Actin inhibieren. Die
Cytochalasine interagieren mit den Enden des filamentösen Actins,
um die Längung
der Aktinfilamente zu inhibieren. Niedrige Dosen von Cytochalasinen
(z.B. Cytochalasin B) unterbrechen auch die Mikrofilamentnetzwerke
von Actin. In vitro Daten zeigen auch, dass, nachdem die vaskulären glatten
Muskelzellen frei von Cytochalasin B geworden sind, Zellen ausreichend
polymerisiertes Actin regenerieren, um die Migration innerhalb 24
Stunden wieder aufzunehmen. In vivo Untersuchungen zeigen, dass
vaskuläre
glatte Muskelzellen den Gefäßtonus innerhalb
vom 2 bis 4 Tagen wiedergewinnen. Es ist während dieser Erholungsperiode,
in die Wirkung der Festsetzung des Lumendurchmessers und der biologische
Stentingeffekt auftreten.
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Das
therapeutische Mittel kann zielgerichtet werden, wird aber bevorzugt
nach der Angioplastie oder dem anderen traumatischen Ereignis direkt
an das traumatisierte Gefäß verabreicht.
Der biologische Stentingeffekt, z.B. von Cytochalasin B, ist erreichbar
unter Verwendung einer einzigen Infusion des therapeutischen Mittels
in den traumatisierten Bereich der Gefäßwand mit einer Dosierungskonzentration
im Bereich von 0,1 Mikrogramm/ml bis etwa 1,0 Mikrogramm/ml.
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Die
Hemmung der Glatten-Gefäßmuskelzell-Migration
(von der Tunica media zur Intima) ist in dem gleichen Dosierungsbereich
gezeigt worden (Beispiel 11); doch ist ein dauerhaftes Aussetzen
des therapeutischen Mittels auf das Gefäß bevorzugt, um diese antimigratorischen
Wirkungen zu maximieren. Wenn die vaskulären glatten Muskelzellen nicht
in die Intima wandern können,
können
sie dort nicht proliferieren. Sollten vaskuläre glatte Muskelzellen in die
Intima wandern, hemmt eine anschließend verabreichte post-proliferative Retarddosierungs form
die Intimaproliferation. Im Ergebnis kann die erfindungsgemäße Retarddosierungsform, die
ein Cytochalasin oder ein anderes proliferatives therapeutisches
Mittel enthält,
in Kombination mit einem cytochalasinfreien therapeutischen Mittel
verabreicht werden. Auf diese Weise kann der biologische Stentingeffekt
und ein antiproliferativer oder antimigratorischer Effekt in einem
einzigen Verabreichungsprotokoll erreicht werden.
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Mittel,
die in den Protokollen der vorliegenden Erfindung verwendet werden
können,
sind beispielsweise gemäß den folgenden
Verfahren identifizierbar. Ein mögliches
Mittel für
eine Verabreichung als freies Mittel (d.h. nicht zielgerichtet bzw.
ungezielt) zeigt ein oder mehrere der folgenden Eigenschaften:
- (i) es behält
ein erweitertes Lumenvolumen nach Angioplastie (z.B. PTCA, perkutane
transluminale Angioplastie (PTA) oder ähnliche) oder einem anderen
Trauma, einschließlich
Atherektomie (z.B. Rotoblater, Laser und ähnliche); Coronararterien-Bypassbbehandlungen
oder ähnlichem;
oder resultierend von einer Gefäßerkrankung
(z.B. Atherosklerose, sekundäre
Augenerkrankungen auf Gefäßstenose
oder Atropie, stenotische cerebrate Gefäßerkrankungen oder ähnliche);
- (ii) die anfängliche
Zunahme des Gefäßquerschnitts,
durch das Mittel erleichtert, führt
nicht zu einer oder einer betonten chronischen Stenose des Lumens;
- (iii) inhibiert die Zielzellkonzentration oder Migration; und
- (iv) ist zytostatisch.
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Bevorzugt
hat ein hierin verwendetes therapeutisches Mittel alle vier Eigenschaften;
jedoch sind für die
Durchführung
der vorliegenden Erfindung die erste und die dritte wichtiger als
die zweite und die vierte. Beispielsweise wurde Cytochalasin B untersucht,
um die Eignung für
die Verwendung in therapeutischen mittelfreien Protokollen zu bestimmen.
Der biologische Stentingeffekt von Cytochalasin B ist erreichbar
unter Verwendung einer einzigen Infusion des therapeutischen Mittels
in den traumatisierten Bereich der Gefäßwand mit einer Dosiskonzentration
im Bereich von etwa 0,1 Mikrogramm/ml bis etwa 1,0 Mikrogramm/ml.
Ein Mittel, der für
die Retard-Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung nützlich
ist, zeigt ein oder mehrere der folgenden Eigenschaften:
- (i) es hält
ein erweitertes Lumenvolumen nach Angioplastie (z.B. PTCA, perkutaner
transluminaler Angioplastie (PTA) oder ähnliche) oder einem anderen
Trauma, einschließlich
Atherectomie (z.B. Rotoblater, Laser und ähnliche); Coronararterien-Bypassbehandlungen
oder ähnlichem;
oder einer Gefäßerkrankung
resultierend (z.B. Atherosklerose, sekundäre Augenerkrankungen auf Gefäßstenose
oder Atropie, stenotische cerebrale Gefäßerkrankungen oder ähnliche);
- (ii) hemmt die Targetzellproliferation (z.B. 5 Minuten und 24
Stunden nach der Aussetzen gegenüber
dem Mittels, glatte Gefäßmuskelgewebekulturen
demonstrieren in vitro einen Hemmspiegel von 3H-Thymidinaufnahme
und zeigen bevorzugt eine relativ geringe Hemmung der 3H-Leucinaufnahme);
- (iii) produziert bei einer Dosis, die zur Hemmung der DNA-Synthese
ausreicht, nur milde bis mäßige (z.B. Grad
2 oder 3 in den unten beschriebenen Assays) morphologische zytotoxische
Effekte;
- (iv) hemmt die Zielzellkonzentration; und
- (v) ist zytostatisch.
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Bei
der Identifizierung eines therapeutischen Mittels, das ein oder
mehrere der vorstehenden Eigenschaften zeigt, wird das Mittel einem
zweiten Testprotokoll unterzogen, welches es umfasst, vaskuläre glatte Muskelzellen
dem therapeutischen Mittel länger
auszusetzen.
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Ein
Mittel, das in den Dauerfreisetzungsausführungsformen der vorliegenden
Erfindung nützlich
ist, zeigt die folgenden Eigenschaften:
- (i)
bei langdauerndem (z.B. 5 Tage) Aussetzen erzeugt das Mittel in
vitro den gleichen oder ähnlichen
Effekt auf DNA-Synthese und Proteinsynthese der Glatten-Gefäßmuskel-Gewebekultur,
wie sie oben für
Aussetzen über
5 Minuten und 24 Stunden beschrieben wurde; und
- (ii) bei einer effektiven Dosis in dem langdauerenden in vitro-Assay
für DNA-Synthesehemmung zeigt
das Mittel milde bis mäßige morphologische
zytotoxische Effekte über
eine längere
Dauer (z.B. 10 Tage).
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Eine
weitere Untersuchung potenzieller antiproliferativer Mittel innerhalb
der vorliegenden Erfindung erfolgt in einem in vivo Ballon-traumatisierten
Schweine-Oberschenkelarterien-Modell. Bevorzugt demonstrieren diese
Mittel eine 50%ige oder stärkere
Hemmung der Zellproliferation in die Tunica media von vaskulären glatten
Muskelzellen, gemäß Indikation
durch eine 1-stündige "BRDU-Blitzmarkierung" vor dem Sammeln
des Gewebes und der histologischen Auswertung. Wenn ein Mittel für eine Zeitspanne
wirksam ist, die ausreicht, um eine intimale glatte Gefäßmuskelproliferation
von 50% oder größer bei
einer einzigen Einwirkung zu inhibieren, ist es ein Mittel innerhalb
der vorliegenden Erfindung, der keine Verabreichung in einer Retarddosierungsform
erfordert. Mittel mit einer kürzeren
Aktivitätsdauer
werden für
die Dauerfreisetzung ausgewertet, wenn die systemische Toxizität und der
potenzielle therapeutische Index scheinbar eine intravenöse Verabreichung
gestatten, um die 50%ige Hemmung zu erreichen, oder wenn der Mittel
für die
lokale Verabreichung zu den vaskulären glatten Muskelzellen mit
Dauerfreisetzung bei einer effektiven antiproliferativen Dosis geeignet ist.
Retardmittel werden in einer Retarddosierungsform für Dosisoptimierungs-
und -wirksamkeitsstudien ausgewertet. Bevorzugt senken antiproliferative
Mittel, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung nützlich sind, die
Gefäßstenose
um etwa 50% in Ballon-traumatisierten Schweine-Oberschenkelarterien
und, noch bevorzugter, senken die Gefäßstenose auf ein ähnliches
Ausmaß in
Schweine-Coronararterien. Diese Mittel sind dann in klinischen Versuchen
am Menschen auszuwerten.
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Die
Zellproliferations- (d.h. DNA-Synthese)- Hemmung ist die primäre Eigenschaft
für die
Dauerfreisetzung von Mitteln. Beispielsweise hemmt Staurosporin
eine Differenz zwischen 3H-Leucin und 3H-Thymidin-Aufnahme so, dass es bei verabreichten
Dosierungen zytostatisch ist. Längerfristige
Toxizitätsstudien
deuteten nicht darauf hin, dass ein verlängertes Aussetzen gegenüber dem
therapeutischen Mittel die Zielzellen nachteilig beeinflussen würde. Zusätzlich zeigte
BRDU-Pulsmarkierung an, dass Staurosporin die Zielzellproliferation
hemmt. Jedoch kann alternativ dazu jede geeignete Methode verwendet
werden, um die Fähigkeit
zu untersuchen, die Zellproliferation zu inhibieren. Demzufolge
ist Staurosporin wirksam dabei, ein expandiertes Lumenvolumen zu
erhalten.
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Die
Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele
besser verstanden werden.
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BEISPIEL 1
-
Bindung an vaskuläre glatte
Muskelzellen in der Blutgefäßwand in
vivo
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1 stellt
die Bindung von NR-AN-01 (einem muriner IgG2b mAb) an vaskuläre glatte
Muskelzellen in der Gefäßwand einer
Arterie in einem 24 Jahre alten männlichen Patienten, 4 Tage
nach der i.v. Verabreichung von NR-AN-01. 1 ist
eine Mikrokopische Fotografie eines histologischen Schnitts durch
den medialen Bereich einer Arterienwand des Patienten nach NR-AN-01
Verabreichung, wobei der Schnitt ex vivo mit HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG
reagiert wurde. Die Reaktion des HRP-Konjugats mit NR-AN-01 MAb
wurde sichtbar gemacht durch Zugabe von 4-Chlor-1-naphthol oder
3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid
als Peroxidasesubstrat (Chromogen). Das Reaktionsprodukt des Substrats
bildet ein unlösliches
violettes oder dunkelbraunes Präzipitat
am Reaktionsort (bei #2 gezeigt, 1). Es
wurde eine Gegenfärbung
verwendet, um kollagenöses
extrazelluläres
Matrixmaterial (bei #2 gezeigt, 1) oder
Zellkerne (#1, 1) sichtbar zu machen. Glatte
Muskelzellen werden unter mikroskopischer Untersuchung als violett
gefärbte
Zellen sichtbar gemacht. Diese Mikrokopische Fotografie zeigt die
Fähigkeit
von mAb, in vivo spezifisch an humanen glatten Gefäßmuskel
zu binden, und wird durch die Zellen aufgenommen und verbleibt für längere Zeit
in den Zellen.
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BEISPIEL 2
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Therapeutische
Konjugate, die therapeutische Trichothecen-Mittel enthalten Konjugate
von NR-AN-01 und Roridin A wurden durch chemische Kupplung eines
Hemisuccinatderivats des Trichothecenzytotoxins (wie unten beschrieben)
an einen monoklonalen Antikörper
namens NR-AN-01 gebaut. Es wurden zwei Konjugate hergestellt, wobei
einer an die Roridin A 2'-Position
gekoppelt wurde und einer an die 13'-Position. In dieser Synthese wurden
zwei Schemata verwendet, wie in 2 und 3 dargestellt.
Das Konjugat wurde dann von unreagiertem Roridin A durch PD-1 0
SEPHAROSE® Säulenchromatographie
(Pharmacia; Piscataway, NJ) gereinigt, durch Größenausschluss-Hochdruckflüssigkeitschromatographie
analysiert, und die Säulenfraktionen
wurden durch SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung (IEF) charakterisiert,
wie unten beschrieben
-
2 zeigt
schematisch das erste Reaktionsschema für die Synthese von Roridin
A-Hemisuccinylsuccinimidat (RA-HS-NHS) durch einen zweistufigen
Prozess mit den Reagenzien: Succinanhydrid, Triethylamin (NEW und
Dimethylaminopyridin (DMAP) vorliegend in Dichlormethan (CH2ClZ) bei Raumtemperatur
(RT); und N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC) Reagenzien, ebenfalls in CH2ClZ bei RT.
-
3 zeigt
schematisch das zweite Reaktionsschema für die Synthese von Roridin
A-Hemisuccinylsuccinimidat (RA-HS-NHS) durch einen fünfstufigen
Prozess mit den Reagenzien: t-Butyldimethylsilylchlorid (TBMS-C1)
und Imidazol in Dimethylformamid (DMF) bei Raumtemperatur (RT);
Acetanhydrid, Triethylamin (TEA) und Diethylaminopyridin in Dichlormethan
(CH2ClZ) bei RT;
Succinanhydrid, Triethylamin (TEA) und Dimethylaminopyridin (DMAP)
in (CH2ClZ) bei
RT; und N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)
Mittel.
-
Synthese von 2'-Roridin-A-Hemisuccinsäure (2):
-
Zu
0,5 g (0,94 mmol) Roridin A wurde 15 ml Dichlormethan hinzugefügt. Zu dieser
Lösung
wurde unter Rühren
0,104 g (1,04 mmol) Succinanhydrid hinzugefügt. Zu diesem Reaktionsgemisch
wurde 0,2 ml Triethylamin in 5 ml Dichlormethan hinzugefügt. Zu dem
homogenen Reaktionsgemisch wurde eine katalytische Menge von Dimethylaminopyridin
hinzugefügt
und bei Raumtemperatur über
15 Stunden gerührt.
Dem Abschluss der Reaktion folgte eine Dünnschichtchromatographie (CH2ClZ : CH3OH = 9,7 : 0,3 mit wenigen Tropfen Essigsäure). Am
Ende der Reaktion wurden 0,3 ml Eisessigsäure hinzugefügt, und
das Lösungsmittel
wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der getrocknete rohe Rest
wurde zwischen Wasser und Methylchlorid aufgeteilt. Die kombinierten
Methylenchloridextrakte (3 × 50
ml) wurden überwasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet, wobei das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt
wurde, und getrocknet, zum Erhalt von 0,575 g (96%) eines Rohgemisches
dreier Verbindungen. Die präparative
Cl 8 HPLC-Separation des Rohgemisches in 50%igem Acrylonitrilwasser
mit 2%iger Essigsäure
ergab 0,36 g (60%) von 2 als weißem Feststoff.
-
Synthese von Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat
(3):
-
Zu
0,3 g (0,476 mmol) 2'-Roridin
A-Hemisuccinsäure
in 30 ml Dichlormethan wurden 0,055 g (0,478 mmol) N-Hydroxysuccinimid
hinzugefügt.
Zu dem klaren Reaktionsgemisch wurden 0,108 g (0,524 mmol) Dicyclohexylcarbodümied hinzugefügt. Das
Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 6 Stunden gerührt. Dem
Abschluss der Reaktion folgte TLC (CH2ClZ : CH3OH = 9,7 :
0,3 mit wenigen Tropfen Essigsäure) als
Entwicklungs-Lösungsmittel.
Einige wenige Tropfen von Eisessigsäure wurden zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, und
das Lösungsmittel
wurde unter reduziertem Druck entfernt. Zu dem getrockneten Rest
wurde Dichlormethan hinzugefügt,
und das präzipitierte
DCU wurde gefiltert. Lösungsmittel
von dem Filtrat wurde unter reduziertem Druck beseitigt, um einen
weißen
Feststoff zu erhalten. Aus dem Rohprodukt wurde 0,208 g (60%) von
3 durch präparative
HPLC in 50%igem Acetonitril mit 2% Essigsäure als mobiler Phase gereinigt.
-
Synthese von 13'-t-Butyldimethylsilyl-Roridin
A (4):
-
Zu
72,3 mg (0,136 mmol) Roridin A in 0,5 ml Dimethylformamidlösung wurden
0,055 g (0,367 mmol) t-Butyldimethylsilylchlorid und 0,025 g (0,368
mmol) Imidazol hinzugefügt.
Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 Stunden gerührt. Dem
Abschluss der Reaktion folgte eine Silikageldünnschichtchromatographie mittels
1 %iger McOH-CHCl3 als Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Lösungsmittel
aus dem Reaktionsgemisch wurde in Vakuum entfernt und getrocknet.
Das Rohprodukt wurde zwischen Wasser und Methylchlorid aufgeteilt.
Lösungsmittel
aus den kombinierten Methylenchloridextrakten wurde unter reduziertem Druck
entfernt und getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie
mittels EtOAc : Hexan (1 : 3) als Eluierungslösungsmittel gereinigt. Lösungsmittel
aus den Eluanten wurde unter reduziertem Druck beseitigt, um 0,66
g (75%) von 4 als Feststoff zu gewinnen.
-
Synthese von 13'-t-Butyldimethylsilyl-2'-Acetyl-Roridin A
(5):
-
Zu
0,1 g (0,155 mmol) von 13'-t-Butyldimethylsilyl-Roridin
A in 10 ml Dichlormethan wurden 0,3 ml Acetanhydrid, 0,2 ml Triethylamin
und einige Kristalle Dimethylaminopyridin hinzugefügt und bei
Raumtemperatur für
2 Stunden aufbewahrt. Dem Abschluss der Reaktion folgte TLC in 1%gem
Methanolmethylenchlorid als Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Lösungsmittel
wurde unter reduziertem Druck entfernt und durch eine Silikagelsäule mittels
1 % Methanolchloroform als Eluierungslösungsmittel gereinigt. Das
Lösungsmittel
von den Eluanten wurde unter Vakuum beseitigt, um 0,085 g (80 %)
5 als Feststoff zu gewinnen
-
Synthese von 2'-Acetyl-Roridin A
(6):
-
Zu
0,05 g (0,073 mmol) 2'-Acetyl-13'-t-Butyldimethylsilyl-Roridin
A in 5 ml Tetrahydrofuran wurden 0,3 ml von 1 M Tetrabutylammoniumfluoridlösung in
THF hinzugefügt.
Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Dem
Abschluss der Reaktion folgte eine Silikagel-Dünnschichtchromatographie
mittels 1 %igem McOH-CHCl3 als dem Entwicklungs-Lösungsmittel.
Das Lösungsmittel
aus dem Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck entfernt
und getrocknet. Das Rohprodukt wurde auf einer Silikagelsäule mittels
1%igem CH3OH-CHCl3 als
Eluierungslösungsmittel
gereinigt. Lösungsmittel
aus den kombinierten Eluanten wurde unter Vakuum beseitigt, um 0,020
g (48%) von 6 als Feststoff zu gewinnen.
-
Synthese von 2'-Acetyl-13-Hemisuccinyl-Roridin
A (7):
-
Zu
0,05 g (0,087 mmol) von 2'-Acetyl-Roridin
A in 1 ml Dichlormethan wurden 0,025 g (0,25 mmol) Succinanhydrid
und 35 ml von Triethylamin hinzugefügt. Einige wenige Kristalle
von Dimethylaminopyridin wurden als Katalysator hinzugefügt. Das
Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Dem
Abschluss der Reaktion folgte eine Dünnschichtchromatographie mittels
5%igem McOH-CHZClZ als Entwicklungs-Lösungsmittel. Am Ende der Reaktion
wurden 30 ml Eisessigsäure
hinzugefügt.
Lösungsmittel von
dem Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck entfernt und
getrocknet. Das Rohprodukt wurde zwischen Wasser und Ethylacetat
aufgeteilt. Lösungsmittel
von den kombinierten Ethylacetatfraktionen wurde unter reduziertem
Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde gereinigt, indem es durch eine
Silikagelsäule
geschickt wurde, um 0,039 g (66%) von 7 als weißem Feststoff zu gewinnen.
-
Synthese von Succi nimidyl-2'-Acetyl-13'-Roridin A-Hemisuccinat
(8):
-
Zu
0,036 g (0,0050 mmol) von 2'-Acetyl-13'-Roridin A-Hemisuccinsäure in 2
ml Dichlormethan wurden 0,009 g (0,09 mmol) N-Hydroxysuccinimid
hinzugefügt.
Zu einer gerührten
Lösung
wurde 0,012 g (0,059 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt. Das
Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 8 Stunden gerührt. Dem
Abschluss der Reaktion folgte eine Silikageldünnschichtchromatographie mittels
5%igem MeOH-CH2Cl2 als
Entwicklungs-Lösungsmittel.
Einige wenige Tropfen von Eisessigsäure wurden zu dem Reaktionsgemisch
hinzugefügt.
Lösungsmittel
von dem Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck entfernt und
getrocknet. Das Rohprodukt wurde auf einer Silikagelsäule mittels
5% McOH-CHZClZ als
Eluierungslösungsmittel
gereinigt. Das Lösungsmittel
von den kombinierten Eluanten wurde unter Vakuum beseitigt, um 0,025
g (61 %) von 8 als weißem
Feststoff zu gewinnen.
-
Konjugation von Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat
(3) und Succinimidyl-2'-acetyl-13'-Roridin A-Hemi succinat
(8) mit NR-AN-01 Gesamt-Antikörper
(MAb):
-
Konjugationsreaktionen
wurden bei pH 8,0 in Boratpuffer in der Gegenwart von 25% Dimethylsulfoxid (DMSO)-Lösungsmittel
bei Raumtemperatur bei leichtem Mischen für 45 Minuten vor der Reinigung
durch Gelpermeationschromatographie durchgeführt. Die molaren Trichothecen-Medikamentenprecursor
zu Antikörperangebote
betrugen 25 : 1 und 40 : 1 für
die 2'- bzw. 13'-Roridin A-Analoge
(3 und 8). Die Antikörperkonzentration
war 0,9 bis 1,0 mg/ml während
der Konjugationsreaktion.
-
Eine
typische 2'-Analogen
(3)-Reaktion mit 25 mg Antikörper
war wie folgt: Zu 4,7 ml von 5,3 mg Ab/ml in Phosphat-gepufferter
Salzlösung
(d.h. PBS; 150 mM NaCl; 6,7 mM Phosphat; pH 7,3) wurden 10 ml PBS und
5 ml Boratpuffer (0,5 M, pH 8,0) hinzugefügt. Unter leichtem Rühren wurden
dem Reaktionsgemisch 6,3 ml DMSO, das 1,37 mg Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat
(3) enthielt, dann tropfenweise über
eine 15 Sekundendauer hinzugefügt.
-
Reinigung:
-
Zur
Reinigung wurden 1 ml Reaktionsaliquots auf Pharmacia PC-10 Sepharose® Säulen gegeben, äquilibriert
in PBS. Das eluierte Konjugat wurde in 2,4 bis 4,8 ml Fraktionen
gesammelt. Die PD-10 gereinigten Konjugataliquots wurden dann gepoolt
und auf einem Amicon PM-1 ODiAflo® Konzentrator
auf 1,5 bis 2,0 mg Ab/ml konzentriert; steril durch eine 0,2 p Gelman
Acarodisc® gefiltert
und in sterile Glasfläschchen
in 5 ml Volumen abgefüllt.
-
Das
2'-Konjugat wurde
in flüssigem
Stickstoff schnellgefroren und dann bis zum Gebrauch bei –70°C aufbewahrt.
Das 13'-Rorodin
A NR-AN-01-Konjugat wurde geforen oder gekühlt aufbewahrt (d.h. bei 5
bis 10°C).
-
Charakterisierung
der Konjugate
-
Die
Proteinkonzentration wurde durch BCA-Assay mittels der Kupferreakti onsmethode
bestimmt (Pierce Chemical Corp.).
-
Die
Abschätzung
des Grads der Antikörperderivatisierung
wurde durchgeführt
durch zuerst Hydrolysieren eines Aliquots des Konjugats in 0,2 M
Carbonat, pH 10,3 für
4 Stunden (bei Raumtemperatur für
2'-Konjugat oder
bei 37°C
für das
13'-Konjugat), gefolgt
durch Filtration durch eine PM-30 Membran. Das Filtrat wurde dann
für Roridin
A auf C-1 8 reverse Phase HPLC untersucht, mittels einer mobilen
Phase eines 50 : 48 : 2 Verhältnisses
von CH3CN : H2O:
HOAC. Es wurde ein Korrekturfaktor von 1,32 verwendet, um eine parallele makrozyklische
Ringzersetzung zu korrigieren, die während der Hydrolyse des 13'-Konjugats polare
Produkte ergibt.
-
Es
wurde auch eine Größenausschluss-Chromatographie
auf DuPont Zorbax® HPLC und isoelektrischer
Fokussierung mittels Serva® Gelplatten (pH 3 bis
10) durchgeführt.
Durch HPLC wurde keine Indikation einer Aggregation beobachtet.
-
Immunoassay
von Roridin A-Antikörperkonjugaten
erfolgt durch entweder kompetitive ELISA mittels biotinyliertem
Ab mit Streptavidin/Peroxidase-Detektion
oder durch kompetitiven Zellbindungsassay mittels 125l-arkiertem
Antikörper.
Altenrativ wurde die Immunoreaktivität unter Bedingungen der Antigensättigung
in einem Zellbindungsassay gemessen, wobei der Antikörper zuerst
mit 1-125 durch die Chloramin-T-Methode spurenmarkiert wurde und
dann anschließend
mit 2'- und 13'-Roridin A-Precursorn
derivatisiert wurde.
-
Die
Strukturformel des Trichothecens ist unten gezeigt:
-
BEISPIEL 3
-
Bindungskinetiken an Matte
Muskelzellen
-
Zur
Verabreichung durch einen i.v. Katheter ist es erwünscht, dass
die therapeutischen Konjugate der Erfindung in weniger als 3 bis
5 Minuten verabreicht werden, sodass der Blutfluss in dem Patienten
wieder hergestellt werden kann. Daher wurden Studien durchgeführt, um
die Bindungskinetiken des Glatten-Muskel-Bindungsproteins mit einem Ka von > 109 Liter/mol
zu bestimmen. Weil menschliche vaskuläre glatte Muskelzellen in der
Kultur langsam wachsen und sich herausstellte, dass glatte Muskelzellen
des Pavians den humanen CSPG-Zelloberflächenmarker
exprimieren, wurden glatte Arterienmuskelzellen vom Pavian und menschliche A375
M/M (Melanom: ATCC #CRL 1619) Zellen, die den CSPG-Oberflächenmarker
trugen, in vielen der Studien verwendet, die in den Beispielen unten
beschrieben sind.
-
Für die Bindungskinetikstudien
wurden A375 M/M- und B054-Zellen in sterilen 96 Well-Mikrotiterplatten
mit 2500 Zellen/Weil angesetzt. Die Platten wurden in Aluminiumfolie
eingewickelt und bei 37°C über Nacht in
einer feuchten Atmosphäre
von 5% CO2/95% Luft inkubiert. Nach angenähert 18
Stunden wurden die Inkubationsplatten entfernt, und die Zellen wurden
mit 0,05% Glutaraldehyd für
5 Minuten fixiert, um einen Membranturnover zu verhindern. Nach
dem Fixieren wurden die Platten im Überschuss mit PBS, das 0,5% Tween-20® enthielt,
gewaschen. Serielle Zweifachverdünnungen
eines NR-AN-01 the rapeutischen Konjugats, das Roridin A enthielt,
wurden mit Proteinkonzentrationen von 10 mg/ml bis 20 ng/ml hergestellt,
und jede Lösung
wurde in zwei Wells aliquotisiert. Die Platten wurden bei 4°C mit dem
NR-AN-01 für
5, 15, 30 und 60 Minuten inkubiert, wonach das ungebundene Protein
durch Absaugen entfernt wurde, und es wurde zu jedem Well 100 ml
CS-Puffer hinzugefügt
(55% Hühnerserum/0,5%
Tween-20® in
PBS). CS-Puffer wurde beseitigt, und das NR-AN-01 therapeutische
Konjugat, gebunden an die Zellen, wurde sichtbar gemacht durch Hinzufügen von
100 ml HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO) zu jedem Well; Inkubieren bei 4°C für eine Stunde; Waschen mit
PBS/0,055% Tween®, um ungebundenes Ziegen-IgG
zu beseitigen; und Hinzufügen
von 2,2'-Azino-bis
(3-ethylbenzthiazol-6-sulfonsäure (ABTS)
chromogenes Substrat (d.h. für
HRP). Nach Inkubation für
30 Minuten wurde die an die Zelle gebundene Menge von NR-AN-01 quantifiziert,
durch Messung der Absorption bei 415 nm und 490 nm mittels ELISA
Plattenlesegeräts,
ausgestattet für
die Datenerfassung mit einem Compaq Computer.
-
4A zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, wobei A375 M/M marker-positive Zellen bei 4°C (d.h. um
Membranturnover zu verhindern) für
5 Minuten (offene Quadrate, 4A),
15 Minuten (geschlossene Rauten, 4A),
30 Minuten (geschlossene Quadrate, 4A)
oder 60 Minuten (offene Rauten, 4A)
mit unterschiedlichen Konzentrationen von NR-AN-01 (NRAND01 pg/ml)
gehalten wurden. Die Bindung des NR-AN-01 MAb an die A375-Zellen
wurde quantifiziert durch Waschen, um ungebundenen Antikörper zu
beseitigen, Hinzufügen
von HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG zur Reaktion mit dem zeltgebundenen
MAb, Waschen, um ungebundenen sekundären Ziegen-Antikörper zu
beseitigen, und Hinzufügen
von 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS)
Substrat für
Peroxidase. Die Farbentwicklung wurde nach 30 Minuten sowohl bei
415 nm als auch 490 nm überwacht
(ABS415.490).
-
4B zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, die in ähnlicher
Weise durchgeführt
wurden, wie oben in Bezug auf 4A beschrieben
wurde, jedoch mittels 8054 marker-positiven glatten Muskelzellen,
d.h. anstatt der A375 m/m Zellen.
-
Die
in 4A und 4B dargestellten
Ergebnisse zeigen eine signifikante Bindung von NR-AN-01 an A375
und B054 Zellen innerhalb 5 Minuten bei 4°C auch bei der geringsten Dosis
von 20 nm/ml.
-
BEISPIEL 4
-
Wirkungen von Roridin
A und RA-NR-AN-01 Konjugaten
-
Die
Wirkungen von Roridin A (RA) und RA-NR-AN-01 Konjugaten auf die
zelluläre
Proteinsynthese (d.h. durch 3H-Leucinaufnahme)
und die metabolische Aktivität
(d.h. durch mitochondrialen MTT-Assay) wurden in den Experimenten
geprüft,
die unten in BEISPIEL 5 und BEISPIEL 6 im Detail angegeben sind.
Die Studien in BEISPIEL 4 enthalten Experimente zur Bestimmung der
Wirkungen der langdauernden (d.h. 24-stündigen) Behandlung mit den
Mitteln. Die Studien in BEISPIEL 5 enthalten Experimente zur Bestimmung
der Effekte einer "Puls" (d.h. 5-minütigen) Behandlung
der Zellen. In beiden Studien wurde die zelluläre Spezifität der Wirkung durch Aufnahme
von "Ziel"-Zellen (d.h. Zellen,
die den CSPG "Marker" tragen) und Nicht-Targetzellen
ausgewertet. Zu Vergleichszwecken wurde auch freies RA (d.h. angekoppeltes)
in den Studien eingebunden. Die Effekte auf die zelluläre Proteinsynthese
oder metabolische Aktivität
wurde entweder unmittelbar nach der Behandlung ausgewertet, oder
es wurde eine "Erholungsdauer" zugelassen (d.h.
einschließlich
der Inkubation der Zellen über
Nacht bei 37°C),
um die langfristigen Effekte der Mittel auf die Zeltpopulationen
zu bestimmen.
-
Metabolische Effekte nach
24-stündiger
Exposition:
-
Während es
bekannt ist, dass monoklonale Antikörper-Medikamentenkonjugate
einen Spezifitätsgrad für Zellen
haben können,
die Markerantigene tragen, wenn in vivo verwendet, hat es sich herausgestellt,
dass es in vielen Systemen schwieriger ist, die in vitro Spezifität der Wirkung
zu demonstrieren, insbesondere mit Verbindungen, die lipophil sind.
Daher wurden die vorliegenden Experimente durchgeführt, wobei
die inhibitorischen Effekte des NR-AN-01 Roridin A-Konjugats auf Target-
und Nichttargetzellen über
24 Stunden getestet wurden. Die Ergebnisse mit RA-NR-AN-01 wurden
mit dem Effekt von freiem Roridin A über die gleiche 24-Stundendauer
verglichen. Ein modifiziertes Methyltetrazoliumblau (MTT)-Assay
wurde mit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (Sigma) genutzt,
um die zelluläre
metabolische Aktivität
zu bestimmen. Dieser Assay ist dazu gedacht, die zelluläre mitochondriale
Dehydrogenaseaktivität
zu messen. Für einige
dieser Studien wurden M14 (Melanom) und B054 (glatter Muskel)-Zelllinien
als marker-positive Zielzellen verwendet, und es wurden HT29-Zellen
(Colonkarzinom; ATCC#HTB38) als Nichttargetspezifitätskontolle verwendet.
In anderen Studien wurde A375 als marker-positive Zelle verwendet.
Die HT29- und M14-Zellen wurden in 96-Weil Mikrotiterplatten mit
einer Konzentration von 5,0 × 103 Zellen/Weil angesetzt, und die B054-Zellen
wurden mit 2,5 × 103 Zellen/Weil angesetzt. Serielle Zweifachverdünnungen
von freiem Roridin A und 2'RA-HS-NR-AN-01
(d.h. Roridin A, gekopelt durch Hemisuccinat (HS)-Kopplungsmittel
and er 2'-Position an
NR-AN-01) wurden
in DMEM über
einen Bereich von Proteinkonzentrationen von 20 mg/ml bis 40 pg/ml hergestellt.
Es wurden Testmittel (doppelt) zu Mikrotiterwells (100 ml/Wlell)
hinzufügt,
und die Platten wurden in Aluminiumfolie eingewickelt und bei 37°C in angefeuchteter
Atmosphäre,
bestehend auf 5% CO2/95% Luft, für 24 Stunden
inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt (durch Absaugen),
wurde frisches DMEM hinzugefügt
(100 ml/Well), und die Zellen wurden umgedreht, um für eine zusätzliche über Nacht
(d.h. 16-18 Stunden) "Erholungsdauer" zu inkubieren. Am
Ende der "Erholungsdauer" wurde die zelluläre metabolische
Aktivität
bestimmt, indem zu jedem Well 20 ml einer 5 mg/ml MTT-Lösung hinzugegeben
wurde. Die Platten wurden abgedeckt und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert, und
dann wurde die Reaktion entwickelt, indem 100 ml/Welt 10%iger SDS/0,1
N Hcl hinzugefügt
wurde. Das dunkelblaue, in Lösung
gebrachte Formazanreaktionsprodukt wurde bei Raumtemperatur nach
16-18 Stunden entwickelt und mittels eines ELISA Mikrotiterplattenlesegeräts bei einer
Absorption von 570 nm quantifiziert.
-
5A zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, wobei B054 markerpositve glatte Muskelzellen mit unterschiedlichen
Konzentrationen von RA-NR-AN-01
(NRAN01-RA; offene Quadrate, 5A)
oder freiem Roridin A (freies RA; geschlossene Rauten; 5A) für
eine Dauer von 24 Stunden inkubiert wurden, gewaschen wurden und
dann zur Kultur für
eine zusätzliche
16-18-stündige Übernacht
(o/n) Erholungsdauer zurückgebracht
wurden, bevor die metabolische Aktivität in einem MTT-Assay getestet
wurde. Die Konzentrationen von freiem RA und RA-NR-AN-01 werden
ausgedrückt
als die berechnete Konzentration von Roridin A (in mg/ml aufgetragen
auf einer logarithmischen Skala) in dem Assay (d.h. anstatt dem
totalen mg/ml von NR-AN-01 Protein in dem Assay), sodass direkte
Vergleiche möglich
sein können.
Die metabolische Aktivität der
Zellen in dem MTT-Assay wird dargestellt als Prozentsatz der metabolischen
Aktivität,
gemessen in einer unbehandelten Kontrollkultur von Zellen, d.h.
% Kontrolle).
-
5B zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, die in ähnlicher
Weise ausgeführt
wurden wie jene, die oben in Bezug auf 5A beschrieben
wurden, jedoch unter Vergleich der Effekte von nur RA-NR-AN-01 (NRAN01-RA)
an drei unterschiedlichen Zelltypen: nämlich B054 markerpositiven
glatten Muskelzellen (B054-NRAN01-RA; offene Quadrate, 5B); HT 29 marker-negativen Kontrollzellen (HT29-NRAN01-RA;
geschlossene Rauten, 5B); und M14 marker-positiven
Zellen (M14-NRAN01-RA; geschlossene Quadrate, 5B). Wie oben in Bezug auf 5A beschrieben,
werden die Konzentrationen in dem vorliegenden Experiment als pg/ml
Roridin A ausgedrückt.
Die metabolische Aktivität
der Zellen wird in ähnlicher
Weise wie in 5A ausgedrückt, d.h. als Prozentsatz der
Aktivität,
gemessen in einer unbehandelten Kontrollkultur von Zellen (% Kontrolle).
-
Die
in 5A und 58 dargestellten
Ergebnisse zeigen, dass die in dem MTT-Assay gemessene metabolische
Aktivitäten
in allen Populationen von Testzellen signifikant abnahmen, sogar
16-18 Stunden nach einer 24-stündigen
Inkubation in entweder freiem Roridin A oder den 2'- oder 13'-RA-NR-AN-01 Konjugaten. Die
Effekte der RA-NR-AN-01 Konjugate schienen nicht spezifisch inhibitorisch
für sowohl
Ziel (8054 und M14)- als auch Nichtziel (HT29)-Zellen (5A und 5B)
zu sein. Die inhibitorischen Effekte wurden bei einer freien Roridin
A- oder RA-Konjugatkonzentration von > 10 ng/ml beobachtet.
-
Zu
Vergleichszwecken wurde eine zweite Studie durchgeführt, wobei
die Effekte von Pseudomonas exotoxin (PE)-Konjugaten auf Zellen
in einem ähnlichen
Protokoll ausgewertet wurden. Für
diese Studie wurden Ziel- und Nichtzielzellen mit PE oder PE-NR-AN-01
für 24
Stunden behandelt, und erhielten dann eine "Erholungsperiode" (wie oben), bevor die metabolische
Aktivität
in einem MTT-Assay getestet wurde.
-
6A zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, die in ähnlicher
Weise durchgeführt
wurden, die oben in Bezug auf 5A beschrieben
wurden, jedoch so ausgestaltet, um die metabolischen Effekte auff
PE-NR-AN-01 (NRAN01-PE) auf Zellen zu untersuchen, d.h. anstatt
RA-NR-AN-01. Drei unterschiedliche Zelltypen wurden verwendet: nämlich B054
marker-positive glatte Muskelzellen (B054; offene Quadrate, 6A); HT29 markernegative Kontrollzellen (HT29;
geschlossene Rauten, 6A); und M14 marker-positive
Zellen (MT14; geschlossene Quadrate, 6A).
In dieser Studie ist die Kon zentration des Konjugats in pg/ml NR-AN-01
Protein ausgedrückt
(aufgetragen auf einer log-Skala), und die metabolische Aktivität wird ausgedrückt als
Prozentsatz der MTT-Aktivität,
gemessen in einer unbehandelten Kontrollkultur (% Kontrolle).
-
6B zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, die in ähnlicher
Weise ausgeführt
wurden wie jene, die oben in Bezug auf 6A diskutiert
wurden, jedoch ausgeführt,
um die mit freiem PPE (PE) erhaltenen Effekte mit den oben erhaltenen
zu vergleichen, d.h. in 6A,
mit PE-NR-AN-01. Die Zellen, die Kulturbedingungen, die Berechnungen
und die Präsentation
der Ergebnisse sind die gleichen wie in 6A oben.
-
Die
in 6A und 6B dargestellten
Ergebnisse zeigen, dass eine 24-stündige Exposition
von PE-NR-AN-01 oder freiem PE nicht spezifisch inhibitorisch für Zellen
der Konzentration von > 100
ng/ml war.
-
Während dieser
Typ nicht-spezifischer Hemmung als ein potenzieller Wert für die biologische
Atherectomie gewertet wurde, wurde er nicht als wünschenswert
für die
Behandlung von Restenose nach Angioplastie angesehen, wo tote und
sterbende Zellen Faktoren freigeben können, die die Glatte-Muskelproliferation
stimulieren.
-
BEISPIEL 5
-
Effekte der
Pulsbehandlung auf zelluläre
Aktivität
-
Es
wurden zusätzliche
Studien durchgeführt,
um die Effekte davon auszuwerten, Zellen kurzfristig, d.h. 5 Minuten,
einem Roridin A-haltigen therapeutischen Konjugat auszusetzen. In
diesen Studien wurde sowohl die metabolische Aktivität (gemessen
in MTT-Assays) als auch die zelluläre Proteinsynthese (gemessen
durch 3H-Leucinaufnahme) ausgewertet.
-
Effekte nach 5 Minuten
der Exposition: Proteinsynthese
-
Die
Effekte einer 5-minütigen
Exposition für
freies Roridin A (RA) oder ein therapeutisches Konjugat wurden ausgewertet.
Verwendet wurde Roridin A-NR-AN-01,
gekoppelt durch Hemisuccinyl (HS) an entweder der 2'-Position (2'RA-HS-NR-AN-01) oder
der 13'-Position
(13'RA-HS-NR-AN-01).
(Im Falle von 13'RA-HS-NR-AN-01
wurde die 2'-Position
von Roridin A auch acetyliert.) Die RA-, 2'- oder 13'RA-NR-AN-01 Konjugate wurden in sterilem
DMEM über
einen Konzentrationsbereich von 400 ng/ml bis 780 pg/ml Roridin
A zweifach verdünnt.
(Die Testproben wurden alle auf Roridin A normalisiert, sodass direkte
Vergleiche der Effekte bei vergleichbaren Dosierungen durchgeführt werden
konnten.) Proben wurden (doppelt) in doppelte Mikrotiterplatten
mit 100 ml/Well zum Aliquot gebracht und bei Raumtemperatur für 5 Minuten
inkubiert.
-
Sowohl
kurzfristige als auch langfristige Effekte der Testproben auf markerpositive
A375- als auch marker-negative H729-Zellen wurden bestimmt. Zur
Untersuchung der kurzfristigen Effekte wurde 100 ml/Well [3H]-Leucin (0,5 mCi/ml) unmittelbar nach
der 5-minütigen
Behandlung mit Konjugat (oder RA) hinzugefügt, und die Proteinsynthese
wurde über
eine 5-stündige
Dauer ausgewertet. Zur Bestimmung der langfristigen Effekte wurden
die Zellen für
5 Minuten behandelt, gewaschen und dann zur Kultur für eine 24-stündige "Erholungs"-Periode im DMEM-Medium
zurückgebracht,
das entweder 5% NBS/5% Serum Plus®, d.h.
für A375oder NT29-Zellen)
oder 10% FBS (d.h. für
B054-Zellen) enthielt.
Am Ende der "Erholungs"-Periode wurde das
Inkubationsmedium entfernt (d.h. durch Absaugen), und es wurde 3H-Leucin hinzugefügt (wie oben). In beiden Fällen (d.h.
ob kurzfristig oder langfristig) wurde die Proteinsynthese der Zellen
ausgewertet durch Inkubieren der Zellen mit 3H-Leucin
für 4 Stunden
bei 37°C
in einer feuchten Kammer (wie oben) und alle Ergebnisse wurden durch
Vergleich mit nicht behandelten Zellen (d.h. 100% Kontrolle) berech net.
Nach 4 Stunden wurde das 3H-Leucin entfernt,
wurden die Zellen von dem Substrat durch Trypsinbehandlung entfernt,
abgesaugt (mittels eines PHDTM Zellerntegeräts (Cambridge
Technology, Inc., Cambridge, MA)) und durch Filtration auf Glasfaserfiltern
gesammelt. Die Glasfaserfilter wurden getrocknet und durch Flüssigszintillationsspektroskopie
in einem Beckman Flüssigszintillationszähler radioaktiv
quantifiziert.
-
7A zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, die durchgeführt
wurden, um die Effekte zu untersuchen, Kontroll HT29 marker-negative
Zellen über
5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von Roridin A (freies
RA; offene Quadrate, 7A) oder 2'-RAN-NR-AN-01 (2'RA-NRAN01; geschlossene Quadrate, 7A) oder 13'RA-NR-AN-01
(13'RA-NRAN01; geschlossene
Dreiecke, 7A) Konjugaten auszusetzen.
Die Konzentrationen von freiem RA, 2'RA-NR-AN-01 oder 13'NR-AN-01 werden ausgedrückt als
die berechnete Konzentration von Roridin A in dem Assay (in pg/ml,
aufgetragen auf einer log-Skala), d.h. anstatt dem gesamten pg/ml
von NR-AN-01 Protein, sodass direkte Vergleiche der Ergebnisse durchgeführt werden können. Für diese
Studien wurden die Zellen für
5 Minuten behandelt, gewaschen und dann zur Kultur für 4 Stunden
zurückgebracht,
wobei während
dieser Zeit die zelluläre
Proteinsynthese ausgewertet wurde, indem 0,5 mCi/ml von 3H-Leucin dem Kulturmedium hinzugefügt wurde.
Am Ende der 4-stündigen
Dauer wurden die zellulären
Proteine gesammelt, und die Radioaktivität wurde bestimmt. Die Ergebnisse
sind ausgedrückt
als der Prozentsatz der Radioaktivität, die in einer Kontroll (nicht
behandelten) NT29-Zellkultur aufgezeichnet wurde (d.h. % Kontrolle).
-
7B zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, die die Effekte davon untersuchen, Kontroll H29 marker-negative
Zellen 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von freiem RA
(offene Quadrate, 7B), 2'RA-NRAN01 (geschlossene Quadrate, 7B) oder 13'RA-NRAN01
(geschlossene Dreiecke, 7B)
auszusetzen, wie oben in Bezug auf 7A beschrieben,
wobei jedoch in den vorliegenden Experimenten die Zellen für eine 16-18-ständige Erho lungsperiode
(d.h. über
Nacht; o/n) inkubiert wurden, bevor die Proteinsynthese in einem
4-stündigen 3H-Leucinproteinsyntheseassay getestet wurde.
Die Ergebnisse sind in ähnlicher
Weise dargeboten wie oben in 7A.
-
Die
in 7A und 7B dargestellten
Ergebnisse zeigen die kurzfristigen bzw. langfristigen Effekte von
RA, 2'RA-HS-NR-AN-01
und 13'RA-HS-NR-AN-01 auf die Proteinsynthese
durch HT29-Kontrollzellen. Die Ergebnisse zeigen eine Dosis-Antworthemmung
der zellulären
Proteinsynthese durch freies Roridin A, jedoch nicht durch RA-NR-AN-01
in HT29-Zellen. Die Hemmung, die durch RA während den 5 Minuten Inkubation ausgelöst wurde,
war nach den 16-18 Stunden Erholungsdauer (7B)
noch immer vorhanden. im Gegensatz hierzu führte die Behandlung von Nichtziel
HT29-Zellen mit 2'RA-HS-NR-AN-01
oder 13'RA-HS-NR-AN-01
zu einer detektierbaren Hemmung der Proteinsynthese. Somit legen
diese Ergebnisse (im Gegensatz zu jenen, die über 24 Stunden hinweg erhalten
wurden) einen überraschenden
Grad an Spezifität
in der in vitro Wirkung der NR-AN-01-Konjugate nahe, wenn die Behandlung
in einem 5-minütigen "Puls" verabreicht wurde.
Jedoch war es auch möglich,
dass das NR-AN-01-Konjugat
inaktiv war, sodass zusätzliche Experimente
durchgeführt
wurden, um den Effekt der Konjugate auf die Zielzellen auszuwerten.
-
7C zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, die die Effekte darauf untersuchen, A375 m/m marker-positive
Zellen 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von freiem RA
(offene Quadrate, 7C), 2'RA-NR-AN-01 (geschlossene Quadrate, 7C) oder 13'RA-NR-AN-01
(geschlossene Dreiecke, 7C)
auszusetzen, wie oben in Bezug auf 7A beschrieben.
In den vorliegenden Studien wurden die A375-Zellen für 5 Minuten
in einem Testmittel inkubiert, gewaschen und auf Proteinsynthese über die
nächsten 4
Stunden getestet, indem 0,5 mCi/ml 3H-Leucin
zu dem Kulturmedium hinzugefügt
wurde. Die Ergebnisse der Experimente sind in ähnlicher Weise aufgetragen,
wie sie oben in Bezug auf 7A beschrieben
sind.
-
7D zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, welche die Effekte darauf untersuchen, A375 m/ml marker-positive
Zellen 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von freiem RA
(offene Quadrate, 7D), 2'RA-NRAN01
(geschlossene Quadrate, 7D),
13'RA-NRAN01 (geschlossene
Dreiecke, 7D) auszusetzen, wie oben in
Bezug auf 7B beschrieben. In den vorliegenden
Studien wurden die A375-Zellen für
5 Minuten in diem Testmittel inkubiert, gewaschen und dann zu der
Kultur für
eine 16-18-stündige Erholungsdauer
(d.h. über
Nacht; o/n) Erholung zurückgebracht,
wobei nach dieser Zeit die Proteinsynthese während eines 4-stündigen 3H-Leucinproteinsyntheseassays
ausgewertet wurde. Die Ergebnisse der Experimente sind in ähnlicher
Weise aufgetragen, wie sie oben in Bezug auf 7A beschrieben
sind.
-
Die
in den 7C und 7D dargestellten
Ergebnisse zeigen die kurzfristigen und langfristigen Effekte jeweils
ovn RA, 2'RA-HS-NR-AN-01
und 13'-RA-HS-NR-AN-01 auf die
Proteinsynthese durch A375-Zielzellen. Die Behandlung von Zielzellen
mit entweder dem 2'-
oder 13'RA-NR-AN-01
therapeutischen Konjugat führte
zu einer kurzfristigen Hemmung der Proteinsynthese, d.h. beobachtet
unmittelbar nach der 5-minütigen Pulsbehandlung
(7C). Diese Feststellungen, in Kombination mit
den Feststellungen in 7A und 7B,
oben, legen nahe, dass die RA-NR-AN-01-Konjugate aktiv waren und
dass sie spezifisch inhibitorisch für Zielzelten waren, jedoch
nicht für
Nichtzielzellen. Interessanterweise wurden, wenn "Puls"-behandelte Zielzellen
zur Kultur zurückgebracht
werden, keine langfristigen inhibitorischen Effekte beobachtet (7D). Die in den 7C und 7D dargestellten
Ergebnisse zeigen wiederum, dass Roridin A für Testzellen nicht spezifisch
inhibitorisch ist (d.h. in ähnlicher
Weise wie in 7A und 7B,
oben) und dass deren Effekt auf die Zellen auch nach einer 16-18-stündigen Erholungsdauer
vorhanden ist. Somit scheinen die spezifischen Effekte von RA-NR-AN-01-Konjugaten
auf die Zielzellen während
einer "Puls"-Behandlung eine
Eigenschaft des NR-AN-01-Bindungsproteins zu sein.
-
Die
Ergebnisse, die mit B054 arteriellen glatten Muskelzellen erhalten
wurden, waren ähnlich
wie jene, die mit den obigen A375-Zellen erhalten wurden, d.h. freies
Roridin A zeigte eine Dosis-Antworthemmung der Proteinsynthese im
Kurzzeitversuch von gleich 60%, 66% und 90% Kontrolle bei 200 ng/ml,
100 ng/ml und 50 ng/ml; und im langfristigen Versuch waren die Effekte
auf die Proteinsynthese gleich 27%, 46% und 98% der Kontrolle bei
den gleichen Dosierungen. Im Gegensatz hierzu zeigte das 2'- oder 13'RA-NR-ANA-01 nur
eine 10-20%ige Hemmung für
die kurz- odere langfristigen Effekte auf die Proteinsynthese (d.h. > 80% der Kontrolle).
-
Somit
zeigen die Ergebnisse einen kurzfristigen spezifischen umkehrbaren
Effekt des Roridin A-konjugierten NR-AN-01 auf Zielzellen, wenn
sie als "Puls"-Behandlung verabreicht werden. Da jedoch
nur die Proteinsynthese in diesen Experimenten ausgewertet wurde,
war es möglich,
dass die zelluluäre
metabolische Aktivität
in den Zellen als Ergebnis der "Puls"-Behandlung beeinträchtigt werden
könnte.
Daher wurden zusätzliche
Studien durchgeführt,
wobei die zelluläre
metabolische Aktivität
nach einer "Puls"-Behandlung ausgewertet
wurde.
-
Effekte nach 5 Minuten
der Exposition: metabolische Aktivität
-
MTT-Assays
wurden 48 Stunden ausgeführt,
nachdem Ziel- und Nichtzielzellen für 5 Minuten RA oder RA-NR-AN-01-Konjugaten
ausgesetzt wurden. Die Zielzellen in diesen Studien enthielten B054-
und A375- und die Nichtzielzellen enthielten HT29-Zellen. Sterile
96 Well-Mikrotiterplatten wurden mit 2500 Zellen/Weil angesetzt,
in Aluminiumfolie eingewickelt und in einer feuchten Kammer, die
5% CO2/95% Luft für 16-18 Stunden inkubiert.
Serielle zweifache Verdünnungen
von Roridin A (RA), 2'RA-HS-NR-AN-01
und 13'RA-HS-NR-AN-01 wurden aus
400 ng/ml bis 780 pg/ml hergestellt, und 100 ml Aliquots der Verdünnungen wurden
in doppelte Wells eingegeben. Nachdem die Testpro ben 5 Minuten ausgesetzt
waren, wurden die Zellen gewaschen, um die Testproben zu beseitigen,
und es wurde frisches Medium hinzugefügt. Die Zellen durften sich
48 Stunden vor dem Test erholen: D.h. die Platten wurden für 48 Stunden
inkubiert, und dann wurde die zelluläre metabolische Aktivität bestimmt,
indem 20 ml/Well einer 5 mg/ml M7T-Lösung hinzugefügt wurde. Die
Platten wurden abgedeckt und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert, und
dann wurde die Reaktion, wie oben beschrieben entwickelt (siehe
BEISPIEL 4, oben). Das dunkelblau gelöste Formazanreaktionsprodukt
wurde bei Raumtemperatur nach 16-18 Stunden Inkubation entwickelt.
Die Proben wurden mittels eines ELISA Mikrotiterplattenlesegeräts bei einer
Absorptions von 570 nm quantifiziert.
-
8A zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, welche die Effekte darauf untersuchen, B054 marker-positive
glatte Muskelzellen 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen
von Roridin A (offene Quadrate, 8A),
2'RANR-AN-01 (NRAN01-2'RA; geschlossene
Rauten, 8A) oder 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene Quadrate, 8A) auszusetzen. Die Ergebnisse wurden in ähnlicher
Weise ausgeführt
wie oben in Bezug auf 7B beschrieben, wobei aber
die metabolische Aktivität
durch einen MTT-Assay
geprüft
wurde, d.h. anstatt der Proteinsynthese wie in 7B, und den Zellen wurden auch 48 Stunden Erholung
gegeben (anstatt 24 Stunden wie in 7B).
Die Ergebnisse der Experimente sind in ähnlicher Weise aufgetragen
wie jene, die (oben) in Bezug auf 7A beschrieben
sind.
-
8B zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, die die Effekte darauf untersuchen, A375 m/m marker-positive
Zellen für
5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von Roridin A (offene
Quadrate, 8B), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; geschlossene Rauten, 8B), 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene
Quadrate, 8B) auszusetzen. Die Experi mente
wurden in ähnlicher
Weise durchgeführt
(und die Ergebnisse aufgetragen) wie jene, die oben in Bezug auf 8A beschrieben sind.
-
8C zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro
Studien, die die Effekte darauf untersuchen, HT29 marker-negative
Zellen für
5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von Roridin A (offene
Quadrate, 80), 2'RA-NR-AN-01(NRAN01-2'RA; geschlossene Rauten, 80), 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene
Quadrate, 8C) auszusetzen. Die Experimente
wurden in ähnlicher
Weise ausgeführt
(und die Ergebnisse aufgetragen) wie jene, die oben in Bezug auf 8A beschrieben sind.
-
Die
in den 8A bis 8C dargestellten
Ergebnisse zeigen leichte Unterschiede zwischen den unterchiedlichen
RA-NR-AN-01-Konjugaten bei den höchsten
Dosen, wobei aber bei den geringeren Dosierungen das 2'- und 13'RA-NR-AN-01 die metabolischen
Aktivität
der Targeszellen (d.h. B054 und A375) oder Nichtzielzellen (d.h.
HT29) über
die längere
Frist (d.h. 48 Stunden) nicht signifikant hemmte. Somit legen die Ergebnisse
nahe, dass die kurzfristige Hemmung der Zielzellproteinsynthese
(7C bis 7D,
oben) nicht zu langfristigen metabolischen Effekten auf die Zellen
führt,
wie messbar in MTT-Assays. Dass diese Assays in der Lage waren,
metabolische Veränderungen
in den Zellen infolge einer 5-minütigen Exposition zu detektieren,
ergibt sich aus den Resultaten, die mit freiem Roridin erhalten
wurden. In diesem Fall war freies Roridin A für Ziel- und Nichtzielzelltypen
nicht spezifisch inhibierend, auch wenn die Zellen dem Mittel für nur 5
Minuten ausgesetzt wurden und dann zur Kultur für die 48-stündige Erholungsdauer zurückgebracht
wurden (8A bis 8C).
-
Somit
legen die Feststellungen mit freiem Roridin A nahe, dass MTT-Assay
in der Lage war, metabolische Veränderungen zu erfassen, die
während
einer 5-minütigen Einwirkung
induziert wurden. Zusammengenommen legen diese Feststellungen nahe,
dass die RA-NR-AN-01-Konjugate die Targezellaktivität spezifisch
inhibieren können
(d.h. die Proteinsynthese), wenn sie in einer "Puls"-Behandlung
verabreicht werden, und dass diese Effekte reversibel waren, ohne
signifikante langfristige Effekte auf entweder die Proteinsynthese
oder die zelluläre
metabolische Aktivität
(gemessen in einem MTT-Assay). Diese in vitro Eigenschaften von RA-NR-AN-01-Konjugaten
wurden als hochnützlich
für die
Hemmung der Glatten-Muskelzellaktivität in vivo bewertet.
-
Daher
wurden als Nächstes
Tiermodellstudien durchgeführt,
um die Effekte dieser therapeutischen Konjugate in vivo auszuwerten.
-
BEISPIEL 6
-
Bestimmung
der Infusionsbedingungen in einem Tiermodell
-
Die
therapeutischen Konjugate der Erfindung sind nützlich, um eine Stenose nach
einem Gefäßtrauma oder
einer Gefäßerkrankung
zu inhibieren. In einem illustrativen Beispiel wird ein Gefäßtrauma,
das während Angioplastie
induziert wird, während
der chirurgischen Prozedur behandelt, indem der Katheter entfernt
wird, der zur Durchführung
der Angioplastie verwendet wird, und indem ein Balloninfusionskatheter
in das Gefäß eingeführt wird.
Der Infusionskatheter wird mit der Eintröpfelöffnung (oder alternativ einem
permeablen Membranbereich) in dem traumatisierten Bereich des Gefäßes positioniert
und dann wird Druck angelegt, um das therapeutische Konjugat einzuführen. Z.
B. kann ein Infusionskatheter mit zwei Ballonen verwendet werden, und
wenn ein Ballon jederseits des Verletzungsorts aufgepumpt wird,
entsteht ein Fluidraum, der mit einem geeigneten Infusionsfluid
gefüllt
werden kann, das das therapeutische Konjugat enthält. Es ist
früher
berichtet worden, dass die Infusion von Meerrettichperoxidase (HRP)
Markerenzym bei einem Druck von 300 mmHg über 45 Sekunden in Hund- oder
Menschen-Coronararterien dazu führte,
dass das HRP in die Gefäßwand eindringt
(6). Jedoch ist HRP ein kleineres Molekül als NR-AN-01, und Menschen-
und Hunde-Coronararterien sind auch beträchtlich kleiner als die Carotis-
oder Oberschenkelarterien in dem vorliegenden Hausschwein-Modellsystem. Es
wurden daher Experimente ausgeführt,
um in einem Hausschwein-Modellsystem die Infusionsbedingungen zu
bestimmen, die zum Verabreichen eines therapeutischen Konjugats
zu den vaskulären
glatten Muskelzellen in Carotis- und Oberschenkelarterien geeignet
sind. Die Verabreichungsbedingungen wurden überwacht, indem das Eindringen
des therapeutischen Konjugats in die Gefäßwand sowie die spezifische
Bindung des therapeutischen Konjugats an die vaskulären glatten
Muskelzellen in der Gefäßwand ausgewertet
wurden.
-
Unter
Verwendung eines Infusionskatheters wurden die Coronar- und Oberschenkelarterien
von Hausschweinen oder nicht-menschlichen Primaten mit NR-AN-01 für 45 Sekunden
bis 3 Minuten bei mehreren Drücken
im Bereich von etwa 0,4 Atmosphären
(300 mmHg) bis 3 Atmosphären
infundiert. Nach der Infusion wurden die Gefäße mit steriler Salzlösung gespült und immunohistochemisch
präpariert,
unter Verwendung von HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG, um das
NR-AN-01-Maus-IgG in der Gefäßwand zu
detektieren. Es wurde bestimmt, dass eine volle Durchdringung von
NR-AN-01 in die Gefäßwände bei
einem Druck von 3 Atmosphären
nach 3 Minuten erreicht wurden.
-
Es
wurd auch Immunohistologie verwendet, um zu bestimmen, welche Tiermodellsysteme
das Zielantigen für
NR-AN-01 exprimiert hatten. Gefäßgewebeschnitte
von leicht verfügbaren
Versuchstierarten wurden NR-AN-01 ausgesetzt, gewaschen und mit
HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG in Reaktion gebracht. Es stellte
sich heraus, dass nur nicht-menschliche Primaten und Schweine sich
250 kD NR-AN-01 Zielantigen mit dem Menschen teilen.
-
Um
zu bestimmen, ob NR-AN-01 in spezifischer Weise an sein Zielantigen
in vivo binden könnte,
wurden die Coronar- und Oberschenkelarterien von Hausschweinen mit
therapeutischen Konjugaten mittels eines Infusionskatheters infundiert,
wurden die Infusionsstellen mit steriler Salzlösung gespült und dann wurden die Operationsstellen
geschlossen, und die Tiere wurden für zusätzliche 3-5 Tage gehalten.
Am Ende dieser Zeit wurden die Gefäßinfusionsstellen herausgenommen
und zur Immunohistologie präpariert,
wiederum unter Verwendung von Ziegen-anti-Maus-IgG, um NR-AN-01
zu identifizieren. NR-AN-01 wurde in der Gefäßwand von Schweinecoronar-
und -oberschenkelarterien 3-5 Tage nach der Operation identifiziert,
und es erschien, dass NR-AN-01 nur vaskulären glatten Muskelzellen assoziiert
war. Diese Feststellungen legen nahe, dass NR-AN-01 in der Lage
ist, spezifisch an sein Zielantigen in vivo zu binden.
-
BEISPIEL 7
-
Hemmung vaskulärer glatter
Muskelzellen in vivo
-
Die
intimale glatte Muskelproliferation, die einem Ballonkatheter-induzierten
Trauma folgt, ist ein gutes Modell, um die therapeutische Wirksamkeit
von Konjugaten zur Hemmung der Glatten-Muskelzellaktivität in vivo
in Antwort auf ein Gefäßtrauma,
einschließlich
Restenose nach Angioplastie, auszuwerten. Hausschweine wurden verwendet,
um die Effekte von NR-AN-01 zu untersuchen (d.h. in diesen Studien
als Glattes-Gefäßmuskelbindungsprotein
oder einfach VSMBP bezeichnet; und die therapeutischen Konjugate
mit Roridin A sind mit VSMBP-RA bezeichnet). Die Ereignisse, die
normalerweise einer Ballonangioplastik in der Schweinearterie folgen,
sind zuvor beschrieben worden (12). In diesen Studien führte die
Dilatation der Caortisarterie mittels eines übergroßen Ballons (Ballon : Arterienverhältnis angenähert 1,5
: 1) in einer kompletten endothelialen Denudation über einen
Bereich von 1,5-2 cm Länge.
Obwohl diese Länge
der traumatischen Verletzung im Versuch ausgewählt wurde, eine Thrombose zu
minimieren, gab es noch immer eine merkliche Plättchenablagerung und Thrombusbildung.
Die Prozdur resultierte auch in einer Dissektion durch die interne
elastische Schicht in die artielle Media und Necrose der medialen
glatten Muskelzellen. Eine Intimaverdickung aufgrund der glatten
Muskelproliferation erschien 7 Tage nach der Verletzung und erreichte
eine mittlere maximale Dicke von 85 mm nach 14 Tagen. Das histologische
Bild dieser Neointima ist sehr ähnlich
dem proliferativen neointimalen Gewebe einer humanen Restenose (13).
-
Es
wurde ein Einzeldosis-Testprotokoll in Hausschweinen mit NR-AN-01-Roridin A-Konjugaten
durchgeführt.
Eine lokalisierte Verabreichung der Testkonjugate, d.h. durch einen
Katheter in einen Bereich eines traumatisierten Gefäßes, das
durch temporäre
Schlupfligaturen begrenzt wurde, war ausgestaltet, um die systemische
Toxizität
zu reduzieren, während
für einen
hohen Pegel dafür
gesorgt wurde, die glatten Zielmuskelzellen auszusetzen. Dieser
intraarterielle Verabreichungsweg in Tiermodellstudien simuliert
die vorgeschlagene Route in humanen Coronararterien. Das Testprotokoll
war ausgestaltet als initiales in vivo Screening von intraarteriolaren,
ortsspezifischen, katheterverabreichten, glatten Gefäßmuskelbindungsprotein (VSMBP)-Konjugaten.
-
Die
Toxizität
des freien Medikaments wurde auch ausgewertet, d.h. für pathobiologische
Effekte auf arteriolare glatte Muskelzellen. Die therapeutisch wirksame
Dosis von Roridin A-NR-AN-01-Konjugat wurde durch in vitro Studien
bestimmt, und der richtige intraarteriolare Verabreichungsdruck
wurde bestimmt, indem freie MAb- und MAb-Konjugate Tieren verabreicht
wurde, wie oben in BEISPIEL 7 beschrieben.
-
Sechs
Mischlings-Hausschweine (Duroc X), entwöhnte Ferkel von angenähert 30
Pfund Körpergewicht,
wurden in dem Experiment verwendet. Die Tiere wurden nach Zufall
dem folgenden Behandlungsregime zugeordnet, wobei jedes Schwein
vier unterschiedliche Behandlungen hatte, aufgeteilt zwischen den
rechten und linken Caortis- und Oberschenkelarterien, deren eine
eine PBS-Kontrolle war (Tabellen 1-3, unten). Tabelle
1
-
Chirurgisches Verfahren:
-
Testkonjugate
und Kontrollverbindungen wurden als einzel-intraarterielle Infusion
am Ort der endothelialen Denudierung und des Traumas, induziert
durch einen Ballonkatheter, verabreicht. Beide carotiden und Oberschenkelarterien
wurden über
1 cm bis 2 cm Endothel durch intraluminale Passage eines 23 cm, Größe 3 (Oberschenkel)
und Größe 4 (carotid)
Uresil Vascu-Flo® Silikonverschlussballonkatheters
(Uresil Technology Center, Skokie, IL) abgeschliffen, ausreichend
mit Salzlösung
gedehnt, um einen leichten Widerstand zu erzeugen. Diese Technik
erzeugte eine leichte Dehnung der Arterie. Nach dieser Behandlung
wurden proximate und distale Schlupfligaturen, 3-0 Seide, nahe den
Enden des abgeschliffenen Bereichs platziert, und ein Größe 8 French
Infant Feeding Katheter (Cutter-Resiflex, Berkeley, CA), der an
einer Inflation Pro® (USCI, C. R. Bard, Inc.,
Billerica, MA) Druckspritze angebracht war, wurde verwendet, um
die Testkonjugate und die Kontrollverbindungen direkt zu dem denudierten
Segment bei einem Druck von 3 Atmosphären für 3 Minuten zu verabreichen.
Die Schlupfligaturen wurden nach der 3-minütigen Aussetzdauer und der
Wiederherstellung der arteriellen Bluflusses entfernt. In diesen
Studien wurden Zweige der Oberschenkel- oder Carotisarterien mit
einer 00 Seidennaht ligiert, um eine Druckinfusion in dem behandelten
Bereich zu erreichen. Der größte distale Zweig
der Oberschenkelarterie (der Saphena-Arterie) wurde eingeschnitten
und als Eintrittsort für
die Katheter verwendet, die dann in die Hauptoberschenkelarterie
eingeführt
wurden. Nach dieser Katheterisierungsprozedur in der Hauptoberschenkelarterie
wurde der sekundäre
Zweig ligiert. In diesen Fällen
wurde Ligation oder Inzision verwendet, um den Eintritt der Katheter
zu erlauben, und die Öffnung
wurde dann mit 3 bis 4 Nähten aus
5-0 Monosilamen-Polybutester (Novafil, D & G Monofil Inc., Monati, PR) verschlossen.
-
Nachfolgende Verfahren:
-
Nach
der Operation wurden die Schweine während der Quarantäne und Operationserholungsdauern in
3 × 5
Fuß Innenlaufställen mit
Zementböden
gehalten. Sie wurden dann für
den Rest der 5-wöchigen
Heilungsdauer vor dem Sammeln der Gewebe zur Histologie zu Innen/Außenlaufställen transferiert.
Die Tiere erholten sich von der Operation normal, ohne Evidenz einer
Blutung oder Entzündung
an den Operationsstellen. Alle sechs Tiere wurden 5 bis 6 Tage nach
der Behandlung mit einem Dopplerstethoskop untersucht, und in jedem
der Tiere waren alle Arterien durchgängig. Nach der Behandlung hatten
alle Tiere einen normalen Appetit, normale Aktivität und normale
Gewichtszunahme.
-
Makroskopische pathologische
und histologische Auswertung:
-
Fünf Wochen
nach der Traumatisierung und Behandlung der Arterien wurden die
Tiere mit 0,6 ml Telazol® (Tiletaminhydrochlorid;
A. H. Robins Co., Richmond, VA) und 0,5 ml Xylazin (Lloyd Laboratories,
Shenandoah, IA) pro 30 Pfund Körpergewicht
durch intramuskulare Injektion sediert, heparinisiert (i.v. 2 ml
Natriumheparin, 1000 Einheiten/ml) und durch im. Pentobarbital euthanasiert.
Es wurden beide rechten und linken Carotis- und Oberschenkelarterien
entfernt, wobei das normale Gefäß sowohl
das proximale als auch das distale bis zum behandelten Segment enthielt.
Die Arterien wurden gemessen und der Ort der Ligaturen und allgemeine
Abnormalitäten
wurden notiert. Die Arterien wurden mit 2 mm Abständen durch
Schnitte und in der Reihenfolge in Cryoform mit O.C.T (optimaler
Schneidtemperatur) Verbindung (Tissue Tek®, Miles
Laboratories Inc., Elkhart, IN) angeordnet und in flüssigem Stickstoff
gefroren. Die Blöcke
wurden auf 5 um geschnitten und mit H/E, Massons Trichrome und Movats
Pentachrome für
morphologische Untersuchungen gefärbt. Die Schnitte wurden auch
für die
immunohistologische Färbung
von glattem Gefäßmuskel
verwendet.
-
Die
histologische Untersuchung der Stufenschnitte der Arterien ergab
eine merkliche Hemmung der intimalen Glatten-Muskelproliferation
in den Bereichen, die traumatisiert und mit RA-NR-AN-01-Konjugaten behandelt
waren (Tabelle 2). Diese Hemmung war auch in der submakroskopischen
Auswertung der Gefäße evident.
Die Hemmung der intimalen Glatten-Gefäßmuskelproliferation
wrude mit minimaler oder keiner histologischen Evidenz des Glatten-Muskelzelltodes
in der Arterienwand erzeugt. Ein Querschnitt einer solchen traumatisierten
Arterie ist in den
9A und
9B angegeben. Tabelle
2 INTIMALE
GLATTE GEFAßMUSKELPROLIFERATION
IN TRAUMATISIERTEN UND BEHANDELTEN SCHWEINEARTERIEN
- *Intimale SMC-Hypertrophie: intimale Glatte-Muskelzellhypertrophie,
bewertet auf einer Skala von 1+ (minimal) bis 4+ (maximal)
-
Die
in 9A dargestellten Ergebnisse zeigen (bei 160-facher
Vergrößerung)
einen Querschnitt einer unbehandelten Arterie 5 Wochen nach Angioplastie.
Dominante histologische Merkmale der Arterie enthalten eine Verlagerung
des Endothels (siehe #1 in 9A)
von der internen elastischen Schicht weg (sie he #2, 9A), scheinbar aufgrund der intimalen Glatten-Muskelproliferation
(siehe #3, 9A).
-
Die
in 9B dargestellten Ergebnisse zeigen (bei 160-facher
Vergrößerung)
einen Querschnitt einer behandelten Arterie 5 Wochen nach Angioplastie
und Infusion des therapeutischen RA-NR-AN-01-Konjugats. Das Gefäß in diesem
Schnitt wurde größeren mechanischen
Belastungen unterzogen als das in 9A gezeigte
Gefäß, mit mehreren
Stellen, wo die externe elastische Membran riss, und es wurde eine
zugeordnete Proliferation glatter Muskelzellen in den äußeren Schichten
der Media beobachtet (siehe #4 in 9B).
Die Behandlung mit therapeutischem Konjugat hemmte die intimate
Hypertrophie, wie sich aus dem Fehlen der Verlagerung des Endothels
(siehe #1, 9B) von der internen elastischen
Schicht (siehe #2, 9B) ergibt. Überraschenderweise
wurde dieser inhibitorische Effekt auf die intimalen glatten Muskelzellen
erreicht, ohne die Hypertrophie der medialen glatten Muskelzellen
in Bereichen zu inhibieren, wo die externe elastische Membran gerissen
war (siehe #4, 9B).
-
Dies
ist ein besonders glückliches
Ergebnis, weil die Wundheilung in dem behandelten Gefäß fortschreitet,
ohne nachteilige Konsequenzen der Intimahyperplasie und Stenose
oder Nekrose glatter Muskelzellen in der Media.
-
In
diesen histologischen Studien wurden auch Vergleiche der Wirksamkeit
sowohl des 2'- als
auch 13'-Roridin
A-Konjugats durchgeführt,
mit der Feststellung, dass das 13'-Konjugat (d.h. 13'RA-HS-NR-AN-01) stärker aktiv bei der Hemmung
der intimalen Hyperplasie der glatten Muskelzellen erschien als
das 2'-Konjugat (d.h. 2'RA-HS-NR-AN-01).
In dieser Studie schien die Niederdruckinfusion des 13'-Konjugats die glatte
Muskelzellproliferation effizienter zu inhibieren als der hohe Druck,
und auch das 13'-Konjugat
schien effizienter zu sein als das 2'-Konjugat.
-
In 9B führte
das therapeutische Konjugat, das am Ort nach Angioplastie verabreicht
wurde, in einer angenähert
95%igen Hemmung der Glatten-Muskelhypertrophie,
die das Lumen des unbehandelten Gefäßes einschränkte (9A).
Das therapeutische Konjugat übte
signifikant seine Effekte auf die glatten Muskelzellen aus, die
von den medialen glatten Muskelschichten in die Intima wandern,
ohne das Endothel zu beeinträchtigen
noch irgend welche Anzeichen von Nekrose (d.h. Zelltod) in den glatten
Muskelzellen in den medialen Schichten der Arterienwand zu erzeugen.
Die Studien zeigten auch keinerlei histologische Anzeichen einer
mononuklearen Infiltration oder Fibrose, die aus toxischen Effekten
auf die Gefäßwand resultieren
könnten.
Auch wurden sichtbare Anzeichen der Heilung in den intimalen Schichten
behandelter Gefäße beobachtet, und
mit beobachtetem Nachwachstum des Endothels, d.h. Endothelzellen,
die über
die dünne
Schicht glatter Muskelzellen in der Intima hinweg wachsen, die zwischen
dem Endothel und der internen elastischen Schicht liegen (d.h. #
1 und #2 in 9B). Diese kombinierten histologischen
Beobachtungen belegen die hocherwünschten Merkmale der Wundheilung,
des Neuwachstums von Endothel und einer verbesserten Gefäßstabilität nach einer
Behandlung mit einem therapeutischen Konjugat, das Glatte-Muskelhyperplasie
in den intimalen Schichten des Gefäßes hemmt.
-
BEISPIEL 8
-
Glatte-Gefäßmuskelzell-in
vitro-DNA- und Proteinsynthesehemmung
-
Die
Fähigkeit
verschiedener therapeutischer Mittel, die DNA-Synthese und Proteinsynthese
in vaskulären
glatten Muskelzellen zu inhibieren, wurde getestet. 3H-Thymidinaufnahme
und Zytotoxizitätsassays
wurden gemäß den folgenden
Protokollen durchgeführt.
-
5-Minuten-Exposition: 3H-Leucinaufnahme:
-
Vaskuläre glatte
Muskelzellen wurden mit 40.000 Zellen/ml in sterile 24 Wellplatten
mit 1 mIM/ell angesetzt. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C, 5% CO2, 95 Luft in einer angefeuchteten Atmosphäre (Sättigung)
inkubiert. Logarithmische Verdünnungen
des interessierenden therapeutischen Mittels wurden mit vaskulären glatten
Muskelzellen für
5 Minuten oder 24 Stunden inkubiert. Proben der therapeutischen
Mittel wurden in DMEM F-12 Medium (Whittaker Bioproducts, Walkersville,
Maryland) mit 5%igem fötalem
Rinderserum (FBS, Gibco BRL, Gaithersbur, MD) und 5% Serum Plus® (JRH
Biosciences, Lenexa, KS) verdünnt.
Nach der Inkubation mit therapeutischem Mittel wurde die Lösung abgesaugt,
und es wurde 1 ml/Well von 0,5 Mikrocurie/ml 3N-Leucin
in leucinfreiem DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle's
Medium) mit 5% Serum Plus hinzugefügt. Die Platten wurden über Nacht
bei 37°C,
5% CO2 in angefeuchteter Atmosphäre nachinkubiert.
Die Zellen wurden visuell mittels eines Umkehrmikroskops unter Verwendung
einer Bewertungsskala eingeteilt, um die Lebensfähigkeit und Zellzahl zu bestimmen.
Die 1 bis 3 Einteilung basiert auf dem Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit
und der Anzahl im Vergleich zu Kontrollwells, wobei 3 = 100%, 2
= 70% bis 100% und 1 = 0% bis 70%. Eine Aufzeichnung dieser Bewertung
unterstützte
die Bestimmung des unmittelbaren zytotoxischen Effekts der therapeutischen
Mittel. Das Medium wurde dann abgesaugt, und die Zellen wurden zwei
Mal mit kaltem 5%igem TCA gewaschen. 400 Mikroliter 0,2 M NaOH wurden
pro Well hinzugefügt,
und die Platten wurden für 2
Stunden bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform inkubiert.
200 Mikroliter/Well der Zelllösung wurden
in Kunststoffszintillationsfläschchen überführt (Bio-Rad
Laboratories), und 4 Milliliter Bio-Safe® II
flüssige
Szintillationsflüssigkeit
(Research Products InterCorp. Mount Prospect, IL) wurden vor dem
Umrühren
hinzugefügt.
Die Fläschchen
wurden an einem Beckman LS2800 Flüssigszintillationszählergezählt, Schnittstelle mit
Beckman "Data Capture" Software zur Umwandlung
in eine Lotus 1-2-3® Datei und Analyse mittels
Lotus 1-2-3®.
-
5-Minuten Exposition: 3H-Thymidinaufnahme: _
-
Vaskuläre glatte
Muskelzellen wurden in einem vollständigen Medium mit 5% FBS (Gibco) über Nacht bei
37°C in
einer angefeuchteten 5%igen CO2 Umgebung
in sterilen 24 Wellplatten inkubiert. Das Medium wurde von den Wells
abgesaugt, und serumfreies Medium wurde hinzugefügt, ergänzt mit Wachstumsfaktoren (DMEM
: F12 Grundmedium, ergänzt
mit einem Wachstumsfaktorcocktail, Katalognummer 11884, welches enthält Insulin
(5 Mikrogramm/ml), Transferrin (5 Mikrogramm/ml) und Natriumselenit
(5 Nanogramm/ml), erhältlich
bei Sigma Chemical, St. Louis; Missouri). Die Zellen wurden in diesem
Medium für
24 Stunden inkubiert. Für
eine 5-minütige
Exposition einem therapeutischen Mittel wurden logarithmische Verdünnungen
des therapeutischen Mittels mit den Zellen in komplettem Medium
inkubiert. Nach 5 Minuten und Absaugen des Mediums wurden 1 ml/Well
von 1,0 Mikrocurie/ml 3H-Thymidin, dispergiert
in komplettem Medium, hinzugefügt.
Die 24-stündige
Exposition involvierte die Inkubation der Zellen mit 1 ml/Well von
1,0 Mikrocurie/ml von 3H-Thymidin, dispergiert
in einem kompletten Medium, und es wurden logarithmische Verdünnungen
des therapeutischen Mittels getestet. In beiden Expositions-Versuchen
wurden die Zellen über
Nacht bei 37°C
in einer angefeuchteten 5%igen CO2 Umgebung
behandelt. Die Zellen wurden auf Lebensfähigkeit und Zellzahl visuell bewertet.
Die Zellen wurden gewaschen und präpariert, um sie in Kunststoffszintillationsfläschchen
zu überführen, wie
für das
3H-Leucinprotokoll beschrieben. Die Fläschchen wurden an einem Beckman
LS2800 Flüssigszintillationszähler gezählt, mit
Schnittstelle zu Beckman "Data
Capture" Software
zur Umwandlung in eine Lotus 1-2-3® Datei
und Analyse mittels Lotus 1-2-3®.
-
Diese
Protokolle sind zur Verwendung mit anderen Zielzellpopulationen
geeignet, insbesondere adhärenten
einschichtigen Zelltypen.
-
Morphologische Auswertung
der Zytotoxizität-Puls-Exposition:
-
Vaskuläre glatte
Muskelzellen wurden mit 4,0 × 104 Zellen/ml Medium/Weil auf einem kommerziell
vorbereiteten Vierwellobjektträger
(Nunc. Inc., Naperville, Illinois) angesetzt. Es wurden ausreichend
Objektträger angesetzt,
um zwei gepulste Expositionsdauern (5 Minuten und 24 Stunden) sowie
eine vorgeschriebene Stufung von Auswertungspunkten (24 Stunden
bis 128 Stunden) aufzunehmen. Alle Objektträger wurden doppelt gefahren,
um etwaige Assayanomalien zu entdecken. Der therapeutische Mittel
wurde in dem gleichen Medium verdünnt, das in den 3H-Leucin-
und 3H-Thymidinassays benutzt wurde. Jeder
Vierwellobjektträger
wurde konzentrationsmäßig gruppiert,
zu einer loggrößeren Konzentration
(Welt "B"), einer log-niedrigeren
Konzentration (Welt "D"), der minimalen
wirksamen Konzentration (Weil "C"), bestimmt durch
die 3H-Leucin- und 3H-Thymidinassays, wie oben beschrieben. Als
Kontrolle für
normale Morphologie wurde ein Well (Weil "A") unbehandelt
belassen (nur Medium). Die Inkubation erfolgte in einem 37°C, 5 % CO2 befeuchteten Inkubator. Nach jeweils zwei
(5 Minuten und 24 Stunden) Expositionspunkten wurde das therapeutische
Mittelmedium aus jedem Well abgesaugt, einschließlich dem unbehandelten Well.
Dann wurde 1 ml frisches Medium hinzugefügt, um das abgesaugte Medium
zu ersetzen. Die Reinkubation erfolgte, bis jeder der gestuften
Auswertungspunkte erreicht wurde. An diesen Punkten wurde das Medium
abgesaugt und anschließend
durch 1 ml 10%igem neutral gepufferten Formalin für 1 Stunde
ersetzt, um die richtige Fixierung zu erlauben. Diese fixierten
Objektträger
wurden in Hematoxylin (nuklear) und Eosin (zytoplasmatisch) zur
morphologischen Auswertung und Einteilung gefärbt.
-
Ergebnisse:
-
Die
Ergebnisse des 24-Stunden 3H-Leucin-Proteinhemmassays
und des 24-Stunden 3H-Thymidin-DNA-Synthesehemmassays sind in
den 10A-10D für Suramin,
Staurosporin, Nitroglycerin bzw. Cytochalasin B gezeigt. Alle der
getesteten Verbindungen zeigten einen verfügbaren therapeutischen Bereich (die
Fläche
unter der Kurve des 3H-Leucin-Assays ist
größer als
jene, die von dem 3H-Thymidin-Assay herrührt), was
die Nützlichkeit
in der Praxis von Retarddosierungsform Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung anzeigt. Insbesondere hemmten die Verbindungen die Fähigkeit
vaskulärer
glatter Muskelzellen, einer DNA-Synthese zu unterliegen, in der
Gegenwart von 5% FPS um ein größeres Ausmaß als sie
die Proteinsynthese vaskulärer
glatter Muskelzellen hemmten. Die Protein- und DNA-Synthesehemmeffekte
von Suramin, Staurosporin, Nitroglycerin und Cytochalasin B während einer
5-minütigen
und 24-stündigen gepulsten
Exposition sind jeweils in 10A-D
gezeigt.
-
BEISPIEL 9
-
Spezifische Bindung und
Internalisierung von targetisierten Partikeln durch vaskuläre glatte
Muskelzellen
-
Die
Fähigkeit
vaskulärer
glatter Muskelzellen, an mit Bindungsprotein oder – peptid
beschichtete Partikel zu binden oder diese zu internalisieren, wurde
mit monoklonalem Antikörper
(NR-AN-01) beschichteten Goldkügelchen
sowol in vitro als auch in vivo demonstriert. Die Glatten-Gefäßmuskelzell-Gewebekulturen (B054),
eine antigenpositive Kontrollzelllinie (A375) sowie eine antigennegative
Kontrollzelllinie (HT29) wurden mit 10 nm Goldkügelchen inkubiert, mit einer
Gruppe, die mit NR-AN-01 beschichtet war, und einer zweiten unbeschichteten
Kontrollgruppe. Diese Zellen wurden den Kügelchen als einschichtige und
Zellsuspensionskulturen ausgesetzt, und wurden auf Bindung und Internalisierung
durch Elektronenmikroskopie zu sechs Zeitpunkten überprüft (d.h.
1 Minute, 5 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 50 Minuten und 24 Stunden).
-
Tabelle
3 zeigt diese Ergebnisse der Experimente, was anzeigt, dass die
Bindung an die Zelloberfläche spezifisch
ist. Das relative Einteilungssystem, das in Tabelle 3 insgesamt
verwendet wurde, repräsentiert
eine subjektive Bewertung der Partikelbindung, wobei 0 = keine,
1 = minimal, 2 = mäßig, 3 =
moderat und 4 = deutlich. Wenn sich Partikelaggregate auf der einschichtigen
Oberfläche
sowohl der glatten Muskelzellen als auch der Kontrollzellen ansiedelten,
wurden die Partikel durch Makro- und Mikrophagozytose nicht spezifisch
internalisiert. Wenn die Zellen in der Zellsuspension verblieben,
war die nicht spezifische Internalisierung minimal oder fehlte.
Das nicht spezifosche Anhaften der Goldperlen ohne NR-AN-01 auf
dem von HT29-Zellen erzeugten Oberflächenmucin wurde beobachtet,
was zur mäßigsten
nicht spezifischen Internalisierung davon führte. Die Glatte-Gefäßmuskel-Aufnahme
von NR-AN-01 targetisierten Goldperlen war in Zellsuspensionskulturen hochspezifisch.
-
-
-
-
11 zeigt einen tangentialen Schnitt parallel zur
Innenoberfläche
einer glatten Muskelzelle, gekennzeichnet durch zahlreiche endocytische
Vesikel, von denen einige antikörperbeschichtete
Goldperlen enthalten, im Prozess der Internalisierung durch die
Zelle. Diese endocytischen Vesikel mit an Zelloberflächenantigenen
haftenden Partikeln wurden zur Verschmelzung mit Lysosomen angeregt,
mit einer höheren
als der erwarteten Rate für
den normalen Zelloberflächenmembranumsatz.
Die resultierende merkliche Ansammlung internalisierter Partikel
wurde an dem 24-stündigen Zeitpunkt
beobachtet und ist in 12 gezeigt.
-
Die
targetisierte Goldperlen-Glatte-Gefäßmuskelzell-Oberflächenbindung,
Internalisierung und Lysosomenkonzentration wurde auch in vivo beobachtet.
NR-AN-01-beschichtete
Goldperlen wurden über
einen intravaskulären
Katheter infundiert, offenendig mit einem behandelten Bereich, der
proximal und distal mit Schlupfligaturen verschlossen war, bei 3
atm Druck angelegt für
3 Minuten in die Wand einer Schweineoberschenkelarterie unmittelbar
nach einem Ballontrauma. Die Kügelchenintemalisierungsrate
variierte mit dem Grad der Beschädigung,
der während
des Ballontraumas von der vaskulären
glatten Muskelzelle gehalten wurde. Zellen mit minimaler oder keiner
Beschädigung
internalisierten die Partikel durch Endozytose und Phagozytose schnell,
wobei die internalisierten Partikel in Lysosomen konzentriert wurden.
-
Zellen,
die durch das Trauma getötet
wurden, zeigten eine Oberflächenperlenbinden.
Zellen, die durch das Trauma beschädigt wurden, jedoch überlebten,
waren durch Perlenoberflächenbindung
mit verzögerter
Internalisierung und Lysosomenkonzentration gekennzeichnet. 13 zeigt die Partikelkonzentration in Lysosomen
in vivo eine Woche nach Verabreichung der Kügelchen.
-
BEISPIEL 10
-
Glatte
Gefäßmuskel
in vitro DNA- und Proteinsynthesehemmung durch Staurosporin und
Cytochalasin Die Fähigkeit
von Staurosporin und Cytochalasin, DNA- und Proteinsynthese in vaskulären glatten
Muskelzellen in vitro zu inhibieren, wurde getestet. 3H-Leucin- und 3H-Thymidinaufnahme
und Zytotoxizitätsassays wurden
gemäß den folgenden
Protokollen durchgeführt.
-
Kulturzellen:
-
B054-Zellen
(vaskuläre
glatte Muskelzellen vom Pavian) wurden von Explantaten von Aorta-Glatten-Gefäßmuskelzellen
vom Pavian erhalten. Die Zellen wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium): F-12 Medium
(Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) mit 5% fötalem Rinderserum
(FBS, Gibco) und 5% Serum Plus® ("komplettes Medium") ausgebreitet, und eine Ansatzmenge
von Zellen wurde im flüssigen
Stickstoff zur künftigen
Verwendung in Durchlauf sieben gefroren.
-
5 Minuten-Exposition:
Proteinsyntheseassay:
-
Vaskuläre glatte
Muskelzellen mit 40.000-50.000 Zellen/ml wurden angesetzt und bearbeitet,
wie in BEISPIEL 8 beschrieben, "5
Minuten Exposition; 3H-Leucinaufnahme". Logarithmische Verdünnungen
von Staurosporin (200 ng/ml, 20 ng/ml, 2 ng/ml, 0,2 ng/ml und 0,02
ng/ml) wurden im kompletten Medium verteilt. Für Cytochalasin B wurden log-Verdünnungen
mit 20 pg/ml, 2,0 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml und 0,002 pg/ml im
kompletten Medium verteilt. Das komplette Medium wurde dann zu den
Kontrollwells gegeben. Ein ml/Well jeder therapeutischen Mittelverdünnung wurde
in Vierfachwells gegeben, und der interessierende Mittel wurde mit
den vaskulären
glatten Muskelzellen für
5 Minuten bei Raumtemperatur in einer steril gelüfteten Haube inkubiert. Nach
der Inkubation des therapeutischen Mittels wurden die Wells anschließend so
behandelt, wie in BEISPIEL 8 beschrieben, "5 Minuten Exposition; 3H-Leucinaufnahme".
-
5 Minuten Exposition:
DNA-Syntheseassay:
-
Glatte
Gefäßmuskel
(B054) Zellen wurden in 24 Wellplatten ausgesetzt und verarbeitet,
wie oben beschrieben, unter "5
Minuten Exposition: Proteinsyntheseassay". Nach 5 Minuten Inkubation mit dem
therapeutischen Testmittel wurde das Medium abgesaugt, und 1 ml/Welt
von 1,0 pCi/ml 3H-Thymidin (anstatt von 3H-Leucin), dispergiert im kompletten Medium,
wurde hinzugefügt.
Die Zellen wurden dann über
Nacht bei 37°C
in einer feuchten 5 % CO2 Umgebung inkubiert.
Der toxische Effekt des therapeutischen Mittels wurde dann bestimmt,
wie oben in dem Proteinsyntheseassay beschrieben.
-
24 und 120 Stunden Exposition:
Proteinsyntheseassay:
-
Glatte
Gefäßmuskel
(B054) Zellen mit 20.000 Zellen/ml wurden in sterilen 24 Wellplatten
angesetzt und im kompletten Medium (1 ml/Well) über Nacht bei 37°C, 5% CO2, 95% Luft in einer feuchten Atmosphäre (Sättigung)
inkubiert. Log-Verdünnungen
von Staurosporin (100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml und 0,01 ng/ml)
wurden sequenziell in den zwei Medien verteilt, wie oben beschrieben.
Für Cytochalasin
B wurden log-Verdünnungen
mit 10 pg/ml, 1,0 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,01 pg/ml und 0,001 pg/ml sequenziell
in den zwei Medien verteilt, wie oben beschrieben:
Medium (1)
= komplettes Medium; und
Medium (2) = DMEM (Leucin-frei) mit
0,5 pCi/ml 3H-Leucin.
Medium (2) wird
für die
letzte 24 Stunden Inkubationsdauer des Experiments verwendet.
-
Insbesondere
wurde in dem 24 Stunden-Assay jeder therapeutische Mittel in dem
Medium (2) verdünnt,
wie oben erwähnt.
Medium (1) wurde aus den Wells abgesaugt, und Aliquots therapeutischer
Mittelverdünnungen
in Medium (2) wurden vierfach zu den geeigneten Wells gegeben. Medium
(2) wurde dann zu den Kontrollwells gegeben.
-
In
dem 120 Stunden-Assay wurde jeder therapeutische Mittel in Medium
(1) verdünnt,
wie oben erwähnt.
Medium (1) wurde von den Wells abgesaugt, und Aliquots der therapeutischen
Mittelverdünnungen
in Medium (1) wurden vierfach zu den geeigneten Wells gegeben. Medium
(1) wurde dann zu den Kontrolwells gegeben. Das Medium wurde alle
24 Stunden gewechselt, und es wurde frischer therapeutischer Mittel
zu den Testwells gegeben. Bei 96 Stunden (d.h. dem vierten Tag)
wurde jeder therapeutische Mittel in Medium (2) verdünnt, wie
oben erwähnt.
Medium (1) wurde von den Wells abgesaugt, und Aliquots der therapeutischen
Mittelverdünnungen
in Medium (2) wurden vierfach zu den geeigneten Wells gegeben. Medium
(2) wurde dann zu den Kontrollwells gegeben.
-
Die
Testmittel in 3H-Leucin (und Kontrollen)
wurden über
Nacht bei 37°C,
5% CO2 in einer feuchten Atmosphäre inkubiert.
Der toxische Effekt der therapeutischen Mittel wurde dann bestimmt,
wie oben beschrieben in 5 Minuten Exposition: Proteinsyntheseassay,
oben beschrieben. Zusätzlich
wurden Änderungen
in den Zellen bei jeder Verdünnung
mittels eines Zeiss Mikroskops (Zeiss, Westdeutschland) bei 320X
fotografiert. Das Medium wurde dann abgesaugt und die Zellen wurden
mit TCA bearbeitet, wie oben beschrieben.
-
24 und 120 Stunden Exposition:
DNA-Syntheseassay:
-
Dieser
Assay wurde entsprechend der Prozedur durchgeführt, wie beschrieben für " 24 und 120 Stunden
Exposition: Proteinsyntheseassay",
außer
dass Medium (2) in diesem 24 und 120 Stunden DNA-SYntheseassay ist:
Medium
(2) = komplettes Mediudum mit 1,0 pCi/ml 3H-Thymidin.
-
Medium
(2) wird für
die letzte 24-stndige Inkubation des Experiments verwendet.
-
Diese
Protein- und DNA-Syntheseassays sind zur Verwendung mit anderen
Zielzellpopulationen geeignet, insbesondere anhaftende einschichtige
Zelltypen.
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Ergebnisse:
-
Die
minimal wirksame Dosis (MED) jedes Mittels wurde als Prozentsatz
der Kontrolle bestimmt, die nur mit Medium behandelt wurde; 50%
der Kontrollwerte wurden als die zytotoxische Grenzmarke gewählt. Bei 5
Minuten Exposition zeigte Staurosporin ein MED von 100 ng/ml in
dem Proteinsyntheseassay und 1 ng/ml in dem DNA-Assay. Die 24 Stunden
MED für
Staurosporin war 10 ng/ml in dem Proteinsyntheseassay und 1 ng/ml
in dem DNA-Syntheseassay. Beide Assays ergaben eine MED von 1 ng/ml
für eine
120 Stunden Exposition von Staurosporin.
-
Nach
5 Minuten Exposition zeigte Cytochalasin B eine MED von 10 pg/ml
in dem Proteinsyntheseassay sowie auch in dem DNA-Assay. Die 24
Stunden MED für
Cytochalasin B war 1,0 pg/ml in dem Proteinsyntheseassay und 0,1
pg/ml in dem DNA-Syntheseassay. Beide Assays ergaben eine MED von
angenähert
0,1 pg/ml für
eine 120 Stunden Exposition von Staurosporin.
-
Therapeutische
Cytochalasin C und Cytochalasin D-Mittel wurden in 24 und 48 Stunden
Expositionen unter Verwendung der gleichen Verdünnungen getestet, wie sie oben
für Cytochalasin
B beschrieben sind. In 24 Stunden zeigte Cyto chalasin C eine MED
von 1,0 pg/ml in dem Proteinsyntheseassay und eine MED 0,01 pg/ml
in dem DNA-Syntheseassay. In 24 Stunden zeigte Cytochalasin C eine
MED von 0,1 pg/ml in dem Proteinsyntheseassay, und 0,01 pg/ml in
dem DNA-Syntheseassay. Cytochalasin D zeigte eine MED von 1,0 pg/ml
in dem 24 Stunden Proteinsyntheseassay, und eine MED von 0,1 pg/ml
in dem 24 Stunden DNA-Syntheseassay. Eine 48 Stunden Exposition
für Cytochalasin
D ergab eine MED im Bereich zwischen 0,1 und 0,01 pg/ml sowohl in
den Proteinsynthese- als
auch DNA-Syntheseassays.
-
BEISPIEL 11
-
Migrationshemmung
der vaskulären
glatten Muskelzellen
-
Es
wurden Kratzassays gemäß dem folgenden
Protokoll durchgeführt,
um das Ausmaß der
Migrationshemmung der vaskulären
glatten Muskelzellen durch Cytochalasin B zu bestimmen:
Vaskuläre glatte
Muskelzellen (B054) wurden aus Explantaten des glatten Aortenmuskels
vom Pavian erhalten, wie in BEISPIEL 10 beschrieben. Die Zellen
wurden in flachbödigen
6 Well-Gewebekulturplatten gezüchtet,
die etwa 5 ml Medium enthielten. Die vaskulären glatten Muskelzellen wurden
mit 200.000 Zellen/Well plattiert und bei 37°C in einem befeuchteten 5% CO2 Inkubator für 18 Stunden platziert. Die
Wells wurden dann mit einem sterilen Teil einer einschneidigen Rasierklinge
abgekratzt, die mit einer Klemme oder einer Pinzette gehalten wurde,
und wurden aseptisch mit einem 90°-Winkel
in Kontakt mit dem Boden des Wells gebracht. Die Zellen von der
kleinen Fläche
entlang dem Kratzer wurden mit einem sterilen Baumwollspitzenapplikator entfernt,
während
die Klinge in Kontakt mit dem Boden des Wells war. Nach der Inkubation
zeigt das Vorhandensein der Zellen in der "abgekratzten" Fläche
die Zellmigration über
die Kratzlinie hinweg an. Eine Kontrollinkubation zeigte eine signifikante
Zellmigration und dient als Standard, gegenüber dem die Migration der Zellen, die
dem therapeutischen Mittel ausgesetzt waren, verglichen wird.
-
Kurz
gesagt, wurde eine Vorratslösung
von Cytochalasin B (Simga Chemical Co.) in Dimethylsulfoxid (DMSO)
mit 1 mg/ml hergestellt. Testverdünnungen von Cytochalasin B
oder Kontrollmedium wurden hinzugefügt. Jedes Experiment enthielt
zwei Sätze
von Platten:
Satz A: Testmittel-Exposition für nur 1,
3, 6, 8 und 10 Tage; und
Satz B: Testmittel-Exposition für 1, 3,
6, 8 und 10 Tage, gefolgt von einer siebentägigen Erholungszeit mit Kontrollmedium.
-
Am
Ende der zeitgesteuerten Expositionen wurden beide Plattensätze fixiert
(10% Formalin in PBS) und gefärbt
(0,02% Kristallviolett). Die Testkonzentrationen für Cytachalasin
B waren 1, 01 und 0,01 pg/ml, und eingeschlossen war eine negative
Mediumkontrolle. Frisches Medium und Medikament wurden drei Mal
pro Woche zugeführt.
-
Tabelle
4 zeigt die Ergebnisse dieser Experimente. In dieser Tabelle bezeichnet "M" den Migrationsgrad, wobei – = keine
Migration; +1 = minimal; +2 = mäßig; +3
= moderat; und +4 = deutlich (maximale Dichte; Grenze der Zellkontakthemmung)
Migration vaskulärer
glatter Muskelzellen in den freien Bereich neben dem Kratzer. In
dieser Tabelle bezeichnet "T" einen morphologischen
Toxizitätsgrad;
wobei – =
keine Toxizität;
+1 = minimal; +2 = mäßig; +3
= moderat; und +4 = deutliche Toxizität. Die Migrationsergebnisse
sind ausgedrückt als "Grad in dem freien
Bereich des Wells; Grad in einem ungestörten Bereich des Wells). Die
Toxizitätswerte repräsentieren
einen Grad für
alle Zellen in jedem Well.
-
Die
Daten zeigen an, dass Cytochalasin B die Migration vaskulärer glatter
Muskelzellen in dem freien Bereich benachbart dem Kratzer hemmt
(+1 bis +2) bei einer Dosis von 0,1 pg/ml mit nur minimaler (- bis
+1) morphologischer Toxizität.
Die Daten zeigen auch, dass die behandelten Zellen (0,1 pg/ml) die
Migra tionsfähigkeit
wiedergewinnen (+3 bis +4) nach der Entfernung des therapeutischen
Mittels, auch nach 10 Tagen fortlaufender Exposition dem therapeutischen
Mittel. Tabelle
4 KRATZ-MIGRATIONSASSAY:
MIGRATIONSHEMMUNG GLATTER GEFASSMUSKELZELLEN DURCH CYTOCHALASIN
B
-
BEISPIEL 12
-
Zytotoxische Effekte des
therapeutischen Mittels auf vaskuläre glatte Muskelzellen -Puls-
und kontinuierliche Exposition
-
Vaskuläre glatte
Muskelzellen wurden einem therapeutischen Mittel in einem von zwei
Expositionsformaten ausgesetzt:
Puls-Exposition: Das Puls-Expositionsprotokoll
ist oben in BEISPIEL 8 beschrieben (siehe "Morphologische Toxizitätsauswertung – Puls-Exposition").
-
Kontinuierliche Exposition:
-
Es
wurde die gleiche Methodik für
die morphologische Toxizitätsauswertung
der kontinuierlichen Exposition verwendet wie für die Puls-Exposition, mit
der Ausnahme, dass die Testwells kontinuierlich dem therapeutischen
Mittel in dem Medium während
der Expositionsdauer ausgesetzt wurden. Das Medium und der therapeutische
Mittel wurden aus jedem Well täglich
abgesaugt, einschließlich
von dem unbehandelten Kontrollwell, und wurden mit 1 ml frischem
Medium und therapeutischem Mittel ersetzt (oder Medium allein für die Kontrollwells).
Es folgte eine Reinkubation, bis jeder der stufigen Auswertungspunkte
des langfristigen kontinuierlichen Expositionsprotokolls erreicht
war. Diese gestuften Auswertungszeitpunkte lagen bei 6, 24, 48,
72, 96, 120, 168, 216 und 264 Stunden. Zu der bezeichneten Zeitspanne
wurden die jeweiligen Zellen fixiert, gefärbt und ausgewertet, wie in
dem Puls-Expositionsprotokoll. Die Ergebnisse eines kontinuierlichen
Expositionsexperiments sind in Tabelle 5 für Suramin, Staurosporin und
Cytochalasin B gezeigt. Die in Tabelle 5 dargebotenen 5 Minuten-
und 24 Stundendaten sind Korrelate der Daten, die in den
10A,
10B und
10C enthalten sind. Tabelle
5
-
In
einer in vitro-wirksamen Dosierung zeigten Cytochalasin B (1 pg/ml;
eine antimigratorische konzentrationswirksame Dosis) und Staurosporin
(1 ng/ml; eine antiproliferative wirksame Dosis) einen Toxizitätsgrad von
1 (minimal) bzw. 2 (mäßig). Unabhängige Studien
haben aufgezeigt, dass ein Grad von 3 (moderat) oder weniger für einen
zytostatischen, antiproliferativen Mittel der vorliegenden Erfindung
bevorzugt ist.
-
BEISPIEL 13
-
In vivo BRDU Assav: Hemmung
der Glatten-Gefäßmuskel-Proliferation
BRDU Assav:
-
In
vivo Glatte-Gefäßmuskel-Proliferation
wurde quantifiziert durch Messung der Aufnahme des Basisanalogen
5-Borm-2'-deoxyuridin
(BRDU, erhältlich
bei Sigma Chemical Co.) in DNA während
der zellulären DNA-Synthese
und Proliferation. Die BRDU-Aufnahme wurde histochemisch mittels
monoklonaler Anti-BRDU-Antikörper
aufgezeigt. Diese einstündige
Pulsmarkierung gestattet die Auswertung der Zellenanzahl, die während der
Pulsperiode einer Teilung unterliegen.
-
Das
oben beschriebene BRDU-Pulsmarkierungsprotokoll wird als Standardauswertungstechnik
mit in vivo Schweine-Gefäßstudien
verwendet. Die folgenden chirurgischen und Behandlungsverfahren
(hierin z.B. in den Beispielen 7 und 11 diskutiert) und einer postoperativen
Erholungsdauer wurden die Schweine sediert und 1 Stunde vor dem
Sammeln des Gewebes mit BRDU gepulst.
-
Kurz
gesagt, die Schweine wurden durch intramuskuläre Injektion mit Triletaminhydrochlorid
und Xylazin sediert (wie in Beispiel 7, "Allgemeine Pathologie und histologische
Auswertung"). Das
BRDU wurde dann intravenös über die
laterale Ohrvene verabreicht. Jedem 30-40 Pfund Schwein wurden zwei
ml BRDU bei einer Konzentration von 50 mg/ml verabreicht. Eine Stunde
später
wurden die Schweine durch intravenös verabreichtes Pentobarbital
getötet.
Dann wurden Testarteriensegmente entfernt (ein Segment enthielt
ein proximal angeordnetes normales Gefäß, und falls möglich, distal
in Bezug auf das behandelte Arteriensegment). Die Arteriensegmente
wurden in 2 mm Abständen
durchschnitten; der Reihenfolge nach in Cryoformen mit O.C.T. (optimaler
Schneidtemperatur) Verbindung (Tissue Tek®, Miles
Laboratories, Inc., Elkhart, IN) angeordnet; und in flüssigem Sticktstoff
gefroren. Die Blöcke
wurden auf 5 Mikrometer geschnitten und mittels der folgenden Prozedur
immunohistologisch gefärbt,
um BRDU zu erfassen:
-
BRDU-markierte Zellerfassung:
-
Nach
der BRDU (1 g BRDU, verdünnt
in 17 ml sterilem Wasser und 3 ml 1 N NaOH) Pulsmarkierung, Entfernung
und Schnitt des Testarteriensegments (wie oben), liefert die immunohistochemische
Färbung
mit monoklonalem BRDU-Antikörper ein
visuelles Mittel zur Bestimmung eines Mitoseindex über eine
bestimmte Zeitperiode. Die immunohistochemische Färbemethode
wurde wie folgt durchgeführt:
- 1) 5 pm Schnitte der Testarterie wurden in
kaltem Aceton (–20°C) für 10 Minuten
dehydriert;
- 2) die Schnitte wurden auf Glasmikroskopobjektträgern angebracht,
und die Objektträger
wurden in einem 37°C-Ofen
für 10
Minuten getrocknet;
- 3) die Objektträger
wurden in PBS für
10 Minuten rehydriert;
- 4) die Objektträger
wurden einer Feulgensäure-Hydrolyse
mittels 1 N HCl unterzogen, wobei vor der Prozedur zwei Aliquots
1 N HCl auf 37°C
und 60°C
vorgewärmt
waren;
- 5) die Objektträger
wurden mit 1 ml 1 N HCl bei 37°C
für 1 Minute
gespült;
6) die Objektträger
wurden auf 60°C
1 N HCl für
15 Minuten überführt;
- 7) die Objektträger
wurden mit 1 ml 1 N HCl bei 37°C
für 1 Minute
gespült;
- 8) die Objektträger
wurden bei Raumtemperatur PBS gewaschen, mittels 3 Wechseln von
PBS in 5 Minutenintervallen;
- 9) endogene kreuzreaktive Orte an den Sektionen wurden mit normalem
Ziegenserum (1 : 25 in PBS) für 20
Minuten blockiert;
- 10) die Objektträger
wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
- 11) die Schnitte wurden mit Maus-anti-BRDU-Antikörper (DAKO
Corporation, Carpinteria, CA) mit 10 pg/ml für 30 Minuten inkubiert;
- 12) die Objektträger
wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
- 13) die Schnitte wurden mit Meerrettichperoxidase markiertem
(HRPO)-Ziegen-anti-Maus-IgG,
(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; Verdünnung 1
: 20 in PBS) und 4% humanem AB-Serum für 30 Minuten inkubiert;
- 14) die Objektträger
wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
- 15) die Schnitte wurden mit Farbstoff (3,3'-Diaminobenzidin (DAB; Sigma) mit 5
mg/ml in 200 ml PBS) und 200 pl von 30% H2O2 für
10 Minuten inkubiert;
- 16) die Objektträger
wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
- 17) die Proben wurden mit Gill 1 Hämatoxylin gegengefärbt (Gill
1 Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA; 30 Eintauchungen);
- 18) die Objektträger
wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8; mit Bläuelösung gespült (1 g
Lithiumcarbonat in 500 ml dH2O); mit deionisiertem
Wasser gewaschen; und
- 19) die Testproben wurden dann dehydriert, gereinigt und mit
Deckglas versehen.
-
Als
Schlussfolgerung dieser Prozedur zeigt eine positive immunohistologische
Färbung
an der Reaktionsstelle(n) eine braune Farbe.
-
Zytocidale
Mittel hemmten die BRDU-Aufnahme relativ zu einer PBS-Kontrolle; jedoch
hemmten Cytochalasin B und Staurosporin die BRDU-Aufnahme (d.h. Zellproliferation), ohne
die vaskulären
glatten Muskelzellen abzutöten.
Die Anzahl der mit BRDU markierten vaskulären glatten Muskelzellen wurde
bei 400-facher Vergrößerung wie
folgt zugeordnet:
1 = <_1/Hochleistungsfeld
(HPF);
2 = 2 bis 5/HPF;
3 = > 5 bis <_10/HPF;
und
4 = > 10/HPF.
-
Sowohl
Cytochalasin B als auch Staurosporin hemmten die Proliferation für 24 Stunden
nach einem Ballontrauma (Grad 1), was einen BRDU-Markierungsgrad ergibt, äquivalent
jenem einer vortraumatischen Grundlinie (Grad 1). PBS und monoklonale
Antikörperkontrollen
zeigten einen Grad von 2,5 bis 4 BRDU-Markierung während dergleichen
Zeitspanne. Vier Tage nach dem Trauma zeigten die Arterien, die
mit Cytochalasin B oder Staurosporin behandelt wurden, sowie die
PBS- und monoklonalen Antikörperkontrollen
einen BRDU-Markierungsgrad von 4. Die antiproliferativen, nicht
zytocidalen Eigenschaften von Cytochalasin B und Staurosporin legen
nahe, dass diese Mittel für
die Retarddosierungsformulierungen zur Reduktion von Gefäßstenose
geeignet sind.
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BEISPIEL 14
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Biologische Stentung von
ballontraumatisierten Schweinarterien
-
Verwendung von Cytochalasin
B
-
Ballontraumatisierte
Schweinearterien, die mit Cytochalasin B behandelt wor den waren,
zeigten einen größeren Lumenquerschnitt
an den 4 Tage und 3 Wochen Postbehandlungszeitpunkten im Vergleich
zu Arterien, die mit anderen Testmitteln behandelt waren, oder Kontrollen.
Zehn Oberschenkelarterien (zwei Arterien, erhalten von jedem der
5 Schweine, die gemäß dem in
Beispiel 7 beschriebenen Einzeldosisprotokoll behandelt worden waren)
wurden histologisch ausgewertet. Der maximale Lumenquerschnitt jeder
Arterie wurde aus digitalisierten mikroskopischen Bildern mit einem
BQ System IV computierisierten morphometrischen Analysesystem (R & M Biometrics,
Inc., Nashville, TN) gemessen und berechnet. Dieses Experiment wurde
mit 5 zusätzlichen
Schweinen (zwei Arterien pro Schwein; Cytochalasin B-Dosis = 0,1
pg/ml, Einwirkung für
3 Minuten bei 1 atm Druck; gleiche Zeitpunkte) wiederholt. Die aus
den zwei Experimenten erhaltenen Daten wurden zusammengefasst. Es
wurde eine Vergrößerung des
Lumenquerschnitts an dem 3 Wochen nach Cytochalasin B-Behandlungszeitpunkt
beobachtet.
-
Der
Lumenquerschnitt der traumatisierten und Cytochalasin B-behandelten
Arteriensegmente wurden auch mit dem Lumenquerschnitt des normalen
unbehandelten Bereichs der Oberschenkelarterie proximal des Testbereichs
verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Lumenquerschnitt in
dem Testbereich angenähert zwei
Mal so groß war
wie der Bereich des normalen Kontrollsegments derselben Arterie.
Die negativen Kontrollmittel, PBS und monoklonaler Antikörper NR-AN-01,
zeigten keine Vergrößerung oder
eine leichte Verringerung des Lumenquerschnitts im Vergleich zu
dem normalen Kontrollsegment derselben Arterie.
-
Eine
Cytochalasin B-Dosis-Antwortstudie wurde dann an 10 Schweinen, nach
dem in Beispiel 7 beschriebenen Experimentalprotokoll, durchgeführt. Kurz
gesagt, beide Arterien in jedem von zwei Schweinen wurden mit einer
der folgenden Dosen Cytochalasin B behandelt: 0,0 pg/ml (d.h. eine
PBS-Negativkontrolle); 0,01
pg/ml; 0,10 pg/ml; 1,0 pg/ml; und 10,0 pg/ml. Der Mittel wurde durch
einen intraluminalen Katheter bei 1 atm Druck für 3 Minuten verab reicht, und
die Arterien wurden 3 Wochen später
durch das oben beschriebene morphometrische Analysesystem ausgewertet.
Das Verhäfltnis
des behandelten Arterienlumenquerschnitts zu dem proximalen normalen
Arterienlumenquerschnitt wurde als prozentuale Änderung in der behandelten
gegenüber
der normalen Fläche
bestimmt. Ein signifikanter Schwelleneffekt wurde bei Dosierungen
von 0,1 pg/ml (= 140%ige Zunahme) zu 1,0 pg/ml beobachtet (14). Die 10 pg/ml Dosis schien für die vaskulären glatten
Muskelzellen toxisch zu sein (Daten nicht gezeigt). Die Subschwellenwertdosis
(0,01 pg/ml) und negative Kontrolle (PBS) zeigten eine a ± = 20%ige Änderung
im Lumenquerschnitt. Diese Daten legen nahe, dass Cytochalasin B
als "biologischer
Stent" wirkt, wenn
es traumatisierten Arterien verabreicht wird.
-
BEISPIEL 15
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Direkte Konjugation von
NR-AN-01-Antikörper
zu funktionellen carboxylischen Gruppen eines Latexpartikels
-
Antikörper-beschichtete
Latexpartikel (ein Modell einer Antikörperbeschichteten Retarddosierungsform)
kann mittels der folgenden aseptischen Technik erhalten werden:
-
Konjugation:
-
Zu
4 ml 0,05 M Natriumborat, pH 8,5, enthaltend 0,01% Tween-200 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat,
Sigma) wird 0,5 ml PBS, enthaltend 5 mg NR-AN-01 monoklonaler Antikörper, hinzugefügt. Zu dieser
Lösung
bei Raumtemperatur werden, unter Mischen, 2,5 ml einer wässrigen
Suspension, enthaltend 50 pg carboxylierter Latexpartikel mit 1
pm Durchmesser, hinzugefügt.
Unmittelbar danach wird 0,50 ml Wasser, enthaltend 100 mg frisch
gelösten
1(3-Dimethylaminopropyl)3-ethylcarbodiimid
HCl unter Vermischen hinzugefügt.
-
Die
Lösung
wird dann unter Schütteln
für 1-2
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird
dann mit 50 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,6 verdünnt, enthaltend 0,2% Gelatinstabilisator (Phosphat/Gelatinpufter).
Dieses Gemisch wird mit 40.000 × g
für 2 Stunden
bei 4-10°C
zentrifugiert. Der Überstand
wird dekantiert und der Pellet wird in 50 ml Phosphat/Gelatinpufter
mittels leistungsschwacher Beschallung für 10 Sekunden resuspendiert.
Die Zentrifugation wird wiederholt, und der Pellet wird zwei Mal
resuspendiert, gefolgt durch Resuspension in dem Phosphat/Gelatinpuffer.
Die konjugierten Partikel werden dann mittels Standardprotokollen
und Sorbitolexzipienten lyophilisiert.
-
Charakterisierung:
-
- (a) Größeneinteilung:
Die Partikelgrößenhomogenität wird durch
Laseranisotropie oder, für
Partikel größer als
1 pm, durch mikroskopische Untersuchung bewertet.
- (b) Spezifische Bindungsbewertung: Die spezifische Bindung an
glatte Muskelzellen wird durch histologische Untersuchung des Gewebes
oder von Zellpellet-Mikrotomscheibchen nach der Inkubation von Protein/Peptidkonjugaten
mit konjugierten Partikeln bestimmt, mit oder ohne Blockerprotein/peptid,
das in dem Inkubationsgemisch enthalten ist. Bevorzugte Detektionstechniken
umfassen zweite Antikörperassays (d.h.
Anti-Maus-IgG) oder
Kompetitionsassays (d.h. radioszintigraphische Detektion in Verbindung
mit radioisotopisch markierten Protein/Peptidkonjugaten).
- (c) Bewertung des Ausmaßes
der Protein/Peptidderivatisierung: Diese Bestimmung erfolgt durch
Beschichtung der Latexpartikel mit einem radioisotopisch markierten
Antikörper,
gefolgt durch Detektion der Radioaktivität, die den beschichteten Partikeln
zugeordnet ist.
-
Die
Charakterisierung der Antikörper-beschichteten
Partikel ist in Tabelle 6 beschrieben. Tabelle
6 Charakterisierung
von NR-AN-01-beschichteten Latexparikeln
-
Der
Partikelaggregationseffekt des pH während der Antikörperkonjugation
ist in Tabelle 7 angegeben. Tabelle
7 pH-Effekt
während
Antikörper-Konjugation-Partkelaggregation
-
Verwendung
von 50 mM MES (pH 5,5); Phosphat (pH 7,0); oder Borat (pH 8,5) Puffer,
wie beschrieben. Ausgewertet durch mikroskopische Untersuchung auf
einer Skala von 0-100%.
-
Diese
Daten legen nahe, dass Proteine oder Peptide direkt mit Retarddosierungsformen
der vorliegenden Erfindung konjugiert werden können. Insbesondere werden Polymilch-glycolsäurepartikel,
die terminate Carbonsäuregruppen
aufweisen, gemäß der hierin
beschriebenen Prozedur oder alternativen Verfahren, die in der Beschreibung
hiervon beschrieben sind, konjugiert.
-
Zitate
-
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Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1245-1249.
-
Während die
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung dargestellt und beschrieben wurde, versteht es sich,
dass darin verschiedene Änderungen
vorgenommen werden können,
ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
-
ASPEKTE DER
ERFINDUNG
-
- 1. Intravaskulärer Stent, umfassend eine Menge
an Cytoskelett-Inhibitor, die wirksam ist, nach Einsetzen des Stents
Stenose zu inhibieren oder Restenose zu vermindern.
- 2. Intravaskulärer
Stent, umfassend eine Menge an Inhibitor der Proliferation glatter
Muskelzellen, die wirksam ist, nach Einsetzen des Stents Stenose
zu inhibieren oder Restenose zu vermindern.
- 3. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 1, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin
B oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 4. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 1, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder
ein Analogon von diesem umfasst.
- 5. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 1, welcher zudem einen Inhibitor der Proliferation
glatter Muskelzellen umfasst.
- 6. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 2, wobei der Stent zudem einen Cytoskelett-Inhibitor
umfasst.
- 7. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 6, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin
B oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 8. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 6, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder
ein Analogon von diesem umfasst.
- 9. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 1 oder 6, welcher den Cytoskelett-Inhibitor in einer
Retard-Form umfasst.
- 10. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 9, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin
B oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 11. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 9, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder
ein Analogon von diesem umfasst.
- 12. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 9, wobei die Retard-Form des Cytoskelett-Inhibitors
ein Bindungspeptid oder -protein umfasst, das in der Lage ist, spezifisch
an glatte Muskelzellen, Stromazellen oder interstitielle Matrix,
welcheglatte Muskelzellen umgibt, zu binden.
- 13. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 1 oder 6, wobei der Stent eine bioabbaubare
Beschichtung oder eine poröse
oder permeable nicht-bioabbaubare Beschichtung umfassend den Cytoskelett-Inhibitor umfasst.
- 14. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 13, wobei die Beschichtung bioabbaubar ist.
- 15. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 13, wobei die Beschichtung porös ist.
- 16. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 13, wobei die Beschichtung eine Retard-Dosierungsform
des Cytoskelett-Inhibitors umfasst.
- 17. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 16, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin
B oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 18. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 16, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder
ein Analogon von diesem umfasst.
- 19. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 1 oder 2, welcher Metall oder einen Kunststoff
umfasst.
- 20. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 1 oder 2, welcher ein bioabbaubares Material
umfasst.
- 21. Der intravaskuläre
Stent nach Anspruch 20, welcher im Wesentlichen aus einem bioabbaubaren
Material besteht.
- 22. Verfahren zur Herstellung eines intravaskulären Stents,
der bei der Aufrechterhaltung des Gefäßlumeninhalts bei einem Säuger wirksam
ist, umfassend das Beschichten eines intravaskulären Stents mit einer Beschichtung,
die eine Retarddosierungsform umfasst, welche eine Menge an Cytoskelett-Inhibitor
umfasst, die wirksam ist, um Stenose oder Restenose in dem Gefäß zu verhindern
oder zu vermindern.
- 23. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei der Stent ein bioabbaubares
Material umfasst.
- 24. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei der Stent Kunststoff
oder Metall umfasst.
- 25. Das Verfahren nach Anspruch 40 oder 41, wobei der Stent
zudem ein therapeutisches Mittel umfasst, das ein Inhibitor der
Proliferation glatter Muskelzellen ist.
- 26. Das Verfahren nach Anspruch 40 oder 41, wobei der Stent
zudem ein therapeutisches Mittel umfasst, das ein Cytoskelett-Inhibitor
ist.
- 27. Das Verfahren nach Anspruch 43, wobei der Cytoskelett-Inhibitor
Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 28. Das Verfahren nach Anspruch 43, wobei der Cytoskelett-Inhibitor
Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 29. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Beschichtung bioabbaubar
ist.
- 30. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Beschichtung porös oder permeabel
ist.
- 31. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei der Cytoskelett-Inhibitor
Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 32. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei der Cytoskelett-Inhibitor
Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 33. Verfahren zur Herstellung eines intravaskulären Stents,
der bei der Aufrechterhaltung des Gefäßlumeninhalts bei einem Säuger wirksam
ist, umfassend das Einführen
einer Menge an Cytoskelett-Inhibitor, die wirksam ist, um Stenose
oder Restenose in dem Gefäß zu verhindern
oder zu vermindern, in die Matrix eines intravaskulären Stents.
- 34. Das Verfahren nach Anspruch 50, wobei der Stent zudem eine
Beschichtung umfasst, die eine Retarddosierungsform umfasst, welche
einen Cytoskelett-Inhibitor
umfasst.
- 35. Das Verfahren nach Anspruch 51, wobei der Cytoskelett-Inhibitor
Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 36. Das Verfahren nach Anspruch 51 wobei der Cytoskelett-Inhibitor
Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 37. Das Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Beschichtung bioabbaubar
ist.
- 38. Das Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Beschichtung porös oder permeabel
ist.
- 39. Das Verfahren nach Anspruch 50, wobei der Cytoskelett-Inhibitor
Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 40. Das Verfahren nach Anspruch 50 wobei der Cytoskelett-Inhibitor
Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 41. Verfahren zur Herstellung eines intravaskulären Stents,
der bei der Aufrechterhaltung des Gefäßlumeninhalts bei einem Säuger wirksam
ist, umfassend das Einführen
einer Menge eines therapeutischen Mittels, welches ein Inhibitor
der Proliferation glatter Muskelzellen ist, die wirksam ist, um
Stenose oder Restenose in dem Gefäß zu verhindern oder zu vermindern,
in die Matrix eines intravaskulären
Stents.
- 42. Das Verfahren nach Anspruch 58, wobei der Stent zudem eine
Beschichtung umfasst, die eine Retarddosierungsform umfasst, welche
einen Cytoskelett-Inhibitor
umfasst.
- 43. Das Verfahren nach Anspruch 59, wobei der Cytoskelett-Inhibitor
Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 44. Das Verfahren nach Anspruch 59 wobei der Cytoskelett-Inhibitor
Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
- 45. Das Verfahren nach Anspruch 59, wobei die Beschichtung bioabbaubar
ist.
- 46. Das Verfahren nach Anspruch 59, wobei die Beschichtung porös oder permeabel
ist.
- 47. Das Verfahren nach Anspruch 29, 50 oder 58, wobei der Stent
Kunstoff oder Metall umfasst.
- 48. Das Verfahren nach Anspruch 29, 50 oder 58, wobei der Stent
ein bioabbaubares Material umfasst.
- 49. Das Verfahren nach Anspruch 65, wobei der Stent im Wesentlichen
aus einem bioabbaubaren Material besteht.