DE69635899T2

DE69635899T2 - Polypeptid, das die differenzierung unterdrueckt

Info

Publication number: DE69635899T2
Application number: DE69635899T
Authority: DE
Inventors: Seiji Fuji-shi SAKANO; Akira Fuji-shi ITOH
Original assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1995-11-17
Filing date: 1996-11-15
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2016-11-16
Also published as: AU716889B2; WO1997019172A1; US20050130271A1; AU7587696A; US20050130268A1; US6337387B1; US7141379B2; US20020128197A1; US20050164348A1; DE69635899D1; US7253265B2; EP0861894A1; ATE319827T1; US7198918B2; EP0861894A4; JP4283891B2; EP0861894B1; US7179622B2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine neue biologisch aktive Substanz, welche die Differenzierung von undifferenzierten Zellen unterdrückt.
Stand der Technik
Menschliches Blut und Lymphe enthalten verschiedene Arten von Zellen, und alle Zellen spielen eine wichtige Rolle. Zum Beispiel tragen die Erythrocyten Sauerstoff; die Plättchen besitzen eine hämostatische Wirkung; und die Lymphocyten verhindern eine Infektion. Diese verschiedenen Zellen stammen von hämatopoietischen Stammzellen im Knochenmark ab. Kürzlich wurde es aufgeklärt, dass die hämatopoietischen Stammzellen zu verschiedenen Blutzellen, die Osteoklasten und Mastzellen aufgrund der Stimulation durch verschiedene Cytokine in vivo und Umweltfaktoren differenziert werden. Bei den Cytokinen wurde gefunden, dass zum Beispiel Erythropoietin (EPO) für die Differenzierung zu Erythrocyten verantwortlich ist; dass der Granulocyten-Kolonie-stimulierende Faktor (granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) für die Differenzierung zu Leukocyten verantwortlich ist; und dass der Plättchenwachstumsfaktor (platelet growth factor, mpl ligand) für die Differenzierung zu Megakaryocyten verantwortlich ist, welche Plättchen produzierende Zellen sind, und die ersten beiden wurden bereits klinisch angewendet.
Die undifferenzierten Blutzellen werden im Allgemeinen in zwei Gruppen klassifiziert, die aus Blutvorläuferzellen bestehen, welche dazu bestimmt sind, zu spezifischen Blut-Reihen zu differenzieren, sowie in hämatopoietische Stammzellen, welche eine Fähigkeit der Differenzierung zu allen Reihen sowie eine Fähigkeit zur Selbst-Replikation besitzen. Die Blutvorläuferzellen können durch verschiedene Kolonie-Assays identifiziert werden. Jedoch wurde ein Identifikations-Verfahren für hämatopoietische Stammzellen noch nicht etabliert. Es wurde berichtet, dass in diesen Zellen der Stammzellenfaktor (stem Cell factor, SCF), Interleukin-3 (IL-3), Granulocyten-Makrophage-Kolonie-stimulierende Faktor (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1 (IL-1), Granulocyten-Kolonie-stimulierende Faktor (granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) und Oncostatin M die Zelldifferenzierung und Proliferation stimulieren. Versuche zur Vermehrung von hämatopoietischen Stammzellen in vitro wurden untersucht, um Knochenmarks-Transplantationen durch die Anwendung der Transplantationstherapie oder Gentherapie mittels hämatopoietischer Stammzellen zu ersetzen. Wenn die hämatopoietischen Stammzellen in Gegenwart der vorstehend erwähnten Cytokine kultiviert werden, verschwanden jedoch die Aktivitäten der Multidifferenzierung und die Aktivitäten der Selbst-Replikation, welche ursprünglich in der Position der hämatopoietischen Stammzellen vorhanden waren, nach und nach, und sie werden zu den Blutvorläuferzellen verändert, welche sich lediglich zu bestimmten Reihen nach 5 Wochen der Kultivierung differenzieren; und die Fähigkeit zur Multidifferenzierung, welche eine der spezifischen Eigenschaften der hämatopoietischen Stammzellen ist, geht verloren (Wagner et al., Blood 86, 512–523, 1995).
Für die Proliferation der Blutvorläuferzellen ist ein einzelnes Cytokin nicht ausreichend, um sie zu bewirken, jedoch ist die synergistische Wirkung mehrerer Cytokine bedeutsam. Um die hämatopoietischen Stammzellen unter Beibehaltung spezifischer Eigenschaften der hämatopoietischen Stammzellen zu proliferieren, ist es infolge dessen notwendig, Cytokine hinzuzugeben, welche die Differenzierung unterdrücken, zusammen mit den Cytokinen, welche die undifferenzierten Blutzellen proliferieren und differenzieren. Im Allgemeinen sind viele Cytokine bekannt, welche die Proliferation oder Differenzierung von Zellen stimulieren, jedoch ist eine kleine Anzahl von Cytokinen bekannt, welche die Zelldifferenzierung unterdrücken. Zum Beispiel besitzt der Leukämie inhibierende Faktor (leukemia inhibitory factor, LIF) eine Wirkung der Proliferation auf embryonale Stammzellen von Mäusen ohne Differenzierung, jedoch hat er keine Wirkung gegenüber den hämatopoietischen Stammzellen oder Blutvorläuferzellen. Der transforming growth factor (TGF-β) besitzt eine unterdrückende Wirkung in Bezug auf die Proliferation gegenüber verschiedenen Zellen, jedoch besitzt er keine bestimmten Wirkungen gegenüber den hämatopoietischen Stammzellen oder den Blutvorläuferzellen.
Man glaubt, dass nicht nur Blutzellen, sondern auch undifferenzierte Zellen, insbesondere Stammzellen, an der Geweberegeneration beteiligt sind. Diese Regeneration der Gewebe und die Proliferation von undifferenzierten Zellen in jedem Gewebe kann auf verschiedenen Wegen durch Bezugnahme auf die bekannte Referenz angewendet werden (Katsutoshi Yoshizato, Regeneration – a mechanism of regeneration, 1996, Yodosha Publ. Co.).
Notch ist ein Membranprotein vom Rezeptortyp, welches an der Regulation der Differenzierung von Nervenzellen beteiligt ist, das in Drosophila gefunden wurde. Homologe von Notch wurden in verschiedenen Tierarten gefunden, die sich bis auf die Invertebraten und Vertebraten erstrecken, einschließlich der Nematoden (Lin-12), Xenopus laevis (Xotch), Maus (Motch) oder das menschliches (TAN-1). Es sind Liganden von Notch in Drosophila bekannt. Diese sind Drosophila delta (Delta) und Drosophila serrate (Serrate). Homologe von Notch-Liganden werden in verschiedenen Tierarten gefunden, da sie zu den Notch der Rezeptoren ähnlich sind (Artavanis-Tsakonas et al., Science 268, 225–232, 1995).
WO 97/01571 betrifft Nukleotidsequenzen von Delta-Genen von Vertebraten und Aminosäure-Sequenzen der dadurch codierten Proteine, sowie Derivate und Analoga derselben. Insbesondere werden isolierte Delta-Gene aus Xenopus, Huhn, Maus und Mensch bereitgestellt. Es werden ebenso Verfahren zur Herstellung von Delta-Proteinen, Derivaten und Analoga, zum Beispiel mittels rekombinanter Verfahren, sowie von Antikörpern, die gegen die vorstehend erwähnten Stoffe gerichtet sind, bereitgestellt.
WO 93/12141 offenbart Nukleotidsequenzen von Serrate-Genen und Aminosäure-Sequenzen der dadurch codierten Proteine, sowie Derivate und Analoga derselben. Darüber hinaus werden Verfahren zur Herstellung von Serrate-Proteinen, Derivaten und Analoga, zum Beispiel durch rekombinante Verfahren, sowie von Antikörpern, die gegen die vorstehend erwähnten Stoffe gerichtet sind, bereitgestellt.
Das humane Notch-Homologe, TAN-1, wird in weit verbreiteter Weise in den Geweben in vivo gefunden (Ellisen et al., Cell 66, 649–661, 1991). Es wurde von zwei analogen Notch-Molekülen berichtet, die von Tan-1 verschieden sind (Artavanis-Tsakonas et al., Science 268, 225–232, 1995). Die Expression von TAN-1 wurde ebenso in CD34 positiven Zellen in Blutzellen mittels PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) beobachtet (Milner et al., Blood 83, 2057–2062, 1994). Jedoch wurde in Bezug auf den Menschen die Klonierung der Gene von humanem Delta und humanem Serrate, von denen man glaubt, dass sie Notch Liganden seien, noch nicht berichtet.
In Notch von Drosophila wurde die Bindung mit dem Liganden studiert und in Einzelheiten erforscht, und es wurde gefunden, dass Notch an den Liganden mit Ca⁺⁺ in dem bindenden Bereich gebunden werden kann, welcher eine wiederholte Aminosäure-Sequenz Nr. 11 und Nr. 12 in der Wiederholung der Aminosäure-Sequenz nach Art der Wiederholung des epidermalen Wachstumsfaktors darstellt (Epidemal Growth Factor, EG F) (Fehon et al., Cell 61, 523–534, 1990, Rebay et al., ibid. 67, 687–699, 1991 und ungeprüfte, veröffentlichte, japanische PCT-Anmeldung 7-503123). Wiederholte Sequenzen nach Art des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) sind in Notch-Homologen von anderen Spezies konserviert. Infolge dessen wird der gleiche Mechanismus bei der Bindung mit den Liganden erwartet. Eine Aminosäure-Sequenz, welche als DSL (Delta-Serrate-Lag-2) bezeichnet wird, befindet sich in der Nähe des Aminosäureendes, und eine wiederholte Sequenz nach Art des epidermalen Wachstumsfaktors, wie jene im Rezeptor, ist in dem Liganden konserviert (Artavanis-Tsakonas et al., Science 268, 225–232, 1995).
Die Sequenz der DSL-Domäne wird nicht gefunden, außer für Moleküle des Notch-Liganden, und sie ist spezifisch für Moleküle des Notch-Liganden. Eine gemeinsame Sequenz der DSL-Domäne wird in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1 in der allgemeinen Formel gezeigt, und ein Vergleich mit dem humanen Delta-1 und dem humanen Serrate-1 der vorliegenden Erfindung und bekannten Molekülen des Notch-Liganden ist in 1 gezeigt.
EGF-ähnliche Sequenzen wurden bei Thrombomodulin (Jackman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8834–8838, 1986), bei dem Rezeptor für das Lipoprotein niedriger Dichte (low density lipoprotein receptor, LDL) (Russell et al., Cell 37, 577–585, 1984) und dem Faktor für die Blutkoagulation (Furie et al., Cell 53, 505–518, 1988) gefunden, und man glaubt, dass sie bedeutsame Rollen in der extrazellulären Koagulation und Adhäsion spielen.
Kürzlich wurde das Vertebraten-Homologe des klonierten Delta aus Drosophila im Huhn (C-Delta-1) und in Xenopus laevis (X-Delta-1) gefunden, und es wurde berichtet, dass X-Delta-1 durch Xotch bei der Erzeugung von Protoneuronen gewirkt hatte (Henrique et al., Nature 375, 787–790, 1995 und Chitnis et al., ibid. 375, 761–766, 1995). Vertebraten-Homologe von Serrate aus Drosophila wurden in Ratten als Ratten-Jagged (Jagged) gefunden (Lindsell et al., Cell 80, 909–917, 1995). Gemäß der Veröffentlichung von Lindsell et al. wurde mRNA von Ratten-Jagged im Rückenmark von fötalen Ratten nachgewiesen. Als Ergebnis der Cokultivierung einer Myoblastenzell-Linie, die dazu gebracht wurde, einen Überschuss an Ratten-Notch zu exprimieren, mit einer Zell-Linie zur Expression von Ratten-Jagged wurde eine Unterdrückung der Differenzierung der Myoblastenzell-Linie gefunden. Jedoch hatte das Ratten-Jagged keine Wirkung gegenüber der Myoblastenzell-Linie ohne forcierte Expression des Ratten-Notch.
Wenn man die vorstehenden Berichte betrachtet, kann das Notch und sein entsprechender Ligand an der Regulation der Differenzierung von Nervenzellen beteiligt sein, jedoch sind ihre Wirkungen gegenüber Zellen einschließlich Blutzellen, insbesondere Primärzellen, unbekannt, ausgenommen manche Myoblastenzellen.
Im Molekül des Notch-Liganden und unter dem Gesichtspunkt früherer Studien mit Drosophila und Nematoden, besitzt der Notch-Ligand in besonderer Weise eine Struktur der DSL-Domäne, welche außer in dem Notch-Liganden nicht gefunden wird. Infolge dessen bedeutet die Tatsache, dass DSL-Domänen vorhanden sind, dass diese äquivalent zu einem Ligandenmolekül für den Notch-Rezeptor sind.
Probleme, die durch die Erfindung gelöst werden
In Bezug auf undifferenzierte Zellen ist die Proliferation, wie vorstehend erwähnt, unter Aufrechterhaltung ihrer Spezifitäten nicht etabliert. Die wichtigsten Gründe dafür sind, dass Faktoren, welche die Differenzierung der undifferenzierten Zellen unterdrücken, noch nicht in ausreichendem Maße gefunden wurden. Die Probleme der vorliegenden Erfindung bestehen darin, eine Verbindung bereit zu stellen, die von neuen Faktoren abstammt, welche die Differenzierung von undifferenzierten Zellen unterdrücken können.
Mittel zur Lösung der Probleme
Wir haben eine Hypothese aufgestellt, dass das Notch und sein Ligand eine Wirkung auf die Regulation der Differenzierung nicht nur für Neuroblasten und Myoblasten, sondern auch für verschiedene undifferenzierte Zellen, insbesondere für undifferenzierte Blutzellen aufweisen. Im Falle der klinischen Anwendung am Menschen weisen jedoch die Notch-Liganden von bisher bekannten, unterschiedlichen Arten, wie zum Beispiel Huhn oder Xenopus laevis, Probleme mit Spezies-Spezifitäten und Antigenizitäten auf. Infolge dessen wird im Wesentlichen gefordert, den bisher unbekannten menschlichen Notch-Liganden zu gewinnen. Wir hatten eine Idee, dass ein Molekül mit einer DSL-Domäne und einer EGF-ähnlichen Domäne, welche den Molekü len des Notch-Liganden gemeinsam sind, und ein Ligand des humanen Notch (TAN-1 etc.), welcher ein humanes Delta-Homologes (nachfolgend als humanes Delta bezeichnet) und ein humanes Serrate-Homologes (nachfolgend als humanes Serrate bezeichnet) ist, gefunden werden können. Ebenso hatten wir eine Idee, dass diese Erkenntnisse ein Kandidat für ein Arzneimittel sein können, welches für die Regulation der Differenzierung der undifferenzierten Zellen nützlich ist. Und wir haben versucht, dieses herauszufinden.
Um humane Notch-Liganden aufzufinden, haben wir Aminosäure-Sequenzen analysiert, welche in Tieren außer dem Menschen konserviert sind, und wir haben versucht, Gene mittels PCR unter Verwendung gemischter Primer für die entsprechende DNA-Sequenz aufzufinden. Als ein Ergebnis ausführlicher Studien waren wir erfolgreich bei der Isolierung von cDNAs, welche die Aminosäure-Sequenzen von zwei neuen Molekülen codieren, neues humanes Delta-1 und neues humanes Serrate-1, und wir haben die Expressionssysteme für das Protein mit verschiedenen Formen unter Verwendung dieser cDNAs hergestellt. Ebenso haben wir ein Reinigungsverfahren für die Proteine aufgebaut, welche gereinigt und isoliert wurden.
Aminosäure-Sequenzen des neuen humanen Delta-1 sind in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2–4 gezeigt. Die DNA-Sequenz, welche diese Sequenz codiert, ist in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 8 gezeigt. Die Aminosäure-Sequenzen des neuen humanen Serrate-1 sind in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 5–7 gezeigt. Die DNA-Sequenz, welche diese Sequenz codiert, ist in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 gezeigt.
Physiologische Wirkungen dieser hergestellten Proteine wurden unter Verwendung von undifferenzierten Nervenzellen, Präadipo cyten, Hepatocyten, Myoblasten, undifferenzierten Hautzellen, undifferenzierten Blutzellen und undifferenzierten Immunozellen untersucht. Als ein Ergebnis haben wir gefunden, dass neues humanes Delta-1 und neues humanes Serrate-1 eine Wirkung der die Differenzierung unterdrückenden Wirkung gegenüber undifferenzierten primären Blutzellen aufweisen, und dass sie eine physiologische Wirkung besitzen, den undifferenzierten Zustand aufrecht zu erhalten.
Solche Wirkungen auf undifferenzierte Blutzellen wurden niemals zuvor beschrieben, und sind ein neues Wissen. Keine signifikanten toxischen Wirkungen wurden in den Toxizitätsstudien bei Mäusen beobachtet, und nützliche pharmazeutische Wirkungen wurden vorgeschlagen. Infolge dessen stellen die pharmazeutischen Zubereitungen, welche das Molekül der vorliegenden Erfindung enthalten, das Medium, welches das Molekül der vorliegenden Erfindung enthält, und die Vorrichtung, welche das Molekül der vorliegenden Erfindung im immobilisierten Zustand enthält, neue Arzneimittel und medizinische Materialien dar, welche die undifferenzierten Zellen des Bluts im undifferenzierten Zustand aufrecht erhalten können. Antikörper gegen humanes Delta-1 und humanes Serrate-1 wurden unter Verwendung von Antigenen des humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 hergestellt, und ein Reinigungsverfahren für diese Antikörper wurde aufgebaut. Die vorliegende Erfindung wurde entsprechend vervollständigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, umfassend die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste, welche ein Gen humanen Ursprungs codiert, ein Polypeptid, umfassend mindestens eine Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 2 oder Nr. 5 der Sequenzliste, ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 3 der Sequenzliste, ein Polypep tid, umfassend eine Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste, ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 6 der Sequenzliste, ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 7 der Sequenzliste, wobei das Polypeptid eine die Differenzierung unterdrückende Wirkung gegenüber undifferenzierten Zellen aufweist, bei denen die undifferenzierten Zellen solche undifferenzierten Zellen sind, ausgenommen jene Zellen des Hirn- und Nervensystems oder des Muskelsystems, und wobei die undifferenzierten Zellen die undifferenzierten Zellen des Bluts sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Polypeptide enthält, und die pharmazeutische Zusammensetzung, bei der ein hämatopoietischer Aktivator verwendet wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Zellkultur-Medium, welches die Polypeptide enthält, und das Zellkultur-Medium, bei dem die Zelle eine undifferenzierte Blutzelle ist. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus eine DNA, welche für das Polypeptid mit mindestens einer Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 2 oder Nr. 5 der Sequenzliste codiert, eine DNA mit einer DNA-Sequenz 242–841 der SEQ ID Nr. 8 oder mit einer DNA-Sequenz 502–1095 der SEQ ID Nr. 9 der Sequenzliste, eine DNA, welche für das Polypeptid mit einer Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 3 der Sequenzliste codiert, eine DNA mit einer DNA-Sequenz 242–1801 der SEQ ID Nr. 8 der Sequenzliste, eine DNA, welche für das Polypeptid mit einer Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste codiert, eine DNA mit einer DNA-Sequenz 242–2347 der SEQ ID Nr. 8 der Sequenzliste, eine DNA, welche für das Polypeptid mit einer Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 6 der Sequenzliste codiert, eine DNA mit einer DNA-Sequenz 502–3609 der SEQ ID Nr. 9 der Sequenzliste, eine DNA, welche für das Polypeptid mit einer Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 7 der Sequenzliste codiert, und eine DNA mit einer DNA-Sequenz 502–4062 der SEQ ID Nr. 9 der Sequenzliste. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus eine rekombinante DNA, umfassend das Ligieren einer DNA, die aus den Gruppen der vorstehend erwähnten DNA ausgewählt wird, und eines Vektors, der zur Expression in der Wirtszelle verwendet werden kann, und eine Zelle, umfassend eine Transformation mittels rekombinanter DNA, und ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids mittels des Kultivierens der Zellen und zur Isolierung der so hergestellten Verbindung. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus einen Antikörper, der das Polypeptid mit der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste spezifisch erkennt, und einen Antikörper, der das Polypeptid mit der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 7 der Sequenzliste spezifisch erkennt.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend in Einzelheiten erklärt.
Die Herstellung der für die Genmanipulation notwendigen cDNA, die Analyse der Expression durch Northern blotting, das Screening durch Hybridisierung, die Herstellung einer rekombinanten DNA, die Bestimmung der DNA-Basenfolge und die Herstellung einer cDNA-Bibliothek, von denen alle eine Reihe molekularbiologischer Experimente darstellen, können anhand einer Beschreibung eines herkömmlichen Textbuches für die Experimente durchgeführt werden. Das vorstehend erwähnte herkömmliche Textbuch für die Experimente ist zum Beispiel Maniatis et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Eds., Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung besitzt mindestens Polypeptide der SEQ ID Nr. 1–7 der Sequenzliste. Eine Mutante und ein Allel, welche natürlicherweise in der Natur auftre ten, sind im Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfasst, es sei denn, dass die Polypeptide der SEQ ID Nr. 1–7 der Sequenzliste ihre Eigenschaften verlieren. Die Modifikation und Substitution von Aminosäuren werden in Einzelheiten in der Veröffentlichung der Patentschrift von Benntt et al. (Nationale ungeprüfte Veröffentlichung WO 96/2645) beschrieben, und können entsprechend dieser Beschreibung ausgeführt werden.
Eine DNA-Sequenz, welche die Polypeptide der SEQ ID Nr. 2–4 der Sequenzliste codiert, ist in der SEQ ID Nr. 8 der Sequenzliste gezeigt, und eine DNA-Sequenz, welche die Polypeptide der SEQ ID Nr. 5–7 der Sequenzliste codiert, ist in der SEQ ID Nr. 9 der Sequenzliste gezeigt, zusammen mit ihren Aminosäure-Sequenzen. In diesen DNA-Sequenzen, auch wenn eine Mutation auf der Stufe der Aminosäuren nicht erzeugt wird, können natürlich isolierte, chromosomale DNA oder cDNA derselben die Möglichkeit zur Mutation in der DNA-Basensequenz aufweisen, als Folge der Entartung des genetischen Codes, ohne die durch die DNA codierte Aminosäure-Sequenz zu verändern. Ein 5'-untranslatierter Bereich und ein 3'-untranslatierter Bereich beinhalten keine Bestimmung der Aminosäure-Sequenz des Polypeptids, so dass DNA-Sequenzen dieser Bereiche leicht mutiert werden. Die Basensequenz, welche durch diese Entartungen des genetischen Codes erhalten wird, ist von der DNA der vorliegenden Erfindung umfasst.
In der vorliegenden Erfindung werden undifferenzierte Zellen als Zellen definiert, welche durch spezifische Stimulation wachsen können, und als Zellen, welche zu Zellen differenziert werden können, die als ein Ergebnis der spezifischen Stimulationen spezifische Funktionen aufweisen. Diese umfassen undifferenzierte Zellen der Hautgewebe, undifferenzierte Zellen des Gehirn- und Nervensystems, undifferenzierte Zellen des Muskel systems und undifferenzierte Zellen von Blutzellen. Diese Zellen umfassen die Zellen mit selbst-reproduzierender Aktivität, welche als Stammzellen bezeichnet werden, und die Zellen mit einer Fähigkeit, die Zellen dieser Linien zu erzeugen. Eine die Differenzierung unterdrückende Wirkung bedeutet eine unterdrückende Wirkung für die autonome und heteronome Differenzierung der undifferenzierten Zellen, und sie bezeichnet eine Wirkung zur Beibehaltung des undifferenzierten Zustands. Die undifferenzierten Zellen des Gehirns und der Nerven können als Zellen definiert werden, welche die Fähigkeit besitzen, durch spezifische Stimulation zu Zellen des Gehirns oder des Nervensystems mit spezifischen Funktionen zu differenzieren. Die undifferenzierten Zellen des Muskelsystems können als Zellen differenziert werden, die eine Fähigkeit aufweisen, durch spezifische Stimulation zu Muskelzellen mit spezifischen Funktionen zu differenzieren. Die undifferenzierten Blutzellen in der vorliegenden Erfindung können als eine Gruppe von Zellen definiert werden, bestehend aus den Blutvorläuferzellen, welche zu den spezifischen Reihen von Blutzellen differenziert werden und anhand eines Blutkolonie-Assays identifiziert werden, sowie aus den hämatopoietischen Stammzellen mit einer Differenzierung zu allen Reihen und mit selbst-reproduzierenden Aktivitäten.
In der Sequenzliste zeigt die Aminosäure-Sequenz in SEQ ID Nr. 1 eine allgemeine Formel einer gemeinsamen Aminosäure-Sequenz einer DSL-Domäne, welche eine gemeinsame Domänenstruktur der Moleküle des Notch-Liganden ist, und mindestens diese Domänenstruktur entspricht der Sequenzliste, SEQ ID Nr. 158–200 des humanen Delta-1 oder der Sequenzliste, SEQ ID Nr. 156–198 des humanen Serrate-1.
Die Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste ist eine Sequenz des aktiven Zentrums des humanen Delta-1 der vorliegenden Erfindung, wobei das Signalpeptid deletiert ist, d.h. eine Aminosäure-Sequenz des Aminoendes der DSL-Domäne, und sie entspricht den Aminosäuren 1 bis 200 der SEQ ID Nr. 4 der reifen, vollständigen Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 der vorliegenden Erfindung. Die Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr. 3 ist eine Aminosäure-Sequenz der extrazellulären Domäne des humanen Delta-1 der vorliegenden Erfindung, wobei das Signalpeptid deletiert ist, und sie entspricht den Aminosäuren Nr. 1 bis 520 der SEQ ID Nr. 9 der reifen, vollständigen Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 der vorliegenden Erfindung. Die Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 4 ist die reife, vollständige Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 der vorliegenden Erfindung.
Die Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 5 der Sequenzliste ist eine Sequenz des aktiven Zentrums des humanen Serrate-1 der vorliegenden Erfindung, wobei das Signalpeptid deletiert ist, d.h. eine Aminosäure-Sequenz vom Aminoende der DSL-Domäne, und sie entspricht den Aminosäuren Nr. 1 bis 198 in der SEQ ID Nr. 7 der reifen, vollständigen Aminosäure-Sequenz des humanen Serrate-1 der vorliegenden Erfindung. Die Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 6 ist eine Aminosäure-Sequenz der extrazellulären Domäne des humanen Serrate-1 der vorliegenden Erfindung, wobei das Signalpeptid deletiert ist, und sie entspricht den Aminosäuren Nr. 1 bis 1036 in der SEQ ID Nr. 7 der reifen, vollständigen Aminosäure-Sequenz des humanen Serrate-1 der vorliegenden Erfindung. Die Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 7 ist die reife, vollständige Aminosäure-Sequenz des humanen Serrate-1 der vorliegenden Erfindung.
Die SEQ ID Nr. 8 ist die gesamte Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 der vorliegenden Erfindung und der cDNA, welche dieselbe codiert, und die SEQ ID Nr. 9 ist die gesamte Aminosäure-Sequenz des humanen Serrate-1 der vorliegenden Erfindung und der cDNA, welche dieselbe codiert.
Die linken bzw. rechten Enden der Aminosäure-Sequenzen in der Sequenzliste weisen auf das Aminoende (nachfolgend als N-Terminus bezeichnet) bzw. auf das Carboxylende (nachfolgend als C-Terminus bezeichnet) hin, und die linken bzw. rechten Enden der Nukleotidsequenzen sind 5'-Enden bzw. 3'-Enden.
Die Klonierung des Gens humanen Notch-Liganden kann durch das folgende Verfahren ausgeführt werden. Während der Evolution der Organismen wurde ein Teil der Aminosäure-Sequenzen des humanen Notch-Liganden konserviert. Die DNA-Sequenz, welche der konservierten Aminosäure-Sequenz entspricht, wird konstruiert und wird als ein Primer der RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) verwendet, und dann wird ein PCR-Templat von humanem Ursprung durch PCR-Reaktion amplifiziert, wobei Fragmente des humanen Notch-Liganden erhalten werden können. Darüber hinaus wird ein RT-PCR-Primer durch Verwendung der Information über bekannte DNA-Sequenzen von Homologen des Notch-Liganden aus anderen Organismen als Menschen hergestellt, und die bekannten Genfragmente können möglicherweise aus dem PCR-Templat dieses Organismus' erhalten werden.
Um die PCR zur Gewinnung von Fragmenten des humanen Notch-Liganden durchzuführen, wird eine PCR für die DSL-Sequenz in Betracht gezogen, jedoch kann eine große Zahl von Kombinationen der DNA-Sequenz, welche der in diesem Bereich konservierten Aminosäure-Sequenz entspricht, erwartet werden, und die Bedingungen für eine PCR sind schwierig. Als ein Ergebnis muss eine PCR einer zu EGF ähnlichen Sequenz ausgewählt werden. Wie in dieser Schrift vorstehend erklärt, ist es äußerst schwierig, die Fragmente zu erhalten und sie zu identifizieren, da eine zu EGF ähnliche Sequenz in einer großen Zahl von Molekülen konserviert ist.
Wir haben etwa 50 PCR-Primersätze konstruiert und hergestellt, zum Beispiel den Primersatz der in Beispiel 1 gezeigten Sequenz. Die PCR wurde mit diesen Primersätzen unter Verwendung eines PCR-Templats einer cDNA durchgeführt, die aus Poly A⁺ RNA von verschiedenen Geweben menschlichen Ursprungs hergestellt wurde, und mehr als 10 PCR-Produkte von jedem Gewebe wurden subkloniert, und es wurde eine Sequenzierung für mehr als 500 Typen durchgeführt. Ein Klon mit der gewünschten Sequenz konnte identifiziert werden. Das erhaltene PCR-Produkt wird nämlich in den Klonierungsvektor kloniert, und in die Wirtszellen unter Verwendung des rekombinanten Plasmids, welches das PCR-Produkt enthält, transformiert; die Wirtszellen, welche das rekombinante Plasmid in großen Mengen enthalten, werden kultiviert; und das rekombinante Plasmid wird gereinigt und isoliert; die DNA-Sequenz des PCR-Produkts, welches in den Klonierungsvektor eingesetzt wurde, wird überprüft, und es wird versucht, das Genfragment, welches die Sequenz des humanen Delta-1 durch Vergleich mit der Sequenz von bekannten Delta-Proteinen anderer Arten aufweisen kann, zu erhalten. Wir waren erfolgreich, das Genfragment zu finden, welches einen Teil der cDNA des menschlichen Delta-1 enthält, jene Sequenz der DNA-Sequenz von 1012–1375, die in der SEQ ID Nr. 8 der Sequenzliste beschrieben ist.
Wir haben ebenso 50 PCR-Primersätze konstruiert und hergestellt, zum Beispiel den Primersatz der in Beispiel 3 gezeigten Sequenz, und die PCR wurde mit diesen Primersätzen unter Verwendung eines PCR-Templats einer cDNA durchgeführt, die aus einer Poly A⁺ RNA aus verschiedenen Geweben menschlichen Ursprungs hergestellt wurde, und mehr als 10 PCR-Produkte aus jedem Gewebe wurden subkloniert, und eine Sequenzierung für mehr als 500 Typen durchgeführt. Ein Klon mit einer gewünschten Sequenz konnte identifiziert werden. Das erhaltene PCR-Produkt wird nämlich in den Kloniervektor kloniert, und in die Wirtszellen unter Verwendung des rekombinanten Plasmids transformiert, welches das PCR-Produkt enthält; die Wirtszellen, welche das rekombinante Plasmid in großen Mengen enthalten, werden kultiviert, das rekombinante Plasmid wird gereinigt und isoliert; die DNA-Sequenz des PCR-Produkts, welches in den Klonierungsvektor eingesetzt wurde, wird überprüft; und es wird versucht, das Genfragment, welches eine Sequenz eines humanen Serrate-1 durch Vergleich mit der Sequenz von bekannten Serrate-Proteinen anderer Arten aufweisen kann, zu erhalten. Wir waren erfolgreich, das Genfragment zu finden, welches einen Teil der cDNA des humanen Serrate-1 enthält, jene Sequenz der DNA-Sequenz von 1272–1737, die in der SEQ ID Nr. 9 der Sequenzliste beschrieben ist.
Die vollständige Länge des gesuchten Gens kann aus der humanen, genomischen Genbibliothek oder der cDNA-Bibliothek unter Verwendung des so erhaltenen humanen Delta-1-Fragments oder des humanen Serrate-1-Genfragments erhalten werden. Die Klonierung des Gens mit vollständiger Länge kann durch Isotopenmarkierung oder Nicht-Isotopenmarkierung mit der Klonierung eines Teils des Gens und durch Screenen der Bibliothek mittels Hybridisierung oder einem anderen Verfahren erfolgen. Die Isotopenmarkierung kann zum Beispiel durch Endmarkierung unter Verwendung von [³²P]γ-ATP und T4 Polynukleotid-Kinase erfolgen, oder andere Markierungsverfahren, wie zum Beispiel die „Nick-Translation", das heißt durch Einbau markierter Nukleotide in DNA-Strangbrüche, oder das Primer-Verlängerungsverfahren, können angewendet werden. Bei einem anderen Verfahren wird eine cDNA-Bibliothek von humanem Ursprung in den Expressionsvektor ligiert, durch COS-7 oder andere Zellen exprimiert, und das gesuchte Gen durch Expressions-Klonierung gescreent, um die cDNA des Liganden zu isolieren. Beim Klonieren für die Expression können ein Zellsortierungs-Fraktionierungs-Verfahren, welches anhand der Bindung mit dem Polypeptid ausgeführt wird, das die Aminosäure-Sequenz von vier bereits bekannten Notch-Proteinen, wie zum Beispiel TAN-1, enthält, sowie ein Nachweisverfahren durch Filmemulsion unter Verwendung eines Radioisotops erwähnt werden. In dieser Beschreibung werden Verfahren zur Gewinnung von Genen des humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 erklärt, und darüber hinaus ist die Gewinnung eines homologen Gens des Notch-Liganden aus einem anderen Organismus wichtig für die Analyse der Ligandenwirkung. Dies kann anhand der gleichen Behandlung erfolgen. Das erhaltene Gen wird der DNA-Sequenzbestimmung unterzogen und die Aminosäure-Sequenz kann abgeschätzt werden.
Wie in Beispiel 2 gezeigt, werden Genfragmente, die das humane Delta-1 PCR-Produkt enthalten, mit einem Radioisotop markiert, um eine Sonde für die Hybridisierung herzustellen, und sie werden unter Verwendung von cDNA, die aus humaner Plazenta stammt, als der Screening-Bibliothek gescreent, die DNA-Sequenzen der so erhaltenen Klone werden bestimmt; und es wird der Klon erhalten, der die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 8 gezeigte DNA-Nukleotidsequenz enthält; und es wird gezeigt, dass er die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4 codierte Aminosäure-Sequenz enthält. Wir waren erfolgreich, die cDNA zu klonieren, welche für die vollständige Länge der Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 codiert.
Diese Sequenzen wurden mit der Datenbank (Genbank release 89, Juni 1995) verglichen, und es wurde gefunden, dass diese Sequenzen neu waren. Diese Aminosäure-Sequenz wurde in ihrem hydrophilen Teil und in ihrem hydrophoben Teil gemäß dem Verfahren von Kyte-Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105, 1982) analysiert. Ein Ergebnis wies darauf hin, dass das humane Delta-1 der vorliegenden Erfindung auf den Zellen als ein zelluläres Membranprotein mit einer transmembranären Domäne exprimiert wird.
Wie in Beispiel 4 gezeigt, werden die Genfragmente, welche das humane Serrate-1-PCR-Produkt enthalten, mit einem Radioisotop markiert, um eine Sonde für die Hybridisierung herzustellen; und sie werden unter Verwendung der cDNA, die aus humaner Plazenta stammt, als einer Screening-Bibliothek gescreent; die DNA-Sequenzen der so erhaltenen Klone werden bestimmt, und der Klon, der die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 gezeigte DNA-Nukleotid-Sequenz enthält, wird erhalten; und es wird gezeigt, dass er für die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 7 beschriebene Aminosäure-Sequenz codiert. Bei diesem Screening kann ein intrazellulärer Teil der Gensequenz, welche für die vollständige Länge der Aminosäure-Sequenz codiert, nämlich ein peripherer Teil des Terminations-Codons, nicht kloniert werden. Infolge dessen wird, wie in Beispiel 4 gezeigt, die Klonierung des Gens durch das RACE-Verfahren (Rapid Amplification of cDNA Ends: Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998–9002, 1988) durchgeführt, und schließlich gelingt die Klonierung der cDNA, welche für die vollständige Länge der Aminosäure-Sequenz des humanen Serrate-1 codiert.
Diese Sequenzen werden mit der Datenbank (Genbank release 89, Juni 1995) verglichen, und es wurde gefunden, dass diese Sequenzen neu waren. Diese Aminosäure-Sequenz wurde in ihrem hydrophilen Teil und in ihrem hydrophoben Teil gemäß einem Verfahren von Kyte-Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105, 1982) analysiert. Ein Ergebnis wies darauf hin, dass das humane Serrate-1 der vorliegenden Erfindung auf den Zellen als ein zelluläres Membranprotein mit einer transmembranären Domäne exprimiert wird.
Beispiele für Plasmide, in die eine cDNA integriert ist, sind zum Beispiel von E. coli abgeleitete pBR322, pUC18, pUC19, pUC118 und pUC119 (Takara Shuzo Co., Japan), jedoch können andere Plasmide verwendet werden, falls sie in den Wirtszellen reproduziert und vermehrt werden können. Beispiele für Phagenvektoren, in die cDNA integriert ist, sind zum Beispiel λgt10 und λgt11, jedoch können andere Vektoren verwendet werden, falls sie in den Wirtszellen wachsen können. Die so erhaltenen Plasmide werden in geeignete Wirtszellen, wie zum Beispiel vom Genus Escherichia und vom Genus Bacillus unter Verwendung des Calciumchlorid-Verfahrens transduziert. Beispiele für das vorstehende Genus Escherichia sind Escherichia coli K12HB101, MC1061, LE392 und JM109. Ein Beispiel für das vorstehende Genus Bacillus ist Bacillus subtilis MI114. Der Phagenvektor kann in die vermehrten E. coli durch ein in vitro Packungsverfahren eingeführt werden (Enquist und Sternberg, Meth. Enzymol., 68, 281, 1979).
Gemäß der Analyse der Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 besteht die Aminosäure-Sequenz eines Vorläufers des humanen Delta-1 aus 723 Aminosäure-Resten, die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 8 gezeigt sind, und von der Signalpeptid-Domäne glaubt man, dass sie der Aminosäure-Sequenz der 21 Aminosäurereste von Nr. –21 Methionin bis Nr. –1 Serin der Sequenzliste entspricht; dass die extrazelluläre Domäne den 520 Aminosäureresten von Nr. 1 Serin bis Nr. 520 Glycin entspricht; dass die transmembranäre Domäne den 32 Aminosäurereste von Nr. 521 Prolin bis Nr. 552 Leucin entspricht; und dass die intrazelluläre Domäne dem Bereich von 150 Aminosäuren von Nr. 553 Glutamin bis Nr. 702 Valin entspricht. Diese Domänen werden aus den Aminosäure-Sequenzen als eine Konstruktion einer Domäne abgeschätzt, und das tatsächliche Vorliegen einer Dömänenform kann sich möglicherweise von der vorstehenden Struktur unterscheiden, und die konstituierenden Aminosäuren einer jeden vorstehend definierten Domäne können möglicherweise bis zu 5 bis 10 Aminosäuren in der Sequenz abweichen.
Gemäß einem Vergleich der Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 und von Delta-Homologen anderer Organismen, betragen die Homologien mit Delta aus Drosophila, Delta aus Huhn bzw. Xenopus laevis 47,6 %, 83,3 % bzw. 76,2 %. Das humane Delta-1 der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von diesen Delta-Proteinen und ist eine neue Substanz, welche zum erstenmal von den vorliegenden Erfindern aufgeklärt wurde. Eine Suche nach allen Organismen in der vorstehenden Datenbank wies darauf hin, dass Polypeptide mit einer zu humanen Delta-1 identischen Sequenz nicht gefunden werden konnten.
Die Homologen des Notch-Liganden besitzen eine im Lauf der Evolution konservierte, gemeinsame Sequenz, d.h. eine wiederholte DSL-Sequenz und eine EGF-ähnliche Sequenz. Als ein Ergebnis des Vergleichs mit der Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 wird diese konservierte Sequenz abgeschätzt. Die DSL-Sequenz entspricht nämlich den 43 Aminosäure-Resten von Nr. 158 Cystein bis Nr. 200 Cystein der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 4 in der Sequenzliste. Eine EGF-ähnliche Sequenz liegt mit 8 Wiederholungen vor, wobei – in der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 4 in der Sequenzliste–die erste EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 205 Cystein bis Nr. 233 Cystein; die zweite EGF-ähnliche Sequenenz von Nr. 236 Cystein bis Nr. 264 Cystein; die dritte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 271 Cystein bis Nr. 304 Cystein; die vierte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 311 Cystein bis Nr. 342 Cystein; die fünfte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 349 Cystein bis Nr. 381 Cystein; die sechste EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 388 Cystein bis Nr. 419 Cystein; die siebte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 426 Cystein bis Nr. 457 Cystein; und die achte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 464 Cystein bis Nr. 495 Cystein sich erstreckt.
Ein Teil der anhängenden Zuckerketten wird aus der Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 abgeschätzt, und der Asparaginrest Nr. 456 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4 kann eine mögliche Bindestelle einer N-glykosidischen Bindung für N-Acetyl-D-glucosamin sein. Man glaubt, dass eine O-glycosidische Bindung des N-Acetyl-D-galactosamins an einem Teil vorliegt, der reich an Serin- oder Threoninresten ist. Ein Protein, das mit einer Zuckerkette verbunden ist, wird im Allgemeinen für in vivo stabil gehalten, und man glaubt, dass es eine starke physiologische Aktivität besitzt. Infolge dessen werden von der Aminosäure-Sequenz des Polypeptids mit einer Sequenz SEQ ID Nr. 2, 3 oder 4 der Sequenzliste Polypeptide mit N-glykosidischer oder O-glykosidischer Bindung mit einer Zuckerkette des N-Acetyl-D-glucosamins oder des N-Acetyl-D-galactosamins von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Gemäß der Analyse der Aminosäure-Sequenz des humanen Serrate-1 besteht die Aminosäure-Sequenz eines Vorläufers des humanen Serrate-1 aus 1218 Aminosäure-Resten, die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 gezeigt sind, und man schätzt, dass die Domäne des Signalpeptids den 31 Aminosäure-Resten in der Aminosäure-Sequenz von Nr. –31 Methionen bis Nr. –1 Alanin der Sequenzliste entspricht; dass die extrazelluläre Domäne den 1036 Aminosäure-Resten von Nr. 1 Serin bis Nr. 1036 Asparagin entspricht; dass die transmembranäre Domäne den 26 Aminosäure-Reste von Nr. 1037 Phenylalanin bis Nr. 1063 Leucin entspricht; und dass die intrazelluläre Domäne den 106 Aminosäure-Resten von Nr. 1063 Arginin bis Nr. 1187 Valin entspricht. Diese Domänen werden aus der Aminosäure-Sequenz als eine Konstruktion von Domänen abgeschätzt, und das tatsächliche Vorliegen einer Domänenform kann sich möglicherweise von der vorstehenden Struktur unterscheiden, und die konstituierenden Aminosäuren einer jeden vorstehend definierten Domäne können möglicherweise bis zu 5 bis 10 Aminosäuren in der Sequenz abweichen.
Gemäß einem Vergleich der Aminosäure-Sequenz des humanen Serrate-1 mit den Serrate-Homologen von anderen Organismen betragen die Homologien mit Serrate aus Drosophila und Jagged aus Ratte 32,1 % bzw. 95,3 %. Das humane Serrate-1 der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von diesen Serrate-Proteinen und ist eine neue Substanz, welche zum erstenmal von den vorliegenden Erfindern aufgeklärt wurde. Eine Suche nach allen Organismen in der vorstehenden Datenbank wies darauf hin, dass Polypeptide mit einer zu dem humanen Serrate-1 identischen Sequenz nicht gefunden werden konnten.
Die Homologen des Notch-Liganden haben eine im Laufe der Evolution konservierte gemeinsame Sequenz, d.h. eine wiederholte DSL-Sequenz und eine EGF-ähnliche Sequenz. Als ein Ergebnis des Vergleichs mit einer Aminosäure-Sequenz des humanen Serrate-1 und anderen homologen Notch-Liganden wurde diese konservierte Sequenz abgeschätzt. Die DSL-Sequenz entspricht nämlich den 43 Aminosäureresten von Nr. 156 Cystein bis Nr. 198 Cystein der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 7 in der Sequenzliste. Die EGF-ähnliche Sequenz liegt mit 16 Wiederholungen vor, wobei in der Aminosäure-Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 7 die erste EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 205 Cystein bis Nr. 231 Cystein; die zweite EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 234 Cystein bis Nr. 262 Cystein; die dritte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 269 Cystein bis Nr. 302 Cystein; die vierte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 309 Cystein bis Nr. 340 Cystein; die fünfte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 346 Cystein bis Nr. 378 Cystein; die sechste EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 385 Cystein bis Nr. 416 Cystein; die siebte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 423 Cystein bis Nr. 453 Cystein; die achte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 462 Cystein bis Nr. 453 Cystein; die neunte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 498 Cystein bis Nr. 529 Cystein; die zehnte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 536 Cystein bis Nr. 595 Cystein; die elfte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 602 Cystein bis Nr. 633 Cystein; die zwölfte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 640 Cystein bis Nr. 671 Cystein; die dreizehnte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 678 Cystein bis Nr. 709 Cystein; die vierzehnte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 717 Cystein bis Nr. 748 Cystein; die fünfzehnte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 755 Cystein bis Nr. 786 Cystein; und die sechzehnte EGF-ähnliche Sequenz von Nr. 793 Cystein bis Nr. 824 Cystein sich erstreckt. Die zehnte EGF-ähnliche Sequenz besitzt jedoch eine unregelmäßige Sequenz, die zehn Cysteinreste enthält.
Ein Teil der anhängenden Zuckerketten wird aus der Aminosäure-Sequenz des humanen Serrate-1 abgeschätzt, und die Asparaginreste Nr. 112, 131, 186, 351, 528, 554, 714, 1014 und 1033 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 7 können eine mögliche Bindestelle einer N-glykosidischen Bindung für N-Acetyl-D-glucosamin sein. Man glaubt, dass eine O-glykosidische Bindung des N-Acetyl-D-galactosamins an einem Teil vorliegt, der reich an Serin- oder Threoninresten ist. Man glaubt, dass ein mit Zuckerketten gebundenes Protein im Allgemeinen in vivo stabil ist, und eine starke physiologische Aktivität besitzt. Infolge dessen werden von der Aminosäure-Sequenz des Polypeptids mit einer Sequenz SEQ ID Nr. 5, 6 oder 7 der Sequenzliste Polypeptide mit einer N-glykosidischen oder O-glykosidischen Bindung einer Zuckerkette des N-Acetyl-D-glucosamins oder des N-Acetyl-D-galactosamins von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Als ein Ergebnis der Studien zur Bindung des Notch aus Drosophila und seines Liganden erstreckt sich die Aminosäure-Region, die für die Bindung des Notch-Liganden aus Drosophila mit Notch notwendig ist, vom N-Terminus zur DSL-Sequenz des reifen Proteins, bei dem das Signalpeptid entfernt ist (ungeprüfte, veröffentlichte japanische PCT-Schrift Nr. 7-503121). Diese Tatsache weist darauf hin, dass die Domäne, welche für die Expression der Ligandenwirkung des Moleküls des humanen Notch-Liganden mindestens notwendig ist, die DSL-Domäne ist, d.h. eine Domäne, welche die Aminosäure-Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1 enthält, und dass die Domäne, welche für die Expression der Ligandenwirkung des humanen Delta-1 mindestens notwendig ist, eine neue Aminosäure-Sequenz ist, die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, und dass eine weitere Domäne, welche für die Expression der Ligandenwirkung des humanen Serrate-1 mindestens notwendig ist, eine neue Aminosäure-Sequenz ist, die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 5 gezeigt ist.
Eine mRNA des humanen Delta-1 kann unter Verwendung einer DNA nachgewiesen werden, die für einen Teil oder die für gesamte Gensequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 8 codiert, und eine mRNA des humanen Serrate-1 kann unter Verwendung einer DNA nachgewiesen werden, die für einen Teil oder für die gesamte Gensequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 codiert. Zum Beispiel kann ein Verfahren zum Nachweis der Expression dieser Gene durch Anwendung der Hybridisierung oder der PCR unter Verwendung komplementärer Nukleinsäuren zu dem vorstehenden 12-Mer oder dem vorstehenden 16-Mer, vorzugsweise dem vorstehenden 18-Mer mit einer Nukleinsäuresequenz eines Teils der Sequenz SEQ ID Nr. 8 oder 9 in der Sequenzliste bewerkstelligt werden, d.h. mittels einer Antisens-DNA oder einer Antisens-RNR, ihren methylierten, methylphosphatierten, deaminierten oder thiophosphatierten Derivaten. Durch dasselbe Verfahren kann der Nachweis von Homologen des Gens aus anderen Organismen, wie zum Beispiel Mäusen, oder die Klonierung des Gens erbracht werden. Die weitere Klonierung von Genen aus dem Genom, einschließlich desjenigen des Menschen, kann erfolgen. Unter Verwendung dieser Gene, welche durch solche Verfahren kloniert wurden, können weitere detaillierte Funktionen des humanen Delta-1 oder des humanen Serrate-1 der vorliegenden Erfindung aufgeklärt werden. Zum Beispiel können – unter Verwendung moderner Genmanipulationsverfahren – alle Verfahren, einschließlich der transgenen Mäuse, des gezielten Abschaltens von Genen in Mäusen („mouse gene targeting"), oder der „Doppel-Knockout-Mäuse", in denen diejenigen Gene mit Bezug auf die Gene der vorliegenden Erfindung inaktiviert werden, herangezogen werden. Falls Abnormalitäten im Genom der vorliegenden Gene gefunden werden, kann eine Anwendung zur Gendiagnose und zur Gentherapie erfolgen.
Eine Transformante E. coli JM109, in welche der Vektor pUCDL-1F, welcher die cDNA enthält, die für die gesamte Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 der vorliegenden Erfindung codiert, transformiert wurde, wurde im National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, of 1-1-3, Higasi, Tsukuba-shi, Ibaragiken, Japan hinterlegt als E. coli: JM109-pUCDL-1F. Das Datum der Hinterlegung war der 28. Oktober 1996, und die Hinterle gungs-Nummer ist FERM BP-5728. Eine Transformante E. coli JM109, in welche der Vektor pUCSR-1, welcher die cDNA enthält, die für die gesamte Aminosäure-Sequenz des humanen Serrate-1 der vorliegenden Erfindung codiert, transformiert wurde, wurde im National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, of 1-1-3, Higasi, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan hinterlegt als E. coli: JM109-pUCSR-1. Das Datum der Hinterlegung war der 28. Oktober 1996, und die Hinterlegungs-Nummer ist FERM BP-5726.
Die Expression und Reinigung verschiedener Formen des humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 unter Verwendung einer cDNA, welche für die Aminosäure-Sequenz des humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 codieren, welche durch die vorstehenden Verfahren isoliert wurden, sind in den Referenzen veröffentlicht (Kriegler, Gene Transfer and Expression – A Laboratory Manual, Stockton Press, 1990 und Yokota et al., Biomanual Series 4, Gene transfer and expression and analysis, Yodosha Co., 1994). Eine cDNA, welche für die Aminosäure-Sequenz des isolierten humanen Delta-1 und humanen Serrate-1 codiert, wird in einen bevorzugten Expressionsvektor ligiert, und wird in die Wirtszellen von eukaryotischen Zellen, wie zum Beispiel Tierzellen und Insektenzellen, oder Prokaryontenzellen, wie zum Beispiel Bakterien, überführt.
Bei der Expresssion des humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 der vorliegenden Erfindung kann die DNA, welche für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, ein Start-Codon für die Translation am 5'-Ende und ein Stop-Codon für die Translation am 3'-Ende aufweisen. Diese Start-Codons für die Translation und Stop-Codons für die Translation können durch Verwendung eines bevorzugten synthetischen DNA-Adapters hinzugefügt werden. Darüber hinaus wird für die Expression dieser DNA der Promotor stromaufwärts von der DNA-Sequenz eingebunden. Beispiele für Vektoren sind Plasmide, die von Bacillus abstammen, Plasmide, die von Hefe oder einem Bakteriophagen, wie zum Beispiel dem λ-Phagen, abstammen, und tierische Viren, wie zum Beispiel Retroviren und Vaccinia-Viren.
Beispiele für Promotoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind beliebige Promotoren, die vorzugsweise denjenigen der Wirtszellen, die in der Genexpression verwendet werden, entsprechen.
Für den Fall, dass die Wirtszelle bei der Transformation vom Genus Escherichia ist, sind der tac-Promotor, trp-Promotor und der lac-Promotor bevorzugt, und für den Fall einer Wirtszelle vom Genus Bacillus sind der SP01-Promotor und der SP02-Promotor bevorzugt, und für den Fall einer Wirtszelle von Hefe sind der PGK-Promotor, GAP-Promotor und der ADH-Promotor bevorzugt.
Für den Fall, dass die Wirtszellen tierische Zellen sind, kann ein Promotor, der aus SV40 stammt, wie zum Beispiel SRα-Promotor, wie er im Beispiel beschrieben ist, ein Promotor eines Retrovirus', ein Metallothionin-Promotor und ein Hitzeschick-Promotor verwendet werden.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung des Expressionsvektors exprimiert werden, der die Eigenschaft besitzt, von einem beliebigen Fachmann verwendet zu werden.
Die Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung von ausschließlich derjenigen DNA erfolgen, weiche die Aminosäure-Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 codiert. Jedoch kann ein Protein, das mit einer spezifischen Funktion ausgestattet ist, unter Verwendung einer DNA hergestellt werden, zu der eine zusätzliche cDNA, welche das bekannte Antigenepitop für einen leichteren Nachweis des produzierten Polypeptids codiert, oder eine zusätzliche cDNA, welche Immunglobulin Fc zur Bildung eines Multimers codiert, hinzugefügt wird.
Wie in Beispiel 5 gezeigt, haben wir Expressionsvektoren wie folgt hergestellt, welche extrazelluläre Proteine des humanen Delta-1 exprimieren:

1) Eine DNA, welche für die Aminosäuren von Nr. 1 bis 520 in der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3 codiert;
2) eine DNA, welche für ein chimäres Protein codiert, zu dem ein Polypeptid mit 8 Aminosäuren hinzugefügt wurde, d.h. eine Aminosäure-Sequenz, bestehend aus Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (nachfolgend als FLAG-Sequenz bezeichnet, in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 10), und zwar am C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 520 in der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3; und
3) eine DNA, welche für ein chimäres Protein codiert, zu dem eine Fc-Sequenz unterhalb des Gelenkbereichs des humanen IgG1 (bezugnehmend auf die ungeprüfte, internationale Veröffentlichung der Patentschrift WO 96/11221) am C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 520 in der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3 hinzugefügt wurde, um eine Dimerstruktur durch Disulfid-Bindungen im Gelenkbereich zu erhalten,

Die Vektoren für die Expression des vollständigen humanen Delta-1 als Expressionsvektoren, welche die vollständigen Proteine des humanen Delta-1 exprimieren, können wie folgt hergestellt werden:

4) Eine DNA, welche für die Aminosäuren von Nr. 1 bis 702 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4 codiert; und
5) eine DNA, welche für das chimäre Protein codiert, zu welchem ein Polypeptid mit der FLAG-Sequenz am C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 702 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4 hinzugefügt wurde,

Wie in Beispiel 6 gezeigt, haben wir Expressionsvektoren wie folgt hergestellt, welche Proteine des humanen Serrate-1 extrazellulär exprimieren:

6) Eine DNA, welche für die Aminosäuren von Nr. 1 bis 1036 in der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 6 codiert,
7) eine DNA, welche für ein chimäres Protein codiert, zu welchem das Polypeptid mit der FLRG-Sequenz am C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 1036 in der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 6 hinzugefügt wurde, und
8) eine DNA, welche für ein chimäres Protein codiert, zu welchem die Fc-Sequenz am C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 1036 in der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 6 hinzugefügt wurde, um eine Dimerstruktur durch Disulfid-Bindungen im Gelenkbereich zu erhalten,

Die Vektoren für die Expression des vollständigen humanen Serrate-1 als Expressionsvektoren, welche die vollständigen Proteine des humanen Serrate-1 exprimieren, können wie folgt hergestellt werden:

9) Eine DNA, welche für die Aminosäuren von Nr. 1 bis 1187 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 7 codiert, und
10) eine DNA, welche für das chimäre Protein codiert, zu welchem das Polypeptid mit der FLAG-Sequenz am C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 1187 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 7 hinzugefügt wurde,

Beispiele für den Wirt sind das Genus Escherichia, das Genus Bacillus, Hefe und Tierzellen. Beispiele für tierische Zellen sind Affenzellen COS-7 und Vero, CHO aus chinesischen Hamsterzellen, und SF9-Zellen aus Seidenraupen.
Wie in Beispiel 7 gezeigt, werden die Expressionsvektoren der vorstehenden Beispiele 1) bis 10) einzeln transduziert: das humane Delta-1 oder das humane Serrate-1 werden in COS-7-Zellen exprimiert (erhältlich vom Institute of Physical and Chemical Research, Cell Development Bank, RCB0539), und die Transformanten, welche mittels dieser Expressionsplasmide transformiert wurden, können erhalten werden. Darüber hinaus können das humane Delta-1 Polypeptid und das humane Serrate-1 Polypeptid durch Kultivierung der Transformanten unter bevorzugten Kulturbedingungen in einem Medium mittels eines bekannten Kulturverfahrens hergestellt werden.
Wie in Beispiel 8 gezeigt, können das humane Delta-1 Polypeptid und das humane Serrate-1 Polypeptid aus der vorstehenden Kulturmasse im Allgemeinen durch die folgenden Verfahren gereinigt werden.
Zur Extraktion der Substanz aus kultivierten, mikrobiellen Zellen oder Zellen, werden die mikrobiellen Zellen oder Zellen durch ein bekanntes Verfahren, wie zum Beispiel die Zentrifugation, nach der Kultivierung gesammelt, in einer bevorzugten Pufferlösung suspendiert, und die mikrobiellen Zellen oder Zellen werden mittels Ultraschall, Lysozym und/oder Einfrieren und Auftauen aufgebrochen, und der Rohextrakt wird durch Zentrifugation oder Filtration gesammelt. Die Pufferlösung kann protein-denaturierende Mittel, wie zum Beispiel Harnstoff und Guanidinhydrochlorid, oder grenzflächen-aktive Mittel, wie zum Beispiel Triton-X, enthalten. Im Falle der Sekretion in das Kulturmedium wird die Kulturmasse durch ein bekanntes Verfahren, wie zum Beispiel Zentrifugation, abgetrennt, um die mikrobiellen Zellen oder Zellen abzutrennen, und die überstehende Lösung wird gesammelt.
Das so erhaltene humane Delta-1 oder humane Serrate-1, welche in den Zellextrakten oder Zellüberständen enthalten sind, können durch bekannte Proteinreinigungs-Verfahren gereinigt werden. Während des Reinigungsverfahrens kann zur Bestätigung des Vorliegens des Proteins im Falle des mit vorstehenden FLAG bzw. des mit dem humanen IgG-Fc fusionierten Proteins dieses mittels eines Immunoassays nachgewiesen werden, wobei ein Antikörper verwendet wird, der gegen bekannte Antigenepitope gerichtet ist, und es kann gereinigt werden. Falls das fusionierte Protein als solches nicht exprimiert wird, kann der Antikörper von Beispiel 9 für den Nachweis verwendet werden.
Antikörper, welche spezifisch das humane Delta-1 und das humane Serrate-1 erkennen, können wie in Beispiel 9 gezeigt hergestellt werden. Antikörper können durch Verfahren hergestellt werden, die in der Literatur beschrieben sind (Antibodies: A laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory) oder es können rekombinante Antikörper durch Verwendung von Immunoglobulin-Genen, welche durch ein Genklonierungs-Verfahren isoliert wurden, in Zellen exprimiert werden. Die so hergestellten Antikörper können für die Reinigung des humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 verwendet werden. Das humane Delta-1 oder das humane Serrate-1 kann nachgewiesen und unter Verwendung von Antikörpern mittels eines Assays bestimmt werden, welche spezifisch das humane Delta-1 oder das humane Serrate-1 erkennen, wie in Beispiel 9 gezeigt, und sie können für diagnostische Mittel für Krankheiten verwendet werden, die mit einer abnormalen Differenzierung von Zellen, wie zum Beispiel malignen Tumoren, einhergehen.
Ein nützlicheres Reinigungsverfahren ist die Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung eines Antikörpers. Die in diesem Fall verwendeten Antikörper sind Antikörper, die in Beispiel 9 beschrieben werden. Als Fusionsprotein werden Antikörper gegen FLAG im Falle von FLAG, und Protein G oder Protein A im Falle des humanen IgG-Fc verwendet, wie in Beispiel 8 gezeigt.
Ein beliebiges anderes Fusionsprotein als das vorstehend gezeigte kann verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Histidin-Tag oder myc-Tag erwähnt werden. Beliebige fusionierte Proteine können durch Verfahren hergestellt werden, welche den heutigen Technologien zur Handhabung der DNA entsprechen, und die sich von den bekannten Verfahren unterscheiden; und die Peptide der vorliegenden Erfindung, die sich von jenen Fusionsproteinen ableiten, liegen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung.
Physiologische Funktionen der so gereinigten, humanen Delta-1 und humanen Serrate-1 Proteine können durch verschiedene Assay-Verfahren identifiziert werden, zum Beispiel durch Assay-Verfahren zur Bestimmung der physiologischen Aktivität unter Verwendung von Zell-Linien und Tieren, wie zum Beispiel Mäusen und Ratten, durch Assay-Verfahren zur intrazellulären Signaltransduktion, die auf molekularbiologischen Mitteln, der Bindung mit dem Notch-Rezeptor etc., beruhen.
Wir haben Wirkungen auf undifferenzierte Blutzellen unter Verwendung von IgG1 chimären Proteinen des humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 beobachtet.
Als ein Ergebnis haben wir gefunden, dass, wie in Beispiel 10 gezeigt, die Polypeptide der vorliegenden Erfindung eine unterdrückende Wirkung der kolonie-bildenden Wirkung gegenüber undifferenzierten Blutzellen – nämlich undifferenzierte Blutzellen aus dem Nabelschnurblut, in denen eine Fraktion mit CD34 positiven Zellen konzentriert ist – aufweisen, welche eine Koloniebildung in Gegenwart von Cytokinen zeigen. Die unterdrückende Wirkung wird nur in Gegenwart von SCF beobachtet. Diese Art von Wirkung war vorher nicht bekannt.
Wie in Beispiel 11 gezeigt, haben wir gefunden, dass eine Aufrechterhaltung der kolonie-bildenden Zellen signifikant durch die Zugabe des IgG1 chimären Proteins von humanem Delta-1 oder von humanem Serrate-1 in einer Flüssigkultur über einen langen Zeitraum (8 Wochen) in Gegenwart der Cytokine, wie zum Beispiel SCF, IL-3, IL-6, GM-CSF und Epo, ausgedehnt wird. Darüber hinaus haben wir gefunden, dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung eine Wirkung hatten, das Wachstum der kolonie-bildenden Zellen nicht zu unterdrücken. Ein Cytokin, MIP-1a, das eine die Migration und Differenzierung unterdrückende Wirkung auf Blutzellen besitzt (Verfaillie et al., J. Exp. Med. 179, 643–649, 1994), hat keine Wirkung bei der Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustands für undifferenzierte Blutzellen.
Wie ferner in Beispiel 12 gezeigt, haben wir gefunden, dass – als ein Ergebnis der Zugabe des IgG1 chimären Proteins von humanem Delta-1 oder von humanem Serrate-1 zur Flüssigkultur in Gegenwart von Cytokinen – das humane Delta-1 und das humane Serrate-1 Aktivitäten aufweisen, um die Anzahl der LTC-IC (Long-Term Culture-Initiating Cells; Langzeitkultur-Startzellen) signifikant aufrecht zu erhalten, welche die meisten undifferenzierten Stammzellen des Bluts in den menschlichen, undifferenzierten Blutzellen darstellen.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das humane Delta-1 und das humane Serrate-1 die Differenzierung der undifferenzierten Blutzellen unterdrückt, und diese Wirkungen breiten sich von den Stammzellen des Bluts auf die kolonie-bildenden Zellen aus. Diese physiologischen Wirkungen sind wesentlich für die in vitro Expansion von undifferenzierten Blutzellen. Die in dem Medium kultivierten Zellen, welches humanes Delta-1 oder humanes Serrate-1 enthält, sind wirksam bei der Erholung der Unterdrückung des Knochenmarks nach Verabreichung von Antitumormitteln. Dementsprechend kann ein in vitro Wachstum von hämatopoietischen Stammzellen möglich sein, falls andere Bedingungen vorliegen würden. Weitere Arzneimittel, welche das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthalten, haben eine schützende Wirkung, sowie eine Wirkung, die Unterdrückung des Knochenmarks frei zu geben, welche als ungünstige Wirkung von Antitumormitteln beobachtet wird.
Die unterdrückende Wirkung bezüglich der Differenzierung von Zellen in undifferenzierten Zellen, die von Blutzellen verschieden sind, wird erwartet, und eine stimulierende Wirkung für die Geweberegeneration kann erwartet werden.
In der pharmazeutischen Anwendung werden die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch Zugabe bevorzugter stabilisierender Mittel, wie zum Beispiel von humanem Serumalbumin, lyophilisiert, und sie werden im gelösten oder suspendierten Zustand mit destilliertem Wasser für die Injektion verwendet, wenn sie zur Anwendung kommen. Zum Beispiel kann eine Zubereitung für die Injektion oder Infusion mit einer Konzentration von 0,1–1000 μg/ml bereitgestellt werden. Eine Mischung der Verbindung der vorliegenden Erfindung von 1 mg/ml und humanem Serumalbumin von 1 mg/ml, aufgeteilt in Fläschchen, konnte die Aktivität dieser Verbindung über einen langen Zeitraum aufrechterhalten. Zur Kultivierung und Aktivierung von Zellen in vitro werden eine lyophilisierte Präparation oder eine flüssige Präparation der Polypeptide der vorliegenden Erfindung hergestellt und zu dem Medium gegeben, oder in einem Gefäß für die Kultur immobilisiert. Die Toxizität der Polypeptide der vorliegenden Erfindung wurde getestet. Jedes Polypeptid wurde mit 10 mg/kg intraperitoneal an Mäuse verabreicht, jedoch wurde kein Tod der Mäuse beobachtet.
Die physiologische Aktivität der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in vitro kann bewertet werden, indem sie an Mäuse verabreicht werden, die als Krankheitsmodell dienen, oder an Ratten oder Affen mit ähnlichen Krankheiten, und indem die Wiederherstellung der physikalischen und physiologischen Funktionen und der abnormen Befunde überprüft wird. Zum Beispiel werden im Falle der Erforschung der Abnormalität in Bezug auf hämatopoietische Stammzellen die als Modell zur Unterdrückung des Knochenmarks dienenden Mäuse durch Verabreichung von Antitumormitteln der 5-FU-Reihe präpariert; und die Zahl der Knochenmarkszellen, die Zahl der peripheren Blutzellen und die physiologischen Funktionen werden in der Gruppe von Mäusen, der ein Arzneimittel verabreicht wurde, oder der Gruppe von Mäusen, der kein Arzneimittel verabreicht wurde, überprüft. Darüber hinaus werden im Fall der Erforschung der in vitro Kultivierung und des Wachstums von hämatopoietischen undifferenzierten Zellen, einschließlich der hämatopoietischen Stammzellen, die Knochenmarkszellen von Mäusen in Gruppen kultiviert, denen eine Verbindung der vorliegenden Erfindung zugegeben wurde oder nicht, und die kultivierten Zellen werden auf Mäuse übertragen, die mit einer letalen Dosis bestrahlt wurden. Das Ergebnis der Wiederherstellung wird anhand der Hinweise auf die Überlebensrate und der Schwankung der Zahl der Blutzellen beobachtet. Diese Ergebnisse können auf die Menschen extrapoliert werden, und dementsprechend nützliche wirksame Daten für die Bewertung der pharmakologischen Aktivitäten der Verbindung der vorliegenden Erfindung können erhalten werden.
Anwendungen der Verbindung der vorliegenden Erfindung für Arzneimittel umfassen Krankheiten mit abnormaler Differenzierung der Zellen, zum Beispiel Leukämie und maligne Tumore. Dies ist eine Zelltherapie, welche durch Kultivierung der vom Menschen stammenden Zellen in vitro unter Beibehaltung ihrer ursprünglichen Funktionen oder unter Hinzufügung neuer Funktionen durchgeführt wird, und eine Therapie, welche durch Regeneration durchgeführt wird, ohne die ursprünglich in den Geweben vorhandenen Funktionen durch Verabreichung der Verbindung der vorliegenden Erfindung während der Regeneration nach der Gewebeverletzung zu zerstören. Die verabreichte Menge kann sich je nach Art der Präparation unterscheiden, und sie liegt im Bereich von 10 μg/kg bis 10 mg/kg.
Darüber hinaus kann eine starke physiologische Aktivität durch Expression der Bildung eines Multimers des Polypeptids der vorliegenden Erfindung erreicht werden.
Da die unterdrückende Wirkung des humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 in dem IgG chimären Protein mit einer Dimerstruktur stärker ist, wird eine Form starker physiologischer Aktivität, wie in Beispiel 10 gezeigt, vorzugsweise in Form einer Multimerbildung exprimiert.
Humanes Delta-1 und humanes Serrate-1 mit einer Multimerstruktur können durch ein Verfahren hergestellt werden, das ein chimäres Protein mit dem humanen IgG-Fc-Bereich exprimiert, wie im Beispiel beschrieben, und das ein Multimer mit einer Disulfidbrücke im Gelenkbereich des Antikörpers exprimiert, oder durch ein Verfahren, welches ein chimäres Protein exprimiert, bei dem der erkennende Bereich des Antikörpers am C-Terminus oder am N-Terminus exprimiert wird, und durch Umset zung mit dem Polypeptid, welches den extrazellulären Teil des so exprimierten humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 enthält, mit dem Antikörper, welcher spezifisch die Region für die Antikörpererkennung am C-Terminus oder N-Terminus erkennt. Bei anderen Verfahren kann ein Verfahren erwähnt werden, bei dem ein Fusionsprotein, das nur mit dem Gelenkbereich des Antikörpers und in einem durch die Disulfid-Bindung dimerisierten Zustand exprimiert wird. Das Multimer des humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 mit einer höheren spezifischen Aktivität als das Dimer kann erhalten werden. Dieses Multimer ist aus einem Fusionsprotein aufgebaut, welches für die Expression des Peptids am C-Terminus, N-Terminus oder in einem anderen Bereich hergestellt wird. Das Protein wird in der Form der Bildung einer Disulfid-Bindung hergestellt, ohne eine andere Aktivität des humanen Delta-1 oder humanen Serrate-1 zu beeinflussen. Die Multimerstruktur kann ebenso durch Anordnung eines oder mehrerer Peptide exprimiert werden, welche aus den Polypeptiden ausgewählt werden, die Aminosäure-Sequenzen der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2, 3, 5 oder 6 enthalten, mit einem Verfahren zur Manipulation der DNA in Reihe oder parallel. Andere bekannte Verfahren zur Bereitstellung einer Multimerstruktur mit einem Dimer oder einer höheren Struktur können angewendet werden. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung beliebige Polypeptide, die Aminosäure-Sequenzen enthalten, welche in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2, 3, 5 und 6 beschrieben sind, in Form einer dimeren oder höheren Struktur, und durch Gentechnologie hergestellt wurden.
Darüber hinaus kann als ein anderes Verfahren das Multimerisierungs-Verfahren unter Verwendung chemischer Vernetzer erwähnt werden. Zum Beispiel kann Dimethylsuberimidat-Dihydrochlorid zum Vernetzen der Lysinreste, N-(γ-Maleimidbutyryloxy)-succinimid zum Vernetzen von Thiolgruppen von Cystein resten, und Glutaraldehyd zum Vernetzen zwischen zwei Aminogruppen erwähnt werden. Das Multimer mit einem Dimer oder einer höheren Struktur kann synthetisiert werden, indem diese Vernetzungsreaktionen verwendet werden. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung beliebige Polypeptide, die Aminosäure-Sequenzen enthalten, welche in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2, 3, 5 oder 6 beschrieben sind, in der Form eines Dimers oder einer höheren Struktur, welche durch chemische Vernetzungsreaktionen hergestellt wurden.
Bei der Anwendung in der medizinischen Versorgung, bei der Zellen in vitro vermehrt und aktiviert werden und dem Körper wieder zugeführt werden, können humanes Delta-1 oder humanes Serrate-1 in der vorstehend beschriebenen Form direkt dem Medium zugegeben werden, jedoch kann auch eine Immobilisierung erfolgen. Das Immobilisierungs-Verfahren umfasst die Anwendung einer Aminogruppe oder Carboxylgruppe in dem Peptid, die Verwendung geeigneter Abstandshalter oder die vorstehend erwähnten Vernetzer, und das Polypeptid kann kovalent an die Kulturgefäße gebunden werden. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung Polypeptide, die Aminosäure-Sequenzen enthalten, welche in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2, 3, 5 oder 6 beschrieben sind, in der Form, dass sie auf einer festen Oberfläche vorliegen.
Da das natürliche humane Delta-1 und das humane Serrate-1 Zellmembran-Proteine sind, kann eine die Differenzierung unterdrückende Wirkung exprimiert werden, zum Beispiel durch Cokultivierung von Zellen, welche diese Moleküle exprimieren, mit undifferenzierten Blutzellen. Infolge dessen umfasst diese Erfindung das Cokultivierungs-Verfahren von transformierten Zellen unter Verwendung einer DNA, welche für die Aminosäure- Sequenzen in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2–7 codiert, mit undifferenzierten Zellen.
Die Zellen für die Expression können COS-7-Zellen sein, wie in den Beispielen gezeigt, jedoch sind Zellen von humanem Ursprung bevorzugt, und weitere Zellen für die Expression können Zell-Linien oder beliebige humane Blutzellen in vivo oder somatische Zellen sein. Infolge dessen kann das Polypeptid in vivo exprimiert werden, indem es in Vektoren für die Gentherapie integriert wird.
Wie in Beispiel 10 gezeigt, zeigen das FLAG chimäre Protein von humanem Delta-1 oder humanem Serrate-1, die in niedriger Konzentration beide Monomere sind, keine die Bildung einer Kolonie unterdrückende Wirkung, sondern eine die Bildung einer Kolonie stimulierende Wirkung. Diese Wirkung kann bei der Expression des Notch-Rezeptors und des Notch-Liganden anlässlich der Zellteilung der undifferenzierten Blutzellen beteiligt sein, und das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann als ein Antagonist für diese Wirkung fungieren. Dies legt nahe, dass das Polypeptid mit der Aminosäure-Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1, 2, 4 oder 5 eine die Bildung einer Kolonie stimulierende Wirkung zeigt, indem es die Konzentration seiner Wirkung kontrolliert.
Diese Tatsache legt nahe, dass die Inhibition der Bindung des Polypeptids mit einer Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2–7 an diese Rezeptoren dafür verwendet werden kann, Moleküle und Verbindungen zur Anregung der Zelldifferenzierung zu finden. Diese Verfahren umfassen ein Bindungsexperiment unter Verwendung von Radioisotopen, einen Luciferase-Assay unter Verwendung von Faktoren zur Transkriptions-Kontrolle, ein stromabwärts von dem Notch-Rezeptor gelegenes Mo lekül, und eine Simulation auf dem Computer durch Röntgenstrukturanalyse. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung Screeningverfahren für Arzneimittel unter Verwendung des Polypeptids der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2–7.
Wie in Beispiel 13 gezeigt, können spezifische Leukämiezellen durch Verwendung des IgG chimären Proteins von humanem Delta-1 oder humanem Serrate-1 differenziert werden. Infolge dessen kann die vorliegende Erfindung für diagnostische Reagenzien für Leukämie oder die Isolierung spezifischer Blutzellen verwendet werden. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass Moleküle des humanen Delta-1 oder des humanen Serrate-1 spezifisch an ihren Rezeptor, ein Notch-Rezeptormolekül, binden. Zum Beispiel kann die Expression des Notch-Rezeptors durch Verwendung eines Fusionsproteins mit der vorstehenden, extrazellulären Region und humanem IgG-Fc nachgewiesen werden. Notch ist bekanntermaßen an solchen Typen von Leukämie beteiligt (Ellisen et al., Cell 66, 649–661, 1991). Dementsprechend kann das Polypeptid mit der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 2, 3, 5 und 6 für diagnostische Reagenzien in vitro oder in vivo verwendet werden.
Kurze Erläuterung der Zeichnungen
1: Alignment einer DSL-Domäne des Notch-Liganden, der in verschiedenen Organismen identifiziert wurde, einschließlich der Moleküle der vorliegenden Erfindung.
2: Unterdrückung der Koloniebildung von undifferenzierten Blutzellen unter Verwendung der Moleküle der vorliegenden Erfindung.
3: Konzentrationsabhängigkeit der Unterdrückung der Koloniebildung von undifferenzierten Blutzellen unter Verwendung der Moleküle der vorliegenden Erfindung.
4: Eine grafische Darstellung, welche die Berechnung des LTC-1 nach einer Flüssigkultur unter Verwendung der Moleküle der vorliegenden Erfindung zeigt.
5: Zellen, die mit den Molekülen der vorliegenden Erfindung gefärbt wurden.
Ausführungsformen der Erfindung
Die folgenden Beispiele erläutern die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, sie sollen jedoch nicht als begrenzende Beispiele aufgefasst werden.
Beispiel 1
Klonierung von PCR-Produkten unter Verwendung des humanen Delta-1 Primers und Bestimmung der Basensequenz
Ein gemischter Primer, welcher der Aminosäure-Sequenz entspricht, die in C-Delta-1 und X-Delta-1 konserviert ist, d.h. ein Sense-Primer DLTS1 (Sequenzliste SEQ ID Nr. 11) und ein Antisense-Primer DLTA2 (Sequenzliste SEQ ID Nr. 12) wurden verwendet.
Ein synthetisches Oligonukleotid wurde unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts hergestellt, das nach dem Prinzip eines Immobilisierungs-Verfahrens arbeitet. Das verwendete, automatische DNA-Synthesegerät war 391PCR-MATE von Applied Biosystems Inc., USA. Das 3'-Nukleotid war an einem Träger immobilisiert, die Lösung und die Reagenzien wurden entsprechend den Anleitungen desselben Herstellers verwendet. Das Oligonukleotid wurde vom Träger nach Beendigung der gewünschten Kopplungsreaktion und der Behandlung des Oligonukleotid-Trägers entfernt, von dem die Schutzgruppe am 5'-Ende mit konzentriertem, flüssigen Ammoniak bei Raumtemperatur für 1 Stunde entfernt wurde. Zur Entfernung der Schutzgruppen der Nukleinsäure und der Phosphorsäure ließ man die Reaktionslösung, welche die Nukleinsäure enthielt, in der konzentrierten Ammoniaklösung im verschlossenen Gefäß bei 55°C über 14 Stunden stehen. Jedes Oligonukleotid, das vom Träger abgelöst und dessen Schutzgruppen entfernt wurden, wurde unter Verwendung einer OPC-Kartusche von Applied Biosystems Inc. gereinigt, und die Tritylgruppen durch Verwendung von 2 % Trifluoressigsäure entfernt. Der Primer wurde in entionisiertem Wasser gelöst, um ihn auf eine Endkonzentration von 100 pmol/μl nach der Reinigung einzustellen.
Die Amplifikation dieser Primer mittels PCR wurde wie folgt durchgeführt. 1 μl der gemischten cDNA-Lösung, die aus einem humanen, fötalen Hirn stammt (QUICK-Clone cDNA, CLONTECH Inc., USA) wurde verwendet. 5 μl einer 10 × Pufferlösung [500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl₂, 0,01 % Gelatine], 4 μl dNTP-Mischung (Takara Shuzo Co., Japan), 5 μl Sense-Primer DLTS1 (100 pmol/μl), welcher spezifisch für die vorstehenden Vertebraten war, und 5 μl Antisense-Primer DLTA2 (100 pmol/μl) und 0,2 μl TagDNA Polymerase (AmpliTaq, Takara Shuzo Co., Japan, 5 U/μl) wurden zu dieser Mischung gegeben, und schließlich wurde entionisiertes Wasser zugegeben, um eine Gesamtmenge von 50 μl einzustellen. Die PCR wurde durchgeführt mit 5 Zyklen eines Zyklus, der aus einer Behandlung bei 95°C für 45 Sekunden, bei 42°C für 45 Sekunden und 72°C für 2 Minuten bestand, ferner aus 35 Zyklen eines Zyklus, der aus einer Behandlung bei 95°C für 45 Sekunden, bei 50°C für 45 Sekunden und 72°C für 2 Minuten bestand, und schließlich ließ man sie bei 72°C für 7 Minuten stehen. Ein Teil des PCR-Produkts wurde einer Elektrophorese mit einem 2 % Agarose-Gel unterzogen, das mit Ethidiumbromid gefärbt (Nippon Gene Co., Japan) und unter ultraviolettem Licht beobachtet wurde, um eine Amplifikation von etwa 400 bp DNA zu bestätigen.
Die gesamte Menge des PCR-Produkts wurde der Gelelektrophorese mit einem 2 % Agarosegel unterzogen, das aus einer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt hergestellt wurde (GIBCO BRL Inc., USA), das mit Ethidiumbromid gefärbt wurde; eine etwa 400 bp große Bande des PCR-Produkts der Delta-Primer wurde unter ultraviolettem Licht ausgeschnitten, destilliertes Wasser im selben Volumen wie das Gel wurde zugegeben und für 10 Minuten auf 65°C erwärmt, und das Gel wurde vollständig aufgelöst. Nach Zugabe eines gleichen Volumens von mit TE gesättigtem Phenol (Nippon Gene Co., Japan) wurde das gelöste Gel bei 15.000 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert, um die überstehende Lösung abzutrennen, und derselbe Trennschritt wurde nach Zugabe einer mit TE gesättigten Lösung von Phenol : Chlorophorm (1:1), und nach Zugabe von Chloroform durchgeführt. Die DNA wurde aus der am Ende resultierenden Lösung durch Ethanolfällung gewonnen.
Ein Vektor, pCRII Vektor (Invitrogen Inc., USA, nachfolgend als pCRII bezeichnet), wurde verwendet. Der Vektor und die vorstehende DNA wurden in einem molaren Verhältnis von 1:3 gemischt, und die DNA wurde in den Vektor unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Invitrogen Inc., USA) ligiert. Der pCRII, in den die DNA integriert wurde, wurde der Gentransduktion in kompetente Zellen von E. coli, die für einen „Schuss" vorbereitet wurden (Invitrogen Inc., USA), unterzogen, und die Zellen wurden auf einer halbfesten Medienplatte von L-Medium (Ta kara Shuzo Co., Japan) verteilt, welches 50 μg/ml Ampicillin (Sigma Corp., USA) enthielt, und man lies sie bei 37°C für etwa 12 Stunden stehen. Die aufgetretenen Kolonien wurden willkürlich ausgewählt, in 2 ml flüssiges L-Medium überimpft, welches dieselbe Konzentration an Ampicillin enthielt, und zur Kultivierung bei 37°C für etwa 18 Stunden geschüttelt. Die kultivierten Bakterienzellen wurden wieder gewonnen, und das Plasmid wurde durch Wizard Miniprep (Promega Inc., USA) gemäß der anliegenden Gebrauchsanleitung abgetrennt. Das Plasmid wurde durch das Restriktionsenzym EcoRI verdaut. Die Integration dieses PCR-Produkts wurde durch das Herausschneiden von etwa 400 bp DNA bestätigt. Die Basensequenz der eingebauten DNA in den untersuchten Klon wurde durch das Fluoreszenz-DNA-Sequenzierungsgerät (Modell 3735, Applied System Inc., USA) bestimmt.
Beispiel 2
Klonierung des vollständigen, neuen, humanen Delta-1 und seine Analyse
Ein Screening der Klone mit vollständiger cDNA wurde durch Hybridisierung mit einer cDNA-Bibliothek, die aus humaner Plazenta stammt (insertierte cDNA in λgt-11, CLONTECH Inc., USA), mit Plaques durchgeführt, die 1 × 10⁶ Plaques entsprachen. Erzeugte Plaques wurden auf ein Nylonfilter (Hybond N+, Amersham Inc., USA) übertragen. Das transkribierte Nylonfilter wurde einer alkalischen Behandlung unterzogen (man ließ es 7 Minuten auf dem Filterpapier liegen, das mit einer Mischung von 1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH getränkt wurde), gefolgt von einer zweimaligen Neutralisierungsbehandlung [man ließ es 3 Minuten auf dem Filterpapier liegen, das mit einer Mischung von 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl (pH 7,2) und 1 mM EDTA getränkt war]. Nachfolgend wurde das Filter 5 Minuten in einer zweifach kon zentrierten SSPE-Lösung [0,36 M NaCl, 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,7) und 2 mM EDTA] geschüttelt, gewaschen, und an der Luft getrocknet. Anschließend ließ man das Filter für 20 Minuten auf dem Filterpapier liegen, welches mit 0,4 M NaOH getränkt wurde; es wurde 5 Minuten mit 5-fach konzentrierter SSPE-Lösung geschüttelt und gewaschen, und anschließend erneut an der Luft getrocknet. Das Screening wurde unter Verwendung dieser Filter mit einer humanen Delta-1-Sonde durchgeführt, die mit dem Radioisotop ³²P markiert war.
Die in Beispiel 1 hergestellte DNA-Sonde wurde mit ³²P wie folgt markiert. Ein DNA-Fragment wurde mit EcoRI aus pCRII ausgeschnitten, ein gereinigtes PCR-Produkt (etwa 400 bp) wurde mittels des humanen Delta-1-Primers insertiert, die Gensequenz wurde bestimmt, und es wurde aus einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt isoliert. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit einem DNA-Markierungskit (Megaprim DNA labeling system, Amersham, USA) markiert. Die 5 μl Primerlösung und entionisiertes Wasser wurden zu 25 ng DNA gegeben, um ein Gesamtvolumen von 33 μl einzustellen, welches 5 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad behandelt wurde. 10 μl Lösung des Reaktionspuffers, der dNTP enthielt, 5 μl α-³²P-dCTP und 2 μl Lösung der T4 DNA-Polynukleotid-Kinase wurden hierzu gegeben und bei 37°C 10 Minuten im Wasserbad behandelt. Nachfolgend wurde die Mischung mittels einer Sephadex-Säule (Quick Spin Column Sephadex G-50, Boehringer Mannheim Inc., Deutschland) gereingt, anschließend für 5 Minuten im kochenden Wasserbad behandelt, und für die Verwendung 2 Minuten auf Eis gekühlt.
Die Hybridisierung wurde wie folgt durchgeführt. Die vorstehend hergestellten Filter wurden in eine Lösung für die Vorhybridisierung getaucht, bestehend aus einer SSPE-Lösung, in welcher die Endkonzentration eines jeden Bestandteils auf die 5-fache Konzentration eingestellt wurde, aus einer 5-fach konzentrierten Denhardt's Lösung (Wako Pure Chemicals, Japan), aus einer 0,5 % SDS-Lösung (Natriumdodecylsulfat, Wako Pure Chemicals, Japan) und aus 10 μg/ml DNA aus Lachssamen (Sigma, USA), die durch kochendes Wasser denaturiert wurde, und bei 65°C 2 Stunden lang geschüttelt; anschließend wurde das Filter in die Hybridisierungslösung von derselben Zusammensetzung wie die vorstehende Lösung für die Vorhybridisierung mit der vorstehend erwähnten, mit ³²P markierten Sonde getaucht, und bei 65°C 2 Stunden 16 Stunden lang geschüttelt, um die Hybridisierung durchzuführen.
Das Filter wurde in die SSPE-Lösung getaucht, die 0,1 % SDS enthielt, bei 55°C geschüttelt und zweimal gewaschen, wiederum in eine 10-fach verdünnte SSPE-Lösung getaucht, die 0,1 % SDS enthielt, und viermal bei 55°C gewaschen. Eine Autoradiographie des gewaschenen Filters wurde unter Verwendung eines Verstärkungsbildschirms durchgeführt. Klone des stark entwickelten Teils wurden gesammelt, und die erhaltenen Plaques wurden durch dasselbe vorstehend erwähnte Verfahren verteilt und gescreent, um die einzelnen Klone vollständig zu trennen.
Die so isolierten Phagenklone waren sieben Klone. Phagen von all diesen Klonen wurden bei etwa 1 × 10⁹ pfu hergestellt, die Phagen-DNA gereinigt, mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und in den Vektor pBluescript (Stratagene Inc., USA) insertiert, welcher mit EcoRI in derselben Weise verdaut wurde. DNA-Sequenzen von beiden Enden dieser Klone wurden durch ein DNA-Sequenzierungsgerät analysiert. Drei Klone von D5, D6 und D7 waren die Klone, welche die DNA-Sequenz von Nr. 1 bis 2244 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 8 enthielten. Ein Klon D4 war ein Klon, der eine DNA-Sequenz von Nr. 999 bis 2663 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 8 enthielt. Mit den Klonen D5 und D4 wurde eine Deletionsmutante unter Verwendung eines Kilosequenz-Deletionskits (Takara Shuzo Co., Japan) gemäß einer Beschreibung der beiliegenden Gebrauchsanweisung hergestellt. Die vollständige cDNA-Basensequenz der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung des DNA-Sequenzierungsgeräts sowohl aus der 5'-Richtung als auch aus der 3'-Richtung bestimmt.
Unter Verwendung der XhoI-Schnittstelle bei Nr. 1214 in der DNA-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 8 wurden D4 und D5 durch das Restriktionsenzym XhoI verdaut, um ein Plasmid pBSDel-1 herzustellen, welches die vollständige DNA-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 8 enthielt.
Beispiel 3
Klonierung des humanen Serrate-1 spezifischen PCR-Produkts unter Bestimmung der Basensequenz
Ein gemischter Primer, welcher der Aminosäure-Sequenz entspricht, die in Drosophila Serrate und Jagged aus der Ratte konserviert ist, d.h. der Sense-Primer SRTS1 (Sequenzliste SEQ ID Nr. 13) und der Antisense-Primer SRTA2 (Sequenzliste SEQ ID Nr. 14) wurden verwendet. Die Herstellung wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Die Amplifikation mittels PCR unter Verwendung dieser Primer wurde wie folgt durchgeführt. Zu 1 μl einer vorstehend erwähnten, gemischten cDNA-Lösung, die aus humanem, fötalen Hirn stammt, wurden 5 μl einer 10-fach konzentrierten Pufferlösung (beschrieben in Beispiel 1), 4 μl dieser dNTP-Mischung, 5 μl Sense-Primer SRTS1 (100 pmol/μl) und 5 μl Antisense-Primer SRTA2 (100 pmol/μl), der spezifisch für das vorstehend erwähnte Serrate-1 Homologe ist, und 0,2 μl TagDNA-Polymerase zugegeben, sowie schließlich entionisiertes Wasser zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 50 μl einzustellen. Die Mischung wurde mit 5 Zyklen eines Zyklus behandelt, der aus einer Behandlung bei 95°C für 45 Sekunden, bei 42°C für 45 Sekunden und bei 72°C für 2 Minuten bestand, und mit 35 Zyklen eines Zyklus, der aus einer Behandlung bei 95°C für 45 Sekunden, bei 50°C für 45 Sekunden und bei 72°C für 2 Minuten bestand, und schließlich ließ man die Mischung bei 72°C 7 Minuten stehen, um eine PCR durchzuführen. Ein Teil des PCR-Produkts wurde einer Elektrophorese mit einem 2 % Agarosegel unterzogen, dieses wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und unter ultraviolettem Licht beobachtet, um die Amplifikation von etwa 500 bp cDNA zu bestätigen.
Die gesamte Menge des PCR-Produkts wurde der Elektrophorese mit einem 2 % Agarosegel unterzogen, das aus einer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt hergestellt wurde, das mit Ethidiumbromid gefärbt wurde; eine etwa 500 bp große Bande wurde unter ultraviolettem Licht ausgeschnitten, und destilliertes Wasser im selbem Volumen wie das Gel zugegeben, und auf 65°C 10 Minuten lang erhitzt, und das Gel wurde vollständig aufgelöst. Nach der Zugabe eines gleichen Volumens von mit TE gesättigtem Phenol wurde das aufgelöste Gel bei 15.000 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert, um die überstehende Lösung abzutrennen, und derselbe Trennungsschritt wurde nach der Zugabe einer Lösung von mit TE gesättigtem Phenol : Chloroform (1:1) bzw. mit Chloroform ausgeführt. Die DNA wurde aus der am Ende resultierenden Lösung durch Fällung mit Ethanol gewonnen.
Ein Vektor, pCRII Vektor, wurde verwendet. Der Vektor und die vorstehende DNA wurden in einem molaren Verhältnis von 1:3 gemischt, und das DNA-Fragment wurde in den Vektor pCRII durch dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 ligiert. Der Vektor pCRII, in den die DNA integriert wurde, wurde der Gentransduktion in E. coli unterzogen. Die auftretenden Kolonien wurden willkürlich ausgewählt und in 2 ml L-Flüssigmedium überimpft, das dieselbe Konzentration an Ampicillin enthielt, und unter Schütteln bei 37°C für etwa 18 Stunden kultiviert. Die kultivierten Bakterienzellen wurden gewonnen, und das Plasmid wurde unter Verwendung eines Wizard Miniprep entsprechend der beiliegenden Gebrauchsanleitung abgetrennt. Das Plasmid wurde durch das Restriktionsenzym EcoRI verdaut. Die Integration dieses PCR-Produkts wurde durch Ausschneiden von etwa 500 bp DNA bestätigt. Die Basensequenz der eingebauten DNA in den untersuchten Klon wurde durch ein DNR-Sequenzierungsgerät auf Fluoreszenz-Baisis bestimmt.
Beispiel 4
Klonierung des vollständigen, neuen, humanen Serrate-1 und seine Analyse
Das Screening der Klone mit vollständiger cDNA wurde durch die Hybridisierung mit der vorstehend erwähnten cDNA-Bibliothek, die aus humaner Plazenta stammt, in Plaques durchgeführt, die 1 × 10⁶ Plaques entsprachen. Die Herstellung des Filters wurde anhand desselben Verfahrens wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Das Screenen wurde mit der Sonde für humanes Serrate-1, die mit dem Radioisotop ³²P markiert war, unter Verwendung des Filters durchgeführt.
Die vorstehend erwähnte DNA-Probe, welche mit ³²P markiert war, wurde durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren hergestellt, und die Hybridisierung, das Waschen des Filters und die Isolierung der Klone wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
Die so isolierten Phagenklone waren 22 Klone. Phagen von allen diesen Klonen wurden bei etwa 1 × 10⁹ pfu hergestellt, die Phagen-DNA wurde gereinigt, mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und in den Vektor pBluescript insertiert, welcher mit EcoRI in derselben Weise verdaut worden war. Die DNA-Sequenzen von beiden Enden dieser Klone wurden mit einem DNA-Sequenzierungsgerät analysiert. Zwei Klone von S16 und S20 waren jene Klone, welche die DNA-Sequenz von Nr. 1 bis 1873 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 enthielten. Zwei Klone, S5 und S14, waren jene Klone, welche die DNA-Sequenz von Nr. 990 bis 4005 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 enthielten. Diese Klone wurden zur Herstellung von Deletionsmutanten unter Verwendung des Kilosequenz-Deletionskits gemäß einer Beschreibung der beiliegenden Gebrauchsanleitung verwendet. Die cDNA-Basensequenz, welche das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wurde unter Verwendung des DNA-Sequenzierungsgeräts sowohl in 5'-Richtung als auch in 3'-Richtung bestimmt.
Durch Nutzung der BglII Schnittstelle bei Nr. 1293 in der DNA-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 wurden S20 und S5 mit dem Restriktionsenzym BglII verdaut, und die DNA der Gensequenz von Nr. 1 bis 4005 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 wurde in den E. coli Vektor pBluescript subkloniert. Dieses Plasmid wurde pBSSRT genannt.
Da das Stop-Codon nicht am C-Ende gefunden wurde und die intrazelluläre Region, welche die C-terminalen Aminosäuren codiert, nicht kloniert wurde, wurde die Klonierung des vollständigen Gens unter Verwendung eines 3'-RACE-Systemkits (GIBCO-BRL, USA) gemäß der Beschreibung der beiliegenden Gebrauchsanleitung durchgeführt. Die Klonierung des cDNA-Gens für die 3'-Richtung wurde mit einer poly A⁺ RNA (CLONTECH Inc., USA) durchgeführt, die aus humaner Plazenta stammt, um die Gensequenz zu bestimmen.
Die so klonierten drei Genfragmente wurden durch Ausnutzen der BglII-Schnittstelle in der DNA-Sequenz Nr. 1293 und der AccI-Schnittstelle in der DNA-Sequenz Nr. 3943 sowie eines Plasmids, welches die vollständige DNA-Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 5 enthielt, zwischen die Schnittstellen EcoRI und Xbal in die Multiklonierungs-Schnittstelle von pUC18 insertiert, um einen pUCSR-1 herzustellen, der das vollständige Gen des humanen Serrate-1 enthielt. Diese Gensequenz sowie seine Aminosäure-Sequenz sind in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 gezeigt.
Beispiel 5
Herstellung eines Expressionsvektors des humanen Delta-1
Unter Verwendung des Gens, das aus der DNA-Sequenz besteht, welche in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 7 beschrieben ist, wurden Expressionsvektoren des humanen Delta-1-Proteins, das in den folgenden Punkten 1)–5) erwähnt ist, hergestellt. Die Hinzufügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen und die Insertion von kurzen Gensequenzen wurden unter Verwendung von ExSite, eines PCR-basierten orts-spezifischen Mutagenesekits (Stratagene Inc., USA), gemäß der Gebrauchsanleitung durchgeführt.
1) Expressionsvektor des löslichen humanen Delta-1-Proteins (HDEX)
Die cDNA, welche für das Polypeptid der Aminosäure-Sequenz von Nr. 1 bis 520 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3 codiert, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, der den SRa-Promo tor und ein Neomycin-Resistenzgen enthält, um einen Expressionsvektor herzustellen.
Um eine stabile Expression des Genprodukts zu erreichen, wurde zur Herstellung des Expressionsvektors des humanen Delta-1 die EcoRI-Schnittstelle 20 bp stromaufwärts in 5'-Richtung vom Start-Codon (Gensequenz Nr. 179 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 8) hinzugefügt. Unter Verwendung des vorstehend erwähnten Mutagenese-Kits wurde ein Plasmid pBSDel-1 verwendet, das die DNA-Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 8 enthielt, und die vollständige Länge der cDNA des humanen Delta-1 wurde als das Templat festgelegt, und die Oligonukleotide mit der Gensequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 15 und SEQ ID Nr. 16 wurden als die Primer festgelegt. Anschließend wurde die DNA, welche eine EcoRI-Schnittstelle 20 bp stromaufwärts in 5'-Richtung hinzufügt, hergestellt. Anschließend wurde dieses Plasmid als pBS/Eco-Delta bezeichnet.
Das pBS/Eco-Delta wurde als ein Templat verwendet. Um ein Startcodon und eine Restriktions-Schnittstelle MluI nach einer Position am C-Terminus hinzuzufügen, wurde – unter Verwendung des Mutagenese-Kits und unter Festsetzung der Oligonukleotide, welche Gensequenzen der Sequenzliste SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18 aufweisen, als Primer – die Hinzufügung des Stop-Codons und der MluI-Schnittstelle durchgeführt. Der erhaltene Vektor wurde mit EcoRI und MluI verdaut, und ein etwa 1.600 bp großes, geschnittenes Genfragment wurde in pMKITNeo ligiert, welches mit demselben Restriktionsenzym behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHDEX bezeichnet.
2) Expressionsvektor des FLAG chimären Proteins von löslichem humanen Delta-1 (HDEXFLAG)
Die cDNA, welche das chimäre Protein codiert, an welches die für die FLAG-Sequenz codierende cDNA am C-Terminus des Polypeptids von Nr. 1 bis 520 der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 3 in der Sequenzliste angefügt wurde, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, der einen SRα-Promotor und ein Neomycin-Resistenzgen enthielt, um den Expressionsvektor herzustellen.
Unter Verwendung des pBS/Eco-Delta als Templat wurde eine FLAG-Sequenz am extrazellulären C-Terminus, d.h. nach dem Gly bei Nr. 520 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3, angefügt. Um das Stop-Codon und die Schnittstelle für das Restriktionsenzym MluI anzufügen, wurden – unter Verwendung des Mutagesekits und unter Festlegung der Oligonukleotide mit den Gensequenzen der Sequenzlisten SEQ ID Nr. 19 und SEQ ID Nr. 18 als Primer – ein Gen, das für die FLAG-Sequenz codiert, das Stop-Codon und die MluI-Schnittstelle am C-Terminus hinzugefügt. Dieser Vektor wird mit EcoRI und MluI verdaut, und ein etwa 1.700 bp großes, geschnittenes Genfragment wurde in den Vektor pMKITNeo ligiert, der mit einem ähnlichen Restriktionsenzym behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHDEXFLAG bezeichnet.
3) Expressionsvektor von IgG1-Fc chimärem Protein eines löslichen, humanen Delta-1 (HDEXIg)
Eine Gensequenz, die für das Polypeptid codiert, an welches die Aminosäure-Sequenz der Fc-Region unterhalb des Gelenkbereichs des humanen IgG1 am C-Terminus des Polypeptids angefügt wurde, die eine Aminosäure-Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3 aufweist, wurde erhalten.
Die Herstellung des Fusionsproteins mit Immunglobulin Fc-Protein wurde gemäß dem Verfahren von Zettlmeissl et al. (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9, 347–354, 1990) durchgeführt. Unter Verwendung genomischer DNA mit Introns wurde ein Gen verwendet, und dieses Gen wurde unter Verwendung der PCR hergestellt. Das humane Genom wurde als ein Templat verwendet. Ein Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID Nr. 20 in der Sequenzliste mit der Schnittstelle für das Restriktionsenzym BamHI, und ein Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID Nr. 21 in der Sequenzliste mit der Schnittstelle für das Restriktionsenzym XbaI wurden als Primer verwendet. Die PCR wurde unter Verwendung der Primer und der humanen genomischen DNA als Templat durchgeführt. Eine etwa 1,4 kbp große Bande wurde gereinigt, mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI (Takara Shuzo Co., Japan) behandelt, und die Gene wurden in den Vektor pBluescript ligiert, welcher in ähnlicher Weise mit Restriktionsenzymen behandelt worden war, indem unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ein Subklon hergestellt wurde. Später wurde die Plasmid-DNA gereinigt und sequenziert, um die Gensequenz zu bestätigen, und dann wurde diese Gensequenz als genomische DNA im Gelenkbereich der schweren Kette des humanen IgG1 bestätigt. (Die Sequenz nimmt Bezug auf Kabat et al., Sequence of Immunological Interest, NIH Publication Nr. 91–3242, 1991). Nachfolgend wird dieses Plasmid als pBShIgFc bezeichnet.
Unter Verwendung des pBS/Eco-Delta als Templat und unter Verwendung des Mutagenese-Kits wurde eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym BamHI am extrazellulären C-Terminus hinzugefügt, d.h. nach dem Gly bei Nr. 520 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 3. Um darüber hinaus Schnittstellen für die Restriktions enzyme XbaI und MluI stromabwärts hinzuzufügen, wurden – unter Festlegung auf die Nukleotide, welche eine Gensequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 22 und SEQ ID Nr. 23 aufweisen, und unter Verwendung des Mutagenese-Kits – Schnittstellen für BamHI, XbaI und MluI hinzugefügt. Dieser Vektor wurde mit XbaI und BamHI verdaut, und ein etwa 1.200 bp großes Genfragment, das aus dem vorstehenden Verdau des Plasmids pBShIgFc mit XbaI und BamHI stammt, wurden ligiert, um einen Vektor herzustellen, der Genfragmente enthält, welche für das schließlich gewünschte, lösliche, humane Delta-1 IgG1-Fc chimäre Protein codieren. Schließlich wurde dieser Vektor mit EcoRI und MluI verdaut, und ein etwa 3-000 bp großes, geschnittenes Genfragment wurde mit pMKITNeo ligiert, der mit ähnlichen Restriktionsenzymen behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHDEXIg bezeichnet.
4) Expressionsvektor für das vollständige humane Delta-1 Protein (HDF)
Die cDNA, die für das Polypeptid von Nr. 1 bis 702 der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4 codiert, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, der einen SRa-Promotor und ein Neomycin-Resistenzgen enthält, um den Expressionsvektor herzustellen.
Um ein Stop-Codon am C-Terminus der vollständigen Sequenz, d.h. nach dem Val bei Nr. 702 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4, sowie eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym MluI hinzuzufügen, wurden – unter Verwendung des Mutagenese-Kits und des pBS/Eco-Delta als Templat und unter Festlegung der Oligonukleotide mit den Gensequenzen der Sequenzliste SEQ ID Nr. 24 und SEQ ID Nr. 25 als Primer – das Stop-Codon und die MluI-Schnittstelle am C-Terminus hinzugefügt. Dieser Vektor wurde mit EcoRI und MluI verdaut, und ein etwa 2.200 bp großes, geschnittenes Genfragment wurde in den Vektor pMKITNeo ligiert, der mit ähnlichen Restriktionsenzymen behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHDF bezeichnet.
5) Expressionsvektor des FLAG chimären Proteins (HDFLAG) des vollständigen humanen Delta-1
Die für das chimäre Protein codierende cDNA, an welche die für die FLAG-Sequenz codierende cDNA am C-Terminus des Polypeptids von Nr. 1 bis 702 der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 4 hinzugefügt wurde, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, der einen SRa-Promotor und ein Neomycin-Resistenzgen enthält, um den Expressionsvektor herzustellen.
Um eine FLAG-Sequenz am C-Terminus, ein Stop-Codon und eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym MluI hinzuzufügen, wurden – unter Festlegung der Oligonukleotide, welche Gensequenzen in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 26 und SEQ ID Nr. 25 aufweisen, als Primer, und unter Verwendung des pBS/Eco-Delta als Templat – ein für die FLAG-Sequenz codierendes Gen, ein Stop-Codon und eine MluI-Schnittstelle am C-Terminus hinzugefügt. Von diesem Vektor wurde die DNA, welche für das vollständige humane Delta-1 codiert, in den E. coli Vektor pUC19 kloniert, um den Vektor pUCDL-1F herzustellen, welcher für die vollständige Länge des humanen Delta-1 codiert. Dieser Vektor wurde mit EcoRI und MluI verdaut, und ein etwa 2.200 bp großes, geschnittenes Genfragment wurde in den Vektor pMKITNeo ligiert, der mit ähnlichen Restriktionsenzymen behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHDFLAG bezeichnet.
Beispiel 6
Herstellung von Expressionsvektoren des humanen Serrate-1 Unter Verwendung des Gens, das aus einer DNA-Sequenz besteht, die in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 beschrieben ist, wurden Expressionsvektoren des humanen Serrate-1 Proteins hergestellt, die in den folgenden Punkten 6)–10) erwähnt sind. Die Hinzufügung von Schnittstellen für ein Restriktionsenzym und die Insertion von kurzen Gensequenzen wurde unter Verwendung eines PCR-basierten, orts-spezifischen Mutagenese-Kits, „ExSite", sowie gemäß den Gebrauchsanweisungen durchgeführt.
6) Expressionsvektor für ein lösliches, humanes Serrate-1-Protein (HSEX)
Die cDNA, welche für ein Polypeptid der Aminosäure-Sequenz von Nr. 1 bis 1036 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 6 codiert, wurde mit dem Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, um einen Expressionsvektor herzustellen.
Zur Herstellung des Expressionsvektors für Zellen, welche das Polypeptid mit der Aminosäure-Sequenz von Nr. 1 bis 1036 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 6 exprimieren, und um ein stabileres Genprodukt zu exprimieren, wurde eine EcoRI-Schnittstelle im Bereich von 10 bp stromaufwärts in 5'-Richtung des Stop-Codons (Gensequenz Nr. 409 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9) hinzugefügt. Unter Verwendung des vorstehend erwähnten Mutagenese-Kits wurde ein Plasmid pBSSRT, welches cDNA des humanen Serrate-1 von Nr. 1 bis 4005 der DNA-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 9 enthielt, als das Templat festgelegt, und ein Oligonukleotid mit der Gensequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 27 sowie ein Oligonukleotid mit der Gensequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 28 wurden als die Primer festgelegt. An schließend wurde die DNA mit einer EcoRI-Schnittstelle 10 bp stromaufwärts in 5'-Richtung hergestellt.
Der so hergestellte Vektor (nachfolgend als pBS/Eco-Serrate-1 bezeichnet) wurde als ein Templat verwendet. Um ein Stop-Codon und eine weitere Schnittstelle für das Restriktionsenzym MluI im extrazellulären C-terminalen Bereich hinzuzufügen, d.h. am C-Terminus des Polypeptids in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 6, wurden – unter Verwendung des Mutagenese-Kits, und unter Festlegung des Oligonukleotids mit der Gensequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 29 und des Oligonukleotids mit der Gensequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 30 als Primer – das Stop-Codon und die MluI-Schnittstelle hinzugefügt. Der erhaltene Vektor wurde mit EcoRI und MluI verdaut, und ein etwa 3.200 bp großes, geschnittenes Genfragment wurde in pMKITNeo ligiert, welches mit demselben Restriktionsenzym behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHSEX bezeichnet.
7) Expressionsvektor des FLAG chimären Proteins eines löslichen, humanen Serrate-1 (HSEXFLAG)
Die für das FLAG chimäre Protein codierende DNA, welche eine FLAG-Sequenz am C-Terminus des Polypeptids von Nr. 1 bis 1036 der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 6 aufweist, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, der einen SRa-Promotor und ein Neomycin-Resistenzgen enthält, um den Expressionsvektor herzustellen.
Unter Verwendung des pBS/Eco-Serrate-1 als Templat wurde die FLAG-Sequenz am extrazellulären, C-terminalen Ende hinzugefügt, d.h. am C-Terminus des Polypeptids in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 6. Um das Stop-Codon und weitere Schnittstellen für das Restriktionsenzym MluI hinzuzufügen, wurden – unter Verwendung des Mutagenese-Kits, und unter Festlegung des Oligonukleotids mit der Gensequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 31 und des Oligonukleotids mit der Gensequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 30 als Primer – ein Gen, welches für die FLAG-Sequenz codiert, ein Stop-Codon und eine MluI-Schnittstelle am C-Terminus hinzugefügt. Dieser Vektor wurde mit EcoRI und MluI verdaut, und ein etwa 3.200 bp großes, geschnittenes Genfragment wurde in den Vektor pMKITNeo ligiert, der mit ähnlichen Restriktionsenzymen behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHSEXFLAG bezeichnet.
8) Expressionsvektor für das IgG1-Fc chimäre Protein des löslichen, humanen Serrate-1 (HSEXIg)
Eine Gensequenz, welche für das Polypeptid codiert, an das die Aminosäure-Sequenz der Fc-Region unterhalb des Gelenkbereichs des humanen IgG1 an den C-Terminus des Polypeptids mit einer Aminosäure-Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 6 hinzugefügt wurde, wurde erhalten.
Um die Schnittstelle für das Restriktionsenzym BamHI am extrazellulären C-Terminus hinzuzufügen, d.h. nach dem Polypeptid mit der Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 6, und um weitere Schnittstellen für die Restriktionsenzyme XbaI und MluI stromabwärts von dieser Sequenz hinzuzufügen, wurden die BamHI-, XbaI- und MluI-Schnittstellen – unter Verwendung des pBS/Eco-Serrate-1 als Templat, und unter Verwendung des Oligonukleotids mit einer Gensequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 32 sowie des Oligonukleotids mit der Gensequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 33 als Primer – mittels des Mutagenese-Kits hinzugefügt. Dieser mit XbaI und BamHI verdaute Vektor und das etwa 1.200 bp große Genfragment, welches aus dem vorstehenden Plasmid pBShIgFc mit XbaI und BamHI verdaut wurde, wurden ligiert, um schließlich einen Vektor herzustellen, welcher Genfragmente enthielt, die für das IgG1-Fc chimäre Protein des löslichen humanen Serrate-1 codieren. Schließlich wurde der Vektor mit EcoRI und MluI verdaut, und ein etwa 4.400 bp großes, geschnittenes Genfragment wurde in den Vektor pMKITNeo ligiert, um den Expressionsvektor herzustellen. Dieser Vektor wurde als pHSEXIg bezeichnet.
9) Expressionsvektor des vollständigen, humanen Serrate-1 Proteins (HSF)
Die cDNA, welche für das Polypeptid von Nr. 1 bis 1187 der Aminosäure-Sequenz der Sequenzliste SEQ ID Nr. 7 codiert, wurde mit dem Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, der einen SRa-Promotor und ein Neomycin-Resistenzgen enthielt, um einen Expressionsvektor herzustellen.
Für die Herstellung eines vollständigen Expressionsvektors wurden ein etwa 900 bp großes, geschnittenes Genfragment aus pBS/Eco-Serrate-1, das durch die Restriktionsenzyme EcoRI und BglII verdaut wurde, und der Vektor pUCSR-1, der durch dieselben Restriktionsenzyme verdaut wurde, miteinander ligiert, und ein Vektor pUC/Eco-Serrate-1, der für das vollständige Gen des humanen Serrate-1 codiert, wurde hergestellt.
Um ein Stop-Codon an die Stelle nach Val bei Nr. 1187 in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 7 hinzuzufügen, und darüber hinaus eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym MluI hinzuzufügen, wurden das Stop-Codon und die MluI-Schnittstelle am C-Terminus – unter Verwendung des Mutagenesekits und unter Verwendung der Nukleotide mit der Gensequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 34 und SEQ ID Nr. 35 als Primer und des pBS/Eco-Serrate-1 als Templat – hinzugefügt. Der erhaltene Vektor wurde mit EcoRI und MluI verdaut, und etwa 3.700 bp große, geschnittene Genfragmente wurden in den Vektor pMKITNeo ligiert, welcher mit denselben Restriktionsenzymen behandelt worden war, um einen Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHSF bezeichnet.
10) Expressionsvektor von FLAG chimären Protein des vollständigen, humanen Serrate-1 (HSFLAG)
Die für das chimäre Protein codierende cDNA, an welche die für die FLAG-Sequenz codierende cDNA am C-Terminus des Polypeptids von Nr. 1 bis 1187 der Aminosäure-Sequenz in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 7 hinzugefügt wurde, wurde in den Expressionsvektor pMKITNeo ligiert, der einen SRa-Promotor und ein Neomycin-Resistenzgen enthält, um den Expressionsvektor herzustellen.
Um eine FLAG-Sequenz am C-Terminus, das Stoppkodon und eine weitere Schnittstelle für das Restriktionsenzym MluI hinzuzufügen, wurden – unter Festsetzung der Oligonukleotide mit den Gensequenzen der Sequenzliste SEQ ID Nr. 36 und SEQ ID Nr. 35 als Primer, sowie unter Verwendung des Vektors pBS/Eco-Serrate-1 als Templat – ein für die FLAG-Sequenz codierendes Gen, das Stop-Codon und die MluI-Schnittstelle an den C-Terminus in einer ähnlichen Weise hinzugefügt. Dieser Vektor wurde mit EcoRI und MluI verdaut, und etwa 3.700 bp große, geschnittene Genfragmente wurden in den Vektor pMKITNeo ligiert, der in ähnlicher Weise mit Restriktionsenzymen behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHSFLAG bezeichnet.
Beispiel 7
Expression und Gentransfer des Expressionsvektors in die Zellen
Die Expressionsvektoren, welche in Beispiel 5 und 6 hergestellt wurden, wurden in die COS-7-Zelle (erhalten von RIKEN Cell Bank, Physical and Chemical Research Insitute, Japan, RCB0539) transduziert.
Die Zellkultur vor der Gentransduktion wurde durch Kultivierung in D-MEM (modifiziertes Eagles-Medium von Dulbecco, GIBCO-BRL Inc., USA) mit 10 % fötalem Kälberserum kultiviert. Einen Tag vor der Gentransduktion wurde das Medium der Zellen ausgetauscht, um die Zellzahlen auf 5 × 10⁵ Zellen/ml einzustellen, und über Nacht kultiviert. Am Tag der Gentransduktion wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert, mit Hilfe der Zentrifuge zweimal mit PBS(–) gewaschen, und die Zellen auf 1 × 10⁷ Zellen/ml in 1 mM MgCl₂ und PBS(–) eingestellt. Der Gentransfer wurde mittels Elektroporation unter Verwendung eines Gerätes für die Gentransduktion „Gen-Pulsar" (BioRad Inc., USA) durchgeführt. Die vorstehend erwähnte Zellsuspension von 500 μl wurde in die Zelle für die Elektroporation (0,4 cm) gegeben, 20 μg des Expressionsvektors wurden hinzugefügt, und man ließ sie im Eis 5 Minuten lang stehen. Die Elektroporation wurde unter der Bedingung von 3 μF und zweimal 450 V durchgeführt; während der zweimaligen Elektroporation ließ man die Zellmischung bei Raumtemperatur stehen. Nach 5-minütigem Stehen auf Eis wurden die Zellen in einem Kulturmedium verteilt, Durchmesser 10 cm, wobei vorher 10 ml Medium zugegeben wurden, und bei 37°C in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid kultiviert.
Am nächsten Tag wurde die Lösung des Kulturüberstands entfernt, und die Zellen, welche der Schale anhafteten, wurden zweimal mit 10 ml PBS(–) gewaschen. Im Falle des Expressionsvektors pHDEX, pHDEXFLAG, pHDEXIg, pHSEX, pHSEXFLAG und pHSEXIg wurden 10 ml serum-freies D-MEM zugegeben und die Kultur wurde 7 Tage fortgesetzt. Die Lösung des Kulturüberstands wurde gewonnen, und der Puffer wurde durch PBS(–) mittels Centricon 30 (Amicon Inc., USA) ersetzt, und gleichzeitig wurde die Lösung auf das 10-fache konzentriert, um eine Lösung des Überstandes der Zellkultur zu erhalten.
Im Falle der Vektoren pHDF, pHDFLAG, pHSF und pHSFLAG wurde das Medium durch D-MEM ausgetauscht, das 10 % fötales Kälberserum enthielt, und für weitere 3 Tage kultiviert, um ein Zell-Lysat herzustellen. Somit wurden 2 × 10⁶ Zellen in 200 μl Zell-Lysepuffer [50 mM Hepes (pH 7,5), 1 % Triton X100, 10 Glyerin, 4 mM EDTA, 50 μg/ml Aprotinin, 100 μM Leupeptin, 25 μM PepstatinA und 1 mM PMSF] suspendiert, man ließ sie in Eis 20 Minuten lang stehen und zentrifugierte bei 14.000 UpM 20 Minuten lang, um die Lösung des Überstands zu entfernen, und damit ein Zell-Lysat zu erhalten.
Unter Verwendung dieser Probe wurde die Expression der Proteine anhand eines Western Blots nachgewiesen.
Konzentrierte Kulturüberstände oder Zell-Lysate wurden der SDS-PAGE unter Verwendung eines Elektrophorese-Tanks und eines Polyacrylamid-Gels für die SDS-PAGE (Gradientengel 5–15 %) (ACI Japan Inc., Japan) gemäß der Anleitung des Herstellers unterzogen. Proben wurden durch Behandlung in kochendem Wasser für 5 Minuten mit 2-Mercaptoethanol (2-ME) für die Reduktion hergestellt, sowie unter nicht reduzierenden Bedingungen, ohne die vorstehend erwähnte Behandlung vorzunehmen. Als Marker wurde ein Rainbow-Marker (hohes Molekulargewicht, Amersham Inc.) verwendet. Die Probenpuffer-Lösung und der Elektrophorese-Puffer wurden unter Bezugnahme auf die beiliegende Gebrauchsanweisung hergestellt. Wenn die SDS-PAGE fertig war, wurde das Acrylamidgel auf ein PVDF-Membranfilter (BioRad Inc., USA) unter Verwendung einer Mini Trans Blot Zelle (BioRad Inc.) übertragen.
Die so hergestellten Filter wurden über Nacht bei 4°C in der „Blockace" (Dainippon Pharm. Co., Japan), TBS-T [20 mM Tris, 137 mM NaCl (pH 7,6) und 0,1 % Tween 20] zum Blockieren geschüttelt. Gemäß der Erläuterung der beiliegenden Gebrauchsanweisung von ECL wurde ein Nachweissystem eines Western-Blots (Amersham Inc., USA) verwendet; für den Fall, dass das gewünschte Protein aus dem humanen Delta-1 stammte, wurde ein monoklonaler Antikörper aus der Maus, der in Beispiel 9 beschrieben ist und gegen das humane Delta-1 gerichtet ist, als ein Primärantikörper verwendet; für den Fall, dass das Protein aus humanem Serrate-1 stammte, wurde ein monoklonaler Antikörper aus der Maus verwendet, der in Beispiel 9 beschrieben ist und gegen humanes Serrate-1 gerichtet ist, als ein Primärantikörper verwendet; für den Fall, dass das Protein ein FLAG chimäres Protein ist, wurde ein monoklonaler Antikörper aus der Maus, der gegen FLAG M2 gerichtet ist (Eastman Kodak, USA) als ein Primärantikörper verwendet, und mit Peroxidase markierte, gegen Maus Ig gerichtete Antikörper aus dem Schaf (Amersham Inc., USA) wurden damit umgesetzt. Im Falle des IgG chimären Proteins wurden mit Peroxidase markierte, gegen humanes Ig gerichtete Antikörper aus dem Schaf (Amersham Inc., USA) umgesetzt.
Die Reaktionszeit für die Antikörper betrug 1 Stunde bei Raumtemperatur, und zwischen einer jeden Reaktion wurde ein Waschschritt durchgeführt, indem das Filter in TBS-T bei Raumtemperatur 10 Minuten dreimal geschüttelt wurde. Nach dem letzten Waschen wurde das Filter in die Reaktionslösung des ECL-Western Blot Nachweissystems (Amersham Inc., USA) 5 Minuten lang getaucht und in eine Hülle aus Polyvinylidenchlorid eingewickelt, um den Röntgenfilm zu belichten.
Als Ergebnis wurden in der Probe mit reduzierender Behandlung die Banden, welche ein Protein zeigen, das durch Transduktion von pHDEX und pHDEXFLAG erhalten wurde, bei etwa 65 kD nachgewiesen. Ein Protein, das durch Transduktion von pHDEXIg erhalten wurde, wurde bei etwa 95 kD nachgewiesen, und ein Protein, das durch Transduktion von pHDF und pHDFLAG erhalten wurde, wurde bei etwa 85 kD nachgewiesen. In der nicht reduzierten Probe wurden Banden, die ein Protein zeigten, welches durch Transduktion von pHDEXIg erhalten wurde, als leicht verschmierte Banden bei 120 kD bis 200 kD nachgewiesen, hauptsächlich bei etwa 180 kD, welche ein etwa 2-faches Molekulargewicht des reduzierten Zustands zeigten, so dass folglich ein Dimer gebildet wurde.
Und ebenso wurden in der Probe mit reduzierender Behandlung die Banden, welche ein Protein zeigen, das durch Transduktion von pHSEX und pHSEXFLAG erhalten wurde, bei etwa 140 kD nachgewiesen. Ein Protein, das durch Transduktion von pHSEXIg erhalten wurde, wurde bei etwa 170 kD nachgewiesen, und ein Protein, das durch Transduktion von pHSF und pHSFLAG erhalten wurde, wurde bei etwa 150 kD nachgewiesen. In der nicht reduzierten Probe wurden Banden, die ein Protein zeigten, welches durch Transduktion von pHSEXIg erhalten wurde, als leicht verschmierte Banden bei 250 kD bis 400 kD nachgewiesen, hauptsächlich bei etwa 300 kD, welche ein etwa 2-faches Molekulargewicht des reduzierten Zustands zeigten, so dass folglich ein Dimer gebildet wurde.
Jedoch wurden bei diesen Experimenten das Zell-Lysat und der Kulturüberstand der COS-7-Zellen getestet, in die der Vektor pMKITNeo als eine Kontrolle transduziert worden war, und es wurden keine Banden nachgewiesen, die gegenüber einem gegen humanes Delta-1 gerichteten, monoklonalen Antikörper aus Maus, einem gegen humanes Serrate-1 gerichteten, monoklonalen Antikörper aus Maus, einem gegen FLAG gerichteten Antikörper und einem gegen humanes Ig gerichteten Antikörper reagierten.
Daher kann dieser Expressionsvektor die gewünschten Polypeptide herstellen.
Beispiel 8
Reinigung des löslichen, humanen Delta-1 und des humanen Serrate-1 Proteins aus gen-transduzierten Zellen Der Kulturüberstand der COS-7-Zellen, die aus HDEXFLAG, HDEXIg, HSEXFLAG und HSEXIg bestehen, für die alle eine Expression durch ein Verfahren nach Beispiel 7 nachgewiesen wurde, wurde in großem Maßstab hergestellt, und jedes chimäre Protein wurde durch eine Affinitätssäule gereinigt.
Im Falle der HDEXFLAG und HSEXFLAG werden 2 Liter des Kulturüberstands, der nach dem Verfahren in Beispiel 7 erhalten wurde, auf eine Säule aufgetragen, die mit einem gegen FLAG M2 gerichteten Affinitätsgel (Eastman Kodak, USA) gepackt war. Das chimäre Protein wurde auf der Säule durch eine Affinitätsreaktion des gegen FLAG gerichteten Antikörpers des Gels und der FLAG-Sequenz des chimären Proteins adsorbiert. Der innere Durchmesser der Säule betrug 10 mm, die verfügbare Säule (BioRad Inc., USA) wurde verwendet, wobei 5 ml des vorstehend erwähnten Gels gepackt wurden. Ein Kreislaufsystem, bestehend aus einer Mediumflasche → Säule → peristaltische Pumpe Mediumflasche, wurde eingerichtet. Der Kreislauf wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min 72 Stunden lang betrieben. Anschließend wurde die Säule mit 35 ml PBS(–) gewaschen und mit 50 ml 0,5 M Tris-Glycin (pH 3,0) eluiert. Das Eluat umfasste 25 Fraktionen zu jeweils 2 ml, die in einer Röhre gesammelt wurden, jede Fraktion wurde mit 200 μl 0,5 M Tris-HCl (pH 9,5) neutralisiert, die zuvor in jedes Röhrchen gegeben wurden.
Je 10 μl einer Eluatfraktion des sezernierten FLAG chimären Proteins, das durch das vorstehend erwähnte Verfahren gereinigt wurde, wurde der Reduktionsbehandlung unterzogen, die in Beispiel 7 beschrieben ist. Die SDS-PAGE Elektrophorese wurde mittels eines Polyacrylamid-Gels mit einem Gradienten von 5–10 % durchgeführt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde eine Silberfärbung unter Verwendung eines Wako-Silberfärbe-Kits II (Wako Pure Chemicals, Japan) entsprechend der Erklärung der beiliegenden Gebrauchsanleitung ausgeführt. Die Fraktionen von Nr. 4 bis Nr. 8 zeigten nachweisbare Banden von HDEXFLAG und HSEXFLAG. Die Größe ist sowohl für HDEXFLAG als auch für HSEXFLAG identisch mit dem Ergebnis des Western-Blots mit gegen FLAG gerichteten Antikörpern, der in Beispiel 6 erhalten wurde. Daher wurden die gereinigten Proteine HDEXFLAG und HSEXFLAG erhalten.
Für den Fall des IgG1-Fc chimären Proteins, d.h. HDEXIg und HSEXIg, wurden 2 Liter Lösung des Kulturüberstands auf einer Protein A Sepharosesäule (Pharmacia Inc., Schweden) adsorbiert, entsprechend demselben Verfahren wie bei dem FLAG chimären Protein, um die Eluatfraktionen zu sammeln. Unter Verwendung eines Teils des Eluats, wie bei dem FLAG chimären Protein, wurde eine Bestimmung der Eluatfraktion, eine Identifizierung der Größe und eine Bestimmung der Reinheit durch SDS-PAGE Elektrophorese und Silberfärbung unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Daher wurden die Banden in den Eluatfraktionen von Nr. 4 bis 15 nachgewiesen. Die Größe derselben ist sowohl für HDEXIg als auch für HSEXIg identisch mit dem Ergebnis des Western-Blots unter Verwendung des gegen humane Ig gerichteten Antikörpers. Daher wurden die gereinigten Proteine HDEXIg und HSEXIg erhalten.
Beispiel 9
Herstellung von Antikörpern, welche das humane Delta-1 und das humane Serrate-1 erkennen
HDEXFLAG und HSEXFLAG, welche durch das Verfahren in Beispiel 8 gereinigt wurden, wurden als ein Immunogen verwendet, und Kaninchen wurden immunisiert. Nach einem Assay des Antikörpertiters wurde das Vollblut gesammelt, und ein Serum wurde erhalten. Ein polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen, der gegen menschliches Delta-1 gerichtet ist, sowie ein polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen, der gegen menschliches Serrate-1 gerichtet ist, wurden unter Verwendung eines IgG-Reinigungs-Kits für Serum „Econopack" (BioRad Inc., USA) mit Bezugnahme auf die anhängende Gebrauchsanleitung gereinigt.
Die nach einem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren gereinigten Proteine HDEXFLAG und HSEXFLAG wurden als Immunogene verwendet, und monoklonale Antikörper aus der Maus wurden entsprechend der Erläuterung des Textbuchs hergestellt. Die gereinigten Proteine HDEXFLAG oder HSEXFLAG wurden an Balb/c Mäuse (Nippon SLC Co., Japan) separat verabreicht; es wurden 10 μg/Maus intrakutan und subkutan immunisiert. Nach der zwei ten Immunisierung wurde ein erhöhter Serumtiter anhand des gesammelten Bluts ophthalmologisch bestätigt, und die dritte Immunisierung wurde durchgeführt. Anschließend wurde die Milz der Mäuse gesammelt und mit Mausmyelom-Zellen P3 × 63Ag8 (ATCC TIB9) unter Verwendung von Polyethylenglykol fusioniert. Hybridomzellen wurden mittels HAT-Medium (Immunological and Biological Research Institute, Japan) selektiert, und die Hybridomstämme, welche Antikörper produzierten, die spezifisch die extrazelluläre Region des humanen Delta-1 oder des humanen Serrate-1 im Medium erkannten, wurden durch einen Enzymimmunoassay isoliert. Die Hybridomstämme, welche einen monoklonalen Antikörper aus der Maus produzierten, der spezifisch humanes Delta-1 oder humanes Serrate-1 erkannte, wurden etabliert.
Ein monoklonaler, gegen humanes Delta-1 gerichteter Antikörper und ein monoklonaler, gegen humanes Serrate-1 gerichteter Antikörper wurden aus dem Überstand der so eingeführten Hybridom-Zellen gereinigt und entsprechend der Erläuterung der Gebrauchsanweisung mittels Mab Trap GII (Pharmacia Inc., Schweden) hergestellt.
Eine Affinitätssäule wurde unter Verwendung dieser monoklonalen Antikörper hergestellt. Die Herstellung der Affinitätssäule wurde entsprechend der anhängenden Erläuterung durchgeführt, die der mit Br-CN aktivierten Sephadex 4B (Pharmacia Inc., Schweden) beigegeben war. Eine Säule, 2 cm² × 1 cm, welche 2 ml Gel enthielt, wurde hergestellt.
Eine konzentrierte Lösung des Überstands der kultivierten COS-7-Zellen, in die pHDEX als Gen transduziert wurde, wurde durch die Säule geleitet, an der ein gegen humanes Delta-1 gerichteter, monoklonaler Antikörper gebunden war. Eine konzentrierte Lösung des Überstands der kultivierten COS-7-Zellen, welche mit dem Vektor pHSEX transduziert wurden, wurde durch die Säule geleitet, an der ein gegen humanes Serrate-1 gerichteter, monoklonaler Antikörper gebunden war. Jede Lösung des Überstands wurde mit 20 ml/Stunde hindurchgeleitet, nachfolgend wurden 15 ml PBS(–) mit derselben Fließrate hindurchgeleitet, und die Säule wurde gewaschen. Schließlich wurden die Produkte mit einer Mischung von 0,1 M Natriumacetat und 0,5 M NaCl (pH 4,0) eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von jeweils 1 ml gesammelt, und wurde durch Zugabe von 200 μl 1 M Tris-HCl (pH 9,1) für jede Fraktion neutralisiert.
Die SDS-PAGE eines jeden gereinigten Proteins wurde unter reduzierenden Bedingungen gemäß dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren durchgeführt, gefolgt von einer Silberfärbung und einem Western Blot, um das Molekulargewicht abzuschätzen. HDEX, mit einem Molekulargewicht von etwa 65 kD, wurde aus dem konzentrierten Überstand der kultivierten COS-7-Zellen gereinigt, die mit dem Vektor pHDEX als Gen transduziert wurden, und HSEX, mit einem Molekulargewicht von etwa 140 kD, wurde aus dem konzentrierten Überstand der kultivierten COS-7-Zellen gereinigt, welche mit dem Vektor pHSEX als Gen transduziert wurden. Infolge dessen konnten humanes Delta-1 und humanes Serrate-1 durch diese Affinitätssäulen gereinigt werden.
Beispiel 10
Wirkungen von HDEXIg und HSEXIg auf die Koloniebildung von undifferenzierten Blutzellen
Um die physiologische Wirkung von HDEXIg und HSEXIg auf undifferenzierte Blutzellen zu beobachten, wurden CD34 positive Zellen in einem serumfreien, halbfesten Medium in Gegenwart von HDEXIg und HSEXIg und bekannten Cytokinen kultiviert, und eine Zahl der kolonie-bildenden Zellen wurde beobachtet.
Menschliches Blut aus der Nabelschnur oder Blut aus dem normalen Knochenmark erwachsener Menschen wurde mit einer Siliziumdioxid-Lösung (Immunological and Biological Research Institute, Japan) gemäß der anhängenden, erläuternden Gebrauchsanleitung behandelt. Anschließend wurde die zelluläre Fraktion mit geringer Dichte (< 1,077 g/ml) durch densitometrische Zentrifugation mit einer Packung Ficoll (Pharmacia Inc., Schweden) fraktioniert, um mononukleare Zellen herzustellen. CD34 positive Zellen aus menschlichem Nabelschnurblut oder aus menschlichem Blut von normalem Knochenmark wurden aus den mononuklearen Zellen isoliert.
Die Abtrennung der CD34 positiven Zellen wurde unter Verwendung eines Micro-Selector Systems (AIS Inc., USA) oder Dynabeads M-450 CD34 und DETACHa-BEADS CD34 (Dynal Inc., Norwegen) gemäß der anhängenden, erläuternden Gebrauchsanleitung durchgeführt. Nach der Abtrennung wurde die Reinheit wie folgt gemessen. Die Zellen wurden mittels FITC-markierter CD34 Antikörper HPCA2 (Beckton-Deckinson Inc., USA) gefärbt und mit einem Durchfluss-Cytometer (FACSCalibur, Beckton-Deckinson, USA) überprüft. Eine Reinheit von mehr als 85 % wurde für die Verwendung bestätigt.
Die so isolierten CD34 positiven Zellen wurden homogen suspendiert, um nachfolgend eine Konzentration von 400 Zellen/ml des Mediums einzustellen, und in einer 35 mm Schale (Falcon Inc., USA) verteilt, und anschließend 2 Wochen in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37°C unter 5°C Kohlendioxid, 5 % Sauerstoff und 90 % Stickstoff und 100 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die gebildeten Blutkolonien wurden unter dem inversen Mikroskop gezählt.
Ein verwendetes Medium ist das α-Medium (GIBCO-BRL, USA), welches 2 % entionisiertes Rinderserumalbumin (BSA, Sigma, USA), 10 μg/ml humanes Insulin (Sigma, USA), 200 μg/ml Transferrin (Sigma, USA), 10^–5 M 2-Mercaptoethanol (Nakarai Tesk Co., Japan), 160 μg/ml Sojabohnen-Lectin (Sigma, USA), 96 μg/ml Cholesterin (Sigma, USA) und 0,9 % Methylcellulose (Wako Pure Chemicals, Japan) enthielt.
Zu dem vorstehend erwähnten Medium wurden das chimäre Protein des extrazellulären humanen Delta-1 mit Ig (HDEXIg) oder das chimäre Protein des extrazellulären humanen Serrate-1 mit Ig (HSEXIg) auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml hinzugegeben, wobei drei verschiedene Bedingungen bezüglich der Cytokine vorlagen. Zur Kontrolle wurde humanes IgG1 (Ahens Research and Technology Inc., USA) mit derselben Konzentration hinzugegeben, um die Wirkung der IgG-Fc-Region zu beobachten.
Die Bedingungen der Cytokine waren wie folgt.

1: 100 μg/ml humanes SCF (Intergen Inc., USA), 10 ng/ml humanes IL-3 (Intergen Inc., USA), 100 ng/ml humanes IL-6 (Intergen Inc., USA)
2: 100 ng/ml humanes SCF, 10 ng/ml humanes IL-3, 4 ng/ml humanes Thrombopoietin (Pepro Techn Inc., USA)
3: 100 ng/ml humanes SCF, 10 ng/ml humanes IL-3, 100 ng/ml humanes IL-6, 2 U/ml Epo (Chugai Seiyaku Co., Japan), 10 ng/ml humanes G-CSF (Chugai Seiyaku Co., Japan)

Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. In 2 ist (A) ein Fall des chimären Proteins des extrazellulären humanen Delta-1 mit Ig (HDEXIg), und (B) ist ein Fall des chimären Proteins des extrazellulären humanen Serrate-1 mit Ig (HSEXIg). Für (A) und (B) wurden jeweils CD34 positive Zellen aus menschlichem Nabelschnurblut von unterschiedlichem Ursprung verwendet. Die senkrechte Achse: Anzahl der Kolonien. Weiß: Kontrolle, Schwarz: HDEXIg oder HSEXIg. Sowohl HDEXIg als auch HSEXIg besaßen eine unterdrückende Wirkung auf die Koloniebildung. Es wurden keine Unterschiede der Aktivitäten auf die Art der Kolonien bemerkt. Daher besitzen die Moleküle der vorliegenden Erfindung eine unterdrückende Wirkung auf die Koloniebildung gegenüber kolonie-bildenden Zellen von undifferenzierten Blutzellen, d.h. eine die Differenzierung unterdrückende Wirkung. Ein Vergleich mit oder ohne SCF auf die Aktivität weist darauf hin, dass die unterdrückende Wirkung dazu neigt, dass sie nur in Gegenwart von SCF beobachtet wird.
Eine dosis-abhängige Art der Aktivität wurde studiert. Ein Vergleich mit dem Dimer HSEXIg und dem Monomer HSEXFLAG wurde durchgeführt. Das Ergebnis ist in 3 gezeigt. Die Konzentration ist in diesem Fall als molare Konzentration angegeben. Zum Vergleich des Dimers und des Monomers wurde das Dimer HSEXIg als die genau 2-fach molare Konzentration angegeben, und sie wurde im Vergleich mit der entsprechenden, äquivalenten, molaren Konzentration des humanen Serrate-1 aufgetragen. Die senkrechte Achse gibt die Anzahl der Koloniebildungen, und die waagrechte Achse gibt die molare Konzentration an. Die Zahl der Koloniebildungen ohne Notch-Liganden wurde auf der senkrechten Achse bei der Konzentration 0 aufgetragen. Zum Vergleich betrug die Zahl der Koloniebildungen bei 1 μg/ml des humanen IgG1 etwa 100 Kolonien.
Das Ergebnis weist darauf hin, dass HSEXIg und HSEXFLAG die Koloniebildung in einer dosis-abhängigen Art unterdrücken. Die Aktivität des Dimers HSEXIg war stärker als die des Monomers. Ein Monomer HSEXFLAG zeigte eine stimulierende Wirkung auf die Koloniebildung im Bereich niedriger Konzentration.
Beispiel 11
Wirkungen von HDEXIg und HSEXIg auf eine Langzeit-Flüssigkultur von kolonie-bildenden, undifferenzierten Blutzellen
Zur Beobachtung der physiologischen Wirkung von HDEXIg und HSEXIg auf undifferenzierte Blutzellen wurden CD34 positive Zellen aus Nabelschnurblut über einen langen Zeitraum in einem serumfreien Flüssigmedium in Gegenwart von HDEXIg oder HSEXIg und bekannten Cytokinen kultiviert, und eine Zahl koloniebildender Zellen wurde beobachtet.
Die mononuklearen CD34 positiven Zellen aus Nabelschnurblut, welche durch das in Beispiel 10 beschriebene Verfahren abgetrennt worden waren, wurden in einer Flüssigkultur bei 1000 Zellen/Napf in einer 24-Napf-Zellkulturplatte (Falcon Inc., USA) kultiviert. Die Kultur wurde bei 37°C in einem Kohlendioxid-Inkubator unter 5 % Kohlendioxid und 100 % Luftfeuchtigkeit durchgeführt. Das Flüssigkultur-Medium war Iscove's modifiziertes Dulbecco Medium (IMDM, GIBCO-BRL, USA), dem 2 % BSA, 10 μg/ml humanes Insulin, 200 μg/ml Transferrin, 40 μg/ml Lipoprotein von niedriger Dichte (GIBCO-BRL, USA), 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, 50 ng/ml humanes SCF, 5 ng/ml humanes IL-3, 10 ng/ml humanes IL-6, 5 ng/ml humanes GM-CSF (Intergen Inc., USA) und 3 U/ml Epo hinzugefügt wurden. Falls es die Bedingungen notwendig machten, wurden 500 ng HDEXIg, 500 ng HSEXIg oder 50 ng/ml MIP-1α (Intergen Inc., USA) hinzugefügt. 1 ml Medium wurde pro Napf hinzugegeben, und die Hälfte des Mediums wurde dreimal pro Woche ausgetauscht. Nach der Kultur über 2, 4, 6 und 8 Wochen wurden alle Zellen aus den Näpfen gesammelt, indem ein Zellabscheider in einem 1,5 ml Mikroröhrchen verwendet wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation sedimentiert, und in 1 ml frischem IMDM resuspendiert, die Zellen wurden unter Verwendung eines Hämocytometers gezählt, und bei einer Konzentration von 5.000 Zellen/ml wurde ein Assay zur Bestimmung der Koloniebildung von Blutzellen durchgeführt.
Der Assay zur Bestimmung der Koloniebildung von Blutzellen wurde unter Verwendung der vollständigen, vorbereiteten Methylcellulose-Mischung von Iscove (Stem Cell Technologies Inc., Canada) durchgeführt, und jeweils 1 ml wurde in zwei Platten einer 35 mm Schale (Falcon Inc., USA) überimpft, und 2 Wochen in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubiert. Die Blutkolonien wurden als CFU-GM und CFU-E im inversen Mikroskop gezählt, und die Gesamtzahl wurde als CFU-C gezält. Die CFU-C Zahl und die Zellzahl, welche durch ein Hämocytometer erhalten wurden, wurden miteinander multipliziert, um die Anzahl der CFU-C/1000 Zellen zu erhalten, welche in der Flüssigkultur überimpft wurden.
In der Tabelle 1 ist das Ergebnis für HDEXIg und in der Tabelle 2 ist das Ergebnis für HSEXIg gezeigt. Die Experimente wurden bei n = 3 durchgeführt, die erhaltenen Werte sind als (Durchschnittswert + Standardabweichung (SD)) gezeigt. In der Tabelle bezeichnet der Ausdruck ND keinen Nachweis einer Kolonie (no detection).
Tabelle 1 Wirkung der Beibehaltung der kolonie-bildenden Zellen in einer Langzeit-Flüssigkultur von humanem Delta-1 der vorliegenden Erfindung
Tabelle 2 Wirkung der Beibehaltung der kolonie-bildenden Zellen in einer Langzeit-Flüssigkultur von humanem Serrate-1 der vorliegenden Erfindung
CFU-C konnte lediglich beobachtet werden bis zur 6. Woche der Kultivierung unter der Bedingung, dass keine Cytokine zur Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustands zugegeben wurden, und unter der Bedingung mit MIP-1α. Es konnte in der 8. Woche in Gegenwart von HDEXIg und HSEXIg beobachtet werden. Beim Vergleich von MIP-1α mit HDEXIg und HSEXIg unterdrückte MIP-1α stark die Koloniebildung nach 2 Wochen Kultur, jedoch wurde bei HDEXIg und HSEXIg keine Unterdrückung beobachtet. Bei der Aufrechterhaltung der CFU-C-Zahlen nach 6 und 8 Wochen der Kultur waren HDEXIg und HSEXIg überlegen.
Beispiel 12
Wirkungen von HDEXIg und HSEXIg auf die Flüssigkultur von undifferenzierten Blutzellen LTC-IC
Um die physiologische Wirkung von HDEXIg und HSEXIg auf undifferenzierte Blutzellen zu beobachten, wurden CD34 positive Zellen aus Nabelschnurblut zwei Wochen lang in einem serumfreien Flüssigmedium in Gegenwart von HDEXIg oder HSEXIg und bekannten Cytokinen kultiviert, und die Anzahl der LTC-IC, die man derzeit für die am meisten (vorkommenden) undifferenzierten Blutzellen hält, wurde beobachtet.
Die CD34 positiven Zellen aus Nabelschnurblut-Monocyten, 100.000 bis 20.000 Zellen, welche durch das in Beispiel 10 beschriebene Verfahren abgetrennt wurden, wurden in folgendem Medium 2 Wochen lang kultiviert. Die Anzahl der LTC-IC in 4 experimentellen Gruppen, welche eine Gruppe vor der Kultivierung, eine Gruppe mit HDEXIg, eine Gruppe mit HSEXIg und eine Kontrollgruppe umfassen, wurde bestimmt. Das im Flüssigkultur-Medium verwendete Medium war α-Medium, dem 2 % BSA, 10 μg/ml humanes Insulin, 200 μg/ml Transferrin, 40 μg/ml Lipoprotein von niedriger Dichte und 10^–5 M 2-Mercaptoethanol zugefügt wurde, und dem darüber hinaus 100 ng/ml humanes SCF, 10 ng/ml humanes IL-3 und 100 ng/ml humanes IL-6 zugegeben wurde.
1 μg/ml HDEXIg oder HSEXIg wurden zu dem vorstehend erwähnten Medium zugegeben. In der Kontrollgruppe wurde humanes IgG1 in der gleichen Konzentration zugegeben.
Die Herstellung der Schicht aus humanen Knochenmarks-Stroma-Zellen, welche für die LTC-IC verwendet wurden, und der quantitative Assay der Frequenz von LTC-IC durch eine Grenzverdünnung wurde gemäß einem Verfahren von Sutherland et al. (Blood, 74, 1563 ff, 1989 und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3584 ff, 1990) durchgeführt.
Die mononuklearen Knochenmarkszellen, 1–2 × 10⁷ Zellen, welche in Beispiel 10 vor der Abtrennung und ohne Behandlung mit einer Siliziumdioxid-Lösung erhalten wurden, wurden in 5 ml LTC-Medium (MyeloCul, Stem Cell Technologies Inc., Kanada) in einer T-25-Flasche (Falcon Inc., USA) bei 37°C unter 5 % Kohlendioxid und 100 % Luftfeuchtigkeit in einem Kohlendioxid-Inkubator kultiviert, dem 1 μM Hydrocortison (Upjohn Japan Co., Japan) hinzugefügt wurde. Die Kultur wurde durchgeführt, bis sich die haftenden Zellschichten der Stromazell-Bildung über mehr als 80 % der Bodenfläche der Kultur ausbreiteten. Die Abtrennung der Zellschicht wurde durch Behandlung mit EDTA-Lösung (Cosmobio Co., Japan) durchgeführt. Die Zellen wurden in eine 96-Napfplatte (Beckton-Deckinson Inc., USA) mit etwa 2 × 10⁴ Zellen/Napf platiert, und die Re-Kultivierung wurde im selben Medium fortgeführt. Röntgenstrahlen, 15 Gy, 250 kV Puls, wurden nach der Rekonstitution auf die Schicht aus Stromazellen eingestrahlt. Das Wachstum der Stromazellen wurde gestoppt, und die Blutzellen in den Stromazellen wurden durch diese Behandlung entfernt. Die so hergestellten Stromazellen wurden als eine Schicht aus Stromazellen für die Experimente verwendet.
Im Assay des LTC-IC wurden die Zellzahlen in jeder Gruppe auf einen Bereich innerhalb von 25–400 Zellen/Napf für CD34 positive Zellen vor der Kultivierung, und auf 625–20.000 Zellen/Napf für die Zellen nach der Kultivierung eingestellt, und die Zellen wurden in einem sechsstufigen Verdünnungsschritt auf diese Bereiche verdünnt. Jeder Verdünnungsschritt der Zellen wurde mit der vorstehend erwähnten Stromazellschicht in der 96-Napfplatte cokultiviert, für 16 Näpfe/Zellen eines Verdünnungschritts. Die Kultur wurde im selben Medium, wie es bei der Bildung der Stromazellen verwendet wurde, bei 37°C unter 5 % Kohlendioxid und 100 % Luftfeuchtigkeit in einem Kohlendioxid-Inkubator für 5 Wochen durchgeführt. Die Zellen in Suspension und die an der Wand haftenden Zellen nach der Kultivierung wurden von jedem Napf gewonnen. Die gesammelten Zellen wurden in ein halbfestes Kulturmedium übertragen, welches α-Medium enthielt, dem 0,9 % Methylcellulose, 30 fötales Kälberserum (FCS, ICN Biomedical, Japan), 1 % BSA, 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, 100 ng/ml humanes SCF, 10 ng/ml humanes IL-3, 100 ng/ml humanes IL-6, 2 U/ml Epo und 10 ng/ml humanes G-CSF zugegeben wurde. Nach 2 Wochen der Kultivierung wurden kolonie-bildende Zellen in derselben Weise nachgewiesen, wie in den Beispielen 10 und 11 beschrieben, und die Zahl der Näpfe, in denen kolonie-bildende Zellen gefunden wurden, wurde nachgewiesen. Die Inzidenz von LTC-IC wurde gemäß dem Verfahren von Taswell et al. (J. Immunol. 126, 1614 ff, 1981) auf der Grundlage der vorstehenden Daten berechnet.
Der für die Berechnung verwendete Graph ist in 4 gezeigt. In 4 sind die Berechnungskurven nach der Flüssigkultur gezeigt. Eine senkrechte Achse zeigt das Verhältnis der Näpfe, in denen keine Kolonien beobachtet wurden und eine horizontale Achse zeigt die Anzahl der Zellen pro Napf. In einer jeden Gruppe des Experiments wurden die Anzahl der Näpfe, in denen keine Kolonien beobachtet wurden, sowie die Anzahl der Zellen aufgetragen, anschließend wurde eine Regressionskurve nach dem Verfahren der kleinsten Quadrate berechnet. Die Anzahl der Zellen, für die keine Kolonien auftraten, welche einer Zahl von 0,37 (einem reziproken Wert einer Base des natürlichen Logarithmus) entsprach, wurde berechnet. Ein reziproker Wert dieser Zahl von Zellen ist eine Häufigkeit für LTC-IC. Darüber hinaus wurde die absolute Zahl der LTC-IC aus der ursprünglichen Zahl von Zellen und der Frequenz der LTC-IC berechnet.
Das Ergebnis weist darauf hin, dass 243 LTC-IC in 25.000 Zellen vor der Flüssigkultur gefunden wurden. In der Kontrollgruppe nahm die Zahl der Zellen während der 2 Wochen der Kultur auf 1.510.000 Zellen zu, und LTC-IC nahm auf 49 Zellen ab. Bei der Kultur mit humanem Delta-1, d.h. HDEXIg oder humanem Serrate-1, d.h. HSEXIg, wurde die Zahl der Zellen bei 1.310.000 bzw. 1.140.000 aufrechterhalten, und die Anzahl der LTC-IC nahm leicht auf 115 bzw. 53 ab. Infolge dessen kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, insbesondere humanes Delta-1, eine Aktivität zur Aufrechterhaltung der Zahl der LTC-IC in der Flüssigkultur aufweisen.
Beispiel 13
Bindung von HDEXIg und HSEXIg an Blutzellen
Die Bindung des Notch-Liganden an verschiedene Blutzellen wurde unter Verwendung spezifischer Bindungen von Notch-Liganden an Notch-Rezeptoren studiert.
Die getesteten Blutzell-Linien waren Jurkat (ATCC TIB-152), Namalwa (ATCC CRL-1432), HL-60 (ATCC CRL-1964), K562 (ATCC CCL-243), THO-1 (ATCC TIB-2 02), UT-7 (Komatsu et al., Cancer Res., 51, 341–348, 1991), Mole (Avanzi et al., Br. J. Hematol., 69, 359 ff, 1988) und CMK (Sato et al., Exp. Hematol., 15, 495–502, 1987). Die Kulturmedien für diese Zellen wurden in der Referenz gefunden oder in ATCC CELL LINES & HYBRIDOMAS, 8. Ed., 1994.
1 × 10⁶ Zellen wurden in der ausgeglichenen Salzlösung von Hank suspendiert, die 2 % FCS und 10 mM Hepes enthielt. 1 μg/ml HDEXIg oder HSEXIg wurden dazu gegeben, und man ließ sie bei 4°C über Nacht stehen. Die Zellen wurden zweimal mit der Lösung von Hank gewaschen. 1 μg/ml eines mit PE markierten, gegen humanes IgG gerichteten, monoklonalen Antikörpers aus dem Schaf wurde hinzugegeben, und man ließ die Mischung 30 Minuten unter Eiskühlung stehen, und sie wurde zweimal mit Hank-Lösung gewaschen und wurde in 1 ml Hank-Lösung suspendiert. Die Analyse wurde unter Verwendung eines Durchfluss-Cytometers (FACS-Calibur) durchgeführt. Anstelle einer Färbung mit HDEXIg oder HSEXIg wurden Kontrollgruppen mit einer Färbung durch humanes IgG1 verwendet.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Eine senkrechte Achse gibt die Zellzahlen an, und eine horizontale Achse gibt die Fluoreszenz-Intensität an. Die Färbung mit HDEXIg oder HSEXIg ist durch die durchgezogene Linie gezeigt, und eine Kontrolle, eine Färbung mit humanem IgG1, ist durch die unterbrochene Linie gezeigt. In 5 zeigt die linke Säule HDEXIg und die rechte Säule HSEXIg. Wie in 5 gezeigt, weisen die Ergebnisse darauf hin, dass die Zell-Linien wie folgt reagiert haben: Jurkat: Reaktion, Namalwa: keine Reaktion, HL-60: keine Reaktion, K562: keine Reaktion, THP-1: keine Reaktion, UT-7: Reaktion, Mo7e: keine Reaktion und CMK: Reaktion. Da die gleichen Ergebnisse für HDEXIg und HSEXIg erhalten wurden, erkannten beide das identische Molekül, und diese Zellen können differenziert werden.
Wirkung der Erfindung
Das Molekül des Notch-Liganden der vorliegenden Erfindung kann für die Aufrechterhaltung der Substanz, welche die Differenzierung unterdrückt, verwendet werden, sowie für Arzneimittel.
SEQUENZLISTE

Claims

Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass es aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: a) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, b) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 3 der Sequenzliste umfasst, c) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste umfasst, d) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 5 der Sequenzliste umfasst, e) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 6 der Sequenzliste umfasst, und f) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 7 der Sequenzliste umfasst,
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung der Differenzierung von undifferenzierten Zellen.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 2, wobei die undifferenzierten Zellen undifferenzierte Zellen sind, mit Ausnahme der Zellen des Hirns, des Nervensystems oder der Muskeln.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 2, wobei die undifferenzierten Zellen undifferenzierte Blutzellen sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach Anspruch 1 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 für die Verwendung als ein blutbildender Aktivator.
Zellkulturmedium, welches das Polypeptid nach Anspruch 1 umfasst.
Zellkulturmedium nach Anspruch 7, wobei die Zelle eine undifferenzierte Blutzelle ist.
DNA, die ein Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
DNA nach Anspruch 9 mit einer DNA-Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche besteht aus: a) den Nukleotid-Positionen 242–841 der SEQ ID Nr. 8 der Sequenzliste, b) den Nukleotid-Positionen 242–1801 der SEQ ID Nr. 8 der Sequenzliste, c) den Nukleotid-Positionen 242–2347 der SEQ ID Nr. 8 der Sequenzliste, d) den Nukleotid-Positionen 502–1095 der SEQ ID Nr. 9 der Sequenzliste, e) den Nukleotid-Positionen 502–3609 der SEQ ID Nr. 9 der Sequenzliste, und f) den Nukleotid-Positionen 502–4062 der SEQ ID Nr. 9 der Sequenzliste.
Rekombinante DNA, die durch Ligation einer DNA gebildet wird, welche aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus der DNA der Ansprüche 9 und 10 und einer Vektor-DNA, welche in der Wirtszelle exprimiert werden können.
Zelle, die mit einer rekombinanten DNA nach Anspruch 11 transformiert wurde.
Verfahren für die Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend die Kultivierung der Zellen nach Anspruch 12 und das Isolieren der Verbindung, die in der Kulturmasse hergestellt wurde.
Antikörper, der spezifisch das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4 der Sequenzliste erkennt.
Antikörper, der spezifisch das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 7 der Sequenzliste erkennt.