DE69635744T2

DE69635744T2 - Modifizierte Nukleinsäuresonden

Info

Publication number: DE69635744T2
Application number: DE69635744T
Authority: DE
Inventors: Glenn H. Mountain View McGall; Charles G. Mountain View Miyada; Maureen T. Los Altos Cronin; Jennifer D. Newark Tan; Mark S. Palo Alto Chee
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1995-05-10
Filing date: 1996-05-09
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2016-05-10
Also published as: HK1014561A1; DE69635744D1; EP0742287B8; US6156501A; EP0742287A3; EP0742287A2; EP0742287B1

Description

Die vorliegende Erfindung stellt Sonden bereit, welche sich aus in Arrays auf festen Substraten immobilisierten Nukleotidanaloga zusammensetzen, zur Analyse von molekularen Interaktionen von biologischem Interesse, sowie Zielnukleinsäuren, welche sich aus Nukleotidanaloga zusammensetzen. Die Erfindung betrifft daher die molekulare Interaktion von auf festen Substraten immobilisierten Polymeren, einschließend verwandte chemische, biologische und medizindiagnostische Verwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Entwicklung der "very large scale immobilized polymer synthesis (VLSIPS^TM)"-Technologie stellt vorbereitende Verfahren zur Anordnung von großen Anzahlen von Oligonukleotidsonden in sehr kleinen Arrays bereit. Siehe die PCT Patentveröffentlichungen Nrs. WO 90/15070 und 92/10092.
Die VLSIPS^TM-Technologie bietet ein effizientes Mittel zur Massenherstellung von miniaturisierten Oligonukleotidarrays für die Sequenzierung durch Hybridisierung ("sequencing by hybridization", SBH), für diagnostische Tests auf vererbte oder somatisch erworbene genetische Krankheiten und zur forensischen Analyse. Andere Anwendungen schließen die Bestimmung der Sequenzspezifität von Nukleinsäuren, Protein-Nukleinsäure-Komplexen und anderen Polymer-Polymer-Interaktionen ein.
Die EP 0 535 242 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz von DNA durch Hybridisierung an ein Array von Oligonukleotiden.
Die WO95/21265 betrifft Verfahren zur Identifizierung von Liganden in einem Array, die an eine Zielnukleinsäure hybridisieren, die eine sekundäre oder tertiäre Struktur aufweisen. Die Liganden bilden ein Array und können Oligonukleotidanaloga beinhalten.
Die WO96/27680 betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Punktmutationen und Polymorphismen in Nukleinsäuren durch Hybridisierung an ein Array von Nukleinsäureanaloga.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Arrays von Oligonukleotidanaloga bereit, welche an festen Substraten gebunden sind, mit einer Dichte von mehr als 100 Mitgliedern an bekannten Plätzen pro cm². Die Nukleinsäureanaloga sind ausgewählt um die Mismatch-Diskriminierung und Duplexstabilität bei Hybridisierung gegen eine Probe zu optimieren. Oligonukleotidanaloga weisen unterschiedliche Hybridisierungseigenschaften auf als Oligonukleotide, welche auf natürlich vorkommenden Nukleotiden basieren. Durch die Einbeziehung von Oligonukleotidanaloga in die Arrays der Erfindung wird die Hybridisierung an eine Zielnukleinsäure optimiert.
Die Oligonukleotidanaloga-Arrays weisen praktisch jede beliebige Anzahl unterschiedlicher Mitglieder auf, welche größtenteils durch die Anzahl oder Vielfalt der in einer gegebenen Anwendung gegen den Array zu screenenden Verbindungen bestimmt wird. In einer Gruppe von Ausführungsformen weist der Array von 10 bis zu 100 Oligonukleotidanaloga-Mitglieder auf. In anderen Gruppen von Ausführungsformen weisen die Arrays zwischen 100 und 10.000 Mitglieder auf, und in wieder anderen Ausführungsformen weisen die Arrays zwischen 10.000 und 1.000,0000 Mitglieder auf. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Array eine Dichte von mehr als 100 Mitgliedern an bekannten Orten pro cm² aufweisen, oder mehr bevorzugt mehr als 1.000 Mitglieder pro cm². In manchen Ausführungsformen weisen die Arrays eine Dichte von mehr als 10.000 Mitgliedern pro cm² auf.
Das Substrat, auf dem der Array aufgebaut ist, schließt jegliches Material ein, auf dem Oligonukleotidanaloga in einer definierten Beziehung zueinander gebunden sind, so wie Kügelchen, Arrays und Objektträger. Besonders bevorzugte Oligonukleotidanaloga des Arrays haben eine Länge von zwischen ca. 5 und ca. 20 Nukleotiden, Nukleotidanaloga oder einer Mischung daraus.
In einer Gruppe von Ausführungsformen werden Nukleosidanaloga, welche in die Oligonukleotidanaloga des Arrays einbezogen sind, die folgende chemische Formel aufweisen:
wobei R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Hydroxy, Alkoxy (beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Allyloxy und Propargyloxy), Alkylthio, Halogen (Fluor, Chlor und Brom), Cyano und Azido, und wobei Y ein heterozyklischer Rest ist, beispielsweise eine Base ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Purinen, Purinanaloga, Pyrimidinen, Pyrimidinanaloga, universelle Basen (beispielsweise 5-Nitroindol) oder anderen Gruppen oder Ringsystemen, welche in der Lage sind, eine oder mehrere Wasserstoffbrückenbindungen mit entsprechenden Resten oder alternierenden Strängen innerhalb einer doppel- oder dreisträngigen Nukleinsäure oder eines Nukleinsäureanalogons zu bilden, oder andere Gruppen oder Ringsysteme, welche in der Lage sind, basenstapelnde Interaktionen mit ihrem nächsten Nachbarn innerhalb eines doppel- oder dreisträngigen Komplexes auszubilden.
In anderen Ausführungsformen sind die Oligonukleotidanaloga nicht aus Nukleosiden konstruiert, sondern sind aufgrund struktureller Ähnlichkeiten zwischen dem Oligonukleotidanalogon und einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure in der Lage, an Nukleinsäuren in Lösung zu binden. Ein Beispiel für ein solches Oligonukleotidanalogon ist eine Peptidnukleinsäure oder Polyamidnukleinsäure, in welcher Basen, welche durch Wasserstoffbrücken an eine Nukleinsäure binden, an ein Polyamidrückgrat gebunden werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Zielnukleinsäuren bereit, welche an Oligonukleotidarrays hybridisiert sind. In den Zielnukleinsäuren der Erfindung sind die Nukleotidanaloga in die Zielnukleinsäure integriert, was die Hybridisierungseigenschaften der Zielnukleinsäure an ein Array von Oligonukleotidsonden verändert. Typischerweise umfassen die Oligonukleotidsondenarrays auch Nukleotidanaloga.
Typischerweise werden die Zielnukleinsäuren durch die Bereitstellung eines Nukleotidanalogons als Reagens während des enzymatischen Kopiervorgangs einer Nukleinsäure synthetisiert. Beispielsweise werden Nukleotidanaloga unter Verwendung von taq-Polymerase in einer PCR-Reaktion in Polynukleinsäureanaloga integriert. Daher wird eine Nukleinsäure, welche eine zu analysierende Sequenz enthält, typischerweise in einem PCR- oder RNA-Amplifizierungsverfahren mit Nukleotidanaloga amplifiziert und das daraus resultierende Zielnukleinsäureanalogon-Amplicon wird an ein Nukleinsäureanalogon-Array hybridisiert.
Oligonukleotidanalogon-Arrays und Zielnukleinsäuren setzen sich gegebenenfalls zusammen aus Oligonukleotidanaloga, welche gegen Hydrolyse oder Abbau durch Nuklease-Enzyme wie RNAase A resistent sind. Dies hat den Vorteil, dass die Lebensdauer von Array oder Zielnukleinsäure verlängert wird, indem es/sie gegen enzymatischen Abbau resistent gemacht wird. Beispielsweise sind 2'-O-Methyloligoribonukleotide umfassende Analoga resistent gegen RNAase A.
Oligonukleotidanalogon-Arrays werden gegebenenfalls als Bibliotheken angeordnet, um Verbindungen auf erwünschte Eigenschaften zu screenen, so wie die Fähigkeit, ein spezifiziertes Oligonukleotidanalogon oder eine Oligonukleotidanaloga enthaltende Struktur zu binden. Die Bibliotheken schließen ebenfalls Oligonukleotidanalogon-Mitglieder ein, welche konformationsbeschränkte Sonden bilden, so wie einmolekulare doppelsträngige Sonden oder einmolekulare doppelsträngige Sonden, welche eine relevante dritte chemische Struktur präsentieren.
Beispielsweise schließt der Array aus Oligonukleotidanaloga gegebenenfalls eine Vielzahl von verschiedenen Mitgliedern ein, wobei jedes Mitglied die Formel Y-L¹-X¹-L²-X² hat, wobei Y ein festes Substrat ist, X¹ und X² komplementäre Oligonukleotide sind, welche mindestens ein Nukleotidanalogon enthalten, L¹ ein Spacer ist und L² eine verknüpfende Gruppe von ausreichender Länge ist, so dass X¹ und X² ein doppelsträngiges Oligonukleotid bilden.
Ein Array von solchen Mitgliedern umfasst eine Bibliothek von einmolekularen doppelsträngigen Oligonukleotidanaloga. In einer anderen Ausführungsform sind die Mitglieder des Arrays aus Oligonukleotiden so angeordnet, dass sie in den Oligonukleotidanaloga-Sonden des Arrays einen relevanten Rest präsentieren. Beispielsweise sind die Arrays gegebenenfalls konformationsbeschränkt und haben die Formel -X¹¹-Z-X¹², wobei X¹¹ und X¹² komplementäre Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga sind und Z eine die relevante Bindungsstelle umfassende chemische Struktur ist.
Oligonukleotidanaloga-Arrays werden auf einem festen Substrat durch eine Vielzahl von Verfahren synthetisiert, einschließend die lichtgesteuerte chemische Kopplung und selektives Fließen synthetischer Reagenzien über Abschnitte des festen Substrats. Das feste Substrat wird durch die Behandlung mit geeigneten Reagenzien für die Synthese oder Bindung von Oligonukleotiden vorbereitet. Beispielsweise wird Glas durch eine Behandlung mit Silanreagenzien vorbereitet.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Bestimmung, ob ein relevantes Molekül Mitglieder des Oligonukleotidanaloga-Arrays bindet, bereit. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform ein Zielmolekül an das Array hybridisiert und das daraus resultierende Hybridisierungsmuster bestimmt. Das Zielmolekül schließt ein: genomische DNA, cDNA, ungespleißte RNA, mRNA und rRNA, Nukleinsäureanaloga, Proteine und chemische Polymere. Die Zielmoleküle werden gegebenenfalls vor der Hybridisierung an das Array amplifiziert, beispielsweise durch PCR, LCR oder Klonierungsverfahren.
Die Oligonukleotidanaloga-Mitglieder des in den oben genannten Verfahren verwendeten Arrays werden mit jedem beliebigen beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Arrays synthetisiert. In einer Ausführungsform werden die Oligonukleotidanaloga-Mitglieder an das feste Substrat gebunden oder sie werden mittels lichtgesteuerter "very large scale immobilized polymer synthesis" synthetisiert, beispielsweise unter Verwendung von photo-entfernbaren schützenden Gruppen während der Synthese.
In einer anderen Ausführungsform werden die Oligonukleotidmitglieder an das feste Substrat gebunden durch die Bildung einer Vielzahl von angrenzend an der Oberfläche des Substrats gelegenen Kanälen, durch Platzierung ausgewählter Monomere in besagten Kanälen, um die Oligonukleotidanaloga an vorbestimmten Abschnitten der ausgewählten Regionen zu synthetisieren, wobei die Abschnitte der ausgewählten Regionen Oligonukleotidanaloga umfassen, welche sich von Oligonukleotidanaloga in wenigstens einer der ausgewählten Regionen unterscheiden, und durch Wiederholung der Schritte mit den entlang eines zweiten Abschnitts der ausgewählten Regionen gebildeten Kanälen. Das feste Substrat besteht aus jeglichem geeigneten Material, wie oben beschrieben, einschließend Kügelchen, Objektträger und Arrays, welche jeweils aus beispielsweise Silan, Polymeren und Glas bestehen.
DEFINITIONEN
Ein "Oligonukleotid" ist eine Nukleinsäuresequenz, welche sich aus zwei oder mehr Nukleotiden zusammensetzt. Ein Oligonukleotid wird gegebenenfalls aus natürlichen Quellen gewonnen, wird aber oft chemisch synthetisiert. Es ist von beliebiger Größe.
Ein "Oligonukleotidanalogon" bezeichnet ein Polymer mit zwei oder mehr monomeren Untereinheiten, wobei die Untereinheiten einige strukturelle Eigenschaften mit einem natürlich vorkommenden Oligonukleotid gemeinsam haben, welche es erlauben, dass das Oligonukleotidanalogon mit einem natürlich vorkommenden Oligonukleotid in Lösung hybridisiert. Beispielsweise werden zu der Ribose oder der Base eines Nukleosids gegebenenfalls strukturelle Gruppen hinzugefügt zur Integration in ein Oligonukleotid, so wie eine Methyl- oder Allylgruppe an der 2'-O-Position auf der Ribose, oder eine Fluorgruppe, welche die 2'-O-Gruppe substituiert, oder eine Bromgruppe auf der Ribonukleosidbase.
Die Phosphodiesterverbindung, oder das "Zucker-Phosphat-Rückgrat" des Oligonukleotidanalogons wird substituiert oder modifiziert, beispielsweise mit Methylphosphonaten oder O-Methylphosphaten. Ein anderes Beispiel für ein Oligonukleotidanalogon für die Zwecke dieser Offenbarung schließt "Peptidnukleinsäuren" ein, in welchen native oder modifizierte Nukleinsäurebasen an einem Polyamidrückgrat gebunden sind.
Gegebenenfalls umfassen Oligonukleotidanaloga eine Mischung aus natürlich vorkommenden Nukleotiden und Nukleotidanaloga. Jedoch wird ein Oligonukleotid, welches sich ausschließlich aus natürlich vorkommenden Nukleotiden zusammensetzt (d.h. solche Nukleotide, welche DNA oder RNA umfassen), mit der Ausnahme einer schützenden Gruppe am Ende des Oligonukleotids, so wie eine während der standardmäßigen Nukleinsäuresynthese verwendete schützende Gruppe, nicht als ein Oligonukleotidanalogon für die Zwecke der vorliegenden Erfindung betrachtet.
Ein "Nukleosid" ist ein Pentoseglykosid, in welchem das Aglykon eine heterozyklische Base ist; durch Hinzufügen einer Phosphatgruppe wird die Verbindung zu einem Nukleotid. Die bedeutendsten biologischen Nukleoside sind β-Glykosidderivate der D-Ribose oder der D-2-Desoxyribose. Nukleotide sind Phosphatester von Nukleosiden, welche aufgrund der Hydroxygruppen auf dem Phosphat in Lösung im Allgemeinen sauer sind. Die Nukleoside von DNA und RNA sind über Phosphateinheiten, welche and der 3'-Position einer Pentose und der 5'-Position der benachbarten Pentose gebunden sind, miteinander verbunden. Nukleotidanaloga und/oder Nukleosidanaloga sind Moleküle mit strukturellen Ähnlichkeiten gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleotiden oder Nukleosiden, wie oben im Zusammenhang mit Oligonukleotidanaloga ausgeführt.
Ein in der standardmäßigen automatisierten Oligonukleotidsynthese verwendetes "Nukleinsäurereagens" trägt üblicherweise ein geschütztes Phosphat am 3'-Hydroxyl der Ribose. Daher werden Nukleinsäurereagenzien als Nukleotide, Nukleotidreagenzien, Nukleosidreagenzien, Nukleosidphosphate, Nukleosid-3'-Phosphate, Nukleosidphosphoramidite, Phosphoramidite, Nukleosidphosphonate, Phosphonate und dergleichen bezeichnet. Es wird allgemein als bekannt vorausgesetzt, dass Nukleotidreagenzien einen reaktiven oder aktivierbaren Phosphoryl- oder Phosphonylrest tragen, um eine Phosphodiesterverbindung zu bilden.
Eine "Schutzgruppe", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jede der Gruppen, die dazu bestimmt sind, eine reaktive Stelle in einem Molekül zu blockieren während eine chemische Reaktion an einer anderen Stelle durchgeführt wird. Noch genauer handelt es sich bei den hierin verwendeten schützenden Gruppen gegebenenfalls um jede beliebige der Gruppen, die in Greene, et al., Protective Groups In Organic Chemistry, 2nd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1991.
Die korrekte Auswahl von schützenden Gruppen für eine bestimmte Synthese wird durch die Gesamtheit der in der Synthese verwendeten Verfahren bestimmt. Beispielsweise sind bei der hierin besprochenen "lichtgesteuerten Synthese" die schützenden Gruppen photolabile schützende Gruppen, so wie NVOC, MeNPoc und jene, die in der ebenfalls anhängigen Anmeldung WO94/10128 (eingereicht am 22. Oktober 1993). Bei anderen Verfahren werden die schützenden Gruppen durch chemische Verfahren entfernt und schließen Gruppen wie FMOC, DMT und andere dem Fachmann bekannte Gruppen ein.
Ein "Purin" ist ein generischer Ausdruck, welcher auf der spezifischen Verbindung "Purin" basiert, welche eine von der Fusion eines Pyrimidinrings und eines Imidazolrings abgeleitete Skelettstruktur aufweist. Der Begriff wird im allgemeinen, und hierin, verwendet, um eine generische Klasse von Verbindungen zu beschreiben, zu deren parentaler Purinverbindung ein Atom oder eine Gruppe von Atomen hinzugefügt wird, so wie die in den natürlich vorkommenden Nukleinsäuren Adenin (6-Aminopurin) und Guanin (2-Amino-6-Oxopurin), oder in weniger häufig vorkommenden Molekülen so wie dem 2-Amino-Adenin, N⁶-Methyladenin oder 2-Methylguanin, vorzufindenden Basen.
Ein "Purinanalogon" besitzt einen heterozyklischen Ring mit strukturellen Ähnlichkeiten zu einem Purin, in welchem ein Atom oder eine Gruppe von Atomen für ein Atom in dem Purinring substituiert wird. Beispielsweise werden in einer Ausführungsform ein oder mehrere N-Atome des heterozyklischen Purinrings durch C-Atome ersetzt.
Ein "Pyrimidin" ist eine Verbindung mit einer spezifischen heterozyklischen Diazinringstruktur, wird jedoch vom Fachmann und hierin generisch verwendet, um jegliche Verbindung zu bezeichnen, welche einen 1,3-Diazinring mit geringfügigen Hinzufügungen aufweist, so wie die gebräuchlichen Nukleinsäurebasen Cytosin, Thymin, Uracil, 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin oder das nicht natürlich vorkommende 5-Bromuracil.
Ein "Pyrimidinanalogon" ist eine Verbindung mit struktureller Ähnlichkeit zu einem Pyrimidin, in welchem eines oder mehrere Atome im Pyrimidinring substituiert werden. Beispielsweise werden in einer Ausführungsform eines oder mehrere N-Atome des Rings durch C-Atome substituiert.
Ein "festes Substrat" besitzt eine fixierte organisatorische Trägermatrix, so wie Silan, polymere Materialien oder Glas. In manchen Ausführungsformen ist wenigstens eine Oberfläche des Substrats teilweise plan. In anderen Ausführungsformen ist es wünschenswert, Bereiche des Substrats physikalisch abzugrenzen, um synthetische Bereiche zu umreißen, beispielsweise mit Furchen, Rillen, Wells oder dergleichen. Beispiele für feste Substrate schließen Objektträger, Kügelchen und Arrays ein.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt zwei Tafeln (1A und 1B), welche den Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den gepaarten (Match-) und den fehlgepaarten (Mismatch-) Sonden auf einem Oligonukleotidanaloga-Array illustrieren.
2 ist eine graphische Darstellung einer spezifischen lichtgesteuerten chemischen Kopplung von Oligonukleotidanaloga-Monomeren an ein Array.
3 zeigt die relative Effektivität und Spezifität der Hybridisierung für immobilisierte Sondenarrays enthaltend Adenin-versus-Sondenarrays enthaltend 2,6-Diaminopurinnukleotide. (3'-CATCGTAGAA-5' (SEQ ID NR:1)).
4 zeigt die Auswirkung einer Substituierung von Adenin mit 2,6-Diaminopurin (D) in immobilisierten Poly-dA-Sondenarrays. (AAAAAANAAAAA (SEQ ID NR:2)).
5 zeigt die Auswirkungen einer Substituierung von 5-Propynyl-2'-Desoxyuridin und 2-Amino-2' Desoxyadenosin in AT-Arrays auf die Hybridisierung an eine Zielnukleinsäure. (ATATAATATA (SEQ ID NR:3) und CGCGCCGCGC (SEQ ID NR:4)).
6 zeigt die Auswirkungen von dI und 7-Deaza-dG Substituierungen in Oligonukleotidarrays. (3'-ATGTT(G1G2G3G4G5)CGGGT-5' (SEQ ID NR:5)).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Verfahren zur Synthetisierung von erwünschten einzelsträngigen Oligonukleotid- und Oligonukleotidanalogasequenzen sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere sind Verfahren zur Synthetisierung von Oligonukleotiden und Oligonukleotidanaloga beispielsweise zu finden in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait, ed., IRL Press, Oxford (1984); W.H.A. Kuijpers Nucleic Acids Research 18(17), 5197 (1994); K.L. Dueholm J. Org. Chem. 59, 5767- 5773 (1994), und S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, Volume 20. Die Synthetisierung von einmolekularer doppelsträngiger DNA in Lösung wurde ebenfalls beschrieben.
Verbesserte Verfahren zur Bildung von großen Arrays von Oligonukleotiden, Peptiden und anderen Polymersequenzen mit einer minimalen Anzahl von Syntheseschritten sind bekannt. Siehe Pirrung et al., U.S. Patent No. 5,143,854 (siehe auch PCT Anmeldung Nr. WO 90/15070) und Fodor et al., PCT Veröffentlichungs-Nr. WO 92/10092, welche Verfahren zur Bildung von riesigen Arrays von Peptiden, Oligonukleotiden und anderen Molekülen, beispielsweise unter Verwendung von lichtgesteuerten Synthesetechniken, offenbaren. Siehe auch Fodor et al., (1991) Science, 251, 767-77. Diese Verfahren zur Synthese von Polymerarrays werden nunmehr als VLSIPS^TM-Verfahren bezeichnet.
Unter Verwendung des VLSIPS^TM-Ansatzes wird ein heterogenes Array von Polymeren durch gleichzeitige Kopplung an einer Reihe von Reaktionsstellen in ein unterschiedliches heterogenes Array umgewandelt. Siehe U.S. 5, 384, 261.
Die Entwicklung der VLSIPS^TM-Technologie, wie in oben genanntem US-Patent Nr. 5,143,854 und den PCT-Patentveröffentlichungen Nrs. WO 90/15070 und 92/10092 beschrieben, wird auf dem Gebiet der kombinatorischen Synthese und des Screening von kombinatorischen Bibliotheken als Pioniertechnologie betrachtet.
Kombinatorische Synthese von Oligonukleotidarrays
Die VLSIPS^rM-Technologie ermöglicht die kombinatorische Synthese von Oligonukleotidarrays. Die kombinatorische VLSIPS^TM-Strategie ermöglicht die Synthese von Arrays, welche eine große Anzahl zusammenhängender Sonden enthalten, mit einer minimalen Anzahl von Syntheseschritten. Beispielsweise ist es möglich, alle denkbaren DNA-8mer-Oligonukleotide (4⁸ oder 65.536 mögliche Kombinationen) in nur 32 chemischen Syntheseschritten zu synthetisieren und zu binden. Im Allgemeinen stellen die VLSIPS^TM-Verfahren eine Methode zur Herstellung von 4ⁿ unterschiedlichen Oligonukleotidsonden auf einem Array mit nur 4n Syntheseschritten bereit.
Kurz gesagt geht die lichtgesteuerte kombinatorische Synthese von Oligonukleotidarrays auf einer Glasoberfläche unter Verwendung von automatisierten Phosphoramidit- und Chipmaskierungstechniken vor sich. In einer bestimmten Ausführungsform wird eine Glasoberfläche mit einem Silanreagens, welches eine funktionelle Gruppe enthält, beispielsweise eine durch eine photolabile schützende Gruppe blockierte Hydroxyl- oder Aminogruppe, derivatisiert. Photolyse durch eine photolithographische Maske wird selektiv verwendet, um funktionelle Gruppen freizulegen, welche dann bereit sind, mit nachfolgenden 5'-photogeschützten Nukleosidphosphoramiditen zu reagieren. Siehe 2.
Die Phosphoramidite reagieren nur mit den Stellen, welche beleuchtet (und daher durch die Entfernung der photolabilen Blockierungsgruppe freigelegt) werden. Folglich fügen sich die Phosphoramidite nur an die Bereiche an, welche im vorhergehenden Schritt freigelegt wurden. Diese Schritte werden wiederholt, bis das gewünschte Array von Sequenzen auf der festen Oberfläche synthetisiert wurde. Die kombinatorische Synthese von unterschiedlichen Oligonukleotidanaloga an unterschiedlichen Stellen auf dem Array wird durch das Beleuchtungsmuster während der Synthese und die Reihenfolge des Hinzufügens der Kopplungsreagenzien bestimmt.
Falls in dem VLSIPS^TM-Verfahren ein Oligonukleotid mit einem Polyamidrückgrat verwendet wird, ist es im Allgemeinen nicht angebracht, phosphoramiditchemische Syntheseschritte durchzuführen, da die Monomere sich nicht mittels Phosphatkopplung aneinander binden. Stattdesen werden ersatzweise peptidsynthetische Verfahren angewandt. Siehe beispielsweise Pirrung et al. US-Pat. Nr. 5,143,854.
Peptidnukleinsäuren, welche ein Polyamidrückgrat und die in natürlich vorkommenden Nukleosiden vorzufindenden Basen umfassen, sind im Handel erhältlich, beispielsweise von Biosearch, Inc. (Bedford, MA, USA). Peptidnukleinsäuren sind in der Lage, mit hoher Spezifität an Nukleinsäuren zu binden und werden für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung als "Oligonukleotidanaloga" betrachtet. Es ist zu beachten, dass Peptidnukleinsäuren gegebenenfalls andere Basen außer den natürlich vorkommenden umfassen.
Hybridisierung von Nukleotidanaloga
Die Stabilität von zwischen RNAs oder DNAs gebildeten Duplexmolekülen in Lösung folgt im Allgemeinen der Rangordnung von RNA:RNA > RNA:DNA > DNA:DNA. Lange Sonden haben zwar eine höhere Duplexstabilität mit einem Target, verfügen jedoch über eine schlechtere Mismatchdiskriminierung als kurze Sonden (Mismatchdiskriminierung bezieht sich auf das gemessene Hybrdisierungssignalverhältnis zwischen einer Perfect-Match-Sonde und einer Einzelbasen-Mismatch-Sonde). Kürzere Sonden (beispielsweise 8-mere) diskriminieren Fehlpaarungen sehr gut, doch ihre gesamte Duplexstabilität ist gering. Um Mismatchdiskriminierung und Duplexstabilität zu optimieren stellt die vorliegende Erfindung eine Reihe von Nukleotidanaloga bereit, welche in Polymere integriert und in einem Array auf einem festen Substrat gebunden sind.
Die Veränderung der thermalen Stabilität (T_m) des zwischen dem Target und der Sonde gebildeten Duplexmoleküls, beispielsweise unter Verwendung von bekannten Oligonukleotidanaloga, ermöglicht die Optimierung der Duplexstabilität und der Mismatchdiskriminierung. Ein nützlicher Aspekt der Veränderung der T_m ergibt sich daraus, dass Adenin-Thymin (A-T)-Duplexmoleküle eine niedrigere T_m aufweisen als Guanin-Cytosin (G-C)-Duplexmoleküle, teilweise aus dem Grund, weil die A-T-Duplexmoleküle 2 Wasserstoffbrückenbindungen pro Basenpaar aufweisen, während die G-C-Duplexmoleküle über 3 Wasserstoffbrückenbindungen pro Basenpaar verfügen.
In heterogenen Oligonukleotidarrays, in denen eine nicht-einheitliche Verteilung der Basen vorliegt, kann es schwierig sein, die Hybridisierungsbedingungen für alle Sonden gleichzeitig zu optimieren. Daher ist es in manchen Ausführungsformen wünschenswert, G-C-reiche Duplexmoleküle zu destabilisieren und/oder die Stabilität der A-T-reichen Duplexmoleküle zu erhöhen, während die Sequenzspezifität der Hybridisierung aufrechterhalten wird. Dies wird beispielsweise erreicht, indem eines oder mehrere der nativen Nukleotide in der Sonde (oder dem Target) mit bestimmten modifizierten, nicht standardgemäßen Nukleotiden ersetzt werden. Beispielsweise wird eine Substituierung von Guaninresten mit 7-Deazaguanin im Allgemeinen Duplexmoleküle destabilisieren, wohingegen eine Substituierung von Adeninresten mit 2,6-Diaminopurin die Duplexstabilität verstärken wird.
Eine Vielzahl anderer modifizierter Basen werden ebenfalls in Nukleinsäuren integriert, um die gesamte Duplexstabilität zu verstärken oder zu verringern, während die Hybridisierungsspezifität aufrechterhalten wird. Die Integration von 6-Aza-pyrimidinanaloga in Oligonukleotidsonden verringert im Allgemeinen deren Bindungsaffinität für komplementäre Nukleinsäuren. Viele 5-substituierte Pyrimidine erhöhen die Stabilität von Hybriden, in welchen sie anstelle der nativen Pyrimidine in die Sequenz substituiert werden, wesentlich. Beispiele umfassen 5-Brom-, 5-Methyl-, 5-Propynyl-, 5-(Imidazol-2-yl)- und 5-(Thiazol-2-yl)-Derivate von Cytosin und Uracil.
Viele modifizierte Nukleoside, Nukleotide und zahlreiche Basen, welche dazu geeignet sind, in Nukleoside integriert zu werden, sind bei einer Vielzahl von Herstellern im Handel erhältlich, darunter die SIGMA Chemiefabrik (Saint Louis, MO, USA), R&D Systems (Minneapolis, MN, USA), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ, USA), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA, USA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD, USA), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz), Invitrogen, San Diego, CA, USA, und Applied Biosystems (Foster City, CA, USA), sowie bei vielen anderen dem Fachmann bekannten kommerziellen Bezugsquellen.
Verfahren zur Bindung von Basen and Zuckerresten, um Nukleoside zu formen, sind bekannt. Siehe beispielsweise Lukevics und Zablocka (1991), Nucleoside Synthesis: Organosilicon Methods Ellis Horwood Limited Chichester, West Sussex, England und die darin enthaltenen Referenzen. Verfahren zur Phosphorylierung von Nukleosiden, um Nukleotide zu erhalten, und zur Integration von Nukleotiden in Oligonukleotide sind ebenfalls bekannt. Siehe beispielsweise Agrawal (ed) (1993) Protocols for Oligonucleotides and Analogues, Synthesis and Properties, Methods in Molecular Biology Band 20, Humana Press, Towota, N.J. und die darin enthaltenen Referenzen. Siehe auch Crooke und Lebleu und Sanghvi und Cook und die darin zitieren Referenzen, beide supra.
Gruppen werden auch an verschiedene Positionen auf dem Nukleosidzuckerring oder auf den Purin- oder Pyrmidinringen gekoppelt, was das Duplexmolekül durch elektrostatische Interaktionen mit dem negativ geladenen Phosphatrückgrat oder durch Wasserstoffbrückenbindungsinteraktionen in den großen und kleinen Furchen stabilisieren kann. Beispielsweise werden Adenosin- und Guanosinnukleotide gegebenenfalls an der N²-Position mit einer Imidazolyl-Propylgruppe substituiert, was die Duplexstabilität erhöht. Universelle Basenanaloga, so wie 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol werden gegebenenfalls in Oligonukleotidsonden eingeschlossen, um die Duplexstabilität durch basenstapelnde Interaktionen zu verbessern.
Die Auswahl der Länge der Oligonukleotidsonden ist ebenfalls eine wichtige Überlegung bei der Optimierung der Hybridisierungsspezifität. Allgemein ausgedrückt sind kürzere Sondensequenzen spezifischer als längere, da das Vorkommen einer Einzelbasen-Fehlpaarung eine größere destabilisierende Wirkung auf das Duplexhybrid hat. Da jedoch die gesamte thermodynamische Stabilität der Hybride mit der Länge abnimmt, ist es in manchen Ausführungsformen wünschenswert, die Duplexstabilität für kurze Sonden generell zu erhöhen.
Bestimmte Modifikationen des Zuckerrestes in Oligonukleotiden bieten eine nützliche Stabilisierung und sie können dazu verwendet werden, die Affinität der Sonden für komplementäre Nukleinsäuresequenzen zu steigern. Beispielsweise haben 2'-O-Methyl-, 2'-O-Propyl- und 2'-O-Allyl-Oligoribonukleotide höhere Bindungsaffinitäten für komplementäre RNA-Sequenzen als ihre unmodifizierten Gegenstücke. Sonden, welche sich aus 2'-Fluor-2'-Desoxyoligoribonukleotiden zusammensetzen, bilden auch stabilere Hybride mit RNA als ihre unmodifizierten Gegenstücke.
Ersetzung oder Substituierung der Internukleotid-Phosphodiester-Verbindung in Oligo- oder Polynukleotiden wird auch dazu verwendet, die Affinität der Sonden-Target-Interaktionen entweder zu erhöhen oder zu verringern. Beispielsweise verringert die Substituierung von Phosphodiesterverbindungen mit Phosphorothioat- oder Phosphorodithioatverbindungen im allgemeinen die Duplexstabilität, ohne die Sequenzspezifität zu beeinträchtigen. Substituierungen mit einer nicht-ionischen Methylphosphonatverbindung (razemisch, oder bevorzugt Rp-Stereochemie) haben eine stabilisierende Wirkung auf die Hybridbildung. Neutrale oder kationische Phosphoramiditverbindungen führen ebenfalls zu einer erhöhten Duplexstabilisierung.
Das Phosphat-Diester-Rückgrat wurde durch eine Vielzahl anderer stabilisierender nichtnatürlicher Verbindungen ersetzt, welche als potentielle therapeutische Antisense-Wirkstoffe erforscht wurden. Siehe beispielsweise Crooke und Lebleu (eds) (1993) Antisense Research Applications CRC Press; und Sanghvi und Cook (eds) (1994) Carbohydrate modifications in Antisense Research ACS Symp. Ser. #580 ACS, Washington DC, USA. Sehr stabile Hybride werden zwischen Nukleinsäuren und Sonden, welche sich aus Peptidnukleinsäuren zusammensetzen, gebildet, worin das gesamte Zuckerphosphatrückgrat durch eine Polyamidstruktur ersetzt wurde.
Ein weiterer bedeutender Faktor, welcher sich manchmal auf die Verwendung von Oligonukleotidsondenarrays auswirkt, ist die Natur der Zielnukleinsäure. Oligodesoxynukleotidsonden können mit unterschiedlicher Affinität und Spezifität an DNA- und RNA-Targets hybridisieren. Beispielsweise bilden Sondensequenzen, welche lange "Reihen" von konsekutiven Desoxyadenosinresten enthalten, weniger stabile Hybride mit komplementären RNA-Sequenzen als mit den komplementären DNA-Sequenzen. Substituierung von dA in der Sonde mit entweder 2,6-Diaminopurindesoxyribosid oder 2'-Alkoxy- oder 2'-Fluor-dA verstärkt die Hybridisierung mit RNA-Targets.
Die interne Struktur innerhalb der Nukleinsäuresonden oder der Targets beeinflusst ebenfalls die Hybridisierungseffizienz. Beispielsweise lagern sich GC-reiche Sequenzen und Sequenzen, welche Reihen von konsekutiven G-Resten enthalten, häufig selbst aneinander, um Strukturen einer höheren Ordnung zu bilden, und dies kann ihre Bindung an komplementäre Sequenzen inhibieren. Siehe Zimmerman et al. (1975) J. Mol Biol 92: 181; Kim (1991) Nature 351: 331; Sen and Gilbert (1988) Nature 335: 364; und Sunquist und Klug (1989) Nature 342: 825. Diese Strukturen werden mit einem oder mehreren der folgenden Purine oder Purinanaloga durch die Substituierung von einem oder mehreren Guaninresten selektiv destabilisiert: 7-Deazaguanin, 8-Aza-7-Deazaguanin, 2-Aminopurin, 1H-Purine und Hypoxanthin, um die Hybridisierung zu verstärken.
Modifizierte Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga können auch verwendet werden, um die chemische Stabilität von Sondenarrays zu verbessern. Beispielsweise können bestimmte Prozesse und Bedingungen, welche entweder zur Herstellung oder zur nachfolgenden Verwendung der Arrays nützlich sind, nicht kompatibel mit der Standard- Oligonukleotidchemie sein und es kann eine andere Chemie angewandt werden, um diese Probleme zu überwinden. Beispielsweise wird ein Aussetzen in saurer Umgebung die Depurinierung von Purinnukleotiden verursachen, was schließlich in Kettenspaltung und vollständigem Abbau des Sondenarrays resultiert. In diesem Fall werden Adenin und Guanin jeweils mit 7-Deazaadenin und 7-Deazaguanin ersetzt, um die Oligonukleotidsonden gegenüber sauren Bedingungen zu stabilisieren, welche während der Herstellung oder der Verwendung der Arrays verwendet werden.
Basen-, Phosphat- und Zuckermodifikationen werden in Kombination verwendet, um hochgradig modifizierte Oligonukleotidanaloga herzustellen, welche sich die vorteilhaften Eigenschaften einer jeden der verschiedenen Modifikationen zunutze machen. Beispielsweise können Oligonukleotide, welche höhere Bindungsaffinitäten für komplementäre Sequenzen haben als ihre unmodifizierten Gegenstücke (beispielsweise 2'-O-Methyl-, 2'-O-Propyl- und 2'-O-Alyloligonukleotide), mittels nicht-ionischer Methylphosphonatverbindungen oder neutralen kationischen Phosphoramidatverbindungen in Oligonukleotide mit modifizierten Basen (Deazaguanin, 8-Aza-7-Deazaguanin, 2-Aminopurin, 1H-Purin, Hypoxanthine und dergleichen) eingebaut werden, was zu einer zusätzlichen Stabilisierung der Duplexbildung zwischen dem Oligonukleotid und einer Zielnukleinsäure führt.
Beispielsweise umfasst ein bevorzugtes Oligonukleotid ein 2'-O-Methyl-2,6-Diaminopurinribosid-Phosphorothioat. In ähnlicher Weise kann jeder der hierin beschriebenen modifizierten Basen in Peptidnukleinsäuren integriert werden, in welchen das gesamte Zuckerphosphatrückgrat durch eine Polyamidstruktur ersetzt wurde.
Untersuchungen zu thermalem Gleichgewicht, kinetische "on-rate"-Untersuchungen und Sequenzspezifitätsanalyse werden gegebenenfalls für jedes Zieloligonukleotid und jede Sonde oder jedes Sondenanalogon durchgeführt. Die erhaltenen Daten zeigen das Verhalten der Analoga bei der Duplexbildung mit Zieloligonukleotiden. Eine durch die Verwendung von Oligonukleotidanalogasonden vermittelte veränderte Duplexstabilität wird beispielsweise bestimmt, indem man die Fluoreszenzsignalintensität von einem mit einem Zieloligonukleotid hybridisiertem Oligonukleotidanalogon über die Zeit verfolgt. Die Daten gestatten die Optimierung von spezifischen Hybridisierungsbedingungen, beispielsweise bei Raumtemperatur (für vereinfachte diagnostische Anwendungen).
Ein anderer Weg, die veränderte Duplexstabilität zu verifizieren ist es, die bei der Hybridisierung erzeugte Signalintensität über die Zeit zu verfolgen. Vorhergehende Experimente unter Verwendung von DNA-Targets und DNA-Chips haben gezeigt, dass die Signalintensität mit der Zeit zunimmt und dass die stabileren Duplexmoleküle höhere Signalintensitäten schneller erzeugen als weniger stabile Duplexmoleküle. Die Signale erreichen nach einer gewissen Zeit einen Plateauwert oder "sind gesättigt", da nach und nach alle Bindungsstellen besetzt werden. Diese Daten gestatten die Optimierung der Hybridisierung und die Bestimmung von Gleichgewichtsbedingungen bei einer spezifischen Temperatur.
Kurven der Signalintensität und der Basen-Fehlpaarungspositionen werden aufgetragen und die Verhältnisse von perfekten Paarungen gegen die Fehlpaarungen werden berechnet. Diese Rechnung zeigt die sequenzspezifischen Eigenschaften der Nukleotidanaloga als Sonden. Perfekte Paarung/Fehlpaarungsverhältnisse größer als 4 sind in einem diagnostischen Oligonukleotidassay oft gewünscht, da für ein diploides Genom Verhältnisse von 2 unterschieden werden müssen (beispielsweise im Falle einer heterozygoten Eigenschaft oder Sequenz).
Zielnukleinsäuren, welche Nukleotidanaloga umfassen
Modifizierte Nukleotide und Nukleotidanaloga werden zur Hybridisierungsanalyse von Oligonukleotidarrays synthetisch oder enzymatisch in DNA- oder RNA-Zielnukleinsäuren integriert. Die Integration von Nukleotidanaloga in das Target optimiert die Hybridisierung des Targets hinsichtlich der Sequenzspezifität und/oder der gesamten Affinität, an Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga-Sondenarrays zu binden. Die Verwendung von Nukleotidanaloga in entweder dem Oligonukleotidarray oder der Zielnukleinsäure oder in beiden verbessert die Optimierbarkeit der Hybridisierungsinteraktionen. Beispiele für nützliche Nukleotidanaloga, welche durch natürlich vorkommende Nukleotide substituiert werden, schließen ein 7-Deazaguanosin, 2,6-Diaminopurinnukleotide, 5-Propynyl und andere 5-substituierte Pyrimidinnukleotide, 2'-Fluor- und 2'-Methoxy-2'-Desoxynukleotide und dergleichen.
Diese Nukleotidanaloga werden unter Verwendung der oben beschriebenen Syntheseverfahren oder unter Verwendung von DNA- oder RNA-Polymerasen in Nukleinsäuren integriert. Die Nukleotidanaloga werden bevorzugt in Zielnukleinsäuren integriert unter Verwendung von in vitro Amplifizierungsverfahren so wie PCR, LCR, Q β-Replikase-Expansion, in vitro Transkription (beispielsweise Nick-Translation oder Random-Primer-Transkription) und dergleichen. Alternativ werden die Nukleotidanaloga gegebenenfalls in klonierte Nukleinsäuren integriert, indem eine Zelle kultiviert wird, welche die klonierte Nukleinsäure in einem ein Nukleotidanalogon einschließenden Medium umfasst.
Ähnlich der Verwendung der Nukleotidanaloga in Sondenarrays wird 7-Deazaguanosin in Zielnukleinsäuren verwendet, um für G/dG zu substituieren, um die Targethybridisierung zu verstärken, indem in Sequenzen, welche Reihen von Poly-G/dG enthalten, die Sekundärstruktur reduziert wird. 6-Diaminopurinnukleotide substituieren für A/dA, um die Targethybridisierung durch verstärkte H-Bindung an T- oder U-reiche Sonden zu verstärken. 5-Propynyl und andere 5-substituierte Pyrimidinnukleotide substituieren für natürliche Pyrimidine, um die Targethybridisierung an bestimmte purinreiche Sonden zu verstärken. 2'-Fluor- und 2'-Methoxy-2'-Desoxynukleotide substituieren für natürliche Nukleotide, um die Targethybridisierung an in ähnlicher Weise substituierten Sondensequenzen zu verstärken.
Synthese von 5'-photogeschützten 2'-O-Alkyl-Ribonukleotidanaloga
Die lichtgesteuerte Synthese von komplexen Arrays von Nukleotidanaloga auf einer Glasoberfläche wird durch die Derivatisierung von Cyanoethyl-Phosphoramiditnukleotiden und – nukleotidanaloga (beispielsweise Nukleosidanaloga von Uridin, Thymidin, Cytidin, Adenosin und Guanosin, mit Phosphaten) mit beispielsweise der photolabilen MeNPoc-Gruppe anstatt der üblichen Dimethoxytritylgruppe an der 5'-Hydroxylposition erreicht. Siehe die Anmeldung SN PCT/US94/12305.
Spezifische basengeschützte 2'-O-Alkylukleoside sind im Handel erhältlich von beispielsweise Chem Genes Corp. (MA, USA). Die photolabile MeNPoc-Gruppe wird an die 5'-Hydroxylposition hinzugefügt und anschließend phosphityliert, um Cyanoethyl-Phosphoramidit-Monomere zu erhalten. Im Handel erhältliche Nukleoside werden gegebenenfalls modifiziert (beispielsweise durch 2-O-Alkylation), um Nukleosidanaloga zu schaffen, welche zur Herstellung von Oligonukleotidanaloga verwendet werden.
Abwandlungen der oben beschriebenen Verfahren werden in manchen Ausführungsformen verwendet, um eine wesentliche Addition von MeNPoc an die 3'-Hydroxylposition zu vermeiden. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform ein 2'-O-Methylribonukleotidanalogon mit DMT-Cl {Di(p-Methoxyphenyl)Phenylchlorid} in der Gegenwart von Pyridin zur Reaktion gebracht, um ein 2'-O-Methyl-5'-O-DMT-Ribonukleotidanalogon zu bilden. Dies ermöglicht die Addition von TBDMS an das 3'-O des Ribonukleosidanalogons durch Reaktion mit TBDMS-Triflat (t-Butyldimethylsilyltrifluormethansulfonat) in der Gegenwart von Triethylamin in THF (Tetrahydrofuran), um ein 2'-O-Methyl-3'-O-TBDMS-5'-O-DMT-Ribonukleotidbasenanalogon zu erhalten.
Dieses Analogon wird mit TCAA (Trichlor-Essigsäure) behandelt, um die DMT-Gruppe abzuspalten, wobei eine reaktive Hydroxylgruppe an der 5'-Position verbleibt. MeNPoc wird dann zum Sauerstoff der 5'-Hydroxylgruppe hinzugefügt unter Verwendung von MenPoc-Cl in der Gegenwart von Pyridin. Die TBDMS-Gruppe wird dann mit F^– (beispielsweise NaF) gespalten, um ein Ribonukleotidbasenanalogon mit einer am 5'-Sauerstoff des Nukleotidanalogons gebundenen MeNPoc-Gruppe zu erhalten. Sofern dies angemessen ist, wird dieses Analogon phosphityliert, um ein Phosphoramidit für die Oligonukleotidanalogonsynthese zu erhalten. Andere Nukleoside oder Nukleosidanaloga werden durch ähnliche Verfahren geschützt.
Synthese von Oligonukleotidanalogonarrays auf Chips
Anders als die Verwendung von photo-entfernbaren schützenden Gruppen, ist die in der VLSIPS^TM-Technologie zur Synthese von Oligonukleotiden und Oligonukleotidanaloga auf Chips angewandte Nukleosidkopplungschemie ähnlich der zur Oligonukleotidsynthese angewandten Chemie. Das Oligonukleotid ist üblicherweise über die 3'-Hydroxyl-Gruppe des Oligonukleotids und eine funktionelle Gruppe auf dem Substrat mit dem Substrat verbunden, was in der Bildung eines Ethers, Esters, Carbamats oder einer Phosphatesterverbindung resultiert.
Nukleotide oder Oligonukleotidanaloga werden über Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen unter Verwendung von beispielsweise Trägern mit (Poly)Trifluorchlorethylen-Oberflächen, oder bevorzugt über Siloxanbindungen (unter Verwendung von beispielsweise Glas oder Siliziumoxid als fester Träger) an den festen Träger gebunden. Siloxanbindungen mit der Oberfläche des Trägers werden in einer Ausführungsform über Reaktionen von oberflächenbindenden Abschnitten, welche Trichlorsilyl- oder Trialkoxysilyl-Gruppen tragen, gebildet.
Die oberflächenbindenden Gruppen besitzen eine Stelle für die Bindung des Oligonukleotidanalogonabschnitts. Zur Bindung geeignete Gruppen schließen beispielsweise Amine, Hydroxyl, Thiol und Carboxyl ein. Bevorzugte oberflächenbindende oder derivatisierende Abschnitte schließen Aminoalkylsilane und Hydroxyalkylsilane ein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der oberflächenbindende Abschnitt entweder
Bis(2-Hydroxyethyl)-Aminopropyltriethoxysilan,
N-(3-Triethoxysilylpropyl)-4-Hydroxybutylamid,
Aminopropyltriethoxysilan oder Hydroxypropyltriethoxysilan.
Die durch die Synthese unter Verwendung von gewöhnlichen Ribonukleotiden hergestellten Oligoribonukleotide sind üblicherweise labil aufgrund der Gegenwart der 2'-Hydroxylgruppe. 2'-O-Methyloligoribonukleotide (2'-OMeORNs), Analoga von RNA bei denen die 2'-Hydroxylgruppe methyliert ist, sind resistent gegen DNAse und RNAse, was sie weniger basenlabil macht. Sproat, B.S., und Lamond, A.I. in Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, herausgegeben von F. Eckstein, New York: IRL Press at Oxford University Press, 1991, pp. 49-86, berichteten von der Synthese von gemischten Sequenzen von 2'-O-Methoxy-Oligoribonukleotiden (2'-O-MeORNs) unter Verwendung von Dimethoxytrityl-Phosphoramidit-Chemie. Diese 2'-O-MeORNs zeigen eine größere Bindungsaffinität für komplementäre Nukleinsäuren als ihre unmodifizierten Gegenstücke.
Andere Ausführungsformen der Erfindung stellen mechanische Mittel zur Herstellung von Oligonukleotidanaloga bereit. Diese Techniken werden in U.S. 5, 384, 261 diskutiert, eingereicht am 22.11.1991. Im Wesentlichen werden Oligonukleotidanalogonreagenzien über die Oberfläche eines Substrats gelenkt, so dass ein vorbestimmtes Array von Oligonukleotidanaloga geschaffen wird. Beispielsweise werden eine Reihe von Kanälen, Rillen oder Spots auf einem Substrat oder angrenzend daran ausgebildet. Reagenzien werden selektiv durch die Kanäle, Rillen oder Spots gespült oder darin angelagert, um ein Array mit verschiedenen Oligonukleotiden und/oder Oligonukleotidanaloga an ausgewählten Stellen auf dem Substrat zu bilden.
Nachweis der Hybridisierung
In einer Ausführungsform wird die Hybridisierung durch die Markierung eines Targets mit beispielsweise Fluoreszein oder anderen bekannten Visualisierungsagenzien und durch Inkubation des Targets mit einem Array von Oligonukleotidanalogasonden nachgewiesen. Bei der Duplexbildung durch das Target mit einer Sonde im Array (oder Triplexbildung in Ausführungsformen, in denen das Array einmolekulare doppelsträngige Sonden umfasst), wird der Fluoreszeinmarker durch beispielsweise einen Argonlaser angeregt und durch Betrachtung des Arrays beispielsweise durch ein konfokales Scannermikroskop nachgewiesen.
Sequenzierung durch Hybridisierung
Derzeitige Sequenzierungsmethoden verlassen sich in hohem Maße auf komplexe Vorgänge und erfordern einen beträchtlichen manuellen Aufwand. Die konventionelle DNA-Sequenzierungstechnologie ist eine arbeitsaufwendige Prozedur und erfordert die elektrophoretische Größentrennung von markierten DNA-Fragmenten. Ein alternativer Ansatz beinhaltet eine Hybridisierungsstrategie, welche mittels Bindung von Target-DNA an eine Oberfläche durchgeführt wird. Das Target wird mit jeweils einer aus einem Satz von Oligonukleotidsonden abgefragt (siehe die Anmeldung WO95/11995).
Ein bevorzugtes Verfahren zur Oligonukleotidsondenarraysynthese beinhaltet die Verwendung von Licht, um die Synthese der Oligonukleotidanalogasonden in miniaturisierten Arrays mit hoher Dichte zu steuern. Matrices von räumlich definierten Oligonukleotidanalogonsondenarrays wurden erzeugt. Die Möglichkeit, diese Arrays zur Identifizierung von komplementären Sequenzen zu verwenden, wurde durch Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden an die hergestellten Matrices gezeigt.
Oligonukleotidanalogonarrays werden beispielsweise verwendet, um die Sequenzspezifität von Nukleinsäuren oder von Protein-Nukleinsäure-Interaktionen zu untersuchen. Oligonukleotidanalogonarrays werden verwendet, um die thermodynamischen und kinetischen Regeln zu definieren, welche die Bildung und Stabilität von Oligonukleotid- und Oligonukleotidanalogonkomplexen bestimmen.
Oligonukleotidanalogasondenarrays und -bibliotheken
Die Verwendung von Oligonukleotidanaloga in Sondenarrays bietet einige Vorteile im Vergleich zu Standardoligonukleotidarrays. Beispielsweise, wie oben ausgeführt, haben bestimmte Oligonukleotidanaloga verstärkte Hybridisierungseigenschaften zu komplementären Nukleinsäuren im Vergleich zu Oligonukleotiden, die aus natürlich vorkommenden Nukleotiden hergestellt werden. Ein hauptsächlicher Vorteil von verstärkten Hybridisierungseigenschaften ist es, dass die Oligonukleotidanalogasonden gegebenenfalls kürzer als die entsprechenden Sonden sind, welche keine Nukleotidanaloga einschließen.
Standardmäßige Oligonukleotidsondenarrays benötigen typischerweise relativ lange Sonden (ca. 15 bis 25 Nukleotide), um eine starke Bindung an Zielnukleinsäuren zu erreichen. Die Verwendung solcher langer Sonden ist aus zwei Gründen nicht vorteilhaft. Erstens müssen umso mehr Syntheseschritte durchgeführt werden, um die Sonde und jeglichen die Sonde umfassenden Sondenarray herzustellen, je länger die Sonde ist. Dies steigert die Kosten für die Herstellung der Sonden und Arrays. Des Weiteren nimmt die Qualität der Sonden mit zunehmender Länge ab, da jeder Syntheseschritt in einer unter 100%igen Kopplung für jedes Nukleotid resultiert.
Zweitens bieten kurze Sonden eine bessere Mismatchdiskriminierung für die Hybridisierung an eine Zielnukleinsäure. Dies liegt daran, dass eine einzelne Basenfehlpaarung für eine Kurzsonde-Target-Hybridisierung weniger destabilisierend ist als eine einzelne Fehlpaarung für eine Langsonde-Target-Hybridisierung. Daher ist es schwieriger, eine einzelne Sonden-Target-Fehlpaarung zu unterscheiden, wenn die Sonde ein 20-mer ist, als wenn die Sonde ein 8-mer ist. Dementsprechend reduziert die Verwendung von kurzen Oligonukleotidanalogasonden die Kosten und erhöht die Mismatchdiskriminierung in Sondenarrays.
Die verstärkten Hybridisierungseigenschaften von Oligonukleotidanaloga ermöglichen auch die Herstellung von Oligonukleotidanalogasondenarrays, worin die Sonden in den Arrays eine beträchtliche Sekundärstruktur aufweisen. Beispielsweise werden die Oligonukleotidanalogasonden gegebenenfalls so konfiguriert, dass sie gänzlich oder teilweise doppelsträngig auf dem Array vorliegen. Die Sonden werden gegebenenfalls mit komplementären Nukleinsäuren komplexiert oder sie sind gegebenenfalls einmolekulare Oligonukleotide mit eigenkomplementären Bereichen. Bibliotheken von diversen doppelsträngigen Oligonukleotidanalogasonden werden beispielsweise in Screeninguntersuchungen verwendet, um die Bindungsaffinität von nukleinsäurebindenden Proteinen, Wirkstoffen oder Oligonukleotiden (beispielsweise zur Untersuchung der Triple-Helixbildung) zu bestimmen.
Es ist bekannt, dass bestimmte Oligonukleotidanaloga förderlich für die Bildung von ungewöhnlichen Sekundärstrukturen sind. Siehe Durland (1995) Bioconjugate Chem. 6: 278-282. Allgemeine Strategien zur Verwendung von einmolekularen doppelsträngigen Oligonukleotiden als Sonden und zur Bibliothekenerstellung sind in der Anmeldung SN 08/327,687 beschrieben und ähnliche Strategien können auf Oligonukleotidanalogasonden angewandt werden.
Im Allgemeinen wird ein fester Träger, welcher gegebenenfalls ein gebundenes Spacer-Molekül aufweist, am distalen Ende der Oligonukleotidanalogasonde befestigt. Die Sonde wird als eine einzelne Einheit befestigt oder wird Monomer für Monomer unter Verwendung von VLSIPS^TM oder oben beschriebenen mechanischen Trennungsverfahren auf dem Träger oder Spacer synthetisiert. Wo die Oligonukleotidanaloga-Arrays gänzlich doppelsträngig sind, werden zu den Sonden auf dem Array komplementäre Oligonukleotide (oder Oligonukleotidanaloga) an das Array hybridisiert.
In manchen Ausführungsformen werden andere Moleküle als Oligonukleotide, so wie Proteine, Färbemittel, Co-Faktoren, Linker und dergleichen in die Oligonukleotidanalogasonde integriert oder am distalen Ende des Oligomers gebunden, beispielsweise als ein Abstandsmolekül oder als Sonde oder Sondentarget. Flexible Linker werden gegebenenfalls verwendet, um komplementäre Abschnitte des Oligonukleotidanalogons zu separieren.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Vorbereitung von Bibliotheken von Oligonukleotidanaloga mit Ausbuchtungen oder Schlaufen (Loops) zusätzlich zu komplementären Bereichen vor. Bestimmte RNA-Ausbuchtungen werden oft von Proteinen erkannt (beispielsweise wird TAR-RNA vom TAT-Protein von HIV erkannt). Dementsprechend sind Bibliotheken von Oligonukleotidanaloga-Ausbuchtungen oder -Loops nützlich bei einer Reihe von diagnostischen Anwendungen. Die Ausbuchtung oder Loop kann im Oligonukleotidanalogon oder in Linkerbereichen vorhanden sein.
Einmolekulare Analogasonden können auf vielerlei Arten konfiguriert werden. In einer Ausführungsform umfassen die einmolekularen Sonden Linker, beispielsweise wo die Sonde gemäß der Formel Y-L¹-X¹-L²-X² angeordnet ist, in denen Y ein fester Träger ist, X¹ und X² ein Paar komplementärer Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga ist, L¹ eine Bindung oder ein Spacer ist und L² eine verbindende Gruppe von ausreichender Länge ist, so dass X¹ und X² ein doppelsträngiges Oligonukleotid bilden.
Jedes der Elemente der Sonde (L¹, X¹, L² und X²) umfasst ein Nukleotid- oder ein Oligonukleotidanalogon. Beispielsweise ist in einer Ausführungsform X¹ ein Oligonukleotidanalogon.
Die Oligonukleotidanalogasonden werden gegebenenfalls so angeordnet, dass sie eine Vielzahl von Resten präsentieren. Beispielsweise werden strukturelle Komponenten gegebenenfalls aus der Mitte einer konformationell beschränkten Oligonukleotidanalogasonde präsentiert. In diesen Ausführungsformen haben die Analogasonden im allgemeinen die Struktur -X¹¹-Z-X¹², wobei X¹¹ und X¹² komplementäre Oligonukleotidanaloga sind und Z ein in von der Oberfläche des Sondenarrays wegführender Richtung präsentiertes strukturelles Element ist. Z kann einschließen einen Agonisten oder Antagonisten für einen Zellmembranrezeptor, ein Toxin, Venom, virales Epitop, Hormon, Peptid, Enzym, einen Co-Faktor, Wirkstoff, ein Protein, einen Antikörper oder dergleichen.
Allgemeine Tilingstrategien zum Nachweis eines Polymorphismus in einem Target-Oligonukleotid
In diagnostischen Anwendungen werden Oligonukleotidanaloga-Arrays (beispielsweise Arrays auf Chips, Objektträgern oder Kügelchen) verwendet um zu bestimmen, ob es irgendwelche Unterschiede zwischen einer Referenzsequenz und einem Target-Oligonukleotid gibt, beispielsweise ob ein Individuum eine Mutation oder einen Polymorphismus in einem bekannten Gen besitzt. Wie bereits oben diskutiert, ist das Oligonukleotidtarget gegebenenfalls eine Nukleinsäure, so wie ein PCR-Amplicon, welche ein oder mehrere Nukleotidanaloga umfasst. In einer Ausführungsform werden Arrays so gestalten, dass sie Sonden enthalten, welche Komplementarität zu einer oder mehreren ausgewählten Referenzsequenzen aufweisen, deren Sequenz bekannt ist.
Die Arrays werden zum Auslesen einer Targetsequenz verwendet, welche entweder die Referenzsequenz selbst oder Varianten dieser Sequenz umfasst. Jedes beliebige Polynukleotid mit bekannter Sequenz wird als Referenzsequenz ausgewählt. Relevante Referenzsequenzen schließen die Sequenzen ein, von denen bekannt ist, dass sie Mutationen oder Polymorphismen einschließen, die mit phänotypischen Veränderungen von klinischer Bedeutung in menschlichen Patienten in Verbindung stehen. Beispielsweise wurden das CFTR-Gen und das p53-Gen in Menschen als der Ort einiger Mutationen identifiziert, welche zu Mukoviszidose bzw. Krebs führen.
Andere relevante Referenzsequenzen schließen die ein, welche zur Identifizierung von pathogenen Mikroorganismen dienen und/oder der Ort von Mutationen sind, durch welche solche Mikroorganismen Wirkstoffresistenz erlangen (beispielsweise das HIV-reverse-Transkriptase-Gen für HIV-Resistenz). Andere relevante Referenzsequenzen schließen Regionen ein, in denen bekannterweise polymorphe Variationen vorkommen (beispielsweise die D-Schlaufenregion der mitochondrialen DNA). Diese Referenzsequenzen sind ebenso nützlich für beispielsweise forensische, kladistische oder epidemiologische Untersuchungen.
Andere relevante Referenzsequenzen schließen die aus dem Genom pathogener Viren ein (beispielsweise Hepatitis (A, B oder C), Herpesvirus (beispielsweise VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, CMV und Epstein-Barr-Virus), Adenovirus, Influenzavirus, Flaviviren, Echovirus, Rhinovirus, Coxsackievirus, Cornovirus, RS-virus, Mumpsvirus, Rotavirus, Masernvirus, Rötelnvirus, Parvovirus, Vakzine-Virus, HTLV-Virus, Dengue-Virus, Papillomavirus, Molluscum-Virus, Poliovirus, Tollwutvirus, JC-Virus und arboviraler Enzephalitisvirus). Andere relevante Referenzsequenzen sind aus Genomen oder Episomen von pathogenen Bakterien, insbesondere aus Regionen, welche Wirkstoffresistenz vermitteln oder die phylogene Charakterisierung des Wirts gestatten (beispielsweise 16S rRNA oder entsprechende DNA).
Solche Bakterien schließen beispielsweise ein Chlamydien, Rickettsie-Bakterien, Mycobakterien, Staphylokokken, Teptokokken, Pneumonokokken, Meningokokken und Gonokokken, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, Diphtheria, Salmonella, Bacilli, Cholera, Tetanus, Botulismus, Anthrax, Plague, Leptospirose und Lymes-Krankheit-Bakterien.
Andere relevante Referenzsequenzen schließen die ein, in welchen Mutationen zu den folgenden autosomalen rezessiven Störungen führen: Sichelzellenanämie, β-Thalassämie, Phenylketonurie, Galactosämie, Wilsonsche Krankheit, Hämochromatose, schwere kombinierte Immuninsuffizienz, Alpha-1-Antitrypsin-Insuffizienz, Albinismus, Alkaptonurie, lysosomale Speicherkrankheiten und das Ehlers-Danlos-Syndrom. Andere relevante Referenzsequenz schließen die ein, in welchen Mutationen zu X-gebundenen rezessiven Störungen führen: Hämophilie, Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Agammaglobulimänie, Diabetes insipidus, Lesch-Nyhan-Syndrom, Muskeldystrophie, Wiskott-Aldrich-Syndrom, Fabrysche Krankheit und fragiles X-Syndrom.
Andere relevante Referenzsequenzen schließen die ein, in welchen Mutationen zu nachfolgenden autosomalen dominanten Störungen führen: familiäre Hypercholesterinämie, polyzystische Nierenkrankheit, Huntington-Krankheit, erbliche Spherocytose, Marfan-Syndrome, von-Willebrand-Krankheit, Neurofibromatose, tuberöse Hirnsklerose, erbliche hämorrhagische Telangiektasie, familiäre intestinale Polyposis, Ehlers-Danlos-Syndrom, myotonische Dystrophie, Muskeldystrophie, Osteogenesis imperfecta, akute periodische Porphyrie und von-Hippel-Lindau-Krankheit.
Obwohl ein Array von Oligonukleotidanalogasonden zur vereinfachten Datenverarbeitung üblicherweise in Reihen und Säulen ausgelegt wird, ist eine solche physikalische Anordnung von Sonden auf dem festen Substrat nicht essentiell wichtig. Vorausgesetzt, dass die räumliche Lage jeder Sonde in einem Array bekannt ist, werden die Daten von den Sonden gesammelt und verarbeitet, um die Sequenz eines Targets ungeachtet der physikalischen Anordnung der Sonden auf beispielsweise einem Chip zu liefern. Bei der Verarbeitung der Daten werden die Hybridisierungssignale von den jeweiligen Sonden zu einem beliebigen konzeptionellen Array, welcher für die nachfolgende Datenreduzierung gewünscht ist, zusammengesetzt, egal wie die physikalische Anordnung der Sonden auf dem Substrat auch sein mag.
In einer Ausführungsform stellt eine grundlegende Tilingstrategie ein Array von immobilisierten Sonden zur Analyse eines Targetoligonukleotids bereit, welches einen hohen Grad an Sequenzähnlichkeit zu einem oder mehreren ausgewählten Referenzoligonukleotiden zeigt (beispielsweise der Nachweis einer Punktmutation in einer Targetsequenz). Beispielsweise umfasst ein erster Sondensatz eine Vielzahl von Sonden, welche perfekte Komplementarität mit einem ausgewählten Referenzoligonukleotid aufweisen. Die perfekte Komplementarität liegt üblicherweise über die gesamte Länge der Sonde vor.
Sonden mit einem oder mehreren Segmenten von perfekter Komplementarität, welche von Führungs- oder Trailing-Sequenzen flankiert sind, welche die Komplementarität zur Referenzsequenz nicht aufweisen, können jedoch auch verwendet werden. Innerhalb eines komplementären Segments besitzt jede Sonde im ersten Sondensatz wenigstens eine Abfrageposition, die mit einem Nukleotid in der Referenzsequenz korrespondiert. Die Abfrageposition wird mit dem entsprechenden Nukleotid in der Referenzsequenz ausgerichtet, wenn die Sonde und die Referenzsequenz ausgerichtet werden, um die Komplementarität zwischen den beiden zu maximieren.
Wenn eine Sonde mehr als eine Abfrageposition aufweist, so korrespondiert eine jede mit einem entsprechenden Nukleotid in der Referenzsequenz. Die Identität einer Abfrageposition und eines entsprechenden Nukleotids in einer bestimmten Sonde im ersten Sondensatz kann nicht einfach durch eine Untersuchung der Sonde des ersten Sondensatzes bestimmt werden. Eine Abfrageposition und das korrespondierende Nukleotid werden von den komparativen Strukturen der Sonden des ersten Sondensatzes und entsprechenden Sonden aus zusätzlichen Sondensätzen definiert.
Für jede Sonde des ersten Sondensatzes gibt es für die Zwecke der vorliegenden Illustration eine Vielzahl von entsprechenden Sonden aus zusätzlichen Sondensätzen. Beispielsweise gibt es gegebenenfalls Sonden, welche mit jedem relevanten Nukleotid in der Referenzsequenz korrespondieren. Jede der korrespondierenden Sonden hat eine mit dem relevanten Nukleotid ausgerichtete Abfrageposition. Üblicherweise sind die Sonden der zusätzlichen Sondensätze mit der korrespondierenden Sonde des ersten Sondensatzes mit einer Ausnahme identisch. Diese Ausnahme besteht darin, dass an der Abfrageposition, welche in jeder der korrespondierenden Sonden der zusätzlichen Sondensätze an der selben Position vorkommt. Diese Position wird von einem anderen Nukleotid in den korrespondierenden Sondensätzen besetzt. Andere Tilingstrategien werden ebenfalls angewandt, je nach der zu erhaltenden Information.
Die Sonden sind Oligonukleotidanaloga, welche in der Lage sind, durch komplementäre Basenpaarung mit einer Zielnukleinsequenz zu hybridisieren. Komplementäre Basenpaarung schließt die sequenzspezifische Basenpaarung ein, welche beispielsweise Watson-Crick-Basenpaarung oder andere Arten der Basenpaarung, so wie Hoogsteen-Basenpaarung umfasst. Die Sonden werden durch eine beliebige geeignete Verbindung an einem Träger gebunden. 3'-Anhang ist gebräuchlicher, da diese Orientierung mit der bevorzugten bei der Festphasensynthese von Oligonukleotiden und Oligonukleotidanaloga (mit der Ausnahme von beispielsweise Analoga, welche kein Phosphatrückgrat besitzen, so wie Peptidnukleinsäuren) angewandten Chemie kompatibel ist.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden zu Zwecken der Veranschaulichung gegeben und sind in keiner Weise einschränkend zu verstehen. Eine Vielzahl von Parametern kann verändert oder modifiziert werden, um im Wesentlichen ähnliche Ergebnisse zu erzielen.
Ein Ansatz, um die Oligonukleotidhybridisierung zu verstärken, ist es, die thermale Stabilität (T_m) des zwischen dem Target und der Sonde gebildeten Duplexmoleküls zu erhöhen unter Verwendung von Oligonukleotidanaloga, von welchen bekannt ist, dass sie T_m's bei der Hybridisierung an DNA erhöhen. Verstärkte Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidanaloga ist in den nachstehenden Beispielen beschrieben, einschließlich der verstärkten Hybridisierung in Oligonukleotidarrays.
Beispiel 1: Lösungs-Oligonukleotid-Schmelz-T_n
Die T_m von 2'-O-Methyl-Oligonukleotidanaloga wurde mit der T_m für die entsprechenden DNA- und RNA-Sequenzen verglichen. Zusätzlich wurde ebenfalls die T_m von 2'-O-Methyl-Oligonukleotid:DNA, 2'-O-Methyl-Oligonukleotide:RNA und RNA:DNA-Duplexmolekülen in Lösung bestimmt. Die T_m wurde durch Veränderung der Probentemperatur und Beobachten des Absorptionsvermögens der Probenlösung bei 260 nm bestimmt. Die Oligonukleotidproben wurden in einer 0,1 M NaCl-Lösung mit einer Oligonukleotidkonzentration von 2 μMol aufgelöst.
Tabelle 1 fasst die Ergebnisse des Experiments zusammen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Hybridisierung von DNA in Lösung annähernd die gleiche T_m hat wie die Hybridisierung von DNA mit einem 2'-O-Methyl-substituierten Oligonukleotidanalogon. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die T_m für das 2'-O-Methyl-substituierte Oligonukleotidduplexmolekül höher ist als die für das korrespondierende RNA:2'-O-Methyl-substituierte Oligonukleotidduplexmolekül, was höher ist als die T_m für das korrespondierende DNA:DNA- oder RNA:DNA-Duplexmolekül.
Beispiel 2: Array-Hybridisierungsexperimente mit DNA-Chips und Oligonukleotidanaloga-Targets
Ein DNA-Sondenarray von variabler Länge auf einem Chip wurde entworfen, um einzelne Basenfehlpaarungen in den folgenden 3 korrespondierenden Sequenzen zu diskriminieren:
5'-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3' (SEQ ID NR: 6) (DNA-Target),
5'-CUGAACGGUAGCAUCUUGAC-3' (SEQ ID NR: 8) (RNA-Target) und
5'-CUGAACGGUAGCAUCUUGAC-3' (SEQ ID NR: 9) (2'-O-Methyl-Oligonukleotid-Target), und hergestellt mittels des VLSIPS^TM-Verfahrens. Der Chip wurde mit angrenzenden 12-meren und 8-meren entworfen, welche sich wie in Tabelle 2 gezeigt mit den 3 Zielsequenzen überschnitten.
Targetoligos wurden unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert. Die DNA- und 2'-O-Methyl-Oligonukleotidanaloga-Targetoligonukleotide wurden in sequentiellen Experimenten bei einer Konzentration von 10 nM in 5 × SSPE bei 20°C an den Chip hybridisiert. Intensitätsmessungen wurden an jeder Sondenposition in den 8-mer- und 12-mer-Arrays über die Zeit durchgeführt. Die Intensitätszunahmerate wurde dann für jede Sondenposition aufgetragen. Die Intensitätszunahmerate war für beide Targets in den 8-mer-Sondenarrays ähnlich, wohingegen die 12-mer-Sonden schneller an die DNA-Targetoligonukleotide hybridisierten.
Plots von Intensität gegen Sondenposition wurden für die RNA-, DNA- und 2'-O-Methyloligonukleotide generiert, um die Mismatchdiskriminierung zu ermitteln. Die 8-mer-Sonden zeigten eine ähnliche Mismatchdiskriminierung gegen alle Targets. Die 12-mer-Sonden zeigten die höchste Mismatchdiskriminierung für die DNA-Targets, gefolgt von dem 2'-O-Methyltarget, wobei das RNA-Target die schwächste Mismatchdiskriminierung zeigte.
Thermale Gleichgewichtsexperimente wurden durchgeführt, indem jedes der Targets für 90 Minuten mit Temperaturintervallen von 5°C an den Chip hybridisiert wurde. Der Chip wurde mit dem Target in 5 × SSPE bei einer Targetkonzentration von 10 nM mit dem Target hybridisiert. Intensitätsmessungen wurden am Ende der 90-minütigen Hybridisierung an jedem Temperaturpunkt durchgeführt, wie oben beschrieben. Alle Targets zeigten eine ähnliche Stabilität, mit minimaler Hybridisierung an die 8-mer-Sonden bei 30°C. Zusätzlich zeigten alle Targets eine ähnliche Stabilität bei der Hybridisierung an die 12-mer-Sonden. Daher hatte das 2'-O-Methyloligonukleotid-Target ähnliche Hybridisierungseigenschaften wie DNA- und RNA-Targets, wenn es gegen DNA-Sonden hybridisiert wurde.
Beispiel 3: 2'-O-Methyl-substituierte Oligonukleotidchips
DMT-geschützte DNA und 2'-O-Methyl-Phosphoramidite wurden verwendet, um 8-mer-Sondenarrays auf einem Glasobjektträger unter Verwendung des VLSIPS^TM-Verfahrens zu synthetisieren. Der sich daraus ergebende Chip wurde in getrennten Experimenten an DNA- und RNA-Targets hybridisiert. Die Zielsequenz, die Sequenzen der Sonden auf dem Chip und der allgemeine physikalische Aufbau des Chips sind in Tabelle 3 beschrieben.
Der Chip wurde in sukzessiven Experimenten an die RNA- und DNA-Targets hybridisiert. Die Hybridisierungsbedingungen waren 10 nM Target in 5 × SSPE. Der Chip und die Lösung wurden von 20°C auf 50°C erhitzt, wobei in 5°C-Intervallen eine Fluoreszenzmessung durchgeführt wurde, wie in WO95/11995 beschrieben. Der Chip und die Lösung wurden vor den Fluoreszenzmessungen bei jeder Temperatur für 90 Minuten gehalten.
Die Ergebnisse des Experiments zeigten, dass für die Hybridisierung an ein DNA-Target DNA-Sonden gleichwertig oder besser waren als 2'-O-Methyl-Oligonukleotidanalogasonden, dass jedoch die 2'-O-Methyl-Oligonukleotidanalogasonden eine drastisch bessere Hybridisierung and das RNA-Target zeigten als die DNA-Sonden. Zusätzlich zeigten die 2'-O-Methyl-Oligonukleotidanalogasonden eine im Vergleich zu den DNA-Sonden überlegene Mismatchdiskriminierung des RNA-Targets.
Die Differenz in der Fluoreszenzintensität zwischen den gepaarten und fehlgepaarten Analogasonden war größer als die Differenz zwischen den gepaarten und fehlgepaarten DNA-Sonden, was den Störabstand drastisch steigerte. 1 stellt die Ergebnisse graphisch dar (1A). (M) und (P) zeigen jeweils die fehlgepaarten und die perfekt gepaarten Sonden an. 1B veranschaulicht die Fluoreszenzintensität gegen den Ort auf einem Beispielchip für die verschiedenen Sonden bei 20°C unter Verwendung von RNA- und DNA-Targets.
Beispiel 4: Synthese von Oligonukleotidanaloga
Das Reagens MeNPoc-Cl-Gruppe reagiert nicht-selektiv mit sowohl den 5'- als auch dem 3'-Hydroxylen auf 2'-O-Methylnukleosidanaloga. Daher wurde das folgende Schutz-Entschützungs-Schema angewandt, um hohe Erträge von 5'-O-MeNPoc-2'-O-Methylribonukleosidanaloga zu erzeugen zur Anwendung bei der Oligonukleotidanalogasynthese.
Die schützende Gruppe DMT wurde zur 5'-O-Position des 2'-O-Methylribonukleosidanalogons in der Anwesenheit von Pyridin hinzugefügt. Das resultierende 5'-O-DMT-geschützte Analogon wurde mit TBDMS-Triflat in THF zur Reaktion gebracht, was in der Addition der TBDMS-Gruppe an das 3'-O-Ende des Analogons resultierte. Die 5'-DMT-Gruppe wurde dann mit TCAA entfernt, um eine freie OH-Gruppe an der 5'-Position des 2'-O-Methylribonukleosidanalogons zu ergeben, gefolgt von der Addition von MeNPoc-Cl in der Anwesenheit von Pyridin, um ein 5'-O-MeNPoc-3'-O-TBDMS-2'-O-Methylribonukleosidanalogon zu ergeben. Die TBDMS-Gruppe wurde dann durch Reaktion mit NaF entfernt und die 3'-OH-Gruppe wurde unter Verwendung von Standardtechniken phosphityliert.
Zwei andere potentielle Strategien resultierten nicht in hohen spezifischen Ausbeuten von 5'-O-MeNPoc-2'-O-Methylribonukleosid. In der ersten wurde ein weniger reaktives MeNPoc-Derivat synthetisiert durch Reaktion von MeNPoc-Cl mit N-Hydroxy-Succimid, um MeNPoc-NHS zu ergeben. Es wurde gefunden, dass diese weniger reaktive photospaltbare Gruppe (MeNPoc-NHS) ausschließlich mit dem 3'-Hydroxyl auf dem 2'-O-Methylribonukleosidanalogon reagiert. In der zweiten Strategie wurde ein Organotin-Schutzschema verwendet. Dibutyltinoxid wurde mit dem 2'-O-Methylribonukleosideanalogon zur Reaktion gebracht, gefolgt von einer Reaktion mit MeNPoc. Sowohl 5'-O-MeNPoc als auch 3'-O-MeNPoc-2'-O-Methylribonukleosidanaloga wurden erhalten.
Beispiel 5: Hybridisierung an mit 2-Amino-2'-Desoxyadenosin (D) substituierten Oligodesoxynukleotidsonden mit gemischter Sequenz
Um die Auswirkung einer 2-Amino-2'-Desoxyadenosin(D)-Substitution in einer heterogenen Sondensequenz zu testen, wurden zwei 4 × 4 Oligodesoxynukleotidarrays konstruiert unter Verwendung der VLSIPS^TM-Methodologie und 5'-O-MeNPOC-geschützten Desoxynukleosid-Phosphoramiditen. Jedes Array setzte sich aus dem folgenden Satz von auf der Sequenz (3')-CATCGTAGAA-(5') (SEQ ID NR:1) basierenden Sonden zusammen:

1. -(HEG)-(3')-CATN _IGTAGAA-(5') (SEQ ID NR:14)
2. -(HEG)-(3')-CATCN ₂TAGAA-(5') (SEQ ID NR:15)
3. -(HEG)-(3')-CATCGN ₃AGAA-(5') (SEQ ID NR:16)
4. -(HEG)-(3')-CATCGTN ₄GAA-(5') (SEQ ID NR:17)

N

Die relative Effizienz der Hybridisierung des Targets an die komplementären und Einzelbasen-Mismatch-Sonden wurde bestimmt, indem die durchschnittliche gebundene Oberflächenfluoreszenzintensität in den Bereichen des Arrays, welche die einzelnen Sondensequenzen enthielten, verglichen wurde. Die Ergebnisse (3) zeigen, dass eine 2-Amino-2'-Desoxyadenosin(D)-Substituierung in einer heterogenen Sondensequenz relativ neutral ist und unter Bedingungen, bei denen das Target im Überfluss vorliegt und die Sonden gesättigt sind, nur geringe Auswirkungen auf entweder die Signalintensität oder die Spezifität der DNA-DNA-Hybridisierung hat.
Beispiel 6: Hybridisierung an eine mit 2-Amino-2'-Desoxyadenosin (D) substituierte dA-Homopolymer-Oligodesoxynukleotidsonde
Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um die Hybridisierung von 2'-Desoxyadenosin, enthaltende Homopolymerarrays, mit 2-Amino-2'-Desoxyadenosin-Homopolymerarrays zu vergleichen. Das Experiment wurde mit zwei 11-mer-Oligodesoxynukleotidsonden enthaltenden Arrays durchgeführt. Zwei 11-mer-Oligodesoxynukleotid-Sondensequenzen wurden auf einem Chip unter Verwendung von 5'-O-MeNPOC-geschützten Nukleosidphosphoramiditen und der standardgemäßen VLSIPS^TM-Methodologie synthetisiert.
Die Sequenz der ersten Sonde war:
(HEG)-(3')- d(AAAAANAAAAA)-(5') (SEQ ID NR:19);
wobei HEG = Hexaethylenglylol-Linker und N entweder A,G,C oder T ist. Die zweite Sonde war identisch, außer das dA durch 2-Amino-2'-Desoxyadenosin (D) ersetzt wurde. Der Chip wurde mit einem 5'-Fluoreszein-markierten Oligodesoxynukleotidtarget, (5')-F1-d(TTTTTGTTTTT)-(3') (SEQ ID NR:20) hybridisiert, welches eine zu den Sondensequenzen mit N=C komplementäre Sequenz enthielt. Die Hybridisierungsbedingungen waren 10 nM Target in 5 × SSPE Puffer bei 22°C mit Bewegung.
Nach 15 Minuten wurde der Chip auf die Fließzelle eines konvokalen Laserscanner-Fluoreszenzmikroskops montiert, kurz mit 5 × SSPE Puffer bei 22°C (niedrige Stringenz) gespült und ein Oberflächenfluoreszenzbild wurde aufgenommen. Die Hybridisierung an den Chip wurde für weitere 5 Stunden fortgesetzt und ein Oberflächenfluoreszenzbild wurde erneut aufgenommen. Schließlich wurde der Chip kurz mit 0,5 × SSPE (hohe Stringenz) und danach mit mit 5 × SSPE gewaschen und erneut gescannt.
Die relative Effizienz der Hybridisierung des Targets an die komplementären und Einzelbasen-Mismatch-Sonden wurde bestimmt, indem die durchschnittliche gebundene Oberflächenfluoreszenzintensität in den Bereichen des Arrays, welche die einzelnen Sondensequenzen enthielten, verglichen wurde. Die Ergebnisse (4) zeigen, dass eine Substituierung von 2'-Desoxyadenosin mit 2-Amino-2'-Desoxyadenosin in einer d(A)_n-homopolymeren Sondensequenz zu einer signifikanten Verstärkung der spezifischen Hybridisierung an eine komplementäre Oligodesoxynukleotidsequenz führt.
Beispiel 7: Hybridisierung an mit 5-Propynyl-2'-Desoxyuridin (P) und 2-Amino-2'-Desoxyadenosin (D) substituierte alternierende A-T-Oligodesoxynukleotidesonden
Im Handel erhältliche 5'-DMT-geschützte 2'-Desoxynukleosid/-nukleosidanaloga-Phosphoramidite (Glen Research) wurden verwendet, um zwei Dekanukleotidsonden auf getrennten Bereichen auf einem Chip unter Verwendung des VLSIPS^TM-Verfahrens zu synthetisieren. In diesem Verfahren wird ein Glassubstrat anfangs mit einem terminal MeNPOC-geschützten Hexaethylenglykol-Linker modifiziert. Das Substrat wurde durch eine Maske dem Licht in einem Schachbrettmuster ausgesetzt, um die schützende Gruppe von dem Linker zu entfernen.
Die erste Sondensequenz wurde dann in dem belichteten Bereich unter Verwendung von DMT-Phosphoramiditen mit Säure-Deprotektionszyklen synthetisiert und die Sequenz wurde schließlich mit (MeO)₂PNiPr₂/Tetrazol "gecapped", gefolgt von einer Oxidation. Eine zweite Schachbrett-Belichtung in einem anderen (zuvor nicht belichteten) Bereich des Chips wurde dann durchgeführt und die zweite Sondensequenz wurde mittels des gleichen Verfahrens synthetisiert. Die Sequenz der ersten "Kontroll"-Sonde war:
-(HEG)-(3')-CGCGCCGCGC-(5') (SEQ ID NR:21); und die Sequenz der zweiten Sonde war eine der folgenden:

1. -(HEG)-(3')-d(ATATAATATA)-(5') (SEQ ID NR:22)
2. -(HEG)-(3')-d(APAPAAPAPA)-(5') (SEQ ID NR:23)
3. -(HEG)-(3')-d(DTDTDDTDTD)-(5') (SEQ ID NR:24)
4. -(HEG)-(3')-d(DPDPDDPDPD)-(5') (SEQ ID NR:25)

Die relative Effizienz der Hybridisierung des Targets an die A/T- und substituierten A/T-Sonden wurde bestimmt, indem die durchschnittliche gebundene Oberflächenfluoreszenzintensität in den Bereichen des Arrays, welche die A/T- oder substituierte Sonde enthielten, mit der an der G/C Kontrollsondensequenz gebundenen Fluoreszenzintensität verglichen wurde. Die Ergebnisse (5) zeigen, dass 5-Propynyl-dU- und 2-Amino-dA-Substituierung in einer A/T-reichen Sonde die Affinität eines Oligonukleotidanalogons für komplementäre Zielsequenzen signifikant verstärkt. Die unsubstituierte A/T-Sonde konnte nur 20% der Targetmenge wie die all-G/C-Sonde der gleichen Länge binden, während die D- & P-substituierte A/T-Sonde beinahe so viel (90%) wie die G/C-Sonde binden konnte. Darüber hinaus ist die Hybridisierungskinetik so beschaffen, dass, zu frühen Zeitpunkten, die Targetmenge, welche an die substituieren A/T-Sonden gebunden ist, größer ist als die Menge, welche an die all-G/C-Sonde gebunden ist.
Beispiel 8: Hybridisierung an mit 7-Deaza-2'-Desoxyguanosin (ddG) und 2'-Desoxyinosin (dI) substituierte Oligodesoxynukleotidsonden
Ein 16 × 64 Oligonukleotidarray wurde unter Verwendung der VLSIPS^TM-Methodologie mit 5'-O-MeNPOC-geschützten Nukleosidphosphoramiditen einschließlich der Analoga ddG und dI konstruiert. Das Array setzte sich aus dem Sondensatz zusammen, welcher durch die folgende Sequenz repräsentiert wird:
-(linker)-(3')- d(A T G T T G₁ G₂ G₃ G₄ G₅ C G G G T) -(5'); (SEQ ID NR: 28)
wobei die unterstrichenen Basen fixiert sind und die fünf internen Desoxyguanosine (G_1-5) mit G, ddG, dI und T in allen möglichen Kombinationen (1024 insgesamt) substituiert werden. Ein am 5'-Ende mit Fluoreszein markiertes komplementäres Oligonukleotidtarget:
(5')-F1-d(CAATACAACCCCCGCCCATCC)-(3')(SEQ ID NO:29),wurde an das Array hybridisiert. Die Hybridisierungsbedingungen waren: 5 nM Target in 6 × SSPE Puffer bei 22°C unter Schütteln. Nach 30 Minuten wurde der Chip auf die Fließzelle eines Affymetrix konfokalen Laserscanner-Fluoreszenzmikroskops montiert, einmal mit 0,25 × SSPE Puffer bei 22°C gespült und danach wurde ein Oberflächenfluoreszenzbild aufgenommen.
Die "Effizienz" der Targethybridisierung an jede Sonde des Arrays ist proportional zur gebundenen Oberflächenfluoreszenzintensität in dem Bereich des Chips, wo die Sonde synthetisiert wurde. Die relativen Werte für eine Untergruppe von Sonden (die, die nur dG- > ddG und dG- >dI-Substituierungen enthalten) sind in 6 gezeigt. Substituierungen von Guanosin mit 7-Deazaguanosin innerhalb der internen Reihe von fünf Gs führt zu einer signifikanten Verstärkung in der Fluoreszenzsignalintensität, welche die Hybridisierung misst. Desoxyinosin-Substituierungen verstärken ebenfalls die Hybridisierung an die Sonde, aber in einem geringeren Ausmaß. In diesem Beispiel wird die beste gesamte Verstärkung realisiert, wenn die dG-"Reihe" zu ~ 40-60% mit 7-Deaza-dG substituiert wird, wobei die Substituierungen gleichmäßig über die ganze Reihe verteilt sind (beispielsweise alternierendes dG/deaza-dG).
Beispiel 9: Synthese von 5'-MeNPOC-2'-Desoxyinosine-3'-(N,N-Diisopropyl-2-Cyanoethyl) Phosphoramidit
2'-Desoxyinosin (5,0 g, 20 mmol) wurde aufgelöst in 50 ml trockenem DMF und 100 ml trockenes Pyridin wurde hinzugegeben und dreimal verdampft, um die Lösung zu trocknen. Weitere 50 ml Pyridin wurden zugegeben, die Lösung wurde unter Argon auf –20°C abgekühlt und 13,8 g (50 mmol) MeNPOC-Chlorid in 20 ml trockenem DCM wurde dann tropfenweise unter Rühren über 60 Minuten zugegeben. Nach 60 Minuten wurde das Kältebad entfernt und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur bewegt. Pyridin und DCM wurden durch Verdampfen entfernt, 500 ml Ethylacetat wurden zugegeben und die Lösung wurde zweimal mit Wasser und dann mit Sole gewaschen (jeweils 200 ml).
Die wässrigen Waschflüssigkeiten wurden kombiniert und zweimal mit Ethylacetat zurück extrahiert und dann wurden alle organischen Schichten kombiniert, mit Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum verdampft. Das Produkt wurde aus DCM re-kristallisiert, um 5,0 g (50% Ausbeute) reines 5'-O-MeNPOC-2'-Desoxyinosin als einen gelben Feststoff (99% Reinheit, gemäß ¹H-NMR – und HPLC-Analyse) zu erhalten.
Das MeNPOC-Nukleosid (2,5 g, 5,1 mmol) wurde in 60 ml trockenem CH₃CN suspendiert und phosphityliert mit 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphorodiamidit (1,65 g/1,66 ml; 5,5 mmol) und 0,47 g (2,7 mmol) Diisopropylammoniumtetrazolid, gemäß dem veröffentlichten Verfahren laut Barone, et al. (Nucleic Acids Res. (1984) 12, 4051-61). Das rohe Phosphoramidit wurde mittels Blitzchromatographie auf Silicagel gereinigt (90:8:2 DCM-MeOH-Et₃N), zweimal co-verdampft mit anhydriertem Acetonitril und für ~24 Stunden im Vakuum getrocknet, um 2,8 g (80%) des reinen Produkts als gelben Feststoff (98% Reinheit, wie bestimmt durch ¹H/³¹P-NMR und HPLC) zu erhalten.
Beispiel 10: Synthese von 5'-MeNPOC-7-Deaza-2'-Desoxy(N2-Isobutyryl)-Guanosin-3'-(N,N-Diisopropyl-2-Cyanoethyl)-Phosphoramidit.
Das geschützte Nukleosid 7-Deaza-2'-Desoxy(N2- Isobutyryl)Guanosin (1,0 g, 3 mmol; Chemgenes Corp., Waltham, MA, USA) wurde durch dreimaliges co-Verdampfen mit 5 ml anhydriertem Pyridin getrocknet und aufgelöst in 5 ml trockenem Pyridin-DCM (75:25 nach Volumen).
Die Lösung wurde unter Argon auf –45°C abgekühlt (Trockeneis/CH₃CN) und eine Lösung von 0,9 g (3,3 mmol) MeNPOC-Cl in 2 ml trockenem DCM wurde dann tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach 30 Minuten wurde das Kältebad entfernt und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur bewegt. Die Lösungsmittel wurden verdampft und das Rohmaterial wurde mittels Blitzchromatographie auf Silicagel gereinigt (2,5%–5% MeOH in DCM), um 1,5 g (88% Ausbeute) 5'-MeNPOC-7-Deaza-2'-Desoxy(N2-Isobutyryl)Guanosin als einen gelben Schaum zu erhalten. Das Produkt war gemäß ¹H-NMR- und HPLC-Analyse zu 98% rein.
Das MeNPOC-Nukleosid (1,25 g, 2,2 mmol) wurde phosphityliert gemäß dem veröffentlichten Verfahren nach Barone, et al. (Nucleic Acids Res. (1984) 12, 4051-61). Das Rohprodukt wurde mittels Blitzchromatographie auf Silicagel gereinigt (60:35:5 Hexanethylacetat-Et₃N), zweimal co-verdampft mit anhydriertem Acetonitril und im Vakuum für ~24 Stunden getrocknet, um 1,3 g (75%) reines Produkt als gelben Feststoff (98% Reinheit, wie bestimmt durch ¹H/³¹P-NMR und HPLC) zu erhalten.
Beispiel 11: Synthese von 5'-MeNPOC-2,6-Bis(Phenoxyacetyl)-2,6-Diaminopurin-2'-Desoxyribosid-3'-(N,N-Diisopropyl-2-Cyanoethyl)Phosphoramidit.
Das geschützte Nukleosid 2,6-Bis(Phenoxyacetyl)-2,6-Diaminopurin-2'-Deoxyriboside (8 mmol, 4,2 g) wurde durch zweimaliges co-Verdampfen von anhydriertem Pyridin getrocknet, aufgelöst in 2:1 Pyridin/DCM (17,6 ml) und dann auf –40°C abgekühlt. MeNPOC-Chloride (8 mmol, 2,18 g) wurde aufgelöst in DCM (6,6 mls) und tropfenweise zum Reaktionsgemisch hinzugefügt. Die Reaktion wurde über Nacht unter langsamer Erwärmung auf Zimmertemperatur bewegt.
Nachdem die Reaktion über Nacht bewegt worden war, wurden weitere 2 mmol (0,6 g) in DCM (1,6 ml) bei –40°C hinzugefügt und für zusätzliche 6 Stunden oder so lange, bis kein unreagiertes Nukleosid mehr anwesend war, bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockenheit verdampft und der Rest wurde in Ethylacetat aufgelöst und zweimal mit Wasser gewaschen, gefolgt von einem Waschschritt mit gesättigtem Natriumchlorid. Die organische Schicht wurde mit MgSO₄ getrocknet und zu einem gelben Feststoff verdampft, welcher mittels Blitzchromatographie in DCM unter Verwendung eines Methanolgradienten gereinigt wurde, um das gewünschte Produkt in 51%iger Ausbeute zu eluieren.
Das 5'-MeNPOC-Nukleosid (4,5 mmol, 3,5 g) wurde phosphityliert gemäß dem veröffentlichten Verfahren laut Barone, et al. (Nucleic Acids Res. (1984) 12, 4051-61). Das Rohprodukt wurde mittels Blitzchromatographie auf Silicagel gereinigt (99:0,5:0,5 DCM-MeOH-Et₃N). Die zusammengefügten Anteile wurden zu einem Öl verdampft, wieder aufgelöst in einer Mindestmenge von DCM, durch die Addition von 800 ml eiskalten Hexans ausgefällt, gefiltert und dann im Vakuum für ~24 Stunden getrocknet.
Die gesamte Ausbeute betrug 56%, bei mehr als 96% Reinheit durch HPLC und ¹H/³¹P-NMR.
Beispiel 12: 5'-O-MeNPOC-geschützte Phosphoramidite zur Integration von 7-Deaza-2'-Desoxyguanosin und 2'-Desoxyinosin in VLSIPS^TM Oligonukleotidarrays
VLSIPS^TM-Oligonukleotidarrays, in welchen alle oder eine Untergruppe von allen Guanosinresten mit 7-Deaza-2'-Dedoxyguanosin und/oder 2'-Desoxyinosin substituiert sind, sind höchst wünschenswert. Das liegt daran, dass guaninreiche Bereiche von Nukleinsäuren sich zu mehrsträngigen Strukturen zusammenschließen. Beispielsweise schließen sich kurze Abschnitte von G-Resten in RNA und DNA für gewöhnlich zu tetrameren Strukturen zusammen (Zimmermann et al. (1975) J. Mol. Biol. 92: 181; Kim, J. (1991) Nature 351: 331; Sen et al. (1988) Nature 335: 364; und Sunquist et al. (1989) Nature 342: 825).
Dies stellt für auf Chiphybridisierung basierende Assays das Problem dar, dass solche Strukturen mit der normalen Hybridisierung zwischen komplementäre Nukleinsäuresequenzen konkurrieren oder in sie eingreifen können. Durch Substituierung des 7-Deaza-G-Analogons in G-reiche Nukleinsäuresequenzen, insbesondere an einer oder mehreren Stellen innerhalb einer Reihe von G-Resten, wird die Tendenz solcher Sonden, Strukturen höherer Ordnung zu bilden, jedoch unterdrückt, während in doppelsträngigen Strukturen im wesentlichen die gleiche Affinität und Sequenzspezifität beibehalten wird. Dies wurde ausgenutzt, um die Bandenkompression in Sequenzierungsgelen zu reduzieren (Mizusawa, et al. (1986) N.A.R. 14: 1319), um die Targethybridisierung an G-reiche Sondensequenzen in VLSIPS^TM-Arrays zu verbessern. Unter Verwendung von Inosin werden ähnliche Ergebnisse erzielt (siehe auch Sanger et al. (1977) P.N.A.S. 74: 5463).
Zur leichten Eingliederung von 7-Deaza-2'-Desoxyguanosin und 2'-Desoxyinosin in Oligonukleotidarrays unter Verwendung von VLSIPS^TM-Verfahren wird ein Nukleosid-Phosphoramidit konstruiert, welches die Analoga-Base mit einer 5'-O'-MeNPOC-schützenden Gruppe umfasst. Dieser Baustein wurde gemäß Schema I aus im Handel erhältlichen Nukleosiden vorbereitet. Diese Amidite bestehen die üblichen Tests für Kopplungseffizienz und Photolyserate. Schema I
Obwohl die vorangehende Erfindung zum Zweck der besseren Verständlichkeit durch Figuren und Beispiele detailliert beschrieben wurde, kann sie dennoch modifiziert werden, ohne dass dadurch vom Sinngehalt oder Umfang der angehängten Patentansprüche abgewichen würde. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung umfassend ein Array von Nukleinsäureanaloga, die mit einer Dichte von mehr als 100 Mitgliedern an bekannten Plätzen pro cm² an einem festen Träger gebunden sind, wobei die Nukleinsäureanaloga ausgewählt sind, Fehlpaarungsunterscheidung und Duplexstabilität bei Hybridisierung gegen eine Probe zu optimieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei entweder: (a) das Array von Nukleinsäureanaloga ein Nukleosidanalogon mit der Formel
umfasst, wobei: R¹ ausgewählt ist aus Wasserstoff, Methyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Halogen, Cyano und Azido; R² ausgewählt ist aus Wasserstoff, Methyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Halogen, Cyano und Azido; und Y ein heterozyklischer Rest ist; oder (b) das Array von Nukleinsäureanaloga ein Nukleosidanalogon mit der Formel
umfasst, wobei: R¹ ausgewählt ist aus Wasserstoff, Hydroxyl, Methyl, Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Allyloxy, Propargyloxy, Fluor, Chlor und Brom; R² ausgewählt ist aus Wasserstoff, Hydroxyl, Methyl, Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Allyloxy, Propargyloxy, Fluor, Chlor und Brom; und Y eine Base ist, ausgewählt aus Purinen, Purinanaloga, Pyrimidinen, Pyrimidinanaloga, 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Array von Nukleinsäureanaloga ein Nukleotid umfasst mit einer Base, ausgewählt aus 7-Deazaguanosin, 2-Aminopurin, 8-Aza-7-deazaguanosin, 1H-Purin und Hypoxanthin.
Verfahren zur Verbesserung der Hybridisierung einer Nukleinsäure an ein Nukleinsäure-Array mit einer Dichte von mehr als 100 Mitgliedern an bekannten Plätzen pro cm², umfassend das Einbauen einer Base, ausgewählt aus 7-Deazaguanosin, 2-Aminopurin, 8-Aza-7-deazaguanosin, 1H-Purin und Hypoxanthin, in die Nukleinsäuren des Arrays; gegebenenfalls wobei die Nukleinsäure ein Homopolymer ist.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein Zielmolekül komplementär zu einer Sonde ist, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Nukleinsäureanalogon-Arrays mit einer Dichte von mehr als 100 Mitgliedern an bekannten Plätzen pro cm² auf einem festen Träger, wobei die Nukleinsäureanaloga ausgewählt sind, Fehlpaarungsunterscheidung und Duplexstabilität bei Hybridisierung gegen eine Probe zu optimieren; (b) Exposition dieses Nukleinsäureanalogon-Arrays auf dem festen Träger gegenüber einer Zielnukleinsäure, wahlweise nach Amplifikation dieser Zielnukleinsäure; und (c) Bestimmung, ob ein Nukleinsäureanalogon-Mitglied des Nukleinsäureanalogon-Arrays an die Zielnukleinsäure bindet.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zielnukleinsäure ausgewählt ist aus genomischer DNA, cDNA, ungespleisster RNA, mRNA und rRNA.
Zusammensetzung umfassend ein Array von Nukleinsäuresonden hybridisiert gegen eine Zielnukleinsäure, welche Zielnukleinsäure ein Nukleotidanalogon umfasst, wobei die Nukleinsäureanaloga ausgewählt sind, Fehlpaarungsunterscheidung und Duplexstabilität bei Hybridisierung gegen eine Probe zu optimieren; und gegebenenfalls wobei die Zielnukleinsäure ein PCR Amplikon ist.
Verfahren zur Detektion einer Zielnukleinsäure, umfassend das enzymatische Kopieren der Zielnukleinsäure, unter Verwendung von Nukleotiden, die ein Nukleotidanalogon umfassen, wobei die Nukleinsäureanaloga ausgewählt sind, Fehlpaarungsunterscheidung und Duplexstabilität bei Hybridisierung gegen eine Probe zu optimieren; und dadurch ein Nukleinsäureanalogon-Amplikon produzierend, und Hybridisieren des Nukleinsäure-Amplikons gegen ein Nukleinsäure-Array.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Nukleinsäure-Array eine Nukleinsäureanalogon-Sonde umfasst, die komplementär zu dem Nukleinsäureanalogon-Amplikon ist.