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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Gen, das für das grün-fluoreszierende Protein der
Qualle Aequorea Victoria codiert, und Verfahren zum Exprimieren
desselben in hohen Leveln in eukaryotischen Zellen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Eine
Expression von eukaryotischen Genprodukten in Prokaryonten ist manchmal
durch das Vorliegen von Codons, die selten in E. coli verwendet werden,
beschränkt.
Eine Expression solcher Gene kann durch systemische Substitution
der endogenen Codons durch Codons, die in hoch exprimierten prokaryotischen
Genen überrepräsentiert
sind (Robinson et al., 1984), verstärkt werden. Es wird allgemein angenommen,
dass seltene Gene ein Stoppen des Ribosoms verursachen, was zu einem
Versagen bei der Vervollständigung
der nascenten Polypeptidkette und der Nicht-Kopplung von Transkription
und Translation führt.
Das mRNA-3'-Ende
des verzögerten
Ribosoms wird cellulären
Ribonucleasen ausgesetzt, die die Stabilität des Transkripts verringern.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Gen, das für das grün-fluoreszierende Protein der Qualle Aequorea Victoria
codiert, worin wenigstens 50% der nicht bevorzugten und weniger
bevorzugten Codons im natürlichen
Gen durch ein bevorzugtes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert,
ersetzt wurde/wurden, wobei die bevorzugten Codons aus der Gruppe
bestehend aus gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc, ctg,
aag, ccc, ttc, agc, acc, tac und gtg ausgewählt sind, die weniger bevorzugten
Codons aus der Gruppe bestehend aus ggg, att, ctc, tcc und gtc ausgewählt sind,
wobei die nicht bevorzugten Codon alle anderen Codons als die bevorzugten
Codons und die weniger bevorzugten Codons sind, wobei das Gen im Vergleich
zu dem natürlichen
Gen in einem in vitro-Säugerzellkultursystem
unter identischen Bedingungen eine verstärkte Expression des grün-fluoreszierenden
Proteins in einer Säugerwirtszelle
erlaubt.
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Bevorzugte
Codons sind: Ala (gcc); Arg (cgc); Asn (aac); Asp (gac); Cys (tgc);
Gln (cag); Gly (ggc); His (cac); Ile (atc); Leu (ctg); Lys (aag);
Pro (ccc); Phe (ttc); Ser (agc); Thr (acc); Tyr (tac); und Val (gtg).
Weniger bevorzugte Codons sind: Gly (ggg); Ile (att); Leu (ctc);
Ser (tcc); Val (gtc). Alle Codons, die nicht mit der Beschreibung
der bevorzugten Codons oder weniger bevorzugten Codons übereinstimmen, sind
nicht-bevorzugte Codons. Im Allgemeinen wird der Präferenzgrad
eines besonderen Codons durch die Prävalenz des Codons in hoch exprimierten
humanen Genen angegeben, wie es in Tabelle 1 unter der Überschrift "Hoch" angeführt ist.
Beispielsweise stellt "atc" 77% der Ile-Codons
in hoch exprimierten Säugergenen
dar und ist das bevorzugte Ile-Codon; "att" stellt 18% der Ile-Codons
in hoch exprimierten Säugergenen
dar und ist das weniger bevorzugter Ile-Codon. Die Sequenz "ata" stellt nur 5% der
Ile-Codons in hoch exprimierten humanen Genen dar und ist ein nicht-bevorzugtes
Codons. Ersetzen eines Codons durch ein anderes Codon, das in hoch
exprimierten humanen Genen stärker
verbreitet ist, wird im Allgemeinen die Expression des Gens in Säugerzellen verstärkten. Dementsprechend
umfasst die Erfindung Ersetzen einer weniger bevorzugten Codons durch
ein bevorzugtes Codon wie auch Ersetzen eines nicht-bevorzugten
Codons durch ein bevorzugtes oder weniger bevorzugtes Codon.
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Die
Erfindung bezieht sich außerdem
auf ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Gens, umfassend:
- (a) Identifizieren nicht-bevorzugter und weniger bevorzugter
Codons in dem natürlichen
Gen, das für
das grün-fluoreszierende Protein
der Qualle Aequorea Victoria codiert, und
- (b) Ersetzen von wenigstens 50% der nicht-bevorzugten und weniger
bevorzugten Codons durch ein bevorzugtes Codon, das für dieselbe
Aminosäure
wie das ersetzte Codon codiert, wobei die bevorzugten Codons aus
der Gruppe, bestehend aus gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac,
atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac und gtg ausgewählt sind,
die weniger bevorzugten Codons aus der Gruppe, bestehend aus ggg,
att, ctc, tcc und gtc, ausgewählt
sind, die nicht-bevorzugten Codons alle anderen Codons als die bevorzugten
und die weniger bevorzugten Codons sind.
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Mit "Protein, das normalerweise
in einer Säugerzelle
exprimiert wird" ist
ein Protein gemeint, das unter natürlichen Bedingungen in einem
Säuger exprimiert
wird. Der Ausdruck umfasst Gene im Säugergenom, z.B. Faktor VIII,
Faktor IX, Interleukine und andere Proteine. Der Ausdruck umfasst
auch Gene, die in einer Säugerzelle
unter Krankheitsbedingungen exprimiert werden, z.B. Onkogene, wie auch
Gene, die durch ein Virus codiert werden (einschließlich eines
Retrovirus), die in Säugerzellen nach
Infektion exprimiert werden. Mit "Protein, das normalerweise in einer
eukaryotischen Zelle exprimiert wird", ist ein Protein gemeint, das unter
natürlichen
Bedingungen in einem Eukaryonten exprimiert wird. Der Ausdruck umfasst
auch Gene, die unter Krankheitsbedingungen in einer Säugerzelle
exprimiert werden.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist das Gen fähig,
das Säugerprotein
oder das eukaryotische Protein in einer Konzentration zu exprimieren, die
wenigstens 110%, 150%, 200%, 500%, 1.000%, 5.000% oder 10.000% derjenigen
ist, die durch das natürliche
Gen in einem in vitro-Säugerzellkultursystem
unter identischen Bedingungen exprimiert wird (d.h. derselbe Zelltyp,
dieselben Kulturbedingungen, derselbe Expressionsvektor).
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Geeignete
Zellkultursysteme zur Messung der Expression des Gens und des entsprechenden natürlichen
Gens werden unten beschrieben. Andere geeignete Expressionssysteme,
die Säugerzellen verwenden,
sind dem Fachmann gut bekannt und werden z.B. in den unten genannten
Referenzstandardwerken der Molekularbiologie beschrieben. Vektoren,
die zum Exprimieren der synthetischen und natürlichen Gene geeignet sind,
werden unten und in den unten beschriebenen Standardreferenzbüchern beschrieben.
Mit "Expression" ist Proteinexpression gemeint.
Expression kann unter Verwendung eines für das interessierende Protein
spezifischen Antikörpers
gemessen werden. Solche Antikörper
und solche Messtechniken sind dem Fachmann gut bekannt. Mit "natürliches
Gen" ist die Gensequenz
(einschließlich
natürlich
auftretender Allelvarianten) gemeint, die natürlicherweise für das Protein
codiert.
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In
anderen bevorzugten Ausführungsformen sind
wenigstens 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% der Codons
im natürlichen
Gen nicht-bevorzugte Codons.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Gens bereit,
das für
ein Protein codiert, welches normalerweise durch eine Säugerzelle oder
eine andere eukaryotische Zelle exprimiert wird. Das Verfahren umfasst
Identifizieren nicht-bevorzugter und weniger bevorzugter Codons
im natürlichen Gen,
das für
das Protein codiert, und Ersetzen eines oder mehrerer der nicht-bevorzugten
und weniger bevorzugten Codons mit einem bevorzugten Codons, das
für dieselbe
Aminosäure
wie das ersetzte Codon codiert.
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Unter
bestimmten Umständen
(z.B. um die Einführung
einer Restriktionsstelle zu ermöglichen) kann
es wünschenswert
sein, ein nicht-bevorzugtes Codon durch ein weniger bevorzugtes
Codon anstatt durch ein bevorzugtes Codon zu ersetzen.
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Es
ist nicht erforderlich, alle weniger bevorzugten oder nicht bevorzugten
Codons durch bevorzugte Codons zu ersetzen. Eine verstärkte Expression
kann selbst durch einen teilweisen Ersatz erreicht werden. Unter
bestimmten Umständen
kann es wünschenswert
sein, nicht-bevorzugte Codons nur teilweise durch bevorzugte oder
weniger bevorzugte Codons zu ersetzen, um einen Zwischenlevel der
Expression zu erreichen.
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In
anderen bevorzugten Ausführungsformen stellt
die Erfindung Vektoren (einschließlich Expressionsvektoren)
bereit, die ein oder mehrere der synthetische Gene umfassen.
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Mit "Vektor" ist ein DNA-Molekül gemeint, das
z.B. von einem Plasmid, Bakteriophagen oder Säuger- oder Insekten-Virus abgeleitet
ist, in das DNA-Fragmente insertiert oder kloniert sein können. Ein
Vektor wird eine oder mehrere einmal vorkommende Restriktionsstellen
enthalten und kann zur autonomen Replikation in einem definierten
Wirts- oder Vehikelorganismus fähig
sein, so dass die klonierte Sequenz reproduzierbar ist. Demnach
ist mit "Expressionsvektor" ein beliebiges autonomes
Element gemeint, das fähig
ist, die Synthese eines Proteins zu steuern. Solche DNA-Expressionsvektoren
umfassen Säugerplasmide
und Viren.
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Die
Erfindung stellt auch Genfragmente bereit, die für einen gewünschten Teils des Proteins
codieren. Solche synthetischen Genfragmente sind den synthetischen
Genen der Erfindung ähnlich,
außer dass
sie nur für
einen Teil des Proteins codieren. Solche Genfragmente codieren vorzugsweise
wenigstens 50, 100, 150 oder 500 benachbarte Aminosäuren des
Proteins.
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Beim
Konstruieren der Gene der Erfindung kann es wünschenswert sein, CpG-Sequenzen
zu vermeiden, da diese Sequenzen ein Gen zur stummen bzw. Gen-"Silencing" verursachen können.
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Die
Gene der Erfindung können
in die Zellen eines lebenden Organismus eingeführt werden. Beispielsweise
können
Vektoren (virale oder nicht-virale) verwendet werden, um ein Gen
zur Gentherapie in Zellen eines lebenden Organismus einzuführen.
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Umgekehrt
kann es wünschenswert
sein, bevorzugte Codons in einem natürlich auftretenden Gen durch
weniger bevorzugte Codons als Mittel zur Senkung der Expression
zu ersetzen.
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Standard-Literaturwerke,
die die allgemeinen Prinzipien der DNA-Rekombinationstechniken beschreiben,
umfassen:
J. D. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, Band
I und II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Herausgeber,
Menlo Park, CA (1987); J. E. Darnell et al., Molecular Cell Biology,
Scientific American Books, Inc., Herausgeber, New York, N. Y. (1986);
R. W. Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction
to Genetic Engineering, 2. Ausgabe, University of California Press,
Herausgeber, Berkeley, CA (1981); T. Maniatis et al., Molecular
Cloning: A Laboratorv Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory,
Herausgeber, Cold Spring Harbor, NY (1989); und Current Protocols
in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1992).
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Detaillierte Beschreibung
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Beschreibung
der Zeichnungen
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WO
86/07595 offenbart einen im Wesentlichen reinen basischen fibroplasten
Wachstumsfaktor (bFGF), ein Polypeptid mit 146 Aminosäureresten. Die
Aminosäurerestsequenz
von bFGF wird offenbart ebenso wie eine DNA-Kette, die für das Polypeptid codiert.
Durch geeignetes Insertieren einer synthetisierten DNA-Kette in
einen Klonierungsvektor und unter Verwendung des Klonierungsvektors
zum Transformieren von Zellen kann synthetischer bFGF aus transformierten
Zelllinien, sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen, erhalten
werden.
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In
US-Patent Nr. 5,270,171 wird beschrieben, dass ein Krebserkennungsfaktor
(SCM-Faktor), der bei der Durchführung
des Tests auf Strukturierung der cytoplasmatischen Matrix (SCM)
einsetzbar ist, isoliert wurde, zur wesentlichen Homogenität gereinigt
und charakterisiert wurde.
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WO
95/07463 offenbart eine Zelle, die ein DNA-Molekül umfasst, das ein regulatorisches
Element aus einem anderen Gen als einem Gen, das für ein grün-fluoreszierendes
Protein codiert, funktionell an eine DNA-Sequenz, die für das grün-fluoreszierende Protein
codiert, verknüpft
enthält.
Diese Erfindung stellt auch lebende Organismen bereit, die die oben
beschriebene Zelle umfassen. Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren
zum Selektieren von Zellen bereit, die ein Protein von Interesse
codieren, wobei das Verfahren umfasst:
a) Einführen eines
DNAI-Moleküls
in die Zellen, das eine DNA-Sequenz
hat, die für
das Protein von Interesse codiert, und ein DNAII-Molekül, das eine DNA-Sequenz
hat, die für
ein grün-fluoreszierendes Protein
codiert; b) Kultivieren der eingeführten Zellen unter Bedingungen,
die eine Expression des grün-fluoreszierenden
Proteins und des Proteins von Interesse erlauben, und c) Selektieren
der kultivierten Zellen, die grün-fluoreszierendes
Protein exprimieren, dadurch Selektieren von Zellen, die das Protein
von Interesse exprimieren. Schließlich stellt die vorliegende
Erfindung verschiedene Verwendungen von grün-fluoreszierendem Protein
bereit.
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Coulombe
und Skup (Gene 46, 89–95,
1986) haben ein rekombinantes Interferon-(IFN)-Gen konstruiert,
dessen codierende Region ein chemisch-synthetisiertes humanes (HU)IFN-α1-Gen
ist, das für
dasselbe Protein wie sein natürliches
Gegenstück
codiert, obgleich es wichtige Modifikationen besitzt. Diese Modifikationen
wurden eingeführt
um (1) die Codonverwendung zu verändern, (2) die Integrität von wiederholten
und komplementären
Oligodesoxynucleotiden in der codierenden Region zu zerstören, (3)
ein Intron einzuführen,
(4) andere Sequenzen für
die IFN-spezifischen-3'-
und -5'-flankierenden
Sequenzen einzusetzen und (5) die Leadersequenz (die für das Signalpeptid
codiert) zu entfernen. Coulombe und Skup berichten außerdem über die
Transfektion und Isolierung von murinen Zellen, die Insertionen mit
niedriger Kopienzahl des rekombinanten Gens enthalten. Diese Linien
halten einen hohen konstanten Level an biologisch aktivem HuIFN-α im Cytoplasma
aufrecht, das aus mRNAs von Mr produziert wird,
das für
korrekt prozessierte Transkripte erwartet wird. Diese Resultate
zeigen direkt, dass die Leadersequenz für eine Sekretion von IFN-Proteinen
essentiell ist. Sie sprechen sich auch gegen eine wesentliche Rolle
der besonderen Merkmale der transkribierten Sequenz des natürlichen
HuIFN-α1-Gens bei der Regulierung seiner Expression
aus.
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Haseloff
und Amos (Trends in Genetics, Band 11, Nr. 8, 1. August 1995, S.
328–329)
berichten über
die Verwendung von GFP in Pflanzen.
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In
WO 96/27675 wird eine DNA-Sequenz offenbart, die für grün-fluoreszierendes
Protein (GFP) codiert, wobei die Sequenz bezüglich der Wildtypsequenz so
modifiziert ist, dass sie eine effizientere Expression eines funktionellen
GFP-Polypeptids
in einer Pflanzenzelle zulässt.
Offenbart wird auch ein modifiziertes GFP-Polypeptid, das eine Aminosäuresubstitution
bezüglich
der Wildtypproteinsequenz umfasst, welches nützliche Charakteristika aufweist, wenn
es in vielen verschiedenen Wirtszelltypen exprimiert wird.
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WO
96/09378 liefert ein synthetisches Gen, das für ein Protein codiert, welches
normalerweise in Säugerzellen
exprimiert wird, worin wenigstens ein nicht-bevorzugtes oder weniger
bevorzugtes Codon im natürlichen
Gen, das für
das Säugerprotein
codiert, durch ein bevorzugtes Codon ersetzt wurde, welches für dieselbe
Aminosäure
codiert.
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1,
Abbildung A ist eine Fotografie von COS-Zellen, die nur mit einem
Vektor transfiziert sind und keine GFP-Fluoreszenz zeigen. 1,
Abbildung B ist eine Fotografie von COS-Zellen, die mit einem CDM7-Expressionsplasmid,
das für
native GFP codiert, das so verändert
ist, dass es eine Consensus-Translationsinitiationssequenz enthält, transfiziert
sind. 1, Abbildung C ist eine Fotografie von COS-Zellen,
die mit einem Expressionsplasmid transfiziert sind, das dieselben
flankierenden Sequenzen und den Initiationsconsensus wie in 1, Abbildung
B, hat, aber eine Codon-optimierte Gensequenz trägt. 1, Abbildung
D ist eine Fotografie von COS-Zellen, die mit einem Expressionsplasmid wie
in 1, Abbildung C, transfiziert sind, das aber als
Rest 65 ein Thr anstelle von Ser trägt.
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2 zeigt
eine DNA-Sequenz, die für
GFP der Qualle Aequorea Victoria codiert.
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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Polymerasekettenreaktion
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Kurz
ausgedrückt, überlappende
15- bis 25-mer-Oligonucleotide,
die an beiden Enden aneinander lagern, wurden verwendet, um die
langen Oligonucleotide durch Polymerasekettenreaktion (PCR) zu amplifizieren.
Typische PCR-Bedingungen waren: 35 Zyklen, 55°C-Annealing-Temperatur, 0,2
s Extensionszeit. PCR-Produkte wurden gelgereinigt, mit Phenol extrahiert
und in einer anschließenden
PCR verwendet, um längere
Fragmente zu erzeugen, die aus zwei benachbarten kleinen Fragmenten
bestehen. Diese längeren
Fragmente wurden in ein von CDM7-abgeleitetes Plasmid, das eine
Leadersequenz des CD5-Oberflächenmoleküls, gefolgt
von einem Nhel/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1-Polylinker enthält, kloniert.
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Die
folgenden Lösungen
wurden in diesen Reaktionen verwendet:
10 × PCR-Puffer (500 mM KCl, 100
mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl2, jeweils
2 mM dNTP). Der Endpuffer wurde mit 10% DMSO ergänzt, um die Genauigkeit der
Taq-Polymerase zu erhöhen.
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DNA-Herstellung
in kleinem Maßstab
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Transformierte
Bakterien wurden in 3 ml-LB-Kulturen für mehr als 6 Stunden oder über Nacht
wachsen gelassen. Etwa 1,5 ml jeder Kultur wurden in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegossen,
für 20
Sekunden zentrifugiert, um die Zellen zu pelletisieren, dann wurde
in 200 μl
Lösung
I resuspendiert. Anschließend
wurden 400 μl
Lösung
II und 300 μl
Lösung
III zugesetzt. Die Mikrozentrifugenröhrchen wurden verkappt, gemischt
und für > 30 s zentrifugiert.
Die Überstände wurden
in frische Röhrchen überführt und
mit Phenol extrahiert. DNA wurde durch Füllen der Röhrchen mit Isopropanol, Mischen und
Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge für > 2 min präzipitiert. Die Pellets wurden
in 70% Ethanol gespült
und in 50 μl
dH2O, das 10 μl RNAse A enthielt, resuspendiert.
Die folgenden Medien und Lösungen
wurden in diesen Verfahren verwendet: LB-Medium (1,0% NaCl, 0,5%
Hefeextrakt, 1,0% Trypton); Lösung
I (10 mM EDTA, pH 8,0); Lösung
II (0,2 M NaOH, 1,0% SDS); Lösung
III (2,5 M KOAc, 2,5 M Eisessig); Phenol (pH auf 6,0 eingestellt, überschichtet
mit TE); TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, pH 8,0).
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DNA-Herstellung
in grobem Maßstab
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Ein-Liter-Kulturen
von transformierten Bakterien wurden 24 bis 36 Stunden (MC1061p3,
transformiert mit pCDM-Derivaten) oder 12 bis 16 Stunden (MC1061,
transformiert mit pUC-Derivaten)
bei 37°C entweder
in M9-bakteriellem Medium (pCDM-Derivate)
oder LB (pUC-Derivate) wachsen gelassen. Bakterien wurden in 1-Liter-Flaschen
unter Verwendung einer Beckman J6-Zentrifuge mit 4200 U/min für 20 min
nach unten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 40 ml Lösung I resuspendiert.
Anschließend
wurden 80 ml Lösung
II und 40 ml Lösung
III zugesetzt und die Flaschen wurden halbkräftig geschüttelt, bis sich Klumpen mit
einer Größe von 2
bis 3 mm entwickelten. Die Flasche wurde mit 4.200 U/min 5 min zentrifugiert,
und der Überstand
wurde durch Gaze in eine 250 ml-Flasche gegossen. Isopropanol wurde
zu dem oberen Teil gegeben, und die Flasche wurde mit 4200 U/min
für 10
min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 4,1 ml Lösung I resuspendiert und zu
4,5 g Cäsiumchlorid,
0,3 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid und 0,1 ml 1% Triton X100-Lösung gegeben.
Die Röhrchen wurden
in einer Beckman J2-Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit 10.000 U/min
5 min zentrifugiert. Der Überstand
wurde in Beckman Quick Seal-Ultrazentrifugenröhrchen überführt, die dann dicht verschlossen
wurden, und es wurde in einer Beckman-Ultrazentrifuge unter Verwendung
eines NVT90-Festwinkelrotors mit 80.000 U/min für > 2,5 h zentrifugiert. Die Bande wurde
durch sichtbares Licht unter Verwendung einer 1 ml-Spritze und einer
Nadel Nr. 2 extrahiert. Es wurde ein gleiches Volumen an dH2O zu dem extrahierten Material gegeben.
DNA wurde einmal mit n-Butanol, das mit 1 M Natriumchlorid gesättigt war,
extrahiert, worauf Zusatz eines gleichen Volumens an 10 M Ammoniumacetat/1
mM EDTA folgte. Das Material wurde in ein 13 ml Schnappröhrchen gegossen,
welches dann bis oben mit absolutem Ethanol gefüllt wurde, es wurde gemischt
und in einer Beckman J2-Zentrifuge mit 10.000 U/min für 10 min zentrifugiert.
Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gespült und in 0,5 bis 1 ml H2O resuspendiert. Die DNA-Konzentration wurde
bestimmt, indem die optische Dichte bei 260 nm in einer Verdünnung von 1:200
(1 OD260 = 50 μg/ml) gemessen wurde.
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Die
folgenden Medien und Puffer wurden in diesen Verfahren eingesetzt:
M9-bakterielles Medium (10 g M9-Salze, 10 g Casaminosäuren (hydrolysiert),
10 ml M9-Zusätze,
7,5 μg/ml
Tetracyclin (500 μl einer
15 mg/ml-Stammlösung),
12,5 μg/ml
Ampicillin (125 μl
einer 10 mg/ml-Stammlösung);
M9-Zusätze (10
mM CaCl2, 100 mM MgSO4,
200 μg/ml
Thiamin, 70 Glycerin); LB-Medium (1,0% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, 1,0%
Trypton); Lösung
I (10 mM EDTA, pH 8,0); Lösung
II (0,2 M NaOH, 1,0% SDS), Lösung
III (2,5 M KOAc, 2,5 M HOAc).
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Sequenzierung
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Gene
wurden durch das Sanger-Didesoxynucleotid-Verfahren sequenziert.
Kurz ausgedrückt, 20
bis 50 μg
doppelsträngige
Plasmid-DNA wurden in 0,5 M NaOH für 5 min denaturiert. Anschließend wurde
die DNA mit 1/10 Volumen Natriumacetat (pH 5,2) und 2 Volumina Ethanol
präzipitiert
und 5 min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen
und in einer Konzentration von 1 μg/ml
resuspendiert. Die Annealing-Reaktion wurde mit 4 μg Matrizen-DNA
und 40 ng Primer in 1 × Annealing-Puffer in
einem Endvolumen von 10 μl
durchgeführt.
Die Reaktion wurde auf 65°C
erwärmt
und langsam auf 37°C
abgekühlt.
In ein getrenntes Röhrchen
wurden 1 μl
0,1 M DTT, 2 μl
Markierungsmischung, 0,75 μl dH2O, 1 μl
[35S] dATP (10 μCi) und 0,25 μl SequenaseTM (12 E/μl)
für jede Reaktion
gegeben. 5 μl
dieses Gemisches wurden zu jedem Röhrchen mit annealter Primer-Matrize
gegeben, und es wurde für
5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für jede Markierungsreaktion
wurden 2,5 μl
jedes der vier Terminationsgemische auf eine Terasaki-Platte gegeben
und bei 37°C vorerwärmt. Am
Ende des Inkubationszeitraums wurden 3,5 μl Markierungsreaktion zu jedem
der vier Terminationsgemische gegeben. Nach 5 min wurden 4 μl Stop-Lösung zu jeder Reaktion gegeben
und die Terasaki-Platte wurde für
10 min in einem Ofen bei 80°C
inkubiert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden an 5% Denaturierungspolyacrylamidgel
laufen gelassen. Eine Acrylamidlösung
wurde hergestellt, indem 200 ml 10 × TBE-Puffer und 957 ml dH2O zu 100 Acrylamid:Bisacrylamid (29:1) gegeben
wurden. 5% Polyacrylamid-46% Harnstoff und 1 × TBE-Gel wurden hergestellt,
indem 38 ml Acrylamidlösung und
28 g Harnstoff kombiniert wurden. Die Polymerisation wurde durch
Zusatz von 400 μl
10% Ammoniumperoxodisulfat und 60 μl TEMED initiiert. Gele wurden
unter Verwendung von silanisierten Glasplatten und Haifischzahnkämmen gegossen
und in 1 × TBE-Puffer
bei 60 bis 100 W für
2 bis 4 h (in Abhängigkeit
von der abzulesenden Region) laufen gelassen. Die Gele wurden auf
Whatman-Blottingpapier transferiert,
bei 80°C
für etwa
1 h getrocknet und bei Raumtemperatur auf Röntgenfilm belichtet. Die typische
Belichtungszeit war 12 h. Die folgenden Lösungen wurden in diesen Verfahren
verwendet: 5 × Annealing-Puffer
(200 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2,
250 mM NaCl); Markierungsgemisch (jeweils 7,5 μM dCTP, dGTP und dTTP); Terminationsgemische
(jeweils 80 μM
dNTP, 50 mM NaCl, 8 μM
ddNTP (jeweils)); Stop-Lösung
(95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenol blau, 0,05% Xylencyanol);
5 × TBE
(0,9 M Tris-Borat, 20 mM EDTA); Polyacrylamidlösung (96,7 g Polyacrylamid,
3,3 g Bisacrylamid, 200 ml 1 × TBE,
957 ml dH2O.
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RNA-Isolierung
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Cytoplasmische
RNA wurde aus Calciumphosphat-transfektierten 293T-Zellen 36 Stunden nach
Transfektion und aus mit Vaccinia infizierten Hela-Zellen 16 h nach
Infektion im Wesentlichen wie von Gilman beschrieben (Gilman Preparation
of cytoplasmic RNA from tissue culture cells. In Current Protocols
in Molecular Biology, Ausubel et al., Herausg., Wiley & Sons, New York,
1992). Kurz ausgedrückt, Zellen
wurden in 400 μl
Lysepuffer lysiert, die Kerne wurden herauszentrifugiert und SDS
und Proteinase K wurden zu 0,2% bzw. 0,2 mg/ml zugesetzt. Die cytoplasmischen
Extrakte wurden bei 37°C
für 20
min inkubiert, 2 × mit
Phenol/Chloroform extrahiert und präzipitiert. Die RNA wurde in
100 μl Puffer
I gelöst und
bei 37°C
für 20
min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl Stop-Puffer
beendet und erneut präzipitiert.
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In
diesem Verfahren wurden die folgenden Lösungen verwendet:
Lysepuffer
(TRUSTEE, enthaltend 50 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP40); Puffer I (TRUSTEE-Puffer mit 10 mM
MgCl2, 1 mM DTT, 0,5 E/μl Placenta-RNAse-Inhibitor, 0,1 E/μl RNAse-freie DNAse
I); Stop-Puffer (50 mM EDTA 1,5 M NaOAc 1,0% SDS).
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Slot-Blot-Analyse
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Zur
Slot-Blot-Analyse wurden 10 μg
cytoplasmischer RNA in 50 μl
dH2O, dem 150 μl 10 × SSC/18% Formaldehyd zugesetzt
worden waren, gelöst.
Die solubilisierte RNA wurde dann 15 min bei 65°C inkubiert und mit einer Slot-Blot-Apparatur aufgetüpfelt. Radiomarkierte
Sonden mit 1,5 kb gp120IIIb- und syngp120mn-Fragmenten wurden zur Hybridisierung
verwendet. Jedes der zwei Fragmente wurde statistisch in einer 50 μl-Reaktion mit 10 μl 5 × Oligo-markierendem
Puffer, 8 μl
2,5 mg/ml BSA, 4 μl α[32P]-dCTP (20 μCi/μl; 6000 Ci/mmol) und 5 E Klenow-Fragment
markiert. Nach 1 bis 3 Stunden Inkubation bei 37°C wurden 100 μl TRUSTEE
zugesetzt und nicht-eingebaute α[32P]-dCTP wurde unter Verwendung einer G50-Spinsäule eliminiert.
Die Aktivität wurde
in einem Beckman-beta-Zählgerät gemessen und
gleiche spezifische Aktivitäten
wurden zur Hybridisierung verwendet. Membranen wurden für 2 Stunden
vorhybridisiert und hybridisierten für 12 bis 24 Stunden bei 42°C mit 0,5 × 106 cpm-Sonde pro ml Hybridisierungsflüssigkeit.
Die Membran wurde zweimal mit Waschpuffer I bei Raumtemperatur (5
min), für
1 Stunde in Waschpuffer II bei 65°C
gewaschen und dann auf Röntgenfilm
belichtet. Ähnliche
Resultate wurden unter Verwendung eines 1,1 kb Not1/Sfi1-Fragments von pCDM7,
das die 3-untranslatierte Region enthielt, erhalten. Kontrollhybridisierungen
wurden parallel mit einer statistisch markierten humanen beta-Actinsonde
durchgeführt.
Die RNA-Expression wurde quantitativ bestimmt, indem die hybridisierten
Nitrocellulosemembranen mit einem Magnetic Dynamics Phosphorimager
gescannt wurden.
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In
diesem Verfahren wurden die folgenden Lösungen verwendet:
5 × Oligo-Markierungspuffer
(250 mM Tris-HCl, pH 8,0, 25 mM MgCl2, 5
mM β-Mercaptoethanol,
2 mM dATP, 2 mM dGTP, mM dTTP, 1 M Hepes, pH 6,6, 1, mg/ml Hexanucleotide
[dNTP]6); Hybridisierungslösung (M
Natriumphosphat, 250 mM NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% Dextransulfat,
50% Formamid, 100 μg/ml
denaturiertes Lachssperma-DNA); Waschpuffer I (2 × SCC, 0,1%
SDS); Waschpuffer II (0,5 × SSC,
0,1% SDS), 20 × SSC
(3 M NaCl, 0,3 M Na3-citrat, pH auf 7,0
eingestellt).
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Zellkultur
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Die
Affennieren-Karzinomzelllinien CV1 und Cos7, die humane Nierenkarzinomzelllinie
293T und die humane Cervix-Karzinomzelllinie
Hela wurden von The American Tissue Typing Collection erhalten und
wurden in supplementiertem IMDM gehalten. Sie wurden auf 10 cm-Gewebekulturplatten
gehalten und typischerweise alle 3 bis 4 Tage 1:5 bis 1:20 aufgespalten.
In diesem Verfahren wurde das folgende Medium verwendet:
Ergänztes IMDM
(90% Iscove's modifiziertes
Dulbecco-Medium, 10% Kälberserum,
Eisen-ergänzt,
Hitze inaktiviert 30 min, 56°C,
0,3 mg/ml L-Glutamin, 25 μg/ml
Gentamycin, 0,5 mM β-Mercaptoethanol
(pH eingestellt mit 5 M NaOH, 0,5 ml)).
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Transfektion
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Eine
Calciumphosphat-Transfektion von 293T-Zellen wurde durch langsames
Zugeben und unter Verwirbeln von 10 μm Plasmid-DNA in 250 μl 0,25 M
CaCl2 zu demselben Volumen an 2 × HEBS-Puffer
unter Verwirbeln durchgeführt.
Nach Inkubation für
10 bis 30 min bei Raumtemperatur wurde das DNA-Präzipitat
in eine kleine Schale mit 50 bis 70%ig konfluenten Zellen gegeben.
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Die
folgenden Lösungen
wurde in diesem Verfahren verwendet:
2 × HEBS-Puffer (280 mM NaCl,
10 mM KCl, 1,5 mL steril filtriert); 0,25 mM CaCl2 (autoklaviert).
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Grün-fluoreszierendes
Protein
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Die
Wirksamkeit des Codonersatzes legt nahe, dass ein Ersetzen nicht-bevorzugter
Codons durch weniger bevorzugte Codons über bevorzugte Codons (und
Ersetzen weniger bevorzugter Codons durch bevorzugte Codons) die
Expression von anderen Proteinen, z.B. anderen eukaryotischen Proteinen,
in Säugerzellen
erhöhen
wird.
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Das
grün-fluoreszierende
Protein (GFP) der Qualle Aequorea Victoria (Ward, Photochem. Photobiol.,
4:1, 1979; Prasher et al., Gene 111:229, 1992; Cody et al., Biochem.
32:1212, 1993) hat seit kurzem wegen seiner möglichen Verwendung als Marker oder
Reporter zur Transfektion und Abstammungsstudien Aufmerksamkeit
an sich gezogen (Chalfie et al., Science 263:802, 1994).
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Die
Untersuchung einer Codonverwendungstafel, die aus der nativen codierenden
Sequenz von GFP konstruiert wurde, zeigte, dass die GFP-Codons entweder
A oder U in der dritten Position begünstigten.
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Die
Ausrichtung in diesem Fall begünstigt
A weniger als die Ausrichtung für
gp120, ist aber wesentlich. Es wurde ein Gen geschaffen, indem die
natürliche
GFP-Sequenz wiederentwickelt wurde. Außerdem wurde die Translationsinitiationssequenz von
GFP durch Sequenzen ersetzt, die dem translationalen Initiationsconsensus
entsprechen. Die Expression des resultierenden Proteins stand im
Gegensatz zu der der Wildtyp-Sequenz, die entsprechend gentechnisch
verändert
war, so dass sie einen optimierten translationalen Initiationsconsensus
trug (1, Abbildung B und 1, Abbildung
C). Außerdem
wurde der Effekt des Einschlusses der Mutation Ser 65 → Thr, von
dem berichtet wurde, dass er die Anregungseffizienz von GFP bei
490 nm verbessert und daher für
die Fluoreszenzmikroskopie bevorzugt wird (Heim et al., Nature 373:663,
1995), untersucht (1, Abbildung D). Eine gentechnische
Codonveränderung
verlieh eine signifikante Erhöhung
bei der Expressionseffizienz (begleitend war ein Prozentgehalt an
Zellen offensichtlich auf Transfektion positiv) und die Kombination
der Ser 65 → Thr-Mutation
und der Codonoptimierung führte
zu einem DNA-Segment, das für
ein stark sichtbares Säugermarkerprotein
codiert (1, Abbildung D).
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Die
oben beschriebene, synthetisches grün-fluoreszierendes Protein
codierende Sequenz wurde aus sechs Fragmenten mit jeweils 120 by
zusammengebaut, wobei eine Strategie zum Zusammenbau verwendet wurde,
die auf der Fähigkeit
der Restriktionsenzyme BsaI und BbsI beruhte, außerhalb ihrer Erkennungssequenz
zu spalten. Es wurden lange Oligonucleotide synthetisiert, die Teile
der codierenden Sequenz für
GFP in flankierenden Sequenzen, die für EcoRI und BsaI codieren,
an einem Ende und BamHI und BbsI am anderen Ende codieren, enthielt.
Demnach hat jedes Oligonucleotid die Konfiguration EcoRI/BsaI/GFP-Fragment/BbsI/BamHI.
Die Restriktionsstellen, die durch die BsaI- und BbsI-Stellen erzeugt
worden waren, waren so konzipiert, dass sie zu kompatiblen Enden
führten,
die verwendet werden könnten,
um benachbarte GFP-Fragmente zu verbinden. Jedes der kompatiblen
Enden war so entwickelt, dass es einmal vorkommend und nicht-selbstkomplementär war. Die
rohen synthetischen DNA-Segmente wurden durch PCR amplifiziert,
zwischen EcoRI und BamHI in pUC9 insertiert und sequenziert. Anschließend wurde
die intakte codierende Sequenz in der Sechs-Fragment-Ligation zusammengebaut,
wobei Insertfragmente verwendet wurden, die durch BsaI und BbsI
hergestellt worden waren. Zwei von sechs Plasmiden, die aus der
Ligation resultierten, trugen ein Insert korrekter Größe und eines
enthielt die gewünschte
Volllängensequenz.
Eine Mutation von Ser65 zu Thr wurde durch Mutagenese auf Standard-PCR-Basis
erreicht, wobei ein Primer verwendet wurde, der eine einmal vorkommende
BssSI-Stelle in synthetischem GFP überlappte.
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Codon-Optimierung
als Strategie zur verbesserten Expression in Säugerzellen
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Die
Gene der Erfindung sind auch zur Gentherapie einsetzbar.
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GFP-Gene
können
in einer beliebigen Anwendung eingesetzt werden, in der natives
GFP-Gen oder ein anderes Reportergen verwendet werden kann. Ein
GFP-Gen, das bevorzugtere Codons als native GFP-Gen verwendet, kann
die Basis eines in hohem Maße
empfindlichen Reportersystems sein. Ein solches System kann z.B.
verwendet werden, um den Einfluss von besonderen Promotorelementen oder
trans-wirkenden Faktoren auf die Genexpression zu analysieren. Somit
kann das GFP-Gen in derselben Art wie andere Reporter, z.B. β-Galactosidase,
eingesetzt werden.