DE69634828T2

DE69634828T2 - Auffindbare künstliche bioimplantate

Info

Publication number: DE69634828T2
Application number: DE69634828T
Authority: DE
Inventors: D. Richard ANTANOVICH; Randel Dorian
Original assignee: Islet Sheet Medical Inc San Francisco; Islet Sheet Medical Inc
Current assignee: Islet Sheet Medical Inc San Francisco; Islet Sheet Medical Inc
Priority date: 1995-10-13
Filing date: 1996-10-15
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2016-10-16
Also published as: CA2234233A1; DE69634828D1; US6372244B1; US6165225A; EP0862391A1; AU725104B2; EP0862391A4; EP0862391B1; WO1997013474A1; US5855613A; ATE297169T1; CA2234233C; AU7432796A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich von bioartifiziellen Pankreas, bioartifiziellen Implantaten im Allgemeinen und Verfahren zu ihrer Herstellung. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von dünnen Blättern, die Zellen einschließen, die über einen längeren Zeitraum vollkommen biokompatibel sind und die keine Fibrose induzieren. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Zellen enthaltende dünne Blätter, die leicht vollständig wiedergewonnen werden können und Abmessungen aufweisen, die durch rasche Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff die Aufrechterhaltung von optimaler Gewebe-Lebensfähigkeit ermöglichen und außerdem als Reaktion auf physiologische Veränderungen rasche Änderungen in der Sekretionsgeschwindigkeit von Insulin und/oder anderen bioaktiven Wirkstoffen ermöglichen. Diese bioartifiziellen Implantate können eingepflanzt werden. Die vorliegende Erfindung kann zur Einpflanzung von lebenden Zellen, Gewebe, Arzneimittel, Medikamenten und/oder Enzymen verwendet werden, die in den bioartifiziellen Implantaten enthalten sind.
Das US-Patent 5.429.821 beschreibt ein Transplantat, das einen Kern aus lebensfähigen, physiologisch aktiven Gewebezellen umfasst, die mit einem nichtfibrinogenen Erdalkalialginat beschichtet sind, das Calcium- und/oder Magnesiumalginat umfasst. Die Beschichtung ist frei von fibrinogenen Mengen an Fucose, Sulfat, Phloroglucinol und Proteingruppierungen. Die Beschichtung weist eine ausreichend niedrige Durchlässigkeit und eine ausreichend große Dicke auf, um das Transplantat nach der Transplantation vor Rezipienten oder immunologischen Wirkstoffen des Wirts zu schützen, und ist außerdem ausreichend durchlässig und dünn, um die Diffusion von ausreichenden Zellnährstoffen und Zellprodukten durch die Beschichtung zu erlauben, was für die Lebensfähigkeit der Zelle erforderlich ist. Die Beschichtungsdicke beträgt vorzugsweise 20–200 μm.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein lebensfähiges, physiologisch aktives und biokompatibles Zell- oder Gewebeimplantat bereitgestellt, umfassend ein biokompatibles geliertes Alginat, das so gereinigt ist, dass es keine Fibrose induziert, eine Konfiguration eines dünnen Blatts mit einer Dicke zwischen 10 μm und 400 μm aufweist und einen Kern aus lebendem Gewebe oder Zellen um fasst, der zumindest 100.000 Zellen in einer ersten Alginatschicht umfasst und von einer Hülle aus einem zweiten Alginat umgeben ist, das dasselbe oder ein anderes als das erste Alginat sein kann, wobei das Implantat eine Durchlässigkeit aufweist, die ausreicht, um Diffusion und Freisetzung von Proteinen mit mittlerer Größe aus dem Implantat in den Wirtskörper zu ermöglichen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines biokompatiblen Implantats bereitgestellt, das ein biokompatibles geliertes Alginat umfasst, das so gereinigt ist, dass es keine Fibrose induziert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
das Kombinieren von lebendem Gewebe oder Zellen, das bzw. die zumindest 100.000 zu implantierende Zellen umfasst bzw. umfassen, mit einer Alginatlösung, wobei die Alginatkonzentration ausreicht, um in Gegenwart eines Vernetzers ein Gel zu bilden;
das Kontaktieren des resultierenden Gemischs in Form einer dünnen Schicht mit einer Lösung des Vernetzers in ausreichender Konzentration, um das Alginat zu gelieren;
und das Ausbilden einer Beschichtungsschicht darauf, die ein biokompatibles Alginatgel umfasst;
um ein Implantat in Form eines dünnen Blatts mit einer Dicke zwischen 10 μm und 400 μm zu bilden, das eine Durchlässigkeit aufweist, die ausreicht, um Diffusion und Freisetzung von Proteinen mittlerer Größe aus dem Implantat in den Wirtskörper zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein bioartifizielles Implantat und Verfahren zu dessen Herstellung. Die Abmessungen des bioartifiziellen Implantats sind so gewählt, dass die Zell-Lebensfähigkeit durch passive Diffusion von Nährstoffen aufrechterhalten werden kann, und vorzugsweise so, dass eine hohe Zelldichte aufrechterhalten werden kann. Außerdem sind die Dimensionen des bioartifiziellen Implantats so gewählt, dass das bioartifizielle Implantat makroskopisch und leicht aus dem Wirt wiedergewinnbar ist und groß genug ist, um einen entscheidenden Teil des Gewebes zu enthalten, das zum Erreichen der gewünschten therapeutischen Wirkung erforderlich ist. Die Durchlässigkeit des bioartifiziellen Implantats ist so gewählt, dass die Zell-Lebensfähigkeit durch passive Diffusion von Nährstoffen aufrechterhalten werden kann, und vorzugsweise so, dass die passive Diffusion von sekretierten Zellprodukten eine rasche Reaktion auf Änderungen der physiologischen Bedingungen ermöglicht. Gleichzeitig verhindert die Durchlässigkeit der Membran die Diffusion von Antikörpern und Komplementen in ausreichendem Ausmaß, um eine Lyse der implantierten Zellen zu verhindern, auch wenn es sich bei dem Gewebe um ein Xenotransplantat handelt. Das bioartifizielle Implantat ist biokompatibel, was bedeutet, dass es keine Fremdkörperreaktion auslöst.
Die Abmessungen des bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration eines dünnen Blatts sind so gewählt, dass die Oberfläche einer Seite eines Blatts zumindest 30 mm², vorzugsweise zumindest 2,5 cm², noch bevorzugter 10 cm², aufweist, was durch entweder (a) den Durchmesser (wenn das Blatt kreisförmig ist) oder (b) die Fläche, die durch das Konvergieren von Polygonen bestimmt wird, definiert ist. Obwohl die maximalen Abmessungen den Maßen entsprechen können, die vom Patienten vertragen werden, dem das Implantat eingepflanzt wird, kann die maximale Oberfläche einer Seite des Blattimplantats der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf eine einfachere Herstellung und Wirtschaftlichkeit von implantierten Zellen 400 cm², noch bevorzugter 300 cm³, insbesondere 250 cm² (bei einem menschlichen Patienten) betragen.
Beim vorliegenden bioartifiziellen Implantat ist die Zelldichte jene Dichte, die in einer dünnen Alginatgelhülle enthalten sein kann: Vorzugsweise beträgt die Zelldichte zumindest 10 Vol.-%, noch bevorzugter 20 Vol.-% und insbesondere zumindest 35 Vol.-%.
Die Oberfläche des bioartifiziellen Implantats ist biokompatibel. Die Erfinder haben herausgefunden, dass Versuche, mithilfe von synthetischen Polymeren^60,3 Neovaskularisierung auf der Oberfläche des Implantats zu induzieren, für eine langfristige Lebensfähigkeit von Implantaten suboptimal sind. Sie haben herausgefunden, dass Implantate, die neutral sind (also weder Fibrose noch Neovaskularisierung verursachen), über ein Jahr mit nur minimalem Funktionsrückgang halten¹².
Das bioartifizielle Implantat wird mithilfe der Begriffe "Kern", "Hülle" und "Deckschicht" beschrieben. Der Kern umfasst das lebende Gewebe, Nährfaktoren und Nährzellen, ein mit einem mehrwertigen Kation, wie z.B. Calcium, vernetztes Alginatpolymer und ein Fasernetz zur Stärkung. Die Hülle umfasst ein mit einem mehrwertigen Kation vernetztes Alginatpolymer, das zur Regelung der Durchlässigkeit dient. Die Deckschicht umfasst ein mit einem mehrwertigen Kation vernetztes Alginatpolymer, das dazu dient, das bioartifizielle Implantat biokompatibel zu machen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ihre Gestalt oder Konfiguration. Frühere Erfindungen haben auf inhärente Einschränkungen in Bezug auf die Diffusion von Sauerstoff mit einer Verringerung der Zelldichten innerhalb des bioartifiziellen Implantats reagiert. Die Erfinder haben herausgefunden, dass ein wirksames Implantat mittlere bis hohe Gewebedichten aufweisen muss, um das Volumen des gesamten bioartifiziellen Implantat zu verringern, und dass die Dicke eines Blatts oder einer Platte sehr gering sein muss, um eine effektive Sauerstoffdiffusion zu ermöglichen. Die Summe aus der Dicke des Kerns, der Hülle und der Deckschicht sollte weniger als 400 μm, vorzugsweise 350 μm oder weniger und noch bevorzugter nicht mehr als 300 μm betragen. Die Dicke der Hülle und der Deckschicht sollten minimiert werden, sodass die Gewebemenge maximiert werden kann. Die Erfinder haben herausgefunden, dass die Dicke der Hülle und Deckschicht 10 bis 100 μm, vorzugsweise 10–80 μm, und insbesondere 10–50 μm, betragen kann. Über biokompatible Implantathüllen mit einer Dicke von nur einigen Dutzend μm wurde noch nie berichtet. Die Länge und Breite des bioartifiziellen Implantat, andererseits, sollten maximiert werden, damit das größtmögliche Volumen an lebendem Gewebe im bioartifiziellen Implantat aufgenommen werden kann und es leicht wiedergewinnbar ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das Material, aus dem das bioartifizielle Implantat hergestellt wird. Biokompatible gereinigte Alginate wurden schon beschrieben, bisher aber nur zur Herstellung von umhüllten und eingekapsel ten Implantaten verwendet. Ein bioartifizielles Implantat, bei dem Alginat als dünnes Blatt verwendet wird, wurde noch nicht beschrieben. Die Eigenschaften eines Alginatgels können kontrolliert werden, indem der G- und M-Gehalt, die Kettenlänge, die Alginatkonzentration und die Gegenionen (z.B. Calcium, Zink, Barium oder eine Kombination daraus) bestimmt werden. Alginat im Kern ist mit lebendem Gewebe kompatibel. Die Herstellung von Alginathydrogelen ist mit der Zell-Lebensfähigkeit kompatibel. Natriumalginat, das zur Herstellung des Kerns verwendet wird, kann vor dem Gelieren mit mehrwertigen Kationen zusammen mit dem sekretierenden Gewebe mit Nährfaktoren und Nährzellen vermischt werden; um eine fördernde Umgebung bereitzustellen. Alginat für die Hülle kann je nach Kettenlänge und G- und M-Fraktionen ausgewählt werden und mit verschiedenen mehrwertigen Kationen geliert werden, um die Durchlässigkeit der Hülle zu kontrollieren. Alginat für die Deckschicht kann so gewählt werden, dass die Biokompatibilität des bioartifiziellen Implantats maximiert wird.
Das bioartifizielle Implantat wird mithilfe einer Reihe von Formen hergestellt, die aus Frittenmaterialien, welche geformt oder gemahlen werden können und Membranen bestehen. Das ermöglicht die Diffusion von Chelatbildnern (z.B. Natriumcitrat) oder mehrwertigen Kation-Geliermitteln (z.B. Calcium-, Barium- oder Zinkchloriden), um den Kern, die Hülle und die Deckschicht zu verflüssigen bzw. zu gelieren. Beim Herstellungsverfahren werden nur Ionen verwendet, die bekannterweise mit den implantierten Zellen kompatibel sind.
Obwohl zahlreiche Variationen des Verfahrens existieren, ist die Grundlage des Verfahrens einfach. Der Kern, die Hülle und die Deckschicht werden geformt, wenn das Alginat flüssig ist. Der Kern und die Hülle (und später die Hülle und die Deckschicht) werden vernetzt, indem einfach flüssiges Alginat, das eine kleine Menge eines Chelatbildners enthält, mit der gelierten Schicht kontaktiert wird. Der Chelatbildner diffundiert in die gelierte Schicht und verflüssigt sie teilweise. Wenn dann ein kationischer Vernetzen zugesetzt wird, wird eine starke Bindung zwischen den Schichten erzeugt. Die Außenfläche wird sehr glatt gemacht, indem einfach die Form mit einer Vernetzerlösung befeuchtet wird, bevor die Form mit der flüssigen Hülle oder Deckschicht kontaktiert wird. Die Erfinder haben herausgefunden, dass der Kontakt mit der so befeuchteten Membran sofort eine sehr glatte Oberfläche erzeugt.
Da die Hülle und Deckschicht aus Flüssigkeiten hergestellt werden, können sie sehr dünn, sogar nur einige μm dick, gehalten werden.
Die Erfinder haben ein bioartifizielles Implantat mit Abmessungen erfunden, die nie vorher erzielt wurden, und das außerdem zahlreiche weitere Vorteile mit sich bringt. Beispielsweise besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines bioartifiziellen Implantats, das leicht aus dem Wirten wiedergewinnbar ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration eines dünnen Blatts, das sowohl hohe Gewebedichten als auch die Diffusion in die Gewebezellen von ausreichenden Mengen an Nährstoffen, Sauerstoff und anderen Substanzen ermöglicht, die für die Gesundheit, Langlebigkeit und effektive Wirkungsweise der Zelle nach der Einpflanzung erforderlich sind.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration eines leicht wiedergewinnbaren dünnen Blatts, das sowohl hohe Gewebedichten als auch eine effektive Diffusion von Nährstoffen in und Zellprodukten aus dem Implantat ermöglicht.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration eines dünnen Blatts aus lebensfähigen, physiologisch aktiven Gewebezellen zur Einpflanzung, das für den Wirten physiologisch annehmbar ist und nach der Einpflanzung effektiv einen längeren Schutz für Gewebezellen vor Zerstörung durch das Immunsystem des Wirten bereitstellt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines effektiven Implantat-Hüllenmaterials mit der Konfiguration eines dünnen Blatts, das physiologisch annehmbar, nicht fibrinogen und für das Wirtsgewebe nicht toxisch ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines bioartifiziellen Implantats, das trophische Substanzen, wie z.B. Nährzellen, Grundsubstanzen, Nährstoffe, Hormone oder Sauerstoffträger enthält, um die Gesundheit, Langlebigkeit und effektive Wirkungsweise des Implantats nach der Einpflanzung zu unterstützen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines neuen Herstellungsverfahrens zur effektiven Umhüllung eines Implantats (z.B. Zellen, Gewebe und/oder andere biologische Substanzen) mit einer Sperrschicht oder Membran, die physiologisch annehmbar, nicht fibrinogen und für das Wirtsgewebe nicht toxisch ist, das eine komplette Sperrschicht mit einer kontrollierten Dicke und einer kontrollierten Durchlässigkeit für Proteine mittlerer Größe bereitstellen kann und leicht wiedergewinnbar ist.
Zusammengefasst kann die vorliegende Erfindung einen Implantatkern mit der Konfiguration eines dünnen Blatts umfassen, das lebensfähige, physiologisch aktive Gewebezellen und ein vernetztes Alginatgel, und gegebenenfalls Nährfaktoren und Nährzellen, und gegebenenfalls einen Fasernetz-Träger, aufweist. Die Alginate sind vorzugsweise frei von fibrogenen Konzentrationen an Verunreinigungen.
Das bioartifizielle Implantat kann eine Hülle und eine Deckschicht zur Regelung der Durchlässigkeit und zur Förderung der Biokompatibilität aufweisen. Das Implantat-Blatt ist dünn und kann durchlässig genug sein, um in der Mitte des Blatts eine physiologisch annehmbare Sauerstoffspannung bereitzustellen, wenn es an einer geeigneten Stelle in einem Menschen oder Tier implantiert wird. Die Dünnheit und Durchlässigkeit des Implantats ermöglicht die Diffusion von Nährstoffen, Sauerstoff, Abfallprodukten des Stoffwechsels und sekretierten Gewebeprodukten. Das Implantat hemmt vorzugsweise die Diffusion von Antikörpern und Komplementen.
Vorzugsweise ermöglicht die Hülle eine rasche Diffusion von Substanzen mit weniger als 50 kD und hemmt die Diffusion von Substanzen über 100 kD deutlich. Außerdem ist die Hülle sehr dünn, vorzugsweise etwa 10–50 μm dick. Die Hülle kann bei spielsweise kurzkettige Alginate mit hohem M-Gehalt, die mit einem Gemisch aus Calcium- und Zinkionen geliert sind, umfassen und somit aus diesen aufgebaut sein.
Für das vorliegende Implantat geeignete Zellen umfassen beispielsweise Langerhanssche Inseln, Nierenrindenzellen, Nebenschilddrüsenzellen, Schilddrüsenzellen, Nebennierenzellen, Leberzellen, Zellen unterschiedlichen Ursprungs, die gentechnisch verändert wurden, um nützliche Substanzen zu sekretieren, Zellen unterschiedlichen Ursprungs, die gentechnisch verändert wurden, um schädliche Substanzen zu metabolisieren, Gewebe und dergleichen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines biokompatiblen Implantats kann folgende Schritte umfassen:

(a) das Ausbilden eines Kerns, der lebensfähige, physiologisch aktive Gewebedonorzellen enthält, in einem Alginatgel, vorzugsweise in einer dünnen, blattförmigen Form, und noch bevorzugter durch Vernetzen ein einer Alginatlösung, welche die Zellen enthält;
(b) das Kontaktieren des Kerns mit einer zweiten Alginatlösung, die eine ausreichende Citratkonzentration aufweist, um zumindest eine teilweise Verflüssigung des Alginatgels im Kern zu induzieren;
(c) das Vernetzen der zweiten Alginatlösung und des verflüssigten Alginatgels im Kern, um eine Hüllenschicht, die an den Kern gebunden ist, und somit das biokompatible Implantat zu bilden, vorzugsweise durch Eindiffundieren eines Vernetzers in die zweite Alginatlösung und das verflüssigte Alginatgel im Kern.

Gegebenenfalls kann der Vernetzungsschritt (c) das Kontaktieren der Innenfläche der Form mit einer wässrigen Calciumionenlösung umfassen, um eine glatte Außenfläche auf dem biokompatiblen Implantat zu schaffen. Dieser optionale Schritt kann zusätzlich zum Diffusionsschritt durchgeführt werden. Eine weitere Option besteht darin, Schritt (b) mit einer dritten Alginatlösung zu wiederholen, die ausreichend Citrat enthält, um eine zumindest teilweise Verflüssigung des Alginatgels in der Hülle zu induzieren, und Schritt (c) zu wiederholen, indem die dritte Alginatlösung und das verflüssigte Alginatgel in der Hülle vernetzt werden, um eine Deckschicht zu bilden, die an die Hülle gebunden ist. Die Hülle des biokompatiblen Implantats kann so ausgebildet werden, dass sie die Durchlässigkeit regelt, und die Deckschicht kann so ausgebildet werden, dass sie die Biokompatibilität fördert.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die folgende detaillierte Beschreibung, die anhand der beiliegenden Abbildungen erläutert wird, wird zu einem besseren Verständnis der Erfindung und vieler ihrer Vorteile führen.
1 ist eine schematische Darstellung des bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration eines dünnen Blatts.
2 ist ein vergrößerter schematischer Querschnitt durch das bioartifizielle Implantat mit der Konfiguration eines dünnen Blatts aus 1.
3 ist ein vergrößerter schematischer Querschnitt durch den Kernrand und die Hülle des bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration eines dünnen Blatts in der Hüllenform.
4 ist ein vergrößerter schematischer Querschnitt durch den Kern des bioartifiziellen Implantats mit der Konfiguration eines dünnen Blatts in der Kernform.
5 ist ein vergrößerter schematischer Querschnitt durch das mit einer Hülle überzogene bioartifizielle Implantat mit der Konfiguration eines dünnen Blatts in der Hüllenform.
6 ist ein vergrößerter schematischer Querschnitt durch das mit einer Deckschicht überzogene bioartifizielle Implantat mit der Konfiguration eines dünnen Blatts in der Deckschichtform.
7 ist ein vergrößerter schematischer Querschnitt durch die Form, die zur Herstellung des Kerns, der Hülle und der Deckschicht verwendet wird, dargestellt als separate Teile (A), in Berührung (B) und zusammengeklemmt (C).
8 ist ein vergrößerter schematischer Querschnitt durch die Form, die zur Herstellung der Hüllenhälfte verwendet wird, dargestellt als separate Teile (A) und in Berührung (B).
9 ist eine Mikroaufnahme des Kerns des bioartifiziellen Implantats, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Polymerkügelchen, die Inseln darstellen sollen (~100×).
10 ist eine Mikroaufnahme eines Abschnitts des Kerns des bioartifiziellen Implantats, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Polymerkügelchen, die Inseln darstellen sollen (~100×).
11 ist eine Mikroaufnahme eines Abschnitts des kompletten (mit Hülle, Deckschicht) bioartifiziellen Implantats, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Polymerkügelchen, die Inseln darstellen sollen (~100×).
Arten der Durchführung der Erfindung
Das bioartifizielle Implantat der vorliegenden Erfindung ist zur Einpflanzung in ein Wirtstier durch herkömmliche chirurgische Verfahren oder unter Verwendung eines Bauchtrokars und eines Laparoskops geeignet.
Der Begriff "Implantat" umfasst hierin alle lebenden Gewebe, Zellen und biologisch aktiven Substanzen, die in den Körper eines Wirtstiers implantiert werden sollen, und "implantieren" bezieht sich auf den Vorgang des Einpflanzens oder der Übertragung dieser Gewebe und Zellen in einen Wirten. Diese Gewebe und Zellen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Gewebe und Zellen, die von einem Spendertier entnommen wurden, Gewebe und Zellen, die durch Inkubation oder Kultivierung von Spendergewebe und -zellen erhalten wurden, Zellen, die aus lebensfähigen Zelllinien erhalten wurden, Zellen, die durch gentechnische Veränderung erhalten wurden, biologisch aktive Produkte von Zellen und Gewebe, Pharmazeutika, Arzneimittel, Enzyme, eutrophe Elemente und dergleichen. Gewebe kann eine nützliche biologische Funktion aufweisen, entweder indem es eine therapeutische oder trophische Substanz sekretiert oder indem es eine toxische oder schädliche entfernt. Ein Beispiel für Letzteres wäre die Entfernung von unterschiedlichen Fettsubstanzen aus einem Serum, um den Lipidblutspiegel zu senken.
Jede Gewebe- oder Zellenart, die eingepflanzt werden soll, kann zu einem Blatt verarbeitet und gemäß der vorliegenden Erfindung implantiert werden. Die am häufigsten implantierten Gewebearten sind Sekretionsorgangewebe, wobei die Implantation eines Spenderorgans in ein Empfänger- oder Wirtstier erwünscht ist, um die Funktion des Spenderorgans im Wirtssystem zumindest teilweise zu replizieren. Bevorzugte Spendergewebearten sind Langerhanssche Inseln, Nierenzellen, Nervenzellen, Nierenrindenzellen, Gefäßendothelzellen, Schilddrüsenzellen, Nebenschilddrüsenzellen, Nebennierenzellen, Thymuszellen und Eierstockzellen.
Nachstehend wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung am Beispiel der Herstellung und Implantation von Langerhansschen Inseln und Inselzellen veranschaulicht, was aber nicht als Einschränkung zu verstehen ist. Dieses Verfahren kann genauso gut für andere Organgewebearten verwendet werden, was für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich ist, wobei bei Bedarf oder Wunsch herkömmliche und offensichtliche Modifikationen vorgenommen werden können, um speziellen Anforderungen oder anderen Gewebearten Rechnung zu tragen. Alle Anwendungen des Verfahrens für unterschiedlichste Gewebe- und Zellarten, die zur Implantation geeignet sind, liegen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
Isolierte Langerhanssche Inseln (oder andere zur Implantation geeignete Zellen oder Gewebearten) werden durch herkömmliche Verfahren gewonnen, wobei sie von um liegendem Gewebe und anderen Donorsubstanzen im Wesentlichen getrennt werden.
In einem ersten Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden isolierte Langerhanssche Inseln (oder andere Zellen oder Gewebearten) mit einer isotonischen Kochsalzlösung gewaschen und einer Lösung von gereinigtem Natriumalginat suspendiert. Das Alginat wurde vorher gereinigt, um es wie in früheren Publikationen^34,33,35 beschrieben, vollständig biokompatibel zu machen.
Das Alginat kann mit verschiedenen Molekulargewichten (Kettenlängen), reich an Guluronatresten oder reich an Mannuronatresten hergestellt werden^30,31,35. Diese Verfahren basieren auf der differenziellen Bindung von homopolymeren M- und G-Blöcken an verschiedene Kationen. Die Wahl (i) der Fraktion aus einheitlichen G-Blöcken, einheitlichen M-Blöcken und alternierenden GM-Blöcken, (ii) der mittleren Kettenlänge, (iii) der Alginatkonzentration und (iv) des Gemischs aus Kationen, das zur Gelierung des Alginats verwendet wird, kann zur Produktion von Alginatgelen mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften genutzt werden. Im Folgenden steht "Alginat" für eine Lösung von Alginat, das aufgrund gewünschter Eigenschaften ausgewählt wurde und gelierbar sein kann, und "mehrwertiges Kation" für ein Gemisch aus mehrwertigen Kationen, wie z.B. Calcium, Barium und Zink, das so gewählt ist, dass gewünschte Eigenschaften erzielt werden, wenn es in Kombination mit dem ausgewählten Alginat verwendet wird.
Das gewählte Kernalginat weist niedrige Viskosität im flüssigen Zustand (sodass die Inseln während der Kernbildung nicht beschädigt werden), hohe Festigkeit im gelierten Zustand (um ein starkes Implantat zu erhalten), Kompatibilität mit Gewebe und Kompatibilität mit Nährfaktoren auf. Das Kernalginat besteht typischerweise aus Alginat (z.B. 80 bis 100 kD, vorzugsweise 100 bis 500 kD, noch bevorzugter 200 bis 400 kD) in einer niedrige Konzentration (vorzugsweise 0,5 bis 10%, noch bevorzugter 1,0 bis 5%, insbesondere etwa 2,0%), das ein Gemisch aus M- und G-Blöcken ist, die mit Calcium vernetzt sind.
Das gewählte Hüllenalginat weist hohe Viskosität im flüssigen Zustand (insbesondere beim "Kautschukverfahren"), hohe Festigkeit im gelierten Zustand (um ein starkes Implantat zu erhalten), hohe Durchlässigkeit für niedermolekulare Spezies (es erlaubt beispielsweise die Diffusion von Molekülen und/oder Komplexen mit einem Molekulargewicht unter 150 kD, vorzugsweise unter 100 kD, noch bevorzugter unter 75 kD) und geringe Durchlässigkeit für hochmolekulare Spezies (es hemmt oder verhindert beispielsweise die Diffusion von Molekülen oder Komplexen mit einem Molekulargewicht über 200 kD, vorzugsweise über 150 kD, noch bevorzugter über 100 kD) auf. Typischerweise besteht das Kernalginat aus kurzkettigem Alginat (z.B. 80 bis 800 kD, vorzugsweise 100 bis 600 kD, noch bevorzugter 100 bis 400 kD) in einer hohen Konzentration (z.B. 5–40%, vorzugsweise 10–30%, noch bevorzugter 15–25%), das mit Calcium vernetzt ist. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis zwischen M-Einheiten und G-Einheiten im Hüllenalginat 0,2:1 bis 6:1, noch bevorzugter 0,4:1 bis 1,5:1.
Es versteht sich, dass sich das Molekulargewicht, die Konzentration und das M:G-Verhältnis unabhängig voneinander auf die Viskosität und Durchlässigkeit des Alginats auswirken. Die gewünschte Viskosität und Durchlässigkeit werden durch gleichzeitige Optimierung aller drei Faktoren geregelt. Im Allgemeinen weisen Alginate mit niedrigerer Konzentration die gleiche Durchlässigkeit auf, wenn sie ein höheres M:G-Verhältnis aufweisen. Eine 25%ige Lösung mit einem M:G-Verhältnis von 1:1 kann beispielsweise ähnliche Eigenschaften aufweisen wie einen 12%ige Lösung mit einem M:G-Verhältnis von 2:1.
Das gewählte Deckschichtalginat weist hohe Durchlässigkeit und hohe Biokompatibilität auf und besteht typischerweise aus einer geringen Konzentration Alginat, das mit Calcium vernetzt ist. Vorzugsweise ermöglicht das Deckschichtalginat die Diffusion von Molekülen und/oder Komplexen mit einem Molekulargewicht unter 800 kD, vorzugsweise unter 400 kD und noch bevorzugter unter 200 kD. Typischerweise besteht das Deckschichtalginat aus Alginat (10 bis 800 kD, vorzugsweise 20 bis 400 kD, noch bevorzugter 20 bis 400 kD) in einer niedrigen Konzentration (z.B. 0,5–10%, vorzugsweise 1–5%, noch bevorzugter 1,5–3%), das einen hohen Anteil an M-Ein heiten aufweist; die mit Calcium vernetzt sind. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis zwischen M-Einheiten und G-Einheiten im Deckschichtalginat 0,2:1 bis 6:1, noch bevorzugter 0,5:1 bis 2:1, insbesondere 0,6:1 bis 1,5:1.
Das Kernalginat wird so gewählt, dass es eine geeignete Umgebung für die Langerhansschen Inseln (oder andere Zellen oder Gewebearten) und für die erforderlichen Nährfaktoren und Nährzellen bereitstellt. Angesichts der Bedeutung der Sauerstoffdiffusion enthalten die meisten Implantate beispielsweise Hämoglobin oder andere Sauerstoffträger im Alginat. Viele Zellen sind in Gegenwart von Collagen gesünder. Andere Nährfaktoren müssen für bestimmte Zellen und Gewebearten geeignet sein. Die optimale Kombination von Bestandteilen für den Implantatkern kann mithilfe bekannter Zellkulturverfahren bestimmt werden.
Sobald die Komponenten des Implantatkerns ausgewählt sind, können sie kombiniert werden. Natrium- (oder Kalium-) Alginat kann zusammen mit einer niedrigen Konzentration an Citrat verwendet werden, um das Gemisch vollkommen flüssig zu halten. Citrat chelatiert Calcium und andere mehrwertige Kationen stark, sodass sie das Alginat nicht vernetzen und gelieren können.
7 ist eine Darstellung einer typischen Form, die zur Herstellung des bioartifiziellen Implantats verwendet wird. Die Formen sind annähernd kreisförmig, können aber auch oval sein oder eine andere kompakte Gestalt aufweisen. Die beiden Hälften der Form, die in 7A separat dargestellt sind, können zusammengesetzt werden, indem ihre Außenringe (7B) in Berührung miteinander gebracht und in dieser Position mithilfe von Klemmen fixiert (7C) werden. Der Hauptteil der Form 11 ist eine Fritte aus gesintertem Edelstahl (Mott Metalurgical, NO oder GT) mit einer Porosität zwischen 0,01 und 5 μm, vorzugsweise etwa 0,4 μm. Die Fritte 11 kann auch aus Sinterglas oder Keramiksinter bestehen. Die Fritte 11 ist dick genug, um der gesamten Anordnung in 7C mechanische Festigkeit zu verleihen. Der Außenring 21, 22 kann aus dem gleichen Material bestehen wie die Fritte 11 (wenn diese nicht zerbrechlich ist, beispielsweise aus gesintertem Edelstahl), oder aus einem nichtporösen, starren Material, wie z.B. Edelstahl oder Keramik, wenn die Fritte 11 zerbrech lich ist. Der Ring 21 der oberen Form ist mit der Fritte 11 bündig. Der Ring 22 der unteren Form ragt um ein genaues Ausmaß im Bereich von 10 μm bis 500 μm über die Fritte 11 hinaus.
Die Formen können ein- bis dreimal zur Herstellung von Implantaten verwendet werden und können je nach Herstellungsstufe in unterschiedlichen Abmessungen bereitgestellt werden. Ein Formensatz für eine bestimmte Herstellungsfolge weist ähnliche Durchmesser auf, mit der Ausnahme dass der Innendurchmesser des Rings 21 bei einer Form, die für einen späteren Schritt bestimmt ist, etwas größer ist. Die Steigerung des Innendurchmessers kann von 20 μm bis einige hundert μm variieren (z.B. 300–400 μm), beträgt aber typischerweise etwa 50 μm. In einem Formensatz für eine bestimmte Herstellungsfolge weist die untere Form 22 zunehmende Tiefen gemessen zwischen Fritte und Ring auf, um die Ausbildung späterer Schichten des Implantats zu ermöglichen.
Die Formen können gegebenenfalls eine Membran 12 umfassen, die an ihre Oberflächen gebunden ist. Die Membran (z.B. Track-etch/Poretics, Livermore, Kalifornien, USA) kann eine Porengröße von 0,01 μm bis 0,2 μm aufweisen.
Die Formen können entweder von dem 7 oder dem in 8 dargestellten Typ sein. Die in 8 dargestellt Form kann verwendet werden, um Hüllenhälften herzustellen. Zwei vorgefertigte Hüllenhälften sind zur Herstellung des Implantats erforderlich, wenn vorgefertigte Hüllenhälften verwendet werden. Die in 8 dargestellte obere Formhälfte weist eine hervortretende Scheibe auf, sodass der Hohlraum der Form ein Blatt mit einem dickeren Ring ("Hüllenhälfte" genannt) definiert.
Andere Herstellungsschritte können eventuell Formen wie sie in 7 dargestellt sind erfordern. Die Oberflächen beider Formhälften sind vorzugsweise flach und können Hohlräume aufweisen, die vollständige Blätter definieren.
Änderungen der physikalischen Eigenschaften von Alginat in Gegenwart verschiedener Ionen werden bei den Herstellungsverfahren genutzt. Alginat ist ein Polymer von Zuckersäuren. In Gegenwart von einwertigen Gegenionen, wie z.B. Natrium und Kalium, sind Alginatlösungen flüssig. In Gegenwart von mehrwertigen Kationen, wie z.B. Calcium, Barium und Zink, bildet das Alginat ein Gel. Der Geliermechanismus besteht darin, dass die mehrwertigen Kationen ionisch an zwei Säuregruppen im Alginatpolymer gebunden werden und diese vernetzen. Wenn andererseits ein Chelatbildner, wie z.B. Citrat oder EDTA, mit einem Alginatgel in Kontakt gebracht wird, lösen sich die Vernetzungsionen vom Alginatgel und werden vom Chelatbildner maskiert.
Diese Beziehungen sind in der folgenden Darstellung zusammengefasst:
Diese Eigenschaft von Alginat wird auf drei Arten genutzt.
Erstens wird flüssiges Alginat, das in eine Form gefüllt wird, geliert, indem Calcium (oder andere geeignete mehrwertige Kationen) durch die Fritte diffundieren gelassen werden, indem die Vorrichtung in eine Lösung von Calciumchlorid (oder eines oder mehrerer Salze anderer geeigneter mehrwertiger Kationen) getaucht wird.
Zweitens wird flüssiges Alginat durch einen zweistufigen Prozess effektiv an ein geliertes Alginat gebunden. Der erste Schritt umfasst das Kontaktieren des gelierten Alginats mit einem Chelatbildner (z.B. Citrat, 1–100 mM, vorzugsweise 5–50 mM, noch bevorzugter etwa 10 mM), der im flüssigen Alginat vorhanden ist. Wenn das flüssige Alginat, das eine geringe Konzentration an Chelatbildner enthält, mit dem gelierten Alginat kontaktiert wird, verflüssigt das Citrat an der Grenzfläche die Oberfläche des Alginatgels, das sich dann mit dem flüssigen Alginat vermischt.
Durch die anschließende Verwendung eines Geliermittels (in einem zweiten Schritt) wird die flüssige Alginatschicht und die verflüssigte Oberfläche des Alginatgels, die, zumindest teilweise, mit dem flüssigen Alginat vermischt wurde, geliert, wodurch als Ergebnis der Bildung von neuen Vernetzungen zwischen dem Alginatgel der vorher gelierten Schicht (z.B. dem Kern) und dem neu gebildeten Alginatgel der darauf folgenden Schicht (z.B. der Hüllenschicht) eine starke Bindung zwischen den beiden Schichten erzeugt wird. Auf ähnliche Weise kann das Alginatgel der Hüllenschicht an das Alginatgel der Deckschicht gebunden werden.
Die Schnelligkeit der Vernetzungsreaktion kann genutzt werden, um eine glatte Oberfläche auf dem Implantat zu erzeugen. Wenn die Membranoberfläche der Form 12 beim Kontaktieren mit dem flüssigen Alginat mit einer Calciumlösung (oder einer Lösung eines anderen mehrwertigen Kations) benetzt wird, erzeugt die rasche Gelierreaktion sofort eine glatte Oberfläche.
Die Herstellungsfolge beginnt mit der Ausbildung entweder des Kerns oder der zwei Hüllenhälften, dann folgt die Herstellung des mit einer Hülle überzogenen Kerns, und dann gegebenenfalls die Ausbildung der Deckschicht.
Eine typische Herstellungsfolge ist in den 4, 5 und 6 dargestellt. Die Fritte 11 und Membranen 12 der Formen sind zu sehen. Die Herstellung des Kerns ist in 4 dargestellt. Das optionale Kernnetz 2 ist von Alginat 3 und Inseln 1 umgeben. Man beachte, dass einige Inseln die Membran 6 berühren. Der Kern wird durch die Diffusion eines Vernetzers (z.B. Calciumionen) durch die Fritte 11 geliert.
Die Herstellung des mit einer Hülle überzogenen Kerns ist in 5 dargestellt. Der Kern (1–3) ist nun von der Hülle 4 umgeben. Das flüssige Hüllenalginat 4, das auf die obere und untere Fläche des Kerns aufgetragen ist und eine geringe Konzentration Citrat enthält, vermischt sich mit der Oberfläche des Kernalginats 3. Man beachte, dass dort, wo eine Insel die Membran der Kernform 6 berührte, diese nun sicher innerhalb der Hülle liegt. Der mit einer Hülle überzogene Kern wird durch Diffusion eines Vernetzers (z.B. Calciumionen) durch die Fritte 11 geliert.
Die optionale Deckschicht 5 wird wie in 6 dargestellt hinzugefügt. Die letzte Schicht, egal ob es sich um die Hülle oder die Deckschicht handelt, kann hergestellt werden, indem die Oberfläche einer geeigneten Form mit einer Lösung eines Vernetzers benetzt und die Lösung des Vernetzers mit dem flüssigen Alginat der Oberflächenschicht in Kontakt gebracht wird, um eine glatte Oberfläche auf dem bioartifiziellen Implantat bereitzustellen.
Das Kernnetz 2 kann gegebenenfalls hinzugefügt werden, um die Festigkeit des Implantats zu erhöhen. Bei höheren Alginatkonzentrationen ist Alginatgel ausreichend widerstandsfähig, sodass kein Netz erforderlich ist. Das Netz kann aus einem beliebigen natürlichen oder synthetischen Monofilament- oder Multifilamentpolymer bestehen. Das in 9, 10 und 11 dargestellte Multifilamentgarnnetz bringt außerdem den Vorteil mit sich, dass das Alginatgel die Netzfasern durchdringen kann, was die Bindung des Kernalginats 3 an das Netz 2 erhöht.
Die Dicke des Implantats und seiner einzelnen Schichten wird durch die Formabmessungen gesteuert. Um ein Implantat mit einer Dicke von 400 μm herzustellen, kann die Kernform beispielsweise eine Hohlraumtiefe von 300 μm aufweisen. Die Hüllenform kann dann eine Hohlraumtiefe von 350 μm aufweisen und die Deckschichtform eine Hohlraumtiefe von 400 μm.
3 zeigt ein alternatives Verfahren zur Herstellung des mit einer Hülle überzogenen Kerns. Hier wurden die Hüllenhälften 4 vorher in der in 8 dargestellten Form hergestellt. Dann werden der flüssige Kern 1 und 3 und das Netz 2 zugesetzt und die Formen zusammengepresst. Die Bindung zwischen den gelierten Hüllenhälften 4 und dem flüssigen Kern 3 erfolgt wie oben beschrieben, wonach die Anordnung in einen Vernetzer (z.B. Calciumionenlösung) getaucht wird, um eine vollständige Gelierung des gesamten mit einer Hülle überzogenen Kerns zu erreichen.
3 zeigt außerdem die entscheidenden Bereiche nahe des Randes der Form, wo der Kern und die beiden Formhälften zusammenstoßen. Die Abmessungen des Im plantats und seiner Schichten werden wie oben beschrieben durch die Formabmessungen gesteuert.
Eine ähnliche Wirkung wie durch das Verflüssigungsmittel kann erzielt werden, indem Barium in das Gel eindiffundiert wird, bevor das flüssige Alginat in Kontakt mit dem gelierten Alginat gebracht wird. Das an die Alginsäure gebundene Barium wird durch die einwertigen Kationen des flüssigen Alginats verdrängt und diffundiert dort, wo es mit Resten des flüssigen Alginats wechselwirkt, aus dem Gel in die Flüssigkeit, wodurch es das flüssige Alginat teilweise vernetzt und das Alginatgel teilweise verflüssigt. Eine darauf folgende Behandlung mit einem Chelatbildner vervollständigt die Vernetzung der beiden Schichten.
Eine weitere Variante besteht in der Herstellung von Hüllenhälften durch Auftragen von flüssigem Alginat auf Membranen, die durch Benetzung mit einem Verflüssigungsmittel vom frisch hergestellten, mit einer Hülle überzogenen Kern abgezogen werden können.
Es gibt zahlreiche weitere Variationen des Gelier-, Vernetzungs- und Diffusionsablaufs mithilfe von Gelier- und Verflüssigungsmitteln, von denen einige in den Beispielen beschrieben werden.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung anhand einiger spezifischer, nicht einschränkender Beispiele genauer erläutert. Sofern nicht anders angegeben sind die Prozentsätze in Gewichtsprozent und die Temperatur in Grad Celsius angegeben. Alle Lösungen sind wässrig, sofern nicht anders angeführt.
Beispiel 1
Herstellung einer Na-Alginatlösung
Kurz zusammengefasst wurde eine Lösung eines Na-Alginats (LV Alginate/Kelco Division von Merck & Co.) durch Filtration gereinigt und mit aktivierter Kohle (perchlo ratgebleicht) behandelt. Die resultierende Lösung wurde ausgefällt, indem der pH mit HCl auf 2 eingestellt wurde. Der Niederschlag wurde in einer 120-mM-NaCl-5-μM-EDTA-10-mM-HEPES-Lösung wieder gelöst und durch Zusatz von Ethanol erneut ausgefällt. Der Niederschlag wurde teilweise in 1 M KCl wieder gelöst, und der verbleibende unlösliche Anteil wurde in einer 120-mM-NaCl-5-μM-EDTA-10-mM-HEPES-Lösung gelöst und durch Zusatz von Ethanol erneut ausgefällt. Der letzte Niederschlag wurde gründlich mit Ethanol gewaschen und bei 80°C im Vakuum getrocknet.
Um Alginatlösungen mit einer Konzentration unter 5% herzustellen, wurde das resultierende trockene Material wieder in 10 mM HEPES, 10 mM Na-Citrat, 110 mM NaCl gelöst, gegen 10 mM HEPES, 10 mM Na-Citrat, 110 mM NaCl dialysiert (10 kD) und durch eine 0,1-μm-Membran filtriert.
Um Alginatlösungen mit einer Konzentration von über 5% herzustellen, wurde das resultierende trockene Material zu einer 1%igen Lösung gelöst, gegen H₂O dialysiert (10 kD) und dann durch eine 0,1-μm-Membran filtriert. Das Alginat wurden steril gefriergetrocknet und dann in sterilem 10 mM HEPES, 10 mM Na-Citrat, 110 mM NaCl wieder in der gewünschten Konzentration gelöst.
Beispiel 2
Herstellung einer Inselsuspension
Der Vorgang wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Aus Ratten isolierte Inseln wurden mit isotonischem NaCl gewaschen und mit einer 2%igen Alginatlösung (durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren hergestellt) zu einer Konzentration von 150.000 Inseln pro Milliliter suspendiert.
Beispiel 3
Herstellung eines bioartifiziellen Implantats durch ein Beschichtungsverfahren für Gummiformteile
Der Vorgang wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Unter Verwendung der Hüllenform wurden die beiden Hälften der Hülle wie folgt hergestellt. Ein dünner Kunststofffilm wurde auf die obere Hüllenform aufgetragen. Eine 20%ige Na-Alginatlösung wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt, dann wurde ein Menge, die ausreicht, um eine 20-μm-Alginat-Hüllenhälfte herzustellen, auf die untere Form aufgetragen. Dieses Material wird als Gummi bezeichnet, weil es, obwohl es flüssig ist, aufgrund der hohen Alginatkonzentration viskos ist. Die beiden Formhälften wurden zusammengepresst. Die obere Form wurde entfernt, und der dünne Kunststofffilm wurde vorsichtig von der Hüllenhälfte abgezogen. Die zweite Hüllenhälfte wurde auf die gleiche Weise hergestellt.
Eine Hälfte der in Beispiel 2 beschriebenen Inselsuspension wurde auf die hergestellte Hüllenhälfte aufgetragen, die in der unteren Hüllenform verblieben war. Ein Netz (Allied Silicone, Ventura, Kalifornien, USA) wurde auf eine Größe zugeschnitten, die etwas kleiner als der Innendurchmesser der Form war (sodass es in die Vertiefung in der hergestellten Hüllenhälfte passt, die für den Kern gedacht ist). Die verbleibende Hälfte der Inselsuspension wurde auf das Netz in der unteren Hüllenform gefüllt. Das Gesamtvolumen des Netzes und der Suspension wurde so gewählt, dass es den Hohlraum zwischen den Hüllenhälften exakt ausfüllte. Die andere untere Hüllenform wurde umgedreht und vorsichtig auf die auf die erste Hüllenform gepresst und festgeklemmt. Da sowohl der Kern als auch die Hüllenalginate flüssig sind, diffundierten sie sofort ineinander. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und der mit einer Hülle überzogene Kern wurde entnommen.
Die obere und untere Form wurden mit einer Lösung aus 120 mM CaCl₂ und 10 mM HEPES benetzt. Eine 2%ige Lösung eines Na-Alginats wurde durch das Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt, und zwar ein Volumen, das zur Herstellung einer 20-μm-Deckschicht ausreicht. Eine Hälfte der Na-Alginatlösung wurde in die Deckschichtform gefüllt. Der mit einer Hülle überzogene Kern wurde gründlich mit wässrigem 120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen und vorsichtig in die Deckschichtform eingebracht. Die zweite Hälfte der Na-Alginatlösung wurde in die Deckschichtform gefüllt. Die obere Deckschichtform wurde auf die untere Deckschichtform gepresst und festgeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine wässrige 120-mM-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und der mit einer Deckschicht und einer Hülle überzogene Kern (das komplette bioartifizielle Implantat) wurde entnommen.
Beispiel 4
Herstellung eines bioartifiziellen Implantats durch teilweise Hüllenverflüssigung
Der Vorgang wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Unter Verwendung der Hüllenform wurden die beiden Hälften der Hülle wie folgt hergestellt. Eine 20%ige Na-Alginatlösung wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt, dann wurde ein Menge, die ausreicht, um eine 20-μm-Alginat-Hüllenhälfte herzustellen, auf jede der unteren Hüllenformen aufgetragen. Die beiden oberen Formen wurden auf die unteren Formen gesetzt, zusammengepresst und zusammengeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen.
Die obere Form wurde entfernt, und die Hüllen wurden an Ort und Stelle gründlich mit 120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen. Eine Hälfte der in Beispiel 2 beschriebenen Inselsuspension wurde auf die hergestellte Hüllenhälfte aufgetragen, die in der unteren Hüllenform verblieben war. Ein Netz (Allied Silicone, Ventura, Kalifor nien, USA) wurde auf eine Größe zugeschnitten, die etwas kleiner als der Innendurchmesser der Form war (sodass es in die Vertiefung in der hergestellten Hüllenhälfte passt, die für den Kern gedacht ist). Die verbleibende Hälfte der Inselsuspension wurde auf das Netz in der unteren Hüllenform aufgebracht. Das Gesamtvolumen des Netzes und der Suspension wurde so gewählt, dass es den Hohlraum zwischen den Hüllenhälften exakt ausfüllte. Die andere untere Hüllenform wurde umgedreht und vorsichtig auf die auf die erste Hüllenform gepresst und festgeklemmt. Nach 5 Minuten Inkubation, um eine teilweise Auflösung des Hüllenalginatgels durch Wechselwirkung mit Citrat in der Inselalginatsuspension zu ermöglichen, wurde die Anordnung 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und der mit einer Hülle überzogene Kern wurde entnommen.
Die obere und untere Deckschichtform wurden mit einer Lösung von 120 mM CaCl₂ und 10 mM HEPES benetzt. Eine 2%ige Lösung eines Na-Alginats wurde durch das Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt, und zwar ein Volumen, das zur Herstellung einer 20-μm-Deckschicht ausreicht. Eine Hälfte der Na-Alginatlösung wurde in die Deckschichtform gefüllt. Der mit einer Hülle überzogene Kern wurde gründlich mit wässrigem 120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen und vorsichtig in die Deckschichtform eingebracht. Die zweite Hälfte der Na-Alginatlösung wurde in die Deckschichtform gefüllt. Die obere Deckschichtform wurde auf die untere Deckschichtform gepresst und festgeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine wässrige 120-mM-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und der mit einer Deckschicht und einer Hülle überzogene Kern (das komplette bioartifizielle Implantat) wurde entnommen.
Beispiel 5
Herstellung eines bioartifiziellen Implantats durch teilweise Kern-Hüllen-Grenzflächenverflüssigung
Der Vorgang wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Unter Verwendung der Hüllenform wurden die beiden Hälften der Hülle wie folgt hergestellt. Eine 20%ige Na-Alginatlösung wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt, dann wurde ein Menge die ausreicht, um eine 20-μm-Alginat-Hüllenhälfte herzustellen, auf jede der unteren Hüllenformen aufgetragen. Die beiden oberen Formen wurden auf die unteren Formen gegeben, zusammengepresst und zusammengeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen.
Die obere Form wurde entfernt, und die Hüllen wurden an Ort und Stelle gründlich mit 120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen. Eine Hälfte der in Beispiel 2 beschriebenen Inselsuspension wurde in die untere Hüllenform gefüllt. Ein Netz (Allied Silicone, Ventura, Kalifornien, USA) wurde auf eine Größe zugeschnitten, die etwas kleiner als der Innendurchmesser der Form war (sodass es in die Vertiefung in der hergestellten Hüllenhälfte passt, die für den Kern gedacht ist). Die verbleibende Hälfte der Inselsuspension wurde auf das Netz in der unteren Hüllenform aufgebracht. Das Gesamtvolumen des Netzes und der Suspension wurde so gewählt, dass es den Hohlraum zwischen den Hüllenhälften exakt ausfüllte. Die beiden Formen wurden zusammengepresst und festgeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen.
Die obere und untere Kernform wurden getrennt, und der Kern wurde herausgenommen. Einige Tropfen 1,5%iges Na-Alginat-10-mM-Na-Citrat-10-mM-HEPES-110-mM-NaCl wurden in die Mitte einer der Hüllenhälften in der Hüllenformhälfte aufgebracht. Der Kern wurde darauf aufgebracht, und einige Tropfen 1,5%iges Na-Alginat-10-mM-Na-Citrat-10-mM-HEPES-110-NaCl wurden auf den Kern aufgetragen. Die andere Hüllenhälfte in ihrer Hüllenform wurde daraufgepresst, und die gesamte Anord nung wurde zusammengeklemmt. Dann wurde die Anordnung 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um den Alginatkern an die Hülle zu binden. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und der mit einer Hülle überzogene Kern wurde entnommen.
Die obere und untere Deckschichtform wurden mit einer Lösung von 120 mM CaCl₂ und 10 mM HEPES benetzt. Eine 2%ige Lösung eines Na-Alginats wurde durch das Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt, und zwar ein Volumen, das zur Herstellung einer 20-μm-Deckschicht ausreicht. Eine Hälfte der Na-Alginatlösung wurde in die Deckschichtform gefüllt. Der mit einer Hülle überzogene Kern wurde gründlich mit 120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen und vorsichtig in die Deckschichtform eingebracht. Die zweite Hälfte der Na-Alginatlösung wurde in die Deckschichtform gefüllt. Die obere Deckschichtform wurde auf die untere Deckschichtform gepresst und festgeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine wässrige 120-mM-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und der mit einer Deckschicht und einer Hülle überzogene Kern (das komplette bioartifizielle Implantat) wurde entnommen.
Beispiel 6
Herstellung eines bioartifiziellen Implantats durch ein Diffusionsbeschichtungsverfahren
Der Vorgang wurde unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Eine Hälfte der in Beispiel 2 beschriebenen Inselsuspension wurde in die untere Kernform gegeben. Ein Netz (Allied Silicone, Ventura, Kalifornien, USA) wurde auf eine Größe zugeschnitten, die etwas kleiner als der Innendurchmesser der Form war (sodass es in die Vertiefung in der hergestellten Hüllenhälfte passt, die für den Kern gedacht ist). Die verbleibende Hälfte der Inselsuspension wurde auf das Netz in der unteren Kernform aufgebracht. Das Gesamtvolumen des Netzes und der Suspension wurde so gewählt, dass es den Hohlraum zwischen den Hüllenhälften exakt ausfüllte. Die beiden Formen wurden zusammengepresst und festgeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine 120-m-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen.
Die obere und untere Kernform wurden getrennt, und der Kern wurde entnommen und 5 Minuten lang in 120 mM BaCl₂, 10 mM HEPES getaucht, um eine Austauschreaktion zwischen Ca- und Ba-Ionen zu bewirken. Dann wurde. der Kern gründlich mit 120 mM NaCl gewaschen.
Eine Lösung von 20% Na-Alginat, die gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt worden war, mit einem Volumen, das zur Herstellung einer 20-μm-Deckschicht ausreicht, wurde hergestellt, und die Hälfte des Volumens wurde auf die untere Hüllenform aufgetragen. Der Kern wurde daraufgegeben, mit der verbleibenden Alginatlösung bedeckt und 5 Minuten lang inkubiert, damit ein Austausch zwischen dem Natrium in der Hüllenalginatlösung und dem an das Kernalginat gebundenen Barium stattfinden kann und das freigesetzte Barium in das Hüllenalginat diffundieren und dieses vernetzen kann. Die Anordnung wurde dann 30 Minuten lang in eine 120-mM-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt und der mit einer Hülle überzogene Kern wurde entnommen.
Die obere und untere Deckschichtform wurden mit einer Lösung von 120 mM CaCl₂ und 10 mM HEPES benetzt. Eine 2%ige Lösung eines Na-Alginats wurde durch das Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt, und zwar ein Volumen, das zur Herstellung einer 20-μm-Deckschicht ausreicht. Eine Hälfte der Na-Alginatlösung wurde in die Deckschichtform gefüllt. Der mit einer Hülle überzogene Kern wurde gründlich mit 120 mM NaCl, 10 mM HEPES gewaschen und vorsichtig in die Deckschichtform eingebracht. Die zweite Hälfte der Na-Alginatlösung wurde in die Deckschichtform gefüllt. Die obere Deckschichtform wurde auf die untere Deckschichtform gepresst und festgeklemmt. Die Anordnung wurde 30 Minuten lang in eine wässrige 120-mM-CaCl₂-10-mM-HEPES-Lösung getaucht, um das Alginat zu vernetzen. Die beiden Formhälften wurden getrennt, und der mit einer Deckschicht und einer Hülle überzogene Kern (das komplette bioartifizielle Implantat) wurde entnommen.
Beispiel 7
Langerhanssche-Inseln-Implantat in Mäusen mit Diabetes (IP)
In Balb/C-Wirtsmäusen wurde durch eine IP-Injektion von 250 mg/kg Streptozotocin, und zwar 50 mg/ml in 0,1 M Citratpuffer, pH = 4,5 einige Tage vor einer Implantation, Diabetes hervorgerufen. Bioartifizielle Implantate, die gemäß Beispiel 4 hergestellt worden waren und 2000–3000 Inseln enthielten, wurden durch einen Bauchschnitt in die Cavitas peritonealis eingebracht, und die Mäuse wurden vernäht.

Claims

Lebensfähiges, physiologisch aktives und biokompatibles Zell- oder Gewebeimplantat, umfassend ein biokompatibles geliertes Alginat, das so gereinigt ist, dass es keine Fibrose induziert, eine Konfiguration eines dünne Blatts mit einer Dicke zwischen 10 μm und 400 μm aufweist und einen Kern (1–3) aus lebendem Gewebe oder Zellen umfasst, der zumindest 100.000 Zellen in einer ersten Alginatschicht umfasst und von einer Hülle (4) aus einem zweiten Alginat umgeben ist, das dasselbe oder ein anderes als das erste Alginat sein kann, wobei das Implantat eine Durchlässigkeit aufweist, die ausreicht, um Diffusion und Freisetzung von Proteinen mit mittlerer Größe aus dem Implantat in den Wirtskörper zu ermöglichen.
Implantat nach Anspruch 1, worin das Implantat zumindest 1.000.000 Zellen umfasst.
Implantat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Durchlässigkeit ausreicht, um Diffusion und Freisetzung von Proteinen mit einem Molekulargewicht von über 200 kD zu hemmen, jedoch wirksame Diffusion und Freisetzung von Proteinen mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 75 kD zu ermöglichen.
Implantat nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3 mit (a) einem Gesamtvolumen von über 10 mm³ und (b) einem Gewebe- oder Zellgehalt von zumindest 10 Vol.-%, wodurch ausreichende Sauerstoffdiffusion ermöglicht wird, um Zell- oder Gewebe-Lebensfähigkeit beizubehalten, wenn das Implantat an einer vaskularisierten Stelle in einem Patienten implantiert wird.
Implantat nach Anspruch 4, worin das Gesamtvolumen zumindest 100 mm³ beträgt.
Implantat nach Anspruch 4, worin das Gesamtvolumen zumindest 500 mm³ beträgt.
Implantat nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin der Gewebe- oder Zellgehalt zumindest 20 Vol.-% beträgt.
Implantat nach Anspruch 7, worin der Gewebe- oder Zellgehalt zumindest 35 Vol.-% beträgt.
Implantat nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Implantat wiedergewinnbar ist.
Implantat nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Kern weiters einen oder mehrere Nährfaktoren und/oder Nährzellen umfasst.
Implantat nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Kern weiters ein Substratmaterial (2) umfasst.
Implantat nach Anspruch 11, worin der Kern weiters ein Antioxidansmaterial umfasst.
Implantat nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das lebende Gewebe Langerhanssche Inseln umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines biokompatiblen Implantats, das ein biokompatibles geliertes Alginat umfasst, das so gereinigt ist, dass es keine Fibrose induziert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: das Kombinieren von lebendem Gewebe oder Zellen, das bzw. die zumindest 100.000 zu implantierende Zellen umfasst bzw. umfassen, mit einer Alginatlösung, wobei die Alginatkonzentration ausreicht, um in Gegenwart eines Vernetzers ein Gel zu bilden; das Kontaktieren des resultierenden Gemisches in Form einer dünnen Schicht mit einer Lösung des Vernetzers in ausreichender Konzentration, um das Alginat zu gelieren; und das Ausbilden einer Beschichtungsschicht darauf, die ein biokompatibles Alginatgel umfasst; um ein Implantat in Form eines dünnen Blatts mit einer Dicke zwischen 10 μm und 400 μm zu bilden, das eine Durchlässigkeit aufweist, die ausreicht, um Diffusion und Freisetzung von Proteinen mit mittlerer Größe aus dem Implantat in den Wirtskörper zu ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Beschichtungsschicht durch Kontaktieren des gelierten Alginats mit einem flüssigen Alginat gebildet wird, das ausreichend Chelatbildner umfasst, um zumindest einen Teil des Gels zu verflüssigen.
Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15 zur Herstellung eines Implantats nach einem der Ansprüche 2 bis 13.