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Hintergrund der Erfindung
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A. Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Cellulasezusammensetzungen.
Die Erfindung betrifft ferner neue Cellulasezusammensetzungen, vorzugsweise
abgeleitet von Bacillus sp.. Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin die Verwendung der neuen Cellulase in Zusammensetzungen,
von denen auf dem Gebiet bekannt ist, daß es vorteilhaft ist, wenn ihnen
Cellulase zugefügt
wird, einschließlich
als Additiv in einer Detergenszusammensetzung, bei der Behandlung
von cellulosehaltigen Stoffen, bei der Behandlung von Zellstoff
und Papier und bei der Behandlung von Stärke für die Herstellung von hoch fruktosehaltigem
Maissirup oder Ethanol.
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B. Stand der Technik
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sCellulasen
sind Enzyme, die zu einer Hydrolyse der β-D-glucosidischen Bindungen
bei Cellulosen fähig
sind. Cellulolytische Enzyme wurden traditionell in drei Hauptklassen
eingeteilt: Endoglucanasen, Exoglucanasen oder Cellobiohydrolasen
und R-Glucosidasen (J. Knowles et al. (1987), TIBTECH 5, 255–261), und
es ist bekannt, daß sie
von einer großen
Anzahl von Bakterien, Hefen und Pilzen erzeugt werden.
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Unter
den Anwendungen, die für
die Verwendung von cellulolytischen Enzymen entwickelt wurden, sind
diejenigen hervorstehend, die eine Degradierung von (Holz)Zellstoffen
zu Zuckern für
die (Bio)Ethanolproduktion involvieren, Textilbehandlungen, wie
das "Stone washing" und "Biopolishing" und Detergenszusammensetzungen.
So sind Cellulasen dafür
bekannt, daß sie
in Detergenszusammensetzungen für
die Entfernung von Dreck, d. h. für die Säuberung, geeignet sind. Die
britischen Anmeldungen Nr. 2 075 028, 2 095 275 und 2 094 826 illustrieren
zum Beispiel eine verbesserte Säuberungsleistung,
wenn die Detergenzien Cellulase enthalten. Zusätzlich illustriert die britische
Anmeldung Nr. 1 358 599 die Verwendung von Cellulase in Detergenzien zur
Reduktion der Härte
von baumwollhaltigen Stoffen.
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Ein
anderes geeignetes Merkmal von Cellulasen bei der Behandlung von
Textilien ist ihre Fähigkeit,
gebrauchte Stoffe wieder zu verbessern, indem ihre Farben wieder
lebhafter gemacht werden. Wiederholtes waschen von baum wollhaltigen
Stoffen führt
zum Beispiel zu einem Grauschleier, von dem angenommen wird, daß er an
zerstörten
und unordentlichen Fasern liegt, die manchmal als "Pillingbildung" bezeichnet werden,
ausgelöst
durch mechanische Wirkungen. Dieser Grauschleier ist insbesondere
bei farbigen Stoffen bemerkbar. In der Konsequenz ist die Fähigkeit
der Cellulose, die unordentliche Oberschicht der Faser zu entfernen
und so. das Gesamterscheinungsbild des Stoffes zu verbessern, von
Wert.
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Trotz
Kenntnissen im Stand der Technik in Bezug auf viele Cellulasezusammensetzungen
mit einigen oder allen obigen Eigenschaften besteht ein fortgesetzter
Bedarf an neuen Cellulasen mit einem variierenden Spektrum von Eigenschaften,
die zum Beispiel bei der Behandlung von Textilien, als Bestandteil
von Detergenszusammensetzungen, bei der Behandlung von Zellstoff
und Papier und bei der Umwandlung von Biomasse nützlich sind. Die Anmelder haben
bestimmte Cellulasen entdeckt, die ein solches Komplement an Eigenschaften
aufweisen und die für
die bekannten Anwendungen von Cellulase nützlich sind.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Cellulase
mit günstigen
Eigenschaften zur Verwendung in Detergenzien, für die Behandlung von Textilien
und Zellstoff und die Papierherstellung bereitzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Cellulase, umfassend eine
Aminosäuresequenz
gemäß 2A–2C (SEQ
ID NO: 1) oder ein Derivat davon mit mehr als 80% Sequenzidentität und vorzugsweise
mindestens 90% Sequenzidentität.
Die neue Cellulase umfaßt
eine Aminosäuresequenz
gemäß den 2A–2C (SEQ
ID NO: 1) und ist von Bacillus sp. CBS 669.93 abgeleitet. CBS 669.93
ist beim Centraalbureeau voor Schimmelcultures (CBS), Baam, Niederlande
unter der Hinterlegungsnummer CBS 669.93 am 23. Dezember 1993 ("CBS 669.93") hinterlegt worden.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend DNA, die eine
Aminosäuresequenz
gemäß den 2A–2C (SEQ
ID NO: 1) kodiert oder ein Derivat davon mit mehr als 80% Sequenzidentität und vorzugsweise
90% Sequenzidentität.
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Gemäß noch einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren zur Transformation eines geeigneten
Mikroorganismus mit DNA bereitgestellt, kodierend eine Aminosäuresequenz gemäß der Erfindung.
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Die
Cellulase kann eine Cellulase sein, abgeleitet von Bacillus sp.
CBS 669.93, mit einem berechneten Molekulargewicht von ungefähr 63 kD.
Die ungefähr
63 kD Cellulase hat einen berechneten isoelektrischen Punkt von
ungefähr
5 und ein pH-Optimum auf CMC von ungefähr 6 bei 40°C und 60°C.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1 zeigt
die pH-Profilaktivität
der Cellulase mit ungefähr
63 kD, abgeleitet von CBS 699.93, bei 40 und 60°C.
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Die 2A–2C zeigen
die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 2) und die korrespondierende Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 1) einer Cellulase mit ungefähr 63 kD, abgeleitet von CBS
669.93, wobei die Leader-Peptidsequenz unterstrichen ist, die bei
Sekretion abgespalten wird, um das reife Enzym zu ergeben.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Es
ist beabsichtigt, daß "Derivat" ein Protein bezeichnet,
das von dem nativen Protein durch Addition von einer oder mehreren
Aminosäuren
entweder zum C- oder N-terminalen Ende des nativen Proteins oder
zu beiden, durch Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an
einer oder einer Anzahl unterschiedlicher Stellen in der nativen
Aminosäuresequenz,
durch Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren an einem oder beiden Enden
des nativen Proteins oder an einer oder mehreren Stellen in der
Aminosäuresequenz
oder durch Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren an
einer oder mehreren Stellen in der nativen Aminosäuresequenz
abgeleitet ist. Die Präparation
eines Enzymderivats wird vorzugsweise durch Modifikation einer DNA-Sequenz
erreicht, die das native Protein kodiert, Transformation der DNA-Sequenz
in einen geeigneten Wirt und Expression der modifizierten DNA-Sequenz
zur Bildung des Derivatenzyms. Das Derivat der Erfindung beinhaltet
Peptide, umfassend geänderte
Aminosäuresequenzen
im Vergleich mit einer Vorläuferenzym-Aminosäuresequenz
(z. B. einem Wildtyp oder nativen Enzym der vorliegenden Erfindung),
wobei die Peptide eine charakteristische Enzymnatur des Vorläuferenzyms
beibehalten, jedoch mit geänderten
Eigenschaften in irgendeinem spezifischen Aspekt. Zum Beispiel kann
eine geänderte
Cellulase ein erhöhtes
pH-Optimum oder einen erhöhten
Temperaturwiderstand aufweisen, jedoch die charakteristische cellulolytische
Aktivität
beibehalten. Derivate beinhalten auch chemische Modifikationen von
Aminosäureresten
innerhalb des Enzymmoleküls.
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"Wirtszelle" bedeutet eine Zelle,
die als Wirt und als Expressionsvehikel für einen rekombinanten DNA-Vektor
gemäß der vorliegenden
Erfindung wirken kann. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
gemäß der vorliegenden
Erfindung bedeutet "Wirtszelle" Zellen von Bazillus.
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"DNA-Konstrukt" oder "DNA-Vektor" bedeutet eine Nukleotidsequenz,
die ein oder mehr DNA-Fragmente umfaßt, kodierend irgendeine der neuen
Cellulasen oder Cellulasederivate wie oben beschrieben.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform ist
die Cellulase von dem Centraalbureeau voor Schimmelcultures, Baam,
Niederlande durch die Hinterlegungsnummer für Mikroorganismen CBS 669.93 (beschrieben
in der Anmeldung PCT/EP94/04312), hinterlegt am 23. Dezember 1993
nach dem Budapester Vertrag, erhältlich.
Wie hier verwendet, wird die hinterlegte Art als CBS 669.93 bezeichnet.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
weist die Cellulase der Erfindung ungefähr 63 kD auf (berechnet auf
Basis der Aminosäuresequenz
des reifen Proteins), abgeleitet von CBS 669.93 (hier bezeichnet als "Cellulase mit 63
kD"). Die Cellulase
mit ungefähr 63
kD hat einen kalkulierten pI für
das reife Protein von ungefähr
5 und ein pH-Optimum auf CMC bei 40 und 60°C von ungefähr 6.
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Das
Gen, das die Aminosäuresequenz
der Cellulase mit ungefähr
63 kD kodiert, wurde durch Vergleich mit den zugänglichen Sequenzdaten in verschiedenen
Bibliotheken analysiert (GenBank, Swiss-Prot, EMBL und PIR) unter
Verwendung des CACOS/CAMM-Centers, Universität von Nijmegen, Holland. Eine
Recherche der Datenbanken für
einen Vergleich der Cellulase, kodiert durch die DNA-Sequenz der
vorliegenden Erfindung, mit Cellulasen, kodiert durch veröffentlichte
oder bekannte Cellulase-Gensequenzen, ergab, daß die höchste Menge an Aminosäureidentität bei der
Cellulase CeIB von Bacillus lautus angetroffen wurde.
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Die
Cellulase mit ungefähr
63 kD hat sich als 58% identisch in der Sequenz und 72% ähnlich in
der Sequenz unter Verwendung des TFastA-Programms erwiesen, wie
beschrieben von Pearson & Lipman, Proc.
Nat. Acad. Sci., Bd. 85, S. 2444–2448 (1988). Das TFastA-Data
Searching-Programm ist kommerziell erhältlich in der Sequence Analysis
Software Package Version 6.0 (Genetic Computer Group, Univ. Wisconsin
Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705). Die Sequenz von
Bacillus lautus wird in Jorgensen et al., Gene, Bd. 93, S. 55–60 (1990)
angetroffen. Die vorliegende Erfindung umfaßt eine Cellulase, die eine
Aminosäuresequenz
gemäß der der 2A–2C (SEQ
ID NO: 1) aufweist oder ein Derivat davon mit mehr als 80% Sequenzidentität und vorzugsweise
mehr als 90% Sequenzidentität.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren für die Herstellung
der Cellulase. Gemäß einer
Ausführungsform
kann die Cellulase durch Kultivieren eines geeigneten Organismus,
z. B. Bacillus sp. CBS 669.93, unter Bedingungen erzeugt werden, um
die Cellulase zu erzeugen.
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Vorzugsweise
beinhalten solche Bedingungen die, die allgemein für die Kultivierung
von Bazillus vorgeschlagen werden, um die Cellulaseproduktion zu
maximieren, und beinhalten die Verwendung eines von Cellulose abgeleiteten
Substrats als Energiequelle in Kombination mit notwendigen Salzen,
Ionen und anderen wohlbekannten Bestandteilen. Im allgemeinen kann
das für
die Kultivierung der Zellen verwendete Medium ein konventionelles
Medium sein, das für
die Anzüchtung
von Bakterien geeignet ist. Die Zellen können unter aeroben Bedingungen
in einem Nährmedium,
das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, zusammen
mit anderen essentiellen Nährstoffen
kultiviert werden. Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate,
wie z. B. Saccharose, Glucose und Stärke, oder Kohlenhydrat-haltige Materialien,
wie z. B. Getreidekörner,
Malz, Reis und Sorghum. Die Kohlenhydratkonzentration, die in dem Medium
enthalten ist, kann in einem breiten Bereich variieren, z. B. bis
zu 25% und nach unten bis 1–5%, jedoch
werden in der Regel 8–10%
geeignet sein, wobei die Prozentzahlen als Äquivalente von Glucose berechnet
sind. Die Stickstoffquelle in dem Nährmedium kann von anorganischer
und/oder organischer Natur sein. Geeignete anorganische Stickstoffquellen
sind Nitrate und Ammoniumsalze. Unter den organischen Stickstoffquellen,
die üblicherweise
in Fermentationsverfahren verwendet werden, die die Kultivierung
von Bakterien involvieren, befinden sich Sojamehl, Baumwollsaatmehl,
Erdnußmehl,
Kasein, Mais, Maisquellflüssigkeit,
Hefeextrakt, Harnstoff und Albumin. Zusätzlich sollte das Nährmedium
auch Standardspurensubstanzen enthalten.
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Die
Cellulase kann aus dem Medium durch konventionelle Verfahren gewonnen
werden, einschließlich
der Abtrennung der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation oder
Filtration, falls notwendig nach Aufbrechen der Zellen, Präzipitation
der proteinartigen Bestandteile des Überstands oder Filtrats durch
ein Salz, z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt von einer Reinigung durch
eine Vielzahl chromatographischer Verfahren, z. B. Ionenaustauschchromatographie,
Affinitätschromatographie
oder ähnliche
auf dem Gebiet anerkannte Verfahren. Für die Herstellung der alkalischen
Cellulase gemäß der Erfindung wird
es bevorzugt, unter alkalischen Bedingungen unter Verwendung von
Medien zu kultivieren, die eine auf Cellulose basierende Energiequelle
enthalten.
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Vorzugsweise
wird die Cellulase gemäß der vorliegenden
Erfindung unter Verwendung von gentechnischen Verfahren erzeugt,
durch Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einem Gen,
kodierend die Cellulase, und Expression unter Bedingungen, die für das Wirtszellwachstum
und die Cellulase expression geeignet sind. In einem ersten Schritt kann
die chromosomale DNA von einem Donorbakterienstamm durch das Verfahren
von Saito und Miura (Saito & Miura,
Biochim. Biophys. Acta., Bd. 72, S. 619 (1963)) erhalten werden
oder durch ein ähnliches
Verfahren. Eine Restriktionsenzymspaltung der so erhaltenen chromosomalen
DNA ergibt DNA-Fragmente, die das alkalische Cellulasegen enthalten.
Zu diesem Zweck kann jedes Restriktionsenzym verwendet werden, unter
der Voraussetzung, daß es
die Region des Gens nicht spaltet. Alternativ kann ein Restriktionsenzym
verwendet werden, das das Gen spaltet, unter Verwendung von jedoch
einer reduzierten Enzymkonzentration oder Inkubationszeit, um nur
einen teilweisen Verdau zu ermöglichen. Eine
bevorzugte Restriktionsendonuklease ist Sau3A. Aus der sich ergebenden
Verdaumischung können
geeignete Fragmente (4–10
kb) isoliert und zur Transformation einer geeigneten Wirtszelle
mit einem DNA-Konstrukt, z. B. mit einem DNA-Konstrukt, einschließlich dem
DNA-Fragment mit ungefähr
9 kb, kodierend die Cellulase mit 63 kD gemäß der Erfindung, in Kombination
mit einer geeigneten Vektorsequenz verwendet werden.
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Das
die Cellulase der vorliegenden Erfindung kodierende Gen kann unter
Verwendung von λ-Phagen(Expressions)-Vektoren
und E. coli Wirtszellen kloniert werden. (Alternativ kann ein PCR-Klonieren
unter Verwendung von Konsensusprimern verwendet werden, die auf
konservierten Domänen entworfen
wurden.) Die Anmelder haben festgestellt, daß die Transformation des die
Cellulase der vorliegenden Erfindung kodierenden Gens und die Expression
in E. coli zu einem aktiven Protein führt. Nach einem ersten Klonierungsschritt
in E. coli kann ein Cellulasegen gemäß der vorliegenden Erfindung
in einen bevorzugteren industriellen Expressionswirt transferiert
werden, wie z. B. Bazillus- oder Streptomyces-Arten, einen filamentösen Pilz,
wie z. B. Aspergillus oder Trichoderma, oder eine Hefe, wie z. B. Saccharomyces.
Hohe Expressionsniveaus und hohe Sekretion, die in diesen Wirtsorganismen
erhältlich
sind, ermöglichen
die Akkumulation der Cellulase in dem Fermentationsmedium, aus dem
sie dann gewonnen werden kann.
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Die
Expressionswirtszelle kann eine Bazillusart umfassen, z. B. Bacillus
licheniformis oder Bacillus subtilis. Bei einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
wird der Transformationswirt für
Proteasegene deletiert, um sicherzustellen, daß die endgültige Cellulase keiner Proteolyse
in der Fermentationsbrühe
oder Konzentraten davon unterzogen wird. Ein bevorzugtes allgemeines
Transformations- und Expressionsprotokoll für Protease-deletierte Bazillusstämme wird
von Ferrari et al., US-Patent 5,264,366, das hier durch Bezugnahme
inkorporiert ist, bereitgestellt. Außerdem wird die Fermentation des
transformierten Bazilluswirts vorzugsweise bei einem pH von ungefähr 6,9 durchgeführt. Die
Transformation und Expression in Aspergillus wird zum Beispiel in
Berka et al., US-Patent 5,364,770, hier durch Inbezugnahme inkorporiert,
beschrieben. Ein bevorzugter Promotor in dem Fall, in dem die Transformationswirtszelle
Bazillus ist, ist der aprE-Promotor.
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Die
vorliegende Cellulase mit ungefähr
63 kD, abgeleitet von CBS 669.93, hat sich als nützlich in Puffersystemen erwiesen,
die Glycin, Ammoniumacetat, Borax und/oder Tris umfassen. von dieser Cellulase
wurde auch gezeigt, daß sie
auf CMC durch die Gegenwart von Magnesium aktiviert und durch die
Gegenwart von Calcium inhibiert wird. Ein Anteil von Magnesium zu
Calcium von ungefähr
250 ppm : 750 ppm hat sich als für
die Aktivität
günstig
erwiesen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung können die
oben beschriebenen Cellulasezusammensetzungen in Detergenszusammensetzungen
gemäß auf dem
Gebiet anerkannten Verfahren zur Verwendung von Cellulasen in Detergenzien
verwendet werden. Die ausgezeichnete Aktivität der gegenwärtigen Cellulase
bei alkalischem pH sollte dazu führen,
daß die gegenwärtige Cellulase
insbesondere für
Detergenzien mit hohem pH geeignet ist.
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Die
Erfindung wird in größerem Detail
in den folgenden Beispielen erklärt,
die für
illustrative Zwecke bereitgestellt werden und die Erfindung nicht
begrenzen sollen.
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Beispiel 1
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Screening und Isolieren
von Cellulase aus alkalischen Erd- und Wasserproben
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Zwei
Verfahren werden für
die Isolierung von Cellulase erzeugenden Mikroorganismen aus alkalischen
Erd- und Wasserproben verwendet. Bei einem Verfahren werden die
Erd- und Wasserproben in 0,85%iger Salzlösung suspendiert und direkt
in einem Carboxymethylcellulose(CMC)-Agardiffusionsassay für den Nachweis
von Cellulase erzeugenden Kolonien verwendet. Bei einem zweiten
Verfahren wurden die Erd- und Wasserproben für cellulasehaltige Stämme durch
Inkubation in einem cellulosehaltigen flüssigen Minimalmedium oder GAM-Medium für 1 bis
3 Tage bei 40°C
angereichert. Kulturen, die ein Bakterienwachstum zeigten, wurden
im Hinblick auf ihre Cellulaseaktivität unter Verwendung des CMC-Agardiffusionsassays
für den
Nachweis von Cellulase erzeugenden Kolonien analysiert. Der CMC-Agardiffusionsassay
und das Anreicherungsverfahren verwendete eine Minimalmediumpräparation
bei einem pH von ungefähr
9,7, umfassend 1% KNO3, 0,1% Hefeextrakt
(Difco), 0,1% KH2PO4, 0,02%
MgSO4·7H2O, 1% Na2CO3, 4% NaCl und 0,25% CMC (Sigma C-4888).
Für die
Verfestigung wurden 1,5% Agar zugefügt.
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Eines
von zwei Verfahren wurde für
den CMC-Agardiffusionsassay verwendet, abhängig davon, ob Kolonien oder
flüssige
Fraktionen getestet wurden. Für
die Überprüfung von
Kolonien wurden Zellsuspensionen in 0,85%iger Salzlösung auf CMC-haltigem
Minimalmedium ausplattiert. Nach einer Inkubation bei 40°C für 1 bis
3 Tage wurden die Platten replikaplattiert und die Ursprungsplatte
wurde mit 0,1% Kongo Rot für
15 Minuten geflutet. Die Platten wurden in 1 M NaCl 30 Minuten entfärbt. Die Stämme, die
eine klare Zone um die Kolonie zeigten, wurden als potentielle Cellulase
erzeugende Mikroorganismen isoliert. Flüssige Fraktionen wurden durch Pipettieren
von 40 μl
Aliquots von Enzymlösung
oder Fermentationsbrühe
in Vertiefungen überprüft, die aus
einer Schicht von 5 mm Minimalmedium in einer Petrischale ausgestanzt
worden waren. Nach einer Inkubation bei 40°C für 16 Stunden wurde die Cellulaseaktivität durch
Kongo Rot/NaCl-Behandlung nachgewiesen. Der Durchmesser der klaren
Zone ist ein Maß für die CMCase-Aktivität.
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Stämme, die
klare Zonen unter Verwendung von einem der beiden Screeningverfahren
zeigten, wurden zum Anwachsen und Isolieren von Cellulase selektiert.
Die Kolonien wurden in 25 ml GAM-Medium in 100 ml Schüttelkolben
in einem Incubator Shaker (New Brunswick Scientific, Edison, NJ,
USA) bei 250 Upm bei 40°C
für 72
Stunden fermentiert. Die CMCase-Aktivität wurde in einer Kulturbrühe bei pH 9
und 40°C
zur Sicherstellung der Gegenwart von Cellulase in der Fermentationsbrühe bestimmt.
Das für
die Enzymproduktion verwendete komplexe Medium (GAM) bestand aus
Pepton (Difco) 0,5%, Hefeextrakt (Difco) 0,5%, Glucose H2O 1%, KH2PO4 0,1%, MgSO4·7H2O 0,02%, Na2CO3 1%, NaCl 4%. Der pH wurde mit 4 M NaCl
auf 9,5 eingestellt, woraufhin 1% CMC zugefügt wurde.
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Unter
Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens wurde ein Cellulase
produzierender Mikroorganismus isoliert, der weiter als bewegliches, langes,
dünnes
stäbchenförmiges Bakterium
charakterisiert wurde, das in langen Ketten auftrat und ein fadenähnliches
Erscheinungsbild hatte oder alternativ in Paaren von Zellen in einer "V"-Form. Die subterminalen Sporen waren
ellipsoid mit einer deutlichen Anschwellung des Sporangiums. Kolonien
auf GAM-Agar erschienen als cremefarbig, kreisförmig, flach, glatt und mit
einer glänzenden
Oberfläche
mit einem leicht unregelmäßigen Rand.
Basierend auf der 16S rRNA-Sequenzanalyse wurde der Mikroorganismus
als Art der Gattung Bazillus klassifiziert. Der Organismus wird
hier als CBS 669.93 bezeichnet und ist beim Centraalbureeau voor
Schimmelcultures, Baam, Niederlande unter dieser Hinterlegungsnummer
hinterlegt.
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Beispiel 2
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Isolierung von DNA, Transformation
und Expression von Cellulase
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Der
alkaliphile Bazillusstamm CBS 669.93 wurde als Donorstamm für die Expressionsklonierung
in E. coli gewählt.
Chromosomale DNA wurde gemäß dem von
Saito & Miura
beschriebenen Verfahren isoliert (Biochim. Biophys. Acta., Bd. 72,
S. 619–629
(1963)).
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Die
isolierte chromosomale DNA wurde teilweise durch das Restriktionsenzym
Sau3A unter Verwendung seriell verdünnter Enzymlösungen verdaut, und
zwar für
1 Stunde bei 37°C
unter Verwendung von React-Puffern (Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg,
Md., USA) unter den von dem Lieferanten empfohlenen Bedingungen.
Die verdaute DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese fraktioniert
und geeignete Fraktionen (4–10
kb) wurden aus dem Gel unter Verwendung von QIAquick Gel Extraktion
Kit gemäß dem von
dem Lieferanten beschriebenen Protokoll isoliert (QIAGEN Inc., Chatsworth,
Ca., USA).
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Die
Sau3A-Fragmente der chromosomalen DNA wurden zur Konstruktion von
genomischen Genbibliotheken in einem BamHI verdauten CIAP-behandelten
ZAP Express Vektor verwendet, gemäß dem von dem Lieferanten zur
Verfügung
gestellten Protokoll (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Ca.,
USA). pBK-CMV-Phagmide, die die klonierten DNA-Inserts enthielten,
wurden aus dem ZAP Express® Vektor ausgeschnitten
und in den E. coli Stamm XLOLR transformiert.
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Rekombinante
Klone wurden durch Agardiffusion gescreent, wie beschrieben von
Wood et al., Meth. Enzym., Bd. 160, S. 59–74 (1988). Stämme, die
klare Zonen um die Kolonie zeigten, wurden isoliert. Die CMCase-Aktivität der isolierten
Rekombinanten wurde nach Fermentation für 48 Stunden in einem 4*YEP-Medium
bestimmt, bestehend aus Hefeextrakt (Difco) 4%, Pepton (Difco) 8%,
Lactose 0,2%, Ampicillin 100 μg/ml.
Das rekombinante Protein wurde gereinigt (Beispiel 3) und die N-terminale Aminosäuresequenz
wurde als folgende bestimmt:
Asn-Glu-Asp-Val-Lys-Thr-Leu-Asp-Ile-Gln
(SEQ ID NO: 3).
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Plasmid-DNA
des Cellulase erzeugenden Rekombinanten wurde unter Verwendung einer
QIAprep Plasmid Kits isoliert, gemäß dem von dem Lieferanten (QIAGEN
Inc.) beschriebenen Protokoll. Das Plasmid enthielt ein Insert mit
ungefähr
9 kb chromosomaler DNA. Die Nukleotidsequenz eines Fragments von
2777 bp wurde unter Verwendung eines Satzes degenerierter Oligonukleotide bestimmt, abgeleitet
von der N-terminalen Aminosäuresequenz als
Primer, um das Gen auf dem 9 kb Insert zu lokalisieren. Das 2777
bp Fragment enthielt einen offenen Leserahmen von 1746 bp, von dem
ein Protein mit 574 Aminosäuren
abgeleitet werden konnte. Die Nukleotidsequenz des Gens (SEQ ID
NO: 2), die für die
Cellulase kodiert, und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) der
isolierten einzelnen Cellulase sind in den 2A–2C dargestellt.
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Beispiel 3
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Reinigung von Cellulase
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sDie
Cellulase erzeugenden Klone gemäß Beispiel
2 wurden auf einem komplexen Medium (4*YEP), bestehend aus Hefeextrakt
(Difco) 4%, Pepton (Difco) 8%, Lactose 0,2%, 100 μg/ml Ampicillin,
angezüchtet.
Die Fermentationsbrühe
wurde von der Kulturflüssigkeit
durch Zentrifugation (8.000 Upm) abgetrennt. Die Cellulase in dem Überstand wurde
mit Ammoniumsulfat (65%ige Sättigung)
ausgefällt.
Das Präzipitat
wurde in 25 mM Phosphatpuffer, pH 7, + 5 mM EDTA gelöst, bis
eine Leitfähigkeit von
7 mS/cm erreicht wurde. Diese Lösung
wurde auf eine Q-Sepharose FF (Durchmesser 5 cm, Länge 10 cm)
Anionenaustauschsäule
aufgebracht, woraufhin die Säule
mit 25 mM Phosphatpuffer, pH 7, + 5 mM EDTA gewaschen wurde, bis
eine Absorption von 0,2 AU erreicht wurde. Ein Gradient von 0 bis
0,5 M NaCl in 25 mM Phosphat, pH 7, wurde an die Säule in 80 Minuten
angelegt, gefolgt von einem Gradienten von 0,5 bis 1 M NaCl in 10
Minuten. Die Elution fand in dem ersten Gradienten statt. Nach der
Elution wurde die Säule
gereinigt (upflow) mit 1 M NaOH und wiederum mit 25 mM Phosphat,
pH 7, + 5 mM EDTA äquilibriert.
Abhängig
von dem Elutionsprofil hatte die erhaltene Cellulase eine Reinheit
von bis zu ungefähr 80%.
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Beispiel 4
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Eigenschaften der erfindungsgemäßen Cellulase
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Um
das pH/Temperaturprofil der Cellulase mit ungefähr 63 kD gemäß der vorliegenden
Erfindung zu bestimmen, wurde die Aktivität der Cellulase auf CMC bei
verschiedenen pH- und Temperaturwerten gemessen. Eine Lösung umfassend
die Cellulase mit ungefähr
63 kD wurde in einem Puffer, verdünnt mit 10 mM Phosphatpuffer
(ph 7), kombiniert. (Der pH wurde unter Verwendung des Puffers,
umfassend eine Mischung von 100 ml 1 M Phosphorsäure, 100 ml Zitronensäure und
600 ml destilliertem Wasser mit einem pH, eingestellt auf 4, 5,
6, 7, 8, 9 oder 10, unter Verwendung von 4 M NaOH kontrolliert,
woraufhin die Mischung auf 1 1 durch destilliertes Wasser aufgefüllt wurde.)
Die Enzymlösung
wurde bis zu 0,05 U/ml verdünnt,
gemessen bei pH 7 und 40°C.
Jedes Puffersystem wurde getestet, um den tatsächlichen pH sicherzustellen,
nach einem Vermischen mit 0,5 ml Puffer, 0,5 ml Substrat (1% CMC)
und 0,1 ml 10 mM Phosphatpuffer. Der tatsächliche pH für die pH
4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10 Lösungen
betrug 4,2, 5,2, 6,2, 7, 8, 8,7 bzw. 9,9.
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Die
Ergebnisse sind in 1 dargestellt und zeigen die
ausgezeichnete alkalische Aktivität der Cellulase. Die Neigung
der Kalibrierungskurve hängt von
dem pH der Enzymsubstratmischung ab, und aus dem Grund wurden zwei
Glucosestandards bei jedem pH genommen (500 mg Glucose.H2)/100 ml, 10- und 25-fach verdünnt.
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Die
Cellulaseaktivität
kann unter Verwendung eines modifizierten PAHBAH-Verfahrens überprüft werden
(Lever M. Anal. Biochem. 1972, 47, 273–279 und Lever M. Anal. Biochem.
1977, 81, 21–27)
und zwar wie folgt: Die pH/Temperaturprofile können unter Verwendung einer
fixierten Enzymkonzentration bestimmt werden, die in den linearen
Bereich des Dosisreaktionsprofils, gemessen bei pH 7 und 40°C, paßt. Diese
Enzymkonzentration kann für die
Messung der Aktivitäten
unter allen anderen bestimmten Bedingungen verwendet werden. Ein
Teströhrchen
wird mit 250 μl
2,5% CMC in 50 mM Glycinpuffer, pH 9 (CMC mit niedriger Viskosität wird von Sigma
gekauft) und 250 μl
Aliquots der 63 kD Cellulase, verdünnt in dem geeigneten Puffer,
gefüllt.
Das Teströhrchen
wird für
30 Minuten bei 40°C
in einem Wasserbad inkubiert, woraufhin 1,5 ml einer täglich frisch
hergestellten PAHBAH-Lösung
(1% PAHBAH in 100 ml 0,5 M NaOH mit 100 ml Wismutlösung (enthaltend
48,5 g Wismutnitrat, 28,2 g Kaliumnatriumtartrat und 12,0 g NaOH
in 100 ml)) zu gefügt
wurden. Die Mischung wird dann für
10 Minuten auf 70°C
erwärmt,
woraufhin sie für
2 Minuten auf Eis gekühlt wird.
Die Absorption wird bei 410 nm gemessen. Um die Hintergrundabsorption
der Enzymproben zu eliminieren, wird ein Kontrollexperiment wie
folgt durchgeführt:
ein Röhrchen
mit Substrat wird unter denselben Bedingungen wie das Teströhrchen inkubiert. Nach
der Inkubation werden 1,5 ml PAHBAH und die Enzympräparation
zugefügt
(und zwar in dieser Reihenfolge). Eine Einheit (U) wird als die
Menge des Enzyms definiert, die 1 μmol Glucose aus einem CMC-Äquivalent,
bestimmt als reduzierende Zucker pro Minute pro Gramm Produkt, erzeugt.