DE69633573T2

DE69633573T2 - Detektion von biologischen molekülen unter verwendung von chemischer amplifikation und optischem sensor

Info

Publication number: DE69633573T2
Application number: DE69633573T
Authority: DE
Inventors: Peter William VAN ANTWERP; Joseph John MASTROTOTARO
Original assignee: Medtronic Minimed Inc
Current assignee: Medtronic Minimed Inc
Priority date: 1995-11-22
Filing date: 1996-11-21
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2016-11-22
Also published as: DE69633573D1; ATE278801T1; CA2235738A1; EP0862648B1; AU1058297A; US6804544B2; WO1997019188A1; US20020018843A1; US6319540B1; US6011984A; JP2000500656A; EP0862648A1; CA2235738C

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein biologische Sensoren. Insbesondere betrifft diese Erfindung minimal invasive Verstärkungssysteme und optische Sensoren, die polyhydroxylierte Verbindungen wie z. B. Glukose erfassen bzw. nachweisen können.
Ein essentielles Werkzeug zur Betreuung eines diabetischen Patienten ist die Messung der Blutglukose. Kürzlich hat das NIDDK (National Institute of Diabetes and Digestion and Kidney Diseases) die Ergebnisse eines großen klinischen Versuchs, des DCCT (Diabetes Control and Complications Trial), veröffentlicht, die schlüssig zeigen, dass eine verbesserte Blutglukosekontrolle das Risiko von Langzeitkomplikationen von Diabetes vermindert, vgl. DCCT Research Group, N. Engl. J. Med. 329, 977–986 (1993).
Die gegenwärtige Technologie erfordert, dass zur Messung der Blutglukosekonzentrationen eine Blutprobe entnommen wird. Proben von venösem Blut können vom Patienten für diese Messung entnommen werden, jedoch ist dieses Verfahren auf nur wenige Proben pro Tag beschränkt und für die Betreuung von ambulanten Patienten nicht geeignet.
Die Selbstüberwachung der Kapillarblutglukose ist praktisch, erfordert jedoch nach wie vor mehrere und häufige Hautpunkturen. Folglich führen die meisten Patienten abhängig von ihren persönlichen Umständen und ihrem medizinischen Zustand 2 bis 6 Tests pro Tag durch. Die Selbstüberwachungsergebnisse werden von technischen Fehlern, Schwankungen des Probenvolumens und beeinträchtigten motorischen Fähigkeiten (wichtig bei hypoglykämischen Schüben) beeinflusst. Der Patient muss andere Aktivitäten unterbrechen, um die Blutglukosemessung durchzuführen.
Das Konzept eines implantierbaren Sensors zur kontinuierlichen Messung der Glukosekonzentrationen in Anwendungen des Holter-Überwachungstyps und bei ambulant zu behandelnden diabetischen Personen gibt es seit mehreren Jahrzehnten. Bezüglich einer neueren Diskussion vgl. Reach et al., Anal. Chem. 64, 381–386 (1992). Das primäre Augenmerk gilt der Beseitigung der Nachteile der Kapillarblutglukose-Selbstüberwachung durch die Entwicklung eines Glukosesensors, der zumindest eine häufigere und leichter zu erfassende Glukoseinformation bereitstellt. Darüber hinaus könnte der Sensor als Hypoglykämie- und Hyperglykämie-Alarm und schließlich als Steuereinrichtung für eine künstliche endokrine Bauchspeicheldrüse dienen. Die potenziellen Beschränkungen dieses Ansatzes umfassen die begrenzte Lebensdauer des Enzyms, Glukoseoxidase, die begrenzte Lebensdauer des Sensors (2 bis 3 Tage) und das Erfordernis, die Vorrichtung zu tragen.
Das Konzept eines nicht-invasiven Glukosesensors hat während der vergangenen Jahre eine signifikante mediale und technische Beachtung gefunden. Das wissenschaftliche Grundziel lag darin, die Nahinfrarot-Spektrophotometrie (NIR-Spektrophotometrie) zur Erfassung der Extinktionseigenschaften des Glukosemoleküls zu nutzen. Das inhärente Problem bei diesem Ansatz besteht darin, dass das Glukosesignal schwach und von anderen Körperbestandteilen maskiert wird. Darüber hinaus wird das System dann, wenn es möglich ist, Glukose zu erfassen, mit der größten Wahrscheinlichkeit eine teure Optik und eine signifikante Rechenleistung erfordern, was zu einer großen, teuren Vorrichtung führt, die eine häufige Rekalibrierung bezüglich des Patienten erfordert und periodische Daten liefert.
Einige Ansätze für eine nicht-invasive Blutglukosemessung sind in den US-Patenten 4,428,366, 4,655,225, 4,805,623, 4,875,486, 4,882,492, 5,028,787, 5,054,487, 5,070,874, 5,077,476, 5,086,229 und 5,112,124 beschrieben.
Die meisten dieser Ansätze umfassen die Nutzung einer transdermalen Infrarot- oder Nahinfrarotstrahlung entweder in einem Transmissions- oder Reflexionsmodus. Trotz der großen Zahl von Patienten und der intensiven Bemühungen durch mindestens 30 große Unternehmen wurden auf diesem Gebiet keine Vorrichtungen erfolgreich implementiert.
Die Probleme mit diesen Ansätzen sind gut bekannt und wurden detailliert von Marquardt et al., Anal. Chem., 65, 3271 (1993) und Arnold et al., Anal. Chem., 62, 1457 (1990) beschrieben. Marquardt et al. haben gezeigt, dass in einer einfachen wässrigen Lösung die Extinktion einer 13 mM-Glukoselösung (234 mg/dl) ein Signal mit einem S/N-Verhältnis von etwa 2 ergibt. In einer Protein-enthaltenden Matrix kann das Signal der Glukose ohne beträchtliche Manipulation der Daten unter Verwendung eines partiellen Ansatzes der kleinsten Fehlerquadrate nicht erfasst werden. Solche kleinen Signal-Rausch-Verhältnisse sind zur Entwicklung eines robusten einfachen Geräts nicht in der Praxis geeignet. Ferner ist die Vorrichtung, die bei diesen Forschungen verwendet worden ist, ein großes Spektrophotometer, dass über vernünftig breite Wellenlängenbereiche scannen können muss.
Im Gegensatz zu diesen rein nicht-invasiven optischen Ansätzen, wird ein Implantat, das eine Wandlerchemikalie enthält, deren optische Eigenschaften durch die Erkennung des Zielanalyten stark moduliert werden, zu einer großen optischen Verstärkung der optischen Signale führen. In diesem Sinne wird der Ausdruck "chemische Verstärkung" in dieser Anmel dung verwendet. Beispielsweise beschreibt das US-Patent 4,401,122 einen implantierten enzymatischen Sensor, der das H₂O₂ misst, das erzeugt wird, wenn Glukose und Sauerstoff in der Gegenwart des Enzyms Glukoseoxidase reagieren. Dieser Ansatz wird durch grundlegende Bedenken bezüglich der biologischen Verträglichkeit eingeschränkt, insbesondere bezüglich Veränderungen der Stabilität im Hinblick auf die Glukosediffusion zu dem Sensor und der Lebensdauer eines Enzyms in einer implantierten Umgebung. Es bestehen weitere Bedenken bei der Verwendung von Enzymen, da der große Unterschied zwischen der O₂- und der Glukosekonzentration im Körper eine Glukose-beschränkende äußere Membran erfordert. Diese Membran beschränkt nicht nur die Glukose, sondern auch das analytische Signal.
Das US-Patent 4,680,268 beschreibt einen implantierbaren Biosensor zur Erfassung von Produkten, wie z. B. Wasserstoffperoxid, die durch eine enzymatische Reaktion zwischen einem Analyten, wie z. B. Glukose, und einem Enzym in der Gegenwart von Sauerstoff erzeugt worden sind.
Ein Ansatz zur Lösung der Probleme ist in dem US-Patent 5,342,789 beschrieben. Bei diesem Ansatz konkurriert ein fluoreszierend markiertes Glycoprotein mit Glukose bezüglich der Bindung an ein unterschiedlich fluoreszierend markiertes Lectin. Da ein gewisser Resonanzenergietransfer von einem Marker zum anderen stattfindet, vermindert die Gegenwart von Glukose die Fluoreszenzintensität des Systems. Es gibt zwei Hauptnachteile des Systems, das in dem '789-Patent beschrieben ist. Das erste Problem besteht darin, dass beide Marker durch die Quelle photoangeregt werden, wobei das Hintergrundsignal signifikant ist. Das zweite Problem hängt mit dem Vermögen des Systems zusammen, in den Körper implantiert zu werden. Der Resonanzenergietransfer erfordert eine Diffusion von Glukose zu dem Lectin und die Diffusion des markierten Glykoproteins von dem Lectin weg. Um zu ermöglichen, dass das System eine vernünftige Zeitkonstante für physiologische Anwendungen aufweist, müssen die Reagenzien in Lösung vorliegen und über einen Konzentrationsgradienten frei diffundieren können. Dies führt dazu, dass die Vorrichtung nur schwer implementiert werden kann, da ein Behälter gestaltet werden muss, der eine Diffusion von Glukose ermöglicht, jedoch ein Herausdiffundieren der Proteine und von Lectin verhindert.
Demgemäß bestand ein Bedarf für einen Glukosesensor, der Glukose über den gesamten physiologischen Bereich von 30 bis 500+ mg/dl (1,6 bis 28+ mM) messen kann. Der Glukosesensor sollte eine kontinuierliche Glukoseinformation bereitstellen und einfach anzuwenden sein. Der Sensor sollte keine Blutprobe erfordern und schmerzfrei einzusetzen sein. Im Hinblick auf die analytische Chemie sollte sowohl die Richtigkeit als auch die Genauigkeit größer als 95% sein und der Sensor sollte nicht-invasiv oder minimal-invasiv sein. Im Hinblick auf das Gerät sollte die Vorrichtung einen linearen Dynamikbereich von mindestens 200 und ein Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 50 aufweisen. Das Erreichen dieser Werte stellt sicher, dass eine analytische Genauigkeit und Richtigkeit erreicht werden können. Weniger empfindliche Geräte könnten jedoch bei der Bereitstellung von Messungen nützlich sein, ob das Analytensignal richtig ist. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und stellt andere, damit zusammenhängende Vorteile bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Bestimmung der biologischen Konzentrationen polyhydroxylierter Verbindungen, insbesondere von Glukose bereit. Das Verfahren nutzt ein Verstärkungssystem, das implantierbar ist und das ein Signal erzeugt, das typischerweise außerhalb der Haut eines Säugers, z. B. eines Menschen, erfasst werden kann. Das Verstärkungssystem ist ein Analytwandler, der in einer Polymermatrix immobilisiert ist. Die Erzeugung eines Signals durch das Verstärkungssystem ist typischerweise das Ergebnis eines Abfragens durch eine optische Quelle. Es ist wichtig, dass das Signal keinen Resonanzenergietransfer erfordert, sondern stattdessen auf einem Elektronentransfer beruht (z. B. einem molekularen Elektronentransfer oder einem Photoelektronentransfer). Durch die Erfassung des erzeugten Signals wird dann die Menge der interessierenden polyhydroxylierten Verbindung oder des interessierenden Analyten bestimmt.
Es gibt daher zwei wichtige Aspekte der Erfindung. Der erste Aspekt ist ein implantierbares Verstärkungssystem (IAS), das eine biologisch verträgliche Polymermatrix und Verstärkungskomponenten umfasst, die beim Abfragen durch ein optisches System ein Signal eines polyhydroxylierten Analyten erzeugen, wobei die Verstärkungskomponenten einen Arylboronsäurerest umfassen, der an ein Amin-funktionalisiertes Farbstoffmolekül gebunden ist, und wobei die Verstärkungskomponenten zur Erzeugung des Signals keinen Resonanzenergietransfer erfordern. Der zweite Aspekt der Erfindung ist ein Biosensor zur Messung der Menge eines polyhydroxylierten Analyten in vivo, wobei der Sensor (a) ein erfindungsgemäßes implantierbares System und (b) ein optisches System umfasst, das eine optische Quelle und einen Detektor umfasst, der das Signal erfasst, wodurch die in-vivo-Menge des Analyten gemessen wird.
Das optische System fragt die immobilisierten Verstärkungskomponenten zur Erzeugung eines erfassbaren Signals ab. In einigen Ausführungsformen ist das optische System ein transdermales optisches System, während in anderen Ausführungsformen ein faseroptisches System verwendet wird.
Die 1 zeigt ein Schema des optischen Glukoseüberwachungssystems.
Die 2 veranschaulicht ein Schema eines optischen Analytenüberwachungssystems, welches das Binden eines polyhydroxylierten Analyten an eine Verstärkungskomponente nach dem Eindringen in eine biologisch verträgliche Matrix weiter veranschaulicht.
Die 3 veranschaulicht eine Ausführungsform der Erfindung, bei der ein faseroptisches Bündel als "Lichtschlauch" zum Abfragen eines implantierten Verstärkungssystems eingesetzt wird.
Die 4 veranschaulicht eine weitere Ausführungsform der Erfindung, bei der eine subkutane Lichtquelle zum Abfragen eines implantierten Verstärkungssystems eingesetzt wird.
Die 5 veranschaulicht eine weitere Ausführungsform der Erfindung, bei der eine subkutane Lichtquelle und ein subkutaner Detektor verwendet werden, um ein vollständig subdermales Analytenüberwachungssystem bereitzustellen.
Die 6 veranschaulicht eine weitere Ausführungsform der Erfindung, bei der eine subkutane Lichtquelle und ein subkutaner Detektor verwendet werden, um ein vollständig subdermales Analytenüberwachungssystem bereitzustellen, das mit einer Analytenquelle oder einer Medikamentenpumpe (z. B. einer Insulinpumpe) gekoppelt ist, um ein Überwachungs- und Zuführungssystem mit einem "geschlossenen Kreislauf" bereitzustellen (z. B. eine künstliche Bauchspeicheldrüse).
Die 7 zeigt die reversible Wechselwirkung zwischen einem polyhydroxylierten Analyten, wie z. B. Glukose, und einem Boronatkomplex, N-Methyl-N-(9-methylenanthryl)-2-methylenphenylboronsäure.
Die 8 stellt die Strukturen für eine Anzahl von Boronatverbindungen der Formel I zusammen mit den Anregungs- und Emissionswellenlängen dar.
Die 9 veranschaulicht ein Syntheseschema für Boronatkomplexe, die als Verstärkungskomponenten geeignet sind.
Die 10 veranschaulicht ein weiteres Syntheseschema für Boronatkomplexe, die als Verstärkungskomponenten geeignet sind.
Die 11 stellt drei Beispiele für implantierbare Verstärkungssysteme zur Immobilisierung von Verstärkungskomponenten dar.
Die 12 stellt eine Kalibrierungskurve für das Löschen der Fluoreszenzintensität durch Glukose bei pH 7,4 dar.
Die 13 zeigt eine reversible Fluoreszenz gegen die Glukosekonzentration für eine Anthracenboronatlösung.
In dieser Beschreibung und den Ansprüchen werden die folgenden Abkürzungen verwendet: dl, Deziliter; DEG, Diethylenglykol; DMF, Dimethylformamid; IAS, implantierbares Verstärkungssystem; PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung; THF, Tetrahydrofuran; DI, entionisiert; PEG, Polyethylenglykol; mV, Millivolt; mg, Milligramm.
Allgemeines
Das allgemeine Konzept der vorliegenden Erfindung ist in der 1 veranschaulicht. Es ist ersichtlich, dass in dem Grundschema sowohl ein Detektor- als auch ein Quellenmodul verwendet wird, das bezüglich der Haut außen liegen kann. Die Quelle stellt ein Anregungssignal bereit, das ein subkutanes Verstärkungssystem abfragt. Das System erzeugt dann ein verstärktes Signal, das durch den externen Detektor überwacht wird.
Das Verstärkungssystem kann in verschiedene Gewebe implantiert werden. Vorzugsweise wird das System subkutan in einer Tiefe von 1 bis 2 mm unter der Oberfläche der Haut implantiert. Bei dieser Tiefe wird das System am einfachsten zwischen der Lederhautschicht und der subkutanen Fettschicht implantiert. Diese Schichten können in Säugern relativ leicht getrennt werden und ein Verstärkungssystem (z. B. chemische Verstärkungskomponenten in einem biologisch verträglichen Polymer) kann in eine kleine Tasche eingesetzt werden, die durch einen kleinen chirurgischen Eingriff erzeugt worden ist. Das implantierte System kann von Kapillarblut reichlich umströmt werden und es kann aus einem Material hergestellt sein, durch das Glukose leicht diffundieren kann. Alternativ kann das Verstärkungssystem in Kontakt mit anderen Fluiden angeordnet werden, die den interessierenden Analyten enthalten.
In einer Gruppe von Ausführungsformen (die in der 1 veranschaulicht sind), enthält das Verstärkungssystem eine immobilisierte chemische Verstärkungskomponente, die einen fluoreszierenden Rest enthalten kann, der ein Signal bereitstellt, das durch die lokale Analytenkonzentration moduliert wird. In das System kann auch ein Filter für die Fluoreszenzphoto nen eingebracht werden (für diejenigen Ausführungsformen, in denen ein Fluoreszenzfarbstoff verwendet wird). Das implantierte Verstärkungssystem wird transdermal von einem kleinen Gerät abgefragt, das über dem Implantat getragen oder angeordnet wird. Das kleine Gerät enthält eine Lichtquelle (z. B. eine gefilterte LED) und einen gefilterten Detektor (z. B. eine Photomultiplierröhre, eine nicht-stabilisierte Siliziumphotodiode). Das Signal von dem Detektor stellt ein kontinuierliches Ausgangssignal der Analytenkonzentration des Patienten bereit, das auch als Eingangssignal beispielsweise für eine Insulinpumpe oder als visuelles Ausgangssignal für den Patienten verwendet werden kann. Alternative Ausführungsformen sind nachstehend beschrieben (z. B. die Verwendung einer Faseroptik zum Abfragen des Verstärkungssystems).
Die 2 stellt ein weiteres Schema bereit, welches das Verstärkungssystem veranschaulicht. Gemäß dieser Figur umfasst das Verstärkungssystem eine permeable Membran, eine Matrix zur Immobilisierung der Verstärkungskomponenten und die Verstärkungskomponenten selbst. Der polyhydroxylierte Analyt kann dann in die Matrix eindringen, an die Verstärkungskomponenten binden und beim Abfragen ein Signal erzeugen, das gesammelt, gefiltert und erfasst wird. Die optischen Quellen können verschiedene Lichtquellen (z. B. eine Laserdiode, eine LED) sein und das Licht kann an das Verstärkungssystem mit Abgabeverfahren abgegeben werden, die Linsen und Faseroptiken umfassen. Alternativ kann das optische Abfragen mit einer transdermalen Belichtung durchgeführt werden. Das resultierende Signal kann auch hier mit einer Faseroptik oder einer Linse gesammelt und zu dem Detektor geschickt werden, wobei gegebenenfalls ein Zwischenfilter oder eine Unterscheidungseinrichtung eingesetzt wird.
Zusätzlich zu den Ausführungsformen, die allgemein in den 1 und 2 beschrieben sind, stellt die vorliegende Erfindung Erfassungssysteme und -verfahren bereit, die allgemein in den 3 bis 6 veranschaulicht sind.
In der 3 ist eine Lichtquelle außerhalb der Haut angeordnet und das Verstärkungssystem ist an dem distalen Ende einer Faseroptik angeordnet oder auf dieses aufgebracht, wobei die Faseroptik durch die Haut in eine subkutane Schicht eingesetzt wird. Die Faseroptik dient zum Leiten von Licht von der Quelle zu dem Verstärkungssystem und sammelt dann das Licht, das von dem Verstärkungssystem emittiert wird und leitet es zu dem Detektor zurück.
Eine weitere Ausführungsform ist in der 4 gezeigt. Gemäß dieser Figur ist auch die Lichtquelle unter der Lederhaut implantiert. Beim Abfragen des IAS durch die interne Licht quelle stellt das IAS ein Signal bereit, das transdermal zu einem externen Detektor übertragen wird.
In einer anderen Ausführungsform (5) sind sowohl die Lichtquelle als auch der Detektor unter der Lederhaut implantiert. Der Detektor stellt dann eine Übertragung von Informationen an eine Ausgangssignallesevorrichtung bereit, die außerhalb der Haut vorliegt.
Schließlich betreffen für diejenigen Ausführungsformen, in denen die Glukosekonzentrationen bestimmt werden, einige Aspekte der Erfindung die Kopplung des Detektorsignals an ein Insulinpumpensystem in einer künstlichen Bauchspeicheldrüse mit "geschlossenem Kreislauf" (vgl. die 6).
Wie es aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich ist, umfassen die erfindungsgemäßen Biosensoren zwei wichtige Komponenten. Die erste Komponente ist ein implantierbares Verstärkungssystem oder IAS, das sowohl Signalverstärkungskomponenten als auch eine Polymermatrix umfasst. Zusätzlich ist ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung die Immobilisierung der Verstärkungskomponenten in der Polymermatrix. Die Immobilisierung kann durch physikalisches Einschließen oder durch eine kovalente Bindung durchgeführt werden. Die zweite Komponente ist das optische System, das eine transdermale Übertragung oder Faseroptikübertragung des Lichts oder Signals nutzt.
Implantierbares Verstärkungssystem (IAS)
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein implantierbares Verstärkungssystem bereit, bei dem es sich um eine Kombination aus einem Analytensignalwandler oder Verstärkungskomponenten und einer Polymermatrix, vorzugsweise einer biologisch verträglichen Matrix handelt.
Gleichgewichtsbindungsverfahren
Nicht-enzymatische, auf einem Gleichgewicht beruhende Verstärkungsverfahren für die Verstärkung eines polyhydroxylierten Analyten (z. B. Glukose) sind gegenüber enzymatischen bevorzugt, da das Vermögen eines Enzyms, dessen Aktivität über lange Zeiträume im Körper aufrechtzuerhalten, beschränkt ist. Darüber hinaus leiden enzymatische Ansätze auf der Basis des O₂-Verbrauchs (für die Glukosemessung) an dem inhärenten Mangel von O₂ bezogen auf Glukose im Körper und erfordern eine differenziell permeable äußere Membran.
Der Gleichgewichtsbindungsansatz, der in der Erfindung verwendet wird, nutzt Zucker-bindende Verbindung auf Boronatbasis. Die Grundwechselwirkung zwischen einem Zucker wie z. B. Glukose und einem markierten Boronatkomplex ist in der 7 gezeigt. Die Bindung von Glukose an die Boronatgruppe ist gemäß der 7 reversibel. In einem Fall wird die Fluoreszenz der Boronatverbindungen bei der Zugabe von Glukose verändert. In anderen Fällen findet aufgrund eines intramolekularen Elektronentransfers eine Fluoreszenzverstärkung oder -löschung statt, vgl. Falasca et al., Biochim. Biophys. Acta, 577, 71 (1979); Nakashima und Shinkai, Chemistry Letters, 1267 (1994) und James et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 277 (1994). In einigen Boronatkomplexen wird die Modifizierung der Azidität des Lewissäure-Borzentrums beim Binden von Glukose verändert.
Es wurden Boronatkomplexe beschrieben, die ein Glucosesignal durch verschiedene Mittel übertragen, vgl. Nakashima et al., Chem. Lett. 1267 (1994); James et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 477 (1994) und James et al., Nature, 374, 345 (1995). Diese umfassen geometrische Änderungen von Molekülen des Porphyrin- oder Indoltyps, Veränderungen des optischen Rotationsvermögens bei Porphyrinen und einen photoinduzierten Elektronentransfer in Resten des Anthracentyps. Entsprechend wurde gezeigt, dass die Fluoreszenz von 1-Anthrylboronsäure durch die Zugabe von Glukose gelöscht wird, vgl. Yoon et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 5874 (1992). Ein postulierter Mechanismus für diesen Effekt ist eine Verschiebung der Lewis-Azidität der Boronatgruppe bei der Komplexierung eines Diols. Alle diese veröffentlichten Ansätze beschreiben lediglich Signalwandlersysteme.
Eine Anwendung für eine tatsächliche in-vivo-Erfassung für die vorstehend genannten Ansätze muss auch die Immobilisierung des Wandlersystems in einem geeigneten Polymersystem umfassen, bei dem es sich vorzugsweise um ein biologisch verträgliches Polymer handelt. In der vorliegenden Erfindung ist das Wandlersystem oder sind die Signalverstärkungskomponenten innerhalb einer geeigneten Polymermatrix eingeschlossen. Alternativ können die Verstärkungskomponenten kovalent an die Polymermatrix gebunden und von dieser umgeben sein. Eine kovalente Bindung der Komponenten an eine Polymermatrix verhindert ein Austreten der Komponenten in das umgebende Gewebe und einen anderen unerwünschten Kontakt der Verstärkungskomponenten mit Fluiden, die keine Zielverbindung enthalten.
In der Erfindung umfassen die Verstärkungskomponenten einen Arylboronsäurerest, der an ein Amin-funktionalisiertes Farbstoffmolekül gebunden ist. Die Bindung bzw. Verknüpfung zwischen dem Arylboronsäurerest und dem Farbstoffmolekül wird typischerweise aus etwa zwei bis etwa 4 Kohlenstoffatomen bestehen, die durch Stickstoff unterbrochen sind. Spezielle nicht-beschränkende Beispiele für geeignete Bindungen umfassen -CH₂-NH-CH₂-, -(CH₂)₂- NH-CH₂-, -C(O)CH₂-NH-CH₂-, -CH₂-NR-CH₂-, -(CH₂)₂-NR-CH₂- und -C(O)CH₂-NR-CH₂-, wobei die R-Gruppe ein Alkylsubstituent mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen ist. Der Begriff "Alkyl" bezieht sich hier auf einen gesättigten Kohlenwasserstoffrest, der geradkettig oder verzweigt sein kann (z. B. Ethyl, Isopropyl, t-Amyl oder 2,5-Dimethylhexyl). Diese Definition gilt sowohl, wenn der Begriff allein verwendet wird, als auch dann, wenn der Begriff als Teil eines zusammengesetzten Ausdrucks verwendet wird, wie z. B. "Halogenalkyl" und ähnliche Ausdrücke. Bevorzugte Alkylgruppen sind diejenigen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten. Alle Zahlenbereiche in dieser Beschreibung und den Ansprüchen sollen deren Ober- und Untergrenzen umfassen. Zusätzlich ist die Alkylgruppe, die in den vorstehend genannten Bindungen an ein Stickstoffatom gebunden ist, vorzugsweise mit einer funktionellen Gruppe wie z. B. Hydroxy, Amino oder Thiol substituiert, welche die kovalente Bindung der Verstärkungskomponente an eine biologisch verträgliche Matrix erleichtert.
In einer verwandten Gruppe von Ausführungsformen umfasst das implantierbare Verstärkungssystem eine Verbindung der Formel
In dieser Formel stellt D¹ einen Farbstoff dar, bei dem es sich um einen Fluoreszenzfarbstoff, einen Lumineszenzfarbstoff oder einen kolorimetrischen Farbstoff handeln kann. Die Symbole R¹, R³ und R⁴ stellen jeweils unabhängig Substituenten dar, welche die elektronischen Eigenschaften der Gruppen verändern, an die sie gebunden sind, oder die funktionelle Gruppen enthalten, die mit der umgebenden Polymermatrix kovalente Bindungen bilden können. Vorzugsweise sind R¹, R³ und R⁴ jeweils unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, Acyl, C₁-C₄-Alkoxy, Halogen, Thiol, Sulfonsäure, Sulfonamid, Sulfinsäure, Nitro, Cyano, Carbonsäure, eine C₁-C₁₂-Alkylgruppe, eine substituierte C₁-C₁₂-Alkylgruppe, eine C₁-C₁₂-Alkenylgruppe, eine substituierte C₁-C₁₂-Alkenylgruppe, eine C₁-C₁₂-Alkinylgruppe, eine substituierte C₁-C₁₂-Alkinylgruppe, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl, substituiertes Arylalkyl, Amin oder substituiertes Amin. Für jede der vorstehend genannten substituierten Spezies sind die Substituenten vorzugsweise Hydroxy, Acyl, Aryl, C₁-C₄-Alkoxy, Halogen, Thiol, Sulfonsäure, Amine, Sulfonamid, Sulfinsäure, Nitro, Cyano, Carboxamid oder Carbonsäure. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind R¹, R³ und R⁴ jeweils unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, C₁-C₄-Acyl, C₁-C₄-Alkoxy, Halogen, Thiol, Sulfonsäure, Sulfonamid, Nitro, Cyano, Carbonsäure, eine C₁-C₄-Alkylgruppe, eine C₁-C₄-Alkenylgruppe, eine C₁-C₄-Alkinylgruppe, Aryl, Arylalkyl oder Amin.
Jedes der R²-Symbole stellt unabhängig Wasserstoff oder C₁-C₄-Alkyl dar oder die beiden R²-Gruppen bilden zusammengenommen eine C₂-C₅-Alkylenkette. Vorzugsweise sind die R²-Gruppen beide Wasserstoff.
Jede der Gruppen L¹ und L² stellt unabhängig eine Verknüpfungsgruppe mit 0 bis 4 aufeinanderfolgenden, vorzugsweise ein bis zwei Atomen dar. Die Verknüpfungsgruppen sind vorzugsweise Alkylenketten (z. B. Methylen, Ethylen, Propylen oder Butylen). Alternativ kann in der Alkylenkette eines oder mehrere der Kohlenstoffatome durch Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor ersetzt sein, wobei beachtet werden sollte, dass die restlichen Valenzen an den Heteroatomen durch Wasserstoff, Hydroxygruppen oder Oxogruppen besetzt sein können. Vorzugsweise sind die Heteroatome, falls vorhanden, Sauerstoff oder Stickstoff.
Das Symbol Z stellt ein Stickstoff-, Schwefel-, Sauerstoff- oder Phosphoratom dar. Dem Fachmann ist klar, dass für diejenigen Ausführungsformen, bei denen Z ein Sauerstoffatom ist, R¹ nicht vorhanden ist. Zusätzlich können wie vorstehend jegliche verbleibenden Valenzen an den Heteroatomen durch Wasserstoff, Hydroxygruppen oder Oxogruppen besetzt sein. Vorzugsweise ist Z Stickstoff. Das Symbol x ist eine ganze Zahl von 0 bis 4.
Die chemischen Begriffe, die hier verwendet werden, haben die vom Fachmann der Chemie anerkannte Bedeutung. Beispielsweise bezieht sich der Begriff "Alkoxy" auf einen vorstehend beschriebenen Alkylrest, der auch einen Sauerstoffsubstituenten trägt, der an einen anderen Kohlenwasserstoffrest kovalent binden kann (wie z. B. Methoxy, Ethoxy und t-Butoxy). "Halogen" steht für -F, -Cl, -Br und -I, obwohl -F und -Cl bevorzugt sind. Der Begriff "Alkenyl" bezieht sich hier auf eine vorstehend beschriebene Alkylgruppe, die einfach oder mehrfach ungesättigt ist. Der Begriff "Alkinyl" bezieht sich hier auf eine vorstehend beschriebene Alkylgruppe, die eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindungen enthält. Der Begriff "Aryl" bezieht sich auf einen aromatischen Substituenten, bei dem es sich um einen einzelnen Ring oder um mehrere Ringe handeln kann, die anneliert, kovalent gebunden oder an eine gemeinsame Gruppe wie z. B. eine Ethylen- oder Methylengruppe gebunden sind. Die aromatischen Ringe können jeweils Heteroatome enthalten, wie z. B. Phenyl, Naphthyl, Biphenyl, Diphenylmethyl, 2,2-Diphenyl-1-ethyl, Thienyl, Pyridyl und Chinoxalyl. Die Arylreste können auch gegebenenfalls substituiert sein, wie es vorstehend diskutiert worden ist. Zusätzlich können die Arylreste an einer beliebigen Position des Arylrests an andere Reste gebunden sein, die ansonsten von einem Wasserstoffatom besetzt sind (wie z. B. 2-Pyridyl-, 3-Pyridyl und 4-Pyridyl). Der Begriff "Arylalkyl" bezieht sich auf einen Arylrest, der direkt an eine Alkylgruppe gebunden ist.
Vorzugsweise ist der in der Formel (I) verwendete Farbstoff ein Anthracen, Fluorescein, Xanthen (z. B. Sulforhodamin, Rhodamin), Cyanin, Cumarin (z. B. Cumarin 153), Oxazin (z. B. Nilblau), ein Metallkomplex oder ein anderer polyaromatischer Kohlenwasserstoff, der ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Strukturen für einige der Ausführungsformen der Formel I sind in der 8 zusammen mit den Anregungs- und Emissionswellenlängen für jede Ausführungsform angegeben. Besonders bevorzugt sind langwellige Fluoreszenzfarbstoffe mit Emissionswellenlängen von mindestens etwa 450 nm, vorzugsweise von 450 bis etwa 800 nm. Farbstoffe mit kürzeren Wellenlängen stellen typischerweise kein ausreichendes Signal durch die Haut bereit. Als Folge davon sind Farbstoffe mit kürzeren Wellenlängen für Anwendungen geeignet, bei denen die Abfrage und die Signalabgabe mittels einer Faseroptik erfolgen. Bevorzugte Farbstoffe mit kürzerer Wellenlänge sind diejenigen, die Emissionswellenlängen von etwa 320 nm bis etwa 450 nm aufweisen.
Die Verbindungen, die in diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden, können mit den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren oder durch Modifizierungen dieser Verfahren hergestellt werden. Die 9 zeigt ein Syntheseschema für die Verbindungen der Formel I. In diesem Schema kann 9-Anthraldehyd (von kommerziellen Quellen wie z. B. Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA, erhältlich) mit 5-Amino-1-pentanol (Aldrich) unter reduktiven Aminierungsbedingungen unter Verwendung von Natriumborhydrid in Methanol behandelt werden. Das resultierende sekundäre Amin kann dann mit einem Brommethylarylboronsäurederivat alkyliert werden, um eine geschützte Verstärkungskomponente bereitzustellen.
Die 10 zeigt ein weiteres Syntheseschema für die Verbindungen der Formel I. In diesem Schema wird 10-(Hydroxymethyl)-9-anthraldehyd (gemäß den Verfahren hergestellt, die in Lin et al., J. Org. Chem. 44, 4701 (1979) beschrieben sind) unter Verwendung von Methylamin in einem zweistufigen Verfahren, das eine Iminbildung und eine anschließende Natriumborhydrid-Reduktion des Imins umfasst, reduktiv aminiert. Die Alkylierung des sekundären Amins mit einem geeigneten Arylboronsäurederivat liefert dann die gewünschte Verbindung der Formel I. In dieser Verbindungsfamilie weist der D¹-Rest (z. B. Anthracen) eine daran gebundene Hydroxymethylgruppe auf, welche die kovalente Bindung der Verbindung an eine biologisch verträgliche Matrix erleichtert.
Spektroskopische Verfahren
Ein Ansatz für eine minimal-invasive Glukoseerfassung ist eine oberflächenverstärkte Resonanz-Ramanspektroskopie. Die Glukose wird an einen Borsäurekomplex gebunden und das Ramanspektrum wird gemessen.
Immobilisierung der Verstärkungskomponenten in einer Polymermatrix
Um die Verstärkungskomponenten zur Analytenerfassung in vivo zu verwenden, müssen die Komponenten für die Reaktionen in einer Polymermatrix immobilisiert werden, die subdermal implantiert werden kann. Die Matrix sollte für den interessierenden Analyten permeabel und innerhalb des Körpers stabil sein. Ferner sollte die Matrix aus biologisch verträglichen Materialien hergestellt sein oder alternativ mit einem biologisch verträglichen Polymer beschichtet sein. Der Begriff "biologisch verträglich" bezieht sich hier auf eine Eigenschaft von Materialien oder einer Matrix, die bei der Implantierung in ein Tier keine nachweisbaren ungünstigen Zustände erzeugt. Während zu Beginn des Einbringens des implantierbaren Verstärkungssystems in ein Lebewesen eine gewisse Entzündung auftreten kann, wird die Entzündung nicht dauerhaft sein und das Implantat wird nicht durch eine Einkapselung (z. B. mit Narbengewebe) funktionsunfähig gemacht.
Die biologisch verträgliche Matrix kann entweder ein flüssiges Substrat (z. B. einen beschichteten Dialyseschlauch) oder ein festes Substrat (z. B. Polyurethane/Polyharnstoffe, Silizium-enthaltende Polymere, Hydrogele, Sol-Gele und dergleichen) umfassen. Zusätzlich kann die Matrix eine biologisch verträgliche Hülle umfassen, die z. B. aus Dialysefasern, einem Teflongewebe, resorbierbaren Polymeren oder Inselchen-Einkapselungsmaterialien hergestellt werden. Die Matrix kann in Form einer Scheibe, eines Zylinders, eines Pflasters, von Mikrokügelchen oder eines wieder befüllbaren Beutels vorliegen und ferner, wie es vorstehend beschrieben worden ist, ein biologisch verträgliches Netz umfassen, das ein vollständiges Einwachsen von Gewebe mit Gefäßbildung erlaubt. Während eine subdermale Implantierung bevorzugt ist, ist dem Fachmann klar, dass weitere Implementierungsverfahren verwendet werden könnten. Die Schlüsseleigenschaft der Matrix ist deren Permeabilität für Analyten und andere Reaktanten, die für die chemische Verstärkung eines Signals erforderlich sind. Beispielsweise muss eine Glukoseüberwachungsmatrix für Glukose permeabel sein. Schließlich sollte das Implantat für das Licht von der optischen Quelle, das zum Abfragen des IAS verwendet wird, optisch transparent sein.
Die 11 zeigt eine Veranschaulichung mehrerer Ausführungsformen. Gemäß der 11A kann ein Verstärkungssystem eine Substratschicht, eine Wandlerschicht, welche die Verstärkungskomponenten enthält, und eine Schicht umfassen, die für den interessierenden Analyten permeabel ist.
Die Substratschicht kann aus einem Polymer wie z. B. Polyurethan, Silikon, einem Silizium-enthaltenden Polymer, Chronoflex, P-HEMA oder Sol-Gel hergestellt sein. Die Substratschicht kann für den interessierenden Analyten permeabel sein oder sie kann impermeabel sein. Bei denjenigen Ausführungsformen, bei welchen die Substratschicht impermeabel ist, werden die Verstärkungskomponenten auf das äußere der Substratschicht aufgebracht und weiter mit einer permeablen Schicht beschichtet (vgl. die 11A).
In einigen Ausführungsformen sind die Verstärkungskomponenten mittels einer kovalenten Bindung innerhalb einer Matrix eingeschlossen oder umhüllt, die selbst für den interessierenden Analyten permeabel und biologisch verträglich ist (vgl. die 11B). In diesen Ausführungsformen ist eine zweite permeable Schicht nicht erforderlich. Trotzdem ist die Verwendung einer permeablen Schicht, wie z. B. aus einem Hydrogel, welche die Gewebeimplantierung weiter erleichtert, bevorzugt (vgl. die 11C).
1. Biologisch verträgliche Matrixmaterialien
Für diejenigen Ausführungsformen, bei denen eine Polymermatrix mit einem Gewebe oder Fluid in Kontakt gebracht wird, ist die Polymermatrix vorzugsweise eine biologisch verträgliche Matrix. Zusätzlich zu der biologischen Verträglichkeit ist eine weitere Anforderung für diese äußerste Schicht eines implantierbaren Verstärkungssystems, dass es für den interessierenden Analyten permeabel ist. Eine Anzahl biologisch verträglicher Polymere ist bekannt, einschließlich einige kürzlich beschriebene Silizium-enthaltende Polymere (vgl. die gleichzeitig anhängige Anmeldung Nr. 08/721,262, die am 26. September 1996 angemeldet und als US-Patent 5,777,060 erteilt worden ist) und Hydrogele (vgl. die gleichzeitig anhängige Anmeldung Nr. 08/749,754, die am 24. Oktober 1996 angemeldet und als US-Patent 5,786,439 erteilt worden ist, sowie die entsprechende EP-A-0 876 604). Zur Immobilisierung der meisten Glukose-bindenden Systeme oder anderer Analytenverstärkungskomponenten kann Silikon-enthaltendes Polyurethan verwendet werden. Andere Polymere wie z. B. Silikonkautschuke (NuSil 4550), biologisch stabiles Polyurethan (Biomer, Tecothane, Tecoflex, Pellethane und andere), PEEK (Polyetheretherketon), Acrylverbindungen oder Kombinationen davon sind ebenfalls geeignet.
a. Silizium-enthaltende Polymere
In einer Gruppe von Ausführungsformen sind die Verstärkungskomponenten entweder in einem Silizium-enthaltenden Polymer eingeschlossen oder kovalent daran gebunden. Dieses Polymer ist eine homogene Matrix, die aus biologisch verträglichen Polymeren hergestellt ist, deren hydrophob/hydrophil-Gleichgewicht über einem weiten Bereich variiert werden kann, um die Geschwindigkeit der Diffusion des polyhydroxylierten Analyten zu den Verstärkungskomponenten zu steuern. Die Matrix kann mit herkömmlichen Verfahren durch die Polymerisation von Diisocyanaten, hydrophilen Diolen oder Diaminen, Silikonpolymeren und gegebenenfalls Kettenverlängerungsmitteln hergestellt werden. Die resultierenden Polymere sind in Lösungsmitteln wie z. B. Aceton oder Ethanol löslich und können durch Tauch-, Sprüh- oder Schleuderbeschichten aus der Lösung als Matrix hergestellt werden. Die Herstellung biologisch verträglicher Matrizen für die Glukoseüberwachung ist in den gleichzeitig anhängigen Anmeldungen 08/721,262 (als US-Patent 5,777,060 erteilt) und 08/749,754 (als US-Patent 5,786,439 erteilt) beschrieben.
Die Diisocyanate, die zum Aufbau einer biologisch verträglichen Matrix geeignet sind, sind diejenigen, die typischerweise zur Herstellung biologisch verträglicher Polyurethane verwendet werden. Solche Diisocyanate sind detailliert in Szycher, „Seminar on advances in medical grade polyurethanes", Technomic Publishing (1995) beschrieben und umfassen sowohl aromatische als auch aliphatische Diisocyanate. Beispiele für geeignete aromatische Diisocyanate umfassen Toluoldiisocyanat, 4,4''-Diphenylmethandiisocyanat, 3,3''-Dimethyl-4,4''-biphenyldiisocyanat, Naphthalindiisocyanat und p-Phenylendiisocyanat. Geeignete aliphatische Diisocyanate umfassen z. B. 1,6-Hexamethylendiisocyanat (HDI), Trimethylhexamethylendiisocyanat (TMDI), trans-1,4-Cyclohexandiisocyanat (CHDI), 1,4-Cyclohexanbis(methylenisocyanat) (BDI), 1,3-Cyclohexanbis(methylenisocyanat) (H₆XDI), Isophorondiisocyanat (IPDI) und 4,4''-Methylenbis(cyclohexylisocyanat) (H₁₂MDI). In bevorzugten Ausführungsformen ist das Diisocyanat Isophorondiisocyanat, 1,6-Hexamethylendiisocyanat oder 4,4''-Methylenbis(cyclohexylisocyanat). Eine Anzahl dieser Diisocyanate ist von kommerziellen Quellen wie z. B. der Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin, USA) erhältlich oder kann einfach mittels Standardsyntheseverfahren unter Verwendung von Literaturvorschriften hergestellt werden.
Die Menge des Diisocyanats, die in dem Reaktionsgemisch für die vorliegenden Zusammensetzungen eingesetzt wird, beträgt typischerweise etwa 50 Mol-%, bezogen auf die gesamten restlichen Reaktanten. Insbesondere ist die Menge des bei der Herstellung der vorliegenden Zusammensetzungen verwendeten Diisocyanats ausreichend, um mindestens etwa 100% der -NCO-Gruppen bereitzustellen, die zur Reaktion mit den Hydroxyl- oder Aminogruppen der restlichen Reaktanten erforderlich sind. Beispielsweise werden für ein Polymer, das unter Verwendung von x mol Diisocyanat hergestellt wird, a mol eines hydrophilen Polymers (Diol, Diamin oder einer Kombination davon), b mol eines Silikonpolymers mit funktionalisierten Endgruppen und c mol eines Kettenverlängerungsmittels derart verwendet, dass x = a + b + c, wobei c den Wert Null haben kann.
Ein zweiter Reaktant, der zur Herstellung der hier beschriebenen biologisch verträglichen Matrix verwendet wird, ist ein hydrophiles Polymer. Das hydrophile Polymer kann ein hydrophiles Diol, ein hydrophiles Diamin oder eine Kombination davon sein. Das hydrophile Diol kann ein Polyalkylenglykol, ein Polyol auf Polyesterbasis oder ein Polycarbonatpolyol sein. Der Begriff „Polyalkylenglykol" bezieht sich hier auf Polymere niederer Alkylenglykole wie z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol und Polytetramethylenetherglykol (PTMEG). Der Begriff „Polycarbonatpolyol" bezieht sich auf Polymere mit einer Hydroxylfunktionalität am Kettenende und einer Ether- und Carbonatfunktionalität innerhalb der Polymerkette. Der Alkylteil des Polymers wird typischerweise aus aliphatischen C₂-C₄-Resten oder in manchen Ausführungsformen aus längerkettigen aliphatischen Resten, cycloaliphatischen Resten oder aromatischen Resten zusammengesetzt sein. Der Ausdruck „hydrophile Diamine" bezieht sich auf beliebige der vorstehend genannten hydrophilen Diole, in denen die endständigen Hydroxylgruppen durch reaktive Amingruppen ersetzt worden sind, oder in denen die endständigen Hydroxylgruppen zur Erzeugung einer verlängerten Kette mit endständigen Amingruppen derivatisiert worden sind. Beispielsweise ist ein bevorzugtes hydrophiles Diamin ein „Diaminopolyoxyalkylen", bei dem es sich um ein Polyalkylenglykol handelt, bei dem die endständigen Hydroxylgruppen durch Aminogruppen ersetzt worden sind. Der Begriff „Diaminopolyoxyalkylen" bezieht sich auch auf Polyalkylenglykole, die an den Kettenenden Aminoalkylethergruppen aufweisen. Ein Beispiel eines geeigneten Diaminopolyoxyalkylens ist Polypropylenglykolbis(2-aminopropylether). Eine Anzahl der vorstehend genannten Polymere ist von Aldrich Chemical Company erhältlich. Alternativ können für deren Synthese Literaturverfahren eingesetzt werden.
Die Menge des hydrophilen Polymers, das in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet wird, beträgt typischerweise etwa 10 Mol-% bis etwa 80 Mol-%, bezogen auf das verwendete Diisocyanat. Vorzugsweise beträgt die Menge etwa 20 Mol-% bis etwa 60 Mol-%, bezogen auf das Diisocyanat. Wenn geringere Mengen des hydrophilen Polymers verwendet werden, ist es bevorzugt, ein Kettenverlängerungsmittel einzubeziehen (siehe unten).
Silikonpolymere, die zur Bestimmung der polyhydroxylierten Analyten (z. B. Glukose) geeignet sind, sind typischerweise linear. Für Polymere, die zur Glukoseüberwachung geeignet sind, sind eine hervorragende Sauerstoffpermeabilität und eine niedrige Glukosepermeabili tät bevorzugt. Ein besonders geeignetes Silikonpolymer ist ein Polydimethylsiloxan mit zwei reaktiven funktionellen Gruppen (d. h. einer Funktionalität von 2). Die funktionellen Gruppen können z. B. Hydroxylgruppen, Aminogruppen oder Carbonsäuregruppen sein, wobei es sich vorzugsweise jedoch um Hydroxyl- oder Aminogruppen handelt. In einigen Ausführungsformen können Kombinationen von Silikonpolymeren verwendet werden, bei denen ein erster Teil Hydroxylgruppen und ein zweiter Teil Aminogruppen umfasst. Vorzugsweise sind die funktionellen Gruppen an den Kettenenden des Silikonpolymers positioniert. Eine Anzahl geeigneter Silikonpolymere ist z. B. von Dow Chemical Company (Midland, Michigan, USA) und General Electric Company (Silicones Division, Schenectady, New York, USA) erhältlich. Andere können durch allgemeine Syntheseverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wobei mit käuflichen Siloxanen (United Chemical Technologies, Bristol, Pennsylvania, USA) begonnen wird. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Silikonpolymeren vorzugsweise um solche mit einem Molekulargewicht von etwa 400 bis etwa 10000, mehr bevorzugt um solche mit einem Molekulargewicht von etwa 2000 bis etwa 4000. Die Menge des Silikonpolymers, die in das Reaktionsgemisch eingebracht wird, hängt von den gewünschten Eigenschaften des resultierenden Polymers ab, aus dem die biologisch verträgliche Membran gebildet wird. Für diejenigen Zusammensetzungen, für die ein geringeres Eindringen des Analyten gewünscht ist, kann eine größere Menge des Silikonpolymers verwendet werden. Alternativ können für Zusammensetzungen, in denen ein stärkeres Eindringen des Analyten gewünscht ist, kleinere Mengen des Silikonpolymers verwendet werden. Typischerweise beträgt die Menge des Siloxanpolymers für einen Glukosesensor 10 Mol-% bis 90 Mol-%, bezogen auf das Diisocyanat. Vorzugsweise beträgt die Menge etwa 20 Mol-% bis 60 Mol-%, bezogen auf das Diisocyanat.
In einer Gruppe von Ausführungsformen enthält das Reaktionsgemisch zur Herstellung biologisch verträglicher Membranen auch ein Kettenverlängerungsmittel, bei dem es sich um ein aliphatisches oder aromatisches Diol, ein aliphatisches oder aromatisches Diamin, ein Alkanolamin oder Kombinationen davon handelt. Beispiele für geeignete Kettenverlängerungsmittel umfassen Ethylenglykol, Propylenglykol, 1,4-Butandiol, 1,6-Hexandiol, Ethanolamin, Ethylendiamin, Butandiamin, 1,4-Cyclohexandimethanol. Aromatische Kettenverlängerungsmittel umfassen z. B. p-Di(2-hydroxyethoxy)benzol, m-Di(2-hydroxyethoxy)benzol, Ethacure 100^® (ein Gemisch aus zwei Isomeren von 2,4-Diamino-3,5-diethyltoluol), Ethacure 300^® (2,4-Diamino-3,5-di(methylthio)toluol), 3,3''-Dichlor-4,4''-diaminodiphenylmethan, Polacure^® 740M (Trimethylenglykolbis(p-aminobenzoat)ester) und Methylendianilin. Das Einbringen eines oder mehrerer der vorstehend genannten Kettenverlängerungsmittel stattet die resultierende biologisch verträgliche Membran typischerweise mit einer zusätzlichen physikalischen Festigkeit aus, erhöht jedoch die Glukosepermeabilität des Polymers nicht wesentlich. Vorzugs weise wird ein Kettenverlängerungsmittel verwendet, wenn geringere (d. h. 10 bis 40 Mol-%) Mengen der hydrophilen Polymere verwendet werden. In besonders bevorzugten Zusammensetzungen ist das Kettenverlängerungsmittel Diethylenglykol, das in einer Menge von etwa 40 Mol-% bis 60 Mol-%, bezogen auf das Diisocyanat, vorliegt.
b. Hydrogele
In manchen Ausführungsformen kann die Polymermatrix, welche die Verstärkungskomponenten enthält, ferner mit einer permeablen Schicht wie z. B. einem Hydrogel, Celluloseacetat, P-HEMA, Nafion oder Glutaraldehyd beschichtet werden. Eine Anzahl von Hydrogelen ist in der vorliegenden Erfindung geeignet. Hydrogele können als Polymermatrix eingesetzt werden, welche die Verstärkungskomponenten einhüllt oder einschließt. In anderen Ausführungsformen können die Verstärkungskomponenten kovalent an ein Hydrogel gebunden werden.
Geeignete Hydrogele können durch die Umsetzung eines Diisocyanats und eines hydrophilen Polymers und gegebenenfalls eines Kettenverlängerungsmittels hergestellt werden. Die Hydrogele sind extrem hydrophil und weisen eine Wasseraufnahme von etwa 120 Gew.-% bis etwa 400 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa 150% bis etwa 400% auf. Die Diisocyanate, die hydrophilen Polymere und die Kettenverlängerungsmittel, die in diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden, sind diejenigen, die vorstehend beschrieben worden sind. Die Menge des in dem Reaktionsgemisch für die vorliegenden Zusammensetzungen verwendeten Diisocyanats beträgt typischerweise etwa 50 Mol-%, bezogen auf die Gesamtmenge der restlichen Reaktanten. Insbesondere ist die Menge des Diisocyanats, die bei der Herstellung der vorliegenden Zusammensetzungen verwendet wird, ausreichend, so dass mindestens etwa 100% der -NCO-Gruppen, die zur Reaktion mit den Hydroxyl- oder Aminogruppen der restlichen Reaktanten erforderlich sind, bereitgestellt werden. Beispielsweise werden für ein Polymer, das unter Verwendung von x mol des Diisocyanats hergestellt wird, a mol eines hydrophilen Polymers (Diol, Diamin oder eine Kombination davon) und b mol eines Kettenverlängerungsmittels derart verwendet, dass x = a + b, wobei b den Wert Null haben kann. Vorzugsweise ist das hydrophile Diamin ein „Diaminopolyoxyalkylen", bei dem es sich um ein Polyalkylenglykol handelt, bei dem die endständigen Hydroxylgruppen durch Aminogruppen ersetzt worden sind. Der Begriff „Diaminopolyoxyalkylen" bezieht sich auch auf Polyalkylenglykole, die an den Kettenenden Aminoalkylethergruppen aufweisen. Ein Beispiel eines geeigneten Diaminopolyoxyalkylens ist Polypropylenglykolbis(2-aminopropylether). Eine Anzahl von Diaminopolyoxyalkylenen ist mit verschiedenen durchschnittlichen Molekulargewichten verfügbar und wird als Jeffamines^® verkauft (beispielsweise Jeffamine 230, Jeffami ne 600, Jeffamine 900 und Jeffamine 2000). Diese Polymere sind von Aldrich Chemical Company erhältlich. Alternativ können zu deren Synthese Literaturverfahren eingesetzt werden.
Die Menge des hydrophilen Polymers, das in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet wird, beträgt typischerweise etwa 10 Mol-% bis etwa 100 Mol-%, bezogen auf das verwendete Diisocyanat. Vorzugsweise beträgt die Menge etwa 50 Mol-% bis etwa 90 Mol-%, bezogen auf das Diisocyanat. Wenn Mengen von weniger als 100% des hydrophilen Polymers verwendet werden, ist der restliche Prozentsatz (um insgesamt 100% einzustellen) ein Kettenverlängerungsmittel.
Die Polymerisation der Substratschichtkomponenten oder der Hydrogelkomponenten kann durch Massepolymerisation oder durch Lösungspolymerisation durchgeführt werden. Die Verwendung eines Katalysators ist bevorzugt, jedoch nicht erforderlich. Geeignete Katalysatoren umfassen Dibutylzinnbis(2-ethylhexanoat), Dibutylzinndiacetat, Triethylamin und Kombinationen davon. Vorzugsweise wird als Katalysator Dibutylzinnbis(2-ethylhexanoat) verwendet. Die Massepolymerisation wird typischerweise bei einer Starttemperatur von etwa 25°C (Umgebungstemperatur) bis etwa 50°C durchgeführt, um ein angemessenes Mischen der Reaktanten sicherzustellen. Nach dem Mischen der Reaktanten wird typischerweise eine exotherme Reaktion festgestellt, wobei die Temperatur auf etwa 90 bis 120°C steigt. Nach der anfänglichen exothermen Reaktion kann der Reaktionskolben bei 75°C bis 125°C erhitzt werden, wobei 90°C bis 100°C ein bevorzugter Temperaturbereich ist. Das Erhitzen wird üblicherweise für ein bis zwei Stunden durchgeführt.
Die Lösungspolymerisation kann in einer entsprechenden Weise durchgeführt werden. Lösungsmittel, die für eine Lösungspolymerisation geeignet sind, umfassen Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid, halogenierte Lösungsmittel wie z. B. 1,2,3-Trichlorpropan und Ketone wie z. B. 4-Methyl-2-pentanon. Vorzugsweise wird THF als Lösungsmittel verwendet. Wenn die Polymerisation in einem Lösungsmittel durchgeführt wird, wird das Erhitzen des Reaktionsgemischs typischerweise mindestens 3 bis 4 Stunden durchgeführt, und vorzugsweise mindestens 10 bis 20 Stunden. Am Ende dieses Zeitraums wird das Lösungspolymer typischerweise auf Raumtemperatur gekühlt und in DI-Wasser gegossen. Das ausgefällte Polymer wird gesammelt, getrocknet, mit heißem DI-Wasser gewaschen, um das Lösungsmittel und nicht umgesetzte Monomere zu entfernen, und dann erneut getrocknet.
2. Verfahren zur Immobilisierung der Verstärkungskomponenten
Die Immobilisierung der Verstärkungskomponenten in der vorstehend beschriebenen Polymermatrix kann durch Einbringen der Komponenten in das Polymerisationsgemisch während der Bildung der Matrix erreicht werden. Wenn die Komponenten so hergestellt werden, dass sie geeignete verfügbare funktionelle Gruppen aufweisen, werden die Komponenten während der Bildung kovalent an das Polymer gebunden. Alternativ können die Komponenten während der Bildung innerhalb der Matrix eingeschlossen werden.
a. Kovalente Bindung
In einer Gruppe von Ausführungsformen werden die Substrate der Fluoreszenz-erzeugenden Reaktion in einem oder auf der Oberfläche eines geeigneten Basismaterial(s) unter Verwendung einer kovalenten Bindungschemie immobilisiert. Die Substrate können unter Verwendung einer Vielzahl kovalenter Bindungstechniken, die gebräuchlich für die Polymersynthese verwendet werden, an das Basismaterial gebunden werden, wie z. B. mittels einer Kondensation, einer Kondensation-Eliminierung oder radikalischer Polymerisationen. Für Verbindungen der Formel I kann die geeignete Funktionalisierung an einer oder mehreren der gebundenen Gruppen R¹, R³ oder R⁴ erreicht werden. Bei Polymerisationen des Kondensationstyps würde die Verwendung eines einzelnen kovalenten Linkers zu einer endständigen Bindung führen, wohingegen die Verwendung von zwei oder drei R-Gruppen zu einer Kettenverlängerung bzw. Vernetzung führt. Bei radikalischen Polymerisationen kann eine Kettenverlängerung mit einer einzelnen funktionalisierten R-Gruppe stattfinden.
Wie es im Beispiel 3 gezeigt ist, kann ein Blockcopolymer mit endständigen Amingruppen, Polypropylenglykol-Block-Polyethylenglykol-Block-Polypropylenglykolbis(2-aminopropylether), mit einem Diisocyanat zur Bildung eines biologisch verträglichen, hydrophilen Polyharnstoffs umgesetzt werden. Das Einbringen eines hydroxyfunktionalisierten, fluoreszierenden Monomers stellt ein Polymer bereit, das eine kovalent gebundene Verstärkungskomponente, in diesem Beispiel, als kettenabbrechende Urethanbindung enthält. In jedem Fall besteht das Ziel der Immobilisierung darin, die Verstärkungskomponenten derart in eine Matrix einzubringen, dass die gewünschte optische und chemische Aktivität des Molekülsystems beibehalten wird. Die 13 zeigt die reversible Änderung der Fluoreszenz für eine Lösung von Anthracenboronat als Funktion der Glukosekonzentration über den physiologischen Bereich.
In einigen Ausführungsformen werden die Verstärkungskomponenten für eine kovalente Bindung an ein Polymer während der Bildung nicht mit geeigneten funktionellen Gruppen substi tuiert. In diesem Fall werden die Reagenzien einfach eingeschlossen. Die Menge der Verstärkungskomponente, die für das kovalente Verfahren oder das Einschlussverfahren verwendet wird, wird typischerweise in einer Größenordnung von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-% liegen, bezogen auf das Gesamtgewicht der biologisch verträglichen Matrix. Dem Fachmann ist klar, dass die Mengen abhängig von der Intensität des erzeugten Signals sowie von der Empfindlichkeit des Detektors weiter nach oben oder unten eingestellt werden können.
Optische Systeme
Der zweite Aspekt des hier beschriebenen Biosensors besteht aus einem optischen System zum Abfragen des IAS und zum Erfassen des so durch das IAS erzeugten Signals. Der Begriff „Abfragen" bezieht sich hier auf die Belichtung der Verstärkungskomponenten in dem IAS und die anschließende Erfassung des emittierten Lichts. Eine Ausführungsform, die ein transdermales optisches System veranschaulicht, ist in der 1 gezeigt, wobei die Lichtquelle (S) durch die Haut leuchtet und ein Detektor (D) die durch die Haut übertragene Fluoreszenz erfasst. Die 3 bis 6 zeigen Ausführungsformen, bei denen keine Übertragung durch die Haut stattfindet, da die Lichtquelle implantiert ist, oder bei denen das Licht mittels einer Faseroptik zu dem am Ende der Faser positionierten Verstärkungssystem übertragen wird.
Die 1 zeigt ein Schema des subdermal implantierten optischen Glukoseüberwachungssystems. Die Lichtquelle (S) könnte eine Lampe, eine LED oder eine Laserdiode (gepulst oder moduliert) sein. Der Detektor (D) kann eine Photodiode, ein CCD-Detektor oder eine Photomultiplierröhre sein. Gegebenenfalls werden Filter zum Filtern des einfallenden und/oder emittierten Lichtstrahls verwendet, um gewünschte Wellenlängen zu erhalten. Die Quelle und der Detektor sind in der 1 so gezeigt, dass sie außerhalb des Körpers positioniert sind, obwohl die Quelle und/oder der Detektor implantiert sein kann bzw. können, wie es in den 3 bis 6 gezeigt ist. Das biologisch verträgliche Material (z. B. Silikon, Polyurethan oder ein anderes Polymer) mit den immobilisierten Vestärkungskomponenten wird unter die Haut implantiert. Die Lichtquelle wird verwendet, um das implantierte System zu belichten und der Detektor erfasst die Intensität des emittierten Lichts (typischerweise Fluoreszenzlicht). Es können auch andere Arten der Wechselwirkung eingesetzt werden, wie z. B. die Extinktion, Durchlässigkeit oder Reflexion, wenn die Änderung der Lichtmenge oder der spektralen Eigenschaften des Lichts, das vom Detektor oder Spektrophotometer gemessen wird, durch die Konzentration des lokalen Analyten (z. B. Glukose) moduliert wird. In anderen Erfassungsverfahren wird anstelle der Lichtintensität die Fluoreszenzlebensdauer gemessen.
Im Fall der Fluoreszenz kann das Verhältnis der Intensität der Anregung und der Emission verwendet werden, um das Glukosesignal zu quantifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verhältnis der Fluoreszenz von den Verstärkungskomponenten zu der Fluoreszenz eines Kalibrierungsfluorophors gemessen. Dieses Verfahren schließt Fehler aufgrund der Erfassung und von Schwankungen des Lichttransports durch die Haut (die z. B. durch verschiedene Hauttöne verursacht werden) aus.
Verfahren zur Erfassung und Quantifizierung von Analyten in vivo
Im Hinblick auf die vorstehenden Zusammensetzungen und Vorrichtungen stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Erfassung und Quantifizierung eines Analyten in vivo bereit. Insbesondere umfassen die Verfahren die Quantifizierung der Menge eines polyhydroxylierten Analyten in einem Lebewesen, und zwar durch (a) Abfragen eines subkutan implantierten Verstärkungssystems mit einer Energiequelle zur Bereitstellung eines angeregten Verstärkungssystems, das eine Energieemission erzeugt, die der Menge des polyhydroxylierten Analyten entspricht, und (b) Erfassen der Emission, so dass dadurch die Menge des polyhydroxylierten Analyten in dem Lebewesen quantifiziert wird.
Die Verstärkungssysteme und optischen Systeme sind im Wesentlichen mit denjenigen identisch, die vorstehend beschrieben worden sind, und die bevorzugten Ausführungsformen, einschließlich der Komponenten der biologisch verträglichen Matrix (z. B. Silizium-enthaltende Polymere, Hydrogele, usw.) sind diejenigen, die vorstehend beschrieben worden sind. Vor der Durchführung des vorliegenden Verfahrens wird das Verstärkungssystem in ein Lebewesen unter Verwendung minimal invasiver chirurgischer oder mikrochirurgischer Techniken implantiert. Der Zweck einer solchen Implantierung besteht darin, das Verstärkungssystem und den interessierenden Analyten (z. B. in einem Fluid oder Gewebe, das den Analyten enthält) in Kontakt zu bringen. Demgemäß kann das Verstärkungssystem in oder unter der Haut oder alternativ innerhalb eines Organs oder Blutgefäßes angeordnet werden. Wenn transdermal abgefragt wird, wird das Verstärkungssystem vorzugsweise subkutan etwa 1 bis 2 mm unterhalb der Hautoberfläche angeordnet. Bei einem mittels einer Faseroptik durchgeführten Abfragen wird die Tiefe 1 bis 4 mm unterhalb der Hautoberfläche betragen. Bei denjenigen Ausführungsformen, bei denen das optische System und die Verstärkungskomponenten mit einer Insulinpumpe in Verbindung stehen, kann das Verstärkungssystem auch in einer größeren Tiefe angeordnet werden.
Der polyhydroxylierte Analyt kann eine beliebige endogene oder xenobiotische Substanz sein, die zwei oder mehr funktionelle Hydroxygruppen in einer vicinalen Position zueinander aufweist. Vorzugsweise ist der Analyt ein Zucker, mehr bevorzugt Glukose.
Vorstehend wurden geeignete Verstärkungssysteme beschrieben. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird das implantierte Verstärkungssystem jedoch ferner ein Kalibrierungsfluorophor umfassen, das ein Signal bereitstellt, welches das Signal von den Verstärkungskomponenten nicht stört. In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das IAS eine Zucker-bindende Verbindung auf Boronatbasis, mehr bevorzugt diejenigen der Formel I, und ein Kalibrierungsfluorophor. Geeignete Kalibrierungsfluorophore sind Fluoreszenzfarbstoffe wie z. B. Fluoresceine, Cumarine, Oxazine, Xanthene, Cyanine, Metallkomplexe und polyaromatische Kohlenwasserstoffe, die ein Fluoreszenzsignal erzeugen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird das Verstärkungssystem ein Kalibrierungsfluorophor und eine Verbindung der Formel I umfassen, in der D¹ ein langwelliger Fluoreszenzfarbstoff ist.
Um dem Fachmann ein vollständigeres Verständnis dieser Erfindung zu ermöglichen, veranschaulichen die folgenden Beispiele die allgemeinen Prinzipien zur Herstellung von Systemen, die auf Glukose reagieren. Diese Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollten nicht beschränkend aufgefasst werden, falls sich aus den beigefügten Ansprüchen nicht etwas anderes ergibt. Alle Teile sind Gewichtsprozent, falls nicht anderes angegeben ist.
Beispiele
In den nachstehenden Beispielen zeigt das Beispiel 1 die Synthese verschiedener chemischer Verstärkungskomponenten. Das Beispiel 2 zeigt die Synthese biologisch verträglicher Polymere. Das Beispiel 3 beschreibt die kovalente Bindung bestimmter Verstärkungskomponenten an ein biologisch verträgliches Polymer.
Allgemeine Materialien und Verfahren
Falls nichts anderes angegeben ist, wurden die in den Beispielen verwendeten Materialien von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA, oder von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA, erhalten.
Beispiel 1
1.1 Synthese von Fluorescein-markierter Boronsäure (FABA)
Die Herstellung einer Fluorescein-markierten Boronsäure (FABA) wurde gemäß Uziel et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 180, 1233 (1991) durchgeführt.
Eine Lösung (5 ml) von 3-Aminophenylboronsäure wurde in DI-Wasser hergestellt. Der pH wurde mit NaOH und NaHCO₃ auf 8 eingestellt. Fluoresceinisothiocyanat (0,45 mmol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Fluorescein-markierte Boronat wurde in Form gelber Kristalle isoliert. Bei pH 10 wurde die Fluoreszenz der Verbindung durch die Zugabe von Glukose zu der Lösung signifikant vermindert.
1.2 Synthese markierter Boronsäuren
Die hier beschriebenen markierten Boronsäuren werden gemäß den in den 9 und 10 gezeigten Schemata hergestellt.
2,4,6-(o-(Brommethyl)phenyl)boroxin (1) wurde gemäß einem Literaturverfahren aus 2,4,6-o-Tolylboroxin hergestellt, wobei anstelle des AlBN-Katalysators Benzoylperoxid (BPO) verwendet wurde (vgl. Hawkins et al., J. Am. Chem. Soc. 82, 3863 (1960)).
9-((N-Methyl-N-(o-boronobenzyl)amino)methyl)anthracen (2) wurde durch eine Modifizierung eines Literaturverfahrens (A) (vgl. James et al., J. Am. Chem. Soc. 117, 8982 (1995)) oder mit dem Verfahren (B) hergestellt.

(A) 2,4,6-(o-(Brommethyl)phenyl)boroxin (100 mg, 0,18 mmol) und 9-((Methylamino)methyl)anthracen (254 mg, 1,1 mmol) wurden in 50 ml Chloroform 3 Stunden unter Rückfluss gehalten. Das Gemisch wurde in einem Eisbad auf 0°C gekühlt und durch eine gesinterte Glasfritte filtriert. Das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohmaterial wurde mit 3 × 3 ml-Portionen von Acetonitril/Wasser (9/1, v/v) gewaschen, um das Hydrochloridsalz von 9-((Methylamino)methyl)anthracen zu entfernen, wobei 2 in Form eines blass-gelben Pulvers erhalten wurde: 155 mg (48%), Schmp.: 149–151°C (Lit.-Schmp.: 147–152°C), ¹H-NMR (300,13 MHz, CD₃OD) δ 2,27 (s, 3H), 3,85 (s, 2H), 4,60 (s, 2H), 7,00–7,80 (m, 8H), 8,05 (m, 2H), 8,30–8,70 (m, 3H).
(B): Eine Lösung von 9-((Methylamino)methyl)anthracen (1,00 g, 4,5 mmol), 2-Brombenzylbromid (1,13 g, 4,5 mmol) und K₂CO₃ (0,691 g, 5,0 mmol) in 50 ml Acetonitril wurde 18 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluss gehalten. Die Lösung wurde auf einem gesinterten Glasfilter filtriert und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter vermindertem Druck entfernt, wobei 9-(N-Methyl-N-(o-brombenzyl)amino)methyl)anthracen erhalten wurde (95%, mittels NMR). Der resultierende Feststoff wurde in Diethylether (50 ml) aufgenommen und bei 0°C mit 1 Äquivalent Butyllithium behandelt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0°C gerührt, worauf 5 Äquivalente Trimethylborat mittels einer Kanüle zugesetzt wurden. Nach dem Erwärmen des Gemischs auf Raumtemperatur wurden 50 ml Wasser zugesetzt, um die Reaktion zu quenchen. Die Etherschicht wurde abgetrennt, mit 3 × 10 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck lieferte einen Feststoff, der mit dem in (A) erhaltenen Feststoff identisch war, in einer Ausbeute von 52%.

2,2-Dimethylpropan-1,3-diyl(o-brommethyl)phenyl)boronat (3)
2,4,6-(o-(Brommethyl)phenyl)boroxin (5,0 g, 25,4 mmol) und 2,2-Dimethyl-1,3-propandiol (8,73 g, 83,8 mmol) wurden in Toluol (200 ml) 24 Stunden unter Rückfluss gehalten, wobei Wasser azeotrop entfernt wurde (Dean-Stark). Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein Feststoff/Öl-Gemisch erhalten wurde, das dann in 25 ml Toluol und Silicagel aufgeschlämmt wurde. Das resultierende Gemisch wurde auf einer gesinterten Glasfritte filtriert und sorgfältig mit kaltem Toluol gewaschen, bis die Waschlösungen mittels DC kein Produkt mehr zeigten. Die vereinigten Filtrate wurden unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 3 als blass-gelbes Öl erhalten wurde: 6,76 g (94%), ¹H-NMR (300,13 MHz, CD₃CN) δ 1,05 (s, 6H), 3,81 (s, 4H), 4,95 (s, 2H), 7,15–7,45 (m, 3H), 7,74 (m, 1H).
9,10-Bis((methylamino)methyl)anthracen (4)
Die Titelverbindung wurde gemäß einem Literaturverfahren hergestellt (vgl. James et al., J. Am. Chem. Soc. 117, 8982 (1995)).
9-((5-Hydroxypentyl)aminomethyl)anthracen (5)
Eine Lösung von Anthraldehyd (9,595 g, 0,0465 mol) und 5-Amino-1-pentanol (15,00 g, 0,116 mmol) in 500 ml Ethanol wurde bei 0°C 3 Stunden gerührt. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und 150 ml Ethanol, das NaBH₄ (4,65 g, 0,1229 mol) enthielt, wurden langsam unter Rühren zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Ethanol wurde unter vermindertem Druck entfernt und dem braunen Öl/Feststoff-Gemisch wurden 150 ml Diethylether zugesetzt. Dieser Lösung wurde Wasser tropfenweise zugesetzt, bis die Wasserstoffentwick lung beendet war, worauf 500 ml Wasser zugesetzt wurden. Die Etherphase wurde isoliert, mit 2 × 50 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf einer gesinterten Glasfritte filtriert. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab 12,17 g (89,2% Ausbeute) 5 als goldfarbenen Feststoff. ¹H-NMR (300,13 MHz, CD₃CN) δ 1,51 (m, 6H), 2,81 (t, 2H), 3,49 (t, 2H), 4,68 (s, 2H), 7,52 (m, 4H), 8,05 (d, 2H), 8,44 (m, 3H), ¹³C-{¹H}-NMR (75,4 MHz, CDCl₃) δ 133,1, 132,0, 131,7, 130,4, 128,6, 127,4, 126,2, 125,1, 62,9, 51,1, 45,8, 33,5, 30,3, 24,8.
9-((N-(5-Hydroxypentyl)-N-(ethyl)amino)methyl)anthracen (6)
9-((5-Hydroxypentyl)aminomethyl)anthracen (1,00 g, 3,41 mol) und K₂CO₃ (0,518 g, 3,75 mmol) wurden in 25 ml Acetonitril aufgenommen. Ethylbromid (11,14 g, 102 mmol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 24 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluss gehalten. Das Gemisch wurde auf einer gesinterten Glasfritte filtriert und das Lösungsmittel sowie überschüssiges Ethylbromid wurden unter vermindertem Druck entfernt. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab 1,07 g (98% Ausbeute) 6 als gelben Feststoff. ¹H-NMR (300,13 MHz, CD₃CN) δ 1,15 (m, 2H), 1,38 (m, 5H), 1,81 (m, 2H), 3,05 (m, 4H), 3,49 (t, 2H), 5,21 (s, 2H), 7,45 (m, 2H), 7,62 (m, 2H), 8,05 (d, 2H), 8,44 (m, 3H), ¹³C-{¹H}-NMR (75,4 MHz, CDCl₃) δ 131,8, 131,3, 130,8, 129,6, 128,0, 125,6, 124,0, 61,7, 53,1, 49,4, 48,7, 31,4, 23,9, 23,3, 10,0.
9-((N-(5-Hydroxypentyl)-N-(o-boronobenzyl)amino)methyl)anthracen (7)
9-((5-Hydroxypentyl)aminomethyl)anthracen (1,06 g, 3,51 mol) und K₂CO₃ (0,56 g, 4,05 mmol) wurden in 15 ml Acetonitril aufgenommen. Eine Lösung von 2,2-Dimethylpropan-1,3-diyl(o-(brommethyl)phenyl)boronat (1,02 g, 3,51 mmol) in 5 ml Acetonitril wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 24 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluss gehalten. Das Gemisch wurde auf einer gesinterten Glasfritte filtriert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der resultierende Feststoff wurde mit Acetonitril/Wasser (4 : 1, v/v) behandelt, um die Schutzgruppe von der Boronatgruppe zu entfernen, auf einer gesinterten Glasfritte filtriert und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 9 als blass-gelber Feststoff erhalten wurde (0,744 g, 48% Ausbeute). ¹H-NMR (300,13 MHz, CD₃OD) δ 0,95 (m, 2H), 1,15 (m, 2H), 1,60 (m, 2H), 2,82 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 4,45 (s, 2H), 5,08 (s, 2H), 7,1–7,8 (m, 8H), 8,07 (d, 2H), 8,21 (d, 2H), 8,62 (s, 1H), ¹³C-{¹H}-NMR (75,4 MHz, CDCl₃) δ 135,8, 133,0, 131,5, 129,1, 128,6, 127,8, 126,5, 124,9, 62,4, 61,9, 53,7, 49,7, 32,6, 24,9, 24,6.
10-(Hydroxymethyl)-9-anthraldehyd (8) wurde gemäß einem Literaturverfahren hergestellt (vgl. Lin et al., J. Org. Chem. 44, 4701 (1979)).
10-(Hydroxymethyl)-9-((methylimino)methyl)anthracen (9)
10-(Hydroxymethyl)-9-anthraldehyd (3,00 g, 12,7 mmol) wurde 50 ml einer gesättigten Lösung von Methylamin in Methanol zugesetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiges Methylamin wurden unter vermindertem Druck entfernt, wobei das Imin als leuchtend gelbes Pulver erhalten wurde (quantitativ). ¹H-NMR (300,13 MHz, DMSO-d₆) δ 3,35 (s, 3H), 5,51 (s, 2H), 7,61 (m, 4H), 8,55 (m, 4H), 9,48 (s, 1H).
10-(Hydroxymethyl)-9-((methylamino)methyl)anthracen (10)
10-(Hydroxymethyl)-9-((methylimino)methyl)anthracen (1,00 g, 4,0 mmol) wurde in 25 ml Isopropanol aufgeschlämmt. NaBH₄ (0,454 g, 12,0 mmol) wurde als Feststoff zugesetzt und die Lösung wurde 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde auf einer gesinterten Glasfritte filtriert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei 10 als leuchtend gelbes Pulver erhalten wurde (0,853 g, 86% Ausbeute). ¹H-NMR (300,13 MHz, CD₃OD) δ 2,55 (s, 3H), 4,64 (s, 2H), 5,56 (s, 2H), 7,55 (m, 4H), 8,38 (m, 2H), 8,50 (m, 2H), ¹³C-{¹H}-NMR (75,4 MHz, CD₃OD) δ 133,4, 133,0, 131,6, 131,5, 126,9, 126,7, 126,2, 125,7, 57,2, 47,9, 36,5.
10-(Hydroxymethyl)-9-N-(o-boronobenzyl)amino)methylanthracen (11)
10-(Hydroxymethyl)-9-((methylamino)methyl)anthracen (0,800 g, 3,18 mmol) und K₂CO₃ (0,56 g, 4,05 mmol) wurden in 15 ml Acetonitril aufgenommen. Eine Lösung von 2,2-Dimethylpropan-1,3-diyl(o-(brommethyl)phenyl)boronat 3 (1,00 g, 3,44 mmol) in 5 ml Acetonitril wurde zugesetzt und das Gemisch wurde unter Stickstoff 24 Stunden unter Rückfluss gehalten. Das Gemisch wurde heiß auf einer gesinterten Glasfritte filtriert und beim Abkühlen fiel ein gelber Feststoff aus. Der resultierende Feststoff wurde mit Acetonitril/Wasser (4 : 1, v/v) behandelt, auf einer gesinterten Glasfritte filtriert und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 11 als leuchtend gelber Feststoff erhalten wurde (0,632 g, 51,6% Ausbeute). ¹H-NMR (300,13 MHz, CD₃OD) δ 2,58 (s, 3H), 4,58, (s, 2H), 5,22 (s, 2H), 5,61 (s, 2H), 7,62 (m, 6H), 7,80 (m, 2H), 8,18 (m, 2H), 8,58 (m, 2H), ¹³C-{¹H}-NMR (75,4 MHz, CD₃OD) δ 136,9, 136,2, 135,9, 132,9, 132,7, 131,4, 129,9, 128,3, 127,1, 126,8, 126,5, 124,9, 124,1, 63,8, 57,1, 50,9, 40,7.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von Polymeren zur Immobilisierung der Verstärkungskomponenten.
2.1 Biologisch verträgliche Polymere (Silikon-enthaltende Polymere und Hydrogelbeschichtungen)
2.1a Silikon-enthaltende Polymere
Synthese eines biologisch verträglichen Silikon/Polyurethan-Pflastermaterials zur subdermalen Implantierung
Ein ofengetrockneter 100 ml-Dreihalsrundkolben, der mit einem mechanischen Rührer und einem Kühler ausgestattet war, wurde unter Stickstoff mit 65 ml wasserfreiem THF, 80 mg Dibutylzinndilaurat (katalytisch), 5,05 g Poly(propylenglykol-b-ethylenglykol-b-propylenglykol)bis(2-aminopropylether) (8,4 mmol, 0,75 Äqu.), 7,01 g Polydimethylsiloxan mit endständigen Aminopropyldimethylgruppen (durchschnittliches MW 2500) (2,8 mmol, 0,25 Äqu.) und 2,94 g 4,4'-Methylenbis(cyclohexylisocyanat) (11,2 mmol, 1 Äqu.), das über einem 4 Å-Molekularsieb getrocknet worden ist, beschickt. Eine anfängliche exotherme Reaktion ließ die Temperatur von 26°C auf 39°C ansteigen. Die Reaktionslösung wurde etwa 15 Stunden unter Rückfluss erhitzt, das Erhitzen wurde eingestellt und die Lösung wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die abgekühlte Lösung, die nun viskoser war, wurde in etwa 900 ml heftig gerührtes DI-Wasser gegossen. Das ausgefällte Polymer wurde gesammelt und erneut in etwa 800 ml DI-Wasser gewaschen. Das gesammelte Polymer wurde bei 80°C unter vermindertem Druck getrocknet.
Ein Massepolymerisationsverfahren zur Polymerbildung wurde mit Isophorondiisocyanat, PEG 600, Diethylenglykol und Polydimethylsiloxan mit endständiger Aminopropylgruppe folgendermaßen durchgeführt.
Isophorondiisocyanat (4,44 g, 20 mmol, 100 Mol-%) wurde über Molekularsieb getrocknet und in einen 100 ml-Rundkolben überführt, der mit einer Stickstoffspülleitung und einem Rückflusskühler ausgestattet war. PEG 600 (2,40 g, 4,0 mmol, 20 Mol-%), Diethylenglykol (1,06 g, 10 mmol, 50 Mol-%) und Polydimethylsiloxan mit endständiger Aminopropylgruppe (15 g, 6,0 mmol, 30 Mol-%, bezogen auf ein durchschnittliches Molekulargewicht von 2500) wurden in den Kolben eingebracht. Es wurde mit einem Heizmantel erhitzt, bis eine Temperatur von 50°C erreicht wurde. Dibutylzinnbis(2-ethylhexanoat) (15 mg) wurde zugesetzt und die Temperatur wurde auf etwa 95°C erhöht. Die Lösung wurde 4 Stunden bei 65°C kontinu ierlich gerührt, wobei das Gemisch während dieser Zeit zunehmend viskos wurde. Das resultierende Polymer wurde in 50 ml heißem THF gelöst und abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurde die Lösung in 5 Liter gerührtes DI-Wasser gegossen. Das ausgefällte Polymer wurde in kleine Stücke gerissen und bei 50°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Ein Lösungspolymerisationsverfahren unter Verwendung von 1,6-Hexamethylendiisocyanat, PEG 200 und Polydimethylsiloxan mit endständiger Aminopropylgruppe wurde folgendermaßen durchgeführt.
Getrocknetes 1,6-Hexamethylendiisocyanat (1,34 g, 8 mmol, 100 Mol-%) wurde einem 100 ml-Dreihalskolben zugesetzt, der 20 ml trockenes THF enthielt. PEG 200 (0,8 g, 4,0 mmol, 50 Mol-%) wurde unter Rühren zugesetzt, worauf Polydimethylsiloxan mit endständiger Aminopropylgruppe (10 g, 4,0 mmol, 50 Mol-%) zugesetzt wurde. Die resultierende Lösung wurde auf 50°C erwärmt und Dibutylzinnbis(2-ethylhexanoat) (etwa 15 mg) wurde zugesetzt. Nach einem anfänglichen Temperaturanstieg auf 83°C wurde das Gemisch erwärmt und 12 Stunden bei 70°C gehalten, wobei das Gemisch während dieser Zeit sehr viskos wurde. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch in 3 Liter heftig gerührtes DI-Wasser gegossen. Das ausgefällte Polymer wurde gesammelt, mit DI-Wasser gewaschen (3 ×), in kleine Stücke gerissen und bei 50°C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Die Tabelle 1 zeigt fünf Formulierungen für repräsentative Polymere, die in biologisch verträglichen Matrizen geeignet sind. Die Polymere wurden mittels Lösungspolymerisation hergestellt.
Tabelle 1 Repräsentative Polymerformulierungen
2.1b Hydrogelbeschichtungen und -polymere
Hydrogele, die zur Verwendung als Biosensorbeschichtungen geeignet sind, wurden durch Kombinieren eines Diisocyanats mit einer äquivalenten molaren Menge eines hydrophilen Diols oder Diamins oder mit einer Kombination aus einem Diol oder Diamin und einem Kettenverlängerungsmittel, so dass die molare Menge der Kombination dem Diisocyanat äquiva lent war, hergestellt. Die Polymerisationen wurden in einer Eintopfreaktion unter Verwendung von THF als Lösungsmittel und einer Spurenmenge eines Katalysators (Tributylzinnethylhexanoat) durchgeführt. Die Reaktionsgemische wurden zum Rückfluss erhitzt und über Nacht (etwa 16 Stunden) bei dieser Temperatur gehalten. Die resultierende Polymerlösung wurde in ein großes Volumen DI-Wasser bei etwa 20°C gegossen und dann filtriert, getrocknet und mit siedendem DI-Wasser gewaschen. Das resultierende Polymer wurde erneut getrocknet und dann in 2-Propanol (als 5 Gew.-%ige Lösung) aufgenommen und zum Einschließen einer Verstärkungskomponente verwendet.
Formulierungen repräsentativer Hydrogelbeschichtungen und Polymere sind in der Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 Repräsentative Polymerformulierungen
2. Einbringen von Verstärkungskomponenten in eine biologisch verträgliche Matrix
2.2a Einbringen von FABA (Fluorescein-markierte Boronsäure) in eine Membran
Die Fluoreszenz von FABA ist pH-empfindlich. Um die Fluoreszenzlöschung aufgrund der Zugabe von Glukose zu messen, wurde ein Verfahren entwickelt, um FABA in eine polymere Membran bei pH 10 einzubringen. Eine 7 Gew.-%ige Lösung eines hydrophilen Polyurethans wurde in 2-Propanol hergestellt. Diese Basislösung wurde mit einer 0,2 mmol-Lösung von FABA, das in pH 10,0 Phosphatpuffer 0,1 M gelöst war, vereinigt. Die Endkonzentration der Membran betrug etwa 5 Gew.-%. Eine Membran wurde durch Ausbreiten von 3 ml der Lösung auf einer Glasplatte und Trocknenlassen der Membran hergestellt. Ein Teil der Membran wurde dann an einem dünnen Glasstück angebracht und in der Diagonalen einer Fluoreszenzküvette angeordnet. Fluoreszenzspektren wurden in einer Pufferlösung mit pH 7,4 aufgenommen. Die 12 zeigt die Kalibrierungskurve, die mit diesem Experiment erzeugt worden ist. Es ist ersichtlich, dass die Fluoreszenzintensität durch die Glukose bei pH 7,4 gelöscht wird.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt die kovalente Bindung bestimmter Komponenten an biologisch verträgliche Polymere.
Einbringen von (6) in ein hydrophiles Polymer mittels einer Urethanverknüpfung
In einen mit einem Kühler und einem Teflonrührstab ausgestatteten 200 ml-Dreihalskolben wurden 60 ml trockenes THF, Polypropylenglykol-Block-Polyethylenglykol-Block-Polypropylenglykolbis(2-aminopropylether) (durchschnittliches Mn etwa 900, Jeffamine 900^®) (6,30 g, 7,0 mmol) und Dibutylzinnbis(2-ethylhexanoat) als Katalysator (0,052 g) eingebracht. Unter Rühren wurden 2,49 g (9,5 mmol) 4,4''-Methylenbis(cyclohexylisocyanat) zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. 9-((5-Hydroxypentyl)aminomethyl)anthracen (0,32 g, 1,0 mmol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 2 Stunden unter Rückfluss gehalten. Der Kolben wurde von der Heizquelle entfernt und der Rührstab wurde durch einen mechanischen Rührer ersetzt. 1,6-Hexamethylendiamin (0,29 g, 2,5 mmol) in 2 ml THF wurde der Lösung unter Rühren zugesetzt und dann wurde 1,5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die viskose Masse wurde 500 ml Wasser zugesetzt, wobei ein bernsteinfarbener Feststoff erzeugt wurde, der auf einem Büchnertrichter luftgetrocknet und über Nacht in einen Vakuumofen eingebracht wurde. Filme des Polymers wurden durch Gießen von Ethanollösungen (1 g Polymer/10 ml Ethanol) auf Glasplatten und Lufttrocknen hergestellt.
Einbringen von (7) in ein hydrophiles Polymer mittels einer Urethanverknüpfung
In einen mit einem Kühler und einem Teflonrührstab ausgestatteten 200 ml-Dreihalskolben wurden 60 ml trockenes THF, Polypropylenglykol-Block-Polyethylenglykol-Block-Polypropylenglykolbis(2-aminopropylether) (durchschnittliches Mn etwa 900, Jeffamine 900^®) (6,30 g, 7,0 mmol) und Dibutylzinnbis(2-ethylhexanoat) als Katalysator (0,052 g) eingebracht. Unter Rühren wurden 2,49 g (9,5 mmol) 4,4''-Methylenbis(cyclohexylisocyanat) zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. 9-((5-Hydroxypentyl)-N-(o-boronobenzyl)amino)methyl)anthracen (0,44 g, 1,0 mmol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 2 Stunden unter Rückfluss-gehalten. Der Kolben wurde von der Heizquelle entfernt und der Rührstab wurde durch einen mechanischen Rührer ersetzt. 1,6-Hexamethylendiamin (0,29 g, 2,5 mmol) in 2 ml THF wurde der Lösung unter Rühren zugesetzt und dann wurde 1,5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die viskose Masse wurde 500 ml Wasser zugesetzt, wobei ein bernsteinfarbener Feststoff erzeugt wurde, der auf einem Büchnertrichter luftgetrocknet und über Nacht in einen Vakuumofen eingebracht wurde. Filme des Polymers wurden durch Gießen von Ethanollösungen (1 g Polymer/10 ml Ethanol) auf Glasplatten und Lufttrocknen hergestellt.
Einbringen von (11) in ein hydrophiles Polymer mittels einer Urethanverknüpfung
In einen mit einem Kühler und einem Teflonrührstab ausgestatteten 200 ml-Dreihalskolben wurden 60 ml trockenes THF, Polypropylenglykol-Block-Polyethylenglykol-Block-Polypropylenglykolbis(2-aminopropylether) (durchschnittliches Mn etwa 900, Jeffamine 900^®) (0,63 g, 0,7 mmol) und Dibutylzinnbis(2-ethylhexanoat) als Katalysator (0,0052 g) eingebracht. Unter Rühren wurden 0,249 g (0,95 mmol) 4,4'-Methylenbis(cyclohexylisocyanat) zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. 10-(Hydroxymethyl)-9-N-(o-boronobenzyl)amino)methyl)anthracen (0,04 g, 0,1 mmol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 2 Stunden unter Rückfluss gehalten. Der Kolben wurde von der Heizquelle entfernt und der Rührstab wurde durch einen mechanischen Rührer ersetzt. 1,6-Hexamethylendiamin (0,029 g, 0,25 mmol) in 2 ml THF wurde der Lösung unter Rühren zugesetzt und dann wurde 1,5 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die viskose Masse wurde 500 ml Wasser zugesetzt, wobei ein bernsteinfarbener Feststoff erzeugt wurde, der auf einem Büchnertrichter luftgetrocknet und über Nacht in einen Vakuumofen eingebracht wurde. Filme des Polymers wurden durch Gießen von Ethanollösungen (1 g Polymer/10 ml Ethanol) auf Glasplatten und Lufttrocknen hergestellt.

Claims

Ein implantierbares Verstärkungssystem, das eine biologisch verträgliche Polymermatrix und Verstärkungskomponenten umfasst, die beim Abfragen durch ein optisches System ein Signal eines polyhydroxylierten Analyten erzeugen, wobei die Verstärkungskomponenten einen Arylboronsäurerest umfassen, der an ein Amin-funktionalisiertes Farbstoffmolekül gebunden ist, und wobei die Verstärkungskomponenten zur Erzeugung des Signals keinen Resonanzenergietransfer erfordern.
Implantierbares Verstärkungssystem nach Anspruch 1, bei dem das Farbstoffmolekül aus der Gruppe bestehend aus Anthracen und Fluorescein ausgewählt ist.
Implantierbares Verstärkungssystem nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Arylboronsäurerest, der an ein Amin-funktionalisiertes Farbstoffmolekül gebunden ist, innerhalb der biologisch verträglichen Matrix eingeschlossen ist.
Implantierbares Verstärkungssystem nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die biologisch verträgliche Polymermatrix ein Polymer umfasst, das aus einem Reaktionsgemisch aus (a) einem Diisocyanat, wobei das Diisocyanat etwa 50 mol-% der Reaktanten in dem Gemisch umfasst, (b) einem hydrophilen Polymer, das eine Verbindung ist, die aus der Gruppe bestehend aus einem hydrophilen Diolpolymer, einem hydrophilen Diaminpolymer und Kombinationen davon ausgewählt ist, und (c) einem Siloxanpolymer, das an den Kettenenden funktionelle Amino-, Hydroxyl- oder Carbonsäuregruppen aufweist, hergestellt wird.
Implantierbares Verstärkungssystem nach Anspruch 4, bei dem die biologisch verträgliche Polymermatrix ferner eine äußere Hydrogelbeschichtung umfasst, wobei das Hydrogel aus einem Reaktionsgemisch aus (a) einem Diisocyanat, wobei das Diisocyanat etwa 50 mol-% der Reaktanten in dem Gemisch umfasst, (b) einem hydrophilen Polymer, das eine Verbindung ist, die aus der Gruppe bestehend aus einem hydrophilen Diolpolymer, einem hydrophilen Diaminpolymer und Kombinationen davon ausgewählt ist, und gegebenenfalls (c) einem Kettenverlängerungsmittel, gebildet wird, wobei das Hydrogel eine Wasseraufnahme von etwa 120 Gew.-% bis etwa 400 Gew.-% aufweist.
Ein Verfahren zur Quantifizierung der Menge eines polyhydroxylierten Analyten in einem Lebewesen, wobei das Verfahren umfasst: (a) Abfragen eines subkutan implantierten Verstärkungssystems nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einer Energiequelle zur Bereitstellung eines angeregten Verstärkungssystems, das eine Energieemission erzeugt, die der Menge des polyhydroxylierten Analyten entspricht, und (b) Erfassen der Emission, so dass dadurch die Menge des polyhydroxylierten Analyten in dem Lebewesen quantifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Energiequelle eine Laserdiode ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei dem der polyhydroxylierte Analyt Glukose ist.
Ein Biosensor zur Messung der Menge eines polyhydroxylierten Analyten in vivo, wobei der Sensor (a) ein implantierbares Verstärkungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und (b) ein optisches System umfasst, das eine optische Quelle und einen Detektor umfasst, der das Signal erfasst, wodurch die in-vivo-Menge des Analyten gemessen wird.
Biosensor nach Anspruch 9, bei dem die optische Quelle eine LED ist.
Biosensor nach Anspruch 9, bei dem das optische System ferner mindestens einen Filter umfasst und die optische Quelle eine LED ist.