DE69632785T2

DE69632785T2 - Verbessertes verfahren zur herstellung magnetisch empfindlicher teilchen

Info

Publication number: DE69632785T2
Application number: DE69632785T
Authority: DE
Inventors: A. Paul LIBERTI; C. Galla RAO; N. Joseph CHIARAPPA; P. Steven PICCOLI
Original assignee: Immunivest Corp
Current assignee: Immunivest Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-04-12
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2016-04-13
Also published as: CA2220169C; EP0842042A4; WO1996040502A1; JPH11506568A; US6120856A; DE69632785D1; US5698271A; CA2220169A1; EP0842042B1; EP0842042A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft stabile Suspensionen von Magnetteilchen und resuspendierbare beschichtete Magnetteilchen, vorzugsweise solche mit biochemischer oder biologischer Aktivität, ist jedoch nicht auf diese eingeschränkt, solche Teilchen umfassende Zusammensetzungen sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Teilchen und Zusammensetzungen.
Biologisch aktive Magnetteilchen finden bei verschiedenen Herstellungs- und Diagnoseverfahren Verwendung. Dazu gehört auch Hochgradient-Magnetabscheidung (HGMS), bei der ein Magnetfeld verwendet wird, um Magnetteilchen aus einer Suspension abzutrennen. In Fällen, bei denen diese Teilchen an biologische Materialien von Interesse (z. B. Zellen, Arzneimittel) gebunden sind, kann das Material von Interesse oder Zielmaterial dadurch von anderen Materialien abgetrennt werden, die nicht an die Magnetteilchen gebunden sind.
Der Begriff "resuspendierbare beschichtete Teilchen" bezieht sich hierin auf einen fein verteilten Feststoff, der eine kolloidale Suspension bildet und aus der Suspension abgetrennt und danach resuspendiert werden kann. "Magnetisch" bezeichnet permanent magnetische oder nicht permanent magnetische Materialien, die auch paramagnetisch oder superparamagnetische sein können, in allen Fällen jedoch in einem Magnetfeld eine Reaktion aufweisen, d. h. magnetisch ansprechend sind. "Aufgespaltene" ("disrupted") Teilchen sind solche, die zu klein sind, um eine komplette magnetische Domäne zu enthalten, oder, alternativ dazu, deren Brownsche Energie deren magnetisches Moment übersteigt. Im Allgemeinen weisen diese Teilchen eine Größe von weniger als 0,03 μm auf.
BESCHREIBUNG VERWANDTER GEBIETE
Nach dem Stand der Technik wurden zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Magnetteilchen oder organisch-magnetischen Materialien vorgeschlagen. Solche Teil chen werden im Allgemeinen in drei Gruppen eingeteilt: große, kleine und Mikroagglomerate von kleinen Teilchen. Große Magnetteilchen, mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm, reagieren auf schwache Magnetfelder und Magnetfeldgradienten. Aufgrund ihrer Größe tendieren sie dazu, sich rasch aus einer Lösung abzusetzen, und weisen außerdem eine begeschränkte Oberfläche pro Gewichtseinheit auf. Große Teilchen neigen außerdem zu Aggregation, nachdem sie einem Magnetfeld ausgesetzt worden sind, weil sie permanent magnetisiert werden können. Kleine Teilchen, die Magnetkerne mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 0,03 μm aufweisen, bleiben aufgrund ihrer Brownschen Energie in Lösung und setzen sich somit nicht spontan ab. Mikroagglomerate von solchen kleinen Magnetteilchen wurden mithilfe verschiedener Verfahren hergestellt. Je nach Größe der Mikroagglomerate können Materialien hergestellt werden, die eine angemessene Zeit lang in Lösung bleiben. Außerdem unterscheiden sich die magnetischen Eigenschaften von kleinen Teilchen und Mikroagglomeraten von kleinen Magnetteilchen bedeutend von jenen der größeren, permanent magnetisierbaren Teilchen. Kleine Magnetteilchen, die entweder aus einzelnen Kristallen ferromagnetischer Materialien, wie beispielsweise Eisenoxiden, oder Agglomeraten von solchen Kristallen bestehen, werden "superparamagnetisch", wenn die Kristallgröße der ferromagnetischen Materialien unter etwa 0,03 μm liegt. Anders als ferromagnetische Kristalle weisen superparamagnetische Kristalle nur magnetisches Verhalten auf, wenn sie in einem Magnetfeldgradienten sind, und werden nicht permanent magnetisiert. Solche Materialien werden als dispergierbare magnetische Metalloxidteilchen und als magnetisch ansprechende Teilchen bezeichnet.
Ein möglicher Weg, ein Magnetteilchen zu erhalten, das einen Biorezeptor enthält, ist in den US-Patenten Nr. 3.970.518 und 4.018.886 von Giaever offenbart, welche die physikalische Aufbringung solcher Materialien auf die Magnetteilchen durch Adsorption beschreiben. Die Aufbringung von Rinderserumalbumin auf Nickelteilchen mit einem Durchmesser von 1 μm wird als Beispiel angeführt.
Das US-Patent Nr. 4.230.685 von Senyei et al. beschäftigt sich mit der Lehre des US-Patents Nr. 3.970.518 und hält fest, dass es "in der Literatur keine Bestätigung dafür gibt, dass unbeschichtete Magnetteilchen effektiv zu einer Bindung an Antikörper" – und somit auch an andere Biorezeptoren – gebracht werden können. Das US-Patent Nr. 4.554.088 von Whitehead et al. hält fest, dass Antikörper, die an Eisenoxide adsorbiert sind, durch eine 24-stündige Inkubation bei 50°C in 1 M Natriumchlorid im Wesentlichen losgelöst werden können und dass die Menge an adsorbiertem Material gering ist.
In Bezug auf eine hierin beschriebene Art superparamagnetischer Teilchen, nämlich kolloidale Teilchen, könnte das in den US-Patenten Nr. 3.970.518 und 4.018.886 von Giaever vorgeschlagene Gewinnungsverfahren nicht leicht in die Praxis umgesetzt werden, da die zum Sammeln solcher kolloidaler Teilchen und zum Wegspülen nichtadsorbierter Materialien erforderliche Feldstärke enorm wäre. Außerdem ist ein Feldgradient erforderlich, der mit dem dort beschriebenen Gerät nicht erreicht werden kann. In Hinblick auf eine Herstellung unter Verwendung von Hochgradient-Magnetabscheidung (HGMS) könnte das Konzept von Giaever funktionieren, wenn effektive Mittel zum Adsorbieren und Halten der Antikörper oder Biorezeptoren auf solchen Teilchen vorhanden sind.
Angesichts des anscheinenden Unvermögens, durch Biorezeptoradsorption funktionell akzeptable Magnetteilchen herzustellen, wurde eine Reihe von anderen Ansätzen verfolgt. Dazu gehört das US-Patent Nr. 4.230.685 von Senyei et al., das die Herstellung von Mikrokügelchen offenbart, die Magnetit, Albumin und Protein A enthalten. Das von Senyei vorgeschlagene Herstellungsverfahren umfasst eine Emulsionspolymerisation der oben genannten Bestandteile. Das US-Patent Nr. 4.554.088 von Whitehead et al. beschreibt die Silanisierung von magnetischen Metalloxiden, die dann kovalent an bioaktive Moleküle gebunden werden können. Beide der letztgenannten Ansätze arbeiten mit agglomerierten superparamagnetischen Teilchen; somit werden die agglomerierten Materialien zur Gruppe der magnetisch ansprechenden Materialien gezählt. Weitere Patente, die eventuell von Interesse sein könn ten, umfassen das US-Patent Nr. 4.152.210 von Robinson et al.; 4.335.094 von Mosbach; 4.070.246 von Kennedy et al.; und 4.454.234 von Czerlinski. Obwohl diese Patente die Herstellung oder Verwendung von magnetischen biologischen Teilchen offenbaren, wird keines als der vorliegenden Erfindung ähnlich betrachtet.
Das US-Patent Nr. 4.452.773 von Molday offenbart "kolloidale" Eisenoxidteilchen, die mit nichtionischem Polysaccharid beschichtet werden, indem Magnetit in 25%igen (Gew./Gew.) Polysaccharidlösungen gebildet wird. Molday beschreibt außerdem die kovalente Bindung von bioaktiven Molekülen an so gebildete Teilchen mithilfe allgemein bekannter chemischer Bindeverfahren. Das US-Patent Nr. 4.795.698 von Owen et al., das durch Verweis hierin aufgenommen ist, beschreibt die Herstellung von Metalloxidteilchen mit kolloidaler Größe, die auf eine wahrscheinlich im Wesentlichen kovalente Art durch Polymere oder Proteine beschichtet werden, die eine beträchtliche Anzahl an ungepaarten Elektronen aufweisen. Bioaktive Moleküle, wie beispielsweise Antikörper oder Enzyme, behalten beim Verfahren gemäß Owen et al., das (1) die Kopräzipitation von Übergangselementoxiden und einem Polymer oder Protein zu 0,1 bis 1 mg/ml durch Titration mit einer Base auf einen leicht alkalischen pH, (2) das darauf folgende Waschen des Kopräzipitats und (3) die Resuspension des Kopräzipitats in geeigneten Puffern gefolgt von einer leichten Beschallung, die in kolloidalen magnetisch ansprechenden Teilchen resultiert, umfasst, ihre biologische Aktivität bei. Bei diesem Verfahren wird fast das gesamte Polymer oder Protein gefällt. Als die Herstellung von dextranbeschichteten Teilchen gemäß den Verfahrensbedingungen nach Owen et al. versucht wurde, konnten keine resuspendierbaren kolloidalen Teilchen erhalten werden. Dieses Ergebnis zeigt zusammen mit der Tatsache, dass Owen et al. eine Kopräzipitation mit Polymeren mit einer beträchtlichen Anzahl an ungepaarten Elektronen verlangt (im Gegensatz zu Dextran und den anderen nichtreaktiven Polysacchariden, die Molday beschreibt), die anscheinend direkt mit Übergangsmetallen wechselwirken, dass die Verfahren gemäß Molday und Owen et al. sich wesentlich unterscheiden. Außerdem gilt anzumerken, dass das Verfahren gemäß Owen et al. erfordert, dass das Protein oder Polymer in Wasser oder einem Puffer mit geringer Ionenstärke vorliegen.
Angesichts der anscheinenden Abwesenheit von Wechselwirkung von Eisen(III)-Ionen und Eisen(II)-Ionen mit Dextran und der Beschaffenheit des Molday-Dextranteilchens ist es aufschlussreich, das hierin dargelegte Verfahren zu untersuchen. Die kolloidalen Teilchen von Molday werden durch Bildung von Magnetit aus Eisen(III)- und Eisen(II)-Chloriden mit NH₄OH in Gegenwart von 25%igem (Gew./Gew.) wässrigem Dextran T-20 (Pharmacia) oder anderen Polysacchariden mit ähnlicher Konzentration erhalten. Aggregate, die während des Verfahrens entstehen, werden später durch drei Zentrifugationszyklen bei geringer G-Kraft entfernt. Kolloidales Dextranmagnetit im Überstand wird gewonnen, worauf eine Gelfiltration folgt, die das nichtumgesetzte Dextran von den kolloidalen Teilchen trennt, die im Hohlraumvolumen auftreten. Nachdem die Teilchen gebildet worden sind, ist eine wesentliche Menge freies Dextran vorhanden. Obwohl der Mechanismus zur kolloidalen Dextranbildung nicht erläutert wird, scheint die Annahme sinnvoll, dass Dextran bei dem Verfahren eine physikalische Rolle spielt oder als "Barriere" dient. Diese Annahme basiert darauf, dass 25%ige (Gew./Gew.) Dextranlösungen extrem viskos sind und aufgrund der Wechselwirkung ihrer zahlreichen Hydroxygruppen mit Wasser umfassende Wasserstoffbrückenbindung aufweisen. Diese Faktoren führen zu einem System, das eine Diffusion einschränkt. Dies würde eine Wechselwirkung zwischen Eisen(III)- und Eisen(II)-Ionen mit einer Base ermöglichen, um lokale Kristallkernbildungsstellen zu schaffen, deren Wachstum mit der Fähigkeit von unbeteiligten Ionen zusammenhängt, am Prozess teilzunehmen. Die Gegenwart von Dextran könnte so die Ionenteilnahme einschränken, was zur Bildung von kleinen Magnetitkristallen (weniger als 300 Å) führt, die dann zur Adsorption von Dextranmolekülen an ihre Oberflächen fähig sind. Bei diesem Szenario hat Dextran also mehrere Aufgaben in dem Verfahren.
Ein alternativer Mechanismus zur Bildung des Molday-Dextranmagnetits hängt mit einer grundlegenden Eigenschaft von Magnetit zusammen. Aus den elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Whitehead et al. und aus der Beschreibung von Senyei et al. lässt sich ableiten, dass Magnetit, der durch die herkömmliche Basenfällung von Eisenchloriden hergestellt wird, aus einem stabilen Kristall mit einer Größe von etwa 300 Å oder weniger besteht. Da in der Literatur keine Berichte vorhanden sind, die darauf hinweisen, dass Magnetit zu einer stabilen kolloidalen Dispersion verarbeitet werden kann, scheint es, dass diese Kristalle eine starke Neigung aufweisen, mithilfe gegenseitiger molekularer Anziehungskräfte zu aggregieren. Auf der anderen Seite scheint Molday durch die Bildung von Kristallen "in situ" und in "Kammern", die durch die hohe Konzentration von Dextran, die von Molday verwendet wird, gebildet werden, sowie durch die Tatsache, dass die "Wände" dieser einzelnen Kammern auf solche Kristalle zusammenfallen und diese beschichten können, zur Herstellung von kolloidal stabilen Magnetteilchen fähig gewesen zu sein. Angesichts des beträchtlichen Unterschieds zwischen den Oberflächen, die durch solche einzelnen Magnetitkristalle bereitgestellt werden, und jenen der Materialien gemäß Giaever scheint Molday außerdem durch Zufall das Adsorptionsproblem von bestimmten Polysacchariden gelöst zu haben.
Eine kolloidale Dispersion von Magnetteilchen in Raketentreibstoff ist im US-Patent Nr. 3.215.572 von Papell offenbart. Die Dispersion soll Magnetteilchen, wie beispielsweise Magnetit (Fe₃O₄) mit einem Durchmesser von 0,25 μm und weniger, vorzugsweise einem Durchmesser von weniger als 0,10 μm, enthalten. Die Dispersion wird durch Mahlen einer Suspension von größeren Magnetteilchen im Treibmittel mithilfe eines Mahlhilfsmittels, das eine "Agglomeration oder ein Verschweißen der winzigen Teilchen beim Mahlen" (Spalte 2, Zeilen 33–34) verhindert, in einer Kugelmühle hergestellt. Die Kugelmühle umfasst Metallkugeln, um die Mahlwirkung zu erzeugen. Das Mahlhilfsmittel, das im Allgemeinen in Mengen im Bereich von etwa 2%, gegebenenfalls auch 10%, enthalten ist, umfasst typischerweise Ölsäure; weiters können "... andere Mahlhilfsmittel, wie beispielsweise Sterinsäure und Cetylalkohol, bei der Herstellung eines magnetischen Treibmittels und andere langkettige Kohlenwasserstoffe mit ähnlich hoher Oberflächenspannung, wie beispielsweise Benzol, Ethan, Hydrazin und Benzin, als Teilchenträger und Hauptbestandteil des magnetischen Treibmittels verwendet werden" (Spalte 4, Zeilen 5–6).
Die US-Anmeldung mit der Seriennummer 397.106 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von polymer/proteinbeschichteten Magnetteilchen, welches das Zerstören von vorgebildeten Kristallagglomeraten (mit Magnetit verwandte Übergangselementoxide) in Gegenwart eines Beschichtungsmaterials umfasst, um Materialien herzustellen, die im Größenbereich von 25 nm bis Mikrometergröße liegen. Die Größe des resultierenden Produkts hängt vom Grad und von den Bedingungen des Zerstörens und dem Verhältnis zwischen Beschichtungsmaterial und Kristallagglomeraten ab. Eine Beschallung unter verschiedenen Bedingungen ist als Verfahren der Wahl offenbart. Für polymerbeschichtete Materialien bringt dieses Verfahren einen bedeutenden Vorteil gegenüber solchen mit sich, bei denen Metalloxide in situ in Gegenwart eines Beschichtungsmaterials gebildet werden, wie es bei Molday oder Owen beschrieben ist. Durch die Trennung des Verfahrens zur Herstellung von Übergangselementoxidkristallen vom Beschichtungsschritt wird im vorgenannten Verfahren eine Störung des Beschichtungsmaterials verhindert. Solch eine Störung kann zu verschiedenen Nachteilen führen, wie beispielsweise heterogenes Kristallwachstum, Probleme bei der Steuerung des Oxidverfahrens und Fehlstellen in Kristallen, die alle das Endprodukt beeinträchtigen können.
Die US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/231.379, die eine Continuation-in-Part der US-Anmeldung mit der Seriennummer 397.106 ist, beschäftigt sich mit einer weiteren Modifikation, die in vielen Aspekten eine Verbesserung des oben beschriebenen Verfahrens darstellt, worin das Zerstören von Kristallagglomeraten in Abwesenheit eines Beschichtungsmaterials durchgeführt wird. Diese Modifikation ist vorteilhaft, wenn ein zu beschichtendes Material durch den Zerstörungsvorgang negativ beeinträchtigt wird. Ein weiterer Vorteil des Trennens des Zerstörens vom Beschichtungsschritt besteht darin, dass die Gegenwart von Beschichtungsmaterial durch Verbindung zweier Kristallagglomerate die Zerstörung verhindern und somit den Zerstörungsvorgang stören kann.
Trotz der Einfachheit der in den letztgenannten Patentanmeldungen beschriebenen Verfahren und der Nützlichkeit des resultierenden Materials weisen Materialien, die durch diese Verfahren erhalten werden, in bestimmten Aspekten Einschränkungen auf. Eine Einschränkung dieses Materials ist ihr Stabilitätsverlust in Puffern mit mäßiger Ionenstärke (0,01 M), wo sie agglomerieren und sich gegebenenfalls in der Lösung absetzen. Somit sollte beim Herstellungsverfahren eine Variation der Ionenstärke, die zu Agglomeration führt, vermieden werden. Darüber hinaus können solche Materialien im Allgemeinen nur nach magnetischem Sammeln resuspendiert werden, wenn sie in Puffern mit geringer Ionenstärke vorliegen. Auch dann kann wiederholtes magnetisches Sammeln und Resuspendieren zu Agglomeraten führen. Diese Eigenschaft kann jedoch auch von Vorteil sein, wie beispielsweise bei der Durchführung von Immuntests in Seren oder Puffern mit einer Ionenstärke im Bereich von 0,15 M. Da diese Medien während der Inkubationsperiode des Tests zu einiger Agglomeration führen und diese Agglomerate geringere magnetische Gradienten erfordern, um aus der Lösung herausgezogen zu werden, kann diese Eigenschaft, die in manchen Fällen unerwünscht ist, tatsächlich einen Vorteil darstellen und die Verwendung von kleineren Materialien, als dies in Abwesenheit des Phänomens möglich wäre, oder alternativ dazu die Verwendung von Trennvorrichtungen mit geringerem magnetischem Gradienten ermöglichen.
Auf der anderen Seite gibt es viele Anwendungsmöglichkeiten, bei denen Größenintegrität des magnetischen Kolloids sehr wichtig ist und solche Agglomerationen äußerst unerwünscht sind. Ein Beispiel wäre die Verwendung dieser Materialien in Labor- oder Bioprocessing-Isolationen von monoklonalen Antikörpern (MAbs) von Ascites-Fluids oder von einer Kultur. Typischerweise weisen solche Medien eine physiologische Ionenstärke (0,15 M) auf, und wenn beispielsweise Protein A zur Bindung von MAbs und darauf folgenden Desorption von MAbs verwendet wird, werden Puffer mit solcher oder bedeutend höherer Ionenstärke verwendet. Es gibt auch Fälle von Immuntests, bei denen keine Agglomeration wünschenswert ist, wie beispielsweise Zweiphaseninkubationen. Um beispielsweise einen Test für chronische Hepatitis durchzuführen, umfasst ein typischer Ansatz die Inkubation von Ferrofluid, das spezifisch für menschliches IgM ist, mit Patientenserum, um das IgM in der Probe zu sammeln. Das Sammeln könnte durchgeführt werden, indem das gesammelte Mate rial magnetisch abgetrennt wird, wonach nichtspezifische Proteine ausgewaschen werden. Als Nächstes könnte das Ferrofluid, das Patienten-IgM enthält, mit überschüssigem markiertem Hepatitisantigen inkubiert, erneut abgeschieden und gewaschen werden und die Markierung mithilfe geeigneter Mittel detektiert werden. Die doppelte Inkubation dieses Verfahrens und die beiden Abscheidungen erfordern ein Material, das sowohl gegenüber mäßiger Ionenstärke als auch gegenüber mehrfacher magnetischer Abscheidungen und Resuspensionen stabil ist.
Im Laufe umfassender Untersuchungen und einer Weiterentwicklung der obigen Verfahren führten verschiedenen Beobachtungen zu der Hypothese, dass das Problem der kolloidalen Instabilität bei hoher Ionenstärke auf inkomplettes Kristallagglomeratdeckvermögen der verwendeten Beschichtungspolymere/proteine zurückzuführen ist. Obwohl es sehr schwierig ist, die Oberfläche solcher Agglomerate und die Menge an Beschichtungsmaterial, die als Monoschicht darauf adsorbiert werden soll, genau zu berechnen, lassen Berechnungen vermuten, dass inkomplettes Deckvermögen möglich ist. Umfassende Erfahrungen mit dispergierten Magnetitkristallagglomeraten zeigen, dass die Oberflächenladung entscheidend dabei ist, um die Agglomerate dispergiert zu halten. Das zeigt sich in einem einfachen Experiment, wie beispielsweise durch Beschallung von Magnetit in einem Phosphatpuffer mit geringer Ionenstärke (10–20 mM). Solch ein Verfahren führt zu einer vorübergehend stabilen Dispersion. Wenn solch ein Material im dispergierten Zustand magnetisch gesammelt wird, kann es nicht resuspendiert werden. Die Dispersion kann auch rasch agglomeriert werden, indem einfach die Ionenstärke mit einfachen Salzen erhöht wird. Weitere Ergebnisse, die vermuten lassen, dass dieses Verfahren keine komplette Beschichtung ergibt, sind: (1) mit einem anionischen Polymer, Dextran oder Rinderserumalbumin (BSA) beschichtete Materialien haften nicht spezifisch an Säugetierzellen, und Bindung kann durch anionische Polymere, die mit Zelloberflächensialinsäure um "blanke Stellen" konkurrieren können, die aufgrund von Eisenatomen auf der Kristalloberfläche eine positive Ladung aufweisen würden, teilweise abgeschwächt werden (siehe US-Patentanmeldung Nr. 07/976.476); (2) ein wesentlicher Teil eines Materials, das unter Verwendung von sehr feiner Stahlwolle (Gradienten über 150 kGauss/cm) durch HGMS gesammelt wird, aggregiert bei diesem Verfahren; und (3) die Größe der Materialien wird durch die Ionenstärke beeinflusst, und bei Ionenstärken von nur 0,02 M kann Agglomeration beobachtet werden.
Aus mehreren Gründen wäre es wünschenswert, gut beschichtetes partikuläres Basismaterial zu haben. Durch Beschichten eines größeren Teils eines Materials mit einem hydrophilen Überzug sollte Stabilität in Medien mit hoher Ionenstärke erreicht werden können, die Bedeckung von "blanken Stellen" sollte nichtspezifische Bindung an Zelloberflächen verringern, und besser beschichtete Materialien sollten im Allgemeinen die Bindung von größeren Mengen an Biorezeptoren ermöglichen, was höhere Bioaktivität ergibt. Es gibt auch Verfahrensvorteile, die entstehen sollten, da besser beschichtete Materialien ohne Kristall-Kristall-Wechselwirkung, die zu Aggregation führt, magnetisch gesammelt und resuspendiert werden können. Dass bei solchen Verfahren keine durch hohe Ionenstärke ausgelöste Aggregation zu befürchten ist, wäre bei verschiedenen Herstellungsschritten, wie beispielsweise bei der Reinigung, ebenfalls ein bedeutender Vorteil. Darüber hinaus ist es einfacher, magnetische Materialien zu verwenden, um ungebundenes Reagens in einem bestimmten Schritt zu entfernen, als Säulenchromatographie einzusetzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft teilweise neue Verfahren zur einfacheren Herstellung von magnetisch ansprechenden superparamagnetischen Teilchen. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, durch das magnetisch ansprechende Metalloxide effektiv beschichtet werden können, indem beim Beschichtungsverfahren Mittel zum Zerstören von Kristallagglomeraten eingesetzt werden, sodass die Beschichtung stattfinden kann, während die resultierende Kristalle sich im aufgespaltenen Zustand befinden. Viele verschiedene Materialien (einschließlich Dextran, Proteine, synthetische Polypeptide, Polymere, Copolymere, Detergenzien und Kombinationen davon) können auf solche Kristalle aufgetragen werden, was zu kolloidalen, magnetisch ansprechenden Teilchen führt. Nicht nur ein kolloidales Produkt kann er halten werden, in den meisten Fällen ist es auch möglich, durch Einschränkung der Menge an Beschichtungsmaterial stabile Mikroagglomerate zu erhalten, die adsorbiertes Material extrem effektiv halten und mithilfe einfacher Labormagnete aus der Lösung entfernt werden können.
In einer alternativen Ausführungsform betrifft diese Erfindung die Herstellung von magnetisch ansprechenden superparamagnetischen Teilchen, die in Systemen mit hoher Ionenstärke, z. B. 1,0 bis 2,0 M NaCl, kolloidal stabil sind und wiederholt Hochgradient-Magnetabscheidungen und Resuspensionen ausgesetzt werden können, ohne dass ihre Größe zunimmt, wie durch das Auftreten von Trübungen oder Teilchengrößenzunahme belegt würde. Solche Materialien bieten Verfahrensvorteile bei der Herstellung, was die Herstellungskosten bedeutend senkt. Diese Vorteile umfassen die Möglichkeit, die resultierenden Teilchen eher durch Magnetscheidung wiederholt von Reagenzien abzuscheiden als Säulenchromatographie einzusetzen, und eine bedeutend größere Freiheit bei der Auswahl von Puffern (Arten und Pufferstärken), die bei diesen Verfahren verwendet werden können, sowie bei chemischen Kopplungsvorgängen oder Modifikations-/Derivatisierungsreaktionen. Diese Materialien können außerdem viel leichter sterilfiltriert werden (bei Materialien unter 200 nm), was die Produktmenge betrifft, die durch Filter hindurchläuft. Außerdem sind sie mit einer größeren Anzahl an Filtermaterialien verträglich. Diese Materialien weisen darüber hinaus bedeutend geringere nichtspezifische Bindung auf, vor allem an Säugetierzellen.
Diese neue Klasse von Materialien bringt auch bedeutende Anwendungsvorteile mit sich, wie beispielsweise die Möglichkeit, wiederholt abgeschieden und resuspendiert zu werden, wie dies häufig bei Mehrfachinkubationstests verlangt wird. Aufgrund ihres erhöhten Gehalts an Beschichtungsmaterial weisen sie eine höhere Möglichkeit auf, eine größere Menge Bioliganden an sie zu binden. Bei Anwendungen, bei denen die Gegenwart dieser Materialien ein entstehendes Signal quencht oder adsorbiert, wie beispielsweise bei chemilumineszenten Immuntests oder Nucleinsäuredetektion, ermöglicht die höhere biologische Aktivität die Verwendung von weniger Material, was wiederum zu größerer Signalleistung führt. Diese höhere biologische Aktivität sowie die kolloidale Stabilität unter verschiedensten Bedingungen, die typischerweise in biologischen und Bioprocessing-Verfahren zu beobachten sind und wahrscheinlich auch bei verschiedenen anderen Herstellungsanwendungen oder -verfahren auftreten, verleiht diesen Materialien bedeutende Vorteile gegenüber magnetischer Polymerteilchen, die durch bisher verfügbare Verfahren hergestellt wurden. Diese Materialien stellen beim Beschichten von Kristallclustern verschiedener Übergangselementoxide, vor allem Magnetite, tatsächlich einen bedeutenden Vorteil gegenüber dem Stand der Technik dar.
Die Magnetteilchen der Erfindung werden durch ein direktes Beschichtungsverfahren auf einem vorübergehend stabilen partikulären magnetischen Substrat erhalten, das nachstehend genauer erläutert ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens wird ein partikuläres magnetisches Ausgangsmaterial in mehrere kleinere Teilchen, die aggregieren können, gespalten, wodurch ein blankes oder unbeschichtetes partikuläres magnetisches Substrat bereitgestellt wird. Das so erhaltene partikuläre magnetische Substrat, das in einem geeigneten flüssigen Medium suspendiert wurde, wird dann mit einem geeigneten Beschichtungsmaterial kontaktiert, um ein Gemisch zu bilden, bevor das partikuläre magnetische Substrat nennenswerte Aggregation erfährt, und zwar für einen Zeitraum, der ausreicht, damit das Beschichtungsmaterial an Substratteilchen haftet, wodurch die resuspendierbaren, beschichteten Magnetteilchen gebildet werden. In einer alternativen Ausführungsform kann das Gemisch auch für einen Zeitraum, der ausreicht, damit das Substrat leichter an den Magnetteilchen haftet, erhitzt werden.
Somit ist es nicht entscheidend, das partikuläre magnetische Ausgangsmaterial in Gegenwart des Beschichtungsmaterials aufzuteilen, um nützliche kolloidale Magnetteilchen zu erhalten, die beispielsweise mit einem biologisch aktiven biofunktionellen Liganden beschichtet sind. Besser gesagt ermöglicht dieses Verfahren die Beschichtung eines vorgeformten, vorübergehend stabilen partikulären magnetischen Substrats. Die Dauer der Stabilität der Substratteilchen kann leicht mithilfe herkömmli cher Versuche auf folgende Weise bestimmt werden. Dieser Ansatz bringt eine Reihe beträchtlicher Vorteile mit sich, wozu gehört, dass nachteilige Auswirkungen des gewählten Zerstörungsverfahrens auf das Beschichtungsmaterial vermieden werden. Außerdem eliminiert der sequentielle Zusatz von Beschichtungsmaterialien bestimmte Einschränkungen des Verfahrens, die der Ausführungsform innewohnend sind, bei der das partikuläre Ausgangsmaterial in Gegenwart des Beschichtungsmaterials aufgeteilt wird. Das kann von Bedeutung sein, wenn das primäre Beschichtungsmaterial in einem Gemisch mit anderen Substanzen mit größerer Affinität zum magnetischen partikulären Substrat vorhanden ist. Da das schrittweise Zusetzen größere Kontrolle über die verwendete Menge an Beschichtungsmaterial erfordert, wird eine Bearbeitung des Endprodukts viel leichter.
Die Auftragung zusätzlicher Beschichtungsmaterialien, z. B. einer Teilchendispersionshilfe, auf die Teilchen, welche das primäre Beschichtungsmaterial tragen, liegt ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung.
Ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur selektiven Bindung verschiedener Polyelektrolyte, z. B. DNA oder RNA, an die hierin beschriebenen resuspendierbaren, kolloidalen magnetischen Teilchen, die vorteilhafterweise bei der Durchführung einer Reihe von bioanalytischen Verfahren, wie beispielsweise Polymerasekettenreaktionen (PCR) oder Nucleinsäuresequenzierungen, verwendet werden können. Dieses Verfahren umfasst die Bereitstellung chemisch behandelter, resuspendierbarer, kolloidaler Teilchen, die eine Oberflächenladung aufweisen, dessen Polarität jener der Ladung des Polyelektrolyten entgegengesetzt ist, wobei die Oberflächenladung der chemisch behandelten, resuspendierbaren, kolloidalen Teilchen gleich ist wie eine vor der chemischen Behandlung existierende Ladung auf den kolloidalen Teilchen oder sich von dieser unterscheidet, sowie das Kontaktieren einer Probe, die den Polyelektrolyten umfasst, mit den chemisch behandelten, resuspendierbaren kolloidalen Teilchen, wodurch die kolloidalen Teilchen direkt an den Polyelektrolyten binden und eine agglomerierte Masse entsteht, die im Wesentlichen aus dem Polyelektrolyten und den Teilchen besteht.
Sobald der Polyelektrolyt auf den chemisch behandelten, resuspendierbaren magnetischen Teilchen eingefangen ist, kann er durch Magnetabscheidung leicht aus der Testprobe entfernt werden, wobei beispielsweise das Gerät und die Verfahren gemäß dem US-Patent 5.186.827 oder US-Patent 5.200.084 verwendet werden, die gewöhnlich mit der vorliegenden Erfindung übertragen werden. Die gesamten Offenbarungen der beiden letztgenannten Patente sind durch Verweis in die vorliegende Beschreibung aufgenommen, als ob sie hierin vollständig ausgeführt seien. Auch ein im Wesentlichen reiner Polyelektrolyt kann durch geeignete Manipulation der Ionenstärke oder des pH gewonnen werden. Ein geeignetes Gewinnungsverfahren ist nachstehend angeführt. Auf diese Art kann die Extraktion von Nucleinsäuren aus komplexen Gemischen, wie beispielsweise Zelllysaten, vereinfacht werden.
Die chemisch behandelten, resuspendierbaren kolloidalen Magnetteilchen, die bei der Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens zur selektiven Bindung von Polyelektrolyten verwendet wurden, sind in der Hinsicht einzigartig, dass die Zielerkennungs- und Trennfähigkeiten in den einzelnen behandelten Teilchen kombiniert sind. D. h. Affinität zwischen dem Polyelektrolyten und der chemisch behandelten Oberfläche der kolloidalen Magnetteilchen ist im Wesentlichen auf physikalische Wechselwirkung zurückzuführen. Keine zusätzlichen Affinitätsreagenzien oder Verfahren, um sie auf die Magnetteilchen aufzutragen, sind erforderlich. Darüber hinaus wird durch die geringe Größe der Magnetteilchen verbesserte Reaktionskinetik bereitgestellt und ermöglicht die Bindung vieler Teilchen an das Zielmolekül, wodurch die magnetische Anziehungskraft des Zielmoleküls erhöht wird.
Das bevorzugte Mittel zum Aufspalten des ursprünglichen Magnetteilchenausgangsmaterials in der Suspension ist Beschallung, aber auch andere mechanische oder chemische Mittel können verwendet werden. Diese anderen "Mittel" umfassen beispielsweise Erhitzen, andere Formen der Anregung von Teilchen, wie z. B. Bestrahlung, und chemische Mittel, wie z. B. pH-Modifikation, oder Kombinationen dieser Verfahren. Insbesondere kann eine Kombination aus pH-Modifikation und Beschallung verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden säurebehandelte, resuspendierbare, kolloidale Teilchen mit einer maximalen Teilchengröße unter 0,2 μm bereitgestellt, die direkt an negativ geladene Polyelektrolyten binden und eine agglomerierte Masse bilden, die im Wesentlichen aus dem negativ geladenen Polyelektrolyten und den säurebehandelten kolloidalen Teilchen besteht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden basenbehandelte, resuspendierbare, kolloidale Teilchen mit einer maximalen Teilchengröße unter 0,2 μm bereitgestellt, die direkt an positiv geladene Polyelektrolyten binden und eine agglomerierte Masse bilden, die im Wesentlichen aus dem positiv geladenen Polyelektrolyten und den basenbehandelten kolloidalen Teilchen besteht.
Das hierin offenbarte Verfahren umfasst die überraschende Entdeckung, dass das Auftragen eines Polymers oder Proteins auf solche Kristalle durch Wärme deutlich beeinflusst und verbessert wird. Genauer gesagt wird, wenn die Beschichtungsreaktion bei Temperaturen durchgeführt wird, die deutlich über den Temperaturen liegen, bei denen Verfahren mit Proteinen normalerweise durchgeführt werden, nicht nur beträchtlich mehr Beschichtung erreicht, sondern auch ein Produkt erhalten, das bei hoher Ionenstärke kolloidal stabil ist. Entgegen der Annahme, dass Proteinbeschichtungsreaktionen am besten in Kälte oder bei Temperaturen von nicht mehr als 37°C durchgeführt werden, zeigte sich, dass, wenn Magnetitaufschlämmungen mit einem Protein, wie z. B. BSA, vermischt, auf Temperaturen über 60°C, typischerweise 75 bis 80°C, erhitzt und beschallt werden, ein Produkt erhalten wird, das salzstabil ist und wiederholt abgeschieden und resuspendiert werden kann. Weiters wurde herausgefunden, dass, wenn die Beschallung solcher Gemische in Kälte (0 bis 5°C) durchgeführt wird, wie beispielsweise in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 397.106 beschrieben ist, und das Gemisch danach auf 75°C erhitzt wird, während immer noch überschüssiges Beschichtungsmaterial vorhanden ist, das erhaltene Produkt dieselben Eigenschaften aufweist wie oben beschrieben. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Überführung in ein salzstabiles Material nicht mit der Beschallungsbehandlung, sondern ganz klar nur mit der Hochtemperaturbeschichtungsreaktion zusammenhängt. Um zu untersuchen, ob die Beschichtungsreaktion in zwei Schritten durchgeführt werden kann, wie in der US-Anmeldung Nr. 08/231.379 offenbart ist, worin Magnetitaufschlämmungen zuerst beschallt werden, um eine Dispersion von Kristallagglomeraten zu ergeben – Einzelkristalle zu Agglomeraten mit einer Größe von bis zu 200 nm, je nach Zerstörungsgrad –, und dann in einem unabhängigen Schritt beschichtet werden, wurde Magnetit durch Beschallung bei 5°C oder 75°C dispergiert und danach bei 75°C mit einem Protein/Polymer beschichtet. In beiden Fällen wird ein Produkt erhalten, das bei hohen Konzentrationen von einfachen Salzen, bei 2 M NaCl und bei wiederholter Magnetabscheidung und Redispersion stabil ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die der Erfindung zugrunde liegende Hypothese lautet, dass magnetische Materialien, oder allgemeiner gesagt Übergangselementoxide, in Teilchenform dazu neigen, beträchtliche Oberflächenpolarität aufzuweisen, die durch Agglomeration von Kristallen solcher Materialien minimiert wird. Wenn diese Kristallagglomerate gespalten oder zerstört werden, werden sie instabil und bilden im Laufe der Zeit erneut Kristallagglomerate. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die entstehenden (und wahrscheinlich geladenen) Oberflächen dieser Subteilchen durch das Beschichtungsmaterial stabilisiert, das auf diesen Oberflächen abgeschieden wird, nachdem die ursprünglichen Teilchen aufgespalten worden sind, jedoch bevor sich Kristallagglomerate zu bilden beginnen. Zu diesem Zweck kann das Beschichtungsmaterial auf Basis seiner Neigung gewählt werden, auf die Oberflächenpolarität der desagglomerierten Magnetteilchen zu reagieren, wobei verschiedene Beschichtungsmaterialien unterschiedlich mit verschiedenen partikulären magnetischen Materialien reagieren. Wenn das Behandlungs- oder Zerstörungsverfahren pH-Modifikation ist oder umfasst, kann auch die Wirkung der pH-Modifikation auf die Oberflächenpolarität von Subteilchen und auf die Polarität des Beschichtungsmaterials in Erwägung gezogen werden. Das Beschichtungsmaterial wird in jedem Fall in Hinblick auf seine Fähigkeit gewählt, an der Oberfläche der desagglomerierten oder gespaltenen Teilchen zu haften, daran adsorbiert zu werden oder diese auf andere Weise zu modifizieren, sodass die Stabilität des partikulären Produkts mit verringerter Größe aufrechterhalten wird, um eine stabile Suspension davon bereitzustellen.
Diese Erfindung bringt neben der Einfachheit des Verfahrens auch bedeutende Vorteile gegenüber den Verfahren gemäß Molday und Owen et al. zur Herstellung von kolloidalen Materialien mit sich. Wenn beispielsweise Verbindungen an Metalloxidteilchen gebunden werden sollen, bei denen die Verbindung reaktive Gruppen oder aktivierte Gruppen aufweist, um danach anderen Materialien, wie z. B. Antikörper oder Enzyme, daran zu binden, sind die Verfahren gemäß Molday und Owen et al. in Bezug wegen der Auswahl solcher Verbindungen eingeschränkt. Der Grund dafür ist, dass diese Verfahren notwendigerweise mit dem Vermischen solcher Verbindungen mit Metallchloriden beginnen, die ihrerseits mit den Verbindungen reagieren können und außerdem einen sauren pH erzeugen. Darüber hinaus ist der Zusatz einer Base, üblicherweise Ammoniumhydroxid, erforderlich, um die Metalloxide zu bilden, was sich natürlich nachteilig auf verschiedene aktivierte chemische Gruppen auswirken kann, die für die nachfolgende Kopplung verwendet werden. Im Gegensatz dazu sind die direkten Adsorptionsverfahren dieser Erfindung keinen solchen Einschränkungen unterworfen.
Bestimmte Beschichtungsarten, wie beispielsweise die im Papell-Patent vorgeschlagenen langkettigen Kohlenwasserstoffe, weisen Detergenswirkung auf. Solche Beschichtungen können zur Stabilisierung der gespaltenen desagglomerierten Magnetteilchen dienen und eine stabile Suspension erzeugen, wie beispielsweise die von Papell offenbarte. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden diese Suspensionen aus Magnetit und durch Beschallung als Zerstörungsmittel erzeugt, und zwar um einige Größenordnungen schneller als beim Kugelmühlverfahren gemäß Papell.
Um resuspendierbare Produkte herzustellen, ist es wichtig, ein Beschichtungsmaterial herzustellen, das nicht nur die gespaltenen Magnetteilchen stabilisiert, sondern auch eine Beschichtung, die intakt bleibt, wenn die beschichteten Teilchen aus der Suspension entfernt werden, was bei Papell nicht der Fall ist.
Bei der Untersuchung von Mitteln zum Beschichten von aufgespaltenen Teilchen wurde herausgefunden, dass solche Reaktionen durch Erhitzen auf eine relativ hohe Temperatur bedeutend verbessert werden. Temperaturen von etwa 45–50°C sind effektiv, und auch Temperaturen in der Höhe von 85°C wurden eingesetzt, wobei die optimale Temperatur 75°C zu sein scheint. Im Falle von Proteinbeschichtungen und bestimmten Polymeren, die sekundäre und tertiäre Strukturen aufweisen, ist es überraschend, dass diese Materialien auf diese Art behandelt werden können. Die resultierenden resuspendierbaren Produkte weisen die folgenden Eigenschaften auf: sie weisen geringe nichtspezifische Bindung an Zellen sowie Makromoleküle auf, weisen bedeutend höhere Anteile an Beschichtungsmaterial auf als nicht wärmebehandelte Produkte, und die meisten besitzen die ungewöhnliche Eigenschaft, dass sie in Puffern mit hoher Ionenstärke kolloidale Stabilität aufrechterhalten können. Je nach Erhitzungsgrad (Temperatur oder Dauer) können Materialien hergestellt werden, die in 0,5 M NaCl bis 2,0 M NaCl stabil sind.
Magnetische Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung als Ausgangsmaterial verwendet werden können, umfassen die Übergangsmetalloxide, -sulfide, -silicide und -carbide, die gegebenenfalls unterschiedliche Übergangsmetalle in einer einzelnen magnetischen Verbindung aufweisen, wie z. B. Gd₃Fe₅O₁₂. Bevorzugt ist die als Ferrite bekannte Gruppe von magnetischen Oxiden, die im Allgemeinen durch MO·Fe₂O₃ dargestellt sind, worin M Zn, Gd, V, Fe, In, Cu, Co, Mg ist, und insbesondere Magnetit (FeO·Fe₂O₃).
Neben den von Owen et al. beschriebenen Übergangselemente enthaltenden Verbindungen und den oben genannten Ferriten kann, wie in dieser Erfindung beschrieben ist, auch eine Gruppe von magnetischen Metalloxiden beschichtet werden, die kein Eisen enthalten. Diese Verbindungen umfassen Oxide von Kombinationen aus zwei oder mehr der folgenden Metallionen: Al(+3), Ti(+4), V(+3), Mn(+2), Co(+2), Ni(+2), Mo(+5), Pd(+3), Ag(+1), Cd(+2), Gd(+3), Tb(+3), Dy(+3), Er(+3), Tm(+3) und Hg(+1). Diese unterscheiden sich von Ferriten sowohl in ihrem Aussehen als auch in ihrer magnetischen Suszeptibilität. Die Nichtferrite können jede beliebige Farbe von weiß oder gelb bis grün und sogar braun aufweisen. Dadurch sind sie besonders für spektralphotometrische Anwendungen geeignet. Nichtferrite sind im Allgemeinen weniger stark magnetisch als Ferrite und laufen somit in Magnetfeldern, die auf Ferrit basierende Materialien sammeln können, durch HGMS-Filter, wodurch eine selektive magnetische Gewinnung möglich ist.
Die Nichteisenoxide können anstelle der von Whitehead et al. beschriebenen Metalloxide verwendet werden, um silanbeschichtete Magnetteilchen herzustellen, welche die oben beschriebenen erwünschten Eigenschaften aufweisen. Auf ähnliche Weise kann, wenn die Chloride (oder Sulfate) solcher Kombinationen gemäß den Verfahren nach Molday oder Owen et al. verwendet werden, ein beschichtetes Produkt mit äußerst wünschenswerten magnetischen und spektralen Eigenschaften erhalten werden.
Beschichtungsmaterialien, die verwendet werden können, liegen in einer wässrigen Suspension oder Lösung vor. Das Beschichtungsmaterial ist üblicherweise ein synthetisches oder natürliches Polymer und kann ein Protein, ein Peptid oder eine Nucleinsäure sein. Prinzipiell kann das Beschichtungsmaterial jedoch jede beliebige Substanz sein, die Affinität zu den Oberflächen solcher Kristalle aufweist und auf die sich hohe Temperaturen nicht nachteilig auswirken.
Um stabile Suspensionen von beschichteten Subteilchen des magnetischen Ausgangsmaterials herzustellen, kann das Gemisch auf verschiedene Arten behandelt werden, um das magnetische partikuläre Ausgangsmaterial aufzuspalten oder zu teilen. Dazu gehören mechanische und chemische Mittel, wie beispielsweise geringe Hitze, Schwingungen, Strahlung, Beschallung, pH-Modifikation oder eine Kombinati on davon. Davon ist Beschallung insbesondere bevorzugt. Während des Verfahrens oder danach kann das System ebenfalls erhitzt werden, vorzugsweise auf 75°C, und bei dieser Temperatur gehalten werden, bis die maximale Beschichtung erreicht ist.
Bei der Untersuchung von Mitteln zum Aufspalten oder Teilen des magnetischen partikulären Ausgangsmaterials zeigte sich, dass Ausgangsmaterial sogar in Abwesenheit von Beschichtungsmaterial in Teilchen mit geringerer Größe gespalten werden kann, wenn auch im Allgemeinen nur mit vorübergehender Stabilität. Aus dieser Beobachtung wurde abgeleitet, dass, wenn Beschichtungsmaterial zu einer Suspension des partikulären magnetischen Substrats mit geringerer Größe in einem geeigneten flüssigen Medium zugesetzt wird, nach der Spaltung des magnetischen Ausgangsmaterials und bevor das partikuläre magnetische Substrat nennenswerte Aggregation erfährt, d. h. während die kleineren Magnetteilchen stabil suspendiert bleiben, resuspendierbare beschichtete Magnetteilchen hergestellt werden können. Mit "nennenswerter Aggregation des partikulären magnetischen Substrats" ist gemeint, dass eine beträchtliche Anzahl an Teilchen nicht länger im feinst verteilten Zustand vorliegt, wie in manchen Fällen durch eine Veränderung des Aussehens der Suspension von glänzend zu matt belegt wird, was auf die Bildung von Teilchenaggregaten hinweist. Alternativ dazu kann das Vorkommen von wesentlicher Teilchenaggregation auch mithilfe quasielektrischer Lichtstreuung bestimmt werden, wenn sich zeigt, dass die mittlere Teilchengröße von ihrer minimalen Größe ausgehend deutlich zunimmt.
Beschichtungsmaterialien können auch nach dem Zerstörungsverfahren nacheinander zugesetzt werden, sodass ein Material von besonderem Interesse zuerst in begrenzter Menge zum gespaltenen Material zugesetzt wird, wonach ihm Zeit gegeben wird, am partikulären Substrat anzuhaften. Die genaue Zeit hängt davon ab, wie lange eine Kristallreaggregation unter den Bedingungen der Aussetzung gegenüber dem ausgewählten spezifischen Beschichtungsmaterial stattfindet. Als Nächstes wird ein anderes Beschichtungsmaterial zugesetzt, dessen wesentliche Funktion darin besteht, Abschnitte von gespaltenen Kristallen zu beschichten, die bei der primären Beschichtung blank geblieben sind, und eine Agglomeration zu verhindern, um das System zu stabilisieren. Zu diesem Zweck könne verschiedene Dispersionshilfen eingesetzt werden. Geeignete Dispersionshilfen umfassen beispielsweise herkömmliche Detergenzien, anionische, kationische und/oder nichtionische Tenside und dergleichen. Die Auswahl einer geeigneten Dispersionshilfe hängt von der Art der Oberflächenladung auf den kolloidalen Magnetteilchen ab. Die Dispersionshilfe dient dazu, die kolloidalen Magnetteilchen in Suspension zu stabilisieren.
Der sequentielle Beschichtungsansatz ermöglicht eine Maximierung der Aufnahme von Beschichtungsmaterial von Interesse, und in vielen Fällen kann eine im Wesentlichen komplette Teilchenbeschichtung erreicht werden. Auf diese Art kann die Menge an primärem Beschichtungsmaterial begrenzt werden, wodurch das Beschichtungsverfahren ohne nachfolgende Reinigung des gewünschten beschichteten Magnetteilchenprodukts von ungebundenem primärem Beschichtungsmaterial durchgeführt werden kann. Außerdem können durch sorgfältige Regelung der Konzentration und/oder zeitlichen Abstimmung von nacheinander zugesetzten Beschichtungsmaterialien stabile Agglomerate verschiedener Größen erhalten werden. Ein weiterer Vorteil des Zusetzens von Beschichtungsmaterialien nach der Desaggregation des partikulären magnetischen Ausgangsmaterials besteht darin, dass nachteilige Wirkungen, die der Zerstörungsvorgang auf die Beschichtungsmaterialien haben könnte, vermieden werden. Darüber hinaus bringt die Freiheit, den Beschichtungsvorgang in zwei separaten Schritten durchzuführen, in bestimmten Situationen eine Reihe weiterer Verfahrensvorteile mit sich.
Die Erfinder haben außerdem herausgefunden, dass die Verwendung von Hochgradient-Magnetabscheidung (HGMS) bei der Herstellung solcher Teilchen ihrer Produktion eine Größenordnung verleiht, die bisher nicht erreicht oder erkannt wurde. Die Verfahren gemäß Molday und Owen et al. nutzen entweder Zentrifugation, Gelfiltration oder "Aussalzen" als Manipulationsverfahren während der Bearbeitung von kolloidalen Materialien. Beim hierin beschriebenen Beispiel wurde HGMS verwendet, um kolloidale Teilchen von einer ungebundenen Beschichtungssubstanz abzutren nen. Bei Verfahren, bei denen es eventuell wünschenswert ist, Substanzen chemisch an solche Teilchen zu koppeln, kann eine Bearbeitung unter Verwendung von HGMS nicht nur leicht maßstäblich angepasst werden, sondern auch äußerst effizient sein.
HGMS kann auch in Übereinstimmung mit abgestimmten Magnetfeldern verwendet werden, um Präparate aufgrund ihrer magnetischen Suszeptibilität/Teilchenvolumsverhältnisse zu fraktionieren. Das ermöglicht eine bequeme Fraktionierung und die Herstellung von Teilchenpräparaten mit bestimmten Größen. Wenn sie als NMR-Kontrastmittel verwendet werden, spielt die Größe der Teilchen eine bedeutende Rolle für die Stoffwechselbahn des Materials. HGMS kann, wiederum bei abgestimmten Magnetfeldern, auch zum selektiven Sammeln von Teilchen verwendet werden, deren magnetisch ansprechender Kern Übergangselementoxide mit höheren magnetischen Suszeptibilitäten als andere Bestandteile des Gemischs enthält. Dieses Konzept könnte in einem System von Nutzen sein, in dem kolloidale Teilchen mit unterschiedlichen magnetischen Suszeptibilitäten sowie unterschiedlichen Biorezeptoren mit einer Probe vermischt und durch sequentielle HGMS unter Verwendung von steigender Gradientenfeldstärke entfernt werden.
HGMS kann nicht nur zum Abtrennen nichtadsorbierter Beschichtungen oder nichtumgesetzter Substanzen und Nebenprodukte vom kolloidalen, magnetischen Teilchenprodukt verwendet werden, sie kann auch zur Immobilisierung von beschichteten magnetischen Produkten und zur Durchführung von Reaktionen auf dem immobilisierten Material verwendet werden. Wenn eine gegebene Beschichtung chemisch modifiziert werden soll, können daher Reaktanten zum magnetisch immobilisierten Material zugesetzt werden, die Reaktion kann im magnetisch immobilisierten Zustand durchgeführt werden, und überschüssige Reaktanten oder andere Reaktionsprodukte können leicht weggespült werden. Dieses Konzept eignet sich, ähnlich wie eine Peptidsynthese auf festen Trägern, gut für sequentielle Reaktionen.
Eine Spaltung des magnetischen partikulären Ausgangsmaterials kann auch in Abwesenheit von Beschichtungsmaterial durchgeführt werden, wobei ein darauf folgender hitzegesteuerter Beschichtungsschritt verwendet wird. Dies kann bei Temperaturen im Bereich von 0°C bis 85°C erreicht werden, und wie oben erwähnt können verschiedene mechanische oder chemische Mittel eingesetzt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform zum Aufspalten von magnetischem partikulärem Ausgangsmaterial ist das Aufspalten bei 0 bis 5°C in Gegenwart von geringen Konzentrationen eines neutralen Phosphatpuffers (5 bis 30 mM) und die Verwendung von Beschallung als Aufspaltungsmittel. Wird die Temperatur in diesem Bereich gehalten, so scheint das zwei Vorteile gegenüber Aufspaltungen bei höheren Temperatur mit sich zu bringen, da eine Oxidation und ein darauf folgender magnetischer Verlust des Kristalls bei niedrigeren Temperaturen vermieden wird und bei der gleichen Energiezufuhr kleinere Kristallagglomerate erhalten werden können. Durch das Aufspalten von magnetischen Material in Abwesenheit von Beschichtungsmaterial wird eine Verteilung von Kristallagglomeratgrößen erzeugt, die resuspendierbar sind. Es zeigte sich, dass das Mittel zum Aufspalten mit der Energiezufuhr (Dauer und Stärke der Beschallung), mit der Gegenwart verschiedener chemischer Spezies vor dem und/oder während des Aufspaltungsverfahren(s), dem magnetischen Sättigungswert des Materials und der Art, auf welche die Kristalle hergestellt werden, zusammenhängt. Bei der Herstellung von Magnetit und anderen Übergangsmetalloxiden führt beispielsweise die Zusatzgeschwindigkeit einer Base (oder die Art der Base, z. B. NH₄OH vs. NaOH) bei der Bildung der Oxide aus den Chlorid- oder Sulfatsalzen zu Kristallen, deren Größe variiert und die in unterschiedlichem Ausmaß gespalten werden können. Rascher Zusatz von NaOH zu den Sulfatsalzen von Eisen resultiert beispielsweise in Magnetitkristallclustern, die typischerweise kleiner sind als jene, die durch langsamen Zusatz oder die Verwendung von NH₄OH zum Hervorrufen der Oxidation erhalten werden. Sobald die Kristallagglomeratverteilung gebildet ist, wird rasch Beschichtungsmaterial in einer Konzentration zugesetzt, die ausreicht, um eine Reagglomeration abzubrechen, und das Gemisch wird erhitzt, um die Beschichtungsreaktion voranzutreiben. Das Beschichtungsmaterial kann dieselbe Temperatur oder eine höhere Temperatur aufweisen. Gemäß einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform wird das magnetische Ausgangsmaterial durch Erhitzen in Abwesenheit des Beschichtungsmaterials gespalten und danach mit einem Beschichtungsmaterial mit 75–80°C vermischt, wobei das Ganze weitere 30 bis 40 min lang auf 75°C erhitzt wird.
Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich ist, bringt die Trennung des Spaltungsschritts vom Verfahren, welches eine Reagglomeration verhindert, gefolgt von der Durchführung des Schritts, der die Beschichtung vorantreibt und beendet, mehrere Vorteile mit sich. Wenn der Spaltungsschritt bei einer hohen Temperatur in Gegenwart von Beschichtungsmaterial durchgeführt wird, wenn die Beschichtungsreaktion deutlich stärker ist, sollte die Gegenwart von Beschichtungsmaterial klarerweise die Spaltungsreaktion beeinträchtigen. Obwohl kolloidal stabile Materialien mit hoher Ionenstärke auf diese Art hergestellt werden können, lässt die Tatsache, dass bei höherer Temperatur so viele unterschiedliche Reaktionen stattfinden, vermuten, dass solch ein Verfahren schwer zu kontrollieren wäre. Auf der anderen Seite sollte die Durchführung der Spaltungsreaktion in Abwesenheit von Beschichtungsmaterial im Prinzip ein kontrollierbarer Vorgang sein, da jedes Herstellungsverfahren mit Materialien beginnt, die auf Kristallebene ähnliche Größe, ähnliche Struktur und, im Fall von magnetischen Materialien, ähnliche magnetische Eigenschaften aufweisen. Indem durch Zusatz von Beschichtungsmaterial in ausreichender Menge, um eine Reagglomeration zu verhindern, eine Reagglomeration im aufgespaltenen System abgebrochen wird und das System dann erhitzt wird, um die Beschichtungsreaktion voranzutreiben, wird die Möglichkeit minimiert, dass Beschichtungsmaterial nahe beieinander gelegene Kristallagglomerate vernetzt.
Obwohl die obigen Verfahren gemäß vorliegender Erfindung als Beschichtungsverfahren charakterisiert wurden, sind solche Verfahren je nach spezieller Anwendung auch als Extraktionsverfahren geeignet. Somit können die hierin beschriebenen Verfahren auch vorteilhaft für den spezifischen Zweck der Extraktion eines Zielmaterials aus einem komplexen Gemisch verwendet werden, wie beispielsweise zur Isolierung von umweltgefährlichen Materialien aus Abfällen, zur Produktgewinnung aus einem Reaktionsgemisch oder zur Abscheidung einer wertvollen Komponente aus einem Gemisch, das im Allgemeinen wertlose Komponenten umfasst.
Eine weitere der Extraktion ähnliche Anwendung der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Binden von Polyelektrolyten, z. B. Nucleinsäuren, an kolloidale Magnetteilchen. Dieses Verfahren umfasst die Verwendung von chemisch behandelten, resuspendierbaren, kolloidalen Magnetteilchen zur selektiven Bindung an Polyelektrolyte, z. B. DNA oder RNA, um solche Zielmoleküle aus einem komplexen Gemisch zu extrahieren. Die Fähigkeit solcher resuspendierbarer, kolloidaler Magnetteilchen, an Polyelektrolyten zu binden, sowie die enorme Oberfläche solcher Materialien führen zusammen mit ihrer Fähigkeit, magnetisch wiedergewonnen zu werden, bei ihrem Einsatz zu bedeutenden Vorteilen. Dieses Bindemittel kann leicht durch Spalten des partikulären magnetischen Ausgangsmaterials in mehrere resuspendierbare, kleinere Teilchen hergestellt werden, die mit einem chemischen Mittel behandelt werden, das solchen Teilchen die gewünschte Oberflächenladung verleiht. Spaltungsverfahren, wie beispielsweise Beschallung oder pH-Einstellung, können zu diesem Zweck verwendet werden, wobei Ersteres bevorzugt ist. Beschallung führt nicht nur zur Desaggregation des partikulären magnetischen Ausgangsmaterials, sondern kann auch verwendet werden, um eine gleichzeitige Spaltung bestimmter biologischer Einheiten, wie z. B. Zellen oder Bakterien, die das Zielmolekül enthalten, auszulösen. Bei der Freisetzung durch Beschallung wird das Zielmolekül an die resultierenden kolloidalen Magnetteilchen gebunden, wenn sie einer geeigneten chemischen Behandlung unterzogen worden sind.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens kann das partikuläre magnetische Ausgangsmaterial aufgespalten werden, um ein vorübergehendes Kolloid zu bilden, wie hierin beschrieben ist, zu dem dann eine Testprobe, welche das zu bindende Zielmolekül enthält, anschließend zugesetzt wird, oder das partikuläre magnetische Ausgangsmaterial kann in Gegenwart des Zielmoleküls gespalten werden.
Die nachstehend angeführten Beispiele zeigen, dass die Behandlung von aufgespaltenen Magnetteilchen mit verschiedenen chemischen Mitteln, wie beispielsweise Säure oder Base, zur Einstellung des pH (oder der Ionenstärke) die Bindeselektivität für verschiedene Polyanionen und Polykationen deutlich beeinflusst. Somit ist klar, dass als Mittel zur Durchführung einer Extraktion dieses Verfahren starke Spezifität für den Polyelektrolyten von Interesse aufweist. Durch die Einstellung der Lösungsmittel-, Puffer- und Salzbedingungen nach dem Bindungsschritt und nachdem das gebundene Polyelektrolytenmaterial magnetisch abgeschieden worden ist, kann der Zielpolyelektrolyt leicht in biologisch aktiver Form gewonnen werden. Nach dem Gewinnen des Zielpolyelektrolyten kann das partikuläre magnetische Material wiederverwendet werden.
Es gilt anzumerken, dass dieses Verfahren auch mit Übergangselementoxidmaterialien funktioniert, die relativ geringe magnetische Suszeptibilitätseigenschaften aufweisen, wie weiter oben beschrieben ist.
In jenen Fällen, in denen das Material zum Sammeln von Polyelektrolyten nicht ausreichend magnetisch ist, damit eine Magnetabscheidung durchgeführt werden kann, könnte zum Abscheiden und die nachfolgende Gewinnung Filtration eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung des Prinzips dieser Erfindung; diese Beispiele dienen jedoch keineswegs zur Einschränkung des Schutzumfangs dieser Erfindung.
Alle in diesen Versuchen verwendeten Reagenzien und Chemikalien wiesen analytische Güte auf und wurden, sofern nicht anders angegeben, von Fisher Scientific (Valley Forge, PA, USA) bezogen.
Vergleichsbeispiel 1
Magnetit wurde hergestellt, indem Lösungen von 3,0 und 1,5 mg/ml Eisen(III)-chloridhexahydrat bzw. Eisen(II)-chloridhexahydrat bei Raumtemperatur verrührt wurden, während der pH mit NH₄OH auf 8,6 angehoben wurde. Der resultierende Magnetit wurden magnetisch gesammelt, 3-mal mit destilliertem Wasser gewaschen und in destilliertem Wasser resuspendiert. Das so hergestellte Präparat enthielt 1,5 mg/ml Magnetit. Auch nach einer 3-minütigen Beschallung (Fisher – Sonic Dismembrator Modell 300) bei 70% Leistung blieben diese Präparate nicht länger als etwa 2 min lang suspendiert.
Um Magnetitteilchen durch das Verfahren der Erfindung zu beschichten, wurden 0,5-ml-Aliquoten verschiedener Beschichtungsmaterialien mit verschiedenen Konzentrationen mit 0,5-ml-Aliquoten der 1,5-mg/ml-Magnetitsuspension vermischt. Proben wurden in konischen Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff vermischt und dann 3 min lang bei 70% Leistung bei Raumtemperatur beschallt. Eine Sichtprüfung der Art, wie Licht durch die Probe gestreut wurde, wies auf ein positives oder teilweise positives Beschichtungsergebnis hin.
Um die Effizienz der Beschichtung zu bestimmen, wurden die resultierenden Proben weiter auf Niederschlag untersucht und auf folgende Weise zu kolloidalem beschichtetem Magnetit oder Mikroagglomeraten davon fraktioniert: 0,5-ml-Aliquoten des beschallten Gemischs in 12 × 75 mm großen Reagenzgläsern wurden in einen Ciba-Corning-Magnetic-Separator (Walpole, MA, USA) gegeben und einer Sichtprüfung unterzogen. Das zur Bestimmung, ob die beschichteten Magnetitkristalle kolloidal waren, verwendete Kriterium war, ob das resultierende Material 10 min lang im Magnetscheider, d. h. im magnetischen Überstand, in Lösung blieb. Das Kriterium wurde basierend auf der Annahme festgelegt, dass Lösungen von proteinbeschichtetem kolloidalem Magnetit, die durch das Verfahren gemäß Owen et al. hergestellt wurden, im Magnetic Separator nicht magnetisch abgetrennt werden können, wenn sie für einen solchen Zeitraum darin platziert werden.
Um zu bestimmen, welcher Teil des beschallten Gemischs stabile, beschichtete, aber agglomerierte. Materialien bildete, die im Magnetic Separator zum Rand der Reagenzgläser gezogen wurden, wurden so gebildete Materialien dreimal mit 20 mM Phosphat gewaschen Und im selben Puffer resuspendiert. Ihre Resuspensionsmerkmale unterschieden sich deutlich von jenen von unbeschichtetem Magnetit, da sie stundenlang suspendiert blieben verglichen mit Minuten für Letztere.
Ein zweites Kriterium umfasste die Untersuchung des magnetischen Überstandes wie folgt: Mutmaßliches kolloidales Material wurde durch HGMS von der Mutterlösung abgetrennt, gewaschen und in einem Puffer resuspendiert und danach durch Sichtprüfung auf kolloidales Aussehen und Stabilität untersucht. Die HGMS wurde durchgeführt, indem etwa 20 mg Edelstahlwolle guter Qualität (McMaster-Carr, New Brunswick, NJ, USA) (in einem Detergens gewaschen, in 1% phosphatgepufferter BSA-Salzlösung (PBS-BSA) inkubiert, mit entionisiertem Wasser gespült, getrocknet und in etwa 3 mm lange Stücke geschnitten) in 12 × 75 mm große Reagenzgläser gegeben wurden. 100 μl des zu untersuchenden Überstands wurden zu den Reagenzgläsern, welche die Edelstahlwolle enthielten, zugesetzt, und das Ganze wurde 2 min lang in das Magnetscheidegestell gegeben, wobei sich in diesem Zeitraum magnetisches Material auf den Edelstahldrähten sammelte. Klare nichtmagnetische Überstände wurden mit Pasteurpipetten entfernt, und das magnetische Material wurde 3-mal mit 300 μl 20 mM Phosphat (pH 7,5) gewaschen. Nach dem dritten Waschvorgang wurde gesammeltes magnetisches Material im Phosphatpufter resuspendiert, nachdem das Reagenzglas vom Gestell genommen worden war, und mithilfe einer Sichtprüfung auf das Aussehen eines stabilen Kolloids untersucht.
In manchen Fällen wurde gewonnenes Material auch durch Laserlichtstreuung (Coulter Sub Micron Particle Analyzer N4SD, Hialeah, FL, USA) klassiert. Einige Überstände wurden durch Gelfiltrationschromatographie auf einem Sephacryl-300 (Pharmacia) oder Ultragel AcA-22 von nichtadsorbiertem Material abgetrennt.
In Tabelle I sind die verschiedenen Verbindungen, die in Beschichtungsversuchen verwendet wurden, sowie ihre Konzentrationen) und andere Lösungsmittelbedingungen zusammengefasst. Die Gegenwart und Semiquantifizierung von kolloidalen und agglomerierten Materialien wurden durch die oben beschriebenen Verfahren visuell bestimmt, indem ein Vergleich mit Standardwerten von bekannten Gemischen von kolloidalen und agglomerierten Ansätzen vorgenommen wurde. Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, ergab jede getestete Verbindung eine gewisse Menge stabiles kolloidales Material. Sofern beobachtet sind auch Stabilität nach einer HGMS und Resuspension in einem Phosphatpuffer angeführt. In allen Fällen konnte der Erfolg des Beschichtungsversuchs sofort nach dem Beschallungsverfahren aus dem gestreuten Licht oder durch den scheinbaren "Glanz" der Lösung bestimmt werden. Materialien, für welche die Beschichtungsbedingungen ungeeignet waren (d. h. stabile beschichtete aufgespaltene Teilchen wurden nicht hergestellt) sahen im Gegensatz dazu matt und heterogen aus. Tabelle I

nd: nicht durchgeführt
P: Phosphatpuffer
GαMFc: Ziege-Antimaus-Fc (Jackson Labs, West Grove, PA, USA)
SDS: Natriumdodecylsulfat
PEG: Polyethylenglykol (Matheson, Coleman und Bell, East Rutherford, NJ, USA)
Dextran: Dextran T-40 (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA)
Poly-G: Polyglutaminsäure (NEN, Pilot Chemical Division, Boston, MA, USA)
GLA: [(Glutaminsäure 45 Mol-%) (Lysin 35 Mol-%) (Alanin 20 Mol-%)]_n (NEN, Pilot Chemical Division, Boston, MA, USA)
IgG: Immunglobulin G
Lipidgestrippte und steroidfreie lipidgestrippte Seren: von Scantibodies Inc., Santee, CA, USA
Tween-20: Polyoxyethylentensid (ICI Americas)

Vergleichsbeispiel 2
Quantifizierung von Proteinbeschichtung und -retention
I-125-markiertes BSA und IgG wurden durch das Iodogen-Verfahren gemäß Fracker und Speck (Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 849 (1978)) hergestellt. Spezifische Aktivitäten waren 520.000 cpm/μg bzw. 810.000 cpm/μg.
BSA wurde unter den folgenden zwei Gruppen von Bedingungen auf Magnetit aufgetragen: (1) bei 7,5% BSA in 10 mM Phosphatpuffer gefolgt von 3-minütiger Beschallung und (2) bei 7,5% BSA in 25 mM Phosphatpuffer gefolgt von 3-minütiger Beschallung. In beiden Fällen wurden vor der Beschallung 800.000 cpm markiertes BSA zum Gemisch zugesetzt (0,5 ml). Eine Sichtprüfung ergab, dass die höhere Phosphatkonzentration zu bedeutend mehr kolloidalem Material führte. Der magnetisch sammelbare Niederschlag wurde bei jedem Versuch entnommen, zweimal in 20 mM Phosphatpuffer gewaschen und gezählt. Das magnetische agglomerierte Material der Bedingungen 1 und 2 enthielt 2.421 bzw. 2.828 cpm. Um zu bestimmen, wie gut BSA diese agglomerierten Präparate adsorbiert hatte, wurde das gewonnene Material 40 min lang bei Raumtemperatur in 0,1 M Glycin mit einem pH von 3,0 suspendiert, magnetisch abgetrennt und einmal mit 20 mM Phosphatpuffer gewaschen. Die Counts bzw. Zählungen bei den Versuchsbedingungen 1 und 2 ergaben 91 bzw. 84%. Wenn ähnliche Präparate in einem Puffer resuspendiert und über Nacht bei 37°C inkubiert wurden, wurde kein Material vom Magnetit desorbiert.
Um die Stabilität des kolloidalen Magnetit-BSA zu bestimmen, wurde die Menge an BSA, die auf dem Kolloid adsorbiert wurde, wie folgt quantifiziert: 3 × 100-μl-Aliquoten des Überstands wurden einzeln durch HGMS gesammelt, zweimal mit 300 μl Phosphatpufter gewaschen und in 100 μl desselben Puffers resuspendiert. Durch eine Beobachtung über einen längeren Zeitraum (16 h) zeigte sich, dass das kolloidale Material stabil war. Radioaktives BSA, das durch HGMS gewonnen wurde, war für den gesamten Überstand 5.400 cpm. Aus den Radioaktivitäten und den Volumina der Überstande und der agglomerierten Materialien, die unter Bedingung 2 erhalten wurden, wurde bestimmt, dass 7.828 cpm auf den Magnetit angegliedert wurden. Das entspricht 0,01% des gesamten zum System zugesetzten BSA, was etwa 0,75 mg/ml des so hergestellten Magnetits entspricht. Dieser Wert ist sehr nahe an der optimalen Menge BSA, die durch das Verfahren gemäß Owen et al. auf Magnetit aufgetragen werden kann.
Die IgG-Beschichtungsversuche wurden bei 5% Proteinkonzentration in PBS/2 (eine 1 : 2-Verdünnung von PBS in H₂O) durchgeführt. Vor der Beschallung wurden Gemische mit 1,8 × 10⁶ cpm radioaktiv markiertem IgG versetzt. Bei diesen Versuchen zeigte sich, dass 1,2% des gesamten zugesetzten Proteins adsorbiert wurden, was 1,2 mg IgG/ml Magnetit entspricht. Wiederum ist dieser Wert nahe bei der maximalen Beschichtung, die durch die Lehre gemäß Owen et al. erhalten werden kann. Als eine HGMS auf dem magnetischen Überstand dieses Versuchs durchgeführt wurde, wurden 23.000 cpm auf dem kolloidalen Material zurückgehalten. Die agglomerierten magnetischen Pellets enthielten nach mehreren Waschschritten 17.300 cpm. Als das magnetische Pellet in Glycin mit einem pH von 3,0 wie oben resuspendiert wurde, wurden nur 50% der Counts auf dem darauf folgenden magnetischen Pellet zurückgehalten. Bei diesen Versuchen zeigte sich jedoch, dass eine Glycinbehandlung des mikroagglomerierten Materials einen beträchtlichen Teil (etwa die Hälfte) in kolloidales Material übergeführt hatte; somit war das IgG-beschichtete Material tatsächlich stabil. Kolloidale Materialien, die durch HGMS gewonnen wurden, zeigten sich bei einer Sichtprüfung stabil.
Vergleichsbeispiel 3
Beibehaltung von biologischer Aktivität
Ziege-Antimaus-Fc (von Jackson Laboratories, West Grove, PA, USA) wurde wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben auf Magnetit aufgetragen. Zum Beschichten wurde das unbehandelte Antiserum 1 : 4 mit 50 mM Phosphat verdünnt. Nach dem Beschallungsverfahren schien der Großteil des resultierenden Materials kolloidal. Der gesamte Überstand wurde an Sephacryl-300 abgetrennt. Kolloidales Material, das im Hohlraumvolumen auftrat, wurde gewonnen und dem folgenden Test unterzogen: 100 μl des gewonnen Kolloids wurden mit entweder 100.000 Counts 125-I-markiertem Maus-IgG oder 100.000 Counts 125-I-BSA vermischt. Diese Gemische wurden in 12 × 75 mm großen Reagenzgläsern in Gegenwart von Eisenpulver wie oben beschrieben inkubiert. Nach 90 min bei Raumtemperatur wurde wie oben beschrieben eine HGMS durchgeführt, Überstände wurden verworfen, und gesammeltes Material wurde zweimal mit 0,8 ml PBS, das 2% BSA enthielt, gewaschen. Für diese Kolloid proben (in dreifacher Ausführung) wurde herausgefunden, dass im Durchschnitt 5.000 Counts Maus-IgG an das Fc-beschichtete Kolloid gebunden waren, im Gegensatz zu 632 cpm nichtspezifisch gebundenem BSA.
Vergleichsbeispiel 4
Hellfarbige Teilchen
Gemischte Übergangsmetalloxide wurden bei Raumtemperatur und bei 65°C durch Zusatz einer Base zu geeigneten Metallchloriden wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben hergestellt. In Tabelle II sind Herstellungsbedingungen, Molverhältnisse, die anfängliche Farbe der Oxide und die Farbe nach 1 Woche oder die Farbe nach 8-stündigem Durchperlen von O₂ durch frisch hergestellte Oxide zusammengefasst.
Tabelle II Konzentration (mmol/l)
In Tabelle III sind die Ergebnisse der Beschichtung der Oxidpräparate aus Tabelle II (Präparate 1, 2, 3 und 4) mit Dextran und mit BSA gemäß dem Verfahren dieser Erfindung zusammengefasst. Klarerweise können diese Material auch auf ähnliche Weise auf Magnetit aufgebracht werden. Es gilt anzumerken, dass die Nichtferrit- und Ferritoxide aus Tabelle II gemäß der Lehre von Whitehead et al. statt Magnetit verwendet werden können, um ähnlich gefärbte silanbeschichtete Materialien herzustellen. Wenn die geeigneten Chloride (oder Sulfate) dieser Metalle gemäß den Lehren von Molday oder Owen et al. verwendet werden, ist es möglich, kolloidale Materialien zu erhalten, die im sichtbaren Bereich nahezu transparent sind.
Tabelle III Aussehen nach Beschallung
Vergleichsbeispiel 5
Kolloidteilchengröße
BSA-Magnetit wurde wie oben beschrieben mit dem Magnetit aus Vergleichsbeispiel 1 und 1% BSA in 50 mM Phosphat mit pH 7,0 hergestellt, mit der Ausnahme, dass eine Allquote eine zweite 3-minütige Periode lang und eine weitere eine dritte 3-mi nütige Periode lang beschallt wurde. Nachdem das gesamte agglomerierte Material wie oben beschrieben mit dem Magnetgestell entfernt worden war, wurden die resultierenden kolloidalen Proben durch Laserlichtstreuung (Coulter Submicron Particle Analyzer) nach ihrer Größe klassifiziert. Mit Einbeziehung von Versuchsfehlern wies jedes Präparat einen mittleren Teilchendurchmesser von 80 nm auf.
Als Nächstes wurde Magnetit zum Beschichten durch zwei Verfahren hergestellt, bei denen die Teilchengröße im Verfahren gemäß Owen et al. abnimmt, nämlich durch äußerst raschen Zusatz einer Base und äußerst raschen Zusatz einer Base bei erhöhter Temperatur (65°C). Wenn BSA-Magnetit in einem einzelnen 3-minütigen Beschallungsschritt, aber mit Magnetit, der gemäß Owen et al. hergestellt worden war, gebildet wurde, wiesen beide resultierende Kolloide einen mittleren Durchmesser von 50 nm auf.
Beispiel 1
Eigenschaften von Magnetit unter Einfluss des pH
3,75% NH₄OH wurden mit 0,6 ml/min zu 200 ml eines gerührten Gemischs aus entgasten hydratisierten Eisen(III)- und Eisen(II)-chloridsalzen mit einer Konzentration von 7 bzw. 3 mg/ml zugesetzt. Als der pH des anfänglichen sauren Gemischs 7,0 erreichte (angezeigt durch einen Farbübergang von dunkelorange zu schwarz), wurden 300-μl-Allquoten entfernt, in 10 × 75-Reagenzgläser gegeben und auf die Gegenwart von Magnetit untersucht, indem ein Neodym/Eisen/Bor-Stabmanget an der Seite des Reagenzglases platziert und die magnetische Klärung visuell beobachtet wurde. Der Übergang von nichtmagnetischem oder teilweise magnetischem Material zu vollkommen magnetischem Material fand bei einem pH von 7,4 statt, nachdem 12,2 ml einer Base zugesetzt worden waren. An diesem Punkt wurden 60 ml des Gemischs entfernt und als Präparat A bezeichnet. Zu dem Gemisch wurde zusätzliche Base zugesetzt, bis ein pH von 8,9 erreicht war; eine 60-ml-Aliquote wurde entfernt und als Präparat B bezeichnet. Weitere Base wurde zum Reaktionsgemisch zugesetzt, bis ein pH von 9,8 erreicht war, und eine Aliquote dieses Materials wurde als Präparat C bezeichnet. Die Magnetitpräparate A, B und C wurden 4-mal mit destilliertem Wasser gewaschen und in Wasser resuspendiert, sodass die Eisensalze in den Ausgangskonzentrationen der ursprünglichen Lösung vorlagen. 0,5-ml-Aliquoten der letzteren Suspensionen von A, B und C wurden 3 min lang bei 70% Leistung beschallt (Fisher Sonic Dismembrator). Direkt nach der Beschallung wiesen alle das glänzende Aussehen von kolloidalem Magnetit auf; innerhalb von 2 min verwandelten sich jedoch alle in matte Suspensionen (was auf Teilchenaggregate hinweist). Beim Präparat C fand der Übergang 20–30 s nach der Beschallung statt; beim Präparat B 40–50 s danach; und Präparat A brauchte 2 min für diesen Übergang. Als die Präparate direkt nach der Beschallung auf dem Magnetgestell von Corning platziert wurden, wurden sie in derselben Reihenfolge wie oben und im selben Zeitraum komplett aus der Suspension geklärt. Nach einer Reaggregation gab es keinen erkennbaren Unterschied zwischen den Proben.
Um zu bestimmen, ob die Suszeptibilität der hergestellten Magnetite für Aufspaltung durch Beschallung durch eine H⁺- oder OH^–-Behandlung verändert wird, wurden 0,5-ml-Aliquoten der Präparat-C-Suspension in Reagenzgläser gegeben und durch Magnetabscheidung und Überstandabsaugung von ihren Wasserüberständen abgetrennt. Magnetische Pellets wurden dann in 0,5 ml entweder verdünnter HCl (0,1, 0,01, 0,001 oder 0,0001 M) oder verdünnter NaOH (0,1, 0,01, 0,001 oder 0,0001 M) 3 min lang wie oben beschallt und einer Sichtprüfung unterzogen. Bei diesen Proben war offensichtlich, dass eine Säuren- oder Basenbehandlung die Aufspaltung von Magnetit in Abhängigkeit von der Konzentration der Säure oder Base erhöhte. Die Aliquoten, die in 0,1 M HCl oder NaOH resuspendiert und beschallt worden waren, blieben fast 12 h lang glänzend, d. h. kolloidal. Die in 0,001 M Säure oder Base resuspendierten Aliquoten wiesen ebenfalls einen erheblichen Zeitraum lang kolloidales Verhalten auf. In 0,0001 M Säure oder Base resuspendierte Aliquoten, auf der anderen Seite, aggregierten ähnlich wie das Ausgangsmaterial in Wasser rasch nach einer Beschallung.
Vergleichsbeispiel 6
Beschichtung von pH-modifiziertem Magnetit
Das Präparat C aus Beispiel 1 wurde durch Aufspaltung durch Beschallung mit anionischen und kationischen Polypeptiden beschichtet. Ein anionisches Terpolypeptid, das aus 60 Mol-% Glutaminsäure, 30 Mol-% Alanin und 10 Mol-% Tyrosin (GAT, Chargennummer M18G) bestand, und ein kationisches Copolymer aus 60 Mol-% Lysin und 40 Mol-% Alanin (LA, Chargennummer M-5B), die beide von Pilot Chemicals, Watertown, MA, USA bezogen wurden, wurden verwendet. Diese Polypeptide, die beide etwa 100.000 Dalton aufwiesen, wurden durch Trituration mit einer geeigneten Säure oder Base löslich gemacht, neutralisiert, gegen eine phosphatgepufferte Salzlösung (pH 7,0) und danach gegen destilliertes Wasser dialysiert. Beschichtungen wurden mit 10-mg/ml-Lösungen eines Polypeptids und Reihenverdünnungen desselben auf 1 : 16 versucht. Beschichtungsversuche wurden wie oben beschrieben durch Beschallung durchgeführt. Bei diesen Versuchen ergaben die 1 : 16- und 1 : 8-Verdünnungen von GAT und LA jeweils stabile kolloidale Lösungen. Die 1 : 4-, 1 : 2- und unverdünnten Polypeptidlösungen ergaben Verteilungen von kolloidalem und agglomeriertem Material. Die Kolloidmenge nahm in beiden Fällen im Allgemeinen mit steigender Polypeptidkonzentration ab. Bei 25 mg/ml GAT war jedoch das gesamte Material kolloidal.
Die Präparate A und C aus Beispiel 1 wurden mit GAT beschichtet. 0,5-ml-Aliquoten von Magnetit wurden 60 s lang in 1,0 ml HCl (0,01 und 0,1 M) oder NaOH (0,01 und 0,1 M) resuspendiert und dann zweimal mit 0,5 ml Wasser gewaschen. Diese vorbehandelten Magnetite wurden in 0,5-ml-Aliquoten von 1 mg/ml GAT resuspendiert, die 2,5 × 10⁶ cpm ^125IGAT (durch das oben beschriebene Iodogen-Verfahren radioaktiv markiert) enthielten, und wie beschrieben beschallt. Beschallte Proben wurden auf das magnetische Gestell von Corning gegeben und über Nacht trennen gelassen. Magnetische Pellets wurden einmal in 0,5 M NaCl gewaschen und gezählt. Gebundene Counts und Prozentsätze von beschichtetem GAT der verschiedenen Magnetite sind in Tabelle IV zusammengefasst. Tabelle IV Wirkung einer H⁺/OH^–-Behandlung der Magnetitpräparate A und C auf die GAT-Beschichtung

nd: nicht durchgeführt

Aus den Daten in Tabelle IV ist ersichtlich, dass die Oberflächenladung eines Magnetitkristalls durch eine Vorbehandlung mit einer Säure positiver gemacht werden kann, und umgekehrt reduziert eine Behandlung mit einer Base die Stellen, die für das negativ geladene Polymer vorhanden sind. Als ein ¹²⁵I-Präparat des kationischen Terpolymers LAT (60 Mol-% lys, 30 Mol-% ala, 10 Mol-% tyr) (von Dr. H. J. Callahan, Jefferson Medical College, Philadelphia, PA) mit ähnlich vorbehandeltem Magnetit verwendet wurde, zeigte sich, dass bei Magnetit, der mit einer Base vorbehandelt worden war, stärkere Bindung dieses positiv geladenen Materials stattfand.
Um zu bestimmen, ob eine Änderung der Kristalloberflächenladung durch Behandlung mit einer Säure oder Base eine allgemeine Eigenschaft von Übergangselementoxiden ist, wie beispielsweise solchen, die aus verschiedenen Molverhältnissen von Chloriden von Fe (II), Dy (III), V (III) hergestellt werden, wurden solche Materialien wie oben mit einer Säure oder Base behandelt und mit entweder radioaktiv markiertem GAT und/oder Lachsspermien-DNA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) vermischt. Wie im Falle von Magnetit förderte Säure die Bindung dieser negativ geladenen Polylelektrolyte. Genauer gesagt ergaben unbeschichtete Materialien, die mit 0,1 M HCl vorbehandelt und dann mit Wasser gewaschen wurden, bei Beschallung Materialien, die sich wie die oben beschriebenen Magnetitpräparate verhielten, d. h. vorübergehend stabile Kolloide. Als diese Materialien sich in einem semistabilen kolloidalen Zustand befanden, führte der Zusatz einer geeigneten Menge Lachsspermien-DNA zu einer kompletten Agglutination, was darauf hinweist, dass die Kristalle eine im Wesentlichen positive Oberflächenladung angenommen hatten.
Beispiel 2
Direkte Beschichtung nach Beschallung
Ein magnetisches Ferrofluid wurde durch Zusatz von Beschichtungsmaterial nach Beschallung eines blanken Magnetits nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt.
Der blanke Magnetit wurde durch das in Vergleichsbeispiel 1 beschriebene Verfahren hergestellt. Mithilfe eines Stabmagneten wurde der Magnetit von Wasser abgetrennt und in einem Phosphatpufter mit pH 7,5 resuspendiert. Die mittlere Teilchengröße des Magnetits wurde durch 5-minütige gepulste Beschallung (Fisher Sonic Dismembrator 550) reduziert, wobei 10 s Impulse und 10 s Pausen aufeinander folgten.
Direkt nach der Beschallung wurde das erste Beschichtungsmaterial, d. h. 1 mg/ml 9 × Biotin-BSA in 20 mM Phosphatpufter mit pH 7,5, mit dem beschallten blanken Magnetit 15 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das zweite Beschichtungsmaterial, d. h. 5 mg/ml BSA in 20 mM Phosphatpuffer mit pH 7,5, wurde zum Gemisch aus Magnetit und erstem Beschichtungsmaterial zugesetzt.
Tabelle V zeigt die Wirkung verschiedener Beschichtungskonzentrationen auf die Größe der kolloidalen Magnetteilchen im Laufe der Zeit und die Abscheidegeschwindigkeiten in einem Magnetfeld mit hohem Gradienten. Die Teilchengröße wurde mithilfe eines Coulter-Sub-micron-Particle-Analyzers (Modell N4SD) gemessen. Die ma- gnetischen Eigenschaften der kolloidalen Teilchen wurden durch Hochgradient-Ma gnetabscheidung (HGMS) in einem 300 μl fassenden Mikrotiterwell mit Gitternetzen in einem gleichmäßigen Magnetfeld mit 4 kG bestimmt.
Tabelle V Wirkung der Konzentration von primären und sekundären Beschichtungen auf die Stabilität und Abscheidegeschwindigkeit von kolloidalen Magnetteilchen
Vergleichsbeispiel 7
Herstellung von stabilen, kolloidalen Magnetteilchen durch direkte Beschichtung von biotinyliertem BSA mit gleichzeitiger Beschallung
Stabile, kolloidale Magnetteilchen wurden durch gleichzeitige Größenreduzierung von partikulärem magnetischem Ausgangsmaterial und Beschichtung während einer Beschallung hergestellt.
Der blanke Magnetit wurde durch das oben in Vergleichsbeispiel 1 beschriebene Verfahren hergestellt. Mithilfe eines Stabmagneten wurde der Magnetit von Wasser abgetrennt und in 1 mg/ml 9 × Biotin-BSA in 20 mM Phosphatpuffer mit pH 7,5 resuspendiert. Die mittlere Teilchengröße des Magnetits wurde durch einminütige ge pulste Beschallung (Fisher Sonic Dismembrator 550) reduziert, wobei 10 s Impulse und 10 s Pausen aufeinander folgten.
Die Teilchengröße und die Magnetabscheidegeschwindigkeit wurden wie oben in Beispiel 2 beschrieben gemessen.
Die mittlere Teilchengröße betrug 80 nm. Die Abscheidegeschwindigkeit lag nach 30 s bei 85% und nach 1 min bei > 95%. Das resultierende Produkt wurde zwei Wochen lang überwacht und erwies sich als stabil, da der direkt beschichtete Magnetit in Suspension blieb und klar aussah.
Vergleichsbeispiel 8
Bindung und Entfernung von DNA aus einer Lösung unter Verwendung von unbeschichteten kolloidalen Magnetteilchen
Dieses Beispiel zeigt, dass reine λ-DNA unter Verwendung von blanken, unbeschichteten, kolloidalen Magnetteilchen unter sauren Bedingungen gebunden und gewonnen werden kann.
Die kolloidalen Magnetteilchen wurden durch magnetisches Abscheiden von Suspensionen von blankem Magnetit, die wie in Vergleichsbeispiel 1 hergestellt wurden, in Wasser bei 1 mg Eisen/ml Lösung hergestellt. Der Magnatant (nicht abgeschiedene flüssige Phase) wurde abgesaugt und in 0,1 M NaCl auf das gleiche Volumen wie das Original resuspendiert. Die Suspension wurde fünf Sekunden lang verwirbelt und dann dreimal nacheinander mit entionisiertem Wasser gewaschen. Bei jedem Waschschritt wurde der Magnetit magnetisch am Platz gehalten.
Zwei Testproben von DNA, die mit dem Noechst-Farbstoff H33258 (Life Technologies Katalognummer 5250SB) fluoreszenzmarkiert wurden, wurden hergestellt. Die erste Probe, Probe A, wurden durch Zusatz von 1 ml 8 μg/ml λ-DNA in 20 mM Phosphatpuffer mit pH 5 zu einem ersten Reagenzglas unter Rühren hergestellt. Das resultierende Gemisch wurde dann im Glas eine Minute lang unter Verwendung einer Microtip-Sonde auf Eis beschallt (Fisher Sonic Dismembrator, Modell 550; Einstellung 3, Pulszyklus 1 s an/1 s ab). Die zweite Probe, Probe B, wurde demselben Verfahren unterzogen, mit der Ausnahme, dass 1 ml 8 μg/ml λ-DNA in 20 mM Phosphatpuffer mit pH 7,5 verwendet wurde.
Die DNA-Menge wurde fluorimetrisch analysiert, indem die Ffuoreszenzmenge vor und nach der Magnetabscheidung verglichen wurde. Tabelle VI zeigt die Fluoreszenzsignale und die berechneten Prozentwerte der durch Bindung an die kolloidalen Magnetteilchen aus der Lösung entfernten DNA.
Tabelle VI Wirkung des pH auf die DNA-Extraktion aus einer Lösung
Vergleichsbeispiel 9
Bindung von DNA durch blanken Magnetit und Gewinnung durch Pufferlösung
Dieses Beispiel zeigt, dass λ-DNA, die unter sauren Bedingungen gesammelt wurde, durch die Wahl des Waschpuffers von gebundenen kolloidalen Magnetteilchen entfernt werden kann.
Der Magnetit und die λ-DNA wurden wie oben in Vergleichsbeispiel 8 beschrieben hergestellt. Zehn Proben des Magnetits wurden vorbereitet. Alle wurden mit fluoreszenzmarkierter DNA unter sauren Bedingungen bei einem pH von 4 unter Verwendung von 20 mM Phosphatpuffer beschallt. Das anfängliche Fluoreszenzsignal der DNA-Ausgangslösung war 80. Die DNA wurde 10 min lang magnetisch angezogen, und der Überstand wurde gemessen. Aus der Differenz zwischen der Ausgangsfluo reszenz und dem Überstandssignal wurde der Prozentwert gewonnener DNA berechnet.
Tabelle VII zeigt, dass der Prozentwert, der durch Beschallung extrahiert wurde, zwischen 58 und 63% variierte. Die relative Effizienz der Waschpuffer ist als prozentuelle Gewinnung angegeben. Tabelle VII Wirkung des Waschpuffertyps auf die DNA-Entfernung aus einem Ferrofluid

A: Fluoreszenzsignal des Überstands nach 10 min Abscheidung.
B: Berechnetes Fluoreszenzsignal. (Anfängliches Fluoreszenzsignal der markierten DNA-Lösung = 80) – A.
C: % DNA extrahiert.
D: Fluoreszenzsignal des Überstands nach der ersten Waschung.
E: % Gewinnung aus der ersten Waschung.
F: Fluoreszenzsignal des Überstands nach der zweiten Waschung.
G: % Gewinnung aus der zweiten Waschung.
H: Gesamt-% Gewinnung = E + G.

Alle in den Beispielen 3–12 verwendeten Reagenzien und Chemikalien wiesen analytische Güte auf und wurden, sofern nicht anders angegeben, von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) bezogen.
Beispiel 3
Heiß beschallter Magnetit, gefolgt von einer Heißbeschichtungsreaktion
Magnetit wurde hergestellt, indem Lösungen aus 17 g und 12 g Eisen(III)-sulfatpentahydrat bzw. Eisen(II)-sulfatheptahydrat in Wasser vermischt und bei 70°C unter Stickstoffatmosphäre gerührt wurden, während der pH mit 60 ml Ammoniumhydroxid erhöht wurde. Der resultierende Magnetit wurde magnetisch gesammelt, 10-mal mit destilliertem Wasser gewaschen und in 600 ml destilliertem Wasser resuspendiert. Das so hergestellte Präparat enthielt etwa 10 mg/ml Magnetit.
Um Rinderserumalbumin-(BSA-)Ferrofluid herzustellen, wurde 1,0 g des oben hergestellten Magnetits in ein Becherglas gemessen und zweimal mit Wasser magnetisch gewaschen. Die endgültige Resuspension fand in 100 ml 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, statt. Der Magnetit wurde auf 70°C vorerhitzt, dann mit einem Fisher-Sonic-Dismembrator Modell 550 20 min lang bei Impulsbeschallung 1 s an/1 s ab (Gesamtdauer 40 min) und Einstellung der Leistung auf 7 beschallt. Währenddessen wurden 1,8 g BSA in 60 ml 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, gelöst und 10 min auf 75°C erhitzt. Nach der Beschallung wurden rasch 30 ml der beschallten Magnetits entfernt, mit dem heißem BSA vermischt und 5–20 min lang auf 75°C erhitzt und dann in einem Eisbad abgekühlt. Die Ferrofluidgrößenverteilung wurde durch eine Reihe von kontrollierten magnetischen Waschungen in einer Kammer mit einem Feld mit 3 kGauss auf der Oberfläche eingeengt. Material, das in einem vorgegebenen Zeitraum gesammelt wurde, wurde zurückgehalten. Dieses Verfahren wurde routinemäßig dreimal mit jedem Präparat durchgeführt. Dieses Verfahren wird hierin im Folgenden als Hochfeldwaschungen bezeichnet. Die Werte für die Größe, die Salzstabilität und das adsorbierte Protein, gemessen durch Kohlenstoffanalyse, sind in Tabelle VIII, Zeile 1–3, angeführt.
Beispiel 4
Kalt beschallter Magnetit, gefolgt von einer Heißbeschichtungsreaktion
Magnetit wurde wie oben in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Um BSA-Ferrofluid herzustellen, wurden 3,6 g BSA in 120 ml 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, gelöst und 10 min lang auf 75°C erhitzt. Währenddessen wurde 1,0 g des oben hergestellten Magnetits in ein Becherglas gemessen und zweimal mit Wasser magnetisch gewaschen. Die endgültige Resuspension fand in 100 ml 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, statt. Der Magnetit wurde mit einem Fisher-Sonic-Dismembrator Modell 550 30 min lang bei 10°C bei Impulsbeschallung 1 s an/1 s ab (Gesamtdauer 60 min) und Einstellung der Leistung auf 7 beschallt. Die Beschallungstemperatur wurde mithilfe eines Umwälzkühlungssystems geregelt, das Ethylenglykol mit –4°C enthielt. Nach der Beschallung wurden rasch 60 ml der beschallten Magnetits entfernt, mit dem heißem BSA vermischt und 5–60 min lang auf 75°C erhitzt und dann in einem Eisbad abgekühlt. Das Ferrofluid wurde im Hochfeld gewaschen. Die Messungen der Größe, der Salzstabilität und des adsorbierten Kohlenstoffs sind in Tabelle VIII, Zeile 4–9, angeführt.
Beispiel 5
Messung der Salzstabilität und des adsorbierten Proteins von Ferrofluid
Um die Salzstabilität des Präparats aus BSA-Ferrofluid zu messen, wurden 0,25 ml umfassende Proben des Ferrofluids in einen NaCl-hältigen Phosphatpuffer gegeben, sodass die Endkonzentrationen an Natriumchlorid 0, 0,5, 1,0 und manchmal 2,0 M betrugen. Die Proben wurden dann mithilfe eines Coulter-N4CD-Submicron-Particle-Analyzers (Coulter Corp., Hialeah, FL, USA) bei t = 0, 1, 2, 4 und 17 h bei Raumtemperatur nach Größe klassifiziert.
Um die Menge an adsorbiertem Protein zu messen, wurden 2–3 mg Ferrofluid mit 1 ml konzentrierter HCl vermischt, in eine Glasampulle gegeben und abgedichtet. Nach einer Verdauung bei 110°C über Nacht wurde die Probe auf einen pH von 2–4 neutralisiert. Der gesamte adsorbierte Kohlenstoff wurde mithilfe eines TOC 5000 (Shimadzu, Kyoto, Japan) gemessen. Die Ergebnisse des obigen Verfahrens für die in Beispiel 3 und 4 hergestellten Ferrofluids sind in der folgenden Tabelle VIII zusammengefasst. Als Kontrolle wurde eine Ferrofluidprobe (kalt beschallter Magnetit, wie in Beispiel 3 beschrieben) mit dem BSA vermischt und 30 min lang unerhitzt bei Raumtemperatur stehen gelassen (siehe Zeile 10). Tabelle VIII

nb: nicht bestimmt
BM: blanke (unbeschichtete) Magnetitaufschlämmungen

Die Fehlerspanne der Größendaten beträgt etwa 5%, kleine Veränderung liegen also innerhalb des Messfehlers. Größere Größenänderungen sind jedoch von Bedeutung. Ein Teilchen mit etwa 300 nm wird sich letztendlich unwiderruflich aus der Lösung absetzen. Die Fehlerspanne der Daten über adsorbierten Kohlenstoff beträgt etwa 4%. Es gilt anzumerken, dass eine längere "Nacherhitzungsdauer" mit BSA in einem Ferrofluid resultiert, das stark mit BSA beschichtet ist (> 300 μg BSA/mg Fe). Außerdem gilt anzumerken, dass die Größe dieser Ferrofluidteilchen auch bei hohen Salzkonzentrationen relativ konstant bleibt, was den Kriterien für Salzstabilität genügt. Schließlich sollte erwähnt werden, dass eine kalte Kontrolle (Zeile 10) bedeutend weniger BSA-Beschichtung aufweist und auch in Salzlösungen, die nur Pufferionen enthalten (20 mM Phosphat), äußerst instabil ist.
Vergleichsbeispiel 10
Wärmebehandlung von kalt beschalltem BSA-Ferrofluid
Ferrofluid kann wie in der US-Patentanmeldung 397.106 offenbart durch kalte Beschallung eines Gemischs aus Magnetit und Protein hergestellt werden. Das Erhitzen dieses Ferrofluids führt ebenfalls zu einer erhöhten Proteinbeschichtung und Salzstabilität. Magnetit wurde wie oben in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben hergestellt. BSA-Ferrofluid wurde durch Vermischen von 2,0 g BSA mit 1,0 g Magnetit in 200 ml hergestellt. Dann wurde das Gemisch mit einem Fisher-Sonic-Dismembrator Modell 550 45 min lang bei Impulsbeschallung 1 s an/1 s ab (Gesamtdauer 90 min) und Einstellung der Leistung auf 7 beschallt. Die Beschallungstemperatur wurde mithüfe eines Umwälzkühlungssystems geregelt, das Ethylenglykol mit –4°C enthielt. Die während des Beschallens gemessene Temperatur betrug 30°C. Dann wurde das resultierende Ferrofluid verschieden lange von 0 bis 90 min auf 80°C erhitzt.
Das adsorbierte Protein wurde mithilfe des Proteintestsets, das im Handel von BioRad Corp. (Richmond, CA, USA) erhältlich ist, gemessen. Die Proben wurden für den Test vorbereitet, indem, wie im US-Patent 5.200.084 (Immunicon Corp., Huntingdon Valley, PA, USA) beschrieben, alle Magnetteilchen durch 5-minütige HGMS-Anziehung in einem Mikrotiter-Well, der mit einem Drahtsieb ausgestattet war, in einem Immunicon-Protein-Separator aus der Lösung entfernt wurden. Der Überstand wurde mit einer Pipette aus dem Mikrotiter-Well entfernt, verdünnt, und der Test wurde gemäß den Anweisungen des Sets durchgeführt, wobei eine Standardkurve, die mit reinem BSA erhalten wurde, verwendet wurde. Das an die Magnetteilchen gebundene Protein wurde durch Subtraktion der Menge an BSA, die im nichtmagnetischen Überstand gefunden wurde, von der ursprünglichen Menge BSA, die zum Magnetit zugesetzt wurde, berechnet.
Die Ergebnisse des Versuchs sind im folgenden Diagramm I dargestellt, worin die Menge an adsorbiertem BSA pro mg Eisen als Funktion der Aufheizzeit dargestellt ist. Der plötzliche Anstieg der Beschichtung, der nach etwa 30 min stattfindet, hängt mit einem Anstieg der Salzstabilität zusammen (Daten nicht dargestellt).
Diagramm I
Vergleichsbeispiel 11
Nichtspezifische Bindung als Funktion der Aufheizzeit während der Beschallung
Magnetit wurde wie oben in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Um BSA-Ferrofluid herzustellen, wurden 0,175 g des Magnetits in ein Becherglas gemessen und zweimal mit Wasser magnetisch gewaschen. Die endgültige Resuspension fand in 35 ml BSA-Lösung statt, die aus 10 mg/ml in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, hergestellt worden war. Das Gemisch wurde in ein isoliertes Becherglas (Hegt Systems, Farmingdale, NY, USA) gegeben und auf die in Tabelle IX angeführten Temperatur abgekühlt oder erhitzt. Dann wurde das Gemisch mit einem Fisher-Sonic-Dismembrator Modell 550 20 min lang bei Impulsbeschallung 1 s an/1 s ab (Gesamtdauer 40 min) und Einstellung der Leistung auf 7 beschallt. Die tatsächliche Beschallungstemperatur wurde gemessen. Nach der Beschallung wurde der BioRad-Test wie in Vergleichsbeispiel 10 beschrieben durchgeführt, um die Menge an gebundenem Protein zu bestimmen. Dann wurde die Ferrofluidgrößenverteilung durch eine Reihe von 3 magnetischen Waschungen mit "Hochfeldmagneten" eingeengt. Die Resuspension fand in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, statt. Dann wurde das Ferrofluid weiter mit zwei "Niedrigfeldmagnetwaschungen" fraktioniert. Die Stärke des Magnetfeldes betrug an der Sammeloberfläche etwa 0,4 kGauss. In diesem Fall wurde nur der Überstand nach jeder Waschung gesammelt, und das Pellet wurde verworfen.
Die Größe, Salzstabilität und innere nichtspezifische Bindung wurden an diesem Punkt gemessen. NSB (nichtspezifische Bindung) ist in diesem Fall als Prozentsatz an Zellen definiert, die aus einer Lösung entfernt werden, wenn die Zellen mit einem Ferrofluid vermischt werden, das dann magnetisch gesammelt wird. In der Ferrofluid/Zelllösung ist keine Substanz vorhanden, die eine Wechselwirkung zwischen Ferrofluid und Zellen verursachen könnte. Beispielsweise sind keine Antikörper, Lectine oder herkömmliche Einfangmittel, wie z. B. Biotin, Streptavidin, Haptene oder Protein A oder G, vorhanden. Die NSB wurde mithilfe eines Radioaktivitätsdifferenztests bestimmt. CEM-Zellen wurden mit ⁵¹Cr markiert, indem bis zu 5,0 × 10⁷ Zellen in 2 ml RPMI suspendiert wurden, das mit 10% Kälberserum, 100 Einheiten Penicillin-Streptomycin und 1,25% L-Glutamin (alle von Mediatech, Washington, DC, USA) ergänzt war. ⁵¹Cr wurde von Dupont (Wilmington, DE, USA) bezogen und direkt aus der Flasche verwendet. Die cpm des Chroms wurden durch Zählung in einem Cobra-11-Gamma-Counter (Packard, Downer's Grove, IL, USA) bestimmt. Etwa 1 × 10⁷ cpm wurden zu den Zellen zugesetzt und bei 37°C 1 h lang inkubiert, wobei alle 15 min verwirbelt wurde. Für den Test wurden 160 μl markierte Zellen mit 2,5 × 10⁶ Zellen/ml mit 160 μl Ferrofluid mit 20 μg Fe/ml in einer isotonischen phosphatgepufferten Salzlösung (IPBS) in einem Reagenzglas vermischt. Das Gemisch wurde 5 min lang inkubiert. Während der Inkubationszeit wurden die Counts von ⁵¹Cr durch Zählung im Gammazähler bestimmt. Dann wurden 250 μl des Gemischs in einen Mikrotiter-Well gegeben, und das Ferrofluid wurde mithilfe einer 5-minütigen magnetischen Abreicherung in einem Immunicon-Cell-Separator wie im US-Patent 5.200.084 (Immunicon Corp. Huntingdon Valley, PA, USA) beschrieben entfernt. Nach der Abreicherung wurden der oder die Mikrotiter-Well(s) entfernt und einzeln in Reagenzgläser gegeben. Die Anzahl an Counts wurde aufgezeichnet. Außerdem wurde das Inkuba tionsgemisch, das im Reagenzglas verblieb, nachdem die Probe zum Mikrotiter-Well entfernt worden war, für ⁵¹Cr gezählt. Die Ausgangszahl der Counts wurde bestimmt, indem die Counts, die im Reagenzglas verblieben, von der Anzahl an Counts subtrahiert wurden, die anfangs zu jedem Reagenzglas zugesetzt wurden. Die prozentuelle Entfernung (NSB) wurde mithilfe der folgenden Gleichung bestimmt:
Die Daten für diese Beispiele sind in der folgenden Tabelle IX zusammengefasst. Es gilt anzumerken, dass das Ferrofluid nur bei einer tatsächlichen Beschallungstemperatur von über etwa 60°C salzstabil wird. Bei höheren Temperaturen nimmt auch die NSB ab, was auf die Eliminierung von "blanken Stellen" auf den Magnetteilchen zurückzuführen sein könnte, die aufgrund der positiven Ladung des Eisens dazu tendieren können, von sich aus an Zellen zu binden, wodurch diese nichtspezifisch aus der Lösung entfernt werden.
Tabelle IX
Beispiel 6
Kopplung von Streptavidin an BSA-Ferrofluid
Streptavidin kann durch das folgende Verfahren an BSA-Ferrofluid gekoppelt werden. Heiß beschichtetes Ferrofluid wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wobei die BSA-Beschichtungszeit 60 min betrug. Das Ferrofluid wurde dekantiert und dreimal mit einem Hochfeldmagneten gewaschen. Nach jeder Waschung wurde das Ferrofluid in 180 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, resuspendiert. Das BSA-Ferrofluid wurde unter Verwendung von N-Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) (Pierce, Rockford, IL, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers aktiviert. Dann wurde das aktivierte Ferrofluid dreimal gewaschen. Nach jeder Waschung wurde das Ferrofluid in 180 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,5, mit 4°C resuspendiert. Zweimal so viel Streptavidin (Prozyme, Richmond, CA, USA) wie die Eisenmasse wurde ausgewogen und in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, mit 5 mM EDTA gelöst. Das Streptavidin wurde mit Traut-Reagens (Pierce, Rockford, IL, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers aktiviert. Dann wurde das aktivierte Streptavidin mithilfe einer PD-10-Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) gereinigt, und 1-ml-Säulenfraktionen wurden entnommen. Die Fraktionen 4 und 5 enthielten Protein und wurden gepoolt. Das aktivierte Ferrofluid und 1,5 mg aktiviertes Streptavidin pro mg Eisen wurden dann vermischt und bei Raumtemperatur 4 h lang unter Rühren reagieren gelassen. Dann wurde die Reaktion mit 4 mg/ml Mercaptosuccinsäure in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, mit 5 mM EDTA gequencht. Die Quenchreaktion wurde unter Rühren 16 h lang bei 4°C fortgesetzt. Nach der Quenchreaktion wurde das Ferrofluid zweimal mit einem Hochfeldmagneten gewaschen. Nach jeder Waschung wurde das Ferrofluid in 150 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, mit 0,2 mg/ml BSA resuspendiert. Die endgültige Resuspension fand jedoch in 10 mM HEPES, pH 7,5, mit 10 mg/ml BSA statt. Das resultierende Ferrofluid wurde 2 min lang in einen Badbeschaller FS-14 von Fisher eingetaucht, dann in 10 mM HEPES, pH 7,5, mit 0,1 mg/ml BSA gewaschen. Schließlich wurde eine 0,2-μm-Filtration durchgeführt.
Beispiel 7
Abreicherung von CEM-Zellen mit heiß beschichtetem Streptavidin-Ferrofluid
Zuerst wurde ein monoklonales Anti-CD45 (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) durch verfügbare freien Aminogruppen biotinyliert. Etwa 1–2 mg Antikörper wurden in etwa 0,5 ml 0,05 M Natriumbicarbonat, pH 8,5, hergestellt. N-Succinimidyl-6-(Biotinamido)hexanoatester (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) wurde in DMSO gelöst und im Überschuss zum Anti-CD45 zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 h lang bei 4°C umgesetzt. Der Antikörper wurde mithilfe einer PD-10-Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) gereinigt, wobei Fraktionen 3 und 4 (1-ml-Fraktionen) entnommen wurden.
CEM-Zellen wurden geerntet und in einer isotonischen phosphatgepufferten Salzlösung mit 1% BSA (1% BSA/IPBS) in einer Konzentration von etwa 2,2 × 10⁷ Zellen/ml suspendiert. Eine Reihe von 0,85 ml Zellsuspension umfassenden Proben wurden 10 min lang bei Raumtemperatur mit 1 μg biotinyliertem Anti-CD45 inkubiert. Lösungen von Streptavidin-Ferrofluid, die wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt wurden (Charge 188-143-6) und in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 397.106 (Charge 0994-1282W) allgemein beschrieben sind, wurden dann in einer Menge von 0,85 ml zu den Zellen zugesetzt. Die Ferrofluidmenge variierte von 12,5 μg bis 100 μg Eisen. Die Gemische wurden 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde jede Probe in eine 2 ml fassende Zelltrennkammer pipettiert, wie sie im US-Patent 5.200.084 (Immunicon Corp., Huntingdon Valley, PA, USA) beschrieben ist. Die Proben wurden 7 min lang magnetisch sammeln gelassen und dann aus dem Magnetfeld entfernt. Danach wurde jede Probe mit einer Pipette durchmischt und erneut in das Magnetfeld gegeben, um eine weitere 7 min lange magnetische Sammlung durchzuführen, wobei frische Stifte verwendet wurden. Die Abreicherungswirksamkeit wurde bestimmt, indem die Zellanzahl mithilfe einer Blutkörperchenzählkammer (Hausser Scientific, Horsham, PA, USA) unter Verwendung eines Ethidiumbromid/Acridinorange-Farbstoffs, der gemäß dem Monoclonal Antibody Sourcebook von BD hergestellt und 1 : 1 mit der Zellsuspension vermischt worden war, gezählt wurde. Die Ergebnisse der Abreicherungen sind in der folgenden Tabelle X zusammengefasst. Es gilt anzumerken, dass, obwohl beide Ferrofluids die Zellen effektiv entfernten, das heiß beschichtete Streptavidin-Ferrofluid auch bei einem Eisengehalt, der nur halb so hoch war wie der für das nicht wärmebehandelte Ferrofluid erforderliche, über 99% der Zellen entfernte.
Tabelle X
Beispiel 8
Vergleich zwischen einem heißbeschichteten Ferrofluid und einem nicht wärmebehandelten Ferrofluid
Ein heißbeschichtetes Ferrofluid wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt und wie in Beispiel 6 beschrieben mit Streptavidin beschichtet (Chargennummer 188-191-15). Ein nicht wärmebehandeltes Streptavidin-Ferrofluid wurde auf ähnliche Weise wie das in Beispiel 7 verwendete Ferrofluid hergestellt (Chargennummer 0395-1308). Beim heißbeschichteten Ferrofluid betrug der gesamte adsorbierte Kohlenstoff, gemessen mithilfe eines TOC 5000, 278 μg/mg Fe. Bei einem nicht wärmebehandelten Ferrofluid beträgt der gesamte adsorbierte Kohlenstoff etwa 145. Diese Messungen wurden an BSA-Teilchen vorgenommen, bevor eine Streptravidin-Kopplung stattfand. Außerdem war das heißbeschichtete Ferrofluid salzstabil, das nicht wärmebehandelte Ferrofluid jedoch nicht.
Der Unterschied in der Proteinbeschichtung und im intrinsischen Verhalten bleibt bestehen, nachdem die BSA-Teilchen mit einem zweiten Protein, z. B. Streptavidin, be schichtet werden. Die Bindekapazität gibt beispielsweise die Menge an biotinyliertem Protein an, die an ein Streptavidin-Ferrofluid gebunden werden kann. Der Wert für die Bindekapazität hängt eng mit der Proteinbeschichtung zusammen, da je mehr Streptavidin auf ein Teilchen aufgetragen ist, desto mehr biotinyliertes BSA (bBSA) es binden kann. Der Bindekapazitätstest begann mit der Markierung von Biotin-BSA mit ¹²⁵I. Biotin-BSA wurde mit N-Succinimidyl-6-(biotinamido)hexanoatester (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) gemäß der vom Hersteller vorgeschlagenen Arbeitsvorschrift biotinyliert. Dann wurde es gereinigt, indem es über eine PD-10-Säule laufen gelassen wurde, und mit 0,25 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, auf 5 mg/ml verdünnt. 200 μl Iodogen (Sigma, St. Louis, MO, USA) wurde in ein Reagenzglas gegeben und getrocknet, indem Stickstoffgas darüber geblasen wurde. Ein Millicurie ¹²⁵Ι und dann 200 μl des Biotin-BSA wurden zum Reagenzglas zugesetzt. Das Gemisch wurde 10 min lang auf Eis inkubiert. Dann wurden 800 μl des Phosphatpuffers zum Glas zugesetzt, und das gesamte Volumen wurde auf eine frische PD-10-Säule gegeben. Markiertes Biotin-BSA wurde in der vierten und fünften 1-ml-Fraktion eluiert.
Der Bindekapazitätstest wurde mit der Herstellung der Standards begonnen. Standards zwischen 15 und 500 μg bBSA/ml wurden mit 2,5% ¹²⁵I-markiertem biotinyliertem BSA in einem Phosphatpuffer (20 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, mit 10 mg/ml BSA und 0,15 M NaCl) hergestellt. Das Ferrofluid wurde mit 20 mM HEPES mit 0,1 mg/ml BSA und 0,05% ProClin 300 (Supelco, Inc., Bellefonte, PA, USA), pH 7,5, auf 400 μg/ml verdünnt. Dann wurde das Ferrofluid weiter mit dem oben genannten eigenen Phosphatpuffer zehnfach verdünnt und 15 min lang inkubiert. In jeden Well einer Reihe von Mikrotiter-Wells wurden 100 μl Ferrofluid gegeben. Dann wurden 100 μl jedes Standards zu den einzelnen Wells zugesetzt und 10 min lang inkubiert. Danach wurde jeder Well in einen Quadrupol-Magnetabscheider gegeben, wie er im US-Patent 5.186.827 beschrieben ist, der eine Öffnung aufweist, deren Größe genau der des Mikrotiter-Wells entspricht. Nach 5 min wurde der nichtmagnetische Überstand der einzelnen Wells verworfen, und das magnetische Material wurde fünfmal unter Verwendung eines PBS-Puffers mit 0,1% Tween 20 gewaschen und schließlich in 20 mM HEPES mit 1 mg/ml BSA und 0,05% ProClin 300 resuspendiert. Da nach wurden die Wells aus dem Magnetabscheider genommen und jeweils in ein 12 × 75 mm großes Reagenzglas gegeben. Die cpm, die in jedem Mikrotiterwell verblieben, wurden mithilfe eines Gammazählers gezählt. Außerdem wurden 10 μl des 500-μg/ml-Standards (oder 5 μg bBSA) im Gammazähler gezählt. Diese Zahl wurde durch 1,25 dividiert, um eine Normierung auf 4 μg bBSA vorzunehmen. Alle Proben-Counts wurden dann durch diesen Faktor dividiert und mit 1.000 multipliziert, um die Anzahl an Mikrogramm Biotin-BSA zu berechnen, die pro Milligramm Eisen gebunden wird. Die Ergebnisse dieses Bindekapazitätstests sind in der folgenden Tabelle XI für das heißbeschichtete Ferrofluid (Chargennummer 188-191-15) und das nicht wärmebehandelte Ferrofluid (Chargennummer 0395-1308) zusammengefasst. Die Daten zeigen, dass das Ferrofluid, das durch das Heißbeschichtungsverfahren hergestellt wurde, fast im gesamten bBSA-Bereich eine etwa doppelt so hohe Bindekapazität aufwies wie ein Ferrofluid, das nicht wärmebehandelt wurde. D. h. vom Ferrofluid konnte bedeutend mehr biotinyliertes Protein gebunden werden, nachdem die Teilchen mit Streptavidin beschichtet worden waren.
Tabelle XI
Ein weiteres Resultat der Menge an Streptavidin, die an ein Ferrofluidteilchen gebunden wird, ist die Leistung des Ferrofluids beim Entfernen von mit biotinyliertem Anti körper markierten Zellen aus einer Lösung. Teilchen mit mehr gebundenem Streptavidin können bei geringeren Mengen Eisen mehr Zellen entfernen. Ein Leistungstest verwendet nichtradioaktive CEM-Zellen bei 1,0 × 10⁷ Zellen/ml. 2 ml Zellen wurden mit 2,0 μg biotinyliertem Anti-CD45, das wie in Beispiel 18 beschrieben hergestellt wurde, vermischt. Die Zellen und Antikörper wurden 30 min lang inkubiert. Dann wurden 150 μl des Zellgemischs in einzelne Wells einer Reihe von Mikrotiter-Wells gegeben und mit 150 μl Ferrofluid zu 1,5–25 μg/ml vermischt. Das Ferrofluid war vorher zumindest 30 min lang mit einem Blockierpuffer (Ferrofluid Dilution Buffer, von Immunicon Corporation, Huntingdon Valley, PA, USA) vorinkubiert worden. Nach einer 10-minütigen Inkubation folgte eine 5-minütige Trennung im Cell Separator von Immunicon, wie in Beispiel 18 beschrieben ist. Nach dem Entfernen aus dem Cell Separator wurde der Überstand in den Wells mit einer Pipette durchmischt, und 100 μg der Probe wurden in eine Zellzählphiole gegeben, die mit 10 ml Isotonic Hematall Diluent gefüllt war. Die Zellzahlen wurden mithilfe eines Coulter-ZF-Cell-Counters (Coulter, Healeah, FL) gemessen. Die Abreicherung wurde durch den Prozentsatz an Zellen, der aus der Probe entfernt worden war, im Vergleich zu einer Probe, zu der anstelle von Ferrofluid ein Puffer zugesetzt worden war, berechnet. Die Abreicherungswerte bei verschiedenen Eisenkonzentrationen sind in der folgenden Tabelle XII zusammengefasst. Es gilt anzumerken, dass, obwohl bei hohen Eisenwerten beide Ferrofluids ähnliche Prozentsätze von Zellen abreichern, das heißbeschichtete Ferrofluid bei geringeren Eisenwerten bedeutend mehr Zellen entfernt.
Tabelle XII
Beispiel 9
Abreicherung einer Fraktion niedriger Dichte von mononuklearen Zellen mit heißbeschichtetem Ferrofluid
Mononukleare Zellen wurden durch Dichtezentrifugation mithilfe eines Ficoll-Paque ET (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) aus einer Probe von peripherem Blut isoliert, zweimal in 1% BSA/IPBS gewaschen und im selben Puffer auf eine Konzentration von etwa 26,5 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert. Zwei Proben von 0,85 ml jeder Zellsuspension wurden 10 min lang bei Raumtemperatur mit 1 μg biotinyliertem Anti-CD45 inkubiert, das wie in Beispiel 18 beschrieben hergestellt worden war. Lösungen von Streptavidin-Ferrofluid, die wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt worden waren (Charge 188-143-6), wurden dann in einer Menge von 0,85 ml zu den Zellen zugesetzt. Bei diesem Versuch wurden 10,0 μg und 75 μg Eisen/Test verwendet. Die Gemische wurden 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde jede Probe in eine 2 ml fassende Zelltrennkammer pipettiert, wie sie im obigen Beispiel 7 verwendet wurde (Immunicon Corp., Huntingdon Valley, PA, USA). Die Proben wurden wie in Beispiel 18 beschrieben zweimal 7 min lang magnetisch gesammelt, wobei zwischen den Sammlungen mithilfe einer Pipette resuspendiert wurde. Die Abreicherungseffizienz betrug 97,2% mit 10,0 g Eisen und 97,9% mit 75,0 μg Eisen.
Beispiel 10
Kopplung von Protein A an BSA-Ferrofluid
Auch andere Proteine können an die oben beschriebenen BSA-Ferrofluids gekoppelt werden. Ein Beispiel dafür ist Protein A. BSA-Ferrofluid wurde wie im obigen Beispiel 3 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass die gesamte Beschallungsdauer 30 min betrug. Die Heißbeschichtung wurde mit 600 mg BSA in 200 ml durchgeführt. Nach der Heißbeschichtung wurde die Probe abgekühlt und weitere 5 min lang beschallt, während sie in einem Ethylenglykolbad mit –4°C gekühlt wurde. Nach einer Inkubation des Ferrofluids bei 4°C über Nacht wurde das Ferrofluid abdekantiert, mit einem Hochfeldmagneten fraktioniert und 4-mal mit 20 mM HEPES, pH 7,5, gewaschen.
BSA-Ferrofluid wurde wie in Beispiel 6 oben beschrieben hergestellt und mit SMCC aktiviert. Protein A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wurde wie in Beispiel 6 beschrieben mit Traut-Reagens aktiviert. Dann wurden 1,0 mg Ferrofluid und 1,0 mg Protein A vermischt, eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Reaktion wurde wie in Beispiel 6 beschrieben mit Mercaptosuccinsäure gequencht, und das Ferrofluid wurde 4-mal gewaschen. Die Bindekapazität dieses heißbeschichteten Protein-A-Ferrofluids war zweimal höher als die Bindekapazität des nicht wärmebehandelten Ferrofluids, das ansonsten auf identische Weise hergestellt worden war, und das Material konnte leicht sterilfiltriert werden.
Beispiel 11
Kopplung von Ziege-Antimaus-Antikörpern an BSA-Ferrofluid
Ziege-Antimaus-Antikörper können ebenfalls an ein BSA-Ferrofluid gekoppelt werden. BSA-Ferrofluid wurde wie im obigen Beispiel 10 beschrieben hergestellt und mit SMCC aktiviert. Ziege-Antimaus-Antikörper (Jackson Labs, West Grove, PA, USA) wurde wie in Beispiel 10 beschrieben mit Traut-Reagens aktiviert. Dann wurden 30,5 mg Ferrofluid und 15,6 mg Ziege-Antimaus-Antikörper vermischt, eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Reaktion wurde wie in Beispiel 10 beschrieben mit Mercaptosuccinsäure gequencht, und das Ferrofluid wurde 4-mal gewaschen. Das auf diese Weise hergestellte Ferrofluid reicherte Zellen bei geringen Ferrofluidkonzentrationen effektiver ab als auf ähnliche Weise hergestellte nicht wärmebehandelte Ferrofluids.
Beispiel 12
Herstellung von heißbeschichteten Ferrofluids unter Verwendung von anderen Polymeren als BSA
Es ist auch möglich, wärmebehandelte Ferrofluids mit anderen Polymeren und Proteinen als BSA herzustellen. Polymere, wie beispielsweise Dextrane T-10 und T-40 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) und Proteine, wie beispielsweise β-Lactoglobulin (Sigma, St. Louis, MO, USA) wurden im Verfahren von Beispiel 4 verwendet, mit der Ausnahme, dass die Heißbeschichtung mit BSA durch eine Heißbeschichtung mit den oben genannten Polymeren ersetzt wurde. Durch dieses Heißbeschichtungsverfahren hergestellte Ferrofluids wurden mit Ferrofluid verglichen, das durch ein identisches Verfahren hergestellt worden war, bei dem jedoch der Erhitzungsschritt fehlte, und basierend auf der Größe und dem gesamten adsorbierten Kohlenstoff verglichen. In allen Fällen ergaben die Heißbeschichtungsverfahren kleine Ferrofluids mit einem relativ hohen Beschichtungsgrad, während das kalte Verfahren zu großen, instabilen Teilchen führte, die sich rasch aus der Lösung absetzten und bedeutend weniger adsorbiertes Beschichtungsmaterial aufwiesen.

Claims

Verfahren zur Herstellung von resuspendierbaren, beschichteten Magnetteilchen durch direktes Auftragen eines wässrigen Beschichtungsmaterials auf ein partikuläres magnetisches Substrat, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Teilen zumindest eines Teilchens eines magnetisches Ausgangsmaterials in mehrere aggregierbare, kleinere Teilchen, um so ein unbeschichtetes, partikuläres magnetisches Substrat bereitzustellen; b) Bilden einer Suspension dieses unbeschichteten, partikulären magnetischen Substrats in einem wässrigen Medium; und c) Kontaktieren des unbeschichteten, partikulären magnetischen Substrats mit dem wässrigen Beschichtungsmaterial, bevor das partikuläre magnetische Substrat nennenswerte Aggregation erfährt, und zwar für einen Zeitraum, der ausreicht, damit das Beschichtungsmaterial am Substrat haftet, wodurch die resuspendierbaren, beschichteten Magnetteilchen gebildet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem das Erhitzen des partikulären magnetischen Substrats während des Kontaktierungsschritts auf eine Temperatur von zumindest 45°C umfasst, und zwar für einen Zeitraum, der ausreicht, damit das Beschichtungsmaterial am Substrat haftet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das magnetische Ausgangsmaterial zumindest ein Übergangsmetalloxid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das magnetische Ausgangsmaterial aus der aus ZnOFe₂O₃, GdOFe₂O₃, VOFe₂O₃, FeOFe₂O₃, InOFe₂O₃, CuOFe₂O₃, CoOFe₂O₃, MgOFe₂O₃ und Gd₃Fe₅O₁₂ bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Übergangsmetalloxid Magnetit ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Beschichtungsmaterial ein natürliches oder synthetisches Polymer ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das magnetische Ausgangsmaterial unter Einfluss von Strahlung, Schwingungen, pH-Modifikation, Beschallung oder einer Kombination davon geteilt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die beschichteten Magnetteilchen im Allgemeinen eine maximale Größe von weniger als 0,2 μm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Gewichtsverhältnis zwischen dem partikulären magnetischen Substrat und dem Beschichtungsmaterial etwa 1.000 : 1 bis etwa 1 : 10 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das außerdem das Resuspendieren der beschichteten Magnetteilchen in Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das außerdem den Schritt des Umsetzens der beschichteten Magnetteilchen mit einer für die Beschichtung spezifischen bifunktionellen Verbindung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das außerdem den Schritt des Umsetzens der beschichteten Magnetteilchen mit einer bifunktionellen Verbindung und des Umsetzens der Produktteilchen mit einem bifunktionellen Liganden umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das außerdem den Schritt des Umsetzens der beschichteten Magnetteilchen mit einem Aktivator und des Umsetzens der Produktteilchen mit einem bifunktionellen Liganden umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Erhitzen bei einer Temperatur von etwa 60°C bis etwa 85°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das magnetische Ausgangsmaterial ein Ιonenpaar umfasst, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Co(II) + Ga(III) Ga(III) + Er(III) Co(II) + Ru(III) Ga(III) + Ru(III) Co(II) + Mn(II) Ga(III) + Mn(II) Ga(III) + V(III) Co(II) + V(III) Ga(III) + Mo(V) Ga(III) + Fe(III) V(III) + Fe(III) Mn(II) + Ru(III) V(III) + Mn(II) Co(II) + Mo(V) Cr(III) + Ga(III) Cr(III) + Mn(II) Er(III) + Ru(III) Er(III) + Co(II) Mn(II) + Er(III) Cr(III) + Fe(II).
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt (a) eine Beschallung des magnetischen Ausgangsmaterials bei einer Temperatur von etwa 75°C umfasst, und zwar ausreichend lange, um Teilchen in einem Größenbereich von 40 bis 180 nm herzustellen; und Schritt (c) bei einer Temperatur im Bereich von 70 bis 80°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Beschichtungsmaterial aus der aus Protein, Peptid und Nucleinsäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, worin das unbeschichtete, suspendierte, partikuläre magnetische Substrat mit einer Menge des Beschichtungsmaterials kontaktiert wird, die nicht größer ist als jene, die ausreicht, um die resuspendierbaren, beschichteten Magnetteilchen vollkommen zu bedecken.
Resuspendierbare, beschichtete Magnetteilchen, die nach einem Verfahren nach Anspruch 16 oder 17 hergestellt wurden.
Resuspendierbares, beschichtetes Magnetteilchen, das in einer einmolaren Salzlösung kolloidale Stabilität aufweist, was sich anhand einer Zunahme der Teilchengröße um nicht mehr als das Zweifache zeigt, wenn das Teilchen für einen Zeitraum von bis zu 24 h bei Raumtemperatur dieser Salzlösung ausgesetzt wird.