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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf die Bestimmung eines Analyten, wie zum Beispiel eines Antigens,
in einer Flüssigkeitsprobe,
wie zum Beispiel Körperflüssigkeit.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren
und eine Vorrichtung zum Nachweis eines Analyten in einer Körperflüssigkeit unter
Verwendung einer mit lateraler Strömung arbeitenden Testzelle,
die ein neuartiges zweiphasiges chromatographisches Substrat enthält.
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Es wurden viele Arten von Ligand-Rezeptor-Bestimmungen
verwendet, um das Vorhandensein verschiedener Substanzen in Körperflüssigkeiten,
wie zum Beispiel Urin oder Blut, festzustellen. Diese Bestimmungen
beinhalten typischerweise Antigen-Antikörper-Reaktionen, synthetische
Konjugate, die enzymatische, fluoreszierende oder visuell beobachtbare
Marken umfassen, und speziell konstruierte Reaktorkammern. Bei den
meisten dieser Bestimmungs- oder Assay-Einrichtungen gibt es einen Rezeptor
(beispielsweise einen Antikörper),
der für
das ausgewählte
Antigen spezifisch ist, sowie Einrichtungen zur Feststellung des Vorhandenseins
und/oder der Menge des Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukts. Die
meisten heutigen Tests sind so ausgelegt, dass sie eine quantitative
Bestimmung durchführen,
doch ist in manchen Fällen
alles was erforderlich ist, eine positiv/negativ Anzeige. Beispiele
derartiger qualitativer Proben schließen die Blut-Typisierung, den
Schwangerschaftstest und viele Arten der Urinanalyse ein. Für diese
Tests werden optisch beobachtbare Anzeigen, wie zum Beispiel das
Vorhandensein einer Agglutination oder einer Farbänderung
bevorzugt.
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Die „positiv/negativ"-Assayeinrichtungen
müssen
sehr empfindlich sein, weil die Konzentration des interessierenden
Liganden in der Testflüssigkeit
in vielen Fällen
klein ist. Fehlerhafte Positivanzeigen können problematisch sein, insbesondere
bei der Agglutination und anderen Schnelldetektionsverfahren, wie
zum Beispiel Eintauch- und Farbänderungs-Tests.
Aufgrund dieser Probleme wurden Sandwich-Assays und andere empfindliche Nachweisverfahren
entwickelt, die Metallsalze und andere Arten von gefärbten Teilchen
verwenden. Diese Techniken haben jedoch nicht alle die Probleme
gelöst,
die bei diesen Schnellnachweisverfahren auftreten. Es sind ein Ziel
der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Nachweiseinrichtung
und ein Verfahren zu schaffen, die bzw. das eine größere Empfindlichkeit
und ein Unterscheidungsvermögen
für interessierende
Analyten hat. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung
einer Assayeinrichtung, die in der Herstellung einfacher ist.
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Die folgenden Dokumente offenbaren
Diagnose-Nachweiseinrichtungen: WO-A-91/12528, WO-A-94/01775, WO-A-94/15215,
DE-A-4314493, EP-A-374684, EP-A-0582231,
EP-A-560411, WO-A-94/06012. Keines dieser Dokumente offenbart jedoch
Einrichtungen, die zweiphasige chromatographische Substrate der
Art umfassen, die hier beschrieben und beansprucht werden.
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Die WO 91/12528 beschreibt ein immunochromatographischen
Teststreifen, der ein Konjugat (i), das aus kolloidialem Gold besteht,
das mit einem Antikörper
zu dem Antigen (hCG) konjugiert ist; einen einfangbaren Bestandteil
(ii), der einen biotinylierten zweiten Antikörper zu dem Antigen umfasst,
und eine Einfangstelle aufweist, die aus Latex und dem Avidin-Komplex
besteht.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung ergibt
eine schnelle, empfindliche Vorrichtung und ein Verfahren zur Feststellung
des Vorhandenseins von Analyten in Körperflüssigkeiten. Das Verfahren und
die Vorrichtung haben eine hohe Empfindlichkeit und führen praktisch
zu keinen falschen Positivanzeigen. Die Verwendung der vorliegenden
Vorrichtung und des Verfahrens ergibt ein Assaysystem, das eine
minimale Anzahl von Verfahrensschritten beinhaltet, und in reproduzierbarer
Weise zuverlässige
Ergebnisse selbst dann ergibt, wenn es von ungeübten Personen verwendet wird.
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Die Vorrichtung und das Verfahren
verwenden ein neuartiges zweiphasiges chromatographisches Medium,
das die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit der Bestimmung verbessert.
Entsprechend ergibt die Erfindung in einem ersten Gesichtspunkt
eine Vorrichtung (5) zur Feststellung des Vorhandenseins
eines Analyten in einer flüssigen
Probe, bei der eine an einem proximalen Ende einer Vorrichtung aufgebrachte
flüssige
Probe stromabwärts
entlang eines Flüssigkeitswegs
zu einem distalen Ende der Vorrichtung wandert, wobei die Vorrichtung
folgendes umfasst:
ein zweiphasiges Substrat (18),
das ein Freisetzungsmedium (30) aus einem ersten saugfähigen hydrophilen Material
und in Flüssigkeitsverbindung
und stromabwärts
hiervon ein Einfangmedium (32) aus einem zweiten, anderen
mikroporösen,
hydrophilen Polymermaterial umfasst, wobei an dem Freisetzungsmedium
des zweiphasigen Substrats zur Freisetzung hieraus folgendes angeordnet
ist:
- (i) ein markiertes Konjugat, das ein Bindungselement
umfasst, das mit einem ersten Epitop des Analyten reaktionsfähig ist,
markiert mit einem nachweisbaren Marker, und
- (ii) ein einfangbarer Bestandteil, der mit einem zweiten Epitop
des Analyten derart reaktionsfähig
ist, dass, wenn der Analyt in der Probe vorliegt, der Analyt dazu
in der Lage ist, einen Komplex aus dem markierten Konjugat, dem
Analyten und dem einfangbaren Bestandteil zu bilden, und wobei an
dem Einfangmedium des Substrats eine Einfangstelle (34)
zum Einfangen des Komplexes angeordnet ist, wobei die Einfangstelle
daran immobilisiert einen Einfangbestandteil aufweist, der eine
Bindungsaffinität
für den
einfangbaren Bestandteil aufweist.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird ein zweiphasiges Substratelement geschaffen, das ein Freisetzungsmedium
umfasst, das mit einem Einfangmedium verbunden ist, das stromabwärts von
dem Freisetzungsmedium angeordnet ist. Die Freisetzungs- und Einfang-Medien
umfassen zwei unterschiedliche Materialien oder Phasen mit unterschiedlichen
spezifischen Eigenschaften. Die zwei Phasen sind miteinander verbunden,
um einen einzigen Flüssigkeitspfad
derart zu bilden, dass eine Lösungsmittelfront
unbehindert von dem proximalen (stromaufwärts gelegenen) Ende des Freisetzungsmediums
zu dem distalen (stromabwärts gelegenen)
Ende des Einfangmediums wandern kann.
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Das Freisetzungsmedium umfasst ein
saugfähiges,
hydrophiles Material, wie zum Beispiel absorbierendes Papier. Bevorzugte
Materialien zur Verwendung als ein Medium schließen Baumwollfaserpapier, Zellulosepapier
oder Papier ein, das aus Zellulose zusammen mit einem polymeren
Fasermaterial hergestellt ist, wie zum Beispiel Polyamid- oder Reyon-Fasern,
und Glasfasermaterial. Die primäre
Funktion des Freisetzungsmediums ist zunächst die Halterung und nachfolgende
Freisetzung und den Transport verschiedener immunologischer Bestandteile
der Assayeinrichtung, wie zum Beispiel eines markierten Bindungselementes
und eines einfangbaren Bestandteils, die beide eine spezifische
Affinität
für den
interessierenden Analyten haben. Diese Freisetzung und der Transport
erfolgt während
der Routine-Betriebsweise der Assayeinrichtung.
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Das Einfangmedium umfasst ein hydrophiles
Polymermaterial, vorzugsweise eine Nitrozellulose- oder Nylon-Membran.
Die bevorzugten Materialien zur Verwendung als Einfangmedium sind
mikroporöse
Filme oder Membranen, die es ermöglichen,
dass Protein-Reagenzien direkt auf der Membran durch passive Adsorption
immobilisiert werden, ohne dass eine chemische oder physikalische
Fixierung erforderlich ist. Zu diesem Zweck werden Membranen aus
Nitrozellulose, Nylon 66 oder ähnlichen Materialien bevorzugt,
die besonders bevorzugt eine Porengröße in dem Bereich von ungefähr 5 μ bis 20 μ haben. Die
Nitrozellulose-Membran kann ein Nitrozellulose-Material allein oder
ein gemischter Ester von Nitrozellulose sein. Die Nitrozellulose-Membran
ist vorzugsweise auf einen durchscheinenden oder durchsichtigen
Polymerfilm aufgeschichtet oder mit diesem laminiert, um eine mechanische
Halterung für
die Membran zu schaffen. Bei einer derzeit bevorzugten Ausführungsform
wird ein Nitrozellulose-Polymermaterial verwendet, das auf einen Polyesterfilm, wie
zum Beispiel Mylar® gegossen wurde. Alternativ
kann auch eine Nitrozellulose-Membran verwendet werden, die auf
einen Polyesterfilm laminiert wurde. Andere Trägermaterialien als Polyester
können
verwendet werden. Die primäre
Funktion des Einfangmediums besteht in der Immobilisierung eines
immunologischen oder chemischen Affinitätsmittels an einer oder mehreren
Einfangstellen, zum Einfangen der von dem Freisetzungsmedium freigesetzten
Reagenzien.
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Wie dies weiter oben angegeben wurde,
sind die Freisetzungs- und Einfangmedien miteinander verbunden,
um einen einzigen Flüssigkeitspfad
zu bilden. Reagenzien zum Nachweisen, Markieren und Einfangen des
interessierenden Analyten sind auf den Freisetzungs- und Einfangmedien
angeordnet. Auf dem Freisetzungsmedium befindet sich ein Bindungselement,
das mit einem ersten Epitop des interessierenden Analyten reagieren
kann. Das Bindungselement ist mit einem nachweisbaren Marker markiert.
Eine einfangbare Komponente befindet sich auf dem Freisetzungsmedium
stromabwärts
von dem Bindungselement, wobei diese Komponente ein Bindungsmittel
umfasst, das mit einem zweiten Epitop des Analyten und einem Element eines
Affinitätspaares
reagieren kann. Die einfangbare Komponente ist in der Lage, einen
Komplex mit dem markierten Bindungselement und dem Analyten zu bilden.
Das markierte Bindungselement und die einfangbare Komponente sind
beide lösbar
an dem Freisetzungsmedium derart gebunden, dass wenn die Lösungsmittelfront,
die durch die analysierte flüssige
Probe geschaffen wird, durch das Freisetzungsmedium hindurchläuft, das
markierte Bindungselement und die einfangbare Komponente beide von
der Flüssigkeit
lösbar
gemacht werden, und mit dem Lösungsmittel
entlang des Flüssigkeitspfads
strömen.
Wenn im Betrieb irgendein Analyt in der Flüssigkeitsprobe enthalten ist,
reagiert er zunächst
mit dem markierten Bindungselement und dann mit der einfangbaren
Komponente, während
sich die Front durch den Flüssigkeitspfad
hindurch vorwärts bewegt.
Zu dem Zeitpunkt, zu dem die Lösungsmittelfront
den Einfangmediumabschnitt des zweiphasigen Materials erreicht,
wurde der einfangbare Komplex gebildet.
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Die Einfangstelle, die sich auf dem
Erfassungsmedium befindet, umfasst das andere Element des Affinitätspaares,
das für
die einfangbare Komponente spezifisch ist. Das Affinitätselement
wird vorzugsweise durch einfache Adsorption an der Einfangstelle
immobilisiert und bewegt sich nicht mit der Lösungsmittelfront weiter vorwärts.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform
ist eine Kontrollstelle ebenfalls auf dem Einfangmedium stromabwärts von
der Einfangstelle angeordnet. An der Kontrollstelle ist ein Bindungsmittel
immobilisiert, das eine Affinität
zu dem markierten Bindungselement hat. Das Bindungsmittel fängt irgendein
markiertes Bindungselement ein, das nicht an der stromaufwärts gelegenen
Einfangstelle eingefangen wurde. Im Betrieb zeigt das Vorliegen
der nachweisenbaren Markierung an der Kontrollstelle an, dass der
Sorptionstransport richtig gearbeitet hat.
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Die vorliegende Erfindung ergibt
weiterhin eine Vorrichtung zum Nachweis des Vorhandenseins eines Analyten
in einer Flüssigkeitsprobe.
Die Vorrichtung umfasst ein langgestrecktes Gehäuse, dass das zweiphasige Medium
aufnimmt und einen Flüssigkeitsproben-Einlass,
ein Vorratsvolumen, ein Testvolumen, das zwischen dem Einlaß und dem
Vorratsvolumen eingefügt
ist, und ein Fenster durch das Gehäuse zur Beobachtung des Testergebnisses
bildet. Vorzugsweise befinden sich der Probeneinlass und das Fenster
auf gegenüberliegenden
Seiten des Gehäuses.
Das Gehäuse
ist so ausgebildet, dass es die Untersuchungsmaterialien aufnimmt,
die auf dem zweiphasigen Medium aufeinanderfolgend im Inneren des
Gehäuses
angeordnet sind. Die Untersuchungsmaterialien umfassen ein wahlweises
Probenabsorbtionsmittel, das zweiphasige chromatographische Substrat
und ein Vorrats-Absorbierungsmittel. Das chromatographische Medium
ist in dem Gehäuse
derart angeordnet, dass die Einfangstelle und die Kontrollstelle,
falls zutreffend, durch das Fenster sichtbar sind. Das Probenabsorbtionsmittel,
das zweiphasige chromatographische Substrat und das Vorrats-Absorptionsmittel
stehen in Flüssigkeitsverbindung
und bilden zusammen einen Flüssigkeitspfad.
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Bei einer derzeit bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Vorrichtung ein Gehäuse,
das einen Probeneinlaß,
ein Testvolumen und ein Vorratsvolumen bildet. In dem Gehäuse sind
ein Probenabsorptionsmittel, das zweiphasige chromatographische
Substrat und ein Vorrats-Absorptionsmittel angeordnet. Das Probenabsorptionsmittel
ist in dem Gehäuse
gegenüberliegend
zum Probeneinlaß angeordnet.
Stromabwärts
von dem Probenabsorptionsmittel befindet sich das zweiphasige chromatographische
Substrat, das ein Freisetzungsmedium und ein Einfangmedium umfasst,
die miteinander verbunden sind, um einen einzigen Flüssigkeitspfad zu
bilden. Das Freisetzungsmedium umfasst vorzugsweise ein sorbierendes
Papier, und das Einfangmedium umfasst vorzugsweise eine Nitrozellulosemembran.
Die Freisetzungs- und Einfangmedien sind vorzugsweise beide auf
einen transparenten Kunststoff-Film oder eine Kunststoffbahn auflaminiert.
Auf dem Freisetzungsmedium ist folgendes angeordnet: (i) ein Bindungselement,
das ein spezifisches Bindungsprotein umfasst, beispielsweise einen
monoklonalen Antikörper,
der mit einem ersten Epitop des Analyten reagiert, wobei der Antikörper mit
einem optisch nachweisbaren Marker, wie zum Beispiel kolloidalen
Goldteilchen, markiert ist; und (ii) eine einfangbare Komponente,
die ein biotinyliertes Bindungsprotein umfasst, beispielsweise einen
Antikörper,
der vorzugsweise stromabwärts
von dem markierten Antikörper
angeordnet ist. Der biotinylierte Antikörper reagiert mit einem zweiten
Epitop des Analyten und ist in der Lage, einen Komplex mit dem markierten
Antikörper
und dem Analyten zu bilden. Auf dem Einfangmedium ist eine Einfangstelle
zum Einfangen und Immobilisieren des Komplexes angeordnet. Auf der
Einfangstelle ist eine Einfangkomponente immobilisiert, die eine hohe
Affinität
für den
Biotin-Teil des Komplexes hat, vorzugsweise Streptavidin.
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Das zweiphasige chromatographische
Medium umfasst vorzugsweise weiterhin eine Kontrollstelle, die auf
dem Einfangmedium stromabwärts
von der Einfangstelle angeordnet ist. Auf der Kontrollstelle ist
ein Mittel immobilisiert, das in der Lage ist, den markierten Antikörper einzufangen.
Die Hauptfunktion der Kontrollstelle besteht im Einfangen und Immobilisieren
des markierten Antikörpers,
der nicht an der Einfangstelle eingefangen wurde. Bei der derzeit
bevorzugten Ausführungsform
sind auf der Kontrollstelle polyklonale Antiseren immobilisiert,
die für
den markierten Antikörper
spezifisch sind. Das Auftreten von Farbe von den Goldteilchen an der
Kontrollstelle zeigt eine richtige Funktionsweise des Tests an,
unabhängig
von dem Vorliegen oder Nichtvorliegen des Analyten in der Probeneinlaß. Sowohl
die Einfangstelle als auch die Kontrollstelle müssen durch das Fenster des
Gehäuses
sichtbar sein.
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Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung
kommt das proximale Ende des zweiphasigen Substrats mit der zu analysierenden
Flüssigkeitsprobe
in Kontakt. Die Flüssigkeitsprobe
wandert unter Antrieb durch Oberflächeneffekte, wie zum Beispiel
durch eine Kapillarwirkung, entlang des Flüssigkeitspfads, der durch das
Substrat gebildet ist. Wenn der interessierende Analyt in der Probe
vorliegt, reagiert er aufeinanderfolgend mit dem markierten Bindungselement
und der einfangbaren Komponente, wodurch der einfangbare Komplex
gebildet wird, gefolgt von einer Reaktion des Komplexes mit der
immobilisierten Einfangkomponente an der Einfangstelle. Der Prozess
führt dazu,
dass sich der markierte Komplex an der Einfangstelle sammelt. Das
Vorhandensein des Analyten wird durch Beobachten des Vorhandenseins
des nachweisbaren Markers an der Einfangstelle bestimmt. Wenn kein
Analyt in der Probe vorhanden ist, bildet sich der einfangbare Komplex
nicht und es erscheint kein feststellbarer Marker an der Einfangstelle.
Wenn eine Kontrollstelle vorhanden ist, sammeln sich der ungebundene
Komplex oder das freie markierte Bindungselement an der Kontrollstelle.
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Das Verfahren der Erfindung kann
auch so ausgelegt werden, dass übliche „Sandwich"- oder „Wettbewerbs"-Techniken ausgenutzt
werden. Im Fall der Sandwich-Technik umfasst das markierte Bindungselement
einen Antikörper,
der sich an einen Epitop des interessierenden Analyten bindet, um
einen markierten Antikörper-Antigen-Komplex
zu bilden. Dieser Komplex wandert dann zu der Einfangstelle, um
mit einer einfangbaren Komponente zu reagieren, die bei dieser Ausführungsform
einen zweiten Antikörper
umfasst, der für
einen zweiten Epitop des Analyten spezifisch ist. Beispielsweise
kann im Fall von Biotin das Affinitätselement Streptavidin sein.
An der Einfangstelle reagieren der Analyt und der markierte Antikörper mit
dem immobilisierten Einfangelement, um ein „Sandwich" aus dem zweiten Antikörper, dem
Analyten und dem markierten Antikörper zu bilden. Dieser Sandwich-Komplex
wird fortschreitend an der Einfangstelle erzeugt, während die Probe
kontinuierlich vorbeiläuft.
Während
mehr und mehr markiertes Konjugat an der Einfangstelle immobilisiert
wird, sammeln sich die gefärbten
Teilchen und werden durch das Fenster des Gehäuses sichtbar, so dass das
Vorliegen des Analyten in der Flüssigkeitsprobe
angezeigt wird. Sowohl bei Vorhandensein als auch bei Fehlen eines
nachweisbaren Pegels des Analyten, sammeln sich die gefärbten Teilchen
an der Kontrollstelle, die ebenfalls durch das Fenster hindurch
sichtbar ist.
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Im Fall der Wettbewerbs-Technik liegt
eine bekannte Menge des interessierenden Analyten auf dem Freisetzungsmedium
vor, das stromaufwärts
an einem hierfür
spezifischen Antikörper
angeordnet ist. Der in dem Freisetzungsmedium vorhandene Analyt
ist markiert. Der markierte Analyt und das Freisetzungsmedium können beispielsweise
eine authentische Probe des Analyten oder einen Bruchteil hiervon
umfassen, der eine vergleichbare Affinität für den Antikörper hat. Während die Flüssigkeitsprobe
entlang des Freisetzungsmediums transportiert wird, stehen der markierte
Analyt, der auf dem Freisetzungsmedium vorhanden ist, und irgendein
nicht-markierter Analyt, der in der Probe vorhanden ist, in Wettbewerb
für Anbindungsstellen
an dem Antikörper.
Wenn kein Analyt in der Probe vorhanden ist, sammelt sich markiertes
Analyt-Antikörper-Material an
der Einfangstelle, und das Vorhandensein von Farbe zeigt das Fehlen
von nachweisbaren Pegeln des Analyten in der Probe an. Wenn Analyt
vorhanden ist, wird die Menge des markierten Analyten, der sich
an der Teststelle bindet, aufgrund der Bindung des Analyten in der
Probe mit dem Antikörper,
verringert, und es entwickelt sich keine Farbe oder nur eine bleichere
Farbe.
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Alternativ kann das für die „Sandwich"-Assayeinrichtung
beschriebene System verwendet werden. Der für den Analyten spezifische
Antikörper
wird biotinyliert, wobei Streptavidin an der Einfangstelle immobilisiert
wird.
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Die Verwendung des Nachweissystems
mit gefärbten
Teilchen in Kombination mit dem neuartigen zweiphasigen Substrat
ermöglicht
die Konstruktion einer Familie von extrem empfindlichen Untersuchungssystemen,
die das Auftreten von falschen positiven Anzeigen zu einem Minimum
machen, und die effektiv von ungeübten Personen verwendet werden
können.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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Die vorliegende Erfindung wird nunmehr
speziell unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben,
in denen sie erläutert
ist, jedoch in keiner Weise auf diese beschränkt ist, und in denen:
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1A eine
Draufsicht auf eine Ausführungsform
einer Testzelle ist, die bei der Vorrichtung und dem Verfahren der
vorliegenden Erfindung brauchbar ist und ein Anzeigefenster zeigt;
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1B eine
Längs-Seitenansicht
der Vorrichtung nach 1A ist;
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1C eine
Unteransicht der Vorrichtung nach 1A ist;
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1D eine
hintere Endansicht der Vorrichtung nach 1A ist;
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1E eine
perspektivische Ansicht einer derzeit bevorzugten Vorrichtung ist,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung aufgebaut ist;
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2 eine
schematische Draufsicht der Testvorrichtung, die durch ein Probenabsorptionsmittel,
ein zweiphasiges Substrat und Vorratsmaterial gebildet ist;
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3 eine
schematische Draufsicht auf ein zweiphasiges Substrat gemäß der vorliegenden
Erfindung ist;
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4 eine
schematische Seitenansicht der Testvorrichtung nach 2 ist;
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5 eine
schematische Draufsicht auf die Testvorrichtung ist, die gemäß der Erfindung
aufgebaut ist;
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6 eine
schematische Draufsicht auf ein sTestsubstrat zur Verwendung in
einer Tauchstab-Ausführung
der vorliegenden Erfindung ist;
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7 eine
perspektivische Ansicht einer Tauchstab-Ausführungsform einer Testzelle
ist, die bei der Vorrichtung und dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung brauchbar ist.
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In den Zeichnungen bezeichnen gleiche
Bezugsziffern in den jeweiligen Zeichnungsfiguren entsprechende
Teile.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Das Verfahren der Erfindung beinhaltet
die Verwendung eines neuartigen zweiphasigen chromatographischen
Substrats zur Erzielung einer leicht ablesbaren, empfindlichen,
reproduzierbaren Anzeige des Vorliegens eines Analyten, wie zum
Beispiel eines menschlichen Choriongonadotropin (hCG) oder eines
luteinisierenden Hormons (LH), in einer Testprobe, wie zum Beispiel
einer Urinprobe eines Menschen. Das Verfahren und die Vorrichtung
kann weiterhin zur Feststellung des Vorhandenseins von infektiösen Agenzien
im Blut, Plasma, Schleim oder anderen Körperflüssigkeiten verwendet werden.
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Das zweiphasige chromatographische
Substrat der vorliegenden Erfindung bildet die Grundlage für immunologisch
basierte Diagnosetests für
den Nachweis verschiedener Analyten. Die Verwendung des Substrats
in einem Diagnosegerät
ermöglicht
es dem Benutzer, mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit das Vorliegen
oder Nicht-Vorliegen eines biologischen Markers festzustellen, der
eine physiologische Kondition oder einen Zustand anzeigt.
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Das zweiphasige chromatographische
Substrat beinhaltet die Verbindung von zwei unterschiedlichen Medien,
jeweils mit einer speziellen Funktion. Auf dem Freisetzungsmedium
sind zwei trockene, diffundierbare Reagenzien angeordnet: ein Bindungselement,
das spezifisch für
eine bestimmte Stelle an dem Analyten ist, das mit kolloidalem Gold
oder einer anderen direkten Markierung markiert ist, und eine einfangbare
Komponente, die ein Bindungselement umfasst, das für eine andere
Stelle an dem Analyten, konjugiert zu einem Element eines Affinitätspaares,
spezifisch ist. Bei der Rekonstitution und bei Berührung mit
der Testlösung,
und bei Vorliegen des Analyten reagieren die diffundierbaren Reagenzien
mit dem Analyten, um eine diffundierbare Sandwich-Struktur zu bilden,
die durch Kapillarwirkung zu dem Einfangmedium transportiert wird.
Das Einfangmedium enthält
zwei trockene, nicht diffundierbare Reagenzien: eine Einfangkomponente,
die das andere Element des Affinitätspaares umfasst, und ein für das markierte
Bindungselement spezifisches Reagenz. Bei der Diffusion in das Einfangmedium
wird die diffundierbare Sandwich-Struktur durch die Wechselwirkung
des Einfang-Aftinitätselements
mit dem einfangbaren Affinitätsanteil
konzentriert, wodurch sich ein optisches Signal ergibt.
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Das zweiphasige chromatographische
Substrat umfasst ein Freisetzungsmedium, das mit einem Einfangmedium
in einer derartigen Weise verbunden ist, dass ein einziger Flüssigkeitspfad
gebildet wird. Das Freisetzungsmedium ist aus einer Substanz gebildet,
die die Freisetzung von Anzeige-Reagenzien ermöglicht, und das Einfangmedium
ist aus einer Substanz gebildet, die eine Immobilisierung der Reagenzien
zum Nachweis ermöglicht.
Das Freisetzungsmedium besteht vorzugsweise aus hydrophilen saugfähigem Material,
dessen Hauptfunktion darin besteht, verschiedene immunologische
Teile des Tests zu halten, freizusetzen und zu transportieren, wie
zum Beispiel die markierte Testkomponente. Diese Freisetzung und
der Transport erfolgt während
des Routinebetriebs des Testverfahrens. Materialien, die zur Bildung
des Freisetzungsmedium geeignet sind, schließen beispielsweise Baumwollfaserpapier,
wie zum Beispiel S & S
903 und S & S
GB002 (erhältlich
von Schleicher und Schuell, Inc., Keene, N. H.), und BFC 180 (erhältlich von
Whatman, Fairfield, N. J.), und Zellulose-Materialien, wie zum Beispiel
Grade 939 aus Zellulose mit Polyamid und Grade 1281 aus Zellulose
und Reyon mit Polyamid (erhältlich
von Filtertek Inc.) und Glasfaser ein, wie zum Beispiel Lydall Borosilicat
(erhältlich
von Lydall, Inc., Rochester, N. H.). Das Freisetzungsmedium ist
vorzugsweise mit einer wässrigen
Lösung
beschichtet, die Rinder-Serum-Albumin
(BSA) und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, wie
zum Beispiel Triton X-100 (erhältlich
von Rohm & Haas
Co., Philadelphia, PA), um eine nicht-spezifische Bindung zu verhindern
und die Freisetzung der diffundierbaren Reagenzien zu erleichtern.
Eine Kombination von ungefähr
3% BSA und ungefähr
0,1% Triton X-100 ist für
diesen Zweck brauchbar.
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Das Einfangmedium umfasst vorzugsweise
einen mikroporösen
polymerischen Film aus Nitrozellulose, Nylon 66, eine Kombination
dieser zwei oder verschiedene andere Materialien von ähnlicher
Eigenart, die für
den Fachmann bekannt sind. Die Porengröße liegt vorzugsweise in dem
Bereich von ungefähr
5 μ bis
ungefähr
20 μ. Die
Hauptfunktion des Einfangmediums besteht in der Immobilisierung
der nicht-diffundierbaren Reagenzien,
die zum Nachweis des Vorliegens des Analyten in dem Test verwendet
werden. Proteinreagenzien können
auf dem Einfangmedium durch Adsorption immobilisiert werden, ohne
dass die Notwendigkeit chemischer oder physikalischer Modifikationen
besteht. Die Nitrozellulose kann Nitrozellulose allein oder in Kombination
mit einem Ester der Salpetersäure
und/oder anderen Säuren
umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nitrozellulose
direkt auf einen klaren Polymerfilm gegossen. Im Handel verfügbare Polyester-Filme,
wie beispielsweise diejenigen, die unter dem Handelsnamen Mylar® erhältlich sind,
sind für diesen
Zweck brauchbar (Mylar® ist eine Marke der Firma
DuPont DeNemours Company). Die Nitrozellulose-Membran kann durch
allgemein bekannte Techniken hergestellt werden, unter Einschluss
des direkten Gießens
des Nitrozellulose-Polymers
auf eine Polyester-Bahn oder durch Laminieren eines Nitrozellulosefilms
mit einer Polyesterbahn. Vorlaminierte oder vorgegossene Bahnen,
die bei der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind im Handel
erhältlich,
beispielsweise von der Firma Millipore Corporation, Bedford, MA
und Corning Costar, Norristown, PA. Beide Medien weisen die Form
von ebenen Streifen auf, die miteinander verbunden werden, um einen
einzigen Strömungspfad
zu bilden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden das Freisetzungsmedium
und das Einfangmedium durch Überlappen
der stromabwärts
gelegenen Kante des Freisetzungsmediums mit der stromaufwärts gelegenen
Kante des Einfangmediums verbunden, worauf das resultierende zweiphasige
Material mit einem klaren Polymerfilm oder einer -bahn verbunden
wird, wodurch die Medien an ihrem Platz gehalten werden.
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Das Verfahren zur Herstellung des
neuartigen zweiphasigen chromatographischen Mediums, das bei der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird nunmehr beschrieben.
Kurz gesagt sind das Freisetzungsmedium und das Einfangmedium derart
angeordnet, dass sie sich geringfügig überlappen, und ein Klebemittel wird
auf die Rückseite
jedes Mediums aufgebracht (wobei die Rückseite die Seite ist, die
der gegenüberliegt, die
die Reagenzien empfängt).
Das Klebemittel kann irgendein druckempfindliches oder Heißschmelz-Klebemittel
sein, das die Poren des Freisetzungs- oder Einfangmediums nicht
füllt,
wodurch eine unbehinderte Strömung
der Lösungsmittelfront
durch die Medien ermöglicht
wird. Klebemittel, die bei der vorliegenden Erfindung brauchbar
sind, sind im Handel erhältlich,
beispielsweise von Adhesives Research Corp. Bei einer derzeit bevorzugten
Ausführungsform
ist das Klebemittel auf einer klaren Polymer-Unterlage angeordnet.
Die überlappenden
Freisetzungs- und Einfangmedin werden dann durch die Laminierwalzen
einer Laminiermaschine, zusammen mit dem auf der Auflage befindlichen
Klebemittel, hindurchgeführt,
wodurch ein Substrat aus den Einfang- und Freisetzungsmedien, dem
Klebemittel und der Polymer-Unterlage gebildet wird. Das resultierende laminierte
zweiphasige Substrat ist dann zur Aufnahme der Reagenzien bereit,
die als kontinuierliche „Streifen" auf der Oberseite
des Substrats abgeschieden werden. Sobald die Reagenzien abgeschieden
und getrocknet wurden, falls erforderlich, wird das Substrat auf
die gewünschte
Größe zugeschnitten.
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Die diffundierbaren und nicht-diffundierbaren
Reagenzien können
auf das Freisetzungs- bzw. Einfangmedium durch irgendeine gut bekannte
Technik aufgebracht werden. Bei einer derzeit bevorzugten Ausführungsform
werden die diffundierbaren Antikörper-Reagenzien
auf das Freisetzungsmedium durch direktes Aufbringen auf die Oberfläche des
Mediums aufgebracht und getrocknet, um ein schmales Band zu bilden.
Die nicht-diffundierbaren Reagenzien werden auf das Einfangmedium
durch passive Adsorption aufgebracht.
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Zum Gebrauch wird das zweiphasige
chromatographische Substrat in einem Testgerät angeordnet, wobei dieses
Gerät ebenfalls
einen Teil dieser Erfindung bildet. Das Gerät umfasst zumindest ein Gehäuse, das
das zweiphasige System zur Durchführung der Untersuchung umgibt.
Eine bevorzugte Gehäuse-Konfiguration
ist in der Geschmacksmuster-Anmeldung 29/023,294 vom 23. Mai 1994
gezeigt.
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Das Verfahren und die Vorrichtung
oder das Gerät
nach der Erfindung wirken zusammen, um es ungeübten Personen zu ermöglichen,
in zuverlässiger
Weise eine Flüssigkeitsprobe
auf das Vorhandensein von extrem kleinen Mengen eines bestimmten
Analyten zu untersuchen, wobei falsche positive Ergebnisse vermieden
und die Testverfahren vereinfacht werden. Die Erfindung ist ideal
zur Verwendung in direkt verkauften Untersuchungs-Testsätzen, die
es einem Verbraucher ermöglichen,
eine Eigendiagnose, beispielsweise von Schwangerschaft, Eisprung,
Geschlechtskrankheiten und anderen Krankheiten, Infektionen oder
klinischen Abnormalitäten
durchzuführen,
die zu dem Vorliegen einer antigenen Markersubstanz in einer Körperflüssigkeit
führen,
unter Einschluss der Bestimmung des Vorliegens von Metaboliten von
Arzneimitteln oder Toxinen. Das Assay-Verfahren und die Vorrichtung sind so
ausgelegt, dass sie speziell das Vorliegen eines vorher ausgewählten einzelnen
Analyten nachweisen, der in einer Körperflüssigkeit vorhanden ist.
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Zusätzlich zu dem zweiphasigen
chromatographischen Substrat kann die Vorrichtung ein Probenabsorptionsmittel
umfassen, das in dem Gehäuse
in der Nähe
des chromatographischen Substrats und in Strömungsmittelverbindung mit diesem
angeordnet ist. Das Probenabsorptionsmaterial ist vorzugsweise ein saugfähiges, hydrophiles
Material, das die Absorption und den Transport einer Flüssigkeitsprobe
zu dem zweiphasigen chromatographischen Medium erleichtert. Derartige
Materialien können
Zelluloseazetat, hydrophiles Polyestermaterial und andere Materialien
einschließen,
die ähnliche
Eigenschaften haben. Eine Kombination von absorbierenden Materialien
kann ebenfalls verwendet werden. Bevorzugte Materialien schließen gebundenes Zelluloseazetat,
gebundenes Polyolefin oder hydrophilen Polyester ein, wie zum Beispiel
diejenigen Materialien, die im Handel von der American Filtrona
Company (Richmond, VA) erhältlich
sind. Andere bevorzugte Materialien schließen absorbierende Papiere,
wie zum Beispiel Grade 939 oder Grade 1281 von der Firma Filtertek,
Inc. ein. Das Probenabsorptionsmaterial ist vorzugsweise mit einer
gepufferten Lösung
beschichtet, die BSA und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives
Material, wie zum Beispiel Triton X-100, enthält. Das Vorhandensein von BSA
und dem grenzflächenaktiven
Medium verringert eine nicht-spezifische Absorption des Analyten
auf ein Minimum. Eine Konzentration von ungefähr 1% BSA und ungefähr 0,2%
grenzflächenaktivem
Material in tris-Puffer ist für
diesen Zweck wirksam.
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Die Vorrichtung kann weiterhin ein
Vorrats-Absorptionsmaterial umfassen, das stromabwärts von
dem chromatographischen Substrat und in Strömungsmittelverbindung mit diesem
angeordnet ist. Durch die Bereitstellung eines Reservoirs eines
sorbierenden Materials, das jenseits des chromatographischen Substrats
angeordnet ist, kann ein relativ großes Volumen der Testflüssigkeit
und irgendeines darin enthaltenen Analyten durch den Testbereich
hindurchgesogen werden, um die Empfindlichkeit zu unterstützen. Das
Vorratsmaterial umfasst vorzugsweise ein hydrophiles Material, das
das gleiche sein kann, wie das stromaufwärts angeordnete Probenabsorptionsmaterial.
Der Zweck des Vorrats-Absorptionsmaterials besteht darin, die Kapillarwirkung entlang
des chromatographischen Substrats zu erleichtern und um überschüssige Flüssigkeit
zu absorbieren, die in dem Gerät
enthalten ist. Das Vorrats-Absorptionsmaterial
umfasst vorzugsweise absorbierendes Papier, das aus langfaserigen
Baumwollfasern hergestellt ist, wie zum Beispiel S & S 300, S & S 470 und S & S 900 (erhältlich von
Schleicher & Schuell,
Inc.) oder zelluloseartige Materialien, wie zum Beispiel Grade 3MM
(erhältlich
von Whatman) und Grade 320 (erhältlich
von Alhstrom).
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Allgemein kann die Vorrichtung und
das Verfahren gemäß der Erfindung
zum Nachweis irgendeines Analyten verwendet werden, der bisher unter
Verwendung bekannter Immuno-Untersuchungsverfahren untersucht wurde
oder der durch derartige Verfahren nachweisbar ist, wobei polyklonale
oder monoklonale Antikörper
oder andere Proteine verwendet werden. Verschiedene spezifische
Untersuchungsprotokolle, Reagenzien und Analyten, die bei der Durchführung der
Erfindung brauchbar sind, sind als solche bekannt, siehe beispielsweise
das US-Patent 4,313,734
und das US-Patent 4,366,241.
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Die Kombination von Merkmalen, die
für die
ausgezeichnete Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit von Untersuchungen
verantwortlich ist, die gemäß der Erfindung
durchgeführt
werden, ist die Verwendung des neuartigen zweiphasigen chromatographischen
Substrats und die Verwendung eines Metallsalzes oder anderer gefärbter Teilchen
als ein Markierungssystem, das eine direkte visuelle Beobachtung
der Farbentwicklung ermöglicht.
Eine Filtriereinrichtung, die die Einführung von Verunreinigungen
von der Probe an die Teststelle begrenzt, kann ebenfalls eingefügt werden.
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Die Untersuchung wird einfach dadurch
durchgeführt,
dass der Einlass der Vorrichtung in Kontakt mit einer flüssigen Testprobe
gebracht wird. Das Gehäuse
der Vorrichtung kann so konstruiert werden, dass es einen direkten
Kontakt mit einer Körperflüssigkeit
ermöglicht,
oder als Tauchstab zum Eintauchen in einen Behälter mit der Körperflüssigkeit
oder einer anderen Testlösung.
Nach dem Kontakt mit der Testflüssigkeit
wartet man lediglich darauf, dass die Testprobe durch das zweiphasige
chromatographische Substrat hindurch in Reaktionskontakt mit der
Teststelle (und wahlweise einer oder mehreren Kontrollstellen) gelangt,
die durch ein Fenster oder Fenster in dem äußeren Gehäuse der Vorrichtung sichtbar sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform
ist das markierte Bindungselement, das für den Analyten spezifisch ist,
in konservierter Form auf dem Freisetzungsmedium in dem Strömungspfad
im Inneren der Vorrichtung angeordnet. Wenn ein Analyt in der Probe
vorhanden ist, gelangt er durch den Einlass und das Innere der Vorrichtung
entlang des chromatographischen Substrats, wo er bei der Sandwich-Ausführungsform
mit dem markierten Bindungsprotein und einer einfangbaren Komponente
reagiert, die mit einem Affinitätsmittel
konjugiert ist. Der durch den Analyten, das markierte Bindungselement
und das Affinitätskonjugat
gebildete Komplex reagiert dann mit einem Einfang-Affinitätsmittel,
das an der Einfangstelle immobilisiert ist, und das spezifisch für den Affinitätsagenten
auf dem Konjugat ist. An der Einfangstelle bildet sich ein Komplex,
der das immobilisierte Einfangmittel-einfangbare Konjugat-Analytmarkiertes
Bindungselement umfasst. Das Vorliegen des Komplexes und damit des
Analyten wird durch die Entwicklung von Farbe angezeigt, die durch
die Ansammlung der Metallsalzteilchen an der Einfangstelle hervorgerufen
wird.
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Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich,
dass der Erfolg des Testverfahrens davon abhängt, dass ein in der Probe
vorliegender Analyt mit dem markierten Bindungselement reagiert
oder davon, dass ein reproduzierbarer Wettbewerb zwischen dem Analyten
und dem Bindungselement für
Anhaftungsstellen an der Einfangstelle erfolgt. Gemäß der Erfindung
sind das markierte Bindungselement und das einfangbare Konjugat
vorzugsweise in konservierter Form, beispielsweise luftgetrocknet
oder gefriergetrocknet, auf dem Freisetzungsmedium in der Vorrichtung
stromaufwärts
von den Einfang- und Kontrollstellen angeordnet. Irgendein Analyt, der
durch die Vorrichtung hindurchgeführt wird und von der Flüssigkeit
mitgeführt
wird, bewegt sich in Kontakt mit dem markierten Bindungselement
und der einfangbaren Komponente, wodurch ein Immunkomplex gebildet
oder ein Wettbewerb in situ eingeleitet wird, während die Strömung fortgesetzt
wird, wobei dieser Komplex schließlich von den auf dem Einfangmedium
immobilisierten Reagenzien eingefangen wird.
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Unter Bezugnahme auf die Zeichnungen
zeigen die 1A–E schematisch eine Ausführungsform einer Testvorrichtung 5,
die gemäß der Erfindung
konstruiert ist und zur Erläuterung
ihrer Konstruktionsprinzipien brauchbar ist. Die Vorrichtung umfasst
ein äußeres geformtes
Gehäuse 10,
das eine hohle, langgestreckte Umschließung bildet. Das Gehäuse 10 bildet
einen Testflüssigkeitseinlass 14 und
eine Öffnung 16,
die ein Fenster bildet, durch das die Einfang- und Kontrollstellen
sichtbar sind. Wie dies in den 1A–E gezeigt ist, ist das Fenster 16 auf
einer dem Probeneinlass 14 gegenüberliegenden Seite des Gehäuses 10 angeordnet. Diese
Konfiguration verringert das Auftreten von Verunreinigungen der
Teststelle, die im Inneren des Gehäuses 10 angeordnet
ist und durch das Fenster 16 freiliegt. Das Gehäuse 10 bildet
weiterhin Entlüftungsöffnungen 38, 40 und 42,
die entlang der Seiten und am distalen Ende des Gehäuses 10 angeordnet
sind. Die Entlüftungsöffnung 38 verringert
das Auftreten einer „Dampfsperre" in der Vorrichtung
während
des Gebrauchs. Das Vorhandensein der Öffnungen 40 und 42 trägt zur Verringerung
eines „Flutens" des chromatographischen Substrats
bei, das Auftreten kann, wenn der Benutzer zu viel Probe auf die
Vorrichtung aufbringt.
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2 zeigt
schematisch eine bevorzugte Ausführungsform
der Untersuchungsmaterialien, die, wenn die Vorrichtung vollständig zusammengebaut
ist, im Inneren des Gehäuses 10 angeordnet
sind. Die Untersuchungsmaterialien umfassen absorbierendes Material 12,
das zweiphasige chromatographische Substrat 18 und das
Vorratsmaterial 24. Die Untersuchungsmaterialien und das
Innere des Gehäuses 10 bilden
zusammen einen Strömungspfad,
der allgemein von rechts nach links in den 1A, B und C verläuft.
Wenn die Testvorrichtung so angeordnet wird, dass der Einlass 14 in
einer Flüssigkeitsprobe
angeordnet ist oder auf andere Weise mit dieser in Kontakt gelangt,
so wird die Flüssigkeit
durch Kapillarwirkung, durch Dochtwirkung oder durch einfaches Benetzen
entlang des Strömungspfads
stromabwärts
durch das absorbierende Material 12, entlang des chromatographischen
Substrats 18 und in das Vorratsmaterial 24 transportiert,
wie dies allgemein durch den Pfeil angezeigt ist. Absorbierendes
Material 12, das einwärts
von dem Einlass 14 angeordnet ist, dient weiterhin als
ein Filter, das teilchenförmiges
Material und störende
Faktoren von verunreinigten Testproben entfernen kann.
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3 zeigt
schematisch das zweiphasige chromatographische Substrat 18,
das ein Freisetzungsmedium 30 und ein Einfangmedium 32 umfasst.
Auf dem Freisetzungsmedium 30 ist lösbar ein Band 26 des
dehydrierten markierten Bindungselements angeordnet, beispielsweise
ein Antikörper-Metallsalz.
Wenn sich die Flüssigkeitsprobe
an dem Band 26 vorbeibewegt, wird das markierte Bindungselement
in der Flüssigkeit
mitgenommen, wieder hergestellt und es reagiert oder steht im Wettbewerb
mit irgendeinem anderen Analyten, der in der Flüssigkeitsprobe enthalten ist.
Stromabwärts
von dem markierten Bindungselement befindet sich ein Band 28 des
dehydrierten einfangbaren Komplexes. Der einfangbare Komplex umfasst
ein Bindungselement, das sich an einen zweiten Epitop des Analyten
bindet, beispielsweise an einen Antikörper, und eine einfangbare
Affinitätskomponente,
beispielsweise Biotin. Der einfangbare Komplex wird ebenfalls von
der Flüssigkeitsprobe
mitgenommen, während
sich diese entlang des Substrats 18 vorwärts bewegt.
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Auf dem Einfangmedium 32 sind
jeweils die Einfangstelle 34 und die Kontrollstelle 36 immobilisiert.
In 3 sind die Kontroll-
und Einfangstellen so dargestellt, als ob sie in Reihe entlang des
Strömungspfads
angeordnet sind. Alternativ können
die Kontroll- und Einfangstelle oder -stellen Seite an Seite oder
in anderen räumlichen
Beziehungen angeordnet sein. Die Einfangstelle 34 umfasst
eine vor ausgewählte
Menge eines Einfang-Aftinitätselements,
das spezifisch für
die auf dem Freisetzungsmedium angeordnete einfangbare Affinitätskomponente
ist. Die einfangbare Komponente ist an ihrem Platz innerhalb des
Strömungspfads
immobilisiert. Wenn beispielsweise das einfangbare Affinitätselement
Biotin ist, so kann die Einfangkomponente Streptavidin sein. Die
Kontrollstelle 36 umfasst immobilisierte Antiseren oder
Antikörper,
die für
das markierte Bindungselement spezifisch sind.
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4 zeigt
schematisch eine Seitenansicht des Betriebsteils der Untersuchungsmaterialien.
Wie dies gezeigt ist, ist das absorbierende Material 12 benachbart
zu dem Freisetzungsmedium 30 angeordnet, und überlappt
das Freisetzungsmedium 30 an einem Ende. Das Freisetzungsmedium 30 überlappt
seinerseits das Einfangmedium 32, das distal zum Freisetzungsmedium 30 angeordnet
ist. Das Vorratsmaterial 24 überlappt das distale Ende des
Einfangmediums 32. Diese vier Komponenten bilden zusammen
einen einzigen Strömungsmittelpfad
und wirken zusammen, um ein Strömen
der Flüssigkeitsprobe
von dem absorbierenden Material 12 entlang des Freisetzungsmediums 30 und
des Einfangmediums 32 in das Vorratsmaterial 24 hervorzurufen.
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5 zeigt
schematisch eine derzeit bevorzugte Ausführungsform des Betriebsteils
der Untersuchungsvorrichtung. Wie dies gezeigt ist, ist auf dem
Freisetzungsmedium 30 in lösbarer oder freisetzbarer Weise
ein Band aus markiertem Bindungselement 26 angeordnet,
das bei der bevorzugten Ausführungsform
ein monoklonaler Antikörper
ist, der mit Goldsalzteilchen konjugiert ist. Stromabwärts von
dem Band 26 befindet sich ein Band 28, das die
einfangbare Komponente umfasst, die bei der bevorzugten Ausführungsform
ein zweiter monoklonaler Antikörper
ist, der für
den mit Biotin konjugierten gleichen Analyten spezifisch ist. Das Band 28 ist
ebenfalls freisetzbar auf dem Freisetzungsmedium 30 angeordnet.
Stromabwärts
von dem Freisetzungsmedium 30 befindet sich das Einfangmedium 32,
auf dem die Einfangstelle 34 immobilisiert ist, die bei
der bevorzugten Ausführungsform
Streptavidin ist. Auf dem Einfangsmedium 32 stromabwärts von
der Einfangstelle 34 befindet sich die Kontrollstelle 36,
die bei der bevorzugten Ausführungsform
aus polyklonalen Antiseren besteht, die für den markierten Antikörper des
Bands 26 spezifisch sind.
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Die Erfindung ist nicht auf die präzise Art
der Einfangstelle 34 und der entsprechenden Kontrollstelle 36 beschränkt, und
tatsächlich
kann die Kontrollstelle 36 vollständig fortgelassen werden, wenn
dies erwünscht
ist. Allgemein kann ein Antikörper
oder ein anderes Affinitätsmittel
an der Einfangstelle 34 und der Kontrollstelle 36,
unter Verwendung einer Absorption, einer Adsorption oder einer ionischen
oder kovalenten Kopplung, entsprechend als solcher bekannter Verfahren,
immobilisiert werden. Das Einfangmedium 32 ist vorzugsweise
so ausgewählt,
das es die Einfangreagenzien ohne die Notwendigkeit einer chemischen
Kopplung bindet. Nitrozellulose und Nylon ermöglichen beide eine nicht-chemische
Bindung der Einfangkomponente und des Kontrollreagenz.
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Wie dies in 5 gezeigt
ist, ist stromabwärts
von dem Einfangmedium 32 ein Vorratsmaterial 24 angeordnet,
das eine relativ große
Masse an absorbierendem oder superabsorbierendem Material umfasst.
Der Zweck des Vorratsmaterials 24 besteht darin, sicherzustellen,
dass eine annehmbar große
Menge der Testflüssigkeit
durch das chromatographische Medium hindurchgesaugt wird.
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6 ist
eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Untersuchungs-materialien,
die bei der Durchführung
von Tauchstab-Untersuchungen
brauchbar ist. Bei der dargestellten Ausführungsform ist das Probenabsorptionsmaterial 12 fortgelassen,
und das Freisetzungsmedium 30 wirkt als das Proben-Absorptionsmaterial.
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Polyklonale Antiseren und monoklonale
Antikörper
oder Bruchteile hiervon mit spezifischen Bindungseigenschaften und
hoher Affinität
für praktisch
jede Antigen-Substanz,
die bei der vorliegenden Erfindung als Bindungselemente und Einfangmaterialien
brauchbar sind, sind bekannt und im Handel erhältlich, oder sie können aus
stabilen Zellensträngen
unter Verwendung gut bekannter Zellenverschmelzungs- und Auswahl-Techniken
erzeugt werden. Die Literatur ist voll von Protokollen zur Erzeugung
und Immobilisierung von Protein. Siehe beispielsweise die Veröffentlichung
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Tijssen,
Bd. 15, Practice and Theory of Enzyme immunoassays, Kapitel 13,
The Immobilization of Immunoreactants on Solid Phases, S. 297–328 und
die darin genannten Referenzen.
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Metallsalze und andere Arten von
gefärbten
Teilchen, die als Marker-Substanzen in Immuno-Untersuchungsverfahren
geeignet sind, sind ebenfalls als solche bekannt. Siehe beispielsweise
das US-Patent 4,313,734. Hinsichtlich der Einzelheiten und Verfahrensprinzipien,
die bei der Synthese von gefärbten
Teilchen-Konjugaten beteiligt sind, sei auf Horisberger, Evaluation
of Colloidal Gold as a Cytochromic Marker for Transmission and Scanning
Electron Microscopy, Biol. Cellulaire, 36, 253–258 (1979); Leuvering et al., „Sol Particle
Immunoassay", J.
Immunoassay, 1 (1): 77–91
(1980), and Frens „Controlled
Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse
Gold Suspensions",
Nature, Physical Science, 241: 20–22 (1973) verwiesen.
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Bei einer derzeit bevorzugten Ausführungsform
ist die Immunoassay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung so ausgelegt,
dass sie die Schwangerschaft beim Menschen feststellt. Bei dieser
Ausführungsform
ist das markierte Bindungselement ein monoklonaler Antikörper (MAb)
gegen menschliches Choriongonadotropin (hCG), das mit kolloidalem
Gold markiert ist. Für
diesen Zweck wird MAb mit der Bezeichnung 2G9 (erhältlich von
Carter-Wallace, Inc.) bevorzugt. Anti-hCG-Antikörper, die mit Biotin markiert
sind, werden für
den einfangbaren Komplex verwendet. Monoklonale Antikörper, die
für diesen
Zweck verwendet werden können,
schließen
die hCG-spezifischen monoklonalen Antikörper mit den Bezeichnungen
2B2 und B109 (erhältlich
von Carter-Wallace, Inc.) und CCFO-(erhältlich
vom Scripps Laboratory) ein. Verfahren zum Konjugieren von Biotin
mit Antikörpern
sind gut bekannt und bilden keinen Teil der vorliegenden Erfindung.
Bei der derzeit bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Einfangstelle Streptavidin, das eine hohe Affinität für Biotin
hat. Eine Kontrollstelle befindet sich vorzugsweise stromabwärts von
der Einfangstelle. Auf der Kontrollstelle ist Ziegen-Anti-Maus-IgG
immobilisiert, das für
das markierte Anti-hCG spezifisch ist (erhältlich von Scantibodies Laboratory).
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Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist die vorliegende Immuno-Probenvorrichtung
zur Feststellung des Eisprungs beim Menschen bestimmt. Bei dieser
Ausführungsform
umfasst das markierte Bindungselement MAb 2G9, das für luteinisiertes
Hormon (LH) und hCG spezifisch ist, markiert mit kolloidalem Gold.
Der einfangbare Komplex umfasst biotinyliertes LH-spezifisches MAb
LH26 (erhältlich
von Carter-Wallace, Inc.). Die Einfangstelle umfasst vorzugsweise
Streptavidin, und die Kontrollstelle umfasst Ziegen-Anti-Maus-IgG,
das für
das markierte MAb spezifisch ist.
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Bei einer anderen Ausführungsform
kann die Vorrichtung zur Feststellung infektiöser Stoffe, wie zum Beispiel
Streptococcus, angepasst sein. Bei dieser Ausführungsform ist das markierte
Bindungselement ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der spezifisch für Streptococcus
ist und mit kolloidalem Gold oder einem anderen direkten Marker
markiert ist. Der einfangbare Komplex ist der gleiche polyklonale
Antikörper
konjugiert mit Biotin, und die Einfang- und Kontrollkomponenten
umfassen Streptavidin und Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG.
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Das Gehäuse 10 kann verschiedene
Formen annehmen. Es wird typischerweise ein langgestrecktes Gehäuse umfassen,
das ineinander passende Teile umfasst, die aus Kunststoffmaterial,
wie zum Beispiel Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polystyrol oder
Polyethylen hergestellt sind. Der innere Strömungspfad des Gehäuses enthält ein relativ
inertes Material oder eine Kombination von Materialien, die zur
Erleichterung des Transports der Flüssigkeit geeignet sind. Das
Gehäuse 10 kann
für einen
direkten Kontakt mit einer Probenflüssigkeit ausgebildet sein,
wie dies in der in den 1A–E gezeigten Ausführungsform gezeigt ist, oder
es kann in Form eines Tauchstabs ausgebildet sein, der hier nicht
gezeigt ist, jedoch in der Technik gut bekannt ist.
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Aus dem Vorstehenden dürfte ersichtlich
sein, dass die Vorteile der Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit
und der Vermeidung falscher Positivanzeigen von Assaysystemen, die
gemäß der Erfindung
aufgebaut sind, auf eine Kombination von Merkmalen der Erfindung
zurückzuführen sind.
Im Gebrauch führt
das zweiphasige chromatographische Substrat zu einem wirkungsvollen
Transport der Reagenzien, was einen empfindlicheren Nachweis des
Analyten ermöglicht.
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Die vorliegende Erfindung wird nun
weiter speziell unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.
In den Beispielen werden die Testvorrichtungen unter Bezugnahme
auf die 1 bis 6 der beigefügten Zeichnungen
beschrieben, die weiter oben kurz beschrieben wurden.
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Beispiele
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Schwangerschaftstest
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Die derzeit bevorzugte Konfiguration
für das
Gehäuse
der Testvorrichtung, das die Erfindung beinhaltet, ist in den 1A–E gezeigt.
Die derzeit bevorzugte Konfiguration der Testmaterialien, unter
Einschluss des Probenabsorptionsmaterials, des zweiphasigen chromatographischen
Substrats und des Vorratsmaterials, ist in den 2 bis 5 gezeigt.
Eine Modifikation der in den 2 bis 5 gezeigten Testmaterialien ist in 6 gezeigt.
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Wie dies in den 1A–E gezeigt ist, umfasst die bevorzugte Testzelle
der Erfindung ein Paar von ineinander passenden Polymerteilen, die
im zusammengebauten Zustand der Vorrichtung eine Umschließung bilden.
Das Gehäuse 10 ist
so konstruiert, dass es das zweiphasige chromatographische Substrat
und die dazugehörenden
absorbierenden Materialien nach den 2 bis 5 aufnimmt. Die Untersuchungsmaterialien
sind innerhalb des Gehäuses 10 derart
angeordnet, dass die klare Polymerunterlage 46 gegenüberliegend
zu dem Fenster 16 (1A)
angeordnet ist. Die Ergebnisse der Untersuchung können durch
die klare Polymerschicht 46 hindurch abgelesen werden,
und das Vorhandensein der Schicht 46 verhindert eine Verunreinigung
der Teststelle während
des Gebrauchs. Im Betrieb wird Testflüssigkeit, die durch den Einlass 14 aufgebracht
wird, durch das Probenabsorptionsmaterial 12 absorbiert
und sickert entlang des chromatographischen Substrats 18,
das den Strömungspfad
bildet, in das Vorratsvolumen 24. In der Tauchstab-Ausführungsform
ist das chromatographische Substrat nach 6, das kein absorbierendes Material 12 aufweist,
in einem Gehäuse
angeordnet, das zu seiner Aufnahme ausgebildet ist, und das in 7 gezeigt ist.
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Bei der derzeit am stärksten bevorzugten
Ausführungsform
ist das absorbierende Material 12 gebundenes hydrophiles
Polyester-Material (American Filtrona), das Freisetzungs-medium
ist entweder S&S
903 Papier oder S&S
GB002-Papier (beides von Schleicher & Schuell), das Einfangmedium ist
eine Nitrozellulose-Membran,
die auf klares Polyethylen-terephthalat (PET) gegossen (oder auflaminiert)
ist (erhältlich
von Millipore Corporation), das Vorratsmaterial 24 ist
S&S 300-Papier
(Schleicher & Schuell).
Die Freisetzungs- und Einfangmedien wurden auf 5/1000 Zoll klares
PET aufgeschichtet, das mit einem Klebemittel vorbeschichtet war
(erhältlich
von Adhesives Research). Die Abmessungen des absorbierenden Materials 12 betrugen
ungefähr
5,0 × 1,27 × 0,25 cm
(2,0 × 0,5 × 0,1 Zoll)
auf jeder Seite. Die Abmessungen des Freisetzungsmediums 32 des
zweiphasigen chromatographischen Substrats 18 sind vorzugsweise
2,8 × 0,8 × 0,06 cm
(1,1 × 0,32 × 0,025
Zoll), und für
das Einfangmedium ungefähr
2,5 × 0,8 × 0,018
cm (1 × 0,32 × 0,007
Zoll). Die Abmessungen des Vorrats-Absorptionskissens sind ungefähr 2,0 × 0,26 × 1,06 cm
(0,8 × 0,1 × 0,4 Zoll).
Eine Anzahl dieser Substrate wurde erzeugt und weiterbehandelt,
um sie zum Nachweis der Schwangerschaft durch Untersuchung von Urin
auf das Vorhandensein des Choriongonadotropins (hCG) des Menschen
auszubilden. Die Testreagenzien waren monoklonale hCG-Antikörper 2G9
(beschafft von Carter-Wallace, Inc.), markiert mit kolloidalem Gold
in einer Größe von 15–30 nm,
biotinylierter hCG-spezifischer monoklonaler Antikörper CCF01
(beschafft von Scripps Laboratory), Streptavidin, lyophilisiertes
Material, das in Phosphatpuffer auf eine Konzentration von 2 mg/ml
rekonstituiert wurde; und Ziegen-Anti-Maus-IgG, eine Lösung die
auf eine Konzentration von 1 mg/ml in Phosphatpuffer eingestellt
wurde. Die Testreagenzien wurden auf den Medien angeordnet, wie dies
in den 3 und 5 gezeigt ist.
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Test-Protokoll
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Zwei Proben der Schwangerschaft-Untersuchungsvorrichtung
wurden unter Verwendung des zweiphasigen chromatographischen Mediums
zubereitet, wie dies weiter oben beschrieben wurde. Eine mit „Test 1" bezeichnete Probe
wurde unter Verwendung einer Nitrozellulose-Membran, die auf einem
Polyesterfilm auflaminiert wurde, als Einfangmedium zubereitet.
Die andere Probe, die mit „Test
2" bezeichnet wurde,
wurde unter Verwendung einer nitrozellularen Membran, die auf eine
Polyester-Unterlage gegossen wurde, als das Einfangmedium zubereitet.
Alle anderen Merkmale des zweiphasigen chromatographischen Mediums
waren identisch.
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Der Test wurde durch Aufbringen von
Lösungen,
die bekannte Mengen von im Handel erhältlichen hCG enthalten, auf
das proximate Ende des chromatographischen Mediums ausgeführt, wobei
man die Testlösungen
durch Kapillarwirkung durch das zweiphasige Medium wandern ließ.
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Zum Vergleich wurde ein im Handel
erhältlicher
Schwangerschafts-Testsatz (First ResponseTM,
Carter-Wallace, Inc., New York, NY) dem gleichen Verfahren unterworfen.
Der im Handel erhältliche
Testsatz verwendet ein Einphasen-Chromatographie-Medium,
das aus hydrophilem Zellulosematerial besteht. Die Unterschiede
zwischen den Testproben und dem im Handel erhältlichen Test sind in der Tabelle
1 gezeigt.
-
-
Die Ergebnisse des Testverfahrens
sind in Tabelle 2 gezeigt:
-
Tabelle
2
Vergleich der Reaktionszeiten für im Handel erhältliche
und verbesserte Schwangerschaftstests
-
Die rosa Farbe war klar bei 50 mIU
des Choriongonadotropins des Menschen für beide Testproben sichtbar,
jedoch nicht für
das im Handel erhältliche
Produkt. Die Ergebnisse zeigen an, dass der Test der vorliegenden
Erfindung die Schwangerschaft bei einem Menschen so früh wie am
Tag einer ausgebliebenen Menstruationsperiode nachweisen kann. In
den Anfangsstufen des Testens wurden ungefähr 50 negative Proben von verschiedenen
Quellen durchlaufen, ohne dass sich falsche Positivanzeigen oder
selbst Grenzfälle ergeben.
Im Gegensatz hierzu zeigte bei 50 mIU an hCG der im Handel erhältliche
Schwangerschaftstest ein negatives Ergebnis.
-
Die Tabelle 3 zeigt die Mengen an
Reagenzien, die für
den Schwangerschaftstest (Test 2) unter Verwendung des zweiphasigen
Substrats der vorliegenden Erfindung verglichen mit dem im Handel
erhältlichen Test
erforderlich sind. Wie dies in Tabelle 3 gezeigt ist, erfordern
die Testvorrichtungen der vorliegenden Erfindung beträchlich weniger
Reagenzien und sind (wie dies in Tabelle 2 gezeigt ist) sowohl empfindlicher
als auch genauer.
-
Tabelle
3
Vergleich des Reagenz-Verbauchs
-
Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse von
tatsächlichen
Versuchen, die unter Verwendung der vorliegenden Schwangerschafts-Testvorrichtung
ausgeführt
wurden. Alle in Tabelle 4 aufgeführten
Versionen enthalten das vorstehend beschriebene zweiphasige Medium
und die Reagenzien, unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der Form
des Gehäuses 10.
Es wurde überraschend
festgestellt, dass bestimmte mechanische Modifikationen an dem Gehäuse 10,
insbesondere die Einführung
der Entlüftungsöffnungen 38, 40 und 42 (1B, 1E) zu einer beträchtlich höheren Genauigkeit und weniger
ungültigen
Ergebnissen führte.
Die Unterschiede zwischen den verschiedenen in Tabelle 4 gezeigten
Versionen sind wie folgt:
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Version 1
-
Diese Version hatte lange Pfosten,
die leicht zerbrochen wurden, wenn die Bestandteile in Kunststoffbeuteln
aufbewahrt wurden. Die Teile fielen leicht auseinander, wenn sie
von einer Tischplatte fielen.
-
Version 2
-
In dieser Version wurden die Pfosten
verkürzt,
um ein Brechen zu beseitigen. Ein Urinstop wurde hinzugefügt, um zu
verhindern, dass Urin das Freisetzungsmedium umgeht und die Membran
benetzt.
-
Version 3
-
Diese Version wies zusätzliche
Pfosten auf, um zu verhindern, dass die Vorrichtung auseinanderfiel, wenn
sie herunterfiel. Zusätzliche
Urinstops wurden eingeführt,
um ein Fluten der Membran weiter zu verhindern. Ein Querbalken wurde
an dem oberen Gehäuse
hinzugefügt,
um das stromaufwärts
gelegene Absorptionsmittel gegen die Membran zu drücken und
die Probenströmung
und die Freisetzung von Gold zu unterstützen.
-
Version 4
-
Vorrichtungen der Version 4 wurden
durch manuelles Einschneiden von Entlüftungsöffnungen in die Vorrichtung
modifiziert. Zwei lange Seiten-Entlüftungsöffnungen
und eine kurze Basis-Entlüftungsöffnung wurden
in das obere Gehäuse
eingeschnitten, um eine Membran-Flutung zu verhindern.
-
Modifizierte Version 4
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Vorrichtungen der Version 4 wurden
dadurch modifiziert, dass ein Fenster in das obere Gehäuse ähnlich zu
dem Urin-Sammelbereich auf dem unteren Gehäuse eingeschnitten wurde. Diese
Vorrichtung wurde als „zweiseitig" bezeichnet – Probe
konnte auf entweder die Vorderseite oder Rückseite der Vorrichtung aufgebracht
werden.
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Die Version 5 stellt die derzeit
bevorzugte Ausführungsform
der Schwangerschafts-Testvorrichtung dar.
Wie dies in Tabelle 4 gezeigt ist, wurden die Tests alle in weniger
als fünf
Minuten und ohne ungültige
Ergebnisse abgeschlossen.