DE69630295T2 - Diagnostische vorrichtung und verfahren - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung eines Analyten, wie zum Beispiel eines Antigens, in einer Flüssigkeitsprobe, wie zum Beispiel Körperflüssigkeit. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis eines Analyten in einer Körperflüssigkeit unter Verwendung einer mit lateraler Strömung arbeitenden Testzelle, die ein neuartiges zweiphasiges chromatographisches Substrat enthält.
  • Es wurden viele Arten von Ligand-Rezeptor-Bestimmungen verwendet, um das Vorhandensein verschiedener Substanzen in Körperflüssigkeiten, wie zum Beispiel Urin oder Blut, festzustellen. Diese Bestimmungen beinhalten typischerweise Antigen-Antikörper-Reaktionen, synthetische Konjugate, die enzymatische, fluoreszierende oder visuell beobachtbare Marken umfassen, und speziell konstruierte Reaktorkammern. Bei den meisten dieser Bestimmungs- oder Assay-Einrichtungen gibt es einen Rezeptor (beispielsweise einen Antikörper), der für das ausgewählte Antigen spezifisch ist, sowie Einrichtungen zur Feststellung des Vorhandenseins und/oder der Menge des Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukts. Die meisten heutigen Tests sind so ausgelegt, dass sie eine quantitative Bestimmung durchführen, doch ist in manchen Fällen alles was erforderlich ist, eine positiv/negativ Anzeige. Beispiele derartiger qualitativer Proben schließen die Blut-Typisierung, den Schwangerschaftstest und viele Arten der Urinanalyse ein. Für diese Tests werden optisch beobachtbare Anzeigen, wie zum Beispiel das Vorhandensein einer Agglutination oder einer Farbänderung bevorzugt.
  • Die „positiv/negativ"-Assayeinrichtungen müssen sehr empfindlich sein, weil die Konzentration des interessierenden Liganden in der Testflüssigkeit in vielen Fällen klein ist. Fehlerhafte Positivanzeigen können problematisch sein, insbesondere bei der Agglutination und anderen Schnelldetektionsverfahren, wie zum Beispiel Eintauch- und Farbänderungs-Tests. Aufgrund dieser Probleme wurden Sandwich-Assays und andere empfindliche Nachweisverfahren entwickelt, die Metallsalze und andere Arten von gefärbten Teilchen verwenden. Diese Techniken haben jedoch nicht alle die Probleme gelöst, die bei diesen Schnellnachweisverfahren auftreten. Es sind ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Nachweiseinrichtung und ein Verfahren zu schaffen, die bzw. das eine größere Empfindlichkeit und ein Unterscheidungsvermögen für interessierende Analyten hat. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Assayeinrichtung, die in der Herstellung einfacher ist.
  • Die folgenden Dokumente offenbaren Diagnose-Nachweiseinrichtungen: WO-A-91/12528, WO-A-94/01775, WO-A-94/15215, DE-A-4314493, EP-A-374684, EP-A-0582231, EP-A-560411, WO-A-94/06012. Keines dieser Dokumente offenbart jedoch Einrichtungen, die zweiphasige chromatographische Substrate der Art umfassen, die hier beschrieben und beansprucht werden.
  • Die WO 91/12528 beschreibt ein immunochromatographischen Teststreifen, der ein Konjugat (i), das aus kolloidialem Gold besteht, das mit einem Antikörper zu dem Antigen (hCG) konjugiert ist; einen einfangbaren Bestandteil (ii), der einen biotinylierten zweiten Antikörper zu dem Antigen umfasst, und eine Einfangstelle aufweist, die aus Latex und dem Avidin-Komplex besteht.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ergibt eine schnelle, empfindliche Vorrichtung und ein Verfahren zur Feststellung des Vorhandenseins von Analyten in Körperflüssigkeiten. Das Verfahren und die Vorrichtung haben eine hohe Empfindlichkeit und führen praktisch zu keinen falschen Positivanzeigen. Die Verwendung der vorliegenden Vorrichtung und des Verfahrens ergibt ein Assaysystem, das eine minimale Anzahl von Verfahrensschritten beinhaltet, und in reproduzierbarer Weise zuverlässige Ergebnisse selbst dann ergibt, wenn es von ungeübten Personen verwendet wird.
  • Die Vorrichtung und das Verfahren verwenden ein neuartiges zweiphasiges chromatographisches Medium, das die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit der Bestimmung verbessert. Entsprechend ergibt die Erfindung in einem ersten Gesichtspunkt eine Vorrichtung (5) zur Feststellung des Vorhandenseins eines Analyten in einer flüssigen Probe, bei der eine an einem proximalen Ende einer Vorrichtung aufgebrachte flüssige Probe stromabwärts entlang eines Flüssigkeitswegs zu einem distalen Ende der Vorrichtung wandert, wobei die Vorrichtung folgendes umfasst:
    ein zweiphasiges Substrat (18), das ein Freisetzungsmedium (30) aus einem ersten saugfähigen hydrophilen Material und in Flüssigkeitsverbindung und stromabwärts hiervon ein Einfangmedium (32) aus einem zweiten, anderen mikroporösen, hydrophilen Polymermaterial umfasst, wobei an dem Freisetzungsmedium des zweiphasigen Substrats zur Freisetzung hieraus folgendes angeordnet ist:
    • (i) ein markiertes Konjugat, das ein Bindungselement umfasst, das mit einem ersten Epitop des Analyten reaktionsfähig ist, markiert mit einem nachweisbaren Marker, und
    • (ii) ein einfangbarer Bestandteil, der mit einem zweiten Epitop des Analyten derart reaktionsfähig ist, dass, wenn der Analyt in der Probe vorliegt, der Analyt dazu in der Lage ist, einen Komplex aus dem markierten Konjugat, dem Analyten und dem einfangbaren Bestandteil zu bilden, und wobei an dem Einfangmedium des Substrats eine Einfangstelle (34) zum Einfangen des Komplexes angeordnet ist, wobei die Einfangstelle daran immobilisiert einen Einfangbestandteil aufweist, der eine Bindungsaffinität für den einfangbaren Bestandteil aufweist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein zweiphasiges Substratelement geschaffen, das ein Freisetzungsmedium umfasst, das mit einem Einfangmedium verbunden ist, das stromabwärts von dem Freisetzungsmedium angeordnet ist. Die Freisetzungs- und Einfang-Medien umfassen zwei unterschiedliche Materialien oder Phasen mit unterschiedlichen spezifischen Eigenschaften. Die zwei Phasen sind miteinander verbunden, um einen einzigen Flüssigkeitspfad derart zu bilden, dass eine Lösungsmittelfront unbehindert von dem proximalen (stromaufwärts gelegenen) Ende des Freisetzungsmediums zu dem distalen (stromabwärts gelegenen) Ende des Einfangmediums wandern kann.
  • Das Freisetzungsmedium umfasst ein saugfähiges, hydrophiles Material, wie zum Beispiel absorbierendes Papier. Bevorzugte Materialien zur Verwendung als ein Medium schließen Baumwollfaserpapier, Zellulosepapier oder Papier ein, das aus Zellulose zusammen mit einem polymeren Fasermaterial hergestellt ist, wie zum Beispiel Polyamid- oder Reyon-Fasern, und Glasfasermaterial. Die primäre Funktion des Freisetzungsmediums ist zunächst die Halterung und nachfolgende Freisetzung und den Transport verschiedener immunologischer Bestandteile der Assayeinrichtung, wie zum Beispiel eines markierten Bindungselementes und eines einfangbaren Bestandteils, die beide eine spezifische Affinität für den interessierenden Analyten haben. Diese Freisetzung und der Transport erfolgt während der Routine-Betriebsweise der Assayeinrichtung.
  • Das Einfangmedium umfasst ein hydrophiles Polymermaterial, vorzugsweise eine Nitrozellulose- oder Nylon-Membran. Die bevorzugten Materialien zur Verwendung als Einfangmedium sind mikroporöse Filme oder Membranen, die es ermöglichen, dass Protein-Reagenzien direkt auf der Membran durch passive Adsorption immobilisiert werden, ohne dass eine chemische oder physikalische Fixierung erforderlich ist. Zu diesem Zweck werden Membranen aus Nitrozellulose, Nylon 66 oder ähnlichen Materialien bevorzugt, die besonders bevorzugt eine Porengröße in dem Bereich von ungefähr 5 μ bis 20 μ haben. Die Nitrozellulose-Membran kann ein Nitrozellulose-Material allein oder ein gemischter Ester von Nitrozellulose sein. Die Nitrozellulose-Membran ist vorzugsweise auf einen durchscheinenden oder durchsichtigen Polymerfilm aufgeschichtet oder mit diesem laminiert, um eine mechanische Halterung für die Membran zu schaffen. Bei einer derzeit bevorzugten Ausführungsform wird ein Nitrozellulose-Polymermaterial verwendet, das auf einen Polyesterfilm, wie zum Beispiel Mylar® gegossen wurde. Alternativ kann auch eine Nitrozellulose-Membran verwendet werden, die auf einen Polyesterfilm laminiert wurde. Andere Trägermaterialien als Polyester können verwendet werden. Die primäre Funktion des Einfangmediums besteht in der Immobilisierung eines immunologischen oder chemischen Affinitätsmittels an einer oder mehreren Einfangstellen, zum Einfangen der von dem Freisetzungsmedium freigesetzten Reagenzien.
  • Wie dies weiter oben angegeben wurde, sind die Freisetzungs- und Einfangmedien miteinander verbunden, um einen einzigen Flüssigkeitspfad zu bilden. Reagenzien zum Nachweisen, Markieren und Einfangen des interessierenden Analyten sind auf den Freisetzungs- und Einfangmedien angeordnet. Auf dem Freisetzungsmedium befindet sich ein Bindungselement, das mit einem ersten Epitop des interessierenden Analyten reagieren kann. Das Bindungselement ist mit einem nachweisbaren Marker markiert. Eine einfangbare Komponente befindet sich auf dem Freisetzungsmedium stromabwärts von dem Bindungselement, wobei diese Komponente ein Bindungsmittel umfasst, das mit einem zweiten Epitop des Analyten und einem Element eines Affinitätspaares reagieren kann. Die einfangbare Komponente ist in der Lage, einen Komplex mit dem markierten Bindungselement und dem Analyten zu bilden. Das markierte Bindungselement und die einfangbare Komponente sind beide lösbar an dem Freisetzungsmedium derart gebunden, dass wenn die Lösungsmittelfront, die durch die analysierte flüssige Probe geschaffen wird, durch das Freisetzungsmedium hindurchläuft, das markierte Bindungselement und die einfangbare Komponente beide von der Flüssigkeit lösbar gemacht werden, und mit dem Lösungsmittel entlang des Flüssigkeitspfads strömen. Wenn im Betrieb irgendein Analyt in der Flüssigkeitsprobe enthalten ist, reagiert er zunächst mit dem markierten Bindungselement und dann mit der einfangbaren Komponente, während sich die Front durch den Flüssigkeitspfad hindurch vorwärts bewegt. Zu dem Zeitpunkt, zu dem die Lösungsmittelfront den Einfangmediumabschnitt des zweiphasigen Materials erreicht, wurde der einfangbare Komplex gebildet.
  • Die Einfangstelle, die sich auf dem Erfassungsmedium befindet, umfasst das andere Element des Affinitätspaares, das für die einfangbare Komponente spezifisch ist. Das Affinitätselement wird vorzugsweise durch einfache Adsorption an der Einfangstelle immobilisiert und bewegt sich nicht mit der Lösungsmittelfront weiter vorwärts.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Kontrollstelle ebenfalls auf dem Einfangmedium stromabwärts von der Einfangstelle angeordnet. An der Kontrollstelle ist ein Bindungsmittel immobilisiert, das eine Affinität zu dem markierten Bindungselement hat. Das Bindungsmittel fängt irgendein markiertes Bindungselement ein, das nicht an der stromaufwärts gelegenen Einfangstelle eingefangen wurde. Im Betrieb zeigt das Vorliegen der nachweisenbaren Markierung an der Kontrollstelle an, dass der Sorptionstransport richtig gearbeitet hat.
  • Die vorliegende Erfindung ergibt weiterhin eine Vorrichtung zum Nachweis des Vorhandenseins eines Analyten in einer Flüssigkeitsprobe. Die Vorrichtung umfasst ein langgestrecktes Gehäuse, dass das zweiphasige Medium aufnimmt und einen Flüssigkeitsproben-Einlass, ein Vorratsvolumen, ein Testvolumen, das zwischen dem Einlaß und dem Vorratsvolumen eingefügt ist, und ein Fenster durch das Gehäuse zur Beobachtung des Testergebnisses bildet. Vorzugsweise befinden sich der Probeneinlass und das Fenster auf gegenüberliegenden Seiten des Gehäuses. Das Gehäuse ist so ausgebildet, dass es die Untersuchungsmaterialien aufnimmt, die auf dem zweiphasigen Medium aufeinanderfolgend im Inneren des Gehäuses angeordnet sind. Die Untersuchungsmaterialien umfassen ein wahlweises Probenabsorbtionsmittel, das zweiphasige chromatographische Substrat und ein Vorrats-Absorbierungsmittel. Das chromatographische Medium ist in dem Gehäuse derart angeordnet, dass die Einfangstelle und die Kontrollstelle, falls zutreffend, durch das Fenster sichtbar sind. Das Probenabsorbtionsmittel, das zweiphasige chromatographische Substrat und das Vorrats-Absorptionsmittel stehen in Flüssigkeitsverbindung und bilden zusammen einen Flüssigkeitspfad.
  • Bei einer derzeit bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung ein Gehäuse, das einen Probeneinlaß, ein Testvolumen und ein Vorratsvolumen bildet. In dem Gehäuse sind ein Probenabsorptionsmittel, das zweiphasige chromatographische Substrat und ein Vorrats-Absorptionsmittel angeordnet. Das Probenabsorptionsmittel ist in dem Gehäuse gegenüberliegend zum Probeneinlaß angeordnet. Stromabwärts von dem Probenabsorptionsmittel befindet sich das zweiphasige chromatographische Substrat, das ein Freisetzungsmedium und ein Einfangmedium umfasst, die miteinander verbunden sind, um einen einzigen Flüssigkeitspfad zu bilden. Das Freisetzungsmedium umfasst vorzugsweise ein sorbierendes Papier, und das Einfangmedium umfasst vorzugsweise eine Nitrozellulosemembran. Die Freisetzungs- und Einfangmedien sind vorzugsweise beide auf einen transparenten Kunststoff-Film oder eine Kunststoffbahn auflaminiert. Auf dem Freisetzungsmedium ist folgendes angeordnet: (i) ein Bindungselement, das ein spezifisches Bindungsprotein umfasst, beispielsweise einen monoklonalen Antikörper, der mit einem ersten Epitop des Analyten reagiert, wobei der Antikörper mit einem optisch nachweisbaren Marker, wie zum Beispiel kolloidalen Goldteilchen, markiert ist; und (ii) eine einfangbare Komponente, die ein biotinyliertes Bindungsprotein umfasst, beispielsweise einen Antikörper, der vorzugsweise stromabwärts von dem markierten Antikörper angeordnet ist. Der biotinylierte Antikörper reagiert mit einem zweiten Epitop des Analyten und ist in der Lage, einen Komplex mit dem markierten Antikörper und dem Analyten zu bilden. Auf dem Einfangmedium ist eine Einfangstelle zum Einfangen und Immobilisieren des Komplexes angeordnet. Auf der Einfangstelle ist eine Einfangkomponente immobilisiert, die eine hohe Affinität für den Biotin-Teil des Komplexes hat, vorzugsweise Streptavidin.
  • Das zweiphasige chromatographische Medium umfasst vorzugsweise weiterhin eine Kontrollstelle, die auf dem Einfangmedium stromabwärts von der Einfangstelle angeordnet ist. Auf der Kontrollstelle ist ein Mittel immobilisiert, das in der Lage ist, den markierten Antikörper einzufangen. Die Hauptfunktion der Kontrollstelle besteht im Einfangen und Immobilisieren des markierten Antikörpers, der nicht an der Einfangstelle eingefangen wurde. Bei der derzeit bevorzugten Ausführungsform sind auf der Kontrollstelle polyklonale Antiseren immobilisiert, die für den markierten Antikörper spezifisch sind. Das Auftreten von Farbe von den Goldteilchen an der Kontrollstelle zeigt eine richtige Funktionsweise des Tests an, unabhängig von dem Vorliegen oder Nichtvorliegen des Analyten in der Probeneinlaß. Sowohl die Einfangstelle als auch die Kontrollstelle müssen durch das Fenster des Gehäuses sichtbar sein.
  • Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kommt das proximale Ende des zweiphasigen Substrats mit der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe in Kontakt. Die Flüssigkeitsprobe wandert unter Antrieb durch Oberflächeneffekte, wie zum Beispiel durch eine Kapillarwirkung, entlang des Flüssigkeitspfads, der durch das Substrat gebildet ist. Wenn der interessierende Analyt in der Probe vorliegt, reagiert er aufeinanderfolgend mit dem markierten Bindungselement und der einfangbaren Komponente, wodurch der einfangbare Komplex gebildet wird, gefolgt von einer Reaktion des Komplexes mit der immobilisierten Einfangkomponente an der Einfangstelle. Der Prozess führt dazu, dass sich der markierte Komplex an der Einfangstelle sammelt. Das Vorhandensein des Analyten wird durch Beobachten des Vorhandenseins des nachweisbaren Markers an der Einfangstelle bestimmt. Wenn kein Analyt in der Probe vorhanden ist, bildet sich der einfangbare Komplex nicht und es erscheint kein feststellbarer Marker an der Einfangstelle. Wenn eine Kontrollstelle vorhanden ist, sammeln sich der ungebundene Komplex oder das freie markierte Bindungselement an der Kontrollstelle.
  • Das Verfahren der Erfindung kann auch so ausgelegt werden, dass übliche „Sandwich"- oder „Wettbewerbs"-Techniken ausgenutzt werden. Im Fall der Sandwich-Technik umfasst das markierte Bindungselement einen Antikörper, der sich an einen Epitop des interessierenden Analyten bindet, um einen markierten Antikörper-Antigen-Komplex zu bilden. Dieser Komplex wandert dann zu der Einfangstelle, um mit einer einfangbaren Komponente zu reagieren, die bei dieser Ausführungsform einen zweiten Antikörper umfasst, der für einen zweiten Epitop des Analyten spezifisch ist. Beispielsweise kann im Fall von Biotin das Affinitätselement Streptavidin sein. An der Einfangstelle reagieren der Analyt und der markierte Antikörper mit dem immobilisierten Einfangelement, um ein „Sandwich" aus dem zweiten Antikörper, dem Analyten und dem markierten Antikörper zu bilden. Dieser Sandwich-Komplex wird fortschreitend an der Einfangstelle erzeugt, während die Probe kontinuierlich vorbeiläuft. Während mehr und mehr markiertes Konjugat an der Einfangstelle immobilisiert wird, sammeln sich die gefärbten Teilchen und werden durch das Fenster des Gehäuses sichtbar, so dass das Vorliegen des Analyten in der Flüssigkeitsprobe angezeigt wird. Sowohl bei Vorhandensein als auch bei Fehlen eines nachweisbaren Pegels des Analyten, sammeln sich die gefärbten Teilchen an der Kontrollstelle, die ebenfalls durch das Fenster hindurch sichtbar ist.
  • Im Fall der Wettbewerbs-Technik liegt eine bekannte Menge des interessierenden Analyten auf dem Freisetzungsmedium vor, das stromaufwärts an einem hierfür spezifischen Antikörper angeordnet ist. Der in dem Freisetzungsmedium vorhandene Analyt ist markiert. Der markierte Analyt und das Freisetzungsmedium können beispielsweise eine authentische Probe des Analyten oder einen Bruchteil hiervon umfassen, der eine vergleichbare Affinität für den Antikörper hat. Während die Flüssigkeitsprobe entlang des Freisetzungsmediums transportiert wird, stehen der markierte Analyt, der auf dem Freisetzungsmedium vorhanden ist, und irgendein nicht-markierter Analyt, der in der Probe vorhanden ist, in Wettbewerb für Anbindungsstellen an dem Antikörper. Wenn kein Analyt in der Probe vorhanden ist, sammelt sich markiertes Analyt-Antikörper-Material an der Einfangstelle, und das Vorhandensein von Farbe zeigt das Fehlen von nachweisbaren Pegeln des Analyten in der Probe an. Wenn Analyt vorhanden ist, wird die Menge des markierten Analyten, der sich an der Teststelle bindet, aufgrund der Bindung des Analyten in der Probe mit dem Antikörper, verringert, und es entwickelt sich keine Farbe oder nur eine bleichere Farbe.
  • Alternativ kann das für die „Sandwich"-Assayeinrichtung beschriebene System verwendet werden. Der für den Analyten spezifische Antikörper wird biotinyliert, wobei Streptavidin an der Einfangstelle immobilisiert wird.
  • Die Verwendung des Nachweissystems mit gefärbten Teilchen in Kombination mit dem neuartigen zweiphasigen Substrat ermöglicht die Konstruktion einer Familie von extrem empfindlichen Untersuchungssystemen, die das Auftreten von falschen positiven Anzeigen zu einem Minimum machen, und die effektiv von ungeübten Personen verwendet werden können.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Die vorliegende Erfindung wird nunmehr speziell unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen sie erläutert ist, jedoch in keiner Weise auf diese beschränkt ist, und in denen:
  • 1A eine Draufsicht auf eine Ausführungsform einer Testzelle ist, die bei der Vorrichtung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbar ist und ein Anzeigefenster zeigt;
  • 1B eine Längs-Seitenansicht der Vorrichtung nach 1A ist;
  • 1C eine Unteransicht der Vorrichtung nach 1A ist;
  • 1D eine hintere Endansicht der Vorrichtung nach 1A ist;
  • 1E eine perspektivische Ansicht einer derzeit bevorzugten Vorrichtung ist, die gemäß der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist;
  • 2 eine schematische Draufsicht der Testvorrichtung, die durch ein Probenabsorptionsmittel, ein zweiphasiges Substrat und Vorratsmaterial gebildet ist;
  • 3 eine schematische Draufsicht auf ein zweiphasiges Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung ist;
  • 4 eine schematische Seitenansicht der Testvorrichtung nach 2 ist;
  • 5 eine schematische Draufsicht auf die Testvorrichtung ist, die gemäß der Erfindung aufgebaut ist;
  • 6 eine schematische Draufsicht auf ein sTestsubstrat zur Verwendung in einer Tauchstab-Ausführung der vorliegenden Erfindung ist;
  • 7 eine perspektivische Ansicht einer Tauchstab-Ausführungsform einer Testzelle ist, die bei der Vorrichtung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbar ist.
  • In den Zeichnungen bezeichnen gleiche Bezugsziffern in den jeweiligen Zeichnungsfiguren entsprechende Teile.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Das Verfahren der Erfindung beinhaltet die Verwendung eines neuartigen zweiphasigen chromatographischen Substrats zur Erzielung einer leicht ablesbaren, empfindlichen, reproduzierbaren Anzeige des Vorliegens eines Analyten, wie zum Beispiel eines menschlichen Choriongonadotropin (hCG) oder eines luteinisierenden Hormons (LH), in einer Testprobe, wie zum Beispiel einer Urinprobe eines Menschen. Das Verfahren und die Vorrichtung kann weiterhin zur Feststellung des Vorhandenseins von infektiösen Agenzien im Blut, Plasma, Schleim oder anderen Körperflüssigkeiten verwendet werden.
  • Das zweiphasige chromatographische Substrat der vorliegenden Erfindung bildet die Grundlage für immunologisch basierte Diagnosetests für den Nachweis verschiedener Analyten. Die Verwendung des Substrats in einem Diagnosegerät ermöglicht es dem Benutzer, mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit das Vorliegen oder Nicht-Vorliegen eines biologischen Markers festzustellen, der eine physiologische Kondition oder einen Zustand anzeigt.
  • Das zweiphasige chromatographische Substrat beinhaltet die Verbindung von zwei unterschiedlichen Medien, jeweils mit einer speziellen Funktion. Auf dem Freisetzungsmedium sind zwei trockene, diffundierbare Reagenzien angeordnet: ein Bindungselement, das spezifisch für eine bestimmte Stelle an dem Analyten ist, das mit kolloidalem Gold oder einer anderen direkten Markierung markiert ist, und eine einfangbare Komponente, die ein Bindungselement umfasst, das für eine andere Stelle an dem Analyten, konjugiert zu einem Element eines Affinitätspaares, spezifisch ist. Bei der Rekonstitution und bei Berührung mit der Testlösung, und bei Vorliegen des Analyten reagieren die diffundierbaren Reagenzien mit dem Analyten, um eine diffundierbare Sandwich-Struktur zu bilden, die durch Kapillarwirkung zu dem Einfangmedium transportiert wird. Das Einfangmedium enthält zwei trockene, nicht diffundierbare Reagenzien: eine Einfangkomponente, die das andere Element des Affinitätspaares umfasst, und ein für das markierte Bindungselement spezifisches Reagenz. Bei der Diffusion in das Einfangmedium wird die diffundierbare Sandwich-Struktur durch die Wechselwirkung des Einfang-Aftinitätselements mit dem einfangbaren Affinitätsanteil konzentriert, wodurch sich ein optisches Signal ergibt.
  • Das zweiphasige chromatographische Substrat umfasst ein Freisetzungsmedium, das mit einem Einfangmedium in einer derartigen Weise verbunden ist, dass ein einziger Flüssigkeitspfad gebildet wird. Das Freisetzungsmedium ist aus einer Substanz gebildet, die die Freisetzung von Anzeige-Reagenzien ermöglicht, und das Einfangmedium ist aus einer Substanz gebildet, die eine Immobilisierung der Reagenzien zum Nachweis ermöglicht. Das Freisetzungsmedium besteht vorzugsweise aus hydrophilen saugfähigem Material, dessen Hauptfunktion darin besteht, verschiedene immunologische Teile des Tests zu halten, freizusetzen und zu transportieren, wie zum Beispiel die markierte Testkomponente. Diese Freisetzung und der Transport erfolgt während des Routinebetriebs des Testverfahrens. Materialien, die zur Bildung des Freisetzungsmedium geeignet sind, schließen beispielsweise Baumwollfaserpapier, wie zum Beispiel S & S 903 und S & S GB002 (erhältlich von Schleicher und Schuell, Inc., Keene, N. H.), und BFC 180 (erhältlich von Whatman, Fairfield, N. J.), und Zellulose-Materialien, wie zum Beispiel Grade 939 aus Zellulose mit Polyamid und Grade 1281 aus Zellulose und Reyon mit Polyamid (erhältlich von Filtertek Inc.) und Glasfaser ein, wie zum Beispiel Lydall Borosilicat (erhältlich von Lydall, Inc., Rochester, N. H.). Das Freisetzungsmedium ist vorzugsweise mit einer wässrigen Lösung beschichtet, die Rinder-Serum-Albumin (BSA) und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, wie zum Beispiel Triton X-100 (erhältlich von Rohm & Haas Co., Philadelphia, PA), um eine nicht-spezifische Bindung zu verhindern und die Freisetzung der diffundierbaren Reagenzien zu erleichtern. Eine Kombination von ungefähr 3% BSA und ungefähr 0,1% Triton X-100 ist für diesen Zweck brauchbar.
  • Das Einfangmedium umfasst vorzugsweise einen mikroporösen polymerischen Film aus Nitrozellulose, Nylon 66, eine Kombination dieser zwei oder verschiedene andere Materialien von ähnlicher Eigenart, die für den Fachmann bekannt sind. Die Porengröße liegt vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr 5 μ bis ungefähr 20 μ. Die Hauptfunktion des Einfangmediums besteht in der Immobilisierung der nicht-diffundierbaren Reagenzien, die zum Nachweis des Vorliegens des Analyten in dem Test verwendet werden. Proteinreagenzien können auf dem Einfangmedium durch Adsorption immobilisiert werden, ohne dass die Notwendigkeit chemischer oder physikalischer Modifikationen besteht. Die Nitrozellulose kann Nitrozellulose allein oder in Kombination mit einem Ester der Salpetersäure und/oder anderen Säuren umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nitrozellulose direkt auf einen klaren Polymerfilm gegossen. Im Handel verfügbare Polyester-Filme, wie beispielsweise diejenigen, die unter dem Handelsnamen Mylar® erhältlich sind, sind für diesen Zweck brauchbar (Mylar® ist eine Marke der Firma DuPont DeNemours Company). Die Nitrozellulose-Membran kann durch allgemein bekannte Techniken hergestellt werden, unter Einschluss des direkten Gießens des Nitrozellulose-Polymers auf eine Polyester-Bahn oder durch Laminieren eines Nitrozellulosefilms mit einer Polyesterbahn. Vorlaminierte oder vorgegossene Bahnen, die bei der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind im Handel erhältlich, beispielsweise von der Firma Millipore Corporation, Bedford, MA und Corning Costar, Norristown, PA. Beide Medien weisen die Form von ebenen Streifen auf, die miteinander verbunden werden, um einen einzigen Strömungspfad zu bilden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden das Freisetzungsmedium und das Einfangmedium durch Überlappen der stromabwärts gelegenen Kante des Freisetzungsmediums mit der stromaufwärts gelegenen Kante des Einfangmediums verbunden, worauf das resultierende zweiphasige Material mit einem klaren Polymerfilm oder einer -bahn verbunden wird, wodurch die Medien an ihrem Platz gehalten werden.
  • Das Verfahren zur Herstellung des neuartigen zweiphasigen chromatographischen Mediums, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird nunmehr beschrieben. Kurz gesagt sind das Freisetzungsmedium und das Einfangmedium derart angeordnet, dass sie sich geringfügig überlappen, und ein Klebemittel wird auf die Rückseite jedes Mediums aufgebracht (wobei die Rückseite die Seite ist, die der gegenüberliegt, die die Reagenzien empfängt). Das Klebemittel kann irgendein druckempfindliches oder Heißschmelz-Klebemittel sein, das die Poren des Freisetzungs- oder Einfangmediums nicht füllt, wodurch eine unbehinderte Strömung der Lösungsmittelfront durch die Medien ermöglicht wird. Klebemittel, die bei der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind im Handel erhältlich, beispielsweise von Adhesives Research Corp. Bei einer derzeit bevorzugten Ausführungsform ist das Klebemittel auf einer klaren Polymer-Unterlage angeordnet. Die überlappenden Freisetzungs- und Einfangmedin werden dann durch die Laminierwalzen einer Laminiermaschine, zusammen mit dem auf der Auflage befindlichen Klebemittel, hindurchgeführt, wodurch ein Substrat aus den Einfang- und Freisetzungsmedien, dem Klebemittel und der Polymer-Unterlage gebildet wird. Das resultierende laminierte zweiphasige Substrat ist dann zur Aufnahme der Reagenzien bereit, die als kontinuierliche „Streifen" auf der Oberseite des Substrats abgeschieden werden. Sobald die Reagenzien abgeschieden und getrocknet wurden, falls erforderlich, wird das Substrat auf die gewünschte Größe zugeschnitten.
  • Die diffundierbaren und nicht-diffundierbaren Reagenzien können auf das Freisetzungs- bzw. Einfangmedium durch irgendeine gut bekannte Technik aufgebracht werden. Bei einer derzeit bevorzugten Ausführungsform werden die diffundierbaren Antikörper-Reagenzien auf das Freisetzungsmedium durch direktes Aufbringen auf die Oberfläche des Mediums aufgebracht und getrocknet, um ein schmales Band zu bilden. Die nicht-diffundierbaren Reagenzien werden auf das Einfangmedium durch passive Adsorption aufgebracht.
  • Zum Gebrauch wird das zweiphasige chromatographische Substrat in einem Testgerät angeordnet, wobei dieses Gerät ebenfalls einen Teil dieser Erfindung bildet. Das Gerät umfasst zumindest ein Gehäuse, das das zweiphasige System zur Durchführung der Untersuchung umgibt. Eine bevorzugte Gehäuse-Konfiguration ist in der Geschmacksmuster-Anmeldung 29/023,294 vom 23. Mai 1994 gezeigt.
  • Das Verfahren und die Vorrichtung oder das Gerät nach der Erfindung wirken zusammen, um es ungeübten Personen zu ermöglichen, in zuverlässiger Weise eine Flüssigkeitsprobe auf das Vorhandensein von extrem kleinen Mengen eines bestimmten Analyten zu untersuchen, wobei falsche positive Ergebnisse vermieden und die Testverfahren vereinfacht werden. Die Erfindung ist ideal zur Verwendung in direkt verkauften Untersuchungs-Testsätzen, die es einem Verbraucher ermöglichen, eine Eigendiagnose, beispielsweise von Schwangerschaft, Eisprung, Geschlechtskrankheiten und anderen Krankheiten, Infektionen oder klinischen Abnormalitäten durchzuführen, die zu dem Vorliegen einer antigenen Markersubstanz in einer Körperflüssigkeit führen, unter Einschluss der Bestimmung des Vorliegens von Metaboliten von Arzneimitteln oder Toxinen. Das Assay-Verfahren und die Vorrichtung sind so ausgelegt, dass sie speziell das Vorliegen eines vorher ausgewählten einzelnen Analyten nachweisen, der in einer Körperflüssigkeit vorhanden ist.
  • Zusätzlich zu dem zweiphasigen chromatographischen Substrat kann die Vorrichtung ein Probenabsorptionsmittel umfassen, das in dem Gehäuse in der Nähe des chromatographischen Substrats und in Strömungsmittelverbindung mit diesem angeordnet ist. Das Probenabsorptionsmaterial ist vorzugsweise ein saugfähiges, hydrophiles Material, das die Absorption und den Transport einer Flüssigkeitsprobe zu dem zweiphasigen chromatographischen Medium erleichtert. Derartige Materialien können Zelluloseazetat, hydrophiles Polyestermaterial und andere Materialien einschließen, die ähnliche Eigenschaften haben. Eine Kombination von absorbierenden Materialien kann ebenfalls verwendet werden. Bevorzugte Materialien schließen gebundenes Zelluloseazetat, gebundenes Polyolefin oder hydrophilen Polyester ein, wie zum Beispiel diejenigen Materialien, die im Handel von der American Filtrona Company (Richmond, VA) erhältlich sind. Andere bevorzugte Materialien schließen absorbierende Papiere, wie zum Beispiel Grade 939 oder Grade 1281 von der Firma Filtertek, Inc. ein. Das Probenabsorptionsmaterial ist vorzugsweise mit einer gepufferten Lösung beschichtet, die BSA und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Material, wie zum Beispiel Triton X-100, enthält. Das Vorhandensein von BSA und dem grenzflächenaktiven Medium verringert eine nicht-spezifische Absorption des Analyten auf ein Minimum. Eine Konzentration von ungefähr 1% BSA und ungefähr 0,2% grenzflächenaktivem Material in tris-Puffer ist für diesen Zweck wirksam.
  • Die Vorrichtung kann weiterhin ein Vorrats-Absorptionsmaterial umfassen, das stromabwärts von dem chromatographischen Substrat und in Strömungsmittelverbindung mit diesem angeordnet ist. Durch die Bereitstellung eines Reservoirs eines sorbierenden Materials, das jenseits des chromatographischen Substrats angeordnet ist, kann ein relativ großes Volumen der Testflüssigkeit und irgendeines darin enthaltenen Analyten durch den Testbereich hindurchgesogen werden, um die Empfindlichkeit zu unterstützen. Das Vorratsmaterial umfasst vorzugsweise ein hydrophiles Material, das das gleiche sein kann, wie das stromaufwärts angeordnete Probenabsorptionsmaterial. Der Zweck des Vorrats-Absorptionsmaterials besteht darin, die Kapillarwirkung entlang des chromatographischen Substrats zu erleichtern und um überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren, die in dem Gerät enthalten ist. Das Vorrats-Absorptionsmaterial umfasst vorzugsweise absorbierendes Papier, das aus langfaserigen Baumwollfasern hergestellt ist, wie zum Beispiel S & S 300, S & S 470 und S & S 900 (erhältlich von Schleicher & Schuell, Inc.) oder zelluloseartige Materialien, wie zum Beispiel Grade 3MM (erhältlich von Whatman) und Grade 320 (erhältlich von Alhstrom).
  • Allgemein kann die Vorrichtung und das Verfahren gemäß der Erfindung zum Nachweis irgendeines Analyten verwendet werden, der bisher unter Verwendung bekannter Immuno-Untersuchungsverfahren untersucht wurde oder der durch derartige Verfahren nachweisbar ist, wobei polyklonale oder monoklonale Antikörper oder andere Proteine verwendet werden. Verschiedene spezifische Untersuchungsprotokolle, Reagenzien und Analyten, die bei der Durchführung der Erfindung brauchbar sind, sind als solche bekannt, siehe beispielsweise das US-Patent 4,313,734 und das US-Patent 4,366,241.
  • Die Kombination von Merkmalen, die für die ausgezeichnete Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit von Untersuchungen verantwortlich ist, die gemäß der Erfindung durchgeführt werden, ist die Verwendung des neuartigen zweiphasigen chromatographischen Substrats und die Verwendung eines Metallsalzes oder anderer gefärbter Teilchen als ein Markierungssystem, das eine direkte visuelle Beobachtung der Farbentwicklung ermöglicht. Eine Filtriereinrichtung, die die Einführung von Verunreinigungen von der Probe an die Teststelle begrenzt, kann ebenfalls eingefügt werden.
  • Die Untersuchung wird einfach dadurch durchgeführt, dass der Einlass der Vorrichtung in Kontakt mit einer flüssigen Testprobe gebracht wird. Das Gehäuse der Vorrichtung kann so konstruiert werden, dass es einen direkten Kontakt mit einer Körperflüssigkeit ermöglicht, oder als Tauchstab zum Eintauchen in einen Behälter mit der Körperflüssigkeit oder einer anderen Testlösung. Nach dem Kontakt mit der Testflüssigkeit wartet man lediglich darauf, dass die Testprobe durch das zweiphasige chromatographische Substrat hindurch in Reaktionskontakt mit der Teststelle (und wahlweise einer oder mehreren Kontrollstellen) gelangt, die durch ein Fenster oder Fenster in dem äußeren Gehäuse der Vorrichtung sichtbar sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das markierte Bindungselement, das für den Analyten spezifisch ist, in konservierter Form auf dem Freisetzungsmedium in dem Strömungspfad im Inneren der Vorrichtung angeordnet. Wenn ein Analyt in der Probe vorhanden ist, gelangt er durch den Einlass und das Innere der Vorrichtung entlang des chromatographischen Substrats, wo er bei der Sandwich-Ausführungsform mit dem markierten Bindungsprotein und einer einfangbaren Komponente reagiert, die mit einem Affinitätsmittel konjugiert ist. Der durch den Analyten, das markierte Bindungselement und das Affinitätskonjugat gebildete Komplex reagiert dann mit einem Einfang-Affinitätsmittel, das an der Einfangstelle immobilisiert ist, und das spezifisch für den Affinitätsagenten auf dem Konjugat ist. An der Einfangstelle bildet sich ein Komplex, der das immobilisierte Einfangmittel-einfangbare Konjugat-Analytmarkiertes Bindungselement umfasst. Das Vorliegen des Komplexes und damit des Analyten wird durch die Entwicklung von Farbe angezeigt, die durch die Ansammlung der Metallsalzteilchen an der Einfangstelle hervorgerufen wird.
  • Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, dass der Erfolg des Testverfahrens davon abhängt, dass ein in der Probe vorliegender Analyt mit dem markierten Bindungselement reagiert oder davon, dass ein reproduzierbarer Wettbewerb zwischen dem Analyten und dem Bindungselement für Anhaftungsstellen an der Einfangstelle erfolgt. Gemäß der Erfindung sind das markierte Bindungselement und das einfangbare Konjugat vorzugsweise in konservierter Form, beispielsweise luftgetrocknet oder gefriergetrocknet, auf dem Freisetzungsmedium in der Vorrichtung stromaufwärts von den Einfang- und Kontrollstellen angeordnet. Irgendein Analyt, der durch die Vorrichtung hindurchgeführt wird und von der Flüssigkeit mitgeführt wird, bewegt sich in Kontakt mit dem markierten Bindungselement und der einfangbaren Komponente, wodurch ein Immunkomplex gebildet oder ein Wettbewerb in situ eingeleitet wird, während die Strömung fortgesetzt wird, wobei dieser Komplex schließlich von den auf dem Einfangmedium immobilisierten Reagenzien eingefangen wird.
  • Unter Bezugnahme auf die Zeichnungen zeigen die 1AE schematisch eine Ausführungsform einer Testvorrichtung 5, die gemäß der Erfindung konstruiert ist und zur Erläuterung ihrer Konstruktionsprinzipien brauchbar ist. Die Vorrichtung umfasst ein äußeres geformtes Gehäuse 10, das eine hohle, langgestreckte Umschließung bildet. Das Gehäuse 10 bildet einen Testflüssigkeitseinlass 14 und eine Öffnung 16, die ein Fenster bildet, durch das die Einfang- und Kontrollstellen sichtbar sind. Wie dies in den 1AE gezeigt ist, ist das Fenster 16 auf einer dem Probeneinlass 14 gegenüberliegenden Seite des Gehäuses 10 angeordnet. Diese Konfiguration verringert das Auftreten von Verunreinigungen der Teststelle, die im Inneren des Gehäuses 10 angeordnet ist und durch das Fenster 16 freiliegt. Das Gehäuse 10 bildet weiterhin Entlüftungsöffnungen 38, 40 und 42, die entlang der Seiten und am distalen Ende des Gehäuses 10 angeordnet sind. Die Entlüftungsöffnung 38 verringert das Auftreten einer „Dampfsperre" in der Vorrichtung während des Gebrauchs. Das Vorhandensein der Öffnungen 40 und 42 trägt zur Verringerung eines „Flutens" des chromatographischen Substrats bei, das Auftreten kann, wenn der Benutzer zu viel Probe auf die Vorrichtung aufbringt.
  • 2 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausführungsform der Untersuchungsmaterialien, die, wenn die Vorrichtung vollständig zusammengebaut ist, im Inneren des Gehäuses 10 angeordnet sind. Die Untersuchungsmaterialien umfassen absorbierendes Material 12, das zweiphasige chromatographische Substrat 18 und das Vorratsmaterial 24. Die Untersuchungsmaterialien und das Innere des Gehäuses 10 bilden zusammen einen Strömungspfad, der allgemein von rechts nach links in den 1A, B und C verläuft. Wenn die Testvorrichtung so angeordnet wird, dass der Einlass 14 in einer Flüssigkeitsprobe angeordnet ist oder auf andere Weise mit dieser in Kontakt gelangt, so wird die Flüssigkeit durch Kapillarwirkung, durch Dochtwirkung oder durch einfaches Benetzen entlang des Strömungspfads stromabwärts durch das absorbierende Material 12, entlang des chromatographischen Substrats 18 und in das Vorratsmaterial 24 transportiert, wie dies allgemein durch den Pfeil angezeigt ist. Absorbierendes Material 12, das einwärts von dem Einlass 14 angeordnet ist, dient weiterhin als ein Filter, das teilchenförmiges Material und störende Faktoren von verunreinigten Testproben entfernen kann.
  • 3 zeigt schematisch das zweiphasige chromatographische Substrat 18, das ein Freisetzungsmedium 30 und ein Einfangmedium 32 umfasst. Auf dem Freisetzungsmedium 30 ist lösbar ein Band 26 des dehydrierten markierten Bindungselements angeordnet, beispielsweise ein Antikörper-Metallsalz. Wenn sich die Flüssigkeitsprobe an dem Band 26 vorbeibewegt, wird das markierte Bindungselement in der Flüssigkeit mitgenommen, wieder hergestellt und es reagiert oder steht im Wettbewerb mit irgendeinem anderen Analyten, der in der Flüssigkeitsprobe enthalten ist. Stromabwärts von dem markierten Bindungselement befindet sich ein Band 28 des dehydrierten einfangbaren Komplexes. Der einfangbare Komplex umfasst ein Bindungselement, das sich an einen zweiten Epitop des Analyten bindet, beispielsweise an einen Antikörper, und eine einfangbare Affinitätskomponente, beispielsweise Biotin. Der einfangbare Komplex wird ebenfalls von der Flüssigkeitsprobe mitgenommen, während sich diese entlang des Substrats 18 vorwärts bewegt.
  • Auf dem Einfangmedium 32 sind jeweils die Einfangstelle 34 und die Kontrollstelle 36 immobilisiert. In 3 sind die Kontroll- und Einfangstellen so dargestellt, als ob sie in Reihe entlang des Strömungspfads angeordnet sind. Alternativ können die Kontroll- und Einfangstelle oder -stellen Seite an Seite oder in anderen räumlichen Beziehungen angeordnet sein. Die Einfangstelle 34 umfasst eine vor ausgewählte Menge eines Einfang-Aftinitätselements, das spezifisch für die auf dem Freisetzungsmedium angeordnete einfangbare Affinitätskomponente ist. Die einfangbare Komponente ist an ihrem Platz innerhalb des Strömungspfads immobilisiert. Wenn beispielsweise das einfangbare Affinitätselement Biotin ist, so kann die Einfangkomponente Streptavidin sein. Die Kontrollstelle 36 umfasst immobilisierte Antiseren oder Antikörper, die für das markierte Bindungselement spezifisch sind.
  • 4 zeigt schematisch eine Seitenansicht des Betriebsteils der Untersuchungsmaterialien. Wie dies gezeigt ist, ist das absorbierende Material 12 benachbart zu dem Freisetzungsmedium 30 angeordnet, und überlappt das Freisetzungsmedium 30 an einem Ende. Das Freisetzungsmedium 30 überlappt seinerseits das Einfangmedium 32, das distal zum Freisetzungsmedium 30 angeordnet ist. Das Vorratsmaterial 24 überlappt das distale Ende des Einfangmediums 32. Diese vier Komponenten bilden zusammen einen einzigen Strömungsmittelpfad und wirken zusammen, um ein Strömen der Flüssigkeitsprobe von dem absorbierenden Material 12 entlang des Freisetzungsmediums 30 und des Einfangmediums 32 in das Vorratsmaterial 24 hervorzurufen.
  • 5 zeigt schematisch eine derzeit bevorzugte Ausführungsform des Betriebsteils der Untersuchungsvorrichtung. Wie dies gezeigt ist, ist auf dem Freisetzungsmedium 30 in lösbarer oder freisetzbarer Weise ein Band aus markiertem Bindungselement 26 angeordnet, das bei der bevorzugten Ausführungsform ein monoklonaler Antikörper ist, der mit Goldsalzteilchen konjugiert ist. Stromabwärts von dem Band 26 befindet sich ein Band 28, das die einfangbare Komponente umfasst, die bei der bevorzugten Ausführungsform ein zweiter monoklonaler Antikörper ist, der für den mit Biotin konjugierten gleichen Analyten spezifisch ist. Das Band 28 ist ebenfalls freisetzbar auf dem Freisetzungsmedium 30 angeordnet. Stromabwärts von dem Freisetzungsmedium 30 befindet sich das Einfangmedium 32, auf dem die Einfangstelle 34 immobilisiert ist, die bei der bevorzugten Ausführungsform Streptavidin ist. Auf dem Einfangsmedium 32 stromabwärts von der Einfangstelle 34 befindet sich die Kontrollstelle 36, die bei der bevorzugten Ausführungsform aus polyklonalen Antiseren besteht, die für den markierten Antikörper des Bands 26 spezifisch sind.
  • Die Erfindung ist nicht auf die präzise Art der Einfangstelle 34 und der entsprechenden Kontrollstelle 36 beschränkt, und tatsächlich kann die Kontrollstelle 36 vollständig fortgelassen werden, wenn dies erwünscht ist. Allgemein kann ein Antikörper oder ein anderes Affinitätsmittel an der Einfangstelle 34 und der Kontrollstelle 36, unter Verwendung einer Absorption, einer Adsorption oder einer ionischen oder kovalenten Kopplung, entsprechend als solcher bekannter Verfahren, immobilisiert werden. Das Einfangmedium 32 ist vorzugsweise so ausgewählt, das es die Einfangreagenzien ohne die Notwendigkeit einer chemischen Kopplung bindet. Nitrozellulose und Nylon ermöglichen beide eine nicht-chemische Bindung der Einfangkomponente und des Kontrollreagenz.
  • Wie dies in 5 gezeigt ist, ist stromabwärts von dem Einfangmedium 32 ein Vorratsmaterial 24 angeordnet, das eine relativ große Masse an absorbierendem oder superabsorbierendem Material umfasst. Der Zweck des Vorratsmaterials 24 besteht darin, sicherzustellen, dass eine annehmbar große Menge der Testflüssigkeit durch das chromatographische Medium hindurchgesaugt wird.
  • 6 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der Untersuchungs-materialien, die bei der Durchführung von Tauchstab-Untersuchungen brauchbar ist. Bei der dargestellten Ausführungsform ist das Probenabsorptionsmaterial 12 fortgelassen, und das Freisetzungsmedium 30 wirkt als das Proben-Absorptionsmaterial.
  • Polyklonale Antiseren und monoklonale Antikörper oder Bruchteile hiervon mit spezifischen Bindungseigenschaften und hoher Affinität für praktisch jede Antigen-Substanz, die bei der vorliegenden Erfindung als Bindungselemente und Einfangmaterialien brauchbar sind, sind bekannt und im Handel erhältlich, oder sie können aus stabilen Zellensträngen unter Verwendung gut bekannter Zellenverschmelzungs- und Auswahl-Techniken erzeugt werden. Die Literatur ist voll von Protokollen zur Erzeugung und Immobilisierung von Protein. Siehe beispielsweise die Veröffentlichung Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Tijssen, Bd. 15, Practice and Theory of Enzyme immunoassays, Kapitel 13, The Immobilization of Immunoreactants on Solid Phases, S. 297–328 und die darin genannten Referenzen.
  • Metallsalze und andere Arten von gefärbten Teilchen, die als Marker-Substanzen in Immuno-Untersuchungsverfahren geeignet sind, sind ebenfalls als solche bekannt. Siehe beispielsweise das US-Patent 4,313,734. Hinsichtlich der Einzelheiten und Verfahrensprinzipien, die bei der Synthese von gefärbten Teilchen-Konjugaten beteiligt sind, sei auf Horisberger, Evaluation of Colloidal Gold as a Cytochromic Marker for Transmission and Scanning Electron Microscopy, Biol. Cellulaire, 36, 253–258 (1979); Leuvering et al., „Sol Particle Immunoassay", J. Immunoassay, 1 (1): 77–91 (1980), and Frens „Controlled Nucleation for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions", Nature, Physical Science, 241: 20–22 (1973) verwiesen.
  • Bei einer derzeit bevorzugten Ausführungsform ist die Immunoassay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung so ausgelegt, dass sie die Schwangerschaft beim Menschen feststellt. Bei dieser Ausführungsform ist das markierte Bindungselement ein monoklonaler Antikörper (MAb) gegen menschliches Choriongonadotropin (hCG), das mit kolloidalem Gold markiert ist. Für diesen Zweck wird MAb mit der Bezeichnung 2G9 (erhältlich von Carter-Wallace, Inc.) bevorzugt. Anti-hCG-Antikörper, die mit Biotin markiert sind, werden für den einfangbaren Komplex verwendet. Monoklonale Antikörper, die für diesen Zweck verwendet werden können, schließen die hCG-spezifischen monoklonalen Antikörper mit den Bezeichnungen 2B2 und B109 (erhältlich von Carter-Wallace, Inc.) und CCFO-(erhältlich vom Scripps Laboratory) ein. Verfahren zum Konjugieren von Biotin mit Antikörpern sind gut bekannt und bilden keinen Teil der vorliegenden Erfindung. Bei der derzeit bevorzugten Ausführungsform umfasst die Einfangstelle Streptavidin, das eine hohe Affinität für Biotin hat. Eine Kontrollstelle befindet sich vorzugsweise stromabwärts von der Einfangstelle. Auf der Kontrollstelle ist Ziegen-Anti-Maus-IgG immobilisiert, das für das markierte Anti-hCG spezifisch ist (erhältlich von Scantibodies Laboratory).
  • Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die vorliegende Immuno-Probenvorrichtung zur Feststellung des Eisprungs beim Menschen bestimmt. Bei dieser Ausführungsform umfasst das markierte Bindungselement MAb 2G9, das für luteinisiertes Hormon (LH) und hCG spezifisch ist, markiert mit kolloidalem Gold. Der einfangbare Komplex umfasst biotinyliertes LH-spezifisches MAb LH26 (erhältlich von Carter-Wallace, Inc.). Die Einfangstelle umfasst vorzugsweise Streptavidin, und die Kontrollstelle umfasst Ziegen-Anti-Maus-IgG, das für das markierte MAb spezifisch ist.
  • Bei einer anderen Ausführungsform kann die Vorrichtung zur Feststellung infektiöser Stoffe, wie zum Beispiel Streptococcus, angepasst sein. Bei dieser Ausführungsform ist das markierte Bindungselement ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der spezifisch für Streptococcus ist und mit kolloidalem Gold oder einem anderen direkten Marker markiert ist. Der einfangbare Komplex ist der gleiche polyklonale Antikörper konjugiert mit Biotin, und die Einfang- und Kontrollkomponenten umfassen Streptavidin und Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG.
  • Das Gehäuse 10 kann verschiedene Formen annehmen. Es wird typischerweise ein langgestrecktes Gehäuse umfassen, das ineinander passende Teile umfasst, die aus Kunststoffmaterial, wie zum Beispiel Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polystyrol oder Polyethylen hergestellt sind. Der innere Strömungspfad des Gehäuses enthält ein relativ inertes Material oder eine Kombination von Materialien, die zur Erleichterung des Transports der Flüssigkeit geeignet sind. Das Gehäuse 10 kann für einen direkten Kontakt mit einer Probenflüssigkeit ausgebildet sein, wie dies in der in den 1AE gezeigten Ausführungsform gezeigt ist, oder es kann in Form eines Tauchstabs ausgebildet sein, der hier nicht gezeigt ist, jedoch in der Technik gut bekannt ist.
  • Aus dem Vorstehenden dürfte ersichtlich sein, dass die Vorteile der Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit und der Vermeidung falscher Positivanzeigen von Assaysystemen, die gemäß der Erfindung aufgebaut sind, auf eine Kombination von Merkmalen der Erfindung zurückzuführen sind. Im Gebrauch führt das zweiphasige chromatographische Substrat zu einem wirkungsvollen Transport der Reagenzien, was einen empfindlicheren Nachweis des Analyten ermöglicht.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun weiter speziell unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben. In den Beispielen werden die Testvorrichtungen unter Bezugnahme auf die 1 bis 6 der beigefügten Zeichnungen beschrieben, die weiter oben kurz beschrieben wurden.
  • Beispiele
  • Schwangerschaftstest
  • Die derzeit bevorzugte Konfiguration für das Gehäuse der Testvorrichtung, das die Erfindung beinhaltet, ist in den 1AE gezeigt. Die derzeit bevorzugte Konfiguration der Testmaterialien, unter Einschluss des Probenabsorptionsmaterials, des zweiphasigen chromatographischen Substrats und des Vorratsmaterials, ist in den 2 bis 5 gezeigt. Eine Modifikation der in den 2 bis 5 gezeigten Testmaterialien ist in 6 gezeigt.
  • Wie dies in den 1AE gezeigt ist, umfasst die bevorzugte Testzelle der Erfindung ein Paar von ineinander passenden Polymerteilen, die im zusammengebauten Zustand der Vorrichtung eine Umschließung bilden. Das Gehäuse 10 ist so konstruiert, dass es das zweiphasige chromatographische Substrat und die dazugehörenden absorbierenden Materialien nach den 2 bis 5 aufnimmt. Die Untersuchungsmaterialien sind innerhalb des Gehäuses 10 derart angeordnet, dass die klare Polymerunterlage 46 gegenüberliegend zu dem Fenster 16 (1A) angeordnet ist. Die Ergebnisse der Untersuchung können durch die klare Polymerschicht 46 hindurch abgelesen werden, und das Vorhandensein der Schicht 46 verhindert eine Verunreinigung der Teststelle während des Gebrauchs. Im Betrieb wird Testflüssigkeit, die durch den Einlass 14 aufgebracht wird, durch das Probenabsorptionsmaterial 12 absorbiert und sickert entlang des chromatographischen Substrats 18, das den Strömungspfad bildet, in das Vorratsvolumen 24. In der Tauchstab-Ausführungsform ist das chromatographische Substrat nach 6, das kein absorbierendes Material 12 aufweist, in einem Gehäuse angeordnet, das zu seiner Aufnahme ausgebildet ist, und das in 7 gezeigt ist.
  • Bei der derzeit am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist das absorbierende Material 12 gebundenes hydrophiles Polyester-Material (American Filtrona), das Freisetzungs-medium ist entweder S&S 903 Papier oder S&S GB002-Papier (beides von Schleicher & Schuell), das Einfangmedium ist eine Nitrozellulose-Membran, die auf klares Polyethylen-terephthalat (PET) gegossen (oder auflaminiert) ist (erhältlich von Millipore Corporation), das Vorratsmaterial 24 ist S&S 300-Papier (Schleicher & Schuell). Die Freisetzungs- und Einfangmedien wurden auf 5/1000 Zoll klares PET aufgeschichtet, das mit einem Klebemittel vorbeschichtet war (erhältlich von Adhesives Research). Die Abmessungen des absorbierenden Materials 12 betrugen ungefähr 5,0 × 1,27 × 0,25 cm (2,0 × 0,5 × 0,1 Zoll) auf jeder Seite. Die Abmessungen des Freisetzungsmediums 32 des zweiphasigen chromatographischen Substrats 18 sind vorzugsweise 2,8 × 0,8 × 0,06 cm (1,1 × 0,32 × 0,025 Zoll), und für das Einfangmedium ungefähr 2,5 × 0,8 × 0,018 cm (1 × 0,32 × 0,007 Zoll). Die Abmessungen des Vorrats-Absorptionskissens sind ungefähr 2,0 × 0,26 × 1,06 cm (0,8 × 0,1 × 0,4 Zoll). Eine Anzahl dieser Substrate wurde erzeugt und weiterbehandelt, um sie zum Nachweis der Schwangerschaft durch Untersuchung von Urin auf das Vorhandensein des Choriongonadotropins (hCG) des Menschen auszubilden. Die Testreagenzien waren monoklonale hCG-Antikörper 2G9 (beschafft von Carter-Wallace, Inc.), markiert mit kolloidalem Gold in einer Größe von 15–30 nm, biotinylierter hCG-spezifischer monoklonaler Antikörper CCF01 (beschafft von Scripps Laboratory), Streptavidin, lyophilisiertes Material, das in Phosphatpuffer auf eine Konzentration von 2 mg/ml rekonstituiert wurde; und Ziegen-Anti-Maus-IgG, eine Lösung die auf eine Konzentration von 1 mg/ml in Phosphatpuffer eingestellt wurde. Die Testreagenzien wurden auf den Medien angeordnet, wie dies in den 3 und 5 gezeigt ist.
  • Test-Protokoll
  • Zwei Proben der Schwangerschaft-Untersuchungsvorrichtung wurden unter Verwendung des zweiphasigen chromatographischen Mediums zubereitet, wie dies weiter oben beschrieben wurde. Eine mit „Test 1" bezeichnete Probe wurde unter Verwendung einer Nitrozellulose-Membran, die auf einem Polyesterfilm auflaminiert wurde, als Einfangmedium zubereitet. Die andere Probe, die mit „Test 2" bezeichnet wurde, wurde unter Verwendung einer nitrozellularen Membran, die auf eine Polyester-Unterlage gegossen wurde, als das Einfangmedium zubereitet. Alle anderen Merkmale des zweiphasigen chromatographischen Mediums waren identisch.
  • Der Test wurde durch Aufbringen von Lösungen, die bekannte Mengen von im Handel erhältlichen hCG enthalten, auf das proximate Ende des chromatographischen Mediums ausgeführt, wobei man die Testlösungen durch Kapillarwirkung durch das zweiphasige Medium wandern ließ.
  • Zum Vergleich wurde ein im Handel erhältlicher Schwangerschafts-Testsatz (First ResponseTM, Carter-Wallace, Inc., New York, NY) dem gleichen Verfahren unterworfen. Der im Handel erhältliche Testsatz verwendet ein Einphasen-Chromatographie-Medium, das aus hydrophilem Zellulosematerial besteht. Die Unterschiede zwischen den Testproben und dem im Handel erhältlichen Test sind in der Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00280001
  • Die Ergebnisse des Testverfahrens sind in Tabelle 2 gezeigt:
  • Tabelle 2 Vergleich der Reaktionszeiten für im Handel erhältliche und verbesserte Schwangerschaftstests
    Figure 00290001
  • Die rosa Farbe war klar bei 50 mIU des Choriongonadotropins des Menschen für beide Testproben sichtbar, jedoch nicht für das im Handel erhältliche Produkt. Die Ergebnisse zeigen an, dass der Test der vorliegenden Erfindung die Schwangerschaft bei einem Menschen so früh wie am Tag einer ausgebliebenen Menstruationsperiode nachweisen kann. In den Anfangsstufen des Testens wurden ungefähr 50 negative Proben von verschiedenen Quellen durchlaufen, ohne dass sich falsche Positivanzeigen oder selbst Grenzfälle ergeben. Im Gegensatz hierzu zeigte bei 50 mIU an hCG der im Handel erhältliche Schwangerschaftstest ein negatives Ergebnis.
  • Die Tabelle 3 zeigt die Mengen an Reagenzien, die für den Schwangerschaftstest (Test 2) unter Verwendung des zweiphasigen Substrats der vorliegenden Erfindung verglichen mit dem im Handel erhältlichen Test erforderlich sind. Wie dies in Tabelle 3 gezeigt ist, erfordern die Testvorrichtungen der vorliegenden Erfindung beträchlich weniger Reagenzien und sind (wie dies in Tabelle 2 gezeigt ist) sowohl empfindlicher als auch genauer.
  • Tabelle 3 Vergleich des Reagenz-Verbauchs
    Figure 00300001
  • Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse von tatsächlichen Versuchen, die unter Verwendung der vorliegenden Schwangerschafts-Testvorrichtung ausgeführt wurden. Alle in Tabelle 4 aufgeführten Versionen enthalten das vorstehend beschriebene zweiphasige Medium und die Reagenzien, unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der Form des Gehäuses 10. Es wurde überraschend festgestellt, dass bestimmte mechanische Modifikationen an dem Gehäuse 10, insbesondere die Einführung der Entlüftungsöffnungen 38, 40 und 42 (1B, 1E) zu einer beträchtlich höheren Genauigkeit und weniger ungültigen Ergebnissen führte. Die Unterschiede zwischen den verschiedenen in Tabelle 4 gezeigten Versionen sind wie folgt:
  • Version 1
  • Diese Version hatte lange Pfosten, die leicht zerbrochen wurden, wenn die Bestandteile in Kunststoffbeuteln aufbewahrt wurden. Die Teile fielen leicht auseinander, wenn sie von einer Tischplatte fielen.
  • Version 2
  • In dieser Version wurden die Pfosten verkürzt, um ein Brechen zu beseitigen. Ein Urinstop wurde hinzugefügt, um zu verhindern, dass Urin das Freisetzungsmedium umgeht und die Membran benetzt.
  • Version 3
  • Diese Version wies zusätzliche Pfosten auf, um zu verhindern, dass die Vorrichtung auseinanderfiel, wenn sie herunterfiel. Zusätzliche Urinstops wurden eingeführt, um ein Fluten der Membran weiter zu verhindern. Ein Querbalken wurde an dem oberen Gehäuse hinzugefügt, um das stromaufwärts gelegene Absorptionsmittel gegen die Membran zu drücken und die Probenströmung und die Freisetzung von Gold zu unterstützen.
  • Version 4
  • Vorrichtungen der Version 4 wurden durch manuelles Einschneiden von Entlüftungsöffnungen in die Vorrichtung modifiziert. Zwei lange Seiten-Entlüftungsöffnungen und eine kurze Basis-Entlüftungsöffnung wurden in das obere Gehäuse eingeschnitten, um eine Membran-Flutung zu verhindern.
  • Modifizierte Version 4
  • Vorrichtungen der Version 4 wurden dadurch modifiziert, dass ein Fenster in das obere Gehäuse ähnlich zu dem Urin-Sammelbereich auf dem unteren Gehäuse eingeschnitten wurde. Diese Vorrichtung wurde als „zweiseitig" bezeichnet – Probe konnte auf entweder die Vorderseite oder Rückseite der Vorrichtung aufgebracht werden.
  • Die Version 5 stellt die derzeit bevorzugte Ausführungsform der Schwangerschafts-Testvorrichtung dar. Wie dies in Tabelle 4 gezeigt ist, wurden die Tests alle in weniger als fünf Minuten und ohne ungültige Ergebnisse abgeschlossen.

Claims (40)

  1. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) Bereitstellen eines zweiphasigen chromatographischen Substrats (18), das ein Freisetzungsmedium (30) aus einem ersten saugfähigen, hydrophilen Material und, in Flüssigkeitsströmungsverbindung und stromabwärts hiervon, ein Einfangmedium (32) aus einem zweiten, anderen mikroporösen hydrophilen Polymermaterial, umfasst, wobei die Freisetzungs- und Einfangmedien zusammen einen einzigen Flüssigkeitsströmungsweg bilden, und wobei in diesem Freisetzungsmedium folgendes freisetzbar angeordnet ist: (I) ein markiertes Konjugat, das ein Bindungselement umfasst, das mit einem ersten Epitop des Analyten reaktionsfähig ist, markiert mit einem nachweisbaren Marker, und (II) einen einfangbaren Bestandteil, der mit einem zweiten Epitop des Analyten derart reaktionsfähig ist, dass, wenn der Analyt in der Probe vorliegt, der Analyt einen Komplex erzeugt, der das markierte Konjugat, den Analyten und den einfangbaren Bestandteil umfasst und wobei in dem Einfangmedium eine Einfangstelle (34) zum Einfangen des Komplexes angeordnet ist, wobei die Einfangstelle daran immobilisiert einen Einfangbestandteil aufweist, der für den einfangbaren Bestandteil eine Bindungsaffinität aufweist; (b) in Berührung bringen einer flüssigen Probe mit dem Freisetzungsmedium (30) derart, dass die Flüssigkeit stromabwärts entlang des Flüssigkeitsströmungsweges zur Einfangstelle (34) wandert; und (c) Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit des Analyten durch Beobachten des Vorhandenseins oder der Abwesenheit des nachweisbaren Markers an der Einfangstelle (34).
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der einfangbare Bestandteil stromabwärts des markierten Konjugats im Freisetzungsmedium (30) angeordnet ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Analyt humanes Choriongonadotropin ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Analyt luteinisierendes Hormon ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Einfangmedium an ein transparentes Polymermaterial laminiert oder auf dieses gegossen ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der nachweisbare Marker ein farbiges Teilchen ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das farbige Teilchen ein Gold-Sol-Teilchen umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der einfangbare Bestandteil ein biotinylierter Antikörper ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der immobilisierte Einfangbestandteil Avidin oder Streptavidin ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Einfangmedium (32) weiterhin eine Kontrollstelle (36) umfasst, die sich stromabwärts der Einfangstelle (34) befindet, die daran immobilisiert ein Mittel aufweist, das zum Einfangen des markierten Konjugates in der Lage ist.
  11. Vorrichtung (5) zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einer flüssigen Probe, wobei eine flüssige Probe, an einem proximalen Ende der Vorrichtung aufgebracht, stromabwärts entlang eines Flüssigkeitsweges zu einem distalen Ende der Vorrichtung wandert, wobei die Vorrichtung folgendes umfasst: ein zweiphasiges Substrat (18), das ein Freisetzungsmedium (30) aus einem ersten saugfähigen, hydrophilen Material und, in Flüssigkeitsverbindung und stomabwärts hiervon, ein Einfangmedium (32) aus einem zweiten, anderen mikroporösen, hydrophilen Polymermaterial umfasst, wobei in dem Freisetzungsmedium des zweiphasigen Substrates zur Freisetzung hieraus folgendes angeordnet ist: (I) ein markiertes Konjugat, das ein Bindungselement umfasst, das mit einem ersten Epitop des Analyten reaktionsfähig ist, markiert mit einem nachweisbaren Marker, und (II) ein einfangbarer Bestandteil, der mit einem zweiten Epitop des Analyten derart reaktionsfähig ist, dass, wenn der Analyt in der Probe vorliegt, der Analyt dazu in der Lage ist, einen Komplex aus dem markierten Konjugat, dem Analyten und dem einfangbaren Bestandteil zu bilden, und wobei in dem Einfangmedium des Substrates eine Einfangstelle (34) zum Einfangen des Komplexes angeordnet ist, wobei die Einfangstelle daran immobilisiert einen Einfangbestandteil aufweist, der eine Bindungsaffinität für den einfangbaren Bestandteil aufweist.
  12. Vorrichtung nach Anspruch 11, die weiterhin eine Kontrollstelle (36) umfasst, die sich stromabwärts der Einfangstelle (34) im Einfangmedium befindet, wobei die Kontrollstelle daran immobilisiert ein Mittel aufweist, das zum Einfangen des markierten Konjugates in der Lage ist.
  13. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der Analyt humanes Choriongonadotropin ist.
  14. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der Analyt luteinisierendes Hormon ist.
  15. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der einfangbare Bestandteil ein biotinylierter Antikörper ist.
  16. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der immobilisierte Einfangbestandteil Avidin, Streptavidin oder einen Anti-Biotin-Antikörper umfasst.
  17. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der einfangbare Bestandteil stromabwärts des markierten Konjugats im Freisetzungsmedium (30) angeordnet ist.
  18. Vorrichtung nach Anspruch 11, die weiterhin ein transparentes, für den Analyten undurchlässiges Blattmaterial auf einer Fläche des Einfangmediums (32) umfasst.
  19. Vorrichtung nach Anspruch 18, die ein Gehäuse (10), das das Substrat aufnimmt und ein Fenster (16) zum Betrachten der Einfangstelle (34) definiert, und einen Einlass für die flüssige Probe (14) in Flüssigkeitsverbindung mit dem Freisetzungsmedium (30) umfasst, wobei das Fenster und der Einlass auf gegenüberliegenden Seiten des Gehäuses angeordnet sind.
  20. Vorrichtung (5) zum Bestimmen des Vorhandenseins eines Analyten in einer flüssigen Probe, wobei eine flüssige Probe, auf einem proximalen Ende der Vorrichtung angeordnet, stromabwärts entlang eines Flüssigkeitsweges zu einem distalen Ende der Vorrichtung wandert, wobei die Vorrichtung folgendes umfasst: (a) ein zweiphasiges Substrat (18), das ein Freisetzungsmedium (30) aus einem ersten saugfähigen, hydrophilen Material und, in Flüssigkeitsverbindung und stromabwärts hiervon, ein Einfangmedium (32) aus einem zweiten, anderen mikroporösen, hydrophilen Polymermaterial umfasst, wobei im Freisetzungsmedium des zweiphasigen Substrates zur Freisetzung hieraus folgendes angeordnet ist: (I) ein markiertes Konjugat, das ein Bindungselement umfasst, das mit einem ersten Epitop des Analyten reaktionsfähig ist, markiert mit einem nachweisbaren Marker, und (II) einen einfangbaren Bestandteil, der mit einem zweiten Epitop des Analyten derart reaktionsfähig ist, dass, wenn der Analyt in der Probe vorliegt, der Analyt einen Komplex erzeugt, der das markierte Konjugat, den Analyten und den einfangbaren Bestandteil umfasst, und wobei im Einfangmedium des zweiphasigen Substrates folgendes angeordnet ist: eine Einfangstelle (34) zum Einfangen des Komplexes, wobei die Einfangstelle daran immobilisiert einen Einfangbestandteil aufweist, der für den einfangbaren Bestandteil eine Bindungsaffinität aufweist; und (b) ein Gehäuse (10), das das zweiphasige Substrat einschließt, wobei das Gehäuse einen Probeneinlass (14) in Flüssigkeitsverbindung mit dem Freisetzungsmedium des zweiphasigen Substrates und eine Nachweisöffnung (18) zum Betrachten der Einfangstelle definiert.
  21. Vorrichtung nach Anspruch 20, die weiterhin eine Kontrollstelle (36) umfasst, die stromabwärts der Einfangstelle (34) angeordnet ist, wobei die Kontrollstelle daran immobilisiert ein Mittel aufweist, das zum Einfangen des markierten Konjugates in der Lage ist.
  22. Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei das Gehäuse weiterhin eine Kontrollöffnung zum Betrachten der Kontrollstelle definiert, die sich stromabwärts der Nachweisöffnung befindet.
  23. Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei die Nachweisöffnung an einer Seite des Gehäuses angeordnet ist, die dem Probeneinlass gegenüberliegt.
  24. Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei das zweiphasige Substrat die Form eines flachen Blattes aufweist und wobei das markierte Konjugat, der einfangbare Bestandteil und die Einfangstelle sich an einer Oberfläche des Blattes befinden.
  25. Vorrichtung nach Anspruch 20, wobei das Einfangmedium an ein transparentes Polymermaterial laminiert ist oder auf dieses gegossen ist.
  26. Vorrichtung nach Anspruch 20, die weiterhin ein Probenabsorptionsmittel (12) umfasst, das stromaufwärts von und in Flüssigkeitsverbindung mit dem zweiphasigen Substrat angeordnet ist.
  27. Vorrichtung nach Anspruch 20, die weiterhin ein Vorratsabsorptionsmittel (24) umfasst, das sich stromabwärts von und in Flüssigkeitsverbindung mit dem zweiphasigen Substrat befindet.
  28. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Bindungselement des markierten Konjugats ein Antikörper ist.
  29. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 20, wobei der einfangbare Bestandteil ein biotinylierter Antikörper ist.
  30. Vorrichtung nach Anspruch 29, wobei der immobilisierte Einfangbestandteil Avidin, Streptavidin oder einen Anti-Biotin-Antikörper umfasst.
  31. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 20, wobei das Freisetzungsmedium (30) und das Einfangmedium (32) des zweiphasigen Substrates beide an einem einzigen Stützträger immobilisiert sind.
  32. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 20, wobei das erste saugfähige, hydrophile Material des zweiphasigen Substrates ein absorbierendes Papier ist.
  33. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 20, wobei das zweite mikroporöse, hydrophile Polymermaterial des zweiphasigen Substrates Nitrozellulose oder Nylon ist.
  34. Vorrichtung (5) zum Bestimmen des Vorhandenseins eines Analyten in einer flüssigen Probe, wobei die flüssige Probe, auf einem proximalen Ende der Vorrichtung angeordnet, stromabwärts entlang eines Flüssigkeitsweges zu einem distalen Ende der Vorrichtung wandert, wobei die Vorrichtung folgendes umfasst: ein zweiphasiges Substrat (18), das ein Freisetzungsmedium (30) aus einem ersten saugfähigen, hydrophilen Material und, in Flüssigkeitsverbindung und stromabwärts hiervon, ein Einfangmedium (32) aus einem zweiten, anderen Material aus Nylon oder Nitrozellulose umfasst, wobei das Freisetzungsmedium und das Einfangmedium beide an einem einzigen Stützträger immobilisiert sind, und wobei in diesem Freisetzungsmedium des zweiphasigen Substrates zum daraus freisetzen folgendes angeordnet ist: (I) ein markiertes Konjugat, das einen ersten Antikörper umfasst, der an ein erstes Epitop des Analyten bindet, markiert mit einem nachweisbaren Marker, und (II) einen einfangbaren Bestandteil, der einen biotinylierten zweiten Antikörper umfasst, der ein zweites, anderes Epitop des Analyten bindet, derart, dass, wenn der Analyt in der Probe vorliegt, der Analyt einen Komplex erzeugt, der das markierte Konjugat, den Analyten und den einfangbaren Bestandteil umfasst, und wobei in dem Einfangmedium des zweiphasigen Substrates folgendes angeordnet ist: eine Einfangstelle (34) zum Einfangen des Komplexes, wobei die Einfangstelle daran immobilisiert einen Einfangbestandteil zum Binden des einfangbaren Bestandteils aufweist.
  35. Vorrichtung nach Anspruch 34, die weiterhin ein Probenabsorptionsmittel (12) umfasst, das stromaufwärts von und in Flüssigkeitsverbindung mit dem zweiphasigen Substrat angeordnet ist.
  36. Vorrichtung nach Anspruch 34, die weiterhin ein Vorratsabsorptionsmittel (24) umfasst, das sich stromabwärts von und in Flüssigkeitsverbindung mit dem zweiphasigen Substrat befindet.
  37. Vorrichtung nach Anspruch 34, wobei das erste saugfähige, hydrophile Material des zweiphasigen Substrates ein absorbierendes Papier ist.
  38. Vorrichtung nach Anspruch 34, wobei der Einfangbestandteil Avidin oder Streptavidin ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste saugfähige, hydrophile Material des zweiphasigen Substrates absorbierendes Papier ist.
  40. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zweite mikroporöse, hydrophile Polymermaterial des zweiphasigen Substrates Nitrozellulose oder Nylon ist.
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