DE69626196T3 - Dna-diagnostik mittels massenspektrometrie - Google Patents

Dna-diagnostik mittels massenspektrometrie Download PDF

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Daniel P. Little
G.Scott Higgings
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Brigitte Darnhofer-Demar
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die genetische Information aller lebenden Organismen (z. B. Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen) ist in Deoxyribonukleinsäure (DNA) kodiert. In Menschen umfaßt das vollständige Genom etwa 100.000 Gene, die auf 24 Chromosomen angeordnet sind (The Human Genome, T. Strachan, BIOS Scientific Publishers, 1992). Jedes Gen kodiert für ein spezifisches Protein, das nach seiner Expression mittels Transkription und Translation eine spezifische biochemische Funktion innerhalb einer lebenden Zelle erfüllt. Veränderungen in einer DNA-Sequenz sind als Mutationen bekannt, und können zu Proteinen führen, deren biochemische Aktivitäten verändert oder manchmal sogar verloren gegangen sind, was wiederum eine Erbkrankheit verursachen kann. Mutationen umfassen Deletionen, Insertionen oder Veränderungen (d. h. Punktmutationen) von Nukleotiden. Punktmutationen können sowohl ”missense” sein, was zu einer Veränderung in der Aminosäuresequenz eines Proteins führt, als auch ”nonsense”, indem sie für einen Stopcodon kodieren, und dadurch zu einem verkürzten Protein führen.
  • Derzeit sind mehr als 3000 Erbkrankheiten bekannt (Human Genome Mutations, D. N. Cooper and M. Krawczak, BIOS Publishers, 1993), umfassend Hämophilien, Thalassämien, Duchenne Muskeldystrophie (DMD), Huntington Krankheit (HD), Alzheimer Krankheit und Mukoviszidose (CF, cystic fibrosis). Zusätzlich zu Genmutationen, die in einer Erbkrankheit resultieren, sind bestimmte angeborene Störungen das Ergebnis von Chromosomenabnormalitäten, wie etwa Trisomie 21 (Down Syndrom), Trisomie 13 (Patau Syndrom), Trisomie 18 (Edward Syndrom), Monosomie X (Turner Syndrom), und andere Aneuploidien der Geschlechtschromosomen wie etwa das Klienfelter Syndrom (XXY). Weiterhin gibt es zunehmende Hinweise, dass bestimmte DNA-Sequenzen ein Individuum für eine einer Reihe von Erkrankungen, wie etwa Diabetes, Arteriosklerose, Fettleibigkeit, verschiedene Autoimmunerkrankungen und Krebs (z. B. Kolonkarzinom, Brust-, Eierstock-, Lungenkrebs), prädisponieren können.
  • Viren, Bakterien, Pilze und andere infektiöse Organismen enthalten charakteristische Nukleinsäuresequenzen, welche von den in der Wirtszelle vorhandenen verschieden sind. Daher können auch infektiöse Organismen auf Basis ihrer spezifischen DNA-Sequenzen nachgewiesen und identifiziert werden.
  • Da eine Sequenz von etwa 16 Nukleotiden aus statistischen Gründen sogar für die Größe des Humangenoms spezifisch ist, können relativ kurze Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, um normale und defekte Gene in höheren Organismen nachzuweisen, und um infektiöse Mikroorganismen (z. B. Bakterien, Pilze, Protisten und Hefen) und Viren nachzuweisen. DNA-Sequenzen können auch als ein Fingerabdruck dienen, um verschiedene Individuen innerhalb derselben Spezies zu bestimmen (Thompson, J. S. and M. W. Thompson, Hrsg., Genetics in Medicine, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1986)).
  • Derzeit werden mehrere Methoden zur Bestimmung von DNA verwendet. Beispielsweise können Nukleinsäuresequenzen identifiziert werden durch Vergleichen der Mobilität eines amplifizierten Nukleinsäurefragments mit einem bekannten Standard durch Gelelektrophorese, oder durch Hybridisierung mit einer Sonde, welche zu der zu identifizierenden Sequenz komplementär ist. Eine Identifizierung kann jedoch nur dann erreicht werden, wenn das Nukleinsäurefragment mit einer empfindlichen Reporterfunktion (z. B. radioaktiv (32P, 35S), fluoreszierend oder chemilumineszent) markiert ist. Radioaktive Markierungen können jedoch gesundheitsgefährend sein, und die von ihnen erzeugten Signale nehmen im Zeitverlauf ab. Nicht-Isotopen-Markierungen (z. B. Fluoreszenzmarkierungen) haben eine geringere Empfindlichkeit, und bei Verwendung von Hochintensitätslasern bleicht das Signal aus. Zusätzlich sind die Durchführung von Markierung, Gelelektrophorese und nachfolgender Bestimmung arbeitsintensive, zeitraubende und fehleranfällige Verfahren. Elektrophorese ist insbesondere fehleranfällig, da die Größe oder die Molekülmasse der Nukleinsäure nicht direkt mit der Mobilität in der Gelmatrix korreliert werden können. Es ist bekannt, dass sequenzspezifische Effekte, Sekundärstrukturen und Wechselwirkungen mit der Gelmatrix Artefakte hervorrufen.
  • Methoden zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, welche die Verwendung von Elektrophorese und/oder die Markierung von Nukleinsäuren mit Reporterfunktionen erfordern, sind beispielsweise in WO 93/20236 , JP6294796 , Landegren et al., Science (1998), Seiten 229–237, EP-A-412883 , WO 92/15712 , WO 91/13075 und WO 91/15600 beschrieben.
  • Im Allgemeinen stellt Massenspektrometrie ein Mittel zum ”Wiegen” von individuellen Molekülen bereit, indem die Moleküle in vacuo ionisiert werden und durch Verdampfen zum ”Fliegen” gebracht werden. Unter dem Einfluss von Kombinationen von elektrischen und magnetischen Feldern folgen die Ionen Flugbahnen in Abhängigkeit von ihrer individuellen Masse (m) und Ladung (z). Auf dem Gebiet von Molekülen mit niedriger Molekülmasse ist Massenspektrometrie seit langem ein Bestandteil des routinemäßigen physikalisch-organischen Repertoires zur Analyse und Charakterisierung organischer Moleküle durch die Bestimmung der Masse des Stammmolekülions. Zusätzlich wird, indem Kollisionen dieses Stammmolekülions mit anderen Partikeln (z. B. Argonatomen) veranlasst werden, das Molekülion durch die so genannte Kollisions-induzierte Dissoziation (CID) fragmentiert, wobei sekundäre Ionen gebildet werden. Das Fragmentierungsmuster bzw. der Fragmentierungsweg ermöglicht oftmals, detaillierte Strukturinformation abzuleiten. Es sind viele Anwendungen massenspektrometrischer Methoden in der Technik, insbesondere in den Biowissenschaften bekannt, und eine Zusammenfassung kann gefunden werden in Methods in Enzymology, Vol. 193: ”Mass Spectrometry” (Hrsg. J. A. McCloskey), 1990, Academic Press, New York.
  • Aufgrund der offensichtlichen analytischen Vorteile von Massenspektrometrie hinsichtlich der Bereitstellung von hoher Nachweisempfindlichkeit, hoher Genauigkeit der Massebestimmung, detaillierter Strukturinformation durch CID in Verbindung mit einer MS/MS-Konfiguration und Geschwindigkeit, sowie online-Datentransfer zu einem Computer besteht ein beträchtliches Interesse, Massenspektrometrie für die Strukturanalyse von Nukleinsäuren zu verwenden. Neuere Übersichten, welche dieses Gebiet zusammenfassen, umfassen K. H. Schram, ”Mass Spectometry of Nucleic Acid Components. Biomedical Applications of Mass Spectrometry” 34, 203–287 (1990); und P. F. Crain, ”Mass Spectrometric Techniques in Nucleic Acid Research”, Mass Spectrometry Reviews 9, 505–554 (1990).
  • Nukleinsäuren sind jedoch stark polare Biopolymere, die schwierig zu verdampfen sind. Dementsprechend war die massenspektrometrische Bestimmung auf synthetische Oligonukleotide mit niedriger Molekülmasse begrenzt, indem die Masse des Stammmolekülions bestimmt und dadurch die bereits bekannte Oligonukleotidsequenz bestätigt wurde, oder alternativ die bereits bekannte Sequenz bestätigt wurde durch die Erzeugung von sekundären Ionen (Fragmentionen) über CID in einer MS/MS-Konfiguration, wobei für die Ionisierung und Verdampfung insbesondere die Methode des Beschusses mit schnellen Atomen (FAB Massenspektrometrie) oder der Plasmadesorption (PD Massenspektrometrie) verwendet wurde. Als ein Beispiel wurde die Anwendung von FAB für die Analyse von geschützten Dimerblöcken für die chemische Synthese von Oligodeoxynukleotiden beschrieben (Köster et al., Biomedical Enviromental Mass Spectrometry 14, 111–116 (1987)).
  • Zwei weitere neuere Ionisierungs/Desorptionstechniken sind Elektrospray/Ionenspray (ES) und Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI). ES-Massenspektrometrie wurde von Fenn et al. (J. Phys. Chem. 88, 4451–59 (1984); PCT-Anmeldung Nr. WO 90/14148 ) eingeführt, und derzeitige Anwendungen sind in kürzlich erschienenen Übersichtsartikeln zusammengefasst (R. D. Smith et al., Anal. Chem. 62, 882–899 (1990) und B. Ardrey, Electrospray Mass Spectrometry, Spectroscopy Europe 4, 10–18 (1992)). Die Molekülmassen eines Tetradecanukleotids (Covey et al., ”The Determination of Protein, Oligonucleotide and Peptide Molecular Weights by Ionspray Mass Spectrometry”, Rapid Communications in Mass Spectrometry 2, 249–256 (1988)), und eines 21-mers (Methods in Enzymology 193, ”Mass Spectrometry” (Hrsg. McCloskey), Seite 425, 1990, Academic Press, New York) wurden veröffentlicht. Als Masseanalysator wird zumeist ein Quadrupol verwendet. Die Bestimmung von Molekülmassen in Femtomol-Probemengen ist aufgrund der Gegenwart zahlreicher Ionenpeaks, welche alle für die Massenberechnung verwendet werden konnten, sehr genau.
  • MALDI Massenspektrometrie kann im Gegensatz dazu insbesondere attraktiv sein, wenn eine Flugzeit (TOF, time-of-fligth) Konfiguration als ein Massanalysator verwendet wird. Die MALDI-TOF Massenspektrometrie ist von Hillenkamp et al. (”Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules”, Biological Mass Spectrometry (Hrsg. Burlingame und McCloskey), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Seiten 49–60, 1990) eingeführt worden. Da mit dieser Technik in den meisten Fällen keine zahlreichen Molekülionenpeaks erzeugt werden, sehen die Massenspektren im Prinzip einfacher aus, verglichen zu ES Massenspektrometrie.
  • Obwohl DNA-Moleküle bis zu einer Molekülmasse von 410.000 Dalton desorbiert und verdampft worden sind (Williams et al., ”Volatilization of High Molecular Weight DNA by Pulsed Laser Ablation of Frozen Aqueous Solutions”, Science 246, 1585–87 (1989)), hat diese Technik bisher nur geringe Auflösung gezeigt (Oligothymidinsäuren bis zu 18 Nukleotiden, Huth-Fehre et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry 6, 209–13 (1992); DNA-Fragmente mit einer Länge von bis zu 500 Nukleotiden, K. Tang et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry 8, 727–730 (1994); und eine doppelsträngige DNA mit 28 Basenpaaren, Williams et al., ”Time-of Flight Mass Spectrometry of Nucleic Acids by Laser Ablation and Ionization from a Frozen Aqueous Matrix”, Rapid Communications in Mass Spectrometry 4, 348–351 (1990)).
  • Das japanische Patent Nr. 59-131909 beschreibt ein Instrument, welches Nukleinsäurefragmente nachweist, die durch Elektrophorese, Flüssigchromatographie oder Hochgeschwindigkeitsgelfiltration aufgetrennt worden sind. Massenspektrometrischer Nachweis wird erreicht durch Einbau von Atomen, die normalerweise nicht in DNA vorkommen, wie etwa S, Br, I oder Ag, Au, Pt, Os, Hg, in die Nukleinsäuren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt massenspektrometrische Verfahren zum Nachweis einer besonderen Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe bereit. In Abhängigkeit von der nachzuweisenden Sequenz können die Verfahren dazu verwendet werden, um beispielsweise eine Erbkrankheit oder Chromosomenabnormalität, eine Prädisposition für eine Krankheit oder Störung (z. B. Fettleibigkeit, Arteriosklerose, Krebs) oder eine Infektion durch einen pathogenen Organismus (z. B. Virus, Bakterienparasit oder Pilz) zu diagnostizieren (z. B. pränatal oder postnatal), oder um Information bezüglich Identität, Erbanlagen oder Kompatibilität (z. B. HLA-Phänotypisierung) bereitzustellen.
  • In einer ersten Ausführungsform werden ein oder mehrere Detektornukleinsäuremoleküle (z. B. ein Oligonukleotid oder Oligonukleotidmimetikum), welche zu der nachzuweisenden Targetstelle komplementär ist, mit der nachzuweisenden Targetstelle hybridisiert, und nicht hybridisiertes Oligonukleotid wird entfernt. Das Produkt wird ionisiert und verdampft und danach mittels Massenspektrometrie analysiert, wobei der Nachweis des Detektoroligonukleotids durch Massenspektrometrie das Vorliegen der Targetnukleinsäure in der biologischen Probe anzeigt.
  • Ein Nukleinsäuremolekül, welches die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz (d. h. das Target) enthält, kann anfangs auf einem festen Träger immobilisiert werden. Eine Immobilisierung kann beispielsweise verwirklicht werden auf Basis von Hybridisierung zwischen einem Abschnitt des Targetnukleinsäuremoleküls, der von der nachzuweisenden Targetstelle verschieden ist, und einem Einfangnukleinsäuremolekül, das zuvor auf einem festen Träger immobilisiert worden ist. Alternativ kann eine Immobilisierung verwirklicht werden durch direktes Binden des Targetnukleinsäuremoleküls an den festen Träger. Bevorzugt ist zwischen dem Targetnukleinsäuremolekül und dem Träger ein Abstandhalter bzw. Spacer (z. B. ein Nukleinsäuremolekül) vorhanden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen wird die nachzuweisende Targetstelle vor dem Nachweis amplifiziert und werden die Nukleinsäuremoleküle konditioniert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die nachzuweisenden Targetsequenzen in einem Format angeordnet, welches mehrere gleichzeitige Nachweise (Multiplexverfahren) ermöglicht sowie parallele Verfahrensführung unter Verwendung von Oligonukleotidanordnungen (”DNA-Chips”).
  • In einer zweiten Ausführungsform ist die Immobilisierung des Targetnukleinsäuremoleküls ein fakultativer Schritt. Sobald ein Nukleinsäuremolekül aus einer biologischen Probe erhalten wurde, wird die nachzuweisende Targetsequenz amplifiziert und direkt durch Massenspektrometrie nachgewiesen. In bevorzugten Ausführungsformen werden die nachzuweisende Targetstelle und/oder die Detektoroligonukleotide vor dem massenspektrometrischen Nachweis konditioniert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die amplifizierten nachzuweisenden Targetsequenzen in einem Format angeordnet, welches mehrere gleichzeitige Nachweise (Multiplexverfahren) ermöglicht sowie parallele Verfahrensführung unter Verwendung von Oligonukleotidanordnungen (”DNA-Chips”).
  • In einer dritten Ausführungsform können Nukleinsäuremoleküle, welche von einem Nukleinsäuremolekül repliziert wurden, das aus einer biologischen Probe erhalten worden war, unter Verwendung einer oder mehrerer Nukleasen (unter Verwendung von Deoxyribonukleasen für DNA oder von Ribonukleasen für RNA) spezifisch verdaut werden. Die Fragmente werden mittels Massenspektrometrie analysiert, wobei die Bestimmung der Molekülmasse der Fragmente anzeigt, ob die Targetnukleinsäuresequenz vorhanden ist. Hybridisierungsereignisse und die tatsächlichen Molekülmassen der Targetsequenzen liefern Information darüber, ob und an welcher Stelle Mutationen in dem Gen vorhanden sind. Die Fragmente können auf einem festen Träger, welcher die entsprechenden komplementären Sequenzen aufweist, eingefangen werden. Die Anordnung kann Punkt für Punkt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert werden. DNA kann in ähnlicher Weise unter Verwendung eines Cocktails von Nukleasen, umfassend Restriktionsendonukleasen, verdaut werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleinsäurefragmente vor dem massenspektrometrischen Nachweis konditioniert.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird mindestens ein Primer mit einer 3'-endständigen Base, welche zu einem Allel (mutiert oder normal) komplementär ist, mit einem das Allel enthaltenden Targetnukleinsäuremolekül hybridisiert. Eine geeignete Polymerase und ein vollständiger Satz von Nukleosidtriphosphaten oder nur eines der Nukleosidtriphosphate werden in separaten Reaktionen verwendet um eine charakteristische Extension des Primers zu bewerkstelligen. Nur wenn der Primer korrekt annealt ist (d. h. kein Mismatch (fehlende Übereinstimmung) am 3'-Ende) und wenn das korrekte (d. h. komplementäre) Nukleosid zugegeben wird, wird der Primer extendiert. Die Produkte können aufgelöst werden durch Verschiebung der Molekülmassen, wie mittels Massenspektrometrie bestimmt.
  • In einer fünften Ausführungsform wird ein Nukleinsäureprimer, der zu einem einer Mutationsstelle benachbarten Abschnitt der nachzuweisenden Targetstelle komplementär ist, mit dem Targetnukleinsäuremolekül hybridisiert. Die Zugabe eines vollständigen Satzes von Dideoxynukleosiden, 3'-Deoxynukleosidtriphosphaten (z. B. pppAdd, pppTdd, pppCdd und pppGdd) oder Ribonukleotidtriphosphaten und einer Polymerase gestattet nur die Extension des Primers mit dem zu dem Targetnukleotid komplementären Dideoxynukleosid, 3'-Deoxynukleosid oder Ribonukleotidtriphosphat. Das Produkt wird ionisiert und verdampft und danach durch Massenspektrometrie analysiert, wobei der Nachweis des Primers durch Massenspektrometrie die Identität des Targetnukleotids bestimmt.
  • Das Nukleinsäuremolekül, welches die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz (d. h. das Target) enthält, kann anfangs auf einem festen Träger immobilisiert werden. Eine Immobilisierung kann beispielsweise verwirklicht werden auf Basis von Hybridisierung zwischen einem Abschnitt des Targetnukleinsäuremoleküls, der von der nachzuweisenden Targetstelle beabstandet ist, und einem Einfangnukleinsäuremolekül, das zuvor auf einem festen Träger immobilisiert worden ist. Alternativ kann eine Immobilisierung verwirklicht werden durch direktes Binden des Targetnukleinsäuremoleküls an den festen Träger. Bevorzugt ist zwischen dem Targetnukleinsäuremolekül und dem Träger ein Abstandhalter (z. B. ein Nukleinsäuremolekül) vorhanden.
  • In einer sechsten Ausführungsform wird eine Targetnukleinsäure mit einem komplementären Oligonukleotid hybridisiert, welches innerhalb einer Region, die eine Mutation M umfasst, an das Target hybridisiert. Der Heteroduplex wird danach mit einem Mittel in Kontakt gebracht, das spezifisch einen nicht hybridisierten Abschnitt spaltet (z. B. eine Einzelstrang-spezifische Endonuklease), so dass ein Mismatch, der die Gegenwart einer Mutation anzeigt, zu einer Spaltung der Targetnukleinsäure führt. Die zwei Spaltungsprodukte können danach durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden.
  • In einer siebten Ausführungsform, welche auf der Ligasekettenreaktion (LCR) beruht, wird eine Targetnukleinsäure mit einem Satz von Ligationsedukten und einer wärmestabilen DNA-Ligase hybridisiert, so dass die Ligationsedukte kovalent aneinander gebunden werden, wobei ein Ligationsprodukt gebildet wird.
  • Das Ligationsprodukt kann danach durch Massenspektrometrie nachgewiesen und mit einem bekannten Wert verglichen werden. Wenn die Reaktion zyklisch durchgeführt wird, kann das erhaltene Ligationsprodukt amplifiziert werden um den Nachweis kleiner Volumina an Targetnukleinsäure zu erleichtern. Selektion zwischen Wildtyp- und mutierten Primern an der Ligationsstelle kann zum Nachweis einer Punktmutation führen.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren stellen erhöhte Genauigkeit und Zuverlässigkeit des Nachweises von Nukleinsäuren durch Massenspektrometrie bereit. Zusätzlich ermöglichen die Verfahren strenge Kontrollen um falsch negative oder positive Ergebnisse zu verhindern. Die erfindungsgemäßen Verfahren vermeiden Elektrophoreseschritte, Markierung und nachfolgenden Nachweis einer Markierung. Tatsächlich erfordert das gesamte Verfahren, umfassend Nukleinsäureisolierung, Amplifizierung und massenspektrometrische Analyse schätzungsweise lediglich etwa 2–3 Stunden. Daher sind die hierin offenbarten erfindungsgemäßen Verfahren schneller und kostengünstiger durchzuführen als existierende Systeme zum DNA-Nachweis. Da die hierin offenbarten Verfahren die Identifizierung und den Nachweis der Nukleinsäurefragmente gleichzeitig anhand ihrer spezifischen Molekülmassen (ein eindeutiger physikalischer Standard) ermöglichen, sind die offenbarten Verfahren zusätzlich auch erheblich genauer und zuverlässiger als derzeit verfügbare Verfahren.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zum Durchführen einer massenspektrometrischen Analyse an einer nachzuweisenden Targetstelle bzw. einer Targetdetektionsstelle (TDS), welche in einem aus einer biologischen Probe erhaltenen Targetnukleinsäuremolekül (T) enthalten ist, zeigt. Eine spezifische Einfangsequenz (C) ist über einen Abstandhalter (S) an einem festen Träger (SS) gebunden. Die Einfangsequenz ist derart ausgewählt, so dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz auf dem Targetnukleinsäuremolekül (T), bezeichnet als die Targeteinfangstelle (TCS), hybridisiert. Der Abstandhalter (S) erleichtert eine unbehinderte Hybridisierung. Eine Detektornukleinsäuresequenz (D), welche zu der TDS komplementär ist, wird danach mit der TDS in Kontakt gebracht. Eine Hybridisierung zwischen D und der TDS kann mittels Massenspektrometrie nachgewiesen werden.
  • 1B ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zum Durchführen einer massenspektrometrischen Analyse an mindestens einer Targetdetektionsstelle (hier TDS1 und TDS2) über direkte Bindung an einen festen Träger zeigt. Die Targetsequenz (T), welche die Targetdetektionsstelle (TDS1 und TDS2) enthält, wird über die Bildung einer reversiblen oder irreversiblen Bindung, welche über eine geeignete Funktionalität (L') auf dem Targetnukleinsäuremolekül (T) und eine geeignete Funktionalität (L) auf dem festen Träger gebildet wird, auf einem festen Träger immobilisiert. Detektornukleinsäuresequenzen (hier D1 und D2), welche zu einer Targetdetektionsstelle (TDS1 oder TDS2) komplementär sind, werden danach mit der TDS in Kontakt gebracht. Hybridisierung zwischen TDS1 und D1 und/oder TDS2 und D2 kann auf Basis von Molekülmassendifferenzen nachgewiesen und unterschieden werden.
  • 1C ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zum Nachweis einer Wildtypsequenz (Dwt) und/oder einer mutierten Sequenz (Dmut) in einem Targetnukleinsäuremolekül (T) zeigt. Wie in 1A ist eine spezifische Einfangsequenz (C) über einen Abstandhalter (S) an einen festen Träger (SS) gebunden. Zusätzlich ist die Einfangsequenz derart ausgewählt, so dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz auf der Targetsequenz (T) wechselwirkt, wobei die nachzuweisende Targeteinfangstelle (TCS) durch Hybridisierung nachzuweisen ist. Wenn die Targetdetektionsstelle (TDS) jedoch eine Mutation X umfasst, welche die Molekülmasse ändert, können mutierte Targetdetektionsstellen durch Massenspektrometrie vom Wildtyp unterschieden werden. Bevorzugt ist das Detektornukleinsäuremolekül (D) derart ausgelegt, so dass die Mutation in der Mitte des Moleküls vorliegt und daher nicht zu einer stabilen Hybride führen würde, wenn das Wildtyp-Detektoroligonukleotid (Dwt) z. B. als eine Kontrolle mit der Targetdetektorsequenz in Kontakt gebracht wird. Die Mutation kann auch nachgewiesen werden, wenn das mutierte Detektoroligonukleotid (Dmut) mit der einen Match ausbildenden Base an der mutierten Position für die Hybridisierung verwendet wird. Wenn ein aus einer biologischen Probe erhaltenes Nukleinsäuremolekül für die besondere Sequenz heterozygot ist (d. h. sowohl Dwt als auch Dmut enthält), binden sowohl Dwt als auch Dmut an den entsprechenden Strang und die Massendifferenz ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Dwt und Dmut.
  • 2 ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zeigt, bei dem mehrere Mutationen gleichzeitig auf einer Targetsequenz unter Verwendung entsprechender Detektoroligonukleotide nachgewiesen werden. Die Molekülmassendifferenzen zwischen den Detektoroligonukleotiden D1, D2 und D3 müssen groß genug sein, so dass ein gleichzeitiger Nachweis (Multiplexverfahren) möglich ist. Dies kann bewirkt werden durch die Sequenz selbst (Zusammensetzung oder Länge), oder durch Einführen von Massen-modifizierenden Funktionalitäten M1–M3 in das Detektoroligonukleotid.
  • 3 ist ein Diagramm, welches ein nochmals weiteres Multiplexdetektionsformat zeigt. In dieser Ausführungsform wird eine Unterscheidung bewirkt durch Verwendung unterschiedlicher spezifischer Einfangsequenzen, welche positionsspezifisch auf einer ebenen Oberfläche (z. B. einer ”Chip-Anordnung”) immobilisiert sind. Wenn unterschiedliche Targetsequenzen T1–Tn vorhanden sind. Wechselwirken ihre Targeteinfangstellen TCS1–TCSn mit komplementären immobilisierten Einfangsequenzen C1–Cn. Ein Nachweis wird bewirkt durch Verwendung von Detektoroligonukleotiden D1–Dn mit geeigneter Massendifferenz, wobei die Massendifferenzen entweder von ihren Sequenzen oder von Massen-modifizierenden Funktionalitäten M1–Mn bedingt sind.
  • 4 ist ein Diagramm, welches ein Format zeigt, worin eine zuvor konstruierte Targeteinfangstelle (TCS) unter Verwendung von PCR-Amplifikation in die Targetsequenz eingeführt wird. Nur ein Strang wird eingefangen, der andere wird entfernt (z. B. auf Basis der Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen). Wenn das Biotin an Primer 1 gebunden ist, kann der andere Strang durch eine TCS geeignet markiert werden. Der Nachweis erfolgt wie vorstehend beschrieben durch die Wechselwirkung eines spezifischen Detektoroligonukleotids D mit der entsprechenden Targetdetektionsstelle TDS über Massenspektrometrie.
  • 5 ist ein Diagramm, welches zeigt, wie Amplifikationsprodukte (hier über Ligasekettenreaktion (LCR)) hergestellt und über Massenspektrometrie nachgewiesen werden können. Unterscheidung der Massen kann bewirkt werden über die an die Primer (P1 bzw. P4) gebundenen Massen-modifizierenden Funktionalitäten (M1 und M2). Ein Nachweis durch Massenspektrometrie kann direkt bewirkt werden (d. h. ohne eine Verwendung von Immobilisierung und Targeteinfangstellen (TCS)). Durch Bereitstellen einer geordneten Anordnung von Einfangsequenzen (C) können mehrere LCR-Reaktionen parallel durchgeführt werden. Dieses Format ermöglicht eine Auftrennung der Ligationsprodukte und eine Identifizierung Punkt für Punkt durch Massenspektrometrie, oder ein Multiplexverfahren, wenn die Massenunterscheidung ausreichend ist.
  • 6A ist ein Diagramm, welches die massenspektrometrische Analyse eines durch ein Transkriptionsamplifizierungsverfahren amplifizierten Nukleinsäuremoleküls zeigt. Eine RNA-Sequenz wird über ihre TCS-Sequenz eingefangen, so dass Wildtyp- und mutierte Targetdetektionsstellen wie vorstehend durch Verwendung geeigneter Detektoroligonukleotide (D) nachgewiesen werden können.
  • 6B ist ein Diagramm, welches ein Multiplexverfahren zum Nachweis zweier verschiedener (mutierter) Stellen auf der gleichen RNA gleichzeitig unter Verwendung Massen-modifizierter Detektoroligonukleotide M1–D1 und M2–D2 zeigt.
  • 6C ist ein Diagramm eines unterschiedlichen Multiplexverfahrens zum Nachweis spezifischer Mutationen unter Verwendung Massen-modifizierter Dideoxynukleosid- oder 3'-Deoxynukleosidtriphosphate und einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase. Alternativ können eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und Ribonukleotidtriphosphate verwendet werden. Dieses Format ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis aller vier möglichen Basen an einer Mutationsstelle (X).
  • 7A ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse an einer Targetdetektionsstelle (TDS), welche in einem aus einer biologischen Probe erhaltenen Targetnukleinsäuremolekül (T) vorhanden ist, zeigt. Eine spezifische Einfangsequenz (C) ist über einen Abstandhalter (S) an einen festen Träger (SS) gebunden. Die Einfangsequenz ist derart ausgewählt, so dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz auf T, bezeichnet als die Targeteinfangstelle (TCS), hybridisiert. Ein Nukleinsäuremolekül, das zu einem Abschnitt der TDS komplementär ist, wird 5' der Mutationsstelle (X) innerhalb der TDS an die TDS hybridisiert. Die Zugabe eines vollständigen Satzes von Dideoxynukleosiden oder 3'-Deoxynukleosidtriphosphaten (z. B. pppAdd, pppTdd, pppCdd und pppGdd) und einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase gestattet, dass nur das zu X komplementäre Dideoxynukleosid oder 3'-Deoxynukleosidtriphosphat angefügt wird.
  • 7B ist ein Diagramm, welches ein Verfahren zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse zum Nachweis der Gegenwart einer Mutation an einer potentiellen Mutationsstelle (M) in einem Nukleinsäuremolekül zeigt. Dieses Format ermöglicht eine gleichzeitige Analyse beider Allele (A) und (B) eines doppelsträngigen Targetnukleinsäuremoleküls, so dass eine Diagnose von normal homozygot, mutiert homozygot und heterozygot bereitgestellt werden kann. Allel A und B werden jeweils mit komplementären Oligonukleotiden ((C) bzw. (D)) hybridisiert, welche innerhalb einer Region, die M umfasst, an A und B hybridisieren. Jeder Heteroduplex wird danach mit einer Einzelstrang-spezifischen Endonuklease in Kontakt gebracht, so dass ein Mismatch an Position M, der die Gegenwart einer Mutation anzeigt, zur Spaltung von (C) und/oder (D) führt, was danach durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden kann.
  • 8 ist ein Diagramm, welches zeigt, wie beide Stränge einer Target-DNA für den Nachweis vorbereitet werden können, unter Verwendung von Transkriptionsvektoren mit zwei verschiedenen Promotoren an gegenüber liegenden Positionen (z. B. der SP6 und der T7 Promoter). Dieses Format ist insbesondere nützlich für den Nachweis von heterozygoten Targetdetektionsstellen (TDS). Unter Verwendung von SP6 oder T7 RNA-Polymerase könnten beide Stränge separat oder gleichzeitig transkribiert werden. Beide RNA können spezifisch eingefangen werden und gleichzeitig unter Verwendung von Detektoroligonukleotiden mit geeigneter Massendifferenz nachgewiesen werden. Dies kann entweder direkt in Lösung oder durch parallele Bearbeitung vieler Targetsequenzen an einer geordneten Anordnung spezifisch immobilisierter Einfangsequenzen bewirkt werden.
  • 9 ist ein Diagramm, welches zeigt, wie RNA, die hergestellt wurden wie in den 6, 7 und 8 beschrieben, unter Verwendung einer oder mehrerer Ribonukleasen spezifisch verdaut, und die Fragmente an einem festen Träger, welcher die entsprechenden komplementären Sequenzen aufweist, eingefangen werden können. Hybridisierungsereignisse und die tatsächlichen Molekülmassen der eingefangenen Targetsequenzen liefern Information darüber, ob und an welcher Stelle Mutationen in dem Gen vorhanden sind. Die Anordnung kann Punkt für Punkt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert werden. DNA kann in ähnlicher Weise unter Verwendung eines Cocktails von Nukleasen, umfassend Restriktionsendonukleasen, verdaut werden. Mutationen können nachgewiesen werden durch unterschiedliche Molekülmassen spezifischer individueller Fragmente im Vergleich zu den Molekülmassen der Wildtypfragmente.
  • 10A zeigt ein aus dem im nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment resultierendes Spektrum. Abbildung i) zeigt die Absorption des 26-mers vor Hybridisierung. Abbildung ii) zeigt das Filtrat der Zentrifugation nach Hybridisierung. Abbildung iii) zeigt die Ergebnisse nach dem ersten Waschschritt mit 50 mM Ammoniumcitrat. Abbildung iv) zeigt die Ergebnisse nach dem zweiten Waschschritt mit 50 mM Ammoniumcitrat.
  • 10B zeigt ein Spektrum, welches aus dem im nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment nach drei Wasch/Zentrifugationsschritten resultiert.
  • 10C zeigt ein Spektrum, welches aus dem im nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment resultiert, und das die erfolgreiche Desorption des hybridisierten 26-mers von den Kügelchen zeigt.
  • 11 zeigt ein Spektrum, welches aus dem im nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment resultiert, und das die erfolgreiche Desorption des hybridisierten 40-mers zeigt. Die Nachweiseffizienz legt nahe, dass auch erheblich längere Fragmente als 40-mere desorbiert werden können.
  • 12 zeigt ein Spektrum, welches aus dem im nachfolgenden Beispiel 2 beschriebenen Experiment resultiert, und das die erfolgreiche Desorption und Unterscheidung eines 18-mers und eines 19-mers durch Elektrospray-Massenspektrometrie zeigt; das Gemisch (oben); hervorgehobene Peaks, die auf das 18-mer zurückzuführen sind (Mitte); und hervorgehobene Peaks, die auf das 19-mer zurückzuführen sind (unten).
  • 13 ist eine graphische Darstellung des Verfahrens zum Nachweis der Mukoviszidose-Mutation ΔF508, wie in Beispiel 3 beschrieben.
  • 14 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 homozygot normalen Probe.
  • 15 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 heterozygot mutierten Probe.
  • 16 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 homozygot normalen Probe.
  • 17 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 homozygot mutierten Probe.
  • 18 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 heterozygot mutierten Probe.
  • 19 ist eine graphische Darstellung der verschiedenen Verfahren zur Durchführung einer Genotypisierung von Apolipoprotein E.
  • 20 zeigt die Nukleinsäuresequenz von normalem Apolipoprotein E (kodiert vom E3 Allel) und von anderen Isotypen, die von den Allelen E2 und E4 kodiert werden.
  • 21A zeigt ein zusammengesetztes Restriktionsmuster für verschiedene Apolipoprotein E-Genotypen.
  • 21B zeigt das in einem 3,5% MetPhor Agarosegel erhaltene Restriktionsmuster für verschiedene Apolipoprotein E-Genotypen.
  • 21C zeigt das in einem 12% Polyacrylamidgel erhaltene Restriktionsmuster für verschiedene Apolipoprotein E-Genotypen.
  • 22A ist eine Tabelle, welche die Molekülmassen der 91-, 83-, 72-, 48- und 35-Basenpaarfragmente, die durch Restriktionsenzymspaltung der Allele E2, E3 und E4 von Apolipoprotein E erhalten wurden, zeigt.
  • 22B ist das Massenspektrum des Restriktionsprodukts eines homozygoten E4 Apolipoprotein E Genotyps.
  • 23A ist das Massenspektrum des Restriktionsprodukts eines homozygoten E3 Apolipoprotein E Genotyps.
  • 23B ist das Massenspektrum des Restriktionsprodukts eines E3/E4 Apolipoprotein E Genotyps.
  • 24 ist eine Autoradiographie eines 7,5% Polyacrylamidgels, auf das 10% (5 μl) jeder PCR aufgetragen wurden. Probe M: Alul-verdauter pBr322; Probe 1: HBV-positiv nach serologischer Analyse; Probe 2: ebenfalls HBV-positiv; Probe 3: ohne serologische Analyse, aber mit einem erhöhten Transaminasenwert, was eine Leberkranknheit andeutet; Probe 4: HBV-negativ; Probe 5: HBV-positiv nach serologischer Analyse; Probe 6: HBV-negativ, (–) Negativkontrolle, (+) Positivkontrolle. Anfärbung erfolgte mit Ethidiumbromid.
  • 25A ist ein Massenspektrum von Probe 1, die HBV-positiv ist. Das Signal bei 20754 Da stellt das HBV-verwandte PCR-Produkt dar (67 Nukleotide, berechnete Masse: 20735 Da). Das Massensignal bei 10390 Da stellt das [M+2H]2+ Signal dar (berechnet: 10378 Da).
  • 25B ist ein Massenspektrum von Probe 3, die nach PCR, serologischen Untersuchungen und Untersuchungen auf Basis von Dot Blots HBV-negativ ist. Das PCR-Produkt wird lediglich in Spurenmengen hergestellt. Nichtsdestoweniger wird es eindeutig bei 20751 Da (berechnet 20735 Da) nachgewiesen. Das Massensignal bei 10397 Da stellt das [M+2H]2+ Molekülion dar (berechnet: 10376 Da).
  • 25C ist ein Massenspektrum von Probe 4, die HBV-negativ aber CMV-positiv ist. Wie erwartet konnten keine HBV-spezifischen Signale erhalten werden.
  • 26 zeigt einen Teil des E. coli lacl-Gens mit Bindungsstellen der in der Ligasekettenreaktion (LCR) verwendeten komplementären Oligonukleotide. Hier ist die Wildtypsequenz abgebildet. Die Mutante enthält eine Punktmutation an bp 191, was auch die Ligationsstelle ist (fett). Die Mutation ist eine Transition von C nach T (bzw. G nach A). Dies führt zu einem T-G-Mismatch mit Oligo A (bzw. einem A-C-Mismatch mit Oligo B).
  • 27 ist ein mit Ethidiumbromid angefärbtes 7,5% Polyacrylamidgel. M: Längenstandard (Mspl-verdaute pUC19 DNA). Bahn 1: LCR mit Wildtyptemplat. Bahn 2: LCR mit mutiertem Templat. Bahn 3: (Kontrolle) LCR ohne Templat. Das Ligationsprodukt (50 bp) wurde nur in der positiven, Wildtyptemplat enthaltenden Reaktion erzeugt.
  • 28 ist ein HPLC-Chromatogramm von zwei gepoolten positiven LCR.
  • 29 zeigt ein HPLC-Chromatogramm der gleichen Bedingungen, aber es wurde mutiertes Templat verwendet. Das schwache Signal des Ligationsprodukts beruht entweder auf Templat-freier Ligation der Edukte oder einer Ligation an einem (G-T, A-C) Mismatch. Das ”falsch positive” Signal ist signifikant schwächer als das in 28 abgebildete Signal des Ligationsprodukts mit Wildtyptemplat. Die Analyse der Ligationsedukte führt zu ”Doppelpeaks”, da zwei der Oligonukleotide 5'-phosphoryliert sind.
  • 30. In a ist das komplexe, durch MALDI-TOF-MS Analyse von Pfu DNA-Ligase-Lösung erhaltene Signalmuster abgebildet. In b ist ein MALDI-TOF Spektrum einer ungereinigten LCR gezeigt. Das Massensignal bei 67569 Da stellt vermutlich die Pfu DNA-Ligase dar.
  • 31 zeigt ein MALDI-TOF Spektrum von zwei gepoolten positiven LCR (a). Das Signal bei 7523 Da stellt nicht ligiertes Oligo A dar (berechnet: 7521 Da), während das Signal bei 15449 Da das Ligationsprodukt darstellt (berechnet: 15450 Da). Das Signal bei 3774 Da ist das [M+2H]2+ Signal von Oligo A. Die Signale im Massenbereich unter 2000 sind auf die Matrixionen zurückzuführen. Das Spektrum entspricht Bahn 1 in 2A und dem Chromatogramm in 2B. In b ist ein Spektrum von zwei gepoolten negativen LCR (mutiertes Templat) gezeigt. Das Signal bei 7517 Da stellt Oligo A dar (berechnet: 7521 Da). In c ist ein Spektrum von zwei gepoolten Kontrollreaktionen (mit Lachssperma-DNA als Templat) abgebildet. Die Signale im Massenbereich um 2000 Da sind auf Tween20 zurückzuführen.
  • 32 zeigt ein Spektrum, das von zwei gepoolten LCR erhalten wurde, bei denen lediglich Lachssperma-DNA als eine negative Kontrolle verwendet worden war; wie erwartet konnte lediglich Oligo A nachgewiesen werden.
  • 33 zeigt ein Spektrum von zwei gepoolten positiven LCR (a). Die Reinigung wurde durchgeführt mit einer Kombination aus Ultrafiltration und Streptavidin-DynaBeads, wie im Text beschrieben. Das Signal bei 15448 Da stellt das Ligationsprodukt dar (berechnet: 15450 Da). Das Signal bei 7527 Da stellt Oligo A dar (berechnet: 7521 Da). Die Signale bei 3761 sind das [M+2H]2+ Signal von Oligo A, während das Signal bei 5140 Da das [M+3H]2+ Signal des Ligationsprodukts ist. In b ist ein Spektrum von zwei gepoolten negativen LCR (ohne Templat) gezeigt. Das Signal bei 7514 Da stellt Oligo A dar (berechnet: 7521 Da).
  • 34 ist eine schematische Darstellung der Oligobasisextension des Mutationsdetektionsprimers B unter Verwendung von ddTTP (A) bzw. ddCTP (B) im Reaktionsgemisch. Die theoretische Massenberechnung ist in Klammern angegeben. Die gezeigte Sequenz ist ein Teil von Exon 10 des CFTR-Gens, das die am häufigsten auftretende Mucoviszidosemutation ΔF508 und die selteneren Mutationen Δ1507 sowie Ile506Ser trägt.
  • 35 sind MALDI-TOF-MS Spektren, die direkt von präzipitierten Oligobasisextendierten Primern aufgezeichnet wurden. Die jeweils oberen Spektren (ddTTP bzw. ddCTP) zeigen den annealten Primer (CF508) ohne weitere Extensionsreaktion. Das Diagnosetemplat ist unterhalb jedes Spektrums angegeben und die beobachteten/erwarteten Molekülmassen sind in Klammern angeführt.
  • 36 zeigt denjenigen Teil der Sequenz von pRFc1-DNA, der als Templat für die PCR-Amplifikation von unmodifizierten und 7-Deazapurin-enthaltenden 99-mer und 200-mer Nukleinsäuren verwendet wurde, sowie die Sequenzen der 19-mer Primer und der zwei 18-mer reversen Primer.
  • 37 zeigt denjenigen Teil der Nukleotidsequenz von M13mp18 RFI-DNA, der für die PCR-Amplifikation von unmodifizierten und 7-Deazapurin-enthaltenden 103-mer Nukleinsäuren verwendet wurde. Ebenfalls gezeigt sind die Nukleotidsequenzen der in der PCR verwendeten 17-mer Primer.
  • 38 zeigt das Ergebnis einer Polyacrylamidgelelektrophorese von PCR-Produkten, die für eine MALDI-TOF MS Analyse gereinigt und aufkonzentriert worden waren. M: Längenmarker; Bahn 1: 7-Deazapurin-enthaltendes 99-mer PCR-Produkt; Bahn 2: unmodifiziertes 99-mer; Bahn 3: 7-Deazapurin-enthaltendes 103-mer; und Bahn 4: unmodifiziertes 103-mer PCR-Produkt.
  • 39: ein Autoradiogramm einer Polyacrylamidgelelektrophorese von PCR-Reaktionen, die mit 5'-[32P]-markierten Primern 1 und 4 durchgeführt wurden. Bahnen 1 und 2: unmodifiziertes und 7-Deazapurin-modifiziertes 103-mer PCR-Produkt (53321 und 23520 Zählimpulse); Bahnen 3 und 4: unmodifiziertes und 7-Deazapurin-modifiziertes 200-mer (71123 und 39582 Zählimpulse); und Bahnen 5 und 6: unmodifiziertes und 7-Deazapurin-modifiziertes 99-mer (173216 und 94400 Zählimpulse).
  • 40: a) MALDI-TOF Massenspektrum der unmodifizierten 103-mer PCR-Produkte (Summe aus zwölf Einzelspektren (singls shot)). Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (31768 u und 31759 u) beträgt 31763 u. Massenauflösung: 18. b) MALDI-TOF Massenspektrum von 7-Deazapurin-enthaltendem 103-mer PCR-Produkt (Summe aus drei Einzelspektren). Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (31727 u und 31719 u) beträgt 31723 u. Massenauflösung: 67.
  • 41: a) MALDI-TOF Massenspektrum des unmodifizierten 99-mer PCR-Produkts (Summe aus zwanzig Einzelspektren). Werte der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen: 30261 u und 30794 u. b) MALDI-TOF Massenspektrum des 7-Deazapurin-enthaltenden 99-mer PCR-Produkts (Summe aus zwölf Einzelspektren). Werte der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen: 30224 u und 30750 u.
  • 42: a) MALDI-TOF Massenspektrum des unmodifizierten 200-mer PCR-Produkts (Summe aus 30 Einzelspektren). Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (61873 u und 61595 u) beträgt 61734 u. Massenauflösung: 28. b) MALDI-TOF Massenspektrum von 7-Deazapurin-enthaltendem 200-mer PCR-Produkt (Summe aus 30 Einzelspektren). Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (61772 u und 61514 u) beträgt 61643 u. Massenauflösung: 39.
  • 43: a) MALDI-TOF Massenspektrum von 7-Deazapurin-enthaltendem 100-mer PCR-Produkt mit ribomodifizierten Primern. Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (30529 u und 31095 u) beträgt 30812 u. b) MALDI-TOF Massenspektrum des PCR-Produkts nach hydrolytischer Primerabspaltung. Der Mittelwert der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen (25104 u und 25229 u) beträgt 25167 u. Der Mittelwert der abgespaltenen Primer (5437 u und 5918 u) beträgt 5677 u.
  • 44A–D zeigt das MALDI-TOF Massenspektrum der vier Sequenzleitern, welche von einem 39-mer Templat (SEQ ID Nr. 13) erhalten wurden, das über eine 3'-Biotinylierung an Streptavidinkügelchen immobilisiert worden war. Für die Sequenzierung wurde ein 14-mer Primer (SEQ ID Nr. 14) verwendet.
  • 45 zeigt ein MALDI-TOF Massenspektrum einer Festphasensequenzierung eines 78-mer Templats (SEQ ID Nr. 15), das über eine 3'-Biotinylierung an Streptavidinkügelchen immobilisiert worden war. Für die Sequenzierung wurden ein 18-mer Primer (SEQ ID Nr. 16) und ddGTP verwendet.
  • 46 zeigt ein Schema, worin doppelsträngige DNA-Sonden mit Einzelstrangüberhang spezifische DNA-Template einfangen und auch als Primer zur Festphasensequenzierung dienen.
  • 47A–D zeigt ein MALDI-TOF Massenspektrum, das erhalten wurde von einem 5'-Fluoreszenz-markierten 23-mer (SEQ ID Nr. 19), annealt an ein 3'-biotinyliertes 18-mer (SEQ ID Nr. 20), wobei ein Überhang von 5 Basen verbleibt, der ein 15-mer Templat (SEQ ID Nr. 21) einfing.
  • 48 zeigt ein Stapelfluorogramm der gleichen Produkte, welche aus der in 35 beschriebenen Reaktion erhalten wurden, jedoch auf einer herkömmlichen DNA-Sequenziervorrichtung gefahren.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Im Allgemeinen stellt die vorliegende Erfindung massenspektrometrische Verfahren zum Nachweis einer besonderen Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe bereit. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff ”biologische Probe” jedes aus einer lebenden Quelle (z. B. Mensch, Tier, Pflanze, Bakterium. Pilz, Protist, Virus) erhaltene Material. Zur Verwendung in der Erfindung sollte die biologische Probe ein Nukleinsäuremolekül enthalten. Beispiele geeigneter biologischer Proben zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen: feste Materialien (z. B. Gewebe, Zellpellets, Biopsien) und biologische Fluide (z. B. Urin, Blut, Speichel, Fruchtwasser, Mundwasser).
  • Nukleinsäuremoleküle können aus einer besonderen biologischen Probe unter Verwendung einer Reihe von Verfahren isoliert werden, die in der Technik gut bekannt sind, wobei das besonders ausgewählte Isolierungsverfahren für die besondere biologische Probe geeignet ist. Beispielsweise können Frier-Auftau- und alkalische Lyseverfahren geeignet sein um Nukleinsäuremoleküle aus festen Materialien zu erhalten; Wärme und alkalische Lyseverfahren können geeignet sein um Nukleinsäuremoleküle aus Urin zu erhalten, und Proteinase K-Extraktion kann verwendet werden, um Nukleinsäure aus Blut zu erhalten (Rolff, A. et al., PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer (1994)).
  • Um eine geeignete Menge an Nukleinsäuremolekülen zu erhalten, mit denen eine Massenspektrometrie durchgeführt werden soll, kann eine Amplifikation erforderlich sein. Beispiele geeigneter Amplifikationsverfahren zur Verwendung in der Erfindung umfassen: Klonierung (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Polymerasekettenreaktion (PCR) (C. R. Newton and A. Graham, PCR, BIOS Publishers, 1994); Ligasekettenreaktion (LCR) (Wiedmann, M. et al. (1994), PCR Methods Appl. Vol. 3, Seiten 57–64; F. Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189–93 (1991)), Strangumordnungsamplifikation (SDA) (G. Terrance Walker et al., Nucleic Acids Res. 22, 2670–77 (1994)) und Variationen wie etwa RT-PCR (Higuchi et al., Bio/Technology 11: 1026–1030 (1993)); allelspezifische Amplifikation (ASA) und Verfahren auf Basis von Transkription.
  • Um die massenspektrometrische Analyse zu vereinfachen kann ein Nukleinsäuremolekül, das eine nachzuweisende Nukleinsäuresequenz enthält, auf einem festen Träger immobilisiert werden. Beispiele von geeigneten festen Trägern umfassen Kügelchen (z. B. Silikagel, Glas mit kontrollierter Porengröße, Magnetkügelchen, Sephadex/Sepharose, Cellulose), ebene Flächen oder Chips (z. B. Glasfaserfilter, Glasflächen, Metallflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Kupfer und Silizium), Kapillaren, Kunststoff (z. B. Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid-Membranen oder -Mikrotiterplatten)); oder Nadeln oder Kämme aus ähnlichen Materialien, umfassend Kügelchen oder ebene Flächen, oder Kügelchen, die in Vertiefungen in ebenen Flächen positioniert sind, wie etwa Wafer (z. B. Siliziumwafer).
  • Eine Immobilisierung kann beispielsweise bewirkt werden auf Basis von Hybridisierung zwischen einer Einfangnukleinsäuresequenz, welche bereits auf dem Träger immobilisiert worden ist, und einer komplementären Nukleinsäuresequenz, die ebenfalls in dem Nukleinsäuremolekül vorhanden ist, welches die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz enthält (1A). Damit die Hybridisierung zwischen den komplementären Nukleinsäuremolekülen nicht durch den Träger behindert wird, kann die Einfangnukleinsäure eine Abstandhalterregion mit einer Länge von mindestens etwa fünf Nukleotiden zwischen dem festen Träger und der Einfangnukleinsäuresequenz umfassen. Der gebildete Doppelstrang wird unter dem Einfluss des Laserimpulses gespalten, und die Desorption kann initiiert werden. Die an den festen Träger gebundene Basissequenz mittels natürlich vorkommender Oligoribo- oder Oligodeoxyribonukleotide dargestellt sein, sowie mittels Analoga (z. B. Thio-modifiziertes Phosphodiester- oder Phosphotriester-Grundgerüst) oder unter Verwendung von Oligonukleotidmimetika wie etwa PNA-Analoga (siehe z. B. Nielsen et al., Science 254, 1497 (1991)), welche die Basissequenz gegenüber enzymatischem Abbau unempfindlicher machen und damit die Gesamtstabilität der an den festen Träger gebundenen Basissequenz erhöhen.
  • Alternativ kann eine Targetdetektionsstelle direkt an einen festen Träger gebunden werden, über eine reversible oder irreversible Bindung zwischen einer geeigneten Funktionalität (L') auf dem Targetnukleinsäuremolekül (T) und einer geeigneten Funktionalität (L) auf dem Einfangmolekül (1B). Eine reversible Bindung kann derart sein, dass sie unter den Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten wird (d. h. eine durch Strahlung spaltbare Bindung wie etwa ein Ladungstransferkomplex oder eine labile Bindung, die zwischen relativ stabilen organischen Resten gebildet wird). Weiterhin kann die Bindung derart gebildet werden, so dass L' eine quaternäre Ammoniumgruppe ist, wobei dann die Oberfläche des festen Trägers bevorzugt negative Ladungen aufweist, die das negativ geladene Nukleinsäuregrundgerüst abstoßen und somit die zur Analyse durch ein Massenspektrometer erforderliche Desorption erleichtern. Desorption erfolgt entweder durch die von dem Laserimpuls erzeugte Wärme und/oder in Abhängigkeit von L durch spezifische Absorption von Laserenergie in Resonanz mit dem Chromphor von L'.
  • Als Beispiele kann die L-L' Chemie vom Typ her eine Disulfidbindung sein (chemisch spaltbar, beispielsweise durch Mercaptoethanol oder Dithioerythrol), ein Biotin/Streptavidin-System, ein heterobifunktionelles Derivat einer Tritylethergruppe (Köster et al., ”A Versstile Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic Biomolecules”, Tetrahedron Letters 31, 7095 (1990)), das unter schwach sauren Bedingungen sowie unter den Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten werden kann, eine Lävulingruppe, die unter nahezu neutralen Bedingungen mit einem Hydrazinium/Acetat-Puffer gespalten werden kann, eine Arginin-Arginin- oder Lysin-Lysin-Bindung, die durch ein Endopeptidaseenzym wie etwa Trypsin spaltbar ist, oder eine Pyrophosphatbindung, die durch eine Pyrophosphatase spaltbar ist, oder eine Ribonukleotidbindung innerhalb der Oligodeoxynukleotidsequenz, die beispielsweise durch eine Ribonuklease oder Alkali spaltbar ist.
  • Die Funktionalitäten L und L' können auch einen Ladungstransferkomplex bilden und dadurch die temporäre L-L'-Bindung ausbilden. Da in vielen Fällen die ”Ladungstransferbande” mittels UV/vis-Spektrometrie bestimmt werden kann (siehe z. B. Organic Charge Transfer Complexes von R. Foster, Academic Press, 1969), kann die Laserenergie auf die entsprechende Energie der Ladungstransferwellenlänge abgestimmt werden und somit eine spezifische Desorption vom festen Träger weg initiiert werden. Der Fachmann wird erkennen, dass eine Reihe von Kombination dafür in Frage kommen, und dass die Donorfunktionalität entweder am festen Träger vorliegen kann oder an das nachzuweisende Nukleinsäuremolekül gekoppelt sein kann, oder umgekehrt.
  • In einem nochmals weiteren Ansatz kann eine reversible L-L'-Bindung gebildet werden, indem homolytisch relativ stabile Reste gebildet werden. Unter dem Einfluss des Laserimpulses erfolgen Desorption (wie vorstehend diskutiert) sowie Ionisierung an der Position des Rests. Der Fachmann wird erkennen, dass andere organische Reste ausgewählt werden können, und dass bezüglich der Dissoziationsenergien, die erforderlich sind um die Bindung zwischen ihnen homolytisch zu spalten, eine entsprechende Laserwellenlänge ausgewählt werden kann (siehe z. B. Reactive Molecules von C. Wentrup, John Wiley & Sons, 1984).
  • Eine Verankerungsfunktion L' kann auch in eine Targeteinfangsequenz eingeführt werden, indem während eines Amplifikationsverfahrens, wie etwa PCR (4), LCR (5), oder Transkriptionsamplifikation (6A), geeignete Primer verwendet werden.
  • Vor der massenspektrometrischen Analyse kann es nützlich sein Nukleinsäuremoleküle zu ”konditionieren”, beispielsweise um die für die Verdampfung erforderliche Laserenergie zu verringern und/oder um Fragmentierung zu minimieren. Eine Konditionierung wird bevorzugt durchgeführt, während eine Targetdetektionsstelle immobilisiert ist. Ein Beispiel einer Konditionierung ist eine Modifikation des Phosphodiestergrundgerüsts des Nukleinsäuremoleküls (z. B. Kationenaustausch), was nützlich sein kann um eine Peakverbreiterung aufgrund einer Heterogenität der pro Nukleotideinheit gebundenen Kationen zu beseitigen. Durch in Kontakt Bringen eines Nukleinsäuremoleküls mit einem Alkylierungsmittel, wie etwa Alkyljodid, Jodacetamid, β-Jodethanol oder 2,3-Epoxy-1-propanol können die Monothiophosphodiesterbindungen eines Nukleinsäuremoleküls in eine Phosphotriesterbindung überführt werden. Ebenso können Phosphodiesterbindungen unter Verwendung von Trialkylsilylchloriden in ungeladene Derivate überführt werden. Weitere Konditionierung umfasst das Einführen von Nukleotiden, welche die Empfindlichkeit auf Depurinierung (Fragmentierung während MS) verringern, wie etwa von N7- oder N9-Deazapurinnukleotiden, oder von RNA-Baublöcken, oder die Verwendung von Oligonukleotidtriestern oder das Einführen von Phosphorothioatfunktionen, die alkyliert sind, oder die Verwendung von Oligonukleotidmimetika wie etwa PNA.
  • Für bestimmte Anwendungen kann es nützlich sein, mehr als einen (mutierten) Locus auf einem besonderen eingefangenen Nukleinsäurefragment (auf einem Punkt einer Anordnung) gleichzeitig nachzuweisen, oder es kann nützlich sein, unter Verwendung von Oligonukleotid- oder Oligonukleotidmimetikaanordnungen auf verschiedenen festen Trägern eine parallele Bearbeitung durchzuführen. Ein ”Multiplexverfahren” kann durch mehrere unterschiedliche Methodiken erreicht werden. Beispielsweise können mehrere Mutationen gleichzeitig auf einer Targetsequenz nachgewiesen werden durch Verwendung entsprechender Detektormoleküle (Sonden) (z. B. Oligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika). Die Molekülmassendifferenzen zwischen den Detektoroligonukleotiden D1, D2 und D3 müssen jedoch groß genug sein, so dass ein gleichzeitiger Nachweis (”Multiplexverfahren) möglich ist. Dies kann bewirkt werden durch die Sequenz selbst (Zusammensetzung oder Länge), oder durch Einführen von Massen-modifizierenden Funktionalitäten M1–M3 in das Detektoroligonukleotid (2).
  • Massen-modifizierende Reste können beispielsweise an das 5'-Ende des Oligonukleotids (M1), an die Nukleobase (oder Basen) (M2, M7), an das Phosphatgrundgerüst (M3), und an die 2'-Position des Nukleosids (von Nukleosiden) (M4, M6), oder/und an die terminale 3'-Position (M5) gebunden werden. Beispiele von Massen-modifizierenden Resten umfassen beispielsweise ein Halogen, eine Azidgruppe, oder eine Gruppe vom Typ-XR, worin X eine Verknüpfungsgruppe ist und R eine Massen-modifizierende Funktionalität ist. Die Massen-modifizierende Funktionalität kann somit verwendet werden, um definierte Masseninkremente in das Oligonukleotidmolekül einzuführen.
  • Hier kann der Massen-modifizierende Rest M an die Nukleobase, M2 (bei c7-Deazanukleosiden auch an C-7, M7), an die Triphosphatgruppe am alpha-Phosphat, M3, oder an die 2'-Position des Zuckerrings des Nukleosidtriphosphats, M4 und M6, gebunden werden. Weiterhin kann die Massen-modifizierende Funktionalität derart zugefügt werden, so dass sie einen Kettenabbruch bewirkt, wie etwa durch Bindung an die 3'-Position des Zuckerrings des Nukleosidtriphosphats, M5. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass viele Kombinationen den Zweck der Erfindung gleichwertig erfüllen. Gleichermaßen wird der Fachmann erkennen, dass kettenverlängernde Nukleosidtriphosphate ebenfalls in einer ähnlichen Weise Massen-modifiziert werden können, mit zahlreichen Variationen und Kombinationen hinsichtlich Funktionalität und Bindepositionen.
  • Ohne den Umfang der Erfindung zu begrenzen kann die Massenmodifikation M für X in XR eingeführt werden, sowie unter Verwendung von Oligo-/Polyethylenglykolderivaten für R. Das Massen-modifizierende Inkrement ist in diesem Fall 44, d. h. fünf verschiedene Massen-modifizierte Spezies können erzeugt werden, indem m von 0 bis 4 variiert wird, wodurch dem Nukleinsäuremolekül (z. B. dem Detektoroligonukleotid (D) bzw. den Nukleosidtriphosphaten (6C)) somit Masseneinheiten von 45 (m = 0), 89 (m = 1), 133 (m = 2), 177 (m = 3) und 221 (m = 4) zugefügt werden. Die Oligo/Polyethylenglykole können auch mit einem Niederalkyl wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, t-Butyl und dergleichen monoalkyliert sein. Eine Auswahl von Verknüpfungsfunktionalitäten X wird ebenfalls erläutert. Andere Chemie kann für die Massen-modifizierten Verbindungen verwendet werden, wie beispielsweise die vor kurzem in Oligonucleotides and Analogues. A Practical Approach, Hrsg. F. Eckstein, IRL Press, Oxford, 1991 beschriebenen.
  • In einer nochmals weiteren Ausführungsform können eine Reihe von von Oligo/Polyethylenglykolen verschiedenen Massen-modifizierenden Funktionalitäten R ausgewählt und über geeignete Verknüpfungschemie X gebunden werden. Eine einfache Massenmodifikation kann erreicht werden durch Austausch von H gegen Halogene wie etwa F, Cl, Br und/oder I, oder gegen Pseudohalogene wie etwa SCN, NCS, oder durch Verwendung von verschiedenen Alkyl-, Aryl- oder Aralkylresten, wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, t-Butyl, Hexyl, Phenyl, substituiertem Phenyl, Benzyl, oder funktionellen Gruppen wie etwa CH2F, CHF2, CF3, Si(CH3)3, Si(CH3)2(C2H5), Si(CH3)(C2H5)2, Si(C2H5)3. Eine nochmals weitere Massenmodifikation kann erreicht werden durch Anbringen von Homo- oder Heteropeptiden an dem Nukleinsäuremolekül (z. B. Detektor (D)) oder an Nukleosidtriphosphaten. Ein Beispiel, das zur Erzeugung von Massen-modifizierten Spezies mit einem Masseninkrement von 57 geeignet ist, ist das Anbringen von Oligoglycinen, z. B. werden Massenmodifikationen von 74 (r = 1, m = 0), 131 (r = 1, m = 2), 188 (r = 1, m = 3), 245 (r = 1, m = 4) erreicht. Einfache Oligoamide können ebenfalls verwendet werden z. B. sind Massenmodifikationen von 74 (r = 1, m = 0), 88 (r = 2, m = 0), 102 (r = 3, m = 0), 116 (r = 4, m = 0) erreichbar. Für den Fachmann wird klar ersichtlich sein, dass es zusätzlich zu den vorstehend erwähnten zahlreiche Möglichkeiten gibt.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Index 0–i gleich i + 1 Massen-differenzierte Nukleotide, Primer oder Markierungen. In manchen Fällen kann der Index 0 eine nicht modifizierte Spezies eines besonderen Recktanten bezeichnen, und der Index i kann die i-te Massen-modifizierte Spezies dieses Recktanten bezeichnen. Wenn beispielsweise mehr als eine Nukleinsäurespezies gleichzeitig nachgewiesen werden sollen, dann können +1 unterschiedliche Massen-modifizierte Detektoroligonukleotide (D0, D1, ..., Di) verwendet werden, um jede Spezies Massen-modifizierter Detektoroligonukleotide (D) von den anderen durch Massenspektrometrie zu unterscheiden.
  • Unterschiedliche Massen-modifizierte Detektoroligonukleotide können verwendet werden, um gleichzeitig alle möglichen Varianten/Mutanten nachzuweisen (6B). Alternativ können alle vier Basenpermutationen an einer Mutationsstelle nachgewiesen werden, indem ein Detektoroligonukleotid derart konstruiert und positioniert wird, dass es als ein Primer für eine DNA/RNA-Polymerase dient (6C). Massenmodifikationen können beispielsweise auch während des Amplifikationsverfahrens eingeführt werden.
  • 3 zeigt ein unterschiedliches Multiplexdetektionsformat, bei dem eine Differenzierung erreicht wird durch Verwendung unterschiedlicher spezifischer Einfangsequenzen, die positionsspezifisch auf einer ebenen Oberfläche (z. B. einer ”Chip-Anordnung”) immobilisiert sind. Wenn unterschiedliche Targetsequenzen T1–Tn vorhanden sind, Wechselwirken deren Targeteinfangstellen TCSI–TCSn spezifisch mit komplementären, immobilisierten Eingangsequenzen C1–Cn. Der Nachweis wird erreicht durch Verwendung geeignet massendifferenzierter Detektoroligonukleotide D1–Dn, welche entweder aufgrund ihrer Sequenzen oder durch Massen-modifizierende Funktionalitäten M1–Mn massendifferenziert sind.
  • Bevorzugte Massenspektrometerformate zur Verwendung in der Erfindung sind Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI), Elektrospray (ES), Ionencyclotronresonanz (ICR) und Fourier-Transform. Für ES werden die in Wasser oder einem flüchtigen Puffer aufgelösten Proben entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich in eine bei Atmosphärendruck gehaltene Ionisationsschnittstelle (API, atmospheric pressure ionization interface) eingespritzt und danach durch einen Quadrupol massenanalysiert. Die Erzeugung zahlreicher Ionenpeaks, welche unter Verwendung von ES Massenspektrometrie erhalten werden können, kann die Genauigkeit der Massenbestimmung erhöhen. Noch detailliertere Information über die spezifische Struktur kann unter Verwendung einer MS/MS Quadrupol-Konfiguration erhalten werden.
  • Bei MALDI Massenspektrometrie können verschiedene Massenanalysatoren verwendet werden, z. B. Magnetsektor/Magnetablenkungsinstrumente in einfachem oder dreifachem Quadrupolmodus (MS/MS), Fourier-Transform und Flugzeit (TOF) Konfigurationen, wie in der Massenspektrometrietechnik bekannt. Für das Desorption/Ionisationsverfahren können zahlreiche Matrix/Laser-Kombinationen verwendet werden. Ionenfalle- und Reflektron-Konfigurationen können ebenfalls verwendet werden.
  • Die vorstehend beschriebenen massenspektrometrischen Verfahren können beispielsweise dazu verwendet werden, eine der mehr als 3000 derzeit bekannten Erbkrankheiten (z. B. Hämophilien, Thalassämien, Duchenne Muskeldystrophie (DMD), Huntington Krankheit (HD), Alzheimer Krankheit und Mukoviszidose (CF)) zu diagnostizieren oder zu identifizieren.
  • Das nachfolgende Beispiel 3 stellt ein massenspektrometrisches Verfahren bereit zum Nachweis einer Mutation (ΔF508) des Transmembranleitfähigkeitregulatorgens bei Mukoviszidose (CFTR, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), das sich lediglich um drei Basenpaare (900 Dalton) vom Wildtyp des CFTR-Gens unterscheidet. Wie weiter in Beispiel 3 beschrieben, beruht der Nachweis auf einer Eintopfreaktion einer kompetitiven Einzelbasenextension eines Oligonukleotids (COSBE, competitive oligonucleotide singls base extension) unter Verwendung eines Primerpaars deren 3'-endständige Base entweder zu dem normalen oder dem mutierten Allel komplementär ist. Nach Hybridisierung und Zugabe einer Polymerase und des Nukleosidtriphosphats eine Base stromabwärts werden nur diejenigen Primer extendiert, die korrekt annealt sind (d. h. kein 3'-endständiger Mismatch); die Produkte werden anhand von Molekülmassenverschiebungen aufgelöst, wie mittels Matrix-unterstützter Laserdesorption/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie bestimmt. Für den Mukoviszidose ΔF508 Polymorphismus erzeugen 28-mer ”normale” (N) und 30-mer ”mutierte” (M) Primer 29- bzw. 31-mere für N- bzw. M-Homozygote, und beide für Heterozygote. Da die Primer- und Produktmolekülmassen relativ gering sind (< 10 kDa), und die Massendifferenz zwischen ihnen mindestens die einer einzelnen ~300 Da Nukleotideinheit ist, ist ein Gerät mit niedriger Auflösung für derartige Messungen geeignet.
  • Zusätzlich zu Genmutationen, die in einer Erbkrankheit resultieren, sind bestimmte angeborene Störungen das Ergebnis von Chromosomenabnormalitäten, wie etwa Trisomie 21 (Down Syndrom), Trisomie 13 (Patau Syndrom), Trisomie 18 (Edward Syndrom), Monosomie X (Turner Syndrom), und andere Aneuploidien der Geschlechtschromosomen wie etwa das Klienfelter Syndrom (XXY).
  • Weiterhin gibt es zunehmende Hinweise, dass bestimmte DNA-Sequenzen ein Individuum für eine Reihe von Erkrankungen, wie etwa Diabetes, Arteriosklerose, Fettleibigkeit, verschiedene Autoimmunerkrankungen und Krebs (z. B. Kolonkarzinom, Brust-, Eierstock-, Lungenkrebs), prädisponieren können; Chromosomenabnormalität (pränatal oder ostnatal); oder eine Prädispoaition für eine Krankheit oder Störung (z. B. Fettleibigkeit, Artherosklerose, Krebs). Der Nachweis von ”DNA-Fingerabdrücken”, z. B. Polymorphismen wie etwa ”Mikrosatellitsequenzen” ist auch geeignet, um die Identität oder Erbanlagen (z. B. Vaterschaft oder Mutterschaft) nachzuweisen.
  • Das nachfolgende Beispiel 4 stellt ein massenspektrometrisches Verfahren zur Identifizierung einer der drei verschiedenen Isoformen von Humanapolipoprotein E bereit, welche von den Allelen E2, E3 und E4 kodiert werden. Hier können die Molekülmassen der nach Verdau mit geeigneten Restriktionsendonukleasen erhaltenen DNA-Fragmente verwendet werden um die Gegenwart einer Mutation nachzuweisen.
  • In Abhängigkeit von der biologischen Probe kann die Diagnose auf eine Erbkrankheit, Chromosomenaneuploidie oder genetische Veranlagung entweder prä- oder postnatal durchgeführt werden.
  • Viren, Bakterien, Pilze und andere infektiöse Organismen enthalten charakteristische Nukleinsäuresequenzen, welche von den in der Wirtszelle vorhandenen Sequenzen verschieden sind. Der Nachweis oder die Quantifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die für den infektiösen Organismus spezifisch sind, ist für die Diagnose oder Überwachung einer Infektion wichtig. Beispiele für krankheitserregende Viren, die Menschen und Tiere infizieren, und die durch das offenbarte Verfahren nachgewiesen werden können, umfassen: Retroviridae (z. B. humane Immundefizienzviren, wie etwa HIV-1 (auch bezeichnet als HTLV-III, LAV oder HTLV-III/LAV, siehe Ratner, L., et al., Nature, Vol. 313, Seiten 227–284 (1985); Wain Hobson, S., et al., Cell, Vol. 40, Seiten 9–17 (1985)); HIV-2 (siehe Guyader et al., Nature, Vol. 328, Seiten 662–669 (1987); Europäische Patentveröffentlichung Nr. 0 269 520 ; Chakraborti et al., Nature, Vol. 328, Seiten 543–547 (1987); und Europäische Patentanmeldung Nr. 0 655 501 ); und andere Isolate, wie etwa HIV-LP (Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/00562 mit dem Titel ”A Novel Human Immunodeficiency Virus”); Picornaviridae (z. B. Polioviren, Hepatitis A-Virus (Gust, I. D. et al., Intervirology, Vol. 20, Seiten 1–7 (1983)), Enteroviren, humane Coxsackie-Viren, Rhinoviren, ECHO-Viren); Calciviridae (z. B. Stämme, die Gastroenteritis hervorrufen); Togaviridae (z. B. Pferdeenzephalitisviren, Rötelnviren); Flaviridae (z. B. Dengueviren, Enzephalitisviren, Gelbfieberviren); Coronaviridae (z. B. Coronaviren); Rhabdoviridae (z. B. bläschenförmige Stomatitis-Viren, Tollwutviren); Filoviridae (z. B. Ebolaviren); Paramyxoviridae (z. B. Viren, die Grippe-ähnliche Erkrankungen hervorrufen, Mumpsvirus, Masernvirus, Atemwegssynzytiumvirus); Orthomyxoviridae (z. B. Influenzaviren); Bungaviridae (z. B. Hantaan-Viren, Bungaviren, Phleboviren und Nairo-Viren), Arenaviridae (hämorrhagisches Fieber-Viren); Reoviridae (z. B. Reoviren, Orbiviren und Rotaviren); Birnaviridae; Hepadnaviridae (Hepatitis B-Virus); Parvoviridae (Parvoviren); Papovaviridae (Papillomviren, Polyomaviren); Adenoviridae (die meisten Adenoviren); Herpesviridae (Herpes simplex-Virus (HSV) 1 und 2, Varizelle zoster-Virus, Cytomegalovirus (CMV), Herpesviren); Poxviridae (Variolaviren, Vaccinaviren, Pockenviren); und Iridoviridae (z. B. Afrikanischer Schweinefiebervirus); und nicht klassifizierte Viren (z. B. die krankheitsverursachenden Mittel von Spongiformenzephalopathien, das Mittel von delta-Hepatitis (von dem angenommen wird, dass es ein defekter Satellit von Hepatitis B-Virus ist), die Mittel von non-A-, non-B-Hepatitis (Klasse 1 = intern übertragen; Klasse 2 = parenteral übertragen) (d. h. Hepatitis C); Norwalk-Viren und verwandte Viren, und Astroviren.
  • Beispiele von infektiösen Bakterien umfassen: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella Pneumophilia, Mycobacteria Spezies (z. B. M. tuberculosis, M. avium, M. intracelulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Gruppe A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Gruppe B Streptococcus), Streptococcus (Viridansgruppe), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobe Spezies), Streptococcus pneumoniae, pathogene Campylobacter Spezies, Enterococcus Spezies, Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebakterium diphtheriae, Corynebakterium Spezies, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides Spezies, Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira und Actinomyces israelli.
  • Beispiele von infektiösen Pilzen umfassen: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Andere infektiöse Organismen (d. h. Protisten) umfassen: Plasmodium falciparum und Toxoplasma gondii.
  • Das nachfolgende Beispiel 5 stellt eine geschachtelte PCR und ein auf einem Massenspektrometer beruhendes Verfahren bereit, die verwendet wurden um Hepatitis B-Virus-DNA (HBV) in Blutproben nachzuweisen. In ähnlicher Weise können andere in Blut vorkommende Viren (z. B. HIV-1, HIV-2, Hepatitis C-Virus (HCV), Hepatitis A-Virus (HAV) und andere Hepatitisviren (z. B. non-A-non-B Hepatitis, Hepatitis G, Hepatitis E), Cytomegalovirus und Herpex simplex-Virus (HSV)) auf Basis der hierin beschriebenen Verfahren jeweils alleine oder in Kombination nachgewiesen werden.
  • Da eine Sequenz von etwa 16 Nukleotiden aus statistischen Gründen (sogar für ein Genom mit der Größe des Humangenoms) spezifisch ist, können relativ kurze Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, um normale und defekte Gene in höheren Organismen nachzuweisen, und um infektiöse Mikroorganismen (z. B. Bakterien, Pilze, Protisten und Hefen) und Viren nachzuweisen. DNA-Sequenzen können auch als ein Fingerabdruck dienen, um verschiedene Individuen innerhalb derselben Spezies zu bestimmen (Thompson, J. S. and M. W. Thompson, Hrsg., Genetics in Medicine, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1986)).
  • Ein Verfahren zum Nachweis einer Wildtypsequenz (Dwt) und/oder einer mutierten Sequenz (Dmut) in einem Targetnukleinsäuremolekül (T) ist in 1C gezeigt. Eine spezifische Einfangsequenz (C) ist über einen Abstandhalter (S) an einen festen Träger (SS) gebunden. Zusätzlich ist die Einfangsequenz derart ausgewählt, so dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz auf der Targetsequenz (T) wechselwirkt, wobei die Targeteinfangstelle (TCS) durch Hybridisierung nachzuweisen ist. Wenn die Targetdetektionsstelle (TDS) jedoch eine Mutation X umfasst, welche die Molekülmasse erhöht oder erniedrigt, können mutierte TDS durch Massenspektrometrie vom Wildtyp unterschieden werden. Beispielsweise wäre für eine Insertion einer Adeninbase (dA) die Molekülmassendifferenz zwischen Dwt und Dmut etwa 314 Dalton.
  • Bevorzugt ist die Detektornukleinsäure (D) derart ausgelegt, so dass die Mutation in der Mitte des Moleküls vorliegt und die flankierenden Regionen sind kurz genug, so dass keine stabile Hybride gebildet würde, wenn das Wildtyp-Detektoroligonukleotid (Dwt) als eine Kontrolle mit der mutierten Targetdetektorsequenz in Kontakt gebracht wird. Die Mutation kann auch nachgewiesen werden, wenn das mutierte Detektoroligonukleotid (Dmut) mit der einen Match ausbildenden Base an der mutierten Position für die Hybridisierung verwendet wird. Wenn eine aus einer biologischen Probe erhaltene Nukleinsäure für die besondere Sequenz heterozygot ist (d. h. sowohl Dwt als auch Dmut enthält), binden sowohl Dwt als auch Dmut an den entsprechenden Strang und die Massendifferenz ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Dwt und Dmut.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren nützt die bekannte Sequenzinformation über die Targetsequenz und bekannte Mutationsstellen. Dennoch können auch neue Mutationen nachgewiesen werden. Beispielsweise kann, wie in 8 gezeigt, ein Transkript eines aus einer biologischen Probe erhaltenen Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung einer oder mehrerer Nukleasen spezifisch verdaut werden, und die Fragmente an einem festen Träger, der die entsprechenden komplementären Nukleinsäuresequenzen aufweist, eingefangen werden. Der Nachweis der Hybridisierung und der Molekülmassen der eingefangenen Targetsequenzen liefert Information darüber, ob und an welcher Position in einem Gen eine Mutation vorhanden ist. Alternativ kann DNA durch eine oder mehrere spezifische Endonukleasen gespalten werden, wobei ein Fragmentgemisch erhalten wird. Ein Vergleich der Molekülmassen von Fragmentgemischen von Wildtyp und Mutante führt zu einem Nachweis einer Mutation.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert, die nicht in irgendeiner Weise als einschränkend ausgelegt werden sollten. Die internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 94/16101 hat den Titel ”DNA Sequencing by Mass Spectrometry” und die internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 94/21822 hat den Titel ”DNA Sequencing by Mass Spectrometry Via Exonuclease Degradation”.
  • Beispiel 1 MALDI-TOF Desorption von Oligonukleotiden direkt auf festen Trägern
  • 1 g CPG (Glas mit kontrollierter Porengröße, Controlled Pore Glass) wurde mit 3-(Triethoxysilyl)epoxypropan funktionalisiert, wobei OH-Gruppen auf der Polymeroberfläche gebildet werden. Eine Standard-Oligonukleotid-Synthese wurde mit 13 mg des OH-CPG an einem DNA-Synthesizer (Milligen, Model 7500) unter Verwendung von β-Cyanoethylphosphoamiditen (Köster et al., Nucleic Acids Res. 12, 4539 (1994)) und TAC N-Schutzgruppen (Köster et al., Tetrahedron 37, 362 (1981)) durchgeführt, wobei eine 3'-T5-50-mer Oligonukleotidsequenz synthetisiert wurde, bei der 50 Nukleotide zu einer ”hypothetischen” 50-mer Sequenz komplementär sind. T5 dient als Abstandhalter. Entfernung der Schutzgruppen mit gesättigtem Ammoniak in Methanol bei Raumtemperatur während 2 Stunden lieferte gemäß der Bestimmung der DMT-Gruppe ein CPG, das etwa 10 μMol 55-mer/g CPG enthielt. Dieses 55-mer diente als ein Templat für Hybridisierungen mit einem 26-mer (mit 5'-DMT-Gruppe) und einem 40-mer (ohne DMT-Gruppe). Das Reaktionsvolumen beträgt 100 μl und enthält etwa 1 nMol CPG-gebundenes 55-mer als Templat, eine äquimolare Menge Oligonukleotid in Lösung (26-mer oder 40-mer) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 und 25 mM NaCl. Das Gemisch wurde 10' bei 65°C erwärmt und während 30' auf 37°C abkühlen gelassen (Annealing). Oligonukleotid, das nicht an das Polymer-gebundene Templat hybridisiert hatte, wurde durch Zentrifugation und drei anschließende Wasch/Zentrifugationsschritte mit jeweils 100 μl eiskaltem 50 mM Ammoniumcitrat entfernt. Die Kügelchen wurden an Luft getrocknet und mit Matrixlösung (3-Hydroxypicolinsäure/10 mM Ammoniumcitrat in Acetonitril/Wasser 1:1) gemischt und mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert. Die Ergebnisse sind in den 10 und 11 gezeigt.
  • Beispiel 2 Elektrospray (ES) Desorption und Unterscheidung zwischen einem 18-mer und einem 19-mer
  • DNA-Fragmente mit einer Konzentration von 50 pMol/μl in 2-Propanol/10 mM Ammoniumcarbonat (1/9, v/v) wurden gleichzeitig mittels eines Elektrospray Massenspektrometers analysiert.
  • Die erfolgreiche Desorption und Unterscheidung zwischen einem 18-mer und einem 19-mer mittels Elektrospray Massenspektrometrie ist in 12 gezeigt.
  • Beispiel 3 Nachweis der Mukoviszidosemutation ΔF508 durch Einschritt- Dideoxyextension und Analyse mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • PCR-Amplifikation und Strangimmobilisierung
  • Die Amplifikation wurde durchgeführt mit Primern, die für Exon 10 spezifisch waren, unter Verwendung von Standard-PCR-Bedingungen (30 Zyklen: 1' bei 95°C, 1' bei 55°C, 2' bei 72°C); der reverse Primer war 5' mit Biotin markiert und war säulengereinigt (Oligopurification Cartridge, Cruachem). Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte durch Säulenauftrennung gereinigt (Qiagen Quickspin) und auf Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen (Dynabeads, Dynal, Norwegen) nach deren Standardprotokoll immobilisiert; DNA wurde unter Verwendung von 0,1 M NaOH denaturiert und mit 0,1 M NaOH, 1 × B + W Puffer und TE Puffer gewaschen, um den nicht biotinylierten Sense-Strang zu entfernen.
  • COSBE Bedingungen
  • Die ligierten Antisense-Strang enthaltenden Kügelchen wurden in 18 μl Reaktionsgemisch 1 (2 μl 10 x Taq Puffer, 1 μl (1 Einheit) Taq Polymerase, 2 μl 2 mM dGTP und 13 μl H2O) resuspendiert und vor Zugabe von Reaktionsgemisch 2 (100 ng jedes COSBE Primers) 5' bei 80°C inkubiert. Die Temperatur wurde auf 60°C erniedrigt und die Gemische wurden während eines 5' Annealing/Extensionszeitraums inkubiert; die Kügelchen wurden danach in 25 mM Triethylammoniumacetat (TEAA), gefolgt von 50 mM Ammoniumcitrat gewaschen.
  • Primersequenzen
  • Alle Primer wurden auf einem Perseptive Biosystems Expedite 8900 DNA-Synthesizer unter Verwendung herkömmlicher Phosphoramiditchemie (Sinha et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12: 4539) synthetisiert. COSBE Primer (beide enthaltend einen gewollten Mismatch eine Base vor dem 3'-Terminus) waren diejenigen, die in einer früheren ARMS Studie verwendet worden waren (Ferrie et al. (1992), Am. J. Hum. Genet. 51: 251–262), außer dass vom 5'-Ende des normalen Primers zwei Basen entfernt wurden:
    Figure 00390001
    Figure 00400001
  • Massenspektrometrie
  • Nach dem Waschen wurden die Kügelchen in 1 μl 18 Mohm/cm H2O resuspendiert. Jeweils 300 nl Matrixlösung (Wu et al., 1993) (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,7 M zweibasisches Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) und resuspendierte Kügelchen (Tang et al. (1995) Rapid Commun. Mass Spectrom 8: 727–730) wurden auf einem Probentarget gemischt und an Luft trocknen gelassen. Bis zu 20 Proben wurden punktförmig auf eine Probentargetscheibe aufgetragen, zum Einbringen in den Quellbereich eines nicht modifizierten Thermo Bioanalysis (früher Finnegan) Visions 2000 MALDI-TOF, der in einem Reflektronmodus mit 5 bzw. 20 kV auf der Target- bzw. Konversionsdynode betrieben wurde. Theoretische mittlere Molekülmassen (Mr(calc)) wurden aus Atomzusammensetzungen berechnet. Die vom Verkäufer gelieferte Software wurde verwendet um unter Verwendung externer Kalibrierung Peakschwerpunkte zu bestimmen; zur Korrektur für die ladungstragende Protonenmasse wurden davon 1,08 Da subtrahiert, um die im Text angegebenen Mr(exp) Werte zu ergeben.
  • Schema
  • Nach dem Annealing an das gebundene Templat werden den Primern N und M (8508,6 bzw. 9148,0 Da) dGTP angeboten; nur Primer mit der korrekten Watson-Crick-Basenpaarung an der variablen (V) Position werden von der Polymerase extendiert. Wenn V mit der 3'-terminalen Base von N eine Paarung ausbildet, wird somit N zu einem 8837,9 Da Produkt (N + 1) extendiert. Andererseits wird, wenn V korrekt an den M-Terminus gepaart vorliegt, M zu einem 9477,3 Da M + 1 Produkt extendiert.
  • Ergebnisse
  • Die 14–18 zeigen die repräsentativen Massenspektren von COSBE Reaktionsprodukten. Bessere Ergebnisse wurden erhalten, wenn PCR-Produkte gereinigt wurden, bevor der biotinylierte Antisense-Strang gebunden wurde.
  • Beispiel 4 Unterscheidung von humanen Apolipoprotein E Isoformen durch Massenspektrometrie
  • Apolipoprotein E (Apo E), eine Proteinkomponente von Lipoproteinen, spielt eine essentielle Rolle im Fettstoffwechsel. Es ist beispielsweise am Cholesterintransport, dem Metabolismus von Lipoproteinpartikeln, der Immunregulation und der Aktivierung einer Reihe von lipolytischen Enzymen beteiligt.
  • Es gibt drei häufige Isoformen von humanem Apo E (kodiert von den Allelen E2, E3 und E4). Das häufigste ist das E3 Allel. Es ist gezeigt worden, dass das E2 Allel den Cholesteringehalt im Plasma senkt, und es kann daher eine Schutzwirkung gegen die Ausbildung von Atherosklerose haben. Schließlich ist die E4 Isoform mit erhöhten Cholesteringehalten korreliert worden, und vermittelt somit eine Prädisposition für Atherosklerose. Die Identität des Apo E Allels eines Individuums ist daher ein wichtiger Parameter für das Risiko der Ausbildung kardiovaskulärer Erkrankungen.
  • Wie in 19 gezeigt, kann eine für Apolipoprotein E kodierende DNA-Probe von einem Individuum erhalten werden, amplifiziert werden (z. B. über PCR), und das PCR-Produkt kann unter Verwendung eines geeigneten Enzyms (z. B. Cfol) verdaut werden. Der erhaltene Restriktionsverdau kann danach durch eine Reihe von Mitteln analysiert werden. Wie in 20 gezeigt, haben die drei Isotypen von Apolipoprotein E (E2, E3 und E4) unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen und haben daher auch unterscheidbare Molekülmassenwerte.
  • Wie in 21A–C gezeigt, zeigen unterschiedliche Apolipoprotein E Genotypen unterschiedliche Restriktionsmuster in einem 3,5% MetPhor Agarosegel oder einem 12% Polyacrylamidgel. Wie in den 22 und 23 gezeigt, können die verschiedenen Apolipoprotein E Genotypen durch Massenspektrometrie auch genau und schnell nachgewiesen werden.
  • Beispiel 5 Nachweis von Hepatitis B-Virus in Serumproben
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Probenvorbereitung
  • Phenol/Chloroform Extraktion von viraler DNA und die Ethanolpräzipitation am Schluß wurden nach Standardprotokollen durchgeführt.
  • Erste PCR
  • Jede Reaktion wurde mit 5 μl der DNA-Präparation aus Serum durchgeführt. 15 pMol jedes Primers und 2 Einheiten Taq DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Weiterstadt, Deutschland) wurden verwendet. Die Endkonzentration jedes dNTP betrug 200 μM, das Endvolumen der Reaktion war 50 μl. 10 × PCR Puffer (Perkin Elmer, Weiterstadt, Deutschland) enthielt 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0,01% Gelatine (w/v). Primersequenzen
    Figure 00420001
  • Geschachtelte PCR
  • Jede Reaktion wurde mit 1 μl der ersten Reaktion bzw. mit einer 1:10 Verdünnung der ersten PCR als Templat durchgeführt. 100 pMol jedes Primers, 2,5 U Pfu(exo-)DNA-Polymerase (Stratagene, Heidelberg, Deutschland), eine Endkonzentration jedes dNTP von 200 μM und 5 μl 10 × Pfu Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,75, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100, 1 mg/ml BSA (Stratagene, Heidelberg, Deutschland)) wurden in einem Endvolumen von 50 μl verwendet. Die Reaktionen wurden in einem Thermocycler (OmniGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) unter Verwendung des folgenden Programms durchgeführt: 1 Minute bei 92°C, 1 Minute bei 60°C und 1 Minute bei 72°C, mit 20 Zyklen. Sequenz der Oligodeoxynukleotide (HPLC-gereinigt von MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland, bezogen):
    Figure 00430001
  • Reinigung von PCR-Produkten
  • Zur Aufzeichnung jedes Spektrums wurde eine PCR, 50 μl, verwendet (durchgeführt wie vorstehend beschrieben). Die Reinigung wurde nach dem folgenden Verfahren durchgeführt: Ultrafiltration wurde unter Verwendung von Ultrafree-MC Filtrationseinheiten (Millipore, Eschborn, Deutschland) nach Herstellerangaben mit 20-minütiger Zentrifugation bei 8000 Umdrehungen pro Minute durchgeführt. 25 μl (10 μg/μl) Dynabeads (Dynal, Hamburg, Deutschland) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert und in 25 μl B/W Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) resuspendiert. Diese Suspension wurde zu den noch in der Filtrationseinheit vorliegenden PCR-Proben zugegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Umgebungstemperatur unter sanftem Schütteln inkubiert. Die Suspension wurde in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt, und der Überstand wurde mit Hilfe eines Magnetic Particle Collector, MPC, (Dynal, Hamburg, Deutschland) entfernt. Die Kügelchen wurden zweimal mit 50 μl 0,7 M Ammoniumcitratlösung, pH 8,0, gewaschen (der Überstand wurde jedes Mal unter Verwendung des MPC entfernt). Eine Spaltung von den Kügelchen kann durch Verwendung von Formamid bei 90°C bewirkt werden. Der Überstand wurde in etwa eine Stunde in einer Speedvac getrocknet und in 4 μl ultrareinem Wasser (MilliQ UF plus, Millipore, Eschborn, Deutschland) resuspendiert. Diese Präparation wurde für die MALDI-TOF MS Analyse verwendet.
  • MALDI-TOF MS
  • Ein halber Mikroliter der Probe wurde auf den Probenhalter pipettiert, danach sofort mit 0,5 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 50% Acetonitril, 70 mM Ammoniumcitrat) gemischt. Dieses Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur trocknen gelassen und in das Massenspektrometer eingebracht. Alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus aufgenommen, unter Verwendung eines Finnigan MAT Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Deutschland), der mit einem Reflektron (5 keV Ionenquelle, 20 keV Nachbeschleunigung) und einem 337 nm Stickstofflaser ausgestattet war. Kalibrierung wurde mit einem Gemisch eines 40-mers und eines 100-mers durchgeführt. Jede Probe wurde mit unterschiedlichen Laserenergien gemessen. In den Negativproben wurde das PCR-Produkt weder mit mehr noch mit weniger Laserenergie nachgewiesen. In den positiven Proben wurde das PCR-Produkt an unterschiedlichen Stellen des Auftragspunkts und auch mit variierenden Laserenergien nachgewiesen.
  • Ergebnisse
  • Ein geschachteltes PCR-System wurde für den Nachweis von HBV DNA in Blutproben verwendet, unter Verwendung von Oligonukleotiden, die komplementär zur c-Region des HBV-Genoms waren (Primer 1 beginnend an Kartierungsposition 1763, Primer 2 beginnend an Kartierungsposition 2032 des Komplementärstrangs), welche für das HBV Kernantigen (HBVcAg) kodiert. DNA wurde unter Verwendung von Standardprotokollen aus dem Serum von Patienten isoliert. Mit der DNA aus diesen Präparationen wurde eine erste PCR unter Verwendung eines ersten Satzes von Primern durchgeführt. Wenn HBV DNA in der Probe vorhanden war, wurde ein DNA-Fragment von 269 bp erzeugt.
  • In der zweiten Reaktion wurden Primer verwendet, die zu einer Region innerhalb des in der ersten PCR erzeugten PCR-Fragments komplementär waren. Wenn HBV-verwandte PCR-Produkte in der ersten PCR vorhanden waren, wurde in dieser geschachtelten PCR ein DNA-Fragment von 67 bp erzeugt (siehe 25A). Die Verwendung eines geschachtelten PCR-Systems zum Nachweis stellt eine hohe Empfindlichkeit bereit und dient auch als eine Spezifitätskontrolle für die externe PCR (Rolfs, A. et al., PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer, Heidelberg, 1992). Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die in der zweiten PCR erzeugte Menge an Fragmenten ausreichend groß ist, um einen unproblematischen Nachweis zu gewährleisten, obwohl Reinigungsverluste nicht vermieden werden können.
  • Die Proben wurden unter Verwendung von Ultrafiltration gereinigt um die Primer vor Immobilisierung auf Streptavidin-Dynabeads zu entfernen. Diese Reinigung wurde durchgeführt, da die kürzeren Primerfragmente aufgrund von sterischen Gründen in höherer Ausbeute auf den Kügelchen immobilisiert wurden. Die Immobilisierung wurde direkt auf der Ultrafiltrationsmembran durchgeführt, um Ausbeuteverluste aufgrund unspezifischer Absorption an der Membran zu vermeiden. Nach der Immobilisierung wurden die Kügelchen mit Ammoniumcitrat gewaschen, um einen Kationenaustausch durchzuführen (Pieles, U. et al (1993), Nucleic Acids Res. 21: 3191–3196). Die immobilisierte DNA wurden von den Kügelchen abgespalten unter Verwendung von 25% Ammoniak, was eine Spaltung von DNA von den Kügelchen in einer sehr kurzen Zeit ermöglicht, aber nicht zu einem Einbringen von Natriumkationen führt.
  • Die geschachtelten PCR und die MALDI-TOF Analysen wurden ohne Kenntnis der Ergebnisse der serologischen Analyse durchgeführt. Aufgrund des nicht bekannten Virustiters wurde jede Probe der ersten PCR unverdünnt als Templat sowie in einer 1:10 Verdünnung verwendet.
  • Probe 1 war einem Patienten mit chronisch aktiver HBV-Infektion entnommen worden, der in HBs- und HBe-Antigentests positiv, aber in einer Dot Blot Analyse negativ war. Probe 2 war eine Serumprobe eines Patienten mit einer aktiven HBV-Infektion und einer massiven Virämie, der in einer Dot Blot Analyse HBV-positiv war. Probe 3 war eine denaturierte Serumprobe, daher konnte keine serologische Analyse durchgeführt werden, aber ein erhöhter Gehalt von Transaminasen wurde nachgewiesen, was eine Leberkrankheit andeutet. In Autoradiographieanalyse (24) war die erste PCR dieser Probe negativ. Nichtsdestoweniger gab es Hinweise auf eine HBV-Infektion. Diese Probe ist für eine MALDI-TOF Analyse von Interesse, da sie zeigt, dass sogar geringe Mengen an PCR-Produkten nach dem Reinigungsverfahren nachgewiesen können. Probe 4 stammte von einem Patienten, der von einer HBV-Infektion geheilt war. Die Proben 5 und 6 wurden Patienten mit einer chronisch aktiven HBV-Infektion entnommen.
  • 24 zeigt die Ergebnisse einer PAGE-Analyse der geschachtelten PCR-Reaktion. In den Proben 1, 2, 3, 5 und 6 ist ein PCR-Produkt deutlich erkennbar. In Probe 4 wurde kein PCR-Produkt erzeugt, sie ist nach serologischer Analyse in der Tat HBV-negativ. Negative und positive Kontrollen sind durch + bzw. – bezeichnet. In den Bahnen 2, 5, 6 und + sind Amplifikationsartefakte sichtbar, wenn unverdünntes Templat verwendet wurde. Diese Artefakte wurden nicht erzeugt, wenn das Templat in einer 1:10 Verdünnung verwendet wurde. In Probe 3 war ein PCR-Produkt nur nachweisbar, wenn das Templat nicht verdünnt worden war. Die Ergebnisse der PAGE-Analyse stimmen mit den Daten überein, die durch serologische Analyse erhalten worden waren, mit Ausnahme von Probe 3, wie vorstehend diskutiert.
  • 25A zeigt ein Massenspektrum eines geschachtelten PCR-Produkts von Probe Nr. 1, welches wie vorstehend beschrieben erzeugt und gereinigt worden war. Das Signal bei 20754 Da stellt das einzelsträngige PCR-Produkt dar (berechnet: 20735 Da, als die mittlere Masse beider Stränge des von den Kügelchen abgespaltenen PCR-Produkts). Die Massendifferenz zwischen berechneter und erhaltener Masse beträgt 19 Da (0,09%). Wie in 25A gezeigt, erzeugte Probe Nr. 1 eine große Menge PCR-Produkt, was zu einem eindeutigen Nachweis führt.
  • 25B zeigt ein von Probe Nr. 3 erhaltenes Spektrum. Wie in 24 abgebildet ist die Menge an PCR-Produkt, die mit dieser Probe erzeugt wurde, erheblich geringer als die von Probe Nr. 1. Nichtsdestoweniger ist das PCR-Produkt klar erkenntlich, mit einer Masse von 20751 Da (berechnet: 20735). Die Massendifferenz beträgt 16 Da (0,08%). Das in 25C abgebildete Spektrum wurde von Probe Nr. 4 erhalten, die HBV-negativ ist (wie auch in 24 gezeigt). Wie erwartet, konnten keine dem PCR-Produkt entsprechenden Signale nachgewiesen werden. Alle in 25 gezeigten Proben wurden mit MALDI-TOF MS analysiert, wobei in allen HBV-positiven Proben, aber nicht in den HBV-negativen Proben, PCR-Produkt nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse wurden in mehreren unabhängigen Experimenten reproduziert.
  • Beispiel 6 Analyse von Ligasekettenreaktionsprodukten über MALDI-TOF Massenspektrometrie
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Oligodeoxynukleotide
  • Außer dem biotinylierten wurden alle anderen Oligonukleotide in einem 0,2 μMol Maßstab auf einem MilliGen 7500 DNA Synthesizer (Millipore, Bedford, MA, USA) unter Verwendung der β-Cyanoethylphosphoamidit-Methode (Sinha N. D. et al. (1984), Nucleic Acids Res. Vol. 12, Seiten 4539–4577) synthetisiert. Die Oligodeoxynukleotide wurden RP-HPLC-gereinigt und die Schutzgruppen nach Standardprotokollen entfernt. Das biotinylierte Oligodeoxynukleotid wurde (HPLC-gereinigt) von Biometra, Göttingen, Deutschland, bezogen. Sequenzen und berechnete Massen der verwendeten Oligonukleotide:
    Figure 00470001
    Figure 00480001
  • 5'-Phosphorylierung der Oligonukieotide A und D
  • Dies wurde mit Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim, Deutschland) nach veröffentlichten Verfahren durchgeführt; die 5'-phosphorylierten Oligonukleotide wurden ungereinigt in der LCR eingesetzt.
  • Ligasekettenreaktion
  • Die LCR wurde mit Pfu DNA-Ligase und einem Ligase Chain Reaction Kit (Stratagene, Heidelberg, Deutschland), enthaltend zwei verschiedene pBluescript KII Phagemide, durchgeführt. Eines davon enthält die Wildtypform des E. coli lacl Gens, und das andere eine Mutante dieses Gens mit einer einzigen Punktmutation an bp 191 des lacl Gens.
  • Die folgenden LCR-Bedingungen wurden für jede Reaktion verwendet: 100 pg Templat-DNA (0,74 fMol) mit 500 pg beschallter Lachssperma-DNA als Träger, 25 ng (3,3 pMol) jedes 5'-phosphorylierten Oligonukleotids, 20 ng (2,5 pMol) jedes nicht-phosphorylierten Oligonukleotids, 4 U Pfu DNA-Ligase in einem Endvolumen von 20 μl, gepuffert mit Pfu DNA-Ligase Reaktionspuffer (Stratagene, Heidelberg, Deutschland). In einem Modellexperiment wurde ein chemisch synthetisiertes ss 50-mer (1 fMol) als Templat verwendet, in diesem Fall war Oligo C ebenfalls biotinyliert. Alle Reaktionen wurden in einem Thermocycler (OmniGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) mit dem folgenden Programm durchgeführt: 4 Minuten 92°C, 2 Minuten 60°C und 25 Zyklen von 20 Sekunden 92°C, 40 Sekunden 60°C. Mit Ausnahme der HPLC-Analyse wurde das biotinylierte Ligationsedukt C verwendet. In einem Kontrollexperiment ergaben die biotinylierten und nicht-biotinylierten Oligonukleotide die gleichen Ergebnisse bei Gelelektrophorese. Die Reaktionen wurden auf 7,5% Polyacrylamidgelen analysiert. Berechnete Masse von Ligationsprodukt 1 (Oligo A und B): 15450 Da; berechnete Masse von Ligationsprodukt 2 (Oligo C und D): 15387 Da.
  • SMART-HPLC
  • Ionenaustausch-HPLC (IE HPLC) wurde auf dem SMART-System (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) unter Verwendung einer Pharmacia Mono Q, PC 1.6/5 Säule durchgeführt. Eluenten waren Puffer A (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 0,3 M NaCl bei pH 8,0) und Puffer B (wie A, aber 1 M NaCl). Beginnend mit 100% A während 5 Minuten bei einer Fließrate von 50 μl/min wurde ein Gradient von 0 bis 70% B in 30 Minuten angewendet, danach in 2 Minuten auf 100% B erhöht und 5 Minuten bei 100% B gehalten. Zwei gepoolte LCR-Volumina (40 μl), die entweder mit Wildtyp oder mutiertem Templat durchgeführt worden waren, wurden injiziert.
  • Probenpräparation für MALDI-TOF MS
  • Präparation von immobilisierter DNA: Zur Aufzeichnung jedes Spektrums wurden zwei LCR (durchgeführt wie vorstehend beschrieben) gepoolt und 1:1 mit 2 × B/W Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) verdünnt. Zu den Proben wurden 5 μl Streptavidin-Dynabeads (Dynal, Hamburg, Deutschland) zugegeben, das Gemisch wurde 15 Minuten bei Umgebungstemperatur unter sanftem Schütteln binden gelassen. Der Überstand wurde mit Hilfe eines Magnetic Particle Collector, MPC, (Dynal, Hamburg, Deutschland) entfernt, und die Kügelchen wurden zweimal mit 50 μl 0,7 M Ammoniumcitratlösung (pH 8,0) gewaschen (der Überstand wurde jedes Mal unter Verwendung des MPC entfernt). Die Kügelchen wurden in 1 μl ultrareinem Wasser (MilliQ, Millipore, Bedford, MA, USA) resuspendiert. Diese Suspension wurde direkt für die MALDI-TOF Analyse, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
  • Kombination von Ultrafiltration und Streptavidin-Dynabeads: Zum Aufzeichnen eines Spektrums wurden zwei LCR (durchgeführt wie vorstehend beschrieben) gepoolt, 1:1 mit 2 × B/W Puffer verdünnt und mit einer 5000 NMWL Ultrafree-MC Filtereinheit (Millipore, Eschborn, Deutschland) gemäß den Angaben des Herstellers eingeengt. Nach der Einengung wurden die Proben gewaschen, indem 300 μl 1 × B/W Puffer zu Streptavidin-Dynabeads zugegeben wurden. Die Kügelchen wurden einmal auf der Ultrafree-MC Filtrationseinheit mit 300 μl 1 × B/W Puffer gewaschen und bearbeitet, wie vorstehend beschrieben. Die Kügelchen wurden in 30 bis 50 μl 1 × B/W Puffer resuspendiert und in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt. Der Überstand wurde entfernt und die Kügelchen wurden zweimal mit 50 μl 0,7 M Ammoniumcitrat (pH 8,0) gewaschen. Schließlich wurden die Kügelchen einmal mit 30 μl Aceton gewaschen und in 1 μl ultrareinem Wasser resuspendiert. Das Ligationsgemisch nach Immobilisierung auf den Kügelchen wurde für die MALDI-TOF MS Analyse, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
  • MALDI-TOF MS
  • Eine Suspension von Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen mit der immobilisierten DNA wurde auf den Probenhalter pipettiert, danach sofort mit 0,5 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure in 50% Acetonitril, 70 mM Ammoniumcitrat) gemischt. Dieses Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur trocknen gelassen und in das Massenspektrometer eingebracht. Alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus aufgenommen, unter Verwendung eines Finnigan MAT Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Deutschland), das mit einem Reflektron (5 keV Ionenquelle, 20 keV Nachbeschleunigung) und einem Stickstofflaser (337 nm) ausgestattet war. Für die Analyse von Pfu DNA-Ligase wurden 0,5 μl der Lösung auf dem Probenhalter mit 1 μl Matrixlösung gemischt und wie vorstehend beschrieben präpariert. Für die Analyse von ungereinigten LCR wurde 1 μl einer LCR mit 1 μl Matrixlösung gemischt.
  • ERGEBNISSE UND DISKUSSION
  • Das E. coli lacl Gen diente als ein einfaches Modellsystem, um die Eignung von MALDI-TOF MS als ein Nachweisverfahren für Produkte, die in Ligasekettenreaktionen erzeugt worden waren, zu untersuchen. Dieses Templatsystem besteht aus einem E. coli lacl Wildtypgen in einem pBluescript KII Phagemid, und einem E. coli lacl Gen, das eine einzige Punktmutation an bp 191 (Transition C nach T) aufweist, im gleichen Phagemid. Vier verschiedene Oligonukleotide wurden verwendet, die nur ligiert werden konnten, wenn das E. coli lacl Wildtypgen vorhanden war (26).
  • Die LCR-Bedingungen wurden unter Verwendung von Pfu DNA-Ligase optimiert, um mindestens 1 pMol Ligationsprodukt in jeder positiven Reaktion zu erhalten. Die Ligationsreaktionen wurden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und HPLC auf dem SMART-System (27, 28 und 29) analysiert. 27 zeigt eine PAGE einer positiven LCR mit Wildtyptemplat (Bahn 1), eine negative LCR mit mutiertem Templat (1 und 2), und eine negative Kontrolle, die Enzym, Oligonukleotide und kein Templat enthält. Die Gelelektrophorese zeigt klar, dass das Ligationsprodukt (50 bp) nur in der Reaktion mit Wildtyptemplat erzeugt wurde, während weder das Templat mit der Punktmutation noch die Kontrollreaktion mit Lachssperma-DNA Amplifikationsprodukte erzeugten. In 28 wurde HPLC verwendet, um zwei gepoolte LCR mit Wildtyptemplat, die unter den gleichen Bedingungen durchgeführt worden waren, zu analysieren. Das Ligationsprodukt ist klar zu erkennen. 29 zeigt die Ergebnisse einer HPLC, bei der zwei gepoolte negative LCR mit mutiertem Templat analysiert wurden. Diese Chromatogramme bestätigen die in 27 gezeigten Daten und zusammen genommen zeigen die Ergebnisse klar, dass das System nur dann Ligationsprodukte in einer signifikanten Menge erzeugt, wenn das Wildtyptemplat bereitgestellt wird.
  • Es wurden geeignete Kontrollläufe durchgeführt, um Retentionszeiten der verschiedenen, an den LCR-Experimenten beteiligten Verbindungen zu bestimmen. Diese umfassen die vier Oligonukleotide (A, B, C und D), ein synthetisches ds 50-mer (mit der gleichen Sequenz wie das Ligationsprodukt), die Wildtyptemplat-DNA, beschallte Lachssperma-DNA und die Pfu DNA-Ligase in Ligationspuffer.
  • Um zu testen, welches Reinigungsverfahren angewandt werden sollte, bevor eine LCR-Reaktion mittels MALDI-TOF MS analysiert werden kann, wurden Aliquots einer ungereinigten LCR (30A) und Aliquots der Enzym-Vorratslösung (30B) mit MALDI-TOF MS analysiert. Es stellte sich heraus, dass eine geeignete Probenpräparation absolut notwendig ist, da alle Signale in der ungereinigten LCR Signalen entsprechen, die in der MALDI-TOF MS Analyse der Pfu DNA-Ligase erhalten wurden. Die berechneten Werte der Massen von Oligo A und dem Ligationsprodukt sind 7521 Da bzw. 15450 Da. Die Daten in 30 zeigen, dass die Enzymlösung zu Massensignalen führt, welche die erwarteten Signale der Ligationsedukte und -produkte überlagern und daher eine eindeutige Signalzuordnung unmöglich machen. Weiterhin zeigten die Spektren Signale des oberflächenaktiven Mittels Tween20, das Bestandteil des Enzymlagerpuffers ist und das Kristallisationsverhalten des Analyt/Matrix-Gemisches auf ungünstige Weise beeinflusst.
  • In einem Reinigungsformat wurden Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchen verwendet. Wie in einer vor kurzem erschienenen Veröffentlichung gezeigt wurde, ist die direkte Desorption von DNA, die immobilisiert ist durch Watson-Crick-Basenpaarung an ein komplementäres DNA-Fragment, welches kovalent an die Kügelchen gebunden ist, möglich und es wird ausschließlich der nicht-biotinylierte Strang desorbiert (Tang, K. et al. (1995), Nucleic Acids Res. 23: 3126–3131). Dieser Ansatz bei Verwendung von immobilisierten ds DNA stellt sicher, dass ausschließlich der nicht-biotinylierte Strang desorbiert wird. Wenn nicht-immobilisierte ds DNA analysiert wird, werden beide Stränge desorbiert (Tang, K. et al. (1994), Rapid Comm. Mass Spectrom. 7: 183–186), was in Abhängigkeit von der Massendifferenz der zwei Stränge zu breiten Signalen führt. Daher werden unter Verwendung dieses Systems für die LCR nur das nicht-ligierte Oligonukleotid A mit einer berechneten Masse von 7521 Da und das Ligationsprodukt aus Oligo A und Oligo B (berechnete Masse: 15450 Da) desorbiert, wenn Oligo C am 5'-Ende biotinyliert ist und auf Streptavidin-beschichteten Kügelchen immobilisiert ist. Dies führt zu einer einfachen und eindeutigen Identifizierung der LCR-Edukte und -Produkte.
  • 31A zeigt ein MALDI-TOF Massenspektrum, das von zwei gepoolten LCR (durchgeführt wie vorstehend beschrieben), gereinigt auf Streptavidin-Dynabeads und direkt von den Kügelchen desorbiert, erhalten worden war, und zeigt, dass das verwendete Reinigungsverfahren (im Vergleich zu 30) effizient war. Es konnten ein Signal, welches das nicht-ligierte Oligo A darstellt, und ein dem Ligationsprodukt entsprechendes Signal nachgewiesen werden. Die Übereinstimmung zwischen den berechneten und den experimentell erhaltenen Massenwerten ist bemerkenswert und ermöglicht eine eindeutige Peakzuordnung und einen genauen Nachweis des Ligationsprodukts. Im Gegensatz dazu konnte im Spektrum, das von zwei gepoolten LCR mit mutiertem Templat erhalten wurde (31B), kein Ligationsprodukt sondern nur Oligo A nachgewiesen werden. Die Spezifität und Selektivität der LCR-Bedingungen und die Empfindlichkeit des MALDI-TOF Nachweises wird weiter aufgezeigt, wenn die Ligationsreaktion in Abwesenheit eines spezifischen Templats durchgeführt wird. 32 zeigt ein Spektrum, welches von zwei gepoolten LCR erhalten wurde, bei denen nur Lachssperma-DNA als eine negative Kontrolle verwendet wurde; wie erwartet, konnte nur Oligo A nachgewiesen werden.
  • Während die in 31A gezeigten Ergebnisse mit Bahn 1 des Gels in 27 korreliert werden können, ist das in 31B gezeigte Spektrum äquivalent zu Bahn 2 in 27, und schließlich entspricht auch das Spektrum in 32 Bahn 3 in 27. Die Ergebnisse sind im Einklang mit der in den 28 und 29 dargestellten HPLC-Analyse. Während sowohl Gelelektrophorese 27) als auch HPLC (28 und 29) entweder einen Überschuss oder annähernd gleiche Mengen von Ligationsprodukt gegenüber den Ligationsedukten zeigen, erzeugt die Analyse mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie ein kleineres Signal für das Ligationsprodukt (31A).
  • Die geringere Intensität des Signals des Ligationsprodukts könnte an unterschiedlichen Desorption/Ionisation-Effizienzen zwischen einem 24-mer und einem 50-mer liegen. Da der Tm-Wert eines Doppelstrangs mit 50 Basenpaaren, verglichen mit 24, erheblich höher ist, könnte mehr 24-mer desorbiert worden sein. Eine Verringerung der Signalintensität kann auch auf einen höheren Fragmentierungsgrad bei den längeren Oligonukleotiden zurückzuführen sein.
  • Trotz der Reinigung mit Streptavidin-Dynabeads offenbart 32 Spuren von Tween20 im Bereich um 2000 Da. Substanzen mit einer viskosen Konsistenz beeinträchtigen den Kristallisierungsvorgang und können daher für eine massenspektrometrische Analyse nachteilig sein. Tween20 und auch Glyzerin, die Bestandteile des Enzymlagerpuffers sind, sollten daher vor massenspektrometrischer Analyse vollständig entfernt werden. Aus diesem Grund wurde ein verbessertes Reinigungsverfahren untersucht, das einen zusätzlichen Ultrafiltrationsschritt vor der Behandlung mit Dynabeads umfasst. Tatsächlich führte diese Probenaufreinigung zu einer signifikanten Verbesserung des Leistungsverhaltens der MALDI-TOF Massenspektrometrie.
  • 33 zeigt Spektren, die von zwei gepoolten positiven (33A) bzw. negativen (33B) LCR erhalten wurden. Die positive Reaktion wurde mit einem chemisch synthetisierten einzelsträngigen 50-mer, mit einer dem Ligationsprodukt von Oligo C und D äquivalenten Sequenz, als Templat durchgeführt. Oligo C war 5'-biotinyliert. Daher wurde das Templat nicht nachgewiesen. Wie erwartet, konnte ausschließlich das Ligationsprodukt von Oligo A und B (berechnete Masse: 15450 Da) von dem immobilisierten und ligierten Oligo C und D desorbiert werden. Dieses neu erzeugte DNA-Fragment wird durch das Massensignal von 15448 Da in 33A dargestellt. Im Vergleich zu 32A zeigt dieses Spektrum deutlich, dass dieses Probenpräparationsverfahren Signale mit verbesserter Auflösung und Intensität erzeugt.
  • Beispiel 7 Mutationsnachweis durch Festphase-Oligobasisextension eines Primers und Analyse mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
  • Zusammenfassung
  • Das Festphase-Oligobasisextension-Verfahren entdeckt Punktmutationen und kleine Deletionen sowie kleine Insertionen in amplifizierter DNA. Das Verfahren beruht auf der Extension eines Detektionsprimers, der angrenzend an eine variable Nukleotidposition in einem Affinitäts-eingefangenen amplifizierten Templat annealt, unter Verwendung einer DNA-Polymerase, eines Gemisches von drei dNTP und dem fehlenden als Dideoxynukleotid. Die resultierenden Produkte werden ohne weitere Markierungsverfahren mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie bewertet und aufgelöst. Das Ziel des nachfolgenden Experiments war es, mutierte Allele und Wildtypallele rasch und zuverlässig nachzuweisen.
  • Beschreibung des Experiments
  • Das Verfahren verwendete einen einzigen Detektionsprimer, gefolgt von einem Oligonukleotidextensionsschritt, wobei Produkte erhalten werden, welche sich in spezifischer Weise für mutierte Allele oder Wildtypallele um ein paar Basen in der Länge unterscheiden, was in einfacher Weise durch MALDI-TOF Massenspektrometrie aufgelöst werden kann. Das Verfahren wird beschrieben unter Verwendung von Exon 10 des CFTR-Gens als Beispiel. Exon 10 dieses Gens enthält die häufigste Mutation in vielen ethnischen Gruppen (ΔF508), die wenn homozygot vorhanden zum klinischen Phänotyp der Mukoviszidose führt.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Genomische DNA
  • Genomische DNA wurde von gesunden Individuen, von Individuen, die für die ΔF508 Mutation homozygot oder heterozygot sind, und von einem Individuum, das für die I506S Mutation heterozygot ist, erhalten. Die Wildtypallele und mutierten Allele wurden durch Standardsequenzierung nach Sanger bestätigt.
  • PCR-Amplifizierung von Exon 10 des CFTR-Gens
  • Die Primer für die PCR-Amplifikation waren CFEx10-F (5'-GCAAGTGAATCCTGAGCGTG-3' (SEQ ID Nr. 13) aus Intron 9 und biotinyliert) und CGEx10-R (5'-GTGTGAAGGGCGTG-3' (SEQ ID Nr. 14) aus Intron 10). Primer wurden in einer Konzentration von 8 pMol verwendet. Taq Polymerase, umfassend 10 × Puffer wurde von Boehringer Mannheim bezogen, und dNTP wurden von Pharmacia erhalten. Das Reaktionsvolumen betrug 50 μl insgesamt. Zyklusbedingungen für die PCR waren anfangs 5 min bei 95°C, gefolgt von 1 min bei 94°C, 45 sec bei 53°C, und 30 sec bei 72°C für 40 Zyklen, mit einer Schlußextensionsdauer von 5 min bei 72°C.
  • Reinigung der PCR-Produkte
  • Amplifizierungsprodukte wurden gereinigt unter Verwendung des Qiagen PCR Purification Kit (No. 28106) gemäß den Angaben des Herstellers. Die Elution der gereinigten Produkte von der Säule wurde in 50 μl TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) durchgeführt.
  • Affinitätseinfang und Denaturierung der doppelsträngigen DNA
  • 10 μl Aliquots des gereinigten PCR-Produkts wurden in eine Vertiefung einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte (No. 1645684 Boehringer Mannheim oder No. 95029262 Labysytems) transferiert. Danach wurden 10 μl Inkubationspuffer (80 mM Natriumphosphat, 400 mM NaCl, 0,4% Tween20, pH 7,5) und 30 μl Wasser zugegeben. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen dreimal mit 200 μl Waschpuffer (40 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,1% Tween20, pH 8,8) gewaschen. Zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA wurden die Vertiefungen 3 min mit 100 μl einer 50 mM NaOH-Lösung behandelt. Danach wurden die Vertiefungen dreimal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen.
  • Oligobasisextensionsreaktion
  • Das Annealen von 25 pMol Detektionsprimer (CF508: 5'-CTATATTCATCATAGGAAACACCA-3' (SEQ ID Nr. 15)) wurde in 50 μl Annealingpuffer (20 mM Tris, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 1% Triton X-100, pH 8,75) während 10 min bei 50°C durchgeführt. Die Vertiefungen wurden dreimal mit 200 μl Waschpuffer und einmal in 200 μl TE-Puffer gewaschen. Die Extensionsreaktion wurde unter Verwendung mancher Komponenten des DNA Sequencing Kit von USB (No. 70770) und von dNTP oder ddNTP von Pharmacia durchgeführt. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 45 μl, bestehend aus 21 μl Wasser, 6 μl Sequenasepuffer, 3 μl 10 mM DTT-Lösung, 4,5 μl 0,5 mM von drei dNTP, 4,5 μl 2 mM des fehlenden Nukleotids als ddNTP, 5,5 μl Glyzerin-Enzymverdünnungspuffer, 0,25 μl Sequenase 2.0, und 0,25 μl Pyrophosphatase. Die Reaktion wurde auf Eis zusammenpipettiert und danach 15 min bei Raumtemperatur und 5 min bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Vertiefungen dreimal mit 200 μl Waschpuffer und einmal mit 60 μl einer 70 mM NH4-Citratlösung gewaschen.
  • Denaturierung und Präzipitation des extendierten Primers
  • Der extendierte Primer wurde 10 min in 50 μl 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) in Wasser bei 80°C denaturiert. Zur Präzipitation wurden 10 μl NH4-Acetat (pH 6,5), 0,5 μl Glykogen (10 mg/ml Wasser, Sigma No. G1765) und 100 μl absoluter Ethanol zum Überstand zugegeben und es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 13.000 G wurde das Pellet in 70% Ethanol gewaschen und in 1 μl 18 Mohm/cm H2O Wasser resuspendiert.
  • Probenpräparation und Analyse mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
  • Die Probenpräparation wurde durchgeführt, indem jeweils 0,3 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,07 M zweibasisches Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) und resuspendiertes DNA/Glykogen-Pellet auf einem Probentarget gemischt und an Luft trocknen gelassen wurden. Bis zu 20 Proben wurden punktförmig auf eine Probentargetscheibe aufgetragen, zum Einbringen in den Quellbereich eines nicht modifizierten Thermo Bioanalysis (früher Finnegan) Visions 2000 MALDI-TOF, der in einem Reflektronmodus mit 5 bzw. 20 kV auf der Target- bzw. Konversionsdynode betrieben wurde. Theoretische mittlere Molekülmassen (Mr(calc)) wurden aus Atomzusammensetzungen berechnet, angegebene experimentelle Mr-Werte (Mr(exp)) sind diejenigen der einfach protonierten Form, bestimmt unter Verwendung externer Kalibrierung.
  • ERGEBNISSE
  • Das Ziel des Experiments war es, ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zum Mutationsnachweis zu entwickeln, das von genauen Stringenzen unabhängig ist, und das zu hoher Qualität und hohem Durchsatz bei der Diagnose von Erbkrankheiten führt. Daher wurde eine spezielle Art von DNA-Sequenzierung (Oligobasisextension eines Mutationsdetektionsprimers) mit der Bewertung der resultierenden Minisequenzierprodukte durch Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie (MS) kombiniert. Die Flugzeit (TOF) Reflektronanordnung wurde als ein mögliches System zur Messung der Massen ausgewählt. Um diese Hypothese zu beweisen wurde die Untersuchung mit Exon 10 des CFTR-Gens durchgeführt, in dem manche Mutationen zum klinischen Phänotyp der Mukoviszidose, der häufigsten monogenetischen Krankheit in der kaukasischen Bevölkerung, führen können.
  • Die schematische Darstellung, wie in 34 dargestellt, zeigt die erwarteten kurzen Sequenzierprodukte mit den theoretisch berechneten Molekülmassen des Wildtyps und verschiedener Mutationen von Exon 10 des CFTR-Gens. Die kurzen Sequenzierprodukte wurden entweder unter Verwendung von ddTTP (34A) oder von ddCTP (34B) erzeugt, wobei ein definitiv sequenzabhängiger Stop in dem entstehenden DNA-Strang eingeführt wird. Die MALDI-TOF MS Spektren von gesunden, für die Mutation heterozygoten und für die Mutation homozygoten Individuen sind in 34 dargestellt. Alle Proben wurden durch Standardsequenzierung nach Sanger bestätigt, die im Vergleich zu der massenspektrometrischen Analyse keine Diskrepanz aufzeigte. Die Genauigkeit der experimentellen Messungen der verschiedenen Molekülmassen war in einem Bereich von minus 21,8 bis plus 87,1 Dalton (Da) des erwarteten Bereichs. Dies ermöglichte eine definitive Interpretation der Ergebnisse in allen Fällen. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist der eindeutige Nachweis der ΔI507 Mutation. In der ddTTP-Reaktion würde das Wildtypallel nachgewiesen werden, während in der ddCTP-Reaktion die Deletion von drei Basenpaaren offensichtlich werden würde.
  • Das beschriebene Verfahren ist in hohem Maße geeignet zum Nachweis von einzelnen Punktmutationen oder DNA-Mikroläsionen. Eine sorgfältige Auswahl der Mutationsdetektionsprimer eröffnet die Möglichkeit von Multiplexverfahren und führt zu einem hohen Durchsatz, einschließlich hoher Qualität, bei der genetischen Diagnose ohne eine Erfordernis für genaue Stringenzen, die in vergleichbaren allelspezifischen Verfahren notwendig ist. Aufgrund der Einzigartigkeit der genetischen Information ist die Oligobasisextension eines Mutationsdetektionsprimers in jedem Krankheitsgen oder jeder polymorphen Region im Genom, wie von Tandemwiederholungen mit variabler Anzahl (VNTR, variable number tandem repeats) oder anderen Einzelnukieotidpolymorphismen (z. B. beim Apolipoprotein E Gen) anwendbar.
  • Beispiel 8 Nachweis von Polymerasekettenreaktionsprodukten, die 7-Deazapurinreste enthalten, mit Matrix-unterstützter Laserdesorption/Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF) Massenspektrometrie
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • PCR-Amplifikationen
  • Die nachfolgenden Oligodeoxynukleotidprimer wurden nach Standardphosphoamiditchemie (Sinha, N. D. et al. (1983), Tetrahedron Let., Vol. 24, Seiten 5843–5846; Sinha, N. D. et al. (1984), Nucleic Acids Res., Vol. 12, Seiten 4539–4557) auf einem MilliGen 7500 DNA-Synthesizer (Millipore, Bedford, MA, USA) in einem 200 pMol Maßstab synthetisiert oder von MWG-Biotech (Ebersberg, Deutschland, Primer 3) und Biometra (Göttingen, Deutschland, Primer 6–7) bezogen.
  • Figure 00600001
  • Die 99-mer und 200-mer DNA-Stränge (modifiziert und nicht-modifiziert) sowie das Ribo- und 7-Deaza-modifizierte 100-mer wurden von pRFc1 DNA (10 ng, großzügig bereitgestellt von S. Feyerabend, Universität Hamburg) amplifiziert, in einem Reaktionsvolumen von 100 μl, enthaltend 10 mMol/l KCl, 10 mMol/l (NH4)2SO4, 20 mMol/l Tris HCl (pH = 8,8), 2 mMol/l MgSO4, (exo(-)Pseudococcus furiosus (Pfu) Puffer, Pharmacia, Freiburg, Deutschland), 0,2 mMol/l jedes dNTP (Pharmacia, Freiburg, Deutschland), 1 μMol/l jedes Primers und 1 Einheit exo(-)Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, Heidelberg, Deutschland).
  • Für das 99-mer wurden die Primer 1 und 2, für das 200-mer wurden die Primer 1 und 3 und für das 100-mer wurden die Primer 6 und 7 verwendet. Um 7-Deazapurin-modifizierte Nukleinsäuren zu erhalten wurden während der PCR-Amplifikation dATP und dGTP durch 7-Deaza-dATP und 7-Deaza-dGTP ersetzt. Die Reaktion wurde in einem Thermocycler (OmniGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) durchgeführt, unter Verwendung des Zyklus: 1 min Denaturierung bei 95°C, 1 min Annealing bei 51°C und 1 min Extension bei 72°C. Für alle PCR betrug die Anzahl der Reaktionszyklen 30. Nach dem letzten Zyklus wurde die Reaktion weitere 10 min bei 72°C extendieren gelassen.
  • Die 103-mer DNA-Stränge (modifiziert und nicht-modifiziert) wurden von M13mp18 RFI DNA (100 ng, Pharmacia, Freiburg, Deutschland) in einem Reaktionsvolumen von 100 μl unter Verwendung der Primer 4 und 5 amplifiziert, wobei alle anderen Konzentrationen unverändert waren. Die Reaktion wurde durchgeführt unter Verwendung des Zyklus: 1 min Denaturierung bei 95°C, 1 min Annealing bei 40°C und 1 min Extension bei 72°C. Nach 30 Zyklen für das nicht-modifizierte bzw. 40 Zyklen für das modifizierte 103-mer wurden die Proben weitere 10 min bei 72°C inkubiert.
  • Synthese von 5'-[32P]-markierten PCR-Primern
  • Die Primer 1 und 4 wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (Epicentre Technologies) und (γ-32P)-ATP (BLU/NGG/502A, Dupont, Deutschland) nach den Protokollen des Herstellers 5'-[32P]-markiert. Die Reaktionen wurden durchgeführt, indem 10% der Primer 1 und 4 in der PCR durch die markierten Primer ersetzt wurden, unter ansonsten unveränderten Reaktionsbedingungen. Die amplifizierten DNA wurden mittels Gelelektrophorese auf einem 10% Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die entsprechenden Banden wurden ausgeschnitten und auf einem Packard TRI-CARS 460C Flüssigszintillationssystem (Packard, CT, USA) ausgezählt.
  • Primerabspaltung von Ribo-modifiziertem PCR-Produkt
  • Die amplifizierte DNA wurde unter Verwendung von Ultrafree-MC Filtereinheiten (30.000 NMWL) gereinigt, und wurde danach in 100 μl 0,2 Mol/l NaOH erneut aufgelöst und 25 Minuten bei 95°C erwärmt. Die Lösung wurde danach mit HCl (1 Mol/l) angesäuert und unter Verwendung von Ultrafree-MC Filtereinheiten (10.000 NMWL) für die MALDI-TOF Analyse weiter gereinigt, wie nachstehend beschrieben.
  • Reinigung von PCR-Produkten
  • Alle Proben wurden unter Verwendung von Ultrafree-MC Einheiten 30.000 NMWL (Millipore, Eschborn, Deutschland) nach der Beschreibung des Herstellers gereinigt und eingeengt. Nach Lyophilisierung wurden PCR-Produkte wieder in 5 μl (3 μl für das 200-mer) ultrareinem Wasser aufgelöst. Diese Analytlösung wurde direkt für MALDI-TOF Messungen verwendet.
  • MALDI-TOF MS
  • Aliquots von 0,5 μl Analytlösung und 0,5 μl Matrixlösung (0,7 Mol/l 3-HPA und 0,07 Mol/l Ammoniumcitrat in Acetonitril/Wasser (1:1, v/v)) wurden auf einem ebenen Metallprobenträger gemischt. Nach Trocknen bei Umgebungstemperatur wurde die Probe zur Analyse in das Massenspektrometer eingebracht. Das verwendete MALDI-TOF Massenspektrometer war ein Finnigan MAT Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Deutschland). Spektren wurden im positiven Ionenreflektormodus mit einer 5 keV Ionenquelle und 20 keV Nachbeschleunigung aufgenommen. Das Gerät war mit einem Stickstofflaser (Wellenlänge 337 nm) ausgestattet. Das Vakuum des Systems war 3 – 4·10–8 hPa im Analysatorbereich und 1 – 4·10-7 hPa im Quellbereich. Spektren von modifizierten und nicht-modifizierten DNA-Proben wurden mit der gleichen relativen Laserleistung erhalten, externe Kalibrierung wurde mit einem Gemisch von synthetischen Oligodeoxynukleotiden (7- bis 50-mer) durchgeführt.
  • ERGEBNISSE UND DISKUSSION
  • Enzymatische Synthese von 7-Deazapurinnukleotid-enthaltenden Nukleinsäuren mittels PCR
  • Um die Machbarkeit einer MALDI-TOF MS für die schnelle, Gel-freie Analyse von kurzen PCR-Produkten zu zeigen, und die Wirkung von 7-Deazapurin-Modifikation von Nukleinsäuren unter MALDI-TOF Bedingungen zu untersuchen, wurden zwei unterschiedliche Primer-Templat-Systeme zur Synthese von DNA-Fragmenten verwendet. Sequenzen sind in den 36 und 37 gezeigt. Während die zwei Einzelstränge des 103-mer PCR-Produkts nahezu gleiche Massen hatten (Δm = 8 u), unterschieden sich die zwei Einzelstränge des 99-mers um 526 u.
  • Unter Berücksichtigung, dass 7-Deazapurinnukleotid-Baublöcke für die chemische DNA-Synthese etwa 160 Mal teurer sind als die normalen (Produktinformation, Glen Research Corporation, Sterling, VA), und dass ihre Anwendung in Standard-β-Cyanphosphoamiditchemie nicht trivial ist (Produktinformation, Glen Research Corporation, Sterling, VA, Schneider, K., und B. T. Chait (1995) Nucleic Acids Res. 23, 1570), wären die Kosten für 7-Deazapurin-modifizierte Primer sehr hoch. Daher wurden, um die Anwendbarkeit und den Umfang des Verfahrens zu erhöhen, alle PCR unter Verwendung von nicht-modifizierten Oligonukleotidprimern, die routinemäßig verfügbar sind, durchgeführt. Ein Austausch von dATP und dGTP gegen c7-dATP und c7-dGTP in der Polymerasekettenreaktion führte zu Produkten, die etwa 80% 7-Deazapurin-modifizierte Nukleoside für das 99-mer und das 103-mer bzw. etwa 90% für das 200-mer enthielten. Tabelle I zeigt die Basenzusammensetzungen aller PCR-Produkte. TABELLE I Basenzusammensetzung der 99-mer, 103-mer und 200-mer PCR-Amplifikationsprodukte (nicht-modifiziert und 7-Deazapurin-modifiziert)
    DNA-Fragmente1 C T A G c7-Deaza-A c7-Deaza-G rel. Modifizierung2
    200-mer s 54 34 56 56
    modifiziertes 200-mer s 54 34 6 5 50 51 90%
    200-mer a 56 56 34 54
    modifiziertes 200-mer a 56 56 3 4 31 50 92%
    103-mer s 28 23 24 28
    modifiziertes 103-mer s 28 23 6 5 18 23 79%
    103-mer a 28 24 23 28
    modifiziertes 103-mer a 28 24 7 4 16 24 78%
    99-mer s 34 21 24 20
    modifiziertes 99-mer s 34 21 6 5 18 15 75%
    99-mer a 20 24 21 34
    modifiziertes 99-mer a 20 24 3 4 18 30 87%
    1 ”s” und ”a” bezeichnen ”Sense” und ”Antisense”-Stränge des doppelsträngigen PCR-Produkts.
    2 bezeichnet relative Modifizierung als Prozentanteil von 7-Deazapurin-modifizierten Nukleotiden der Gesamtmenge von Purinnukleotiden.
  • Es bleibt jedoch zu bestimmen, ob 80–90% 7-Deazapurin-Modifikation für einen genauen massenspektrometrischen Nachweis ausreichend sind. Es war daher wichtig zu bestimmen, ob alle Purinnukleotide während des enzymatischen Amplifikationsschritts ersetzt werden könnten. Dies war nicht trivial, da gezeigt worden war, dass c7-dATP in PCR dATP nicht vollständig ersetzen kann, wenn Taq DNA-Polymerase verwendet wird (Seela, F. and A. Roelling (1992), Nucleic Acids Res. 20, 55–61). Glücklicherweise fanden wir heraus, dass exo(-)Pfu DNA-Polymerase in der Tat c7-dATP und c7-dGTP in Abwesenheit nicht-modifizierter Purintriphosphate akzeptieren konnte. Der Einbau war jedoch weniger effizient, was zu einer geringeren Ausbeute an PCR-Produkt führt (38). Ethidiumbromid färbt durch Interkalation zwischen die gestapelten Basen des DNA-Doppelstrangs. Geringere Bandenintensitäten im Ethidiumbromid-gefärbten Gel können daher Artefakte sein, da die modifizierten DNA-Stränge nicht notwendigerweise die gleichen Bandenintensitäten ergeben wie die nicht-modifizierten.
  • Um diese Ergebnisse zu verifizieren wurden die PCR mit [32P]-markierten Primern wiederholt. Das Autoradiogramm (39) zeigt klar geringere Ausbeuten für die modifizierten PCR-Produkte. Die Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und ausgezählt. Für alle PCR-Produkte betrug die Ausbeute der modifizierten Nukleinsäuren etwa 50%, bezogen auf das entsprechende nicht-modifizierte Amplifikationsprodukt. Weitere Experimente zeigten, dass auch exo(-)Deep Vent und Vent DNA-Polymerase während der PCR c7-dATP und c7-dGTP einbauen konnten. Es stellte sich jedoch heraus, dass das Leistungsverhalten insgesamt für die exo(-)Pfu DNA-Polymerase am besten war, welche die wenigsten Nebenprodukte während der Amplifikation ergab. Es wurde herausgefunden, das derartige PCR, die c7-dATP und c7-dGTP anstelle ihrer Isostere verwendeten, bei Verwendung aller drei Polymerasen weniger Nebenreaktionen zeigten, was zu einem reineren PCR-Produkt führt. Ein geringeres Auftreten von Amplifikationsnebenprodukten kann erklärt werden durch eine Verringerung von Primermismatchen aufgrund einer niedrigeren Stabilität des Komplexes, der aus dem Primer und dem 7-Deazapurin-enthaltenden Templat, das während der PCR synthetisiert wird, gebildet wird. Ein erniedrigter Schmelzpunkt von 7-Deazapurin-enthaltenden DNA-Doppelsträngen ist beschrieben worden (Mizusawa, S. et al. (1986), Nucleic Acids Res. 14, 1319–1324). Es wird davon ausgegangen, dass zusätzlich zu den drei vorstehend angegebenen Polymerasen (exo(-)Deep Vent DNA-Polymerase, Vent DNA-Polymerase und exo(-)Pfu DNA-Polymerase) andere Polymerasen verwendet werden können, wie etwa das große Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase, Sequenase, Taq DNA-Polymerase und U AmpliTaq DNA-Polymerase. Zusätzlich müssen, wenn das Templat RNA ist, RNA-Polymerasen wie etwa die SP6 oder die T7 RNA-Polymerase verwendet werden.
  • MALDI-TOF Massenspektrometrie von modifizierten und nicht-modifizierten PCR-Produkten
  • Die 99-mer, 103-mer und 200-mer PCR-Produkte wurden mittels MALDI-TOF MS analysiert. Aufgrund früherer Erfahrung war bekannt, dass der Depurinierungsgrad von der zur Desorption und Ionisation des Analyten verwendeten Laserenergie abhängt. Da der Einfluss von 7-Deazapurin-Modifikation aufgrund von Depurinierung auf die Fragmentierung untersucht werden sollte, wurden alle Spektren mit der gleichen relativen Laserenergie gemessen.
  • Die 40a und 40b zeigen die Massenspektren der modifizierten und nicht-modifizierten 103-mer Nukleinsäuren. Beim modifizierten 103-mer verursacht Fragmentierung ein breites (M+H)+ Signal. Das Maximum des Peaks ist zu niedrigeren Massen verschoben, so dass die zugeordnete Masse einen Mittelwert des (M+H)+ Signals und Signale von fragmentierten Ionen, anstelle des eigentlichen (M+H)+ Signals, darstellt. Obwohl das modifizierte 103-mer immer noch etwa 20% A und G von den Oligonukleotidprimern enthält, zeigt es weniger Fragmentierung, was sich durch schmalere und symmetrische Signale zeigt. Insbesondere ist eine Schwanzbildung des Peaks auf der unteren Massenseite aufgrund von Depurinierung erheblich verringert. Somit ist die Differenz zwischen gemessener und berechneter Masse stark verringert, obwohl sie immer noch unterhalb der erwarteten Masse ist. Für die nicht-modifizierte Probe wurde ein (M+H)+ Signal von 31670 beobachtet, was eine Differenz von 97 u oder 0,3% zu der berechneten Masse ist. Währenddessen nahm bei der modifizierten Probe diese Massendifferenz auf 10 u oder 0,03% ab (gefunden: 31713 u, berechnet: 31723 u). Diese Beobachtungen werden verifiziert durch eine signifikante Zunahme in der Massenauflösung des (M+H)+ Signals der zwei Signalstränge (m/Δm = 67, gegenüber 18 für die nicht-modifizierte Probe, mit Δm = volle Breite bei halbem Maximum, fwhm (full width at half maximum)). Aufgrund der geringen Massendifferenz zwischen den zwei Einzelsträngen (8 u) wurden ihre individuellen Signale nicht aufgelöst.
  • Mit den Ergebnissen der 99 Basenpaar DNA-Fragmente werden die Wirkungen einer erhöhten Massenauflösung für 7-Deazapurin-enthaltende DNA sogar noch offensichtlicher. Die zwei Einzelstränge in der nicht-modifizierten Probe wurden nicht aufgelöst, obwohl die Massendifferenz zwischen den zwei Strängen des PCR-Produkts aufgrund einer ungleichen Verteilung von Purinen und Pyrimidinen mit 526 u sehr hoch war (41a). Im Gegensatz dazu zeigte die modifizierte DNA unterscheidbare Peaks für die zwei Einzelstränge (41b), was die Überlegenheit dieses Ansatzes für den Nachweis von Molekülmassen gegenüber gelelektrophoretischen Methoden noch hervorhebt. Obwohl keine Basislinienauflösung erhalten wurde, konnten die individuellen Massen mit einer Genauigkeit von 0,1% zugeordnet werden: Δm = 27 u für den leichteren Strang (berechnete Masse = 30224 u) und Δm = 14 u für den schwereren Strang (berechnete Masse = 30750 u). Es wurde wiederum festgestellt, dass die volle Breite bei halbem Maximum für die 7-Deazapurin-enthaltende Probe signifikant verringert war.
  • Sowohl beim 99-mer als auch beim 103-mer ergeben die 7-Deazapurin-enthaltenden Nukleinsäuren anscheinend eine höhere Empfindlichkeit, trotz der Tatsache, dass sie immer noch etwa 20% nicht-modifizierte Purinnukleotide enthalten. Um ein vergleichbares Signal-zu-Rauschen Verhältnis bei ähnlichen Intensitäten für die (M+H)+ Signale zu erhalten, brauchte das nicht-modifizierte 99-mer 20 Laserschüsse, gegenüber 12 für das modifizierte, und das 103-mer brauchte 12 Schüsse für die nicht-modifizierte Probe, gegenüber 3 für das 7-Deazapurinnukleosid-enthaltende PCR-Produkt.
  • Beim Vergleich der Spektren der modifizierten und nicht-modifizierten 200-mer Amplicons wurde wiederum eine verbesserte Massenauflösung sowie erhöhte Signalintensitäten für die 7-Deazapurin-enthaltende Probe gefunden (42a und 42b). Während im Spektrum der modifizierten Probe das Signal der Einzelstränge vorherrscht, ergaben für die nicht-modifizierte Probe der DNA-Doppelstrang und Dimere der Einzelstränge das stärkste Signal.
  • Eine vollständige 7-Deazapurin-Modifikation von Nukleinsäuren kann entweder durch Verwendung modifizierter Primer in der PCR oder durch Abspalten der nicht-modifizierten Primer aus dem teilweise modifizierten PCR-Produkt erreicht werden. Da mit modifizierten Primern Nachteile assoziiert sind, wie vorstehend beschrieben, wurde ein 100-mer synthetisiert, unter Verwendung von Primern mit einer Ribo-Modifikation. Die Primer wurden hydrolytisch mit NaOH abgespalten, nach einer Methode, die früher in unserem Labor entwickelt worden war (Koester, H. et al., Z. Physiol. Chem. 359, 1570–1589). Die 10a und 10b zeigen das Spektrum des PCR-Produkts vor und nach Primerabspaltung. 10b zeigt, dass die Hydrolyse erfolgreich war. Sowohl hydrolysiertes PCR-Produkt als auch die zwei freigesetzten Primer konnten nachgewiesen werden, zusammen mit einem schwachen Signal von restlichem, ungespaltetem 100-mer. Dieses Verfahren ist insbesondere für die MALDI-TOF Analyse von sehr kurzen PCR-Produkten geeignet, da der Anteil von nicht-modifizierten Purinen, die aus dem Primer stammen, mit abnehmender Länge der amplifizierten Sequenz zunimmt.
  • Die bemerkenswerten Eigenschaften von 7-Deazapurin-modifizierten Nukleinsäuren können durch eine effizientere Desorption und/oder Ionisation, eine erhöhte Ionenstabilität und/oder durch eine niedrigere Denaturierungsenergie der doppelsträngigen, Purin-modifizierten Nukleinsäure erklärt werden. Der Austausch von N-7 gegen eine Methingruppe führt zum Verlust eines Akzeptors für eine Wasserstoffbindung, was die Fähigkeit der Nukleinsäure, aufgrund von nicht-Watson-Crick-Basenpaarung Sekundärstrukturen auszubilden, beeinflusst (Seela, F. and A. Kehne (1987), Biochemistry 26, 2232–2238), was einen Grund für eine bessere Desorption während des MALDI-Verfahrens darstellen sollte. Zusätzlich dazu hat das aromatische System von 7-Deazapurin eine niedrigere Elektronendichte, was die Watson-Crick-Basenpaarung schwächt und zu einem erniedrigten Schmelzpunkt des Doppelstrangs führt (Mizusawa, S. et al. (1986), Nucleic Acids Res. 14, 1319–1324). Diese Wirkung kann die zur Denaturierung des Doppelstrangs während des MALDI-Verfahrens erforderliche Energie verringern. Diese Aspekte sowie der Verlust einer Stelle, die am N-7 Stickstoff vermutlich eine positive Ladung aufweisen wird, macht die 7-Deazapurin-modifizierte Nukleinsäure weniger polar, und kann die Desorptionswirksamkeit fördern.
  • Aufgrund der Abwesenheit von N-7 als Protonenakzeptor und der verringerten Polarisierung der C-N-Bindung in 7-Deazapurinnukleosiden wird eine Depurinierung nach dem für Hydrolyse in Lösung aufgezeigten Mechanismus verhindert. Obwohl eine direkte Korrelation von Reaktionen in Lösung und in der Gasphase problematisch ist, kann im MALDI-Verfahren eine geringere Fragmentierung aufgrund von Depurinierung der modifizierten Nukleinsäuren erwartet werden. Depurinierung kann entweder von Ladungsverlust begleitet werden, was die Gesamtausbeute geladener Spezies verringert, oder sie kann geladene Fragmentierungsprodukte erzeugen, was die Intensität des nicht-fragmentierten Molekülionensignals verringert.
  • Die Beobachtung sowohl einer höheren Empfindlichkeit als auch einer verringerten Peak-Schwanzbildung der (M+H)+ Signale an der unteren Massenseite aufgrund verringerter Fragmentierung der 7-Deazapurin-enthaltenden Proben deutet darauf hin, dass das N-7 Atom in der Tat für den Depurinierungsmechanismus im MALDI-TOF Verfahren essentiell ist. Zusammenfassend zeigen 7-Deazapurin-enthaltende Nukleinsäuren deutlich erhöhte Ionenstabilität und Empfindlichkeit unter MALDI-TOF Bedingungen, und sorgen somit für höhere Massengenauigkeit und Massenauflösung.
  • Beispiel 9 Festphasensequenzierung und massenspektrometrischer Nachweis
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Oligonukleotide wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) in ungereinigter Form bezogen. Sequenzreaktionen wurden an einer festen Oberfläche unter Verwendung von Reagenzien aus dem Sequenzierkit für Sequenase, Version 2.0 (Amersham, Arlington Heights, Illinois) durchgeführt.
  • Sequenzierung eines 39-mer Targets
  • Sequenzierkomplex:
    Figure 00700001
  • Um eine Festphase-DNA-Sequenzierung durchzuführen wurde der Templatstrang DNA11683 mittels terminaler Deoxynukleotidyltransferase 3'-biotinyliert. Eine 30 μl Reaktion, enthaltend 60 pMol DNA11683, 1,3 nMol Biotin 14-dATP (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 30 Einheiten terminale Transferase (Amersham, Arlington Heights, Illinois) und 1 × Reaktionspuffer (mit dem Enzym geliefert), wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hitzeinaktivierung der terminalen Transferase bei 70°C während 10 min gestoppt. Das resultierende Produkt wurde durch Leiten durch eine TE-10-Zentrifugiersäule (Clonetech) entsalzt. Es konnten mehr als ein Molekül Biotin 14-dATP an das 3'-Ende von DNA11683 angefügt werden. Die biotinylierte DNA11683 wurde 30 min bei Umgebungstemperatur mit 0,3 mg Dynal Streptavidin-Kügelchen in 30 μl 1 × Binde- und Waschpuffer inkubiert. Die Kügelchen wurden zweimal mit TE gewaschen und in 30 μl TE wieder aufgelöst, ein 10 μl Aliquot (enthaltend 0,1 mg Kügelchen) wurde für die Sequenzreaktionen verwendet.
  • Die 0,1 mg Kügelchen aus dem obigen Schritt wurden in einem 10 μl Volumen, enthaltend 2 μl 5 × Sequenase-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,5), 100 mM MgCl2 und 250 mM NaCl) aus dem Sequenase Kit, und 5 pMol des entsprechenden Primers, PNA16/DNA, resuspendiert. Das Annealing-Gemisch wurde auf 70°C erwärmt und während eines Zeitraums von 20–30 min langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Danach wurden 1 μl 0,1 M Dithiothreitol-Lösung, 1 μl Mn-Puffer (0,15 M Natriumisocitrat und 0,1 M MnCl2) und 2 μl verdünnte Sequenase (3,25 Einheiten) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in vier Aliquots von jeweils 3 μl aufgeteilt und mit Terminationsgemischen gemischt (jedes besteht aus 3 μl des entsprechenden Terminationsgemisches: 32 μM c7dATP, 32 μM dCTP, 32 μM c7dGTP, 32 μM dTTP und 3,2 μM eines der vier ddNTP, in 50 mM NaCl). Die Reaktionsgemische wurden 2 min bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Extension wurden die Kügelchen präzipitiert und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden zweimal gewaschen und in TE resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt.
  • Sequenzierung eines 78-mer Targets
  • Sequenzierkomplex:
    Figure 00720001
  • Das Target TNR.PLASM2 wurde biotinyliert und sequenziert unter Verwendung von Verfahren, die den im vorstehenden Abschnitt beschriebenen (Sequenzierung eines 39-mer Targets) ähnlich waren.
  • Sequenzierung eines 15-mer Targets mit teilweise doppelsträngiger Sonde
  • Sequenzierkomplex
    Figure 00720002
  • CM1B3B wurde auf Dynabeads M280 mit Streptavidin (Dynal, Norwegen) immobilisiert durch 30-minütige Inkubation von 60 pMol CM1B3B mit 0,3 Magnetkügelchen in 30 μl 1M NaCl und TE (1 × Binde- und Waschpuffer) bei Raumtemperatur. Die Kügelchen wurden zweimal mit TE gewaschen und in 30 μl TE wieder aufgelöst, für Sequenzreaktionen wurden 10 oder 20 μl Aliquots (enthaltend 0,1 bzw. 0,2 mg Kügelchen verwendet.
  • Der Doppelstrang wurde gebildet durch Annealen entsprechender Aliquots von Kügelchen aus dem obigen Schritt mit 10 pMol DF11a5F (oder 20 pMol DF11a5F für 0,2 mg Kügelchen) in einem 9 μl Volumen, enthaltend 2 μl 5 × Sequenase-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,5), 100 mM MgCl2 und 250 mM NaCl) aus dem Sequenase Kit. Das Annealing-Gemisch wurde auf 65°C erwärmt und während eines Zeitraums von 20–30 min langsam auf 37°C abkühlen gelassen. Der doppelsträngige Primer wurde danach mit 10 pMol TS10 (20 pMol TS10 für 0,2 mg Kügelchen) in einem Volumen von 1 μl gemischt und das resultierende Gemisch wurde weiter 5 min bei 37°C, 5–10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 1 μl 0,1 M Dithiothreitol-Lösung, 1 μl Mn-Puffer (0,15 M Natriumisocitrat und 0,1 M MnCl2) und 2 μl verdünnte Sequenase (3,25 Einheiten) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in vier Aliquots von jeweils 3 μl aufgeteilt und mit Terminationsgemischen gemischt (jedes besteht aus 4 μl des entsprechenden Terminationsgemisches: 16 μM dATP, 16 μM dCTP, 16 μM dGTP, 16 μM dTTP und 1,6 μM eines der vier ddNTP, in 50 mM NaCl). Die Reaktionsgemische wurden 5 min bei Raumtemperatur und 5 min bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Extension wurden die Kügelchen präzipitiert und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden in 20 μl TE resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Ein Aliquot von 2 μl (von 20 μl) wurde aus jedem Röhrchen entnommen und mit 8 μl Formamid gemischt, die resultierenden Proben wurden 5 min bei 90–95°C denaturiert, und 2 μl (von insgesamt 10 μl) wurden auf eine ALF DNA-Sequenziervorrichtung (Pharmacia, Piscataway, NJ) unter Verwendung eines 10% Polyacrylamidgels, das 7 M Harnstoff und 0,6 × TBE enthielt, aufgetragen. Der Rest des Aliquots wurde für die MALDI-TOF MS Analyse verwendet.
  • MALDI Probenpräparation und Instrumentierung
  • Vor der MALDI Analyse wurden die mit der Sequenzleiter beladenen Magnetkügelchen zweimal unter Verwendung von 50 mM Ammoniumcitrat gewaschen und in 0,5 μl reinem Wasser resuspendiert. Die Suspension wurde danach auf das Probentarget des Massenspektrometers aufgetragen, und 0,5 μl gesättigte Matrixlösung (3-Hydroxypicolinsäure(HPA):Ammoniumcitrat = 10:1 Molverhältnis in 50% Acetonitril) wurden zugegeben. Vor der massenspektrometrischen Analyse wurde das Gemisch trocknen gelassen.
  • Für die Analyse wurde das Reflektron TOF-MS Massenspektrometer (Vision 2000, Finnigan MAT, Bremen, Deutschland) verwendet. In der Ionenquelle wurden 5 kV angelegt, und für die Nachbeschleunigung wurden 20 kV angelegt. Alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus aufgenommen und es wurde ein Stickstofflaser verwendet. Normalerweise wurde jedes Spektrum für mehr als 100 Schüsse gemittelt, und es wurde eine Standard-25 Punkt-Glättung angewandt.
  • ERGEBNISSE UND DISKUSSION
  • Herkömmliche Festphasensequenzierung
  • Bei herkömmlichen Sequenziermethoden wird ein Primer direkt an das Templat annealt und danach extendiert und in einer Dideoxysequenzierung nach Sanger ein Kettenabbruch herbeigeführt. Normalerweise wird ein biotinylierter Primer verwendet und die Sequenzleitern durch Streptavidin-beschichtete Magnetkügelchen eingefangen. Nach dem Waschen werden die Produkte unter Verwendung von EDTA und Formamid von den Kügelchen eluiert. Unsere früheren Erkenntnisse deuteten jedoch darauf hin, dass nur der annealte Strang eines Doppelstrangs desorbiert wird und der immobilisierte Strang auf den Kügelchen verbleibt. Es ist daher vorteilhaft, das Templat zu immobilisieren und den Primer zu annealen. Nach der Sequenzreaktion und dem Waschen können die Kügelchen mit dem immobilisierten Templat und der annealten Sequenzleiter direkt auf das Massenspektrometertarget geladen und mit der Matrix gemischt werden. Bei MALDI wird nur die annealte Sequenzleiter desorbiert und ionisiert, und das immobilisierte Templat verbleibt auf dem Target.
  • Ein 39-mer Templat (SEQ ID Nr. 23) wurde zunächst biotinyliert, durch Anfügen von Biotin 14-dATP an das 3'-Ende mit terminaler Transferase. Es konnten mehr als ein Biotin 14-dATP Molekül durch das Enzym angefügt werden. Da jedoch das Templat immobilisiert war und während MALDI auf den Kügelchen verblieb, würde die Anzahl von Biotin 14-dATP die Massenspektren nicht beeinträchtigen. Ein 14-mer Primer (SEQ ID Nr. 29) wurde für die Festphasensequenzierung verwendet. MALDI-TOF Massenspektren der vier Sequenzleitern sind in 34 gezeigt, und die erwarteten theoretischen Werte sind in Tabelle II gezeigt. TABELLE II
    Figure 00760001
    TABELLE II (Fortsetzung)
    A-Reaktion C-Reaktion G-Reaktion T-Reaktion
    1.
    2. 4223,8 4223,8 4223,8 4223,8
    3. 4521,1
    4. 4809,2
    5. 5122,4
    6. 5434,6
    7. 5737,8
    8. 6051,1
    9. 6379,2
    10. 6704,4
    11. 6995,6
    12. 7284,8
    13. 7574,0
    14. 7878,2
    15. 8207,4
    16. 8495,6
    17. 8808,8
    18. 9097,0
    19. 9386,2
    20. 9699,4
    21. 10027,6
    22. 10355,8
    23. 10644,0
    24. 10933,2
    25. 11246,4
    26. 11574,6
    27 11886,8
  • Die Sequenzreaktion erzeugte eine relativ homogene Leiter, und die Volllängensequenz wurde leicht nachgewiesen. Ein Peak bei etwa 5150, der in allen Reaktionen erschien, ist nicht identifiziert. Eine mögliche Erklärung ist, dass ein kleiner Teil des Templats irgendeine Art von Sekundärstruktur ausbildete, wie etwa eine Schleife, was eine Extension durch Sequenase verhinderte. Falscher Einbau spielt eine geringe Rolle, da die Intensität dieser Peaks erheblich geringer war als die der Sequenzleitern. Obwohl 7-Deazapurine in der Sequenzreaktion verwendet wurden, welche die N-glykosidische Bindung stabilisieren und Depurinierung verhindern könnten, wurden immer noch in geringem Umfang Basenverluste beobachtet, da der Primer nicht durch 7-Deazapurine substituiert war. Die Volllängenleiter, mit einem ddA am 3'-Ende, trat in der A-Reaktion mit einer scheinbaren Masse von 11899,8 auf. In allen vier Reaktionen trat jedoch ein intensiverer Peak von 122 auf und ist wahrscheinlich auf das Anfügen eines zusätzlichen Nukleotids durch das Sequenase-Enzym zurückzuführen.
  • Die gleiche Technik könnte verwendet werden, um längere DNA-Fragmente zu sequenzieren. Ein 78-mer Templat, das einen CTG-Repeat (mehrere CTG hintereinander) enthielt (SEQ ID Nr. 25) wurde 3'-biotinyliert durch Anfügen von Biotin 14-dATP mit terminaler Transferase. Ein 18-mer Primer (SEQ ID Nr. 26) wurde direkt außerhalb des CTG-Repeats annealt, so dass der Repeat sofort nach Primerextension sequenziert werden konnte. Die vier Reaktionen wurden gewaschen und wie üblich mittels MALDI-TOF MS analysiert. Ein Beispiel der G-Reaktion ist in 35 gezeigt, und die erwartete Sequenzleiter mit theoretischen Massenwerten für jede Komponente der Leiter ist in Tabelle III gezeigt. Alle Sequenzpeaks waren gut aufgelöst, mit Ausnahme der letzten Komponente (theoretischer Wert 20577,4), die vom Hintergrund nicht unterscheidbar war. Zwei benachbarte Sequenzpeaks (ein 62-mer und ein 63-mer) waren ebenfalls aufgetrennt, was anzeigt, dass eine derartige Sequenzanalyse auf längere Template anwendbar sein könnte. In diesem Spektrum wurde wiederum die Anfügung eines zusätzlichen Nukleotids durch das Sequenase-Enzym beobachtet. Diese Anfügung ist nicht Templat-spezifisch und trat in allen vier Reaktionen auf, was ihre Identifizierung einfach macht. Bei dem langen Templat hatten die Sequenzpeaks im Vergleich zu den Primerpeaks eine deutlich geringere Intensität. Weitere Optimierung der Sequenzreaktion mag erforderlich sein.
    Figure 00790001
    Figure 00800001
    TABELLE III (Fortsetzung)
    ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
    1. 5491,6 5491,6 5491,6 5491,6
    2. 5764,8
    3. 6078,0
    4. 6407,2
    5. 6696,4
    6. 7009,6
    7. 7338,8
    8. 7628,0
    9. 7941,2
    10. 8270,4
    11. 8559,6
    12. 8872,8
    13. 9202,0
    14. 9491,2
    15. 9804,4
    16. 10133,6
    17. 10422,88
    18. 10736,0
    19. 11065,2
    20. 11354,4
    21. 11667,6
    22. 11996,8
    23. 12286,0
    24. 12599,2
    25. 12928,4
    26. 13232,6
    27. 13521,8
    28. 13835,0
    29. 14124,2
    30. 14453,4
    21. 14742,6
    32. 15046,8
    33. 15360,0
    34. 15673,2
    35. 15962,4
    36. 16251,6
    37. 16580,8
    38. 16894,0
    39. 17207,2
    40. 17511,4
    41. 17800,6
    42. 18089,8
    43. 18379,0
    44. 18683,2
    45. 19012,4
    46. 19341,6
    47. 19645,8
    48. 19935,0
    49. 20248,2
    50. 20577,4
    51. 20890,6
    52. 21194,4
    53. 21484,0
    54. 21788,2
    55. 22092,4
  • Sequenzierung unter Verwendung doppelsträngiger DNA-Sonden zum Einfang und Primen
  • Es ist gezeigt worden, dass doppelsträngige DNA-Sonden mit Einzelstrangüberhang spezifische DNA-Template einfangen können und auch als Primer für die Festphasensequenzierung dienen können. Das Schema ist in 46 gezeigt. Stapelwechselwirkungen zwischen einer Doppelstrangsonde und einem einzelsträngigen Templat ermöglichen, dass nur ein Überhang von 5 Basen zum Einfang zur Verfügung steht. Auf Basis dieses Formats wurde ein 5'-Fluoreszenz-markiertes 23-mer (5'-GAT GAT CCG ACG CAT CAC AGC TC) (SEQ ID Nr. 29) an ein 3'-biotinyliertes 18-mer (5'-GTG ATG CGT CGG ATC ATC) (SEQ ID Nr. 30) annealt, wobei ein Überhang von 5 Basen verbleibt. Ein 15-mer Templat (5'-TCG GTT CCA AGA GCT) (SEQ ID Nr. 31) wurde durch den Doppelstrang eingefangen und mittels Extendierung des 5-Basenüberhangs wurden Sequenzreaktionen durchgeführt. MALDI-TOF Massenspektren der Reaktionen sind in 47A–D gezeigt. Alle Sequenzpeaks waren aufgelöst, wenn auch mit relativ geringen Intensitäten. Der letzte Peak in jeder Reaktion ist auf die unspezifische Anfügung eines Nukleotids zum Volllängenextensionsprodukt durch das Sequenase-Enzym zurückzuführen. Zum Vergleich wurden die gleichen Produkte auf einer herkömmlichen DNA-Sequenziervorrichtung laufen gelassen, und ein Stapelfluorogramm der Ergebnisse ist in 48 gezeigt. Wie aus der Figur ersichtlich ist, hatten die Massenspektren das gleiche Muster wie das Fluorogramm, mit Sequenzpeaks in einer im Vergleich zum 23-mer Primer erheblich geringeren Intensität.
  • Verbesserungen von MALDI-TOF Massenspektrometrie als Nachweistechnik
  • Die Probenverteilung kann homogener gemacht werden und die Signalintensität könnte theoretisch erhöht werden, indem man die Pikoliterviolentechnik verwirklicht. In der Praxis können die Proben auf kleine Vertiefungen mit quadratischen Öffnungen mit einer Größe von 100 μm aufgetragen werden. Die bei der Festphasensequenzierung verwendeten Kügelchen haben einen Durchmesser kleiner 10 μm, so dass sie gut in die Mikroliterviolen passen sollten. Mikrokristalle aus Matrix und DNA, die ”Sweet Spots” enthalten, werden in der Viole eingeschlossen. Da der Laser eine Punktgröße mit einem Durchmesser von etwa 100 μm hat, bedeckt er die gesamte Öffnung der Viole. Daher ist eine Suche nach Sweet Spots nicht notwendig, und zur Aufnahme von Spektren kann ein Laser mit einer hohen Wiederholungsrate (z. B. > 10 Hz) verwendet werden. Ein früherer Bericht hat gezeigt, dass diese Vorrichtung im Vergleich zu der herkömmlichen MALDI Probenpräparationstechnik die Nachweisempfindlichkeit von Peptiden und Proteinen um mehrere Größenordnungen erhöhen kann.
  • Die Auflösung von MALDI in bezug auf DNA muß weiter verbessert werden, um den Sequenzierbereich auf mehr als 100 Basen auszudehnen. Unter Verwendung von 3-HPA/Ammoniumcitrat als Matrix und eines Reflektron TOF Massenspektrometers mit einer 5 kV Ionenquelle und 20 kV Nachbeschleunigung ist derzeit die Auflösung des Peaks der Durchgangsreaktion in 33 (73-mer) größer 200 (FWHM), was in diesem Fall zur Sequenzbestimmung ausreichend ist. Diese Auflösung ist auch die höchste veröffentlichte für MALDI-desorbierte DNA-Ionen oberhalb des 70-mer Bereichs. Die Verwendung einer verzögerten Extraktionstechnik könnte die Auflösung weiter verstärken.

Claims (58)

  1. Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Targetnukleinsäuresequenzen, die in einer biologischen Probe vorliegen, umfassend die Schritte: a) Hybridisieren eines oder mehrere Detektoroligonukleotide mit einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen und Entfernen von nicht hybridisiertem Detektoroligonukleotid; b) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt a); und c) Analysieren der ionisierten und verdampften Nukleinsäure durch Massenspektrometrie, worin der Nachweis des Detektoroligonukleotids durch Massenspektrometrie das Vorliegen der Targetnukleinsäuresequenz in der biologischen Probe anzeigt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nukleinsäuremolekül auf einem festen Träger immobilisiert ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin Immobilisierung durch Hybridisierung zwischen einem komplementären Einfangnukleinsäuremolekül, das zuvor auf einem festen Träger immobilisiert worden ist, und einer komplementären spezifischen Sequenz auf dem Nukleinsäuremolekül verwirklicht wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, worin Immobilisierung durch direktes Binden des Nukleinsäuremoleküls an den festen Träger verwirklicht wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, worin vor Immobilisierung das Nukleinsäuremolekül amplifiziert wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Nukleinsäuremolekül durch ein Amplifikationsverfahren amplifiziert wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Klonieren, transkriptionsbasierende Amplifikation, die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR) und Strangumordnungsamplifikation (SDA).
  7. Verfahren nach Anspruch 2, worin der feste Träger ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Kügelchen, flachen Oberflächen, Nadeln, Kämmen und Wafer.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin Immobilisierung verwirklicht wird durch Hybridisierung zwischen einer Anordnung komplementärer Einfangnukleinsäuremoleküle, welche zuvor auf einem Träger immobilisiert worden sind, und einem Teil des Nukleinsäuremoleküls, welcher verschieden von der Zielnukleinsäuresequenz ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die komplementären Einfangnukleinesäuremoleküle Oligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika sind.
  10. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Immobilisierung reversibel ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Massenspektrometrieformat ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation, Flugzeit (MALDI-TOF), Elektrospray (ES), Ionencyclotronresonanz (ICR), Fourier-Transform und Kombinationen davon.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, worin vor Schritt b) eines oder beide von dem Detektoroligonukleotid und Nukleinsäuremolekül behandelt werden, um die Laserenergie, die zur Verdampfung erforderlich ist, zu verringern, Fragmentierung zu minimieren oder Signalverbreiterung zu eliminieren.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, worin mindestens zwei Detektoroligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika massendifferenziert werden, um mindestens zwei Targetnukleinsäuresequenzen gleichzeitig nachzuweisen und zu unterscheiden.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Massendifferenzierung erreicht wird durch Unterschiede der Länge oder Sequenz der mindestens zwei Oligonukleotide.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Massendifferenzierung erreicht wird durch Einführen von Massen-modifizierenden Funktionalitäten in den Base-, Zucker- oder Phosphatrest der Detektoroligonukleotide.
  16. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Massendifferenzierung durch den Austausch von Kationen an der Phosphodiesterbindung erreicht wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nukleinsäuremolekül unter Verwendung Massen-modifizierter Deoxynukleosidtriphosphate und RNA-abhängiger DNA-Polymerase vor der Massenspektrometrie repliziert wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nukleinsäuremolekül unter Verwendung von Massen-modifizierten Ribonukleosidtriphosphaten und DNA-abhängiger RNA-Polymerase vor der Massenspektrometrie repliziert wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Targetnukleinsäuresequenz ein DNA-Fingerprint ist oder verbunden ist mit einer Krankheit oder einem Zustand, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer genetischen Krankheit Chromosomenanomalie, einer genetischen Predisposition, einer viralen Infektion, einer Pilzinfektion, einer Bakterieninfektion und einer Protistinfektion.
  20. Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Zielnukleinsäuresequenzen, die in einer biologischen Probe vorliegen, umfassend die Schritte: a) Amplifizieren eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle; b) Hybridisieren eines oder mehrerer Detektoroligonukleotide mit den Nukleinsäuremolekülen und Entfernen von nicht hybridisiertem Detektoroligonukleotid; c) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt b); und d) Analysieren der ionisierten und verdampften Nukleinsäure durch Massenspektrometrie, worin der Nachweis des Detektoroligonukleotids durch Massenspektrometrie das Vorliegen der Targetnukleinsäuresequenz in der biologischen Probe anzeigt.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Nukleinsäure durch ein Amplifikationsverfahren amplifiziert wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Klonieren, auf Transkription basierende Amplifikation, die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR) und Strangumordnungsamplifikation (SDA).
  22. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Massenspektrometer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation, Flugzeit (MALDI-TOF), Elektrospray (ES), Ionencyclotronresonanz (ICR), Fourier-Transform und Kombinationen davon.
  23. Verfahren nach Anspruch 20, worin vor Schritt c) eines oder beide von dem Detektoroligonukleotid und dem Nukleinsäuremolekül behandelt werden, um die für die Verdampfung erforderliche Laserenergie zu verringern, Fragmentierung zu minimieren oder Signalverbreiterung zu eliminieren.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, worin mindestens zwei Detektoroligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika massendifferenziert werden, um mindestens zwei Targetnukleinsäuresequenzen gleichzeitig nachzuweisen und zu unterscheiden.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Massendifferenzierung durch Massenmodifizierungsfunktionalitäten, die an Primer gebunden sind, die zur Amplifikation verwendet werden, erreicht wird.
  26. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Massendifferenzierung durch Austausch von Kationen oder Entfernung der Ladung an der Phosphodiesterbindung erreicht wird.
  27. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Nukleinsäuremolekül DNA ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Nukleinsäuremolekül RNA ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 20, worin vor Schritt c) amplifizierte Nukleinsäuremoleküle auf einem festen Träger immobilisiert werden.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, worin Immobilisierung durch Hybridisierung zwischen einem komplementären Einfangnukleinsäuremolekül, welches zuvor auf einem festen Träger immobilisiert worden ist, und dem Nukleinsäuremolekül verwirklicht wird.
  31. Verfahren nach Anspruch 29, worin der feste Träger ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Kügelchen, flache Oberflächen, Nadeln, Kämme und Wafer.
  32. Verfahren nach Anspruch 29, worin die Immobilisierung reversibel ist.
  33. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Targetnukleinsäuresequenz ein DNA-Fingerprint ist oder kennzeichnend für eine Krankheit oder einen Zustand ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer genetischen Krankheit, einer Chromosomenanomalie, einer genetischen Predisposition, einer viralen Infektion, einer Pilzinfektion, einer Bakterieninfektion und einer Protistinfektion.
  34. Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte: a) Replizieren eines Nukleinsäuremoleküls; b) spezifisches Verdauen des replizierten Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung von mindestens einer geeigneten Nuklease, wobei verdaute Fragmente erhalten werden; und c) Analysieren der Fragmente durch Massenspektrometrie, worin der Nachweis des Molekulargewichts der Fragmente anzeigt, ob die Zielnukleinsäuresequenz vorliegt.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Nukleinsäurefragmente auf einem festen Träger immobilisiert werden.
  36. Verfahren nach Anspruch 35, worin der feste Träger komplementäre Einfangnukleinsäuremoleküle enthält.
  37. Verfahren nach Anspruch 35, worin der feste Träger ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Kügelchen, flachen Oberflächen, Nadeln, Kämmen und Wafer.
  38. Verfahren nach Anspruch 36, worin die komplementären Einfangnukleinsäuremoleküle Oligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika sind.
  39. Verfahren nach Anspruch 35, worin die Immobilisierung reversibel ist.
  40. Verfahren nach Anspruch 34, worin das Massenspektrometer ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation, Flugzeit (MALDI-TOF), Elektrospray (ES), Ionencyclotronresonanz (ICR), Fourier-Transform und Kombinationen davon.
  41. Verfahren nach Anspruch 34, worin vor Schritt c) die Nukleinsäurefragmente behandelt werden, um die Laserenergie, die zur Verdampfung erforderlich ist, zu erniedrigen, Fragmentierung zu minimieren oder Signalverbreiterung zu eliminieren.
  42. Verfahren nach Anspruch 41, worin die Behandlung Massendifferenzierung ist.
  43. Verfahren nach Anspruch 42, worin die Massendifferenzierung erreicht wird durch Einbringen Massen-modifizierender Funktionalitäten in den Base-, Zucker- oder Phosphatrest der Detektoroligonukleotide.
  44. Verfahren nach Anspruch 41, worin die Behandlung durch den Austausch von Kationen an der Phosphordieseterbindung erreicht wird.
  45. Verfahren nach Anspruch 34, worin das Nukleinsäuremolekül in DNA unter Verwendung Massen-modifizierter Deoxynukleosid- und/oder Dideoxynukleosidtriphosphate und RNA-abhängiger DNA-Polymerase repliziert wird.
  46. Verfahren nach Anspruch 34, worin das Nukleinsäuremolekül in RNA repliziert wird unter Verwendung von Massenmodifizierten Ribonukleosid- und/oder 3'-Dideoxynukleosidtriphosphaten und DNA-abhängiger RNA-Polymerase.
  47. Verfahren nach Anspruch 34, worin das Nukleinsäuremolekül in DNA repliziert wird unter Verwendung von Masse-modifizierten Deoxynukleosid- und/oder Dideoxynukleosidtriphosphaten und DNA-abhängiger DNA-Polymerase.
  48. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Targetnukleinsäuresequenz ein DNA-Fingerprint ist oder kennzeichnend für eine Krankheit oder einen Zustand ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer genetischen Krankheit, einer Chromosomenanormalität, einer genetischen Predisposition, einer viralen Infektion, einer Pilzinfektion, einer Bakterieninfektion und einer Protestinfektion.
  49. Verfahren zum Identifizieren eines Targetnukleotids in einem Nukleinsäuremolekül, umfassend die Schritte: a) Hybridisieren des Nukleinsäuremoleküls mit einem Primeroligonukleotid, das komplementär zu einer Steile ist, die benachbart dem Targetnukleotid in einem Nukleinsäuremolekül ist; b) Inkontaktbringen des Produkts von Schritt a) mit einem vollständigen Satz von Dideoxynukleosidtriphosphaten, 3'-Deoxynukleosidtriphosphaten oder Ribonukleotidtriphosphaten und einer Polymerase, sodass nur die Dideoxynukleosid-, 3'-Deoxynukleosid oder Ribonukleotidtriphosphate, die komplementär zu dem Targetnukleotid sind, auf dem Primer verlängert werden; c) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt b); und d) Analysieren der ionisierten und verdampften Nukleinsäure durch Massenspektrometrie, worin der Nachweis des Primers durch Massenspektrometrie die Identifizierung des Targetnukleotids bestimmt.
  50. Verfahren nach Anspruch 49, worin vor Schritt a) das Nukleinsäuremolekül auf einem Träger immobilisiert wird.
  51. Verfahren zum Nachweis einer Mutation in einem Nukleinsäuremolekül, umfassend die Schritte: a) Hybridisieren eines Nukleinsäuremoleküls mit einer Oligonukleotidsonde, wobei eine fehlende Übereinstimmung an der Stelle einer Mutation gebildet wird; b) Inkontaktbringen des Produkts von Schritt a) mit einer einstrangspezifischen Endonuklease; c) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt b); und d) Nachweisen der durch Massenspektrometrie erhaltenen Produkte, worin das Vorliegen von mehr als einem Fragment anzeigt, dass das Nukleinsäuremolekül eine Mutation enthält.
  52. Verfahren zum Nachweis einer Targetnukleinsäuresequenz, die in einer biologischen Probe vorliegt, umfassend die Schritte: a) Erhalten einer Nukleinsäure, die eine Targetnukleinsäuresequenz enthält, aus einer biologischen Probe; b) Durchführen mindestens einer Hybridisierung der Targetnukleinsäuresequenz mit einem Satz von Ligationsedukten und einer thermostabilen DNA-Ligase, wobei ein Ligationsprodukt gebildet wird; c) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt b); und d) Nachweisen des Ligationsprodukts durch Massenspektrometrie und Vergleichen des erhaltenen Wertes mit einem bekannten Wert, um die Targetnukleinsäuresequenz zu bestimmen.
  53. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Nuklease eine Endonuklease ist.
  54. Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Zielnukleinsäuresequenzen in einer biologischen Probe umfassend: a) Amplifizieren eines oder mehrerer Targetnukleinsäuremoleküle; b) Ionisieren und Verdampfen des Produkts von Schritt a); und c) Analysieren der ionisierten und verdampften Nukleinsäure durch Massenspektrometrie, worin der Nachweis der Targetnukleinsäuresequenz durch Massenspektrometrie das Vorliegen der Targetnukleinsäuresequenz in der biologischen Probe anzeigt; mit der Maßgabe, dass das ionisierte und verdampfte Produkt nicht ist: i) ein Nukleinsäuremolekül, das keine oder bis zu zehn negative Ladungen und keine oder bis zu zehn positive Ladungen enthält, worin wenn das Nukleinsäuremolekül keine negativen Ladungen aufweist, es mehr als 17 Zucker-Zucker-Bindungen aufweist und wenn die Nukleinsäure eine Ladung aufweist, gibt es weniger Ladungen als es Zucker-Zucker-Bindungen gibt; oder ii) ein Nukleinsäuremolekül, das eine negativ geladene nicht-Phosphat-Zucker-Zucker-Bindung umfasst und in welchem die Ladung von allen oder bis zu allen außer zehn der Zucker-Zucker-Bindungen des Nukleinsäuremoleküls eliminiert worden sind; und worin das Nukleinsäuremolekül, das in (i) und (ii) definiert ist, aus Templat-DNA, die von einem Patienten stammt, hergestellt ist, worin der Patient ein Patient ist, in dem das Vorliegen oder die Abwesenheit einer Mutation bestimmt werden soll und welche durch PCR amplifiziert wird.
  55. Verfahren nach Anspruch 1 oder 54, worin eine genetische Krankheit, Chromosomenanomalie, genetische Prädisposition für eine Krankheit oder einen Zustand oder eine Infektion durch ein Pathogen nachgewiesen oder ihre Identität bestimmt werden kann.
  56. Verfahren nach Anspruch 2, worin eine Pluralität von Nukleinsäuren auf einem festen Träger in einer Anordnung angeordnet werden und jeder Spot auf der Anordnung einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen wird.
  57. Verwendung einer massenspektrometrischen Analyse zum Nachweis in einer biologischen Probe einer genetischen Krankheit, einer Chromosomenanomalität, einer Prädisposition für eine Krankheit oder einen Zustand oder eine Infektion durch einen pathogenen Organismus durch Bestimmung ob die Probe eine Zielnukleinsäuresequenz umfasst, die ein Molekulargewicht gemäß Bestimmung durch Massenspektrometrie aufweist, das charakteristisch ist für die Krankheit, Abnormität, den Zustand oder die Infektion; mit der Maßgabe, dass die Zielnukleinsäuresequenz nicht ist: i) ein Nukleinsäuremolekül, das keine oder bis zu zehn negative Ladungen und keine oder bis zu zehn positive Ladungen enthält, worin wenn das Nukleinsäuremolekül keine negativen Ladungen aufweist, es mehr als 17 Zucker-Zucker-Bindungen aufweist und wenn die Nukleinsäure eine Ladung aufweist, gibt es weniger Ladungen als es Zucker-Zucker-Bindungen gibt; oder ii) ein Nukleinsäuremolekül, das eine negativ geladene nicht-Phosphat-Zucker-Zucker-Bindung umfasst und in welchem die Ladung von allen oder bis zu allen außer zehn der Zucker-Zucker-Bindungen des Nukleinsäuremoleküls eliminiert worden sind; und worin das Nukleinsäuremolekül, das in (i) und (ii) definiert ist, aus Templat-DNA, die aus einem Patienten stammt, hergestellt ist, worin der Patient ein Patient ist, in dem das Vorliegen oder die Abwesenheit einer Mutation bestimmt werden soll, worin die Mutation eine genetische Krankheit verursacht, und welche durch PCR amplifiziert wird.
  58. Verwendung einer Massenspektrometrieanalyse zum Erhalten einer Information aus einer biologischen Probe, die in Bezug steht mit der Identität, Vererbung oder genetischen Kompatibilität des Individuums, aus welchem die Probe erhalten worden ist, durch Bestimmen ob die Probe eine Targetnukleinsäure umfasst, die ein Molekulargewicht gemäß Bestimmung durch Massenspektrometrie aufweist, das repräsentativ für die Identität, Vererbung oder Kompatibilität ist.
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Families Citing this family (583)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6436635B1 (en) * 1992-11-06 2002-08-20 Boston University Solid phase sequencing of double-stranded nucleic acids
US5795714A (en) * 1992-11-06 1998-08-18 Trustees Of Boston University Method for replicating an array of nucleic acid probes
EP1262564A3 (de) 1993-01-07 2004-03-31 Sequenom, Inc. Dns-Sequenzierung durch Massenspektrometrie
US6194144B1 (en) 1993-01-07 2001-02-27 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US6074823A (en) * 1993-03-19 2000-06-13 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
PT700521E (pt) * 1993-05-28 2003-10-31 Baylor College Medicine Metodo e espectrometro de massa para dessorcao e ionizacao de analitos
US20020037517A1 (en) * 1993-05-28 2002-03-28 Hutchens T. William Methods for sequencing biopolymers
US6428955B1 (en) 1995-03-17 2002-08-06 Sequenom, Inc. DNA diagnostics based on mass spectrometry
US7803529B1 (en) 1995-04-11 2010-09-28 Sequenom, Inc. Solid phase sequencing of biopolymers
US20060063193A1 (en) * 1995-04-11 2006-03-23 Dong-Jing Fu Solid phase sequencing of double-stranded nucleic acids
US5830655A (en) 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US20020164818A1 (en) * 1995-05-23 2002-11-07 Gruber Karl F. Mass spectrometric immunoassay analysis of specific proteins and variants present in various biological fluids
WO1996037777A1 (en) * 1995-05-23 1996-11-28 Nelson Randall W Mass spectrometric immunoassay
US20030027216A1 (en) * 2001-07-02 2003-02-06 Kiernan Urban A. Analysis of proteins from biological fluids using mass spectrometric immunoassay
US6316266B1 (en) * 1995-06-07 2001-11-13 Arizona State University Board Of Regents Sample presentation apparatus for mass spectrometry
US6146854A (en) * 1995-08-31 2000-11-14 Sequenom, Inc. Filtration processes, kits and devices for isolating plasmids
JP3623025B2 (ja) * 1995-09-29 2005-02-23 日機装株式会社 混合気体成分分析装置
DE19543065C2 (de) * 1995-11-09 2002-10-31 Gag Bioscience Gmbh Zentrum Fu Verfahren zur Genomanalyse und Mittel zur Durchführung des Verfahrens
US6613508B1 (en) * 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
US6852487B1 (en) * 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
AU2069597A (en) 1996-03-04 1997-09-22 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
US5945675A (en) * 1996-03-18 1999-08-31 Pacific Northwest Research Foundation Methods of screening for a tumor or tumor progression to the metastatic state
EP0898575B1 (de) 1996-04-17 2004-12-29 KÖSTER, Hubert, Dr. Kombinatorische schutzgruppestrategie für multifunktionelle molekule
US6022688A (en) 1996-05-13 2000-02-08 Sequenom, Inc. Method for dissociating biotin complexes
EP0912761A4 (de) * 1996-05-29 2004-06-09 Cornell Res Foundation Inc Bestimmung von unterschieden in der nukleisäuresequenz mittels einer kombination von ligasebestimmung und polymerase-kettenreaktion
DE19633436A1 (de) * 1996-08-20 1998-02-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Ermittlung der Masse
US5777324A (en) 1996-09-19 1998-07-07 Sequenom, Inc. Method and apparatus for maldi analysis
US5965363A (en) 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US5885775A (en) * 1996-10-04 1999-03-23 Perseptive Biosystems, Inc. Methods for determining sequences information in polynucleotides using mass spectrometry
US6133436A (en) * 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
US6140053A (en) * 1996-11-06 2000-10-31 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
US6024925A (en) 1997-01-23 2000-02-15 Sequenom, Inc. Systems and methods for preparing low volume analyte array elements
CA2268740C (en) 1996-11-06 2010-07-20 Sequenom, Inc. High density immobilization of nucleic acids
US7285422B1 (en) * 1997-01-23 2007-10-23 Sequenom, Inc. Systems and methods for preparing and analyzing low volume analyte array elements
CA2270132A1 (en) * 1996-11-06 1998-05-14 Sequenom, Inc. Dna diagnostics based on mass spectrometry
CA2274587A1 (en) * 1996-12-10 1998-06-18 Genetrace Systems Inc. Releasable nonvolatile mass-label molecules
JP4663824B2 (ja) * 1996-12-31 2011-04-06 ハイ スループット ジェノミクス インコーポレイテッド 多重化分子分析装置および方法
US20050042625A1 (en) * 1997-01-15 2005-02-24 Xzillion Gmbh & Co. Mass label linked hybridisation probes
AU6553498A (en) * 1997-03-14 1998-09-29 Hybridon, Inc. Method for sequencing of modified nucleic acids using electrospray ionization-fourier transform mass spectrometry
US6994960B1 (en) * 1997-05-28 2006-02-07 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Nucleic acid diagnostics based on mass spectrometry or mass separation and base specific cleavage
AU743146B2 (en) * 1997-05-28 2002-01-17 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The Nucleic acid diagnostics based on mass spectrometry or mass separation and base specific cleavage
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
WO1999005321A1 (en) * 1997-07-22 1999-02-04 Rapigene, Inc. Amplification and other enzymatic reactions performed on nucleic acid arrays
US6207370B1 (en) * 1997-09-02 2001-03-27 Sequenom, Inc. Diagnostics based on mass spectrometric detection of translated target polypeptides
US20110166040A1 (en) * 1997-09-05 2011-07-07 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of strains of e. coli o157:h7
US6764822B1 (en) 1997-09-19 2004-07-20 Sequenom, Inc. DNA typing by mass spectrometry with polymorphic DNA repeat markers
WO1999014375A2 (en) * 1997-09-19 1999-03-25 Genetrace Systems, Inc. Dna typing by mass spectrometry with polymorphic dna repeat markers
US8236500B2 (en) * 1997-10-23 2012-08-07 The United States Of America, As Represented By The Department Of Veterans Affairs Promoter variants of the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor
AU741141B2 (en) * 1997-11-04 2001-11-22 Roche Diagnostics Gmbh Specific and sensitive method for detecting nucleic acids
US6268131B1 (en) 1997-12-15 2001-07-31 Sequenom, Inc. Mass spectrometric methods for sequencing nucleic acids
US6458533B1 (en) 1997-12-19 2002-10-01 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system for monitoring ESTs
US6238869B1 (en) 1997-12-19 2001-05-29 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system
US20030039967A1 (en) * 1997-12-19 2003-02-27 Kris Richard M. High throughput assay system using mass spectrometry
US6232066B1 (en) * 1997-12-19 2001-05-15 Neogen, Inc. High throughput assay system
US20100105572A1 (en) * 1997-12-19 2010-04-29 Kris Richard M High throughput assay system
US20030096232A1 (en) 1997-12-19 2003-05-22 Kris Richard M. High throughput assay system
US6407816B1 (en) * 1998-02-23 2002-06-18 Zygo Corporation Interferometer and method for measuring the refractive index and optical path length effects of air
US20020090639A1 (en) * 1998-02-26 2002-07-11 Mcginnis Ralph Evan Two dimensional linkage study methods and related inventions
US6428956B1 (en) * 1998-03-02 2002-08-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometric methods for biomolecular screening
WO1999053102A1 (en) * 1998-04-16 1999-10-21 Packard Bioscience Company Analysis of polynucleotide sequence
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6723564B2 (en) 1998-05-07 2004-04-20 Sequenom, Inc. IR MALDI mass spectrometry of nucleic acids using liquid matrices
ATE256142T1 (de) * 1998-05-15 2003-12-15 Isis Innovation Bibliotheken von unterschiedlich markierten oligomeren
US6104028A (en) * 1998-05-29 2000-08-15 Genetrace Systems Inc. Volatile matrices for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry
US6218118B1 (en) 1998-07-09 2001-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method and mixture reagents for analyzing the nucleotide sequence of nucleic acids by mass spectrometry
US5965358A (en) * 1998-08-26 1999-10-12 Genvec, Inc. Method for assessing the relative purity of viral gene transfer vector stocks
US6994998B1 (en) 1998-10-01 2006-02-07 Sequenom, Inc. Base-modified nucleotides and their use for polymorphism detection
US6777188B2 (en) 1998-10-01 2004-08-17 Variagenics, Inc. Genotyping by mass spectrometric analysis of allelic fragments
US6566059B1 (en) 1998-10-01 2003-05-20 Variagenics, Inc. Method for analyzing polynucleotides
US6458945B1 (en) 1998-10-01 2002-10-01 Variagenics, Inc. Method for analyzing polynucleotides
US6500650B1 (en) 1998-10-01 2002-12-31 Variagenics, Inc. Method for identifying polymorphisms
US6440705B1 (en) 1998-10-01 2002-08-27 Vincent P. Stanton, Jr. Method for analyzing polynucleotides
US6610492B1 (en) 1998-10-01 2003-08-26 Variagenics, Inc. Base-modified nucleotides and cleavage of polynucleotides incorporating them
US6855500B2 (en) 1998-10-01 2005-02-15 Sequenom, Inc. Fluorescence-based genotyping
WO2000021665A1 (en) * 1998-10-14 2000-04-20 Arizona Board Of Regents Immobilized silver immunoassay system
GB9824444D0 (en) * 1998-11-06 1999-01-06 Univ Manchester Metropolitan Micro-Organism identification
AUPP702498A0 (en) * 1998-11-09 1998-12-03 Silverbrook Research Pty Ltd Image creation method and apparatus (ART77)
AU2375600A (en) * 1998-12-22 2000-07-12 Stephen Felder High throughput assay system using mass spectrometry
DE19905082C1 (de) * 1999-01-29 2000-05-18 Epigenomics Gmbh Verfahren zur Identifikation von Cytosin-Methylierungsmustern in genomischen DNA-Proben
US6225061B1 (en) 1999-03-10 2001-05-01 Sequenom, Inc. Systems and methods for performing reactions in an unsealed environment
US6436640B1 (en) * 1999-03-18 2002-08-20 Exiqon A/S Use of LNA in mass spectrometry
US20020009394A1 (en) 1999-04-02 2002-01-24 Hubert Koster Automated process line
US6994969B1 (en) 1999-04-30 2006-02-07 Methexis Genomics, N.V. Diagnostic sequencing by a combination of specific cleavage and mass spectrometry
EP1072679A3 (de) * 1999-07-20 2002-07-31 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Methode zur Herstelung von Nucleinsäuremolekülen mit einer reduzierten Sekundärstruktur
DE19938138C2 (de) * 1999-08-16 2003-02-13 November Ag Molekulare Medizin Verfahren und Vorrichtung zur Identifikation einer Biopolymersequenz auf Festkörperoberflächen
US6306628B1 (en) * 1999-08-25 2001-10-23 Ambergen, Incorporated Methods for the detection, analysis and isolation of Nascent proteins
US6869572B1 (en) * 1999-09-13 2005-03-22 Millipore Corporation High density cast-in-place sample preparation card
WO2001019520A1 (en) * 1999-09-13 2001-03-22 Millipore Corporation High density cast-in-place sample preparation card
AU1075701A (en) 1999-10-08 2001-04-23 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for performing large numbers of reactions using array assembly
JP2003519829A (ja) 1999-10-13 2003-06-24 シークエノム・インコーポレーテツド データベースを作成する方法および多型遺伝的マーカーを同定するためのデータベース
US7917301B1 (en) 2000-09-19 2011-03-29 Sequenom, Inc. Method and device for identifying a biological sample
US7668658B2 (en) * 1999-10-13 2010-02-23 Sequenom, Inc. Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
US20030207297A1 (en) * 1999-10-13 2003-11-06 Hubert Koster Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
US6709816B1 (en) * 1999-10-18 2004-03-23 Affymetrix, Inc. Identification of alleles
DE60035293D1 (de) * 1999-12-20 2007-08-02 Penn State Res Found Aufgebrachte dünne filme und ihr gebrauch in nachweis, anheftung und biomedizinischen anwendungen
WO2001061040A1 (en) * 2000-02-16 2001-08-23 Quantum Dot Corporation Microarray methods utilizing semiconductor nanocrystals
CA2401118A1 (en) * 2000-02-23 2001-08-30 Zyomyx, Inc. Microfluidic devices and methods
DE10010282B4 (de) * 2000-02-25 2006-11-16 Epigenomics Ag Verfahren zur Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA Proben
DE10010280B4 (de) * 2000-02-25 2006-08-10 Epigenomics Ag Verfahren zur Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA Proben
AU2001250381A1 (en) * 2000-03-15 2001-09-24 Epigenomics Ag Diagnosis of diseases associated with tumor suppressor genes and oncogenes
DE10032529A1 (de) * 2000-06-30 2002-02-07 Epigenomics Ag Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des Major Histocompatibility Complex (MHC)
EP1274996A4 (de) * 2000-04-13 2006-02-01 Thermo Finnigan Llc Proteomische analyse durch parallele massenspektrometrie
DE10021204A1 (de) * 2000-04-25 2001-11-08 Epigenomics Ag Verfahren zur hochparallelen Analyse von Polymorphismen
KR20010097731A (ko) * 2000-04-25 2001-11-08 김희태 다양한 종류의 특이 핵산 시발자( 이하 프라이머 )를피씨알 튜브안에 함께 부착하여 핵산 중합 반응( 이하피씨알 )을 함께 수행하여 준 뒤 여기에 표지자가 부착된탐침자( 이하 프로브 )를 핵산 결합 반응을 시켜주어유전정보를 알 수 있게 하는 실험기법.
DE10027120A1 (de) * 2000-05-23 2001-12-06 Epigenomics Ag Probenträger für Massenspektrometer
ATE423221T1 (de) * 2000-06-13 2009-03-15 Univ Boston Verwendung von mass-matched nukleotide in der analyse von oligonukleotidmischungen sowie in der hoch-multiplexen nukleinsäuresequenzierung
EP1170379A1 (de) * 2000-06-30 2002-01-09 Centre National de Genotypage Erstellung von Proben zur Genotypisierung mittels Massenspektroskopie
AU2001278872A1 (en) * 2000-07-06 2002-01-21 Genvec, Inc. Method of identifying a binding partner of a gene product
DE10033091A1 (de) * 2000-07-07 2002-01-31 Max Planck Gesellschaft Polymer-Chip
US6958214B2 (en) 2000-07-10 2005-10-25 Sequenom, Inc. Polymorphic kinase anchor proteins and nucleic acids encoding the same
EP1816214B1 (de) * 2000-07-11 2008-06-25 Kirk Hogan Verfahren und Zusammensetzungen zur perioperativen genomischen Profilerstellung
US6811977B2 (en) * 2000-07-27 2004-11-02 California Institute Of Technology Rapid, quantitative method for the mass spectrometric analysis of nucleic acids for gene expression and genotyping
DE10036743A1 (de) * 2000-07-27 2002-02-07 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls
GB0021286D0 (en) * 2000-08-30 2000-10-18 Gemini Genomics Ab Identification of drug metabolic capacity
US20040185464A1 (en) * 2000-09-15 2004-09-23 Kris Richard M. High throughput assay system
US6479242B1 (en) 2000-10-26 2002-11-12 Cleveland State University Method for genotyping of single nucleotide polymorphism
KR100649342B1 (ko) * 2000-10-30 2006-11-27 시쿼넘, 인코포레이티드 기판 상으로 서브마이크로리터 볼륨들을 전달하기 위한 방법 및 장치
US7060442B2 (en) * 2000-10-30 2006-06-13 Regents Of The University Of Michigan Modulators on Nod2 signaling
US20030188326A1 (en) 2000-11-03 2003-10-02 Dana Farber Cancer Institute Methods and compositions for the diagnosis of cancer susceptibilities and defective DNA repair mechanisms and treatment thereof
JP2004536555A (ja) 2000-11-03 2004-12-09 ダナ ファーバー キャンサー インスティテュート 癌感受性の診断のための方法及び組成物並びに欠損ｄｎａ修復メカニズム及びその処置
AU2002222614A1 (en) * 2000-12-12 2002-07-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of detecting polymorphism in dna by using mass spectroscopy
AU2002246729A1 (en) * 2000-12-18 2002-08-06 Curagen Corporation G-protein coupled receptors and nucleic acids encoding same
FI115139B (fi) * 2001-01-10 2005-03-15 Valtion Teknillinen Menetelmä ja testipakkaus solu- tai kudosnäytteissä olevien polynukleotidien määrässä tapahtuvien vaihteluiden kvantitatiiviseen ja/tai vertailevaan arvioimiseen
JP2002214196A (ja) * 2001-01-18 2002-07-31 Hitachi Ltd Ｄｎａ解析システム
DE10108453B4 (de) 2001-02-22 2005-10-20 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrische Mutationsanalyse mit photolytisch spaltbaren Primern
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US20040121313A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in organs for transplantation
WO2004060278A2 (en) 2002-12-06 2004-07-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US20040121314A1 (en) * 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in containers
ATE476654T1 (de) * 2001-03-02 2010-08-15 Activx Biosciences Inc Plattform für protein-profiling
US20040121310A1 (en) * 2002-12-18 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in forensic studies
US20030027135A1 (en) * 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
AU2003298030B2 (en) * 2001-03-02 2009-12-10 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US7718354B2 (en) * 2001-03-02 2010-05-18 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
AU2003297687B2 (en) * 2001-03-02 2009-11-26 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20030036057A1 (en) * 2001-03-09 2003-02-20 Andreas Braun Genes and polymorphisms associated with cardiovascular disease and their use
US6428964B1 (en) 2001-03-15 2002-08-06 Exact Sciences Corporation Method for alteration detection
EP2332896A3 (de) * 2001-03-19 2012-09-26 President and Fellows of Harvard College Entwicklung neuer molekularer Funktionen
US20030219734A1 (en) * 2001-04-13 2003-11-27 Biosite Incorporated Polypeptides related to natriuretic peptides and methods of their identification and use
US7524635B2 (en) * 2003-04-17 2009-04-28 Biosite Incorporated Methods and compositions for measuring natriuretic peptides and uses thereof
KR100436554B1 (ko) * 2001-04-17 2004-06-18 삼성전자주식회사 혼성화된 핵산의 검출감도를 증가시키는 방법
US20020155587A1 (en) 2001-04-20 2002-10-24 Sequenom, Inc. System and method for testing a biological sample
WO2002096541A1 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Waters Investments Limited Desalting plate for maldi mass spectrometry
EP1390539A4 (de) * 2001-05-25 2007-06-27 Waters Investments Ltd Maldi-platten zur probenkonzentrierung für die maldi-massenspektrometrie
US7217510B2 (en) * 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
US7858560B2 (en) * 2001-07-16 2010-12-28 Caprotec Bioanalytics Gmbh Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
US6739803B2 (en) 2001-07-20 2004-05-25 Shell Oil Company Method of installation of electrically heated pipe-in-pipe subsea pipeline
US6714018B2 (en) 2001-07-20 2004-03-30 Shell Oil Company Method of commissioning and operating an electrically heated pipe-in-pipe subsea pipeline
US6814146B2 (en) * 2001-07-20 2004-11-09 Shell Oil Company Annulus for electrically heated pipe-in-pipe subsea pipeline
US6686745B2 (en) 2001-07-20 2004-02-03 Shell Oil Company Apparatus and method for electrical testing of electrically heated pipe-in-pipe pipeline
WO2004072616A2 (en) * 2003-02-10 2004-08-26 Waters Investments Limited A sample preparation plate for mass spectrometry
GB0120131D0 (en) 2001-08-17 2001-10-10 Micromass Ltd Maldi target plate
US20030040129A1 (en) * 2001-08-20 2003-02-27 Shah Haresh P. Binding assays using magnetically immobilized arrays
US20050147984A1 (en) * 2001-08-31 2005-07-07 Clondiag Chip Technologies Gmbh Interaction detection on several probe arrays
DE10144250A1 (de) 2001-08-31 2003-04-03 Fraunhofer Ges Forschung Verbesserte massenspektrometrische Analyse unter Verwendung von Nanopartikeln
US7582425B2 (en) * 2001-09-21 2009-09-01 The Regents Of The University Of Michigan Atlastin
US7108975B2 (en) * 2001-09-21 2006-09-19 Regents Of The University Of Michigan Atlastin
US20040019005A1 (en) * 2001-10-01 2004-01-29 Jeffrey Van Ness Methods for parallel measurement of genetic variations
KR100442822B1 (ko) * 2001-10-23 2004-08-02 삼성전자주식회사 전단응력 측정을 이용한 생분자들간의 결합 여부 검출 방법
US20030224380A1 (en) * 2001-10-25 2003-12-04 The General Hospital Corporation Genes and polymorphisms on chromosome 10 associated with Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases
AU2002364945A1 (en) * 2001-10-25 2003-07-09 Neurogenetics, Inc. Genes and polymorphisms on chromosome 10 associated with alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases
US20030170678A1 (en) * 2001-10-25 2003-09-11 Neurogenetics, Inc. Genetic markers for Alzheimer's disease and methods using the same
JP2005507078A (ja) * 2001-10-26 2005-03-10 セクエノム， インコーポレイテッド 規定された体積の固体粒子の並行分配のための方法および装置
US7045319B2 (en) * 2001-10-30 2006-05-16 Ribomed Biotechnologies, Inc. Molecular detection systems utilizing reiterative oligonucleotide synthesis
CN1604968A (zh) * 2001-10-31 2005-04-06 诺瓦提斯公司 基于tcf1基因多态性治疗糖尿病和相关病症的方法
AU2002364894A1 (en) * 2001-11-09 2003-06-30 Neurogenetics, Inc. Single nucleotide polymorphisms and mutations on alpha-2-macroglobulin
US20040067512A1 (en) * 2001-11-09 2004-04-08 Neurogenetics, Inc. Single nucleotide polymorphisms and mutations on Alpha-2-Macroglobulin
AU2002358110A1 (en) * 2001-12-10 2003-07-09 Novartis Ag Methods of treating psychosis and schizophrenia based on a polymorphism in the ctf gene
US20030148284A1 (en) * 2001-12-17 2003-08-07 Vision Todd J. Solid phase detection of nucleic acid molecules
US20050106587A1 (en) * 2001-12-21 2005-05-19 Micronas Gmbh Method for determining of nucleic acid analytes
US7195873B2 (en) * 2001-12-27 2007-03-27 Myriad Genetics, Inc. Drug response marker in beta-1 adrenergic receptor gene
US7877273B2 (en) * 2002-01-08 2011-01-25 Fredric David Abramson System and method for evaluating and providing nutrigenomic data, information and advice
EP1465998A2 (de) 2002-01-08 2004-10-13 Bayer HealthCare AG Herz-kreislauf-erkrankung und medikamentenwirkung voraussagende einzelnukleotid-polymorphismen
US7255986B2 (en) * 2002-01-31 2007-08-14 The Board Of Trustees Operating Michigan State University Compositions for the diagnosis and treatment of epizootic catarrhal enteritis in ferrets
US20030148288A1 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Yi-Wei Tang Colorimetric genetic test for clinically significant TNF polymorphism and methods of use thereof
EP1333101B1 (de) * 2002-02-01 2007-03-28 Bruker Daltonik GmbH Mutationsanalyse Mittels PCR und Massenspektrometrie
WO2003066882A2 (en) * 2002-02-06 2003-08-14 Tethys Bioscience, Inc. Method and apparatus for validating dna sequences without sequencing
AU2003280177A1 (en) * 2002-02-21 2004-05-13 Sense Proteomic Limited Enzyme array and assay
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
BR0200690A (pt) * 2002-03-04 2004-03-23 Embrapa Pesquisa Agropecuaria Método para detecção de proteinas de origem em misturas complexas
JP3530942B2 (ja) * 2002-03-05 2004-05-24 独立行政法人通信総合研究所 分子ビーム発生方法及び装置
AU2003224674A1 (en) * 2002-03-11 2003-09-29 Hk Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for analyzing the proteome
US6723546B2 (en) * 2002-03-26 2004-04-20 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and expression of BsaI restriction endonuclease and BsaI methylase in E. coli
AU2003222110A1 (en) 2002-03-28 2003-10-13 The Johns Hopkins University Detection of malaria parasites by mass spectrometry
AU2003269809A1 (en) * 2002-04-01 2003-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method for rapid detection and identification of viral bioagents
CA2484676A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-13 Sequenom, Inc. Kinase anchor protein muteins, peptides thereof, and related methods
US7442506B2 (en) * 2002-05-08 2008-10-28 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US20030220844A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Marnellos Georgios E. Method and system for purchasing genetic data
US20030219755A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Nanibhushan Dattagupta Compositions and methods for performing hybridization assays using target enhanced signal amplification (TESA)
AU2003249681A1 (en) 2002-05-31 2003-12-19 Diversa Corporation Multiplexed systems for nucleic acid sequencing
US20040018533A1 (en) * 2002-06-04 2004-01-29 Adam Gail Isabel Reid Diagnosing predisposition to fat deposition and therapeutic methods for reducing fat deposition and treatment of associated conditions
SE0201705D0 (sv) * 2002-06-05 2002-06-05 Sp Sveriges Provnings Och Fors Improved analysis
US6688900B2 (en) 2002-06-25 2004-02-10 Shell Oil Company Insulating joint for electrically heated pipeline
AU2003248794B2 (en) * 2002-06-27 2007-10-04 Harkness Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for reducing fat deposition and treating associated conditions
WO2004002295A2 (en) * 2002-06-27 2004-01-08 Sequenom, Inc. Diagnosing predisposition to fat deposition and associated condition
FI20021325A0 (fi) 2002-07-05 2002-07-05 Valtion Teknillinen Menetelmä ja reagenssipakkaus yksittäisten polynukleotidien määrän määrittämiseksi
US20040009482A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-15 Nanibhushan Dattagupta Compositions and methods for detecting streptococcus agalactiae surface immunogenic protein genes
US20040009574A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-15 Nanibhushan Dattagupta Compositions and methods for detecting streptococcus agalactiae capsular polysaccharide synthesis genes
US6624409B1 (en) 2002-07-30 2003-09-23 Agilent Technologies, Inc. Matrix assisted laser desorption substrates for biological and reactive samples
EP2385137A1 (de) 2002-07-31 2011-11-09 University of Southern California Polymorphismen zur Vorhersage des Krankheits- und Behandlungsausgangs
US20060073475A1 (en) * 2002-08-09 2006-04-06 Nanibhushan Dattagupta Compositions and methods for detecting pathogenic bacteria expressing chaperonin proteins
AU2003263937B2 (en) * 2002-08-19 2010-04-01 The President And Fellows Of Harvard College Evolving new molecular function
DE10240746A1 (de) * 2002-09-01 2004-03-18 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen mittels spaltbarer Sondenmoleküle
AU2003272361A1 (en) * 2002-09-11 2005-04-11 Sequenom, Inc. Methods for identifying subjects at risk of melanoma and treatments thereof
US20040050787A1 (en) * 2002-09-13 2004-03-18 Elena Chernokalskaya Apparatus and method for sample preparation and direct spotting eluants onto a MALDI-TOF target
US6863731B2 (en) * 2002-10-18 2005-03-08 Controls Corporation Of America System for deposition of inert barrier coating to increase corrosion resistance
EP1576185A4 (de) * 2002-10-18 2008-04-16 Genematrix Inc Verfahren zum nachweis von mutationen
CA2504903A1 (en) * 2002-11-06 2004-05-27 Sequenom, Inc. Method for identifying risk of melanoma and treatments thereof
US6937030B2 (en) * 2002-11-08 2005-08-30 Shell Oil Company Testing electrical integrity of electrically heated subsea pipelines
JP2006514546A (ja) * 2002-11-14 2006-05-11 ジェンタ・サルース・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー Ｂｃｌ−２を標的とする抑制性オリゴヌクレオチド
CA2505786C (en) * 2002-11-25 2011-06-21 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof
EP2112229A3 (de) 2002-11-25 2009-12-02 Sequenom, Inc. Verfahren zum Identifizieren des Brustkrebsrisikos und zugehörige Behandlungen
US20050064442A1 (en) * 2002-11-25 2005-03-24 Roth Richard B. Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof
AU2003298742A1 (en) * 2002-11-25 2004-06-18 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof
AU2003298733B2 (en) * 2002-11-27 2009-06-18 Agena Bioscience, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
US20040121315A1 (en) * 2002-12-18 2004-06-24 Ecker David J. Secondary structure defining database and methods for determining identity and geographic origin of an unknown bioagent in containers thereby
US20040122857A1 (en) * 2002-12-18 2004-06-24 Ecker David J. Secondary structure defining database and methods for determining identity and geographic origin of an unknown bioagent in forensic studies thereby
US20040121312A1 (en) * 2002-12-18 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of the absence of bioagents
CA2512134A1 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Mmi Genomics, Inc. Compositions, methods and systems for inferring bovine traits
WO2004064972A2 (en) * 2003-01-16 2004-08-05 Hk Pharmaceuticals, Inc. Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
US20070141570A1 (en) * 2003-03-07 2007-06-21 Sequenom, Inc. Association of polymorphic kinase anchor proteins with cardiac phenotypes and related methods
CA2518904A1 (en) * 2003-03-12 2004-09-23 Cleveland State University Molecular haplotyping of genomic dna
US8017323B2 (en) * 2003-03-26 2011-09-13 President And Fellows Of Harvard College Free reactant use in nucleic acid-templated synthesis
JP2006527190A (ja) 2003-04-17 2006-11-30 サイファージェン バイオシステムズ インコーポレイテッド ナトリウム利尿ペプチドに関連したポリペプチド、並びにこれらの同定および使用法
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
EP1618216A2 (de) * 2003-04-25 2006-01-25 Sequenom, Inc. Auf fragmentierung beruhende verfahren und systeme zur de-novo-sequenzierung
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US20040219532A1 (en) * 2003-04-30 2004-11-04 Sampson Jeffrey R. Internal references measurements
JP2006524988A (ja) * 2003-05-09 2006-11-09 キャピタルバイオ コーポレーション Ｓａｒｓウイルスを検出するための方法および組成物
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7964343B2 (en) * 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US20040248104A1 (en) * 2003-06-05 2004-12-09 Zohar Yakhini Methods and reagents for profiling quantities of nucleic acids
CN100494399C (zh) * 2003-06-30 2009-06-03 清华大学 一种基于dna芯片的基因分型方法及其应用
EP1493824A1 (de) * 2003-07-02 2005-01-05 Consortium National de Recherche en Genomique (CNRG) Verfahren zur detektion von Mutationen in DNA
US20050233341A1 (en) * 2003-07-23 2005-10-20 Roth Richard R Methods for identifying risk of melanoma and treatments thereof
US20050272043A1 (en) * 2003-07-24 2005-12-08 Roth Richard B Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof
EP2107129B1 (de) 2003-07-31 2012-08-22 Sequenom, Inc. Verfahren für Multiplex-Polymerasekettenreaktionen auf hohem Niveau und homogene Massenausdehnungsreaktionen zur Genotypisierung von Polymorphismen
CA2534382C (en) 2003-08-04 2018-12-11 The Hospital For Sick Children Epm2b gene mutations associated with lafora's disease
CN1580283A (zh) * 2003-08-13 2005-02-16 清华大学 一种检测核酸分子的方法
KR100647277B1 (ko) * 2003-08-14 2006-11-17 삼성전자주식회사 Ｂ형 간염 검사용 ｐｃｒ 프라이머 세트 및 이를 포함하는 ｂ형 간염 검사 키트
US20050123952A1 (en) * 2003-09-04 2005-06-09 Griffey Richard H. Methods of rapid detection and identification of bioagents using microRNA
US9394565B2 (en) * 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
US6977143B1 (en) * 2003-09-08 2005-12-20 Quest Diagnostics Investments Incorporated Determination of testosterone by mass spectrometry
US20080138808A1 (en) * 2003-09-11 2008-06-12 Hall Thomas A Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US20060240412A1 (en) * 2003-09-11 2006-10-26 Hall Thomas A Compositions for use in identification of adenoviruses
US20100035239A1 (en) * 2003-09-11 2010-02-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US20120122103A1 (en) 2003-09-11 2012-05-17 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of bacteria
US20100129811A1 (en) * 2003-09-11 2010-05-27 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of pseudomonas aeruginosa
US7964344B2 (en) * 2003-09-17 2011-06-21 Canon Kabushiki Kaisha Stable hybrid
ES2339710T5 (es) 2003-09-23 2017-10-05 University Of North Carolina At Chapel Hill Células que coexpresan vitamina K reductasa y proteína dependiente de vitamina K y uso de las mismas para mejorar la productividad de dicha proteína dependiente de vitamina K
US20050142584A1 (en) * 2003-10-01 2005-06-30 Willson Richard C. Microbial identification based on the overall composition of characteristic oligonucleotides
KR20070012779A (ko) * 2003-10-29 2007-01-29 리보메드 바이오테그놀로지스 인코포레이티드 반복적 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 조성물, 방법 및검출 기법
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US7276338B2 (en) * 2003-11-17 2007-10-02 Jacobson Joseph M Nucleotide sequencing via repetitive single molecule hybridization
EP1536021A1 (de) 2003-11-27 2005-06-01 Consortium National de Recherche en Genomique (CNRG) Methode zur Typisierung von HLA
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
US20090197246A1 (en) * 2004-01-10 2009-08-06 Udo Stropp Haplotypes and polymorphisms linked to human thiopurine s-methyltransferase deficiencies
US7432057B2 (en) * 2004-01-30 2008-10-07 Michigan State University Genetic test for PSE-susceptible turkeys
US20050191678A1 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Geneob Usa Inc. Genetic predictability for acquiring a disease or condition
US7666592B2 (en) * 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
WO2005080605A2 (en) 2004-02-19 2005-09-01 Helicos Biosciences Corporation Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
US20050186579A1 (en) * 2004-02-23 2005-08-25 Dellinger Douglas J. MALDI-MS analysis of nucleic acids bound to a surface
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
US7312036B2 (en) * 2004-03-22 2007-12-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for use in identification of viral hemorrhagic fever viruses
US7608394B2 (en) 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
US9249456B2 (en) * 2004-03-26 2016-02-02 Agena Bioscience, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
ES2529044T3 (es) * 2004-05-21 2015-02-16 Mo Bio Laboratories, Inc. Kits y procedimientos para eliminar contaminantes de ácidos nucleicos en muestras ambientales y biológicas
EP2458619B1 (de) * 2004-05-24 2017-08-02 Ibis Biosciences, Inc. Massenspektrometrie mit selektivem Ionfilter durch digitale Schwelle
US20050266411A1 (en) * 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
WO2005118856A1 (en) * 2004-05-27 2005-12-15 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof
US7785843B2 (en) * 2004-06-23 2010-08-31 Sequenom, Inc. Target-specific compomers and methods of use
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
US20080199480A1 (en) * 2004-07-22 2008-08-21 Sequenom, Inc. Methods for Identifying Risk of Type II Diabetes and Treatments Thereof
US20060073501A1 (en) * 2004-09-10 2006-04-06 Van Den Boom Dirk J Methods for long-range sequence analysis of nucleic acids
ES2345993T3 (es) 2004-09-14 2010-10-07 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Metodo para el tratamiento con bucindolol basado en direccionamiento genetico.
US20110098554A1 (en) * 2004-09-29 2011-04-28 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Monitoring of convection enhanced drug delivery
US7445896B2 (en) 2004-10-18 2008-11-04 University Of Washington Methods and compositions for detecting VKORC1 single nucleotide polymorphisms
GB0423873D0 (en) * 2004-10-27 2004-12-01 Univ Erasmus Nucleic acid analysis
CA2600184A1 (en) * 2005-03-03 2006-09-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for use in identification of adventitious viruses
US8084207B2 (en) * 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
EP1861499A4 (de) 2005-03-15 2008-09-03 Univ North Carolina Verfahren und zusammensetzungen zur herstellung aktiver vitamin-k-abhängiger proteine
US7745226B2 (en) 2005-04-06 2010-06-29 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting vitamin D metabolites
US7972867B2 (en) 2005-04-06 2011-07-05 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting vitamin D metabolites by mass spectrometry
EP1891244B1 (de) * 2005-04-13 2010-10-06 Ibis Biosciences, Inc. Zusammensetzungen für die identifizierung von adenoviren
US8486629B2 (en) * 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
WO2007002135A2 (en) * 2005-06-21 2007-01-04 Trace Bio Analytics, Llc Non-signal imidazole reagents for mass spectrometry analysis of phosphomonoesters
US20110045991A1 (en) * 2005-06-23 2011-02-24 Sadanand Gite Methods for the Detection of Colorectal Cancer
US8026084B2 (en) * 2005-07-21 2011-09-27 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
EP1924708A4 (de) * 2005-09-12 2010-03-10 Applera Corp Herstellungsverfahren für reine mirna-probe
ATE501278T1 (de) 2005-09-22 2011-03-15 Inst Nat Sante Rech Med Verfahren zur verwendung von il-21
WO2007041067A2 (en) * 2005-09-29 2007-04-12 Children's Hospital & Research Center At Oakland Methods and compositions for kir genotyping
WO2007047778A2 (en) * 2005-10-17 2007-04-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for use in identification of influenza viruses
CN101663048A (zh) 2005-11-01 2010-03-03 艾博特生物技术有限公司 使用生物标志物诊断强直性脊柱炎的方法和组合物
US20070207455A1 (en) * 2005-11-17 2007-09-06 Third Wave Technologies, Inc. Compositions and methods for detecting an HCV-1 subtype
US20080318215A1 (en) * 2005-12-20 2008-12-25 Ming-Sheng Lee Apparatus, methods and products for detecting genetic mutation
GB0601302D0 (en) 2006-01-23 2006-03-01 Semikhodskii Andrei Diagnostic methods and apparatus
US8457900B2 (en) * 2006-03-23 2013-06-04 The Regents Of The University Of California Method for identification and sequencing of proteins
WO2007118222A2 (en) 2006-04-06 2007-10-18 Ibis Biosciences, INC Compositions for the use in identification of fungi
US20070256148A1 (en) * 2006-04-26 2007-11-01 Katz David A DEP2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders
US8933209B2 (en) 2006-04-26 2015-01-13 Abbvie Inc. Dep2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders
US8084734B2 (en) * 2006-05-26 2011-12-27 The George Washington University Laser desorption ionization and peptide sequencing on laser induced silicon microcolumn arrays
US20100285973A1 (en) * 2006-05-30 2010-11-11 Synergenz Bioscience Limited of Sea Meadow House Methods and compositions for assessment of pulmonary function and disorders
EP3617321A3 (de) 2006-05-31 2020-04-29 Sequenom, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur nukleinsäureextraktion und -verstärkung aus einer probe
AU2007257162A1 (en) 2006-06-05 2007-12-13 Cancer Care Ontario Assessment of risk for colorectal cancer
CN101501251A (zh) * 2006-06-16 2009-08-05 塞昆纳姆股份有限公司 扩增、检测和定量样品中核酸的方法和组合物
US7972794B2 (en) * 2006-07-18 2011-07-05 Quest Diagnostics Investments Incorporated Oxidized apoA-I determination by mass spectrometry
AU2007275638B2 (en) 2006-07-21 2014-01-16 Amgen Inc. Method of detecting and/ or measuring hepcidin in a sample
JP5994121B2 (ja) 2006-09-07 2016-09-21 オタゴ イノベーション リミテッド バイオマーカー
US9149473B2 (en) * 2006-09-14 2015-10-06 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
US8053247B2 (en) * 2006-10-11 2011-11-08 Phynexus, Inc. Method and device for preparing an analyte for analysis by mass spectrometry
US8017015B2 (en) 2006-10-20 2011-09-13 Quest Diagnostics Investments Incorporated Monolithic column chromatography
US7604998B2 (en) * 2006-10-26 2009-10-20 Integrated Dna Technologies, Inc Fingerprint analysis for a plurality of oligonucleotides
US20080117416A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-22 Hunter Ian W Use of coherent raman techniques for medical diagnostic and therapeutic purposes, and calibration techniques for same
US7902345B2 (en) 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
EP2126117A2 (de) * 2007-01-18 2009-12-02 University Of Southern California Für duale tki-therapie prädiktive genpoylmorphismen
WO2008098142A2 (en) 2007-02-08 2008-08-14 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for rhd typing, gender determination and nucleic acid quantification
WO2008104002A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic dna analysis
CA2679954A1 (en) 2007-03-05 2008-09-12 Cancer Care Ontario Assessment of risk for colorectal cancer
US20100204266A1 (en) * 2007-03-23 2010-08-12 Ibis Biosciences, INC Compositions for use in identification of mixed populations of bioagents
US8652780B2 (en) 2007-03-26 2014-02-18 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
CA2684217C (en) * 2007-04-13 2016-12-13 Sequenom, Inc. Comparative sequence analysis processes and systems
DE102007023015A1 (de) * 2007-05-15 2008-11-20 Dietmar Fassbach Behälter zum Transport von warmen Speisen, insbesondere Pizza
WO2009023358A2 (en) * 2007-05-25 2009-02-19 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of strains of hepatitis c virus
AU2008260029B2 (en) 2007-05-31 2015-02-12 Yale University A genetic lesion associated with cancer
WO2008151023A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
US20110045456A1 (en) * 2007-06-14 2011-02-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses
US8017403B2 (en) 2007-06-14 2011-09-13 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry method for measuring vitamin B6 in body fluid
NZ556506A (en) * 2007-07-13 2010-03-26 Ovita Ltd Ovine identification method
US9404150B2 (en) 2007-08-29 2016-08-02 Sequenom, Inc. Methods and compositions for universal size-specific PCR
WO2009039122A2 (en) 2007-09-17 2009-03-26 Sequenom, Inc. Integrated robotic sample transfer device
US20090134325A1 (en) 2007-11-27 2009-05-28 Goldman Mildred M Methods for detecting estradiol by mass spectrometry
US7972868B2 (en) * 2007-11-28 2011-07-05 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting dihydroxyvitamin D metabolites by mass spectrometry
US8030084B2 (en) 2007-12-06 2011-10-04 Quest Diagnostics Investments Incorporated Thyroglobulin quantitation by mass spectrometry
US8916385B2 (en) 2007-12-13 2014-12-23 Quest Diagnostics Investments, Inc. Methods for detecting estrone by mass spectrometry
WO2009091934A1 (en) 2008-01-17 2009-07-23 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions
TW200933195A (en) * 2008-01-28 2009-08-01 Ind Tech Res Inst Autostereoscopic display
US20110097704A1 (en) * 2008-01-29 2011-04-28 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of picornaviruses
SG10201609507TA (en) 2008-02-01 2017-01-27 Gen Hospital Corp Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions
WO2011009104A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 The General Hospital Corporation Nucleic acid analysis
US8709726B2 (en) 2008-03-11 2014-04-29 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
CA2715914C (en) 2008-03-12 2019-01-22 Otago Innovation Limited Insulin signal peptide fragment biomarkers
CA2715921A1 (en) 2008-03-12 2009-09-17 Otago Innovation Limited Biomarkers
CA2718137A1 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
US20090270601A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-29 Steven Albert Benner Differential detection of single nucleotide polymorphisms
WO2009155103A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-23 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of tick-borne pathogens
WO2009151982A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-17 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of francisella
US20110151437A1 (en) * 2008-06-02 2011-06-23 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious viruses
US20100159506A1 (en) * 2008-07-25 2010-06-24 Cellscape Corporation Methods and systems for genetic analysis of fetal nucleated red blood cells
EP2149612A1 (de) 2008-07-29 2010-02-03 Merck Serono SA Genetische Marker der Reaktion auf Efalizumab
US8106351B2 (en) 2008-08-08 2012-01-31 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry assay for plasma-renin
US7834313B2 (en) 2008-08-08 2010-11-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry assay for plasma-renin
US9121844B1 (en) * 2008-09-09 2015-09-01 Sociedad Europea de Analisis Diferencial de Movilidad Method to analyze and classify persons and organisms based on odor patterns from released vapors
US7893399B2 (en) * 2008-09-09 2011-02-22 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting dehydroepiandrosterone by mass spectrometry
US8962247B2 (en) * 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8148163B2 (en) 2008-09-16 2012-04-03 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
US8476013B2 (en) * 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
JP5727375B2 (ja) 2008-09-16 2015-06-03 セクエノム， インコーポレイテッド 非侵襲性の出生前診断のために有用な、母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく濃縮のためのプロセスおよび組成物
US8534447B2 (en) 2008-09-16 2013-09-17 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
EP2349549B1 (de) 2008-09-16 2012-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Mischpatronen, mischstationen und verwandte ausrüstungen, und system
US20110200985A1 (en) * 2008-10-02 2011-08-18 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of herpesviruses
US20110189687A1 (en) * 2008-10-02 2011-08-04 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of members of the bacterial genus mycoplasma
US20110183343A1 (en) * 2008-10-03 2011-07-28 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of members of the bacterial class alphaproteobacter
WO2010039870A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of neisseria, chlamydia, and/or chlamydophila bacteria
WO2010039787A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of clostridium difficile
WO2010039848A2 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of streptococcus pneumoniae
US20110190170A1 (en) * 2008-10-03 2011-08-04 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of antibiotic-resistant bacteria
US7804063B2 (en) 2008-10-06 2010-09-28 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting dihydrotestosterone by mass spectrometry
US7952067B2 (en) 2008-10-06 2011-05-31 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting vitamin C by mass spectrometry
WO2010096117A2 (en) * 2008-10-29 2010-08-26 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating psychosis and schizophrenia based on polymorphisms in the erbb4 gene
WO2010077832A1 (en) 2008-12-15 2010-07-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and compositions for testing and breeding cattle for improved fertility and embryonic survival
US7952068B2 (en) 2008-12-16 2011-05-31 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting catecholamines by mass spectrometry
US8039794B2 (en) * 2008-12-16 2011-10-18 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry assay for thiopurine-S-methyl transferase activity and products generated thereby
US8399829B2 (en) 2008-12-18 2013-03-19 Quest Diagnostics Investments Incorporated Vitamin B2 detection by mass spectrometry
WO2010080616A1 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Abbott Laboratories Molecular assay for diagnosis of malaria
US20110207143A1 (en) * 2008-12-19 2011-08-25 Abbott Laboratories Diagnostic test for mutations in codons 12-13 of human k-ras
EP2381947A4 (de) 2008-12-23 2012-08-22 Quest Diagnostics Invest Inc Massenspektrometrietest für östrogen-verbindungen
EP2384437B1 (de) 2008-12-24 2018-12-12 Quest Diagnostics Investments Incorporated Massenspektrometrisches testverfahren für pregnenolon und 17-hydroxypregnenolon
US8110796B2 (en) 2009-01-17 2012-02-07 The George Washington University Nanophotonic production, modulation and switching of ions by silicon microcolumn arrays
EP2393939B1 (de) 2009-02-06 2014-09-17 Yale University Snp-marker für mamma- und ovarialkarzinomrisiko
EP2394175B1 (de) * 2009-02-09 2016-02-03 caprotec bioanalytics GmbH Vorrichtungen, systeme und verfahren zur trennung magnetischer partikel
ES2805347T3 (es) 2009-02-11 2021-02-11 Caris Mpi Inc Perfilado molecular de tumores
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
WO2010104798A1 (en) 2009-03-08 2010-09-16 Ibis Biosciences, Inc. Bioagent detection methods
CN102428191A (zh) * 2009-03-18 2012-04-25 塞昆纳姆股份有限公司 热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用
US9393564B2 (en) 2009-03-30 2016-07-19 Ibis Biosciences, Inc. Bioagent detection systems, devices, and methods
EP3211095B1 (de) 2009-04-03 2019-01-02 Sequenom, Inc. Zusammensetzungen und verfahren für die herstellung von nukleinsäuren
US9490113B2 (en) * 2009-04-07 2016-11-08 The George Washington University Tailored nanopost arrays (NAPA) for laser desorption ionization in mass spectrometry
WO2010123626A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 University Of Southern California Cd133 polymorphisms and expression predict clinical outcome in patients with cancer
WO2010124257A2 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Colby Pharmaceutical Company Methods and kits for determining oxygen free radical (ofr) levels in animal and human tissues as a prognostic marker for cancer and other pathophysiologies
CA2766210A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Yale University Single nucleotide polymorphisms in brca1 and cancer risk
EP2454000A4 (de) 2009-07-17 2016-08-10 Ibis Biosciences Inc Systeme zur identifizierung von biowirkstoffen
US8950604B2 (en) * 2009-07-17 2015-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
WO2011014811A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
DE102009035587B3 (de) * 2009-07-31 2011-03-24 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zur Filterung eines Chromatogramms
KR20120040725A (ko) 2009-07-31 2012-04-27 위니버르시티 오브 베른 Ｈｃｖ 감염 환자에서 ｃ형 간염 결과를 진단 또는 예측하기 위한 방법
WO2011017656A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Non-mass determined base compositions for nucleic acid detection
US20110065111A1 (en) * 2009-08-31 2011-03-17 Ibis Biosciences, Inc. Compositions For Use In Genotyping Of Klebsiella Pneumoniae
EP2475989A4 (de) 2009-09-09 2013-02-27 Gen Hospital Corp Verwendung von mikrovesikeln bei der analyse von kras-mutationen
EP2475988B1 (de) 2009-09-09 2018-11-14 The General Hospital Corporation Verwendung von mikrovesikeln bei der analyse von nukleinsäureprofilen
US9512481B2 (en) 2009-09-11 2016-12-06 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Polymorphisms in the PDE3A gene
WO2011041695A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-07 Ibis Biosciences, Inc. Determination of methylation status of polynucleotides
ES2628739T3 (es) * 2009-10-15 2017-08-03 Ibis Biosciences, Inc. Amplificación por desplazamiento múltiple
AU2010315400B2 (en) 2009-10-27 2016-07-21 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
US20110111512A1 (en) * 2009-11-05 2011-05-12 Cory Bystrom Quantitation of insulin-like growth factor-i and insulin-like growth factor-ii with high-resolution mass spectrometry
US20120316187A1 (en) 2009-11-13 2012-12-13 Pangaea Biotech, S.L. Molecular biomarkers for predicting response to tyrosine kinase inhibitors in lung cancer
US7977117B2 (en) 2009-12-03 2011-07-12 Quest Diagnostics Investments Incorprated Vitamin D metabolite determination utilizing mass spectrometry following derivatization
WO2011067712A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for embryo-specific expression in plants
US8034627B2 (en) 2009-12-03 2011-10-11 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting dihydroxyvitamin D metabolites by mass spectrometry
WO2011072152A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry of steroidal compounds in multiplex samples
US20110240840A1 (en) 2009-12-11 2011-10-06 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometric determination of cookson-derivatized, non-metabolized vitamin d
WO2011084757A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 University Of Southern California Germline polymorphisms in the sparc gene associated with clinical outcome in gastric cancer
WO2011084751A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Quest Diagnostics Investments Incorporated Glucagon detection and quantitation by mass spectrometry
GB0922377D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Arab Gulf University The Mutant LDL receptor
US9926593B2 (en) 2009-12-22 2018-03-27 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
CA2822747A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Arca Biopharma, Inc. Use of s-(6-nitro-oxi-hexahydro-furo[3,2-b]thioacetate in the treatment of cardiovascular disorders associated with oxide synthase dysfunction
WO2011085334A1 (en) 2010-01-11 2011-07-14 University Of Southern California Cd44 polymorphisms predict clinical outcome in patients with gastric cancer
TWI518325B (zh) 2010-02-04 2016-01-21 自治醫科大學 對ａｌｋ抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療
US8774488B2 (en) 2010-03-11 2014-07-08 Cellscape Corporation Method and device for identification of nucleated red blood cells from a maternal blood sample
WO2011115840A2 (en) * 2010-03-14 2011-09-22 Ibis Biosciences, Inc. Parasite detection via endosymbiont detection
US10837972B2 (en) 2010-06-09 2020-11-17 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometric determination of derivatized methylmalonic acid
ES2629850T3 (es) 2010-07-19 2017-08-16 Otago Innovation Limited Biomarcadores de señal
WO2012031008A2 (en) 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
WO2012051301A1 (en) 2010-10-12 2012-04-19 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying modulators of triglyceride metabolism, for modulating triglyceride metabolism and for identifying subjects at risk for abnormal triglyceride metabolism
CN103299184A (zh) * 2010-10-29 2013-09-11 Atonarp株式会社 分析装置
US20120207771A1 (en) 2010-11-05 2012-08-16 Morphotek Inc. Folate receptor alpha as a diagnostic and prognostic marker for folate receptor alpha-expressing cancers
WO2012087438A1 (en) 2010-11-08 2012-06-28 Georgetown University Methods for simultaneous quantification of thyroid hormones and metabolites thereof by mass spectrometry
WO2012064993A1 (en) 2010-11-10 2012-05-18 Exosome Diagnosties, Inc. Method for isolation of nucleic acid containing particles and extraction of nucleic acids therefrom
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
AU2011325956B2 (en) 2010-11-12 2016-07-14 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
WO2012088222A2 (en) 2010-12-21 2012-06-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for producing active vitamin k-dependent proteins
CA2823324C (en) 2010-12-28 2019-12-31 Quest Diagnostics Investments Incorporated Quantitation of insulin by mass spectrometry
US9177766B2 (en) 2010-12-30 2015-11-03 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometric quantitation assay for metabolites of leflunomide
WO2012112883A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Yale University The kras-variant and endometriosis
EP2492688A1 (de) 2011-02-23 2012-08-29 Pangaea Biotech, S.A. Molekulare Biomarker zur Vorhersage der Reaktion auf die Antitumorbehandlung bei Lungenkrebs
PE20140627A1 (es) 2011-03-02 2014-05-30 Berg Llc Ensayos interrogatorios basados en celulas y usos de los mismos
EP2689030A1 (de) 2011-03-21 2014-01-29 Yale University Kras-variante und tumorbiologie
CA2834218C (en) 2011-04-29 2021-02-16 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species using inhibitory oligonucleotides
EP2707381B1 (de) 2011-05-11 2019-08-14 Exosome Diagnostics, Inc. Nukleinsäureextraktion aus heterogenen biologischen materialien
WO2012159089A1 (en) 2011-05-19 2012-11-22 Sequenom, Inc. Products and processes for multiplex nucleic acid identification
US8728824B2 (en) 2011-06-22 2014-05-20 Quest Diagnostics Investments Inc. Mass spectrometric determination of fatty acids
US20140154209A1 (en) 2011-06-30 2014-06-05 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Polymorphisms associated with non-response to a hepatitis c treatment or susceptibility to non-spontaneous hepatitis c clearance
EP2748335B1 (de) 2011-08-22 2018-10-03 Exosome Diagnostics, Inc. Urinbiomarker
EP3564261A1 (de) 2011-08-23 2019-11-06 Foundation Medicine, Inc. Kif5b-re-fusionsmoleküle und verwendungen davon
WO2013030786A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Method for diagnosing or predicting hepatocellular carcinoma outcome
EP2753697A1 (de) 2011-09-05 2014-07-16 ETH Zürich Biosynthetischer gencluster zur herstellung von peptid- bzw. protein-analoga
WO2013045505A1 (en) 2011-09-28 2013-04-04 Novartis Ag Biomarkers for raas combination therapy
US20140271542A1 (en) 2011-10-05 2014-09-18 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Service Genetic marker for predicting prognosis in patients infected with hepatitis c virus
US10174361B2 (en) 2011-11-10 2019-01-08 Exosome Diagnostics, Inc. Cerebrospinal fluid assay
US9447458B2 (en) 2011-11-16 2016-09-20 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Detection of neighboring variants
WO2013103417A2 (en) * 2011-11-22 2013-07-11 Purdue Research Foundation Sample deposition chamber for laser-induced acoustic desorption (liad) foils
JP6444736B2 (ja) 2011-11-23 2018-12-26 クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド タンデム質量分析によるキスペプチン−５４の検出
WO2013080050A2 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Universitaetsklinikum Erlangen Methods and compositions for determining responsiveness to treatment with a tnf-alpha inhibitor
US8669519B2 (en) 2011-12-05 2014-03-11 Quest Diagnostics Investments, Inc. Methods for detecting reverse triiodothyronine by mass spectrometry
US8779355B2 (en) 2011-12-28 2014-07-15 Quest Diagnostics Investments, Inc. Methods for detecting lacosamide by mass spectrometry
CA2863121A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbott Molecular Inc. Microorganism nucleic acid purification from host samples
WO2013112216A1 (en) 2012-01-24 2013-08-01 Cd Diagnostics, Llc System for detecting infection in synovial fluid
EP3401399B1 (de) 2012-03-02 2020-04-22 Sequenom, Inc. Verfahren und prozesse zur nicht-invasiven beurteilung genetischer variationen
WO2013131068A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Berg Pharma, Llc Methods and kits for detection of coenzyme q10
EP2828282B1 (de) 2012-03-20 2017-12-27 Otago Innovation Limited Biomarker
MX2014011682A (es) 2012-03-29 2015-01-22 Novartis Ag Diagnostico farmaceutico.
US10061887B2 (en) 2012-04-02 2018-08-28 Berg Llc Interrogatory cell-based assays and uses thereof
JP6399660B2 (ja) 2012-04-10 2018-10-03 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア 癌治療用組成物および方法
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
EP2680005A1 (de) 2012-06-28 2014-01-01 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Lipidanalyse
US20140004105A1 (en) 2012-06-29 2014-01-02 Sequenom, Inc. Age-related macular degeneration diagnostics
CN104603290B (zh) 2012-06-29 2019-02-01 Htg分子诊断有限公司 用于检测核苷酸变异的核酸酶保护方法
JP2015521862A (ja) 2012-07-13 2015-08-03 セクエノム， インコーポレイテッド 非侵襲性の出生前診断に有用な母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物
EP2875131B1 (de) 2012-07-18 2018-03-14 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Verfahren zur normalisierung von biologischen proben
CA3163776A1 (en) 2012-08-03 2014-02-06 Foundation Medicine, Inc. Human papilloma virus as predictor of cancer prognosis
AU2013301606B2 (en) 2012-08-06 2018-08-02 Merck Patent Gmbh Genetic markers for predicting responsiveness to FGF-18 compound
US9638687B2 (en) 2012-08-28 2017-05-02 Bloodworks Biochemical markers of red blood cell storage and toxicity
CA2883220C (en) 2012-08-30 2022-09-20 Exosome Diagnostics, Inc. Controls for nucleic acid assays
CA2885542C (en) 2012-09-20 2023-01-24 Quest Diagnostics Investments Incorporated Thyroglobulin quantitation by mass spectroscopy
US20150252428A1 (en) 2012-10-03 2015-09-10 Exosome Diagnostics, Inc. Use of microvesicles in diagnosis, prognosis, and treatment of medical diseases and conditions
CA3120521A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2912194B1 (de) 2012-10-26 2019-05-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Androgenrezeptorvarianten und verfahren zur herstellung und verwendung
CA2890207A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Foundation Medicine, Inc. Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof
US9594074B2 (en) 2012-12-26 2017-03-14 Quest Diagnostics Investments Incorporated C peptide detection by mass spectrometry
CA2898326C (en) 2013-01-18 2022-05-17 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
US9896728B2 (en) 2013-01-29 2018-02-20 Arcticrx Ltd. Method for determining a therapeutic approach for the treatment of age-related macular degeneration (AMD)
ITUD20130021A1 (it) 2013-02-20 2014-08-21 Alifax Holding S P A Procedimento per l'identificazione di classi batteriche tramite gas cromatografia/spettrometria di massa in campioni biologici
EP3597774A1 (de) 2013-03-13 2020-01-22 Sequenom, Inc. Primer zur analyse der dna-methylierung
UY35464A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Araxes Pharma Llc Inhibidores covalentes de kras g12c.
WO2014190230A1 (en) 2013-05-23 2014-11-27 Iphenotype Llc Phenotypic integrated social search database and method
EP2805769A1 (de) 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Verfahren zur nanoskaligen Einzelzellenanalyse
US9670545B2 (en) 2013-06-11 2017-06-06 Coutagen Life Sciences, Inc. Methods and kits for treating and classifying individuals at risk of or suffering from TRAP1 change-of-function
WO2015009831A2 (en) 2013-07-17 2015-01-22 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating urothelial carcinomas
JP2016526922A (ja) 2013-08-06 2016-09-08 エクソサム ダイアグノスティクス，インコーポレイティド 尿バイオマーカーコホート、遺伝子発現特性、およびその使用の方法
TWI659021B (zh) 2013-10-10 2019-05-11 亞瑞克西斯製藥公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ之抑制劑
US11365447B2 (en) 2014-03-13 2022-06-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
BR112016026459B1 (pt) 2014-05-12 2022-09-27 Quest Diagnostics Investments Incorporated Métodos para determinar a quantidade de norendoxifeno e para determinar a quantidade de tamoxifeno e metabólitos do mesmo em uma amostra humana por espectrometria de massas
JP2017521654A (ja) 2014-06-27 2017-08-03 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ヒトペギウイルス２（ＨＰｇＶ−２）を検出するための組成物および方法
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
EP3197870B1 (de) 2014-09-25 2020-08-19 Araxes Pharma LLC Inhibitoren von g12c mutierten kras proteinen
US10011600B2 (en) 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
US10858650B2 (en) 2014-10-30 2020-12-08 The General Hospital Corporation Methods for modulating ATRX-dependent gene repression
US20180003721A1 (en) 2015-01-15 2018-01-04 Joslin Diabetes Center Metabolite Biomarkers Predictive Of Renal Disease In Diabetic Patients
WO2016128383A1 (en) 2015-02-10 2016-08-18 B.R.A.H.M.S Gmbh Free histone proteins as biomarkers
US10324082B2 (en) 2015-03-03 2019-06-18 Quest Diagnostics Investments Llc Methods for quantitation of insulin levels by mass spectrometry
US10900036B2 (en) 2015-03-17 2021-01-26 The General Hospital Corporation RNA interactome of polycomb repressive complex 1 (PRC1)
CA2981530A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
US10428064B2 (en) 2015-04-15 2019-10-01 Araxes Pharma Llc Fused-tricyclic inhibitors of KRAS and methods of use thereof
WO2016172571A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Agena Bioscience, Inc. Multiplexed method for the identification and quantitation of minor alleles and polymorphisms
EP3286328B1 (de) 2015-04-24 2020-10-21 Agena Bioscience, Inc. Multiplex verfahrens für detektion und quantifizierung leichten varianten
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
JP6703090B2 (ja) 2015-07-23 2020-06-03 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． Ｃｒｔｈ２受容体アンタゴニストに対する応答に関連した遺伝的マーカー
CA2994416A1 (en) 2015-08-04 2017-02-09 Cd Diagnostics, Inc. Methods for detecting adverse local tissue reaction (altr) necrosis
JP6630742B2 (ja) 2015-08-17 2020-01-15 クラ オンコロジー， インコーポレイテッド ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤を用いて癌患者を治療する方法
EP3356349A1 (de) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitoren von kras-g12c-mutanten proteinen
EP3356347A1 (de) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitoren von kras-g12c-mutanten proteinen
EP3356353A1 (de) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitoren von kras-g12c-mutanten proteinen
EP3356359B1 (de) 2015-09-28 2021-10-20 Araxes Pharma LLC Inhibitoren von kras-g12c-mutanten proteinen
EP3356351A1 (de) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitoren von kras-g12c-mutanten proteinen
US10689356B2 (en) 2015-09-28 2020-06-23 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
US11360098B2 (en) 2015-09-28 2022-06-14 Quest Diagnostics Investments Llc Amyloid beta detection by mass spectrometry
WO2017058805A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017070256A2 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Araxes Pharma Llc Method for screening inhibitors of ras
TW201726656A (zh) 2015-11-16 2017-08-01 亞瑞克西斯製藥公司 包含經取代雜環基團之２－經取代喹唑啉化合物及其使用方法
WO2017100546A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
WO2017125406A1 (en) 2016-01-19 2017-07-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting left ventricular remodeling in subjects suffering from hypertension
US20200200735A9 (en) 2016-02-22 2020-06-25 Ursure, Inc. System and method for detecting therapeutic agents to monitor adherence to a treatment regimen
CN109476731A (zh) 2016-02-29 2019-03-15 基础医药有限公司 治疗癌症的方法
US10822312B2 (en) 2016-03-30 2020-11-03 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
CN109563547A (zh) 2016-04-15 2019-04-02 外来体诊断公司 间变性淋巴瘤激酶(alk)核酸和alk融合转录物的基于血浆的检测及其在癌症诊断和治疗中的用途
WO2017189906A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Mira Dx, Inc. Immune-based treatment of kras-variant cancer patients
CN109642229A (zh) 2016-05-13 2019-04-16 外来体诊断公司 从生物液体分离细胞外囊泡和共分离无细胞dna的自动和手动方法
WO2018009547A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Diagnosing col6-related disorders and methods for treating same
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
WO2018045162A1 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Biogen Ma Inc. Biomarkers predictive of primary progressive multiple sclerosis and uses thereof
JP6983455B2 (ja) 2016-09-14 2021-12-17 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 高純度ｒｎａ組成物及びその調製のための方法
US10280172B2 (en) 2016-09-29 2019-05-07 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
WO2018068017A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Araxes Pharma Llc Heterocyclic compounds as inhibitors of ras and methods of use thereof
WO2018076018A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Exosome Diagnostics, Inc. Sequencing and analysis of exosome associated nucleic acids
AU2017366813B2 (en) 2016-11-30 2023-04-20 Exosome Diagnostics, Inc. Methods and compositions to detect mutations in plasma using exosomal RNA and cell free DNA from non-small cell lung cancer patients
EP3555303B1 (de) 2016-12-14 2022-12-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Menschliche genetische marker im zusammenhang mit dem ansprechen auf behandlungen, die gegen clostridium difficile toxin b gerichtet sind
MX2019007030A (es) 2016-12-15 2020-01-15 Univ California Composiciones y metodos para el tratamiento del cancer.
EP3562959A2 (de) 2017-01-02 2019-11-06 Exosome Diagnostics, Inc. Verfahren zur unterscheidung zwischen rna und dna in einer kombinierten zubereitung
WO2018132639A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Foster Charles Stephen Methods and kits for the diagnosis and/or prognosis of ocular cicatricial pemphigoid
US11274093B2 (en) 2017-01-26 2022-03-15 Araxes Pharma Llc Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
WO2018140599A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
EP3573967A1 (de) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Kondensierte bicyclische hetero-hetero-verbindungen und verfahren zur verwendung davon
US11136308B2 (en) 2017-01-26 2021-10-05 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline and quinazolinone compounds and methods of use thereof
US11279689B2 (en) 2017-01-26 2022-03-22 Araxes Pharma Llc 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1 yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as KRAS G12C modulators for treating cancer
CN110291037A (zh) * 2017-02-17 2019-09-27 卫理公会医院 用于确定对象中的感染水平的组合物和方法
CN110914691A (zh) 2017-03-31 2020-03-24 奎斯特诊断投资有限公司 用于定量胰岛素和c-肽的方法
WO2018218069A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Araxes Pharma Llc Quinazoline derivatives as modulators of mutant kras, hras or nras
US10736897B2 (en) 2017-05-25 2020-08-11 Araxes Pharma Llc Compounds and methods of use thereof for treatment of cancer
CN110869358A (zh) 2017-05-25 2020-03-06 亚瑞克西斯制药公司 Kras的共价抑制剂
CN111133106A (zh) 2017-07-12 2020-05-08 外来体诊断公司 用于分离和富集生物流体来源的细胞外囊泡的方法及其使用方法
CN107219110A (zh) * 2017-07-24 2017-09-29 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 适用于maldi‑tof检测的微生物培养液处理方法及快速鉴定方法
EP3662290A4 (de) * 2017-07-31 2021-03-31 Quest Diagnostics Investments LLC Nachweis von apolipoprotein e-isotyp durch massenspektrometrie
US11860141B2 (en) 2017-08-14 2024-01-02 Quest Diagnostics Investments Llc Detection and quantitation of guanidinoacetate, creatine, and creatinine by mass spectrometry
WO2019084547A1 (en) * 2017-10-27 2019-05-02 Frontier Diagnostics, Llc MASS SPECTROMETRY METHODS FOR CARCINOMA ASSESSMENTS
GB201802123D0 (en) 2018-02-09 2018-03-28 Metabolomic Diagnostics Ltd A method of processomg a biological sample
EP3691635B1 (de) 2018-05-25 2023-07-05 Arca Biopharma, Inc. Verfahren und zusammensetzungen mit bucindolol zur behandlung von vorhofflimmern
CN112292459A (zh) 2018-06-01 2021-01-29 基纳生物技术有限公司 用于核酸检测和定量的产品和方法
CN108913685B (zh) * 2018-07-27 2019-07-09 迈凯基因科技有限公司 去引物二聚体的方法
CA3107467A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Sequenom, Inc. Methods, and systems to detect transplant rejection
WO2020053380A1 (en) 2018-09-14 2020-03-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of amniotic fluid peptides for predicting postnatal renal function in congenital anomalies of the kidney and the urinary tract
EP3884045B1 (de) 2018-11-20 2023-01-11 Exosome Diagnostics, Inc. Verfahren zur internen kontrolle von mikrovesikel isolierung
WO2020104458A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and kits for detecting liver dysfunction in a subject
MX2021006234A (es) 2018-11-30 2021-09-10 Caris Mpi Inc Perfilado molecular de proxima generacion.
CA3128894A1 (en) 2019-02-19 2020-08-27 Sequenom, Inc. Compositions, methods, and systems to detect hematopoietic stem cell transplantation status
CN110129893A (zh) * 2019-03-25 2019-08-16 为康（苏州）基因科技有限公司 一种芯片的制备方法及其应用
CN112176038A (zh) * 2019-07-01 2021-01-05 申翌生物科技(杭州)有限公司 缓冲液组合物
AU2020364006A1 (en) 2019-10-10 2022-05-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) methods for analyzing ampholyte lot variation
IL293489A (en) 2019-12-02 2022-08-01 Caris Mpi Inc predictor of pan-cancer platinum response
CN115552034A (zh) 2020-01-31 2022-12-30 瑞泽恩制药公司 液相色谱法和质谱法用于表征寡核苷酸的用途
JP2023516299A (ja) 2020-02-28 2023-04-19 ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス 父子判定のための組成物、方法、およびシステム
EP4133285A1 (de) 2020-04-09 2023-02-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Verfahren und zusammensetzungen zur bestimmung der qualität von einheiten roter blutkörperchen
JP2020150946A (ja) * 2020-04-13 2020-09-24 国立大学法人大阪大学 マイクロｒｎａにおけるメチル化修飾部位を計測する方法
EP4343004A2 (de) 2020-10-19 2024-03-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Keimbahnbiomarker einer klinischen reaktion und nutzen für eine immuncheckpoint-inhibitortherapie
EP4237421A1 (de) 2020-11-02 2023-09-06 Trethera Corporation Kristalline formen eines desoxycytidinkinasehemmers und verwendungen davon
EP4086621A1 (de) 2021-03-17 2022-11-09 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Reinigungsverfahren und gereinigtes produkt
WO2023158732A1 (en) 2022-02-16 2023-08-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for decreasing pathologic alpha-synuclein using agents that modulate fndc5 or biologically active fragments thereof
US20230357446A1 (en) 2022-04-11 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing

Family Cites Families (369)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US40130A (en) * 1863-09-29 Improvement in grain-driers
US7048A (en) * 1850-01-29 Brick-press
US96258A (en) * 1869-10-26 Improvement in carpenters planes
US8615A (en) * 1851-12-23 sloan
US3465A (en) * 1844-03-09 Improvement in wheel-plows
US119021A (en) * 1871-09-19 Improvement in boot and shoe-heels
US111494A (en) * 1871-01-31 Improvement in chairs
US16451A (en) * 1857-01-20 Beelector for vaults
US42112A (en) * 1864-03-29 Improvement in grain-drills
US33091A (en) * 1861-08-20 Combined pehholdeb and lettek-balaktce
US5478A (en) * 1848-03-21 Cooking-stove
US9394A (en) * 1852-11-09 Brick-machnsfe
US54410A (en) * 1866-05-01 Improvement in carriages
US96426A (en) * 1869-11-02 Improved tool-post
US3568735A (en) 1968-06-26 1971-03-09 Cooke Eng Co Laboratory microtitration dispensing apparatus
US3553452A (en) 1969-02-17 1971-01-05 Us Air Force Time-of-flight mass spectrometer operative at elevated ion source pressures
CH543306A (de) 1971-10-13 1973-10-31 Hoffmann La Roche Mikropipettiergerät
US3776700A (en) 1971-12-08 1973-12-04 Linbro Chem Co Inc Serial dilution apparatus
US5283342A (en) 1992-06-09 1994-02-01 Neorx Corporation Biotinylated small molecules
US3931516A (en) 1974-08-30 1976-01-06 Nasa Moving particle composition analyzer
CH583460A5 (de) 1974-09-30 1976-12-31 Balzers Patent Beteilig Ag
DE2548891C3 (de) 1975-10-31 1983-04-28 Finnigan MAT GmbH, 2800 Bremen Probenwechsler für Massenspektrometer
US3999689A (en) 1976-01-07 1976-12-28 Ciantro Steven V Device for simultaneously delivering equal amounts of liquid
DE2739829C2 (de) * 1977-09-03 1986-04-10 Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH, 8000 München Anordnung zur Analyse einer Probenschicht durch Beschuß mit elektromagnetischer Strahlung
US4139346A (en) 1977-11-28 1979-02-13 Enzo Bio Chem Incorporated Nucleic acid and protein binding paper
US4218539A (en) 1978-03-24 1980-08-19 Weltman Joel K Enzyme conjugates and method of preparation and use
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US4418576A (en) 1981-07-02 1983-12-06 Rca Corporation Apparatus and method for automatically replenishing liquid and measuring the rate of evaporation of a liquid
US4442354A (en) * 1982-01-22 1984-04-10 Atom Sciences, Inc. Sputter initiated resonance ionization spectrometry
US4461328A (en) 1982-06-04 1984-07-24 Drummond Scientific Company Pipette device
DE3221681A1 (de) 1982-06-08 1983-12-08 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Massenspektrometer mit externer probenhalterung
US5198540A (en) 1982-10-28 1993-03-30 Hubert Koster Process for the preparation of oligonucleotides in solution
JPS59131909A (ja) 1983-01-19 1984-07-28 Nec Corp 光記録ヘツド
DE3301833A1 (de) 1983-01-20 1984-07-26 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig Verfahren zur simultanen synthese mehrerer oligonocleotide an fester phase
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
US5059654A (en) 1983-02-14 1991-10-22 Cuno Inc. Affinity matrices of modified polysaccharide supports
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4515781A (en) 1983-02-23 1985-05-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services 2',5'-Riboadenylate-morpholinoadenylate nucleotides
DE3329892A1 (de) * 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
USRE34069E (en) 1983-08-18 1992-09-15 Biosyntech Gmbh Process for the preparation of oligonucleotides
US4554839A (en) 1983-10-14 1985-11-26 Cetus Corporation Multiple trough vessel for automated liquid handling apparatus
US4983521A (en) 1983-10-26 1991-01-08 The Regents Of The University Of California Transmembrane integrator sequences
JPS60119067A (ja) 1983-11-30 1985-06-26 Shimadzu Corp 飛行時間型質量分析装置
US4733073A (en) 1983-12-23 1988-03-22 Sri International Method and apparatus for surface diagnostics
US4582789A (en) 1984-03-21 1986-04-15 Cetus Corporation Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives
US4729947A (en) 1984-03-29 1988-03-08 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska DNA sequencing
US4957858A (en) 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
US4683194A (en) 1984-05-29 1987-07-28 Cetus Corporation Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences
US4849077A (en) 1984-08-06 1989-07-18 Akademie Der Wissenschaften Der Ddr Process for solid phase-sequencing of nucleic acid fragments
US4952518A (en) 1984-10-01 1990-08-28 Cetus Corporation Automated assay machine and assay tray
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5118605A (en) * 1984-10-16 1992-06-02 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US4775619A (en) 1984-10-16 1988-10-04 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US4604363A (en) 1984-10-18 1986-08-05 Analytical Bio-Chemistry Laboratories Inc. Automatic evaporator system
GB2168478A (en) 1984-11-26 1986-06-18 Scan Limited M Analysis of protein etc using mass spectrometry
US5064754A (en) * 1984-12-14 1991-11-12 Mills Randell L Genomic sequencing method
US5221518A (en) 1984-12-14 1993-06-22 Mills Randell L DNA sequencing apparatus
US4808520A (en) 1985-03-15 1989-02-28 Molecular Diagnostics, Inc. Labelling of oligonucleotides
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4797355A (en) 1985-06-13 1989-01-10 Amgen Inc. Methods for attaching polynucleotides to supports
GB2177507B (en) 1985-06-13 1989-02-15 Mitsubishi Electric Corp Laser mass spectroscopic analyzer
US4948442A (en) 1985-06-18 1990-08-14 Polyfiltronics, Inc. Method of making a multiwell test plate
US5047215A (en) 1985-06-18 1991-09-10 Polyfiltronics, Inc. Multiwell test plate
US4663944A (en) 1985-07-12 1987-05-12 Cornell Research Foundation, Inc. Cryogenic sample stage for an ion microscope
GB8518144D0 (en) 1985-07-18 1985-08-21 Univ Belfast Solid phase peptide synthesis
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US5023187A (en) 1985-09-13 1991-06-11 Fisher Scientific Company Method and device for accelerated treatment of thin sample on surface
US4731335A (en) 1985-09-13 1988-03-15 Fisher Scientific Company Method for treating thin samples on a surface employing capillary flow
US4806546A (en) 1985-09-30 1989-02-21 Miles Inc. Immobilization of nucleic acids on derivatized nylon supports
US4935357A (en) 1986-02-05 1990-06-19 New England Biolabs, Inc. Universal restriction endonuclease
US4855225A (en) 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
US4826360A (en) 1986-03-10 1989-05-02 Shimizu Construction Co., Ltd. Transfer system in a clean room
US5604099A (en) 1986-03-13 1997-02-18 Hoffmann-La Roche Inc. Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US5108703A (en) 1986-03-26 1992-04-28 Beckman Instruments, Inc. Automated multi-purpose analytical chemistry processing center and laboratory work station
FR2597260B1 (fr) 1986-04-10 1988-07-15 Univ Pasteur Procede d'introduction directe automatique d'echantillons dans un spectrometre de masse, et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5000921A (en) 1986-10-24 1991-03-19 Hanaway Richard W Multiple pipette samples
GB8626075D0 (en) * 1986-10-31 1986-12-03 Vg Instr Group Time-of-flight mass spectrometer
US4877745A (en) 1986-11-17 1989-10-31 Abbott Laboratories Apparatus and process for reagent fluid dispensing and printing
EP0269520A3 (de) 1986-11-21 1988-08-24 Institut Pasteur Zum Hervorrufen von AIDS geeignetes Retrovirus vom HIV-2-Typ sowie seine Antigen- und Nukleinsäurebestandteile
US5175209A (en) 1987-01-06 1992-12-29 Baylor College Of Medicine Porous wafer for segmented synthesis of biopolymers
US4779467A (en) 1987-01-28 1988-10-25 Rainin Instrument Co., Inc. Liquid-end assembly for multichannel air-displacement pipette
US4988879A (en) * 1987-02-24 1991-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior College Apparatus and method for laser desorption of molecules for quantitation
US4844298A (en) 1987-03-11 1989-07-04 Sumitomo Electric Industries, Ltd. Apparatus for automatically dispensing accurately a predetermined quantity of liquids required to be stored at constant temperatures
US4794150A (en) 1987-03-11 1988-12-27 Samuel Steel Synthesis of peptide analogs
US5037882A (en) 1987-03-11 1991-08-06 Steel Samuel L Synthesis of oligonucleotide analogs
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5149625A (en) * 1987-08-11 1992-09-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex analysis of DNA
JPS6433070U (de) 1987-08-22 1989-03-01
US4962037A (en) 1987-10-07 1990-10-09 United States Of America Method for rapid base sequencing in DNA and RNA
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US4902481A (en) 1987-12-11 1990-02-20 Millipore Corporation Multi-well filtration test apparatus
DE68908054T2 (de) 1988-01-21 1994-03-10 Genentech Inc Verstärkung und nachweis von nukleinsäuresequenzen.
US5670381A (en) 1988-01-29 1997-09-23 Abbott Laboratories Devices for performing ion-capture binding assays
DE3809504C1 (de) * 1988-03-22 1989-09-21 Bruker - Franzen Analytik Gmbh, 2800 Bremen, De
SE8801070D0 (sv) * 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US5002867A (en) 1988-04-25 1991-03-26 Macevicz Stephen C Nucleic acid sequence determination by multiple mixed oligonucleotide probes
US5266684A (en) 1988-05-02 1993-11-30 The Reagents Of The University Of California Peptide mixtures
JP3042626B2 (ja) 1988-05-24 2000-05-15 ゲゼルシャフト フュア バイオテクノロギッシェ フォーシュング エムベーハー（ゲーベーエフ） オリゴヌクレオチドバンクを用いるｄｎａ塩基配列の決定法
ATE241014T2 (de) 1988-06-14 2003-06-15 Qiagen Gmbh Hiv-2 varianten
US5174962A (en) 1988-06-20 1992-12-29 Genomyx, Inc. Apparatus for determining DNA sequences by mass spectrometry
US5003059A (en) * 1988-06-20 1991-03-26 Genomyx, Inc. Determining DNA sequences by mass spectrometry
GB8816982D0 (en) 1988-07-16 1988-08-17 Probus Biomedical Ltd Bio-fluid assay apparatus
US4925629A (en) 1988-07-28 1990-05-15 Bioquant, Inc. Diagnostic device
US5185243A (en) 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
FR2636739B1 (fr) * 1988-09-20 1993-02-12 Commissariat Energie Atomique Procede et installation d'identification des bases d'un adn
GB8822228D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
SE464595B (sv) 1988-09-29 1991-05-13 Ffv Aerotech Ab Saett att med ett peltier-element med tvaa ytor bestaemma den ena eller baada ytornas temperatur
DE3930312A1 (de) 1988-10-24 1990-04-26 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur direkten sequenzierung von nukleinsaeureketten
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5489507A (en) * 1988-11-30 1996-02-06 Perkin-Elmer Corporation DNA detection by color complementation
US5082935A (en) 1988-12-15 1992-01-21 Amoco Corporation Diagnostic reagents made by attaching cytidine containing nucleic acid probes to amino functionalized solid supports by bisulfite mediated transamination
US5237016A (en) * 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
US5077210A (en) 1989-01-13 1991-12-31 Eigler Frances S Immobilization of active agents on substrates with a silane and heterobifunctional crosslinking agent
US4920264A (en) * 1989-01-17 1990-04-24 Sri International Method for preparing samples for mass analysis by desorption from a frozen solution
KR970002043B1 (ko) 1989-02-01 1997-02-21 아사히 가라스 가부시끼가이샤 히드로클로로플루오로카본 공비 또는 공비형 혼합물
US5856092A (en) 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
JP2901004B2 (ja) 1989-04-12 1999-06-02 株式会社日立製作所 Ｄｎａの塩基配列決定法
ES2099699T3 (es) 1989-05-02 1997-06-01 Abbott Lab Fijacion covalente de los miembros de union especificos a las fases solidas.
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
EP0434792A4 (en) * 1989-05-19 1992-05-20 John B. Fenn Multiply charged ions and a method for determining the molecular weight of large molecules
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5242974A (en) 1991-11-22 1993-09-07 Affymax Technologies N.V. Polymer reversal on solid surfaces
GB2233654A (en) 1989-07-07 1991-01-16 Nat Res Dev Immobilised polynucleotides
DK0408295T3 (da) 1989-07-11 1996-09-16 Gen Probe Inc Fremgangsmåder til opformering af nukleinsyresekvenser
FR2650840B1 (fr) * 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
US5118937A (en) * 1989-08-22 1992-06-02 Finnigan Mat Gmbh Process and device for the laser desorption of an analyte molecular ions, especially of biomolecules
US5045694A (en) * 1989-09-27 1991-09-03 The Rockefeller University Instrument and method for the laser desorption of ions in mass spectrometry
US5262128A (en) 1989-10-23 1993-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Array-type multiple cell injector
US5410068A (en) 1989-10-23 1995-04-25 Perseptive Biosystems, Inc. Succinimidyl trityl compounds and a process for preparing same
WO1991011533A1 (en) 1990-01-26 1991-08-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for isolating primer extension products from template-directed dna polymerase reactions
IL97222A (en) * 1990-02-16 1995-08-31 Orion Yhtymae Oy Method and Responder for Determining Special Changes to Nucleotide
WO1991015600A1 (en) * 1990-03-30 1991-10-17 City Of Hope Detection of minimal residual disease in lymphoid malignancies
US5288644A (en) * 1990-04-04 1994-02-22 The Rockefeller University Instrument and method for the sequencing of genome
CA2036946C (en) 1990-04-06 2001-10-16 Kenneth V. Deugau Indexing linkers
DE69115690T2 (de) 1990-04-11 1996-05-30 Ludwig Inst Cancer Res Verfahren und gerät zum folgerichtigen chemischen reaktionsablauf
US5583042A (en) 1990-04-16 1996-12-10 Neose Pharmaceuticals, Inc. Apparatus for the synthesis of saccharide compositions
US5195657A (en) 1990-04-30 1993-03-23 Source Scientific Systems Manifold liquid handling device with backsip function
HU218095B (hu) 1990-05-01 2000-05-28 Amgen Inc. Eljárás átvitt szennyeződések csökkentésére, amplifikációs eljárásokban
US5135870A (en) * 1990-06-01 1992-08-04 Arizona Board Of Regents Laser ablation/ionizaton and mass spectrometric analysis of massive polymers
DE4019005C2 (de) * 1990-06-13 2000-03-09 Finnigan Mat Gmbh Vorrichtungen zur Analyse von Ionen hoher Masse
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
TW221493B (de) 1990-07-10 1994-03-01 Cardiovascular Diagnostics Inc
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
DE4024545A1 (de) 1990-08-02 1992-02-06 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und vorrichtung zum dosierten zufuehren einer biochemischen analysefluessigkeit auf ein target
SE9002579D0 (sv) 1990-08-07 1990-08-07 Pharmacia Ab Method and apparatus for carrying out biochemical reactions
US5648462A (en) 1990-10-09 1997-07-15 Setsuko Funakoshi Peptide purification method using novel linker and solid-phase ligand
GB2250858B (en) 1990-10-22 1994-11-30 Kratos Analytical Ltd Charged particle extraction arrangement
US5846710A (en) * 1990-11-02 1998-12-08 St. Louis University Method for the detection of genetic diseases and gene sequence variations by single nucleotide primer extension
DE4036115C2 (de) 1990-11-13 1997-12-11 Max Planck Gesellschaft Verfahren und Einrichtung zur quantitativen nichtresonanten Photoionisation von Neutralteilchen und Verwendung einer solchen Einrichtung
US5234824A (en) 1990-11-13 1993-08-10 Specialty Laboratories, Inc. Rapid purification of DNA
EP0557456A4 (en) * 1990-11-14 1995-11-15 Siska Diagnostics Inc Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor
US5492821A (en) 1990-11-14 1996-02-20 Cargill, Inc. Stabilized polyacrylic saccharide protein conjugates
EP0566670A4 (en) * 1990-12-17 1993-12-08 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
US5210412A (en) * 1991-01-31 1993-05-11 Wayne State University Method for analyzing an organic sample
WO1992013629A1 (en) * 1991-01-31 1992-08-20 Wayne State University A method for analyzing an organic sample
US5888819A (en) * 1991-03-05 1999-03-30 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through primer extension
US6004744A (en) * 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US5300774A (en) 1991-04-25 1994-04-05 Applied Biosystems, Inc. Time-of-flight mass spectrometer with an aperture enabling tradeoff of transmission efficiency and resolution
US5175430A (en) 1991-05-17 1992-12-29 Meridian Instruments, Inc. Time-compressed chromatography in mass spectrometry
US5198531A (en) 1991-06-14 1993-03-30 Research Diagnostic Antibodies Polymeric resin for peptide synthesis
US5853989A (en) 1991-08-27 1998-12-29 Zeneca Limited Method of characterisation of genomic DNA
US5994069A (en) 1996-01-24 1999-11-30 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages
US5846717A (en) 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
US5492817A (en) 1993-11-09 1996-02-20 Promega Corporation Coupled transcription and translation in eukaryotic cell-free extract
EP0610396B1 (de) 1991-10-23 2001-01-17 Baylor College Of Medicine Fingerabdruckartige identifikation von bakterienstämmen mittels amplifikation repetitiver dna-sequenzen
GB2260811B (en) 1991-10-23 1995-07-05 Yorkshire Cancer Research Camp Detection of malignant tumours
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
IL103674A0 (en) 1991-11-19 1993-04-04 Houston Advanced Res Center Method and apparatus for molecule detection
US5677195A (en) 1991-11-22 1997-10-14 Affymax Technologies N.V. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US5171989A (en) 1992-01-24 1992-12-15 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Method and apparatus for continuous sample ice matrix production for laser desorption in mass spectrometry
DE4202123C2 (de) * 1992-01-27 1995-04-06 Bruker Franzen Analytik Gmbh Vorrichtung für die massenspektrometrische Untersuchung schneller organischer Ionen
US5312233A (en) 1992-02-25 1994-05-17 Ivek Corporation Linear liquid dispensing pump for dispensing liquid in nanoliter volumes
US5382793A (en) * 1992-03-06 1995-01-17 Hewlett-Packard Company Laser desorption ionization mass monitor (LDIM)
CH686955A5 (de) 1992-03-16 1996-08-15 Der Loepfe Ag Geb Fadenbremseinrichtung.
GB9207381D0 (en) 1992-04-03 1992-05-13 Ici Plc Synthesis of oligonucleotides
EP0636186B1 (de) * 1992-04-03 1998-11-25 The Perkin-Elmer Corporation Proben zusammensetzung und verfahren
US5325021A (en) 1992-04-09 1994-06-28 Clemson University Radio-frequency powered glow discharge device and method with high voltage interface
US5412083A (en) 1992-04-16 1995-05-02 Northeastern University Carbohydrate heterobifunctional cross-linking reagent
US5616700A (en) 1992-04-24 1997-04-01 Beckman Instruments, Inc. Processes for synthesizing nucleotides and modified nucleotides using N.sub.
JPH05308999A (ja) 1992-05-08 1993-11-22 Sumitomo Metal Ind Ltd Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ−Ｃ変異の判定法
GB9210177D0 (en) 1992-05-12 1992-06-24 Cemu Bioteknik Ab Loop structures
US5629154A (en) 1993-11-12 1997-05-13 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5247175A (en) 1992-05-27 1993-09-21 Finnigan Corporation Method and apparatus for the deconvolution of unresolved data
US5440119A (en) 1992-06-02 1995-08-08 Labowsky; Michael J. Method for eliminating noise and artifact peaks in the deconvolution of multiply charged mass spectra
WO1994000562A1 (en) 1992-06-24 1994-01-06 The Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York A novel human immunodeficiency virus
US5710028A (en) 1992-07-02 1998-01-20 Eyal; Nurit Method of quick screening and identification of specific DNA sequences by single nucleotide primer extension and kits therefor
US5650277A (en) 1992-07-02 1997-07-22 Diagenetics Ltd. Method of determining the presence and quantifying the number of di- and trinucleotide repeats
US5757392A (en) 1992-09-11 1998-05-26 Brother Kogyo Kabushiki Kaisha Piezoelectric type liquid droplet ejecting device which compensates for residual pressure fluctuations
US5795714A (en) * 1992-11-06 1998-08-18 Trustees Of Boston University Method for replicating an array of nucleic acid probes
US6436635B1 (en) * 1992-11-06 2002-08-20 Boston University Solid phase sequencing of double-stranded nucleic acids
US5503980A (en) * 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
EP0599397B1 (de) 1992-11-17 1996-08-28 The Research Foundation Of State University Of New York Tetracycline inclusive nicht antimicrobiel wirksame, chemisch modifizierte Tetracycline hemmende exzessive Kollagenquervernetzung bei Diabetes
US5541311A (en) 1992-12-07 1996-07-30 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
US5719028A (en) 1992-12-07 1998-02-17 Third Wave Technologies Inc. Cleavase fragment length polymorphism
US5843654A (en) 1992-12-07 1998-12-01 Third Wave Technologies, Inc. Rapid detection of mutations in the p53 gene
US5888780A (en) 1992-12-07 1999-03-30 Third Wave Technologies, Inc. Rapid detection and identification of nucleic acid variants
US5614402A (en) 1992-12-07 1997-03-25 Third Wave Technologies, Inc. 5' nucleases derived from thermostable DNA polymerase
US5422253A (en) 1992-12-07 1995-06-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of site specific nucleic acid cleavage
US5436143A (en) 1992-12-23 1995-07-25 Hyman; Edward D. Method for enzymatic synthesis of oligonucleotides
EP1262564A3 (de) 1993-01-07 2004-03-31 Sequenom, Inc. Dns-Sequenzierung durch Massenspektrometrie
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US6194144B1 (en) 1993-01-07 2001-02-27 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
US5571669A (en) 1993-01-14 1996-11-05 The University Of Pennsylvania Transcription and nucleic acid sequence determination with short primer DNA/RNA molecules and RNA polymerase
US5482836A (en) 1993-01-14 1996-01-09 The Regents Of The University Of California DNA purification by triplex-affinity capture and affinity capture electrophoresis
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
EP0612994A3 (de) 1993-02-26 1996-03-06 Ciba Geigy Ag Matrix für die matrix-unterstützte Laserdesorptions-Massenspektroskopie.
GB9304462D0 (en) 1993-03-04 1993-04-21 Kore Tech Ltd Mass spectrometer
AU687801B2 (en) 1993-03-19 1998-03-05 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
US6074823A (en) 1993-03-19 2000-06-13 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
FR2703052B1 (fr) 1993-03-26 1995-06-02 Pasteur Institut Nouvelle méthode de séquençage d'acides nucléiques.
JP3201867B2 (ja) * 1993-04-12 2001-08-27 株式会社日立製作所 核酸分析方法
US5381008A (en) * 1993-05-11 1995-01-10 Mds Health Group Ltd. Method of plasma mass analysis with reduced space charge effects
US5376788A (en) * 1993-05-26 1994-12-27 University Of Manitoba Apparatus and method for matrix-assisted laser desorption mass spectrometry
PT700521E (pt) 1993-05-28 2003-10-31 Baylor College Medicine Metodo e espectrometro de massa para dessorcao e ionizacao de analitos
US5399857A (en) 1993-05-28 1995-03-21 The Johns Hopkins University Method and apparatus for trapping ions by increasing trapping voltage during ion introduction
US5363885A (en) 1993-06-02 1994-11-15 R. J. Reynolds Tobacco Company Robotic sample preparation system and method
PT1156059E (pt) 1993-06-21 2007-10-19 Aventis Pharma Inc Ligantes cliváveis selectivamente com base num grupo de metionina e um grupo éster
US5650274A (en) 1993-06-25 1997-07-22 Hitachi, Ltd. DNA analyzing method
US5576419A (en) 1993-06-30 1996-11-19 Regents Of The University Of Minnesota Mild solid-phase synthesis of aligned branched triple-helical peptides
AU673765B2 (en) 1993-07-09 1996-11-21 Microscan, Inc. Fluid dispensing apparatus and method
US5571902A (en) 1993-07-29 1996-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
GB9315847D0 (en) * 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
RU2041263C1 (ru) 1993-08-11 1995-08-09 Геннадий Моисеевич Ершов Способ микродозирования водных растворов веществ на носитель и устройство для его осуществления
US5527675A (en) 1993-08-20 1996-06-18 Millipore Corporation Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
US6007987A (en) 1993-08-23 1999-12-28 The Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
WO1995006752A1 (en) 1993-09-03 1995-03-09 Duke University A method of nucleic acid sequencing
FR2709761B1 (fr) * 1993-09-10 1995-11-24 Pasteur Institut Procédé de détection de molécules contenant des mésappariements nucléotidiques et de localisation de ces mésappariements, et application à la détection de substitutions ou de délétions de bases .
US5439649A (en) 1993-09-29 1995-08-08 Biogenex Laboratories Automated staining apparatus
WO1995009688A1 (en) 1993-10-04 1995-04-13 Hewlett-Packard Company Sample preparation system and method
US5849542A (en) 1993-11-17 1998-12-15 Amersham Pharmacia Biotech Uk Limited Primer extension mass spectroscopy nucleic acid sequencing method
WO1995015400A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 The Johns Hopkins University Genotyping by simultaneous analysis of multiple microsatellite loci
US5622829A (en) 1993-12-08 1997-04-22 The Regents Of The University Of California Genetic markers for breast, ovarian, and prostatic cancer
DE4343126A1 (de) 1993-12-17 1995-06-22 Hoechst Ag Festphasensynthese von Oligoribonucleotiden
US5616698A (en) 1994-01-10 1997-04-01 University Of Toronto Innovations Foundation Polymer-supported solution synthesis of oligosaccharides
US5501969A (en) 1994-03-08 1996-03-26 Human Genome Sciences, Inc. Human osteoclast-derived cathepsin
US5538897A (en) 1994-03-14 1996-07-23 University Of Washington Use of mass spectrometry fragmentation patterns of peptides to identify amino acid sequences in databases
JP3385707B2 (ja) 1994-03-17 2003-03-10 株式会社日立製作所 質量分析装置
US5457041A (en) 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
US5976798A (en) 1994-03-30 1999-11-02 Mitokor Methods for detecting mitochondrial mutations diagnostic for Alzheimer's disease and methods for determining heteroplasmy of mitochondrial nucleic acid
AU2360195A (en) 1994-05-05 1995-11-29 Beckman Instruments, Inc. Oligonucleotide repeat arrays
US5986076A (en) 1994-05-11 1999-11-16 Trustees Of Boston University Photocleavable agents and conjugates for the detection and isolation of biomolecules
US5643722A (en) 1994-05-11 1997-07-01 Trustees Of Boston University Methods for the detection and isolation of proteins
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5679773A (en) 1995-01-17 1997-10-21 Affymax Technologies N.V Reagants and methods for immobilized polymer synthesis and display
US5622821A (en) 1994-06-29 1997-04-22 The Regents Of The University Of California Luminescent lanthanide chelates and methods of use
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
US5853979A (en) 1995-06-30 1998-12-29 Visible Genetics Inc. Method and system for DNA sequence determination and mutation detection with reference to a standard
US5498545A (en) 1994-07-21 1996-03-12 Vestal; Marvin L. Mass spectrometer system and method for matrix-assisted laser desorption measurements
US5608889A (en) 1994-08-17 1997-03-04 Ceridian Corporation DNA controller with wrap-around buffer mode
GB9417211D0 (en) * 1994-08-25 1994-10-12 Solicitor For The Affairs Of H Nucleotide sequencing method
DE4431174A1 (de) 1994-09-01 1996-03-07 Deutsches Krebsforsch Nachweisverfahren für tumorspezifische mRNA
CA2118048C (en) 1994-09-30 2003-04-08 James W. Schumm Multiplex amplification of short tandem repeat loci
US6121048A (en) 1994-10-18 2000-09-19 Zaffaroni; Alejandro C. Method of conducting a plurality of reactions
US5985356A (en) 1994-10-18 1999-11-16 The Regents Of The University Of California Combinatorial synthesis of novel materials
US5545539A (en) 1994-10-18 1996-08-13 Genzyme Corporation Method for nucleotide sequence amplification
US5453613A (en) 1994-10-21 1995-09-26 Hewlett Packard Company Mass spectra interpretation system including spectra extraction
US5504326A (en) * 1994-10-24 1996-04-02 Indiana University Foundation Spatial-velocity correlation focusing in time-of-flight mass spectrometry
DE4438630A1 (de) 1994-10-28 1996-05-02 Katharina Dr Pachmann Selfpriming - ein einfaches und schnelles Verfahren zur Amplifikation von nicht charakterisierten DNA-Abschnitten
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
GB9422814D0 (en) 1994-11-11 1995-01-04 Medinnova Sf Chemical method
GB9423912D0 (en) 1994-11-26 1995-01-11 Imp Cancer Res Tech Detecting tumours
US5688642A (en) 1994-12-01 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Selective attachment of nucleic acid molecules to patterned self-assembled surfaces
US5601982A (en) 1995-02-07 1997-02-11 Sargent; Jeannine P. Method and apparatus for determining the sequence of polynucleotides
US5609907A (en) 1995-02-09 1997-03-11 The Penn State Research Foundation Self-assembled metal colloid monolayers
JP3592780B2 (ja) 1995-02-22 2004-11-24 富士写真フイルム株式会社 液体噴射装置
GB9504598D0 (en) 1995-03-03 1995-04-26 Imp Cancer Res Tech Method of nucleic acid analysis
US6140045A (en) 1995-03-10 2000-10-31 Meso Scale Technologies Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US6428955B1 (en) 1995-03-17 2002-08-06 Sequenom, Inc. DNA diagnostics based on mass spectrometry
AU5296496A (en) * 1995-03-24 1996-10-16 Mitokor Mutation detection by differential primer extension of mutant and wildtype target sequences
WO1996032504A2 (en) * 1995-04-11 1996-10-17 Trustees Of Boston University Solid phase sequencing of biopolymers
US5624711A (en) * 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US5770272A (en) 1995-04-28 1998-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Matrix-bearing targets for maldi mass spectrometry and methods of production thereof
US5827659A (en) 1995-05-19 1998-10-27 Perseptive Biosystems, Inc. Methods and apparatus for sequencing polymers using mass spectrometry
WO1996036986A1 (en) * 1995-05-19 1996-11-21 Perseptive Biosystems, Inc. Methods and apparatus for sequencing polymers with a statistical certainty using mass spectrometry
US5625184A (en) * 1995-05-19 1997-04-29 Perseptive Biosystems, Inc. Time-of-flight mass spectrometry analysis of biomolecules
US5753439A (en) * 1995-05-19 1998-05-19 Trustees Of Boston University Nucleic acid detection methods
US5869240A (en) 1995-05-19 1999-02-09 Perseptive Biosystems, Inc. Methods and apparatus for sequencing polymers with a statistical certainty using mass spectrometry
US5830655A (en) 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5700642A (en) * 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
GB9510699D0 (en) 1995-05-26 1995-07-19 Fisons Plc Apparatus and method for surface analysis
US5654150A (en) 1995-06-07 1997-08-05 President And Fellows Of Harvard College Method of expression cloning
US5589136A (en) 1995-06-20 1996-12-31 Regents Of The University Of California Silicon-based sleeve devices for chemical reactions
US5872010A (en) 1995-07-21 1999-02-16 Northeastern University Microscale fluid handling system
US6146854A (en) 1995-08-31 2000-11-14 Sequenom, Inc. Filtration processes, kits and devices for isolating plasmids
GB9518429D0 (en) 1995-09-08 1995-11-08 Pharmacia Biosensor A rapid method for providing kinetic and structural data in molecular interaction analysis
US5869242A (en) * 1995-09-18 1999-02-09 Myriad Genetics, Inc. Mass spectrometry to assess DNA sequence polymorphisms
US5654545A (en) * 1995-09-19 1997-08-05 Bruker-Franzen Analytik Gmbh Mass resolution in time-of-flight mass spectrometers with reflectors
AU7016896A (en) * 1995-10-30 1997-05-22 Trustees Of Boston University Piezoelectric force sensing apparatus and methods for biopolymer sequencing
US5716825A (en) 1995-11-01 1998-02-10 Hewlett Packard Company Integrated nucleic acid analysis system for MALDI-TOF MS
JP2001507563A (ja) 1995-11-23 2001-06-12 キャンサー リサーチ キャンペーン テクノロジー リミテッド Ｂｒｃａ２癌感受性遺伝子の同定及び配列決定に関する材料及び方法並びにそれらの使用
US5641959A (en) * 1995-12-21 1997-06-24 Bruker-Franzen Analytik Gmbh Method for improved mass resolution with a TOF-LD source
US5742049A (en) * 1995-12-21 1998-04-21 Bruker-Franzen Analytik Gmbh Method of improving mass resolution in time-of-flight mass spectrometry
US5807767A (en) 1996-01-02 1998-09-15 Micron Technology, Inc. Technique for attaching die to leads
US6027890A (en) 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
US5985557A (en) 1996-01-24 1999-11-16 Third Wave Technologies, Inc. Invasive cleavage of nucleic acids
US5736626A (en) 1996-01-29 1998-04-07 The Perkin-Elmer Corporation Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides
US5686656A (en) 1996-02-27 1997-11-11 Aviv Amirav Method and device for the introduction of a sample into a gas chromatograph
US5580434A (en) 1996-02-29 1996-12-03 Hewlett-Packard Company Interface apparatus for capillary electrophoresis to a matrix-assisted-laser-desorption-ionization mass spectrometer
AU2069597A (en) 1996-03-04 1997-09-22 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
WO1997033550A2 (en) 1996-03-15 1997-09-18 Start Technology Partnership Methods and compositions for diagnosis and treatment of pathological conditions related to abnormal dopamine receptor expression
AU2217597A (en) * 1996-03-18 1997-10-22 Sequenom, Inc. Dna sequencing by mass spectrometry
EP0898575B1 (de) * 1996-04-17 2004-12-29 KÖSTER, Hubert, Dr. Kombinatorische schutzgruppestrategie für multifunktionelle molekule
DE19617011C2 (de) 1996-04-27 2000-11-02 Bruker Daltonik Gmbh Matrixkomponentengemisch für die matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisierung sowie Verfahren zur Zubereitung eines Matrixkomponentengemisches
DE19618032C2 (de) 1996-05-04 2000-04-13 Bruker Daltonik Gmbh Lagerfähig vorpräparierte Maldi-Probenträger
US5777325A (en) * 1996-05-06 1998-07-07 Hewlett-Packard Company Device for time lag focusing time-of-flight mass spectrometry
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US6022688A (en) * 1996-05-13 2000-02-08 Sequenom, Inc. Method for dissociating biotin complexes
US6156512A (en) 1996-05-23 2000-12-05 Promega Corp Allelic ladders for short tandem repeat loci
US6083762A (en) 1996-05-31 2000-07-04 Packard Instruments Company Microvolume liquid handling system
FR2749662B1 (fr) 1996-06-11 1998-08-28 Elf Aquitaine Laboratoire robotise d'analyses d'echantillons
JP2001505648A (ja) 1996-07-05 2001-04-24 ベックマン コールター インコーポレイテッド 自動試料処理システム
DE19628178C1 (de) 1996-07-12 1997-09-18 Bruker Franzen Analytik Gmbh Verfahren zum Beladen von Probenträgern für Massenspektrometer
US5743960A (en) 1996-07-26 1998-04-28 Bio-Dot, Inc. Precision metered solenoid valve dispenser
US5789395A (en) 1996-08-30 1998-08-04 The Research Foundation Of State University Of New York Method of using tetracycline compounds for inhibition of endogenous nitric oxide production
US5885841A (en) 1996-09-11 1999-03-23 Eli Lilly And Company System and methods for qualitatively and quantitatively comparing complex admixtures using single ion chromatograms derived from spectroscopic analysis of such admixtures
US5965363A (en) * 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US5777324A (en) 1996-09-19 1998-07-07 Sequenom, Inc. Method and apparatus for maldi analysis
US5864137A (en) * 1996-10-01 1999-01-26 Genetrace Systems, Inc. Mass spectrometer
US5885775A (en) * 1996-10-04 1999-03-23 Perseptive Biosystems, Inc. Methods for determining sequences information in polynucleotides using mass spectrometry
US6140053A (en) 1996-11-06 2000-10-31 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
US5900481A (en) 1996-11-06 1999-05-04 Sequenom, Inc. Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports
CA2268740C (en) * 1996-11-06 2010-07-20 Sequenom, Inc. High density immobilization of nucleic acids
US7285422B1 (en) * 1997-01-23 2007-10-23 Sequenom, Inc. Systems and methods for preparing and analyzing low volume analyte array elements
DE19782097T1 (de) * 1996-11-06 1999-10-14 Sequenom Inc Zusammensetzungen und Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren an feste Träger
US6133436A (en) 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
CA2270132A1 (en) 1996-11-06 1998-05-14 Sequenom, Inc. Dna diagnostics based on mass spectrometry
US6024925A (en) * 1997-01-23 2000-02-15 Sequenom, Inc. Systems and methods for preparing low volume analyte array elements
CA2274587A1 (en) 1996-12-10 1998-06-18 Genetrace Systems Inc. Releasable nonvolatile mass-label molecules
US5854486A (en) 1996-12-27 1998-12-29 R. T. Hodgson Method and apparatus for MALDI mass spectrometry
US5812272A (en) 1997-01-30 1998-09-22 Hewlett-Packard Company Apparatus and method with tiled light source array for integrated assay sensing
FR2758884B1 (fr) 1997-01-30 1999-04-02 Bio Merieux Procede pour isoler, notamment detecter ou quantifier un analyte dans un milieu
US6994960B1 (en) 1997-05-28 2006-02-07 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Nucleic acid diagnostics based on mass spectrometry or mass separation and base specific cleavage
US5888778A (en) 1997-06-16 1999-03-30 Exact Laboratories, Inc. High-throughput screening method for identification of genetic mutations or disease-causing microorganisms using segmented primers
US5975492A (en) 1997-07-14 1999-11-02 Brenes; Arthur Bellows driver slot valve
US6006171A (en) 1997-07-28 1999-12-21 Vines; Caroline J. Dynamic maintenance management system
US6207370B1 (en) * 1997-09-02 2001-03-27 Sequenom, Inc. Diagnostics based on mass spectrometric detection of translated target polypeptides
WO1999014375A2 (en) 1997-09-19 1999-03-25 Genetrace Systems, Inc. Dna typing by mass spectrometry with polymorphic dna repeat markers
US6764822B1 (en) 1997-09-19 2004-07-20 Sequenom, Inc. DNA typing by mass spectrometry with polymorphic DNA repeat markers
US5928952A (en) 1997-11-05 1999-07-27 Zymark Corporation Scheduled system and method for processing chemical products
DE19754978C2 (de) 1997-12-11 2000-07-13 Bruker Daltonik Gmbh Probenträger für die MALDI-Massenspektrometrie nebst Verfahren zur Herstellung der Platten und zum Aufbringen der Proben
US6268131B1 (en) 1997-12-15 2001-07-31 Sequenom, Inc. Mass spectrometric methods for sequencing nucleic acids
DE19803309C1 (de) 1998-01-29 1999-10-07 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrisches Verfahren zur genauen Massenbestimmung unbekannter Ionen
US5969350A (en) 1998-03-17 1999-10-19 Comstock, Inc. Maldi/LDI time-of-flight mass spectrometer
US7094943B2 (en) * 1998-04-27 2006-08-22 Hubert Köster Solution phase biopolymer synthesis
US6132724A (en) 1998-04-29 2000-10-17 City Of Hope National Medical Center Allelic polygene diagnosis of reward deficiency syndrome and treatment
US6723564B2 (en) * 1998-05-07 2004-04-20 Sequenom, Inc. IR MALDI mass spectrometry of nucleic acids using liquid matrices
US6104028A (en) 1998-05-29 2000-08-15 Genetrace Systems Inc. Volatile matrices for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry
US6132685A (en) 1998-08-10 2000-10-17 Caliper Technologies Corporation High throughput microfluidic systems and methods
US6147344A (en) 1998-10-15 2000-11-14 Neogenesis, Inc Method for identifying compounds in a chemical mixture
US6270835B1 (en) 1999-10-07 2001-08-07 Microcoating Technologies, Inc. Formation of this film capacitors
US6225061B1 (en) 1999-03-10 2001-05-01 Sequenom, Inc. Systems and methods for performing reactions in an unsealed environment
US20020009394A1 (en) 1999-04-02 2002-01-24 Hubert Koster Automated process line
US20030207297A1 (en) 1999-10-13 2003-11-06 Hubert Koster Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
US7668658B2 (en) 1999-10-13 2010-02-23 Sequenom, Inc. Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
US6232076B1 (en) 2000-02-04 2001-05-15 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Stabilizer of dye sequencing products
ATE423221T1 (de) 2000-06-13 2009-03-15 Univ Boston Verwendung von mass-matched nukleotide in der analyse von oligonukleotidmischungen sowie in der hoch-multiplexen nukleinsäuresequenzierung
US6958214B2 (en) * 2000-07-10 2005-10-25 Sequenom, Inc. Polymorphic kinase anchor proteins and nucleic acids encoding the same
KR100649342B1 (ko) 2000-10-30 2006-11-27 시쿼넘, 인코포레이티드 기판 상으로 서브마이크로리터 볼륨들을 전달하기 위한 방법 및 장치
US7047563B1 (en) 2000-12-07 2006-05-16 Cisco Technology, Inc. Command authorization via RADIUS
US20030036057A1 (en) 2001-03-09 2003-02-20 Andreas Braun Genes and polymorphisms associated with cardiovascular disease and their use
US20020155587A1 (en) * 2001-04-20 2002-10-24 Sequenom, Inc. System and method for testing a biological sample
JP4178359B2 (ja) 2001-05-01 2008-11-12 株式会社ディーエイチシー 美白化粧料
US7858560B2 (en) * 2001-07-16 2010-12-28 Caprotec Bioanalytics Gmbh Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
US6528268B1 (en) * 2001-08-03 2003-03-04 Sequenom-Gemini Limted Reagents and methods for detection of heart failure
JP2005507078A (ja) 2001-10-26 2005-03-10 セクエノム， インコーポレイテッド 規定された体積の固体粒子の並行分配のための方法および装置

Also Published As

Publication number Publication date
JP4231056B2 (ja) 2009-02-25
JP2006271382A (ja) 2006-10-12
EP1352971A3 (de) 2004-02-18
US5605798A (en) 1997-02-25
US20030228594A1 (en) 2003-12-11
CN1202204A (zh) 1998-12-16
US6277573B1 (en) 2001-08-21
EP2017357A1 (de) 2009-01-21
US6221601B1 (en) 2001-04-24
EP1352971A2 (de) 2003-10-15
EP0815261A2 (de) 1998-01-07
US7074563B2 (en) 2006-07-11
DE69626196T2 (de) 2003-09-11
US20020150903A1 (en) 2002-10-17
US20060223105A1 (en) 2006-10-05
JP3948746B2 (ja) 2007-07-25
ES2194985T7 (es) 2011-08-01
AU722218B2 (en) 2000-07-27
US20110269643A1 (en) 2011-11-03
US6221605B1 (en) 2001-04-24
US6235478B1 (en) 2001-05-22
CA2214359C (en) 2003-12-16
DK0815261T3 (da) 2003-06-10
EP2011884A1 (de) 2009-01-07
US6602662B1 (en) 2003-08-05
JPH11508122A (ja) 1999-07-21
WO1996029431A2 (en) 1996-09-26
DE69626196D1 (de) 2003-03-20
US20090092977A1 (en) 2009-04-09
CA2214359A1 (en) 1996-09-26
EP0815261B3 (de) 2010-08-25
US6300076B1 (en) 2001-10-09
US6500621B2 (en) 2002-12-31
US20110027773A1 (en) 2011-02-03
US6197498B1 (en) 2001-03-06
EP0815261B1 (de) 2003-02-12
AU5365196A (en) 1996-10-08
US6589485B2 (en) 2003-07-08
ES2194985T3 (es) 2003-12-01
US6043031A (en) 2000-03-28
EP1352971B1 (de) 2014-09-17
ATE232558T1 (de) 2003-02-15
US20090042203A1 (en) 2009-02-12
US7419787B2 (en) 2008-09-02
PT815261E (pt) 2003-06-30
EP2071042A1 (de) 2009-06-17
WO1996029431A3 (en) 1996-12-27
US7759065B2 (en) 2010-07-20
US6258538B1 (en) 2001-07-10
US20020137046A1 (en) 2002-09-26
US6268144B1 (en) 2001-07-31

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