DE69535608T2 - Methode zur Ausführung mikrofluidischer Manipulationen zur chemischen Analyse und Synthese - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Miniaturinstrumente für die chemische Analyse, chemische Messung und Synthese und spezieller elektrisch gesteuerte Manipulationen von Fluiden in mikrotechnisch hergestellten Kanälen. Diese Manipulationen können in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der elektrisch gesteuerten Manipulation von Fluid für Kapillarelektroforese, Flüssigchromatographie, Fließinjektionsanalyse und chemische Reaktion und Synthese.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Laboranalyse ist ein schwieriges Verfahren. Die Erfassung von chemischer und biochemischer Information erfordert teure Ausrüstung, spezialisierte Laboratorien und hochqualifiziertes Personal. Aus diesem Grund werden Laboruntersuchungen nur unter bestimmten Umständen durchgeführt, wo der Erhalt von chemischer Information nützlich ist. Ein großer Anteil an Untersuchungen, sowohl in der Forschung als auch unter klinischen Umständen, wird mit groben manuellen Methoden durchgeführt, die durch hohe Laborkosten, hohen Reagenzienverbrauch, lange Umsetzungszeiten, relative Ungenauigkeit und schlechte Reproduzierbarkeit gekennzeichnet sind. Die Praxis von Techniken, wie Elektroforese, die in der Biologie und in medizinischen Laboratorien weit verbreitet angewendet werden, hat sich in dreißig Jahren nicht wesentlich geändert.
  • Vorgänge, die bei typischen Laborverfahren durchgeführt werden, umfassen Probenpräparation, chemische/biochemische Umwandlungen, Probenfraktionierung, Signalerfassung und Datenverarbeitung. Um diese Aufgaben zu bewältigen, werden Flüssigkeiten häufig mit volumetrischer Genauigkeit gemessen und verteilt, miteinander gemischt und einer oder mehreren verschiedenen physikalischen oder chemischen Umgebungen ausgesetzt, die eine Umwandlung oder Fraktionierung durchführen. Unter Forschungs-, Diagnostik- oder Entwicklungssituationen werden diese Vorgänge in einem makroskopischen Maßstab durchgeführt, wobei Fluidvolumina im Bereich von wenigen Mikrolitern bis zu mehreren Litern gleichzeitig verwendet werden. Individuelle Vorgänge werden nacheinander durchgeführt, wobei häufig unterschiedliche spezialisierte Ausrüstung und Instrumente für separate Stufen in dem Verfahren verwendet werden. Komplikationen, Schwierigkeiten und Aufwand sind häufig das Ergebnis von Vorgängen, die mehrere Laborverarbeitungsstufen umfassen.
  • Viele Arbeitskräfte haben versucht, diese Probleme durch Schaffung integrierter Laborsysteme zu lösen. Herkömmliche Robotereinheiten wurden angepaßt, um Pipettieren, Probenhandhabung, Mischen von Lösungen sowie einige Fraktionierungs- und Erfassungsvorgänge durchzuführen. Jedoch sind diese Einheiten hochkompliziert, sehr teuer und ihr Betrieb erfordert soviel Training, daß ihre Verwendung auf eine relativ geringe Anzahl von Forschungs- und Entwicklungsprogrammen gesteuert war. Erfolgreicher waren automatisierte klinische Diagnostiksysteme zum schnellen und preiswerten Durchführen einer geringen Anzahl von Anwendungen, wie klinischen chemischen Tests für die Mengen von Glucose, Elektrolyten und Gasen im Blut. Leider ist solch eine Ausrüstung aufgrund ihrer Komplexität, großen Abmessung und hohen Kosten in ihrer Anwendung auf eine geringe Anzahl diagnostischer Gegebenheiten gesteuert.
  • Der Wunsch, die Vorteile von integrierten Systemen in einem breiteren Rahmen von Laboranwendungen auszunutzen, führte zu Vorschlägen, solche Systeme zu miniaturisieren. In den 80er Jahren wurde beträchtlicher Forschungs- und Entwicklungsaufwand in eine Untersuchung des Konzepts von Biosensoren investiert mit der Hoffnung, sie könnten den Bedarf erfüllen. Solche Einrichtungen nutzen selektive chemische Systeme oder Biomoleküle, die an neue Erfassungsmethoden gekoppelt sind, wie Elektrochemie und Optiken zur Umwandlung chemischer Signale in elektrische, die von Computern und anderen Signalverarbeitungseinheiten interpretiert werden können. Leider waren Biosensoren eine wirtschaftliche Enttäuschung. Weniger als 20 kommerzialisierte Produkte waren 1993 erhältlich, was Einnahmen in den USA von weniger als $ 100 Millionen ausmachte. Die meisten Beobachter stimmen darin überein, daß dieser Fehlschlag in erster Linie eher einen technologischen Hintergrund hat, als daß er eine Fehlinterpretation des Marktpotentials wiederspiegelt. Tatsächlich würden viele Situationen, wie umfangreiches Screenen nach neuen Arzneimitteln, hochgradig parallele genetische Forschung und Erprobung, Mikrochemie zur Minimierung von kostspieligem Reagenzienverbrauch und Abfallerzeugung sowie Diagnostik am Krankenbett oder in der Arztpraxis in hohem Maße von miniaturisierten integrierten Laborsystemen profitieren.
  • In den frühen 90er Jahren begann man, die Möglichkeit der Schaffung von Miniaturversionen von herkömmlicher Technologie zu diskutieren. Andreas Manz war einer der ersten, der die Idee in der wissenschaftlichen Presse artikulierte. Indem er sie "miniaturisierte Gesamtanalysesysteme" oder "μ-TAS" nannte, sagte er voraus, daß es möglich sein würde, mikroskopische Versionen der verschiedenen Elemente, die notwendig sind, chemische oder biochemische Proben zu verarbeiten, in einzelne Einheiten zu integrieren, um dabei ein automatisiertes Experimentieren zu erreichen. Seit dieser Zeit tauchten Miniaturkomponenten auf, insbesondere molekulare Trennverfahren und Mikroventile. Jedoch wurden Versuche, diese Systeme in vollständig integrierte Systeme zu kombinieren, nicht mit Erfolg umgesetzt. Dies liegt in erster Linie daran, daß sich die genaue Manipulation von kleinen Fluidvolumina in extrem engen Kanälen als eine schwierige technologische Hürde erwiesen hat.
  • Ein hervortretendes Gebiet, das einer Miniaturisierung zugänglich ist, ist die Kapillarelektroforese. Kapillarelektroforese wurde eine gängige Technik zur Trennung von geladenen Molekülspezies in Lösung. Die Technik wird in kleinen Kapillarröhrchen durchgeführt, um Bandenverbreiterungseffekte aufgrund von terminaler Konvektion zu verringern und damit die Auflösungsleistung zu verbessern. Die kleinen Röhrchen setzen voraus, daß genaue Volumina von Materialien in der Größenordnung von Nanolitern für die Injektion der Probe in das Trennungskapillarröhrchen gehandhabt werden müssen.
  • Anal. Chem. 1993, 65, Seiten 2637 bis 2642 "Glasspäne für Hochgeschwindigkeitskapillarelektroforesetrennungen mit Submikrometer-Bodenhöhen" von C. S. Effenhauser, A. Manz und H. M. Widmer offenbart ein Kapillarelektroforesesystem mit 6 Reservoirs, die durch Kanäle mit einer Trennsäule verbunden sind. Reservoirs 1 und 4 befinden sich an einem Ende der Trennsäule und Reservoirs 5 und 6 befinden sich an dem anderen Ende. Eine Probe wird in Reservoir 1 gelagert und Puffer in Reservoir 2. Kanäle verbinden die Reservoirs 1 bis 4 mit der Säule an 4 jeweils beabstandeten Kreuzungen. Potentiale werden an die Reservoirs 1 bis 4 angelegt, um kleine aliquote Teile von Proben, die durch Puffer getrennt sind, auf die Trennsäule zu geben. Es gibt einen kurzen Hinweis auf "der Säule nachgeschaltete Reaktionen". Dies ermöglicht nur eine Trennung von Proben und mögliche der Trennung nachgeschaltete Reaktionen mit Proben.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gesichtspunkte der Erfindung sind in den Ansprüchen genau angegeben, auf die die Aufmerksamkeit gelenkt wird. Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Betreiben eines Mikrochip-Laborsystems zur Verfügung gestellt, welches einen Aufbau mit integrierten Kanälen in Flüssigkeitsverbindung mit wenigstens fünf Reservoirs für die Aufnahme von flüssigen Materialien, ein System, welches so ausgestaltet ist, daß es gleichzeitig elektrische Potentiale auf wenigstens die fünf Reservoirs anlegt, um die flüssigen Materialien durch das System zu transportieren, und eine Reaktionskammer umfaßt, wobei ein erstes Reservoir für das Lagern eines Reagens und ein zweites Reservoir für das Lagern eines Reagens über erste bzw. zweite Kanäle mit einer ersten Kreuzung in Flüssigkeitsverbindung stehen, um Reagenzien an die erste Kreuzung zuzuführen, ein drittes (Puffer-)Reservoir und ein viertes (Abfall-)Reservoir über dritte bzw. vierte Kanäle mit einer zweiten Kreuzung in Flüssigkeitsverbindung stehen, wobei die Reaktionskammer in Flüssigkeitsverbindung mit und zwischen der ersten und der zweiten Kreuzung angeordnet ist, und ein Trennkanal die Flüssigkeitsverbindung der zweiten Kreuzung mit einem fünften (Abfall-)Reservoir bereitstellt, um in der Reaktionskammer erzeugte Reaktionsprodukte abzutrennen, wobei das Verfahren umfaßt, daß man das System so betreibt, daß elektrische Potentiale auf die Reservoirs angelegt werden, um Reagenzien von dem ersten und dem zweiten Reservoir über die erste Kreuzung zu der Reaktionskammer zu transportieren, um die Reagenzien zu mischen und/oder umzusetzen, und dann die Reaktionsprodukte oder die gemischten Reagenzien zur Abtrennung zu dem Trennkanal zu transportieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher das Mischen und/oder Reaktionen von Reagenzien vor dem Trennen der Misch-/Reaktionsprodukte zur Verfügung, was eine komplexere Analyse ermöglicht.
  • Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden erläuternden Beschreibung in Verbindung mit den anhängenden Zeichnungen, welche bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung offenbaren, verständlich.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist eine schematische Darstellung einer Mikrochip-Ausführungsform;
  • 2 ist eine vergrößerte vertikale Querschnittsdarstellung eines gezeigten Kanals;
  • 3 ist eine schematische Draufsicht auf einen Mikrochip;
  • 4 ist eine vergrößerte Darstellung des Kreuzungsbereichs aus 3;
  • 5 zeigt CCD-Bilder eines Pfropfens aus Analyt, der sich durch die Kreuzung der Ausführungsform von 3 bewegt;
  • 6 ist eine schematische Draufsicht auf ein Mikrochiplaborsystem;
  • 7 ist ein CCD-Bild eines "Probenbeladungsmodus für Rhodamin B" (schattierter Bereich);
  • 8(a) ist eine schematische Darstellung des Kreuzungsbereichs des Mikrochips aus 6 vor der Analyteninjektion;
  • 8(b) ist ein CCD-Fluoreszenzbild des gleichen Bereichs, wie er in 8(a) gezeigt ist, nach dem Probenauftrag gemäß dem gedrängten Modus;
  • 8(c) ist eine Mikrofotografie von dem gleichen Bereich, wie er in 8(a) dargestellt ist, nach dem Probenauftrag im schwimmenden bzw. frei fließenden Modus;
  • 9 zeigt integrierte Fluoreszenzsignale für injizierte Volumina, aufgetragen gegenüber der Zeit, für gedrängte und schwimmende Injektionen;
  • 10 ist eine schematische Draufsicht eines Mikrochips;
  • 11 ist eine vergrößerte Darstellung des Kreuzungsbereichs aus 10;
  • 12 ist eine schematische Draufsicht auf ein Mikrochiplaborsystem;
  • 13(a) ist eine schematische Darstellung einer CCD-Kameraansicht des Kreuzungsbereichs des Mikrochiplaborsystems nach 12;
  • 13(b) ist ein CCD-Fluoreszenzbild von dem gleichen Bereich, wie er in 13(a) dargestellt ist, nach dem Probenauftrag im gedrängten Modus;
  • 13(c)13(e) sind CCD-Fluoreszenzbilder von dem gleichen Bereich, wie er in 13(a) dargestellt ist, welche aufeinanderfolgend einen Pfropfen eines Analyten zeigen, der sich von der Kanalkreuzung weg bewegt, bei 1, 2 bzw. 3 Sekunden nach Umschalten in den Durchlauf- bzw. Betriebsmodus;
  • 14 zeigt zwei Injektionsprofile von Didansyl-Lysin, welches für 2 Sekunden mit γ gleich 0,97 und 9,7 injiziert wurde;
  • 15 sind Elektroferogramme bei (a) 3,3 cm, (b) 9,9 cm und (c) 16,5 cm vom Injektionspunkt für Rhodamin B (weniger zurückgehalten) und Sulforhodamin (stärker zurückgehalten);
  • 16 ist ein Diagramm der Effizienzdaten, die aus den Elektroferogrammen gemäß 15 generiert wurden und welche die Veränderung der Bodenanzahl mit der Kanallänge zeigen für Rhodamin B (Quadrat mit Pluszeichen) und Sulforhodamin (Quadrat mit Punkt) mit der besten linearen Ausgleichskurve (durchgezogene Linien) für jeden Analyten;
  • 17(a) ist ein Elektroferogramm von Rhodamin B und Fluoreszein mit einer Trennfeldstärke von 1,5 kV/cm und einer Trennungslänge von 0,9 mm;
  • 17(b) ist ein Elektroferogramm von Rhodamin B und Fluoreszein mit einer Trennfeldstärke von 1,5 kV/cm und einer Trennungslänge von 1,6 mm;
  • 17(c) ist ein Elektroferogramm von Rhodamin B und Fluoreszein mit einer Trennfeldstärke von 1,5 kV/cm und einer Trennungslänge von 11,1 mm;
  • 18 ist ein Diagramm, welches die Veränderung der Bodenanzahl pro Zeiteinheit als eine Funktion der elektrischen Feldstärke für Rhodamin B bei Trennungslängen von 1,6 mm (Kreis) und 11,1 mm (Quadrat) und für Fluoreszein bei Trennungslängen von 1,6 mm (Raute) und 11,1 mm (Dreieck) zeigt;
  • 19 zeigt ein Chromatogramm von Cumarinen, die durch Elektrochromatographie unter Verwendung des Systems nach 12 analysiert wurden;
  • 20 zeigt ein Chromatogramm von Cumarinen, das durch mizellare elektrokinetische Kapillarchromatographie unter Verwendung des Systems nach
  • 12 erhalten wurde;
  • 21(a) und 21(b) zeigen die Trennung von drei Metallionen unter Verwendung des Systems nach 12;
  • 22 ist eine schematische Draufsicht auf einen Mikrochip gemäß 3, die zusätzlich ein Reagenzreservoir und einen Reaktionskanal umfaßt;
  • 23 ist eine schematische Darstellung der Ausführungsform nach 22, welche angelegte Spannungen zeigt;
  • 24 zeigt zwei Elektroferogramme, die unter Verwendung der Ausführungsform nach 22 produziert wurden;
  • 25 ist eine schematische Darstellung eines Mikrochiplaborsystems gemäß einer anderen Ausführungsform;
  • 26 zeigt die Reproduzierbarkeit der injizierten Menge für Arginin und Glycin unter Verwendung des Systems nach 25;
  • 27 zeigt die Überlagerung von drei elektroforetischen Trennungen unter Verwendung des Systems nach 25;
  • 28 zeigt einen Auftrag von injizierten Mengen gegenüber der Reaktionszeit unter Verwendung des Systems nach 25;
  • 29 zeigt ein Elektroferogramm von Restriktionsfragmenten, die unter Verwendung des Systems gemäß 25 produziert wurden;
  • 30 ist eine schematische Darstellung eines Mikrochiplaborsystems;
  • 31 ist eine schematische Darstellung der Vorrichtung nach 21 und zeigt das aufeinanderfolgende Anlegen von Spannungen, um erwünschte Fluidmanipulationen zu bewirken; und
  • 32 ist ein Diagramm, welches die verschiedenen Spannungen zeigt, die angelegt wurden, um die Fluidmanipulationen gemäß 23 zu bewirken.
  • Ausführungsformen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind unter anderem in den 1, 25 und 31 gezeigt und unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Integrierte Mikrolaborsysteme für die Analyse oder Synthese von Chemikalien erfordern eine genaue Art und Weise der Manipulation von Fluiden und fluidgestütztem Material und Aussetzen der Fluide an ausgewählte chemische oder physikalische Mileus, die gewünschte Umwandlungen oder Aufteilungen erzeugen. Unter den vorgegebenen Konzentrationen von Analyten, die chemische Umwandlungen in angemessenen Zeitmaßstäben erzeugen, der Natur der molekularen Erfassung, Diffusionszeiten und Herstellungsverfahren zur Schaffung von Einrichtungen in einem mikroskopischen Maßstab, verleihen sich miniaturisierte integrierte Mikrolaborsysteme selbst Kanäle mit Dimensionen in der Größenordnung von 1 bis 100 Mikrometern Durchmesser. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, daß elektrokinetisches Pumpen zum Transportieren von Materialien in mikroskopisch hergestellten Laborsystemen vielseitig und wirkungsvoll ist.
  • Die vorliegender Erfindung stellt die Werkzeuge bereit, die notwendig sind, elektrokinetisches Pumpen nicht nur bei Trennungen einzusetzen, sondern auch Flüssigkeitshandhabung durchzuführen, die andere wichtige Probenverarbeitungsstufen erfüllt, wie chemische Umwandlungen oder Probenaufteilung. Durch gleichzeitiges Steuern der Spannung an mehreren Anschlüssen, die durch Kanäle in einer Mikrochipstruktur verbunden sind, ist es möglich, Fluide mit großer Genauigkeit zu messen und zu verteilen, Reagenzien zu mischen, Reaktionsbestandteile zu inkubieren, die Bestandteile in Richtung von Stellen der physikalischen oder biochemischen Aufteilung zu lenken und die Bestandteile Detektorsystemen zuzuführen. Durch Kombinieren dieser Fähigkeiten auf einem einzelnen Mikrochip ist man in der Lage, vollständige, miniaturisierte, integrierte, automatisierte Laborsysteme für die Analyse oder Synthese von Chemikalien zu schaffen.
  • Solche integrierten Mikrolaborsysteme können aus mehreren Teilelementen aufgebaut sein. Teilelemente können Flüssigkeitsverteilungssysteme, Flüssigkeitsmischsysteme, molekulare Aufteilungssysteme, Detektorfenster usw. umfassen. Zum Beispiel kann man, wie es hierin beschrieben ist, ein relativ vollständiges System für die Identifizierung von Restriktionsendonukleasestellen in einem DNA-Molekül aufbauen. Diese einzelne mikrotechnisch hergestellte Vorrichtung umfaßt somit in einem einzelnen System die Funktionen, die traditionell von einem Techniker durchgeführt werden, der Pipetten, Inkubatoren, Gelelektroforesesysteme und Datenerfassungssysteme verwendet. In diesem System wird DNA mit einem Enzym gemischt, das Gemisch wird inkubiert, und ein ausgewähltes Volumen des Reaktionsgemischs wird in einen Trennkanal gegeben. Elektroforese wird gleichzeitig mit einer Fluoreszenzmarkierung der DNA durchgeführt.
  • In 1 ist ein Beispiel eines Mikrochiplaborsystems 10 gezeigt, das für eine Implementierung einer ganzen chemischen Analyse oder Synthese konfiguriert ist. Das Laborsystem 10 umfaßt sechs Reservoirs, 12, 14, 16, 18, 20 und 22, die miteinander durch ein System von Kanälen 24 verbunden sind, die durch mikrotechnische Materialbearbeitung in ein Substrat oder Basisteil (in 1 nicht dargestellt) eingebracht sind, wie es nachfolgend ausführlicher diskutiert wird. Jedes Reservoir 1222 steht in Flüssigkeitsverbindung mit einem entsprechenden Kanal 26, 28, 30, 32, 34, 36 und 38 des Kanalsystems 24. Der erste Kanal 26, der von dem ersten Reservoir 12 weg führt, ist mit dem zweiten Kanal 28, der von dem zweiten Reservoir 14 weg führt, an einer ersten Kreuzung 38 verbunden. In gleicher Weise ist der dritte Kanal 30 von dem dritten Reservoir 16 mit dem vierten Kanal 32 an einer zweiten Kreuzung 40 verbunden. Die erste Kreuzung 38 ist mit der zweiten Kreuzung 40 durch eine Reaktionskammer oder einen Kanal 42 verbunden. Der fünfte Kanal 34 von dem fünften Reservoir 20 ist ebenfalls mit der zweiten Kreuzung 40 verbunden, so daß die zweite Kreuzung 40 eine Vierwegekreuzung der Kanäle 30, 32, 34 und 42 ist. Der fünfte Kanal 34 kreuzt auch den sechsten Kanal 36 von dem sechsten Reservoir 22 an einer dritten Kreuzung 44.
  • Die in den Reservoirs gespeicherten Materialien werden vorzugsweise elektrokinetisch durch das Kanalsystem 24 transportiert, um die gewünschte Analyse oder Synthese zu implementieren. Zur Bereitstellung solch eines elektrokinetischen Transports umfaßt das Laborsystem 10 einen Spannungsregler 46, der in der Lage ist, auswählbare Spannungsniveaus, einschließlich Erdung, anzulegen. Solch ein Spannungsregler kann unter Verwendung mehrerer Spannungsteiler und mehrerer Relais implementiert sein, um die auswahlbaren Spannungsniveaus zu erhalten. Der Spannungsregler ist mit einer Elektrode verbunden, die in jedem der sechs Reservoirs 1222 durch Spannungsleitungen V1–V6 angeordnet ist, um die gewünschten Spannungen an die Materialien in den Reservoirs anzulegen. Vorzugsweise umfaßt der Spannungsregler auch Sensorkanäle S1, S2 und S3, die mit den ersten, zweiten und dritten Kreuzungen 38, 40 bzw. 44 verbunden sind, um die an diesen Kreuzungen anliegenden Spannungen zu erfassen.
  • Die Anwendung von elektrokinetischem Transport auf mikrominiaturisierte, planare Flüssigphasentrennungseinrichtungen, wie sie oben beschrieben sind, ist ein entwicklungsfähiger Ansatz für die Probenmanipulation und als ein Pumpmechanismus für Flüssigchromatographie. Die vorliegende Erfindung bringt auch die Verwendung von elektroosmotischem Fluß zum Mischen verschiedener Fluide in einer kontrollierten und reproduzierbaren Art und Weise mit sich. Wenn ein geeignetes Fluid in einem Röhrchen plaziert wird, das aus einem entsprechend geeigneten Material hergestellt ist, können funktionale Gruppen an der Oberfläche des Röhrchens ionisieren. Im Fall von Rohrmaterialien, die mit Hydroxylgruppen enden, werden Protonen die Oberfläche verlassen und in ein wäßriges Lösungsmittel eintreten. Unter solchen Bedingungen wird die Oberfläche eine negative Nettoladung haben, und das Lösungsmittel wird einen Überschuß an positiven Ladungen aufweisen, in den meisten Fällen in der geladenen Doppellage an der Oberfläche. Mit der Anwendung eines elektrischen Feldes entlang des Röhrchens werden die überschüssigen Kationen zur Kathode oder negativen Elektrode angezogen werden. Die Bewegung dieser positiven Ladungen durch das Röhrchen wird das Lösungsmittel mitziehen. Die Geschwindigkeit im stabilen Zustand ist durch Gleichung I gegeben,
    Figure 00080001
    worin v die Lösungsmittelgeschwindigkeit, ε die Dielektrizitätskonstante des Fluides, ξ das Zetapotential der Oberfläche, E die elektrische Feldstärke und π die Lösungsmittelviskosität ist.
  • Aus Gleichung I ist es offensichtlich, daß die Fluidflußgeschwindigkeit oder Flußrate durch die elektrische Feldstärke gesteuert werden kann. Somit kann Elektroosmose als ein programmierbarer Pumpmechanismus verwendet werden.
  • Das in 1 gezeigte Labormikrochipsystem 10 könnte zur Durchführung vieler Arten von Laboranalysen oder -synthesen verwendet werden, wie DNA-Sequenzierung oder -Analyse, Elektrochromatographie, mizellare elektrokinetische Kapillarchromatographie (MECC), anorganische Ionenanalyse und Gradientenelutionsflüssigchromatographie, wie es nachfolgend ausführlicher diskutiert wird. Der fünfte Kanal 34 wird typischerweise für elektroforetische oder elektrochromatographische Trennungen verwendet und kann somit in bestimmten Ausführungsformen als ein Trennkanal oder eine Trennsäule bezeichnet sein. Die Reaktionskammer 42 kann dazu verwendet werden, irgendwelche zwei Chemikalien, die in den ersten und zweiten Reservoirs 12, 14 gespeichert sind, zu mischen. Zum Beispiel könnte DNA aus dem ersten Reservoir 12 mit einem Enzym aus dem zweiten Reservoir 14 in der ersten Kreuzung 38 gemischt werden, und das Gemisch könnte in der Reaktionskammer 42 inkubiert werden. Das inkubierte Gemisch könnte dann durch die zweite Kreuzung 40 in die Trennsäule 34 zur Trennung transportiert werden. Das sechste Reservoir 22 kann dazu verwendet werden, eine Fluoreszenzmarkierung zu speichern, die in der dritten Kreuzung 44 mit den Materialien, die in der Trennsäule 34 getrennt wurden, gemischt wird. Ein geeigneter Detektor (D) könnte dann dazu verwendet werden, die markierten Materialien zwischen der dritten Kreuzung 44 und dem fünften Reservoir 20 zu analysieren. Durch Bereitstellung einer Vor-Trennsäulenreaktion in der ersten Kreuzung 38 und der Reaktionskammer 42 und einer Nach-Trennsäulenreaktion in der dritten Kreuzung 44 kann das Laborsystem 10 zur Implementierung vieler Standardlabortechniken verwendet werden, die normalerweise in einem herkömmlichen Labor manuell implementiert sind. Darüber hinaus könnten die Elemente des Laborsystems 10 dazu verwendet werden, ein komplexeres System aufzubauen, um komplexere Laborverfahren zu lösen.
  • Das Labormikrochipsystem 10 umfaßt ein Substrat oder Basisteil (in 1 nicht gezeigt), welches ein etwa 2 Inch × 1 Inch großes Teil eines Objektträgers (Corning, Inc. #2947) sein kann. Obwohl Glas ein bevorzugtes Material ist, können andere ähnliche Materialien verwendet werden, wie Siliciumdioxidglas, kristalliner Quarz, Quarzglas, Kunststoffe und Silicium (wenn die Oberfläche ausreichend behandelt wird, um dessen Widerstand zu verändern). Vorzugsweise wird ein nicht leitfähiges Material, wie Glas oder Quarzglas, verwendet, um zu ermöglichen, daß relativ hohe elektrische Felder für das elektrokinetische Transportieren von Materialien durch Kanäle in dem Mikrochip angelegt werden können. Halbleitermaterialien, wie Silicium, könnten ebenfalls verwendet werden, aber das angelegte elektrische Feld würde normalerweise auf einem Minimum gehalten werden müssen (etwa weniger als 300 V/cm unter Anwendung derzeitiger Techniken zur Bereitstellung von isolierenden Schichten), was eine ungenügende elektrokinetische Bewegung liefern könnte.
  • Das Kanalmuster 24 wird in einer planaren Oberfläche des Substrats unter Verwendung von photolithographischen Standardverfahren, gefolgt von naßchemischem Ätzen, ausgebildet. Das Kanalmuster kann mit einem positiven Photoresist (Shipley 1811) und einer mit einem Elektronenstrahl geschriebenen Chrommaske (Institute of Advanced Manufacturing Sciences, Inc.) auf das Substrat übertragen werden. Das Muster kann unter Verwendung einer HF/NH4F-Lösung chemisch geätzt werden.
  • Nach Ausbildung des Kanalmusters kann eine Deckplatte anschließend unter Verwen dung einer direkten Verbindungstechnik mit dem Substrat verbunden werden, wobei die Substrat- und die Deckplattenoberflächen zuerst in einer verdünnten NH4OH/H2O2-Lösung hydrolysiert und anschließend miteinander verbunden werden. Der Aufbau wird dann bei etwa 500°C getempert, um eine gute Haftung der Deckplatte an dem Substrat sicherzustellen.
  • Nach dem Verbinden der Deckplatte werden die Reservoirs an dem Substrat befestigt, wobei Abschnitte der Deckplatte dazwischen unter Verwendung von Epoxidharz oder anderen geeigneten Mitteln schichtartig angeordnet sind. Die Reservoirs können zylindrisch mit offenen gegenüberliegenden axialen Enden ausgebildet sein. Typischerweise wird ein elektrischer Kontakt hergestellt, indem man eine Platindrahtelektrode in jedem Reservoir anordnet. Die Elektroden werden mit einem Spannungsregler 46 verbunden, der ein gewünschtes Potential an ausgewählte Elektroden in einer nachfolgend ausführlicher beschriebenen Art und Weise anlegt.
  • Ein Querschnitt des ersten Kanals ist in 2 gezeigt und mit dem Querschnitt jedes der anderen integrierten Kanäle identisch. Wenn man ein nichtkristallines Material (wie Glas) für das Substrat verwendet und wenn die Kanäle naßchemisch geätzt werden, findet ein isotropes Ätzen statt, d. h. das Glas wird gleichmäßig in allen Richtungen geätzt, und die resultierende Kanalgeometrie ist trapezförmig. Der trapezförmige Querschnitt beruht auf einem "Unterschneiden" durch das chemische Ätzverfahren an der Kante des Photoresists. Bei einer Ausführungsform hat der Kanalquerschnitt der erläuterten Ausführungsform Abmessungen von 5,2 μm in der Tiefe, 57 μm in der Breite an der Oberseite und 45 μm in der Breite an der Unterseite. Bei einer anderen Ausführungsform hat der Kanal eine Tiefe "d" von 10 μm, eine obere Breite "w1" von 90 μm und eine untere Breite "w2" von 70 μm.
  • Ein wichtiger Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist der kontrollierte elektrokinetische Transport von Materialien durch das Kanalsystem 24. Dieser kontrollierte elektrokinetische Transport kann dazu verwendet werden, eine ausgewählte Menge an Material aus einem der Reservoirs durch eine oder mehrere Kreuzungen der Kanalstruktur 24 zu verteilen. Alternativ, wie es oben erwähnt ist, können ausgewählte Mengen an Materialien aus zwei Reservoirs zu einer Kreuzung transportiert werden, wo die Materialien in gewünschten Konzentrationen gemischt werden können.
  • Gesteuerter Verteiler
  • In 3 ist eine Laborkomponente 10A gezeigt, die dazu verwendet werden kann, ein Verfahren zum Transportieren von Materialien durch eine Kanalstruktur 24A zu implementieren. Das A, das jeder Zahl in 3 nachgestellt ist, bedeutet, daß sie einem entsprechenden Element aus 1 mit der gleichen Zahl ohne das A entspricht. Zur Vereinfachung sind die Elektroden und die Verbindungen zu dem Spannungsregler, der den Transport von Materialien durch das Kanalsystem 24A steuert, in 3 nicht gezeigt.
  • Das in 3 gezeigte Mikrochiplaborsystem 10A steuert die Menge an Material aus dem ersten Reservoir 12A, das durch die Kreuzung 40A in Richtung des vierten Reservoirs 20A transportiert wird, durch elektrokinetisches Öffnen und Schließen des Zugangs zu der Kreuzung 40A von dem ersten Kanal 26A. Als solches implementiert das Labormikrochipsystem 10A im wesentlichen ein gesteuertes elektrokinetisches Ventil. Solch ein elektrokinetisches Ventil kann als ein Verteiler verwendet werden, um ausgewählte Volumina eines einzelnen Materials abzugeben, oder als ein Mischer, um ausgewählte Volumina mehrerer Materialien in der Kreuzung 40A zu mischen. Allgemein wird Elektroosmose dazu verwendet, "Fluidmaterialien" zu transportieren, und Elektroforese wird dazu verwendet, Ionen zu transportieren, ohne das Fluidmaterial, das die Ionen umgibt, zu transportieren. Dementsprechend wird der Begriff "Material", wie er hierin benutzt wird, in breiter Weise verwendet, um jede Form von Material abzudecken, einschließlich Fluiden und Ionen.
  • Das Laborsystem 10A liefert einen kontinuierlichen, unidirektionalen Fluß von Fluid durch den Trennkanal 34A. Dieses Injektions- oder Verteilungsschema erfordert nur, daß die Spannung von einem (oder zwei) Reservoir(s) verändert oder entfernt wird, und erlaubt, daß das vierte Reservoir 20A beim Erdungspotential verbleibt. Dies ermöglicht, daß Injektion und Trennung mit einer Stromquelle mit nur einer Spannungsrichtung durchgeführt werden.
  • Eine vergrößerte Darstellung der Kreuzung 40A ist in 4 gezeigt. Die Richtungspfeile deuten die zeitliche Abfolge der Strömungsprofile an der Kreuzung 40A an. Die durchgezogenen Pfeile zeigen das anfängliche Strömungsmuster. Spannungen an den verschiedenen Reservoirs sind so eingestellt, so daß das beschriebene Strömungsmuster erhalten wird. Das anfängliche Strömungsmuster bringt ein zweites Material aus dem zweiten Reservoir 16A mit einer ausreichenden Rate, daß das gesamte erste Material, das aus dem Reservoir 12A zu der Kreuzung 40A transportiert wird, in Richtung des dritten Reservoirs 18A geschoben wird. Allgemein wird die Potentialverteilung so sein, daß das höchste Potential an dem zweiten Reservoir 16A, ein etwas niedrigeres Potential an dem ersten Reservoir 12A und ein noch niedrigeres Potential an dem dritten Reservoir 18A anliegt, wobei das vierte Reservoir 20A geerdet ist. Unter diesen Bedingungen besteht der Strom in Richtung des vierten Reservoirs 20A alleine aus dem zweiten Material aus dem zweiten Reservoir 16A.
  • Um Material aus dem ersten Reservoir 12A durch die Kreuzung 40A abzugeben, kann das Potential an dem zweiten Reservoir 16A auf einen Wert umgeschaltet werden, der geringer ist als das Potential des ersten Reservoirs 12A, oder die Potentiale an den Reservoirs 16A und/oder 18A können kurzzeitig erhöht werden, um den in 4 durch die kurzgestrichelten Pfeile gezeigten Fluß zu liefern. Unter diesen Bedingungen wird der primäre Fluß aus dem ersten Reservoir 12A nach unten in Richtung des Trennkanalabfallreservoirs 20A stattfinden. Der Fluß von den zweiten und dritten Reservoirs 16A, 18A wird gering sein und könnte in jeder Richtung stattfinden. Diese Bedingung wird lange genug beibehalten, um eine gewünschte Menge an Material aus dem ersten Reservoir 12A durch die Kreuzung 40A und in den Trennkanal 30A zu transportieren. Nach ausreichender Zeit für den Durchtritt des gewünschten Materials durch die Kreuzung 40A wird die Spannungsverteilung auf die ursprünglichen Werte zurückgeschaltet, um zu verhindern, daß zusätzliches Material aus dem ersten Reservoir 12A durch die Kreuzung 40A in Richtung des Trennkanals 34A fließt.
  • Eine Anwendung für solch einen "gesteuerten Verteiler" besteht darin, einen kontrollierten, in der Größe variablen Pfropfen eines Analyten aus dem ersten Reservoir 12A für eine elektroforetische oder chromatographische Trennung in den Trennkanal 34A zu injizieren. In solch einem System speichert das erste Reservoir 12A Analyt, das zweite Reservoir 16A speichert einen ionischen Puffer, das dritte Reservoir 18A ist ein erstes Abfallreservoir, und das vierte Reservoir 20A ist ein zweites Abfallreservoir. Um einen kleinen variablen Pfropfen eines Analyten aus dem ersten Reservoir 12A zu injizieren, werden die Potentiale an dem Pufferreservoir und dem ersten Abfallreservoir 16A, 18A einfach für eine kurze Zeitdauer (≈ 100 ms) erdfrei geschaltet, um zu ermöglichen, daß der Analyt in der Trennsäule 34A nach unten wandert. Um den Injektionspfropfen abzubrechen, werden die Potentiale an dem Pufferreservoir 16A und dem ersten Abfallreservoir 18A wieder angelegt. Alternativ könnte die Schließsequenz bewirkt werden, indem man die Reservoirs 16A und 18A auf das Potential der Kreuzung 40A bringt und sie anschließend auf ihre ursprünglichen Potentiale zurücksetzt. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, daß die Zusammensetzung des injizierten Pfropfens eine elektroforetische Mobilitätsneigung besitzt, wobei die schneller wandernden Verbindungen gegenüber den langsamer wandernden Verbindungen bevorzugt in die Trennsäule 34A eingebracht werden.
  • In 5 kann man eine aufeinanderfolgende Darstellung von CCD-Bildern eines Pfropfens aus Analyt sehen, der sich durch die Kreuzung der Ausführungsform aus 3 bewegt. Der Analyt, der durch das Laborsystem 10A gepumpt wurde, war Rhodamin B (dunkler Bereich), und die Orientierung der CCD-Bilder des Injektionskreuzes oder der Kreuzung ist die gleiche wie in 3. Das erste Bild (A) zeigt den Analyten, der durch das Injektionskreuz oder die Kreuzung in Richtung des ersten Abfallreservoirs 18A gepumpt wird, vor der Injektion. Das zweite Bild (B) zeigt den Analytenpfropfen, der in die Trennsäule 34A injiziert wird. Das dritte Bild (C) zeigt den Analytenpfropfen, der sich von der Injektionskreuzung weg bewegt, nachdem ein Injektionspfropfen vollständig in die Trennsäule 34A eingebracht wurde. Die Potentiale an dem Puffer- und dem ersten Abfallreservoir 16A, 18A wurden für 100 ms erdfrei geschaltet, während sich die Probe in die Trennsäule 34A bewegte. Zu dem Zeitpunkt des Bildes (C) hat der geschlossene Beschränkungsmodus damit begonnen, weiteren Analyten daran zu hindern, sich durch die Kreuzung 40A in die Trennsäule 34A zu bewegen, und ein sauberer Injektionspfropfen mit einer Länge von 142 μm wurde in die Trennsäule eingebracht. Wie es unten diskutiert wird, trägt der gesteuerte Injektor nur zu einem geringen Teil zu der gesamten Bodenhöhe bei. Die Injektionspfropfenlänge (Volumen) ist eine Funktion der Zeit der Injektion und der elektrischen Feldstärke in der Säule. Die Form des injizierten Pfropfens ist aufgrund der Ausrichtung des Spaltungspufferflusses leicht verzerrt. Für eine vorgegebene Injektionsdauer ist die Reproduzierbarkeit der injizierten Menge, die durch Integration der Peakfläche bestimmt wird, jedoch 1% RSD für eine Reihe von zehn wiederholten Injektionen.
  • Elektroforeseexperimente wurden unter Verwendung des Mikrochiplaborsystems 10A aus 3 durchgeführt, und es wurde die Methodik gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Die Chipdynamik wurde unter Verwendung von Analytenfluoreszenz analysiert. Eine Kamera mit ladungsgekoppeltem Bauelement (CCD) wurde dazu verwendet, bestimmte Bereiche des Chips aufzuzeichnen, und ein Photomultiplierröhrchen (PMT) verfolgte Einzelpunktereignisse. Die CCD-Kamera (Princeton Instruments, Inc., TE/CCD-512TKM) wurde auf ein Stereomikroskop (Nikon SMZ-U) montiert, und das Laborsystem 10A wurde unter Verwendung eines Argonionenlasers (514,5 nm, Coherent Innova 90), der bei 3 W betrieben wurde und bei dem der Strahl auf einen kreisförmigen Punkt mit 2 cm Durchmesser aufgeweitet war, beleuchtet. Das PMT mit Sammeloptik war unterhalb des Mikrochips mit der optischen Achse senkrecht zu der Mikrochipoberfläche angeordnet. Der Laser wurde bei etwa 20 mW betrieben, und der Strahl traf auf den Mikrochip in einem Winkel von 45° von der Mikrochipoberfläche und parallel zu dem Trennkanal auf. Der Laserstrahl und die PMT-Beobachtungsachse waren durch einen Winkel von 135° voneinander getrennt. Bei dem Punkterfassungssystem wurde ein Helium-Neon-Laser (543 nm, PMS Electro-optics LHGP-0051) mit einem Elektrometer (Keithley 617) verwendet, um die Antwort des PMT (Oriel 77340) aufzuzeichnen. Der Spannungsregler 46 (Spellman CZE 1000R) für die Elektroforese wurde zwischen 0 und +4,4 kV, relativ zur Erdung, betrieben.
  • Der Typ von gesteuertem Injektor, der in Bezug auf die 3 und 4 beschrieben ist, zeigt eine auf elektroforetischer Mobilität basierende Vorspannung bzw. einen Fehler, wie es bei herkömmlichen elektroosmotischen Injektionen der Fall ist. Dennoch besitzt dieser Ansatz Einfachheit bezüglich der Anforderungen an die Spannungsumschaltung und an die Herstellung und liefert einen kontinuierlichen unidirektionalen Fluß durch den Trennkanal. Darüber hinaus liefert der gesteuerte Injektor ein Verfahren zum Ablassen eines variablen Volumens von Fluid in den Trennkanal 34A in einer Art und Weise, die durch die angelegten elektrischen Potentiale präzise gesteuert wird.
  • Eine weitere Anwendung des gesteuerten Verteilers 10A besteht darin, gewünschte Mengen an Materialien in einer kontrollierten Art und Weise zu verdünnen oder zu mischen. Zur Implementierung solch eines Mischungssystems, um die Materialien aus den ersten und zweiten Reservoirs 12A, 16A zu mischen, müssen die Potentiale in den ersten und zweiten Kanälen 26A, 30A höher gehalten werden als das Potential der Kreuzung 40A während des Mischens. Diese Potentiale werden bewirken, daß sich die Materialien aus den ersten und zweiten Reservoirs 12A und 16A gleichzeitig durch die Kreuzung 40A bewegen und dabei die zwei Materialien gemischt werden. Die an den ersten und zweiten Reservoirs 12A, 16A angelegten Potentiale können so eingestellt werden, wie es erwünscht ist, um für jedes Material die ausgewählte Konzentration zu erzielen. Nach der Abgabe der gewünschten Mengen jedes Materials kann das Potential an dem zweiten Reservoir 16A in einer Art und Weise erhöht werden, die ausreicht, zu verhindern, daß weiteres Material aus dem ersten Reservoir 12A durch die Kreuzung 40A in Richtung des dritten Reservoirs 30A transportiert wird.
  • Analytinjektor
  • In 6 ist ein Mikrochipanalytinjektor 10B gezeigt. Das Kanalmuster 24B besitzt vier begrenzte Kanäle 26B, 30B, 32B und 34B, die durch mikrotechnische Bearbeitung in ein Substrat 49 eingebracht wurden, wie es oben diskutiert wurde. Jeder Kanal hat ein zugehöriges Reservoir, das über dem Ende jedes Kanalabschnitts angebracht ist, und alle vier Kanäle kreuzen sich an einem Ende in einer Vierwegekreuzung 40B. Die gegenüberliegenden Enden jedes Abschnitts liefern Enden, die sich gerade hinter die Umfangskante einer Deckplatte 49', die auf dem Substrat 49 befestigt ist, erstrecken. Der in 6 gezeigte Analytinjektor 10B ist zu dem gesteuerten Verteiler 10A im wesentlichen identisch mit der Ausnahme, daß die elektrischen Potentiale in einer Art und Weise angelegt werden, daß ein Volumen von Material aus Reservoir 16B durch die Kreuzung 40B und nicht aus dem Reservoir 12B injiziert wird, und das Volumen an injiziertem Material wird durch die Größe der Kreuzung gesteuert.
  • Das in 6 gezeigte System kann für verschiedene Materialmanipulationen verwendet werden. In einer Anwendung wird das Laborsystem dazu verwendet, einen Analyten aus einem Analytenreservoir 16B durch die Kreuzung 40B in den Trennkanal 34B zu injizieren. Der Analytinjektor 10B kann entweder in einem "Beladungsmodus" oder einem "Durchlaufmodus" betrieben werden. Dem Reservoir 16B wird ein Analyt und dem Reservoir 12B Puffer zugeführt. Reservoir 18B stellt ein Analytenabfallreservoir dar, und Reservoir 20B stellt ein Abfallreservoir dar.
  • In dem "Beladungsmodus" sind wenigstens zwei Arten der Analyteneinbringung möglich. Bei der ersten, die als eine "erdfrei geschaltete" Beladung bekannt ist, wird ein Potential an das Analytenreservoir 16B angelegt, wobei das Reservoir 18B geerdet ist. Gleichzeitig sind die Reservoirs 12B und 20B erdfrei, was bedeutet, daß sie weder mit der Stromquelle verbunden, noch geerdet sind.
  • Der zweite Beladungsmodus ist der "gedrängte" Beladungsmodus, bei dem Potentiale gleichzeitig an Reservoirs 12B, 16B und 20B angelegt werden, wobei Reservoir 18B geerdet ist, um die Injektionspfropfenform zu steuern, wie es nachfolgend ausführlicher diskutiert wird. Wie es hierin verwendet wird, bedeutet gleichzeitiges Steuern von elektrischen Potentialen an mehreren Reservoirs, daß die Elektroden während der gleichen chemisch signifikanten Zeitdauer mit einer Betriebsstromquelle verbunden sind. Erdfreischalten eines Reservoirs bedeutet, die Verbindung der Elektrode in dem Reservoir von der Stromquelle zu trennen, und somit wird das elektrische Potential an dem Reservoir nicht gesteuert.
  • In dem "Durchlaufmodus" wird ein Potential an das Pufferreservoir 12B angelegt, wobei das Reservoir 20B geerdet ist und wobei die Reservoirs 16B und 18B ungefähr die Hälfte des Potentials von dem Reservoir 12B aufweisen. Während des Durchlaufmodus bewirkt das relativ hohe Potential, das an das Pufferreservoir 12B angelegt ist, daß sich der Analyt in der Kreuzung 40B in Richtung des Abfallreservoirs 20B in der Trennsäule 34B bewegt.
  • Diagnostische Experimente wurden unter Verwendung von Rhodamin B und Sulforhodamin 101 (Exciton Chemical Co., Inc.) als Analyt mit 60 μM für die CCD-Bilder und 6 μM für die Punkterfassung durchgeführt. Ein Natriumtetraboratpuffer (50 mM, pH 9,2) war die mobile Phase in den Experimenten. Eine Injektion von räumlich gut definierten kleinen Volumina (≈ 100 pl) und mit kleiner Längsausdehnung (≈ 100 μm) ist vorteilhaft, wenn diese Arten von Analysen durchgeführt werden.
  • Der Analyt wird in das Injektionskreuz als ein vorderes Elektroferogramm eingebracht, und sobald die Front des langsamsten Analytenbestandteils durch das Injektionskreuz oder die Kreuzung 40B hindurchtritt, ist der Analyt bereit, analysiert zu werden. In 7 zeigt ein CCD-Bild (dessen Bereich durch das Quadrat mit unterbrochener Linie angegeben ist) das Strömungsmuster des Analyten 54 (dunkler Bereich) und des Puffers (weißer Bereich) durch den Bereich der Injektionskreuzung 40B.
  • Durch Drängen des Analytenflusses ist das Volumen des Analytenpfropfens über die Zeit stabil. Die geringfügige Asymmetrie der Pfropfenform beruht auf den unterschiedlichen elektrischen Feldstärken in dem Pufferkanal 26B (470 V/cm) und dem Trennkanal 34B (100 V/cm), wenn an dem Puffer, den Analyten und die Abfallreservoirs 1,0 kV angelegt werden und das Analytenabfallreservoir geerdet ist. Jedoch beeinflussen die verschiedenen Feldstärken nicht die Stabilität des injizierten Analytenpfropfens. Wenn der Analytenpfropfen in den Trennkanal 34B injiziert wird, würde idealerweise nur der Analyt in dem Injektionskreuz oder der Kreuzung 40B in den Trennkanal wandern.
  • Das Volumen des Injektionspfropfens in dem Injektionskreuz beträgt etwa 120 pl bei einer Pfropfenlänge von 130 μm. Ein Teil des Analyten 54 in dem Analytenkanal 30B und dem Analytenabfallkanal 32B wird in den Trennkanal 34B gezogen. Nach der Umschaltung in den Trenn-(Durchlauf-)Modus beträgt das Volumen des Injektionspfropfens etwa 250 pl bei einer Pfropfenlänge von 208 μm. Diese Dimensionen sind aus einer Reihe von CCD-Bildern geschätzt, die unmittelbar nach dem Umschalten in den Trennmodus hergestellt wurden.
  • Die zwei Beladungsmodi wurden für die Analyteneinbringung in den Trennkanal 34B getestet. Der Analyt wurde in dem Analytenreservoir 16B untergebracht und bei beiden Injektionssystemen in die Richtung des Reservoirs 18B, einem Abfallreservoir, "transportiert". CCD-Bilder der zwei Arten von Injektionen sind in den 8(a)8(c) gezeigt. 8(a) zeigt schematisch die Kreuzung 40B sowie die Endabschnitte von Kanälen.
  • Das CCD-Bild von 8(b) zeigt eine Beladung in dem gedrängten Modus unmittelbar bevor in den Durchlaufmodus umgeschaltet wird. In dem gedrängten Modus wird Analyt (in weiß gegen dunklen Hintergrund gezeigt) elektroforetisch und elektroosmotisch aus Reservoir 16B zu Reservoir 18B (von links nach rechts) gepumpt, wobei Puffer aus dem Pufferreservoir 12B (oben) und dem Abfallreservoir 20B (unten) in Richtung des Reservoirs 18B (rechts) befördert wird. Die an die Reservoirs 12B, 16B, 18B und 20B angelegten Spannungen betrugen 90%, 90%, 0 bzw. 100% des Ausgangs der Stromquelle, was elektrischen Feldstärken in den entsprechenden Kanälen von 400, 270, 690 bzw. 20 V/cm entspricht. Obwohl die an das Abfallreservoir 20B angelegte Spannung höher ist als die Spannung, die an das Analytenreservoir 18B angelegt ist, liefert die zusätzliche Länge des Trennkanals 34B, verglichen mit dem Analytenkanal 30B, zusätzlichen elektrischen Widerstand, und daher überwiegt der Fluß aus dem Analytenpuffer 16B in die Kreuzung. Folglich hat der Analyt in dem Injektionskreuz oder der Kreuzung 40B eine Trapezform und ist in dem Kanal 32B durch dieses Materialtransportmuster räumlich begrenzt.
  • 8(c) zeigt eine Beladung im erdfrei geschalteten Modus. Der Analyt wird aus dem Reservoir 16B zu 18B gepumpt, wie bei der gedrängten Injektion, mit der Ausnahme, daß an die Reservoirs 12B und 20B kein Potential angelegt wird. Indem der Fluß von mobiler Phase (Puffer) in den Kanalabschnitten 26B und 34B nicht gesteuert wird, kann sich der Analyt frei in diese Kanäle durch Konvektions- und Diffusionsströmung ausbreiten, was zu einem längeren Injektionspfropfen führt.
  • Wenn man die gedrängten und erdfreien Injektionen vergleicht, ist die gedrängte Injektion in drei Bereichen überragend: zeitliche Stabilität des injizierten Volumens, die Genauigkeit des injizierten Volumens und Pfropfenlänge. Wenn zwei oder mehr Analyten mit erheblich unterschiedlichen Mobilitäten zu analysieren sind, stellt eine Injektion mit zeitlicher Stabilität sicher, daß gleiche Volumina der sich schneller und langsamer bewegenden Analyten in die Trennsäule oder den -kanal 34B eingebracht werden. Die hohe Reproduzierbarkeit des Injektionsvolumens erleichtert die Möglichkeit, quantitative Analyse durchzuführen. Eine geringere Pfropfenlänge führt zu einer höheren Trenneffizienz und folglich zu einer größeren Komponentenaufnahmefähigkeit für ein vorgegebenes Instrument und zu Trennungen mit höherer Geschwindigkeit.
  • Um die zeitliche Stabilität für jeden Modus zu bestimmen, wurden Reihen von CCD-Fluoreszenzbildern in Intervallen von 1,5 Sekunden, beginnend unmittelbar bevor der Analyt die Injektionskreuzung 40B erreichte, gesammelt. Eine Abschätzung der Menge an Analyt, der injiziert wurde, wurde durch Integrieren der Fluoreszenz in der Kreuzung 40B und den Kanälen 26B und 34B bestimmt. In 9 ist die Fluoreszenz gegenüber der Zeit aufgetragen.
  • Für die gedrängte Injektion stabilisiert sich das injizierte Volumen in wenigen Sekunden und hat eine Stabilität von 1% relativer Standardabweichung (RSD), welche mit der Stabilität des bestrahlenden Lasers vergleichbar ist. Für die erdfreie Injektion steigt die Menge an Analyt, der in den Trennkanal 34B zu injizieren ist, aufgrund des dispersiven Flusses von Analyt in die Kanäle 26B und 34B mit der Zeit an. Für eine Injektion von 30 Sekunden ist das Volumen des Injektionspfropfens ca. 90 pl und für die gedrängte Injektion stabil, gegenüber ca. 300 pl und einem kontinuierlichen Anstieg mit der Zeit für eine erdfreie Injektion.
  • Durch Aufzeichnung des Trennkanals bei einem Punkt 0,9 cm von der Kreuzung 40B wurde die Reproduzierbarkeit für den Modus der gedrängten Injektion durch Integrieren des Bereichs des Bandenprofils nach dem Einbringen in den Trennkanal 34B getestet. Bei sechs Injektionen mit einer Dauer von 40 Sekunden ist die Reproduzierbarkeit für die gedrängte Injektion 0,7% RSD. Der größte Teil dieser gemessenen Instabilität stammt von dem optischen Meßsystem. Die gedrängte Injektion besitzt eine höhere Reproduzierbarkeit aufgrund der zeitlichen Stabilität des injizierten Volumens. Es wird erwartet, daß sich die RDS mit elektronisch gesteuerter Spannungsumschaltung für beide Systeme verbessert.
  • Die Injektionspfropfenbreite und schließlich die Auflösung zwischen Analyten hängt in großem Maße sowohl von dem Strömungsmuster des Analyten und den Dimensionen des Injektionskreuzes oder der Kreuzung 40B ab. Für diese Säule beträgt die Breite des Kanals an der Oberseite 90 μm, aber eine Kanalbreite von 10 μm ist realisierbar, was bei einer gedrängten Injektion zu einer Abnahme des Volumens des Injektionspfropfens von 90 pl herab bis auf 1 pl führen würde.
  • Es gibt Situationen, in denen es nicht erwünscht sein kann, den Fluß in dem Trennkanal umzukehren, wie es oben für die "gedrängten" und "erdfreien" Injektionssysteme beschrieben ist. Beispiele für solche Fälle können die Injektion eines neuen Probepfropfens, bevor der vorangegangen Pfropfen vollständig eluiert wurde, oder die Verwendung eines der Säule nachgeschalteten Reaktors, wo Reagens kontinuierlich in das Ende der Trennsäule injiziert wird, sein. Im letztgenannten Fall wäre es im allgemeinen nicht erwünscht, daß Reagens zurück in den Trennkanal fließt.
  • Alternativer Analytinjektor
  • 10 erläutert ein alternatives Analytinjektorsystem 10C mit sechs verschiedenen Anschlüssen oder Kanälen 26C, 30C, 32C, 34C, 56 bzw. 58, die mit sechs verschiedenen Reservoirs 12C, 16C, 18C, 20C, 60 und 62 verbunden sind. Der Buchstabe C nach der Nummer jedes Elementes bedeutet, daß das angegebene Element zu den entsprechend numerierten Elementen aus 1 analog ist. Das Mikrochiplaborsystem 10C ist dahingehend den zuvor beschriebenen Laborsystemen 10, 10A und 10B ähnlich, daß ein Injektionskreuz oder eine Kreuzung 40C vorgesehen ist. In derm System nach 10 sind auch eine zweite Kreuzung 64 und zwei zusätzliche Reservoirs 60 und 62 vorgesehen, um die Probleme mit der Umkehrung des Flusses in dem Trennkanal zu überwinden.
  • Wie bei den vorangegangenen Systemen kann das Analytinjektorsystem 10C dazu verwendet werden, eine Analytentrennung durch Elektroforese oder Chromatographie zu implementieren oder Material in ein anderes verarbeitendes Element abzugeben. In dem Laborsystem 10C enthält das Reservoir 12C Trennpuffer, Reservoir 16C enthält den Analyten, und die Reservoirs 18C und 20C sind Abfallreservoirs. Die Kreuzung 40C wird vorzugsweise im gedrängten Modus betrieben, wie in der in 6 gezeigten Ausführungsform. Die untere Kreuzung 64, die in einer Flüssigkeitsverbindung mit den Reservoirs 60 und 62 steht, wird dazu verwendet, einen zusätzlichen Fluß zu liefern, so daß ein kontinuierlicher Pufferstrom abwärts in Richtung des Abfallreservoirs 20C und, wenn es erforderlich ist, aufwärts in Richtung der Injektionskreuzung 40C gelenkt werden kann. Reservoir 60 und der verbundene Kanal 56 sind nicht notwendig, obwohl sie durch Reduzierung der Bandenverbreiterung, wenn ein Pfropfen die untere Kreuzung 64 passiert, die Leistung verbessern. In vielen Fällen wird der Fluß aus dem Reservoir 60 mit demjenigen aus Reservoir 62 symmetrisch sein.
  • 11 ist eine vergrößerte Darstellung der zwei Kreuzungen 40C und 64. Die verschiedenen Arten von Pfeilen zeigen die Flußrichtungen unter bestimmten Umständen in der Zeit für die Injektion eines Pfropfens von Analyt in den Trennkanal. Die durchgezogenen Pfeile zeigen das anfängliche Strömungsmuster, bei dem der Analyt elektrokinetisch in die obere Kreuzung 40C gepumpt und durch Materialfluß aus den Reservoirs 12C, 60 und 62 in Richtung dieser gleichen Kreuzung "gedrängt" wird. Ein Fluß weg von der Injektionskreuzung 40C wird zu dem Analytenabfallreservoir 18C befördert. Der Analyt fließt auch aus dem Reservoir 16C zu dem Analytenabfallreservoir 18C. Unter diesen Umständen findet auch ein Fluß aus dem Reservoir 60 (und Reservoir 62) durch den Trennkanal 34C zu dem Abfallreservoir 20C statt. Solch ein Strömungsmuster wird durch gleichzeitiges Steuern der elektrischen Potentiale an allen sechs Reservoirs erzeugt.
  • Ein Pfropfen des Analyten wird durch die Injektionskreuzung 40C in den Trennkanal 34C durch Umschalten des Strömungsprofils injiziert, wie es durch die kurzgestrichelten Pfeile gezeigt ist. Puffer strömt aus dem Reservoir 12C abwärts zu der Injektionskreuzung 40C und in Richtung der Reservoirs 16C, 18C und 20C. Dieses Strömungsprofil drängt auch den Analytenpfropfen in Richtung des Abfallreservoirs 20C in den Trennkanal 34C, wie es zuvor beschrieben ist. Dieses Strömungsprofil wird für eine ausreichende zeitliche Länge gehalten, um den Analytenpfropfen über die untere Kreuzung 64 hinaus zu bewegen. Der Fluß von Puffer aus den Reservoirs 60 und 62 sollte gering sein, wie es durch den kurzen Pfeil angedeutet ist, und in den Trennkanal 34 erfolgen, um Störung zu minimieren.
  • Der Abstand zwischen den oberen und unteren Kreuzungen 40C bzw. 64 sollte so gering sein wie möglich, um eine Pfropfenstörung und die Kritizität der zeitlichen Koordinierung beim Umschalten zwischen den zwei Fließbedingungen zu minimieren. Elektroden zum Erfassen des elektrischen Potentials können ebenfalls an der unteren Kreuzung und in den Kanälen 56 und 58 angeordnet sein, um das Einstellen der elektrischen Potentiale für eine gute Flußsteuerung zu unterstützen. Genaue Flußsteuerung an der unteren Flußkreuzung 64 kann notwendig sein, um eine unerwünschte Bandenverbreiterung zu verhindern.
  • Nachdem der Probenpfropfen die untere Kreuzung passiert hat, werden die Potentiale zurück in die anfänglichen Zustände geschaltet, um das ursprüngliche Strömungsprofil zu liefern, wie es mit den langgestrichelten Pfeilen gezeigt ist. Dieses Strömungsmuster erlaubt, daß Puffer in den Trennkanal 34C fließt, während der nächste Analytenpfropfen zu dem pfropfenbildenden Bereich in der oberen Kreuzung 40C transportiert wird. Dieses Injektionssystem wird es erlauben, eine schnelle Abfolge von Injektionen durchzuführen, und kann sehr wichtig sein für Proben, die langsam wandern, oder wenn es eine lange Zeit erfordert, an der oberen Kreuzung 40C eine homogene Probe zu erhalten, wie mit verwickelten Polymerlösungen. Diese Implementierung der gedrängten Injektion hält auch einen unidirektionalen Fluß durch den Trennkanal aufrecht, wie es für eine der Säule nachgeschaltete Reaktion erforderlich sein könnte, was nachfolgend unter Bezugnahme auf 22 diskutiert wird.
  • Gewundener Kanal
  • Ein anderes Analytinjektorsystem 10D ist in 12 gezeigt. Das in 12 gezeigte Laborsystem 10D ist im wesentlichen zu dem in 6 gezeigten Laborsystem 10B identisch, mit der Ausnahme, daß der Trennkanal 34D einem gewundenen Weg folgt. Der gewundene Weg des Trennkanals 34D erlaubt es, die Länge des Trennkanals sehr stark zu erhöhen, ohne die Fläche des Substrats 49D, die benötigt wird, um den gewundenen Weg zu implementieren, wesentlich zu erhöhen. Eine Vergrößerung der Länge des Trennkanals 34D verbessert die Fähigkeit des Laborsystems 10D, Elemente eines Analyten zu unterscheiden. Bei einer speziellen bevorzugten Ausführungsform beträgt die eingeschlossene Länge (die von der Deckplatte 49D abgedeckt ist) des Kanals, der sich von Reservoir 16D zu Reservoir 18D erstreckt, 19 mm, während die Länge des Kanalabschnitts 26D 6,4 mm und des Kanals 34D 171 mm beträgt. Der Kurvenradius jeder Biegung des Kanals 34D, welcher als eine Trennsäule dient, beträgt 0,16 mm.
  • Um eine Trennung unter Verwendung des modifizierten Analytinjektorsystems 10D durchzuführen, wird ein Analyt zuerst in die Injektionskreuzung 40B eingebracht, wobei eines der oben beschriebenen Beladungsverfahren verwendet wird. Nachdem der Analyt in die Kreuzung 40D des Mikrochiplaborsystems 10 geladen wurde, werden die Spannungen vom Beladungsmodus in den Durchlauf-(Trennungs-)Betriebsmodus geschaltet. Die 13(a)13(e) zeigen eine Trennung von Rhodamin B (weniger zurückgehalten) und Sulforhodamin (stärker zurückgehalten) unter Anwendung der folgenden Bedingungen: Einj = 400 V/cm, Erun = 150 V/cm, Puffer = 50 mM Natriumtetraborat mit einem pH-Wert von 9,2. Die CCD-Bilder zeigen das Trennverfahren in Intervallen von 1 Sekunde, wobei 13(a) ein Schema des Abschnittes des abgebildeten Chips zeigt und wobei die 13(b)13(e) die Entwicklung der Trennung zeigen.
  • 13(b) zeigt wiederum die gedrängte Injektion, wobei die angelegten Spannungen an den Reservoirs 12D, 16D und 20D gleich sind und Reservoir 18D geerdet ist. Die 13(c)13(e) zeigen den Pfropfen, der sich von der Kreuzung weg bewegt, 1, 2 bzw. 3 Sekunden nach dem Umschalten in den Durchlaufmodus. In 13(c) wandert der Injektionspfropfen um eine 90°-Biegung, und eine Bandenverzerrung ist sichtbar, weil der innere Bereich des Pfropfens eine geringere Distanz zurücklegt als der äußere Bereich. In 13(d) haben sich die Analyten in deutliche Banden getrennt, welche in der Form eines Parallelogramms verzerrt sind. In 13(e) sind die Banden gut getrennt und haben eine mehr rechteckige Form angenommen, d. h. ein Zusammenbruch des Parallelogramms aufgrund von radialer Diffusion, einem zusätzlichen Beitrag zu einem Effizienzverlust.
  • Wenn die Umschaltung von dem Beladungsmodus in den Durchlaufmodus durchgeführt wird, ist ein sauberer Abriß des Injektionspfropfens von dem Analytenstrom erwünscht, um ein Nachziehen zu vermeiden. Dies wird erreicht, indem man die mobile Phase oder den Puffer aus Kanal 26D gleichzeitig in die Kanäle 30D, 32D und 34D pumpt, indem man das Potential an der Kreuzung 40D unter dem Potential des Reservoirs 12D und über den Potentialen der Reservoirs 16D, 18D und 20D hält.
  • In den repräsentativen Experimenten, die hierin beschrieben sind, wurde die Kreuzung 40D während des Durchlaufmodus bei 66% des Potentials von Reservoir 12D gehalten. Dies lieferte ausreichenden Fluß des Analyten zurück und weg von der Kreuzung 40D entlang der Kanäle 30D und 32D, ohne die Feldstärke in dem Trennkanal 34D signifikant zu verringern. Alternative Kanalausgestaltungen würden es erlauben, daß ein größerer Anteil des an das Reservoir 12D angelegten Potentials über den Trennkanal 34D abfällt, wobei die Effizienz verbessert wird.
  • Dieser Dreiwegefluß ist in den 13(c)13(e) demonstriert, wo die Analyten in den Kanälen 30D und 32D (links bzw. rechts) sich mit der Zeit werter weg von der Kreuzung bewegen. Dreiwegefluß erlaubt gut definierte, reproduzierbare Injektionen unter minimalem Durchschlagen des Analyten in den Trennkanal 34D.
  • Detektoren
  • Bei den meisten Anwendungen, die für diese integrierten Mikrosysteme zur chemischen Analyse oder Synthese ins Auge gefaßt werden, wird es notwendig sein, das in einem Kanal an einer oder mehreren Positionen vorhandene Material, ähnlich wie bei herkömmlichen Labormeßverfahren, zu quantifizieren. Techniken, die typischerweise zur Quantifizierung verwendet werden, umfassen, sind jedoch nicht gesteuert auf optische Absorption, Veränderung des Brechungsindex, Fluoreszenzemission, Chemilumineszenz, verschiedene Formen von Raman-Spektroskopie, elektrische Leitfähigkeitsmessungen, elektrochemische amperometrische Messungen und Messungen der Schallwellenausbreitung.
  • Messungen der optischen Absorption werden üblicherweise mit herkömmlichen Laboranalysesystemen aufgrund der Allgemeingültigkeit des Phänomens im UV-Bereich des elektromagnetischen Spektrums durchgeführt. Die optische Absorption wird allgemein durch Messen der Dämpfung von auftreffender optischer Energie bestimmt, wenn sie durch eine bekannte Länge eines Materials, das zu quantifizieren ist, hindurchtritt. Alternative Ansätze sind möglich mit Lasertechnologie, einschließlich photoakustischen und photothermalen Techniken. Solche Messungen können mit der hierin diskutierten Mikrochiptechnologie mit dem zusätzlichen Vorteil eingesetzt werden, daß optische Wellenleiter potentiell auf mikrotechnisch hergestellten Einrichtungen integriert werden. Die Verwendung von optischen Festkörperquellen, wie LEDs und Diodenlasern mit und ohne Frequenzumwandlungselementen, wäre für die Reduzierung der Systemgröße interessant. Eine Integration einer optischen Festkörperquelle und von Detek tortechnologie auf einem Chip scheint derzeit nicht entwicklungsfähig zu sein, kann jedoch eines Tages von Interesse sein.
  • Brechungsindexdetektoren wurden ebenfalls allgemein für die Quantifizierung von chemischen Analysesystemen mit einem fließenden Strom aufgrund der Allgemeingültigkeit des Phänomens eingesetzt, waren jedoch typischerweise weniger empfindlich als optische Absorption. Auf Laser basierende Implementierungen der Brechungsindexdetektion könnten in einigen Fällen eine adäquate Empfindlichkeit liefern und haben den Vorteil der Einfachheit. Fluoreszenzemission (oder Fluoreszenzdetektion) ist eine äußerst empfindliche Detektionstechnik und wird allgemein für die Analyse von biologischen Materialien verwendet. Dieser Ansatz der Detektion hat besondere Relevanz für miniaturisierte chemische Analyse- und Synthesevorrichtungen aufgrund der Empfindlichkeit der Technik und der kleinen Volumina, die manipuliert und analysiert werden können (Volumina im Pikoliterbereich sind möglich). Zum Beispiel hätte ein 100 pl Probenvolumen mit 1 nM Konzentration an Analyt nur 60.000 zu verarbeitende und zu detektierende Analytenmoleküle. Es gibt mehrere Veranschaulichungen in der Literatur für die Detektion eines einzelnen Moleküls in Lösung durch Fluoreszenzdetektion. Häufig wird eine Laserquelle als die Anregungsquelle für ultrasensitive Messungen verwendet, jedoch werden herkömmliche Lichtquellen, wie Edelgasentladungslampen und lichtemittierende Dioden (LEDs) ebenfalls verwendet. Die Fluoreszenzemission kann durch ein Photomultiplierröhrchen, eine Photodiode oder einen anderen Lichtsensor erfaßt werden. Ein Felddetektor, wie ein Detektor mit ladungsgekoppeltem Bauelement (CCD), kann dazu verwendet werden, eine räumliche Verteilung eines Analyten abzubilden.
  • Raman-Spektroskopie kann als ein Detektionsverfahren für Mikrochipvorrichtungen ver wendet werden mit dem Vorteil, daß molekulare Schwingungsinformation gewonnen wird, aber mit dem Nachteil relativ schlechter Empfindlichkeit. Die Empfindlichkeit wurde durch Effekte der oberflächenvergrößerten Raman-Spektroskopie (SERS) verbessert, aber nur auf dem Forschungsniveau. Ansätze der elektrischen oder elektrochemischen Detektion sind ebenfalls von besonderem Interesse für die Implementierung auf Mikrochipeinrichtungen aufgrund der Einfachheit der Integration auf einer mikrotechnisch hergestellten Struktur und der potentiell hohen Empfindlichkeit, die erreicht werden kann. Der allgemeinste Ansatz für elektrische Quantifizierung ist eine konduktometrische Messung, d. h. eine Messung der Leitfähigkeit in einer ionischen Probe. Das Vorhandensein eines ionisierten Analyten kann entsprechend die Leitfähigkeit eines Fluides erhöhen und erlaubt somit eine Quantifizierung. Amperometrische Messungen umfassen die Messung des Stroms durch eine Elektrode bei einem vorgegebenen elektrischen Potential aufgrund der Reduktion oder Oxidation eines Moleküls an der Elektrode. Eine gewisse Selektivität kann durch Steuerung des Potentials der Elektrode erreicht werden, jedoch ist sie minimal. Amperometrische Detektion ist eine weniger verbreitete Technik als Leitfähig keit, weil nicht alle Moleküle innerhalb der begrenzten Potentiale, die mit herkömmlichen Lösungsmitteln eingesetzt werden können, reduziert oder oxidiert werden können. Empfindlichkeiten im Bereich von 1 nM wurden in kleinen Volumina (10 nl) gezeigt. Der andere Vorteil dieser Technik ist, daß die Anzahl der gemessenen Elektronen (durch den Strom) gleich der Anzahl der vorhandenen Moleküle ist. Die für jedes dieser Detektionsverfahren erforderlichen Elektroden können durch photolithographische Mustergebung und Metallabscheidungsverfahren auf einem mikrotechnisch hergestellten Bauteil enthalten sein. Elektroden könnten auch dazu verwendet werden, ein Chemilumineszenzdetektionsverfahren zu initiieren, d. h. ein Molekül im angeregten Zustand wird über einen Oxidations-Reduktions-Prozeß erzeugt, welches dann seine Energie auf ein Analytenmolekül überträgt, welches anschließend ein Photon emittiert, das detektiert wird.
  • Akustische Messungen können ebenfalls zur Quantifizierung von Materialien verwendet werden, wurden jedoch bis heute nicht in breitem Maße eingesetzt. Ein Verfahren, das in erster Linie zur Gasphasendetektion verwendet wurde, ist die Dämpfung oder Phasenverschiebung einer Oberflächenakustikwelle (SAW). Adsorption von Material an der Oberfläche eines Substrates, wo sich eine SAW ausbreitet, beeinflußt die Ausbreitungscharakteristika und erlaubt eine Konzentrationsbestimmung. Selektive Sorptionsmittel auf der Oberfläche des SAW-Bauteils werden häufig verwendet. Ähnliche Techniken können in den hierin beschriebenen Vorrichtungen brauchbar sein.
  • Die Mischfähigkeiten der hierin beschriebenen Mikrochiplaborsysteme eignen sich für Detektionsverfahren, welche die Zugabe von einem oder mehreren Reagenzien umfassen. Derivatisierungsreaktionen werden allgemein in biochemischen Tests eingesetzt. Zum Beispiel werden Aminosäuren, Peptide und Proteine allgemein mit Dansylierungsreagenzien oder o-Phthaldialdehyd unter Herstellung von fluoreszierenden Molekülen, die einfach detektierbar sind, markiert. Alternativ könnte ein Enzym als ein Markierungsmolekül verwendet werden, und ein Reagens, einschließlich eines Substrats, könnte hinzugegeben werden, um ein enzymverstärktes Detektionssystem bereitzustellen, d. h. das Enzym produziert ein detektierbares Produkt. Es gibt viele Beispiele, wo solch ein Ansatz in herkömmlichen Laborverfahren eingesetzt wurde, um die Detektion entweder durch Absorption oder Fluoreszenz zu verstärken. Ein drittes Beispiel eines Detektionsverfahrens, das von integrierten Mischverfahren profitieren könnte, ist Chemilumineszenzdetektion. Bei diesen Arten von Detektionsszenarien werden ein Reagens und ein Katalysator mit einem geeigneten Zielmolekül gemischt, um ein Molekül im angeregten Zustand zu erzeugen, das ein detektierbares Photon emittiert.
  • Analytenanhäufung
  • Um die Empfindlichkeit des Mikrochiplaborsystems 10D zu erhöhen, kann vor der Trennung eine Analytenvorkonzentrierung durchgeführt werden. Konzentrationserhöhung ist ein nützliches Mittel, speziell wenn Umweltproben und biologische Materialien, zwei Gebiete, die von der Mikrochiptechnologie angesprochen werden, analysiert werden. Analytenanhäufung ist eine vorteilhafte Technik zur Verbindung mit elektroforetischen Analysen. Zur Durchführung von Analytenanhäufung wird der Analyt in einem Puffer mit einer niedrigeren Leitfähigkeit als der Trennpuffer bereitgestellt. Der Unterschied in der Leitfähigkeit bewirkt, daß sich die Ionen in dem Analyten am Anfang oder Ende des Analytenpfropfens anhäufen, was zu einem konzentrierten Analytenpfropfenbereich führt, der leichter detektiert werden kann. Aufwendigere Vorkonzentrierungstechniken umfassen Zwei- und Dreipuffersysteme, d. h. transiente isotachoforetische Vorkonzentrierung. Es ist klar, daß es umso schwieriger ist, die Injektionstechnik zu implementieren, je größer die Anzahl der involvierten Lösungen ist. Vorkonzentrierungsstufen sind gut geeignet für eine Implementierung auf einem Mikrochip. Elektroosmotisch angetriebener Fluß ermöglicht, daß Trenn- und Probenpuffer ohne die Verwendung von Ventilen oder Pumpen gesteuert werden können. Verbindungen mit geringem Totvolumen zwischen Kanälen können einfach hergestellt werden und ermöglichen eine Fluidmanipulation mit hoher Genauigkeit, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit.
  • Unter erneuter Bezugnahme auf 12 wird die Vorkonzentrierung des Analyten an der Oberseite des Trennkanals 34D durchgeführt, wobei eine modifizierte gesteuerte Injektion verwendet wird, um den Analyten anzuhäufen. Zuerst wird ein Analytenpfropfen unter Verwendung von elektroosmotischem Fluß auf den Trennkanal 34D gebracht. Dem Analytenpfropfen folgt dann mehr Trennpuffer aus dem Pufferreservoir 16D. An diesem Punkt häuft sich der Analyt an den Grenzen des Analyten und des Trennpuffers an. Es wurden dansylierte Aminosäuren als Analyt verwendet, welche Anionen sind, die sich an der hinteren Grenze des Analytenpufferpfropfens anhäufen. Eine Implementierung der Analytenanhäufung wird zusammen mit den Wirkungen der Anhäufung sowohl auf die Trenneffizienz als auch die Detektionsgrenzen beschrieben.
  • Für die Anwendung einer gesteuerten Injektion unter Verwendung des Mikrochiplaborsystems 10D wird der Analyt in dem oberen Reservoir 12D und der Puffer in dem linken Reservoir 16D gespeichert. Die gesteuerte Injektion, die für die Analytenanhäufung verwendet wird, wird mit einem Analyten mit einer Ionenstärke, die geringer ist als diejenige des Laufpuffers, durchgeführt. Puffer wird durch Elektroosmose aus dem Pufferreservoir 16D in Richtung sowohl des Analytenabfall- als auch des Abfallreservoirs 18D, 20D transportiert. Dieser Pufferstrom verhindert, daß der Analyt in den Trennkanal 34D ausläuft. In einer repräsentativen Ausführungsform betragen die relativen Potentiale an den Puffer-, Analyten-, Analytenabfall- und Abfallreservoirs, 1, 0,9, 0,7 bzw. 0. Für 1 kV, die an den Mikrochip angelegt sind, betragen die Feldstärken in den Puffer-, Analyten-, Analytenabfall- und Trennkanälen während der Trennung 170, 130, 180 bzw. 120 V/cm.
  • Zur Injektion des Analyten auf den Trennkanal 34D wird das Potential an dem Pufferreservoir 16D für eine kurze Zeitdauer (0,1 bis 10 Sekunden) erdfrei geschaltet (Öffnen des Hochspannungsschalters), und Analyt wandert in den Trennkanal. Für 1 kV, die an den Mikrochip angelegt sind, betragen die Feldstärken in den Puffer-, Proben-, Probenabfall- und Trennkanälen während der Injektion 0, 240, 120 bzw. 110 V/cm. Zum Abreißen des Analytenpfropfens wird das Potential an dem Pufferreservoir 16D erneut angelegt (Schließen des Hochspannungsschalters). Das Volumen des Analytenpfropfens ist eine Funktion der Injektionszeit, der elektrischen Feldstärke und der elektroforetischen Mobilität.
  • Die Zusammensetzungen des Trennpuffers und des Analyten können ziemlich verschie den sein, jedoch kann mit den gesteuerten Injektionen die Integrität sowohl des Analyten- als auch des Pufferstroms zur Durchführung des Anhäufungsvorgangs alternativ in dem Trennkanal 34D aufrechterhalten werden. Die Analytenanhäufung hängt von der relativen Leitfähigkeit γ des Trennpuffers gegenüber dem Analyten ab. Zum Beispiel ist γ = 9,7 bei einem 5 mM Trennpuffer und einer 0,516 mM Probe (0,016 mM Dansyl-Lysin und 0,5 mM Probenpuffer). 14 zeigt zwei Injektionsprofile für Didansyl-Lysin, das für 2 Sekunden mit γ = 0,97 und 9,7 injiziert wurde. Das Injektionsprofil mit γ = 0,97 (wobei die Trenn- und Probenpuffer beide 5 mM sind) zeigt keine Anhäufung. Das zweite Profil mit γ = 9,7 zeigt eine mäßige Erhöhung um 3,5 für die relativen Peakhöhen gegenüber der Injektion mit γ = 0,97. Didansyl-Lysin ist ein Anion und häuft sich somit an der hinteren Grenze des Probenpufferpfropfens an. Zusätzlich zur Erhöhung der Analytenkonzentration wird die räumliche Erstreckung des Pfropfens begrenzt. Das Injektionsprofil mit γ = 9,7 hat eine Breite bei halber Höhe von 0,41 s, wogegen das Injektionsprofil mit γ = 0,97 eine Breite bei halber Höhe von 1,88 s aufweist. Die elektrische Feldstärke in dem Trennkanal 34D während der Injektion (Injektionsfeldstärke) ist 95% der elektrischen Feldstärke in dem Trennkanal während der Trennung (Trennungsfeldstärke). Diese Profile werden gemessen, während die Trennfeldstärke angelegt ist. Für eine Injektionszeit von 2 Sekunden wird für γ = 0,97 eine Injektionspfropfenbreite von 1,9 s erwartet.
  • Die Konzentrationserhöhung aufgrund von Anhäufung wurde für mehrere Probenpfropfenlängen und relative Leitfähigkeiten des Trennpuffers und des Analyten bestimmt. Die Erhöhung aufgrund von Anhäufung steigt mit zunehmenden relativen Leitfähigkeiten γ an. In Tabelle 1 ist die Erhöhung für γ von 0,97 bis 970 aufgelistet. Obwohl die Erhöhung am größten ist, wenn γ = 970, leidet die Trenneffizienz aufgrund eines elektroosmotischen Druckes, der von der Konzentrationsgrenze herrührt, wenn die relative Leitfähigkeit zu groß ist. Es muß ein Kompromiß zwischen der Anhäufungsverstärkung und der Trenneffizienz erreicht werden, und es wurde herausgefunden, daß γ = 10 optimal ist. Für Trennungen, die unter Verwendung von ange häuften Injektionen mit γ = 97 und 970 durchgeführt wurden, konnten Didansyl-Lysin und Dansyl-Isoleucin aufgrund eines Effizienzverlustes nicht aufgelöst werden. Auch weil der Injektionsvorgang auf dem Mikrochip computergesteuert ist und die Säule nicht physikalisch von Gefäß zu Gefäß transportiert wird, beträgt die Reproduzierbarkeit der angehäuften Injektionen 2,1% RSD (% relative Standardabweichung) für einen Peakbereich bei sechs wiederholten Analysen.
  • Zum Vergleich hat eine nicht gehäufte, gesteuerte Injektion eine RSD von 1,4% für einen Peakbereich von sechs wiederholten Analysen, und die gedrängte Injektion hat eine RSD von 0,75% für einen Peakbereich von sechs wiederholten Analysen. Dies entspricht gut beschriebenen Werten für in großem Maßstab arbeitenden, handelsüblichen, automatisierten Kapillarelektroforeseinstrumenten. Jedoch sind Injektionen, die auf dem Mikrochip durchgeführt werden, 100-mal kleiner im Volumen, z. B. 100 pl auf dem Mikrochip gegenüber 10 nl auf einem handelsüblichen Instrument. Tabelle 1: Veränderung der Anhäufungsverstärkung mit der relativen Leitfähigkeit γ
    γ Konzentrationserhöhung
    0,97 1
    9,7 6,5
    97 11,5
    970 13,8
  • Pufferströme von verschiedenen Leitfähigkeiten können auf Mikrochips genau kombi niert werden. Hierin beschrieben ist ein einfaches Anhäufungsverfahren, obwohl aufwendigere Anhäufungssystemen durch Herstellung eines Mikrochips mit zusätzlichen Pufferreservoirs eingesetzt werden können. Darüber hinaus können die vorlaufenden und nachlaufenden Elektrolytpuffer so ausgewählt werden, daß sie die Probenanhäufung verstärken und schließlich die Detektionsgrenzen unter die hierin gezeigten absenken. Es wird auch erwähnt, daß viel größere Verstärkungen für anorganische (elementare) Kationen aufgrund der Kombination von feldverstärkter Analyteninjektion und besserer Übereinstimmung von Analyten- und Pufferionenmobilitäten erwartet werden.
  • Unabhängig davon, ob Probenhäufung verwendet wird, kann das Mikrochiplaborsystem 10D aus 12 dazu verwendet werden, elektroforetische Trennung eines Analyten, der aus Rhodamin B und Sulforhodamin zusammengesetzt ist, zu erreichen. 15 zeigt Elektroferogramme bei (a) 3,3 cm, (b), 9,9 cm und (c) 16,5 cm vom Injektionspunkt für Rhodamin B (geringer zurückgehalten) und Sulforhodamin (stärker zurückgehalten). Diese wurden unter Anwendung der folgenden Bedingungen aufgenommen: Der Injektionstyp war gedrängt, Einj = 500 V/cm, Erun = 170 V/cm, Puffer = 50 mM Natriumtetraborat mit einem pH-Wert von 9,2. Um Elektroferogramme in der herkömmlichen Art und Weise zu erhalten, wurde Einzelpunktdetektion mit dem Helium-Neon-Laser (grüne Linie) an verschiedenen Stellen entlang der Achse des Trennkanals 34D eingesetzt.
  • Ein wichtiges Maß für die Brauchbarkeit eines Trennsystems ist die Anzahl an Böden, die pro Zeiteinheit erzeugt werden, angegeben durch die Formel N/t = L/(Ht),worin N die Anzahl der theoretischen Böden, t die Trennungszeit, L die Länge der Trennsäule und H das Höhenäquivalent für einen theoretischen Boden ist. Die Bodenhöhe H kann angegeben werden als H = A + B/u,worin A die Summe der Beiträge der Injektionspfropfenlänge und der Detektorweglänge, B gleich 2Dm1, worin Dm der Diffusionskoeffizient für den Analyten in dem Puffer ist, und u die lineare Geschwindigkeit des Analyten ist.
  • Kombiniert man die zwei oben genannten Gleichungen und ersetzt u = μE, worin μ die effektive elektroforetische Mobilität des Analyten und E die elektrische Feldstärke ist, können die Böden pro Zeiteinheit als eine Funktion der elektrischen Feldstärke ausgedrückt werden: N/t = (μE)2/(AμE + B).
  • Bei niedrigen elektrischen Feldstärken, wenn die axiale Diffusion die überwiegende Form der Bandendispersion ist, ist der Ausdruck AμE klein gegenüber B, und folglich steigt die Anzahl der Böden pro Sekunde mit dem Quadrat der elektrischen Feldstärke.
  • Wenn die elektrische Feldstärke ansteigt, nähert sich die Bodenhöhe einem konstanten Wert, und die Böden pro Zeiteinheit steigen linear mit der elektrischen Feldstärke an, weil B gegenüber AμE klein ist. Es ist daher vorteilhaft, A so gering wie möglich zu haben, ein Vorteil des gedrängten Injektionssystems.
  • Die Effizienz der elektroforetischen Trennung von Rhodamin B und Sulforhodamin an zehn gleichmäßig verteilten Positionen wurde aufgezeichnet, wobei jede ein getrenntes Experiment darstellt. 16,5 cm vom Injektionspunkt betragen die Effizienzen von Rhodamin B und Sulforhodamin 38.100 bzw. 29.000 Böden. Effizienzen von dieser Höhe sind für viele Trennungsanwendungen ausreichend. Die Linearität der Daten liefert Information über die Gleich mäßigkeit und Qualität des Kanals entlang seiner Länge. Wenn in dem Kanal ein Defekt, z. B. eine Vertiefung, vorhanden wäre, würde dies zu einer scharfen Abnahme der Effizienz führen, jedoch wurde keine festgestellt. Die Effizienzdaten sind in 16 aufgetragen (die Bedingungen für 16 waren die gleichen wie für 15).
  • Ein ähnliches Trennungsexperiment wurde unter Verwendung des Mikrochipanalytinjektors 10B aus 6 durchgeführt. Aufgrund des geraden Trennkanals 34B ermöglicht der Analytinjektor 10B schnellere Trennungen, als sie unter Verwendung des gewundenen Trennkanals 34D des in 12 gezeigten alternativen Analytinjektors 10D möglich sind. Darüber hinaus waren die verwendeten elektrischen Feldstärken höher (470 V/cm und 100 V/cm für den Puffer bzw. die Trennkanäle 26B, 34B), was die Geschwindigkeit der Trennungen weiter erhöhte.
  • Ein besonderer Vorteil des ebenen Mikrochiplaborsystems 10B der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß man mit laserinduzierter Fluoreszenz den Punkt der Detektion irgendwo entlang der Trennsäule plazieren kann. Die Elektroferogramme werden bei Trennlängen von 0,9 mm, 1,6 mm und 11,1 mm von der Injektionskreuzung 40B erfaßt. Die Trennlängen von 1,6 mm und 11,1 mm wurden über einen Bereich von elektrischen Feldstärken von 0,06 bis 1,5 kV/cm verwendet, und die Trennungen hatten eine Grundlinienauflösung über diesen Bereich. Bei einer elektrischen Feldstärke von 1,5 kV/cm werden die Analyten, Rhodamin B und Fluoreszein, in weniger als 150 ms für die Trennlänge von 0,9 mm aufgelöst, wie es in 17(a) gezeigt ist, in weniger als 260 ms für die 1,6 mm Trennlänge, wie es in 17(b) gezeigt, und in weniger als 1,6 Sekunden für die Trennlänge von 11,1 mm, wie es in 17(c) gezeigt ist.
  • Aufgrund der trapezförmigen Geometrie der Kanäle machen es die oberen Ecken schwierig, den Probenpfropfen präzise wegzuschneiden, wenn die Potentiale von dem Probenbeladungsmodus in den Trennmodus geschaltet werden. Daher hat der Injektionspfropfen einen geringfügigen Schweif, der mit ihm verbunden ist, und dieser Effekt trägt wahrscheinlich zu dem Nachziehen bei, das man in den getrennten Peaks beobachtet.
  • In 18 ist die Anzahl der Böden pro Sekunde für die Trennlängen von 1,6 mm und 11,1 mm gegenüber der elektrischen Feldstärke aufgetragen. Die Anzahl der Böden pro Sekunde wird schnell eine lineare Funktion der elektrischen Feldstärke, weil sich die Bodenhöhe einem konstanten Wert annähert. Die Symbole in 18 repräsentieren die experimentellen Daten, die für die zwei Analyten bei den Trennlängen von 1,6 mm und 11,1 mm gesammelt wurden. Die Linien sind unter Verwendung der zuvor angegebenen Gleichung berechnet, und die Koeffizienten sind experimentell bestimmt. Man sieht eine geringfügige Abweichung zwischen den experimentellen Daten und den berechneten Zahlen für Rhodamin B bei der Trennlänge von 11,1 mm. Dies ist in erster Linie auf einen experimentellen Fehler zurückzuführen.
  • Elektrochromatographie
  • Ein Problem der Elektroforese für allgemeine Analysen ist ihr Unvermögen, ungeladene Spezies aufzutrennen. Alle neutralen Spezies in einer bestimmten Probe werden keine elektroforetische Mobilität besitzen und somit die gleiche Migrationszeit. Der in 12 gezeigte Mikrochipanalytinjektor 10D kann auch dazu verwendet werden, Elektrochromatographie zur Trennung von nichtionischen Analyten durchzuführen. Zur Durchführung dieser Elektrochromatographie wurde die Oberfläche des Trennkanals 34D durch chemische Bindung einer Umkehrphasenbeschichtung an die Wände des Trennkanals nach dem Verbinden der Deckplatte mit dem Substrat zum Einschließen der Kanäle präpariert. Der Trennkanal wurde mit 1 M Natriumhydroxid behandelt und anschließend mit Wasser gespült. Der Trennkanal wurde bei 125°C für 24 Stunden getrocknet, während mit Helium bei einem Manometerdruck von etwa 50 kPa gespült wurde. Eine 25%-ige (w/w) Lösung von Chlordimethyloctadecylsilan (ODS, Aldrich) in Toluol wurde in den Trennkanal mit einem Überdruck an Helium von etwa 90 kPa geladen. Das ODS/Toluol-Gemisch wurde kontinuierlich in die Säule während der 18 Stunden Reaktionsdauer bei 125°C gepumpt. Die Kanäle werden mit Toluol und anschließend mit Acetonitril gespült, um nicht umgesetztes ODS zu entfernen. Das Laborsystem 10D wurde zur Durchführung von Elektrochromatographie an einem Analyten verwendet, der aus Cumarin 440 (C440), Cumarin 450 (C450) und Cumarin 460 (C460; Exciton Chemicals Co., Inc.) mit 10 μM für die direkten Fluoreszenzmessungen der Trennungen und 1 μM für die indirekten Fluoreszenzmessungen der Totzeit zusammengesetzt war. Der Puffer war ein Natriumtetraboratpuffer (10 mM, pH 9,2) mit 25% (v/v) Acetonitril.
  • Der Analytinjektor 10D wurde mit einem gedrängten Analytbeladungsmodus und einem Trenn-(Durchlauf-)Modus betrieben, wie sie oben unter Bezugnahme auf 6 beschrieben sind. Der Analyt wird in das Injektionskreuz über ein frontales Chromatogramm, welches von dem Analytenreservoir 16D zu dem Analytenabfallreservoir 18D befördert wird, beladen, und sobald die Front des langsamsten Analyten durch die Injektionskreuzung 40D hindurchtritt, ist die Probe bereit, analysiert zu werden. Zum Umschalten in den Trennmodus werden die angelegten Potential rekonfiguriert, z. B. durch manuelles Umwerfen eines Schalters. Nach dem Schalten der angelegten Potentiale ist der primäre Fließweg für die Trennung von dem Pufferreservoir 12D zu dem Abfallreservoir 20D. Um einen kleinen Analytenpfropfen in den Trennkanal 34D zu injizieren und zu verhindern, daß der überschüssige Analyt in den Trennkanal ausläuft, werden die Analyten- und Analytenabfallreservoirs 16D, 18D bei 57% des an das Pufferreservoir 12D angelegten Potentials gehalten. Dieses Verfahren zur Beladung und Injektion der Probe ist zeitunabhängig, nicht vorgespannt und reproduzierbar.
  • In 19 ist ein Chromatogramm der Cumarine für eine lineare Geschwindigkeit von 0,65 mm/s gezeigt. Für C440 wurden 11.700 Böden beobachtet, was 120 Böden/s entspricht. Der am stärksten zurückgehaltene Bestandteil, C460, besitzt eine Effizienz nahezu um eine Größenordnung geringer als für C440, welche 1.290 Böden betrug. Der wellenförmige Hintergrund in den Chromatogrammen ist auf Hintergrundfluoreszenz von dem Glassubstrat zurückzuführen und zeigt die Energieinstabilität des Lasers. Dies beeinträchtigte jedoch nicht die Qualität der Trennungen oder der Detektion. Diese Ergebnisse lassen sich ziemlich gut mit herkömmlichen Hochleistungs-LC-(HPLC-)Labortechniken bezüglich der Olat-Zahlen vergleichen und übertreffen HPLC in der Geschwindigkeit um einen Faktor von 10. Die Effizienz nimmt mit der Zurückhaltung schneller ab, als man es anhand der Theorie vorhergesagt hätte. Dieser Effekt kann auf eine Überladung der stationären oder kinetischen Effekte der Einzellage aufgrund der hohen Geschwindigkeit der Trennung zurückzuführen sein.
  • Mizellare elektrokinetische Kapillarchromatographie
  • In den oben unter Bezugnahme auf 19 diskutierten elektrochromatographischen Experimenten wurden Probenbestandteile aufgrund ihrer Aufteilungswechselwirkung mit einer stationären Phase, mit der die Kanalwände beschichtet waren, getrennt. Ein anderes Verfahren zum Trennen von neutralen Analyten ist mizellare elektrokinetische Kapillarchromatographie (MECC). MECC ist eine Betriebsweise der Elektroforese, bei der ein Detergens, wie Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer ausreichenden Konzentration zur dem Puffer hinzugegeben wird, so daß in dem Puffer Mizellen gebildet werden. In einer typischen experimentellen Anordnung bewegen sich die Mizellen viel langsamer in Richtung der Kathode als die umgebende Pufferlösung. Die Aufteilung der gelösten Stoffe zwischen den Mizellen und der umgebenden Pufferlösung liefert einen Trennungsmechanismus, ähnlich demjenigen von Flüssigchromatographie.
  • Das Mikrochiplaborsystem 10D aus 12 wurde verwendet, um dies an einem Analyten durchzuführen, der aus neutralen Farbstoffen Cumarin 440 (C440), Cumarin 450 (C450) und Cumarin 460 (C460, Exciton Chemical Co., Inc.) zusammengesetzt war. Einzelne Stammlösungen jedes Farbstoffs wurden in Methanol hergestellt und anschließend vor der Verwendung in dem Analysepuffer verdünnt. Die Konzentration jedes Farbstoffs betrug etwa 50 μM, wenn es nicht anders angegeben ist. Der MECC-Puffer bestand aus 10 mM Natriumborat (pH 9,1), 50 mM SDS und 10% (v/v) Methanol. Der Methanol unterstützt das Lösen des Cumarin-Farbstoffs in dem wäßrigen Puffersystem und bewirkt auch die Aufteilung von einigen der Farbstoffe in die Mizellen. Beim Arbeiten mit Cumarin-Farbstoffen ist Vorsicht walten zu lassen, da die chemischen, physikalischen und toxikologischen Eigenschaften dieser Farbstoffe noch nicht vollständig aufgeklärt sind.
  • Das Mikrochiplaborsystem 10D wurde in dem "gedrängten Injektionsmodus" betrieben, der zuvor beschrieben wurde. Die an die Reservoirs angelegten Spannungen werden entweder auf einen Beladungsmodus oder einen "Betriebs"-(Trennungs-)Modus eingestellt. In dem Beladungsmodus wird ein frontales Chromatogramm der Lösung in dem Analytenreservoir 16D elektroosmotisch durch die Kreuzung und in das Analytenabfallreservoir 18D gepumpt. Spannungen, die an die Puffer- und Abfallreservoirs angelegt sind, bewirken auch schwache Ströme in die Kreuzung von den Seiten und anschließend in das Analytenabfallreservoir 18D. Der Chip bleibt in diesem Modus, bis die sich am langsamsten bewegende Komponente des Analyten durch die Kreuzung 40D hindurchgetreten ist. An diesem Punkt ist der Analytenpfropfen in der Kreuzung für die Analytenlösung ohne elektrokinetische Vorspannung repräsentativ.
  • Eine Injektion wird vorgenommen, indem man den Chip in den "Betriebs"-Modus umschaltet, wobei die an die Reservoirs angelegten Spannungen so verändert wenden, daß Puffer nun aus dem Pufferreservoir 12D durch die Kreuzung 40D in den Trennkanal 34D zu dem Abfallreservoir 20D fließt. Der Pfropfen aus Analyt, der in der Kreuzung 40D war, wird in den Trennkanal 34D gespült. Entsprechend geringere Spannungen werden an die Analyten- und Analytenabfallreservoirs 16D, 18D angelegt, um einen schwachen Fluß von Puffer aus dem Pufferreservoir 12D in diese Kanäle zu bewirken. Diese Ströme stellen sicher, daß der Probenpfropfen sauber von dem Analytenstrom "abreißt" und daß kein überschüssiger Analyt während der Analyse in den Trennkanal ausläuft.
  • Die Ergebnisse der MECC-Analyse eines Gemisches aus C440, C450 und C460 sind in 20 gezeigt. Die Peaks wurden durch Einzelanalysen jedes Farbstoff identifiziert. Die Migrationszeitstabilität des ersten Peaks, C440, bei veränderter Methanolkonzentration war ein starkes Anzeichen dafür, daß dieser Farbstoff sich nicht in einem signifikanten Ausmaß in die Mizellen verteilte. Daher wurde er als ein Marker für den elektroosmotischen Fluß mit einer Migrationszeit t0 angesehen. Der letzte Peak, C460, wurde als ein Marker für die mizellare Migrationszeit tm angesehen. Unter Verwendung dieser Werte von t0 und tm aus den Daten in 20 beträgt der berechnete Elutionsbereich t0/tm 0,43. Dies stimmt gut mit einem Literaturwert von t0/tm = 0,4 für ein ähnliches Puffersystem überein und unterstützt unsere Annahme. Diese Ergebnisse sind gut vergleichbar mit herkömmlicher MECC, die in Kapillaren durchgeführt wird, und zeigt auch einige Vorteile gegenüber dem oben beschriebenen elektrochromatographischen Experiment dahingehend, daß die Effizienz mit dem Rückhalteverhältnis erhalten bleibt. Weitere Vorteile dieses Ansatzes zur Trennung neutraler Spezies sind, daß keine Oberflächenmodifikation der Wände notwendig ist und daß die stationäre Phase während der Experimente kontinuierlich erneuert wird.
  • Analyse anorganischer Ionen
  • Eine weitere Laboranalyse, die entweder auf dem Laborsystem 10B aus 6 oder dem Laborsystem 10D aus 12 durchgeführt werden kann, ist die Analyse von anorganischen Ionen. Unter Verwendung des Laborsystems 10B aus 6 wurde Analyse von anorganischen Ionen an Metallionen, die mit 8-Hydroxychinolin-5-sulfonsäure (HQS) komplexiert waren, welche durch Elektroforese getrennt und mit durch UV-Laser induzierter Fluoreszenz detektiert werden, durchgeführt. HQS wurde in weitem Maße als ein Ligand für optische Bestimmungen von Metallionen verwendet. Die optischen Eigenschaften und die Löslichkeit von HQS in wäßrigen Medien wurden kürzlich für die Detektion von Metallionen verwendet, die durch Ionenchromatographie und Kapillarelektroforese getrennt wurden. Weil nicht komplexierte HQS nicht fluoresziert, wird ein Überschuß an Ligand zu dem Puffer hinzugegeben, um das Komplexierungsgleichgewicht während der Trennung aufrechtzuerhalten, ohne zu einem großen Hintergrundsignal beizutragen. Dies ist sowohl für die Effizienz der Trennung als auch die Detektierbarkeit der Probe vorteilhaft. Die Verbindungen, die für die Experimente verwendet werden, sind Zinksulfat, Cadmiumnitrat und Aluminiumnitrat. Der Puffer ist Natriumphosphat (60 mM, pH 6,9) mit 8-Hydroxychinolin-5-sulfonsäure (20 mM für alle Experimente, ausgenommen 5; Sigma Chemical Co.). Wenigstens 50 mM Natriumphosphatpuffer werden benötigt, um bis zu 20 mM HQS zu lösen. Das verwendete Substrat 49B war Glasquarz, welches eine größere Sicht bietet als Glassubstrate.
  • Die erdfreie oder gedrängte Analytenbeladung, wie sie zuvor unter Bezugnahme auf 6 beschrieben ist, wird zum Transportieren des Analyten zu der Injektionskreuzung 40B verwendet. Mit der erdfreien Probenbeladung hat der injizierte Pfropfen keine elektroforetische Vorspannung, aber das Volumen der Probe ist eine Funktion der Probenbeladungszeit. Weil die Probenbeladungszeit umgekehrt proportional zu der eingesetzten Feldstärke ist, wird für hohe Injektionsfeldstärken eine kürzere Injektionszeit als für niedrige Injektionsfeldstärken verwendet. Zum Beispiel beträgt für eine Injektionsfeldstärke von 630 V/cm (3a) die Injektionszeit 12 Sekunden, und für eine Injektionsfeldstärke von 520 V/cm (3b) beträgt die Injektionszeit 14,5 Sekunden. Sowohl die gedrängte als auch die erdfreie Probenbeladung kann mit und ohne Unterdrückung des elektroosmotischen Flusses verwendet werden.
  • Die 21(a) und 21(b) zeigen die Trennung von drei Metallionen, die mit 8-Hydroxychinolin-5-sulfsonsäure komplexiert sind. Alle drei Komplexe haben eine negative Nettoladung. Mit dem durch die kovalente Bindung von Polyacrylamid an die Kanalwände minimierten elektroosmotischen Fluß werden gegenüber der Erdung negative Potentiale verwendet, um die Komplexe während der Probenbeladung und -trennung zu manipulieren. In den 21(a) und 21(b) ist die Trennkanalfeldstärke 870 bzw. 720 V/cm, und die Trennungslänge beträgt 16,5 mm. Das Volumen des injizierten Pfropfens ist 120 pl, was 16, 7 und 19 injizierten fmol für Zn, Cd bzw. Al für 4(a) entspricht. In 4(b) wurden 0,48, 0,23 bzw. 0,59 fmol Zn, Cd bzw. Al auf die Trennsäule injiziert. Die durchschnittliche Reproduzierbarkeit der injizierten Mengen beträgt 1,6% RSD (% relative Standardabweichung), gemessen anhand von Peakflächen (sechs wiederholte Analysen). Die Stabilität des zur Anregung der Komplexe verwende ten Lasers beträgt ≈ 1% RSD. Die Detektionsgrenzen liegen in einem Bereich, wo brauchbare Analysen durchgeführt werden können.
  • Dem Trennkanal nachgeschalteter Reaktor
  • Ein alternatives Mikrochiplaborsystem 10E ist in 22 gezeigt. Das Muster der Kanäle mit fünf Anschlüssen ist auf einem Substrat 49E mit einem Deckglas 49E' verteilt, wie in den zuvor beschriebenen Ausführungsformen. Die Ausführungsform des Mikrochiplaborsystems 10E wurde unter Verwendung von standardphotolithographischen, naßchemischen Ätz- und Bindungstechniken hergestellt. Eine Photomaske wurde durch Besputtern von Chrom (50 nm) auf einen Glasobjektträger und Abtragen der Kanalausgestaltung in den Chromfilm mittels eines CAD/CAM-Laserverdampfungssystems (Resonetics, Inc.) hergestellt. Das Kanaldesign wurde dann unter Verwendung eines positiven Photoresists auf das Substrat übertragen. Die Kanäle wurden in einem verdünnten HF/NH4F-Bad in das Substrat geätzt. Zur Ausbildung des Trennkanals 34E wurde eine Deckplatte unter Verwendung einer direkten Verbindungstechnik über den geätzten Kanälen mit dem Substrat verbunden. Die Oberflächen wurden in verdünnter NH4OH/H2O2-Lösung hydrolysiert, in entionisiertem, gefiltertem H2O gespült, miteinander verbunden und anschließend bei 500°C getempert. Zylindrische Glasreservoirs wurden unter Verwendung von RTV-Silikon (hergestellt von General Electric) an dem Substrat befestigt. Platinelektroden stellten elektrischen Kontakt von dem Spannungsregler 46E (Spellman CZE1000R) zu den Lösungen in den Reservoirs her.
  • Der Kanal 26E ist bei einer Ausführungsform von dem ersten Reservoir 12E zu der Kreuzung 40E 2,7 mm lang, während der Kanal 30E 7 mm und der dritte Kanal 32E 6,7 mm lang sind. Der Trennkanal 34E ist aufgrund der Hinzufügung eines Reagenzienreservoirs 22E, welches einen Reagenzienkanal 36E aufweist, der den Trennkanal 34E an einem Misch-T 44E verbindet, modifiziert, so daß er nur 7,0 mm lang ist. Daher wird die Länge des Trennkanals 34E von der Kreuzung 40E bis zu dem Misch-T 44E gemessen. Der Kanal 56, der sich von dem Misch-T 44E zu dem Abfallreservoir 20E erstreckt, ist die Reaktionssäule oder der Reaktionskanal, und bei der dargestellten Ausführungsform ist dieser Kanal 10,8 mm lang. Die Länge des Reagenzienkanals 36E beträgt 11,6 mm.
  • In einem repräsentativen Beispiel wurde das System gemäß 22 verwendet, um einen Analyten aufzutrennen, und die Trennung wurde mittels Fluoreszenz unter Verwendung eines Argonionenlasers (351,1 nm, 50 mW, Coherent Innova 90) für die Anregung auf dem Mikrochip aufgezeichnet. Das Fluoreszenzsignal wurde mit einem Photomultiplierröhrchen (PMT, Oriel 77340) für die Punkterfassung und einem ladungsgekoppelten Bauelement (CCD, Princeton Instruments, Inc. TE/CCD-512TKN) zum Abbilden eines Bereichs des Mikrochips 90 gesammelt. Die zum Testen der Vorrichtung verwendeten Verbindungen waren Rhodamin B (Ex citon Chemical Co., Inc.), Arginin, Glycin, Threonin und o-Phthaldialdehyd (Sigma Chemical Co.). Ein Natriumtetraboratpuffer (20 mM, pH 9,2) mit 2% (v/v) Methanol und 0,5% (v/v) β-Mercaptoethanol war in allen Tests der Puffer. Die Konzentrationen der Aminosäure-, OPA- und Rhodamin B-Lösungen waren 2 mM, 3,7 mM bzw. 50 μM. Es wurden verschiedene Betriebsbedingungen verwendet.
  • Die schematische Darstellung in 23 zeigt ein Beispiel, wenn 1 kV an das gesamte System angelegt ist. Mit dieser Spannungskonfiguration sind die elektrischen Feldstärken in dem Trennkanal 34E (Esep) und dem Reaktionskanal 36E (Erxn) 200 bzw. 425 V/cm. Dies erlaubt die Kombination von 1 Teil Trennungsausfluß mit 1,125 Teilen Reagens an dem Misch-T 44E. Ein Analyteneinführungssystem wie dieses mit oder ohne der Säule nachgeschalteter Reaktion erlaubt eine sehr schnelle Zykluszeit für viele Analysen.
  • Die Elektroferogramme (A) und (B) in 24 zeigen die Trennung von zwei Paaren von Aminosäuren. Die Spannungskonfiguration ist die gleiche wie in 23 mit der Ausnahme, daß die gesamte angelegte Spannung 4 kV beträgt, was einer elektrischen Feldstärke von 800 V/cm in der Trennsäule (Esep) und 1.700 V/cm in der Reaktionssäule (Erxn) entspricht. Die Injektionszeiten betrugen 100 ms für die Tests, was geschätzten Injektionspfropfenlängen von 384, 245 bzw. 225 μm für Arginin, Glycin bzw. Threonin entspricht. Die Injektionsvolumina von 102, 65 bzw. 60 pl entsprechen 200, 130 bzw. 120 injizierten fmol für Arginin, Glycin bzw. Threonin. Der Detektionspunkt liegt 6,5 mm stromabwärts von dem Misch-T, was eine Gesamtsäulenlänge von 13,5 mm für die Trennung und Reaktion ergibt.
  • Die Reaktionsraten der Aminosäuren mit dem OPA sind mäßig schnell, aber nicht schnell genug auf der Zeitskala dieser Experimente. Eine Zunahme der Bandenverzerrung wird beobachtet, weil die Mobilitäten der derivatisierten Verbindungen von den reinen Aminosäuren verschieden sind. Bis die Reaktion vollständig ist, werden sich die Zonen aus nicht umgesetzter und umgesetzter Aminosäure mit verschiedenen Geschwindigkeiten bewegen, was eine Verbreiterung der Analytenzone bewirkt. Wie es in 24 gezeigt wird, weist Glycin die größte Diskrepanz der elektroforetischen Mobilitäten zwischen der derivatisierten und der nicht derivatisierten Aminosäure auf. Um sicherzustellen, daß die übermäßige Bandenverbreiterung nicht eine Funktion der Rückhaltezeit war, wurde Threonin ebenfalls getestet. Threonin hat eine geringfügig längere Rückhaltezeit als das Glycin, jedoch ist die Verbreiterung nicht so stark wie für Glycin.
  • Zum Testen der Effizienz des Mikrochips sowohl in der Trennsäule als auch der Reakti onssäule wurde ein Fluoreszenzlaserfarbstoff, Rhodamin B, als eine Sonde verwendet. Effizienzmessungen, berechnet anhand der Peakbreite bei halber Höhe, wurden unter Anwendung des Punktdetektionssystems bei Abständen von 6 mm und 8 mm von dem Injektionskreuz oder 1 mm stromaufwärts und 1 mm stromabwärts von dem Misch-T durchgeführt. Dies lieferte Information über die Wirkungen des Mischens der zwei Ströme.
  • Die elektrischen Feldstärken in der Reagenziensäule und der Trennsäule waren etwa gleich, und die Feldstärke in der Reaktionssäule betrug das Zweifache derjenigen der Trennsäule. Diese Konfiguration der angelegten Spannungen erlaubte ein Volumenverhältnis von etwa 1:1 von Derivatisierungsreagens und Ausfluß aus der Trennsäule. Mit Zunahme der Feldstärken stieg das Ausmaß an Turbulenz an dem Misch-T. Bei der Trenndistanz von 6 mm (1 mm stromaufwärts von dem Misch-T) war die Bodenhöhe, wie erwartet, das Inverse zu der linearen Geschwindigkeit des Analyten. Bei der Trenndistanz von 8 mm (1 mm stromaufwärts von dem Misch-T) nahmen die Bodenhöhen ab, wie erwartet, als das Inverse der Geschwindigkeit des Analyten. Bei der Trenndistanz von 8 mm (1 mm stromabwärts von dem Misch-T) nahmen die Bodenhöhendaten von 140 V/cm zu 280 V/cm zu 1.400 V/cm ab. Dieses Verhalten ist abnormal und zeigt ein Bandenverbreiterungsphänomen, wenn zwei Ströme mit gleichen Volumina zusammenlaufen. Die Geometrie des Misch-T war nicht optimiert, um diese Bandenverzerrung zu minimieren. Über einer Trennfeldstärke von 840 V/cm stabilisiert sich das System und die Bodenhöhe nimmt mit zunehmender linearer Geschwindigkeit wieder ab. Für Esep = 1.400 V/cm beträgt das Verhältnis der Bodenhöhen bei den Trennlängen von 8 mm und 6 mm 1,22, was kein inakzeptabler Verlust der Effizienz der Trennung ist.
  • Die Intensität des Fluoreszenzsignals, das aus der Reaktion von OPA mit Aminosäure erzeugt wurde, wurde durch kontinuierliches Pumpen von Glycin entlang des Trennkanals zum Mischen mit dem OPA an dem Misch-T getestet. Das Fluoreszenzsignal aus der OPA/Aminosäure-Reaktion wurde unter Verwendung einer CCD gesammelt, während sich das Produkt stromabwärts von dem Misch-T bewegte. Wieder war das relative Volumenverhältnis des OPA und des Glycinstroms 1,125. OPA hat eine typische Halbwertszeit der Reaktion mit Aminosäuren von 4 Sekunden. Die durchschnittlichen Verweilzeiten eines Analytenmoleküls in dem Beobachtungsfenster sind 4,68, 2,34, 1,17 und 0,58 Sekunden für die elektrischen Feldstärken in der Reaktionssäule (E) von 240, 480, 960 bzw. 1.920 V/cm. Die relativen Intensitäten der Fluoreszenz entsprechen qualitativ dieser Halbwertszeit der Reaktion von 4 Sekunden. Wenn die Feldstärke in dem Reaktionskanal ansteigt, verschieben sich die Steigung und das Maximum der Intensität der Fluoreszenz weiter stromabwärts, weil das Glycin und OPA mit höheren Feldstärken schneller aus dem Misch-T weggespült werden. Idealerweise hätte die beobachtete Fluoreszenz aus dem Produkt eine Stufenfunktion einer Antwort nach dem Mischen des Trennungsausflusses und des Derivatisierungsreagenzes. Jedoch verhindern die Kinetik der Reaktion und die letztendliche Mischrate, welche durch Diffusion bestimmt wird, daß dies auftritt.
  • Die Trennung unter Verwendung des dem Trennkanal nachgeschalteten Reaktors verwendete ein gesteuertes Reaktionssystem, um die Analyten-, Puffer- und Reagenzienströme isoliert zu halten, wie es oben unter Bezugnahme auf 3 diskutiert ist. Für die dem Trennkanal nachgeschalteten Reaktionen wurde der Mikrochip in einem kontinuierlichen Analytenbeladungs-/-trennmodus betrieben, wobei der Analyt kontinuierlich aus dem Analytenreservoir 12E durch die Injektionskreuzung 40E in Richtung des Analytenabfallreservoirs 18E gepumpt wurde. Puffer wurde gleichzeitig aus dem Pufferreservoir 16E in Richtung der Analytenabfall- und Abfallreservoirs 18E, 20E gepumpt, um den Analytenstrom abzulenken und zu verhindern, daß der Analyt den Trennkanal entlang wandert. Zur Injektion eines kleinen aliquoten Teils von Analyt werden die Potentiale an den Puffer- und Analytenabfallreservoirs 16E, 18E einfach für eine kurze Zeitdauer (≈ 100 ms) erdfrei geschaltet, um zuzulassen, daß der Analyt als ein Analyteninjektionspfropfen entlang des Trennkanals wandert. Zum Abreißen des Injektionspfropfens werden die Potentiale an den Puffer- und Analytenabfallreservoirs 16E, 18E erneut angelegt.
  • Die Verwendung von mikrotechnisch hergestellten, der Säule nachgeschalteten Reaktoren kann die Wirkung der dem Trennkanal nachgeschalteten Reaktionen als ein analytisches Werkzeug durch Minimieren des Volumens der Plombierung außerhalb des Kanals, insbesondere zwischen den Trenn- und Reagenzienkanälen 34E, 36E, verbessern. Diese Mikrochipausgestaltung (22) wurde mit geringen Längen für den Trennkanal 34E (7 mm) und den Reagenzienkanal 36E (10,8 mm) hergestellt, was für diese Demonstration mehr als ausreichend war. Längere Trennkanäle können auf einem Mikrochip mit ähnlicher Größe unter Verwendung eines gewundenen Pfades hergestellt werden, um schwierigere Trennungen durchzuführen, wie es oben unter Bezugnahme auf 12 diskutiert wird. Um die Bandenverzerrungen hinter dem Misch-T zu verringern, sollte das Verhältnis der Kanalabmessungen zwischen dem Trennkanal 34E und dem Reaktionskanal 56 so minimiert werden, daß die elektrische Feldstärke in dem Trennkanal 34E groß ist, d. h. ein enger Kanal, und in dem Reaktionskanal 56 klein ist, d. h. ein breiter Kanal.
  • Für Kapillartrennsysteme können die kleinen Detektionsvolumina die Anzahl an Detektionssystemen, die verwendet werden können, um Information herauszuziehen, begrenzen. Fluoreszenzdetektion bleibt eine der empfindlichsten Detektionstechniken für Kapillarelektroforese. Wenn man Fluoreszenzdetektion in ein System aufnimmt, das keine natürlich fluoreszierenden Analyten aufweist, muß entweder vor oder nach der Trennung eine Derivatisierung des Analyten stattfinden. Wenn die fluoreszierende "Markierung" von kurzer Lebensdauer ist oder die Trennung durch der Trennung vorgeschaltete Derivatisierung gestört wird, wird die der Säule nachgeschaltete Zugabe von Derivatisierungsreagens zur Methode der Wahl. Eine Vielzahl von der Trennung nachgeschalteten Reaktoren wurden für Kapillarelektroforese gezeigt. Jedoch war die Fähigkeit, einen der Trennung nachgeschalteten Reaktor mit Verbindungen für äußerst niedrige Volumina zur Minimierung der Bandenverzerrung zu konstruieren, schwierig. Das vorliegende System wählt den Ansatz der Herstellung einer Mikrochipeinrichtung für elektroforetische Trennungen mit einem integrierten, der Trennung nachgeschalteten Reaktionskanal 56 in einer einzelnen monolithischen Vorrichtung, was äußerst kleine Volumenaustausche zwischen einzelnen Kanalfunktionen ermöglicht.
  • Dem Trennkanal vorgeschaltetes Reaktionssystem
  • Anstelle der in 22 gezeigten Ausgestaltung des dem Trennkanal nachgeschalteten Reaktors umfaßt das Mikrochiplaborsystem 10F, das in 25 gezeigt ist, einen dem Trennkanal vorgeschalteten Reaktor. Die in 25 gezeigte Ausgestaltung des dem Trennkanal vorgeschalteten Reaktors ist der in 1 gezeigten ähnlich mit der Ausnahme, daß die ersten und zweiten Kanäle 26F, 28F mit der Reaktionskammer 42F eher eine "Torpfosten"-Gestalt ausbilden als die "Y"-Gestalt aus 1. Die Reaktionskammer 42F wurde so ausgestaltet, daß sie breiter ist als der Trennkanal 34F, um in der Reaktionskammer niedrigere elektrische Feldstärken zu erhalten und somit längere Verweilzeiten für die Reagenzien. Die Reaktionskammer ist 96 μm breit bei halber Höhe und 6,2 μm tief, und der Trennkanal 34F ist 31 μm breit bei halber Höhe und 6,2 μm tief.
  • Das Mikrochiplaborsystem 10F wurde verwendet, um dem Trennkanal vorgeschaltete Online-Reaktionen durchzuführen, gekoppelt mit elektroforetischer Analyse der Reaktionsprodukte. Hier wird der Reaktor kontinuierlich mit kleinen aliquoten Teilen betrieben, die periodisch in den Trennkanal 34F unter Verwendung des unter Bezugnahme auf 3 oben diskutierten gesteuerten Verteilers eingebracht werden. Der Betrieb des Mikrochips besteht aus drei Elementen: der Derivatisierung von Aminosäuren mit o-Phthaldialdehyd (OPA), Injektion der Probe auf die Trennsäule und Trennung/Detektion der Bestandteile des Reaktorausflusses. Die für die Experimente verwendeten Verbindungen waren Arginin (0,48 mM), Glycin (0,58 mM) und OPA (5,1 mM; Sigma Chemical Co.). Der Puffer in allen drei Reservoirs war 20 mM Natriumtetraborat mit 2% (v/v) Methanol und 0,5% (v/v) 2-Mercaptoethanol. 2-Mercaptoethanol wird dem Puffer als ein Reduktionsmittel für die Derivatisierungsreaktion zugegeben.
  • Zum Implementierung der Reaktion wurden die Reservoirs 12F, 14F, 16F, 18F und 20F gleichzeitig mit gesteuerten Spannungen von 0,5 HV, 0,5 HV, HV, 0,2 HV bzw. Erdung versorgt. Diese Konfiguration erlaubte den niedrigsten Potentialabfall über die Reaktionskammer 42F (25 V/cm für an den Mikrochip angelegte 1,0 kV) und den höchsten über den Trennkanal 34F (300 V/cm) für an den Mikrochip angelegte 1,0 kV) ohne signifikantes Auslaufen des Produkts in den Trennkanal, wenn man das gesteuerte Injektionssystem verwendete. Der Spannungsteiler, der verwendet wurde, um die an jedes der Reservoirs angelegten Potentiale aufzubauen, besaß einen Gesamtwiderstand von 100 MΩ mit 10 MΩ-Teilern. Der Analyt aus dem ersten Reser voir 12F und das Reagens aus dem zweiten Reservoir 14F werden elektroosmotisch in die Reaktionskammer 42F mit einem volumetrischen Verhältnis von 1:1,06 gepumpt. Daher sind die Lösungen aus den Analyten- und Reagenzienreservoirs 12F, 14F um einen Faktor von ≈ 2 verdünnt. Puffer wurde gleichzeitig durch Elektroosmose aus dem Pufferreservoir 16F in Richtung der Analytenabfall- und Abfallreservoirs 18F, 20F gepumpt. Dieser Pufferstrom verhindert, daß das neu gebildete Produkt in den Trennkanal 34F ausläuft.
  • Bevorzugt wird ein gesteuertes Injektionssystem, wie es oben unter Bezugnahme auf 3 beschrieben ist, verwendet, um Auslauf aus der Reaktionskammer 42F in den Trennkanal 34F zu injizieren. Das Potential an dem Pufferreservoir 16F wird einfach für eine kurze Zeitdauer (0,1 bis 1,0 Sekunden) erdfrei geschaltet, und Probe wandert in den Trennkanal 34F. Zum Abreißen des Injektionspfropfens wird das Potential an dem Pufferreservoir 16F erneut angelegt. Die Länge des Injektionspfropfens ist eine Funktion sowohl der Zeit der Injektion als auch der elektrischen Feldstärke. Mit dieser Konfiguration des angelegten Potentials erzeugt die Reaktion der Aminosäuren mit dem OPA kontinuierlich frisches Produkt, das zu analysieren ist.
  • Ein wesentlicher Nachteil vieler Kapillarelektroforeseexperimente war die schlechte Reproduzierbarkeit der Injektionen. Weil das Mikrochipinjektionsverfahren computergesteuert wird und das Injektionsverfahren das öffnen eines einzelnen Hochspannungsschalters umfaßt, können hierin die Injektionen zeitlich genau gesteuerte Ereignisse sein. 26 zeigt die Reproduzierbarkeit der injizierten Menge (% relative Standardabweichung, % rsd, für die integrierten Bereiche der Peaks) sowohl für Arginin als auch für Glycin bei Injektionsfeldstärken von 0,6 und 1,2 kV/cm und Injektionszeiten im Bereich von 0,1 bis 1,0 Sekunden. Für Injektionszeiten von mehr als 0,3 Sekunden liegt die prozentuale relative Standardabweichung unter 1,8%. Dies ist mit beschriebenen Werten für kommerzielle, automatisierte Kapillarelektroforeseinstrumente vergleichbar. Jedoch haben Injektionen, die auf dem Mikrochip durchgeführt werden, ≈ 100-fach geringeres Volumen, z. B. 100 pl auf dem Mikrochip gegenüber 10 nl auf einem kommerziellen Instrument. Ein Teil dieser Fluktuation ist auf die Stabilität des Lasers zurückzuführen, welche ≈ 0,6% beträgt. Für Injektionszeiten > 0,3 Sekunden scheint der Fehler unabhängig von der injizierten Verbindung und der Injektionsfeldstärke zu sein.
  • 27 zeigt die Überlagerung von drei elektroforetischen Trennungen von Arginin und Glycin nach einer der Säule vorgeschalteten Derivatisierung auf dem Mikrochip mit OPA mit einer Trennfeldstärke von 1,8 kV/cm und einer Trennlänge von 10 mm. Die Trennfeldstärke ist die elektrische Feldstärke in dem Trennkanal 34F während der Trennung. Die Feldstärke in der Reaktionskammer 42F beträgt 150 V/cm. Die Reaktionszeiten für die Analyten stehen in umgekehrtem Verhältnis zu ihren Mobilitäten, z. B. für Arginin beträgt die Reaktionszeit 4,1 Sekunden, und für Glycin beträgt die Reaktionszeit 8,9 Sekunden. Die Volumina der injizierten Pfropfen waren 150 und 71 pl für Arginin bzw. Glycin, was 35 und 20 fmol der auf den Trennkanal 34F injizierten Aminosäuren entspricht. Der gesteuerte Injektor erlaubt, daß schneller aufeinanderfolgende Injektionen durchgeführt werden. In diesem speziellen Fall könnte alle 4 Sekunden eine Analyse durchgeführt werden. Die beobachteten elektroforetischen Mobilitäten für die Verbindungen werden durch eine lineare Anpassung an die Variation der linearen Geschwindigkeit mit der Trennfeldstärke bestimmt. Die Steigungen waren 29,1 und 13,3 mm2/(kV-as) für Arginin bzw. Glycin. Es wurde kein Hinweis auf Stromwärme beobachtet, wie es durch die Linearität der Geschwindigkeit gegenüber der Feldstärkedaten angedeutet wird. Eine lineare Anpassung produzierte Korrelationskoeffizienten von 0,999 für Arginin und 0,996 für Glycin für Trennfeldstärken von 0,2 bis 2,0 kV/cm.
  • Mit steigenden Potentialen, die an das Mikrochiplaborsystem 10F angelegt werden, steigen die Feldstärken in der Reaktionskammer 42F und dem Trennkanal 34F. Dies führt zu kürzeren Verweilzeiten der Reaktanten in der Reaktionskammer und schnelleren Analysezeiten für die Produkte. Durch Variieren der an den Mikrochip angelegten Potentiale können die Reaktionskinetiken studiert werden. Die Veränderung der erzeugten Produktmenge mit der Reaktionszeit ist in 28 aufgetragen. Die Antwort ist die integrierte Fläche des Peaks, korrigiert hinsichtlich der Verweilzeit in dem Detektorbeobachtungsfenster und der Photobleichung des Produkts. Der Versatz zwischen den Daten für das Arginin und das Glycin in 28 ist in erster Linie auf den Unterschied in den injizierten Mengen zurückzuführen, d. h. verschiedene elektroforetische Mobilitäten für die Aminosäuren. Es wurde ein zehnfacher Überschuß an OPA verwendet, um Reaktionsbedingungen von pseudo-erster Ordnung zu erhalten. Die Steigungen der an die Daten angepaßten Geraden entsprechen den Raten der Derivatisierungsreaktion. Die Steigungen sind 0,13 s–1 für Arginin und 0,11 s–1 für Glycin, was Halbwertszeiten der Reaktion von 5,1 bzw. 6,2 Sekunden entspricht. Diese Halbwertszeiten der Reaktion sind vergleichbar mit den zuvor für Alanin beschriebenen 4 Sekunden. Wir haben keine zuvor beschriebenen Daten für Arginin oder Glycin gefunden.
  • Diese Ergebnisse zeigen den potentiellen Nutzen integrierter mikrotechnisch hergestellter Systeme zur Durchführung chemischer Verfahren. Die in 28 präsentierten Daten können unter Computersteuerung innerhalb von etwa fünf Minuten produziert werden, wobei größenordnungsmäßig 100 nl Reagens verbraucht werden. Diese Ergebnisse sind beispiellos hinsichtlich Automatisierung, Geschwindigkeit und Volumen für chemische Reaktionen.
  • DNA-Analyse
  • Zur Demonstration eines nützlichen biologischen Analyseverfahrens werden ein Restriktionsverdau und ein elektroforetisches Größenbestimmungsexperiment nacheinander auf dem in 29 gezeigten integrierten biochemischen Reaktor/Elektroforese-Mikrochipsystem 10G durchgeführt. Das Mikrochiplaborsystem 10G ist zu dem in 25 gezeigten Laborsystem identisch mit der Ausnahme, daß der Trennkanal 34G des Laborsystems 10G einem gewundenen Weg folgt. Die Sequenz für das Plasmid pBR322 und die Erkennungssequenz des Enzyms Hinf I sind bekannt. Nach einem Verdau wird eine Bestimmung der Fragmentverteilung durchgeführt, indem die Verdauprodukte unter Verwendung von Elektroforese in einem Siebmedium in dem Trennkanal 34G getrennt werden. Für diese Experimente wird Hydroxyethylzellulose als das Siebmedium verwendet. An einem festen Punkt stromabwärts in dem Trennkanal 34G werden wandernde Fragmente unter induzierter Fluoreszenz mittels eines Lasers auf dem Chip mit einem interkalierenden Farbstoff, Thiazolorangedimer (TOTO-1), als das Fluorophor abgefragt.
  • Die Reaktionskammer 42G und der Trennkanal 34G, die in 29 gezeigt sind, sind 1 bzw. 67 mm lang, haben eine Breite bei halber Höhe von 60 μm und eine Tiefe von 12 μm. Darüber hinaus sind die Kanalwände mit Polyacrylamid beschichtet, um elektroosmotischen Fluß und Adsorption zu minimieren. Elektroferogramme werden unter Verwendung von Einzelpunktdetektion mittels laserinduzierter Fluoreszenzdetektion erzeugt. Ein Argonionenlaser (10 mW) wird auf einen Punkt auf dem Chip unter Verwendung einer Linse (100 mm Brennwerte) fokussiert. Das Fluoreszenzsignal wird unter Verwendung einer 21× Objektivlinse (N. A. = 0,42) gesammelt, gefolgt von räumlichem Filtern (0,6 mm Blendendurchmesser) und Spektralfiltern (560 nm Bandpaß, 40 nm Bandbreite) und Messen unter Verwendung eines Photomultiplierröhrchens (PMT). Die Datenerfassungs- und Spannungsschalteinrichtung sind computergesteuert. Der Reaktionspuffer enthält 10 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesiumacetat und 50 mM Kaliumacetat. Der Reaktionspuffer wird in die in 29 gezeigten DNA-, Enzym- und Abfall-1-Reservoirs 12G, 14G und 18G gegeben. Der Trennpuffer enthält 9 mM Tris-Borat mit 0,2 mM EDTA und 1% (w/v) Hydroxyethylzellulose. Der Trennpuffer wird in die Puffer- und Abfall-2-Reservoirs 16F und 20F gegeben. Die Konzentrationen des Plasmids pBR322 und des Enzyms Hinf I betragen 125 ng/μl bzw. 4 Einheiten/μl. Die Verdaus und Trennungen werden bei Raumtemperatur (20°C) durchgeführt.
  • Die DNA und das Enzym werden elektroforetisch in die Reaktionskammer 42G aus ihren entsprechenden Reservoirs 12G, 14G durch Anlegen eines geeigneten elektrischen Potentials geladen. Die relativen Potentiale an den DNA-(12G), Enzym-(14G), Puffer-(16G), Abfall-1-(18G) und Abfall-2-(20G) Reservoirs betragen 10%, 10%, 0, 30% bzw. 100%. Aufgrund der Unterschiede der elektroforetischen Mobilität zwischen der DNA und dem Enzym wird die Beladungsdauer ausreichend lang ausgestaltet, um ein Gleichgewicht zu erreichen. Aufgrund des kleinen Volumens der Reaktionskammer 42G, 0,7 nl, findet auch ein schnelles Diffusionsmischen statt. Der elektroosmotische Fluß wird durch die kovalente Immobilisierung von linearem Polyacrylamid minimiert, so daß nur Anionen aus den DNA- und Enzymreservoirs 12G, 14G in die Reaktionskammer 42G bei den verwendeten Potentialverteilungen wandern. Der Reakti onspuffer, welcher Kationen enthält, die für die enzymatischen Verdaus erforderlich sind, z. B. Mg2+, wird ebenfalls in dem Abfall-1-Reservoir 18G untergebracht. Dies ermöglicht, daß sich die Kationen in die Reaktionskammer im Gegenstrom zu der DNA und dem Enzym während des Beladens der Reaktionskammer ausbreiten. Der Verdau wird wegen der relativ kurzen Durchtrittszeit der DNA durch die Reaktionskammer statisch durchgeführt, indem nach dem Beladen der Reaktionskammer 42G alle elektrischen Potentiale entfernt werden.
  • Nach der Dauer des Verdaus wandern die Produkte in den Trennkanal 34F zur Analyse durch Anheben der Spannungen an den Puffer- und Abfall-1-Reservoirs 16F, 18F. Die Injektion besitzt eine Mobilitätsvorspannung, wo die kleineren Fragmente bevorzugt gegenüber den größeren Fragmenten injiziert werden. In diesen Experimenten wird geschätzt, daß die Injektionspfropfenlänge für das 75 Basenpaare (bp) lange Fragment 0,34 mm beträgt, wogegen es für das 1632 bp Fragment nur 0,22 mm sind. Diese Pfropfenlängen entsprechen 34% bzw. 22% des Reaktionskammervolumens. Die gesamten Inhalte der Reaktionskammer 42F können unter derzeitigen Trennbedingungen nicht analysiert werden, weil der Beitrag der Injektionspfropfenlänge zu der Bodenhöhe überwältigend wäre.
  • Nach Verdau und Injektion auf den Trennkanal 34F werden die Fragmente unter Verwendung von 1,0% (w/v) Hydroxyethylzellulose als Siebmedium aufgelöst. 29 zeigt ein Elektroferogramm der Restriktionsfragmente des Plasmides pBR322 nach einem zweiminütigen Verdau mit dem Enzym Hinf I. Um eine effiziente Färbung der doppelstrangigen DNA auf der Säule nach dem Verdau, aber vor dem Abfragen zu ermöglichen, wird der interkalierende Farbstoff TOTO-I (1 μM) nur in das Abfall-2-Reservoir 20G gegeben und wandert im Gegenstrom zu der DNA. Wie erwartet steigt die relative Intensität der Banden mit zunehmender Fragmentgröße an, weil in den größeren Fragmenten mehr Interkalationsstellen vorhanden sind. Die nicht aufgelösten 220/221 und 507/511 bp Fragmente haben aufgrund der Bandenüberlappung höhere Intensitäten als benachbarte Einzelfragmentpeaks. Die Reproduzierbarkeit der Migrationszeiten und Injektionsvolumina beträgt 0,55 bzw. 3,1% relative Standardabweichung (% rsd) für fünf wiederholte Analysen.
  • Diese Demonstration eines Mikrochiplaborsystems 10G, das Plasmid-DNA-Restriktionsfragmentanalyse leistet, zeigt die Möglichkeit der Automatisierung und Miniaturisierung anspruchsvollerer biochemischer Verfahren. Dieses Experiment repräsentiert die anspruchsvollste integrierte Mikrochipeinrichtung für chemische Analyse, die bis heute gezeigt wurde. Die Vorrichtung mischt ein Reagens mit einem Analyten, inkubiert das Analyt/Reagens-Gemisch, markiert die Produkte und analysiert die gesamten Produkte unter Computersteuerung, während es 10.000-mal weniger Material verbraucht als das typische Laborverfahren mit kleinem Volumen.
  • Allgemein kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, verschiedene Fluide, die in verschiedenen Anschlüssen oder Reservoirs enthalten sind, zu mischen. Dies könnte für ein Flüssigchromatographietrennexperiment verwendet werden, gefolgt von der Säule nachgeschalteten Markierungsreaktionen, in denen verschiedene chemische Lösungen mit einem gegebenen Volumen in den primären Trennkanal gepumpt werden, und andere Reagenzien oder Lösungen können zu verschiedenen Zeiten in den Strom injiziert oder gepumpt werden, um in präzisen und bekannten Konzentrationen gemischt zu werden. Zur Ausführung dieses Verfahrens ist es notwendig, Losungen in den verschiedenen Kanälen genau zu steuern und zu manipulieren.
  • Einer Trennung vor-/nachgeschaltetes Reaktorsystem
  • 31 zeigt das gleiche Mikrochiplaborsystem 10 mit sechs Anschlüssen, das in 1 gezeigt ist, welches den Vorteil dieses neuen Mischsystems nutzen könnte. Besondere Merkmale sind an den verschiedenen Anschlüssen befestigte Lösungsmittelreservoirs. Dieses Laborsystem könnte potentiell für ein Flüssigchromatographietrennungsexperiment, gefolgt von der Säule nachgeschalteten Markierungsreaktionen verwendet werden. In solch einem Experiment würden Reservoirs 12 und 14 Lösungsmittel enthalten, die in einem Flüssigchromatographielösungsmittelprogrammtyp der Trennung verwendet würden, z. B. Wasser und Acetonitril.
  • Der Kanal 34, der mit dem Abfallreservoir 20 und mit den zwei Kanälen 26 und 28, welche die Analyten- und Lösungsmittelreservoirs 12 und 14 verbinden, verbunden ist, ist der primäre Trennkanal, d. h. wo das Flüssigchromatographieexperiment stattfinden würde. Die sich kreuzenden Kanäle 30, 32, welche die Puffer- und Analytenabfallreservoirs 16 und 18 verbinden, werden dazu verwendet, eine Injektion in den Flüssigchromatographie- oder Trennkanal 34 durchzuführen, wie es oben diskutiert wird. Schließlich werden das Reservoir 22 und dessen Kanal 36, die mit dem Trennkanal 34 verbunden sind, dazu verwendet, Reagens hinzuzufügen, welches in Anteilen zugegeben wird, um die in dem Trennkanal getrennten Spezies detektierbar zu machen.
  • Zur Durchführung dieses Verfahrens ist es notwendig, Lösungen in den verschiedenen Kanälen genau zu steuern und zu manipulieren. Die oben beschriebenen Ausführungsformen verwendeten sehr kleine Volumina an Lösung (≈ 100 pl) aus den Reservoirs 12 und 14 und injizierten sie genau in den Trennkanal 34. Für diese verschiedenen Szenarien muß ein vorgegebenes Volumen an Lösung von einem Kanal in einen anderen überführt werden. Zum Beispiel erfordert Lösungsmittelprogrammierung für Flüssigchromatographie oder Reagenzienzugabe für der Säule nachgeschaltete Markierungsreaktionen, daß Lösungsströme in präzisen und bekannten Konzentrationen gemischt werden.
  • Das Mischen verschiedener Lösungsmittel in bekannten Verhältnissen kann gemäß der vorliegenden Erfindung durch Steuerung von Potentialen, welche letztendlich die elektroosmotischen Flüsse steuern, wie es in Gleichung 1 angegeben ist, durchgeführt werden. Gemäß Gleichung 1 muß die elektrische Feldstärke bekannt sein, um die lineare Geschwindigkeit des Lösungsmittels zu bestimmen. Allgemein wird bei diesen Arten von Fluidmanipulationen ein bekanntes Potential oder eine bekannte Spannung an ein vorgegebenes Reservoir angelegt. Die Feldstärke kann aus der angelegten Spannung und den Merkmalen des Kanals berechnet werden. Darüber hinaus muß der Widerstand oder die Leitfähigkeit des Fluides in den Kanälen ebenfalls bekannt sein.
  • Der Widerstand eines Kanals ist durch Gleichung 2 gegeben, worin R der Widerstand, κ der spezifische Widerstand, L die Länge des Kanals und A die Querschnittsfläche ist.
  • Figure 00430001
  • Fluide werden üblicherweise durch die Leitfähigkeit charakterisiert, welche nur der reziproke Wert des Widerstands ist, wie es in Gleichung 3 gezeigt ist. In Gleichung 3 ist K die elektrische Leitfähigkeit, ρ ist die spezifische Leitfähigkeit, A ist die Querschnittsfläche, und L ist die Länge, wie oben.
  • Figure 00430002
  • Unter Anwendung des Ohmschen Gesetzes und der Gleichungen 2 und 3 können wir die Feldstärke in einem bestimmten Kanal i als den Spannungsabfall über den Kanal, geteilt durch dessen Länge, angeben, welche gleich dem Strom Ii durch Kanal i, multipliziert mit dem spezifischen Widerstand dieses Kanals, geteilt durch die Querschnittsfläche, ist, wie es in Gleichung 4 gezeigt ist.
  • Figure 00430003
  • Daher kann, wenn der Kanal sowohl bezüglich der Abmessungen als auch elektrisch charakterisiert ist, der Spannungsabfall über den Kanal oder der Strom durch den Kanal dazu verwendet werden, die Lösungsmittelgeschwindigkeit oder die Flußrate durch den Kanal zu bestimmen, wie es in Gleichung 5 ausgedrückt ist. Es ist auch festzuhalten, daß der Fluidfluß von dem Zeta-Potential der Oberfläche und somit von dem chemischen Aufbau des Fluides und der Oberfläche abhängt. Vi ~ Ii ~ Fluß
  • Offensichtlich hängen die spezifische Leitfähigkeit κ oder der spezifische Widerstand ρ von den Eigenschaften der Lösung ab, die von Kanal zu Kanal variieren könnten. In vielen CE-Anwendungen dominieren die Eigenschaften des Puffers die elektrischen Eigenschaften des Fluides, und daher ist die Leitfähigkeit konstant. Im Falle von Flüssigchromatographie, wo Lösungsmittelprogrammierung durchgeführt wird, könnten die elektrischen Eigenschaften der zwei mobilen Phasen erheblich voneinander abweichen, wenn kein Puffer verwendet wird. Während eines Lösungsmittelprogrammierungslaufs, bei dem sich der Molanteil des Gemisches ändert, kann sich die spezifische Leitfähigkeit des Gemisches in einer nichtlinearen Art und Weise ändern, jedoch wird sie sich von der spezifischen Leitfähigkeit des einen reinen Lösungsmittels zu dem anderen monoton ändern. Die tatsächliche Veränderung der Leitfähigkeit mit dem Molanteil hängt zusätzlich zu der spezifischen Leitfähigkeit der einzelnen Ionen von der Dissoziationskonstante des Lösungsmittels ab.
  • Wie es oben beschrieben ist, könnte die schematisch in 31 gezeigte Vorrichtung z. B. zur Durchführung von Gradientenelutionsflüssigchromatographie mit der Säule nachgeschalteter Markierung zu Detektionszwecken verwendet werden. Die 31(a), 31(b) und 31(c) zeigen die Fluidflußerfordernisse für eine Ausführung der in einem Flüssigchromatographieexperiment, wie es oben erwähnt ist, involvierten Aufgaben. Die Pfeile in den Figuren zeigen die Richtung und die relative Größe der Strömung in den Kanälen. In 31(a) wird ein Volumen des Analyten aus dem Analytenreservoir 16 in die Trennkreuzung 40 geladen. Zur Durchführung einer gedrängten Injektion ist es notwendig, die Probe von dem Analytenreservoir 16 über die Kreuzung zu dem Analytenabfallreservoir 18 zu transportieren. Um das Analytenvolumen zu begrenzen, muß zusätzlich Material von dem Trennkanal 34 und den Lösungsmittelreservoirs 12, 14 in Richtung der Kreuzung 40 fließen, wie es gezeigt ist. Der Fluß von dem ersten Reservoir 12 ist viel größer als derjenige von dem zweiten Reservoir 14, weil dies die anfänglichen Bedingungen für ein Gradientenelutionsexperiment sind. Am Anfang des Gradientenelutionsexperimentes ist es erwünscht zu verhindern, daß das Reagens in dem Reagenzienreservoir 22 in den Trennkanal 34 eintritt. Um solch einen Reagenzienfluß zu verhindern, ist ein geringer Fluß an Puffer aus dem Abfallreservoir 20, der in Richtung des Reagenzienkanals 36 gerichtet ist, erwünscht, und dieser Fluß sollte so nahe bei 0 liegen wie möglich. Nachdem ein repräsentatives Analytvolumen an der Injektionskreuzung 40 präsentiert wurde, kann die Trennung fortgeführt werden.
  • In 31(b) ist der Betriebs-(Trenn-)Modus gezeigt, bei dem Lösungsmittel aus den Reservoirs 12 und 14 durch die Kreuzung 40 und entlang des Trennkanals 34 fließen. Zusätzlich fließen die Lösungsmittel in Richtung der Reservoirs 4 und 5, um eine saubere Injektion des Analyten in den Trennkanal 34 durchzuführen. Ein geeigneter Fluß von Reagens aus dem Reagenzienreservoir 22 wird ebenfalls in Richtung des Trennkanals gerichtet. Die Anfangsbedingung, wie sie in 31(b) gezeigt ist, ist mit einem großen Molanteil an Lösungsmittel 1 und einem kleinen Molanteil an Lösungsmittel 2. Die an die Lösungsmittelreservoirs 12, 14 angelegten Spannungen werden als eine Funktion der Zeit verändert, so daß die Anteile an Lösungsmitteln 1 und 2 von einem Überschuß an Lösungsmittel 1 nach hauptsächlich Lösungsmittel 2 verändert werden. Dies ist in 31(c) gezeigt. Diese letztgenannte monotone Veränderung der angelegten Spannung bewirkt das Gradientenelutionsflüssigchromatographieexperiment. Wenn die isolierten Bestandteile den Reagenzienzugabekanal 36 passieren, kann eine geeignete Reaktion zwischen diesem Reagens und dem isolierten Material unter Bildung einer detektierbaren Spezies stattfinden.
  • 32 zeigt, wie die Spannungen an den verschiedenen Reservoirs für ein hypothetisches Gradientenelutionsexperiment verändert werden. Die in diesem Diagramm gezeigten Spannungen geben nur relative Höhen und nicht absolute Spannungen an. In dem Beladungsmodus des Vorgangs werden statische Spannungen an die verschiedenen Reservoirs angelegt. Lösungsmittelfluß aus allen Reservoirs, ausgenommen dem Reagenzienreservoir 22, findet in Richtung des Analytenabfallreservoirs 18 statt. Daher hat das Analytenreservoir 18 das niedrigste Potential, und alle anderen Reservoirs haben ein höheres Potential. Das Potential des Reagenzienreservoirs sollte ausreichend unterhalb desjenigen des Abfallreservoirs 20 liegen, um nur einen geringfügigen Fluß in Richtung des Reagenzienreservoirs zu tiefern. Die Spannung an dem zweiten Lösungsmittelreservoir 14 sollte ausreichend groß bezüglich der Höhe sein, um einen Nettofluß in Richtung der Injektionskreuzung 40 zu liefern, aber der Fluß sollte eine geringe Größe haben.
  • Beim Bewegen in den Betriebs-(Start-)Modus, wie er in 31(b) gezeigt ist, werden die Potentiale erneut eingestellt, wie es in 32 gezeigt ist. Der Fluß ist nun so, daß sich das Lösungsmittel aus den Lösungsmittelreservoirs 12 und 14 entlang des Trennkanals 34 in Richtung des Abfallreservoirs 20 bewegt. Es findet auch ein geringfügiger Lösungsmittelfluß weg von der Injektionskreuzung 40 in Richtung der Analyten- und Analytenabfallreservoirs 16 und 18 und ein geeigneter Reagenzienfluß aus dem Reagenzienreservoir 22 in den Trennkanal 34 statt. Das Abfallreservoir 20 muß sich nun bei dem minimalen Potential und das erste Lösungsmittelreservoir 12 bei dem höchsten Potential befinden. Alle anderen Potentiale werden so eingestellt, daß die Fluidflußrichtungen und -größen geliefert werden, wie sie in 31(b) gezeigt sind. Wie es in 32 gezeigt ist, werden auch die an die Lösungsmittelreservoirs 12 und 14 angelegten Spannungen monoton so verändert, daß sie sich von den Bedingungen eines großen Molanteils an Lösungsmittel 1 zu einem großen Molanteil an Lösungsmittel 2 verändern.
  • Am Ende des Lösungsmittelprogrammierungslaufes ist die Vorrichtung nun bereit für ein Zurückschalten in den Injektionszustand zum Beladen einer weiteren Probe. Die Spannungsveränderungen, wie sie in 32 gezeigt sind, sollten nur erläutern, was getan werden könnte, um die verschiedenen Fluidflüsse in den 31(a)–(c) zu liefern. In einem tatsächlichen Experiment können einige der verschiedenen Spannungen in ihrer relativen Höhe stark abweichen.
  • Obwohl vorteilhafte Ausführungsformen zur Erläuterung der Erfindung ausgewählt wurden, ist für den Fachmann auf dem Gebiet klar, daß verschiedene Veränderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen, wie er in den anhängenden Patentansprüchen definiert ist.

Claims (6)

  1. Verfahren zum Betreiben eines Mikrochip-Laborsystems, welches einen Aufbau mit integrierten Kanälen (24, 36) in Flüssigkeitsverbindung mit wenigstens fünf Reservoirs (12, 14, 16, 18, 20) für die Aufnahme von flüssigen Materialien, ein System (46), welches so ausgestaltet ist, daß es gleichzeitig elektrische Potentiale auf wenigstens die fünf Reservoirs anlegt, um die flüssigen Materialien durch das System zu transportieren, und eine Reaktionskammer (42) umfaßt, wobei ein erstes Reservoir (12) für das Lagern eines Reagens und ein zweites Reservoir (14) für das Lagern eines Reagens über erste (26) bzw. zweite Kanäle (28) mit einer ersten Kreuzung (38) in Flüssigkeitsverbindung stehen, um Reagenzien an die erste Kreuzung zuzuführen, ein drittes (Puffer-)Reservoir (16) und ein viertes (Abfall-)Reservoir (18) über dritte (30) bzw. vierte Kanäle (32) mit einer zweiten Kreuzung (40) in Flüssigkeitsverbindung stehen, wobei die Reaktionskammer in Flüssigkeitsverbindung mit und zwischen der ersten und der zweiten Kreuzung (38, 40) angeordnet ist, und ein Trennkanal (34) die Flüssigkeitsverbindung der zweiten Kreuzung (40) mit einem fünften (Abfall-)Reservoir (20) bereitstellt, um in der Reaktionskammer (42) erzeugte Reaktionsprodukte abzutrennen, wobei das Verfahren umfaßt, daß man das System so betreibt, daß elektrische Potentiale auf die Reservoirs angelegt werden, um Reagenzien von dem ersten (12) und dem zweiten Reservoir (14) über die erste Kreuzung (38) zu der Reaktionskammer zu transportieren, um die Reagenzien zu mischen und/oder umzusetzen, und dann die Reaktionsprodukte oder die gemischten Reagenzien zur Abtrennung zu dem Trennkanal (34) zu transportieren.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, welches das Mischen der Reagenzien an der ersten Kreuzung (38) umfaßt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Reaktionskammer (42F) breiter ist als der Trennkanal.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, welches das Zuführen von Reagens aus einem sechsten Reservoir (22) über einen sechsten Kanal (44) zu einer Mischverbindungsstelle (44) des sechsten Kanals mit dem Trennkanal (34) und das Durchführen eines nach der Abtrennung erfolgenden Mischens des Reagens aus dem sechsten Reservoir mit den abgetrennten Reaktionsprodukten umfaßt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, welches die Verwendung eines Detektors (D) umfaßt, um das Gemisch aus Reagens und abgetrennten Produkten zwischen der Mischverbindungsstelle (44) und dem fünften Reservoir zu analysieren.
  6. Verfahren zum Betreiben des Systems nach Anspruch 1, 2 oder 3, welches die folgenden Stufen umfaßt: Bereitstellen von ersten und zweiten Reagenzien in dem ersten bzw. dem zweiten Reservoir (12 bzw. 14), Bereitstellen eines Puffers in dem dritten Reservoir (16), Anlegen eines ersten Satzes von Potentialen auf die Reservoirs, um die Reagenzien aus dem ersten und dem zweiten Reservoir in die Reaktionskammer zu bringen und um den Puffer aus dem dritten Reservoir (16) zu dem vierten (18) und dem fünften Reservoir (20) zu bewegen, Anlegen eines zweiten Satzes von Potentialen auf die Reservoirs, so daß Reaktionsprodukte sich aus der Reaktionskammer (42F) zu dem Trennkanal (34F) bewegen, und erneutes Anlegen des ersten Satzes von Potentialen, um die Reaktionsprodukte in dem Trennkanal zu dem fünften Reservoir zu bewegen.
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