DE69535554T2

DE69535554T2 - Lumineszente lanthanidenchelate und verfahren zu ihrer verwendung

Info

Publication number: DE69535554T2
Application number: DE69535554T
Authority: DE
Inventors: Paul R. Berkeley SELVIN; John Berkeley HEARST
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1994-06-29
Filing date: 1995-06-29
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2015-06-30
Also published as: US5656433A; AU688928B2; EP0767912A1; DE69535554D1; CA2193501A1; ES2290953T3; US5622821A; US5639615A; CA2193501C; WO1996000901A1; EP0767912A4; EP0767912B1; JPH10505820A; JP3814291B2; AU2956795A

Description

EINLEITUNG
Gebiet der Erfindung
Das Gebiet dieser Erfindung sind lumineszente Lanthanoidchelatoren.
Hintergrund
Lumineszente (einschließlich fluoreszierende und phosphoreszierende) Marker finden vielfach Anwendung in Wissenschaft, Medizin und Ingenieurwesen. In zahlreichen Situationen stellen diese Marker kostengünstigen Ersatz für Markierungen mit radioaktiven Atomen, Chromogene, strahlungsdichte Farbstoffe etc. bereit. Verbesserungen bei der fluorimetrischen Instrumentierung weisen gesteigerte erzielbare Empfindlichkeiten und zulässige quantitative Analyse auf.
Die einzige signifikanteste Beschränkung für die Verwendung von Lumineszenz-Markern ist vielleicht die Erzeugung eines akzeptablen Signal-Rausch-Verhältnisses. Marker abhängige Eigenschaften wie etwa Höchstwerte für Absorption und Emission, Stokessche Verschiebung, Quantenwirkungsgrad etc. bewirken die Leichtigkeit des Unterscheidungssignals der Auto- oder Hintergrundfluoreszenz. Folglich besteht ein fortlaufender Bedarf an der Bereitstellung von verbesserten Lumineszenz-Markern, besonders Lumineszenz-Markern mit langlebiger Lumineszenz und/oder großen Stokesschen Verschiebungen mit langen Wellenlängen-Emissionen. Andere nützliche und wünschenswerte Eigenschaften umfassen: einfache und kosteneffektive Synthese; chemische Stabilität, besonders in einer wässrigen Umgebung; leichte Anbringbarkeit an eine große Vielfalt von Makromolekülen einschließlich Proteinen und Nukleinsäuren; effiziente Anregbarkeit durch einen geeigneten Laser; Fähigkeit zur intensiven Lumineszenz; die Fähigkeit, als gute lumineszente Resonanzenergietransferdonoren zu wirken, Ermöglichung der Bestimmung von molekularen Abständen über 100 Å und Nützlichkeit als durch Strahlung gehärtete Fluorophore in der Röntgenmikroskopie.
Relevante Literatur
Relevante Patente umfassen die US Patente Nr. 4,637,988 (1987) und 4,837,169 (1989). Für eine Patentanmeldung, die Lanthanoidkryptate als Energietransferdonoren verwendet, siehe U.S. Patent 5,512 493 (1996).
DTPA-pAS-Tb wird in Bailey et al. (1984) Analyst 109, 1449-1450 gemeldet. Für Hintergrundinformationen bezüglich anderen Lanthanoidchelatoren siehe Diamandis (1992) Analyst 117, 1879-1884, Canfi et al. (1989) Analyst 114, 1405-1406, Ando et al. (1993) Biochimica et Biophysica Acta. 1102, 186-194, Georges und Ghazarian (1993) Analytica Chimica Acta, 276, 401-409, Mathis et al. (1993) Clin. Chem, 39, 1953 und Desai et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 11032, Seveus et al. (1992) 13, 329-338, Saavedra und Picozza (1989) Analyst 114, 835-838, von Brenndorff et al. (1993) in Proceedings, 4th Intnl. Conf. an X-ray Microscopy, Chernogolovoka, Moscow District, Russia, Clark et al. (1993) Analytical Biochemistry 210, 1-6.
Für einen aktuellen Überblick über Fluoreszenzresonanzenergietransfer siehe Selvin (1994) Fluorescence Resonance Energy Transfer, in Biochemical Spectroscopy, a volume of Methods in Enzymology, Academic Press, Hrsg. Kenneth Sauer, im Druck.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Folgendes bereit:
ein Lanthanoidchelat, das einen kovalent mit einem Sensibilisator verbundenen Lanthanoidchelator beinhaltet, wobei der Chelator eine Vielzahl von Carboxylat- oder Phosphonatgruppen beinhaltet, wobei das Chelat fähig ist, ein Lanthanoid mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁶ M^–1 zu binden, wobei ein Komplex aus dem Chelat und dem Lanthanoid zur erhöhten Lanthanoidlumineszenz fähig ist, und wobei der Sensibilisator durch die folgende Allgemeinformel dargestellt wird:
wobei X ein Atom aus der Periodengruppe 5 oder 6 beinhaltet, wobei ein erstes Kohlenstoffatom in Position 2-8 des Sensibilisators, das das Kohlenstoffatom in Position 2 oder 4 ist, durch eine doppelte kovalente Bindung mit einem Sauerstoffatom substituiert wird, und wobei ein einzelnes, zweites Kohlenstoffatom in Position 2-8 des Sensibilisators, das das Kohlenstoffatom in Position 7 ist, mit einer Verknüpfungsgruppe substituiert wird, durch die der Sensibilisator kovalent mit dem Chelator verbunden ist,
wobei ein Komplex des Chelats und eines Lanthanoids zum Binden des Chelats mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁶ M^–1 zu mindestens 500% größerer Lumineszenzintensität als das Lanthanoid fähig ist;
eine molekulare Markierung, die ein Chelat der Erfindung beinhaltet, das kovalent mit einem Analyt selektiven Reagens verbunden ist;
ein Verfahren zum Erhöhen der Lumineszenz eines Lanthanoids, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet: Bilden einer Mischung eines Lanthanoidchelats gemäß der Erfindung und eines Lanthanoids, das zum Binden des Chelats mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁸ M^–1 fähig ist, wobei ein lumineszenter Lanthanoidchelat-Lanthanoid-Komplex gebildet wird;
Verfahren zum Erkennen eines Analyts, der in einem Abschnitt einer Probe vorhanden sein kann, durch Lumineszenz, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet:
Kontaktieren eines Probenabschnitts mit einem lumineszenten Komplex eines Lanthanoidchelats der Erfindung und einem Lanthanoid, das fähig ist, das Chelat mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁸ M^–1 zu binden, wobei das Chelat kovalent mit einem Reagens verbunden ist, das zum selektiven Binden des Analyts fähig ist;
Inkubieren des Probenabschnitts unter Konditionen, bei denen das Reagens zum selektiven Binden des Analyts fähig ist;
Belichten des Probenabschnitts bei einer ersten Wellenlänge, die fähig ist, einen ersten elektronischen Übergang in dem Chelat zu induzieren;
Erkennen einer Lichtabgabe von dem Probenabschnitt bei einer zweiten Wellenlänge, wobei die zweite Wellenlänge länger als die erste Wellenlänge ist und aus einem zweiten elektronischen Übergang in dem Chelat resultiert;
wobei das Erkennen der Lichtabgabe mit der Anwesenheit des Probenabschnitts des Analyts korreliert; und
ein Verfahren zum Erkennen des Abstands zwischen einer ersten Position und einer zweiten Position in einem Abschnitt einer Probe durch Resonanzenergietransfer unter Verwendung eines lumineszenten Lanthanoidchelatdonors und eines organischen Resonanzenergieakzeptors, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet:
Belichten eines Probenabschnitts, der den Donor beinhaltet, der sich an der ersten Position befindet, und den Akzeptor, der sich an der zweiten Position befindet, bei einer ersten Wellenlänge, die fähig ist, einen ersten elektronischen Übergang in dem Donor zu induzieren, wobei der Donor einen Komplex eines Lanthanoidchelats gemäß der Erfindung und ein Lanthanoid, das fähig ist, das Chelat mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁸ M^–1 zu binden, und wobei die spektrale Überlappung der Emission des Donors und der Absorption des Akzeptors ausreichend ist, um den Energietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor wie durch erkennbares Quenchen der Lumineszenzintensität des Donors oder der Lebensdauer oder der erkennbaren Steigerung in der Lumineszenzintensität oder Lebensdauer des Akzeptors gemessen zu ermöglichen;
wobei mindestens eines von Folgendem erkannt wird:
die Intensität einer ersten Lichtabgabe von dem Probenabschnitt bei einer zweiten Wellenlänge, wobei die zweite Wellenlänge länger ist als die erste Wellenlänge und aus einem zweiten elektronischen Übergang in dem Donor resultiert, wobei die Intensität der ersten Lichtabgabe invers mit dem Abstand zwischen der ersten und zweiten Position des Probenabschnitts korreliert; und
die Intensität einer zweiten Lichtabgabe von dem Probenabschnitt bei einer dritten Wellenlänge, wobei die dritte Wellenlänge länger ist als die erste Wellenlänge und aus einem elektronischen Übergang in dem Akzeptor resultiert, wobei die Intensität der zweiten Lichtabgabe mit dem Abstand zwischen der ersten und zweiten Position des Probenabschnitts korreliert.
Die Lanthanoidchelate der Erfindung beinhalten folglich einen Lanthanoidchelator, der kovalent mit einem polynuklearen heterozyklischen aromatischen Sensibilisator der folgenden Allgemeinformel verbunden ist:
wobei X ein Atom aus der Periodengruppe 5 oder 6 beinhaltet.
Der Sensibilisator weist ein erstes Kohlenstoffatom in Position 2-8 auf, das durch eine doppelte kovalente Bindung mit einem Sauerstoffatom substituiert wird, und ein einzelnes, zweites Kohlenstoffatom in Position 2-8, das sich von dem ersten Kohlenstoffatom in Position 2-8 unterscheidet, das mit einer Verknüpfungsgruppe substituiert wird, durch die der Sensibilisator kovalent mit dem Chelator verbunden ist. Bei bevorzugten Chelaten weist der Sensibilisator ein substituiertes drittes Kohlenstoffatom in Position 2-8 auf, das sich von den ersten und zweiten Kohlenstoffatomen in Position 2-8 unterscheidet. Das erste Kohlenstoffatom in Position 2-8 ist das Kohlenstoffatom in Position 2 oder 4 und das zweite Kohlenstoffatom ist das Kohlenstoffatom in Position 7. Der Sensibilisator und der Chelator werden häufig durch eine Amin- oder Carboxylgruppe verbunden, und/oder das dritte Kohlenstoffatom in Position 2-8 ist der Kohlenstoff in Position 4 und wird durch einen Kohlenwasserstoff oder Halogen substituierten Kohlenwasserstoff substituiert. Beispielhafte Sensibilisatoren umfassen 2- oder 4-Quinolone, 2- oder 4-Cumarine oder Derivate davon, z. B. Carbostyril 124 (7-amino-4-methyl-2-quinolon), Cumarin 120 (7-amino-4-methyl-2-cumarin), Cumarin 124 (7-amino-4-(trifluoromethyl)-2-cumarin), etc.
Die Chelate sind dazu fähig, Komplexe mit hoher Affinität mit Lanthanoiden wie etwa Terbium oder Europium durch Chelatorgruppen wie etwa DTPA zu bilden. Die Chelatoren beinhalten eine Vielzahl von strukturell eingeschränkten anionischen Gruppen wie etwa Carboxylat- oder Phosphonatgruppen. Lösungen von Chelat-Lanthanoid-Komplexen sind zur intensiven Lumineszenz fähig. Die Chelate können an eine große Vielfalt von Verbindungen gekoppelt werden, um spezifische Markierungen, Sonden, diagnostische und/oder therapeutische Reagenzien etc. zu schaffen.
Chelatlanthanoidkomplexe sind als erkennbare Markierungen in einer großen Vielfalt von Anwendungen nützlich. Im Allgemeinen involvieren die Verfahren das Kontaktieren eines Probenabschnitts mit einem lumineszenten Komplex; Belichten des Probenabschnitts bei einer ersten Wellenlänge, die fähig ist, einen ersten elektronischen Übergang in dem Chelat zu induzieren und Erkennen einer Lichtabgabe von dem Probenabschnitt bei einer zweiten Wellenlänge, die länger als die erste Wellenlänge ist und aus einem zweiten elektronischen Übergang in dem Chelat resultiert. Spezifische Analyte in der Probe können durch das Koppeln des Chelats an ein Reagens, das zum selektiven Binden eines Analyts fähig ist, erkannt werden.
Die Chelate finden ebenfalls Verwendung in dem Resonanzenergietransfer zwischen den Chelatlanthanoidkomplexen und einem anderen lumineszenten Mittel, oft einem fluoreszierenden nicht auf Metall basierenden Resonanzenergieakzeptor. Durch das Koppeln des Chelatlanthanoidkomplexdonors an ein Atom und des Akzeptors an ein zweites Atom kann der Abstand zwischen zwei Atomen gemessen werden. Im Allgemeinen ist die spektrale Überlappung der Emission des Donors und der Absorption des Akzeptors ausreichend, um den Energietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor wie durch erkennbares Quenchen der Lumineszenzintensität des Donors oder der Lebensdauer oder der erkennbaren Steigerung in der Lumineszenz des Akzeptors gemessen zu ermöglichen.
Wenn sich die Atome auf dem gleichen Molekül befinden, stellen die Verfahren nützliche Informationen über die Struktur oder die Konformation des Moleküls bereit. Die Verfahren werden zum Beispiel verwendet, um den Status einer Polymerase-Kettenreaktion durch das Koppeln des Donors und des Akzeptors an getrennte Atome eines diagnostischen Oligonukleotids zu überwachen. Während sich die Konzentration von Ziel-DNA steigert, steigert sich der Prozentsatz an diagnostischen Oligonukleotiden, die auf Ziel-DNA hybridisiert sind, was wiederum den mittleren Abstand zwischen den markierten Atomen steigert. Dieser gesteigerte mittlere Abstand wird als eine Verringerung im Energietransfer zwischen dem Donor und dem Akzeptor erkannt. Wenn sich die Atome auf unterschiedlichen Molekülen befinden, stellen die Verfahren nützliche Informationen bezüglich der Interaktionen oder relativen Standorte der zwei Moleküle bereit.
BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Wir haben eine Reihe von neuen chemischen Verbindungen, die sich an Lanthanoidelemente einschließlich Terbium und Europium binden und diese effizient sensibilisieren, synthetisiert, d. h. ihnen erlaubt, effizient angeregt zu werden und folglich effizient zu lumineszieren. Die Verbindungen ermöglichen ebenfalls ein geeignetes Koppeln an Makromoleküle. Wir nennen diese Verbindungen Lanthanoidchelate.
Die Bedeutung der Erfindung ist vielseitig: erstens können unsere Lanthanoidchelate als nicht isotoper Ersatz für radioaktive Markierungen verwendet werden. Zweitens können sie als Alternativen zu herkömmlichen fluoreszierenden Farbstoffen verwendet werden, besonders bei Abbildungsanwendungen, mit dem Potential für gesteigerten Kontrast. Der gesteigerte Kontrast geht daraus hervor, dass die Lanthanoidlumineszenz extrem lang ist (0,6-2,3 Millisekunden). Wenn man eine gepulste Anregungsquelle und gesperrte (zeitlich aufgelöste) Erkennung verwendet, wird die intensive Autofluoreszenz (Hintergrund) zerfallen, wobei die Markierungen immer noch emittieren. Eine solche Autofluoreszenz verhindert gegenwärtig fluoreszierende Abbildungen von vielen Gewebeproben. Drittens, da die Chelate alle in der gleichen spektralen Region angeregt werden, ist eine Abbildung in zwei Farben möglich. Viertens können die Lanthanoidchelate als extrem effiziente Donoren bei lumineszenten Energietransferanalysen verwendet werden. Diese Verwendung ermöglicht Messungen von Abständen über 100 Å, Abstände, die gegenwärtig nicht mit standardmäßigen Fluoreszenzenergietransfertechniken messbar sind, aber in der strukturellen Biologie und Medizin wichtig sind.
Unsere Chelate weisen eine Reihe von wichtigen Vorteilen auf: 1. sie können leicht synthetisiert und an Makromolekülen angebracht werden; 2. sie werden effizient durch einen Stickstofflaser (bei 337 nm) angeregt; 3. einige von ihnen (z. B. DTPA-cs124) können sowohl Terbium als auch Europium sensibilisieren; 4. die Lanthanoidlumineszenz von den Chelaten ist extrem intensiv, das unten veranschaulichte Terbiumchelat luminesziert zum Beispiel ungefähr fünfundsechzig mal intensiver als DTPA-Paraaminosalycilat (DTPA-pAS), wenn es bei 337 nm angeregt wird; 5. sie sind chemisch stabil; 6. sie können verwendet werden, um Nukleinsäuren und Proteine unter chemischen Konditionen, die bei automatisierten Synthetisatoren verwendet werden (z. B. dem Schaffen von Phosphoramiditen in DNA/RNA-Technologie oder Proteintechnologie) zu markieren; 7. sie sind extrem gute Resonanzenergietransferdonoren. Ein wichtiges Element für den Erfolg unserer Chelate beim Energietransfer ist die Tatsache, dass es zwischen der Emission des Sensibilisators und der Emission des Lanthanoids sehr wenig spektrale oder zeitliche Überlappung gibt. Im Gegensatz dazu weist DTPA-pAS sehr signifikante zeitliche und spektrale Überlappung auf und stellt einen schlechten Energietransferdonor bereit; und 8. sind sie nützlich als durch Strahlung gehärtete Fluorophore in der Röntgenmikroskopie.
Unsere Lanthanoidchelate beinhalten einen polynuklearen heterozyklischen aromatischen Sensibilisator mit der folgenden Allgemeinformel:
wobei X ein Atom aus der Periodengruppe 5 oder 6 beinhaltet.
Geeignete Sensibilisatoren können eine Vielfalt von zusätzlichen Strukturen einschließlich Strukturen, bei denen die obige Allgemeinformel einen strukturell geringeren Abschnitt des Sensibilisators beinhaltet, umfassen. Mindestens eins der Kohlenstoffatome in Position 2-8, insbesondere in Position 2 oder 4, wird oxidiert, vorzugsweise mit einem Carbonyl (d. h. doppelt an ein Sauerstoffatom gebunden). Die Positionen werden konventionell nummeriert: von dem Heteroatom, das Position Nummer 1 ist, gegen den Uhrzeigersinn. Häufig wird ein anderes Kohlenstoffatom in Position 2-8, vorzugsweise der anderen Position 2 oder 4, mit einer Gruppe, die eine Alkyl-, Vinyl-, Oxy- (einschließlich Hydroxyl-, Alkoxy-, Carboxyl-), Carbonyl- oder substituierten Stickstoff- (z. B. Nitro-, Amino- einschließlich substituierter Amine etc.), Cyano-, Acetat- etc. Gruppe oder eines Derivats davon, insbesondere Halidderivate, substituiert (d. h. ein Wasserstoffatom wird ersetzt).
Beispielhafte Sensibilisatoren umfassen Rhodamin 560, 575 und 590, Fluoreszeine, 2- oder 4-Quinolone, 2- oder 4-Cumarine oder Derivate davon, z. B. Cumarin 445, 450, 490, 500 und 503, 4-Trifluoromethylcumarin (TFC), 7-Diethyl-amino-cumarin-3-carbohydrizid, etc. und insbesondere Carbostyril 124 (7-amino-4-methyl-2-quinolon), Cumarin 120 (7-amino-4-methyl-2-cumarin), Cumarin 124 (7-amino-4-(trifluoromethyl)-2-coumarin), Aminomethyltrimethylpsoralen:
Eine große Vielfalt von Derivaten der obigen Allgemeinformel kann als Sensibilisatoren verwendet werden, solange das resultierende Chelat die erforderliche Lanthanoidbindung und Lumineszenzerhöhung bereitstellt. Mit erhöhter Lumineszenz ist gemeint, dass eine mit einem Lanthanoid komplexierte Lösung des Chelats, wenn es bei einer Wellenlänge belichtet wird, das komplexierte Lanthanoid Licht von größerer Intensität oder Lebensdauer als eine identische Probe ohne das Chelat emittiert. Die Erhöhung ist gewöhnlicherweise mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 500%, noch besser mindestens 5 000% und am besten mindestens 50 000% größere Intensität unter mindestens einem Satz Konditionen (z. B. festgelegte Konzentration, Lösungssystem etc.) siehe z. B. hier beschriebene Konditionen.
Um das residente Lanthanoid effektiv anzuregen, stellen die Chelate im Allgemeinen Absorptionshöchstwerte zwischen 150 und 750 nm, gewöhnlicherweise zwischen 200 und 650 nm, noch gewöhnlicher zwischen 250 und 550 nm und am besten zwischen 300 und 450 nm bereit. Im Allgemeinen sind erkannte Emissionen mindestens 50 nm, gewöhnlicherweise mindestens 100 nm, noch gewöhnlicher mindestens 150 nm größer als das einfallende Licht. Bevorzugte erkannte Emissionen für Terbium und Europium sind zum Beispiel 492 und 546 nm bzw. 617 und 695 nm. Die Extinktionskoeffizienten übersteigen im Allgemeinen 5 000, gewöhnlicherweise 8 000 und noch gewöhnlicher 11 000.
Die Auswahl bestimmter Chelator-Sensibilisator-Kombinationen hängt von der beabsichtigten Anwendung ab. Kriterien umfassen das ausgewählte Lanthanoid, Quellen von potentieller Hintergrundfluoreszenz, Mittel zum Quenchen, die einfallende Lichtquelle etc. Funktionell werden geeignete Chelate für ein gegebenes Lanthanoid durch das Koppeln eines Kandidatensensibilisators an einen Chelator wie etwa DTPA, das Komplexieren mit dem Lanthanoid und das Identifizieren der Komplexe, die zur erhöhten Lanthanoidlumineszenz fähig sind, identifiziert. Details des Assays werden unten beschrieben.
Die Chelate sind dazu fähig, mit Lanthanoiden wie etwa Terbium oder Europium Komplexe mit hoher Affinität zu bilden. Die Chelate binden mindestens ein Lanthanoid, vorzugsweise mindestens eines von Terbium und Europium, mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁶ M^–1, vorzugsweise mindestens 10⁸ M^–1, noch besser mindestens 10¹⁰ M^–1 unter mindestens einem hier beschriebenen Satz Konditionen. Eine große Vielfalt struktureller Anteile kann verwendet werden, um die erforderliche Bindungsaffinität des Lanthanoids bereitzustellen, solange das resultierende Chelat die erforderliche Lumineszenz bereitstellt. Das Lanthanoid wird jedoch üblicherweise durch anionische Gruppen wie etwa Carboxylat- oder Phosphonatgruppen ionisch gebunden.
Die Chelate beinhalten häufig einen oder mehrere strukturell ausgeprägte Chelatorabschnitte. Diese Chelatorabschnitte beinhalten eine Vielzahl von strukturell eingeschränkten anionischen Gruppen wie etwa Carboxylat- oder Phosphonatgruppen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Abschnitte aus Verbindungen ausgewählt, die selbst dazu fähig sind, als Lanthanoidchelatoren mit den zuvor erwähnten Bindungsaffinitäten zu funktionieren. Derartige Chelatorabschnitte umfassen zum Beispiel EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA etc. und ihre analogen Phosphonate wie etwa DTPP, EDTP, HDTP, NTP etc. Die Lanthanoidaffinität des Chelats kann ebenfalls ein kooperatives (synergistisches) Ergebnis der Interaktion einer Vielzahl von funktionellen Gruppen sein. Ein Anteil oder mehrere Anteile von Aminosäuren, z. B. Glycin, des Chelats können zum Beispiel strukturell positioniert sein, um vakante Koordinationsstellen des Lanthanoids zu binden, um die gesamte Bindungsaffinität zu erhöhen.
Wenn das Chelat einen strukturell ausgeprägten Chelatorabschnitt beinhaltet, ist es gewöhnlich kovalent mit dem Sensibilisatorabschnitt verbunden, typischerweise durch eine Verknüpfungsgruppe. Jede Verknüpfungsgruppe, die zum kovalenten Verknüpfen des Sensibilisators mit dem Chelator fähig ist und erforderliches Lanthanoidbinden und Lumineszenz nicht ausschließt, kann verwendet werden. Folglich kann die Verknüpfungsgruppe eine große Vielfalt von Strukturen beinhalten. Die Verknüpfungsgruppe beinhaltet häufig eine Stickstoff-, Carboxyl-Carbonyl- oder Alkoholgruppe oder ein Stickstoff- oder Carboxylderivat und ist kovalent mit einem Kohlenstoffatom in Position 2-8 in der Allgemeinformel verbunden. Die Verknüpfungsgruppe ist oft kovalent mit einem der Kohlenstoffatome oben in Position 2-8, häufig Position 7 verbunden. Übliche Verknüpfungsgruppen sind aliphatische und aromatische Amine, die primär oder sekundär, Carboxyle und Sulfhydryle sein können. Der Chelator und der Sensibilisator werden häufig durch eine Amid-, Anhydrid-, Disulfid-, Thioharnstoff-, Thioether- etc. Bindung verbunden.
Die Chelate können auf jede beliebige zweckmäßige Weise synthetisiert werden. Zahlreiche der offenbarten Sensibilisatoren und Chelatoren sind im Handel erhältlich – andere werden aus im Handel erhältlichen Ausgangsmaterialien gemäß konventionellen Verfahren synthetisiert oder modifiziert. Die zwei können durch jede geeignete Chemie gekoppelt werden, obwohl sie meistens direkt durch funktionelle Gruppen wie hier beschrieben gekoppelt werden. Einige der bevorzugten Chelate basieren zum Beispiel auf einer Reaktion zwischen einem Anhydrid (z. B. aus Diethylentriaminpentaessigsäure, caDTPA) und einem Sensibilisator (DTPA wirkt als der Chelator, der das Lanthanoid eng bindet und eine strahlungslose Deaktivierung durch Wasser verhindert, und die organische Verbindung wirkt als ein Sensibilisator, der die effiziente Anregung des Lanthanoids erlaubt). Diese Chelate können durch eine Modifizierung der Verfahrensweise von Bailey et al. (1984) Analyst 109, 1449-1450, wo Amin enthaltende Sensibilisatoren pAS ersetzen, gemacht werden. Die Anhydride von DTPA werden separat in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, typischerweise trockenem Dimethylsulfoxid, aufgelöst. Das Anhydrid und der ausgewählte Sensibilisator werden dann gemischt und ungefähr eine Stunde lang reagieren gelassen. Das Anhydrid reagiert mit dem Amin auf dem Sensibilisator, um eine stabile Amidbindung zu bilden.
Wenn gewünscht, kann das Chelat an ein Analyt spezifisches Reagens, organisches Polymer, Makromolekül (besonders Biomoleküle wie etwa Nukleinsäuren und Proteine) auf jede beliebige zweckmäßige Weise gekoppelt werden. Zum kovalenten Koppeln an ein Protein (oder ein anderes Amin enthaltendes Makromolekül) kann das Chelat zum Beispiel original unter Verwendung des Dianhydrids von DTPA gebildet werden. Nach dem Koppeln an den Sensibilisator wird die Mischung dann zu dem Amin enthaltenden Makromolekül hinzugegeben, entweder in einem organischen Lösungsmittel oder in einem wässrigen Lösungsmittel. Das zweite Dianhydrid reagiert dann mit dem Amin/den Aminen auf dem Makromolekül, wodurch eine weitere Amidbindung gebildet wird. Die Reaktivität des Amins ist ausreichend groß, so dass diese Reaktion in einem wässrigen Medium vorgenommen werden kann (obwohl das Wasser um die Reaktion mit dem Anhydrid konkurriert).
Alternativ kann ein bifunktioneller Linker verwendet werden, um das Chelat und das Makromolekül zu koppeln. Ein geeigneter Linker kann zum Beispiel sowohl eine Thiol reaktionsfähige Gruppe (z. B. Maleinid, Acetylhalid etc.) und eine Amin reaktionsfähige Gruppe (z. B. Thioharnstoff, Isothiocyanat etc.) beinhalten. Das Monoanhydrid von DTPA kann zum Beispiel durch das Reagieren mit 3-(2-Pyridildithio)propionylhydrazid (PDPH) mit einem Protein gekoppelt werden.
Chelatlanthanoidkomplexe sind als erkennbare Markierungen in einer großen Vielfalt von Anwendungen nützlich. Im Allgemeinen involvieren die Verfahren das Kontaktieren eines Probenabschnitts mit einem lumineszenten Komplex eines Chelats und eines Lanthanoids; Belichten des Probenabschnitts bei einer ersten Wellenlänge, die fähig ist, einen ersten elektronischen Übergang in dem Chelat zu induzieren und Erkennen, vorteilhafterweise mit einer Zeitverzögerung, um die Erkennung von kurzzeitiger Hintergrundlumineszenz zu minimieren, einer Lichtabgabe von dem Probenabschnitt bei einer zweiten Wellenlänge, die länger als die erste Wellenlänge ist und aus einem zweiten elektronischen Übergang in dem Chelat resultiert. Spezifische Analyte in der Probe können durch das Koppeln des Chelats an ein Reagens, das zum selektiven Binden eines Analyts fähig ist, erkannt werden.
Die Verfahren können auf eine große Vielfalt von Proben einschließlich biologischer Proben und Extrakte (wie beispielsweise physiologische Fluids, Nukleinsäure und/oder proteinöse Lösungen, mikrobielle Kulturen etc.), Umweltproben (wie etwa Wasserquellen), industrielle, besonders chemische Reagenzien, Produkte und Abfälle etc. angepasst werden. Die Chelate können in der Lösung frei sein oder auf eine Vielfalt von Wegen beschränkt werden. Die Chelate können zum Beispiel vorzugsweise in oder auf einer Phase flüssig oder fest verteilt sein, wie etwa auf einer soliden Oberfläche oder Membran adsorbiert oder innerhalb einer Perle (z. B. Latexmikrosphären) gehalten werden. Folglich sind die Verfahren in Verbindung mit Sortierung (z. B. Zellsortierung), Chromatographie, elektrophoretischen, osmotischen und zentrifugalen Trennungen nützlich. Wärme- und oganostabile Chelate werden für Anwendungen ausgewählt, die erhöhte Temperatur (z. B. Destillationen, Verbrennungen etc.) und organische Extrahierungen involvieren.
Die erste Wellenlänge (die des einfallenden Lichts) wird ausgewählt, um das äußerste Signal-Rausch-Verhältnis der Lanthanoidemission zu optimieren. Das einfallende Licht wird häufig in einer Form bereitgestellt, um die Hintergrundabsorption zu minimieren. Nützliche Quellen umfassen Laser (z. B. Stickstoff, Helium-Cadmium, Farbstofflaser etc.) und Bogenlampen (z. B. Hochdruck, Quecksilber, Xenon, Quarz, etc.). Stickstofflaser werden besonders bevorzugt, da ihre Emissionsfrequenz von 337 nm nahe an einem Lanthanoidabsorptionsmaximum liegt. Auf ähnliche Weise wird die zweite Wellenlänge ausgewählt, um das Signal-Rausch-Verhältnis unter Berücksichtigung der verfügbaren Instrumentierung zu optimieren.
Die Subjektchelate können an eine große Vielfalt von Verbindungen gekoppelt sein, um spezifische Markierungen, Sonden, diagnostische und/oder therapeutische Reagenzien etc. zu schaffen. Beispiele umfassen Biomoleküle wie etwa Proteine (Antikörper, Enzyme, Rezeptoren etc.), Nukleinsäuren (RNA, DNA etc.), bioaktive Moleküle (Arzneistoffe, Giftstoffe etc.), feste Substrate wie etwa Glas oder polymere Perlen, Schichten, Fasern, Membranen (z. B. Nylon, Nitrocellulose), Gleitstücke (z. B. Glas, Quarz) und Sonden, etc. Zahlreiche unser Chelate sind besonders zugänglich für das, was wir als Lumineszenzresonanzenergietransfer oder LRET bezeichnen. LRET ist eine verallgemeinerte Version von Fluoreszenzresonanzenergietransfer, oder FRET, einer in Polymerwissenschaft, Biochemie und struktureller Biologie weitgehend verwendeten Technik. FRET kann verwendet werden, um die Abstände zwischen zwei Punkten zu messen, die mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind und durch ungefähr 10-75 Å getrennt sind. Die Technik ist nützlich, da Messungen unter physiologischen (oder anderen) Konditionen mit naher Angström-Auflösung und mit der exquisiten Empfindlichkeit von Fluoreszenzmessungen vorgenommen werden können. FRET beruht auf einem entfernungsabhängigen Transfer von Energie von einem fluoreszierenden Farbstoff – dem Donor – zu einem anderen absorbierenden oder fluoreszierenden Farbstoff – dem Akzeptor. Der Donor und der Akzeptor sind ortsspezifisch an den zwei Punkten platziert, zwischen denen der Abstand gemessen werden soll.
Während Lanthanoide nicht fluoreszieren, erlaubt ihnen die Verwendung unserer Chelate, effizient angeregt zu werden. Ein nicht fluoreszierender Quantenübergang des Lanthanoids kann dann einen Nicht-Strahlungs-Energietransfer zu einem geeigneten und mit angemessenem Abstand angeordneten Akzeptor bewirken. Um einen Transfer zu bewirken, muss eine Absorption des Akzeptors eine Lanthanoidemission überlappen. Das Chelat-Akzeptor-Paar wird zur optimalen Überlappung ausgewählt: für Messungen über größere Abstände wird eine größere Überlappung bevorzugt. Da die Lanthanoide Lebensdauern im Bereich einer Millisekunde aufweisen, wird das Signal-Rausch-Verhältnis der sensibilisierten Emission des Akzeptors in LRET durch Emissionserkennung durch Zeitauflösung (Impulsverzögerung) oder Phasenmodulation verbessert. Der Energietransfer kann durch Quenchen des Donors oder vorzugsweise Akzeptorlumineszenz erkannt werden.
Durch die Verwendung ilumineszenter Lanthanoidchelatoren als Donoren (anstelle von herkömmlichen Farbstoffen) und herkömmlichen fluoreszierenden Farbstoffen als Akzeptoren haben wir das Signal zum Hintergrund von LRET um ungefähr das Hundertfache verbessert. Diese Verbesserung erlaubt Messungen über 100 Å hinaus, ein Abstand, der gegenwärtig unter Verwendung von kleinen, herkömmlichen fluoreszierenden Farbstoffen nicht messbar ist. Dieses Abstandsregime ist bei vielen biologischen Problemen wichtig. Die Verwendung von Lanthanoidchelatoren als Donoren macht die Messungen von Abstand ebenfalls genauer, da die Chelatoren die Ungewissheit in der Ausrichtungsabhängigkeit des Energietransfers minimieren. Wir haben ebenfalls die erste Messung der Lebensdauer der sensibilisierten Emission des Akzeptors demonstriert, eine LRET-Messung, die mit nicht spezifischer oder unvollständiger Markierung assoziierte Probleme eliminiert.
Eine große Vielfalt von Akzeptoren sind bei unseren Chelatdonoren nützlich. Im Allgemeinen wird der ausgewählte Akzeptor ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge zwischen 25 nm und 250 nm länger als der des Donorchelats aufweisen. Beispielhafte Akzeptoren umfassen Xanthenfarbstoffe wie etwa Fluoreszeine und Rhodamine, Cumarine, Benzimidfarbstoffe, Phentanthridinfarbstoffe, Ethidiumfarbstoffe, Acridinfarbstoffe, Cyaninfarbstoffe wie etwa Thiazolorange, Thiazolblau, Cy5, Cy5,5, Cy3 etc., Carbazolfarbstoffe, Phenoxazinfarbstoffe, Porphyrinfarbstoffe, Quinolonfarbstoffe, Phycobiliproteine, z. B. Allophycocyanin, R-phycoerythrin, B-phycoerithrin, Bodipy-Farbstoffe etc. Die Akzeptoren emittieren im Allgemeinen in den sichtbaren Bereichen oder Infrarotbereichen.
LRET ist besonders nützlich, um strukturelle und kinetische Informationen über Makromoleküle in Lösung in Echtzeit zu erhalten. Markierte Oligonukleotide mit doppeltem Ende stellen zum Beispiel erkennbare LRET-Signalisierung bereit, wenn sie durch Nukleinsäure bindende Proteine, z. B. Transkriptionsfaktoren, gebunden werden. Dementsprechend werden die Verfahren verwendet, um auf potentielle Therapeutika zu prüfen, die die Struktur oder die Interaktionen von Biomolekülen ändern; zum Beispiel werden antivirale Mittel auf ihre Fähigkeit geprüft, durch den viralen Transkriptionsfaktor induzierte Änderungen in der Nukleinsäurekonformation zu ändern.
Das allgemeine auf LRET basierende Verfahren zum Erkennen des Abstands zwischen einer ersten Position und einer zweiten Position in einem Abschnitt einer Probe involviert Folgendes: Belichten eines Probenabschnitts, der den Donorlanthanoid-Chelatkomplex, der sich an der ersten Position befindet, und den Akzeptor, der sich an der zweiten Position befindet, beinhaltet, bei einer ersten Wellenlänge, die fähig ist, einen ersten elektronischen Übergang in dem Donor zu induzieren. Die spektrale Überlappung der Emission des Donors und der Absorption des Akzeptors ist ausreichend, um den Energietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor wie durch erkennbares Quenchen der Lumineszenzintensität des Donors oder der Lebensdauer oder der erkennbaren Steigerung in der Lumineszenzintensität des Akzeptors oder der Lebensdauer gemessen zu ermöglichen. Dann wird die Intensität einer ersten Lichtabgabe von dem Probenabschnitt bei einer zweiten Wellenlänge erkannt, wobei die zweite Wellenlänge länger ist als die erste Wellenlänge und aus einem zweiten elektronischen Übergang in dem Donor resultiert, wobei die Intensität der ersten Lichtabgabe mit dem Abstand zwischen der ersten und zweiten Position korreliert. Mit anderen Worten, je näher die Positionen sind, desto größer der Energietransfer und desto größer das Quenchen des Donors. Alternativ kann man die Intensität einer zweiten Lichtabgabe von dem Probenabschnitt bei einer dritten Wellenlänge erkennen, wobei die dritte Wellenlänge länger ist als die erste Wellenlänge und aus einem elektronischen Übergang in dem Akzeptor resultiert, wobei die Intensität der zweiten Lichtabgabe invers mit dem Abstand zwischen der ersten und zweiten Position des Probenabschnitts korreliert. Mit anderen Worten, je näher die Positionen sind, desto größer der Energietransfer und desto größer die Lumineszenz des Akzeptors.
Dieses allgemeine Verfahren findet breite Anwendung, wann immer der statische oder dynamische Abstand zwischen zwei Positionen, z. B. zwei Atomen oder Molekülen, von Interesse ist. In einer spezifischen Ausführungsform wird das Verfahren verwendet, um den Status einer Polymerase-Kettenreaktion zu überwachen. Hier beinhaltet der Probenabschnitt einen Zielnukleinsäurestrang, der einen ersten Strangabschnitt und einen diagnostischen Nukleinsäurestrang, der proximal zu einem Ende mit dem Akzeptor und proximal zu dem anderen Ende mit dem Donor markiert ist (d. h. ein erstes Atom beinhaltet, das kovalent mit dem Donor verbunden ist, und ein zweites Atom beinhaltet, das kovalent mit dem Akzeptor verbunden ist, wobei das erste und das zweite Atom durch einen zweiten Strangabschnitt getrennt sind). Der erste und zweite Strangabschnitt sind ausreichend komplementär, um unter Entspannungskonditionen zu hybridisieren, und der zweite Strangabschnitt ist von ausreichender Länge, um einen erkennbaren Unterschied in dem Aggregatenergietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor bereitzustellen, wenn der erste und zweite Strangabschnitt wie im Vergleich mit dem Aggregatenergietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor hybridisiert werden, wenn der erste und zweite Strangabschnitt nicht hybridisiert werden. Der erkennbare Unterschied wird als mindestens einer eines erkennbaren Quenchens von Donorlumineszenz oder erkennbarer Steigerung in der Akzeptorlumineszenz gemessen, und der Abstand zwischen dem ersten und dem zweiten Atom gibt an, ob die Nukleinsäurestränge hybridisiert sind. Während die Reaktion fortschreitet, wird folglich die schrittweise Steigerung in der Menge an Zielnukleinsäure in einer schrittweisen Abnahme im Energietransfer reflektiert.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht als Beschränkung geboten.
BEISPIELE
Beispiel 1
In diesem Beispiel veranschaulichen wir die Technik des lumineszenten Resonanzenergietransfers (LRET) durch das Einführen eines lumineszenten Terbiumchelats als ein Donor, und eines organischen Farbstoffs, Tetramethylrhodamin, als Akzeptor. Die Ergebnisse stimmen mit einer Förster-Theorie des Energietransfers überein, vorausgesetzt, die angemessenen Parameter werden verwendet. Die Verwendung von Lanthanoiddonoren im Allgemeinen und diesem Paar im Besonderen weist zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlicheren FRET-Paaren auf, die sich nur auf organische Farbstoffe verlassen. Der Abstand, bei dem 50% Energietransfer auftritt (R_o) ist groß, 65 Å; die Lebensdauer des Donors ist einfach exponentiell und lang (Millisekunden), was die Messungen der Lebensdauer einfach und akkurat macht; Unsicherheit im Ausrichtungsfaktor (κ²), die eine Unsicherheit in den gemessenen Abständen schafft, wird durch die mehrfachen elektronischen Übergänge des Donors und die lange Lebensdauer minimiert; die sensibilisierte Emission des Akzeptors kann mit wenig oder keinem sich einmischenden Hintergrund gemessen werden, was eine > 25fache Verbesserung in Signal zu Hintergrund gegenüber standardmäßigen Donator-Akzeptor-Paaren ergibt. Von diesen Verbesserungen wird erwartet, dass sie die Abstände größer als 100 Å messbar über LRET machen. Wir melden ebenfalls die Messung der sensibilisierten Emissionslebensdauer, eine Messung, die gegenüber Gesamtkonzentration und unvollständiger Markierung vollkommen unempfindlich ist.
Bei FRET überträgt ein fluoreszierendes Donormolekül Energie über eine nicht strahlende Dipol-Dipol-Interaktion zu einem Akzeptormolekül (das normalerweise ein fluoreszierendes Molekül ist). FRET ist eine standardmäßige Spektroskopietechnik zum Messen von Abständen in dem Bereich 10-70 Å. Beim Energietransfer, der von dem R^–6-Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor abhängt, werden die Lebensdauer des Donors und der Quantenwirkungsgrad reduziert, und die Fluoreszenz des Akzeptors wird gesteigert oder sensibilisiert (1). FRET wird häufig in sowohl Polymerwissenschaft als auch struktureller Biologie verwendet und ist in letzter Zeit verwendet worden, um makromolekulare Komplexe von DNA, RNA und Proteinen (2-4) zu untersuchen.
Trotz dieser Erfolge hat FRET eine Reihe von ernsthaften Mängeln aufgewiesen, was seinen Nutzen eingeschränkt hat. Erstens ist der maximale Abstand, der gemessen werden kann, für zahlreiche biologische Anwendungen nicht optimal gewesen. Zweitens ist die Lebensdauer gemeinsam verwendeter Donorfluorophore kurz (typischerweise ein paar Nanosekunden) und multiexponentiell, was die Messungen der Lebensdauer schwierig und weniger akkurat macht. Drittens ist der Signal-Hintergrund der sensibilisierten Emission aufgrund von eingreifender Fluoreszenz von dem Donor und direkter Anregung des Akzeptors niedrig gewesen. Viertens ist die Bestimmung von genauen Abständen schwierig gewesen, da die Effizienz des Energietransfers nicht nur von dem R^–6-Abstand zwischen dem Donor und den Akzeptoren abhängt, sondern auch von ihrer relativen Orientierung, wie ausgedrückt durch den κ²-Faktor. (Die Effizienz des Energietransfers = 1/(1 + R⁶/R_o ⁶), wobei R_o eine Funktion von κ² ist, siehe Anhang).
Die lumineszenten Lanthanoidelemente Terbium und Europium sind attraktive FRET-Donoren, da sie potentiell zahlreiche dieser Probleme überwinden. Da die Emission des Lanthanoids nicht aus einem Singulett-Singulett-Übergang hervorgeht, wird der Energietransfer unter Verwendung von Lanthanoiddonoren genauer Lumineszenzresonanzenergietransfer (LRET) genannt. Die Lanthanoide sind hauptsächlich bei diffusionserhöhtem FRET (5) und als isomorpher Ersatz bei Kalzium bindenden Proteinen (6-8) verwendet worden. Zusätzlich dazu hat Mathis Europium-Kryptate mit dem multichromophorischen Allophycocanin verwendet, um ein extrem großes R_o von 90 Å (9) zu erreichen. Wir haben kürzlich Ergebnisse dargestellt, die zahlreiche Vorteile der Verwendung von Polycarboxylatchelat von Europium als ein Donor in Verbindung mit einem organischen Farbstoff wie etwa CY-5 als der Akzeptor (10) zeigen. Hier erweitern wir diese Ergebnisse auf die Verwendung von Terbium als ein Donor.
Als ein Modellsystem bringen wir kovalent Donor und Akzeptor an den 5'-Enden einer Reihe von doppelsträngigen DNA-Oligomeren von variierender Länge an. Es ist zuvor gezeigt worden, dass die Verwendung von DNA in einem solchen Modellsystem für Messungen des Energietransfers zwischen organischen Farbstoffen (11) gültig ist.
Material und Verfahren
Synthese von markierten DNA-Oligomeren. Komplementäre DNA von 10, 12, 14 Basen in der Länge wurden unter Verwendung von standardmäßigen Phosphoramidit-Verfahrensweisen synthetisiert. Eine über einen sechs Kohlenstoff-Linker (Glen Research) angebrachte Aminogruppe wurde an dem 5'-Ende inkorporiert. Die Sequenz des Akzeptors war die durch Clegg et al. (11) verwendete: 5'-CCA-CTC-TAG-G-3' (10 bp); 5'-CCA-CTG-GCT-AGG-3' (12 bp); 5'-CCA-CTG-CTG-CTA-GG-3' (14 bp). Das 5-Isomer von Tetramethylrhodamin-isothiocyanat (Molecular Probes, T-1480: Abkürzung: TMR) wurde über standardmäßige Verfahrensweisen angebracht und durch Umkehrphase-HPLC gereinigt. Extinktionskoeffizienten für TMR, angebracht an DNA, wurden als e₂₆₀ = 33 mM ^–1cm^–1 und e₅₅₆ = 93 mM ^–1cm^–1 bestimmt. Der Donorstrang bestand aus komplementärer DNA, markiert an dem 5'-Ende mit einem Terbiumchelat. Das Chelat ist Diethylentriaminpentaessigsäure, gekoppelt mit einem Laserfarbstoff, Carbostyril 124 (DTPA-cs124). Details der Synthese des Donorchelats werden an anderer Stelle dargestellt. Nicht gekennzeichnete DNA-Oligomere wurden ebenfalls synthetisiert.
Hybridisierungskonditionen: Donor- und Akzeptorstränge wurden in einem gewünschten Verhältnis in einem D₂O-Puffer, der 10 mM Tris, pH-Wert 8,0, 10 mM MgCl₂, 150 mM NaCl gemischt. Experimente wurden ebenfalls in einem auf H₂O basierenden Puffer durchgeführt. Die Konzentration des Donorstrangs betrug ungefähr 200 nM. Oligomere wurden durch das Erwärmen auf 75°C geglüht und auf die endgültige Temperatur (22°C oder 5°C) im Verlauf von 15 Minuten abgekühlt.
Spektroskopie: Absorptionsmessungen wurden auf einem Hewlett Packard 8452A-Spektrometer vorgenommen. Stationäre Fluoreszenzmessungen erfolgten auf einem SPEX Fluorolog-Fluorimeter. Zeitlich aufgelöste und gesperrte Lumineszenzmessungen wurden auf einem im Labor gebauten Spektrometer unter Benutzung von Erkennung im rechten Winkel mit einem gepulsten Laser-Photonics-Stickstofflaser (5 nsec Pulsbreite, 40 Hz Wiederholungsrate), einem Photon zählenden Galliumarsenid-Detektor, einem gesperrten Impulsunterscheider (Ortec 584) und einem Mehrkanal-Skalar mit einer Zeitauflösung von 2 μsec vorgenommen. Polarisationsstudien wurden ebenfalls ausgeführt, obwohl ohne einen Analysator durchgeführte Energietransferexperimente die gleichen Ergebnisse ergaben wie die unter Verwendung eines Analysators. Ein Analysator wurde daher routinemäßig ausgelassen. Ein temperaturregulierter Küvettenhalter und eine 3 mm × 3 mm große Küvette aus Quarz wurden verwendet. Daten der Lebensdauer wurden unter Verwendung von TableCurve Software (Jandel Scientific) angepasst.
Ergebnisse und Erörterung
Die Struktur des Donorchelats, DTPA-cs124-Tb, und das zum Energietransfer verwendete Modellsystem werden unten gezeigt:
Das Chelat des Donors weist einige wichtige Merkmale auf. Als Erstes bindet das Chelat Terbium (und Europium) extrem eng – Titrierung mit einem 100fachen Überschuss an EDTA (K_b ≤ 10¹⁷ M ^–1) ist nicht fähig, eine messbare Menge an Terbium zu ersetzen. Dies ist in Übereinstimmung mit anderen auf DTPA basierenden Chelatoren (12) und stellt sicher, dass kein freies Terbium vorhanden ist. Zweitens erlaubt das Chelat stellenspezifische Anbringung des Terbiums an den Makromolekülen. Drittens schützt das Chelat das Terbium vor nicht strahlenden Entregungsmechanismen, wobei es wahrscheinlich ist, dass dies in einem Quantenwirkungsgrad für Terbiumlumineszenz nahe der Einheit in D₂O resultiert (siehe Anhang I). Schließlich überwindet die kovalente Anbringung des Laserfarbstoffs Carbostyril 124 den extrem niedrigen Absorptionsquerschnitt von Terbium (< 1 M ^–1cm^–1) (6). Das cs124 absorbiert Licht (E₃₂₈ = 11 000 M ^–1cm^–1; E₃₃₈ = 8 000 M ^–1cm^–1) und wegen seiner engen Nähe zu dem Terbium überträgt es Energie an das Lanthanoid (13, 14).
Die Ergebnisse zeigen die spektralen Charakteristiken des Terbiumchelats und des Tetramethylrhodamins, die zum effizienten Energietransfer und einem großen R_o von 65 Å in D₂O (60 Å in H₂O) führen. R_o wird aus Standardgleichungen (siehe Anhang) berechnet. Hier erwähnen wir zwei ungewöhnliche Aspekte der Verwendung eines Lanthanoidchelats als Donor: 1) die Effizienz des Energietransfers kann eingestellt werden, und folglich kann das für das bestimmte System optimierte R_o gemessen werden, einfach durch das Variieren des Verhältnisses von H₂O zu D₂O in dem Lösungsmittel. Das H₂O/D₂O-Verhältnis beeinträchtigt die Effizienz des Energietransfers durch das Ändern des Quantenwirkungsgrads (q_D) des Lanthanoids in unserem Chelat (q_D = 1 in D₂O; q_D = 0,6 in H₂O; siehe Anhang I) (15). 2) Die Ausrichtungsabhängigkeit des Energietransferprozesses wird minimiert, da das Terbium mehrfache, degenerierte elektronische Übergange aufweist und daher ein isotropischer Donor ist, selbst wenn ortsfest. Dies minimiert die Ungewissheit in dem gemessenen Abstand aufgrund der Ausrichtungswirkungen von +/–12% in dem schlimmsten Fall (16).
Die Ergebnisse zeigen ebenfalls die äußerst spitze Beschaffenheit der Emission des Termiums. Das Quenchen des Donors kann ohne Beeinträchtigung der Emission des Akzeptors bei 492 nm und 546 nm gemessen werden. Auf ähnliche Weise kann die sensibilisierte Emission des Akzeptors ohne signifikante Beeinträchtigung von Donorlumineszenz gemessen werden, da Terbium um 570 nm herum fast still ist, wobei sich TMR bei 70% seines Abgabemaximums befindet. Das Terbiumsignal bei 570 nm ist 240× geringer als sein Maximum, 546 nm.
Wenn die sensibilisierte Emission gemessen wird, können wir ebenfalls die direkte Fluoreszenz des Akzeptors durch zeitliche Unterscheidung eliminieren. Wir verwenden gepulste Anregung und sammeln Daten nur nach einer Verzögerung von 90 μsec, wobei während dieser Zeit die direkte Fluoreszenz des Rhodamins zerfallen ist. (Die Fluoreszenz des Akzeptors, mit einer Lebensdauer von einigen Nanosekunden, zerfällt schnell; wir finden ebenfalls eine kleine Komponente – wahrscheinlich entweder verzögerte Fluoreszenz oder ein Detektorartefakt – die innerhalb der Verzögerung von 90 μsec zerfällt). Wegen seiner Lebensdauer von Millisekunden bleibt der Donor angeregt und fähig, an dem Ende der Verzögerungsperiode Energie zu übertragen. Folglich ist jedes Signal, das um 570 nm nach der Verzögerung auftritt, nur aufgrund von sensibilisierter Emission, d. h. Fluoreszenz des Akzeptors aufgrund von Energietransfer.
Die Ergebnisse zeigen die Ergebnisse eines Energietransferexperiments auf einer teilweise hybridisierten 10mer DNA. Der durchschnittliche Energietransfer ist 77%. Das Signal an Hintergrund der sensibilisierten Emission bei 570 nm ist 54:1. Im Vergleich ist das Signal an Hintergrund zur sensibilisierten Emission, wenn Fluoreszein-Rhodamin als Energietransferpaare auf der gleichen DNA verwendet werden, ungefähr 1. Da der Hintergrund in unserem Fall so klein ist, werden kleine Signale messbar, und folglich werden viel größere Abstände als R_o erwartungsgemäß möglich. Horrocks und Bruno haben zum Beispiel die Möglichkeit gezeigt, Abstände von 4 R_o (R_o = 3,1 Å) unter Benutzung von sensibilisierter Emission mit dunklem Hintergrund von Tyrosin an den Terbiumenergietransfer (6) zu benutzen.
Wir können das sensibilisierte Emissionssignal von der Donorlumineszenz selbst in Regionen isolieren, in denen Donorlumineszenz signifikant ist. Bei einer Verfahrensweise analog zu der durch Clegg et al. (11) verwendeten können wir die Donorlumineszenz bei allen Wellenlängen subtrahieren, was das sensibilisierte Emissionssignal zurücklässt. Die Effizienz der übertragenen Energie ist dann einfach der Bereich der korrigierten sensibilisierten Emission, geteilt durch den gesamten korrigierten Bereich: Effizienz des Energietransfers = (fA/qA)/(fA/qA + fD) (1)wobei f_A der Bereich unter der sensibilisierten Emissionskurve ist, q_A der Fluoreszenzquantenwirkungsgrad des Akzeptors ist, und f_D der Bereich unter der Donorlumineszenzkurve ist. Man kann den Quantenwirkungsgrad des Akzeptors durch einen Vergleich mit den Donorquenchdaten bestimmen. Basierend auf einem Quantenwirkungsgrad von 0,174 für TMR (siehe Anhang II) ergibt die Gleichung 1 einen durchschnittlichen Energietransfer von 77%.
Die Ergebnisse zeigen die Daten der Lebensdauer auf einer Reihe von 10mer DNA-Oligomeren. Das Donor-allein (Einzelstrang-DNA)-Signal ist ein einfach exponentielles mit einer Lebensdauer von 2,14 msec. (Ein Terbium markiertes DNA-Oligomer, hybridisiert auf sein Komplement, ist ein einfach exponentielles mit einer Lebensdauer von 2,80 msec. Der Unterschied in der Lebensdauer zwischen doppelsträngiger und einsträngiger Terbium-nur DNA ist aufgrund unterschiedlicher strahlender Raten, die aus unterschiedlichen das Terbium umgebenden Symmetrien anstatt unterschiedlichen Quantenwirkungsgraden hervortreten, wahrscheinlich). Eine Titrierung mit gesteigerten Mengen an Akzeptorsträngen zeigt biexponentielles Quenchen des Donors. Die Komponente mit langer Lebensdauer entspricht unhybridisierter, nur-Donor einsträngiger DNA; die kurze Komponente entspricht den Terbiumsträngen, die mit Akzeptorsträngen hybridisiert werden. Wie erwartet steigert das Steigern der Menge an Akzeptorstrang die Amplitude der kurzen Komponente und verringert die Amplitude der langen Komponente, wobei ihre Lebensdauern unverändert bleiben. Dass die Langzeitkomponente dem Nur-Donor-Signal entspricht, ist eine wichtige interne Kontrolle, die zeigt, dass der intermolekulare Energietransfer nicht signifikant ist. Die Lebensdauer der kurzen Komponente entspricht einem Energietransfer in dem Donor-Akzeptor-Komplex von 88% (1-331 μsec/2809 μsec). Im Vergleich ist der Energietransfer auf der gleichen 10mer DNA mit den gleichen sechs Kohlenstoff Linkern unter Verwendung des Fluoreszein-TMR-Paars 23% (11).
Beim Berechnen der Effizienz des Energietransfers auf der Basis der sensibilisierten Emissionskurve ignorieren wir die Kurzzeitkomponente, da dies aufgrund des zurückbleibenden Signals ist, das aus der direkten Fluoreszenz des Akzeptors hervorgeht. (Für diese Daten wurde keine Sperrung verwendet). Mehrere Experimente zeigen, dass die Langzeitkomponente im schlimmsten Fall innerhalb 10% wiederholbar ist, und gewöhnlicherweise innerhalb ein paar Prozent wiederholbar ist. Die Kurzzeitkomponente ist jedoch höchst variabel, da es aufgrund direkter Fluoreszenz, die nicht aufgelöst werden kann, einen sehr großen, sehr kurzen Spike gibt.
Bei einem zweifachen Überschuss des Akzeptorstrangs gibt es immer noch eine 10-12%ige unhybridisierte Komponente. Ein ähnliches Phänomen ist bei mit Farbstoff gekennzeichneten Oligomeren (17) und bei FRET-Experimenten mit Europium, substituiert in unserem Chelat (10), gesehen worden. In unserem Fall scheint es nicht ein Phänomen einer einfachen Schmelztemperatur zu sein, da es bei sowohl 5°C als auch 22°C präsent ist. Der Grund hierfür wird untersucht. Es ist unwahrscheinlich, dass dieses restliche nicht gequenchte Donorsignal auf fundamentaler Lanthanoid Photophysik beruht, da dies einen ungekoppelten magnetischen Dipolübergang erfordern würde, eine Situation, die nicht präsent ist, da die gesamte Lumineszenz des Terbiums (und Europiums) aus dem gleichen angeregten Zustand (18, 19) hervorgeht.
Die Ergebnisse zeigen ebenfalls die Lebensdauer der sensibilisierten Emission bei 570 nm entsprechend dem biexponentiellen Donor-Quenchen. Der sensibilisierte Emissionszerfall kann akkurat an die Gleichung gepasst werden: y = 33% exp(–t/45 μsec) + 67% exp(–t/326 μsec). Die 45 msec-Komponente entspricht der direkten Fluoreszenz von dem Akzeptor oder einem Detektorartefakt (das durch Sperrung eliminiert werden kann). Die 326 μsec-Komponente beruht auf Energietransfer auf dem Donor-Akzeptor-Komplex, und stimmt extrem gut mit der 329-331 μsec-Donorquenchkomponente überein. Zu beachten ist, dass nach ungefähr 90 μsec die einzige Spezies, die zu dem sensibilisierten Emissionssignal beiträgt, der Donor-Akzeptor-Komplex ist – der Nur-Donor oder der Nur-Akzeptor tragen nichts bei. Dies minimiert das Problem der unvollständigen Markierung signifikant. Das sensibilisierte Emissionslebensdauersignal ist ebenfalls gegenüber der Gesamtkonzentration, gegenüber Quantenwirkungsgraden und gegenüber Nicht-Energie-Transfereffekten, die das Quenchen des Donors verursachen können, nicht empfindlich.
Tabelle 1 fasst die Lebensdauer und die Energietransferdaten auf Donor-Akzeptor markierten DNA-Duplexen von 10, 12 und 14 bp Länge zusammen. Tabelle 1

Lebensdauer (μsec) Effizienz des Energietransfers Berechneter Abstand (Å) Clegg et al. Abstand (Å)

10 mer 336 0,88 46,6 55,5

12 mer 724 0,74 54,6 56,4

14 mer 1154 0,59 61,2 61,0
Daten aus mehreren Experimenten zeigen Quenchen des Donors und sensibilisierte Emissionslebensdauern für eine gegebene Länge, DNA stimmen immer innerhalb von 10%, üblicherweise innerhalb einiger Prozent, überein. Wie erwartet gibt es eine Abnahme im Energietransfer bei gesteigerten Abständen. Zum Vergleich schließen wir die durch Clegg et al. bestimmten Abstände unter Verwendung des Fluoreszein-TMR (11) ein. Beide Ergebnisse sind konsistent mit der Geometrie der Doppelhelix der DNA, obwohl sich unterscheidende Salzkonditionen und Donorlebensdauern zu unterschiedlichen Positionen des Farbstoffs und folglich unterschiedlich gemessenen Abständen führen. Wir haben unsere Abstände unter Verwendung des Clegg et al.-Modells der DNA-Helix und zugefügten Farbstoffen angepasst. Mit nur drei Datenpunkten ist es nicht möglich, alle Parameter in dem Modell einmalig aufzulösen, nichtsdestotrotz wird eine gute Anpassung an ihr Modell erreicht, wenn angenommen wird, dass sich das Terbiumchelat und/oder der Akzeptor recht nah an der DNA-Helix befinden. Dies reduziert die in ihren FRET-Daten gesehene Modulation, die aus der spiralförmigen Geometrie der DNA und der Tatsache hervorgeht, dass ihr Donor und Akzeptor von der Helix weg gestreckt werden (19 Å bzw. 13 Å). Dieser Unterschied ist qualitativ sinnvoll, da von der langen Lebensdauer unseres Donors erwartet wird, das er eingeschränkte Diffusion des Donors und Akzeptors innerhalb der Grenzen, die durch die sechs Kohlenstoff-Linker gesetzt werden, erlaubt, und wegen der größeren hier verwendeten Ionenstärke, die den Abstoß der Ladung minimiert.
Zusammenfassend sind die Daten mit der Geometrie der Doppelhelix-DNA konsistent, wenn die Energietransferdaten auf der Basis des Dipol-Dipol-Förster ähnlichen Mechanismus erlangt werden. Zahlreiche technische Vorteile des Lumineszenzresonanzenergietransfers machen dies zu einer Technik, die für Messungen auf biologisch interessanten Makromolekülen sehr geeignet ist.
Anhang I
Berechnung von R_o: R_o, der Abstand, bei dem 50% der Energie des angeregten Zustands des Donors zu dem Akzeptor übertragen werden, wird von den folgenden Standardgleichungen (1) berechnet: Ro = (8,79 × 10–5Jκ2n–4qD)1/6 Å (2)wobei q_D der Quantenwirkungsgrad der Lumineszenz zur Emission des Donors in der Abwesenheit des Akzeptors ist, J die spektrale Überlappung der Emission des Donors (f_D) und der Absorption des Akzeptors (e_A) (J = ∫f_DE_Aλ^ddλ) ist, n der Brechungsindex ist und k² der geometrische Faktor ist, der sich auf die relativen Winkel der zwei Dipole bezieht. Hier evaluieren wir jeden der Begriffe in Gleichung 2 und erörtern ihre Ungewissheit.
Der Brechungsindex n variiert von 1,33 für Wasser bis 1,39 für zahlreiche organische Moleküle. Wir haben 1,33 verwendet. Eine numerische Integration führt zu einem J Überlappungsintegral von 3,8 × 10¹⁵ nm⁴ M ^–1. Dies ist eine obere Grenze für J, da die 546 nm Spitze von Terbium von dem magnetischen Dipol hervortreten kann, sowie elektrische Dipolübergänge (19) und die vorherigen übertragen nicht signifikant Energie (18). Der Anteil der magnetischen Dipolkontribution kann theoretisch berechnet werden (20, 21), oder das Problem kann durch Verwendung der 492 nm Linie von Terbium, die einfach als elektrischer Dipolübergang (20) bekannt ist, vermieden werden.
Wenn organische Farbstoffe in FRET verwendet werden, ist κ² oft eine signifikante quelle von Ungewissheit und kann im schlimmsten Fall von 0 bis 4 variieren (22). Bei Terbium geht die Emission jedoch aus den mehreren elektronischen Übergängen, die κ²: 1/3 < κ² < 4/3 einschränken, hervor. Zusätzlich dazu ist es wahrscheinlich, dass der Akzeptor während der Lebensdauer des Donors von einer Millisekunde Rotationsbewegung unterzogen werden kann. Dies schränkt κ² weiter ein, und wir nehmen an, dass κ² = 2/3 einer zufälligen Ausrichtung, die schnell innerhalb der Lebensdauer des Donors rotiert, entspricht.
Die genaue Bestimmung des Quantenwirkungsgrads der Lumineszenz des Terbiums q_D ist wegen der wirklich niedrigen Absorbanz des Terbiums schwierig. q_D ist wahrscheinlich jedoch sehr nah an 1 in D₂O (siehe unten). Es ist zu beachten, dass es beim Berechnen von R_o wichtig ist, den Quantenwirkungsgrad des Terbiums (= 1 in D₂O) zu verwenden, nicht den Quantenwirkungsgrad des gesamten Chelats. Der Quantenwirkungsgrad des gesamten Chelats gleicht dem Quantenwirkungsgrad des Lanthanoids mal dem Anteil der Energie, die durch das cs124, das zu dem Lanthanoid übertragen wird, absorbiert wird.
Quantenwirkungsgrad der Lanthanoidemission: es gibt einige Zeilen des (indirekten) Beweises, die darlegen, dass q_D = 1 in D₂O. Als Erstes geht die Emission aus 4f-4f Elektronen der inneren Schale hervor, die von dem Lösungsmittel und anderen Quellen nicht strahlender Entregung durch das Chelat abgeschirmt werden. Die 1,2 H₂O-Moleküle in der primären Koordinationssphäre des Terbiums in unserem Chelat (Daten nicht gezeigt) sind die primäre Quelle der nicht strahlenden Entregung, diese werden aber durch D₂O ersetzt, was Terbium nicht signifikant deaktiviert (15, 23). Die Nichtwasser-Liganden, Carboxylatgruppen und Aminstickstoffe sind beim Deaktivieren des durch Terbium angeregten Zustands extrem ineffizient (23). Über Temperaturstudien (24) haben wir ebenfalls nach Quencheffekten des cs124 geschaut und keine gefunden.
Ein zweiter Beweis, der q_D = 1 in D₂O unterstützt, kommt aus der Arbeit von Elbanowski und Mitarbeitern, die den Quantenwirkungsgrad einer 1:3 Mischung aus Terbium:EDTA direkt gemessen haben und einen Wert von 0,54 (25) gefunden haben. Diese Messung ist schwierig und von unbekannter Genauigkeit, aber nichtsdestotrotz legt sie sogar einen hohen Quantenwirkungsgrad in H₂O nahe, und der Quantenwirkungsgrad in D₂O ist erwartungsgemäß bedeutend höher. (Es sind wahrscheinlich 2 Wassermoleküle an dem Terbium in ihrem Komplex (23) koordiniert.)
Der dritte Beweis kommt von Energietransferexperimenten unter Verwendung von Terbium als ein Donor in Thermolysin (8, 26) und als ein Akzeptor in wirbellosem Calmodulin (6), wobei die Annahme (manchmal implizit) des einheitlichen Quantenwirkungsgrads in D₂O einen guten Kompromiss mit Röntgenkristallographiedaten ergibt.
Anhang II
Berechnen des Fluoreszenzquantenwirkungsgrads des Akzeptors: durch das Vergleichen der Donorquenchlebensdauerdaten mit den Bereichen und die Verwendung von Gleichung 1 ist es möglich, den Quantenwirkungsgrad des Akzeptors zu messen. Dies ist ein allgemeines und neues Verfahren zum Messen von Quantenwirkungsgraden jedes beliebigen Farbstoffs, dessen Absorption die Emission von Terbium (oder Europium) überlappt. Es weist den Vorteil gegenüber konventionelleren Verfahren zum Messen von Quantenwirkungsgraden dadurch auf, dass die Messung nur eine Probe involviert – die aktuelle Probe von Interesse – anstatt eine Referenz mit der Probe zu vergleichen.
Um den Quantenwirkungsgrad von TMR zu evaluieren, nehmen wir an, dass die Unbekannte in Gleichung 1 q_A ist und nehmen die durchschnittliche Effizienz des Energietransfers als 77,6%. Auf der Basis der integrierten Bereiche (620 für f_A und 1 032 für f_D, in willkürlichen Einheiten) ergibt dies q_A = 0,174. Im Vergleich weist das freie Tetramethylrhodamin in Phosphat gepuffertem Salz einen Quantenwirkungsgrad von 0,25 auf, wie durch Standardtechniken gemessen (27).
Parenthetische Referenzen aus Beispiel 1

1) Cantor und Schimmel, (1980) Biophysical Chemistry. (W. H. Freeman und Co., San Francisco); 2) Clegg, (1992) Methods Enzymol. 211:353-388; 3) Selvin, (1994) Methods Enzymol. 246, (im Druck); 4) Coker et al., (1994) Resonance Energy Transfer. (VCH Publishers, Inc.) (im Druck); 5) Stryer et al., (1982) Annu. Rev. of Biophys. and Bioengin. 11:203-222; 6) Bruno et al., (1992) Briochem. 31:7016-7026; 7) Croce und Herrick's, (1992) Biochem. 31:7963-7969; 8) Horrock's, et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4764-4768; 9) Mathis, (1993) Clin. Chem. 39:1953-1959; 10) Selvin et al., (1994) JACS (im Druck); 11) Clegg et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90:2994-2998; 12) Oser et al., (1990) Anal. Biochemistry 191:295-301; 13) Abusaleh und Meares, (1984) Photochem. & Photobiol 39:763-769; 14) Kirk et al., (1993) J. Phys. Chem. 97:10326-10340; 15) Horrocks et al., (1977) JACS 99:2378-2380; 16) Stryer, (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:819-46; 17) Cooper und Hagerman, (1990) Biochemistry 29:9261-9268; 18) Dexter, (1953) J. Chem. Phys. 21:836-850; 19) Bunzli, (1989) Luminescent Probes, Hrsg. Bunzli, J.-C. G., Choppin, G. R. (Elsevier, New York), S. 219-293; 20) Carnall et al., (1968) J. Chem. Phys. 49:4412-4423; 21) Gorller-Walrand et al., (1991) J. Phys. Chem. 95:3099-3106; 22) Dale et al., (1979) Biophys. J. 26:161-194; 23) Horrocks und Sudnick, (1979) J. Am. Chem. Soc. 101:334-350; 24) Alpha et al., (1990) Photochem. and Photobiol. 52:299-306; 25) Elbanowski et al., (1989) Monat. Chem 120:699-703; 26) Berner et al., (1975) Biochem. & Biophys. Res. Commun. 66:763-768; 27) Waggoner, (1994) Methods Enzymol. 246 (im Druck).

Beispiel 2
In diesem Beispiel veranschaulichen wir die Technik des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) durch das Einführen eines Europiumchelats als ein Donor, und eines organischen Farbstoffs, CY-5, als Akzeptor. Die Verwendung von Lanthanoiddonoren im Allgemeinen und diesem Paar im Besonderen weist zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlicheren FRET-Paaren auf, die sich allein auf organische Farbstoffe verlassen. Der R_o ist groß, 70 Å; die Lebensdauer des Donors ist einfach exponentiell und lang (2,5 msec in D₂O); der Ausrichtungsfaktor, der eine Unsicherheit in den gemessenen Abständen schafft, wird durch die mehrfachen elektronischen Übergänge des Donors und die lange Lebensdauer minimiert; die sensibilisierte Emission des Akzeptors kann mit wenig oder keinem sich einmischenden Hintergrund gemessen werden, was eine > 50fache Verbesserung in Signal zu Hintergrund gegenüber standardmäßigen Donator-Akzeptor-Paaren ergibt. Von diesen Verbesserungen in Signal zu Hintergrund wird erwartet, dass sie Abstandsmessungen, die größer als 100 Å sind, realisierbar machen. Wir messen ebenfalls die sensibilisierte Emissionslebensdauer, eine Messung, die unabhängig von Gesamtkonzentration und unvollständiger Markierung ist.
Wir haben ein lumineszentes Europiumchelat als Donor und einen organischen Farbstoff CY-5 als Akzeptor verwendet. Dieser Lumineszenzresonanzenergietransfer (LRET) weist einige Vorteile gegenüber dem herkömmlicheren FRET² auf. Der Abstand, bei dem 50% der Energie übertragen werden, (R_o) ist groß, 70 Å; die Lebensdauer des Donors ist einfach exponentiell und lang (0,63 msec in H₂O; 2,5 msec in D₂O), was die Messungen der Lebensdauer einfach und äußerst akkurat macht; die Ausrichtungsabhängigkeit (κ²) des Energietransfers wird durch die mehrfachen elektronischen Übergänge des Donors und die lange Lebensdauer minimiert, was die Ungewissheit in dem gemessenen Abstand aufgrund der Ausrichtungseffekte auf +/–12% im schlimmsten Fall³ einschränkt; die sensibilisierte Emission des Akzeptors kann mit wenig oder keinem eingreifenden Hintergrund gemessen werden, was eine > 50 fache Verbesserung in Signal zu Hintergrund über standardmäßige Donor-Akzeptor-Paare ergibt und das Messen⁴ von Abständen einige Male R_o ermöglicht. Wir messen ebenfalls die sensibilisierte Emissionslebensdauer, die in unserem Fall unabhängig von der Gesamtkonzentration und unvollständigen Markierung ist.
Wir haben sowohl Terbium⁵ als auch Europium als Donoren verwendet, und die Ergebnisse für Europium werden hier dargestellt. Ein schematisches Diagramm des Donor-Akzeptor-Modellsystems, das doppelsträngige DNA mit Europiumchelat (Donor) bei einem 5'-Ende und CY-5 an dem anderen 5'-Ende beinhaltet, wird unten gezeigt:
Das Europiumchelat (Diethylentriaminpentaessigsäure-carbostyril 124-Eu: Trivialname, DTPA-cs124-Eu) wurde durch eine Modifizierung der Verfahrensweise von Bailey¹², beginnend mit dem Dianhydrid von DTPA (Sigma), Carbostyril 124 (Aldrich), und der synthetischen geschützten DNA-Base und auf der Säule gefertigt, um sicherzustellen, dass die Markierung nur an der 5' Aminogruppe auftritt. Das Cs124 steigert effektiv den Absorptionsquerschnitt des Europiums auf ungefähr 8000 M ^–1cm^–1 bei 337 nm, wo wir den Donor mit einem gepulsten Stickstofflaser anregten. Ein 100facher Überschuss an EDTA entfernte keine bemerkbare Menge an Europium von dem DTPA-cs124 Chelator. Der Akzeptor wurde mit CY-5¹³ (Biological Detection Systems) über standardmäßige Verfahren 5' markiert. Ungekennzeichnete komplementäre DNA-Oligomere wurden als Kontrollen gefertigt. Die ganze DNA wurde in der Umkehrphase HPLC gereinigt. In diesem System dient das doppelsträngige DNA-Oligomer als eine feste Anbindung, um einen definierten Abstand zwischen dem Europiumdonor und dem CY5-Akzeptor festzulegen. Die Punkte der Anbringung des Donors und des Akzeptors werden durch 42 Å getrennt, obwohl die Positionen der Farbstoffe aufgrund der flexiblen Kohlenstofflinker, die zur Anbringung^6,7 verwendet werden, eingeschränkte Variabilität beibehalten.
Die Ergebnisse zeigen die spektralen Charakteristiken, die zu dem ungewöhnlich großen R_o von 70 Å in D₂O führen (56 Å in H₂O). R_o wird von Standardgleichungen¹ auf der Basis einer berechneten spektralen Überlappung (J) von 6,55 × 10¹⁵ M ^–1nm⁴, einem Ausrichtungsfaktor (κ²) von 2/3, einem Brechungsindex von 1,33 und einem Quantenwirkungsgrad für die Lumineszenz von Europium in D₂O von einem (0,25 in H₂O)⁸ bestimmt. Beim Berechnen des R_o ist es wichtig, den Quantenwirkungsgrad der Lanthanoidemission zu verwenden, und nicht den Quantenwirkungsgrad des gesamten Chelats, und nur die Übergänge in der Berechnung der spektralen Überlappung (J) einzuschließen, die elektrische Dipole sind. Die Europiumemission bei 617 nm, die hier zum Energietransfer verwendet wird, hat sich als „gezwungener" elektrischer Dipol⁹ gezeigt, und folglich ist die Förster-Theorie des Energietransfers anwendbar. Die Europiumemission bei 596 nm kann sich nicht an einen Akzeptor koppeln, da es sich um einen magnetischen Dipolübergang handelt und so nicht in der Berechnung der spektralen Überlappung¹⁰ eingeschlossen ist.
Wir können die sensibilisierte Emission des Akzeptors ohne signifikante Beeinträchtigung von entweder der Emission des Donors oder der direkten Akzeptorfluoreszenz messen. Bei 668 nm ist Europium fast still (die Europiumemission bei 668 nm ist 125 mal geringer als ihr Maximum von 617 nm), und durch die Verwendung gepulster Anregung und das Sperren des Detektors für 90 msec, werden die direkte Fluoreszenz des Carbostyrilsensibilisators in dem Donorkomplex und die direkte Fluoreszenz des CY-5 vollständig eliminiert, während das Europium angeregt bleibt und zum Energietransfer¹¹ fähig ist.
Die Ergebnisse zeigen ein solches sensibilisiertes Emissionsexperiment mit dunklem Hintergrund. Hier beträgt das Verhältnis von Donor- zu Akzeptorsträngen ungefähr 1:0,6, wir fügen absichtlich weniger Akzeptor als Donor hinzu, um die Fähigkeit unseres Systems zu zeigen, heterogene Signale zu analysieren. Der durchschnittliche Anteil von Energietransfer bei diesen Ergebnissen beträgt 57%. Das Signal bei 668 nm geht nur aus der sensibilisierten Emission von CY-5 hervor, d. h. Fluoreszenz nur aufgrund von Energietransfer. Wir berechnen das Signal/den Hintergrund bei 668 nm als 94:1 (wobei der Hintergrund aufgrund einer kleinen Menge an Europiumlumineszenz ist), ein Faktor von 50-100 Verbesserung bei Signal/Hintergrund über dem sensibilisierten Emissionssignal von Fluoreszein/Rhodamin, eines der besten Donor-/Akzeptorpaaren, angebracht an dem gleichen 10mer.
Daten der Lebensdauer zeigen, dass das Nur-Donor-Signal mit einer Lebensdauer von 2,52 msec einfach exponentiell ist. Das Donorquenchsignal passt einen Biexponenten extrem gut (r² = 0,998): y = 63% exp(–t/0,22 msec) + 37% exp(–t/2,40 msec). Die Langzeitkomponente entspricht der Nur-Donor-Spezies. Dass die Langzeitkomponente fast der Nur-Donor-Lebensdauer entspricht, ist eine interne Kontrolle, die zeigt, dass der intermolekulare Energietransfer höchstens 5% ist. Die Kurzzeitkomponente geht aus dem intramolekularen Energietransfer in dem hybridisierten Donor-Akzeptor-Komplex hervor und entspricht 91% des Quenchen (1-0,22 msec/2,52 msec), und einem Donor-Akzeptor-Abstand von 46 Å. (Fluoreszein-Rhodamin auf der gleichen DNA mit C-6-Linkern ergibt 22% Energietransfer⁷). Eine Titrierung mit gesteigerter Akzeptorkonzentration steigert den Anteil der Kurzzeitkomponente, ändert aber nicht wie erwartet deren Lebensdauer. Bei zweifachem Überschuss des Akzeptorstrangs verbleibt eine 10%ige Komponente entsprechend dem Nur-Donor-Signal, vermutlich aufgrund der unhybridisierten Donorstränge.
Die Ergebnisse zeigen ebenfalls die Lebensdauer der sensibilisierten Emission. Das sensibilisierte Emissionslebensdauersignal ist an eine Biexponentielle gepasst (r² = 0,999): y = 40% exp(–t/59 μsec) + 60% exp(–t/0,25 msec). Die Kurzzeitkomponente ist auf die direkte Fluoreszenz des Akzeptors zurückzuführen und kann durch das Sperren des Detektors eliminiert werden. Die 0,25 msec Komponente ist aufgrund eines Energietransfers von 90% (1-0,25/2,52 msec), in ausgezeichneter Vereinbarung mit der Kurzzeitkomponente des Donorquenchens. Eine sehr kleine Langzeitkomponente (= 1%) ist aufgrund der direkten Donorfluoreszenz ersichtlich.
Zusammenfassend ergibt der Lumineszenzenergietransfer Ergebnisse, die mit einer Förster-Theorie konsistent sind, unter der Annahme, dass die geeigneten Parameter verwendet werden. Auf der Basis des großen R_o, der Leichtigkeit und Reproduzierbarkeit unserer Lebensdauermessungen, des ausgezeichneten Signals an Hintergrund sind Abstände, die signifikant größer als 100 Å sind, messbar.
FUSSNOTENREFERENZEN IN BEISPIEL 2

(1) Cantor und Schimmel, (1980) Biophysical Chemistry, W. H. Freeman und Co., San Francisco, Band 2; (2) Lanthanoide im Energietransfer sind bei Diffusion erhöhtem FRET verwendet worden (Stryer, L.; Thomas, D. D.; Meares, C. F. (1982) In Annual Review of Biophysics and Bioengineering, L. J. Mullins, Hrsg.; Annual Reviews, Inc., Palo Alto, CA, 11:203-222). Sie sind ebenfalls bei multichromophorischem Allophycocanin verwendet worden (Mathis, (1993) Clin. Chem 39:1953) und als isomorpher Ersatz bei Calcium bindenden Proteinen (Horrocks et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1975), 72, 4764; Cronce und Horrocks, (1992) Biochem 31:7963); (3) Stryer, (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:819-846; (4). Die Fähigkeit, Energietransfer über R_o hinweg unter Verwendung von sensibilisierter Emission zu messen, ist durch Bruno und Horrocks gezeigt worden. Sie verwendeten Terbium als den Akzeptor und Tyrosin als den Donor. Mit einem R_o von 3 Å maßen sie bis zu 12 Å (Bruno et al., (1992) Biochem. 31:7016); (5) Selvin und Hearst, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci, USA (eingereicht), (6) Cardullo et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8780; (7) Clegg et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2994; (8). Die Bestimmung des genauen Quantenwirkungsgrads ist schwierig, obwohl die lange Lebensdauer und der Mangel an strahlungslosen Deaktivierungsmechanismen es wahrscheinlich machen, dass sich der Quantenwirkungsgrad nahe in D₂O befindet. Diese Annahme weist gegebene Abstände in Vereinbarung mit Röntgenstrahlenkristallographiestudien auf (siehe Ref. 4). Bei H₂O wird der Quantenwirkungsgrad verringert, da es 1,3 Wassermoleküle in der primären Koordinationssphäre des Lanthanoids in unserem Chelat gibt (Horrocks und Sudnick, (1979) J. Am. Chem. Soc. 101:334); (9) Bunzli, J.-C. G. (1989) In Lanthanide Probes in Life, Chemical and Earth Sciences, Theory and Practice Luminescent Probes; Bunzli, J.-C. G. & Choppin, G. R. Hrsg.; Elsevier, New York, S. 219-293; (10) Dexter, (1953) J. Chem. Phys. 21:836; (11), Morrison hat gesperrte Integration verwendet, um das Signal zu Hintergrund der sensibilisierten Emission mit organischen Farbstoffen zu steigern. Morrison, (1988) Anal Biochem. 174:101; (12) Bailey et al., (1984) Analyst 109:1449; und (13) Mujumdar et al., (1993) Bioconj. Chem. 4:105.

Beispiel 3. Terbiumchelat – Fluoreszeinenergietransfer
Dieses Beispiel setzte ein Terbiumchelat (Terbiumdiethylentriaminpentaessigsäure gekoppelt mit Carbostyril 124), das Energie an Fluoreszein überträgt, ein. Der Donor und der Akzeptor werden durch ein 8mer DNA Duplex Oligonukleotid, modifiziert mit einem primären Amin an dem 5'-Ende, getrennt. Der Akzeptor ist an einem 5'-Ende eines komplementären Oligonukleotids angebracht. Die sensibilisierte Emission wird ohne Hintergrund bei ungefähr 520 nm gemessen. Des Weiteren gibt es eine ausgezeichnete Überlappung zwischen der 492 nm Linie der Emission des Donors und der Fluoreszeinabsorbanz, was zu einem großen R_o führt. Durch die Verwendung einer gepulsten Anregungsquelle und das Überwachen bei 520 nm geht jedes Signal nur aus der sensibilisierten Emission hervor. Das 8-mer Oligonukleotid wird verwendet, um den Donor und den Akzeptor strikt zu trennen, und der Komplex wird in eine viskose Sacharoselösung eingetaucht, um intermolekulare Interaktionen zu eliminieren, obwohl die Sacharoselösung im Allgemeinen nicht notwendig ist, wenn die Oligonukleotidlösung unter ungefähr 0,25 uM gehalten wird. Das sensibilisateur Emissionssignal zum Hintergrundverhältnis bei 520 nm ist ungefähr 400:1. Das Ausmaß des Energietransfers auf der Basis von sowohl Donorintensitätquenchen und dem integrierten sensibilisierten Emissionsbereich ist 70%. Die Messungen der nicht gequenchten Donorlebensdauer (1,5 msec) in der Abwesenheit des Akzeptors und die sensibilisierte Emissionslebensdauer in dem Donorakzeptorkomplex (Lebensdauer 250 usec) geben ein Quenchen von 85% an. Der Unterschied zwischen den 70 und 85% ist aufgrund des kleinen Anteils von unhybridisierter Donor markierter DNA, die keine Energie übertragen kann.
Beispiel 4. Assay zur enzymatischen (proteolytischen) Aktivität
Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist verwendet worden, um die enzymatische Aktivität zu untersuchen, wenn sich der Abstand zwischen zwei markierten Punkten als eine Funktion dieser Aktivität verändert. Im Allgemeinen kann, wenn FRET verwendet worden ist, LRET ebenfalls verwendet werden, oft mit signifikanten Verbesserungen. Matayoshi et al. (1990) Science 247:954-958, verwendeten zum Beispiel FRET, um die HIV Proteaseaktivität durch das Markieren eines Substratpeptids mit einem Donor und einem Akzeptor auf beiden Seiten einer Proteasebindungs-/-schnittseite zu messen. Wegen der engen Nähe des Donors und des Akzeptors wurde die Donorfluoreszenz in dem intakten Peptid sehr gequencht. Bei Zugabe einer Protease wurde das Peptid gespalten, der Donor und der Akzeptor diffundieren voneinander weg und die Donorfluoreszenz steigerte sich ungefähr vierzigfach. Die Sensibilität des Assays wird weitgehend durch das Ausmaß an Donorquenchen in dem intakten Peptid bestimmt. Der Mangel an 100% Quenchen verursacht Hintergrundfluoreszenz sogar in der Abwesenheit von proteolytischer Aktivität. Die Autoren merken an, dass sie einen Donor mit einer relativ langen Lebensdauer (Zehntel von Nanosekunden) verwendet haben, da dies dabei hilft, das Donorquenchen des intakten Peptids zu steigern. (Der Grund ist, dass das Peptid flexibel ist und eine lange Lebensdauer der Peptidzeit erlaubt, flexibel zu sein, so dass der Donor und der Akzeptor nahe zusammen kommen, was im Donorquenchen resultiert).
Das Ersetzen eines standardmäßigen fluoreszierenden Donors mit einem Lanthanoidchelat stellt einen signifikant reduzierten Hintergrund bereit, und folglich eine bessere Empfindlichkeit. Das Lanthanoidchelat weist eine Lebensdauer auf, die > 10⁵ länger ist als das organische Fluorophor, was zu größerem Donorquenchen aufgrund von Flexibilität des Peptids führt. Zusätzlich dazu kann jede zurückbleibende Donorlumineszenz durch die Verwendung von gepulster Anregung und das Wenden des Detektors für einen Anteil einer Millisekunde nach dem Impuls unterschiedlich behandelt werden. Wenn der Donor um zum Beispiel 90% in dem intakten Peptid gequencht wird, haben die verbleibenden 10% Lumineszenz eine Lebensdauer 1/10 des nicht gequenchten Chelats, oder ungefähr 100 usec. Durch das Absperren des Detektors für einige Hundert Mikrosekunden wird diese verbleibende Donorlumineszenz daran gehindert, den Detektor zu erreichen, während die nicht gequenchte Lumineszenz, die nach der Proteolyse hervorgeht und eine Lebensdauer von ungefähr einer Millisekunde aufweist, relativ unbeeinträchtigt durch die Sperrung ist. Zuletzt erlaubt die außergewöhnliche Effizienz des Energietransfers von den Lanthanoidchelaten zu den Akzeptoren das weiter voneinander entfernte Platzieren der Anbringungspunkte auf dem Peptid, als es mit standardmäßigen Farbstoffen möglich ist. Dies ist eine wichtige Überlegung, wenn die Bindungsstelle des Enzyms groß ist.
Beispiel 5. Erkennung von Genen und DNA-Sequenzen
FRET ist verwendet worden, um spezifische DNA-Sequenzen zu erkennen, Morrison et al. (1989) Analytical Biochemistry 183:231-244, und Lee at al. (1993) Nucleic Acids Research 21:3761-3766. Der primäre Vorteil der Verwendung von FRET bei dieser Anwendung ist, dass die Technik potentiell sensibel ist (d. h. dazu fähig, eine oder einige „Ziel"-DNA-Sequenzen zu erkennen), und in einem homogenen Format vorgenommen werden kann. Die gleiche Technik, die von Lee et al. beschrieben wird, ist nun ein im Handel erhältliches Produkt von Applied Biosystems, bekannt als „TaqMan". Bei dieser Anwendung wird eine zu der Ziel-DNA-Sequenz komplementäre DNA-Sonde, angebracht mit dem Donor und dem Akzeptor, gemacht. Wenn die Sonde intakt und einsträngig ist, wird der Donor sehr gequencht, da sich der Akzeptor in naher Nähe befindet. Wenn die Sonde zu der Ziel-DNA hybridisiert, wird die Sonde durch eine spezifische Endo- oder Exonuklease verringert. Der Donor ist dann frei, von dem Akzeptormolekül weg zu diffundieren, und die Donorfluoreszenz steigert sich. Wenn es keine Ziel-DNA gibt, tritt keine spezifische Degradierung auf, und keine spezifische Steigerung in der Donorfluoreszenz tritt auf.
Dieses System kann ebenfalls die Verstärkung ausnutzen: es gibt zahlreiche Sonden-DNA-Moleküle, und jedes Mal, wenn sich eins bindet, wird die Sonde in dem doppelsträngigen Produkt durch die Nuklease hydrolisiert, und die Fluoreszenz steigert sich. Sobald ein Sondenmolekül verringert wird, kann sich ein anderes Sondenmolekül binden, und das Enzym wiederholt den Prozess. Für nur ein Target kann folglich die Fluoreszenz von zahlreichen Sondenmolekülen erzeugt werden. Eine Vielfalt von Exonukleasen und Endonukleasen sind mit der Verstärkung kompatibel; Applied Biosystems benutzt zum Beispiel Taq-Polymerase, die eine 5'-Exonukleaseaktivität aufweist. Wenn die Sonde RNA beinhaltet, kann RNAaseH verwendet werden, um die Verstärkung auszunutzen.
Bei jedem dieser auf FRET basierenden Systeme zur Erkennung von DNA verbessert das Ersetzen des organischen Farbstoff-Donors durch ein Lanthanoidchelat das Assay. Das Ausmaß des Donorquenchens bei der intakten einsträngigen Sonde ist wegen der langen Lebensdauer und dem effizienten Energietransfer des Lanthanoids bedeutend größer. Jede verbleibende Donorlumineszenz kann durch Zeitsperrung unterschiedlich behandelt werden. Das Ergebnis ist signifikant verringerter Hintergrund (genau analog zu dem oben dargelegten Proteaseexperiment).
Beispiel 6. Auf die Lebensdauer zugeschnittene Farbstoffe
Wie oben erörtert, können die Lanthanoide in Mikroskopie und bei Erkennung im Allgemeinen als lumineszente Markierungen verwendet werden. Durch die Verwendung von gepulster Anregung und Zeit verzögerter Erkennung ermöglicht die Lebensdauer (Millisekunden) des lange angeregten Zustands des Lanthanoids das Isolieren des Signals von Hintergrundfluoreszenz, die normalerweise die Dauer einer Nanosekunde hat. Die lange Lebensdauer hat jedoch den Nachteil, dass die Signalintensität pro Molekül notwendig schwach ist: ein Molekül mit einer angeregten Zustandslebensdauer von 1 msec kann höchstens 1 000 Photonen/Sek. emittieren. Dies ist besonders signifikant bei hohen Illuminationsintensitäten, bei denen langsam emittierende Moleküle sättigen können. Bei niedriger Illuminationsintensität ist die lange Lebensdauer nicht schädlich, da jedes Lanthanoid bei einer Rate von weniger als der Inverse der Lebensdauer angeregt wird. Idealerweise würde man über eine lumineszente Markierung verfügen, bei der die Lebensdauer auf den optimalen Zeitmaßstab zugeschnitten werden kann – lang genug, dass der Hintergrund unterschiedlich behandelt werden kann und kurz genug, dass die Signalintensität nicht signifikant beeinträchtigt wird. Da der Hintergrund normalerweise eine Lebensdauer von Nanosekunden aufweist, würde zum Beispiel eine Sonde mit einer Lebensdauer von Millisekunden immer noch eine tausendmal längere Lebensdauer aufweisen, was die Unterscheidung des Signals ermöglichen würde, wäre aber potentiell fähig, 1 000 mal mehr Photone/Sek. als das Millisekundenlanthanoid zu emittieren. Derartige Lebensdauer zugeschnittene Farbstoffe können unter Benutzung von Lumineszenzenergietransfer zwischen einem Lanthanoidchelat (als Donor) und einem fluoreszierenden Akzeptor gemacht werden. Das Signal wird die Emission des Akzeptors aufgrund von Energietransfer sein. Die Lebensdauer dieser Emission (τ) wird der Lebensdauer des gequenchten Donors entsprechen, und wird sein wie folgt: τ = τ0(1 – E) (1)wobei τ₀ die Lebensdauer des Lanthanoidchelats in der Abwesenheit des Akzeptors ist und E der Anteil der übertragenen Energie ist (ebenfalls Effizienz der übertragenen Energie genannt). Der Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor (R), um ein gegebenes τ zu erreichen, kann leicht berechnet werden unter Verwendung der Standardformel für FRET, Cantor et al. (1980) Biophysical Chemistry, WH Freeman und Co, SF, eine Formel, die sich als anwendbar erwiesen hat auf LRET (Selvin et al. (1994) PNAS USA 91:10024-10028; Selvin et al. J. Amer. Chem. Soc. 116:6029-6030; Selvin et al. (1994) Methods in Enzymology, K Sauer, Academic Press, Orlando): E = 1/[1 + (R/Ro)6] (2)wobei R_o aus den spektralen Eigenschaften des Donors und des Akzeptors berechnet werden kann. Das Kombinieren der Gleichungen 1 und 2 ergibt die Lebensdauer als eine Funktion des Abstands zwischen dem Donor und dem Akzeptor: τ = τ0/[1 + (Ro/R)6] (3)
Wenn τ₀ 1,5 msec ist, dann wird mit einem 90%igen Energietransfer die sensibilisierte Emission mit einer Lebensdauer von 150 usec zerfallen. Bei 99% Energietransfer beträgt die Lebensdauer 15 usec. Wenn eine lumineszente Markierung mit einer Lebensdauer von 15 usec gewünscht ist, dann sollten der Donor und der Akzeptor so platziert werden, dass ein Energietransfer von 99% auftritt. Dies entspricht einem Abstand von 0,465 × R_o. Für Tb-Chelat als Donor und Tetramethylrhodamin als Akzeptor (Selvin, et al., 1995, supra) wo R_o = 60 Å, entspricht dies 28 Å. Eine Sonde mit einer Lebensdauer von 1,5 usec kann erreicht werden, indem der Donor und der Akzeptor für 99,9% Energietransfer 0,316 R_o entfernt voneinander platziert werden, oder 19 Å für Tb-Chelat und Tetramethylrhodamin.
Es ist zu beachten, dass auf die Lebensdauer zugeschnittene Farbstoffe gefertigt werden können, um bei vielen verschiedenen Farben zu emittieren. Jeder Akzeptor, der Energie von dem lumineszenten Lanthanoidchelat nehmen kann, ist möglich. Die Absorption des Akzeptors muss nicht mit der Hauptemissionslinie des Lanthanoids überlappen, das Überlappen mit weniger intensiven Emissionslinien kann immer noch sehr effizienten Energietransfer ergeben, solange der Akzeptor ausreichend nah platziert ist. Ein Donor-/Akzeptorpaar mit einem R_o von nur 30 Å ergibt immer noch 99,9% Energietransfer bei einem Abstand von 9,5 Å. Es ist weiter zu beachten, dass effizienter Energietransfer auftreten kann, selbst wenn das Donorlanthanoid einen relativ schlechten Quantenwirkungsgrad für die Emission aufweist. Während Tb- und Eu-Quantenwirkungsgrade dazu neigen, in dem angemessenen Chelat recht hoch zu sein, werden andere Lanthanoide und Übergangselemente mit signifikant niedrigeren Quantenwirkungsgraden wie etwa Pr, Nd, Sm, Dy, Ho, Er, Tm und Ru, Os und Sm ebenfalls nützliche Donoren. Schließlich ist zu beachten dass, da die Effizienz des Energieübergangs im Allgemeinen hoch ist (> 90%), beinahe jedes Photon, das von dem Lanthanoid emittiert worden wäre, nun durch den Akzeptor emittiert wird, aber in einem kürzeren Zeitraum. Der einzige signifikante Verlust bei Photonen geht aus dem nicht einheitlichen Quantenwirkungsgrad des Akzeptors hervor. Dies kann durch die Wahl von Akzeptoren mit hohen Quantenwirkungsgraden minimiert werden.
Eine große Vielfalt von unterschiedlichen Linkermolekülen kann verwendet werden, um diese auf die Lebensdauer zugeschnittenen Farbstoffe zu schaffen. Im Allgemeinen stellen diese Gegenstandslinker Trennungsabstand von ungefähr 4 bis 60, vorzugsweise von ungefähr 9 bis ungefähr 30 Å bereit. Die Komposition des Linkers wird auf der Basis der Bedürfnisse der Anwendung ausgewählt, hydrophobe polymerische Linker werden z. B. verwendet, um Membran durchlässige Farbstoffe bereitzustellen. Peptide werden leicht auf nützliche Längen synthetisiert, und ihre N← und C-Termini können verwendet werden, um den Donor und den Akzeptor anzubringen. Durch das Einführen eines internen Aminophenylalanins (oder eines Lysins) wird ein reaktionsfähiges Isothiocyanat zur Anbringung des Komplexes an einem biologischen (oder anderen) Makromolekül erzeugt. Peptide weisen ebenfalls den Vorteil auf, dass die Eigenschaften des Peptids für eine bestimmte Anwendung optimiert werden können, Polyprolin ist zum Beispiel sehr steif und hydrophob, Polylysin ist hydrophil und hoch positiv geladen; während Polyglutamat oder Polyaspartat hydrophil und negativ geladen sind. Andere Linker umfassen Polymere wie etwa Polysaccharide, die eine ausgezeichnete Lösbarkeit und Reaktivität, Polyimide und Nukleinsäuren aufweisen. Die Polymere können derivatisiert werden, um verbesserte Anbringungsstellen bereitzustellen, z. B. kann ein primäres Amin in einen Nukleinsäurestrang eingeführt und in eine Isothiocyanatgruppe zur Anbringung an Makromolekülen konvertiert werden.

Claims

Ein Lanthanoidchelat, das einen kovalent mit einem Sensibilisator verbundenen Lanthanoidchelator beinhaltet, wobei der Chelator eine Vielzahl von Carboxylat- oder Phosphonatgruppen beinhaltet, wobei das Chelat fähig ist, ein Lanthanoid mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁶ M^–1 zu binden, wobei ein Komplex aus dem Chelat und dem Lanthanoid zur erhöhten Lanthanoidlumineszenz fähig ist, und wobei der Sensibilisator durch die folgende Allgemeinformel dargestellt wird:
wobei X ein Atom aus der Periodengruppe 5 oder 6 beinhaltet, wobei ein erstes Kohlenstoffatom in Position 2-8 des Sensibilisators, das das Kohlenstoffatom in Position 2 oder 4 ist, durch eine doppelte kovalente Bindung mit einem Sauerstoffatom substituiert wird, und wobei ein einzelnes, zweites Kohlenstoffatom in Position 2-8 des Sensibilisators, das das Kohlenstoffatom in Position 7 ist, mit einer Verknüpfungsgruppe substituiert wird, durch die der Sensibilisator kovalent mit dem Chelator verbunden ist, wobei ein Komplex des Chelats und eines Lanthanoids zum Binden des Chelats mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁶ M^–1 zu mindestens 500% größerer Lumineszenzintensität als das Lanthanoid fähig ist.
Chelat gemäß Anspruch 1, wobei die Verknüpfungsgruppe im Wesentlichen aus einer Amin- oder Carboxylgruppe besteht.
Chelat gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei ein drittes Kohlenstoffatom in Position 2-8 des Sensibilisators, das sich von den ersten und zweiten Kohlenstoffatomen in Position 2-8 unterscheidet, substituiert wird.
Chelat gemäß Anspruch 3, wobei das dritte Kohlenstoffatom in Position 2-8 der Kohlenstoff in Position 4 ist und durch einen Kohlenwasserstoff oder Halogen substituierten Kohlenwasserstoff substituiert wird.
Chelat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Sensibilisator ein 2- oder 4-Quinolon oder ein 2- oder 4-Cumarin beinhaltet.
Chelat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Sensibilisator Carbostyril 124 (7-amino-4-methyl-2-quinolon), Cumarin 120 (7-amino-4-methyl-2-cumarin) oder Cumarin 124 (7-amino-4-(trifluoromethyl)-2-cumarin) ist.
Chelat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Komplex des Chelats und eines Lanthanoids, fähig zum Binden des Chelats mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁸ M^–1, zu mindestens 5 000% größerer Lumineszenzintensität als das Lanthanoid fähig ist.
Chelat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine erste Lösung, die Komplexe des Chelats und eines Lanthanoids beinhaltet und dazu fähig ist, das Chelat mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁸ M^–1 zu binden, zu mindestens 5 000% größerer Lumineszenzintensität fähig ist, als es eine zweite Lanthanoid beinhaltende Lösung ist, wobei die erste und die zweite Lösung identisch sind, außer der Anwesenheit des Chelats in der ersten Lösung und der Abwesenheit des Chelats in der zweiten Lösung.
Chelat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Lanthanoid Terbium oder Europium ist.
Chelat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Chelator fähig ist, das Lanthanoid mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10¹⁰ M^–1 zu binden.
Chelat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Chelator EDTA, DTPA, DOTA, NTA oder HDTA, oder ein DTPP, EDTP, HDTP oder NTP entsprechendes analoges Phosphonat beinhaltet.
Chelat gemäß Anspruch 11, wobei der Chelator DTPA beinhaltet.
Chelat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Chelat kovalent mit einem Makromolekül verbunden ist.
Chelat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erhöhte Lanthanoidlumineszenz eine mindestens 50 000% größere Intensität ist.
Eine molekulare Markierung, die ein Chelat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche beinhaltet, das kovalent mit einem Analyt selektiven Reagens verbunden ist.
Ein Verfahren zum Erhöhen der Lumineszenz eines Lanthanoids, wobei das Verfahren Folgendes beinhaltet: Bilden einer Mischung eines Lanthanoidchelats gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche und eines Lanthanoids, das zum Binden des Chelats mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁸ M^–1 fähig ist, wobei ein lumineszenter Lanthanoidchelat-Lanthanoid-Komplex gebildet wird.
Verfahren zum Erkennen eines Analyts, der in einem Abschnitt einer Probe vorhanden sein kann, durch Lumineszenz, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet: Kontaktieren eines Probenabschnitts mit einem lumineszenten Komplex eines Lanthanoidchelats gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche und einem Lanthanoid, das fähig ist, das Chelat mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁸ M^–1 zu binden, wobei das Chelat kovalent mit einem Reagens verbunden ist, das zum selektiven Binden des Analyts fähig ist; Inkubieren des Probenabschnitts unter Bedingungen, bei denen das Reagens zum selektiven Binden des Analyts fähig ist; Belichten des Probenabschnitts bei einer ersten Wellenlänge, die fähig ist, einen ersten elektronischen Übergang in dem Chelat zu induzieren; Erkennen einer Lichtabgabe von dem Probenabschnitt bei einer zweiten Wellenlänge, wobei die zweite Wellenlänge länger als die erste Wellenlänge ist und aus einem zweiten elektronischen Übergang in dem Chelat resultiert; wobei das Erkennen der Lichtabgabe mit der Anwesenheit des Probenabschnitts des Analyts korreliert.
Verfahren zum Erkennen des Abstands zwischen einer ersten Position und einer zweiten Position in einem Abschnitt einer Probe durch Resonanzenergietransfer unter Verwendung eines lumineszenten Lanthanoidchelatdonors und eines organischen Resonanzenergieakzeptors, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet: Belichten eines Probenabschnitts, der den Donor beinhaltet, der sich an der ersten Position befindet, und den Akzeptor, der sich an der zweiten Position befindet, bei einer ersten Wellenlänge, die fähig ist, einen ersten elektronischen Übergang in dem Donor zu induzieren, wobei der Donor einen Komplex eines Lanthanoidchelats gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche beinhaltet und ein Lanthanoid, das fähig ist, das Chelat mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens 10⁸ M^–1 zu binden, und wobei die spektrale Überlappung der Emission des Donors und der Absorption des Akzeptors ausreichend ist, um den Energietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor wie durch erkennbares Quenchen der Lumineszenzintensität des Donors oder der Lebensdauer oder der erkennbaren Erhöhung in der Lumineszenzintensität oder Lebensdauer des Akzeptors gemessen zu ermöglichen; wobei mindestens eines von Folgendem erkannt wird: die Intensität einer ersten Lichtabgabe von dem Probenabschnitt bei einer zweiten Wellenlänge, wobei die zweite Wellenlänge länger ist als die erste Wellenlänge und aus einem zweiten elektronischen Übergang in dem Donor resultiert, wobei die Intensität der ersten Lichtabgabe invers mit dem Abstand zwischen der ersten und zweiten Position des Probenabschnitts korreliert; und die Intensität einer zweiten Lichtabgabe von dem Probenabschnitt bei einer dritten Wellenlänge, wobei die dritte Wellenlänge länger ist als die erste Wellenlänge und aus einem elektronischen Übergang in dem Akzeptor resultiert, wobei die Intensität der zweiten Lichtabgabe mit dem Abstand zwischen der ersten und zweiten Position des Probenabschnitts korreliert.
Verfahren gemäß Anspruch 18, das verwendet wird, um den Status einer Polymerase-Kettenreaktion zu überwachen, wobei der Probenabschnitt einen Zielnukleinsäurestrang beinhaltet, der einen ersten Strangabschnitt und einen diagnostischen Nukleinsäurestrang beinhaltet, der ein erstes Atom beinhaltet, das kovalent mit dem Donor verbunden ist, und ein zweites Atom, das kovalent mit dem Akzeptor verbunden ist, wobei das erste und das zweite Atom durch einen zweiten Strangabschnitt getrennt werden, wobei der erste und der zweite Strangabschnitt ausreichend komplementär sind, um unter Entspannungskonditionen zu hybridisieren; wobei der zweite Strangabschnitt ausreichend lang ist, um einen erkennbaren Unterschied bei dem Aggregatenergietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor bereitzustellen, wenn der erste und zweite Strangabschnitt wie im Vergleich zu dem Aggregatenergietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor hybridisiert werden, wenn der erste und zweite Strangabschnitt nicht hybridisiert werden, wobei der erkennbare Unterschied als mindestens einer eines erkennbaren Quenchens von Donorlumineszenz oder erkennbarer Erhöhung in der Akzeptorlumineszenz gemessen wird, und der Abstand zwischen dem ersten und dem zweiten Atom angibt, ob die Nukleinsäurestränge hybridisiert sind.