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Hintergrund
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Die
Erfindung betrifft Fusionsprotein-Expressionssysteme für die Verwendung
in Säugetierzellen,
die die Produktion eines gegebenen Zielproteins verstärken. Insbesondere
betrifft die Erfindung eine Sekretionskassette, die aus einem Säugetier-Signalpeptid
und einem Teil von Säugetier-Immunglobulinen
besteht, die, wenn als der aminoterminale Fusionspartner für das Zielprotein
verwendet, im Allgemeinen zu einem hohen Expressions- und Sekretionsspiegel
des Fusionsprodukts führt.
Derartige Fusionsproteine sind, zum Beispiel, für die Herstellung und extrazelluläre Sammlung
von Zielproteinen ohne die Notwendigkeit einer Lyse einer Wirtszelle
von Nutzen. Die Erfindung ist vielleicht am meisten für die Expression
von Zielproteinen von Nutzen, die normalerweise nicht von einer
Wirtszelle sezerniert werden, von einer Wirtszelle mit niedrigen
Spiegeln sezerniert werden oder für eine Wirtszelle toxisch oder
auf andere Weise schädlich
sind.
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Gen-Fusionskonstrukte
einsetzende Expressionssysteme wurden verwendet, um die Produktion
von Proteinen in Bakterien zu erhöhen. Der Einsatz eines bakteriellen
Proteins, dessen Exprssionsspiegel normalerweise sehr hoch ist,
als der aminoterminale Fusionspartner eines Fusionsproteins hilft
dabei, effiziente Traskription und Translation der Botschaft und
in einigen Fällen
die Sekretion und das Löslichmachen
des Fusionsproteins zu gewährleisten
(Smith und Johnson (1988) Gene 67:31; Hopp et al. (1988) Biotechnology 6:1204;
La Vallie et al. (1993) Biotechnology 11:187). Das Hauptziel der
Expression von rekombinanten Fusionsproteinen in Säugetierzellen
war die Übertragung
von neuen Eigenschaften auf die Hybridmoleküle, z. B. Lenkung eines Cytokins
oder Toxins in vivo, Fc-Rezeptorbindung, Komplementfixierung, Protein
A-Bindung, Erhöhung
der Halbwertszeit und Durchqueren der Blut-Hirn-Schrank. Beispiele für rekombinante
Fusionsproteine, die in Säugetierzellen
hergestellt werden, umfassen Cytokin-Immunokonjugate (Gillies et
al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1428; Gillies et al. (1993)
Bioconjugate Chemistry 4:230), Immunadhäsine (Capon et al. (1989) Nature
337:525), Immuntoxine (Chaudhary et al. (1989) Nature 339:394),
und ein Nervenwachstumsfaktor-Konjugat (Friden et al. (1993) Science
259:373).
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In
der PCT-Veröffentlichung
WO 91/08298 werden Fusionsproteine
offenbart, die in N- zur C-Richtung (5' → 3') eine Signalsequenz
enthalten, die mit einem Zielprotein verbunden ist ("Ligandenbindungspartner"), das mit einer
Gelenkregion verbunden ist, die schließlich mit der Fc-Region eines
Immunglobulins (CH2-CH3-Domäne) verbunden
ist. Diese Konstrukte zeigen eine erhöhte Plasmastabilität des Ligandenbindungspartners.
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Gillies
et al. (Bioconjugate Chem. 1993, 4, 230-235) lehren Fusionsproteine,
die aus einem intakten vollständigen
Antikörper
bestehen, der mit seinem C-Terminus an den N-Terminus eines Cytokins
wie beispielsweise IL2 und GM-CSF verbunden ist. Diese Immuncytokine
zeigen eine deutlich rasche Clearance-Geschwindigkeit in vivo, bezogen
auf den freien Antikörper.
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Proteine,
die in Säugetierzellen
hergestellt werden, weisen oftmals nicht die Löslichkeits- und Sekretionsprobleme
auf, die bei bakterieller Expression angetroffen werden. Die Verwendung
von Genfusions-Konstrukten zur Erhöhung der Produktion oder Sekretion
eines Zielproteins in einem Säugetiersystem
wurde nicht vollständig
erforscht.
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung DNAs bereitzustellen, die die Produktion
und Sekretion eines Zielproteins erleichtern. Insbesondere sind
Aufgaben der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von neuen
DNAs, die: effiziente Produktion und Sekretion von schwer zu exprimierenden
Proteinen, wie beispielsweise Nucleoproteinen, regulatorischen Proteinen
oder Proteinen, die auf andere Weise für eine Wirtszelle toxisch sein
können,
erleichtern und die an jegliches interessierende Zielpolypeptid
angepasst werden können,
die kodiert werden und in einem Wirtsorganismus exprimiert werden
können;
die Bereitstellung von DNA-Konstrukten für die schnelle und effiziente
Produktion und Sekretion von Proteinen in einer Vielzahl von Wirtszellen;
und die Bereitstellung eines Verfahrens zur Produktion, Sekretion
und Sammlung von genetisch veränderten
Proteinen, einschließlich
nicht-nativen, biosynthetischen oder auf andere Weise künstlichen
Proteinen, wie beispielsweise Proteinen, die durch rationales Design
erschaffen wurden. Andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind
die Bereitstellung von DNA-Sequenzen, die, wenn mit einem für ein Zielprotein kodierenden
Polynucleotid fusioniert, für
ein Fusionspolypeptid kodieren, das unter Verwendung von üblichen
Reagenzien und Techniken gereinigt werden kann, und gegebenenfalls
die Einführung
einer proteolytischen Spaltungsstelle zwischen der kodierten Sekretionskassette
und dem kodierten Zielprotein, so dass die Sekretionskassette von
dem Zielprotein abgespalten werden kann und das Zielprotein unabhängig gereinigt
werden kann. Noch eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines
Verfahrens, das sowohl effizient wie auch kostengünstig ist.
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Diese
und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden
Beschreibung, den Abbildungen und Ansprüchen offensichtlich.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bietet eine DNA mit allgemeiner AnwendBarkeit
für die
Produktion und Sekretion von Fusionsproteinen. Die DNA enthält eine
Sekretionskassette als den aminoterminalen Fusionspartner und ein
Zielprotein, und wird hierin als ein „Immunfusin" bezeichnet. Die
Erfindung stellt, in ihren verschiedenen Aspekten, eine rekombinante
DNA bereit, die für
das Immunfusion kodiert, und Verfahren zur Herstellung des kodierten
Immunfusinproteins. Das Immunfusin ist eine DNA, die ein Polynucleotid
enthält,
das für eine
Sekretionskassette kodiert, die in ihrer 51 zur 3'-Richtung eine Signalsequenz
und eine Immunglobulin-Fc-Region
enthält
und ein Polynucleotid, das für
ein Zielprotein kodiert, das an das 3'-Ende der Sekretionskassette fusioniert
ist. Eine erfindungsgemäße Sekretionskassette
kann, einmal konstruiert, an verschiedene Zielproteine fusioniert
werden. Außerdem
kann man die Sequenzen optimieren, die die Expression einer Sekretionskassette
regulieren, und so die Expression des Immunfusins. Die resultierende
DNA kann in einer Wirtszelle in hohen Spiegeln exprimiert werden,
und das Fusionsprotein wird effizient von der Wirtszelle produziert
und sezerniert. Das sezernierte Immunfusin kann aus dem Kulturmedium
gesammelt werden, ohne dass die Wirtszelle lysiert werden muss,
und kann auf Aktivität
untersucht werden oder unter Verwendung von üblichen Reagenzien gereinigt
werden, je nach Wunsch.
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Der
Anteil der DNA, der für
die Signalsequenz kodiert, kodiert vorzugsweise für ein Peptidsegment, das
die Sekretion des Immunfusinproteins steuert und anschließend abgespalten
wird. Wie in der Patentschrift und den Ansprüchen verwendet, meint „Immunglobulin-Fc-Region" den carboxyterminalen
Teil einer konstanten Region der schweren Immunglobulinkette. Jede
konstante Region der schweren Immunglobulinkette besteht bekanntermaßen aus
vier oder fünf
Domänen.
Die Domänen
werden aufeinander folgend wie folgt bezeichnet: CH1-Gelenk-CH2-CH3(-CH4),
und der Fc-Region von jeder Immunglobulin-Unterklasse fehlt die CH1-Domäne. Wie
aus einer Übersicht
der DNA-Sequenzen der Immunglobulin-Unterklassen ersichtlicht, weisen
die DNA-Sequenzen der Domänen
der schweren Kette eine Kreuzhomologie unter den Immunglobulinklassen
auf, z. B. ist die CH2-Domäne
von IgG homolog zur CH2-Domäne
von IgA und IgD, und zur CH3-Domäne
von IgM und IgE.
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Die
derzeit bevorzugte Sekretionskassette ist ein Polynucleotid, das
in seiner 5'- zur
3'-Richtung für die Signalsequenz
eines Gens einer leichten Immunglobulinkette und die FCγ1-Region
des humanen Immunglobulin γ1-Gens
kodiert. Die Fcγ1-Region
des Immunglobulin γ1-Gens
umfasst einen Teil der Gelenk-Domäne, der CH2-Domäne
und CH3-Domäne.
Die für
die Sekretionskassette kodierende DNA kann in ihrer genomischen
Konfiguration oder in ihrer cDNA-Konfiguration
vorliegen. Die unten beschriebenen Untersuchungen verwenden jedoch
eine Sekretionskassette in der genomischen Konfiguration. Die Verwendung
des humanen Fcγ1
als die Fc-Regionssequenz hat mehrere Vorteile. Zum Beispiel kann,
wenn das Fusionsprotein als ein Biopharmazeutikum verwendet werden
soll, die Fcγ1-Domäne die Effektorfunktionsaktivitäten auf
das Fusionsprotein übertragen.
Die Effektorfunktionsaktivitäten
umfassen die biologischen Aktivitäten wie beispielsweise Komplementfixierung,
antikörpergerichtete
zelluläre
Zytotoxizität,
Fähigkeit
für Plazentadurchtritt
und eine längere
Halbwertszeit im Serum. Die Fc-Domäne ermöglicht auch den Nachweis durch
anti-Fc-ELISA und Reinigung durch Bindung an das Staphylococcus
aureus Protein A ("Protein
A"). In bestimmten
Anwendungen kann es wünschenswert
sein, spezifische Effektorfunktionen aus der FC-Region zu deletieren,
wie beispielsweise Fc-Rezeptorbindung oder Komplementfixierung.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann die Fc-Region ein murines Immunglobulin-Gen sein. Die Verwendung
von murinem Fc als die Fc-Region kann Vorteile haben. Zum Beispiel
wird dann, wenn das Fusionsprotein für die Herstellung von Proteinen
in Mäusen
verwendet werden soll, die murine Fc-Region keine Immunantwort in
dem Wirtstier hervorrufen. Die Fc-Domäne kann die Effektorfunktionsaktivitäten an das
Fusionsprotein übertragen
und den Nachweis des Fusionsproteins durch anti-Fc-ELISA sowie die
Reinigung durch Bindung an Protein A ermöglichen. In bestimmten Anwendungen
kann es wünschenswert
sein, spezifische Effektorfunktionen aus der Fc-Region zu deletieren.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kodiert die DNA-Sequenz für
eine proteolytische Spaltungsstelle, die zwischen die Sekretionskassette
und das Zielprotein eingeschoben ist. Eine Spaltungsstelle ermöglicht die proteolytische
Spaltung des kodierten Fusionsproteins und so die Abtrennung der
Fc-Domäne
von dem Zielprotein. Wie hier verwendet, versteht sich „proteolytische
Spaltungsstelle" als
die Aminosäuresequenzen,
die durch ein proteolytisches Enzym oder andere proteolytische Spaltungsmittel
gespalten werden. Wie weiter unten noch genauer beschrieben, umfassen
nützliche
proteolytische Spaltungsstellen Aminosäuresequenzen, die durch proteolytische
Enzyme wie Trypsin, Plasmin oder Enterokinase K erkannt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
kodiert die Zielproteinsequenz für
das Prostata-spezifische Membranantigen, PSMA. PSMA ist ein Membranprotein
vom Typ II, also wird die extrazelluläre Domäne, oder lösliche Form des Proteins, als
die Zielproteinsequenz verwendet. Die kodierte lösliche Form von PSMA kann eine
humane Sequenz sein, wie beispielsweise die in Israeli et al. (1993)
Cancer Res., 53:227-ff. bereitgestellte Sequenz.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
kodiert die Zielproteinsequenz für
das Protein gp120. Das Hüllprotein
gp120 des humanen Immundefizienz-Virus ist ein Glykoprotein, das
in infizierten Zellen als ein Polyprotein, gp160 exprimiert wird,
und dann durch eine zelluläre
Protease in gp120 und gp41 gespalten wird. Die Nucleotidsequenz
und die Aminosäuresequenz
von gp120 wird in Ratner et al., 1985, Nature, 313:277-ff bereitgestellt.
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In
einem weiteren Aspekt wird die erfindungsgemäße DNA-Sequenz innerhalb eines
replizierbaren Expressionsvektors integriert. Wie hier verwendet,
versteht sich „Vektor" als jegliche Nukleinsäure, die
eine interessierende Nucleotidsequenz enthält und für einen Einbau in eine Wirtszelle
und für
eine Rekombination mit und Integration in das Wirtszellengenom kompetent
ist, oder für
eine autonome Replikation als ein Episom. Derartige Vektoren umfassen
lineare Nukleinsäuren,
Plasmide, Phagemide, Cosmide und dergleichen. Ein bevorzugter Expressionsvektor
ist pdC, in dem die Transkription der Immunfusin-DNA unter die Kontrolle
des Enhancers und des Promotors des humanen Cytomegalovirus gestellt
wird. Der Vektor pdC wurde von pdEMp abgeleitet, der in Lo et al.
1991, Biochim. Biophys. Acta 1088:712 wie folgt beschrieben wurde.
Das SalI-XhoI-Fragment, das die originale Enhancer- und Promotersequenz
enthält,
wurde durch den Enhancer und Promotor des humanen Cytomegalovirus
mittels standardmäßiger molekularbiologischer
Techniken ersetzt. Die Enhancer- und Promotersequenz des verwendeten
humanen Cytomegalovirus wurde von den Nucleotiden –601 bis
+7 der Sequenz abgeleitet, die in Boshart et al., 1985, Cell 41:521
bereitgestellt wurde. Der Vektor enthält auch das mutierte Dihydrofolat-Reductase-Gen
als einen Selektionsmarker (Simonsen und Levinson (1983) Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 80:2495.
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Eine
geeignete Wirtszelle kann mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz transformiert oder transfiziert
werden und für
die Expression und Sekretion eines Zielproteins genutzt werden.
Derzeit bevorzugte Wirtszellen für
die Verwendung in der Erfindung umfassen unsterbliche Hybridom-Zellen,
Myelom-Zellen, 293-Zellen, (Chinese hamster ovary-) CHO-Zellen,
Hela-Zellen und COS-Zellen. Wie hier verwendet, versteht sich „Genexpression" oder „Expression
eines Zielproteins" als
Bezug auf die Transkription der DNA-Sequenz, Translation des mRNA-Transkripts
und Sekretion des Fusionsproteinprodukts.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst die Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die für ein Immunfusin
kodiert, Transfektion der DNA-Sequenz
in eine Wirtszelle durch eine zugängliche Transfektions- oder Transformationstechnik,
Kultivieren der transfizierten Wirtszelle in einem geeigneten Medium
unter Bedingungen, die die Expression und Sekretion des Immunfusins
fördern,
und Sammeln des Fusionsproteins aus dem extrazellulären Medium.
Wenn gewünscht,
kann das Zielprotein von der Sekretionskassette abgespalten werden,
entweder bevor oder nachdem es aus dem extrazellulären Medium
gesammelt wurde.
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Andere
Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der
folgenden Beschreibung, den Abbildungen und aus den Ansprüchen offensichtlich.
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Kurze Beschreibung der Abbildung
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Die 1A-D
sind eine schematische Darstellung eines Immunfusins. 1A, „DNA", stellt die DNA dar,
die für
ein Immunfusinprotein kodiert. 1B, „Fusioniertes
Protein 1", stellt
das Immunfusinprotein vor der Abspaltung der Signalsequenz dar. 1C, „Fusioniertes
Protein 2", stellt
das Immunfusinprotein nach der Abspaltung der Signalsequenz dar. 1D, „Zielprotein", stellt den Zielproteinteil
eines Immunfusinproteins nach Spaltung des Immunfusinproteins an
der Spaltungsstelle dar, die zwischen der Fc-Region und dem Zielprotein
eingeschoben wurde.
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Ausführliche Beschreibung
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Die
vorliegende Erfindung ist eine DNA, die ein Polynucleotid enthält, das
in seiner 5'- zur
3'-Richtung für eine Signalsequenz,
eine Fc-Region eines Immunglobulins und ein Zielprotein kodiert.
Dieser Ansatz für die
Expression und nachfolgende Sekretion eines Zielproteins ist bestehenden
Techniken aufgrund der Wahl und der Konfiguration der Sekretionskassette überlegen,
die an das 5'-Ende
des Fusionskonstrukts gesetzt wird. Außerdem können die regulatorischen Sequenzen,
die die Expression der Sekretionskassette steuern, optimiert werden
und die optimierte Sekretionskassette kann mit einer Vielzahl an
Zielproteinen gepaart werden, was eine effiziente Produktion einer
Vielzahl von Fusionsproteinen ermöglicht.
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Die
Herstellung der Immunfusinproteine ist als effizient und mit hohen
Spiegeln gekennzeichnet, da das Zielprotein mit einem Spiegel von
mehreren Mikrogramm/Milliliter produziert wurde, unter Verwendung
der DNAs und Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung. Bisher haben Arbeitskräfte auf dem Gebiet die Expressionsspiegel
von schwer zu exprimierenden Proteinen selten quantifiziert, aufgrund
der niedrigen Expressionsspiegel, die in den bekannten Säugetier-Expressionssystemen
erhalten werden und den Schwierigkeiten im Anbetracht der Quantifizierung
von Proteinen durch Techniken wie Western Blot und RIA. Vor den
Lehren der vorliegenden Erfindung wurde die Expression von Mikrogramm
pro Milliliter von schwer zu exprimierenden Proteinen oftmals unter
Verwendung von bakteriellen Expressionssystemen versucht.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf dem Konzept, dass die Leichtigkeit
der Produktion und Sammlung eines Zielproteins verbessert werden
könnte,
wenn das interessierende Polypeptid mit einer Fc-Domäne eines
Immunglobulins verknüpft
wäre und
das Fusionsprotein in einer Wirtszelle exprimiert würde, insbesondere
in einer komplementären
Wirtszelle, die das Immunglobulin natürlicherweise exprimiert, so
dass das Fusionsprotein ohne Weiteres von der Wirtszelle sezerniert
würde.
Zusätzlich
zur Förderung
der Sekretion des Fusionsproteins von der Wirtszelle kann die Fc-Region weiter ausgenutzt
werden, um die Reinigung des fusionierten Polypeptids zu unterstützen. Der
allgemeine Ansatz dieser Erfin dung umfasst die Konstruktion eines rekombinanten
Polypeptids, das bei Expression zu einer Expression einer Sekretionskassette
führt,
die mit einem Zielprotein verknüpft
ist, d. h. einem interessierende Protein mit möglichem oder nachweisbarem
Nutzen.
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Die
Gesamtstruktur der erfindungsgemäßen bevorzugten
DNA, das von ihr kodierte Fusionsprotein, die Form des Proteins,
das am meisten sezerniert wird und das Zielproteinprodukt nach enzymatischer
Spaltung sind schematisch in den 1A-D dargestellt.
Bezugszeichen in der DNA, 1A, werden
in das Protein übernommen, 1B-D,
als entsprechende, mit Strichindex versehene Zeichen. Die DNA, die
für das
Immunfusin kodiert, ist zwischen den Start- und Stopmarkierungen
auf der dargestellten DNA-Sequenz gezeigt, 1A. Regulatorische
Elemente stromaufwärts
sind am 5'-Ende
der DNA gezeigt und als „regulatorische
Sequenzen" bezeichnet.
Die DNA besteht aus drei verschiedenen Polynucleotiden, die miteinander
verknüpft sind.
In 1A, ist 3' der
regulatorischen Sequenzen, die für
jede Sekretionskassette optimiert werden können, eine erste DNA 8,
die für
eine Sekretionskassette kodiert, die zwei der drei Polynucleotide
enthält:
1) eine Signalsequenz 10, und 2) eine Immunglobulin-Fcγ-Region 12.
Die Immunglobulin-Fcγ-Region
besteht aus drei Unterregionen: 1) eine Gelenk-Region 14,
2) eine CH2-Region 16, und eine CH3-Region 20.
An das 3'-Ende der
für die
Sekretionskassette kodierenden DNA ist das dritte Polynucleotid
geknüpft,
eine für
das Zielprotein kodierende DNA 24. Gegebenenfalls kann
eine DNA, die für
eine proteolytische Spaltungsstelle 22 kodiert, zwischen
die für
die CH3-Region der
Immunglobulin-Fcγ-Region
kodierende DNA und die für
das Zielprotein kodierende DNA eingeschoben werden.
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Das
kodierte fusionierte Protein umfasst die Sekretionskassette 8' und das Zielprotein 24', wie als Fusioniertes
Protein in 1 in 1B gezeigt. Meistens wird das
Signalpeptid 10' enzymatisch
durch die Wirtszelle vor der Sekretion des Immunfusins von dem Fusionsprotein
abgespalten und so zeigt das Fusionierte Protein 2, gezeigt in 1C,
das sezernierte fusionierte Protein, das das Fcγ-Peptid 12' fusioniert
an das Zielpolypeptid 24' enthält. Sowohl
Fusioniertes Protein 1 wie auch Fusioniertes Protein 2 zeigen den
optionalen Einschub einer proteolytischen Spaltungsstelle 22' zwischen der
CH3-Domäne 20' der Fcγ-Region 12' und dem Zielprotein 24'. Spaltung von
entweder dem Fusionierten Protein mit dem geeigneten proteolytischen
Mittel an der Spaltungsstelle 22' führt zu der Freisetzung des
Zielproteins 24 von der Fc-Region 12', wie in 1D gezeigt.
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Die
Verfahren zur Manipulation, Amplifizierung und Rekombination von
DNAs sind im Allgemeinen auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden
daher hier nicht im Detail beschrieben. Verfahren zur Identifizierung und
Isolierung von Genen, die für
Proteine von Interesse kodieren, oder zur Konstruktion derartiger
Gene sind wohl verstanden und entwickelt. Im Allgemeinen umfassen
die Verfahren die Auswahl des genetischen Materials, das für Aminosäuren kodiert,
die das interessierende Polypeptid gemäß dem genetischen Code definieren.
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Demzufolge
kann das DNA-Konstruktionsprinzip, das hierin offenbart wird, ausgenutzt
werden unter Verwendung von bekannten DNA-Rekombinationstechniken,
die die Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen umfassen,
die sequenzspezifische Schnitte in DNA machen, um stumpfe Enden
oder kohäsive Enden
herzustellen, DNA-Ligase-Techniken, die enzymatische Addition von
klebrigen Enden an stumpf endende DNA ermöglichen, Konstruktion von synthetischen
DNAs durch Zusammenbau von kurzen Oligonucleotiden, cDNA-Synthesetechniken,
Polymerasekettenreaktion und synthetische Sonden für die Isolierung
von Genen mit einer bestimmten Funktion. Verschiedene Promotorsequenzen
und andere regulatorische DNA-Sequenzen,
die zur Erreichung von Expression verwendet werden, und verschiedene
Arten von Wirtszellen sind ebenfalls bekannt und zugänglich.
Herkömmliche
Transfektionstechniken und ebenso herkömmliche Techniken zum Klonen
und Subklonen von DNA sind bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung
von Nutzen und Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Es können verschiedene
Arten von Vektoren verwendet werden, wie beispielsweise Plasmide
und Viren, einschließlich
tierischer Viren. Die Vektoren können
verschiedene Markergene einsetzen, die einer erfolgreich transfizierten
Zelle eine nachweisbare phänotypische
Eigenschaft vermitteln, die für
eine Identifizierung verwendet werden kann, welche einer Familie
von Zellen erfolgreich die rekombinante DNA des Vektors eingebaut
hat. Angesichts des vorhergehenden Stands der Technik bei gentechnischen
Veränderungen,
sind Fachleute in der Lage, die hierin beschriebene Erfindung im
Anbetracht dieser Beschreibung auszuführen.
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Ein
Verfahren, um die DNA zu erhalten, die für verschiedene, hierin offenbarte
synthetische Linker kodiert, ist der Zusammenbau von synthetischen
Oligonucleotiden in einem herkömmlichen,
automatisierten Polynucleotid-Synthesizer, gefolgt von Ligation
mit einer Ligase. Zum Beispiel können
die Linker als komplementäre
DNA-Fragmente unter Verwendung von Phosphoramidit-Chemie synthetisiert
werden.
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Die
erfindungsgemäße Signalsequenz
ist ein Polynucleotid, das für
eine Aminosäuresequenz
kodiert, die den Transport eines Proteins durch die Membran des
endoplasmatischen Retikulums initiiert. Signalsequenzen, die in
der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein werden, umfassen Signalsequenzen
von leichten Ketten von Antikörpern,
z. B. Antikörper
14.18 (Gillies et al., 1989, Jour. of Immunol. Meth., 125:191-202),
Signalsequenzen von schweren Ketten von Antikörpern, z. B. der Signalsequenz
der schweren Kette des Antikörpers
MOPC141 (Sakano et al., 1980, Nature 286:5774), und beliebige andere
Signalsequenzen, die auf dem Gebiet bekannt sind (siehe zum Beispiel,
Watson, 1984, Nucleic Acids Research 12:5145). Signalsequenzen wurden
auf dem Gebiet gut charakterisiert und es ist bekannt, dass sie
typischerweise 16 bis 30 Aminosäurereste
enthalten und mehr oder weniger Aminosäurereste enthalten können. Ein
typisches Signalpeptid besteht aus drei Regionen, einer basischen
N-terminalen Region, einer zentralen hydrophoben Region und einer
polareren C-terminalen Region. Die zentrale hydrophobe Region enthält 4 bis
12 hydrophobe Reste, die das Signalpeptid durch die Membran-Lipiddoppelschicht
während
des Transports des naszierenden Polypeptids verankern. Im Anschluss
an die Initiierung wird das Signalpeptid gewöhnlich durch zelluläre Enzyme,
die als Signalpeptidasen bekannt sind, in das Lumen des endoplasmatischen
Retikulums abgespalten. Mögliche Spaltungsstellen
des Signalpeptids folgen im Allgemeinen der „(–3, –1)-Regel". So hat ein typisches Signalpeptid
kleine, neutrale Aminosäurereste
in den Positionen –1
und –3
und es fehlen Prolinreste in dieser Region. Die Signalpeptidase
wird ein derartige Signalpeptid zwischen den –1 und +1-Aminosäuren spalten.
So kann der Anteil der DNA, der für die Signalsequenz kodiert,
vom Amino- Terminus
des Immunfusinproteins während der
Sekretion abgespalten werden. Dies führt zu der Sekretion eines
Immunfusinproteins, bestehend aus der Fc-Region und dem Zielprotein.
Eine detaillierte Diskussion von Signalpeptidsequenzen wird bereitgestellt
von von Heijne (1986) Nucleic Acids Res., 14:4683. Wie einem Fachmann
offensichtlich wäre,
kann die Eignung einer bestimmten Signalsequenz für die Verwendung
in der Sekretionskassette einige Routineexperimente erfordern. Derartige
Experimente werden die Bestimmung der Fähigkeit der Signalsequenz umfassen,
die Sekretion eines Immunfusins zu steuern, und auch die Bestimmung
einer optimalen Konfiguration, genomisch oder cDNA, der zu verwendenden
Sequenz, um eine effiziente Sekretion von Immunfusinen zu erreichen.
Zusätzlich
ist ein Fachmann in der Lage, ein synthetisches Signalpeptid zu
erschaffen, indem er den von von Heijne vorgestellten Regeln folgt,
die oben zitiert wurden, und auf die Effizienz einer derartigen
synthetischen Signalsequenz durch Routineexperimente testet. Eine
Signalsequenz wird auch als ein „Signalpeptid", eine „Leader-Sequenz" oder als „Leader-Peptide" bezeichnet und jeder
dieser Begriffe mit Bedeutungen, die synonym zu Signalsequenz sind,
kann hierin verwendet werden.
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Die
FC-Region eines Immunglobulins ist die Aminosäuresequenz für den carboxylterminalen
Teil einer konstanten Region einer schweren Immunglobulinkette.
Die Fc-Regionen sind insbesondere bei der Bestimmung der biologischen
Funktionen des Immunglobulins von Bedeutung und diese biologischen
Funktionen werden als Effektorfunktionen bezeichnet. Bekanntlich
enthalten die schweren Ketten der Immunglobulin-Unterklassen vier
oder fünf
Domänen:
IgM und IgE besitzen fünf
schwere Ketten-Domänen
und IgA, IgD und IgG besitzen vier schwere Kette-Domänen. Die
Fc-Region von IgA, IgD und IgG ist ein Dimer der Gelenk-CH2-CH3-Domänen und
in IgM und IgE ist sie ein Dimer der Gelenk-CH2-CH3-CH4-Domänen. Des
Weiteren ist die CH3-Domäne
von IgM und IgE strukturell äquivalent
zu der CH2-Domäne von IgG,
und die CH4-Domäne
von IgM und IgE ist das Homolog der CH3-Domäne von IgG (siehe, W. E. Paul,
Hrsg., 1993, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, New
York). Jegliche der bekannten Fc-Regionen würde als die Fc-Region der Sekretionskassette
von Nutzen sein. Es ist jedoch wichtig, dass die Bindungsstellen
für bestimmte
Proteine aus der FC-Region während
der Konstruktion der Sekretionskassette deletiert werden. Zum Beispiel sollte,
da Co-Expression mit der leichten Kette unnötig ist, die Bindungsstelle
für das
Bindungsprotein der schweren Kette, Bip (Hendershot et al. (1987)
Immunol. Today 8:111-114) aus der CH2-Domäne der
Fc-Region von IgE deletiert werden, so dass diese Stelle die effiziente
Sekretion des Immunfusins nicht beeinträchtigt. Ebenso sollten die
Cysteinreste, die in den Fc-Regionen vorkommen und für die Bindung
an die leichte Kette des Immunglobulins verantwortlich sind, deletiert
oder durch eine andere Aminosäure
substituiert werden, so dass diese Cysteinreste nicht die richtige
Faltung der Fc-Region beeinträchtigt,
wenn sie als ein Immunfusin produziert wird. Auf die gleiche Weise
sollten Sequenzen der Transmembran-Domäne, wie beispielsweise solchen,
die in IgM vorkommen, deletiert werden, so dass diese Sequenzen
nicht zu einer Fehlsteuerung des Immunfusins an die Membran als
ein Transmembranprotein führen.
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Bei
Expression und Produktion der Fc-Region als ein Teil der Sekretionskassette
kann diese einige der biologischen Eigenschaften, die als „Effektorfunktionen" bezeichnet werden
und die für
die bestimmte Immunglobulinklasse nativ sind, aus der die Fc-Region erhalten wurde,
beibehalten. Nützliche
Effektorfunktionen umfassen, zum Beispiel, Komplementfixierung,
Fc-Rezeptorbindung, Bindung an Zellmembranen und Plazentadurchtritt.
In einigen Fällen
kann es von Vorteil sein, eine oder mehrere dieser Effektorfunktionen
zu modifizieren oder zu beseitigen, wie beispielsweise Fc-Rezeptorbindung
oder Komplementfixierung, indem ortsgerichtete Mutagenese oder andere
wohlbekannte molekularbiologische Techniken verwendet werden. Zum
Beispiel haben Duncan et al. (Nature, 1988, 332:738) die Aminosäuren kartiert,
die für
einige der Immunglobulin-Gamma-Effektorfunktionsaktivitäten verantwortlich
sind, siehe auch Duncan et al., 1988, 332:563; Yasmeen et al., Immunol.,
1976, 116:518; Tao et al., J. Immunol., 1989, 143:2595. Die Aminosäuren oder
Peptidsegmente, die für
diese Funktionen verantwortlich sind, können deletiert werden, was
den Teil der Fc-Region entfernt, oder durch Sequenzen substituiert
werden, die diese Funktion nicht übertragen würden, unter Verwendung von wohlbekannten
molekularbiologischen Techniken.
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Die
derzeit bevorzugte Klasse von Immunglobulin, aus der die Fc-Region
gewonnen wird, ist Immunglobulin Gamma-1, da es gut charakterisiert
wurde und es von den meisten Zellarten effizient sezerniert wird. Die
FC-Region der anderen Unterklassen von Immunglobulin Gamma (Gamma-2,
Gamma-3 und Gamma-4) würde
ebenso gut in der Sekretionskassette funktionieren. Die Fc-Region
von Immunglobulin Gamma-1, die vorzugsweise in der Sekretionskassette
verwendet wird, umfasst zumindest einen Teil der Gelenkregion, CH2-Region und CH3-Region.
Außerdem
kann die Fc-Region von Immunglobulin Gamma-1 ein CH2-deletiertes
Fc sein, das einen Teil einer Gelenkregion und eine CH3-Region umfasst,
wobei die CH2-Region deletiert wurde. Ein CH2-deletiertes Fc wurde
beschrieben von Gillies et al., 1990, Hum. Antibod. Hybridomas,
1:47; diese Veröffentlichung
wird durch Bezugnahme hier aufgenommen.
-
Wie
aus der oben aufgeführten
Diskussion von FC-Regionen ersichtlich, wären die FC-Regionen von den
anderen Klassen von Immunglobulinen, IgA, IgD, IgE und IgM, ebenfalls
als die Fc-Region
der Sekretionskassette von Nutzen. Des Weiteren wären Deletionskonstrukte
dieser Fc-Regionen, in denen eine oder mehrere der konstanten Domänen deletiert
sind, ebenfalls von Nutzen. Ein durchschnittlicher Fachmann könnte derartige
Deletionskonstrukte unter Verwendung von wohlbekannten molekularbiologischen
Techniken herstellen.
-
Die
Identität
des Zielproteins, das gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt wurde, ist im Wesentlichen nicht eingeschränkt. Tatsächlich ist
ein wichtiges Merkmal der Erfindung, dass diese ein allgemeines DNA-Konstrukt
sowie ein Verfahren bereitstellt, das angepasst werden kann, um
die rekombinante Produktion von jeglichem gewünschten Zielprotein zu erleichtern.
Zum Beispiel ermöglicht
die Anwendung der Erfindung auf die Expression von regulatorischen
Proteinen, wie beispielsweise Transkriptionsfaktoren, die normalerweise
im Zellkern lokalisiert sind, die effiziente Sekretion von derartigen,
normalerweise nicht sezernierten Proteinen. Außerdem sind regulatorische
Proteine im Allgemeinen schwer zu exprimieren und die Reinigungsverfahren
sind im Allgemeinen mühsam
(siehe, zum Beispiel, Meisterernst et al. (1991) Cell 66:981). Daher
ist es besonders wünschenswert,
dass derartige Proteine in das Kulturmedium exportiert werden. Außerdem kann die
Erfindung verwendet werden, um die Herstellung und Sekretion von
Proteinen zu verstärken,
die normalerweise mit geringen Spiegeln exprimiert werden. Wenn
ein gewünschtes
Zielprotein Sequenzen umfasst, die für ein Sekretionssignal oder
ein Transmembransignal kodieren, können diese Sequenzen aus dem
Zielprotein entfernt werden, so dass die Sekretionskassette die
Sekretion des Fusionsproteins steuert.
-
Die
optionale proteolytische Spaltungsstelle kann jegliche Aminosäuresequenz
sein, die von spezifischen Spaltungsmitteln erkannt wird. Die Spezifizität der Spaltungsmittel
wird durch die Identität
der Sequenz von Aminosäuren
an oder nahe dem hydrolysierten Peptid bestimmt. Ein gegebenes Spaltungsmittel
kann die Bindung zwischen zwei spezifischen Aminosäuren erkennen
oder kann eine Bindung erkennen, die auf eine Aminosäure oder
eine spezifische Sequenz aus Aminosäuren folgt. Die Spezifizität vieler
Spaltungsmittel ist bekannt. Tabelle 1 legt unten Listen von verschiedenen,
bekannten Spaltungsmitteln sowie deren primäre (und in einigen Fällen sekundäre) Wirkungsstelle
dar. TABELLE 1
Spaltungsmittel | Hauptwirkungsstelle | andere
Wirkungsstellen |
Trypsin | Arg,
Lys | |
Chymotrypsin | Trp,
Phe, Tyr | Leu,
Met, His |
Elastase | Neutrale
aliphatische Reste | |
Pepsin | Phe,
Leu, Trp | Ala,
Gly, Glu |
Papain | Arg,
Lys, Gly | breite
Spezifizität |
Subtilisin | aromatische
und aliphatische Reste | verschiedene |
Thermolysin | Amino-verknüpfte Bindungen
von aliphatischen Resten | Ala,
Phe |
S.
aureus-Protease | Glu | Asp |
Endoproteinase | Arg | |
Arg
C (Submaxillaris Protease) | | |
Clostripain | Arg | |
Thrombin | Arg | |
Collagenase | X-Gly-Pro | X-Ala-Pro
X-Gly-Thr |
Lysobacter | Lys | |
Enzymogene
(Endoproteinase Lys-C) | | |
Mysobacter
Al-1 | Lys | |
Protease | | |
Armillaria
mellea | Lys | |
Flavobacterium
meringosepticum | Pro | |
Factor
Xa | Ile-Glu-Gly-Arg | |
CNBr | Met | |
BNPS-Skatol | Trp | |
N-Bromsuccinimid | Trp | |
O-Iodosobenzoesäure | Trp | |
HBr/DMSO | Trp | |
NTCB | Cys | |
Natriummetall
in flüssigem
Ammoniak | Pro | |
Hydroxylamin | Asn-Gly | |
verdünnte Säure: | Asp-Pro | |
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Andere
Spaltungsmittel sind bekannt. Solche für die Verwendung in der vorliegenden
Erfindung bevorzugte sind Enzyme mit einer primären Wirkungsstelle, die an
der C-terminalen Seite des Spaltungsstellenrests spalten.
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Die
Spaltungsstelle in dem fusionierten Protein kann im Allgemeinen
jegliche Aminosäure
oder Sequenz an Aminosäuren
enthalten, die durch ein Spaltungsmittel gespalten werden, das für die Stelle
in einer geeigneten Umgebung spezifisch ist. Die Spezifizität der Spaltung
kann erhöht
werden und die Wahrscheinlichkeit einer unerwünschten Spaltung innerhalb
des Zielproteins oder anderswo in dem fusionierten Polypeptid kann
vermindert werden, indem das Spaltungsmittel mit einer Wirkungsstelle
ausgewählt
wird, die im Zielpolypeptid nicht vorkommt. Das fusionierte Polypeptid
wird vorzugsweise unter Bedingungen gespalten, in denen es seine
native Konformation angenommen hat. Dies hat den Effekt, dass die
Gegenwart von potentiellen Spaltungsstellen in dem Zielpolypeptid
maskiert wird.
-
Die
Erfindung wird weiter durch die folgenden nichteinschränkenden
Beispiele erläutert.
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Beispiel 1. Konstruktion einer Sekretionskassette
-
Die
Konstruktion einer beispielhaften Sekretionskassette wird unten
beschrieben. Wie von einem durchschnittlichen Fachmann verstanden
würde,
könnten
die Signalsequenz und die Fc-Region eines Immunglobulins andere
Sequenzen als die beschriebenen sein.
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Die
Signalsequenz einer leichten Immunglobulinkette des Antikörpers 14.18
wurde für
die Verwendung als die Signalsequenz der Sekretionskassette ausgewählt. Die
Sequenz der leichten Kette des Antikörpers 14.18 wird in Gillies
et al., 1989, Jour. Immunol. Meth., 125:191-202 bereitgestellt und
ist durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Die Signalsequenz wurde
für eine
leichtere Klonierung als ein XbaI-AflII-Fragment der DNA modifiziert.
Wie für
einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich wäre, könnte auch die DNA, die für eine humane
Signalsequenz kodiert, verwendet werden. Insbesondere wurde eine
XbaI-Stelle 5' des Translationsstartcodons
und der Konsensus-Sequenz für
eine optimale Ribosombindung eingefügt (Kozak, 1984, Nature 308:241).
Eine AflII-Stelle wurde in das 3'-Ende
der Signalsequenz durch Mutagenese der für den vorletzten Aminosäurereste
des Signalpeptids kodierenden DNA von einem Serin zu einem Leucin
eingefügt,
und so wurde die Sequenz ATC zu TTA unter Verwendung von ortsgerichteter
Mutagenese mutagenisiert.
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Die
Fc-Region eines Immunglobulins wurde ausgewählt als die humane, genomische
Fcγ1-DNA,
die die genomische Konfiguration der Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen umfasst.
Die genomische Sequenz von humanem Fcγ1 wird
in Huck et al., (1986) Nucleic Acids Res. 14:1779 bereitgestellt.
Wie einem durchschnittlichen Fachmann offensichtlich wäre, kann
auch ein CH2-deletiertes Fc als die Fc-Region der Sekretionskassette verwendet
werden (siehe, Gillies et al., 1990, Hum. Antibod. Hybridomas, 1:47),
in welchem Fall die CH2-Domäne
aus der Fc-Region unter Verwendung von bestehenden molekularbiologischen
Techniken während
der Konstruktion der Sekretionskassette deletiert werden würde. Die
genomische DNA von Fcγ1
wurde für
eine leichtere Klonierung als ein AflII-XmaI-Fragment modifiziert. Das 5'-Ende der humanen
genomischen Fc-DNA wurde zu einer AflII-Stelle mutagenisiert, indem
eine Polymerase kettenreaktion (PCR) ausgeführt wurde, bei der ein 5'-Sinn-Primer mit
der folgenden Sequenz (Sequence ID No. 1) verwendet wurde:
GAGAATTCTTAAGCGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCAC
-
Dieser
Primer führte
eine AflII-Stelle (unterstrichen) ein und eine Mutation von Cystein
zu Serin (TGT zu TCT, fett). Das mutierte Cystein ist jenes, das
normalerweise an der Disulfid-Bindung
mit der leichten Kette beteiligt ist, und sich daher nicht auf die
Effektorfunktionen der Fc-Region auswirkt.
-
Die
Deletion dieses Cysteins kann dazu dienen, die Produktion der Fcγ1-Region
zu verstärken,
da die effiziente Produktion dieser modifizierten Fcγ1-Region
nicht die Coexpression der leichten Immunglobulinkette erfordert.
Dieses Cystein wurde ebenfalls entfernt, so dass es die richtige
Faltung der Fcγ1-Region
oder des fusionierten Zielproteins nicht beeinträchtigt. Das 3'-Ende der genomischen Fcγ1-DNA kodiert für zwei XmaI-Restriktionsstellen.
Sie befinden sich bei 10 und 280 bp stromaufwärts des Translationsstopcodons
in der CH3-Domäne.
Die distale XmaI-Stelle wurde durch die Einführung einer stillen Mutation
zerstört,
unter Verwendung einer ortsgerichteten Mutagenese, (TCC zu TCA,
wobei die CC die ersten beiden Basen der XmaI-Stelle waren), so
dass es nur noch eine einzige XmaI-Stelle 10 bp stromaufwärts des
Stopcodons gab.
-
Das
XbaI-AflII-Restriktionsfragment, das für das Signalpeptid der leichten
Kette kodiert, wurde dann mit dem AflII-XmaI-Restriktionsfragment
ligiert, das für
die Fc-Region kodiert. Das resultierende XbaI-XmaI-Restriktionsfragment
kodiert daher für
die Sekretionskassette und das Gen, das für das interessierende Zielprotein
kodiert, kann an das 3'-Ende
der Sekretionskassette über
die XmaI-Stelle ligiert werden.
-
Im
Allgemeinen kann die DNA, die für
das Zielprotein kodiert, an die einzige XmaI-Stelle durch die Verwendung
eines Linker-Adaptors
ligiert werden, wobei ein derartiger Linker-Adaptor auch Restriktionsendonuclease-Stellen
zusätzlich
zu einer XmaI-Stelle umfassen kann. Die Verwendung eines Linker-Adaptors
hat das zusätzliche
Merkmal, dass er für
eine proteolytische Spaltungsstelle für eine nachfolgende Verwendung
bei der Abspaltung des Zielproteins von der Sekretionskassette nach
Produktion und Sekretion des Fusionsproteins kodiert. Zum Beispiel
kann der Linker-Adaptor für
einen Lysinrest an der Verbindung des Fusionsproteins kodieren,
was die Option einer Spaltung des Zielproteins von der Fc-Domäne durch
proteolytische Enzyme wie Trypsin oder Plasmin bietet. Ebenso kann
der Linker-Adaptor eine DNA umfassen, die für die Spaltungsstelle der Enterokinase
K (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) kodiert, um eine spezifische Spaltung des
sezernierten Fusionsproteins durch Enterokinase K zu ermöglichen.
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Beispiel 2. Konstruktion eines Immunfusins
-
Die
Konstruktion eines beispielhaften Immunfusins, einschließlich einer
Sekretionskassette und eines Zielproteins, wird unten beschrieben.
Wie für
einen durchschnittlichen Fachmann offensichtlich wäre, können andere
Zielprotein an eine Sekretionskassette unter Verwendung der gleichen
oder anderer Techniken des molekularen Klonens fusioniert werden.
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Als
das Zielprotein für
das beispielhafte Immunfusin wurde CD26 ausgewählt, das ein Membranprotein vom
Typ II ist, dessen aktive Stelle sich innerhalb der carboxyterminalen
Region des Proteins befindet, die die extrazelluläre Domäne ist.
Während
der Konstruktion eines CD26-Immunfusins werden die cytoplasmatische und
Transmembrandomänen
von CD26 deletiert, so dass sie die Sekretion des Immunfusins durch
die Sekretionskassette nicht stören.
Das 5'-Ende der
cDNA, die für
die extrazelluläre
Domäne
kodiert, wurde für
eine leichtere Klonierung so modifiziert, dass sie eine XmaI-Stelle umfasst, die über einen
Linker-Adaptor eingeführt wurde.
Das 3'-Ende der
CD26-cDNA wurde ebenfalls für
eine leichtere Klonierung so modifiziert, dass es eine XhoI-Stelle
umfasst, die stromabwärts
des Translationsstopcodons entweder mittels PCR oder mittels Ligation durch
Linker-Adaptor eingeführt
werden könnte.
-
Es
können
verschiedene Linker-Adaptoren verwendet werden, in Abhängigkeit
von dem Wunsch nach einer Einführung
einer proteolytischen Spaltungsstelle zwischen der für die Fc-Region
kodierenden DNA und der CD26-cDNA. Zum Beispiel ist ein Linker-Adaptor,
der für
CD26 verwendet werden kann:
wie in SEQ ID Nos. 2 und
3 bereitgestellt. Die ersten drei Codons in dem oberen Strang kodieren
für die
letzen drei Aminosäurereste
der CH3-Domäne,
und mit dem Codon GGC beginnt die Gensequenz der extrazellulären Domäne von CD26.
Dieser Linker-Adaptor hatte das kohäsive Ende einer XmaI-Stelle
an seinem 5'-Ende
und das stumpfe Ende einer PvuII-Stelle an seinem 3'-Ende, wobei die
stumpf endende PvuII-Stelle eine bequeme Stelle für eine Rekonstruktion
mit dem Rest der CD26-cDNA ist. Der Lysin-Codon (AAA, in Klammern)
in dem Linker-Adaptor ist nur eine von vielen möglichen Aminosäuresequenzen,
die von Nutzen sind, um eine proteolytische Spaltungsstelle durch
Spaltungsmittel bereitzustellen. Zum Beispiel kann dieser Lysinrest
durch Enzyme wie beispielsweise Trypsin oder Plasmin gespalten werden.
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Alternativ,
für eine
spezifischere proteolytische Spaltung durch Enterokinase K, kann
die für
die Enterokinase K-Spaltungsstellen kodierende Sequenz über den
folgenden Linker-Adaptor eingeführt
werden:
wie in SEQ ID Nos. 4 und
5 bereitgestellt. Die fettgedruckten Nucleotide kodieren für die Aminosäurereste (Asp)4-Lys,
die die Erkennungsstelle für
Enterokinase K sind. Der Linker-Adaptor endet mit einer HindIII-Stelle, an
die das CD26-Gen oder andere Zielprotein-Gensequenzen geknüpft werden
können.
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Beispiel 3. Wirtszellen und Transfektion
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Die
bevorzugten Wirtszelllinien umfassen die Myelom- (oder Hybridom-)
NS/0- und Sp2/0 Ag14-Zellen der Maus. Die Myelomzellen wurden durch
Protoplastenfusion transfiziert und in Dulbecco's modifziertem Eagles Medium (Gibco),
enthaltend 10 % fötales
Rinderserum und 100 nM Methotrexat, selektiert, wie von Gillies et
al., 1989, BioTechnology, 7:799 beschrieben; diese Veröffentlichung
ist durch Bezugnahme hier aufgenommen. Transfektanten, die die Immunfusine
sezernierten, wurde mittels anti-Fc-ELISA identifiziert, wie durch Gillies
et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191 beschrieben; diese Veröffentlichung
wird durch Bezugnahme hier aufgenommen. Die höchsten Produzenten wurde an
Medien adaptiert, die 1 μM
MTX enthielten, und durch limitierende Verdünnungen subkloniert. Für die Produktion
von Immunfusinen wurden die Zellen in Hybridom-Serumfreiem Medium
(HSFM, Gibco)gezüchtet,
das 1 % fötales
Rinderserum und 1 μM
MTX enthielt.
-
Die
andere bevorzugte Empfängerzelllinie
sind die humanen Nieren 293-Zellen, die sowohl für transiente wie auch für stabile
Expression von Nutzen sind. Andere Zellen wie beispielsweise die
HeLa- und die Chinese hamster ovary (CHO-) Zellen funktionierten
ebenfalls in unserem System. Das bevorzugte Transfektionsverfahren
für diese
adhärenten
Zellen ist durch Copräzipitation
von Plasmid-DNA
mit Calciumphosphat, und andere Verfahren umfassen Lipofektion und
Elektroporation. Für
eine Beschreibung dieser Verfahren und anderer nützlicher Transfektionsverfahren,
siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor, NY, durch Bezugnahme hier aufgenommen.
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Beispiel 4. Charakterisierung und Reinigung
von Immunfusinen
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Für Routinecharakterisierung
durch Gelelektrophorese wurden Immunfusine in den konditionierten Medien
zunächst
auf Protein A Sepharose (Repligen, Cambridge, MA) gefangen und dann
durch Kochen in dem Proteinprobenpuffer mit oder ohne 2-Mercaptoethanol
eluiert. Nach Elektrophorese auf einem SDS-Gel wurden die Proteinbanden
mittels Coomassie-Färbung
sichtbar gemacht. Zum Beispiel ergab das IL2-Immunfusin, siehe Beispiel
5, eine Bande mit dem Molekulargewicht von 45 kD unter reduzierenden
Bedingungen und eine Bande mit dem Molekulargewicht von 90 kD unter
nicht reduzierenen Bedingungen, was zeigt, dass das IL2-Immunfusin
als ein Dimer hergestellt wurde, vermutlich durch Disulfidbindung
in der Gelenkdomäne der
FC-Region.
-
Zur
Reinigung wurden die Zellkulturmedien gesammelt und anschließend wurden
die Immunfusine an Protein A Sepharose gebunden. Die Immunfusine
wurden nacheinander von dem Protein A in einen Natriumcitratpuffer
(100 mM, pH 4) eluiert. Das Eluat wurde dann sofort mit 0,1 Volumen
1 M Tris-Hydrochlorid, pH 8, neutralisiert. Im Falle von CD26-Immunfusin
wurde gezeigt, dass ein derartiges Elutionsverfahren zu einer mehr
als 80 %igen Gewinnung des CD26-Immunfusins
ohne Verlust von Enzymaktivität
führte.
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Beispiel 5. Expression von IL2-Immunfusin
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Die
cDNA des reifen IL2-Proteins wurde zur leichteren Klonierung so
modifiziert, dass sie eine 5'-XmaI-Restriktionsendonuclease-Stelle
und eine 3'-XhoI-Restriktionsendonuclease-Stelle
aufweist, unter Verwendung von wohlbekannten Molekulartechniken
wie sie beispielsweise in Beispiel 2 beschrieben wurden. Die Sequenz
der reifen IL2-cDNA wird von Taniguchi et al., 1983, Nature, 302:305
bereitgestellt und ist durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Die
cDNA des reifen IL2-Proteins wurde unter Verwendung von rekombinanten
Techniken als ein synthetisches Gen konstruiert, um die Codon-Verwendung
zu optimieren und wünschenswerte
Restriktionsendonuclease-Spaltungsstellen einzuführen. Das synthetische Gen
wurde unter Verwendung von herkömmlichen
Techniken zur DNA-Manipulierung geschaffen. Sobald die synthetische
IL2-cDNA konstruiert
war, wurde die 5'-XmaI-Stelle
der IL2-cDNA an die 3'-XmaI-Stelle
der Sekretionskassette, beschrieben in Beispiel 1, ligiert. Das
IL2-Immunfusin wurden anschließend
in den Expressionsvektor pdC einkloniert. Der IL2-Immunfusin-Expressionsvektor
wurde mittels Protoplastenfusion in NS/0 und Sp2/0 als Wirtszellen
transfiziert, wie von Gillies et al., 1989, Biotechnology, 7:799,
beschrieben.
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Zwei
bis drei Wochen nach der Transfektion traten MTX-resistenten NS/0-
und Sp2/0-Klone auf. Die Anfangsklone wurden mittels anti-Fc-ELISA
gescreent. Das IL2-Immunfusinprotein wurde aus den Medien gesammelt.
Ein geeignetes Assay für
die biologische Aktivität
von IL2 war das standardmäßige T-Zell-Proliferationsassay
nach Gillies et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89:1428). Die
verbrauchte Kultur des besten Klons enthielt etwa 100 μg/ml IL2-Immunfusin. Die Wirtszellklone,
die das IL2-Immunfusinprotein effizient erzeugten und sezernierten,
wurden in Medien subkloniert, die 100 nM MTX enthielten, und der
beste Subklon erzeugte etwa 200 μg/ml
Protein in verbrauchter Kultur. Wenn MTX aus dem Medien bei Subklonieren
weggelassen wurde, erzeugte der beste so isolierte Subklon etwa
180 μg/ml
in verbrauchter Kultur. Also ermöglichte
die Konstruktion eines IL2-Immunfusins unerwarteterweise die Produktion
von IL2 auf einem Niveau das in etwa 80 Mal dem entspricht, das
durch die Expression von IL2 allein unter Verwendung des pdEMp-Vektors
(unveröffentlichte
Daten) erreicht wird, und viele Male dem von IL2, das in Säugetierzellen
(Conradt et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17368) und in Hefe (Ernst
et al.. 1989, Biotechnology, 7:716) exprimiert wurde. Wie in Beispiel 4
erwähnt,
wurde das IL2-Immunfusin als ein Homo-Dimer mit einem Molekulargewicht
von 90 kD erzeugt, vermutlich durch Disulfid-Bindung in der Gelenkregion des 45 kD
Monomers.
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Beispiel 6. Expression von CD26-Immunfusin
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Die
Konstruktion von CD26 als ein Immunfusin wurde unternommen, um nachzuweisen,
dass die Erfindung auf die Expression von membranverankerten Proteinen
wie Membranproteinen vom Typ II anwendbar ist. Ein Membranprotein
vom Typ II zeigt die carboxylterminale Domäne auf der extrazellulären Oberfläche und umfasst
meistens seine aktive Region innerhalb dieser carboxylterminalen
Domäne.
Die Verknüpfung
eines Fusionspolypeptids mit der carboxylterminalen Region eines
derartigen Proteins kann die richtige Faltung der aktiven Stelle
beeinträchtigen
und so die Produktion von aktivem Protein vermindern oder verhindern.
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CD26
ist ein Membranprotein vom Typ II, das 766 Aminosäurereste
enthält.
Die biologische Funktion von CD26 ist als ein T-Zell-Aktivierungsantigen
und der putative Corezeptor für
den Eintritt von HIV in CD4+-Zellen (Callebaut et al. (1993) Science
262:2045). Das CD26-Protein ist an die Lipiddoppelschicht der Plasmamembran
durch eine hydrophobe Domäne
zwischen den Resten 7 und 28 am N-Terminus verankert. Aminosäuren 1 bis
6 bilden einen kurzen cytoplasmatischen Schwanz. Der Rest des Proteins
zwischen den Resten 29 und 766, ist extrazellulär und umfasst mehrere mögliche N-Glykosylierungsstellen
und die aktive Stelle des Enzyms (Tanaka et al. (1992) J. Immunol.
149:481). Die 728 carboxylterminalen Reste im CD26 ragen aus der
Membranoberfläche
heraus und der C-Terminus ist frei. Ein lösliches CD26, das als ein Immunadhäsin exprimiert
wird, wird eine Konformation aufweisen, die sich von der des nativen
CD26 unterscheidet, da der Carboxyl-Terminus in einem Immunadhäsin-CD26-Protein
nicht frei ist, sondern mit einer Antikörpersequenz verbunden ist.
Andererseits, wenn wir ein Immunfusin entwerfen, in dem die Antikörpersequenz
zum Zielprotein aminoterminal ist, wie beispielsweise CD26, wird
die native Konforma tion von CD26 konserviert, d. h. der C-Terminus
ist frei und die Antikörpersequenz,
hier eine Fc-Region, nimmt den Platz der Membran ein, an der CD26
normalerweise verankert ist. Die enzymatischen und biologischen
Aktivitäten
eines derartigen löslichen
CD26-Immunfusins werden nicht gefährdet. Außerdem ist CD26 eine Protease
und seine Expression kann für
die Wirtszelle schädlich
sein. Also kann durch einen effizienten Export der CD26-Protease
aus der Wirtszelle heraus in der Form eines Immunfusins ein höherer Expressionsspiegel
erreicht werden.
-
Ein
2,3 kb cDNA-Fragment, das für
die extrazelluläre
Domäne
von CD26 kodiert, wurde verwendet, um den CD26-Immunfusin-Expressionsvektor
zu konstruieren. Die DNA-Sequenz von CD26 wird in Tanaka et al.,
1992, J. Immunol., 149:481 bereitgestellt. CD26 wurde 3' der Sekretionskassette
fusioniert, wie oben in Beispiel 2 beschrieben, und anschließend wurde
die Sekretionskassette und das CD26-Ziel-Protein in den Expressionsvektor pdC
einkloniert, unter Verwendung der XbaI-Restriktionsendonuclease-Stelle
5' der Signalsequenz
der leichten Kette und der XhoI-Restriktionsendonuclease-Stelle
3' des CD26-Proteins,
wie in Beispiel 2 oben beschrieben. Der resultierende CD26-Immunfusin-Expressionsvektor
wurde in eine Wirtszelle wie oben in Beispiel 3 beschrieben transfiziert.
MTX-resistente Klone aus transfizierten NS/0- und Sp2/0-Zellen wurden mittels
anti-Fc-ELISA und DPPIV-Aktivitätsassay
gescreent. CD26 ist auch als DPPIV bekannt, das eine Exopeptidase
ist, die nach aminoterminalen X-P spaltet (x kann ein beliebiger
Aminosäurerest
sein und P ist Prolin). DPPIV-Enzymaktivität des CD26-Immunfusin wurde
gemäß Tanaka
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1993, 90:4586) unter Verwendung
von Glycylprolin-p-nitroanilid-tosylat (Gly-Pro-pNA) als ein Substrat
untersucht. Der beste NS/0-Klon produzierte etwa 3,5 μg/ml CD26-Immunfusin.
Es wurde nachgewiesen, dass die DPPIV-Einheit des Proteinprodukts vollständig aktiv
war, mit KM- und kcat-Werten, die denen
von nativem CD26 ähneln.
Weiterhin wurde die enzymatische Aktivität von CD26-Immunfusin durch
bekannte Peptidinhibitoren auf eine Dosis-abhängige Weise inhibiert. Die
untersuchten Peptidinhibitoren umfassten die Tripeptide IPI und VPL
und APL und jedes von ihnen inhibierte die CD26-Enzymaktivität um mehr
als 30 % bei 0,15 mM, mehr als 70 % bei 1 mM und mehr als 90 % bei
4 mM. Als eine Kontrolle wurden bekannte Nicht-Inhibitorpeptide ebenfalls
auf ihre Wirkung auf die CD26-Enzymaktivität untersucht und es wurde gefunden,
dass die bekannten Nicht-Inhibitoren, GGG und GPHyP (wobei HyP Hydroxyprolin
ist) keine Wirkung auf die CD26-Aktivität haben, wenn sie mit dem CD26-Immunfusin
bei Konzentrationen im Bereich zwischen 0,01 mM und 11 mM inkubiert
werden.
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Beispiel 7. Expression von Tat-Immunfusin
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Die
Erfindung wurde auch auf die Expression von regulatorischen Proteinen
angewandt, die sich normalerweise am Zellkern befinden. Da regulatorische
Proteine im Allgemeinen schwer zu exprimieren und zu reinigen sind,
ist es besonders wünschenswert,
ein Verfahren zu entwickeln, durch das derartige Proteine effizient
von einer Wirtszelle sezerniert werden können. Immunfusin-Konstrukte
von Tat und Rev (beschrieben in Beispiel 8), die zwei durch den
humanen Immundefizienz-Virus (HIV) kodierte Proteine sind, die die
Expression von viralen Proteinen im Zellkern regulieren, wurden
hergestellt, um die Effizienz zu bestimmen, mit der diese Proteine
exprimiert und gesammelt werden können. Wir haben einen hohen
Expressions- und Sekretionsspiegel von Tat- und Rev-Immunfusinen
erreicht und die Immunfusine in einem einzigen Schritt ohne Weiteres
gereinigt.
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Ein
für Tat
kodierendes cDNA-Fragment mit 260 Basenpaaren wurde in die XmaI-
und XhoI-Stellen des pdC-Expressionsvektors durch Modifizierung
der 5'- und 3'-Enden des Tat-Proteins
unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken wie oben beschrieben
einkloniert. Die Sequenz der für
das Tat-Protein kodierenden DNA wird in Ratner et al., 1985, Nature,
313:277 bereitgestellt. Insbesondere wurde die Sequenz am 5'-Ende modifiziert
zu Seq. ID No. 6, C CCG GGT CGC ATG GAG..., wobei die unterstrichene
Sequenz die XmaI-Stelle
ist und das ATG in fett das Translationsstartcodon des Tat-Gens ist. Am 3'-Ende wurde eine XhoI-Stelle
direkt stromabwärts
des Translationsstopcodons mittels standardmäßiger PCR-Techniken eingeführt. Der
Tat-Immunfusin-Expressionsvektor wurde dann in eine Wirtszelle transfiziert,
wie oben beschrieben, und die Wirtszellen wurde auf die Produktion
von Tat-Immunfusinprotein analysiert. Es wurden hohe Expressionsspiegel
in transient transfizierten 293-Zellen und stabil transfizierten
NS/0-Zellen erhalten. Stabile NS/0-Klone produzierten etwa 3 μg/ml eines
48 kD Proteins, analysiert auf einem SDS-Gel unter reduzierenden
Bedingungen. Dass dieses Protein ein Tat-Immunfusin ist, wurde durch
einen anti-Tat-Antikörper bestätigt (Cat.
#7001, American BioTechnologies, Cambridge, MA).
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Durch
das folgenden transiente Expressionsexperiment in 293-Zellen, dessen Ergebnisse
unten in Tabelle 2 dargestellt werden, wurde gezeigt, dass das Tat-Immunfusin
aktiv ist. Der Expressionsvektor für Tat-Immunfusin wurde mit
einem seperaten Vektor co-transfiziert,
der LTR-TAR-Kappa enthält,
wobei LTR-TAR die lange terminale Repeat-DNA-Sequenz von HIV ist,
die durch das Tat-Protein
transaktiviert wird und Kappa die Gensequenz ist, die für die leichte
Kappa-Kette des Immunglobulins kodiert. Um die Expressionsspiegel
von Fc-Tat (Tat-Immunfusin) und Kappa zu messen, wurden die Überstände mittels
anti-Fc- bzw. anti-Kappa-ELISA analysiert. In Tabelle 2, stellt
pdC-Fc-Tat den pdC-Expressionsvektor für das Tat-Immunfusin dar, stellt LTR-TAR-Kappa
den Expressionsvektor für
die leichte Kappa-Kette dar, in der die regulatorische Region von LTR-TAR
durch Tat transaktiviert werden kann, und ist pCEP-Tat ein Expressionsvektor
für Tat,
dessen Transkription unter der Kontrolle des humanen Cytomegalovirus-Enhancers und -Promoters
steht. pCEP-Tat wurde als eine positive Kontrolle verwendet, um
die Transaktivierung des LTR-TAR-Kappa durch das Tat-Protein zu überwachen.
Als eine negative Kontrolle wurde nur LTR-TAR-Kappa transfiziert,
um nachzuweisen, dass es in der Abwesenheit des Tat-Proteins oder
Tat-Immunfusins nicht transaktiviert wird. Wie in Tabelle 2 gezeigt,
wurden hohe Expressionsspiegel an Tat-Immunfusin bei Transfektion
1 beobachtet; hohe Expressionsspiegel von sowohl Tat und leichter
Kappa-Kette wurden in dem Cotransfektionsexperiment, Transfektion
2 beobachtet. Transaktivierung von Kappa durch Tat wurde in der
positiven Kontrolle, Transfektion 3, gesehen, wie erwartet. Geringe
oder keine Expression von Kappa wurde in der negativen Kontrolle,
Transfektion 4, gesehen, ebenfalls wie erwartet. Daher wird die
leichte Kappa-Kette nur durch Transaktivierung der LTR-TAR-Region
durch ein funktionales Tat-Protein exprimiert und das Tat-Immunfusin
liefert ein funktionales Tat-Protein, das ohne weiteres von der
Wirtszelle sezerniert wird. Dieses Ergebnis zeigt auch, dass die
Sekretionskassette in der Lage ist, die Sekretion eines Proteins
zu steuern, das normalerweise zum Zellkern der Wirtszelle transportiert wird. Tabelle 2
| ELISA | (ng/ml) |
in der Transfektion
verwende te DNA | Fc | Kappa |
1.) | pdC-Fc-Tat | >3000 | 0 |
2.) | pdC-Fc-Tat, LTR-TAR-Kappa | 1600 | 160 |
3.) | pdC-Fc-Tat, LTR-TAR-Kappa | 0 | 277 |
4.) | LTR-TAR-Kappa | 0 | 3 |
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Beispiel 8. Expression von Rev-Immunfusin
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Ein
für Rev
kodierendes cDNA-Fragment mit 350 Basenpaaren wurde so modifiziert,
dass es eine 5'-XmaI-Stelle
und eine 3'-XhoI-Stelle umfasst, und
dann an das 3'-Ende
der beschriebenen Sekretionskassette in dem pdC-Expressionsvektor
ligiert. Die Sequenz der für
das Rev-Protein kodierenden DNA wird in Ratner et al., 1985, Nature,
313:277 bereitgestellt und wird durch Bezugnahme hier aufgenommen.
Insbesondere wurde die Sequenz am 5'-Ende der cDNA modifiziert zu C CCG GGT CGC ATG GCA...(Seq.
ID No. 7), wobei die unterstrichene Sequenz die XmaI-Stelle und
das ATG in fett das Translationsstartcodon des Rev-Gens ist. Am 3'-Ende wurde eine
XhoI-Stelle direkt stromabwärts
des Translationsstopcodons mittels standardmäßiger PCR-Techniken eingeführt. Es
wurden hohe Expressionsspiegel in transient transfizierten 293-Zellen
und stabil transfizierten NS/0-Zellen erhalten. Stabile NS/0-Klone
produzierten etwa 3 μg/106 Zellen/Tag des Rev-Immunfusins, das ein
Molekulargewicht von etwa 50 kD aufweist, bei Analyse auf einem
SDS-Gel unter reduzierenden Bedingungen.
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Beispiel 9. Stellenspezifische Proteolytische
Spaltung eines Immunfusins
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Unten
wird eine beispielhafte Spaltung eines Immunfusins beschrieben.
Wie einem durchschnittlichen Fachmann offensichtlich wäre, könnte jedes
der oben beschriebenen Immunfusine von seiner jeweiligen Sekretionskassette
unter Verwendung des gleichen Verfahrens oder eines analogen Verfahrens
abgespalten werden.
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Ein
CD26-Immunfusin mit einem Lysinrest („Fc(Lys)-CD26-Immunfusin"), der durch den
Linker-Adaptor während
der Konstruktion des Immunfusins zwischen der Fc-Region und der
CD26-Zielproteinsequenz eingeführt
wurde, wurde unter Verwendung von Trypsin gespalten. Um das Fc(Lys)-CD26-Immunfusin
zu spalten, wurde das Immunfusin an Protein A Sepharose gebunden
und an der gewünschten
Lysinposition durch Trypsin gespalten, um CD26 wie folgt freizusetzen:
Fc(Lys)-CD26-Immunfusin,
das an Protein A Sepharose gebunden war, wurde mit einer 1 %igen
Trypsinlösung
bei 37 °C
für 2 h
inkubiert. Anschließend
wurde Trypsin-Inhibitor (Sigma) zugegeben, um jeglichen weiteren
Verdau zu stoppen. Der Überstand
wurde dann entfernt und auf einem SDS-Gel unter reduzierenden Bedingungen
analysiert. Nach Coomassie-Färbung
wurde eine Bande mit einem Molekulargewicht von 110 kD erhalten,
was der Größe von CD26
ohne die Sekretionskassette entspricht. Als eine Kontrolle wurde
CD26-Immunfusin ohne den Lysinrest an der Verbindung der Fusion
zwischen der Fc-Domäne
und dem CD26-Zielprotein („Fc-CD26-Immunfusin") an Protein A Sepharose
gebunden und gleichartig behandelt. Es wurde erwartungsgemäß festgestellt,
dass CD26 nicht von der Sekretionskassette des Fc-CD26-Immunfusins
freigesetzt wurde, und dies bestätigte
auch die spezifische Spaltung des Immunfusins an der Aminosäure Lysin,
die zwischen der CH3-Domäne
der Fc-Region und dem CD26-Zielprotein eingeführt wurde. Als eine weitere
Kontrolle wurde ein identisches Aliquot des Fc-CD26-Immunfusins,
das an Protein A Sepharose gebunden wurde, in dem gleichen Proteinprobenpuffer
gekocht und die SDS-Gel-Analyse des Überstandes zeigte eine Bande
mit 140 kD, die dem Volllängen-CD26-Immunfusinproteinmonomer
entspricht.
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Die
Ergebnisse aus dem Gelelektrophorese-Experiment wurden durch DPPIV-Aktivitätsassays
der Produkte des Trypsinverdaus bestätigt. Quantitative Gewinnung
der enzymatischen DPPIV-Aktivität
wurde in den Überständen erhalten,
wenn das an Protein A Sepharose gebundene Fc(Lys)-CD26-Immunfusin
mit Trypsin behandelt wurde. In dem parallelen Experiment mit Fc-CD26-Immunfusin,
gab es keine DPPIV-Aktivität
in dem Überstand,
da das CD26-Protein nicht von der Protein A Sepharose freigesetzt
wurde.
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Beispiel 10. Expression von OSF-2-Immunfusin
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OSF-2
ist ein sekretorisches Protein mit 80 kD, das am Knochenbildungsprozess
beteiligt ist. Die Sequenz der für
das OSF-2 kodierenden DNA wird in Takeshita et al., 1993, Biochem.
J. 294:271 bereitgestellt und wird durch Bezugnahme hier aufgenommen.
Die für
das OSF-2 kodierende cDNA mit ihrem Signalpeptid wurde in den Expressionsvektor
pdC einkloniert. Es wurden NS/0-Zellen für eine stabile Transfektion
verwendet und 293-Zellen wurden für transiente Expression verwendet;
aber in keinem Fall wurde das OSF-2-Protein nachgewiesen.
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Die
OSF-2-cDNA wurde dann so angepasst, dass sie als ein Immunfusin
exprimiert wurde. Am 3'-Ende
wurde die XbaI-Stelle am Translationsstopcodon durch Linker-Ligation
in eine XhoI-Stelle umgewandelt. Am 5'-Ende wurde der folgende Linker-Adaptor
verwendet:
wie in den SEQ ID Nos. 8
und 9 bereitgestellt. Die Nucleotide in Fett kodieren für den N-Terminus
des reifen OSF-2-Proteins, das mit kohäsiven Enden von BglII endet.
Diese kohäsiven
Enden von BglII wurden an das BglII-XhoI-Fragment der OSF-2-cDNA
ligiert. Die kohäsiven
Enden von XmaI am 5'-Ende
des Linker-Adaptors (unterstrichen) wurden an die einzige XmaI-Stelle
in dem Immunfusin-Expressionsvektor ligiert.
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Es
wurden hohe Expressionsspiegel in transient transfizierten 293-Zellen
und stabil transfizierten NS/0-Zellen erhalten. Stabile NS/0-Klone
produzierten etwa 5 bis 7 μg/ml
eines 110 kD Proteins, bei Analyse auf einem SDS-Gel unter reduzierenden
Bedingungen. Es wurde mittels Western Blot mit einem anti-OSF-2-Antikörper bestätigt, dass
es sich bei diesem Protein um das OSF-2-Immunfusin handelt.
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Es
wurde auch gefunden, dass die Expression von OSF-2 als ein Immunfusin
in einem Säugetier-System
der Expression von OSF-2 in dem Thioredoxingenfusions-Expressionssystem
in E. coli (LaVallie et al., 1993, Biotechnology, 11:187) überlegen
war. Das Thioredoxin-Genfusionssystem wurde entworfen, um die Bildung
von Einschlusskörpern
zu umgehen, da Fusion an Thioredoxin die Löslichkeit vieler heterologer
Proteine, die im Cytoplasma von E. coli produziert werden, erhöht. Um dieses
System auf die Expression von OSF-2 zu prüfen, wurde die für das reife
OSF-2 kodierende cDNA in die SmaI-Stelle des pTrxFus-Vektors (Invitrogen, San
Diego, CA) insertiert, um so ein Thioredoxin-OSF-2-Fusionsprotein zu
schaffen. Es wurde der Anleitung des Lieferanten für die Expression
der Fusionsproteine gefolgt. Das Thioredoxin-OSF-2-Fusionsprotein wurde exprimiert
und es wurde, als eine Kontrolle, Thioredoxinprotein allein ohne
einen Fusionspartner exprimiert. Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl
Thioredoxin allein als ein lösliches
Protein mit einem hohen Spiegel produziert werden konnte, das Thioredoxin-OSF-2-Fusionsprotein
nur in der unlöslichen
Fraktion vorkam. Daher wurde zusätzlich
zu einem Fehlen von posttranslationaler Modifizierung bei der bakteriellen
Expression, ein relativ komplexes Säugetierprotein wie OSF-2 bei
Fusion an Thioredoxin nicht als ein lösliches Protein synthetisiert.
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Beispiel 11. Expression von βIG-H3-Immunfusin
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βIG-H3, ein
Genprodukt, das durch den Transforming Growth Faktor -induziert
wird, ist ein sekretorisches Protein mit 68 kD, das eine Sequenzhomologie
mit OSF-2 teilt. Die Sequenz der für das βIG-H3 kodierenden cDNA wird
in Skonier et al. (1992) DNA and Cell Biology, 11:511 bereitgestellt
und wird durch Bezugnahme hier aufgenommen. Die für das native βIG-H3 kodierende
cDNA wurde in den Expressionsvektor pdC einkloniert; aber Versuche,
stabile βIG-H3 produzierende
Transfektanten zu erhalten, blieben erfolglos.
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Die βIG-H3-cDNA
wurde dann so angepasst, dass sie als ein Immunfusin exprimiert
wurde. Am 3'-Ende
wurde die BsmI-Stelle stromabwärts
des Translationsstopcodons durch Linker-Ligation in eine XhoI-Stelle umgewandelt.
Am 5'-Ende wurde
der folgende Linker-Adaptor verwendet:
(Seq ID. Nos. 10 und 11).
Die Nucleotide in Fett kodieren für den N-Terminus des reifen βIG-H3-Proteins.
Der Linker-Adaptor hatte kohäsive
Enden von XmaI für
die Ligation des Expressionsvektors wie in den oben genannten Beispielen
beschrieben, und kohäsive
Enden von ApaI für
die Ligation der ApaI-Stelle an das 5'-Ende der für das reife βIG-H3 kodierenden
cDNA-Sequenz.
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Es
wurden hohe Expressionsspiegel in transient transfizierten 293-Zellen
und stabil transfizierten NS/0-Zellen erhalten. Stabile NS/0-Klone
produzierten etwa 3,5 μg//106 Zellen/Tag eines 100 kD Proteins, bei Analyse
auf einem SDS-Gel unter reduzierenden Bedingungen. Es wurde mittels
Western Blot mit einem anti-βIG-H3-Antikörper bestätigt, dass
es sich bei diesem Protein um das βIG-H3-Immunfusin handelt.
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Beispiel 12. Expression der löslichen
Form des IgE-Rezeptors als ein Immunfusin
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Die
alpha-Untereinheit des IgE-Rezeptors (IgE-R) hoher Affinität, dessen
DNA-Sequenz gefunden werden kann in Kochan et al. (1988) Nucleic
Acids Res. 16: 3584 und durch Bezugnahme hier aufgenommen wird,
wurde wie folgt als ein Immunfusin konstruiert: Eine XmaI-Stelle
wurde am 5'-Ende
der für
den reifen IgE-R kodierenden cDNA eingeführt, so dass die Sequenz an
der Verbindung der Fusion C CCG
GGT GTC CCT CAG --- (Seq. ID No. 12) war, wobei die XmaI-Stelle
unterstrichen ist und die drei Codons in Fett die ersten drei Aminosäurereste
des reifen IgE-R sind. Am 3'-Ende
des IgE-R, wurde die für
die Transmembrandomäne
und den Rest des C-Terminus
kodierende cDNA deletiert und es wurde ein Translationsstopcodon
hinter den letzten Codon der extrazellulären Domäne gesetzt. Die Sequenz des
IgE-R-Immunfusins am 3'-Ende
war also TAC TGG CTA TAA CTC GAG (Seq.
ID No. 13), wobei die drei Codons in Fett die letzten drei Aminosäurereste
der extrazellulären
Domäne
von IgE-R waren, und auf sie folgte ein Stopcodon und eine XhoI-Stelle (unterstrichen).
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Der
das IgE-R-Immunfusin enthaltende pdC-Expressionsvektor wurde in
293-Zellen und NS/0-Zellen transfiziert. Es wurden hohe Expressionsspiegel
(3 bis 5 μg/ml)
des IgE-R-Immunfusins mittels anti(Fc)-ELISA in den Zellkulturmedien
nachgewiesen. SDS-Gelanalyse unter reduzierenden Bedingungen zeigte
eine Bande bei der erwarteten Größe von 70
kD. Es wurde gezeigt, dass das teilweise gereinigte Protein (auf
Protein A Sepharose) in einem IgE-R/IgE-ELISA an IgE bindet.
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Beispiel 13. Expression von Fcγ1
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Fcγ1 wurde für sich ohne
ein C-terminales Zielprotein exprimiert. Dies wurde erreicht, indem
der folgende Linker (mit kohäsiven
Enden von XmaI und XhoI) ligiert wurde:
(Seq. ID Nos. 14 und 15),
an die XmaI und XhoI-Stellen des pdC, um die kodierende Region des
Fc zu rekonstruieren. Es wurden hohe Expressionsspiegel mittels
anti(Fc)-ELISA in den Zellkulturmedien der transient transfizierten
293-Zellen (5 bis 7 μg/ml)
und den stabil transfizierten NS/0-Klonen (5 bis 10 μg/ml) nachgewiesen.
SDS-Gelanalyse unter reduzierenden Bedingungen zeigte eine Fc-Bande bei der erwarteten
Größe von 31
kD.
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Beispiel 14. Expression von PSMA-Immunfusin
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PSMA,
Prostata-spezifisches Membranantigen, ist ein Membranprotein vom
Typ II mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 kD. PSMA ist
ein integrales Membranprotein und ist als solches ein attraktives Ziel
für bildgebende
Verfahren und Immunkonjugat-Lieferung.
Um die Expression von signifikanten Mengen an PSMA zu erleichtern,
haben wir die extrazelluläre
Domäne
von PSMA (die lösliche
Form) subkloniert und diese Domäne
von PSMA als ein Immunfusin exprimiert. Ein Teil der extrazellulären Domäne von PSMA,
die die lösliche
Form von PSMA ist, kann als ein Immunfusin produziert werden.
-
Die
für das
Volllängen-PSMA
kodierende cDNA wurde aus einer humanen Prostatakarzinom-Zelllinie LNCaP
kloniert (Israeli et al. (1993) Cancer Res., 53:227). Der Teil der
PSMA-cDNA, die der extrazellulären Domäne entspricht,
wurde so angepasst, dass er durch Polymerasekettenreaktion unter
Verwendung der folgenden Primer als ein Immunfusin exprimiert werden
sollte:
N-terminal: 5' AAGCTT AAA TCC TCC AAT GAA
GC
C-terminal: 5' CTCGAG TTA GGC TAC TTC ACT
CAA AG
(Seq ID. Nos. 16 und 17). Die beiden Primer liefern
die HindIII- und
die XhoI-Stellen (unterstrichen) für das Einklonieren in den Immunfusin-Expressionsvektor.
In dem N-terminalen Primer folgt auf die HindIII-Stelle die kodierende
Sequenz der extrazellulären
Domäne
von PSMA (in fett) direkt hinter der Transmembranregion. In dem
C-terminalen Primer folgt auf die XhoI-Stelle der Anticodon des
Stopcodons und die C-terminale kodierende Sequenz von PSMA (in fett).
Die Aminosäuresequenz
der extrazellulären
Domäne
von PSMA wird in SEQ ID 18 gezeigt.
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Es
wurden hohe Expressionsspiegel in stabil transfizierten 290- und Sp2/0-Zellen
erhalten. Das in die Zellkulturmedien sezernierte PSMA-Immunfusin
wurde mittels Protein A Sepharose gereinigt. Behandlung des Immunfusins
mit der Protease Plasmin wandelte das 130 kD Fc-PSMA quantitativ
in zwei Produkte um: die extrazelluläre Domäne von PSMA mit 100 kD und
das Fc mit 31 kD. Das Fc wurden anschließend aus der Lösung durch
Absorption auf Protein A Sepharose entfernt. Das lösliche PSMA
wurde gereinigt und für
die Immunisierung von Mäusen
verwendet. Es wird erwartet, dass ein nur auf PSMA spezifischer
Antikörper
die Diagnose und Therapie von Prostata-Krebs erleichtern sollte.
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Beispiel 15. Expression von murinem Fc
-
Die
Fc-Region von murinem γ2a
wurde für
die Expression als ein Immunfusin hergestellt. Da die murine Fc-Region
für Mäuse nicht
immunogen sein wird, kann ein derartiges Immunfusin, das das murine
Fc gefolgt von, zum Beispiel, einem humanen Protein-Fusionspartner enthält, verwendet
werden, um Mäuse
ohne vorherige Spaltung, um das Fc loszuwerden, direkt zu immunisieren.
Die murine Fc wurde in unseren Immunfusin-Expressionsvektor wie
unten beschreiben einkloniert und wurde unter unseren Expressionsbedingungen mit
einem hohen Spiegel exprimiert.
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Die
murine Fc-γ2a-Domäne, der
ein Signalpeptid wie oben beschrieben vorherging, wurde in einem Expressionsvektor
kloniert, pdC, und ohne Fusion an ein Zielprotein exprimiert. Murine
Fc-γ2a-cDNA (Sikorav et
al., 1980, Nucleic Acids Res., 8:3143-3155) wurde für die Klonierung
in den Expressionsvektor durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung
der folgenden Primer angepasst:
N-terminal: 5' CTTAAGC GAG CCC AGA GGG CCC ACA
C-terminal:
5' CTCGAGC TCA TTT ACC CGG AGT CCG
(Seq
ID. Nos. 19 und 20). Der N-terminale Primer enthält eine AflII-Stelle (unterstrichen)
für die
Ligation an die AflII-Stelle am 3'-Ende des oben beschriebenen Signalpeptids.
Die auf die AflII-Stelle folgende Sequenz (in fett) kodiert für die Aminosäurereste
in der Gelenkregion des murinen γ2a-Gens.
Der C-terminale
Primer enthält
eine XhoI-Stelle für
das Einklonieren in den Expressionsvektor, gefolgt durch die Anticodons
des Translationsstopcodons und das Carboxyl-Ende des murinen γ2a (in fett).
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Expression
der murinen Fcγ2a-Region
in hohen Spiegeln wurde in 293-Zellen durch SDS-Gel-Analyse gefolgt
von Western Blot mit einem anti-murine IgG-Antikörper nachgewiesen.
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Beispiel 16. Expression von gp120
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Das
Hüllprotein
gp120 des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) ist ein Glykoprotein
mit einem Molekulargewicht von 120 kD und wird auf der Oberfläche von
HIV-Partikeln und HIV-infizierten Zellen exprimiert. Das Protein
gp120 wird ursprünglich
in infizierten Zellen als ein Polyprotein, gp160 exprimiert, das
dann durch ein zelluläres
Protein in gp120 und gp41 gespalten wird. gp120 wurde als ein Immunfusin
hergestellt und es wurde nachgewiesen, dass das gp120-Immunfusin
in sehr hohen Spiegeln exprimiert wurde. Jeder gewünschte Teil
von gp120 kann ebenfalls als Immunfusin hergestellt werden. Die
Fc-Einheit des gp120-Immunfusins konnte abgespalten werden und gp120
wurde gereinigt.
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Die
vollständige
Nucleotidsequenz von HIV wurde veröffentlicht in Ratner et al.
(1985) Nature, 313:277. Um das gp120-Immunfusin herzustellen, wurde
ein Translationsstopcodon gefolgt von einer XhoI-Restriktionsstelle
in die gp120-gp41-Verbindung nach Aminosäure Arg-518 von gp160 unter
Verwendung von standardmäßigen molekularbiologischen
Techniken, z. B. der Polymerasekettenreaktion, eingeführt. Die bestehende
NdeI-Restriktionsstelle, die an Nucleotid 5979 vorliegt, das innerhalb
des aminoterminalen Teils von gp120 liegt, wurde in eine HindIII-Restriktionsstelle
durch eine Linker-Adaptor-Ligation umgewandelt, um eine In-Frame-Fusion zu erzeugen.
Das resultierende HindIII-XhoI-Fragment (1,36 Kilobasenpaare), das
für gp120
kodiert, wurde anschließend
in den Immunfusin-Expressionsvektor, pdC, einkloniert, wie oben
beschrieben.
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Der
gp120-Immunfusin-Expressionsvektor wurde in stabil transfizierten
293-Zellen gemäß den oben beschriebenen
Verfahren exprimiert und es wurde eine Expression des gp120-Immunfusins
in hohen Spiegeln erhalten. Das gp120-Immunfusin war funktional aktiv,
wie durch Bindung an CD4 in einem ELISA nachgewiesen. Es wurde auch
nachgewiesen, dass das gp120-Immunfusin quantitativ durch Enterokinase
gespalten wird, um die gp120 und die FC-Region freizusetzen. SEQUENZPROTOKOLL