DE69535254T2

DE69535254T2 - Hochgeschwindigkeits-lichtquelle mit vielfachen wellenlängen für die quantitative verhältnis-lumineszenzmikroskopie

Info

Publication number: DE69535254T2
Application number: DE69535254T
Authority: DE
Inventors: Gary Brooker
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-03-25
Filing date: 1995-03-10
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2015-03-11
Also published as: ATE341759T1; DE69535254D1; EP0783680A1; US5491343A; WO1995026498A1; EP0783680B1; EP0783680A4; AU1977995A; JP3640964B2; JPH10500479A; CA2186241A1; CA2186241C

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Hochgeschwindigkeitsbeleuchtungsquelle mit mehreren Wellenlängen, eine Vorrichtung, die die Beleuchtungsquelle enthält, um lumineszierende Proben zu beleuchten und eine Lumineszenzmikroskopie mit quantitativem Verhältnis unter Anwendung der Beleuchtungsquelle auszuführen.
Hintergrund
Ein wachsendes Gebiet in der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie ist die Verhältnisabbildung, die das sequenzielle Beleuchten des gleichen Feldes einer Probe mit zwei oder mehr Lichtwellenlängen beinhaltet, wobei jedes Bild aufgenommen und anschließend die Intensitäten der zwei sich ergebenden Bilder geteilt werden (oder von interessierenden Flächen innerhalb der Bilder), um ein Intensitätsverhältnis der beiden Bilder zu erhalten. Typischerweise ist die Probe mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, wobei das Fluoreszenzverhältnis mit einer quantitativen Eigenschaft des Farbstoffs oder mit einer Wechselwirkung mit einer weiteren Substanz, die die Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffes beeinflusst, in Beziehung steht. Ein Beispiel eines Verfahrens und einer Vorrichtung für Verhältnisphotometrie mit mehreren Wellenlängen und Verhältnisabbildung mit mehreren Wellenlängen ist in der US-Anmeldung mit der Anmelde-Nr. 07/935,873, die am 26. August 1992 eingereicht wurde und nunmehr das am 26. Juli 1994 erteilte US-Patent 5,332,905 ist, beschrieben.
Bei der quantitativen Fluoreszenzverhältnisabbildung oder der Fluoreszenzphotometrie (auch als „quantitative Verhältnisabbildung" oder „quantitative Verhältnisphotometrie" bekannt), wird eine Probe, die eine fluoreszente Verbindung oder eine fluoreszente Materialsorte enthält, mit zwei unterschiedlichen Lichtwellenlängen (λ₁ und λ₂) beleuchtet. Die entsprechenden resultierenden Fluoreszenzintensitäten (I₁ und I₂) werden in einem oder mehreren vorbestimmten interessierenden Bereichen auf der fluoreszenten Probe mit einem Photometer gemessen. Alternativ können die Fluoreszenzintensitäten I₁ und I₂ als ein Feld aus Bildpunkten bzw. Pixeln mittels eines Bilddetektors gemessen werden, so dass ein Bild der fluoreszenten Probe erzeugt und/oder beobachtet werden kann. Die Abhängigkeit zwischen dem Verhältnis der fluoreszierenden Emissionsintensitäten (I₁/I₂) bei jeder der beiden entsprechenden Anregungswellenlängen λ₁ und λ₂ ist eine Funktion der Konzentration der Substanzen, die mit dem fluoreszierenden Farbstoff in Wechselwirkung treten oder sich mit diesem Verbinden. Die Konzentration der die fluoreszenzbeeinflussenden Substanz ([Substanz]) ist durch die folgende Gleichung (1) definiert:
Die Intensitäten können an der bzw. den gleichen Stellen der Probe gemessen werden. Somit ist die Konzentration der fluoreszenten Verbindung ([Farbstoff]) bei beiden Anregungswellenlängen die gleiche. Somit besteht der einzige Unterschied in den Messungen gemäß Gleichung (1) in der Anregungswellenlänge. Daher fällt der Term mit der Farbstoff konzentration in Gleichung (1) weg und die Gleichung reduziert sich auf:
Gegenwärtig ist die Rate, mit der das Verhältnisbild der Probe erhalten werden kann, durch die Frequenz begrenzt, bei der die Probe abwechselnd mit jeder der Anregungswellenlängen bestrahlt werden kann. Die Wellenlängenänderung wird in jedem Falle durch eine mechanische Vorrichtung (etwa ein Filterrad) gesteuert, um die Beleuchtungswellenlänge abzuwechseln. Das am häufigsten verwendete Verfahren zur abwechselnden Einstrahlung der Anregungswellenlänge besteht darin, die Probe mit einer Bogenentladungsleuchte bzw. einer Entladungsleuchte 11 zu bestrahlen (die ein breites Lichtspektrum bietet) und die Wellenlänge der Beleuchtung durch Schalten von Filtern auf einem Filterrad 12 zu ändern, das lediglich die gewünschte Lichtwellenlänge zu der Probe 13 durchlässt, wie dies in 1 gezeigt ist.
Ein weiteres Verfahren besteht darin, zwei Quellen mit monochromatischem Licht, das auf die Probe gebündelt wird, abzuwechseln. Dies wird gegenwärtig dadurch erreicht, dass eine mechanische Einrichtung zwischen den beiden Lichtquellen 22 und 23 einerseits und der Probe 24 andererseits angeordnet wird, wie in 2 gezeigt ist. Die mechanische Einrichtung 21 blockiert typischerweise einen einzelnen Lichtstrahl, indem abwechselnd ein Verschluss geöffnet oder geschlossen wird oder indem die Drehung eines Zerhackerrades gesteuert wird. Nach dem Durchlaufen der mechanischen Einrichtung 21 tritt der Lichtstrahl in die Filter 25 oder 26 ein, bevor er auf die Probe 24 trifft.
Die Vorgehensweisen unter Anwendung eines Filterrades, von Verschlüssen oder eines Zerhackerrades sind durch die Geschwindigkeit der mechanischen Bewegung begrenzt, die zur Änderung der Filter, der Verschlüsse, oder der Zerhackerflächen erforderlich ist. Im Gegensatz dazu ist die Geschwindigkeit, mit der ein Detektor so geändert werden kann, dass er eine neue Messung durchführt, lediglich durch die elektronische Schaltung begrenzt, die die Messvorrichtung steuert. Im Allgemeinen können elektronische Impulse mit einer wesentlich höheren Geschwindigkeit als eine mechanische Einrichtung, etwa ein Filterrad, Verschlüsse oder Zahnräder geändert werden. Es ist daher ein wünschenswertes Ziel auf dem Gebiet der Photometrie, eine Einrichtung zum (wiederholten) Ändern oder Schalten von Lichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängen mit der Geschwindigkeit einer elektronischen Schaltung anstatt der Geschwindigkeit von mechanischen Bewegungen bereitzustellen.
Des weiteren verursacht das mechanische Schalten von Filtern, Verschlüssen oder Zerhackerrädern auch Schwingungen in der Messvorrichtung. Derartige Schwingungen können zu Änderungen der Position der Probe führen, die gerade gemessen wird (insbesondere, wenn eine Probe unter einem Mikroskop betrachtet wird), wodurch die Zuverlässigkeit der durch Messungen ermittelten Daten verloren geht.
Das schnellste Filterrad, das aktuell verfügbar ist, ermöglicht es, zwischen unterschiedlichen Anregungswellenlängen in einer Zeitdauer von ungefähr 2,5 bis 5 Millisekunden (ms) umzuschalten. Jedoch ist ein derartiges Filterrad in einer konstanten Bewegung während des Betriebs. Die konstante Bewegung begrenzt die Dauer, mit der die Probe beleuchtet werden kann, und ruft ebenso ungleichmäßige Stör- bzw. Interferenzmuster beim Filtern des Anregungslichts hervor.
Dokument US-A-5,294,799 offenbart eine quantitative Fluoreszenzmessung für mehrere phosphorisierende Stoffe, in denen zwei Laserquellen eine Probe mit Strahlen mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen bestrahlen, deren Intensität sinusförmig moduliert sind. Die Reaktion der phosphorisierenden Stoffe werden mittels einer synchronen Erfassung ermittelt.
Überblick über die Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist durch den angefügten Patentanspruch 1 definiert. Diverse Ausführungsformen sind in den abhängigen Patentansprüchen angegeben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ein vollständigeres Verständnis der Erfindung und viele damit verknüpfter Vorteile können erreicht werden, indem auf die folgende detaillierte Beschreibung im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen Bezug genommen wird, wobei:
1 ein konventionelles Verfahren zum Ändern der Beleuchtungswellenlänge durch Verwendung eines Filterrades zeigt;
2 ein konventionelles Verfahren zum Verändern der Beleuchtungswellenlänge unter Anwendung von Verschlüssen oder einem sich drehenden Zerhackerrad darstellt;
3 ein Verfahren zum Ändern der Wellenlänge der Anregungsenergie durch elektronisches Steuern zweier unabhängiger Entladungsleuchten zeigt;
4 eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zum Durchführen einer Emissionsverhältnisphotometrie und/oder einer Emissionsverhältnisabbildung zeigt;
5 die Verhaltenseigenschaften einer geschalteten Quelle mit mehreren Entladungsleuchten darstellt;
6a und 6b graphisch die Änderungen im Entladungsstrom und die Lichtausbeute für jede der beiden unabhängigen Lichtquellen als Folge einer elektrischen Steuerung und Schaltung zeigen;
7 die allgemeine Abhängigkeit zwischen dem Entladungsstrom und der Lichtintensität darstellt;
8 eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Beleuchtungsquelle in Verbindung mit einem Strahlvereiniger zeigt; und
9 eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Beleuchtungsquelle mit mehreren Entladungsleuchten, wobei eine Pilot- oder Führungsentladung und eine aktive Entladung verwendet werden, zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es sei auf die Figuren verwiesen, in denen gleiche Bezugszeichen identische oder entsprechende Teile durchwegs in den diversen Ansichten repräsentieren, und es wird insbesondere auf 3 verwiesen, wobei ein erster Schritt des vorliegenden Verfahrens zum sequenziellen Beleuchten einer Probe mit unterschiedlichen Lichtwellenlängen und eine Vorrichtung, die für das Verfahren geeignet ist, in statischer Weise dargestellt sind. In 3 liefert eine elektronische Stromsteuereinrichtung 31 einen relativ hohen Strom zu einer ersten Lichtquelle 32. Die erste Lichtquelle 32 stellt Anregungslicht bereit, das durch einen ersten wellenlängenempfindlichen Filter 34 läuft, der ein Licht einer ersten Wellenlänge λ₁ erzeugt, das dann eine Probe 36 trifft (oder diese beleuchtet), die eine lumineszierende Substanz (vorzugsweise eine fluoreszierende Substanz) enthält. Gleichzeitig wird ein relativ geringer Strom mittels der elektronischen Stromsteuereinrichtung 31 zu einer zweiten Lichtquelle 33 zugeführt. Der relative Anteil an Strom für die zweite Lichtquelle 33 ist ausreichend gering, um damit nicht die lumineszente Emission bzw. Emissionen der Probe 36 zu stören oder zu beeinflussen, die durch die Beleuchtung mit dem Anregungslicht der ersten Wellenlänge λ₁ hervorgerufen wird, wobei dieses Licht durch die erste Lichtquelle 32 und den ersten wellenlängenempfindlichen Filter 34 erzeugt wird.
Wie bekannt ist, ist die Energie des Lichts umgekehrt proportional zu seiner Wellenlänge. Die Begriffe „Energie" und „Wellenlänge" können austauschbar in Bezug auf Licht verwendet werden. Ferner betreffen die Begriffe „lumineszent" und „Lumineszenz bzw. Leuchtkraft" sowohl Fluoreszenz- als auch Phosphoreszenzphänomene.
Um die Wellenlänge des Anregungslichts zu ändern, ändert die elektronische Stromsteuereinrichtung 31 abwechselnd den relativen Betrag des elektrischen Stroms, der durch die jeweilige Lichtquelle fließt, beispielsweise die Entladungsleuchten 32 und 33. Als Folge davon ändert die elektronische Stromsteuereinrichtung 31a abwechselnd die Intensität der ersten und der zweiten Lichtquelle 32 und 33. Aus dem ersten in 3 gezeigten Schritt wird durch Erhöhen des durch die zweite Lichtquelle 33 fließenden Stromes und durch Reduzieren des durch die erste Lichtquelle 32 fließenden Stromes die Wellenlänge des auf die Probe 36 treffenden Lichts geändert.
Das Ändern des Stromes auf diese Weise verursacht einen plötzlichen Wechsel der Lichtintensität jeder Lichtquelle. Im Falle eines Systems mit zwei Quellen besteht die resultierende Wirkung darin, dass, wenn der Strom in der ersten Leuchte 32 (die λ₁ bestimmt) und der Strom in der zweiten Leuchte 33 (die λ₂ bestimmt) reduziert wird, die Probe 36 mit Licht der Wellenlänge λ₁ beleuchtet wird. Wenn der Strom dann in der zweiten Leuchte 33 (die λ₂ bestimmt) erhöht wird und der Strom in der ersten Leuchte 32 (die λ₁ bestimmt) abgesenkt wird, besteht die resultierende Wirkung darin, dass die Probe 36 mit Licht der Wellenlänge λ₂ beleuchtet wird. Dieser Ablauf kann mit einer beliebigen Frequenz wiederholt werden, mit der die elektronische Stromsteuereinrichtung betreiben werden kann, um abwechselnd die Probe mit diesen beiden Lichtwellenlängen zu beleuchten.
Die erste oder die zweite Wellenlänge des Lichts kann die mittlere oder die Durchschnittswellenlänge eines Bandes oder eines Bereichs aus Wellenlängen an Licht repräsentieren (beispielsweise 300 bis 340 nm oder 380 bis 400 nm), oder die entsprechende Wellenlänge kann ein Band oder einen Bereich repräsentieren, der größer ist als eine ausgewählte oder gewünschte Wellenlänge (beispielsweise ein „Durchlassfilter für lange Wellenlängenbereiche, der es ermöglicht, Licht mit einer Wellenlänge von 500 nm oder mehr durchzulassen). Somit kann die erfindungsgemäße Vorrichtung ferner eine erste und eine zweite Einrichtung zum Auswählen eines Bandbereichs aus Licht umfassen, wobei die Einrichtung ein Filter, ein Gittermonochromator oder eine äquivalente Einrichtung sein kann, die einen ausgewählten Bandbereich an Wellenlängen des Lichts liefert. Die erfindungsgemäße Einrichtung zum Auswählen eines Lichtbandbereichs empfängt jeden Lichtstrahl, nachdem dieser von einer Lichtquelle erzeugt und bevor dieser die Probe trifft oder diese beleuchtet.
Obwohl ein Bereich aus Licht mit einer gewünschten Bandbreite ausgewählt werden kann, besitzen das erste und das zweite Band aus Wellenlängen eine Bandbreite von 40 nm oder weniger, oder die entsprechenden Wellenlängen sind größer oder gleich als eine gewünschte oder ausgewählte Wellenlänge. Derartige Bereiche aus Wellenlängen von Licht können durch einen ersten Filter und einen zweiten Filter bereitgestellt werden, die entsprechend in den optischen Wegen des von der ersten bzw. der zweiten Lichtquelle er zeugten Lichts liegen. Derartige Filter können aus einem oder mehreren geeigneten konventionellen wellenlängenselektiven Materialien hergestellt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Alternativ kann ein konventioneller Gittermonochomator, der die gewünschte Anregungswellenlänge liefert, anstatt des ersten und/oder des zweiten Filters eingesetzt werden. Somit wird in einer vorteilhaften Ausführungsform eine Probe durch die erfindungsgemäße Vorrichtung sequenziell mit zwei oder mehreren Wellenlängen beleuchtet. Die erste Wellenlänge ist eine mittlere oder eine durchschnittliche Wellenlänge eines ersten Bandes aus Wellenlängen, die zweite Wellenlänge ist eine mittlere oder eine Durchschnittswellenlänge eines zweiten Bandes aus Wellenlängen, und das erste und das zweite Wellenlängenband besitzen (a) eine Bandbreite von 40 nm oder weniger, oder (b) sind größer oder gleich als eine gewünschte oder vorgegebene Wellenlänge.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die erste Lichtquelle in der Vorrichtung für das sequenzielle Beleuchten einer Probe mit Licht eine erste Entladungsleuchte und die zweite Lichtquelle ist eine zweite Entladungsleuchte.
In der vorliegenden Erfindung kann eine beliebige geeignete Entladungsleuchte, die ein ausreichendes Anregungslicht zum Erzeugen einer oder mehrerer lumineszenter Emissionen in der Probe bereitstellt, verwendet werden. Beispielsweise kann eine Entladungsleuchte mit einer Leistung von 10 bis 2000 Watt verwendet werden. Die Art einer geeigneten Entladungsleuchte kann auf der Grundlage der Höhe der Beleuchtungsintensität (Anregungslicht), das erforderlich ist, auf der Grundlage der Intensität des von der Lichtquelle erzeugten Lichts und/oder auf der Grundlage eines oder mehrerer anderer entsprechender Faktoren bestimmt werden. Die erste Quelle ist eine Entladungsleuchte, die eine erste Lichtintensität (beispielsweise eine Entladungsleuchte mit 500 Watt (W) liefert, und eine zweite Entladungsleuchte als Lichtquelle kann eine zweite relativ höhere oder relativ geringere Lichtintensität (beispielsweise eine Entladungsleuchte mit 10 Watt oder 2000 Watt) bereitstellen.
Die vorliegende Erfindung kann auch erweitert werden, so dass mehr als zwei Lichtquellen und mehr als zwei Lichtwellenlängen verwendet werden. Theoretisch besteht keine Grenze im Hinblick auf die Anzahl der Lichtquellen, die verwendet werden können, so lange die erzeugten Lichtstrahlen auf die Probe zur Ausleuchtung dieser gerichtet werden können. In ähnlicher Weise besteht keine Beschränkung im Hinblick auf die Anzahl der Wellenfängen aus Licht, die ausgewählt werden können, solange jede der ausgewählten Wellenlängen erzeugt und zur Beleuchtung der Probe verwendet werden kann.
4 zeigt eine beispielhafte Ansicht einer speziellen Vorrichtung zum Ausführen einer Emissionsverhältnisphotometrie oder einer Verhältnisabbildung. Die Lichtquelle 41 liefert Licht mit einer geeigneten Anregungsenergie, um damit die gewünschten Emissionsphänomene zu bewirken. In der vorliegende Ausführungsform ist die Lichtquelle 41 vorzugsweise die in 3 gezeigte Vorrichtung, die eine elektronische Stromsteuereinrichtung 31 und die erste und die zweite Lichtquelle 32 und 33 aufweist. Das Licht aus der Lichtquelle 41 läuft durch die Filtervorrichtung 42 (die, wie in 3 gezeigt ist, den ersten und den zweiten Filter 34 und 35 umfasst), und wird dann von dem dichroischen Spiegel 43 und dem Bereich zur Probenmontage oder der Halterung 44 reflektiert. Das Anregungslicht wird dann von der Probe absorbiert, die auf der Montagehalterung 44 angeordnet oder montiert ist. Die Probe enthält eine lumineszierende (fluoreszierende oder phosphoreszierende) Substanz oder einen lumineszierenden Komplex, wobei der Komplex eine lumineszierende Substanz und eine lumineszenzbeeinflussende Sorte aufweist. Die lumineszierende Substanz oder der Komplex wird angeregt, emittiert dann Licht mit geringerer Energie und größerer Wellenlänge als das Anregungslicht. Das von der lumineszierenden Substanz ausgesandte Licht läuft durch den dichroischen Spiegel 43 und wird von einer Reihe von Spiegeln 45 (A), 45 (B) und 45 (C) zum Detektor 46 reflektiert, an welchem die Emission gemessen wird.
Der Vorgang wird dann wiederholt, um eine zweite Emission zu erhalten. Für eine Probe mit einer oder mehreren zusätzlichen lumineszierenden Substanzen oder Komplexen wird der Prozess doppelt so häufig für jede zusätzliche lumineszierende Substanz oder jeden Komplex wiederholt. Jeder der Emissionsvorgänge wird unabhängig von einem geeignet ausgestalteten Detektor aufgezeichnet.
Erfindungsgemäß werden Leuchten so positioniert, dass die Probe so beleuchtet wird, wie dies in den konventionellen Verfahren der Fall ist, wie sie zuvor unter Anwendung von Verschlüssen oder einem Zerhacker beschrieben werden, mit der Ausnahme, dass derartige mechanische Einrichtungen zum Ändern der Lichtwellenlänge bei der Praktizierung der vorliegenden Erfindung nicht verwendet werden.
Wie in 5 gezeigt ist, wird der Übergang von einer ersten Wellenlänge aus Anregungslicht (λ₁) zu einer zweiten Wellenlänge aus Anregungslicht (λ₂) elektronisch bewerkstelligt, wobei die elektronische Stromsteuereinrichtung 51 verwendet wird. Vorzugsweise ist die steuernde Einrichtung zum Einstellen des elektrischen Stromes zu den Lichtquellen mittels einer elektronischen Halbleiterschaltung realisiert.
In der statischen Darstellung aus 5 liefert die elektronische Stromsteuereinrichtung 51 einen relativ hohen Strom zu der ersten Lichtquelle 52, d. h. der Entladungsleuchte, die die aktive Lichtquelle in dieser statischen Darstellung repräsentiert. Beispielsweise beträgt der relative Anteil des Stromes, der in die erste Lichtquelle eingespeist wird, > 90% des Gesamtstromes, der von der elektronischen Stromsteuereinrichtung 51 zu der ersten Lichtquelle 52 und der zweiten Lichtquelle 53, die beide Entladungsleuchten sind, zugeführt wird. Im Hinblick auf das Beibehalten eines ausreichend kleinen Stromes durch die nicht aktive Lichtquelle ist es vorteilhaft, dass der maximale relative Anteil des Stromes für die aktive Lichtquelle bei 95 bis 99% des Gesamtstromes liegt, der von der elektronischen Stromsteuereinrichtung zu allen Lichtquellen zugeführt wird. Somit beträgt in der statischen Darstellung aus 5 der relative Anteil des Stromes, der der ersten Lichtquelle 52 zugeführt wird, vorzugsweise 95 bis 99%, und der relative Anteil des Stromes, der der zweiten Lichtquelle 53 zugeführt wird, beträgt vorzugsweise 1 bis 5% des Gesamtstromes, der von der elektronischen Stromsteuereinrichtung 51 der ersten Lichtquelle 52 und der zweiten Lichtquelle 53 zugeführt wird.
Die erste Lichtquelle 52 liefert einen ersten Lichtstrahl, der durch einen ersten wellenlängenspezifischen Filter 54 läuft, wodurch Licht einer ersten Wellenlänge λ₁ erzeugt wird, das dann auf einen ersten Detektor 56 trifft. Gleichzeitig wird ein relativ geringer Strom durch die elektronische Stromsteuereinrichtung 51 zu der zweiten Lichtquelle 53 geführt, die einen zweiten Lichtstrahl erzeugt, der durch einen zweiten wellenlängensensitiven Filter 55 läuft, wodurch Licht mit einer zweiten Wellenlänge λ₂ erzeugt wird, das dann auf einen zweiten Detektor 57 trifft.
Um zwischen den unterschiedlichen Wellenlängen des Anregungslichts umzuschalten, ändert die elektronische Stromsteuereinrichtung 51 abwechselnd den Betrag des elektrischen Stromes, der durch entsprechende Lichtquellen 52 und 53 fließt, wodurch abwechselnd die relative Intensität jeder Lichtquelle 52 und 53 geändert wird. Die Lichtquellen 52 und 53 sind Entladungsleuchten. Durch Erhöhen des Stromes, der durch die Lichtquelle 53 fließt und durch Reduzieren des Stromes, der durch die erste Lichtquelle 52 fließt, ändern sich die Intensitäten jeder Wellenlänge des Lichts, das auf den ersten und den zweiten Detektor 56 und 57 trifft, relativ zueinander. Ferner kann man zwischen unterschiedlichen Intensitäten des Anregungslichts wählen, indem die elektronische Stromsteuereinrichtung 51 verwendet wird, um abwechselnd den relativen Betrag des elektronischen Stromes zu ändern, der durch die entsprechende Lichtquelle 52 und 53 fließt.
Wenn die Intensität einer Lichtquelle (eine Entladungsleuchte) reduziert ist, wird erfindungsgemäß ein minimaler Strom in der Lichtquelle aufrecht erhalten. Ein „minimaler Strom" in einer Entladungsleuchte ist so zu verstehen, dass dieser ausreichend ist, um einen kleinen Entladungsbogen aufrecht zu erhalten, wobei der Strom jedoch keine Störung der Messung der Emission hervorruft, die sich aus der Beleuchtung mit Licht von einer Entladungsleuchte ergibt, die einen relativ großen Stromfluss aufweist. Man kann sich die Entladung, die bei einem minimalen Strom betrieben wird, als einen „Pilot- bzw. Führungs"-Zustand vorstellen. Ströme bis zu 1% oder weniger des maximalen Stromes, der der Leuchte zugeführt wird, halten die Entladung in Gang. Solange die Entladung in Gang ist, führt das Zuführen eines erhöhten Stromes instantan zu einer höheren Beleuchtungsintensität. Wenn die Entladung in dem Pilotzustand erlischt, ist ein rasches Umschalten nicht möglich. Es ist eine relativ lange Zeitdauer (beispielsweise 1 bis 20 Sekunden) erforderlich, um die Entladung erneut in Gang zu bringen.
Erfindungsgemäß ermöglicht es das Beibehalten der Entladung in dem Pilotzustand auch, in effizienter Weise eine neu und stabile Lichtintensität einzurichten. Die Stabilität und Reproduzierbarkeit der neuen Intensität kann vorteilhaftweise verbessert werden, indem mit geeigneten Standards kalibriert wird, bevor eine Probe mit einer unbekannten Konzentrationsverteilung an lumineszierenden Sorten oder lumineszenzbeeinflussenden Sorten bestrahlt wird oder die Emissionsintensitäten gemessen werden. Somit können Entladungsleuchten vorteilhafter Weise eingesetzt werden, so dass diese dennoch einen hohen dynamischen Bereich für das rasche Umschalten von Lichtintensitäten bereitstellen, wobei das wichtige Merkmal einer instantanen nicht-mechanischen schwingungsfreien elektronischen Steuerung gegeben ist.
Wie in 5 gezeigt ist, werden die in den 6a und 6b angegebenen Lichtintensitäten in Abhängigkeit der Zeit erhalten, wenn der relativ hohe und der relativ geringe Strom abwechselnd in die erste Lichtquelle 52 und die zweite Lichtquelle 53 eingeprägt werden, und wenn die Intensitäten jedes erzeugten Lichtstrahls mittels des ersten und des zweiten Detektors 56 und 57 aufgezeichnet werden. Der erste und der zweite Detektor 5fi und 57 sind beispielsweise Hochgeschwindigkeitsphotodiodendetektoren. Die instantane Einspeisung eines höheren Stromes führt zu einer unmittelbaren Zunahme der Lichtintensität. In ähnlicher Weise führt eine unmittelbare Reduzierung des Stromes zu einer unmittelbaren und verhältnisgleichen Abnahme der Lichtausgangsleistung (Intensität). In dem in 6a und 6b gezeigten Beispiel kann die Zeitdauer für eine einzelne Beleuchtung mit λ₁ und λ₂ von einer kurzen Zeitdauer von 1 ns bis zu einer Dauer, die theoretisch gegen unendlich geht, variiert werden, wobei dies aus praktischen Gründen jedoch 2 bis 4 Stunden sein kann, und wobei die sich ergebende Wiederholbarkeit in den 6a und 6b gezeigt ist.
Gemäß den 6a und 6b kann die Zeitdauer „a", in der die Probe mit Licht der Wellenlänge λ₂ beleuchtet wird und/oder die Zeitdauer „b", in der die Probe mit dem Licht der Wellenlänge λ₁ bestrahlt wird, eine beliebige Zeitdauer sein, die elektronisch steuerbar ist. Theoretisch gibt es keine obere Grenze für die Zeitdauer, mit der die Probe mit einer oder beiden Lichtwellenlängen bestrahlt werden kann. Aus praktischen Gesichtspunkten heraus wird jedoch die Probe mit einer einzelnen Lichtwellenlänge für eine Zeitdauer von 1 ns bis 24 Stunden und noch vorteilhafterweise von 1 ns bis 1 Sekunde und noch besser von einer 1 ns bis 2,5 ms bestrahlt.
Wie ferner in dem Graphen in 7 gezeigt ist, ist die von einer Lichtquelle (Entladungsleuchte) ausgegebene Intensität an Licht linear proportional zu dem Betrag des Stromes, der der Lichtquelle zugeführt wird.
Wie in 8 gezeigt ist, ist die vorliegende Erfindung auch für die fluoreszente Verhältnisphotometrie und Abbildung in einem Mikroskop geeignet, wobei die Komponenten der Vorrichtung so angeordnet werden, dass die beiden Lichtquellen 82 und 83 (Strahlen von Entladungsleuchten) mit einem konventionellen Strahlungsvereiniger 84 kombiniert werden, um die Probe zu beleuchten. Beispielsweise ist ein geeigneter Strahlvereiniger von Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland, erhältlich. Die elektronische Stromsteuerung 91 wechselt die Beleuchtung durch die Lichtquelle 82 mit λ₁ und durch die Lichtquelle λ₂ mit einer Frequenz von 1 ns bis 24 Stunden pro Zyklus, nach Bedarf.
Eine optionale Ausführungsform der vorliegenden Belichtungsquelle umfasst eine Leuchte mit mehreren Entladungen, d. h. einer Pilotentladung und einer aktiven Entladung, die vorzugsweise elektrisch verbunden sind. Somit wird in einer alternativen Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung mindestens eine Lichtquelle eingesetzt, in der zwei oder mehrere Entladungen aufrecht erhalten werden (eine Leuchte mit mehreren Entladungen), wobei eine Entladung eine Führungs- bzw. Pilotentladung und eine weitere Entladung eine aktive Entladung bzw. Betriebsentladung ist.
In der erfindungsgemäßen Leuchte mit mehreren Entladungen bleibt eine Entladung in jeder Lichtquelle außerhalb der optischen Achse in einem „Pilotzustand", um einen minimalen elektrischen Strom in der Lichtquelle aufrecht zu erhalten, und eine weitere Entladung in jeder Lichtquelle ist in der optischen Achse positioniert (die „aktive" Entladung). Die aktive Entladung kann ein oder ausgeschaltet werden, oder ihre Intensität kann durch elektrisches Variieren des eingespeisten Stromes eingestellt werden.
Eine Ausführungsform einer Leuchte mit mehreren Entladungen mit einer Pilotentladung und einer aktiven Entladung ist in 9 gezeigt. Die Hauptentladung 91 (die „aktive" oder „Betriebsentladung") ist zu der optischen Achse des Strahls aus Licht, der durch die Leuchte mit mehreren Entladungen erzeugt wird, ausgerichtet. Ein relativ hoher vorgewählter oder gewünschter Betrag an Strom wird von der elektronischen Stromsteuereinrichtung (nicht gezeigt) bereitgestellt und wird in die Hauptentladung 91 eingespeist, um eine erste Wellenlänge aus Licht λ₁ für die Beleuchtung der Probe bereitzustellen. Die elektronische Stromsteuereinrichtung liefert einen minimalen Strom zu der Pilotentladung 92, um den „Pilotzustand" aufrecht zu erhalten.
Wenn die Pilotentladung elektrisch mit der aktiven bzw. Betriebsentladung verbunden ist, besteht die Funktion der Pilotentladung darin, einen minimalen elektrischen Strom durch die Lichterzeugungseinrichtung der Lichtquelle (die mehreren Entladungen) aufrecht zu erhalten. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft, wenn die Betriebsentladung abwechselnd ein und ausgeschaltet wird. Wenn der durch die Betriebsentladung fließende Strom auf einen relativ hohen Wert erhöht wird (von einem relativ geringen Wert oder vom Wert Null), liefert die Pilotentladung einen Strom, der instantan die Entladung in der Betriebsentladung wieder herstellt. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden erfindungsgemäßen Leuchte mit mehreren Entladungen besteht darin, dass das von der Pilotentladung erzeugte Licht (wesentlich oder vollständig außerhalb der Ausrichtung) der optischen Achse justiert ist. Somit erzeugt die Leuchte mit mehreren Entladungen ein geringes Störlicht aus einer Entladung, die in einem „Pilotzustand" aufrecht erhalten wird, im Vergleich zu einer Leuchte mit einer einzelnen Entladung.
Um die Wellenlänge des Licht zur Probenbeleuchtung von λ₁ auf λ₂ umzuschalten, reduziert die elektronische Stromsteuereinrichtung den Strom in der Hauptentladung 91 auf einen minimalen Stromwert, vorzugsweise auf einen Wert 0. Nachfolgend wird der Strom zu einer zweiten Lichtquelle (die in 9 nicht gezeigt ist und die eine Leuchte mit einzelner Entladung oder mehreren Entladungen sein kann) ausreichend erhöht, um eine Anregungswellenlänge λ₂ für die Beleuchtung der Probe bereitzustellen. Der der Pilotentladung 92 zugeführte Strom wird auf einem minimalen Wert gehalten (wie dies zuvor definiert ist), und wird vorteilhafterweise mit konstantem Strom betrieben. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist die zweite Lichtquelle eine zweite Leuchte mit mehreren Entladungen und das Umschalten der Wellenlänge und der Intensität für die Probenbeleuchtung umfasst das Erhöhen des Stromes in der Betriebsentladung der zweiten Leuchte mit mehreren Entladungen in ausreichender Weise, um einen Lichtstrahl mit der Wellenlänge λ₂ zu erzeugen.
Die erfindungsgemäße Beleuchtungsquelle und die Vorrichtung sind insbesondere im Verfahren für Emissionsverhältnisphotometrie und Emissionsverhältnisabbildung einsetzbar, wobei die Emissionsverhältnisphotometrie und Abbildung mit mehreren Wellenlängen und die Flureszenzemissionsverhältnismetrie und Abbildung gehören. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese speziellen Einsatzzwecke beschränkt.
Somit betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung für die Lumineszenzphotometrie mit:

(a) einer ersten Entladungsleuchte, die einen ersten Lichtstrahl mit ausreichender Energie erzeugt, um elektronisch mindestens eine lumineszente Verbindung in einer Probe anzuregen,
(b) einer zweiten Entladungsleuchte, die einen zweiten Lichtstrahl mit ausreichend Energie erzeugt, um mindestens eine lumineszente Verbindung in der Probe elektronisch anzuregen,
(c) einer Steuereinrichtung zum Steuern des elektrischen Stromes zu jeweils der ersten und der zweiten Entladungsleuchte, wobei die Steuereinrichtung elektrisch mit der ersten und der zweiten Entladungsleuchte verbunden und ausgebildet ist, den elektrischen Strom, der durch die erste Leuchte bzw. die zweite Leuchte fließt, so zu steuern, dass jeder Strom abwechselnd auf einen minimalen Wert, der dem Pilotzustand entspricht, und auf einen Wert für einen Betriebszustand eingestellt wird, bei welchem ein erster bzw. ein zweiter Lichtstrahl erzeugt wird, wobei eine Leuchte in dem Pilotzustand ist, während die andere Leuchte in dem Betriebszustand ist,
(d) einer ersten Einrichtung zum Auswählen einer Wellenlänge des Lichts, die in dem Strahlengang des ersten Lichtstrahls angeordnet ist, um den ersten Lichtstrahl mit einer ersten Wellenlänge bereitzustellen,
(e) einer zweiten Einrichtung zum Auswählen einer Lichtwellenlänge, die in dem Strahlengang des zweiten Lichtstrahls angeordnet ist, um den zweiten Lichtstrahl mit einer zweiten Wellenlänge bereitzustellen, wobei die zweite Wellenlänge sich von der ersten Wellenlänge unterscheidet,
(f) einer Aufnahmeplattform für die Probe, die so angeordnet ist, dass der erste und der zweite Lichtstrahl die Probe so treffen, dass die lumineszente Verbindung eine Lumineszenzemission erzeugt, und
(g) einem Detektor, der angeordnet ist, um die Lumineszenzemission zu empfangen.

In bevorzugten Ausführungsformen kann die erfindungsgemäße Vorrichtung für Lumineszenzphotometrie ferner umfassen:

(h-1) einen dichroischen Spiegel, der in den Strahlengang jeweils des ersten und des zweiten Lichtstrahls (die jeweils eine erste und eine zweite Wellenlänge aufweisen) angeordnet ist, um den ersten und den zweiten Lichtstrahl zu einer Position auf der Aufnahmeplattform zu reflektieren, an der die Probe angeordnet ist;
(h-2) einen Strahlvereiniger;
(h-3) einen zweiten Detektor;

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung für die Lumineszenzemissionsphotometrie weist der Detektor (g) (und/oder der zweite Detektor (h-3)) eine elektronische Schaltvorrichtung auf, um die Empfindlichkeit des Detektors mindestens zwei Mal in einer Zeitdauer von ungefähr 2 ns bis 1 Minute einzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Detektor eine Kamera mit einem photoempfindlichen Element und einer Einrichtung zum Ändern der elektrischen Signale, die in dem photoempfindlichen Element erzeugt werden, etwa in Form des Detektors, wie er in der US-Anmeldung mit der Nr. 07/935 873, die am 26. August 1992 eingereicht und nunmehr erteilt ist, beschrieben ist. Eine konventionelle intensitätsverbesserte ladungsgekoppelte Einrichtung (CCD), die im Stand der Technik bekannt ist, ist zur Verwendung als Detektor geeignet. Eine bevorzugte Kamera, die das bevorzugte photoempfindliche Element und eine Einrichtung zum Ändern der elektrischen Signale aufweist, ist eine Kamera, wie sie in Verbindung mit dem „Attofluor" Digitalfluorenszenzmikroskopiesystem (eingetragenes Zeichen, Atto Instruments, Rockville, Maryland) erhältlich ist.
In der Ausführungsform mit einem zweiten Detektor erfasst der erste Detektor (Detektor (g)) eine Emission aus der Probe in Reaktion auf eine Anregung mittels des ersten Lichtstrahls. Der zweite Detektor erfasst eine Emission aus der Probe in Reaktion auf die Anregung mittels des zweiten Lichtstrahls.
Optional kann der Detektor mit einer ersten und einer zweiten Kamera versehen sein. Ein konventioneller Strahlteiler kann verwendet werden, um den reflektierten ausgesandten Strahl in Wellenlängenbereichskomponenten vor dem Auftreffen des Lichtstrahls auf Filter zu trennen, die aus einem oder mehreren geeigneten konventionellen Wellenlängen selektiven Materialien hergestellt sind, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Der Wellenlängenbereich des ausgesandten Strahls, der auf die Kamera 7 (a) mittels des Strahlteilers reflektiert wird, wird in Richtung des Filters 10 (a) mittels eines Prismas oder eines Spiegels 11 gelenkt. Das System mit zwei Kameras liefert den Vorteil, dass eine genaue gleichzeitige Überwachung der beiden unabhängigen Emissionsvorgänge möglicht ist. Jedoch besteht der Nachteil des Systems mit zwei Kameras darin, dass die Photosensoren exakt ausgerichtet sein müssen, um zuverlässige Ergebnisse zu erzeugen.
Beispiel 1
Kultivierte Astrozytoma-Zellen, die auf Glasträgern aufgewachsen wurden, werden mit 5 μm Fura-2 AM (einem fluroeszenten Farbstoff, der kommerziell von Molekular Probes, Junction City, Oregon, beziehbar ist) 20 Minuten lang in einer physiologischen Kochsalzlösung mit 5 mM Glyklose markiert. Die Zellen werden gewaschen, um das überschüssige Fura-2 AM aus dem Medium zu entfernen. Die Zellen werden dann auf der Halterung eines Zeiss Axiovert 135 Mikroskops angeordnet und werden mittels eines Zeiss Achrostigmat 40 mit Ölimmersionsobjektiv beobachtet. Die Zellen wurden mit einer Doppelanregungslichtquelle (mit einer ersten und einer zweiten Bogenentladung als Lichtquellen) angeregt (beleuchtet). Der entsprechende Strom für die Lichtquelle wird mittels eines Computers gesteuert, der durch die Steuereinrichtung 51 repräsentiert ist, die in dem schematischen Diagramm in 5 dargestellt ist. Die Strahlen werden unter Anwendung des Strahlvereinigers 84 (der von Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland hergestellt ist) kombiniert, wie in 8 gezeigt ist. Gemäß 5 sind die erste und die zweite Entladungsquelle 52 und 53 jeweils 100 Watt Quecksilberdampfentladungsquellen, der Interferenzfilter 54 ist ein 10 nm Bandpass (Bandbreitenfilter), der Licht mit einer mittleren Wellenlänge von 334 nm durchlässt, und der Interferenzfilter 55 ist ein 10 nm Bandbassfilter, der Licht mit einer mittleren Wellenlänge von 380 nm durchlässt. Eine dichroischer Spiegel, der das Anregungslicht von dem Emissionslicht separiert, indem Licht unter 395 nm reflektiert wird und indem Licht über dieser Wellenlänge durchgelassen wird, ist angeordnet, um den ersten und den zweiten Lichtstrahl, die von der Lichtquelle mit Doppelanregung erzeugt werden, sowie die Emission von der Probe aufzunehmen. Es sei beispielsweise auf 4 verwiesen, wobei der Anregungsstrahl, der von der Lichtquelle 41 (mit abwechselnd 334 nm und 380 nm Wellenlänge) den dichroischen Spiegel 43 trifft und auf die Zellenprobe 44 reflektiert wird. Fluoreszenzemissionen aus den Zellen, die mit dem Fura-2 (und/oder Fura 2AM) markiert sind, liegen im Bereich von 500 nm. Die Fluoreszenzemissionen laufen durch den dichroischen Spiegel 43 und werden zu der Kamera oder dem Photodetektor 46 reflektiert, nachdem das Licht durch einen 459 nm Langpassfilter gelaufen ist, der in dem Strahlengang zwischen dem dichroischen Spiegel und dem Photodetektor angeordnet ist. Das Ändern der Beleuchtung zwischen 334 und 380 nm bewirkt, dass die Zellen alternativ eine Fluoreszenz proportional zur Konzentration der Kalziumionen zu den Zellen emittieren.

Claims

Vorrichtung zum sequenziellen Bestrahlen einer Probe mit zwei oder mehr Wellenlängen, die umfasst: (A) eine erste Lichtbogenlampe (32, 82) zum Erzeugen eines ersten Lichtstrahls mit einer ersten Wellenlänge; (B) eine zweite Lichtbogenlampe (33, 83) zum Erzeugen eines zweiten Lichtstrahls mit einer zweiten Wellenlänge, die sich von der ersten Wellenlänge unterscheidet; (C) eine Steuereinrichtung (31, 81), die elektrisch mit der ersten und der zweiten Lichtbogenlampe verbunden und so eingerichtet ist, dass sie den elektrischen Strom zu der ersten und der zweiten Lichtbogenlampe so steuert, dass jeder der Ströme, die durch die erste bzw. durch die zweite Lampe fließen, abwechselnd auf einen Minimalwert eingestellt wird, der ausreicht, um den jeweiligen Lichtbogen aktiv zu halten, um so einen Pilotzustand zu definieren, und auf einen Pegel erhöht wird, bei dem er den ersten bzw. den zweiten Lichtstrahl erzeugt, um so einen Betriebszustand zu definieren, wobei sich eine Lampe in dem Pilotzustand befindet, während sich die andere in dem Betriebszustand befindet.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei wenigstens die erste oder die zweite Lichtbogenlampe eine Mehrfachlichtbogenlampe ist, die einen Pilotlichtbogen (92) und einen Betriebslichtbogen (91) umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei der durch die Mehrfachlichtbogenlampe erzeugte Lichtstrahl eine optische Achse hat und der Betriebslichtbogen auf die optische Achse ausgerichtet ist, während der Pilotlichtbogen nicht auf die optische Achse ausgerichtet ist.
Vorrichtung für Lumineszenz-Emissionsfotometrie, die eine Vorrichtung zum sequenziellen Bestrahlen einer Probe mit zwei oder mehr Wellenlängen nach Anspruch 1 umfasst, wobei die erste Lichtbogenlampe (32, 82) zum Erzeugen eines ersten Lichtstrahls eingerichtet ist, der ausreichend Energie hat, um wenigstens eine erste lumineszente Verbindung der Probe elektronisch zu erregen, die zweite Lichtbogenlampe (33, 83) zum Erzeugen eines zweiten Lichtstrahls eingerichtet ist, der ausreichend Energie hat, um wenigstens eine zweite lumineszente Verbindung in der Probe elektronisch zu erregen, wobei die Vorrichtung für Lumineszenz-Emissionsfotometrie des Weiteren umfasst: eine erste Wellenlängen-Auswähleinrichtung (34; 54), die auf dem Weg des ersten Lichtstrahls angeordnet ist, um dem ersten Lichtstrahl die erste Wellenlänge zu verleihen, eine zweite Wellenlängen-Auswähleinrichtung (35; 55), die auf dem Weg des zweiten Lichtstrahls angeordnet ist, um den zweiten Lichtstrahl die zweite Wellenlänge zu verleihen, eine Anbringungsplattform (44) für die Probe, die so angeordnet ist, dass der erste und der zweite Lichtstrahl auf die Probe auftreffen und jede lumineszente Verbindung eine lumineszente Emission erzeugt, und einen Detektor (46; 56), der so angeordnet ist, dass er die lumineszente Emission empfängt.
Vorrichtung für Lumineszenz-Emissionsfotometrie nach Anspruch 4, die des Weiteren einen dichroitischen Spiegel (43) umfasst, der auf dem Weg des ersten und des zweiten Lichtstrahls angeordnet ist, um den ersten und den zweiten Lichtstrahl an eine Position auf der Anbringungsplattform zu reflektieren.
Vorrichtung für Lumineszenz-Emissionsfotometrie nach Anspruch 5, wobei der Detektor (46) eine elektronische Schalteinrichtung zum wenigstens zweimaligen Regulieren der Empfindlichkeit eines Detektors innerhalb eines Zeitraums zwischen ungefähr 2 ns und 1 min aufweist.
Vorrichtung für Lumineszenz-Emissionsfotometrie nach Anspruch 5, die des Weiteren einen Strahlkombinierer (84) umfasst.
Vorrichtung für Lumineszenz-Emissionsfotometrie nach Anspruch 5, wobei der Detektor so eingerichtet ist, dass er eine Emission von der Probe in Reaktion auf eine Erregung durch den ersten Lichtstrahl erfasst, und die Vorrichtung des Weiteren einen zweiten Detektor (57) umfasst, der eine Emission von der Probe in Reaktion auf eine Erregung durch den zweiten Lichtstrahl erfasst.
Vorrichtung für Lumineszenz-Emissionsfotometrie nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die erste und die zweite Lichtbogenlampe eine Wattzahl zwischen 10 und 2000 W haben.