DE69534468T2

DE69534468T2 - Wachstums-differenzierungsfaktor-11

Info

Publication number: DE69534468T2
Application number: DE69534468T
Authority: DE
Inventors: Se-Jin Lee; Alexandra C. Mcpherron
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2015-07-08
Also published as: EP1574577A3; JPH10502811A; US5914234A; ES2251721T3; ATE305036T1; EP0776337B1; CA2194660A1; EP0776337A4; US20020150577A1; DK0776337T3; CA2194660C; DE69534468D1; EP0776337A1; EP1574577A2; WO1996001845A1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gegenstand der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Wachstumsfaktoren und im Speziellen auf ein neues Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktors Beta (TGF-β)-Superfamilie, das als Wachstumsdifferenzierungsfaktor 11 (GDF-11) bezeichnet wird.
2. Beschreibung verwandter Gebiete
Die transformierende Wachstumsfaktor-β-Superfamilie (TGF-β) umfasst eine Gruppe strukturell verwandter Proteine, die während der embryonalen Entwicklung einen weiten Bereich von Differenzierungsprozessen beeinflussen. Zu der Familie gehört die Müller-inhibierende Substanz (MIS), die für die normale männliche Geschlechtsentwicklung erforderlich ist (Behringer, et. al., Nature 345: 167, 1990), das Drosophila Decapentaplegic Genprodukt, das für die dorsal-ventrale Achsenbildung und die Morphogenese der Bildscheiben erforderlich ist (Padgett, et al., Nature, 325: 81–84, 1987), das Xenophus-VG-1 Genprodukt, das an den vegetativen Pol von Eiern lokalisiert ist (Weeks, et. al., Cell, 51: 861–867, 1987), die Aktivine (Mason, et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 135: 957–964, 1986), die die Bildung von Mesoderm und anteriore Strukturen in Xenopus-Embryonen induzieren können (Thomsen, et. al., Cell, 63: 485, 1990) sowie knochenmorphogenetische Proteine (BMPs, Osteogenin, OP-1), die die Neubildung von Knorpel- und Knochengewebe induzieren kann (Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265 13198, 1990). Die TGF-β-Familie kann eine Vielzahl von Differenzierungsprozessen beeinflussen, einschließlich Lipogenese, Myogenese, Chondrogenese, Hämatopoese, ephiteliale Zelldifferenzierung (für Review siehe Massague, Cell, 49: 437, 1987).
Die Proteine der TGF-β-Familie werden anfänglich als ein großes Vorläufer-Protein synthetisiert, das anschließend einer proteolytischen Spaltung an einer Gruppe von basischen Resten ungefähr 110 bis 140 Aminosäuren vom C-Terminus, unterzogen wird.
Die C-Terminus-Bereiche, oder reife Bereiche, der Proteine sind alle strukturell verwandt, und die verschiedenen Familienmitglieder können nach dem Maß ihrer Homologie in bestimmte Untergruppen eingeteilt werden. Obwohl die Homologien innerhalb einer speziellen Untergruppe zwischen 70 und 90%iger Übereinstimmung der Aminosäuresequenzidentität liegen, sind die Homologien zwischen den Untergruppen signifikant niedriger und liegen generell bei nur 20 bis 50%. In jedem Fall scheinen die aktiven Spezies ein Dimer der C-Terminus-Fragmente mit Disulfidbindung zu sein. Studien haben gezeigt, dass, wenn der Pro-Bereich eines Mitgliedes der TGF-β-Familie gleichzeitig mit dem reifen Bereich eines anderen Mitgliedes der TGF-β-Familie koexprimiert wird, intrazelluläre Dimerisation und Sekretion von biologisch aktivem Homodimer auftritt (Gray, A. und Maston, A., Science, 247: 1328, 1990). Zusätzliche Studien von Hammonds et. al., (Molec Endocrin, 5: 149, 1991) haben gezeigt, dass die Verwendung des Pro-Bereichs des BPM-2 kombiniert mit dem reifen Bereich des BPM-4 zu einer deutlich verbesserten Expression des reifen BMP-4 geführt hat. Bei den meisten der untersuchten Familienmitglieder wurde festgestellt, dass die homodimeren Spezies biologisch aktiv sind, während bei anderen Familienmitgliedern wie den Inhibinen (Ling., et. al., Nature, 321: 779, 1986) und den TGF-β (Cheifetz, et. al., Cell, 48: 409, 1987) Heterodimere festgestellt wurden, die andere biologische Eigenschaften aufzuweisen scheinen als die entsprechenden Homodimere.
Andere Mitglieder der TGF-β-Superfamilie sind bekannt aus WO 94/26892, das ein als BMP-II bezeichnetes Protein offenbart, aus WO 92/00382, das ein als GDF-1 bezeichnetes Protein offenbart, aus WO 94/ 21681, das ein als GDF-8 bezeichnetes Protein bekannt macht und aus McPherron and Lee, 1993, Journal of Biochemistry, 268(5): 3444–3449, das ein als GDF-3 und GDF-9 bezeichnetes Protein bekannt macht. WO 94/26892 und WO 94/21681 wurden zwischen dem Prioritäts- und Veröffentlichungsdaten der vorliegenden Anwendung veröffentlicht.
Die Identifizierung neuer Faktoren, die in ihren Expressionsmustern gewebsspezifisch sind, werden ein besseres Verständnis der Entwicklung und Funktion dieses Gewebes ermöglichen.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt schafft die gegenwärtige Erfindung ein isoliertes oder rekombinantes Polynukleotid, das ein Zellwachstumsdifferenzierungsfaktor-11-(GDF-11)-Polypeptid kodiert, wobei das Polynukleotid aufweist:

(a) die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei T auch U sein kann
(b) die Nukleotide 1 bis 135 von SEQ ID Nr. 1, wobei T auch U sein kann, oder
(c) eine Nukleotidsequenz, die das Polypeptid von SEQ ID Nr. 2 kodiert

In einem zweiten Aspekt schafft die Erfindung einen Expressionsvektor einschließlich des Polynukleotids des ersten oder zweiten Aspekts.
In einem dritten Aspekt schafft die Erfindung eine mit dem Vektor des dritten Aspekts stabil transformierte Wirtszelle.
In einem vierten Aspekt schafft die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung des GDF-11-Polypeptids, das die Kultivierung der Wirtszelle des vierten Aspekts unter geeigneten Bedingungen und die Rückgewinnung des exprimierten Polypeptids aufweist.
In einem fünften Aspekt schafft die Erfindung ein GDF-11-Polypeptid, das durch ein Polynukleotid des ersten oder zweiten Aspekts kodiert oder durch das Verfahren des fünften Aspekts hergestellt wird.
In einem sechsten Aspekt schafft die Erfindung Antikörper, die sich selektiv an die Polypeptide des sechsten Aspekts oder an Antigen bindende Fragmente davon binden.
In einem siebten Aspekt schafft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polynukleotid des ersten oder zweiten Aspekts, einen Vektor des dritten Aspekts, ein Polypeptid des sechsten Aspekts und/oder einen Antikörper des siebenten Aspekts und optional eine pharmazeutisch akzeptable Trägersubstanz aufweist.
In einem achten Aspekt schafft die Erfindung eine diagnostische Zusammenstellung, die ein Polynukleotid des ersten oder zweiten Aspekts, einen Vektor des dritten Aspekts, ein Polypeptid des sechsten Aspekts und/oder einen Antikörper des siebenten Aspekts und optional ein geeignetes Nachweismittel aufweist.
In einem neunten Aspekt schafft die Erfindung ein In-vitro-Verfahren zum Nachweis einer mit der Expression von GDF-11 in Verbindung stehenden Muskelzellproliferationsstörung, das die Kontaktierung eines Antikörpers des siebten Aspekts mit einer Probe eines Untersuchungsobjekts, das im Verdacht steht, eine mit GDF-11 in Verbindung stehende Funktionsstörung zu haben, sowie den Nachweis der Bindung des Antikörpers umfasst.
In einem zehnten Aspekt schafft die Erfindung die Verwendung eines Antikörpers des siebten Aspekts für die Bereitung einer diagnostischen Zusammenstellung zum Nachweis einer Muskelzellproliferationsstörung, die in Verbindung mit der Expression von GDF-11 steht
In einem elften Aspekt schafft die Erfindung die Verwendung eines Antikörpers des siebten Aspekts oder eines Polynukleotids des ersten oder zweiten Aspekts, der bzw. das die GDF-11- Aktivität unterdrückt, zur Bereitung einer pharmazeutischen Zusammenstellung zur Behandlung einer Muskelzellproliferationsstörung, die mit der Expression von GDF-11 in Verbindung steht.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Nukleotid und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen des murinen GDF-11 (1) und vom Menschen (2). Die mutmaßlichen proteolytischen Verarbeitungsstellen sind durch die schattierten Kästchen dargestellt. In der Humansequenz wird das potentielle N-gebundene Glykolysierungssignal durch das offene Kästchen dargestellt, das Konsens-Polyadenylierungssignal ist unterstrichen, der Poly-A-Anhang ist nicht gezeigt.
2 zeigt Northern Blots von RNA aus dem Gewebe von Erwachsenen (2a) oder fötalem und neonatalem Gewebe (2b), das mit einer murinen GDF-11-Sonde untersucht wurde.
3 zeigt Aminosäure-homologien zwischen verschiedenen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie. Die Nummern stellen die prozentuale Aminosäure-Identitäten zwischen jedem Paar dar, berechnet vom ersten konservierten Cystein bis zum C-Terminus. Die Kästchen stellen Homologien zwischen den hochgradig verwandten Mitgliedern innerhalb bestimmter Untergruppen dar.
4 zeigt eine Anordnung der vorhergesagten Aminosäuresequenzen des menschlichen GDF-11 (oberste Reihen) mit dem menschlichen GDF-8 (untere Reihen). Die vertikale Linien zeigen Übereinstimmungen an. Die Punkte stellen Lücken dar, die eingefügt wurden, um die Anordnung zu maximieren. Die Nummern bezeichnen die Aminosäurepositionen in Bezug auf den N-Terminus. Die mutmaßlichen proteolytischen Verarbeitungsstellen werden durch die offenen Kästchen dargestellt. Die konservierten Cystein-Reste im C-Terminus-Bereich werden durch die schattierten Kästchen dargestellt.
5 zeigt die Expression von GDF-11 in Säugetierzellen. Das aufbereitete Medium aus Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, die mit einem, in einen MSXND-Expressionsvektor entweder in Gegensinn-Orientierung (Bahn 1) oder in Sinn-Richtung (Bahn 2) geklonten, hybriden GDF-8/GDF-11-Gen (siehe Text) transfektiert wurden, wurde dialysiert, lypophylisiert und einer Western-Analyse unterzogen, bei der Antikörper, die gegen den C-Terminus-Teil des GDF-8-Proteins gerichtet wurden, verwendet wurden. Die Pfeile rechts geben die mutmaßlichen unverarbeiteten (Pro-GDF-8/GDF-11) oder verarbeiteten GDF-11-Proteine an. Die Nummerierungen links geben die Mobilitäten der Molekulargewichtsstandards an.
6 zeigt die Chromosomkartierung des menschlichen GDF-11. Von somatischen Zelllinien von Menschen/Nagetieren bereitete DNA-Proben wurden einer Polymerase-Kettenreaktion unterzogen, auf Agarose-Gel elektrophoresiert, geblottet und untersucht. Das in jeder der hybriden Zelllinien enthaltene menschliche Chromosom wurde im oberen Bereich der ersten 24 Bahnen (1–22, X und Y) identifiziert. In den mit CHO-, M- und H bezeichneten Bahnen war die Ausgangs-DNA-Matrize jeweils von Hamster, Maus bzw. von humanen Quellen stammende gesamte genomische DNA. In der als B1 gekennzeichneten Bahn wurden keine DNA-Matrizen verwendet. Die Zahlen links geben die Mobilitäten der DNA-Standards an.
7 zeigt die FISH-Lokalisierung des GDF-11. Von peripheren Blutlymphozyten abgeleitete Metaphase-Chromosomen wurden mit einer Digoxigenin-markierten menschlichen GDF-11-Sonde (a) oder einer Mischung aus humanem GDF-11-Genom und spezifischem Chromosom 12-Zentromer-Sonden (b) hybridisiert, und wie im Text beschrieben analysiert. Eine schematische Darstellung der Lage von GDF-11 in Position 12g13 ist im Feld (c) gezeigt.
8 zeigt das Nukleotid und die deduzierte Aminosäurensequenz von murinem GDF-8.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schafft einen Wachstums- und Differenzierungsfaktor GDF-11 und eine Polynukleotidsequenz zur Kodierung des GDF-11. Der GDF-11 wird in höchsten Konzentrationen in Muskeln, Gehirn, Uterus, Milz und Thymus und in geringeren Konzentrationen in anderen Geweben exprimiert. Eine zellproliferative oder immunologische Störung muskulären Ursprungs, die mit einer GDF-11-Expression oder -Funktion in Verbindung steht, kann festgestellt werden. Eine zellproliferative und immunologische Störung kann durch Verwendung eines Mittels, welches die GDF-11-Aktivität unterdrückt oder verstärkt, behandelt werden.
Die TGF-β-Superfamilie besteht aus multifunktionalen Polypeptiden, welche die Proliferation, Differenzierung und andere Funktionen in vielen Zellarten kontrollieren. Viele der Peptide üben eine sowohl positiv als auch negativ regulierende Wirkung auf andere Peptidwachstumsfaktoren aus. Die strukturelle Homologie zwischen dem GDF-11-Protein der vorliegenden Erfindung und den Mitgliedern der TGF-β-Familie zeigt, dass GDF-11 ein neues Mitglied der Familie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren ist. Basierend auf den bekannten Aktivitäten vieler anderer Mitglieder kann erwartet werden, dass auch GDF-11 biologische Aktivitäten besitzt, die ihn als ein diagnostisches und therapeutisches Reagens nützlich machen.
Bestimmte Mitglieder dieser Superfamilie haben Expressionsmuster oder besitzen Aktivitäten, die sich auf die Funktion des Nervensystems beziehen. Beispielsweise wurde bei einem Mitglied, nämlich GDNF, nachgewiesen, ein potenter neurotropher Faktor zu sein, der das Überleben dopaminerger Neuronen fördern kann (Lin, et al, Science, 260: 1130). Ein weiteres Familien-Mitglied, nämlich Dorsalin-1, ist in der Lage, die Differenzierung neuraler Kammzellen zu befördern (Basler, et al, Cell, 73: 687, 1993). Es wurde gezeigt, dass die Inhibine und Aktivine im Gehirn exprimiert werden (Meunier, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 85: 247, 1988; Sawchenko, et al., Nature, 334: 615, 1988), und es wurde gezeigt, dass Aktivin in der Lage ist, als Nervenzellen-Überlebensmolekül zu funktionieren (Schubert, et al., Nature, 344: 868, 1990). Ein weiteres Familien-Mitglied, nämlich GDF-1, ist in seinem Expressionsmuster spezifisch für das Nervensystem (Lee, Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 88: 4250, 1991) und bestimmte andere Mitglieder, wie Vgr-1 (Lyons, et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 86: 4554, 1989; Jones, et al., Development, 111: 581, 1991), OP-1 (Ozkaynak, et al., J. Biol. Chem., 267: 25220, 1992) und BMP-4 (Jones, et al., Development, 111: 531, 1991) sind ebenfalls dafür bekannt, dass sie im Nervensystem exprimiert werden. Die Expression von GDF-11 im Gehirn und Muskel lässt vermuten, dass auch GDF-11 über Aktivitäten verfügt, die mit der Funktion des Nervensystems in Zusammenhang stehen. Insbesondere ist beispielsweise bekannt, dass der Skelettmuskel einen Faktor oder Faktoren erzeugt, die das Überleben von Motorneuronen fördern (Brown, Trends Neurosci., 7: 10, 1984). Die bekannten neurotrophen Aktivitäten anderer Mitglieder dieser Familie und die Expression von GDF-11 im Muskel lassen vermuten, dass eine Aktivität von GDF-11 als ein trophischer Faktor für Motorneuronen fungiert; tatsächlich ist GDF-11 eng mit GDF-8 verwandt, das in seinem Expressionsmuster praktisch muskelspezifisch ist. Alternativ könnte GDF-11 neurotrophe Aktivitäten für andere neuronale Populationen haben. Daher könnte es für GDF-11 in vitro und in vivo Anwendungen in der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, wie amyotropher Lateralsklerose, oder bei der Bewahrung von Zell- oder Gewebekulturen prior zu Transplantationen geben.
GDF-11 könnte ebenfalls bei der Behandlung von Krankheitsprozessen mit Muskelbeteiligung zur Anwendung kommen, wie beispielsweise bei muskeldegenerativen Erkrankungen oder bei Gewebereparatur aufgrund eines Traumas. In dieser Hinsicht sind viele andere Mitglieder der TGF-β-Familie auch wichtige Vermittler bei der Gewebereparatur. Es wurde nachgewiesen, dass TGF-β einen deutlichen Einfluss auf die Bildung von Kollagen hat und eine erstaunliche angiogene Reaktion bei der neugeborenen Maus bewirkt (Roberts, et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 83: 4167, 1986). Ebenfalls konnte nachgewiesen werden, dass TGF-β die Differenzierung von Myoblasten in Kultur hemmt (Massague, et al., Proc. Natl Acad. Sci., USA, 83: 8206, 1986). Da überdies Myoblastzellen in der Gentherapie als Transportmittel zur Abgabe von Genen an Muskeln verwenden werden können, könnten die Eigenschaften des GDF-11 ausgenutzt werden, um Zellen prior zu Transplantation am Leben zu erhalten oder um die Effizienz des Fusionsprozesses zu verbessern.
GDF-11 könnte auch Anwendung in der Behandlung von Immunstörungen finden. Insbesondere konnte nachgewiesen werden, dass TGF-β über ein breites Spektrum an immunregulierenden Aktivitäten verfügt, einschließlich einer wirksamen unterdrückenden Wirkung auf die Proliferation und Funktion von B- und T-Zellen (für Review siehe Palladino, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 593: 181, 1990). Die Expression von GDF-11 in Milz und Thymus lässt vermuten, dass GDF-11 über ähnliche Aktivitäten verfügt und daher als ein entzündungshemmendes Agens oder als eine Behandlung von Störungen, die mit einer anormalen Proliferation oder Funktion von Lymphozyten in Zusammenhang stehen, verwendet werden können.
Der hier verwendete Ausdruck "im Wesentlichen rein" bezieht sich auf GDF-11, das im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlehydraten oder anderen Materialien ist, mit denen es naturgemäß verbunden ist. Fachleute können GDF-11 mit Hilfe von Standardverfahren zur Proteinreinigung reinigen. Im Wesentlichen reine Polypeptide werden eine einzige Hauptbande auf einem nicht reduzierenden Polyacrylamid-Gel ergeben. Die Reinheit vom GDF-11-Polypeptid lässt sich auch mittels aminoterminaler Aminosäuresequenzanalyse bestimmen. GDF-11-Polypeptid enthält auch funktionelle Fragmente des Polypeptids, solange die Aktivität von GDF-11 erhalten bleibt. Kleinere Peptide können die biologische Aktivität von GDF-11 enthalten.
Die Erfindung schafft Polynukleotide, die das GDF-11-Protein kodieren. Diese Polynukleotide enthalten DNA, cDNA und RNA Sequenzen, die GDF-11 kodieren. Es wird verstanden, dass alle Polynukleotide, die alle GDF-11 kodieren, ebenfalls hierin enthalten sind, solange sie ein Polypeptid mit GDF-11-Aktivität kodieren. Solche Polynukleotide beinhalten natürlich vorkommende, synthetische und absichtlich manipulierte Polynukleotide. GDF-11-Polynukleotide beispielsweise lassen sich einer ortsgerichteten Mutagenese unterziehen. Die polynukleotide Sequenz von GDF-11 beinhaltet auch Gegensinn-Sequenzen. Die Polynukleotide der Erfindung beinhalten Sequenzen, die infolge des genetischen Codes degeneriert sind. Es existieren 20 natürliche Aminosäuren, von denen die meisten durch mehr als ein Kodon definiert sind. Aus diesem Grund werden alle degenerierten Nukleotidsequenzen in die Erfindung einbezogen, solange die durch die Nukleotidsequenz kodierte Aminosäuresequenz des GDF-11-Polypeptids in ihrer Funktion unverändert ist.
Speziell offengelegt wird hierin eine DNA-Sequenz, die das humane GDF-11-Gen enthält. Die Sequenz enthält einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid über eine Länge von 407 Aminosäuren kodiert. Die Sequenz enthält eine mutmaßliche proteolytische RXXR-Spaltungsstelle bei den Aminosäuren 295–298. Eine Spaltung des Präkursors an dieser Stelle würde ein aktives C-terminales Fragment mit einer Länge von 109 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ca. 12.500 kD erzeugen. Die menschliche GDF-11-Nukleotidsequenz ist vorzugsweise SEQ ID Nr: 1. Außerdem wird hierin eine partielle murine genomische Sequenz offenbar. (siehe SEQ ID Nr: 3).
Das Polynukleotid, welches GDF-11 kodiert, schließt SEQ ID Nr.: 1 sowie zu SEQ ID Nr.: 1 komplementäre Nukleinsäuresequenzen ein. Eine komplementäre Sequenz kann ein Gegensinn-Nukleotid beinhalten. Wenn die Sequenz RNA ist, werden die Deoxynukleotide A, G, C und T von SEQ ID Nr.: 1 durch die Ribonukleotide A, G, C bzw. U ersetzt. Fragmente der oben beschrieben Nukleinsäuresequenzen, die mindestens 15 Basen lang sind, genügen, um das Fragment selektiv zur DNA, die das Protein von SEQ ID Nr.: 2 kodiert unter physiologischen Bedingungen zu hybridisieren.
Der C-terminale Bereich von GDF-11, der der mutmaßlichen proteolytischen Verarbeitungsstelle folgt, zeigt eine signifikante Homologie zu den bekannten Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie. Die GDF-11-Sequenz enthält die meisten der Reste, die in anderen Familienmitgliedern in hohem Maße konserviert sind (siehe 1). Wie die TGF-βs und die Inhibin βs enthalten auch die GDF-11 ein zusätzliches Paar Cysteinreste in Ergänzung zu den sieben Cysteinen, die in praktisch allen anderen Familienmitgliedern gefunden wurden. Unter den bekannten Familienmitgliedern ist GDF-11 zu GDF-8 am meisten homolog (92% Sequenzidentität)(siehe 3).
Geringfügige Modifikationen der rekombinanten primären GDF-11-Aminosäuresequenz können zur Entstehung von Proteinen führen, die verglichen mit dem hierin beschriebenen GDF-11-Polypeptid im Wesentlichen äquivalente Aktivitäten aufweisen. Derartige Modifikationen können beabsichtigt, wie beispielsweise durch ortsgerichtete Mutagenese, oder spontan sein.
Alle Polypeptide, die durch diese Modifikationen entstehen, werden hierin eingeschlossen, solange die biologische Aktivität von GDF-11 noch besteht. Weiterhin kann auch das Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren zu einer Modifikation der Struktur des resultierenden Moleküls führen, ohne dass dabei seine biologische Aktivität signifikant geändert wird. Dies kann zur Entwicklung eines kleineren aktiven Moleküls führen, das einen breiteren Nutzen haben würde. So können beispielsweise amino- oder carboxyterminale Aminosäuren, die nicht für die biologische Aktivität von GDF-11 erforderlich sind, entfernt werden.
Die Nukleotidsequenz, die das GDF-11-Polypeptid der Erfindung kodiert, schließt die offengelegte Sequenz und konservative Variationen davon ein. Die hierin gebrauchte Bezeichnung "konservative Variation" bezeichnet die Substitution eines Aminosäurerests durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele für konservative Variationen schließen die Substitution eines hydrophoben Rests wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin gegeneinander oder die Substitution eines polaren Rests durch einen anderen, wie die Substitution von Anginin durch Lysin, Glutamin- durch Asparaginsäure oder Glutamin durch Asparagin und dergleichen. Die Bezeichnung "konservative Variation" beinhaltet auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer unsubstituierten parentalen Aminosäure, vorausgesetzt, dass Antikörper, die zu den substituierten Polypeptide gezüchtet wurden, ebenfalls mit den unsubstituierten Polypeptiden immunreagieren.
DNA-Sequenzen der Erfindung können durch mehrere Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel lässt sich die DNA mit Hilfe von Hybridisierungsverfahren isolieren, die in Fachkreisen gut bekannt sind. Zu diesen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein: 1) Hybridisierung von genomischen oder cDNA-Bibliotheken mit Sonden zur Detektion homologer Nukleotidsequenzen, 2) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) an genomischer DNA oder cDNA unter Verwendung von Primern, die in der Lage sind, sich an die interessierende DNA-Sequenz anzulagern, und 3) Antikörper-Durchsuchung von Expressionsbibliotheken, um geklonte DNA-Fragmente mit gemeinsamen strukturellen Merkmalen zu detektieren.
Das GDF-11-Polynukleotid der Erfindung wird vorzugsweise von einem Säugetierorganismus gewonnen, am bevorzugtesten von einer Maus, einer Ratte oder einem Menschen. Screening-Verfahren, die auf Nukleinsäurehybridisierung beruhen, ermöglichen es, eine beliebige Gensequenz eines beliebigen Organismus zu isolieren, vorausgesetzt, dass die entsprechende Sonde verfügbar ist.
Oligonukleotidsonden, die einem Teil der Sequenz entsprechen, die das betreffende Protein kodiert, lassen sich chemisch synthetisieren. Dazu müssen kurze Oligopeptid-Abschnitte der Aminosäuresequenz bekannt sein. Die DNA-Sequenz, die das Protein kodiert, lässt sich aus dem genetischen Code ableiten, wobei die Degeneration des Codes jedoch berücksichtigt werden muss. Es ist möglich, eine gemischte Additionsreaktion durchzuführen, wenn die Sequenz degeneriert ist. Dies schließt ein heterogenes Gemisch denaturierter Doppelstrang-DNA ein. Für ein solches Screening ist die Hybridisierung vorzugsweise entweder an einer Einzelstrang-DNA oder einer denaturierten Doppelstrang-DNA durchzuführen. Die Hybridisierung erweist sich als besonders nützlich bei der Ermittlung von cDNA-Klonen, die von Quellen abgeleitet sind, wel che eine äußerst niedrige Menge an mRNA Sequenzen, in Bezug auf das betreffende Polypeptid, aufweisen. Anders gesagt, durch die Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen, um unspezifische Bindungen zu vermeiden, ist es, zum Beispiel, möglich, die autoradiographische Visualisierung eines spezifischen cDNA-Klons durch die Hybridisierung der Ziel-DNA an diese Einzelsonde in der Mischung, die ihr vollständiges Komplement ist, zuzulassen (Wallace, et al., Nuc. Acid Res., 9: 879, 1981; Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989).
Die Entwicklung spezifischer DNA-Sequenzen, die GDF-11 kodieren, kann außerdem erhalten werden durch: 1) Isolierung von Doppelstrang-DNA-Sequenzen aus der genomischen DNA; 2) chemische Herstellung einer DNA-Sequenz zur Schaffung der erforderlichen Kodons für das betreffende Polypeptid und 3) In-vitro-Synthese einer Doppelstrang-DNA-Sequenz durch umgekehrte Transkription einer, aus einer eukaryotischen Spenderzelle isolierten, mRNA. Im letzteren Fall wird schließlich eine zur mRNA komplementäre Doppelstrang-DNA gebildet, die allgemein als cDNA bezeichnet wird.
Von den drei oben genannten Verfahren zur Entwicklung bestimmter DNA-Sequenzen zur Verwendung in rekombinanten Verfahren ist die Isolierung genomischer DNA-Isolate am wenigsten gebräuchlich. Dies trifft besonders zu, wenn es wünschenswert ist, die mikrobielle Expression von Säugetier-Polypeptiden wegen des Vorhandenseins von Intronen zu erlangen.
Die Synthese von DNA-Sequenzen ist oft das bevorzugte Verfahren, wenn die gesamte Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptidprodukts bekannt ist. Ist die gesamte Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptids nicht bekannt, so ist die direkte Synthese von DNA-Sequenzen nicht möglich, und das bevorzugte Verfahren ist die Synthese von cDNA Sequenzen. Zu den Standardverfahren zur Isolierung der interessierenden cDNA-Sequenzen zählt auch die Bildung von Plasmid- oder Phagen-tragenden cDNA-Bibliotheken, die von reverser Transkription von mRNA abgeleitet sind, die in Spenderzellen mit hohem genetischem Expressionsniveau reichlich vorhanden ist. In Kombination mit der Polymerase-Kettenreaktion lassen sich mit diesem Verfahren auch seltene Expressionsprodukte klonen. In diesen Fällen, wo signifikante Teile der Aminosäuresequenz des Polypeptids bekannt sind, kann die Erzeugung von markierten Einzel- oder Doppelstrang-DNA- oder RNA-Sondensequenzen, die mutmaßliche in der Ziel-DNA vorhandene Sequenz duplizieren, in DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren angewendet werden, die an geklonten, zu Einzelstrang-Formen denaturierten Kopien der cDNA durchgeführt werden. (Jay. et al., Nucl. Acid Res., 11: 2325, 1983).
Eine cDNA-Expressionsbibliothek, wie zum Beispiel Lambda gt11, kann unter Verwen dung von Antikörpern, die für GDF-11 spezifisch sind, indirekt auf GDF-11-Peptide, die mindestens ein Epitop besitzen, gescreent werden. Solche Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal abgeleitet sein und zum Nachweisen eines Expressionsprodukts, das das Vorhandensein von GDF-11 cDNA anzeigt, verwendet werden.
DNA-Sequenzen, die GDF-11 kodieren, lassen sich in vitro durch DNA-Transfer in eine geeignete Wirtszelle exprimieren. "Wirtszellen" sind Zellen, in denen ein Vektor vermehrt und dessen DNA exprimiert werden kann. Der Begriff umfasst auch alle Nachkommenschaft der betreffenden Wirtszelle. Es wird davon ausgegangen, dass nicht alle Nachkommen identisch mit der Elternzelle sein können, da es während der Replikation zu Mutationen kommen kann. Dennoch wird in den Begriff „Wirtszelle" auch eine solche Nachkommenschaft eingeschlossen. Verfahren zum stabilen Transfer in dem Sinne, dass die fremde DNA dauerhaft in der Wirtszelle erhalten bleibt, sind in Fachkreisen bekannt.
In der vorliegenden Erfindung kann die GDF-11-Polynukleotidsequenz in einen rekombinanten Expressionsvektor eingefügt werden Der Begriff „rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Plasmid, einen Virus oder eine andere, in Fachkreisen bekannte Trägersubstanz, die mittels Einfügung oder Integration der GDF-11-Gensequenzen manipuliert wurde. Solche Expressionsvektoren enthalten eine Promotersequenz, welche die effiziente Transkription der eingefügten genetischen Sequenz des Wirts erleichtert. Der Expressionsvektor besitzt üblicherweise einen Replikationsursprung, einen Promoter sowie bestimmte Gene, die die phänotypische Selektion der transformierten Zellen ermöglichen. Zu den Vektoren, die für den Gebrauch in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der T7-basierte Expressionsvektor zur Expression in Bakterien (Rosenberg, et al., Gene, 56: 125, 1987), der pMSXND-Expressionsvektor zur Expression in Säugetierzellen (Lee und Nathans, J. Biol. Chem., 263: 3521, 1988) und vom Baculovirus abgeleitete Vektoren zur Expression in Insektenzellen. Das DNA-Segment kann in einem Vektor vorhanden sein, der operabel mit den Regulationselementen, zum Beispiel einem Promoter, verbunden ist (d.h. T7, Metallothionein I oder Polyhedrin Promoter).
Polynukleotide Sequenzen, die GDF-11 kodieren, können entweder in Prokaryoten oder in Eukaryoten exprimiert werden. Wirte können mikrobielle, Hefe-, Insekten- und Säugetierorganismen bereithalten. Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen, die eukaryotische oder virale Sequenzen in Prokaryoten aufweisen, sind in Fachkreisen gut bekannt. Biologisch funktionelle virale und plasmidische DNA-Vektoren, die zur Expression und Replikation in einem Wirt fähig sind, sind in Fachkreisen bekannt. Solche Vektoren werden verwendet, um DNA-Sequenzen der Erfindung zu inkorporieren. Der reife C-terminale Bereich des GDF-11 wird am besten von einem DNA-Klon exprimiert, der die gesamte Codierungsequenz des GDF-11 enthält. Alternativ lässt sich der C-terminale Bereich des GDF-11 als ein Fusionsprotein mit der Proregion eines anderen Mitglieds der TGF-β-Familie exprimieren oder mit einer anderen Proregion coexprimieren (siehe z.B.: Hammonds, et al., Molec. Endocrin. 5: 149, 1991; Gray, A., und Mason, A., Science, 247: 1328, 1990).
Die Transformation einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA lässt sich mittels konventioneller Verfahren durchführen, wie sie in Fachkreisen gut bekannt sind. Ist der Wirt prokaryotisch, wie z.B. E. coli, lassen sich kompetente Zellen, die in der Lage sind, DNA aufzunehmen, aus Zellen bilden, die nach der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und im Anschluß mittels CaCl₂-Verfahren, das in Fachkreisen gut bekannt ist, behandelt werden. Alternativ können MgCl₂ oder RbCl angewandt werden. Falls gewünscht, kann die Transformation auch nach der Bildung eines Protoplasten von der Wirtszelle vorgenommen werden.
Ist der Wirt ein Eukaryot, können Verfahren zur DNA-Transfektion, wie Kalziumphosphat Co-Präzipitationen, konventionelle mechanische Verfahren, wie Mikroinjektion, Elektroporation, Einfügung eines in Liposome eingeschlossenen Plasmids oder Virusvektoren verwendet werden. Eukaryotische Zellen lassen sich auch mit DNA-Sequenzen, die GDF-11 der Erfindung kodieren, und einem zweiten, fremden DNA-Molekül, das einen selektierbaren Phänotyp, wie z.B. das Herpes-Simplex-Virus-Thymidin-Kinase-Gen kodiert, co-transformieren. Als weiteres Verfahren kann ein eukaryotischer Virusvektor, wie z.B. das Simian-Virus 40 (SV40) oder das Bovine Papilloma-Virus verwendet werden, um vorübergehend eukaryotische Zellen zu infizieren oder zu transformieren und um das Protein zu exprimieren (siehe z.B.: Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman Hrsg., 1982).
Die Isolierung und Reinigung durch die Erfindung geschaffener mikrobiell exprimierter Polypeptide oder Fragmente davon, können mit konventionellen Mitteln einschließlich präparativer Chromatografie und immunologischer Separation unter Einbeziehung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper vorge-nommen werden.
Die GDF-11-Polypeptide der Erfindung können auch verwendet werden, um Antikörper zu produzieren, die immunoreaktiv sind oder an Epitope der GDF-11-Polypeptide binden. Antikörper, die im Wesentlichen aus vereinigten monoklonalen Antikörpern mit verschiedenen epitopischen Spezifitäten bestehen, sowie deutlich monoklonale Antikörperpräparate werden geschaffen. Monoklonale Antikörper werden mittels in Fachkreisen gut bekannter Verfahren aus Antigen, das Fragmente des Proteins enthält, erhalten (Köhler, et al., Nature, 256: 495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Hrsg., 1989).
Der in dieser Erfindung verwendete Begriff "Antikörper" schließt intakte Moleküle sowie Fragmente davon, wie z.B. Fab, F(ab')₂ und Fv ein, die in der Lage sind, die epitopische Determinante zu binden. Solche Antikörperfragmente bewahren die Fähigkeit, sich selektiv an ihr Antigen oder ihren Rezeptor zu binden und sind wie folgt definiert:

(1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes, antigenbindendes Fragment eines Antikörpermoleküls enthält, lässt sich durch Verdauung des ganzen Antikörpers mit dem Enzyms Papain bilden und ergibt eine intakte leichte Kette sowie eine Portion einer schweren Kette.
(2) Fab' – Das Fragment eines Antikörpermoleküls kann durch Behandlung des ganzen Antikörpers mit Pepsin behandelt mit anschließender Reduktion erhalten werden. Es wird eine leichte Kette sowie eine Portion einer schweren Kette gewonnen; pro Antikörpermolekül lassen sich zwei Fab'-Fragmente gewinnen.
(3) (Fab')₂ – Das Fragment des Antikörpers lässt sich durch Behandlung des ganzen Antikörper mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion gewinnen; (Fab')₂ ist ein Dimer von zwei Fab'-Fragmenten, die von zwei Disulfidbindungen zusammengehalten werden.
(4) Fv ist als ein genmanipuliertes Fragment definiert, das die variable Region der leichten Kette und die variable Region der schweren Kette, exprimiert als zwei Ketten, enthält.
(5) Einkettiger Antikörper („SCA"), definiert als ein genmanipuliertes Molekül, das die variable Region der leichten Kette und die variable Region der schweren Kette enthält, verbunden durch einen geeigneten Polypeptidverbinder als ein genetisch verschmolzenes einkettiges Molekül.

Verfahren zur Schaffung dieser Fragmente sind in Fachkreisen bekannt (siehe z.B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1888), durch Bezugnahme eingeschlossen). Wie in dieser Erfindung verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Epitop" jede antigene Determinante auf einem Antigen, an das sich das Paratop eines Antikörpers bindet. Die Epitop-Determinanten bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächenmolekülgruppierungen, wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und haben gewöhnlich sowohl spezifisch dreidimensionale Strukturmerkmale als auch spezifische Ladungscharakteristiken.
Antikörper, die sich an das GDF-11-Polypeptid der Erfindung binden, können unter Verwendung eines intakten Polypeptids oder von Fragmenten, die kleine Peptide von Interesse als immunisierendes Antigen enthalten, hergestellt werden. Das Polypeptid oder ein Peptid, das zur Immunisierung eines Tieres verwendet wird, kann von translatierter cDNA oder chemischer Synthese abgeleitet werden, die auch, falls gewünscht, an ein Trägerprotein gebunden werden kann. Zu solchen gewöhnlich verwendeten Trägern, die an das Peptid chemisch gekoppelt sind, gehören Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke (KLH), Thyroglobulin, Rinderserumalbumin (BSA) und Tetanus-Toxoid. Das gekoppelte Peptid wird sodann verwendet, um das Tier (z.B. eine Maus, eine Ratte oder ein Kaninchen) zu immunisieren.
Falls gewünscht, können polyklonale oder monoklonale Antikörper noch weiter gereinigt werden, zum Beispiel durch Bindung an eine Matrix und Elution von der Matrix, an die das Polypeptid oder ein Peptid, zu dem die Antikörper gezüchtet wurden, gebunden ist. Fachleute werden verschiedene Verfahren kennen, die in der Immunologie zur Reinigung und/oder Konzentration von sowohl polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern gebräuchlich sind (siehe zum Beispiel Coligan, et. al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, durch Bezugnahme eingeschlossen).
Es ist auch möglich, die Antiidiotyp-Technik zu verwenden, um monoklonale Antikörper zu produzieren, die ein Epitope nachahmen. Zum Beispiel wird ein zu einem ersten monoklonalen Antikörper gemachter antiidiotypischer monoklonaler Antikörper eine bindende Domäne in der hypervariablen Region haben, die die "Abbildung" des durch den ersten monoklonalen Antikörper gebundenen Epitops ist.
Der Begriff "zellproliferative Störung" bezeichnet sowohl bösartige als auch nicht-bösartige Zellpopulationen, die sich oft vom umgebenden Gewebe sowohl morphologisch als auch genotypisch zu unterscheiden scheinen. Bösartige Zellen (d.h. Krebs) entwickeln sich im Ergebnis eines mehrstufigen Prozesses. Das GDF-11-Polynukleotid, das ein Gegensinn-Molekül ist, ist für die Behandlung bösartiger Erkrankungen der verschiedenen Organsysteme, besonders zum Beispiel Zellen in Muskel, Uterus, Milz, Thymus oder Nervengewebe, nützlich. Im Wesentlichen kann jede Störung, die ätiologisch mit einer geänderten GDF-11 Expression verbunden ist, kann für eine Behandlung mit einem GDF-11 unterdrückenden Reagenz empfänglich betrachtet werden. Eine solche Störung ist zum Beispiel eine bösartige zellproliferative Störung.
Die Erfindung schafft ein In-vitro-Verfahren für den Nachweis einer zellproliferativen Störung von Muskelzellen. Das Verfahren weist die Kontaktierung eines Anti-GDF-11-Antikörpers mit einer Zelle, die verdächtigt wird, eine Störung im Zusammenhang mit GDF-11 zu haben, und den Nachweis der Bindung an den Antikörper auf. Der GDF-11-reaktive Antikörper ist mit einer Verbindung markiert, die den Nachweis der Bindung an GDF-11 ermöglicht. Für die Zwecke der Erfindung kann ein für GDF-11-Polypeptid spezifischer Antikörper verwendet werden, um das Niveau von GDF-11 in biologischen Flüssigkeiten und Geweben festzustellen. Jede Probe, die eine nachweisbare Menge an Antigen enthält, lässt sich verwenden. Das Niveau von GDF-11 in der verdächtigen Zelle lässt sich mit dem Niveau in einer normalen Zelle vergleichen um zu bestimmen, ob das Untersuchungsobjekt eine mit GDF-11 in Zusammenhang stehende zellproliferative Störung hat. Vorzugsweise ist das Untersuchungsobjekt menschlich.
Die Antikörper der Erfindung können in jedem Untersuchungsobjekt verwendet werden, in dem es wünschenswert ist, in vitro oder in vivo Immundiagnose oder Immuntherapie zu verabreichen. Die Antikörper der Erfindung sind für die Verwendung zum Beispiel in Immunassays geeignet, in denen sie in flüssiger Phase oder an einen Fest-Phasenträger gebunden genutzt werden können. Zusätzlich können die Antikörper in diesen Immunassays auf verschiedene Weisen nachweisbar markiert sein. Beispiele für Arten von Immunassays, die Antikörpern der Erfindung nutzen können, sind kompetitive und nicht-kompetitive Immunassays in entweder einem direkten oder indirekten Format. Beispiele für solche Immunassays sind das Radioimmunassay (RIA) und das Sandwich- (immunometrische) Assay. Der Nachweis der Antigene unter Verwendung der Antikörper der Erfindung lässt sich unter der Nutzung von Immunassays führen, die in einem Vorwärts-, Rückwärts oder Simultanmodus durchgeführt werden, einschließlich immun-histochemische Tests an physiologischen Proben. Fachleute kennen andere Immunassay-Formate oder können solche leicht ohne übermäßiges Experimentieren herausfinden.
Die Antikörper der Erfindung können an viele verschiedene Träger gebunden und verwendet werden, um die Anwesenheit eines Antigens festzustellen, das das Polypeptid der Erfindung aufweist. Beispiele für bekannte Träger sind Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Die Art des Trägers kann für die Zwecke der Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein. Fachleute werden andere geeignete Trägern für die Bindung von Antikörpern kennen oder in der Lage sein, solche mit Hilfe routinemäßigen Experimentierens zu ermitteln.
Es gibt viele verschiedene Markerstoffe und Markierungsverfahren, die einem Fachmann normalerweise bekannt sind. Beispiele für die Arten von Markerstoffen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Enzyme, Radioisotope, fluoreszierende Verbindungen, kolloidale Metalle, chemolumineszente Verbindungen. phosphoreszierende Verbindungen und biolumineszente Verbindungen. Fachleute werden andere geeignete Markerstoffe für das Binden an Antikörper kennen oder in der Lage sein, solche mit Hilfe routinemäßigen Experimentierens zu ermitteln.
Eine andere Technik, die auch größere Empfindlichkeit ergeben kann, besteht darin, die Antikörper an Haptenen niedrigen Molekulargewichts zu kuppeln. Diese Haptene lassen sich dann spezifisch mittels einer zweiten Reaktion nachweisen. Zum Beispiel ist es üblich, solche Haptene wie Biotin zu verwenden, das mit Avidin oder Dinitrophenyl, Puridoxal und Fluoreszein reagiert, die mit bestimmten Antihapten-Antikörpern reagieren können.
Bei der Nutzung der monoklonalen Antikörper der Erfindung für den In-vivo-Nachweis von Antigen wird der nachweisbar markierte Antikörper in einer Dosis gegeben, die diagnostisch wirksam ist. Der Ausdruck "diagnostisch wirksam" bedeutet, dass der nachweisbar markierte monoklonale Antikörper in einer ausreichenden Menge verabreicht wird, um den Nachweis der Stelle zu ermöglichen, die das Antigen hat, welches ein Polypeptid der Erfindung aufweist, für die die monoklonalen Antikörper spezifisch sind.
Die Konzentration der verabreichten, nachweisbar markierten monoklonalen Antikörper sollte genügen, damit die Bindung an diejenigen Zellen, die das Polypeptid haben, im Vergleich zum Hintergrund nachweisbar ist. Es ist ferner wünschenswert, dass der nachweisbar markierte monoklonale Antikörper rasch aus dem Kreislauf entfernt wird, um das beste Ziel zu Hintergrund Signalverhältnis zu erhalten.
In der Regel wird die Dosierung von nachweisbar markiertem monoklonalen Antikörper für die In-vivo-Diagnose abhängig von solchen Faktoren wie Alter, Geschlecht und Ausmaß der Krankheit der Person variieren. Solche Dosierungen können zum Beispiel abhängig davon variieren, ob mehrfache Injektionen verabreicht werden, antigene Belastung und andere Faktoren vorliegen, die in Fachkreisen gut bekannt sind.
Für diagnostische In-vivo Bildgebung ist die Art des verfügbaren Nachweisinstruments ein wesentlicher Faktor für die Auswahl eines gegebenen Radioisotops. Das gewählte Radioisotop muss von einem Zerfallstyp sein, der für einen gegebenen Instrumententyp nachweisbar ist. Ein weiterer wichtiger Faktor für die Auswahl eines Radioisotops für eine In-vivo-Diagnose ist, dass die für den Wirt schädliche Strahlung so gering wie möglich ist. Idealerweise gibt es bei einem für die In-vivo-Bildgebung verwendeten Radioisotop keine Teilchenstrahlung; es wird aber eine große Anzahl von Photonen im 140–250 keV Bereich produziert, die leicht mittels konventioneller Gammakameras nachgewiesen werden können.
Für die In-vivo-Diagnose können Radioisotope an Immunglobulin entweder direkt oder indirekt durch Verwendung einer funktionellen Zwischengruppe gebunden werden. Funktionelle Zwischengruppen, die oft benutzt werden, um die als Metallionen existierenden Radioisotope an Immunglobuline zu binden, sind die bifunktionalen Chelatbildner, wie Diethylen triaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und ähnliche Moleküle. Typische Beispiele für Metallionen, die an die monoklonalen Antikörper der Erfindung gebunden werden können, sind ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr und ²⁰¹Ti.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können auch mit paramagnetischen Isotopen zum Zwecke der In-vivo-Diagnose, wie bei der magnetischen Resonanzbildgebung (MRI) oder der Elektronenspinresonanz (ESR), markiert werden. Im Allgemeinen kann jedes konventionelle Verfahren für die Visualisierung von Diagnosebildgebung verwendet werden.
Normalerweise werden Gamma- und Positronemittierende Radioisotope für die Kamerabildgebung und paramagnetische Isotope für MRI verwendet. Zu den Elementen, die für solche Techniken besonders nützlich sind, gehören ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁵²Dy, ⁵⁶Cr und ⁵⁶Fe.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung lassen sich in-vitro und in vivo verwenden, um den Verlauf der Besserung einer mit GDF-11 in Verbindung stehenden Krankheit in einem Subjekt zu überwachen. Auf diese Weise würde es zum Beispiel durch Messen der Zunahme oder Abnahme der Anzahl der Antigen-exprimierenden Zellen, die ein Polypeptid der Erfindung aufweisen, oder von Veränderungen in der Konzentration eines solchen, in verschiedenen Körperflüssigkeiten vorhandenen Antigens möglich, zu bestimmen, ob ein bestimmter Behandlungsplan zur Besserung der mit GDF-11 in Verbindung stehenden Krankheit wirksam ist. Der Ausdruck "Besserung" bezeichnet eine Verringerung der schädlichen Wirkung der mit GDF-11 in Verbindung stehenden Krankheit in dem Subjekt, das der Therapie unterzogen wird.
Die gegenwärtige Erfindung identifiziert eine Nukleotidsequenz, die verglichen mit der Exprimierung in einer normalen Zelle auf eine geänderte Art exprimiert werden kann, weshalb es möglich ist, auf diese Sequenz ausgerichtete entsprechende therapeutische oder diagnostische Verfahren zu entwickeln. So lassen sich dort, wo eine zellproliferative Störung in Verbindung mit der Exprimierung von GDF-11 steht, Nukleinsäuresequenzen verwenden, die mit der Expression von GDF-11 auf der Translationsebene interferieren. Dieser Ansatz nutzt zum Beispiel Gegensinn-Nukleinsäure und Ribozyme, um die Translation einer bestimmten GDF-11-mRNA zu blockieren, entweder durch Maskierung dieser mRNA mit einer Gegensinn-Nukleinsäure oder durch Spaltung mit einem Ribozym. Zu solchen Störungen gehören zum Beispiel neurodegenerative Krankheiten.
Gegensinn-Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die zumindest zu einem Teil eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind (Weintraub, Scientific American, 262: 40, 1990). In der Zelle hybridisieren die Gegensinn-Nukleinsäuren zu der entsprechenden mRNA und bilden ein Doppelstrangmolekül. Die Gegensinn-Nukleinsäuren interferieren mit der Translation der mRNA, da die Zelle keine mRNA translatiert, die doppelstrangig ist. Gegensinn-Oligomere von etwa 15 Nukleotiden werden bevorzugt, da sie sich leicht synthetisieren lassen und es bei ihnen weniger wahrscheinlich ist, dass sie Probleme verursachen, als bei größeren Molekülen, wenn sie in die GDF-11 produzierende Zielzelle eingebracht werden. Die Nutzung von Gegensinn-Verfahren zur Hemmung der In-vitro-Translation von Genen ist in Fachkreisen gut bekannt (Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172: 289, 1988).
Ribozyme sind RNA-Moleküle, die die Fähigkeit besitzen, andere einstrangige RNA auf eine, den DNA-Restriktionsendonukleasen analoge Art spezifisch, zu spalten. Durch die Änderung von Nukleotidsequenzen, die diese RNA kodieren, ist es möglich, Moleküle zu konstruieren, die bestimmte Nukleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen und es spalten (Cech, J. Amer. Med. Assn., 260: 3030, 1988). Ein Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, dass aufgrund ihrer Sequenzspezifität nur mRNA mit bestimmten Sequenzen inaktiviert werden.
Es gibt zwei Grundtypen von Ribozymen, nämlich der Tetrahymenatyp (Hasselhoff, Nature, 334: 585, 1988) und der Typ "Hammerkopf". Ribozyme des Tetrahymenatyps erkennen Sequenzen von vier Basen Länge, während Ribozyme des Typs "Hammerkopf" Basensequenzen von 11–16 Basen Länge erkennen. Je länger die Erkennungssequenz ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Sequenz ausschließlich in der Ziel-mRNA auftritt. Folglich sind Ribozyme des Typs Hammerkopf Ribozymen des Typs Tetrahymena für die Inaktivierung einer bestimmten mRNA-Art vorzuziehen, und 18 Basen lange Erkennungssequenzen sind kürzeren Erkennungssequenzen vorzuziehen.
Das GDF-11-Gegensinn-Polynukeotid kann in Zellen, die durch GDF-11-Protein vermittelte Muskelzellenproliferationsstörung aufweisen, eingebracht werden. Die Lieferung von Gegensinn-GDF-11-Polynukleotid kann mit Hilfe eines rekombinanten Expressionsvektors, zum Beispiel eines chimerischen Virus oder eines kolloidalen Dispersionsystems, erreicht werden. Für die therapeutische Lieferung von Gegensinn-Sequenzen wird besonders die Verwendung zielgerichteter Liposome bevorzugt.
Zu den verschiedenen viralen Vektoren, die, wie hier gelehrt, für Gentherapie gebraucht werden können, gehören Adenovirus, Herpesvirus, Vaccinia oder, vorzugsweise, ein RNA-Virus, zum Beispiel ein Retrovirus.
Vorzugsweise ist der retrovirale Vektor ein Derivat eines Ratten- oder Vogelretrovirus. Zu den Beispielen für retrovirale Vektoren, in die ein einzelnes fremdes Gen eingebracht werden kann, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein: Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MoMuLV), Harvey-Maus-Sarkomavirus (HaMuSV), Maus-Mamma-Tumor-Virus (MuMTV) und Rous-Sarkomavirus (RSV). Eine Anzahl zusätzlicher retroviraler Vektoren kann Mehrfachgene integrieren. Alle diese Vektoren können ein Gen für einen selektierbaren Marker übertragen oder integrieren, so dass umgewandelte Zellen identifiziert und erzeugt werden können. Beispielsweise wird durch Einführen einer interessierenden GDF-11-Sequenz in den Virusvektor zusammen mit einem anderen Gen, das den Liganden für einen Rezeptor auf einer bestimmten Zielzelle kodiert, der Vektor nun zielspezifisch. Retrovirale Vektoren können durch Anhängen zum Beispiel eines Zuckers, eines Glykolipids oder eines Proteins zielspezifisch gemacht werden. Vorzugsweise wird Zielspezifität durch Verwendung eines Antikörpers erreicht, um den retroviralen Vektor zu treffen. Fachleute kennen bestimmte Polynukleotidsequenzen, oder können solche ohne übermäßiges Experimentieren herausfinden, die ins retrovirale Genom eingeführt oder an eine virale Hülle angehängt werden können, um die zielgerichtete Lieferung des retroviralen Vektors, der das GDF-11 Gegensinn-Polynukleotid enthält, zu ermöglichen.
Da rekombinante Retroviren defekt sind, brauchen sie Hilfe, um infektiose Vektorpartikel zu produzieren. Diese Hilfe kann zum Beispiel durch Verwenden von Helferzelllinien geboten werden, die Plasmide enthalten, die alle strukturellen Gene des Retrovirus unter Kontrolle von regulatorischen Sequenzen innerhalb des LTR kodieren. Diesen Plasmiden fehlt eine Nukleotidsequenz, die es dem Verpackungsmechanismus ermöglicht, ein RNA-Transkript für die Verkapselung zu erkennen. Zu Helferzelllinien mit Deletionen von Verpackungssignal gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, zum Beispiel Ψ2, PA317 und PA12. Diese Zelllinien produzieren leere Virionen, da kein Genom verpackt ist. Wenn ein retroviraler Vektor in solche Zellen eingefügt ist, in denen das Verpackungssignal intakt ist, aber die strukturellen Gene durch andere interessierende Gene ersetzt werden, kann der Vektor verpackt und Vektorvirion produziert werden.
Alternativ können NIH 3T3 oder andere Gewebskulturzellen direkt mit Plasmiden, die die retroviralen strukturellen Gene gag, pol und env kodieren, durch konventionelle Kalziumphosphattransfektion transfektiert werden. Diese Zellen werden dann mit dem Vektorplasmid, das die interessierenden Gene enthält, transfektiert. Die entstehenden Zellen geben den retroviralen Vektor in das Kulturmedium ab.
Ein anderes zielgerichtetes System für die Lieferung von GDF-11-Gegensinn-Polynukleotiden ist ein kolloidales Dispersionssystem. Zu den kolloidalen Dispersionssystemen gehören Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokugeln, Perlen und Systeme auf Lipidbasis, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen und Liposome. Das bevorzugte kolloidale System dieser Erfindung ist ein Liposom. Liposome sind künstliche Membranvesikel, die als Liefervesikel in vitro und in vivo nützlich sind. Es konnte gezeigt werden, dass große unilamellare Vesikel (LUV) in dem Größenbereich von 0.2–4.0 μm einen wesentlichen Prozentsatz eines wässrigen Puffers, der große Makromoleküle enthält, verkapseln können. RNA, DNA und intakte Virionen können im wässrigen Inneren verkapselt und zu Zellen in einer biologisch aktiven Form geliefert werden (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci. 6: 77, 1981). Zusätzlich zu Säugetier-Zellen sind Liposome für die Lieferung von Polynukleotiden in Pflanzen, Hefe und bakteriellen Zellen verwendet worden. Damit ein Liposom ein effizientes Genübertragungsvesikel ist, sollten die folgenden Merkmale vorhanden sein: (1) Kapselung der interessierenden Gene mit hoher Effizienz ohne Beeinträchtigung ihrer biologischen Aktivität, (2) bevorzugte und wesentliche Bindung an eine Zielzelle gegenüber Nicht-Zielzellen, (3) Lieferung des wässrigen Inhalts des Vesikels an das Zytoplasma der Zielzelle mit hoher Effizienz und (4) genaue und wirksame Expression der genetischen Informationen (Mannino et al., Biotechniques, 6: 682, 1988).
Die Zusammensetzung des Liposoms ist normalerweise eine Kombination aus Phospholipiden, besonders Phospholipiden hoher Phasenübergangstemperatur, normalerweise in Kombination mit Steroiden, speziell Cholesterin. Andere Phospholipide oder andere Lipide können ebenfalls verwendet werden. Die physikalischen Merkmale der Liposome hängen von pH-Wert, Ionenstärke und der Gegenwart von divalenten Kationen ab.
Beispiele für Lipide, die bei der Liposomproduktion nützlich sind, sind Phosphatidylverbindungen, wie Phosphatidylglyzerol, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside. Besonders nützlich sind Diacylphosphatidylglyzerole, in denen der Lipidanteil 14–18 Kohlenstoffatome, besonders 16–18 Kohlenstoffatome enthält und gesättigt ist. Zu illustrativen Phospholipiden gehören Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.
Das Zielrichten von Liposomen kann auf der Basis anatomischer und mechanistischer Faktoren klassifiziert werden. Die anatomische Klassifizierung basiert auf der Ebene der Selektivität, zum Beispiel organspezifisch, zellspezifisch und organellspezifisch. Bei der mechanistischen Zielrichtung kann unterschieden werden, ob sie passiv oder aktiv ist. Passives Zielrichten nutzt die natürliche Tendenz von Liposomen, an Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) in Organen mit sinusoidalen Kapillaren zu verteilen. Aktives Ausrichten schließt andererseits eine Veränderung der Liposome durch Kopplung des Liposoms an einen bestimmten Liganden, wie einen monoklonalen Antikörper, Zucker, Glykolipid oder Protein oder durch Veränderung der Zusammensetzung oder Größe des Liposoms, um eine Zielrichtung auf Organe und Zellarten zu erreichen, die von den natürlichen Stellen des Vorkommens verschieden sind.
Die Oberfläche der zielgerichteten Abgabe kann auf vielfältige Weise modifiziert werden. Im Falle einer liposomal zielgerichteten Abgabe, können Lipidgruppen in die Lipiddoppelschicht des Liposoms integriert werden, um den zielgerichteten Liganden in stabiler Verbindung mit der liposomalen Doppelschicht zu erhalten. Verschiedene Verbindungsgruppen können für den Anschluss der Lipidketten an den zielgerichteten Liganden verwendet werden.
Aufgrund der Expression von GDF-11 im Muskel, in der Milz, im Uterus, im Thymus und im Nervengewebe gibt es eine Vielfalt von Anwendungen unter Nutzung des Polypeptids, Polynukleotids und Antikörper der Erfindung bezüglich dieser Gewebe. Zu solchen Anwendungen gehört die Behandlung zellproliferativer und immunologischer Störungen, die diese und andere Gewebe einschließen. Außerdem kann GDF-11 bei verschiedenen Gentherapieverfahren nützlich sein.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung verdeutlichen, aber nicht einschränken. Während sie typisch für anwendbare Verfahren sind, können andere, den Fachleuten bekannte Verfahren alternativ verwendet werden.
Beispiel 1
Identifikation und Isolierung eines neuartigen TGF-β-Familienmitglieds
Um neuartige Mitglieder der TGF-β-Superfamilie zu identifizieren, wurde eine muringenomische Bibliothek bei reduzierter Stringenz mit Hilfe der murinen GDF-8-Sonde durchsucht (8; Nukleotide 865–1234), wobei der Bereich abgedeckt wurde, der die C-terminale Region des GDF-8-Präkursorproteins kodiert. Die Hybridisierung wurde wie beschrieben (Lee, Mol Endocrinol., 4: 1034, 1990) bei 65°C ausgeführt, und die letzte Waschung wurden bei derselben Temperatur in einem Puffer mit 0,5 M NaCl ausgeführt. Unter den hybridisierenden Phagen war einer, der von dem GDF-8 enthaltenden Phagen aufgrund seiner reduzierten Hybridisierungsintensität zur GDF-8-Sonde unterschieden werden konnte. Eine partielle Nukleotidsequenzanalyse der genomischen Einfügung in diesem schwach hybridisierten Phagen zeigte, dass dieser Klon eine Sequenz enthielt, die zwar stark verwandt mit dem murinen GDF-8, aber von diesem verschieden ist.
Eine partielle Nukleotidsequenz der genomischen Einfügung in diesem Phagen wird in 1a gezeigt. Die Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen, der sich von den Nukleotiden 198 bis 575 erstreckte und eine signifikante Homologie zu den bekannten Mitgliedern der TGF-β Superfamilie zeigte (siehe unten). Dieser Sequenz ging eine 3'-Spleißkonsenssequenz an ge nau der gleichen Stelle wie im GDF-8-Gen voraus. Diesem neuen TGF-β-Familienmitglied wurde die Bezeichnung GDF-11 (Wachstums-/Differenzierungsfaktor-11) gegeben.
Beispiel 2
Expression von GDF-11
Um das Expressionsmuster des GDF-11 zu bestimmen, wurden aus einer Vielfalt von Geweben hergestellte RNA-Proben mittels Northern-Analyse durchsucht. RNA-Isolierung und Northern-Analyse wurden wie zuvor beschrieben ausgeführt (Lee, Mol. Endocrinol, 4: 1034, 1990), außer, dass die Hybridisierung in 5 × SSPE, 10% Dextransulfat, 50% Formamid, 1% SDS, 200 μg/ml Lachs-DNA und 0,1% jeweils von Rinderserumalbumin, Ficoll und Polyvinylpyrrolidon ausgeführt wurde. Fünf Mikrogramm von zweimal poly-A-selektierter RNA wurden von jedem Gewebe präpariert (außer zweitägiges neonatales Gehirn, für das nur 3,3 μg RNA verwendet wurde), auf Formaldehyd elektrophoresiert, geblottet und mit GDF-11 sondiert. Wie in 2 gezeigt, wies die GDF-11-Sonde zwei RNA-Arten von etwa 4,2 und 3.2 kb Länge in Thymus, Hirn, Milz, Uterus und Muskel von Erwachsenen sowie in ganzen Embryonen, die am Tag 12,5 oder 18,5 isoliert wurden, und in verschiedenen Entwicklungsstufen entnommenen Gehirnproben nach. Bei längeren Belichtungen dieser Blots konnten niedrigere Niveaus von GDF-11-RNA auch in einer Anzahl anderer Gewebe nachgewiesen werden.
Beispiel 3
Isolierung von GDF-11 kodierenden cDNA-Klonen
Um GDF-11 kodierende cDNA-Klone zu isolieren wurde eine cDNA-Bibliothek im Vektor Lambda ZAP II (Stratagen) unter Verwendung von aus der Humanmilz von Erwachsenen gewonnener RNA erstellt. Aus 5 μg zweimal poly-A-selektierter RNA, gewonnen aus menschlicher Milz, wurde eine aus 21 Millionen rekombinanten Phagen bestehende cDNA-Bibliothek entsprechend den von Stratagen gelieferten Anweisungen erstellt. Die Bibliothek wurde ohne Vervielfältigung durchsucht. Durchsuchung der Bibliothek und Charakterisierung von cDNA-Einfügungen wurden wie zuvor beschrieben ausgeführt (Lee, Mol. Endocrinol, 4: 1034, 1990). Aus dieser Bibliothek wurden 23 hybridisierende Phagen erhalten.
Die ganze Nukleotidsequenz des Klons, die sich am weitesten in Richtung des 5-Endes des Gens erstreckt, wurde bestimmt. Die 1258 Basen-Paarsequenz enthielt einen einzelnen langen offenen Leserahmen, der vom 5'-Ende des Klons beginnt und sich bis zu einem TAA-Stopp-Codon erstreckt. Weil sich der offene Leserahmen und die Homologie mit GDF-8 (siehe unten) bis ganz ans 5'-Ende des Klons erstreckt, schien es wahrscheinlich, dass diesem Klon die Kodierungssequenz fehlt, die dem N-terminalen Ende des GDF-11-Präkursorproteins entspricht. Um den übrigen Teil der GDF-11-Sequenz zu erhalten, wurden mehrere genomische Klone dadurch isoliert, dass eine Humangenombibliothek mit der menschlichen GDF-11-cDNA-Sonde durchsucht wurde. Die Teilsequenzanalyse eines dieser genomischen Klons zeigte, dass dieser Klon das GDF-11-Gen enthielt. Von diesem Klon wurde die restliche GDF-11-Kodierungssequenz erhalten. 1b zeigt die vorhergesagte Sequenz des GDF-11 zusammengesetzt aus der genomischen – und cDNA-Sequenzen. Die Nukleotide 136 bis 1393 stellt die Länge der von einem cDNA-Klon erhaltenen Sequenz dar. Die Nukleotide 1 bis 135 wurden von einem genomischen Klon erhalten. Die Sequenz wurde, willkürlich beginnend, mit einer Sac-II-Position im genomisch Klon nummeriert, aber die mRNA-Anfangsposition ist nicht bekannt. Die Sequenz enthält ein mutmaßliches initiierendes Methionin bei Nukleotid 54. Ob die gesamte Sequenz stromaufwärts dieses Methionin-Codons im mRNA vorhanden ist, ist nicht bekannt. Beginnend mit diesem Methionin-Codon erstreckt sich der offene Leserahmen über einen Bereich von 407 Aminosäuren. Die Sequenz enthält eine potentielle N-gebundene Glycosylationposition bei Asparagin 94. Die Sequenz enthält eine vorhergesagte proteolytische RXXR-Spaltungsstelle bei den Aminosäuren 295 bis 298, und eine Spaltung des Präkursors an dieser Stelle würde ein aktives C-terminales Fragment von 109 Aminosäuren in Länge mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von etwa 12.500 kD erzeugen. In dieser Region sind die vorhergesagten murinen und humanen GDF-11-Aminosäure-Sequenzen 100%ig identisch. Der hohe Grad der artenübergreifenden Sequenzkonservierung ist ein Hinweis darauf, dass GDF-11 eine wichtige Rolle in vivo spielt.
Die C-terminale Region, die der vorhergesagten Spaltungsstelle folgt, enthält alle in anderen TGF-β-Familienmitgliedern vorhandenen Kennzeichen. GDF-11 enthält die meisten der Reste, die in anderen Familienmitgliedern hoch konserviert sind, einschließlich der sieben Zysteinreste mit ihren charakteristischen Abständen. Wie bei TGF-β'^S, enthalten auch die Inhibin β'^S und GDF-8, GDF-11 zwei zusätzliche Zysteinreste. Im Falle von TGF-β2 sind diese zusätzlichen Zysteinreste dafür bekannt, eine intramolekulare Disulfidbindung zu bilden (Daopin, et al., Science, 257: 369, 1992; Schlunegger und Grutter, Nature, 358: 430, 1992). Eine tabellarische Aufstellung der Aminosäuresequenzhomologien zwischen GDF-11 und den anderen TGF-β-Familienmitgliedern wird in 3 gezeigt. Die Nummern stellen prozentuale Aminosäureidentitäten zwischen jedem vom ersten konservierten Zystein bis zum C-Terminal berechneten Paar dar. Die Kästen stellen Homologien zwischen eng verwandten Mitgliedern innerhalb be stimmter Untergruppen dar. In dieser Region ist GDF-11 am engsten mit GDF-8 (92% Sequenzidentität) verwandt.
Eine Anordnung der Aminosäuresequenzen von GDF-8 (SEQ ID Nr.: 5) und GDF-11 (SEQ ID Nr.: 6) wird in 4 gezeigt. Die beiden Sequenzen enthalten potentielle N-gekoppelte Glykolysierungssignale (NIS) und mutmaßliche proteolytische Verarbeitungsstellen (RSRR) an analogen Positionen. Die zwei Sequenzen sind nicht nur in der C-terminalen Region, die der mutmaßlichen Spaltungsstelle (90% Aminosäuresequenzidentität) folgt, sondern auch in der Proregion der Moleküle (45% Aminosäuresequenzidentität) verwandt.
Beispiel 4
Konstruktion eines hybriden GDF-8/GDF-11-Gens
Um GDF-11-Protein zu exprimieren, wurde ein hybrides Gen konstruiert, bei dem die N-terminale Region von GDF-11 durch die analoge Region von GDF-8 ersetzt wurde. Solche Hybridkonstrukte sind verwendet worden, um biologisch aktives BMP-4 zu produzieren (Hammonds, et al., Mol. Endocrinol., 5: 149, 1991) und Vg-1 (Thomsen und Melton, Cell, 74: 433, 1993). Um sicherzustellen, dass das vom hybriden Konstrukt produzierte GDF-11-Protein authentischen GDF-11 darstellt, wurde das hybride Gen dergestalt konstruiert, dass die Fusion der beiden Genfragmente genau an den vorhergesagten Spaltungsstellen erfolgt. Insbesondere gibt es in beiden Sequenzen eine Avall-Restriktionsstelle an der Stelle, die der vorhergesagten proteolytischen Spaltungsstelle entspricht. Die N-terminale Proregion von GDF-8 bis zu dieser Avall-Stelle wurde durch Teilverdauung des Klons mit Avall erhalten und mit der C-terminalen Region von GDF-11, die an dieser Avall-Stelle beginnt, fusioniert. Das entstehende Hybridkonstrukt wurde dann in den Säugetier-Expressionsvektor pMSXND eingebracht (Lee und Nathans, J. Biol. Chem., 263: 3521) und in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters transfektiert. Wie in 5 gezeigt, ergab die Western-Analyse des konditionierten Mediums aus G418-resistenten Zellen unter Verwendung von Antikörpern, die gegen den C-terminalen Teil von GDF-8 gezüchtet wurden, dass diese Zellen GDF-11-Protein in das Medium sekretierten und dass zumindest etwas von dem Hybridprotein proteolytisch verarbeitet wurde. Weiterhin zeigen diese Untersuchungen, dass die gegen den C-terminalen Teil von GDF-8 gerichteten Antikörper auch mit GDF-11-Protein reagieren.
Beispiel 5
Chromosomale Lokalisierung von GDF-11
Um die chromosomale Position von GDF-11 abzubilden, wurden DNA-Proben somatischer Zellhybride aus humanen Zellen und Nagetierzellen (Drwinga, et al, Genomics, 16: 311–313, 1993; Dubois and Naylor, Genomics, 16: 315–319, 1993) durch Polymerase-Kettenreaktion mit nachfolgendem Southern Blotting analysiert. Die Polymerase-Kettenreaktion wurde mittels Primer #101, 5'-GAGTCCCGCTGCTGCCGATATCC-3' (SEQ ID Nr: 7) und Primer #102, 5'-TAGAGCATGTTGATTGGGGACAT-3' (SEQ ID Nr.: 8) in 35 Zyklen bei 94° für 2 Minuten, bei C 58°C für 1 Minute und bei 72°C für 1 Minute ausgeführt. Diese Primer entsprechen den Nukleotiden 981 bis 1003 bzw. dem reversen Komplement der Nukleotide 1182 bis 1204 in der menschlichen GDF-11-Sequenz. PCR-Produkte wurden auf Agarose-Gelen elektrophoresiert, blottet und mit Oligonukleotid #104, 5'-AAATATCCGCATACCCATTT-3' (SEQ ID Nr.: 9) sondiert, das einer internen Sequenz der Region entspricht, die von Primer #101 und #102 flankiert wird. Die Filter wurden in 6 × SSC, 1 × Denhardt-Lösung, 100 μg/ml Hefe-Transfer-RNA und 0,05% Natriumpyrophosphat bei 50°C hybridisiert.
Wie in 6 gezeigt, hat die humanspezifische Sonde ein Band der vorhergesagten Größe (etwa 224 Basenpaare) in der positiven Kontrollprobe (total humangenomische DNA) und in einer einzelnen DNA-Probe aus der Palette der Hybride aus humanen Zellen und Nagetierzellen nachgewiesen. Dieses positive Signal entspricht dem menschlichen Chromosom 12. Das in jeder der hybriden Zelllinien enthaltene menschliche Chromosom wurde im oberen Bereich der ersten 24 Bahnen (1–22, X und Y) identifiziert. In den mit CHO, M und H bezeichneten Bahnen war die DNA-Ausgangsmatrize gesamte genomische DNA von Hamster-, Maus- beziehungsweise menschlichen Quellen. In der als B1 markierten Bahn wurde keine Matrizen-DNA verwendet. Die linksseitigen Nummern zeigen die Mobilitäten der DNA-Standards an. Diese Daten zeigen, dass sich das menschliche GDF-11-Gen auf dem Chromosom 12 befindet.
Zur genaueren Bestimmung der Position von GDF-11 auf Chromosom 12 wurde das GDF-11-Gen durch Fluorescenz In Situ Hybridisierung (FISH) lokalisiert. Mit diesen FISH-Lokalisierungsuntersuchungen wurde BIOS Laboratories (New Haven, Connecticut) vertraglich beauftragt. Gereinigte DNA von einem genomischen Human-GDF-11-Klon wurde mit Digoxigenin-dUTP durch Nick-Translation markiert. Die markierte Probe wurde mit gescherter menschlicher DNA verbunden und zu normalen Metaphasen-Chromosomen, die von PHA- stimulierten peripheren Blutlymphozyten abgeleitet sind, in einer Lösung aus 50% Formamid, 10% Dextransulfat und 2 × SSC hybridisiert. Spezifische Hybridisierungssignale wurden durch Inkubierung der hybridisierten Objektträger in fluorescein-konjugierten Antidigoxigen-Antikörpern von Schafen festgestellt. Die Objektträger wurden dann mit Propidiumjodid gegengefärbt und analysiert. Wie in 7a gezeigt, führte dieses Experiment zur spezifischen Bezeichnung des proximalen langen Arms eines Gruppen-C-Chromosoms, dessen Größe und Gestalt mit Chromosom 12 übereinstimmten. Um die Identität des speziell markierten Chromosoms zu bestätigen, wurde ein zweiter Versuch durchgeführt, bei dem eine auf das Chromosom 12 gerichtete spezifische Zentromersonde mit GDF-11 kohybridisiert wurde. Wie in 7b gezeigt, demonstrierte dieser Versuch eindeutig, dass GDF-11 sich in einer Position befindet, die 23% des Abstands vom Zentromer zum Telomer des langen Arms des Chromosoms 12 beträgt, ein Bereich, der der Bande 12g13 (7c) entspricht. Insgesamt wurden 85 Metaphasezellen analysiert, und 80 wiesen eine spezifische Markierung auf.
Sequenzdarstellung

Claims

Ein isoliertes oder rekombiniertes Polynucleotid, das ein Wachstums-Differenzierungsfaktor-11-(GDF-11)-Polypeptid kodiert, wobei das Polynucleotid aufweist: (a) die Nucleotid-Sequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei T auch U sein kann, (b) die Nucleotide 1 bis 135 von SEQ ID Nr. 1, wobei T auch U sein kann, (c) eine Nucleotid-Sequenz, die das Polypeptid der SEQ ID Nr. 2 kodiert, oder (d) eine Nucleotid-Sequenz komplementär zur Nucleotid-Sequenz von SEQ ID Nr. 1, wobei T auch U sein kann.
Die Polynucleotidsequenz nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid von einer Säugetierzelle isoliert ist.
Die Polynucleotidsequenz nach Anspruch 2, wobei die Säugetierzelle aus einer Gruppe von Mäuse-, Ratten- und menschlichen Zellen ausgewählt ist.
Ein Expressionsvektor, der die Polynucleotide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.
Der Vektor nach Anspruch 4, wobei der Vektor ein Plasmid oder ein Virus ist.
Eine Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 4 oder 5 stabil verändert ist.
Die Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei die Zelle prokaryotisch oder eukaryotisch ist.
Verfahren zur Herstellung eines GDF-11-Polypeptids, das die Kultivierung der Wirtszelle nach Anspruch 6 oder Anspruch 7 unter geeigneten Bedingungen und die Gewinnung des exprimierten Polypeptids einschließt.
Ein GDF-11-Polypetid, das durch ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert oder durch das Verfahren nach Anspruch 8 hergestellt ist.
Antikörper, die selektiv an die Polypeptide nach Anspruch 9 binden oder Antigen bindende Fragmente davon.
Die Antikörper nach Anspruch 10, wobei die Antikörper polyklonal oder monoklonal sind.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, den Vektor nach Anspruch 4 oder 5, das Polypeptid nach Anspruch 9 und/oder den Antikörper nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 und gegebenenfalls eine pharmazeutisch akzeptable Trägersubstanz aufweist.
Eine diagnostische Zusammensetzung, die das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, den Vektor nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, das Polypeptid nach Anspruch 9 und/oder den Antikörper nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 und gegebenenfalls ein geeignetes Nachweismittel aufweist.
Ein In-vitro-Verfahren zum Nachweis einer Muskelzellen-Proliferationsstörung, die mit der Expression von GDF-11 in Verbindung steht, das die Kontaktierung des Antikörpers nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 mit einer Probe eines Subjekts aufweist, das im Verdacht steht, eine mit GDF-11 in Verbindung stehende Störung zu haben, sowie zum Nachweis der Bindung des Antikörpers.
Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 für die Bereitung einer diagnostischen Zusammensetzung zum Nachweis einer Muskelzellen-Proliferationsstörung, die in Verbindung mit der Expression von GDF-11 steht.
Verfahren nach Anspruch 14 oder Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Antikörper nachweisbar markiert ist.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 16, wobei die nachweisbare Markierung aus einer Gruppe, bestehend aus einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Komponente, einer biolumineszenten Komponente und einer chemolumineszenten Komponente und einem Enzym, ausgewählt ist.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 oder eines Polynucleotids nach Anspruch 1, 2 oder 3, der bzw. das die GDF-11- Aktivität unterdrückt, zur Bereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Muskelzellen-Proliferationsstörung, die mit der Expression von GDF-11 in Verbindung steht.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Polynucleotid mit Hilfe eines Vektors in eine Zelle eingebracht wurde.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Vektor ein kolloidales Dispersionssystem ist.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das kolloidale Dispersionssystem ein Liposom ist.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Liposom an einen Anteil gekoppelt wird, der aus einer Gruppe, bestehend aus einem Zucker, einem Glycolipid und einem Protein, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Vektor ein Virus ist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei der Virus ein RNA-Virus ist.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei der RNA-Virus ein Retrovirus ist.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei der Retrovirus weiters ein Polynucleotid aufweist, das in ein retrovirales Genom oder in einen Anteil eingebracht ist, der aus der Gruppe, bestehend aus einem Zucker, einem Glycolipid und einem Protein, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 22 oder 26, wobei das Protein ein Antikörper ist.