DE69534348T2

DE69534348T2 - Gasbetätigtes Element zum Austragen von Genmaterial

Info

Publication number: DE69534348T2
Application number: DE69534348T
Authority: DE
Inventors: E. Dennis McCABE
Original assignee: Powderject Vaccines Inc
Current assignee: Powderject Vaccines Inc
Priority date: 1994-01-21
Filing date: 1995-01-20
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2015-01-21
Also published as: US5865796A; US5584807A; DK1293559T3; DK0690732T3; CA2158733C; NZ279995A; ES2247248T3; JPH08509131A; EP1293559A1; PT690732E; EP0690732B1; WO1995019799A1; ES2192573T3; EP0690732A1; RU2134295C1; DE69534348D1; CN1112943C; AU1729595A; CN1124460A; CA2501743C

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Zufuhr von Material in Zellen, insbesondere der Zufuhr genetischen Materials in lebendes Gewebe.
Hintergrund der Erfindung
In den letzten zehn Jahren hat sich die Beschleunigung von Material, insbesondere von genetischem Material, in lebende Zellen und Gewebe mit Hilfe von Partikeln zu einem wichtigen Instrument der pflanzlichen und tierischen Biotechnologie entwickelt. Die vorübergehende Expression und Keimbahnintegration von eingebrachter DNA wurde in Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren nachgewiesen.
Nachdem die Grundsätze der Technologie ausgearbeitet wurden, richtet sich die Aufmerksamkeit zunehmend auf die Entwicklung von Geräten, die dem Bediener die Fähigkeit bieten, eine Reihe von Gentransfers mit Hilfe von Partikeln in schneller Folge nacheinander auszuführen. Ein solches Gerät wäre insbesondere zur Verwendung bei Massenimpfungen von Menschen oder Haustieren mit genetischen Impfstoffen von Vorteil.
Eine Beschränkung bestehender Gentransfervorrichtungen mit Hilfe von Partikeln ist die Form, in welcher die Probe bereitgestellt wird. Bei all diesen Vorrichtungen wird die Probe auf die Oberfläche kleiner, dichter Partikel eines Materials wie Gold oder Platin aufgebracht. Die beschichteten Partikel werden dann selbst entweder auf eine steife Fläche wie eine Metallplatte oder auf eine Trägerfolie aus fragilem Material wie Mylar aufgebracht. Die beschichtete Folie wird dann auf ein Ziel zu beschleunigt. Dieses Vorgehen hat mehrere Vorteile wie auch einige Nachteile. Die Vorteile haben mit der Tatsache zu tun, dass die flache Folie eine sehr gleichmäßige Verteilung beschleunigter Partikel erzeugt. Ein Nachteil besteht darin, dass jede partikelbeschichtete Platte oder Trägerfolie einzeln erzeugt wird und nur einmal verwendet werden kann, was die Partikelbeschleunigung zu einem zeitaufwändigen und ineffizienten Vorgang macht, insbesondere wenn viele wiederholte Gentransfers angestrebt sind. Jede beschichtete Trägerfolie ist relativ groß und muss mit Sorgfalt gehandhabt werden, um eine Beschädigung oder Verunreinigung zu vermeiden. Es ist manchmal auch schwierig, die beschichtete Nutzseite einer Trägerfolie von der nicht beschichteten Seite zu unterscheiden. Eine falsche Positionierung der Trägerfolie kann den Durchsatz senken und zu einer Vergeudung von Proben führen.
Die Verteilung bzw. Streuung des Musters von Trägerpartikeln kann bei manchen Anwendungen wichtiger als bei anderen Anwendungen sein, d.h. wenn Keimbahnvorgänge erwünscht sind, vor allem wenn nur eine vorübergehende Expression der eingeschleusten Gene erforderlich ist. Wenn ein nur gelegentlicher Keimbahn-Transformationsvorgang erwünscht ist, ist es erforderlich, die Partikel gleichmäßig hin zu einer großen Fläche von Zellen oder Geweben zu beschleunigen. Bisher galt es daher als wünschenswert, die beschichteten Partikel als Monolayer auf einer relativ großen Fläche zu verteilen, bevor sie auf ein Ziel zu beschleunigt wurden, um die Anzahl an Zellen zu maximieren, welche unter exakt gleichmäßigen Bedingungen Partikel aufnehmen, und um dadurch die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass eine Zelle eine Keimbahntransformation erfährt. Bei Beschleunigung von Partikeln in die Zellen dagegen, um eine vorübergehende Genexpression in somatischen Geweben wie Haut zu induzieren, ist die Notwendigkeit weniger zwingend, eine exakt gleichmäßige Beschleunigung der Partikel vorzunehmen, da eine ausreichende Expression erfolgen kann, selbst wenn nur eine kleine Anzahl an Zellen von Partikeln penetriert werden. Daher sind nun Partikelzufuhrverfahren wünschenswert, die bisher unerwünscht waren.
Um diese und andere Beschränkungen zu überwinden, ist eine Genzufuhrvorrichtung mit großem Durchsatz erwünscht, die mehrere Proben für schnelles und aufeinander folgendes Einschleusen in Zielgewebe aufnehmen kann. Erwünscht ist auch eine Probenlager- und Zufuhrplattform, die haltbarer ist und leichter herzustellen, zu lagern und zu bedienen ist als bisherige Plattformen.
US-A-4 945 050 offenbart eine Vorrichtung, bei der die Partikel über einen Gewindeeinlass, der anschließend durch eine Schraube verschlossen wird, in das Beschleunigungsrohr eingebracht werden.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird in Anspruch 1 definiert.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Vorrichtung im Gegensatz zu der von bisherigen Geräten aufgenommenen einzigen Probe mehrere Proben aufnimmt.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Kartusche vor dem Gebrauch vorbereitet und problemlos gelagert und bedient werden kann.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung in Zusammenschau mit den Begleitzeichnungen hervor.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine schematische Abbildung, welche die Wirkungen bei Ändern des Winkels der Austrittdüse zeigt.
3 ist eine Seitenansicht einer ersten Ausführung der vorliegenden Erfindung.
4 ist eine Vorderansicht einer Probenkartuschenhalterung der Ausführung von 3.
5 ist eine freigeschnittene Seitenansicht einer rohrförmigen Probenkartusche aus der Ausführung von 3.
6 ist eine physikalische Karte von Plasmid pWRG1602.
7 ist eine Seitenansicht einer anderen Ausführung der vorliegenden Erfindung.
8 ist eine auseinander gezogen dargestellte Ansicht der Ausführung von 7.
9 ist eine Querschnittansicht des Ventils der Ausführung von 7.
10 ist eine Querschnittansicht des Aktormechanismus der Ausführung von 7.
11 ist eine Draufsicht auf optionale Diffusorsiebe zur Verwendung mit den Ausführungen von 3 und 7.
Eingehende Beschreibung der bevorzugten Ausführung
Die vorliegende Erfindung gibt eine Vorrichtung und ein Verfahren für die schnelle und reproduzierbare, aufeinander folgende Zufuhr von Partikeln, welche mit einem genetischen Material beschichtet sind, in lebende Zielgewebe und Zellen an die Hand. In 1 wird eine schematische Darstellung gezeigt, welche das allgemeine Verfahren für den Betrieb eines Partikelbeschleunigungs-Gentransformationsgeräts veranschaulichen soll, das nach dem Prinzip der hier bevorzugten Ausführung arbeitet. Die in 1 gezeigten Teile der Vorrichtung werden an einigen Stellen der Klarheit halber in leicht auseinander gezogener Ansicht gezeigt. Diese Darstellung soll das grundlegende Funktionsprinzip des Instruments veranschaulichen, nicht seine Konstruktionseinzelheiten zeigen.
Unter Bezug nun auf 1 ist in dem Instrument eine Trägerpartikelkartusche 14 in mittig angeordnet. Die Partikelkartusche 14 ist eine längliche konkave oder rohrförmige Konstruktion, welche einen durch ihre Mitte verlaufenden konkaven hohlen Durchlass aufweist. Es sind mehrere Trägerpartikel 16 am Inneren der Trägerpartikelkartusche angeordnet. Die Trägerpartikel sind, wie nachstehend eingehender beschrieben wird, kleine, dichte Partikel, die zuvor mit dem biologischen Material, d.h. DNA oder RNA, beschichtet wurden, das in den Zielorganismus eingeschleust werden soll. Die Partikel können auch mit anderen Arten von biologischen Materialien wie Peptiden, Cytokinen, Hormonen oder Proteinen beschichtet werden. Ein Gasventil 18 ist stromaufwärts der Trägerpartikelkartusche angeordnet und ist über eine geeignete Fluidleitung 17 mit dem Inneren der Trägerpartikelkartusche 14 verbunden. Das Gasventil ist durch einen bei 13 gezeigten geeigneten Schlauch mit einer Quelle für Druckgas 12 verbunden. Die Quelle für Druckgas 12 kann ein herkömmlicher handelsüblicher Druckgasbehälter sein, vorzugsweise mit einem reaktionsträgen Druckgas wie Helium. Ein Druckgasspeicher ist zwischen der Gasquelle 12 und dem Ventil 18 wünschenswert, es hat sich aber gezeigt, dass der Schlauch 13 als solcher Speicher fungieren kann.
Rechts neben der Trägerpartikelkartusche befindet sich eine Mündung 20, welche Zugang zum Inneren einer Beschleunigungskammer 22 gibt, welche wiederum in einer kegelförmigen Austrittdüse 24 endet. Der Patient, Gewebe oder Zellen, die zu behandeln sind und in 1 mit 19 bezeichnet sind, finden sich rechts in der Darstellung.
Bei seinem allgemeinen Betrieb wird das Ventil 18 kurz betrieben, um einen Stoß Druckgas abzugeben, das in dem durch den Schlauch 13 gebildeten Speicher gehalten wird. Zwischen dem Ventil 18 und der Austrittdüse 24 bilden die Zwischenteile einen Partikelbeschleunigungsdurchlass, durch den expandierendes Gas, das zuvor unter Druck stand, einen sich bei beträchtlicher Geschwindigkeit fortbewegenden Gasstrom erzeugt. Der Gasstrom beschleunigt durch den Partikelbeschleunigungsdurchlass, und bei Durchtreten durch das Innere der Partikelkartusche 14 nimmt der beschleunigende Gasstrom die Trägerpartikel 16 auf und führt sie mit sich. Der beschleunigende Gasstrom strömt dann durch die Kammer 22 zu der Austrittdüse 24. Die Partikel treten dann aus dem Instrument aus und in die Gewebe des Patienten 19, wo sich die Trägerpartikel in den Zellen des Ziels oder Patienten festsetzen, diese aber nicht abtöten.
Wichtig für das richtige Funktionieren des in 1 gezeigten Instruments ist die Geometrie der Austrittdüse 24. Der Grund für diese Wichtigkeit wird schematisch in 2 gezeigt, die als Versionen A, B und C drei verschiedene mögliche Geometrien der Austrittdüse 24 sowie deren Wirkung auf den Flug der Partikel 16 zeigt. In Version A weitet sich die Austrittdüse 24 hin zu ihrem Abgabeende der Vorrichtung nicht wesentlich. Dadurch tritt der austretende Gasstrom geradlinig aus dem Ende der Austrittdüse 24 aus und bewegt sich auf einer Strecke direkt hin zum Ziel 19 weiter. Dadurch bewegen sich die Trägerpartikel weiterhin auf einer relativ geraden Strecke und treffen alle auf einem in 2 mit 25 bezeichneten relativ schmalen Bereich des Patienten 19 auf Die Partikel 16 streben zwar etwas auseinander, doch ist das Abweichen recht gering und unerheblich.
Analog weist die Austrittdüse 24 in Version B von 2 einen äußerst breiten Winkel eines konischen Kegels hin zum Abgabeende der Vorrichtung auf. Auch bei dieser Ausführung tritt der Gasstrom recht geradlinig aus dem Instrument aus, und die Trägerpartikel 16 streuen nicht breit. Die Partikel treffen wiederum auf einem relativ kleinen Teil 25 des Patienten 19 auf.
Ein anderes Phänomen tritt auf, wenn – wie in der Version von 2 gezeigt – der Kegelwinkel der Kegelform der Austrittdüse unter einem kritischen Winkel liegt. Wenn in diesem Fall der beschleunigte Gasstrom in die Austrittdüse gelangt, erzeugt er durch eine Wirbelwirkung ein Vakuum zwischen der Durchtrittstrecke des Gasstroms und den Seiten der Austrittdüse 24. Dieses Vakuum bewirkt, dass der Gasstrom in alle Richtungen senkrecht zur Fortbewegungsrichtung des Gasstroms nach außen gezogen wird. Die Feinverteilung der Gasströme und der Partikel erfolgt mit anderen Worten seitlich zur Fortbewegungsrichtung der Partikel, die sich von dem Instrument und hin zum Patienten 19 erstreckt. Dadurch wird, wie in Version C von 2 ersichtlich ist, der aus dem Instrument austretende Gasstrom seitlich über einer breiteren Fläche gestreut, wodurch die darin mitgeführten Trägerpartikel 16 über einer breiteren Fläche verteilt werden und ein viel weiter gestreutes Muster der Trägerpartikel erzeugt wird, wie in Version C in 2 gezeigt wird. Die Folge ist, dass die Partikel über einer viel größeren Fläche 25 des Zielorganismus verteilt werden, als dies der Fall wäre, wenn die kegelförmige Austrittdüse nicht so geformt wäre. Dadurch wird das Überdosieren einer kleinen Fläche des Patienten mit Trägerpartikeln vermieden und es wird eine relativ breite und gleichmäßige Verteilung der Trägerpartikel ohne Notwendigkeit einer mechanischen Verteilung der Partikel oder komplizierter Gasumleitungs- oder Gasverteilungsgeräte verwirklicht.
Der exakte Kegelwinkel der kegelförmigen Austrittdüse 24 ist abhängig vom verwendeten Gasdruck und der Größe der Beschleunigungskammer 22 von Ausführung zu Ausführung unterschiedlich. Bei einem Instrument, welches mit einem handelsüblichen Heliumtank betrieben wird, bei dem die Beschleunigungskammer 22 einen Durchmesser von etwa 1,6 mm (1/16 Zoll) hat, liefert eine Austrittdüse, welche über eine Spanne von 8,4 cm (3,3 Zoll) von 1,6 mm (1/16 Zoll) auf 16,9 mm (2/3 Zoll) zuläuft, nachgewiesenermaßen ein zufrieden stellendes Partikelverteilungsmuster mit einem Durchmesser von etwa 1,6 mm (1/16 Zoll) bis zu etwa 16,9 mm (2/3 Zoll), eine Zunahme von dem über 100fachen der Fläche, über die Partikel verteilt werden, mit einer resultierenden Abnahme des über 100fachen der Partikelverteilungsdichte. Für effektives Arbeiten muss die konische Austrittdüse wesentlich länger sein (z.B. 8,4 cm (3,3 Zoll)), als sie an ihrem Anfangs- oder Enddurchmesser ist (z.B. 1,6 mm bis 16,9 mm (1/16 Zoll bis 2/3 Zoll)). Ein konischer Kegel, der breiter als lang ist, bewirkt keine geeignete Streuung der Partikel. Es ist aber nicht erforderlich, dass die kegelförmige Austrittdüse gleichmäßig kegelförmig ist. Die Austrittdüse kann zum Beispiel mehrere kleine gestufte Durchmesserzunahmen an Stelle einer kontinuierlichen Durchmesserzunahme aufweisen, ohne dass ihre Gesamtfunktion nachteilig beeinflusst wird.
Durch Abändern des Drucks des Gases kann die Kraft, mit der die Partikel auf das Ziel 19 auftreffen und sich darin festsetzen, geändert werden. Der Gasdruck muss groß genug sein, um die beschichteten Partikel 16 von der Kartusche 14 zu lösen, darf aber nicht so groß sein, dass das Ziel 19 geschädigt wird. Bei der Zufuhr zu unversehrter Haut eines Tiers hat sich nicht gezeigt, dass ein Gasstrom die Haut schädigt. Bei manchen höheren Gasdrücken tritt eine gewisse geringfügige Rötung der Haut bei sehr tolerierbaren Werten ein. Die Gasdrücke bei im Handel erhältlichen Behältern mit verdichtetem Helium haben sich für das Ablösen der Partikel 16 und das Zuführen der Partikel 16 in die Hautzellen eines Zieltiers, beispielsweise eines Schweins oder einer Maus, als völlig zufrieden stellend erwiesen. Niedrigere Drücke oder höhere Drücke können abhängig von der Dichte der Partikel, der Beschaffenheit der Zielfläche und der erwünschten Tiefe des Eindringens der Partikel in bestimmten Situationen geeignet sein. Die Erfahrung mit Schweinehaut entspricht aufgrund der mechanischen Ähnlichkeit zwischen menschlicher Haut und Schweinehaut der bei menschlicher Haut erwarteten Erfahrung.
Die Partikelkartusche 14 ist vorzugsweise konkav und ist am bevorzugtesten rohrförmig, mit an ihrer Innenfläche aufgebrachten Partikeln, da eine solche Kartusche dann mühelos gehandhabt werden kann, ohne die Trägerpartikel zu berühren. Es sind zwar viele Formen und Geometrien der Partikelkartusche 14 möglich, doch beruht eine einfache und funktionsfähige Version auf der Verwendung eines kurzen Schlauchsegments aus einem reaktionsträgen Material wie Tefzel^®. Der Schlauch bildet einen Zylinder mit einem zylinderförmigen Durchlass durch seine Mitte. Ein Vorteil dieser Rohrform liegt darin, dass die mit dem biologischen Material beschichteten Trägerpartikel nicht die Wände der Vorrichtung kontaminieren können. Ein Vorteil des Materials Tefzel^® liegt darin, dass es transparent ist, was das visuelle Identifizieren der geladenen Kartusche zulässt. Dieses Identifizieren erfolgt anhand des Aussehens der Kartusche, welche erkennbar goldstichig ist oder einen sichtbaren Goldstreifen hat. Der Innendurchmesser der Kartusche muss nur so groß sein, dass darin Partikel gelagert werden können und ein ausreichender Gasstrom durch diesen bei einem für das Ablösen der Partikel ausreichenden Druck zugelassen wird. Die Kartusche 14 muss aber nicht unbedingt rohrförmig sein, sondern könnte jede konkave Form aufweisen, in welcher das mit Druck beaufschlagte Gas eingeschlossen ist, so dass die abgelösten Partikel 16 nicht gestreut werden, sondern vielmehr durch den Gasstrom hin zum Ziel geführt werden. Die Kartusche 14 kann beispielhaft aus einem Halbrohr bestehen, in welchem die Partikel 16 in dem Halbrohr aufgebracht sind und durch eine ebene oder nicht ebene Fläche der Vorrichtung dicht abgedeckt sind, um eine halbzylindrische Bahn zu bilden, durch welche das Gas strömen kann. Dementsprechend sind die Geometrien der Probenkartusche und der umgebenden Kammer, welche durch eine Fläche der Vorrichtung gebildet wird, nicht ausschlaggebend, solange die beiden zusammen den Gasstrom von dem Behälter 12 zu dem Ziel 19 leiten.
Sehr kleine Trägerpartikel 16 aus einem beliebigen biologisch reaktionsträgen Material hoher Dichte sollten zur Verwendung als auf eine Oberfläche der Probenkartusche 14 aufgebrachte Trägerpartikel akzeptabel sein. Die Trägerpartikel 16 sind aus dichtem Material, so dass sie leicht ihren Schwung beibehalten, und sind klein genug bemessen, dass sie gegenüber den Zellen des Organismus, den sie transformieren sollen, klein sind. Es wurde festgestellt, dass Trägerpartikel mit einer Größe von ein paar Mikron in lebende Zellen eindringen können, indem sie deren Zellwände durchdringen, ohne die Überlebensfähigkeit der meisten der lebenden Zellen ungebührlich zu beeinträchtigen. Die Trägerpartikel können mit anderen Worten in lebende Zellen eindringen, ohne diese zu töten, um so das biologische Material an den Partikeln in die Zelle zu befördern.
Gold ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein optimales Material, da es eine hohe Dichte aufweist, sowohl gegenüber biologischen Materialien als auch Oxidation relativ reaktionsträge ist und in Form von Kugeln mit einem Durchmesser von 0,2 bis 3 Mikrometer problemlos verfügbar ist. Kugelförmige Goldpartikel oder Goldperlen in einem Größenbereich von 1 – 3 Mikron wurden erfolgreich eingesetzt, ebenso wie Gold, das als mikrokristallines Pulver mit einem gemessenen Größenbereich von 0,2 bis 3 Mikron verkauft wird.
Es könnte auch Wolfram verwendet werden, das eine Dichte von 19 hat. Iridium, das einen Dichtewert von 22 hat, könnte auch bevorzugt sein, doch wurde Iridium von den Anmeldern nicht verwendet, da es nur als relativ grobes Pulver leicht erhältlich ist. Wolfram ist auch verglichen mit Gold wahrscheinlich weniger wünschenswert, da es an Luft und bei Vorhandensein auch nur von Spuren von Feuchtigkeit zur Oxidation neigt. Eine solche Oxidationsschicht auf den Trägerpartikeln neigt dazu, die Partikel zusammenzubinden, was eine starke Zunahme der durchschnittlichen Partikelgröße verursacht, wenn die Partikel aggregieren. Partikel, die zu unregelmäßige Aggregationen verklumpen, sind für die Umsetzung der vorliegenden Erfindung weniger wünschenswert, da diese Aggregationen in Masse und Größe stark schwanken, was zu Problemen mit dem Erhalt regelmäßig replizierbarer Ergebnisse führt.
In 3 wird eine Seitenansicht einer Ausführung einer Partikelbeschleunigungsvorrichtung 10 gezeigt, welche erfindungsgemäß konstruiert wurde. Die gezeigte Vorrichtung ist von Hand bedienbar und tragbar, so dass sie von einem Experimentator, Techniker oder Kliniker mühelos und einfach gehandhabt und bewegt werden kann.
Unter Hinwendung auf die Einzelheiten der Vorrichtung von 3 umfasst das Gerät einen Handgriff 28, welcher vorzugsweise länglich ist und von jeder geeigneten Form oder Größe sein kann, welche für die Bedürfnisse und den Komfort des jeweiligen Bedieners der Vorrichtung ausgelegt ist. Wie in 3 gezeigt wird, ist der Handgriff 28 in Form eines Pistolengriffs ausgebildet sein, um dem Bediener einen festen Griff und mühelosen Zugang zu einem Ventilauslösemechanismus 30 zu geben.
Durch den Handgriff 28 verläuft ein Einlassschlauch 32, der an beiden Enden offen ist und aus einem festen Material besteht, welches Gas bei den von der Vorrichtung verwendeten Drücken enthalten kann. Somit ist bevorzugt, dass der Einlassschlauch 32 und alle anderen Teile der Vorrichtung (mit Ausnahme der Probenkartusche), die den unter Druck stehenden Gasstrom kontaktieren, aus einem nicht verformbaren festen Material wie Metall, vorzugsweise Messing, oder einem Thermoplast oder Harzmaterial hoher Dichte bestehen. Der Einlassschlauch 32 dient als oben beschriebener Behälter, welcher einen freigebbaren Speicher für genügend Gas bei Betriebsdruck bietet, um eine partikelbeschleunigte Zufuhr zu verwirklichen. Die Maße des Einlassschlauchs 32 sind nicht ausschlaggebend und können größer oder kleiner gehalten werden, um ausreichend Gas unter Druck aufzunehmen. Ein separater, eigens vorgesehener Gasbehälter kann vorgesehen werden, wenn das Volumen in dem Einlassschlauch 32 unzureichend ist.
An einem Ende des Einlassschlauchs 32 befindet sich ein Verbindungsstück 31, das sich mit einer externen Gasquelle 12 verbinden lässt. Die Gasquelle kann ein handelsüblicher Behälter mit biologisch und chemisch reaktionsträgem Druckgas sein. Das reaktionsträge Gas ist vorzugsweise Helium. Der Druck, bei welchem Gas die Gasquelle verlässt, wird vorteilhafterweise durch ein herkömmliches Druckregelventil geregelt und an einem für den Bediener sichtbaren Messgerät angezeigt.
Ein Ventil 34, das das Strömen des Gases von dem Einlassschlauch 32 zu dem länglichen Körper 33 der Vorrichtung 10 regelt, ist an dem gegenüberliegenden Ende des Einlassschlauchs 32 angeschlossen. In der ersten Ausführung von 3 ist das Ventil 34 ein elektrisch betätigtes Magnetventil, das durch einen Ventilauslösemechanismus 30 an dem Handgriff 28 betrieben wird. Die Drähte zwischen dem Ventil 34 und dem Auslösemechanismus 30 sind vorteilhafterweise in dem Handgriff 28 verborgen, um die Sicherheit und Bedienbarkeit der Vorrichtung bei Gebrauch zu verbessern. Die Erfindung ist nicht auf die gezeigte bestimmte Art von Ventil oder einen bestimmten Aktor oder Auslösemechanismus beschränkt. Es sind viele Ventil- und Auslösemechanismuskombinationen bekannt, die von einem Durchschnittsfachmann an Stelle der hierin gezeigten Kombination eingesetzt werden können, wie sie durch die nachstehend beschriebene zweite Ausführung veranschaulicht wird. Viele Ventil- und Aktor-Kombinationen sind geeignet, solange der Ventilkolben und der Ventilköper dem Druck des aus dem Einlassschlauch 32 eindringenden Gasstroms standhalten kann.
Der Fluidauslass des Ventils 34 steht in Fluidverbindung mit einer Kartuschenhalterung 36. In einer bevorzugten Ausführung, die das schnelle Probennachladen erleichtert, wird eine Mehrfachkartuschenhalterung 36 an die Hand gegeben. Um die Anzahl an Proben zu maximieren, die vor dem Betrieb des Geräts in einem einzigen Schritt vorgeladen werden können, ist die Mehrtachkartuschenhalterung zylinderförmig. Eine Vorderansicht der zylinderförmigen Kartuschenhalterung 36 wird in 4 gezeigt. Mehrere Kartuschenkammern 38, die jeweils so bemessen sind, dass sie eine Partikelkartusche 14 aufnehmen, sind kreisförmig bei einem festen Abstand entlang der Radien der zylinderförmigen Halterung so angeordnet, dass eine Kartuschenkammer 38 während jeder Zufuhr im Gasstrom positioniert werden kann. Die Halterung 36 dreht sich um 360° um ihre radiale Achse. Mehrere Rasten 40 am Umfang der Kartuschenhalterung 36 greifen mit einer Noppe, um jede Position zu bestimmen, in der sich eine Kammer 36 in der Strecke des Gases befindet. Die Noppe kann durch Vorsehen eines federbelasteten Vorsprungs 42 durch den Körper 33 vorgesehen werden, um die Noppe an der Kartuschenhalterung einzurücken. Die Kartuschenhalterung 36 könnte andere Formen annehmen, wobei sie abhängig von den Anforderungen des Bedieners mehr oder weniger Proben aufnimmt. Die Probenhalterung 36 muss nicht wie dargestellt zylinderförmig sein, sondern könnte eine lineare Anordnung von Probenkartuschen sein, die in Position bewegt werden können, um den durch das Ventil 34 tretenden Gasstrom aufzunehmen.
Eine hohle Partikelbeschleunigungskammer 44 in dem Körper 33 bietet dem Partikel befördernden Gasstrom eine Bahn hin zu dem Ziel. Die Kammer 44 wurde mit einem Durchmesser von 1,6 mm (1/16 Zoll) konstruiert und ist 12 bis 15 mm lang. Wenn die Kammer 44 zu lang ist, wird der Gasstrom reibungsbedingt langsamer. Wie in dem frei geschnittenen Teil von 3 aufgezeigt wird, nimmt der Durchmesser der hohlen Kammer 44 an ihrem distalen Ende zu, um eine Austrittdüse 46 zu bilden, die eine ausreichende Streuung von im Gasstrom mitgeführten beschichteten Partikeln erlaubt. An dem distalen Ende der Partikelbeschleunigungskammer 44 ist jenseits der Austrittdüse 46 ein Abstandhalter 48 angebracht, der dem Bediener das Einstellen eines festen Abstands zwischen der Vorrichtung 10 und dem Ziel ermöglicht. Der geeignete Abstand kann anhand empirischer Beobachtungen des Aussehens der Zielzellen und des Ausmaßes der Genexpression nach Zufuhr ermittelt und nach Bedarf festgelegt werden. Es wurde für Säugetierhaut festgestellt, dass ein Abstandshalter von 19 mm bis 25 mm (3/4 – 1 Zoll) gute Dienste leistet. Es wurde festgestellt, dass das Polieren der Innenfläche der Kammer 44 eine vorteilhafte Wirkung auf den Betrieb des Geräts 10 hat. Dies kann durch Auftragen einer Polierverbindung auf eine Schnur oder einen Pfeifenreiniger und dessen Verwenden zum Polieren des Inneren der Kammer 44 erfolgen. Das reduziert Reibungswiderstand und Wechselwirkung mit den Seiten der Kammer 44 und erleichtert dadurch ein Strömen der Trägerpartikel hin zu dem geplanten Ziel. Die Austrittdüse 46 kann ähnlich poliert werden. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, den Bereich zu beschränken, durch welchen das Gas nach dem Ventil 34 strömt, bevor es den Anfang der Kammer 44 erreicht, indem der Raum mit einem geeigneten Abstandshalter gefüllt wird, wie nachstehend eingehender unter Bezug auf die Ausführung von 7 veranschaulicht wird.
Es kann eine große Anzahl brauchbarer Probenkartuschen 14, die in 5 gezeigt werden und beschichtete Partikel 16 tragen, in einem einzigen Vorgang wie folgt in einer Reihe von verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Es wurden zwei verschiedene Verfahren erfolgreich verwendet.
Bei dem ersten Verfahren wird eine Suspension aus mit biologischen Materialien beschichteten Partikeln, die in einer auf dem Gebiet bekannten Weise erzeugt wird, in ein Stück Kunststoffschlauch eingebracht, und man lässt die Partikel unter der Schwerkraft auf den Boden der Schlauchinnenfläche absetzen. Nachdem sich die Partikel gesetzt haben, wobei sie entlang der ganzen Länge des Schlauchs ein Partikelband bilden, wird die Flüssigkeit aus dem Schlauch abgelassen und der Schlauch wird gedreht, um die Kugeln über der Innenfläche zu verteilen, während sie unter Stickstoff getrocknet werden. Dann wird der Schlauch in Stücke geschnitten, die für das Einführen in die Probenkammern der Zufuhrvorrichtung geeignet sind. Ein Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass die Anzahl beschichteter Partikel, die für den Transfer verfügbar sind, durch Verändern der Konzentration der Partikelsuspension oder der Verändern der Länge des zur Bildung einer Kartusche verwendeten Schlauchs verändert werden kann. Er wird auch erkennen, dass die in der vorliegenden Erfind brauchbaren Probenkartuschen in anderer Weise als gerade beschrieben hergestellt werden können. Ein Durchschnittsfachmann ist mit anderen Möglichkeiten der ablösbaren Anbringung von probenbeschichteten Partikeln an einer Oberfläche vertraut.
Ein zweites Verfahren nützt eine leicht Klebstoffwirkung, um die Trägerpartikel 16 in der Trägerpatrone 14 zu befestigen. Es hat sich gezeigt, dass ein solcher leichter Klebstoff dazu beträgt sicherzustellen, dass die Partikel gut beschleunigt werden, indem er sie vorübergehend an der konkaven Innenfläche der Kartusche haften lässt, bis der Gasstrom seinen vollen Druck erreicht. Um dies zu verwirklichen, wird ein Zusatz verwendet, wenn die Partikel in Alkohol suspendiert sind. Zusätze, die nur leicht klebend sind und die erfolgreich verwendet wurden, sind Polyvinylpyrrolidon (PVP), Cholesterin, Glycerin und Wasser. Cholesterin wird zum Beispiel bei einem Verhältnis von 1 mg Cholesterin pro ml Alkohol in der Suspension verwendet. Die Suspension aus Partikeln/Alkohol wird mit Ultraschall behandelt, um die Suspension zu unterstützen, dann wird die Suspension einfach in die Kartusche 14 gegeben, welche auf ihre Seite gelegt wird. Die Trägerpartikel fallen entlang einer Seite der Innenfläche der Kartusche schnell aus der Suspension. Der Alkohol kann dann entfernt und das Innere der Kartusche mit einem Stickstoffstrom getrocknet werden, während der Schlauch gedreht wird.
In 7 und 8 wird eine andere Ausführung einer Partikelbeschleunigungsvorrichtung gezeigt, welche erfindungsgemäß konstruiert wurde. Bei der Vorrichtung 110 von 7 und 8 wurden Elementen, die eine ähnliche oder entsprechende Funktion wie die in der Ausführung von 3 haben, ähnliche Bezugszeichen zugewiesen, aber mit dem Zusatz 100. Der Griff 128 und der Auslösemechanismus 130 der Ausführung von 7 sind zum Beispiel genau wie der Griff 28 und der Auslösemechanismus 30 der Ausführung von 3 dargestellt. In der Vorrichtung 110 von 7 wird das Ventil 134 für das Freigeben des Gasstoßes durch ein Fluidbetätigungssystem betrieben, das aus dem in der oben beschriebenen Ausführung verwendeten Magnetventil adaptiert wurde. Das Ventil 134 ist mit dem Auslösemechanismus 130 durch eine Fluidleitung 160 verbunden.
In der auseinander gezogen dargestellten Ansicht von 8 sind zusätzliche innere Komponenten der Vorrichtung von 7 sichtbar. Ein Ventilelement 151 ist in das Ende des Gehäuses des Ventils 134 einschraubbar. Das Ventilelement umfasst ein Gewindefitting 152, von dem sich eine federbelastete Vorspannwelle 154 erstreckt, an deren Ende ein Ventilelement 156 angebracht ist. Ein Kapillar- oder Heliumsablassrohr 158, das eine Öffnung von etwa 50 Mikron hat, erstreckt sich über das Ventil 134, um ein kontinuierliches schwaches Ablassen von Heliumgas durch die Vorrichtung 110 vorzusehen. Ein Rohr 160 verbindet die linke Seite des Ventils 134 mit einem Aktorblock 162. Ein Auslösemechanismus/Kolben 164 ist in dem Aktorblock 162 aufgenommen. Ein Abstandshalter 166 und ein Fitting 168 dienen der Verbindung des Ventils 134 mit dem zylinderförmigen Körper 133. Der Abstandshalter hat einen Innendurchlass von etwa 0,63 mm (1/4 Zoll), um das Volumen zu beschränken, in das das Gas nach dem Ventil 134 strömt. An dem Punkt, an dem der Gasdurchlass in den Körper 133 mündet, ist ein Einlasspunkt von etwa 2,794 mm (0,11 Zoll) vorgesehen, so dass expandierendes Gas beschleunigt, wenn es durch die Kartuschenhalterung 136 tritt. Der Körper 133 und die Kartuschenhalterung 133 sind ansonsten ähnlich zu denen der Ausführung von 3, außer dass die Kartuschenhalterung 136 an der oberen Seite des Körpers 133, nicht an dessen unterer Seite angeordnet ist.
Die Einzelheiten des Ventils 134 werden in 9 gezeigt. Ein Einlassgasrohr 132 ähnlich dem Einlassgasrohr 32 der ersten Ausführung verbindet mit dem unteren Teil des Ventils und liefert eingeleitetes druckbeaufschlagtes Gas. Wenn das Ventil 134 sich in seinem normalerweise geschlossenen Zustand befindet, ruht das Ventilelement 156, wobei es an einem konisch zulaufenden Ventilsitz ruht, der bei 170 gezeigt wird. Die Bohrung des Inneren de Ventils 134 ist ein Zylinder 172, der eng an das Ventilelement 156 angepasst ist, aber nicht in fluiddichter Berührung mit diesem steht. Wie in 9 ersichtlich ist, verbindet das Rohr 160 an der Kammer links des Ventilelements 156 mit dem Ventil 134.
In 10 werden weitere Einzelheiten des Aktors 162 gezeigt. Eine Welle 174, die sich nur zur Vorderseite des Aktorblocks 162 öffnet, erstreckt sich horizontal in den Aktorblock 162. Drei vertikale Bohrungen 176, 178 und 180 sind so ausgebildet, dass sie sich von der Oberseite des Aktorblocks und in Fluidverbindung mit der Welle 174 nach unten erstrecken. Der obere Teil der Bohrung 176 ist so bemessen, dass sie das andere Ende des Rohrs aufnimmt, während die Wellen 178 und 180 klein sind und einfach zur Umgebungsluft hin öffnen. Ein Haltestift 182 erstreckt sich in das geschlossene Ende der Welle 174, um die Bewegung des Auslösekolbens 164 zu beschränken, und der Haltestift umfasst eine Feder zum Vorspannen des Kolbens in seine Ruhestellung, wie in 10 gezeigt wird. Der Kolben 164 ist eine längliche Welle mit zwei an ihm angeordneten O-Ringen, die gegen das Innere der Welle 174 abdichten. Eine Wellenverlängerung 186 verbindet den tatsächlichen Auslöserknopf am Ende des Kolbens 164 mit der länglichen Welle in der Welle 174.
Bei Betrieb der Vorrichtung 110 ist der Einlass 131 mit der Zufuhr von Hochdruckgas, vorzugsweise Helium, verbunden. Das Kapillarrohr 158 erlaubt ein geringfügiges schwaches Lecken oder Austreten von Helium über dem Ventil 134 und in das Innere des Körpers 133, um Helium in die Austrittdüse 146 zu fluten. Dies erfolgt, damit Helium das vorherrschende Gas in der Austrittdüse 146 und zwischen der Austrittdüse und dem Ziel ist, noch bevor das Gerät betrieben wird. Helium bietet in diesem Bereich einen geringeren Reibungswiderstand gegenüber dem Trägerpartikelstrom und einen einheitlicheren Betrieb der Vorrichtung 110.
Das Ventilelement 156 sitzt normalerweise an dem Ventilsitz 170, wie in 9 gezeigt wird. Das gesamte Innere des Ventils 134 ist durch das Rohr 160 mit der vertikalen Bohrung 176 in dem Aktorblock 162 verbunden. Solange der Kolben 164 sich an seiner in 10 gezeigten Position befindet, wird das untere Ende der Bohrung 176 durch die O-Ringe 184 abgedichtet und es geht durch diese Strecke kein Gas verloren. Wenn der Auslösemechanismus/Kolben 164 vom Bediener gegen die Kraft der Feder an dem Haltestift 182 niedergedrückt wird, treten die O-Ringe zur linken Seite des unteren Teils der Bohrung 176. Dies lässt das Gas in der Bohrung 176 durch die Bohrung 180 an die Atmosphäre austreten. Dieses Ablassen hat die Wirkung einer Druckminderung an der linken Seite des Ventilelements 156. Die Wände der Kammer 172 verhindern einen uneingeschränkten Fluidstrom zur linken Seite des Ventils 134 und somit ist der Druck an der rechten Seite des Ventilelements 156 größer als an der linken Seite. Die Feder 154 wird so gewählt, dass dieses Druckdifferential ausreicht, um das Drücken des Ventilelements 156 in 9 nach links zu bewirken, und das Ventilelement 156 löst sich vom Ventilsitz 170, wodurch der Strom von Hochdruckgas durch die Kartusche und in den Körper 133 geöffnet wird. Dieser Zustand hält solange an, bis der Auslösemechanismus freigegeben wird, woraufhin der Auslösemechanismus/Kolben 164 zu seiner in 10 gezeigten Stellung zurückgeführt wird, die den unteren Teil der Bohrung 176 abdichtet. Dadurch kann sich der hohe Druck an der linken Seite des Ventils 134 wieder einstellen und das Ventilelement 156 sitzt wieder am Ventilsitz 170 an, um den Gasstrom durch das Ventil 134 zu verschließen.
Nach dem Ventil 134 bewahrt die Vorrichtung einen relativ konstanten Bereich für die Gasstromeinheit bis zur Verengung vor dem Eindringen in den Kartuschenträger. Der Abstandshalter 166 soll den übrigen Raum zwischen dem Fitting 168 und dem Ventilsitz 170 mit Ausnahme einer mittleren Bohrung durch den Abstandshalter 166, deren Durchmesser in etwa gleich dem Durchmesser der Bohrung durch den Körper 133 ist, füllen. Das Konzept besteht darin, die Fläche für die Gasexpansion auf eine Bohrung von 6,9 mm (1/4 Zoll) zu beschränken, bis sie die 2,8 mm (0,11 Zoll) große Einlassöffnung für die Kartuschenhalterung erreicht.
Es gibt Anhaltspunkte, die darauf hinweisen, dass ein am in 7 rechten Ende des Abgabeende der Vorrichtung 110 angebrachter Diffuser zur Effizienz der Genzufuhr beiträgt. In 11 werden zwei solche Diffuser bei 190 und 191 gezeigt. Jeder Diffuser umfasst einen ringförmigen Ring und jeweils ein mittig angeordnetes Sieb 192 bzw. 193, das jeweils durch Drähte 194 bzw. 195 abgehängt ist. Der Diffuser dient zur gezielten Beseitigung eines Teils der Perlen aus der Mitte des Musters, um eine noch gleichmäßigere Verteilung der Trägerpartikel in der Zielfläche zu bewirken.
Die hierin beschriebene Vorrichtung wird vorteilhafterweise für Massenimpfungen von Menschen oder Haustieren unter Verwendung eines genetischen Impfstoffs verwendet. Genetische Impfstoffe werden aus genetischem Material, für gewöhnlich DNA, welche aus einem pathogenen Stoff gewonnen wird und dann in lebende Zellen eines Organismus mit Hilfe einer Vorrichtung, wie sie hier beschrieben werden, zugeführt wird, gebildet. Sobald es sich in der Zelle befindet, wird das genetische Material durch die zelluläre Transkription und Translationsmaschinerie ausgedrückt, um ein Protein oder Peptid zu erzeugen, welches in dem Organismus eine Immunreaktion auslöst, die das Tier oder die Person gegenüber einer späteren Infektion durch den Stoff, aus welchem der Impfstoff gewonnen wurde, resistent macht. Diese Vorrichtung kann auch für die Gentherapie verwendet werden, wobei Gene eingeschleust werden, die in dem Organismus fehlen, aber von diesem benötigt werden. Alternativ kann es möglich sein, dieses genetische Material stabil in dem genetischen Material eines erbgutgeschädigten Organismus zu integrieren und dadurch den Erbgutschaden zumindest in bestimmten somatischen Zellen zu korrigieren.
Zwar wurde die Vorrichtung soweit für ihre Eignung bei wiederholter Verabreichung von genetischen Impfstoffen in großem Maßstab entwickelt, doch kann sie auch in gleicher Weise verwendet werden, wie bisherige Partikelbeschleunigungsvorrichtung bei Einmalverabreichungsverfahren verwendet werden, einschließlich aber nicht ausschließlich für den Transfer genetischen Materials in die Organe, Gewebe und gezüchteten Zellen von Pflanzen und Tieren. Die Vorrichtung wurde erfolgreich zur Einschleusung von Genen in die Meristeme von lebenden Pflanzen zur Schaffung transgener Pflanzen verwendet. Alle Vorteile dieser Vorrichtung, insbesondere ihre Tragbarkeit und einfache Probenhandhabung, kommen gleichermaßen zum Tragen, wenn die Vorrichtung für die Einmalzufuhr eines Gens durch Partikelbeschleunigung verwendet wird. Das Prinzip der Erfindung kann aber auch in eine stationäre, nicht tragbare Einheit integriert werden, um erhebliche Vorteile bei Geschwindigkeit, Reproduzierbarkeit und Komfort zu verwirklichen.
BEISPIEL
1. Plasmid
Bei Plasmid pWRG1602, das durch die Plasmidkarte von 5 veranschaulicht wird, leitet der unmittelbare frühe hCMV-Promotor die Expression eines Genes eines menschlichen Wachstumshormons (hGH). Die hGH-Hüllensequenz ist in einem Xbal-EcoRI-Fragment von etwa 2,2 kbp enthalten, das selbst von Plasmid-pGH erhalten wurde (erhältlich bei Nichols Institute). Der in 5 EMBO J. 1367–1371 (1986) beschriebene unmittelbare frühe hCMV-Promotor ist in einem AccII-Fragment mit 619 Basenpaaren enthalten, das den Bereich von 522 Basenpaaren stromaufwärts bis zu 96 Basenpaaren stromabwärts des unmittelbaren frühen CMV-Transkriptioninitiationsorts umschließt. Plasmid-DNA wurde mit Hilfe standardmäßiger molekularbiologischer Verfahren erzeugt.
2. Herstellung DNA-beschichteter Partikel
Dann wurden Kopien des pWRG1602-Plasmids auf Trägerpartikel aus Gold aufgebracht. Dies erfolgte durch Mischen von 26 mg gefälltem Goldpulver (0,95 Mikron Durchschnittsdurchmesser) mit 200 μl 0,1 M Spermidin in 25 μg DNA. Das Verhältnis von DNA zu Gold betrug 2,5 μg DNA pro mg Gold. Dann wurden dem Gemisch 200 μl einer 2,5 M Calciumchloridlösung unter ständigem Rühren zugegeben, woraufhin die Probe weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde, um ein Fällen der DNA auf die Trägerpartikel zu ermöglichen. Das Gemisch wurde 3 Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um die Trägerpartikel mit der DNA darauf zu konzentrieren, woraufhin die Trägerpartikel vorsichtig mit Ethanol gewaschen und in 3 ml Ethanol in einem verschlossenen Glasfläschchen wieder suspendiert wurden. Die erneute Suspension der Trägerpartikel in dem Ethanol wurde durch Eintauchen des Glasfläschchens in ein beschallendes Wasserbad über mehrere Sekunden unterstützt.
3. Einschleusen beschichteter Partikel in tierisches Gewebe
Anästhetisierte Mäuse wurden kurz geschoren, um das meiste Fell von der Zielstelle zu entfernen. Die Transformationen wurden an dieser entblößten Stelle des Tiers durchgeführt.
Bereits vorbereitete Probenkartuschen wurden für Labortests in die erfindungsgemäße Vorrichtung geladen. In einem ersten Test wurde das Druckgas bei verschiedenen Drücken zugeführt, um die Wirkung des Gasdrucks auf die Genzufuhr zu ermitteln. Zur Prüfung der Wirksamkeit der Vorgehen wurde die Zielhaut 24 Stunden nach der Behandlung entfernt und homogenisiert. Der Wert an menschlichem Wachstumshormon (hGH) in jeder Probe wurde mit Hilfe eines handelsüblichen Assay auf ELISA-Basis für hGH quantifiziert. Tabelle 1 zeigt die ungefähre Menge menschlichen Wachstumshormons (hGH), die von den transformierten Zellen in der Mäuseepidermis pro Zufuhrstelle erzeugt wurde.
Tabelle 1
In einem Experiment, das zur Messung der hGH-Proteinexpression ausgelegt war, wurde eine weitere wie beschrieben hergestellte pWRG1602-Probenkartusche in die Vorrichtung geladen und die darauf aufgebrachten Partikel wurden in vivo in eine chirurgisch freigelegte Mausleber bei 34,5 bar (500 psi) eingeschleust. Als die Leber und das Serum 24 Stunden nach Einschleusung untersucht wurden, wiesen beide hohe hGH-Werte auf, jeweils das drei- und zweifache über den Hintergrundwerten.
Ein Satz Probenkartuschen, der insgesamt etwa 0,5 Milligramm Gold und DNA pro Kartusche enthielt, wurde hergestellt. Diese Kartuschen wurden in die Vorrichtung geladen und die Partikel wurden bei verschiedenen Drücken in die Epidermis eines anästhesierten Schweins eingeschleust. Vor der Zufuhr der Partikel wurde keine Vorbehandlung der Haut vorgenommen. 24 Stunden nach der Behandlung wurden die behandelten Hautstellen entfernt und mit Hilfe des ELISA-Assay auf hGH geprüft. Bei 44,8 bar (650 psi) wiesen mehrere Stellen ein Erythema an den Zufuhrstellen auf. An der einen Stelle, die das geringste Erythema aufwies, wurden 937 ng hGH festgestellt. Bei 55,1 bar (800 psi) wiesen die meisten Stellen Erythema auf; in der Stelle, die das geringste Erythema aufwies, wurden 412 ng hGH festgestellt. Bei 75,8 bar (1.100 psi) wurde an keiner Zufuhrstelle hGH festgestellt und alle wiesen an dieser Zufuhrstelle ein signifikantes Erythema auf.

Claims

Kartusche (14) zur Verwendung in einem mit Druckgas betriebenen Genzufuhrinstrument, wobei die Kartusche (14) umfasst: einen Körper mit einem in dessen Inneren ausgebildeten bogenförmigen, geradlinigen Durchgang und eine Ablagerung von mit genetischem Material beschichteten Trägerpartikeln (16), welche in dem Durchgang in der Kartusche (14) so abgelagert sind, dass die Partikel (16) durch einen Strom entspannenden Gases, welcher den Durchgang passiert, abgelöst werden können, wobei die Kartusche (14) durch einen Bediener manuell handhabbar ist, ohne dass der Bediener die an der Kartusche abgelagerten Trägerpartikel (16) berühren muss.
Kartusche nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Körper ein zylindrischer, starrer, rohrförmiger Körper ist und der Durchgang ein zylindrischer Durchgang ist.
Kartusche nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerpartikel (16) Goldpartikel sind.
Kartusche nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerpartikel (16) in dem Durchgang in einem mit der Achse des Durchgangs ausgerichteten geradlinigen Muster abgelagert sind.
Kartusche (14) nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einer Kartuschenhalterung (36; 136).
Kombination nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kartuschenhalterung mehrere Kartuschenkammern (38) umfasst, wovon jede eine Kartusche (14) aufnehmen und halten kann, wobei die Kartusche in einer der Kammern aufgenommen und gehalten wird.
Kombination nach Anspruch 6, wobei zwölf Kartuschenkammern (38) in der Kartuschenhalterung vorgesehen sind.
Kombination nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kartuschenhalterung eine Rotationsachse aufweist und die mehreren Kartuschenkammern (38) jeweils bei gleichem Abstand von der Rotationsachse angeordnet sind.
Kombination nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die mehreren Kartuschenkammern (38) um die Rotationsachse gleichmäßig voneinander beabstandet sind.
Kombination nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mehreren Kartuschenkammern (38) geradlinig angeordnet sind.
Kombination nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kartuschenhalterung mehrere Rasten (40) für das Einrücken mit einer Noppe (42; 142) an dem Genzufuhrinstrument umfasst, um jeweils die Position zu bestimmen, in welcher sich eine Kartuschenkammer (38) in der Strecke des Gases befindet.
Genzufuhrinstrument, welches die Kartusche (14) nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Genzufuhrinstrument, welches die Kartuschenhalterung (36) und die Kartuschen (14)-Kombination nach einem der Ansprüche 5 bis 11 umfasst.
Genzufuhrinstrument nach Anspruch 13, welches weiterhin eine Noppe (42; 142) für das Einrücken mit der oder mit mehreren Rasten (40) an der Kartuschenhalterung (38) umfasst.
Genzufuhrinstrument nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Noppe (42; 142) auf eine Raste (40) zu federbelastet ist.
Genzufuhrinstrument nach einem der Ansprüche 13, 14 oder 15, welches weiterhin umfasst: einen Körper (33; 133) mit einem darin ausgebildeten und sich an einem Ende desselben öffnenden Partikelbeschleunigungsdurchgang (22, 44; 144); und ein Ventil (18; 34; 134), welches zur Verbindung mit einer Quelle von Druckgas (12) ausgelegt ist, um zur Bildung eines beschleunigenden Gasstroms gezielt Druckgas in den Partikelbeschleunigungsdurchgang einzulassen; wobei der Körper eine im Wesentlichen kegelförmige Austrittdüse (24; 46; 146) an der Öffnung des Partikelbeschleunigungsdurchgangs von dem Körper umfasst, die kegelförmige Gestalt der kegelförmigen Austrittdüse solcher Art ist, dass der Konus der Austrittdüse in Richtung des Gasstroms länger ist, als er in Richtung senkrecht zum Gasstrom breit ist, wobei die kegelförmige Gestalt bei Einsatz den aus dem Körper austretenden Gasstrom veranlasst, sich nach außen zu weiten, um so die Trägerpartikel über eine breitere Fläche zu verteilen als bei einer nicht kegelförmigen Austrittdüse; wobei die Kartuschenhalterung (36; 136) so angeordnet ist, dass sich in dem Partikelbeschleunigungsdurchgang eine Patronenkammer (38) befindet.
Verfahren zur Herstellung einer Kartusche, wobei die Kartusche die in einem der Ansprüche 1 bis 4 dargelegte Konstruktion aufweist, wobei das Verfahren umfasst: Suspendieren der mit dem genetischen Material beschichteten Partikel in einer Suspensionsflüssigkeit; Einbringen der Partikelsuspension in ein Stück Schlauch; und Entfernen der Suspensionsflüssigkeit aus dem Schlauch, um die Partikel in dem Schlauch abgelagert zu lassen.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel sich vor dem Schritt des Entfernens unter der Schwerkraft am Boden der Schlauchinnenfläche absetzen dürfen.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, welches weiterhin das Drehen des Schlauchs nach dem Schritt des Einbringens umfasst, um die Partikel über der Innenfläche des Schlauchs zu verteilen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Entfernens der Suspensionsflüssigkeit das Ablassen der Flüssigkeit umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Entfernens der Suspensionsflüssigkeit das Trocknen des Inneren des Schlauchs mit Stickstoff umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, welches weiterhin das Schneiden des Schlauchstücks in kürzere Stücke umfasst, welche für das Einsetzen in die Kartuschenkammern (38) einer Kurtuschenhalterung (36) geeignet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikelsuspension einen schwach klebenden Zusatz enthält, um die Partikel schwach an der Innenfläche des Schlauchs haften zu lassen.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusatz aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylpyrrolidon (PVP), Cholesterin, Glycerin und Wasser gewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspensionsflüssigkeit Alkohol ist.