DE69534347T2

DE69534347T2 - Bibliotheken aus Polyklonalen Antikörpern

Info

Publication number: DE69534347T2
Application number: DE69534347T
Authority: DE
Inventors: Jacqueline Sharon
Original assignee: Boston University
Current assignee: Boston University
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2015-01-28
Also published as: WO1995020401A1; US6335163B1; AU1736495A; DE69531148T2; EP0744958B1; ES2201097T3; EP1231268B1; ES2247204T3; EP1231268A3; EP0744958A4; EP0744958A1; PT744958E; EP1231268A2; DK0744958T3; DK1231268T3; ATE243745T1; DE69531148D1; DE69534347D1; US5789208A; ATE300610T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung, Interkonversion und Anwendung von Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern, Zelloberflächenrezeptoren und anderen Proteinen mit variablen Regionen. Diese variablen Regionen werden verknüpft, in Expressionsvektoren cloniert, die wie gewünscht bereitgehalten, selektiert und amplifiziert werden können, und die Bibliotheken oder Sub-Bibliotheken von variablen Regionen werden ohne Verlust von Gesamtdiversität oder -komplexität in andere Expressionsvektoren transferiert. Die so erhaltenen Bibliotheken von variablen Regionen und Bibliotheken von Gesamtproteinen können zur Behandlung, Vorbeugung oder Diagnose spezifischer Krankheiten und Störungen, darunter Neoplasien, Bösartigkeiten, Infektionen und genetische Defekte und Defizite verwendet werden.
Lymphocyten bilden etwa 20% der Blut-Leukocyten und sind der Hauptbestandteil des Antigen-Erkennungssystems der Säuger, wobei sie vorwiegend in zwei Formen, nämlich B-Zellen und T-Zellen vorkommen. T-Zellen differenzieren in der Thymusdrüse und möglicherweise in anderen Geweben in cytotoxische Zellen (T_C), Helfer-Zellen (T_H) und Suppressor-Zellen (T_S). Diese T-Zellen erkennen fremdes Antigen in Verbindung mit dem Haupt-Histokompatibilitätskomplex-(MHC)-Antigen über einen spezifischen T-Zellen-Rezeptor (TcR). Dieser Rezeptor ist hochgradig polymorph und clonal verteilt. Der typische TcR ist ein Disulfidverbundenes Heterodimer, das aus einem α- und einem β-Polypeptid besteht, und auf der Oberfläche von reifen T-Zellen exprimiert wird. Die beiden Ketten sind von ähnlicher Größe und besitzen einen Transmembranabschnitt, der von einer konstanten Region und einer polymorphen variablen Region, die beträchtliche strukturelle Homologie zu Immunglobulinen aufweist, eingeschlossen ist. Jede variable Region wird von einem variablen Segment (V), einem Verbindungssegment (J) und einem Diversitätssegment (D; nur β-Ketten), die in die polymorphe Region eingegliedert sind. Eine solche Diversität ist für die T-Zellen nötig, um auf eine große Vielfalt von Antigenen reagieren zu können.
B-Zellen differenzieren im Knochenmark adulter Säuger, indem sie sich von Vorläufer-B-Zellen zu antikörperproduzierenden Plasmazellen entwickeln. Die Bedeutung von B-Zellen für das Immunsystem wird durch jene seltenen Immunschwächekrankheiten unterstrichen, bei denen der Patient nur durch wiederholte Gammaglobulin-Injektionen überleben kann. Einer der faszinierenden Aspekte von B-Zellen ist die Heterogenität ihrer Antikörper-Expression. Nach Beobachtungen wurde geschätzt, daß nicht mehr als zwei von 10⁸ verschiedenen Antikörper identisch sind. Kein Wunder, daß die für solche Diversität verantwortlichen Mechanismen noch nicht vollständig erforscht sind. Antikörper und TcRs, die beide konstante und variable Region haben, zählen zur sogenannten Immunglobulin-Überfamilie.
Der Prozeß der Immunglobulin-Expression wird durch die Aktivierung von ruhenden B-Zellen gestartet. Im T-Zellen-unabhängigen Reaktionsweg bindet Mitogen an die Oberflächenrezeptoren von B-Zellen und stimuliert die Expression von IgM-Monomeren von ziemlich niedriger Affinität. Bei der Erkennung von fremdem Antigen kreuzverbinden sich diese IgM-Monomere an der Zelloberfläche und werden in die Zelle eingeschleust. Dann schaltet die Antikörperexpression auf die Transkription und Translation von IgG, IgE, IgA oder pentamerem IgM um. Beim T-Zellen-abhängigen Reaktionsweg ist wiederum Mitogen erforderlich, um die ruhende B-Zelle zu stimulieren, jedoch wird das Antigen nach der Einschleusung innerhalb der Zelle verarbeitet, um dann wieder assoziiert mit MHC-Molekülen der Klasse II auf der Zelloberfläche aufzutauchen. Wie eine Antigenpräsentierende Zelle (APC), werden Antigen-MHC-Komplexe erkannt und stimulieren die Aktivierung der T-Zellen und Produktion einer Anzahl von löslichen T- und B-Zell-Vermittlern. Die von diesen Oberflächenkomplexen empfangene Information wird über Second-Messenger zum Zellkern der B-Zellen übertragen, was neben anderen Auswirkungen zu einem erhöhten zyklischen Nucleotidstoffwechsel und einer Proteinkinase C-Aktivität führt. Sowohl im T-Zellen-abhängigen als auch im T-Zellen-unabhängigen Reaktionsweg entwickeln sich die B-Zellen zu funktionell reifen, antikörperproduzierenden Zellen
Antikörper sind bifunktionelle Moleküle, die zwei schwere (H) und zwei leichte (L) Ketten umfassen, die mit Zwischenketten-Disulfidbindungen verbunden sind. Jede Kette enthält Konstante (C) und variable (V) Regionen, die in Domänen mit den Bezeichnungen C_H1, C_H2, C_H3 und V_H, und C_L und V_L aufgeteilt werden können. IgM existiert als Zelloberflächen-Monomer oder zirkulierendes Pentamer, das von einem als J-Kette bezeichneten 137-Aminosäuren-Peptid zusammengehalten wird. Auch die IgA-Moleküle zirkulieren, jedoch in Paaren, die mit J-Ketten verbunden sind und eine kleine sekretorische Komponente (SC) enthalten, die am Transport durch die epithelialen Membranen beteiligt ist. Der Antikörper bindet über die Domänen der variablen Region, die im Fab-Abschnitt enthalten sind, an das Antigen und interagiert nach der Bindung mit dem Rest des Immunsystems durch die Effektorfunktionen der Domäne der konstanten Region, hauptsächlich durch den Fc-Abschnitt. Die Effektorfunktionen beinhalten die Aktivierung der Komplementierungskaskade, die Interaktion mit Effektorzellen, wie Lymphocyten, und die Kompartimentierung von Immunglobulinen. Auch von den konstanten Regionen nimmt man an, daß sie die Stabilität der verschiedenen Immunglobuline beeinflussen. IgG zum Beispiel ist relativ stabil, mit einer Zirkulations-Halblebensdauer von etwa 23 Tagen. IgG ist auch der Immunglobulin-Responder, der mit der sekundären Immunantwort verbunden ist. Dieses Immunglobulin bindet durch die klassische Komplementierungskaskade Komplement und hat die Fähigkeit, Macrophagen und Neutrophile zu rekrutieren. Pentameres IgM ist ein anderer sehr starker Aktivator der klassischen Komplementierungskaskade, und es hat eine Serum-Halblebensdauer von etwa fünf Tagen. IgA hat eine Serum-Halblebensdauer von fünf bis sechs Tagen, aktiviert Komplement durch den alternativen Reaktionsweg und ist der wichtigste Antikörper in Schleimsekreten.
Die antigenbindenden Domänen, die variablen Regionen, werden von den Genen der variablen Regionen codiert, die etwas verstreut im Genom liegen, und die durch einen „somatische Rekombination" genannten Vorgang zusammengebracht werden müssen. Bei diesem Vorgang werden die V-, D- und die (nicht mit der J-Kette verwandten) J-Segmente des Wirtsgenoms zusammengebracht, so daß sie eine Genregion bilden. Diese Region wird mit der mRNA, die die Domäne der konstanten Region des Antikörpers codiert, gespleißt und so zusammen als Polypeptid und letztlich als Antikörpermolekül exprimiert.
Konstante Antikörperregionen sind die bestimmenden Hauptmerkmale der Antikörperklasse sowohl für die schweren als auch für die leichten Ketten, und sie werden von etwa 15 verschiedenen Genen codiert. Die fünf Klassen von Genen der schweren Ketten werden als Alpha (α), Gamma (γ), Delta (δ), Mü (μ) und Epsilon (ε), und die zwei Gene der leichten Ketten als Kappa (κ) und Lambda (λ) bezeichnet. Die variablen Regionen, die auch die Antigen-Bindungsstelle enthalten, werden von über 1000 verschiedenen genetischen Regionen codiert. Diese Regionen rekombinieren selektiv und erzeugen so die zur Erkennung und Bindung des Zielantigens nötige Aminosäurenkombination. Die Bindungsstellenvariabilität ist nicht gleichmäßig verteilt, vielmehr enthält jede Domäne eine Anzahl hochgradig variabler Abschnitte, die hypervariablen Regionen (HVR) oder komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR), und es sind diese Regionen, die mit dem Antigen interagieren.
Die Generierung von Bindungsstellen-Diversität ist eine Kombination von mehreren Faktoren; (1) die Kombination von verschiedenen V_H- und V_L-Domänen, (2) die Kombination von verschiedenen V-, D- und J-Regionen, die die variable Domäne bilden, (3) die Generierung neuer Diversität an Domänenverbindungen, die als Verbindungsdiversität bezeichnet wird, und (4) Diversität aufgrund somatischer Mutationen. Somatische Mutationen sind auch großenteils für die Reifung der Immunantwort verantwortlich, wobei die B-Zellen-Clone, die sich während der Entwicklung der humoralen Antwort vermehren, eine immer höhere Affinität zum Antigen haben. Die Kombination dieser Vorgänge erlaubt theoretisch einem Organismus, gegen fast jedes Antigen eine spezifische Immunantwort zu generieren.
Auf der Stimulation einer Antikörperantwort beruhen die meisten Formen der Impfungstherapie und -prophylaxe. Zur Prophylaxe wird einem Patienten Antigen in Form von getöteten oder abgeschwächten Mikroorganismen oder gereinigtem Protein verabreicht. Man hofft, daß die Verabreichung dieser Impfung das Immunsystem des Patienten auf die mögliche spätere Erkennung des gleichen Antigens in Form einer Infektion vorbereitet. Wenn die Infektion frühzeitig abgefangen werden kann, wenn mit anderen Worten anti-Antigen-Antikörper nach einem anfänglichen oder früheren Kontakt mit dem Organismus im Körper zirkulieren, könnte der Organismus aus dem Körper eliminiert werden, bevor er Fuß fassen oder eine voll ausgeprägte Infektion verursachen kann. Dieser Aspekt wurde schon vor sehr langer Zeit erkannt; sogar bevor die Grundstruktur des Antikörpers bekannt war. Antikörperbehandlungen beinhalten passive Impfungen mit vereinigtem Serum in Form von Gammaglobulin. Das Blutplasma wird von konvaleszenten Personen oder Tieren gewonnen, die sich von der jeweiligen Krankheit erholt haben, und es wird in die Protein- oder Gammaglobulinfraktion raffiniert, die ihre Bezeichnung der Tatsache verdankt, daß sie vorwiegend IgG-Moleküle enthält. Die Impfungen dieses Gammaglobulins werden viele Male über einen Zeitraum von Stunden oder Tagen verabreicht; gewöhnlich unmittelbar nach dem Kontakt mit dem infektiösen Organismus oder der giftigen Substanz, um den Patienten mit einem Kurzzeitschutz gegen die Infektion zu versehen. Beispielsweise wird Personen, die von einem Tier, gebissen wurden, das als Träger des Tollwutvirus, eines Rhabdovirus verdächtig ist, eine Gammaglobulinbehandlung verabreicht, um das Virus an einer Infektion zu hindern, denn wenn einmal eine Infektion stattgefunden hat, ist der Ausgang unweigerlich ziemlich schlecht. Wenn aber die Behandlung frühzeitig begonnen wird, kann die Prognose ziemlich optimistisch sein.
Die Verwendung von Antikörpern zur Krebstherapie (oder -prophylaxe) basiert auf der Prämisse, daß das antigene Profil einer Krebszelle von dem von normalen Zellen verschieden ist. Wie schematisch in 1 dargestellt, könnten diese Unterschiede potentiell folgendes beinhalten: (1) Antigene Determinanten, die ausschließlich auf der Oberfläche von Tumorzellen vorkommen, (2) intrazelluläre Moleküle, die sich ausschließlich in Tumorzellen finden, die als Peptide auf der Zelloberfläche in Verbindung mit MHC-Molekülen dargebracht werden, (3) Antigene, die nur auf einigen normalen Zellen vorkommen, und (4) quantitative Unterschiede in der Menge der Expression bestimmter Antigene auf der Oberfläche der Tumorzellen im Vergleich zu anderen Nicht-Tumor-Zelltypen. Diese Prämisse wurde durch die Entdeckung sogenannter Tumor-assoziierter Antigene erhärtet, die auf den Oberflächen normaler Zellen nicht in signifikanter oder meßbarer Menge exprimiert werden (M. Herlyn und H. Koprowski, Ann. Rev. Immunol. 6: 283–308, 1988). Diese tumorspezifischen Peptide werden auf der Zelloberfläche in Verbindung mit MHC-Antigenen der Klasse I dargebracht.
Im Gegensatz zu polyclonalen Antikörper umfassen monoclonale Antikörper eine Kollektion identischer Moleküle, die von einem gemeinsamen B-Zellen-Clon hergestellt werden, und die gegen eine einzelne antigene Determinante gerichtet sind. Monoclonale Antikörper lassen sich vom polyclonalen Antikörpern dadurch unterscheiden, daß monoclonale Antikörper einzeln selektiert werden müssen, während polyclonale Antikörper in Gruppen von mehr als einem, oder mit anderen Worten in großer Menge selektiert werden. Große Mengen von monoclonalen Antikörpern können durch die Immortalisierung einer polyclonalen B-Zellen-Population mit Hilfe der Hybridomtechnologie hergestellt werden. Jede immortalisierte B-Zelle kann sich teilen, und zwar vermutlich beliebig oft, und so bildet sie eine clonale Population von Zellen, von denen jede ein identisches Antikörpermolekül exprimiert. Die einzelnen immortalisierten B-Zellen-Clone, die Hybridome, werden abgetrennt und separat gezüchtet.
Die Therapie mit monoclonalen Antikörpern wurde in zunehmendem Maß bei der Krebstherapie und -diagnose benützt, weist jedoch einige Unzulänglichkeiten auf (H. Thomas und K. Sikora, Rev. Oncol. 4: 107-120, 1991). Oft treten Tumorzellen-Varianten auf, denen die einzelne antigene Determinante fehlt, die der monoclonale Antikörper erkennt, und die von der Behandlung nicht erfaßt werden. Weil jeder monoclonale Antikörper gegen eine einzelne antigene Determinante auf der Ziel-Krebszelle gerichtet ist, ist die Dichte dieser Determinanten auf der Zelloberfläche gewöhnlich nicht hoch genug, um die Zerstörung der Zelle zu ermöglichen. Außerdem sind die Effektormechanismen, die durch die FC-Regionen der gebundenen Antikörpermoleküle vermittelt werden, wie die, Komplementbindung der Wert und die gleichzeitige Produktion von C3b, Opsonisation/Phagocytose und Antikörper-abhängige, zellvermittelte Cytotoxizität (ADCC) nicht aktiviert. Nur bei hohen Antikörperdichten wird Komplement aktiviert oder werden genügend F_C-Rezeptoren in Betrieb genommen, so daß die vorgesehenen Funktionen der Effektorzellen ausgelöst werden. Demzufolge sind monoclonale anti-Tumor-Antikörper zur vollständigen Ausschaltung der Zielzellen gewöhnlich unwirksam.
Um einige von diesen Problemen zu umgehen, wurden Verfahren entwickelt, die darauf abzielen, die Tötungswirksamkeit von monoclonalen Antikörpern mit radioaktiven Isotopen, Giften oder Medikamenten zu erhöhen. Diese Zusätze können jedoch ihrerseits schädliche Nebenwirkungen verursachen (T.A. Waldmann, Sci. 252: 1657–62, 1991). Selbst wenn ein monoclonaler Antikörper (mit Zusätzen oder ohne Zusätzen) zu Eliminierung von Krebszellen ziemlich effektiv ist, und Rückfälle dokumentiert wurden, bricht der Krebs in den meisten Fällen von neuem aus, da Tumorzellen-Varianten, die die antigene Zieldeterminante verloren haben, entkommen und sich vermehren (R.A. Miller et al., N. Engl. J. Med. 306: 517–22, 1982). Dieses Problem könnte teilweise durch die Verwendung von Kollektionen von monoclonalen anti-Tumor-Antikörper gelöst werden, die den Vorteil hätten, daß sie das gleiche, schon existierende Reagens für viele Patienten verwenden. Obwohl dies ein Vorteil wäre, da einzelne Tumore so variabel sind, ist es kein alltägliches Ereignis, daß für einen Krebstyp spezifische mehrfache Antigene gefunden werden, die auf allen Krebsen des betreffenden Typs vorhanden sind (D. Berd et al., Cancer Res. 49: 6840–44, 1989). Selbst wenn für Patienten mit einigen Krebstypen eine wirksame Behandlung mit Kollektionen von monoclonalen Antikörpern gefunden wird, ist es unwahrscheinlich, daß diese gegen viele Formen von Neoplasie wirksam ist.
Die Technologie der monoclonalen Antikörper ist beim derzeitigen Entwicklungszustand auf die Anwendung nicht menschlicher monoclonaler Antikörper fokussiert. Dies stellt oft ein Problem dar, da die Patienten Antikörper gegen die nichtmenschlichen Regionen des Proteins, und zwar sowohl gegen die konstante als auch gegen die variable Region entwickeln. Antikörper, die gegen die Antigenbindungsstelle, also gegen die variable Region eines anderen Antikörpers reaktiv sind, nennt man anti-idiotypische Antikörper. Es wurde gezeigt, daß monoclonale Antikörper von Mäusen, die am leichtesten herstellbaren und häufigsten, eine humorale Antwort beim Menschen auslösen, welche als menschliche anti-Maus-Antwort oder HAMA-Antwort (human anti-mouse antibody response) bezeichnet wird (D.L. Sawler et al., J. Immunol. 135: 1530–35, 1985). Eine signifikante HAMA-Antwort bei Patienten, die sich einer solchen Therapie unterziehen, macht nicht nur jeden möglichen Behandlungserfolg zunichte, sondern führt auch noch zu zahlreichen Komplikationen, darunter Störungen des Immunkomplexes.
In den letzten Jahren wurden diese Probleme teilweise durch die Herstellung und Anwendung chimärer Antikörper gelöst. Chimäre Antikörper haben V-Regionen, die aus den tumorspezifischen monoclonalen Mäuse-Antikörpern, doch menschlichen C-Regionen (S.L. Morrison und V.T. Oi, Adv. Immunol. 44:65–92, 1989) abgeleitet sind. Bei solchen Formen ist die HAMA-Antwort signifikant verringert (wenn auch nicht vollkommen eliminiert), ein Problem bleibt aber noch die anti-idiotypische Antwort. Im Bemühen, die anti-idiotypische Antwort auszuschalten, wurden Antikörper entworfen, bei denen nur die CDRs von Mäuseantikörper abgeleitet sind, das Gerüst und die C-Regionen aber menschlichen Ursprungs sind. Dies sind die sogenannten humanisierten Antikörper (P. C. Caron et al., Cancer Res. 52: 6761–7, 1992). Diese Antikörper sind sehr schwierig herzustellen; es sind mehrere Clonierungsschritte erforderlich, und es könnten dabei immer noch anti-idiotypische Antikörper hervorgebracht werden (The Third Annual IBC International Conference on Antibody Engineering, 14.–16. Dezember 1992, San Diego). Monoclonale Antikörper komplett menschlichen Ursprungs werden derzeit entwickelt; man erhofft sich, daß diese keine anti-idiotypischen Antikörper hervorbringen werden (C.J. Fisher et al., Critical Care Med. 18: 1311–l5, 1990). Da aber Mäuse perfekt dazu in der Lage sind, anti-idiotypische Antikörper gegen Antikörper zu erzeugen, die aus der gleichen Art, ja sogar aus dem gleichen, durch Inzucht hervorgebrachten Stamm abgeleitet sind, wird die Erzeugung anti-idiotypischer Antikörper nach der Injektion von großen Mengen von Antikörpern mit identischen V-Regionen immer ein Problem bleiben, solange monoclonale Antikörper verwendet werden.
Die Verwendung polyclonaler Antikörper würde einige der Nachteile überwinden, die mit der Therapie mit monoclonalen Antikörpern verbunden sind. Im Gegensatz zu den monoclonalen Antikörpern sind polyclonale Antikörper gegen viele verschiedene antigene Determinanten auf der Oberfläche der Zielzellen gerichtet und würden mit ausreichender Dichte binden, um den Effektormechanismen des Immunsystems ein wirkungsvolles Arbeiten zu ermöglichen; sie würden damit auch möglicherweise die Notwendigkeit radioaktiver oder toxischer Zusätze eliminieren. Weiterhin ist die Chance verschwindet gering, daß evasive Tumorzellenvarianten ("escape variants") von auftreten, die die Reaktivität mit allen polyclonalen Antikörpern verloren haben. Es ist nicht zu erwarten, daß die anti-idiotypische Reaktivität für Patienten ein Problem wird, da keine V-Region-Kombination in ausreichender Menge vorhanden sein dürfte, um eine signifikante Antwort auszulösen.
Die Verwendung konventioneller polyclonaler Antikörper bringt mehrere Probleme mit sich. Erstens sind polyclonale Antikörper in Form von Gammaglobulin nur in sehr beschränkter, für die Behandlung von Menschen in großem Maßstab nicht ausreichender Menge verfügbar. Zweitens werden viele von den polyclonalen Antikörpern, wenn sie bei einem Patienten angewandt werden, von dessen normalen Zellen und Geweben absorbiert. Die Zahl der verschiedenen Antikörper, die nach der Absorption übrigbleiben, wäre sehr gering, möglicherweise zu gering für eine heilende Wirkung. Drittens erfordert diese Menge, abgesehen davon, daß sie gar nicht ausreichend ist, einen großen Reinigungsaufwand, um unerwünschtes Material, wie Cytokine und immunregulatorische Proteine zu entfernen, die unerwünschte Immunantworten und Nebenwirkungen auslösen könnten. Es besteht auch ein substantielles Kontaminationsrisiko, das mit infektiösen Organismen wie HIV oder mit Toxinen wie Lipopolysacchariden zusammenhängt, die in der Quelle vorhanden sein könnten. Diese Probleme sind aufgrund der Variabilität der Zusammensetzung des aus verschiedenen biologischen Quellen stammenden Materials schwer zu lösen. Die rekombinante Produktion polyclonaler Antikörper würde einige dieser Probleme lösen, doch die Gene, die diese Antikörper codieren, sind nicht leicht zu bestimmen, und die Technologie zur wirkungsvollen Arbeit mit Kollektionen von Antikörpergenen muß erst noch entwickelt werden.
Neuerdings wurden antigenbindende Antikörperfragmente auf der Oberfläche von fädigen Phagen exprimiert (G.P. Smith, Sci. 228: 1315, 1985). Bibliotheken von variablen H- und L-Regionen-cDNAs sind aus tierischen und menschlichen B-Zellen gewonnen worden und in Paaren in zufälligen H-L-Kombinationen in Phagendisplayvektoren cloniert worden, um so kombinatorische Bibliotheken zu erhalten, die Fab oder Einzelketten-Fv-Fragmente aufweisen (W.D. Huse et al., Sci. 246: 1275–81, 1989). Fab wird durch die Assoziierung der L-Kette mit V_H und C_H1-Domänen der H-Kette gebildet, die Fd-Region. In Phagendisplaybibliotheken ist das carboxy-terminale Ende der Fd- oder Fv-Region an ein Fragment eines Phagen-Hüllproteins, wie epIII oder cpVIII angelagert, das das Fab-Fragment an der Oberfläche des Phagen verankert. Sowohl in Fab- als auch in Fv- Fragmenten wird die Antigenbindungsstelle bei intakten Antikörpern aus der Kombination der V_H- und V_L- Domänen gebildet.
Phagendisplaybibliotheken können nach ihrer Bindung an spezifische Antigene durch Affinitätschromatographie (R.E. Hawkins et al.; J. Mol. Biol. 226: 889, 1992) oder durch Ausstreichen von Phagen auf antigenbeschichteten Oberflächen (C.F. Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363, 1991) selektiert werden. Da die DNA-Segmente, die die selektierten Antikörperfragmente codieren, auf Phagenpartikeln liegen, können die selektierten Phagenpartikel, die monoclonale Antikörperfragmente codieren, isoliert und unbegrenzt propagiert werden. Die selektierten Phagenclone können modifiziert werden, um Antikörperfragmente ohne Hüllproteineinheit zu erzeugen, die ebenfalls von den Bakterienzellen sekretiert werden können. Aus solchen kombinatorischen Phagendisplaybibliotheken wurden Antikörperfragmente, die für Haptene, Proteine und mehrere menschliche Viren spezifisch sind, gewonnen (J.D. Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581, 1991; R.A. Williamson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4141, 1993).
Ein Hauptnachteil dieser kombinatorischen Bibliotheken ist, daß die V_H- und V_L-Regionen, die die Antigenbindungsdomäne bilden, zufällig assoziiert sind. Die ursprünglichen Kombinationen von H- und L-Ketten, die durch das Antigen in vivo so wirkungsvoll selektiert wurden, gehen verloren (J. McCafferty et al., Nature 348: 552–54, 1990). Die Chance, H- und L-Kombinationen mit hoher Affinität zum Antigen von Interesse zu finden, ist sehr klein. Die Anzahl der Clone, die nach einer spezifischen Bindung an das Antigen abgesucht werden müßten, wächst um die Größenordnung des Mehrfachen.
Ein Verfahren zur Amplifikation und zur Verbindung der exprimierten Gene der V_H- und V_L-Regionen innerhalb einzelner Zellen in einer Population von Zellen wurde in allerjüngster Zeit vorgestellt (M.J. Embleton et al., Nuc. Acids Res. 20: 3831–37, 1992). Dieses Verfahren wurde durch ein Beispiel mit zwei Mäuse-Hybridomzellinien veranschaulicht, von denen jede ein bekanntes und unterschiedliches Immunglobulin-(Ig-) Produkt erzeugt. Die beiden Zellpopulationen wurden vermischt, mit Formaldehyd fixiert und mit dem Detergens NP-40 permeabilisiert. Mittels reverser Transskriptase und zu den 3'-Enden der V_H- und V_L-mRNAs komplementärer Primer wurden cDNAs synthetisiert. Die cDNAs wurden dann durch PCR amplifiziert und in der gleichen Reaktion verknüpft, wobei zusätzlich zu den cDNA-Primern ein Primer vom 3'-Ende des V_H-Gens und ein Primer vom 5'-Ende des V_L-Gens verwendet wurden. Diese Primer enthielten auch komplementäre Schwänze von zusätzlichen Sequenzen für die Selbstzusammenstellung von V_H- und V_L-Genen. In einer zweiten PCR wurden nach dem Waschen der Zellen die verknüpften V_H- und V_L-Region-Gene mit terminalen „nested" Primern amplifiziert, und ergaben so eine Population von DNA-Fragmenten, die die V_H- und V_L-Sequenzen in Kopf-Schwanz-Transkriptionsrichtung vom codierten. Diese DNA-Fragmente wurden aus den Zellüberständen gewonnen.
Obwohl dieser Bericht behauptete, daß fast alle untersuchten V_H-V_L-Kombinationen von nur einer der Hybridomzellinien abgeleitet waren, führt das Verfahren zu gemischten V_H-V_L-Kombinationen, bei denen V_H und V_L aus unterschiedlichen Zellen abgeleitet sein können. Auch theoretische Betrachtungen lassen augenscheinlich werden, daß V_H-V_L-Vermischung vorkommen kann. Da die verknüpften V_H-V_L-Kombinationen aus dem Überstand der fixierten/permeabilisierten Zellen gewonnen werden, die Poren in den Membranen dieser Zellen aber den freien Durchgang solcher verknüpfter DNA-Moleküle erlauben, ist zu erwarten, daß die kleineren V_H- und V_L-DNA-Moleküle die Zellen verlassen können und außerhalb der Zellen verknüpft und weiter amplifiziert werden könnten, wobei eine freie Vermischung von V_H und V_L aus verschiedenen Zellen vorkommen kann.
Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme und Nachteile, die mit den derzeitigen Strategien und Konzepten verbunden sind und liefert neue Zusammensetzungen und Verfahren für die Prophylaxe und Behandlung bestimmter Krankheiten und Störungen.
Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern haben eine höhere Komplexität als monoclonale Antikörper oder Antikörper-Cocktails, da sie gegen viele verschiedene antigene Determinanten gerichtet sind, und beinhalten die Option der Verwendung von radioaktiven, toxischen und anderen Zusätzen sowohl für die Therapie als auch für die Diagnose. Eine Ausführungsform der Erfindung zielt auf die Verfahren zur Behandlung neoplastischer Störungen unter Verwendung von Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern, die spezifisch gegen eine Krankheit oder Störung gerichtet sind. Von einem Patienten wird eine Probe von neoplastischem Gewebe gewonnen. Die Probe wird in eine Zellpopulation eingeführt, die in der Lage ist, Antikörper zu erzeugen, wie die Milzzellen eines Säugers. Die Zellpopulation wird fixiert, permeabilisiert, und die V_H- und V_L-mRNA-Moleküle werden in V_H- und V_L-cDNA-Sequenzen revers transkribiert. Die cDNA-Sequenzen werden PCR-amplifiziert, und die amplifizierten Sequenzen verknüpft, und zwar vorzugsweise in einer Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung. Die verknüpften Sequenzen werden abermals PCR-amplifiziert, und so wird eine Population von DNA-Fragmenten erzeugt, die die V_H- und V_L-Antikörperregionen codieren. Diese DNA-Fragmente werden in Expressionsvektoren cloniert und die verschiedenen Populationen von Expressionsvektoren in den transfizierten Wirt expandiert. Die Expressionsvektoren, die eine Bibliothek von rekombinanten anti-neoplastischen Antikörpern codieren, werden selektiert und die Subpopulationen oder Subbibliotheken abermals expandiert. Dann werden die rekombinanten anti-neoplastischen Antikörper, die von diesen Vektoren hergestellt werden, den Patienten verabreicht. Die neoplastischen Störungen, die behandelt werden können, beinhalten Leukämien, Lymphome, Sarcome, Carcinome, neutrale Zelltumore, schuppige Zellcarcinome, Keimzellentumore, Metastasen, undifferenzierte Tumore, Seminome, Melanome, Neuroblastome, gemischte Zelltumore, durch infektiöse Mittel verursachte Neoplasien und andere Bösartigkeiten.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf die in-vivo-Diagnose einer neoplastischen Störung durch Sichtbarmachen des erkrankten Gewebes in einem Patienten. Es wird eine Bibliothek von patientenspezifischen, anti-neoplastischen Antikörpern wie in dieser Arbeit beschrieben erzeugt, und diese mit einem feststellbaren Marker markiert. Die Antikörper können ganze Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, wie Fab-Fragmente sein. Die markierte Bibliothek wird dem Patienten verabreicht und der Marker beispielsweise mittels Radioaktivitätsdetektion, visueller Inspektion, nuklearmagnetischer Resonanz (NMR) oder anderen Mitteln zur Feststellung von Markern in Körpergewebe, in Körperausscheidungen oder im gesamten Körper selbst festgestellt. Mit diesen Verfahren können bis dahin nicht bemerkte Neoplasien festgestellt werden, die einer Feststellung mit anderen Mitteln entgangen sind. Auch kann eine einmal festgestellte Neoplasie in Verlauf einer Behandlung wirksam überwacht werden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf Verfahren zur Erzeugung von patientenspezifischen oder Antigen spezifischen Bibliotheken aus polyclonalen Antikörper. Diese Bibliotheken, die wie oben beschrieben erzeugt werden, sind für die Behandlung oder Prophylaxe einer Anzahl von Krankheiten von Nutzen, darunter Neoplasien, Bösartigkeiten, Infektionen, genetische Defekte und genetische Defizite. Die Bibliotheken können Vektoren umfassen, die DNA enthalten, die die variablen Regionen codiert, solche, die den gesamten Antikörper codiert oder Antikörper oder Antikörperfragmente. Ist sie einmal isoliert und cloniert, kann die Bibliothek expandiert werden, um sicherzustellen, daß alle Mitglieder des antigenen Profils vertreten sind, und sie kann leicht auf andere Vektoren transferiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung zielt auf Zusammensetzungen, die Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern oder genetischen Expressionsvektoren, die diese Antikörper codieren, enthalten. Die Bibliothek oder die selektierte Subbibliothek aus Antikörpern kann mit einem feststellbaren Marker markiert werden und/oder einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Die Zusammensetzungen können dem Patienten für Diagnose- oder Behandlungsverfahren verabreicht werden. Alternativ können dem Patienten Vektor-Bibliotheken für die in-vivo-Expression von Antikörper oder Antikörperfragmenten verabreicht werden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf Diagnosehilfen oder Kits und Verfahren zur Verwendung dieser Kits zur Feststellung von Krankheiten und Störungen. Die Diagnosehilfen oder Kits umfassen eine Bibliothek aus polyclonalen Antikörpern, die mit einem feststellbaren Marker markiert sein kann, zu der eine Probe hinzugefügt wird, die im Verdacht steht, das Zielantigen zu enthalten. Die Probe kann eine Probe einer Körperflüssigkeit, wie Blut, Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphe oder Urin sein. Das Vorhandensein oder Fehlen von Zielantigen zeigt das Vorliegen einer bestimmten Krankheit, Störung oder eines kontaminierenden Stoffes an. Die Proben können biologische Proben von einem Patienten oder biologische Proben aus einer Umweltquelle sein, die im Verdacht steht, einen kontaminierenden Stoff zu enthalten. Die Probe wird mit der Bibliothek vermischt und das Vorhandensein von Antigen durch die Bindung einer signifikanten Antikörperzahl und Feststellen des Markers bestimmt.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf Verfahren zur Erzeugung und Anwendung von Bibliotheken von Rezeptorproteinen, die variable Regionen besitzen. Zu den Rezeptorproteinen, die zur Erzeugung einer Bibliothek verwendet werden können, zählen T-Zellen-Rezeptoren, B-Zellen-Rezeptoren, natürliche Killerzellen-Rezeptoren, und Macrophagen-Rezeptoren. Es wird eine Probe biologischen Gewebes in eine Zellpopulation, die in der Lage ist, Rezeptorproteine zu erzeugen, eingeführt. Die mRNAs von Rezeptorproteinen der variablen Region werden revers in cDNA-Sequenzen transkribiert, die mit PCR amplifiziert werden, und die so erhaltenen DNA-Fragmente werden in Expressionsvektoren cloniert. Die Expressionsvektoren, die das rekombinante Rezeptorprotein codieren, werden selektiert, und eine Subpopulation wird expandiert, um die Bibliothek zu erzeugen. Diese Bibliotheken können dazu benützt werden, Krankheiten und Störungen, darunter Neoplasien, Infektionen, genetische Defekte und Defizite zu diagnostizieren, sichtbar zu machen oder zu behandeln. Zusätzlich können mit den gleichen Verfahren Bibliotheken von chimären Proteinen, die sowohl Abschnitte des Antikörpers, als auch solche des Rezeptorproteins enthalten, erzeugt und angewandt werden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf Nucleinsäurevektoren, die dazu benützt werden können, antigenspezifische Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern herzustellen. Diese Vektoren umfassen Erkennungsstellen von Restriktionsenzymen, die ein bequemes Clonieren von Nucleinsäurefragmenten und -Sequenzen zur wirkungsvollen PCR-Amplifikation der cDNA-Fragmente erlauben. Die Vektoren sind so entworfen, daß sie ein oder mehrere Paare von genetischen Fragmenten aufweisen, die in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung insertiert sind, und daß sie weiterhin wahlweise transkriptions- und translationssteuernde Sequenzen, wie TATA-Boxen, CAT-Boxen, Ribosomenbindungsstellen, RNA-Polymerase-Initiations- und -Terminationsstellen, Leadersequenzen, starke Transkriptionspromotoren, die differenziell gesteuert werden können, oder Teile oder Kombinationen davon enthalten.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf Verfahren zum Transferieren einer Bibliothek von Nucleinsäurefragmenten zwischen verschiedenen Vektoren ohne signifikanten Verlust der Diversität der Bibliothek. Die Bibliothek von Fragmenten wird in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung in erste Vektoren insertiert und bildet rekombinante Vektoren. Die Inserts dieser rekombinanten Vektoren werden, beispielsweise durch PCR-Amplifikation der insertierten Sequenzen oder durch Restriktionsenzymclonierung ohne signifikanten Diversitätsverlust der Bibliothek in zweite Vektoren transferiert.
Andere Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung sind teilweise in den folgenden Beschreibungen dargelegt, zum anderen Teil werden sie aus dieser Beschreibung offensichtlich, oder sie werden sich im Zug der Anwendung der Erfindung erschließen.
Beschreibung der Figuren
1: Schematischer Vergleich der Dichte- und Diversitätsunterschiede von Antigenen auf der Oberfläche von normalen Zellen im Vergleich zu Tumorzellen.
2: Schematische Darstellung des Aufbaus von (a) pUC19-Cκ-CH1, (b) pUC119-Cκ-CH1, (c) plPPl2 und (d) pJS.
3: Partialkarten der Phagemiden-Expressionsvektoren (a) pComb3, (b) phh3, (c) plPPl und (d) phh3mu oder phh3hu; nicht maßstäblich dargestellt. Die Aminosäuren, die von den Vektoren beigesteuert werden, sind im Ein-Buchstaben-Code vor den Fd- und L-Ketten-Genen gezeigt. P = Promotor, l = Leadersequenz, lmod = Leadersequenz mit modifizierter Nucleotidsequenz.
4: Schematisches Diagramm (a) eines murinen Dualvektors, pMDV, (b) eines chimären Dualvektors, pCDV; hierbei bedeuten: P = Promotor, E = Enhancer, l = Leadersequenz, ss = Spleißstelle, hum = human; und (c) der Transfer variabler Regionen in großer Zahl (bulk) zwischen Bakterien- und Säuger-Vektoren.
5: Schematische Darstellung der cDNA-Synthese- und der PCR-Reaktionen.
6: Agarose-Gel Analyse von PCR Produkten.
7: Transfer von innerhalb der Zelle verknüpften V_H-V_L-Kombinationen in einen murinen Expressionsvektor
8: Zellüberstandsanalyse durch (a) Western Blot und (b) ELISA.
9: Untersuchung der Phagenbindung an Ars-BSA durch (a) direktbindende ELISA und (b) Inhibitions-ELISA.
10: Erzeugung von (a) bakteriellen und (b) Säuger-Vektoren zur Expression von Fab-Phagendisplay-Bibliotheken oder intakten Antikörpern, abgeleitet aus Kopf-Kopf-verknüpften V_H-V_L-Kombinationen.
Wie hier dargestellt und ausführlich beschrieben, umfaßt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Bibliotheken verwandter Proteine, wie Antikörper, Rezeptoren einschließlich T-Zellen-Rezeptoren und anderer mit dem Immunsystem zusammenhängender Proteine.
Während einer Immunantwort werden viele Tausende verschiedener B-Zellen-Clone, die für jede antigene Determinante spezifisch sind, erzeugt, und sie vermehren sich und erzeugen so eine große Vielfalt von Antikörpern. Diese Vielfalt wird durch somatische Hypermutationsmechanismen, die in antigenstimulierten B-Zellen wirken, weiter erhöht. Diese äußerst wirkungsvollen Vorgänge, die während der Reifung der Immunant wort ablaufen, führen zu einer sehr großen Auswahl von Antikörpern mit erhöhter Affinität zum Antigen. Die derzeit übliche Antikörpertherapie hat jedoch ihren Schwerpunkt auf die Verwendung von monoclonalen Antikörpern gelegt, und wenn B-Zellen-Clone durch Hybridombildung immortalisiert werden, ist nur ein kleiner Bruchteil der B-Zellen-Clone repräsentiert. Weiter sind, da nur teilende Zellen an der Bildung von stabilen Zellhybriden teilnehmen können, terminal differenzierte Plasmazellen, die Antikörper hoher Affinität erzeugen, wahrscheinlich nicht in der Population vertreten.
Eine Ausführungsform der Erfindung zielt auf Verfahren zur Behandlung neoplastischer Störungen durch Verwendung von patientenspezifischen oder krankheitsspezifischen anti-Tumor-Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern. Von solchen Bibliotheken erwartet man, daß sie das volle Spektrum einer Antikörperantwort gegen Tumorzellen sehr viel wirkungsvoller umfassen als von Hybridomen erzeugte monoclonale Antikörper oder monoclonale Antikörper-Cocktails. Diese Bibliotheken sind auch leicht reproduzierbar und können in der ganzen Diversität erzeugt und bereitgehalten werden, die mit einer natürlichen Immunantwort verbunden ist. Obwohl die Komplexität jeder Bibliothek aus polyclonalen Antikörpern nicht unmittelbar bekannt ist, steht zu erwarten, daß sie sehr hoch ist, und daß sie die Fähigkeit beinhaltet, alle Effektorfunktionen zu aktivieren, die mit einer Immunantwort verbunden sind.
Eine Bibliothek wird hergestellt, indem eine Probe von neoplastischem Gewebe von einem Patienten mit einer bestimmten Störung gewonnen wird. Das neoplastische Gewebe kann aus Tumorgeweben, Blut und mit Blut verwandten Geweben, Biopsiegeweben, krebsartigen Geweben, bösartigen Geweben, metastasierten Geweben und Kombinationen von solchen gewonnen werden. Die Proben können aus der Biopsie von erkranktem Gewebe, primären oder immortalisierten Zellkulturen von verwandten Zelltypen, oder aus Zellen, die künstlich zur Präsentation eines bestimmten antigenen Profils stimuliert wurden, gewonnen werden. Das neoplastische Gewebe kann auch zuerst in einem immundefizitären Tier, wie einem Mäusemodell propagiert werden, um die ungehinderte Expression von Antigen zu unterstützen. Nutzbare Mäusemodelle sind unter anderen die Nacktmaus, die SCID-Maus und die verstrahlte Maus. Von Geburt an thymuslose Nacktmäuse, die in ihrer T-Zellen-Funktion defizitär sind, erlauben die in-vivo-Aufzucht von menschlichen Tumoren. Auch von SCID-(severe combined immunodeficient)-Mäusen mit schweren, kombinierten Immundefiziten, denen funktionierende B- und T-Zellen fehlen, und von subletal verstrahlten Mäusen, deren T- und B-Zellen zerstört sind, wurde gezeigt, daß sie das Wachstum von allogenen und xenogenen Tumoren ermöglichen. Nacktmäuse und SCID-Mäuse sind für das Wachstum normaler menschlicher Zellen permissiv und können mit Leukocyten aus menschlichem peripherem Blut (Hu-PBL), beispielsweise durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von etwa 1 – 5 × 10⁷ Zellen rekonstituiert werden.
Alternativ kann das neoplastische Gewebe der Reinigung unterworfen werden, um ein einzelnes Zielantigen, Gruppen von Antigenen oder antigenhaltigen Extrakt zu gewinnen. Diese Vorgehensweise ist besonders nützlich, wenn das Risiko besteht, unerwünschte oder gefährliche Bestandteile aus lebenden und getöteten Zellen in den Prozeß einzuschleppen, oder einfach aus Gründen der Bequemlichkeit oder Lagerung. Wenn z.B. menschliche Blutzellen verwendet werden, besteht das Risiko, infektiöse Viren, wie HIV-1- oder Hepatitisviren einzuschleppen, und es wäre wünschenswert, dieses Risiko zu eliminieren. Aus den Zellen mit stark verringerter Konzentration normaler Antigene und/oder erhöhter Konzentration neoplastischer Antigene werden Extrakte präpariert. Im allgemeinen sind Zelloberflächen-, Membran- oder Gesamtzellenextrakte vorzuziehen, und sie können bei 4 °C, –20 °C, –80 °C oder in flüssigem Stickstoff hergestellt und gelagert oder lyophilisiert und etwa bei Raumtemperatur gelagert werden. Verfahren zur Proteinreinigung und der Herstellung von Extrakten sind dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt. Viele dieser Vorgehensweisen sind im Guide to Protein Purification (Methods in Enzymology, Bd. 182, Herausgeber M.P. Deutscher, Academic Press, San Diego CA, 1990) beschrieben. Schließlich kann Probenantigen auch synthetisch, mit Verfahren der organischen Chemie hergestellt werden, wenn dies angemessen oder bequem ist.
Die Probe von neoplastischem Gewebe oder Antigen wird dann entweder in vitro oder in vivo in eine Zellpopulation eingeführt, die in der Lage ist, Antikörper herzustellen. Verwendbare in vitro-Zellpopulationen sind unter anderen Zellen von Mäusen, Schafen, Schweinen, Primaten, Menschen, transformierte, fusionierte oder immortalisierte Zellen, oder Kombinationen daraus. Die antikörperproduzierenden Zellen werden dem Tier oder der Zellkultur entnommen und dem Antigen ausgesetzt. Die antigenstimulierten Zellen können direkt verwendet werden oder mit einer immortalisierten Zellinie, wie einem Myelom fusioniert werden, um eine Population von antikörperproduzierenden Hybridomen zu erzeugen. Zu bevorzugen sind in vivo-Zuchtverfahren; sie beinhalten die direkte Injektion von Probe in ein Tier, das eine zur Antwort befähigte Population von antikörperproduzierenden Zellen enthält. Das Tier kann ein Mensch oder ein anderer Primate, eine Maus, eine Ziege, ein Kaninchen oder ein anderer Säuger sein. Werden Tiere verwendet, sind mehrfache Injektionen mit Adjuvans das bevorzugte Verfahren, und dies führt oft zu einer hohen Konzentration von antigenspezifischen antikörperproduzierenden Zellen mit sehr starker Affinität zum Antigen. Die antikörperproduzierenden Zellen, die gewöhnlich aus der Milz gewonnen werden, doch möglicherweise auch aus peripherem Blut oder Lymphe, können leicht ärztlich, nicht ärztlich oder auf anderem Weg, wie geeignet, isoliert werden.
Antigenstimulierte antikörperproduzierende Zellen, die entweder aus in vivo oder aus in vitro-Quellen gewonnen wurden, wie etwa nach der Fusion mit einer Myelom- oder Hybridom-Zellinie werden mit einer Fixiererlösung wie Streck Tissue Fixative (Streck Labs; Omaha, NE) oder mit einer Lösung, die eine Chemikalie wie Carbohydrazin, Glutaraldehyd oder Osmiumtetroxid, vorzugsweise jedoch Formaldehyd oder Kombinationen dieser Chemikalien enthält. Zum Beispiel werden 10⁴ bis 10⁸ präzipitierte Zellen in 0,1 bis 2,0 ml 10% Formaldehydlösung plus 0,15 M NaCl suspendiert. Die Zellen werden eine Zeitlang auf Eis aufbewahrt, gewaschen und präzipitiert. Dann werden diese fixierten Zellen mit einer permeabilisierenden Lösung, die Chemikalien wie Nonidet P-40 (NP-40), Brij, Tween, zum Beispiel Tween-20, Polysorbat, Triton X-100 (TX-100), CHAPS, Sorbitan oder Kombinationen davon enthält, durchlässig gemacht. Die Permeabilisierungslösung kann zum Beispiel 0,5% NP-40 enthalten, das zum fixieren Zellpräzipitat hinzugefügt wird; das Gemisch wird eine Zeitlang auf Eis inkubiert, gewaschen, präzipitiert und das Präzipitat in PBS mit 0,1 M Glycin dispergiert, um die Gesamtstruktur der Zellen zu erhalten. Alternativ kann die Permeabilisierung die Behandlung der fixierten Zellen mit Enzymen wie Proteinase K umfassen. Die Fixierung und Permeabilisierung soll den Zellen die geeignete Porösität verleihen, um das Eindringen von Enzymen ohne unnötige Zerstörung der Zellabteilungen oder der Nucleinsäuren innerhalb der Abteilungen zu ermöglichen. Die Permeabilisierung erlaubt Enzymen, Nucleotiden und anderen benötigten Reagentien in die einzelnen Zellen, nunmehr fixierte Zellabteilungen, zu gelangen, die zelluläre V_H- und V_L-mRNA in V_H- und V_L-cDNA-Sequenzen revers zu transkribieren. Der feste Träger kann jeder Träger sein, der geeignet und für den Vorgang nicht hinderlich ist, wie eine Glas- oder Plastikoberfläche oder ein Membranpolymer. Die Zellen sollten räumlich so konzentriert wie möglich sein, um das Gesamtvolumen zu minimieren. Ein kleineres Volumen erlaubt es, geringere Mengen und konzentriertere Lösungen von Enzymen hinzuzufügen.
Die reverse Transkription kann in einem einzelnen Schritt oder wahlweise in einem kombinierten Vorgang aus reverser Transkription und PCR erfolgen. Die erste Enzymlösung enthält z.B. reverse Transkriptase, wie AMV- oder MMTV-Reverstranskriptase, eine balancierte Salzlösung, die Tris-HCl, pH 8–8.5, Dithiothreitol (DTT), Kaliumchlorid (KCl) und Magnesiumchlorid (MgCl₂), ausreichende Mengen aller vier dNTPs und Primer, die an die mRNA binden und eine 3'-Hydroxylgruppe für die reverse Transkriptase zur Initiation der Polymerisation liefern. Wahlweise kann ein RNase-Inhibitor, wie RNasin (Promega; Madison, WI) hinzugefügt werden, um das Degradieren der RNA zu verhindern. Obwohl jede zur mRNA komplementäre Primersequenz verwendet werden kann, sind zur Erleichterung der Selektion der Botschaften von variablen Regionen Primer vorzuziehen, die zum 3'-Ende der V_H- und V_L-mRNA-Moleküle komplementär sind. Die Synthese des ersten Stranges wird beispielsweise etwa 60 min lang bei etwa 42 °C durchgeführt. Molekularbiologische Verfahren zur Optimierung enzymatischer Verfahren in der Ausführung dieser Erfindung, wie dieses und andere hier beschriebenen, sind in Current Protocolls in Molecular Biology, Hrsg. F.M. Ausubel et al., John Wiley & Sons, NY, 1989) offenbart. Nach dem Abschluß der Reaktion werden die Zellen präzipitiert, zur Entfernung der Reaktionsreagentien gewaschen und in PBS resuspendiert.
Die so erhaltenen cDNA-Sequenzen werden unter Verwendung von Primern, die für Immunglobulingene und vorzugsweise für die terminalen Regionen der V_H- und V_L-Nucleinsäuren spezifisch sind, mit PCR amplifiziert. Verfahren der PCR-Amplifikation sind im US-Patent Nr. 4,683,195 offenbart. Vorzugsweise werden die cDNAs PCR-amplifiziert und in der gleichen Reaktion verknüpft, wozu zusätzlich zur cDNA Primer verwendet werden, und zwar ein Primer für das 5'-Ende des Gens der V_H-Region und ein weiterer für das 5'-Ende des Gens der V_L-Region. Diese Primer enthalten auch komplementäre Schwänze zusätzlicher Sequenz, um die Selbstzusammenstellung der V_H- und V_L-Gene zu ermöglichen. Nach der PCR-Amplifikation und Verkettung ist die Wahrscheinlichkeit, gemischte Produkte – mit anderen Worten gemischte variablen Regionen – zu erhalten, minimal, da die Amplifikations- und Verkettungsreaktionen innerhalb jeder Zelle durchgeführt wurden. Das Vermischungsrisiko kann weiter verringert werden, indem sperrige Reagentien, wie Dioxigenin-markierte Nucleotide verwendet werden, um zusätzlich sicherzustellen, daß die cDNA-Paare der V-Region die zellulären Abteilungen nicht verlassen und sich vermischen, sondern zur PCR-Amplifikation und Verkettung innerhalb der Zelle verbleiben. Die amplifizierten Sequenzen werden durch Hybridisierung komplementärer terminaler Sequenzen verknüpft. Nach der Verkettung können die Sequenzen aus den Zellen gewonnen werden. Zum Beispiel können die Zellen nach der Verkettung mit einer Lösung von Natriumdodecylsulfat (SDS) gewaschen werden. Das SDS schlägt sich nach einer Inkubation auf Eis außerhalb der Zelle nieder, und der Überstand kann in ein Agarose- oder Acrylamidgel elektrophoresiert werden. Alternativ oder in Kombination mit dem SDS-Prozeß können die DNA-Produkte innerhalb der Zelle verbleiben und amplifiziert werden, wenn ein Reagens wie Dioxigenin-gebundene Nucleotide verwendet wird. Das verknüpfte Produkt wird durch Elektrophorese des Überstands gewonnen.
Nach der Elektrophorese des Überstands wird die Gelscheibe, die dem passenden Molekulargewicht des verknüpften Produktes entspricht, entfernt und die DNA beispielsweise auf Silikakügelchen isoliert. Die gewonnene DNA kann nötigenfalls mit terminalen Primern PCR-amplifiziert und in Vektoren cloniert werden, die Plasmide, Phagen, Cosmide, Phagemiden, virale Vektoren oder Kombinationen davon sein können. In die hybridisierten Sequenzen können Schnittstellen für bequemen Einsatz von Restriktionsenzymen eingebaut werden, um ein Clonieren zu erleichtern. Diese Vektoren können auch als Bibliothek verknüpfter, variabler Regionen für spätere Verwendung aufbewahrt werden.
Alternativ können die verknüpften Gene der V_H- und V_L-Regionen unter Verwendung von terminalen „nested" Primern ein zweites Mal PCR-amplifiziert werden, wodurch man eine Population von DNA-Fragmenten erhält, die die verknüpften genetischen Regionen von V_H und V_L codieren. Diese DNA-Fragmente werden aus Zellüberständen gewonnen. Die Gruppierung von V_H- und V_L-Kombinationen ist ein Vorteil dieses Verfahrens und erlaubt den Massen- oder Gruppentransfer von allen Clonen und allen DNA-Fragmenten während dieser und aller Clonierungsvorgänge. Vorzugsweise werden die V_H- und V_L-cDNAs in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung (← →), also im Gegensinn zur Kopf-Schwanz-Transkriptionsrichtung (→ → oder ← ←) verknüpft. Diese Transkriptionsrichtung erlaubt den leichten Transfer von Paaren der V-Region zwischen Vektoren, sowie die Erzeugung intakter Antikörper oder Antikörperfragmente, wie Fab-Fragmente, ohne die ursprüngliche H- und L-Ketten-Kombinationen, die in der ursprünglichen Population polyclonaler Antikörper vorhanden waren, zu verlieren.
Außerdem erlaubt diese Clonierungsrichtung die Gruppierung der Transkriptionssteuerungsequenzen in einer einzigen Region und die gesteuerte Expression eines jeden Gens. Die einzelne Steuerungsregion kann als Kassette angelegt und mit mehreren Restriktionsenzymstellen versehen werden, damit sie leicht zwischen verschiedenen Vektoren transferiert werden kann. Auch erlaubt das Vorliegen der verknüpften Sequenzen in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung einen Mengentransfer von DNA-Fragmenten, die beide variablen Regionen umfassen, in einen Expressionsvektor in einem einzigen Schritt. Kopf-Schwanz-Transkriptionsrichtungen erfordern im allgemeinen mehrfache Clonierungsschritte.
Manchmal kann es wünschenswert sein, die Gensequenzen der variablen Region mit einem Mutagen zu behandeln. Mutagene erzeugen Punktmutationen, Lücken, Deletionen oder Additionen in der genetischen Sequenz, die allgemein oder spezifisch, zufällig oder stellengerichtet sein können. Verwendbare Mutagene sind unter anderem am Ultraviolettlicht, Gammastrahlung, Chemikalien wie Ethidiumbromit, Psoralen und Nucleinsäureanaloga, oder DNA-modifizierende Enzyme, wie Restriktionsenzyme, Transferasen, Kinasen und spezifische und nichtspezifische Nucleasen und Polymerasen. Besonders Zufallsmutationen können durch oligonucleotidgerichtete Mutagenese in die CDRs der Gene der V_H- und V_L-Regionen eingeführt werden. In die Gensequenzen eingeführte Mutationen werden im Endeffekt die Komplexität der Bibliothek wie auch ihre Affinität zu Antigen erhöhen, was die Nützlichkeit der Bibliothek für die Behandlung weiter erhöhen kann. Weiterhin kann solche Mutagenese an einem einzelnen V_H-V_L-Paar oder einer definierten Gruppe von solchen Paaren angewandt werden, um de novo eine Bibliothek zu erzeugen.
Das Clonieren geschieht z.B. durch Spaltung der cDNA- und Vektorsequenzen mit einem Restriktionsenzym, wobei nötigenfalls bestimmte Nucleinsäurefragmente isoliert, in Gegenwart von Ligase in einer geeigne ten ausbalancierten Salzlösung zusammengemischt werden, und das Gemisch unter enzymatisch akzeptablen Bedingungen über einen vorgeschriebenen Zeitraum inkubiert wird. Durch Verwendung verschiedener Enzymerkennungsstellen an jedem Ende der cDNAs, kann die Clonierungsrichtung vorbestimmt werden. Die Vektoren werden in verträgliche Wirtszellkulturen transformiert und die Kulturen amplifiziert, um die verschiedenen Vektorpopulationen, die die Bibliothek bilden, zu expandieren. Die Wirtszellen für prokaryontische Vektoren können eine Bakterienkultur wie Escherichia coli sein. Die Wirtszellen für eukaryontische Vektoren können eine Kultur von eukaryontischen Zellen sein, wie jede beliebige Säuger-, Insekten-, oder Hefen-Zellinie, die für Gewebekultur geeignet ist. Bakterielle Zellen werden mit Vektoren durch Calciumchlorid-Hitze-Schock oder Elektroporation transformiert. Eukaryontische Zellen werden mit Calciumphosphatpräzipitation oder Elektroporation transfiziert, obwohl es viele verschiedene Transformationsverfahren gibt, die ebenfalls akzeptabel wären. Die DNA-Fragmente können in prokaryontische oder eukaryontische Expressionsvektoren, Chimäre Vektoren oder Dualvektoren cloniert werden. Der Expressionsvektor kann ein Plasmid, Cosmid, Phage, viraler Vektor, Phagemid und Kombinationen davon sein, ist jedoch vorzugsweise ein Phagendisplayvektor, bei dem das rekombinante Produkt auf der Phagenoberfläche exprimiert wird, um das Absuchen und die Selektion zu erleichtern. Auf dem Expressionsvektor können nützliche Transkriptions- und Translationsstellen plaziert werden, darunter RNA-Polymerase-Erkennungsregionen, wie eine TATA-Box-Stelle, eine CAT-Stelle, ein Enhancer, geeignete Spleißstellen, wenn nötig eine AT-reiche Terminalregion und eine Transkriptions-Initiationsstelle. Nützliche Stellen zur Erleichterung der Translation sind unter anderen Translations-Start- und -Stoppstellen und Ribosomenbindungsstellen. Typischerweise sind einige der nützlicheren Stellen für eine wirkungsvolle eukaryontische Expression, wie die SV40-, CMV-, HSV- oder Baculovirus-Promotor/Enhancer-Region von Viren abgeleitet. Der erhaltene rekombinante Antikörper kann von der murinen Klasse IgG₁, IgG_2A, IgG₂₈, IgM, IgA, IgD oder IgE, der menschlichen Klasse IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgM, IgA₂, IgA₂, IgD oder IgE oder von Kombinationen oder Fragmenten davon sein. Vorzugsweise ist die Bibliothek aus chimären Antikörpern primär aus IgG-Antikörpern oder Fab-Antikörperfragmenten zusammengesetzt.
Die Amplifikation der Vektorenpopulation geschieht durch Inkubation und Expansion der rekombinanten Zellkulturen. Bakterielle Zellkulturen werden beispielsweise in L-Nährmedium über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Eukaryontische Zellen werden beispielsweise bei 37 °C bei hoher Feuchtigkeit, im CO₂-Inkubator 1–7 Tage oder länger pro Durchgang inkubiert. An diesem Punkt ist eine ziemlich hohe Komplexität der Bibliothek zu erwarten, mit großen Zahlen von Vektoren für jede verschiedene Vektorpopulation. Die Population enthält eine repräsentative Nucleinsäuresequenz für jede oder fast jede variable Region, die als Antwort auf das anfängliche Antigen erzeugt wurde.
Ein Merkmal der Erfindung ist die Leichtigkeit, mit der Paare genetischer Elemente, die intakte und exprimierbare variable Regionen enthalten, innerhalb von und zwischen Vektoren, wie prokaryontischen, eukaryontischen und Säugervektoren transferiert werden können. Ganze Bibliotheken oder Sub-Bibliotheken können mit gleicher Wirksamkeit transferiert werden. Der Transfer geschieht durch Öffnung des Vektors, vorzugsweise mit Restriktionsenzymen zwecks Stellenspezifität, zwischen den codierenden Regionen der Aminoenden der Proteine der variablen Region. In diesem Bereich können Kassetten mit Promotor- und Leadersequenzen in Kopf-Kopf-Richtung (Leader-Promoter-Promoter-Leader; lPPl), eingefügt werden, die von Prokaryonten oder von Säugern stammen können, um die vorhandene Steuerungsregion zu ersetzen, oder als erste Steuerungsregion. Die DNA-Bereiche, die die Gene der variablen Region und die lPPl-Kassette umfassen, werden dann unter Verwendung von geeigneten Primern PCR-amplifiziert und zwischen Vektoren transferiert. Gruppen verknüpfter V-Regionen mit oder ohne Promotor-Leader-Regionen, wie ganze Bibliotheken oder Teile von Bibliotheken können schnell und leicht nach Belieben transferiert werden. Diese DNA-Segmente können zur schnellen Analyse in die DNA von Phagendisplayvektoren eingebaut werden, zur langfristigen Aufbewahrung in Cosmide, oder zur anschließenden Expression in Säugervektoren. Die Expression kann zum Zweck der Herstellung polyclonaler Antikörper oder zum Absuchen von Oberflächen-Phagendisplaybibliotheken, die prokaryontisch oder eukaryontisch sein können, geschehen, um eine oder mehrere Sub-Bibliotheken zu isolieren. Ein anderes Merkmal der Erfindung ist die Fähigkeit, zusätzliche Sequenzen in die Vektoren einzubauen, um die Handhabung zu erleichtern, etwa mit zusätzlichen Restriktionsenzymstellen oder zusätzlichen Transkriptions- oder Translationssteuerungs-Regionen, um die Proteinexpression zu erleichtern oder noch weitergehend zu steuern.
Bibliotheken von Säuger- oder bakteriellen Expressionsvektoren, die rekombinante anti-neoplastische Antikörper oder Antikörperfragmente codieren, können in Sub-Bibliotheken selektiert werden, in denen das rekombinante Partikel, das eine eukaryontische oder prokaryontische Zelle oder ein Virus sein kann, an neoplastisches oder nicht-neoplastisches Gewebe adsorbiert wird. Die Selektion wird die gesamte Komplexität der Bibliothek verringern, doch die antigenspezifische Komplexität der Sub-Bibliothek dürfte nicht nennenswert beeinträchtigt sein. Das Gewebe kann eine weitere Probe des gleichen Gewebes sein, aus dem die antikörperproduzierenden Zellen gewonnen wurden, oder ein anderes Gewebe eines anderen oder desselben Patienten. Beispielsweise können nicht-neoplastische Gewebe desselben Patienten am nützlichsten seien, um nicht-neoplastische antigenbindende Antikörper zu entfernen, die auf der Oberfläche des präsentierenden Phagen exprimiert werden. Alternativ kann neoplastisches Gewebe vom gleichen oder von einem anderen Patienten am nützlichsten sein, um die spezifischen anti-neoplastischen Antikörper zu isolieren. In jedem Fall können Gewebe oder Antigene auf einem festen Träger fixiert werden und Expressionsvektoren massenhaft beispielsweise Affinitätschromatographieverfahren unterworfen werden, wobei nach Belieben entweder der Durchfluß oder die Spülungen isoliert werden können. Auch kann die Vektorenpopulation durch beispielsweise Western Blot-Analyse des exprimierten Antigens oder Southern Blot- oder Northern Blot-Analyse zur Bestimmung der Nucleinsäure abgesucht werden. Die so erhaltenen selektierten Vektoren oder Sub-Bibliotheken werden durch Züchtung und Expandieren der Population des Wirtsorganismus amplifiziert. Wenn nötig können DNA-Fragmente in bakteriellen Expressionsvektoren in Säuger-Expressionsvektoren transferiert werden, z.B. als Kassetten, da die geschaffenen verknüpften Regionen von Restriktionsenzymstellen flankiert sind. Eine Eigenschaft dieses Aspekts der Erfindung ist, daß mehr als 99,9% der Bibliothek während der Selektion entfernt werden können, doch die verbleibende Vektorenpopulation, die Subpopulation, noch amplifiziert werden kann, um große Zahlen von Vektoren oder eine große Menge von Protein zu erzeugen. Effektiv geht nichts von der spezifischen Komplexität der selektierten oder der Sub-Bibliothek verloren, und diese Sub-Bibliothek kann ebenso leicht wie die ursprüngliche Bibliothek intakt und in großer Menge zwischen Vektoren übertragen werden.
Die expandierten und amplifizierten Populationen der selektierten Expressionsvektoren können für eine spätere Anwendung aufbewahrt werden, einem Patienten direkt verabreicht werden, wenn es die Sicherheitsbe dingungen erlauben, oder die Produkte können transkribiert und übersetzt und die exprimierten neoplastischen Antikörper dem Patienten verabreicht werden. Die Verabreichung kann auf parenteralem, sublingualem, rektalem oder enteralem Weg erfolgen. Gewöhnlich wird die parenterale Verabreichung bevorzugt, zu der auch die intravenöse (i.v.) Injektion, die subcutane (s.c.) Injektion, die intramuskuläre (i.m.) Injektion, die intraarterielle Injektion, die intrathecale Injektion, die intraperitoneale (i.p.) Injektion oder die direkte Injektion in den Bereich einer Neoplasie gehören. Es können sowohl Antikörper als auch Vektoren verabreicht werden, jedoch sind Antikörper vorzuziehen, da die wirkungsvolle Expression aus dem Vektor und Umständen weitere Komplikationen aufwerfen kann, oder es können Sicherheitsbedenken in bezug auf das Einschleusen rekombinanter Vektoren-DNA in das Tier bestehen.
Die neoplastischen Störungen, die mit diesen Verfahren behandelt werden können, sind zahlreich und beinhalten Leukämien, Lymphome, Sarcome, Carcinome, neutrale Zelltumore, schuppige Zellcarcinome, Keimzellentumore, Metastasen, undifferenzierte Tumore, Seminome, Melanome, Neuroblastome, gemischte Zelltumore, durch infektiöse Mittel verursachte Neoplasien und andere Bösartigkeiten. Die universelle Anwendbarkeit des Verfahrens ist zum Teil auf seine Fähigkeit zurückzuführen, Proben von fast jedem beliebigen Antigen ausnützen zu können. Vorzugsweise ist der zu behandelnde Patient ein Mensch, doch ist auch jeder Säuger mit einem funktionierenden humoralen Immunsystem ebenfalls behandelbar. Die Patienten können je nach Notwendigkeit therapeutisch oder prophylaktisch nach vorgeschriebenen Verfahren behandelt werden. Beispielsweise durchlaufen bestimmte Krebserkrankungen aufeinanderfolgende Zyklen von Progression und Regression, die sich über Monate und Jahre erstrecken. Die Bibliotheken können kurz vor der Progressionsphase hergestellt und verabreicht werden, um das Wachstum des Krebses, den Befall andere Gewebe oder den Vorgang der Metastasenbildung zu hemmen. Die Bibliotheken können auch als große Pillen verabreicht werden, um den Krebs mit einer einzigen Dosis oder mit einer Anzahl von Dosen zu eliminieren.
Die Bibliothek kann auch im Zusammenwirken mit einem anti-neoplastischen Mittel, das das Immunsystem des Patienten stärkt, verabreicht werden, wie zum Beispiel T-Zellen-Wachstumsfaktor, B-Zellen-Wachstumsfaktor, Granulocyten/Macrophagen-Wachstumsfaktor, Granulocyten-Wachstumsfaktor, Macrophagen-Wachstumsfaktor, Stammzellen-Wachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor, Erythropoietin, Stahlfaktor, morphogenes Knochenprotein, Differtierungsmittel, Interleukin, Interferon, Hormone, Bestandteile des Komplementsystems oder eine Kombination davon. Das Behandlungsverfahren des Patienten kann auch andere Therapieformen einschließen, wie Chemotherapie, Bestrahlungstherapie, Diät oder Imunotoxintherapie. nützliche chemotherapeutische Mittel sind unter anderen alkylierende Mittel, Purin- und Pyrimidinanaloga, Vincamin und vincaminartige Alkaloide, Etoposide und etoposidartige Wirkstoffe, Antibiotika, Corticosteroide, Nitroharnstoffe, Antimetabolite, auf Platin basierende cytotoxische Gifte, hormonale Antagonisten, Anti-Androgene und Anti-Östrogene. Diese Behandlung Formen können in ein Gesamtbehandlungsverfahren für die Neoplasie des Patienten einbezogen werden.
Die immuntoxische Therapie kann durch die hier offenbarten Verfahren erleichtert werden. Zum Beispiel können rekombinante DNA-Fragmente, die sowohl die V_H- als auch die V_L-Antikörperfragmente codieren, in Expressionsvektoren cloniert werden, die die konstante Region des Antikörpers und eine giftige Substanz codieren. Die exprimierten Fusionsprodukte werden daher eine höhere Anzahl verschiedener Antikörper für die Zielneoplasie aufweisen, von denen jeder mit einer giftigen Substanz, wie einem tierischen, pflanzlichen bakteriellen, fungalen, viralen oder parasitischen Toxin verbunden ist. Die Verabreichung der Antikörperbibliothek an dem Patienten ruft nicht nur die Immunabwehr des Wirtes auf den Plan, sondern bringt das Toxin in direkten Kontakt mit der erkrankten Zelle, was die Zerstörung der Neoplasie unter Umständen erleichtern kann. Zu den besonders nützlichen Giftstoffen zählen aus bestimmten Pflanzen und Bakterien abgeleitete Toxine, wie die Pseudomonas-Toxin, Diphteria-Toxin, Escherichia-Toxin und Ricin.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf ein Verfahren zum Sichtbarmachen einer neoplastischen Störung bei einem Patienten. Eine Bibliothek patientenspezifischer anti-neoplastischer Antikörper wird wie vorstehend beschrieben erzeugt und mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie Wasser, einem Salz oder einer gepufferten Lösung, Glycerin, Öl, einem Saccharid oder Polysaccharid, Cellulose oder Stärke, Alkohol oder Kombinationen daraus vermischt. Die Antikörper der Bibliothek werden mit einem feststellbaren Marker markiert und dem Patienten verabreicht. Die Antikörper wandern durch den Körper und binden an ein Ziel, das die Neoplasie oder eine neoplastische Metastase sein kann, und die Markierung wird im Patienten sichtbar gemacht. Feststellbare Marker, die für diese Vorgehensweise nützlich sein können, sind unter anderen Radioisotope, stabile Isotope, Enzyme, fluoreszierende Verbindungen, lumineszierende Verbindungen, färbende Verbindungen, Metalle oder elektrische Ladungen. Die nunmehr markierte Neoplasie kann durch geeignete Mittel festgestellt werden, und zwar je nach Marker mit einem Geigerzähler, einem Abbildungsgerät für nuklearmagnetische Resonanz (NMR), Sichtdetektoren oder einfach nach Sicht, oder durch Autoradiographie.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf eine Zusammensetzung, die eine patientenspezifische Bibliothek anti-neoplastischer Antikörper oder Antikörperfragmente und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. Die Zusammensetzungen werden an Patienten mit der charakteristischen Neoplasie, gegen die die hergestellten Antikörper gerichtet sind, verabreicht. Der pharmazeutisch verträgliche Träger ist eine Verbindung oder ein Medium, die/das die Verabreichung erleichtert, die mögliche Aufbewahrungsdauer der Zusammensetzung verlängert oder den Nutzen der Zusammensetzung für den Patienten, beispielsweise durch Steigerung der Zirkulation oder des Serum-Halblebens erhöht. Nutzbare Träger sind unter anderen Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol, Glykole, darunter Polyethylenglykol, Öl, Polysaccharide, Salze, Glycerin, Stabilisatoren, Emulgatoren und Kombinationen davon. Die Zusammensetzung kann Antikörper oder Antikörperfragmente, vorzugsweise Fab-Fragmente umfassen, die aus der Gruppe bestehend aus den murinen Klassen IgG₁, IgG_2A, IgG_2B, IgM, IgA, IgD und IgE, den menschlichen Klassen IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgM, IgA₁, IgA₂, IgD oder IgE oder Kombinationen oder Fragmenten davon ausgewählt wird. Die Zusammensetzung kann auch durch Dialyse oder Lyophilisierung des Proteins, um alle Flüssigkeit zu entfernen, über lange Zeiträume aufbewahrt werden. Lyophilisierte Antikörper können bei Raumtemperatur jahrelang stabil bleiben.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf Verfahren zur Herstellung und Anwendung einer Bibliothek von antigen- oder gewebespezifischen polyclonalen Antikörpern oder Antikörperfragmenten wie vorstehend beschrieben. Es wird eine Probe von biologischem Gewebe oder von einem auf natürlichem, rekombinantem oder synthetischem Weg isolierten Antigen genommen, und zwar möglichst von dem zu behandelnden Patienten oder von einem Patienten mit einer verwandten Störung. Das biologische Gewebe oder Antigen, das zur Stimulation der antikörperproduzierenden Zellen verwendet wird, kann von Tumorgeweben, Blut und mit Blut verwandten Geweben, Biopsiegeweben, infizierten Geweben, Bakterien, Pilzen, Parasiten, bösartigen Geweben, genetisch abnormen Geweben oder Kombinationen davon abgeleitet sein, oder aus einer Quelle der Umwelt stammen, wie einem Wasservorkommen, aus dem Boden, aus Abfall menschlichen und natürlichen Ursprungs oder Biomasse. Die Probe wird zu einer Zellpopulation gegeben, die in der Lage ist, Antikörper zu erzeugen. Die V_H- und V_L-mRNA der Zellpopulation werden revers in V_H- und V_L-cDNA-Sequenzen transkribiert, die PCR-amplifiziert werden, wobei die so erhaltenen amplifizierten Sequenzen verknüpft werden. Die verknüpften Sequenzen werden PCR-amplifiziert, um eine Population von DNA-Fragmenten zu erzeugen, die V_H- und V_L-Antikörperfragmente codieren, die in Expressionsvektoren cloniert werden, und die Population clonierter Expressionsvektoren wird expandiert. Die Expressionsvektoren, die antigen- oder gewebespezifische Antikörper oder Antikörperfragmente codieren, können selektiert und die selektierte Subpopulation expandiert werden, um die Bibliothek zu erzeugen. Die Bibliothek aus polyclonalen Fragmenten kann im Leserahmen in andere Expressionsvektoren cloniert werden, die Gensequenzen der konstanten Antikörperregionen codieren, um polyclonale Antikörper oder Antikörperfragmente zu exprimieren. Diese Antikörper können dann zwecks systemischer Infektion dem Patienten intravenös oder subcutan injiziert, zur örtlichen Behandlung direkt auf eine Wunde aufgetragen oder je nach Bedarf dem Patienten auf andere Art und Weise verabreicht werden.
Krankheitsspezifische oder antigenspezifische Bibliotheken können in Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung solcher Störungen wie viraler, Pilz-, Parasiten- oder bakterieller Infektionen, genetischer Abnormitäten und Vergiftungen angewandt werden. Zum Beispiel können Bibliotheken von Antikörpern gegen das gp120-Protein des HIV-1-Virus, das das Immunschwächesyndrom (AIDS) verursacht, erzeugt und AIDS-Patienten verabreicht werden, um den Virus-induzierten Zelltod, die Virusladung oder die Infektiosität zu verringern, oder als Prophylaxe, um einer möglichen Infektion nach einem Kontakt oder bei der Gefahr eines Kontaktes vorzubeugen. Die Bibliotheken können dazu verwendet werden, andere Formen der passiven Immuntherapie zu ersetzen oder zu ergänzen, wie Gammaglobulinbehandlungen bei solchen Krankheiten wie Tollwut, Hepatitis, Varicella-Zoster-Virus, Herpes oder Röteln. Beispielsweise kann eine anti-Röteln-Bibliothek nach Bedarf schwangeren Frauen periodisch verabreicht werden, die Gefahr laufen, seitens eines anderen Familienangehörigen mit Röteln infiziert zu werden. Das ist frei von schädlichen Nebenwirkungen und wirkungsvoll. Anti-Herpes-Antikörper könnten nichtinfizierten Personen seitens infizierter Partner übertragen werden. Gehirnhautentzündung kann besonders bei Kindern eine lebensbedrohliche Krankheit sein, da eine wirkungsvolle Behandlung nicht immer bestimmt und schnell verabreicht werden kann. Im Gegensatz dazu können Bibliotheken polyclonaler Anti-Meningitis-Antikörper gelagert und dann angewandt werden, wenn ein Verdachtsfall vorliegt, denn das Risiko von Komplikationen bei der Behandlung ist sehr niedrig. Polyclonale Antikörper, die mit diesen Verfahren erzeugt wurden, können konventionelle Influenza-Impfungen ergänzen, indem sie kurzfristig Schutz gegen Influenza bieten, bis das eigene Immunsystem des Wirtes eine ausreichende Antikörperantwort auf das Antigen liefern kann.
Polyclonale Bibliotheken können auch zur Prophylaxe oder Behandlung bei Patienten mit Verbrennungen nützlich sein, die gegen eine Vielzahl von im Spital erworbenen Infektionen empfindlich sind, z.B. durch Staphylococcus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas und die Actinomyceten. Die Bibliotheken können dazu verwendet werden, die bakterielle Sepsis durch Erzeugung und Verabreichung von Bibliotheken gegen Lipopolysaccharide (LPS), Lipid A, Tumornekrosefaktor oder LPS-bindende Proteine zu behandeln, ihnen vorzubeugen oder die damit einhergehenden Symptome zu lindern. Auch andere Vergiftungen können mit Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern behandelt werden, wie von bakteriellen oder viralen Mikroorganismen hervorgerufene Störungen des Magen-Darm-Traktes, durch Hefen- oder andere mykotische Infektionen hervorgerufene Toxikosen oder durch Umwelteinflüsse verursachte Vergiftung mit schädlichen Metallen, wie Blei oder Aluminium, Pestiziden, Industrieabfällen, Krebserregern und anderen schädlichen organischen oder anorganischen Verbindungen.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf einen Diagnosekit zur Feststellung einer Krankheit oder Störung bei einem Patienten, oder eines verseuchenden Stoffes in der Umgebung, der eine Bibliothek von antigen-, gewebe- oder patientenspezifischen Antikörpern oder Antikörperfragmenten umfaßt. Der Diagnosekit kann dazu verwendet werden, Krankheiten, wie bakterielle, virale, Parasiten- oder mykotische Infektionen, Neoplasien oder genetische Defekte und Defizite festzustellen. Die biologische Probe kann Blut, Urin, Gallenflüssigkeit, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, Lymphe, Fruchtwasser oder Peritonealflüssigkeit sein, die vorzugsweise von einem Menschen gewonnen wurden. Bibliotheken, die aus Umweltproben gewonnen wurden, können dazu verwendet werden, verseuchende Stoffe in Proben aus Flüssen und Strömen, Salz- oder Süßwasservorkommen, Boden oder Fels oder Proben von Biomasse festzustellen. Der Antikörper kann ein ganzer Antikörper, wie etwa ein IgG oder ein Antikörperfragment, wie ein Fab-Fragment sein. Die Bibliothek kann mit einem feststellbaren Marker markiert werden, oder der Kit kann außerdem einen markierten sekundären Antikörper enthalten, der Antigen-Antikörper-Komplexe erkennt und an diese bindet. Vorzugsweise ist der feststellbare Marker visuell feststellbar, wie ein Enzym, eine fluoreszierende Chemikalie, lumineszierende Chemikalie, oder färbende Chemikalie, was die Bestimmung der Testergebnisse seitens des Anwenders oder Arztes erleichtert. Das Diagnosemittel kann weiterhin Agentien zur Erhöhung der Stabilität, der Haltbarkeit, solche zur Hemmung oder Verhinderung der Kontamination des Produktes und zur Steigerung der Geschwindigkeit der Feststellung umfassen. Nützliche Stabilisierungsmittel sind unter anderen Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol, Glykole, darunter Polyethylenglykol, Öl, Polysaccharide, Salze, Glycerin, Stabilisatoren, Emulgatoren und Kombinationen davon. Nützliche antibakterielle Mittel sind unter anderen Antibiotika, bakteriostatische und bakterizide Chemikalien. Mittel zum Optimieren der Feststellungsgeschwindigkeit, wie Salze und Puffer, können die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung zielt auf ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von Rezeptorproteinen oder beliebiger anderer Proteine, die Variabilität aufweisen. Als Rezeptorproteine können bei diesem Verfahren beliebige eukaryontische oder prokaryontische Proteine verwendet werden, die variable Regionen haben, darunter T-Zellen-Rezeptoren, wie TcR, B-Zellen Rezeptoren einschließlich Immunglobulinen, natürliche Killer-Zellen-(NK-) Rezeptoren, Macrophagen-Rezeptoren und Teile und Kombinationen davon. Kurz gesagt, wird eine Probe eines biologischen Gewebes, wie normales Gewebe, neoplastisches Gewebe, infiziertes Gewebe, Gewebe, das extrazelluläres Matrixprotein (ECM) enthält, oder ein beliebiges abnormes Gewebe in eine Zellpopulation eingeführt, die in der Lage ist, die Rezeptorproteine zu erzeugen. Die Zellpopulation wird fixiert und die Zellen werden permeabilisiert. Die mRNAs der variablen Region des Rezeptorproteins werden mittels einer reversen Transkriptase in cDNA-Sequenzen revers transkribiert. Die cDNA-Sequenzen werden PCR-amplifiziert und verknüpft, und zwar vorzugsweise durch Hybridisierung komplementärer Sequenzen an den terminalen Regionen dieser cDNAs. Die verknüpften Sequenzen werden PCR-amplifiziert und so eine Population von DNA-Fragmenten erzeugt, die die variablen Regionen des Rezeptorproteins codieren. Diese DNA-Fragmente enthalten die variablen Regionen vorzugsweise in einer Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung und werden massenhaft in Expressionsvektoren cloniert. Nützliche Expressionsvektoren sind unter anderen Phagen, wie Display-Phagen, Cosmide, virale Vektoren, Phagemiden oder Kombinationen davon, und die in Wirtsorganismen transformierten Vektoren und die verschiedenen Organismenpopulationen werden expandiert. Die Expressionsvektoren, die das rekombinante Rezeptorprotein codieren, werden selektiert und die Subpopulation wird expandiert. Die Subpopulation kann wenn nötig in Expressionsvektoren cloniert werden, die im selben Leserahmen Gene konstanter Rezeptorregionen enthalten, und die Bibliothek kann nochmals expandiert und exprimiert werden, um die Sub-Bibliothek selektierter Rezeptorproteine zu bilden. Chimäre Bibliotheken können leicht durch Clonieren der selektierten Gene der variablen Regionen in Expressionsvektoren, die die Gene der konstanten Region anderer Proteine, wie Gene konstanter Antikörperregionen oder T-Zellen-Rezeptor-Gene enthalten, hergestellt werden. Die selektierten Subbibliotheken können direkt verwendet werden oder vor der Transfektion in Wirtszellen in andere Expressionsvektoren transferiert werden. Die Wirtszellen können T-Zellen sein, die vom Patienten abgeleitet sind, und die die Rezeptorenbibliothek auf ihrer Oberfläche exprimieren, wenn sie wieder in den Patienten eingeführt werden. Diese Art von T-Zellen-Therapie kann dazu verwendet werden, eine Immunantwort zu stimulieren, um die gleichen Krankheiten wie die bei der Antikörpertherapie beschriebenen zu heilen.
Durch Verwendung der vorstehend diskutierten Verfahren zur Herstellung von Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern und von Bibliotheken von T-Zellen-Rezeptoren, können Bibliotheken chimärer Fusionsproteine hergestellt werden, die die variablen Regionen von Antikörpern verbunden mit den konstanten Regionen von T-Zellen-Rezeptoren enthalten. Solche Bibliotheken können nützlich für die Behandlung oder zur Vorbeugung von Krankheiten und Störungen sein, indem sie wie vorstehend beschrieben die Immunantwort eines Patienten stimulieren oder verstärken. Die Bindung des Antigens an den T-Zellen-Rezeptor ist beispielsweise ein integraler Bestandteil der Immunantwort. Durch Bereitstellung einer Bibliothek aus chimären Antikörpern/TcR-Protein und durch Transfektion dieser Bibliothek in eine T-Zellen-Population eines Patienten kann die eigene Immunantwort des Patienten verstärkt werden, um eine Krankheit oder Störung abzuwehren, die sonst nicht erfolgreich bekämpft werden könnte.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf Nucleinsäurevektoren, die dazu verwendet werden können, die antigenspezifischen Bibliotheken und Sub-Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern zu erzeugen. Diese Vektoren umfassen Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, die ein bequemes Clonieren erlauben, und Sequenzen, um rekombinante Nucleinsäurefragmente wirkungsvoll durch PCR zu amplifizieren. Geeignete Vektoren sind unter anderen Plasmide, Phagen, Phagemiden, Display Phagen, Cosmide, virale Vektoren und Kombinationen davon. Die Vektoren sind so entworfen, daß sie ein oder mehrere Paare genetischer Fragmente haben, wie cDNA-Fragmente, die in Kopf-Kopf-Transskriptionsrichtung insertiert sind. Vorzugsweise sind die Vektoren Expressionsvektoren und können prokaryontischer, eukaryontischer oder kombinierter oder teilweise solcher Art sein. Diese Vektoren enthalten auch vorzugsweise transkriptions- und translationssteuernde Sequenzen, wie TATA-Boxen, CAT-Boxen, Ribosomenbindungsstellen, RNA-Polymerase-Initiations- und Terminationsstellen, Leader-Sequenzen, starke Transkriptionspromotoren, die gesteuert sein können, oder Teile oder Kombinationen davon.
Beispielsweise kann ein nützlicher Vektor wie in 2 graphisch dargestellt konstruiert werden. Zuerst kann das Rückgrat des Vektors wie in 2B gezeigt aus einem handelsüblichen Phagemidenvektor, wie pUC119 (United States Biochemical; Cleveland, OH) gewonnen werden. Zwei Primer werden zur Amplifikation eines pUC119-Rückgrats verwendet, wobei am Ende eines lacZ' begonnen und am Beginn von lacI aufgehört wird. Der Vorwärtsprimer ist zum Ende des lacZ' komplementär und hat einen nichthybridisierenden Schwanz, der eine BglII-Stelle enthält. Der Rückwärtsprimer ist zum Anfang von lacI komplementär und hat einen nichthybridisierbaren Schwanz, der eine BstEII-Stelle enthält. Nach der PCR-Amplifikation wird dieses Rückgrat mit BglII und BstEII verdaut und mit einem BstEII-Insert ligiert (2B). Das BstEII-Insert wird folgendermaßen gewonnen (2A): zuerst wird der Polylinker von pUC19 (New England Biolabs; Beverly, MA) durch einen Polylinker ersetzt, der BglII-EcoRI-HindIII-BstEII enthält, wobei alle Restriktionsstellen durch 6 Nucleotide voneinander getrennt sind. Das Ersetzen geschieht durch Verdauung von pUC19 mit EcoRI und HindIII, wobei die Überhänge mit S1-Nuclease entfernt werden und das Rückgrat mit einem doppelsträngigen synthetischen Linker mit den Stellen BglII-EcoRI-HindIII-BstEII ligiert wird, und so einen modifizierter pUC (pUC 19mod) erzeugt wird. (Man bemerke, daß pUC 19 nur dazu verwendet wird, einen Polylinker mit Restriktionsenzymstellen zu liefern. Es könnte auch jeder beliebige andere, schon existierende oder leicht herzustellende Vektor verwendet werden, der einen Polylinker mit geeigneten Restriktionsstellen enthält.) Ein Cκ-Gen wird von aus menschlichen Leukocyten abgeleiteter RNA revers transkribiert und unter Verwendung eines reversen Primers, der einen nichthybridisierenden 5'-Schwanz mit einer BstEII-Restriktionsstelle, eine Translations-Terminationsstelle (Stop-Stelle) und eine XbaI-Stelle umfaßt, sowie eines Vorwärts-Primers, der einen nichthybridisierenden 5'-Schwanz mit einer HindIII-Retriktionsstelle umfaßt, durch PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit BstEII und HindIII verdaut und mit einem BstEII-HindIII-pUC19mod-Rückgrat ligiert, und so pUC19-Cκ erzeugt. Es wird ein EcoRI-BglII-DNA-Fragment synthetisiert, das das menschliche γ1-CH1-Gen enthält, angelagert an das gIII-Gensegment, das ein Fragment des cp-III-Phagenhüllproteins (Aminosäuren 198-407) enthält. Kurz gesagt, wird ein cpIII-Hüllprotein-Genfragment von einem M13-Vektor, wie M13mp18 (New England BioLabs; Beverly, MA) amplifiziert, wobei ein Rückwärts-Primer, der zur Endsequenz des cpIII-Fragments komplementär ist, jedoch mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der eine BglII-Stelle, eine Translations-Terminationsstelle (Stop-Stelle) und eine Nhel-Stelle enthält, verwendet wird. Der Vorwärts-Primer für die Amplifikation des cpIII-Fragments ist zu cpIII komplementär und hat einen nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der eine zum Ende des CH1-Gens komplementäre Sequenz und eine SpeI-Stelle enthält. Ein menschliches CH1-Gen wird von RNA, die aus menschlichen Leukocyten abgeleitet ist, revers transkribiert und PCR-amplifiziert, wozu ein Rückwärts-Primer, der zum Ende des γ1-CH1-Gens komplementär ist, mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der eine SpeI-Stelle enthält, verwendet wird. Der Vorwärts-Primer ist zum Anfang des CH1-Gens komplementär, mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der eine EcoRI-Stelle enthält. Da der Vorwärts- und der Rückwärts-Primer komplementäre Sequenzen enthalten, werden die cpIII- und CH1-PCR-Produkte durch Überlappungsextensions-PCR unter Verwendung des cpIII-Rückwärts-Primers und des CH1-Vorwärtsprimers angelagert. Das so erhaltene PCR-Produkt wird mit EcoRI und BglII geschnitten und mit einem aus pUC 19-Cκ abgeleiteten EcoRI-BglII-Rückgrat ligiert, wodurch pUC 19-Cκ-CH1 erzeugt wird. Das BglII-BstEII-Insert wird entfernt und mit dem aus pUC19 abgeleiteten BglII-BstEII-Rückgrat ligiert, wodurch der phh3hu-artige Vektor pUC119-Cκ-CH1 (2B) erzeugt wird.
Auch eine Kassette vom lppl-Typ kann leicht erzeugt werden (2C). Ein BamHI-XhoI-Fragment wird aus dem tac-Promotor (Ptac) und pelB-Leadersequenzen zusammengebaut. Die pelB-Leadersequenz wird durch PCR-Amplifikation aus dem Vektor pET-22b (Novagen, Inc.; Madison, WI), gewonnen, wozu ein Vorwärts-Primer und ein Rückwärts-Primer mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der eine Xhol-Stelle und Codons für LKVQA enthält, verwendet werden. Die Ptac-Sequenz wird durch PCR-Amplifikation aus dem Vektor pDR540 (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) gewonnen, wobei ein Vorwärts-Primer mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der eine BamHI-Stelle enthält und ein Rückwärts-Primer mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der komplementär zur Anfangssequenz des pelB-Leaders in pET-22b ist, verwendet werden. Der pelB-Leader und die Ptac-Produkte können über ihre komplementären Enden hybridisieren und werden durch Überlappungsextensions-PCR unter Verwendung der BamHI- und XhoI-enthaltenden Primer angelagert. Das so erhaltene PCR-Produkt wird mit XhoI und BamHI verdaut, und mit einem XhoI-BamHI-Rückgrat, das aus pUC19Xho abgeleitet ist, ligiert, wodurch pPl erzeugt wird. (Das pUC19Xho-Rückgrat wird durch Verdauung von pUC19 mit HindIII, Ausfüllen der Überhänge mit Klenow und Ligierung des Rückgrates mit einem XhoI-Linker gebildet.) Ein BamHI-SacI-Fragment wird aus dem lacZ-Promotor (PlacZ) und gIII-Leadersequenz des cpIII-Hüllproteins von M13 zusammengestellt. Die gIII-Leadersequenz erhält man durch PCR-Amplifikation von M13mp18 unter Verwendung eines Vorwärts-Primers und eines Rückwärts-Primers, der einen nichthybridisierenden 5'-Schwanz mit einer SacI-Stelle und die Codons für EA enthält. Die PlacZ-Sequenz erhält man durch PCR-Amplifikation von pUC119 unter Verwendung eines Vorwärts-Primers, mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz mit einer BamHI-Stelle und eines Rückwärts-Primers mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der komplementär zur Anfangssequenz des gIII-Leaders ist. Die gIII-Leader- und PlacZ-PCR-Produkte können durch ihre komplementären Enden hybridisieren und werden durch Überlappungsextensions-PCR unter Verwendung der BamHI- und SacI-enthaltenden Endprimer angelagert. Das so erhaltene PCR-Produkt wird mit SacI und BamHI verdaut und mit einem SacI-BamHI-Rückgrat, das aus pPl abgeleitet ist, ligiert, wodurch der plPPl-artige Vektor plPPl2 erzeugt wird. Wie in 2D gezeigt wird, können in den Vektor pUC119-Cκ-CH1 Kopf-Kopfverknüpfte Gene der V_H- und V_L-Region insertiert werden. Die erhaltenen Vektoren können mit XhoI und SacI geöffnet werden, um eine lPPl-Kassette aus dem Vektor plPPl2 zu insertieren und so pJS zu erzeugen.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt auf ein Verfahren zum Transfer einer Bibliothek von Nucleinsäurefragmenten zwischen verschiedenen Vektoren ohne signifikanten Verlust an Bibliotheksdiversität. Die Bibliothek kann eine Bibliothek von cDNA-Fragmenten, Fragmenten genomischer DNA, rekombinanten Nucleinsäuren, RNA, oder eine Kombination davon sein. Die Fragmente werden in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung in einen ersten Vektor insertiert. Die Insertion kann durch Ligierung der Nucleinsäuren in Vektoren geschehen, die durch Spaltung mit Restriktionsenzymen geöffnet wurden. Die Fragmente können vor der Insertion modifiziert werden, wie etwa durch Hinzufügen von Linkern und Restriktionsenzymen oder anderen Stellen, oder durch Anfügen von zusätzlichen codierenden Sequenzen. Der Erst- und der Zweitektor können prokaryontische oder eukaryontische Vektoren sein, und sie sind vorzugsweise Expressionsvektoren. Die inser tierten Sequenzen werden aus den ersten Vektoren gewonnen und ohne signifikanten Verlust von Bibliotheksdiversität in zweite Vektoren reinsertiert. Die Fragmente können durch Spaltung der rekombinanten ersten Vektoren mit den geeigneten Restriktionsenzymen in großer Menge gewonnen werden. Alternativ können die Sequenzen der Fragmente durch PCR-Amplifikation der insertierten Sequenzen gewonnen werden. Die Reinsertion geschieht durch Ligierung der Sequenzen in die zweiten Vektoren, doch die Sequenzen können wenn gewünscht vor der Ligierung wie beschrieben modifiziert werden. Die Gesamtdiversität der Bibliothek umfaßt mehr als mindestens 10 verschiedene Fragmente, vorzugsweise 100 verschiedene Fragmente, stärker vorzuziehen 1000 verschiedene Fragmente, noch stärker vorzuziehen wenigstens 10.000 verschiedene Fragmente, und möglicherweise noch viel mehr, wie 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ und 10⁹ verschiedene Fragmente. Nach dem Transfer ist zu erwarten, daß die Diversität der Bibliothek, wie durch Analyse der erhaltenen Rekombinanten festgestellt werden kann, um weniger als 90%, vorzugsweise um weniger als 50%, stärker bevorzugt um weniger als 10%, noch stärker bevorzugt um weniger als 1%, und noch stärker bevorzugt um weniger als 0,1% verringert ist, obwohl dies stärker von dem jeweiligen Bibliothekstyp abhängen kann, der hergestellt wird.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen Ausführungsformen der Erfindung, sollen jedoch nicht als den Schutzbereich der Erfindung einschränkend betrachtet werden.
Beispiele
Beispiel 1: In vivo- und in vitro-Präparation von Tumorproben
Pathologische Abfälle von menschlichen Tumoren und normalen Geweben wurden aus der Chirurgischen Pathologie am Boston University Medical Center bezogen. Von den präparierten Tumoren waren drei Eierstock-Carcinome, zwei waren Gebärmutter-Adenocarcinome, einer war ein Mesotheliom des Bauchfells und einer war ein Mundtumor vom Mundboden. Zwei Stück des Tumorgewebes und zwei Stück eines beliebigen, verfügbaren normalen Gewebes wurden in OCT (Polyvinylalkohol, Benzalkonchlorid, Polyethylenglykol, alle in destilliertem Wasser; Miles Laboratories; Kankakee, IL) schockgefroren, um anschließend tiefgefrorene (Kryostat-) Schnitte herzustellen. War genügend normales Gewebe verfügbar, wurden ein paar Proben für die anschließende Präparation von Membranen für die spätere Antikörperabsorption ohne OCT schockgefroren.
Die Tumorgewebe wurden in etwa 1 mm³ große Stückchen zerkleinert und 45 Minuten lang bei 37 °C mit einen Enzymgemisch aus 1 mg/ml Kollagenase Typ IA, 1 mg/ml Kollagenase Typ IV, 200 pg/ml DNase und 100 Einheiten/ml Hyaluronidase in Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) verdaut. Das Gemisch wurde durch Nitex gefiltert, um unverdaute Stücke zu entfernen und Zellsuspensionen zu gewinnen, die zur subcutanen (s.c.) Injektion von BALB/c-Nacktmäusen verwendet wurden, worauf sich Tumore entwickelten, Explantatkulturen in D-Val-angereichertem Medium angelegt und Aliquote davon in 90% menschlichem Serum/10% Dimethylsulfoxid (DMSO) eingefroren wurden.
Die suspendierten Zellen wurden mit IMDM gewaschen und auf einen Percoll/Phosphatgepufferte Kochsalzlösung-(PBS)-Stufengradienten geladen. Die Tumorzellen wurden zwischen 1,07 g/ml Percoll und dem PBS vom Träger isoliert. Die isolierten Tumorzellen wurden BALB/c-Mäusen i.p. injiziert, um anti-Tumor-Antikörper zu erhalten, BALB/c-Nacktmäusen s.c. injiziert, um Tumore zu bilden, in D-Val-Medium, das mit 30% eines dialysierten Gemisches aus gleichen Teilen menschlichem Serum, fötalem Rinderserum (FBS) und Ratten-Fibroblastenkultur-Zellüberstand angereichert war, zur Kultur angesetzt, um Zellinien zu etablieren und in Aliquoten mit 90% menschlichem Serum/10% DMSO für den späteren Gebrauch eingefroren.
Einer der verarbeiteten Eierstock-Tumore wurde als mäßig differenziertes Adenocarcinom diagnostiziert. Folgende Proben wurden vom Patienten am Tag der Operation gewonnen: Eine Tumorprobe aus dem Eierstock, eine Lymphknotenmetastase und normales Myometrium, Endometrium und Dünndarm. Die Tumor- und normalen Gewebeproben wurden wie oben beschrieben verarbeitet. Die mit Tumorzellen angereicherte Fraktion, die auf dem Percoll-Gradienten isoliert wurde, bestand in erster Linie aus kleinen Klumpen von großen Zellen, und eine direkte Zellzählung konnte nicht durchgeführt werden. Die Zellzahl wurde nach der Zentrifugierung aufgrund der Erfahrung mit Zellen ähnlicher Größe geschätzt. Die Ausbeute wurde auf 2 × 10⁸ Zellen von dem Eierstocktumor geschätzt. Eine anschließende Cytospin-Präparation der Zellen wurde analysiert, und es wurde festgestellt, daß sie größtenteils Tumorzellen enthielt. Vier BALB/c-Mäusen wurden je 0,25 ml dieser Zellsuspension in IMDM (auf 10⁷ Zellen pro Maus geschätzt) i.p. injiziert, um anti-Tumor-Antikörper zu erzeugen.
Einer Nacktmaus wurden 0,2 ml zerkleinerter, aus dem Eierstock abgeleiteter Tumor in IMDM s.c. injiziert. Einer anderen Nacktmaus wurden 0,2 ml zerkleinerter, aus dem Lymphknoten abgeleiteter Tumor in IMDM s.c. injiziert. Beide Nacktmäuse entwickelten subcutane Tumore. Die Tumore waren 15–18 Tage nach der Injektion sichtbar. Die Maus, der der aus dem Eierstock abgeleitete Tumor injiziert worden war, wurde 1 Monat nach der Injektion getötet, als der Tumor etwa 1,5 cm × 1 cm × 0,5 cm groß war. Die Analyse eines Cytospin-Präparats von Zellen, die durch Percollgradienten-Zentrifugierung aus ihrem Tumor isoliert worden waren, zeigte, daß er menschlichen Ursprungs und vom gleichen Typ wie der ursprüngliche Eierstocktumor war. Dieser Tumor konnte sowohl in Nacktmäusen als auch in SCID-Mäusen durch s.c.-Injektion von entweder frischen, zerkleinerten Tumorstückchen oder Tumorstücken, die in 90% menschlichem Serum/10% DMSO eingefroren und für die Injektion aufgetaut worden waren, weiter propagiert werden.
Der Tumor, der sich in den Nacktmäusen entwickelte, denen aus den Lymphknotenmetastasen abgeleiteten Tumorstückchen injiziert worden waren, wurde weiter verarbeitet. Nach dem Schockgefrieren einer Probe in flüssigem Stickstoff wurde der Tumor in 1 cm große Stückchen zerkleinert. Die Hälfte der zerkleinerten Stücke wurde in Aliquoten von 0,4 ml (gepackte Tumorstücke) in 90% menschlichem Serum/10% DMSO und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die andere Hälfte wurde dazu benützt, eine Tumorzellen Suspension durch Percoll-Dichtegradientenzentrifugierung wie oben beschrieben durchzuführen. Die gewonnenen Zellen wurden in zwei Aliquoten von je ungefähr 4 × 10⁷ Zellen in 90% menschlichem Serum/10% DMSO gefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Percoll-isolierten Zellsuspensionen des OC2-Tumors wurden dazu verwendet, i.p. und s.c. Tumore in einer Nacktmaus zu erzeugen. Die OC2-Tumore sowohl in BALB/c-Nacktmäusen als auch in SCID-Mäusen wurden durch i.p. Injektion von Tumorstücken (0,25 ml) propagiert. OC2-Tumorgewebe konnte in immundefizitären Mäusen propagiert werden, und sowohl subcutane als auch intraperitoneale Tumore entwickelten sich in einer Nacktmaus und in einer SCID-Maus.
Aufgrund der erfolgreichen Propagierung des OC2-Tumors sowohl in Nacktmäusen als auch in SCID-Mäusen wurde vom OC2-Patienten eine heparinisierte Blutprobe von 10 cc genommen. Die Leukocytenfraktion (1,4 × 10⁷ Zellen) wurde isoliert, in 90% menschlichem Serum/10% DMSO tiefgefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Es wurden noch weitere Blutproben von dem Patienten genommen. Die normale Myometrium- Probe wurde vom Patienten am Tag der Operation gewonnen und in flüssigem Stickstoff tiefgefroren, um Membranpräparate zu erhalten. Das tiefgefrorene Gewebe wurde mit einem Stößel in einem Mörser in flüssigem Stickstoff zerkleinert, in einer Pufferlösung mit den Proteaseinhibitoren Leupeptin, Aprotinin, Pepstatin und PMSF homogenisiert und 10 Minuten lang bei 1200 × g zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen. Durch 90minütige Zentrifugierung bei 150.000 × g wurden membranhaltige Präzipitate gewonnen, die bei –80 °C in Aliquoten mit 10% Glycerin aufbewahrt wurden.
Das OC2-Carcinom wurde sowohl in BALB/c-Nacktmäusen als auch in SCID-Mäusen durch s.c. oder i.p. Injektion von entweder frischen oder vorher tiefgefrorenen zerkleinerten Tumorstückchen propagiert. Zusätzlich zum ständigen Nachschub von frischem menschlichem Tumor, der in den Nacktmäusen oder in den SCID-Mäusen propagiert worden war, wurden gefrorene Aliquote von zerkleinertem Tumor und von Percollgradientenisolierten Tumorzellen hergestellt, die aus dem ersten Durchgang der OC2-Lymphknotenmetastasen durch eine Nacktmaus abgeleitet waren. Direkt vom Patienten gewonnene Zellen und Gewebestückchen wurden in 90% menschlichem Serum/10% DMSO gefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Darunter waren auch 14 Aliquote Percoll-separierter OC2-Tumorzellen, jeweils von geschätzten 10⁷ Zellen, die aus dem Eierstock des Patienten abgeleitet waren, drei Aliquote von jeweils etwa 0,75 ml von zerkleinerten OC2-Lymphknotenmetastasen vom Patienten, fünf Aliquote von jeweils 2,8 × 10⁶ Patienten-PBLs und Proben des Eierstocktumors. Die Lymphknotenmetastasen, das Myometrium, Endometrium und der Dünndarm wurden mit oder ohne OCT in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C aufbewahrt.
Beispiel 2: Erzeugung und Testen von OC2-Immunseren von Mäusen
Vier BALB/c-Mäuse wurden einmal i.p. mit etwa 10⁷ aus dem Eierstock abgeleiteten OC2-Zellen immunisiert. Die Mäuse wurden am Tag 30 mit etwa 5 × 10⁶ OC2-Tumorzellen aus der ursprünglichen Zubereitung, die in 90% menschlichem Serum/10% DMSO eingefroren, in flüssigem Stickstoffaufbewahrt und vor der Anwendung aufgetaut und gewaschen worden waren, durch i.p. Impfung aufgefrischt. Die Antiseren wurden an den Tagen 12 und 30 nach der Primärimmunisierung und am Tag 11 nach der Sekundärimmunisierung gewonnen. Den Mäusen können weitere Auffrischungsimpfungen, sowohl i.p. als auch i.v. verabreicht werden, bis keine weitere Steigerung der Antwort mehr erreicht wird. Die Reaktivität der Antiseren mit den OC2-Tumorzellen im Vergleich zur Reaktivität der Präimmunseren wird durch Festphasen-ELISA bestimmt; dazu werden OC2-Tumormembranpräparat-beschichtete Schalen und Alkaliphosphatse-markierte anti-Maus Immunglobuline von Ziegen und Nitroblautetrazol-(NBT-) plus Indolylphosphat-(BCIP-) Substrat (Promega; Madison, WI) als Entwicklersubstanzen verwendet.
Die Reaktivität von Antiseren mit 4Mikron-Kryostatschnitten des OC2-Tumors kann immunhistochemisch bestimmt werden. In Aceton fixierte Proben werden mit 0,3% H₂O₂ in Methanol behandelt, um die endogene Peroxidaseaktivität zu zerstören, und dann in PBS/1% FBS rehydratiert. Dann werden sie mit dem Antiserum etwa 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, gespült und mit biotinyliertem anti-Maus Ig von Kaninchen inkubiert. Die Färbung wird mit Avidin-Merrettichperoxidase und Diaminobenzidin entwickelt. Die Schnitte werden mit Methylgrün gegengefärbt.
Beispiel 3: Generierung bakterieller und von Säuger-Expressionsvektoren
Es wurden sowohl bakterielle als auch Säuger-Expressionsvektoren hergestellt, in denen verknüpfte Kombinationen von Genen der V_H- und V_L-Regionen in großer Menge aus den B-Zellen, in denen sie exprimiert werden, in bakterielle Expressionsvektoren und ohne die Kombinationen zu verlieren in Säuger-Expressionsvektoren transferiert werden können. Die H- und L-Ketten sind in beiden Vektoren in umgekehrter Transkriptionsrichtung mit Kopf-Kopf-Promotoren angeordnet. In dieser Richtung kann die V-Region-Genkombination als Einheit zwischen Vektoren transferiert werden. Weiterhin können die Vektoren, soweit sie zirkulär sind, durch Restriktionsenzyme zwischen den Genen der V_H- und V_L-Regionen geöffnet werden, um intervenierende DNA-Fragmente, wie Promotoren ohne Verlorst der V_H-V_L-Kombination, die auf dem selben DNA-Stück bleibt, zu insertieren.
Chimäre Proteine können auf der Oberfläche von fädigen (M13) Phagen exprimiert werden, wenn sie an ein Phagen-Hüllprotein wie cpIII oder cpVIII gebunden sind. Für diese Studien wurde der zirkuläre Phagemiden-Expressionsvektor pComb3 benützt, der eine insertierbare Stelle im selben Rahmen mit cpIII enthält; es können aber auch andere ähnliche, üblicherweise erhältliche Vektoren verwendet werden. Es wurde eine pComb3-Phagemidenvektor-DNA erzeugt, die einen Fd-Abschnitt (V_H und C_H1-Domänen) eines Antikörpers codiert. Die den Antikörperabschnitt codierende Genregion wurde an das Gen gIII gebunden, daß das Carboxyl-Ende von epIII codiert (3). Der Vektor ist kreisförmig und die Verdauung mit SpeI und NheI, die kompatible kohäsive Enden erzeugt, führt zur Entfernung des gIII-Hüllproteinfragments und ermöglicht nach der Religierung die Produktion freier Fabs. Phagendisplaybibiliotheken von 10⁷ Mitgliedern können nach einer Co-Infektion von XLI-Blue E. coli mit Helfer-Phagen erhalten werden und durch Ausstreichen auf antigenbeschichteten Oberflächen auf Antigenbindung selektiert werden. Die Gene, die die selektierten Fab-Fragmente codieren, sind in den Phagenpartikeln enthalten und damit sofort für Clonierung und Sequenzierung verfügbar.
Der pComb3-Vektor codiert auch freie L-Kette (V_L- und C_L-Kappa-Domänen), die mit der an das Hüllprotein gebundenen Fd-Region assoziiert, und so Fab-Fragmente bildet, die auf der Pagenoberfläche dargeboten werden. Das Fusionsprotein Fd-cpIII und die L-Kette werden von ihrem eigenen (lacZ) Promotor in Kopf-Schwanz-Transkriptionsrichtung exprimiert. Um eine Phagenreihe erhalten, die Antikörper hoher Affinität exprimiert, die gegen eine Vielzahl von Antigenen gerichtet sind, wie jene auf der Oberfläche einer Tumorzelle, ist es wirkungsvoller, die H- und L-Ketten-Kombinationen in vivo als Antwort auf eine Immunisierung generieren zu lassen.
Um einen bakteriellen Vektor zu erhalten, bei dem die Gene der V_H- und V_L-Region im Gegensinn der Transkriptionsrichtung angeordnet sind, wurde der pComb3-Phagendisplayvektor modifiziert. Dieser modifizierte pComb3-Vektor (phh3, 3b) enthält den LacZ- und den tac-Promotor in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung, die die Transkription der Kappa- bzw. der Fd-Gene der Maus treiben. Die C_H1-Domäne des Fd-Gens ist aus dem IgG_2b abgeleitet. Obwohl die Leadersequenzen für beide Ketten die pe1B-Leader-Aminosäuresequenz haben, unterscheiden sich die Nucleotidsequenzen an vielen Stellen. Diese Vorsichtsmaßnahme wurde getroffen, um Deletionen vorzubeugen. Die Integrität dieses Phagemidenvektors sowohl in der Doppel- als auch in der Einzelstrangform wurde durch diagnostische Restriktionsenzymanalyse, durch Sequenzierung und PCR-Amplifikation bestimmter Abschnitte überprüft.
Das DNA-Segment, das die bakteriellen Kopf-Kopf-Promotor- und Leadersequenzen von phh3, eine bakterielle lPPl-Kassette enthält, wurde durch Subclonieren in pBluescript II KS (Stratagene; La Jolla, CA) erzeugt. Der phh3-Vektor wurde durch Ersetzen der Gene der variablen Region und der Leader- und Promotorsequenzen durch eine Stück irrelevante DNA modifiziert, und so phh3mu hergestellt, das die murinen Gene Cκ und γ_2b CH1 enthält (3d). Ein zusätzlicher bidirektionaler Phagendisplayvektor, der die menschlichen Gene Cκ und γ₁ CH1 enthält (phh3hu; 3d), wurde aus phh3mu durch Ersetzen der murinen C-Gene durch menschliche C-Gene abgeleitet.
Sowohl phh3mu als auch phh3hu sind zur Clonierung verknüpfter V_L-V_H-Paare in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung nützlich. Diese zirkulären Vektoren können zwischen deen Aminoenden der Gene der V_L- und V_H-Region geöffnet werden, um eineaus plPPL abgeleitete lPPl-Kassette zu insertieren und eine bidirektionale Phagendisplaybibliothek zu erzeugen. Wie in 4c dargestellt, können die V_L-V_H-Paare, in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung verknüpft, leicht in großer Menge zwischen einem zirkulären bidirektionalen Phagendisplayvektor und einem zirkulären Säugerexpressionsvektor transferiert werden. Der Transfer erfordert das Öffnen des Vektors zwischen den V_L- und V_H-Aminoenden und den Austausch der Kassetten, die entweder prokaryontische oder Säuger-Leadersequenzen enthalten, nämlich der lPPl-Kassetten. Die V_L-V_H-Paare einschließlich der lPPl-Kassetten werden durch PCR aus einem Vektor entnommen und in einen anderen Vektor insertiert. Zur Insertion in den Säugervektor enthalten die nichthybridisierenden Schwänze der PCR-Primer Spleißstellen (ss = Spleißstelle; 3c).
Es wurde ein muriner Doppelvektor, pMDV (4a) konstruiert, der in er Lage ist, eine Mäuse-IgG_2b-H-Kette und eine Mäuse-Kappa-L-Kette zu exprimieren, und dazu verwendet, IgG₂b-Antikörper durch Transfektion in die Nullhybridom-Zellinie Sp2/0-Ag14, die keine endogenen H- oder L-Ketten produziert, zu exprimieren. Das IgG_2b-C-Region-Gen wird durch enzymatische Manipulationen wie in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Hrsg. J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY, 1989) beschrieben gegen das IgG_2a-C-Region-Gen ausgetauscht. Der murine Doppelvektor kann auch modifiziert werden, indem die murinen Cγ₂₆- und Cκ-Gene gegen menschliche Cγ₁- bzw. Cκ-Gene ausgetauscht, um den in 4b gezeigten chimären Doppelvektor zu erzeugen. Der selektierbare Marker Eco gpt verleiht in säugerzellen Resistenz gegen Mycophenolsäure, wenn im Medium Xanthin vorhanden ist.
Beispiel 4: Zellfixierung und Permeabilisierung
Die Zellen wurden im wesentlichen wie von Embleton et al. (Nuc. Acids Res. 20: 3831–37, 1992) beschrieben, mit geringfügigen Abweichungen fixiert. Die Zellen wurden bei 3–5 × 10⁷ in einem konischen 50 ml-Röhrchen (Costar; Cambridge, MA) dreimal in 10 ml PBS, pH 7.2 bei Raumtemperatur gewaschen. Das Zellpräzipitat wurde in 1,0 ml 150 mM NaCl resuspendiert, anschließend wurde 1,0 ml eiskaltes 20% Formaldehyd (Sigma Chemical; St. Louis, MO)/150 mM NaCl tropfenweise unter sanftem Vortexen (Schütteln) hinzugefügt. Die Zellen wurden auf Eis aufbewahrt und 1 Stunde lang alle 10 Minuten gevortexed (geschüttelt), dann drei Mal bei 4 °C mit eiskalter PBS bei 350 × g gewaschen. Das Röhrchen wurde angetippt, um das Präzipitat zwischenden Waschvorgängen zu dispergieren. Das Präzipitat wurde in 1,0 ml 0,5% NP-40 (Sigma Chemical; St. Louis, MO) in Wasser resuspendiert. Die Zellen wurden eine Stunde lang unter gelegentlichem Vortexen (Schütteln) auf Eis gelagert, dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen transferiert und 3 Minuten lang bei 14.000 U/min bei 4 °C zentrifugiert. Es folgten drei Waschgänge mit eiskalter PBS und ein Waschgang mit eiskalter PBS/100 mM Glycin. Zwischen den Waschgängen wurde das Präzipitat durch kräftiges Antippen des Mikrozentrifugenröhrchens dispergiert. Die Zellen wurden mit einer Mikropipette in PBS/100 mM Glycin resuspendiert, um das Zellpräzipitat zu dispergieren und sichtbare Zellklumpen zu entfernen. Aliquote von 10⁶ Zellen in PBS/100 mM Glycin wurden auf Trockeneis eingefroren und bis zu drei Wochen lang bei –80 °C gelagert.
Beispiel 5: Verkettung der H- und L-Ketten-Gene der V-Region innerhalb der Zelle Es wurde ein innerhalb der Zelle ablaufendes PCR-Verfahren entwickelt, bei dem cDNAs der V_H- und der V_L-Region in einer Population von fixierten/permeabilisierten Zellen in situ synthetisiert wurden. Es wurden zwei transfizierte Zellinien erzeugt, von denen eine einen Mäuse-IgG_2b(κ)-Antikörper, der für das Hapten p-Azophenylarsonat (Ars; J. Sharon et al., J. Immunol. 142: 596–601, 1989) spezifisch ist. Die andere Zellinie produziert einen chimären IgG_2b(κ)-Antikörper, der mit dem anti-Ars-Antikörper sowohl auf der Aminosäuren- als auch auf der Nucleotidebene identisch ist, mit Ausnahme der komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs), die von einem anti-Dextran-Antikörper abgeleitet sind. Diese zwei Zellinien wurden verwendet, da die Primer für die cDNA-Synthese und PCR, die die CDRs nicht beinhalten, die gleiche Komplementarität zu den H- und den L-Genen beider Zellinien haben, die resultierenden verknüpften V_H-V_L-Kombinationen aber durch Sequenzieren in die CDRs unterschieden werden könnten.
Die cDNA-Synthese und PCR-Amplifikationen in fixierten/permeabilisierten Zellen wurde mit geringfügigen Abweichungen im wesentlichen so ausgeführt, wie von M.J. Embleton et al. beschrieben (Nuc. Acids Res. 20: 3831–37, 1992). 2 × 10⁶ fixierte/permeabilisierte Zellen wurden ein Mal mit Wasser gewaschen und in einer 50 μl-Reaktion zur cDNA-Synthese verwendet. Es wurden 40 Einheiten Reverse Transkriptase SuperScript (Gibco/BRL; Grand Island, NY), Erststrangpuffer (Gibco/BRL; Grand Island, NY) und jeweils 25 pmol der Vorwärtsprimer 3A-CL und 1A-CH1 (Operon Technologies; Alameda, CA) verwendet. Nach der cDNA-Synthese wurden die Zellen mikrozentrifugiert (3 Minuten bei 14.000 U/min bei 4 °C), in 200 μl PBS/100 mM Glycin gewaschen und in 10 μl des gleichen Puffers resuspendiert. Die PCRs wurden mit AmpliTaq-DNA-Polymerasekit (Perkin-Elmer Cetus; Norwalk, CT) in einem DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer Cetus; Norwalk, CT) über 30 Zyklen ausgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 30 Sekunden bei 95 °C, 30 Sekunden bei 65 °C und 30 Sekunden bei 72 °C. Die Endkonzentration von MgCl₂ war 2,5 mM. Eine 20 μl PCR-Kontrolle, die ein 1,2 Kilobasenpaare-Produkt ergab, gehörte dazu.
In der ersten PCR wurden je 10 pmol der Verkettungsprimer 4L und 2H zusammen mit je 25 pmol der Vorwärtsprimer 3A-CL und 1A-CH1 verwendet.
Vorwärtsprimer:
Verbindungsprimer:
„Nested" Primer:
„Sequenzierende Primer:
„Promoter/Leader-Primer:
Nach der ersten PCR wurden die Zellen mikrozentrifugiert und der Überstand aufgenommen. Für die zweite PCR wurden nach zwei Waschgängen mit 200 μl PBS/100 mM Glycin, je 25 pmol der „nested" Primer 3L und 1H hinzugefügt. Nach Vollendung der 30 Zyklen wie vorstehend beschrieben, wurden die Zellen mikrozentrifugiert und die Überstände aufgenommen. Die Reaktionsprodukte, die nach der ersten und zweiten PCR erhalten wurden, werden in 6 gezeigt. Eine Bande von 777 bp, die der verknüpften V_H-V_L-Kombination (durch einen Pfeil angegeben) entspricht, wurde nach der zweiten PCR beobachtet. Die Produkte, die als erstes und zweites PCR-Produkt erhalten wurden, werden in den Reihen 1 bzw. 2 gezeigt. m und M sind eine 123-bp-Leiter, bzw. eine HindIII-Verdauung von Kappa-Phagen-DNA, wobei die Größen in Basenpaaren für einige Banden angegeben werden. Die beobachtete Bande wies die richtige Größe auf, die für die V_H-V_L-Kombination erwartet wurde. Diese Bande wurde Gel-gereinigt und nach der Verdauung mit EcoRI und NindIII in die EcoRI-HindIII-Stellen von M13mp19 cloniert.
Eine schematische Darstellung der Reverstranskriptasen- und PCR-Reaktion innerhalb der Zelle und der erhaltenen Produkte wird in 5 gezeigt. Nach der cDNA-Synthese mit den Primern 1A-CH1 und 3A-CL (beide Gegensinn), die zum Beginn der C_H1- und Cκ-Gene für die mRNAs der H- bzw. L-Ketten komplementär sind, wurden die gleichen Primer plus zwei Verbindungsprimer, 2H und 4L (beide Sinn) in einer ersten PCR-Reaktion verwendet. Die Verbindungsprimer liefern nicht nur eine Möglichkeit, die V_H-V_L-Kombination innerhalb von Zellen zu verketten, sondern führen auch Restriktionsstellen (XhoI und SacI) für die anschließende Clonierung von Promotorsequenzen zwischen V_H und V_L ein. Der Primer 2H hybridisiert mit dem Anfang der VH-Sequenz, einschließlich eines Teils der Leadersequenz, hat eine XhoI-Restriktionsenzymstelle, die den Aminosäurepositionen 5 und 6 der VH-Region entspricht, und enthält einen 30 Nucleotide langen Schwanz von Zufallssequenz. Der Primer 4L hybridisiert mit dem Anfang der Vκ-Sequenz einschließlich eines Teils der Leadersequenz, hat eine Sacl-Restriktionsenzymstelle, die den Aminosäurepositionen 1 und 2 der Vκ-Regionen entspricht, und enthält einen 30 Nucleotide langen Schwanz, der das reverse Komplement vom Schwanz des Primers 2H ist.
Da die Schwänze der Primer 2H und 4L komplementär sind, wurden die amplifizierten V_H- und V_L-Fragmente während der PCR durch Überlappungsextension verknüpft. Nach dem Waschen der Zellen wurde zur Entfernung extrazellulärer, nichtinkorporierter Primer und etwaiger aus den Zellen ausgetretener PCR-Produkte eine zweite PCR mit den „nested" Primern 1H und 3L angesetzt; beide Gegensinn-Primer und nicht mit den Primern 1A-CHL und 3A-CL überlappend. Der Primer 1H ist zum äußersten Anfang der CH1-Domilne des IgGγ_2b und zu einem Teil von JH2 komplementär. Zusätzlich enthält er eine HindIII-Restriktionsstelle und eine Spleißstelle. Der Primer 3L ist zum äußersten Anfang der Cκ-Domäne und zu einem Teil von Jκ1 komplementär. Er enthält eine EcoRI-Restriktionsstelle und eine Spleißstelle. Die Spleißstellen und Restriktionsstellen in den Primern 1H und 3L sind dazu gedacht, eine spätere Clonierung der verknüpften V_H-V_L-Kombinationen in die in 4 gezeigten dualen Säuger-Expressionsvektoren zu ermöglichen.
Beispiel 6: Erzeugung intakter IgG-Antikbrper nach DNA-Synthese und PCR-Amplifikation innerhalb der Zelle
Um festzustellen, ob die innerhalb der Zelle amplifizierten V_H-V_L-Kombinationen in Myelom- oder Hybridomzellen als IgG-Antikörper exprimiert werden können, wurden Kopf-Kopf-Säugerpromotoren bereitge stellt (7). Ein Clon, der eine verknüpfte V_H-V_L-Kombination enthielt, die die V-Regionen des anti-Ars-Antikörpers codiert, wurde mit XhoI und SacI verdaut und mit einem XhoI-SacI-DNA-Fragment ligiert, das einen H-Ketten-Promotor, eine Leadersequenz und DNA, die die ersten vier Aminosäuren der reifen H-Kette in Kopf-Kopf-Richtung zu einer Kappa-Ketten-Promotor- und Leadersequenz codiert, enthielt. Aus dem so erhaltenen Vektor wurde ein 2,25 kb EcoRI-HindIII-DNA-Fragment, das die Promotoren und V-Region-Gene enthielt, isoliert und in das EcoRI-HindIII-Rückgrat, das aus dem murinen Dualvektor IgG_2b abgeleitet war, ligiert. Der so erhaltene Expressionsvektor (7) wurde durch Elektoporierung in Sp2/0-Ag14 Nullhybridomzellen transfiziert.
Die Transfektanten zeigten eine Produktion intakter IgG-Antikörper, ausweislich der Western-Blot-Analyse ihrer Überstände (8a), die wie von H. Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350–54, 1979) beschrieben ausgeführt wurde. Die Position des 150 KDa-IgG-Produktes ist mit einem Pfeil markiert. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker in Kda sind ebenfalls angegeben, und zwar als: E = die aus der innerhalb der Zelle verknüpften V_H-V_L-Kombination abgeleitete Versuchs-Transfektante; – C = negative Kontrolle (parentale Sp2/0-Ag14-Zellinie); M = vorab gefärbter Molekulargewichtsmarker; + C = positive Kontrolle (eine anti-Ars-IgG_2b-Transfektante; – A = eine Transfektante, die einen mutierten IgG_2b-Antikörper, der die Ars-Bindung verloren hat, erzeugt. Wie mit Festphasen-Enzymgebundenen Immuntests (ELISA) mit Ars-BSA-beschichteten Schalen und alkaliphosphatasemarkiertem anti-Maus-IgG von Ziegen (Fc-spezifisch; 8b) im ProtoBlot-System (Promega, Madison, WI) nachgewiesen wurde, banden die Transfektanten an Ars.
In einem zusätzlichen Versuch wurde ein aus einem murinen Antikörper gegen p-Azophenylarsonat (Ars) abgeleitetes V_H-V_L-Paar zusammen mit der intervenierenden Säuger-lPPl-Kassette durch PCR aus dem Säuger-Expressionsvektor entnommen und in phh3mu transferiert. Die Säuger-lPPl-Kassette wurde dann gegen die prokaryontische lPPl-Kassette, die die Kopf-Kopf-gerichteten lacZ- und tac-Promotoren und die zwei pelB-Leadersequenzen enthielt, ausgetauscht und so phh3-Ars erzeugt. Wie in 9 gezeigt, banden die aus dem Vektor phh3-Ars hergestellten Phagen (9A, direkte ELISA) spezifisch an eine mit Ars-Rinderserumalbumin (Ars-BSA) beschichtete Schale. Weiterhin konnte die Bindung an die Ars-BSA-beschichtete Schale durch lösliche Ars-BSA inhibiert werden, nicht jedoch durch lösliche BSA (9B).
Die Ergebnisse zeigen, daß die durch PCR innerhalb der Zelle amplifizierten und verk-knüpften V_H-V_L-Kombinationen erfolgreich in einen Expressionsvektor transferiert werden können. Die verknüpften V_H-V_L-Kombinationen könnten auch leicht zuerst in den Phagemiden-Oberflächendisplayvektor phh3 und in murine oder chimäre duale Expressionsvektoren (4) transferiert werden, und daß der bidirektionale Phagendisplayvektor erfolgreich für den Transfer eines Kopf-Kopf-verknüpften V_H-V_L-Paares zur Erzeugung von Phagenpartikeln, die antigenbindende Fab-Fragmente präsentieren verwendet werden kann.
Beispiel 7: PCR-Amplifikation und Verkettung der V_H- und V_L-Region-Kombinationen aus untransformierten Zellen innerhalb der Zelle
Milzzellen und Lymphknotenzellen von immunisierten Mäusen werden nach der Lyse der roten Blutkörperchen präpariert, kombiniert, in 10% Formaldehyd fixiert, mit 0,1% NP-40 permeabilisiert und bei –80 °C in Aliquoten von 10⁷ Zellen bis zur Verwendung für die PCR innerhalb der Zelle gelagert. Weitere Mäuse werden mit aus Patienten abgeleiteten Percoll-isolierten OC2-Zellen aus den tiefgefrorenen Aliquoten immunisiert.
Ein Aliquot von fixierten/permeabilisierten Milzzellen plus aus den OC2-Immunmäusen abgeleiteten Lymphknotenzellen, abgeleitet, wird der cDNA-Synthese und PCR-Amplifikation und -Verkettung unterworfen, doch mit einem Vorrat von Primern und mit „nested" Primern, um die Amplifikation aller oder der meisten Gene der V-Region sicherzustellen. Die für diese Reaktionen verwendeten Primer sind dafür entworfen, das gesamte Immunglobulinrepertoire, einschließlich der Antikörper gegen Proteinepitope, Kohlenhydratepitope und flüssige Epitope zu erweitern.
Für die cDNA-Synthese der V_H-Regionen wird ein Vorrat von Primern (1A-CH1, Gegensinn) verwendet, der zum Beginn der CH1-Domänen jedes der Mäuse-Serum-Isotypen komplementär ist (5). Der Vorrat besteht aus sieben 1A-CH1-Primern: 1A-CH1-γ1, 1A-CH1-γ2a, 1A-CH1-γ2b, 1A-CH1-γ3, 1A-CH1-μ, 1A-CH1-ε und 1A-CH1-α. Für die cDNA-Synthese der V_L-Regionen wird ein Vorrat von Primern (3A-CL, Gegensinn) verwendet, der zum Beginn der Cκ- und Cλ-Domänen komplementär ist. Die vier 3A-CL-Primer sind: 3A-CL-κ, 3A-CL-λ1, 3A-CL-λ2 und 3A-CL-λ3.
Die gleichen Primervorräte (1A-CHl und 3A-CL) sowie Verkettungsprimer werden für die erste PCR verwendet. Die Verkettungsprimer für die V_H-Regionen (2H, Sinn) sind zum Beginn der V_H-Sequenz einschließlich eines Teils der Leadersequenz komplementär, haben eine XhoI-Restriktionsenzymstelle, die den Aminosäurepositionen 5 und 6 der VH-Region entspricht, und enthalten zusätzlich einen 30 Nucleotide langen Schwanz aus Zufallssequenz. Die neun 2H-Primer, die auf den von A.S. Kang et al. (Methods 2: 111–18, 1991) verwendeten Primern beruhen, werden als 2H1 bis 2H9 bezeichnet. Die Verkettungsprimer für die V_L-Regionen (4L, Sinn) sind zum Beginn der Vκ- und Vλ-Sequenzen einschließlich eines Teils der Leadersequenz komplementär, haben eine SacI-Stelle, die den Aminosäurepositionen l und 2 der V_L-Region entspricht, und enthalten zusätzlich einen 30 Nucleotide langen Schwanz, der das reverse Komplement des Schwanzes von Primer 2H ist. Die 4L-Primer, die bei Vκ ebenfalls auf den von A.S. Kang et al. (Methods 2: 111–18, 1991), bei Vκ auf den von E.A. Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Auflage, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) verwendeten Primern beruhen (es gibt nur zwei Vκ-Gene in der Maus) sind: 4L-Vκ1 bis 4L-Vκ7, 4L-Vλ1 und 4L-Vλ2.
Die komplementären Schwänze der 2H- und 4L-Primer verbinden die amplifizierten Fragmente der V_H- und V_L-Region durch Überlappungsextensions-PCR (H.A. Erlich, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, W.H. Freeman & Co., NY, NY, 1992). Die durch diese Primer eingeführten XhoI- und SacI-Stellen ermöglichen die nachfolgende Clonierung von Promotorsequenzen zwischen die V_H- und V_L-Sequenzen. Nach dem Waschen der Zellen, um die Primer und etwaige PCR-Produkte, die aus den Zellen ausgetreten sein könnten, zu entfernen, wird eine zweite PCR angesetzt, um die verknüpften V_H-V_L-Regionen-Kombinationen unter Verwendung der „nested" Primer (JH und JL; alle Gegensinn) weiter zu amplifizieren. Diese Primer wurden für die anschließende Clonierung der verknüpften V_H-V_L-Kombinationen in den Phagemidenvektor phh3mu oder phh3hu entworfen (3). Die JH-Primer, die als JH 1 bis JH4 bezeichnet werden, sind zu einem Teil eines JH-Gens komplementär (es gibt vier JH-Gene in der Maus) und enthalten eine zusätzliche EcoRI-Restriktionsstelle an ihren 5'-Enden. Der andere Primervorrat (JL) ist jeweils zu einem Teil des Jκ- oder Jλ-Gens (es gibt vier funktionelle Jκ- und drei funktionelle Jλ-Gene in der Maus) und enthalten eine zusätzliche HindIII-Restriktionsstelle an ihren 5'-Enden. Diese Primer sind: Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jλ1, Jλ2 und Jλ3.
Das erste und das zweite PCR-Produkt werden durch Agarose-Gelelektrophorese auf die Gegenwart von DNA-Fragmenten getestet. Nach der zweiten PCR wird ein 0,8 kb-Fragment erwartet. Diese Bande, die die amplifizierten V_H-V_L-Kombinationen enthält, wird mittels Geneclean II (Bio101; La Jolla, CA) gelisoliert.
Beispiel 8: Erzeugung einer Fab-Phagendisplaybibliothek und löslichen Fab-Bibliothek aus den verknüpften V_H-V_L-Kombinationen
Die gelisolierten V_H-V_L-Kombinationen werden mit EcoRI und HindIII verdaut und mit dem EcoRI-HindIII-Rückgrat aus dem phh3-Phagemidenvektor (oder dem phh3hu-artigen Vektor) verknüpft, und so eine Population von Phagemiden-Expressionsvektoren phh3/VH-VL, wie in den 2D und 10 gezeigt, erzeugt. Die bakterielle Transformation und die Erzeugung der Phagenbibliothek geschehen wie beschrieben (C.F. Barbas und R.A. Lerner, Methods 2:119–24, 1991). Da diese Vektoren Phagemiden sind, werden sie durch Transformation und Wachstum von XLI-Blue-E. coli in carbenicillin- und tetracyclinhaltigem Kulturmedium propagiert. Die Kolonien, die Phagemiden enthalten, werden durch Ausplattieren eines Aliquotes der Kultur auf Agar gezüchtet. Um Phagen zu erhalten, werden die Bakterien mit einem Überschuß an Helfer-Phagen VCSM13 überinfiziert, wodurch man gepackte Phagemiden erhält, die XLI-Blue-E. coli infizieren.
Das phh3/VH-VL-Ligierungsgemisch wird durch Elektroporation mit einer Transformationseffizienz von 5 × 10⁹ koloniebildenden Einheiten (cfu) pro μg DNA (Stratagene; La Jolla, CA) in kompetente XLI-Blue-SURE-Bakterienzellen transformiert, und es werden Aliquote der transformierten Zellkulturen zum Ausplattieren entnommen, um die Bibliotheksgröße und die Zahl der ursprünglichen Mitglieder zu bestimmen. Eine gute Bibliothek hat im allgemeinen wenigstens 10⁷ cfu. Nach dem Expandieren des Restes der bakteriellen Kultur, wird doppelsträngige Phagemiden-DNA präpariert und mit SacI und XhoI verdaut. Das große Fragment wird mit einem SacI-XhoI-Fragment, das die aus phh3 abgeleiteten bakteriellen Promotoren in Kopf-Kopf-Anordnung enthält, und so phh3B/VH-VL erzeugt (10).
phh3BNH-VL-artige Vektoren erhält man durch Transformation des Ligierungsgemisches in elektrokompetente SURE-Zellen. Es werden Aliquote ausplattiert, die eine Transformationseffizienz von mindestens 10⁷ Gesamt-cfu garantieren. Der Rest der transformierten Bakterien wird bei 10¹² plaquebildenden Einheiten (pfu) mit dem Helfer-Phagen VCSM13 überinfiziert, wodurch man gepackte Phagemiden erhält, die Fab-Fragmente präsentieren. Dieser letzte Schritt vergrößert die Bibliothek, indem er die zahlenmäßige Vertretung jedes ursprünglichen Mitglieds erhöht. Die Plaques werden mit Polyethylenglykol aus dem Zellüberstand gefällt und in PBS resuspendiert. Dies ist die ursprüngliche Bibliothek.
Lösliches Fab wird aus der Phagemidenbibliothek durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen SpeI und NheI, um das gIII-Hüllprotein-DNA-Segment zu entfernen, und Religierung hergestellt (10). Die Verdauung mit SpeI und NheI erzeugt kompatible kohäsive Enden, die ligiert werden. Das DNA-Fragmente, dem der gIII-Hüllproteinabschnitt fehlt, wird gelgereinigt, selbstligiert und in elektrokompetente SURE-Zellen transformiert. Die Titer der Bibliothek werden durch Ausplattieren von Aliquoten bestimmt. Es wird erwartet, daß die Bibliothek aus mindestens 10⁷ cfu besteht. Die Expression von Fab in der Kultur wird mit IPTG induziert (sowohl für den lacZ-als auch den tac-Promotor) und die Zellen werden durch drei Einfrier-/Auftauzyyklen zwischen –80 °C und 37 °C lysiert, und ergeben so Fab-haltige Lysate.
Beispiel 9: Testen der Reaktivität der ursprünglichen Fab-Bibliothek
Die Phagendisplaybibliothek wird mit dem OC2-Tumor und mit normalen Patienten-/menschlichen Geweben immunhistochemisch auf ihre Reaktivität getestet. Aus dem OC2-Tumor werden Kryostatschnitte (4 Mikron dick) präpariert, wozu sowohl der aus den Eierstöcken abgeleitete Tumor als auch der aus den Lymphmetastasen und Lymphknotenmetastasen und aus den Myometrium-, Endometrium- und Dünndarmproben, die vom OC2-Patienten gewonnen wurden, verwendet werden. In Aceton fixierte Cytospin-Präparate der PBL des Patienten und von PBL eines anderen Menschen werden wie in Current Protocols in Immunology (Hrsg. J.E. Coligan et al., John Wiley & Sons, NY, NY, 1992) beschrieben getestet. Andere Kryostatschnitte aus menschlichen Geweben, wie Leber, Nieren, Herz, Lunge, Milz, Speiseröhre, Zwolffingerdarm (Jejunum) werden aus Operationsproben und/oder Autopsien hergestellt, die 6 bis 18 Stunden nach dem Tod vorgenommen wurden. Die Immunhistochemie wird sowohl an den Kryostat- als auch an den Cytospin-Präparaten vorgenommen, außer daß zur Detektion gebundener Fab-(M13-) Phagenpartikeln statt der vorher verwendeten Avidin-Peroxidase der anti-M13 vom Schaf und anschließend der biotinylierte anti-Schaf-Antikörper vom Esel (5 Prime → 3 Prime; Boulder, CO) verwendet werden. Alternativ werden die Schnitte mit löslichem Fab behandelt, der aus der Fab-Phagendisplaybibliothek hergestellt worden war; es folgte biotinylierter anti-Maus-Kappa vom Kaninchen und dann Avidin-Peroxidase. In diesem Stadium reagieren die Bibliotheken mit den Tumorzellen und mit normalen Zellen.
Beispiel 10: Selektion der Fab-Phagendisplaybibliothek auf ihre Reaktivität mit den OC2-Tumorzellen
Wenn die V_H-V_L-Kombinationen aus Mäusen, die gegen den OC2-Tumore immun sind, amplifiziert werden, werden auch Antikörper vertreten sein, die nicht gegen die Tumorzellen oder irgendwelche anderen menschlichen Gewebe gerichtet sind vertreten sein. Um diese irrelevanten Antikörper und über repräsentierte anti-Tumor-Antikörper aus der Bibliothek zu eliminieren, wird die Fab-Phagendisplaybibliothek mit Percollgradienten-isolierten OC2-Tumorzellen auf ihre Reaktivität selektiert. Intakte, unfixierte Tumorzellen werden dazu verwendet, die Integrität der antigenen Determinanten auf den Zellmembranen zu bewahren. Ein 100 μl-Aliquot der Bibliothek, das 10¹¹ cfu enthält, wird mit 10⁷ gewaschenen OC2-Zellen 3 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gefällt, der Überstand wird entfernt, und die Zellen werden 3 Mal mit PBS gewaschen, um nicht gebundene Phagen zu entfernen. Gebundene Phagen werden von den Zellen mit 0,1 M Glycin/HCl, pH 2.2, mit 1 mg/ml BSA entfernt. Nach 5 Minuten wird die Zellsuspension mit 6 μl 2 M Trizma-Base neutralisiert und 1 : 10 mit SOC-Medium verdünnt. Diese Behandlung führt nicht zur Lyse von Säugerzellen. Die große Mehrheit bleibt während des Vorgangs intakt, doch kann ein gewisses Anschwellen der Zellen beobachtet werden. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gefällt, und der Überstand, der den eluierten Phagen enthält, wird zur Infektion von E. coli-XLI-Blue-Zellen verwendet. Aus den transformierten Zellkulturen werden Aliquote zum Ausplattieren entnommen, um die Zahl der gepackten Phagemiden zu bestimmen, die aus der Schale ausgewaschen worden waren. Die Kulturen werden mit Helfer-Phagen VCSM 13 infiziert, um mehr gepackte Phagemiden zu erzeugen. Diese werden mit einer limitierenden Zahl von OC2-Tumorzellen geschüttelt – und zwar jener Zahl, die vorab durch Retitrieren von ungebundenem Phagenpartikeln als limitierend bestimmt wurde. Die Amplifikation des eluierten Phagen und das weitere Binden an eine limitierende Zahl von OC2- Zellen, mit nachfolgender Elution werden drei oder vier Mal wiederholt, um die Tumorspezifität der selektierten Bibliothek sicherzustellen. Diese selektierte Bibliothek wird durch Immunhistochemie auf ihre Reaktivität mit dem OC2-Tumor und mit normalem Gewebe getestet. Sie zeigt eine stärkere Reaktivität, doch mit einem ähnlichen Muster, wie es bei der ursprünglichen Bibliothek beobachtet worden war.
Beispiel 11: Absorption der Tumor-selektierten Bibliothek mit normalen Menschen-/Patientengeweben und PBL
Die Tumor-selektierte Bibliothek zeigt starke Kreuzreaktivität mit normalem menschlichem Gewebe. Das Gros dieser Kteuzreaktivität könnte von normalem Gewebe, das aus jeder beliebigen menschlichen Quelle abgeleitet ist, absorbiert werden, da die große Mehrheit der menschlichen Antigene bei verschiedenen Individuen identisch sind (Molecular Biology of the Cell Hrsg. B. Alberts et al., Garland Publishing, Inc., NY, NY, 1989). Die Histokompatibilitätsantigene unterscheiden sich jedoch von Individuum zu Individuum aufgrund polymorpher Determinanten. Während die Reaktivitäten gegen die nichtpolymorphen Determinanten der Histokompatibilitätsantigene durch Gewebe von jedem Menschen absorbiert werden können, wird vom Patienten abgeleitetes Gewebe benötigt, um beliebige Fab-Phagen zu absorbieren, die mit polymorphen Determinanten dieser Antigene reagieren. Leukocyten aus peripherem Blut sind für diesen Zweck besonder gut geeignet, da sie alle Histokompatibilitätsantigene kollektiv exprimieren, darunter auch MHC-Antigene Klasse I, die in allen Körperzellen mit Zellkern vorkommen, und MHC-Antigene Klasse II, die meist in B-Zellen, Monocyten und Dendritenzellen vorkommen.
Die Fab-Phagendisplaybibliothek wird zuerst mit normalen menschlichen PBL absorbiert, dann mit einem Gemisch aus Festgewebepräparaten, die von Menschen im Allgemeinen und von OC2-Patienten im Besonderen abgeleitet sind. Zuletzt wird die Bibliothek mit PBLs vom OC2-Patienten absorbiert. Nach jeder Absorption wird die Bibliothek reamplifiziert und durch Immunhistochemie auf ihre Reaktivität gegen den OC2-Tumor und gegen normale Menschen-/Patientengewebe und PBLs getestet, wobei Kryostatschnitte und Cytospinpräparate verwendet werden. Die Reabsorptionen mit neuen Festgewebepräparaten oder PBLs und die anschließenden Reamplifikationen der Bibliothek werden fortgesetzt, bis die absorbierte Bibliothek viel stärker mit dem OC2-Tumor reagiert als mit jedem beliebigen der getesteten normalen Menschen-/Patientenzellen oder -gewebe.
Für die Absorption mit normalen menschlichen PBL werden frisch präparierte ganze Zellen verwendet. Ein Aliquot der Tumor-selektierten Fab-Phagendisplaybibliothek wird bei Raumtemperatur 3 Stunden lang mit 1 × 10⁸ PBLs geschüttelt. Überschüssige Zellen werden entfernt, um sicherzustellen, daß die meisten reaktiven Phagenpartikel entfernt wurden.
Für die Absorption mit Festgeweben werden Membranen verwendet. Eine Membranfraktion war schon aus der Myometriumprobe vom OC2-Patienten zubereitet und bei – 80 °C tiefgefroren aufbewahrt worden. Die Endometrium- und Dünndarmproben vom OC2-Patienten, die in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C aufbewahrt worden waren, wurden zur Präparation der Membranen in der gleichen Weise verarbeitet. Darüberhinaus werden andere Proben von normalem menschlichem Gewebe aus Operationsproben und Autopsien gewonnen und die Membranfraktionen präpariert und in Aliquoten mit 10% Glycerin bei –80 °C gelagert. Nach dem Auftauen werden annähernd gleiche Membranaliquote aller Gewebe vereinigt und bei Raumtemperatur 3 Stunden lang mit einem Aliquot der mit menschlichen PBL absorbierten Fab- Phagendisplaybibliothek geschüttelt. Der Überstand, der den unadsorbierten Phagen enthält, wird nach Fällung der Membranen bei 150.000 × g gewonnen.
Die Schlußabsorption der Fab-Phagendisplaybibliothek mit PBL vom OC2-Patienten geschieht wie vorstehend beim normalen menschlichen PBL beschrieben, außer der Tatsache, daß aufgrund des geringen verfügbaren Vorrats nur 5 × 10⁶ Zellen pro Absorption verwendet werden. Da die Bibliothek mit normalem Gewebe wie Endometrium, Myometrium und Dünndarm, die vom OC2-Patienten abgeleitet sind, schon absorbiert wäre, und die MHC-Klasse I-spezifischen/patientenspezifischen Fab-Phagen schon drastisch vermindert wären, ist die Absorption mit den PBL des Patienten dazu gedacht, nur die MHC-Klasse II-spezifischen, patientenspezifischen Fab-Phagen zu vermindern.
Beispiel 12: Abschätzung der Komplexität der Bibliothek
Die optimale (absorbierte) Bibliothek zielt auf viele verschiedene Epitope (antigene Determinanten). Obwohl die Tumorzellen, die zur Immunisierung von Mäusen verwendet werden, dem Immunsystem viele Epitope präsentieren, sind wahrscheinlich nur wenige immundominant, so daß Antikörper gegen sie in der ursprünglichen Bibliothek überrepräsentiert sein werden. Antikörper gegen andere Epitope werden daher in der ursprünglichen Bibliothek unterrepräsentiert sein. Obwohl dies bei einem konventionellen polyclonalen Antiserum zu großer Sorge Anlaß geben würde, umgeht die Fab-Phagendisplaybibliothek dieses Problem. Die Bindung der Bibliothek an limitierende Konzentrationen von OC2-Tumorzellen mit anschließender Reamplifikation der gebundenen Fab-Phagenpartikel erhöht die Vertretung der weniger immunogenen Epitope. Die anschließende Absorption der Tumor-selektierten Bibliothek mit normalen Geweben und PBL verringert die Vertretung mancher Epitope in der Fab-Phagendisplaybibliothek drastisch.
Eine Abschätzung der Zahl der verschiedenen Epitope, auf die die tumorselektierte/normal-gewebeabsorbierte Bibliothek zielt, erhält man durch Clonieren einiger der Mitglieder der Bibliothek. Aliquote von mit der absorbierten Fab-Phagendisplaybibliothek infizierten XLI-Blue E. coli werden ausplattiert und einzelne Kolonien ausgewählt. Die doppelsträngigen Phagemidenvektoren werden isoliert und ihre V-Region-Nucleotidsequenzen bestimmt. Die Sequenzen werden mit dem Homologie-Suchprogramm BLAST (S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–10, 1990), das von der Molecular Biology Computer Research Resource erhältlich ist, untersucht, um die Untergruppe der V-Region, die Verwendung der D-Gene und der J-Gene zu bestimmen. Diese Analyse liefert ein erstes Maß der Komplexität der Bibliothek, da sie anzeigte, ob die analysierten Clone von vielen oder von sehr wenigen ursprünglichen B-Zellen-Clones abgeleitet sind.
Als zweites Maß der Komplexität wird die Fähigkeit der Fab-Fragmente von verschiedenen Clones bestimmt, um die Bindung an die OC2-Tumorzellen zu kreuzkompetieren; dies geschieht durch ELISA unter Verwendung von Schalen mit OC2-Membranpräparaten und/oder durch Immunhistochemie. Lösliche Fab-Fragmente von verschiedenen Clones kompetieren mit der Bindung von phagengebundenen Fab-Fragmenten von einem der Clone, bei dem die Bindung von Phagen mit anti-M13-Antikörpern vom Schaf und anschließend biotinylierten anti-Schaf-Antikörpern vom Esel und Avidin-Peroxidase festgestellt wird. Wenn zwei Clone nicht kreuzkompetieren, nimmt man an, daß sie gegen verschiedene Epitope gerichtet sind. Aufgrund der Zahl der kreuzkompetierenden Clone in einem gegebenen Satz von Clones und der Zahl der cfu in der Bibliothek wird die Komplexität der Bibliothek abgeschätzt. Diese Art der Analyse gibt nur einen Hinweis auf die Zahl der Epitope unter antigenen Determinanten, auf die die Bibliothek zielt. Sie offenbart nicht, auf wieviele verschiedene Antigene gezielt wird. Dies kann jedoch abgeschätzt werden, indem die Bibliothek mit Zellbestandteilen reagieren gelassen wird, die durch 2-dimensionale Elektrophorese getrennt wurden.
Beispiel 13: Erzeugung einer anti-Tumor IgG_2a-Bibliothek von Mäusen
Um festzustellen, welches der murinen IgG-Isotope am wirksamsten Effektorfunktionen zur Eliminierung der CD4+-Zellen vermittelt, wurden chimäre Antikörper auf ihre Fähigkeit getestet, in vitro komplementabhängige Cytotoxizität, in vivo Zellentleerung und Verlängerung des Überlebens bei allogener Hauttransplantation und Unterdrückung der allo-Antikörperproduktion zu vermitteln. Insgesamt wurde bei diesen Tests als wirkungsvollster Mäuse-Idiotyp IgG_2a bestimmt. Auch andere haben gezeigt, daß IgG_2a der beste Mäuse-Isotyp hinsichtlich der Fc-vermittelten Effektorfunktionen ist. Der menschliche Isotyp IgG₁, der wahrscheinlich der zum Mäuse IgG_2a am meisten analoge Isotyp ist, hat sich als einer der beiden besten menschlichen Isotypen hinsichtlich der Fc-vermittelten Effektorfunktionen erwiesen (J.L. Dangl et al., EMBO J. 7: 1989–94, 1988).
Die Kombinationen der variablen H- und L-Regionen werden von der Phagemidenbibliothek als murine IgG_2a Antikörper exprimiert. Vor dem Transfer der verknüpften V_H-V_L-Kombinationen in den murinen Dualvektor IgG_2a (4a) wird das SacI-XhoI-DNA-Fragment, das die Kopf-Kopf-gerichteten bakteriellen Promotoren und Leadersequenzen im Phagemidenvektor phh3B/VH-VL enthält (10a), gegen ein SacI-XhoI-DNA-Fragment ausgetauscht, das die murinen H- und L-Promotoren und Leadersequenzen in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung enthält, und so phh3M/VH-VL erzeugt (10b). Die verknüpften V_H-V_L-Kombinationen einschließlich der Säuger-Promotoren werden durch PCR-Amplifikation aus dem phh3M/VH-VL-Vektor herausgenommen, wozu die 3L- und 3H-Primervorräte verwendet werden (3).
Der 1H-Primervorrat (Gegensinn) ist zum unmittelbaren Beginn der IgGy_2b-CH1-Domäne und zu einem Teil eines JH-Gens (vier Primer; einer für jedes der murinen JH-Gene) komplementär. Zusätzlich enthält dieser Primervorrat eine HindIII-Restriktionsstelle und eine Spleißstelle und eliminiert die vorher existierende EcoRI-Stelle des phh3B/VH-VL-Vektors (10a). Die 3L-Primer (Gegensinn) ist zum unmittelbaren Beginn der Cκ-Domäne und zu einem Teil des JL-Gens (7 Primer; für die 4 funktionellen Jκ-Gene und die 3 funktionellen Jλ-Gene) komplementär. Zusätzlich enthält dieser Primervorrat eine EcoRI-Restriktionsstelle und eine Spleißstelle und eliminiert die vorher existierende HindIII-Stelle des phh3B/VH-VL-Vektors (10a).
Die PCR-amplifizierten DNA-Fragmente werden gelisoliert, mit EcoRI und HindIII verdaut und mit dem EcoRI-HindIII-Rückgrat des murinen Dualvektors IgG_2a ligiert (4a). Das Ligierungsgemisch wird mit einer Transformationsfrequenz größer als 10¹⁰ pro μg DNA in elektrokompetente DH101B-Zellen transformiert (Gibco/BRL; Grand Island, NY) und so eine IgG_2a-Expressionsbibliothek erzeugt (IgG_2a/lib-Vektor). Um die Komplexität der Bibliothek während dieser Manipulationen zu erhalten, werden Bakterienzellen hoher Transformationseffizienz und Säugerzellen hoher Transfektionseffizienz verwendet.
Beispiel 14: Expression der Mäuse IgG_2a Bibliothek in Hybridomzellen, Reinigung der Antikörper, Abschätzung der Komplexität der Bibliothek
Nach der Linearisierung durch Restriktionsenzymverdauung an der einzigen SalI-Stelle, wird der IgG_2a/lib-Vektor durch Elektroporation in die Nullhybridomzellenlinie Sp2/0-Ag14 transfiziert, außer der Tatsache, daß pro Küvette 1 ml-Aliquote mit je 2 × 10⁷ Zellen verwendet werden. Die Transfektanten werden in selek tivem Medium mit Xanthin und Mycophenolsäure gewonnen. Die Transfektionsfrequenz der Sp2/0-Ag14-Zellinie beträgt etwa 1 von 10⁴ Zellen, und etwa 50% der Transfektome erzeugen nennenswerte Mengen von Immunglobulin, wie mit Western-Blot-Analyse abgeschätzt wurde.
Für die Transfektion der Bibliothek werden 5 × 10⁸ Sp2/0-Ag-14-Zellen und eine Gesamtmenge von 500–1000 μg IgG_2a Bibliotheks-Vektor-DNA verwendet, in der Erwartung, etwa 25.000 Clone zu erhalten. Die transfizierten Zellen werden 20 Stunden lang gezüchtet, und danach wird selektives Medium mit Xanthin und Mycophenolsäure hinzugefügt. Es werden Aliquote entnommen und in selektiven Medium auf Weichagar ausplattiert, um die Bibliothek zu titrieren. Der Rest wird in 4-Liter Rollerflaschen in selektivem Medium gezüchtet, um alle außer den stabil transfizierten Zellen absterben zu lassen und um eine Zelldichte von 2 × 10⁶ Zellen/ml zu erreichen.
Die Antikörper werden aus dem Kulturüberstand auf Protein A- oder Protein G-Sepharose (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) gereinigt, und die Reinheit wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) getestet. Auf der Basis der bisherigen Erfahrungen mit dieser Art von Transfektanten wird die Gewinnung von 5-10 μg IgG pro ml Kulturüberstand erwartet, also waren voraussichtlich 60 mg IgG_2a Bibliotheksantikörper aus 8 l Kulturüberstand zu erhalten.
Obwohl es keine Schätzung der Komplexität der absorbierten Fab-Phagendisplaybibliothek gibt, muß diese geringer als 10⁷, der Größe der ursprünglichen (nicht absorbierten) Fab-Phagendisplaybibliothek sein. Verwendet man eine Säugerbibliothek, die 400 mal kleiner ist als die ursprüngliche Fab-Phagendisplaybibliothek, (25.000) kann es sein, daß nicht alle einzigartigen Mitglieder der absorbierten Fab-Phagendisplaybibliothek in der Mäuse-IgG_2a Bibliothek vertreten sein werden. Dies ist nicht wahrscheinlich, da ein sehr hoher Prozentsatz der Bibliotheksmitglieder während der Absorption mit normalen Menschen/Patienten-Geweben und PBL eliminiert wird. Darüber hinaus enthält die ursprüngliche Fab-Phagendisplaybibliothek von 10⁷ Mitgliedern zahlreiche aus dem selben B-Zellen-Clon abgeleitete Mitglieder, was ihre tatsächliche Komplexität verringert. Weiterhin ist, da stabile Transfektion durch Elektroporation zur Einbeziehung mehrerer Kopien des transfizierten Vektors pro Zelle führt, die Größe der Säugerbibliothek wahrscheinlich größer als 25.000. Nichtsdestoweniger besteht eine Wahrscheinlichkeit verschieden von Null, das die Säugerbibliotheken weniger komplex als die Fab-Phagendisplaybibliothek sein werden, aus der sie abgeleitet sind. Jedoch könnte die Komplexität der Säugerbibliotheken realistischerweise nicht um mehr als eine halbe Größenordnung erhöht werden, ohne daß die Größe des Transfektionsversuchs diesen technisch undurchführbar machen würde.
Wegen der vorstehenden Überlegungen und, noch wichtiger, weil einzelne Hybridomzellentransfektanten innerhalb einer Population dazu neigen, mit verschiedenen Wachstumsraten zu wachsen, verschiedene Mengen von Immunglobulin zu erzeugen und manchmal die Immunglobulinproduktion zu verlieren, werden die Säuger-IgG-Bibliotheken nicht durch Amplifikation aus einem kleinen Zellenaliquot weiter propagiert. Stattdessen werden die Bibliotheken de novo aus der absorbierten Fab-Phagendisplaybibliothek erzeugt. Die anfängliche Expansion der Säugerbibliothek für mögliche zukünftige klinische Anwendungen wird von größerem Ausmaß sein.
Nach der Expansion der Säugerbibliotheken erhält man eine Absetzung ihrer Komplexität aus der Nucleotidsequenz der exprimierten Gene der V-Region. Es wird die cDNA-Synthese innerhalb der Zelle und die Verkettung der exprimierten Gene der H- und L-Kette der V-Region ausgeführt. Dann werden die verknüpften V_H-V_L-Kombinationen in phh3 transferiert und die Nucleotidsequenzen von 30 bis 40 Phagemidenclones bestimmt.
Beispiel 15: Auswirkung der Mäuse-IgG_2a Bibliothek auf das Wachstum des OC2-Tumors in Nacktmäusen
Die Fähigkeit von Antikörpern mit murinen C-Regionen, in einer Maus Effektorfunktionen zu vermitteln, die zur Eliminierung von Zielzellen eines bestimmten menschlichen Tumors führen, ist ein Indikator für die Fähigkeit derselben Antikörper, in Menschen Effektorfunktionen zu vermitteln, die zur Eliminierung von Zielzellen jenes Tumors führen, wenn sie mit menschlichen C-Regionen zur Verfügung gestellt werden. Deshalb wird die Nacktmaus als Modell verwendet, um das Potential der anti-Tumor-Bibliothek bei der Eliminierung von Tumor-Zielzellen in vivo zu testen. BALB/c-Nacktmäusen werden 0,25 ml OC2-Tumorstücke oder 10⁷ OC2-Tumorzellen sowohl s.c. als auch i.p. injiziert. Auch intravenöse Injektionen von Tumorzellensuspensionen werden verwendet, wenn das Wachstum des OC2-Tumors in einem beliebigen Organ nachgewiesen werden kann, beispielsweise in der Milz oder dem Eierstock. Den Mäusen werden gleichzeitig oder hintereinander die IgG_2a-Antikörperbibliothek oder im Fall der Kontrollgruppe eine äquivalente Menge Mäuse-IgG_2a injiziert. Die Wirkung der Antikörper Behandlung wird durch visuelle und taktile Untersuchung auf Entwicklung eines subcutanen Tumors bestimmt. Dessen Ausmaße werden zu verschiedenen Zeiten nach der Antikörperbehandlung im Vergleich zur Kontrollgruppe gemessen. Die Mäuse, denen intraperitoneal Tumor injiziert worden war, werden zu einer Zeit getötet, die aufgrund der Untersuchung von Kontrollmäusen, die einen sichtbaren Tumor in der Bauchhöhle entwickeln, im voraus bestimmt wird (ungefähr nach 3–5 Wochen), und auf Tumorwachstum geprüft. Es werden alle getöteten Mäuse, einschließlich aller i.v. mit Tumorzellsuspensionen geimpften auf Metastasen und Tumornekrose geprüft.
Das Wachstum der subcutanen Tumore kann schwieriger zu hemmen sein als das Wachstum der intraperitonealen Tumore oder der Tumore an anderen Stellen, da die letzteren besser für Antikörper und Effektorzellen zusätzlich zugänglich sein könnten. Es werden sowohl s.c. als auch i.p. Tumore getestet, denn wenn s.c. Tumore schwieriger zu hemmen sind, ist ihre Hemmung ein zusätzliches Maß für die Stärke der Antikörperbibliothek.
Es werden 100 μg IgG_2a-anti-Tumor-Antikörperbibliothek durch i.p. Injektion 3 Tage nach der Injektion der Tumorstücke verabreicht. Um den Prozeß zu optimieren werden je nach den Ergebnissen Antikörper zu einem früheren oder späteren Zeitpunkt injiziert. Abermals werden, je nach den Ergebnissen, verschiedenen Dosen von IgG_2a-Antikörper, mehr oder weniger als 100 μg pro Maus, durch wiederholte Injektionen auf i.v. Injektionsweg verabreicht. Es können auch verschiedene Dosen von Tumorstücken und OC2-Tumorzellen verabreicht werden. Zuerst werden für jedes Versuchsverfahren nur zwei Mäuse und für die Kontrolle (nichtspezifisches Mäuse-IgG_2a) drei Mäuse verwendet. Dann werden die Versuchsverfahren, wenn sie wirkungsvoll waren, an einer Gruppe von 5 Mäusen und 5 Mäusen in der Kontrollgruppe getestet.
Beispiel 16: Erzeugung einer chimären Maus/Mensch-IgG₁-Bibliothek und Wirkung der chimären Maus/Mensch-IgG₁-Bibliothek auf das Wachstum des OC2-Tumors bei HU-PBL-SCID-Mäusen
Einen Abschnitt des EcoRI-HindIII-DNA-Fragmentpräparates, das die verknüpften V_H-V_L-Kombinationen einschließlich der Säuger-Promotoren und Spleißstellen enthält, wird mit dem EcoRI-HindIII für Rückgrat des chimären dualen Vektors IgG₁ (4b) und in elektrokompetente DH101-B-Zellen transformiert, um eine chimäre Maus/Mensch IgG₁-Expressionsbibliothek zu erzeugen. Die Fähigkeit der chimären Maus/Mensch IgG₁-Bibliothek, das Wachstum des OC2-Tumors zu hemmen, wird sowohl in Nacktmäusen als auch in SCID-Mäusen ohne und mit Rekonstitution der SCID-Mäuse mit menschlichen PBL getestet. Es wurde gezeigt, daß menschliche Fc-Regionen murine Fc-Rezeptoren binden, und daher ist es möglich, daß die chimäre IgG₁-Bibliothek das Wachstum des OC2-Tumors hemmen wird. Es werden sowohl da subcutane als auch das intraperitoneale Tumorwachstum getestet.
Die Fähigkeit der chimären IgG₁-Antikörperbibliothek, das Wachstum des OC2-Tumors in HU-PBL-SCID-Mäusen zu hemmen, wird getestet, um festzustellen, ob die menschlichen Effektorzellen einen zusätzlichen Vorteil verleihen. Um HU-PBL-SCID-Mäuse zu erzeugen, werden SCID-Mäuse intraperitoneal mit 2 – 5 × 10⁷ adulten PBLs transplantiert, die vom Gesamtblut durch vier FicoII-Plaque Dichtegradientenzentrifugierungen zum Zeitpunkt der ersten Injektion der chimären IgG₁-Antikörperbibliothek abgetrennt wurde. Der Großteil der menschlichen PBL verbleibt in der Bauchhöhle und erscheint erst 3 bis 6 Wochen nach der Rekonstitution in der Milz und im Blut (als 1 – 10% der gesamten Zellen nach der Lyse der roten Blutkörperchen), und daher erstreckt sich der Test nur auf die Inhibition des intraperitonealen Tumorwachstums. Durch Ausscheiden EBV-positiver Proben und/oder Tumore werden Komplikationen aufgrund des Auftretens von Epstein-Barr-Virus-(EBV-) induzierten Lymphomen bei Mäusen, die mit PBL von einigen EBV-seropositiven Spendern rekonstituiert wurden, vermieden. Die Zeit des Auftretens dieser Lymphome variiert zwischen 6 und 20 Wochen nach der Rekonstitution, aber sie ist für einen gegebenen EBV-seropositiven Spender reproduzierbar. PBLs von manchen EBV-seropositiven Spendern verursachen nie Lymphome. Die PBLs von einigen wenigen Spendern werden vorab getestet, und es werden nur die Spender verwendet, deren PBL nicht zur frühen Entwicklung von Lymphomen bei den rekonstituierten Mäusen führen. Weiterhin wird eine Kontrollgruppe von Mäusen, denen der OC2-Tumor nicht injiziert wurde, in die Versuche einbezogen. Die Strategie in bezug auf die Antikörperdosen und die Reihenfolge und den Zeitpunkt der Injektionen der Antikörperbibliothek und des OC2-Tumors ist dieselbe, die bei der Mäuse-IgG2a-Bibliothek beschrieben wurde.
Dem Fachmann werden sich aus der Lektüre dieser Beschreibung und Ausführung der darin offenbarten Erfindung noch andere Ausführungsformen und Anwendungen dieser Erfindung ergeben.

Claims

Verfahren zur Erzeugung einer Bibliothek von Expressionsvektoren, umfassend eine Diversität von Paaren genetischer Elemente, codierend variable Regionen von Rezeptorproteinen, die für ein bestimmtes Ziel spezifisch sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Erhalt einer Diversität von Nukleinsäuresegmenten, umfassend Paare genetischer Elemente, codierend variable Regionen von Rezeptorproteinen, (b) Inserieren der Diversität von Segmenten in einen ersten Vektor, der für das Screening variabler Regionen, codiert durch die Inserts, geeignet ist, und Erhalt einer ersten Bibliothek, (c) Herstellung einer Unterbibliothek von Vektoren durch Screening der ersten Bibliothek, umfassend eine Diversität von Nukleinsäuresegmenten, wobei jedes Segment ein Paar variabler Regionen eines Rezeptorproteins codiert, das für ein bestimmtes Ziel spezifisch ist, und (d) massenweise Übertragung der Segmente von der Unterbibliothek zu einem zweiten Vektor, der eine Expression der variablen Rezeptorprotein-Regionen vermitteln kann, wobei "massenweise" eine Umsetzung aller Segmente mit den zweiten Vektormolekülen in derselben Reaktion involviert, was zur Bildung einer Bibliothek von Expressionsvektoren führt, die eine Diversität von Rezeptorprotein oder Fragmenten davon codieren können, umfassend Paare variabler Regionen, die für ein bestimmtes Ziel spezifisch sind, wobei die Diversität der Paare der variablen Regionen um weniger als 50 % im Vergleich zu der Unterbibliothek reduziert ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Diversität um weniger als 10 % reduziert ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Diversität um weniger als 1 % reduziert ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäuresegmente, umfasst in der Bibliothek der ersten Vektoren, mindestens eine Kassette enthalten, enthaltend mindestens ein Promotorelement, das für die Kontrolle der Expression des ersten Vektors geeignet ist.
Verfahren gemäss Anspruch 4, wobei die Kassette (Kassetten) enthaltend das Promotorelement, die für die Kontrolle der Expression des ersten Vektors geeignet ist (sind), durch eine Kassette (Kassetten) ersetzt wird (werden), die für die Kontrolle der Expression des zweiten Vektors geeignet ist (sind).
Verfahren gemäss Anspruch 5, wobei die Kassette (Kassetten) enthaltend das Promotorelement, die für die Kontrolle der Expression des ersten Vektors geeignet ist (sind) vor der massenweisen Übertragung ersetzt wird (werden).
Verfahren gemäss Anspruch 5, wobei die Kassette (Kassetten) enthaltend das Promotorelement, die für die Kontrolle der Expression des ersten Vektors geeignet ist (sind), nach der massenweisen Übertragung zum zweiten Vektor ersetzt wird (werden).
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Kassette (Kassetten) enthaltend das Promotorelement, die für die Kontrolle der Expression des ersten Vektors geeignet ist (sind), bakterielle Promotorelemente umfasst (umfassen) und wobei die Kassette (Kassetten), die für die Kontrolle der Expression des zweiten Vektors geeignet ist (sind), die die erste Kassette (Kassetten) ersetzt (ersetzen) Säugerpromotorelemente umfasst (umfassen).
Verfahren gemäss einem der Ansprüche l bis 8, wobei das Nukleinsäuresegment aus zwei unabhängigen Nukleinsäurefragmenten besteht, die jeweils eine variable Region codieren, die in entgegengesetzten und divergenten Transkriptionsorientierungen gebunden sind.
Verfahren gemäss Anspruch 9, wobei eine Kassette enthaltend ein Promotorelement, umfassend zwei Promotoren, in entgegengesetzten und divergenten Orientierungen zwischen den Nukleinsäurefragmenten eingeführt wird.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der zweite Vektor konstante Regionen des Rezeptorproteins codiert.
Verfahren gemäss Anspruch 11, wobei die konstanten Regionen aus den menschlichen Immunglobulinklassen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD oder IgE selektiert werden.
Verfahren gemäss Anspruch 12, wobei alle konstanten Regionen von einer der Immunglobulinklassen in dem Expressionsvektor, codierend einen Gesamtlängen-Antikörper, vorliegen.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Diversität der variablen Regionen der Rezeptorproteine gewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, T-Zellrezeptoren, B-Zellrezeptoren, natürlichen Killerzellrezeptoren, Makrophagenrezeptoren und Kombinationen daraus.
In vitro-Verfahren zur Erzeugung einer Zusammensetzung, umfassend rekombinante polyklonale Rezeptorproteine oder Fragmente davon mit einer Spezifität gegenüber einem gewünschten Ziel, wobei jedes Rezeptorprotein ein Paar variabler Regionen enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Erhalt einer Bibliothek von Expressionsvektoren gemäss dem Verfahren von einem der vorstehenden Ansprüche, (b) Übertragung der Bibliothek von Expressionsvektoren in einen Wirt, wobei der Wirt für die Expression der Rezeptorproteine geeignet ist, (c) Kultivieren des Wirts unter geeigneten Bedingungen, und (d) Erhalt der Zusammensetzung, umfassend polyklonale Rezeptorproteine.
Verfahren gemäss Anspruch 15, wobei der für die Expression der Rezeptorproteine geeignete Wirt eukaryontisch ist.
Verfahren gemäss Anspruch 15 oder 16, wobei die exprimierten rekombinanten polyklonalen Rezeptorproteine oder Fragmente davon Antikörper V_H- und V_L-Regionen umfassen.
Verfahren gemäss Anspruch 17, wobei die rekombinanten polyklonalen Rezeptorproteine Gesamtlängen-Antikörper sind.