DE69533697T2

DE69533697T2 - ANTISENSE OLIGONUKLEOTIDMODULATION DER raf GENEXPRESSION

Info

Publication number: DE69533697T2
Application number: DE69533697T
Authority: DE
Inventors: Brett P. Monia; Russell T. Boggs
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1995-05-31
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2015-06-01
Also published as: IL113804A0; FI964792A; EP0763052B1; JPH09507502A; WO1995032987A1; AU689267B2; IL113804A; JP3231779B2; US5563255A; NO965080L; AU2698295A; NO965080D0; EP0763052A1; CA2191795C; ATE280772T1; JP3121599B2; EP0763052A4; FI964792A0; JP2000152797A; CA2191795A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen und Verfahren zur Modulation der Expression des menschlichen c-raf-Gens, ein natürlich vorhandenes Zellgen, das bei der abnormalen Zellproliferation und Tumorbildung eine Rolle spielt. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Inhibierung der Hyperproliferation von Zellen; diese Verfahren können diagnostisch und therapeutisch verwendet werden. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung von Zuständen, die mit der Expression des menschlichen c-raf-Gens verbunden sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es wird angenommen, dass Veränderungen in den Zellgenen, die direkt oder indirekt das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung kontrollieren, die Hauptursache für Krebs sind. Die raf-Gen-Familie umfasst drei hoch konservierte Gene, die als A-, B- und c-raf (ebenfalls raf-1 genannt) bezeichnet werden. Raf-Gene kodieren Proteinkinasen, von denen angenommen wird, dass sie in Signaltransduktionsprozessen, die die Zellproliferation regulieren, wichtige regulatorische Rollen spielen. Es wird angenommen, dass die Expression des c-raf-Proteins eine Rolle in der abnormalen Zellproliferation spielt, da berichtet wurde, dass 60% aller Lungenkarzinomzelllinien ungewöhnlich hohe Gehalte an c-raf-mRNA und Protein exprimieren. Rapp et al., The Oncogene Handbook, E. P. Reddy, A. M. Skalka und T. Curran, Herausg. Elsevier Science Publishers, New York, 1988, Seiten 213–253.
Oligonukleotide wurden als therapeutische Komponenten bei der Behandlung von Krankheitszuständen in Tieren und im Menschen verwendet. Zum Beispiel haben nun Fachleute auf diesem Gebiet Antisense-, Triplex- und andere Oligonukleotidverbindungen identifiziert, die in der Lage sind, die Expression von Genen, die bei Virus-, Pilz- und Stoffwechselkrankheiten eine Rolle spielen, zu modulieren.
Das am 4. August 1992 veröffentlichte U.S. Patent 5,135,917 stellt als Beispiele Antisense-Oligonukleotide, die die menschliche Interleukin-1-Rezeptorexpression inhibieren, zur Verfügung. Das am 24. März 1992 veröffentlichte U.S. Patent, 5,098,890 von Gewirtz et al. betrifft Antisense-Oligonukleotide, die zu den c-myb-Onkogen- und Antisense-Oligonukleotidtherapien für bestimmte kanzeröse Zustände komplementär sind. Das am 11. Februar 1992 veröffentlichte U.S. Patent 5,087,617 stellt Verfahren zur Behandlung von Krebspatienten mit Antisense-Oligonukleotiden zur Verfügung. Das am 24. November 1992 veröffentlichte U.S. Patent 5,166,195 stellt HIV-Oligonukleotidinhibitoren zur Verfügung. Das am 2. April 1991 veröffentlichte U.S. Patent 5,004,810 stellt Oligomere zur Verfügung, die befähigt sind, an die Herpessimplex-Virus Vmw65-mRNA zu hybridisieren und eine Replikation zu hemmen. Das am 16. März 1993 veröffentlichte U.S. Patent 5.194,428 stellt Antisense-Oligonukleotide mit antiviraler Aktivität gegen das Influenzavirus zur Verfügung. Das am 21. Februar 1989 veröffentlichte U.S. Patent 4,806,463 stellt Antisense-Oligonukleotide und Verfahren zur Verfügung, um sie zur Inhibierung der HTLV-III-Replikation zu verwenden. Das am 15. Februar 1994 veröffentliche U.S. Patent 5,286,717 (Cohen et al.) betrifft eine gemischte Verknüpfung von Oligonukleotid-Phosphorthioaten, die zu einem Onkogen komplementär sind; das U.S. Patent 5,276,019 und das U.S. Patent 5,264,423 (Cohen et al.) betrifft Phosphorthioat-Oligonukleotidanaloga, die zur Verhinderung einer Replikation fremder Nukleinsäuren in Zellen verwendet wurden. Antisense-Oligonukleotide wurden an Menschen sicher verabreicht und es finden derzeit klinische Erprobungen von mehreren Antisense-Oligonukleotidarzneimitteln statt, die sowohl gegen virale als auch gegen zelluläre Genprodukte gerichtet sind. Es wurde gezeigt, dass das Phosphorthioat-Oligonukleotid, ISIS 2922 gegen eine Netzhautentzündung des Zytomegalievirus in AIDS-Patienten wirksam ist. Bioworld Today, 29. April 1994, S. 3. Es ist daher gesichert, dass Oligonukleotide brauchbare therapeutische Instrumente sein können und so konfiguriert werden können, dass sie bei Behandlungstherapien zur Behandlung von Zellen und Versuchstieren, insbesondere von Menschen einsetzbar sein können.
Die Antisense-Oligonukleotidinhibierung der Genexpression erwies sich als ein brauchbares Werkzeug zum Verständnis der Rollen von raf-Genen. Ein zu den ersten sechs Codons von menschlichem c-Raf komplementäres Antisense- Oligonukleotid wurde verwendet, um zu demonstrieren, dass die mitogene Reaktion von T-Zellen auf Interleukin-2 (IL-2) c-raf erfordert. Die mit dem Oligonukleotid behandelten Zellen zeigten einen nahezu vollständigen Verlust an c-raf-Protein und eine wesentliche Verringerung der proliferativen Reaktion gegen IL-2. Riedel et al., Eur. J. Immunol. 1993, 23, 3146–3150. Rapp et al. offenbarten Expressionsvektoren, die ein raf-Gen in einer Antisense-Orientierung stromabwärts eines Promotors enthielten, und Verfahren zur Inhibierung der raf-Expression durch Expression eines Antisense-Raf-Gens oder eines mutierten Raf-Gens in einer Zelle. WO-Anmeldung 93/04170. Eines zu den Codons 1-6- von murinem c-Raf komplementäres Antisense-Oligonukleotid wurde zur Aufhebung der Insulinstimulierung der DNA-Synthese in der Ratten-Hepatomzelllinie H4IIE verwendet. Tornkvist et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 13919–13921. Die WO-Anmeldung 93/06248 offenbart Verfahren zur Identifizierung eines Individuums mit erhöhtem Risiko zur Entwicklung von Krebs und zur Bestimmung einer Prognose und einer geeigneten Behandlung von Patienten, die an Krebs leiden, umfassend das Amplifizieren einer Region des c-raf-Gens und deren Analyse bezüglich eines Anzeichens für eine Mutation.
Denner et al. offenbaren Antisense-Polynukleotide, die an das Gen für raf hybridisieren, und Verfahren, die diese verwenden. WO 94/15645. Oligonukleotide, die an menschliche und Ratten-raf-Sequenzen hybridisieren, werden offenbart.
Iversen et al. offenbaren zu raf komplementäre heterotypische Antisense-Oligonukleotide, die befähigt sind, ras-aktivierte Krebszellen zu töten, und Verfahren zum Töten von raf-aktivierten Krebszellen. Zahlreiche Oligonukleotidsequenzen werden offenbart, von denen keine einzige wirklich Antisense-Oligonukleotidsequenzen sind.
Monia et al. (WO 94/08003; ISIS Pharmaceuticals) offenbaren Antisense-Oligonukleotide, die gegen DNA oder RNA, die von einem menschlichen ras-Gen stammen, gerichtet sind. Insbesondere werden Oligonukleotide offenbart, die gegen DNA oder RNA, die von dem menschlichen H-ras-Gen und dem menschlichen Ki-ras-Gen stammen, gerichtet sind.
Riedel et al. (in European Journal of Immunology, 1993, Band 23, Seiten 3146–3150) offenbaren Oligonukleotide, die gegen die kodierende Region einer menschliches c-raf kodierenden mRNA gerichtet sind, die zur Inhibierung der Expression von menschlichem c-raf befähigt sind.
Crooke et al. (in ,Antisense Research and Applications', 1993, CRC Press, Seiten 7–35) offenbaren, dass Sequenzen in der 3'-nichttranslatierten Region von Ziel-mRNA-Molekülen häufig am empfindlichsten bezüglich des Antisense-Zielens sind.
Es bleibt ein seit langem bemerktes Bedürfnis an verbesserten Verbindungen und Verfahren zur Hemmung der raf-Genexpression bestehen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt gemäß Anspruch 1 Oligonukleotide zur Verfügung, die gegen menschliches c-raf kodierende Nukleinsäuren gerichtet sind und zur Inhibierung der menschlichen c-raf-Expression befähigt sind. Gemäß Anspruch 2 und 11 stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls chimäre Oligonukleotide zur Verfügung, die gegen menschliches raf kodierende Nukleinsäuren gerichtet sind. Es wird angenommen, dass die Oligonukleotide der Erfindung sowohl diagnostisch als auch therapeutisch verwendbar sind, und es wird angenommen, dass sie besonders in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren zur Inhibierung der Expression von menschlichem c-raf gemäß Anspruch 12, insbesondere der abnormalen Expression von c-raf gemäß Anspruch 14. Es wird angenommen, dass diese Verfahren infolge der Assoziation zwischen der c-raf-Expression und der Hyperproliferation sowohl therapeutisch als auch diagnostisch verwendbar sind. Diese Verfahren sind ebenfalls als Werkzeuge zum Beispiel zum Nachweis und zur Bestimmung der Rolle der c-raf-Expression bei verschiedenen Zellfunktionen und physiologischen Prozessen und Zuständen und zur Diagnose von Zuständen, die mit der c-raf-Expression assoziiert sind, verwendbar.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls gemäß Anspruch 15 Verfahren zur Inhibierung der Hyperproliferation von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotiden der Erfindung. Es wird angenommen, dass diese Verfahren zum Beispiel zur Diagnose von einer mit c-raf assoziierten Hyperproliferation von Zellen verwendbar sind. Verfahren zur Behandlung der abnormalen proliferativen Zustände werden ebenfalls gemäß Anspruch 15 zur Verfügung gestellt. Diese Verfahren verwenden ebenfalls Oligonukleotide der Erfindung. Es wird angenommen, dass diese Verfahren sowohl therapeutisch und als auch als klinische Forschungs- und Diagnosewerkzeuge verwendbar sind.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung von ISIS 5132 (1A) und eines zerhackten Kontrolloligonukleotids ISIS 10353 (1B) auf das Wachstum von A549-Lungentumorxenotransplantaten in nackten Mäusen zeigt. ISIS 5132 verringerte in allen Dosen (0,006 mg/kg; 0,06 mg/kg; 0,6 mg/kg und 6,0 mg/kg) auf Dosisabhängige Weise die Tumorgröße. Das zerhackte Oligonukleotid ISIS 10353 wies bei keiner Dosis eine Wirkung auf (1B).
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bösartige Tumore entwickeln sich über eine Reihe von schrittweisen, fortschreitenden Änderungen, die zu dem Verlust von Wachstumskontrollcharakteristika von Krebszellen führen, das heißt, zu einer fortlaufenden nicht regulierten Proliferation, der Fähigkeit, in umgebende Gewebe einzudringen, und der Fähigkeit, an verschiedenen Organstellen Metastasen zu bilden. Sorgfältig kontrollierte in vitro Untersuchungen halfen die Faktoren zu definieren, die das Wachstum von normalen und neoplastischen Zellen charakterisieren, und führten zu der Identifikation spezifischer Proteine, die das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung kontrollieren. Die raf-Gene sind Mitglieder einer Genfamilie, die miteinander verwandte, als A-, B- und c-raf bezeichnete Proteine kodieren. Raf-Gene kodieren hoch konservierte Serin-Threonin-spezifische Proteinkinasen. Diese Enzyme werden differentiell exprimiert; c-raf, das am vollständigsten charakterisiert ist, wird in allen Organen und in allen Zelllinien, die untersucht worden sind, exprimiert. A- und B-raf werden in urogenitalen beziehungsweise in Gehirngeweben exprimiert. Die c-raf-Proteinkinaseaktivität und die subzelluläre Verteilung werden durch Mitogene über Phosphorylierung reguliert. Es wurde gezeigt, dass verschiedene Wachstumsfaktoren, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor, den sauren Fibroblastenwachstumsfaktor, den von Plättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor, Insulin, den Granulozyt-Makrophagenkolonie Insulin, den Granulocyten-Makrophagen stimulierenden Faktor, Interleukin-2, Interleukin-3 und Erythropoietin, die Phosphorylierung von c-raf induzieren. Daher wird angenommen, dass c-raf eine fundamentale Rolle in dem normalen zellulären Signaltransduktionsweg spielt, wobei eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren zu deren Gesamtwirkung, der Zellproliferation, gekoppelt werden.
Es wird angenommen, dass bestimmte abnormale proliferative Zustände mit der c-raf-Expression assoziiert sind, und es wird daher angenommen, dass sie auf eine Inhibierung der raf-Expression ansprechen. Ebenfalls spielen abnormal hohe Expressionsniveaus des raf-Proteins bei der Transformation und abnormalen Zellproliferation eine Rolle. Es wird ebenfalls angenommen, dass diese abnormalen Proliferationszustände auf eine Inhibierung der raf-Expression ansprechen. Beispiele für abnormale proliferative Zustände sind hyperproliferative Erkrankungen, wie zum Beispiel Krebs, Tumore, Hyperplasien, Lungenfibrose, Angiogenese, Psoriasis, Atherosklerose und glatte Muskelzellenproliferation in den Blutgefäßen, wie zum Beispiel Stenose oder Restenose infolge einer Angioplastie. Der zelluläre Signalweg, von dem raf ein Teil ist, spielt ebenfalls eine Rolle bei Entzündungserkrankungen, die durch eine T-Zellenproliferation (T-Zellenaktivierung und -Wachstum) charakterisiert sind, wie zum Beispiel eine Gewebetransplantatabstoßung, einen Endotoxinschock und beispielsweise eine Glomerulonephritis.
Es wurde nun festgestellt, dass eine Ausschaltung oder Verringerung der c-raf-Genexpression eine abnormale Zellproliferation anhalten oder umkehren kann. Dies wurde selbst dann festgestellt, wenn die Gehalte der c-raf-Expression nicht abnormal hoch sind. Es besteht ein großer Wunsch, Verbindungen einer Substanz bereitzustellen, die die Expression des c-raf-Gens modulieren kann. Es ist hoch erwünscht, Verfahren zum Nachweis des c-raf-Gens in Zellen, Geweben und Tieren bereitzustellen. Es ist ebenfalls erwünscht, Verfahren zur Diagnose und Behandlung von abnormalen proliferativen Zuständen, die mit einer abnormalen c-raf-Genexpression assoziiert sind, bereitzustellen. Zusätzlich sind Kits und Reagenzien zum Nachweis und zur Untersuchung des c-raf-Gens erwünscht. Eine „abnormale" c-raf-Genexpression wird hier als ein abnormal hoher Expressionsgehalt an c-raf-Protein oder als jeder c-raf-Expressionsgehalt in einer abnormalen proliferativen Bedingung oder Zustand definiert.
Die vorliegende Erfindung verwendet Oligonukleotide, die gegen c-raf-kodierende Nukleinsäuren gerichtet sind. Diese Beziehung zwischen einem Oligonukleotid und dessen komplementärem Nukleinsäureziel, an das es hybridisiert, wird im Allgemeinen als „Antisense" bezeichnet. Das „Zielen" eines Oligonukleotids auf ein ausgewähltes Nukleinsäureziel im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein mehrstufiger Prozess. Normalerweise beginnt der Prozess mit der Identifikation einer Nukleinsäuresequenz, deren Funktion moduliert werden soll. Dies können zum Beispiel ein zelluläres Gen (oder eine von dem Gen hergestellte mRNA), dessen Expression mit einem speziellen Erkrankungszustand assoziiert ist, oder eine fremde Nukleinsäure aus einem infektiösen Mittel sein. In der vorliegenden Erfindung ist das Ziel eine c-raf-kodierende Nukleinsäure; mit anderen Worten, das c-raf-Gen oder eine von dem c-raf-Gen exprimierte mRNA. Der Prozess des Zielens umfasst ebenfalls die Bestimmung einer Stelle oder mehrerer Stellen innerhalb der Nukleinsäuresequenz, damit die Oligonukleotidwechselwirkung so stattfindet, dass die gewünschte Wirkung – eine Modulation der Genexpression – resultiert. Sobald die Zielstelle oder -stellen identifiziert worden sind, werden Oligonukleotide ausgewählt, die zu dem Ziel ausreichend komplementär sind, das heißt die ausreichend gut und mit ausreichender Spezifität hybridisieren, um die gewünschte Modulation zu ergeben.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „Modulation" entweder eine Inhibierung oder Stimulation. Die Inhibierung der c-raf-Genexpression ist derzeit die bevorzugte Form der Modulation. Diese Modulation kann auf Arten, die in dem Fachgebiet zur Routine gehören, zum Beispiel durch einen Northern-Blot-Assay der Proteinexpression oder einen Western-Blot-Assay der Proteinexpression, gemäß der Lehre in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gemessen werden. Wirkungen auf die Zellproliferation oder das Tumorzellwachstum können gemäß der Lehre in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung ebenfalls gemessen werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet „Hybridisierung" eine Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen, die ebenfalls als Watson-Crick-Basenpaarung bekannt ist, zwischen komplementären Basen, normalerweise auf gegenüberliegenden Nukleinsäuresträngen oder zwei Regionen auf einem Nukleinsäurestrang. Guanin und Cytosin sind Beispiele für komplementäre Basen, von denen bekannt ist, dass sie untereinander Wasserstoffbrückenbindungen bilden. Adenin und Thymin sind Beispiele für komplementäre Basen, die untereinander zwei Wasserstoffbrückenbindungen bilden. „Spezifisch hybridisierbar" und „komplementär" sind Begriffe, die verwendet werden, um auf einen ausreichenden Grad an Komplementarität hinzuweisen, so dass eine stabile und spezifische Bindung zwischen dem DNA- oder RNA-Ziel und dem Oligonukleotid stattfindet. Es ist selbstverständlich, dass ein Oligonukleotid zu seiner Zielnukleinsäuresequenz nicht 100% komplementär sein muss, um spezifisch hybridisierbar zu sein. Ein Oligonukleotid ist spezifisch hybridisierbar, wenn die Bindung des Oligonukleotids an das Ziel die normale Funktion des Zielmoleküls stört, um einen Verlust der Brauchbarkeit zu verursachen, und es ist ein ausreichender Grad an Komplementarität vorhanden, um nicht spezifisches Binden des Oligonukleotids an Nicht-Zielsequenzen unter Bedingungen, unter denen die spezifische Bindung erwünscht ist, das heißt, unter physiologischen Bedingungen im Falle von in vivo Assays oder einer therapeutischen Behandlung oder im Falle von in vitro Assays unter Bedingungen, unter denen die Assays durchgeführt werden, zu vermeiden.
Die vorliegende Erfindung stellt gemäß den Ansprüchen 1 und 2 Oligonukleotide zur Verfügung, die gegen die 3'-nichttranslatierte Region der c-raf kodierenden mRNA gerichtet sind. Die Funktionen der zu störenden Messenger-RNA umfassen alle lebenswichtigen Funktionen, wie zum Beispiel die Translokation der RNA an die Stelle für die Proteintranslation, die eigentliche Translation eines Proteins von der RNA, das Spleißen oder die Reifung der RNA und möglicherweise sogar eine unabhängige katalytische Aktivität, die durch die RNA eingeschaltet werden kann. Die Gesamtwirkung derartiger Störungen der RNA-Funktion soll eine Störung der raf-Proteinexpression verursachen.
Die vorliegende Erfindung stellt Oligonukleotide zur Modulation der c-raf-Genexpression gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Verfügung. Derartige Oligonukleotide sind gegen c-raf kodierende Nukleinsäuren gerichtet. Wie vorstehend hier definiert wurde bedeutet „Modulation" entweder eine Inhibierung oder Stimulation. Die Inhibierung der c-raf-Genexpression ist derzeit die bevorzugte Form der Modulation.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Oligonukleotid" auf ein Oligomer oder Polymer aus Nukleotid- oder Nukleosidmonomeren, die aus natürlich vorkommenden Basen, Zuckern und Verknüpfungen zwischen Zuckern (Gerüstbindungen) bestehen. Der Begriff „Oligonukleotid" umfasst ebenfalls Oligomere, die nicht natürlich vorkommende Monomere oder Teile davon, die ähnlich wirken, umfassen. Derartige modifizierte oder substituierte Oligonukleotide werden gegenüber den nativen Formen aufgrund von Eigenschaften, wie zum Beispiel erhöhte Zellaufnahme und erhöhte Stabilität in Gegenwart von Nukleasen, häufig bevorzugt.
Bestimmte bevorzugte Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung sind chimäre Oligonukleotide. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind „chimäre Oligonukleotide" oder „Chimären" Oligonukleotide, die zwei oder mehr chemisch verschiedene Regionen enthalten, wobei jede aus mindestens einem Nukleotid besteht. Diese Oligonukleotide enthalten typischerweise mindestens eine Region eines modifizierten Nukleotids, das eine oder mehrere vorteilhafte Eigenschaften (wie zum Beispiel erhöhte Nukleasebeständigkeit, erhöhte Aufnahme in die Zellen, erhöhte Bindungsaffinität für das RNA-Ziel) verleiht, und eine Region, die ein Substrat zur RNAse H-Spaltung ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein chimäres Oligonukleotid mindestens eine Region, die modifiziert ist, um die Zielbindungsaffinität zu erhöhen, und normalerweise eine Region, die als Substrat für RNase H wirkt. Die Affinität eines Oligonukleotids für dessen Ziel (in diesem Fall eine raf kodierende Nukleinsäure) wird durch Messung der Tm eines Paares aus Oligonukleotid/Ziel routinemäßig bestimmt; die die Temperatur ist, bei der das Oligonukleotid und das Ziel dissoziieren, die Dissoziation wird spektrophotometrisch nachgewiesen. Je höher die Tm ist, desto größer ist die Affinität des Oligonukleotids für das Ziel. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Region des Oligonukleotids, das zur Erhöhung der raf-mRNA-Bindungsaffinität modifiziert worden ist, mindestens ein an der 2'-Position des Zuckers modifiziertes Nukleotid, besonders bevorzugt ein 2'-O-Alkyl- oder ein 2'-Fluor-modifiziertes Nukleotid. Derartige Modifikationen werden routine mäßig in Oligonukleotide eingebaut und es wurde gezeigt, dass diese Oligonukleotide eine höhere Tm (das heißt eine höhere Zielbindungsaffinität) als 2'-Desoxyoligonukleotide bezüglich eines gegebenen Ziels aufweisen. Die Wirkung einer derartig erhöhten Affinität besteht in einer starken Erhöhung der Antisense-Oligonukleotidinhibierung der c-raf-Genexpression. RNase N ist eine zelluläre Endonuklease, die den RNA-Strang von RNA:DNA-Duplexen spaltet; eine Aktivierung dieses Enzyms führt daher zu der Spaltung des RNA-Ziels und kann daher die Leistungsfähigkeit der Antisense-Inhibierung stark erhöhen. Eine Spaltung des RNA-Ziels kann routinemäßig durch Gelelektrophorese nachgewiesen werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das chimäre Oligonukleotid ebenfalls zur Erhöhung der Nukleasebeständigkeit modifiziert. Die Zellen enthalten eine Vielzahl von Exo- und Endonukleasen, die Nukleinsäuren abbauen können. Es wurde gezeigt, dass eine Zahl von Nukleotid- und Nukleosidmodifikationen das Oligonukleotid, in das sie eingebaut worden waren, gegen Nukleaseverdau beständiger machen als das native Oligodesoxynukleotid. Die Nukleasebeständigkeit wird routinemäßig durch Inkubation von Oligonukleotiden mit Zellextrakten oder isolierten Nukleaselösungen und durch Messung des Ausmaßes an über die Zeit hinweg intakt bleibendem Oligonukleotid, normalerweise durch Gelelektrophorese gemessen. Oligonukleotide, die zur Erhöhung ihrer Nukleasebeständigkeit modifiziert worden sind, überleben intakt während einer längeren Zeitdauer als nicht modifizierte Oligonukleotide. Es wurde gezeigt, dass eine Vielzahl von Oligonukleotidmodifikationen die Nukleasebeständigkeit erhöhen oder diese verleihen. Oligonukleotide, die mindestens eine Phosphorthioatmodifkation enthalten, sind derzeit bevorzugter. In manchen Fällen sind Oligonukleotidmodifikationen, die die Zielbindungsaffinität erhöhen, unabhängig davon ebenfalls in der Lage, die Nukleasebeständigkeit zu erhöhen.
Spezifische Beispiele für einige bevorzugte Oligonukleotide, die für die vorliegende Erfindung ins Auge gefasst werden, können Phosphorthioate, Phosphotriester, Methylphosphonate, kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkylverknüpfungen zwischen Zuckern oder kurzkettige heteroatomare oder heterocyclische Verknüpfungen zwischen Zuckern (Gerüstbindungen) enthalten. Besonders bevorzugt sind Phosphorthioate und diejenigen mit CH₂-NH-O-CH₂, CH₂-N(CH₃)-O-CH₂ (bekannt als Methylen- (Methylimino-) oder MMI-Gerüst), CH₂-O-N-(CH₃)-CH₂, CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂ und O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-Gerüste (wobei Phosphodiester O-P-O-CH₂ ist). Ebenfalls bevor zugt sind Oligonukleotide mit Morpholingerüststrukturen. Summerton, J. E. und Weiler, D. D., U.S. Patent Nr. 5,034,506. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen, wie zum Beispiel das Protein-Nukleinsäure- oder Peptid-Nukleinsäure- (PNA) Gerüst, kann das Phosphodiestergerüst des Oligonukleotids durch ein Polyamidgerüst ersetzt werden, wobei die Basen direkt oder indirekt an die Azastickstoffatome des Polyamidgerüsts gebunden sind. P. W. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science 1991, 254, 1497. Weitere bevorzugte Oligonukleotide können Alkyl- und Halogen-substituierte Zuckerkomponenten enthalten, umfassend an der 2'-Position eine der folgenden Gruppen: OH, SH, SCH₃, F, OCN, OCH₃OCH₃, OCH₃O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nNH₂ oder O(CH₂)_nCH₃, wobei n von 1 bis ungefähr 10 beträgt; C₁ bis C₁₀ Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkaryl oder Aralkyl; Cl; Br; CN; CF₃; OCF₃; O-, S- oder N-Alkyl; O-, S- oder N-Alkenyl; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂; N₃; NH₂; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl; Aminoalkylamino; Polyalkylamino; substituiertes Silyl; eine RNA-Spaltungsgruppe; eine Cholesterylgruppe; ein Konjugat; eine Reportergruppe; eine interkalierende Substanz; eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotids; oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonukleotids und andere Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Oligonukleotide können ebenfalls mimetische Zucker, wie zum Beispiel Cyclobutyle anstelle der Pentofuranosylgruppe aufweisen. Weitere bevorzugte Ausführungsformen können mindestens eine modifizierte Basenform oder „universelle Base", wie zum Beispiel Inosin umfassen.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide weisen vorzugsweise eine Länge von ungefähr 8 bis 50 Nukleotiden auf. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung versteht es sich von selbst, dass dies nicht natürlich vorkommende Oligomere, wie sie hier vorstehend beschrieben sind, mit 8 bis 50 Monomeren umfasst.
Die erfindungsgemäß verwendeten Oligonukleotide können praktisch und routinemäßig durch die gut bekannte Festphasensynthesetechnik hergestellt werden. Die Apparatur für eine derartige Synthese wird von mehreren Händlern, einschließlich Applied Biosystems, verkauft. Alle anderen Mittel können ebenfalls für eine derartige Synthese verwendet werden; die eigentliche Synthese wird entsprechend dem Können des Fachmanns ausgeführt. Die Verwendung ähnlicher Techniken zur Herstellung anderer Oligonukleotide, wie zum Beispiel Phosphorthioate und alkylierte Deri vate ist ebenfalls gut bekannt. Ebenfalls gut bekannt ist die Verwendung von ähnlichen Techniken und handelsüblichen modifizierten Amiditen und von Glasprodukten mit kontrollierten Poren (CPG-Produkte), wie zum Beispiel Biotin, Fluorescein, Acridin oder Psoralen-modifizierte Amidite und/oder CPG (erhältlich von Glen Research, Sterling VA) zur Synthese von fluoreszenzmarkierten, biotinylierten oder anderen modifizierten Oligonukleotiden, wie zum Beispiel Cholesterin-modifizierte Oligonukleotide. Es wurde nun festgestellt, dass bestimmte Oligonukleotide, die gegen Teile der c-raf-mRNA gerichtet sind, besonders zur Inhibierung der raf-Expression und zur Störung der Zellhyperproliferation einsetzbar sind. Verfahren zur Inhibierung der c-raf-Expression unter Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden sind ebenso zur Störung der Zellhyperproliferation verwendbar. In den Verfahren der Erfindung werden Gewebe oder Zellen mit Oligonukleotiden in Kontakt gebracht. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet das „Inkontaktbringen" von Geweben oder Zellen mit einem Oligonukleotid oder Oligonukleotiden, dass ein Oligonukleotid(e) normalerweise in einem flüssigen Träger, zu einer Zellsuspension oder einer Gewebeprobe entweder in vitro oder ex vivo zugegeben wird, oder dass das (die) Oligonukleotid(e) den Zellen oder Geweben innerhalb eines Tieres verabreicht werden.
Für die Therapeutik werden Verfahren zur Inhibierung der Hyperproliferation von Zellen und Verfahren zur Behandlung abnormaler proliferativer Bedingungen bereitgestellt. Es wird angenommen, dass die Formulierung von therapeutischen Zusammensetzungen und deren anschließende Verabreichung innerhalb des Könnens des Fachmanns liegen. Für eine Therapie wird im Allgemeinen einem Patienten, von dem vermutet wird, dass er einer solchen Therapie bedarf, ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid im Allgemeinen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, in Mengen und über Zeiträume, die in Abhängigkeit von der Art der speziellen Krankheit, deren Schwere und dem Gesamtzustand des Patienten variieren werden, gegeben. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer Zahl von Wegen in Abhängigkeit davon, ob eine lokale oder systemische Behandlung erwünscht ist, und von dem zu behandelnden Gebiet, verabreicht werden. Die Verabreichung kann topisch (einschließlich ophthalmisch, vaginal, rektal, intranasal), oral oder parenteral, zum Beispiel durch eine intravenöse Infusion, eine intravenöse Injektion oder durch eine subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion erfolgen.
Formulierungen zur topischen Verabreichung können Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Zäpfchen, Sprays, Flüssigkeiten und Pulver umfassen. Herkömmliche pharmazeutische Träger auf wässriger, Pulver- oder öliger Basis, Verdickungsmittel und dergleichen können notwendig oder erwünscht sein. Beschichtete Kondome, Handschuhe und dergleichen können ebenfalls verwendbar sein.
Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung umfassen Pulver oder Körnchen, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder nicht wässrigen Medien, Kapseln, Beutel oder Tabletten. Verdickungsmittel, Geschmacksmittel, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Dispersionshilfsstoffe oder Bindemittel können erwünscht sein.
Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können sterile wässrige Lösungen umfassen, die ebenfalls Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Zusatzstoffe enthalten können.
Zusätzlich zu derartigen pharmazeutischen Trägern können kationische Lipide in die Formulierung eingeschlossen werden, um die Oligonukleotidaufnahme zu erleichtern. Eine derartige Verbindung, von der gezeigt wurde, dass sie die Aufnahme erleichtert, ist Lipofectin (BRL, Bethesda MD).
Die Dosierung hängt von der Schwere und Ansprechempfindlichkeit des zu behandelnden Zustands ab, wobei der Behandlungsverlauf von mehreren Tagen bis zu mehreren Monaten oder bis eine Heilung bewirkt oder eine Verminderung des Krankheitszustandes erreicht worden ist, dauern kann. Optimale Dosierungsprogramme können aus Messungen bezüglich der Arzneimittelanhäufung im Körper berechnet werden. Der Durchschnittsfachmann kann leicht die optimalen Dosierungen, Dosierungsmethodologien und Wiederholungsraten bestimmen. Die optimalen Dosierungen können in Abhängigkeit von der relativen Wirksamkeit der einzelnen Oligonukleotide variieren und sie können im Allgemeinen basierend auf den EC50-Werten in in vitro und in vivo Tieruntersuchungen berechnet werden. Ist zum Beispiel das Molekulargewicht der Verbindung (abgeleitet aus der Oligonukleotidsequenz und der chemischen Struktur) und eine wirksame Dosis, wie zum Beispiel ein IC50-Wert (experimentell abgeleitet) gegeben, wird eine Dosis in mg/kg routinemäßig berechnet.
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls zur Diagnose von abnormalen proliferativen Zuständen in Gewebe- oder anderen Proben aus Patienten, die unter dem Verdacht stehen, eine hyperproliferative Krankheit, wie zum Beispiel Krebs, Psoriasis oder Blutgefäßrestenose oder Atherosklerose, aufzuweisen, geeignet. Die Fähigkeit der Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung zur Inhibierung der Zellproliferation kann zur Diagnose derartiger Zustände verwendet werden. Eine Anzahl von Assays kann unter Verwendung der vorliegenden Erfindung formuliert werden, wobei die Assays im Allgemeinen das Inkontaktbringen einer Gewebeprobe mit einem Oligonukleotid der Erfindung unter Bedingungen, die so ausgewählt sind, um einen Nachweis und normalerweise eine quantitative Bestimmung einer derartigen Inhibierung zu erlauben, umfassen. Entsprechend kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, um mit c-raf assoziierte Tumore von Tumoren mit anderen Ätiologien zu unterscheiden, damit eine wirksame Behandlungstherapie entworfen werden kann.
Die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung können ebenfalls für Forschungszwecke verwendet werden. Somit kann die von den Oligonukleotiden gezeigte spezifische Hybridisierung für Assays, Reinigungen, Zellproduktpräparate und in anderen Methodologien, die dem Durchschnittsfachmann klar sind, verwendet werden.
Die Oligonukleotide der Erfindung sind ebenfalls zum Nachweis und zur Diagnose der c-raf-Expression verwendbar. Zum Beispiel können radioaktiv markierte Oligonukleotide durch ³²P-Markierung an dem 5'-Ende mit Polynukleotidkinase hergestellt werden. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Band 2, S. 10.59. Dann werden radioaktiv markierte Oligonukleotide mit Gewebe oder Zellproben, bei denen eine c-raf-Expression vermutet wird, in Kontakt gebracht und die Probe wird zur Entfernung von ungebundenem Oligonukleotid gewaschen. Die in der Probe zurückbleibende Radioaktivität weist auf gebundenes Oligonukleotid hin (was wiederum auf das Vorhandensein von c-raf hinweist) und kann unter Verwendung eines Scintillationszählers oder anderer routinemäßig verwendeter Mittel quantitativ bestimmt werden. Radioaktiv markiertes Oligo kann ebenfalls zur Durchführung einer Autoradiographie von Geweben verwendet werden, um die Lokalisierung, Verteilung und Menge der c-raf-Expression für Forschungs-, Diagnose- oder therapeutische Zwecke zu bestimmen. Bei derartigen Untersuchungen werden wie vorstehend beschrieben Gewebeschnitte mit radioaktiv markiertem Oligonukleotid behandelt und gewaschen, dann mittels Routineautoradiographieverfahren einer photographischen Emulsion ausgesetzt. Nach ihrer Entwicklung ergibt die Emulsion ein Bild von Silberkörnchen über Regionen, die c-raf exprimieren. Eine quantitative Bestimmung der Silberkörnchen gestattet den Nachweis der c-raf-Expression.
Analoge Assays zum Fluoreszenznachweis der c-raf-Expression können unter Verwendung von Oligonukleotiden der Erfindung, die mit Fluorescein oder einem anderen Fluoreszenzmarker anstelle der radioaktiven Markierung konjugiert sind, entwickelt werden. Derartige Konjugationen werden routinemäßig während der Festphasensynthese unter Verwendung von markierten Amiditen oder CPG (zum Beispiel Fluorescein-markierte Amidite und CPG, erhältlich von Glen Research, Sterling VA. Siehe 1993 Catalog of Products for DNA-Research, Glen Research, Sterling VA, S. 21) ausgeführt.
Jedes dieser Assayformate ist aus dem Stand der Technik bekannt. Der Fachmann könnte leicht diese bekannten Assays zum Nachweis der raf-Expression gemäß den Lehren der Erfindung anpassen, wobei ein neues und brauchbares Mittel zum Nachweis der raf-Expression bereitgestellt wird:
Oligonukleotide, die gegen die 5'UTR, AUG-, kodierende oder Stop-Regionen von c-raf oder A-raf gerichtet sind, sind in der nachstehenden Beschreibung nur für Vergleichszwecke enthalten und fallen nicht in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Oligonukleotidinhibierung der c-raf-Expression
Die in Tabelle 1 gezeigten Oligonukleotide wurden unter Verwendung der Genbank c-raf-Sequenz HUMRAFR (Genbankeintrag x03484) synthetisiert und bezüglich einer Inhibierung der c-raf-mRNA-Expression in T24-Blasenkarzinomzellen unter Verwen dung eines Northern-Blot-Assays getestet. Es sind alles Oligodesoxynukleotide mit Phosphorthioatgerüsten.
Tabelle 1 Menschliche c-raf-Kinase-Antisense-Oligonukleotide
In einer ersten Screening-Runde von Oligonukleotiden mit Konzentrationen von 100 nM oder 200 nM zeigten die Oligonukleotide 5074, 5075, 5132, 8034, 7826, 7827 und 7828 eine Inhibierung der c-raf-mRNA von mindestens 50%. Die Oligonukleotide 5132 und 7826 (SEQ ID Nr.: 8 und SEQ ID Nr.: 17) zeigten eine Inhibierung von mehr als 90%. In zusätzlichen Assays erniedrigten die Oligonukleotide 6721, 7848, 7847 und 8094 c-raf-mRNA Spiegel um mehr als 50%. Von diesen zeigte 7847 (SEQ ID Nr.: 22) eine Inhibierung der c-raf-mRNA von ungefähr 90%.
Spezifität von ISIS 5132 für raf
Die Spezifität von ISIS 5132 für raf-mRNA wurde durch einen Northern-Blot-Assay gezeigt, in dem dieses Oligonukleotid bezüglich der Fähigkeit zur Inhibierung von Ha-ras-mRNA sowie c-raf-mRNA in T24-Zellen getestet wurde. Ha-ras ist ein zelluläres Onkogen, das bei der Transformation und Tumorgenese eine Rolle spielt. Es wurde gezeigt, dass ISIS 5132 die c-raf-mRNA ohne Auswirkung auf die Ha-ras-mRNA Spiegel beinahe vollständig abschaffte.
2'-Modifizierte Oligonukleotide
Einige dieser Oligonukleotide wurden entweder mit Phosphodiester- (P=O) oder Phosphorthioat- (P=S) Gerüsten synthetisiert und ebenfalls einheitlich an der 2'-Position des Zuckers mit entweder einer 2'-O-Methyl-, 2'-O-Propyl oder 2'-Fluorgruppe substituiert. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 Einheitlich 2'-Zucker-modifizierte c-raf-Oligonukleotide
Die Oligonukleotide aus Tabelle 2 mit einheitlichen 2'O-Methyl-Modifikationen und einem Phosphorthioatgerüst wurden auf die Fähigkeit zur Inhibierung der c-raf-Proteinexpression in T24-Zellen bestimmt durch Western-Blot-Assay getestet. Die Oligonukleotide 8033, 7834 und 7835 zeigten die größte Inhibierung.
Chimäre Oligonukleotide
Es wurden chimäre Oligonukleotide, die die SEQ ID Nr: 8 aufwiesen hergestellt. Diese Oligonukleotide wiesen zentrale „Lücken"-Regionen mit 6, 8 oder 10 Desoxynukleotiden, flankiert von zwei Regionen mit 2'-O-Methyl-modifizierten Nukleotiden auf. Die Gerüste waren einheitlich Phosphorthioat. In einer Northern-Blot-Analyse zeigten alle drei dieser Oligonukleotide (ISIS 6720, 6-Desoxylücke; ISIS 6717, 8-Desoxylücke; ISIS 6729, 10-Desoxylücke) eine Inhibierung der c-raf-mRNA-Expression in T24-Zellen von mehr als 70%. Diese Oligonukleotide sind bevorzugt. Die Verbindung mit der 8-Desoxylücke (6717) zeigte eine Inhibierung von mehr als 90% und ist besonders bevorzugt.
Es wurden zusätzliche chimäre Oligonukleotide mit einer oder mehreren Regionen mit einer 2'-O-Methylmodifikation und einheitlichen Phosphorthioatgerüsten synthetisiert. Diese sind in Tabelle 3 gezeigt. Es sind alles Phosphorthioate; Regionen in Fettdruck zeigen 2'-O-Methyl-modifizierte Regionen an.
Tabelle 3 Chimäre 2'-O-Methyl-P=S-c-raf-Oligonukleotide
Beim Testen auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung der c-raf-mRNA durch Northern-Blot-Analyse ergaben ISIS 7848, 7849, 7851, 7856, 7855, 7854, 7847 und 7853 eine Inhibierung von mehr als 70%. Von diesen ergaben 7851, 7855, 7847 und 7853 eine Inhibierung von mehr als 90%.
Es wurden zusätzliche chimäre Oligonukleotide mit verschiedenen 2'-Modifikationen hergestellt und getestet. Diese sind in Tabelle 4 gezeigt. Es sind alles Phosphorthioate; Regionen in Fettdruck zeigen 2'-modifizierte Regionen an.
Tabelle 4 Chimäre 2'-modifizierte P=S-c-raf-Oligonukleotide
Von diesen werden die Oligonukleotide 6720, 6717, 6729, 9720 und 9058 bevorzugt. Die Oligonukleotide 6717, 6729, 9720 und 9058 werden besonders bevorzugt.
Es wurden ebenfalls zwei chimäre Oligonukleotide mit 2'-O-Propyl-Zuckermodifikationen und chimären P=O/P=S-Gerüsten synthetisiert. Diese sind in Tabelle 5 gezeigt, wobei Regionen in Kursivdruck Regionen anzeigen, die sowohl 2'-modifiziert sind als auch Phosphodiestergerüste aufweisen.
Tabelle 5 Chimäre 2'-modifizierte P=S/P=O-c-raf-Oligonukleotide
Inhibierung der Proliferation von Krebszellen
Es wurde gezeigt, dass das Phosphorthioatoligonukleotid ISIS 5132 die T24-Blasenkrebszellproliferation inhibiert. Die Zellen wurden mit verschiedenen Oligonukleotidkonzentrationen zusammen mit Lipofectin (kationisches Lipid, das die Aufnahme von Oligonukleotid erhöht) behandelt. Eine Dosis-abhängige Inhibierung der Zellproliferation wurde nachgewiesen, wie es in Tabelle 6 angegeben ist, wobei „Keines" eine unbehandelte Kontrolle (kein Oligonukleotid) und „Kontrolle" eine Behandlung mit einem negativen Kontrolloligonukleotid anzeigt. Die Ergebnisse sind als prozentuale Inhibierung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle gezeigt.
Tabelle 6 Inhibierung der Proliferation von T24-Zellen durch ISIS 5132
Wirkung von ISIS 5132 auf menschliche T24-Blasenkarzinomtumore Subkutane menschliche T24-Blasenkarzinomxenotransplantate wurden in nackten Mäusen eingesetzt und mit ISIS 5132 und einem nicht verwandten Kontrollphosphorthioatoligonukleotid behandelt, die dreimal wöchentlich mit einer Dosierung von 25 mg/kg intraperitoneal verabreicht wurden. In dieser vorbereitenden Untersuchung inhibierte ISIS 5132 das Tumorwachstum nach elf Tagen um 35% im Vergleich zu den Kontrollen. Die mit Oligonukleotid behandelten Tumore blieben über den Verlauf der Untersuchung hinweg kleiner als Kontrolltumore.
Wirkung von ISIS 5132 auf menschliche MDA-MB 231-Brustkarzinomtumore
Subkutane menschliche MDA-MB 231-Brustkarzinomxenotransplantate wurden in nackten Mäusen eingesetzt und mit ISIS 5132 und einem nicht verwandten Kontrollphosphorthioatoligonukleotid behandelt, die einmal am Tag mit einer Dosierung von 0,6 mg/kg oder 6,0 mg/kg intravenös verabreicht wurden. ISIS 5132 inhibierte das Tumorwachstum nach 27 Tagen (Ende der Untersuchung) um näherungsweise 80% im Vergleich zu den Kontrollen.
ISIS 5132 war ebenfalls bei einer intraperitonealen Verabreichung an MDA-MB 231-Xenotransplantate in nackten Mäusen wirksam. Das Oligonukleotid wurde einmal täglich mit 0,6 mg/kg oder 6,0 mg/kg verabreicht. Am Tag 27 (Ende der Untersuchung) war das Tumorvolumen um 57% (bei einer Dosis von 0,6 mg/kg) oder 64% (6,0 mg/kg) im Vergleich zur Kontrolle inhibiert.
Wirkung von ISIS 5132 auf c-raf-mRNA-Gehalte in MDA-MB231-Tumoren
Eine RNA wurde aus MDA-MD231-Tumorxenotransplantaten isoliert und zur Bewertung der Oligonukleotidwirkungen auf die raf-RNA-Gehalte wurden Northern-Blots durchgeführt. ISIS 5132 erniedrigte raf-RNA-Gehalte nach 27 Tagen bei intravenöser Verabreichung um 67% und bei intraperitonealer Verabreichung um 39% (jeweils mit 6 mg/kg).
Wirkung von ISIS 5132 auf menschliche Colo 205-Kolonkarzinomtumore
Subkutane menschliche Colo 205-Kolonkarzinomxenotransplantate wurden in nackten Mäusen eingesetzt und mit ISIS 5132 und einem nicht verwandten Kontrollphosphorthioatoligonukleotid behandelt, die einmal am Tag mit einer Dosierung von 6,0 mg/kg intravenös verabreicht wurden. In dieser Untersuchung inhibierte ISIS 5132 das Tumorwachstum nach 25 Tagen um mehr als 40% im Vergleich zu den Kontrollen.
Wirkung von ISIS 5132 auf menschliche A549-Lungenadenokarzinotumore
Subkutane menschliche A549-Lungenadenokarzinomxenotransplantate wurden in nackten männlichen Balb/c-Mäusen eingesetzt und mit ISIS 5132 und einem Kontrolloligonukleotid behandelt, die täglich durch intravenöse Injektion mit Dosen im Bereich von 0,0006 bis 6,0 mg/kg verabreicht wurden. ISIS 5132 verringerte die Tumorgröße bei allen Dosen auf Dosis-abhängige Art, wie in 1A gezeigt ist. Ein zerhacktes raf-Oligonukleotid, ISIS 10353 wies keine Wirkung bei irgendeiner Dosis auf (1B).
Wirkung von ISIS 5132 auf c-raf-RNA-Gehalte in A549.Tumorzellen
RNA wurde aus A549-Tumorxenotransplantaten isoliert und Northern-Blots wurden zur Bewertung der Oligonukleotidwirkungen auf raf-RNA-Gehalte durchgeführt. ISIS 5132 erniedrigte zunehmend raf-RNA-Gehalte, beginnend 8 Stunden nach dem Start der Oligobehandlung. Als das Experiment am Tag 13 beendet wurde waren die RNA-Gehalte immer noch am abnehmen und hatten Gehalte von näherungsweise 15% der Kontrolle erreicht.
Wirkung von ISIS 6717, ein lückenhaftes 2'-O-Methyl-Oligonukleotid, auf A549-Lungenxenotransplantattumore
ISIS 6717, ein in Tabelle 4 gezeigtes lückenhaftes 2'-O-Methyl-Oligonukleotid, wurde mit ISIS 5132 bezüglich der Fähigkeit zur Inhibierung des A549-Tumoxenotransplantatwachstums verglichen. Bei intravenös verabreichten Dosen mit 0,006, 0,06, 0,6 und 6,0 mg/kg waren die zwei Oligonukleotide in ihren Wirkungen auf das Tumorwachstum praktisch ununterscheidbar. ISIS 6717 ist daher eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Gegen A-raf gerichtete Antisense-Oligonukleotide
Es wird angenommen, dass bestimmte Oligonukleotide, die gegen Teile der A-raf-mRNA gerichtet sind und die die A-raf-Expression hemmen, zur Störung der Zellproliferation verwendbar sein werden. Ebenso wird angenommen, dass Verfahren zur Inhibierung der A-raf-Expression unter Verwendung derartiger Antisense-Oligonukleotide zur Störung der Zellhyperproliferation verwendbar sind. Oligonukleotide, die gegen Teile der A-raf-mRNA gerichtet sind und die die A-raf-Expression hemmen, fallen nicht in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die in Tabelle 7 gezeigten Phosphorthioatdesoxyoligonukleotide wurden unter Verwendung der Genbank A-raf-Sequenz HUMARAFIR (Genbankeintrag x04790) entworfen und synthetisiert.
Tabelle 7 Gegen menschliches A-raf gerichtete Oligonukleotide
Die Oligonukleotide ISIS 9061, ISIS 9069 und ISIS 10228 wurden durch Northern-Blot-Analyse bezüglich ihrer Wirkungen auf A-raf-mRNA-Gehalte in A549-, T24- und NHDF-Zellen bewertet. Alle drei Oligonukleotide erniedrigten A-raf-RNA-Spiegel auf Dosis-abhängige Weise in allen drei Zelltypen mit einer Inhibierung von mehr als 50% bei einer Dosis von 500 nM in allen Zelltypen. Die größte Inhibierung (88%) wurde mit ISIS 9061 und 9069 in T24-Zellen erreicht.
Identifikation der gegen Ratten und Mäuse-c-raf gerichteten Oligonukleotide
Viele Zustände, von denen angenommen wird, dass sie durch raf-Kinase vermittelt werden, sind einer Untersuchung in Menschen nicht zugänglich. Zum Beispiel ist eine Gewebetransplantatabstoßung ein Zustand, der wahrscheinlich durch eine Störung der raf-Expression verbessert werden kann; jedoch ist offensichtlich, dass dies eher bei Tieren als bei menschlichen Transplantatpatienten bewertet werden muss. Ein weiteres solches Beispiel ist die Restenose. Diese Zustände können jedoch in Tiermodellen getestet werden, wie zum Beispiel die hier verwendeten Ratten- und Mäusemodelle.
Die Oligonukleotidsequenzen zur Inhibierung der c-raf-Expression in Ratten- und Mäusezellen wurden identifiziert. Ratten- und Mäuse-c-raf-Gene weisen Regionen mit hoher Homologie auf; es wurde eine Reihe von Oligonukleotiden, die sowohl auf eine Ratten- aus auch eine Mäuse-c-raf-mRNA-Sequenz zielen, unter Verwendung von Information, die aus einer Bewertung von gegen menschliches c-raf gerichteten Oligonukleotiden erlangt worden war, entworfen und synthetisiert. Diese Oligonukleotide wurden bezüglich einer Aktivität in Mäuse-bEND-Zellen und Ratten-A-10-Zellen unter Verwendung von Northern-Blot-Assays gescreent. Die Oligonukleotide (alles Phosphorthioate) sind in Tabelle 8 gezeigt:
Tabelle 8 Gegen Mäuse- und Ratten-c-raf gerichtete Oligonukleotide
Es wurde festgestellt, dass die Oligonukleotide ISIS 11061 und 10707 die c-raf-RNA-Gehalte um mehr als 90% in Mäuse-bEND-Zellen bei einer Dosis von 400 nM inhi bieren. Diese zwei Oligonukleotide inhibierten in Ratten-A-10-Zellen bei einer Konzentration von 200 nM die raf-RNA-Gehalte praktisch vollständig. Es wurde festgestellt, dass der IC50-Wert für ISIS 10707 in Mäuse-bEND-Zellen 170 nM und in Ratten-A-10-Zellen 85 nM betrug. Für ISIS 11061 wurde ein IC50-Wert von 85 nM in Mäuse-bEND-Zellen und von 30 nM in Ratten-A-10-Zellen bestimmt.
Wirkung von ISIS 11061 auf die endogene c-raf-Expression in Mäusen
Mäusen wurde intraperitoneal ISIS 11061 (50 mg/kg) oder Kontrolloligonukleotid oder eine Salzlösungskontrolle einmal täglich während drei Tagen injiziert. Die Tiere wurden geopfert und Organe wurde bezüglich der c-raf-Expression durch Northern-Blot-Analyse analysiert. Es wurde festgestellt, dass ISIS 11061 die Gehalte von c-raf-mRNA in der Leber um näherungsweise 70% erniedrigt. Die Kontrolloligonukleotide wiesen keine Wirkungen auf die c-raf-Expression auf. Die Wirkung von ISIS 11061 war für c-raf spezifisch; A-raf- und G3PDH-Gehalte wurden von der Oligonukleotidbehandlung nicht beeinflusst.
Das Antisense-Oligonukleotid gegen c-raf erhöht das Überleben in einem murinen Herzallotransplantatmodell
Zur Bestimmung der therapeutischen Wirkungen des c-raf-Antisense-Oligonukleotids ISIS 11061 zur Verhinderung einer Allotransplantatabstoßung wurde dieses Oligonukleotid bezüglich einer Aktivität in einem murinen vaskularisierten heterotopen Herztransplantatmodell getestet. Herzen von C57BI10-Mäusen wurden in die Bauchhöhle von C3H-Mäusen als primäre vaskularisierte Transplantate, im wesentlichen entsprechend der Beschreibung von Isobe et al., Circulation 1991, 84, 1246–1255, transplantiert. Die Oligonukleotide wurde durch fortlaufende intravenöse Verabreichung über eine 7-Tage-Alzetpumpe verabreicht. Die mittlere Überlebenszeit der Allotransplantation betrug für unbehandelte Mäuse 7,83 ± 0,75 Tage (7, 7, 8, 8, 8, 9 Tage). Allotransplantate in Mäusen, die während 7 Tagen mit 20 mg/kg oder 40 mg/kg ISIS 11061 behandelt worden waren, überlebten alle mindestens 11 Tage (11, 11, 12 Tage bei einer Dosis von 20 mg/kg und > 11, > 11, > 11 Tage bei einer Dosis von 40 mg/kg).
In einer bei Ratten durchgeführten Pilotstudie wurden Herzen von Lewis-Ratten in die Bauchhöhle von ACl-Ratten transplantiert. Den Ratten wurde ISIS 11061 mit einer Dosis von 20 mg/kg während 7 Tagen mit einer Alzetpumpe verabreicht. Die mittlere Überlebenszeit des Allotransplantats betrug für unbehandelte Ratten 8,86 ± 0,69 Tage (8, 8, 9, 9, 9, 9, 10 Tage). In Ratten, die mit Oligonukleotid behandelt worden waren, betrug die Überlebenszeit des Allotransplantats 15,3 ± 1,15 Tage (14, 16, 16 Tage).
Wirkungen eines gegen c-raf gerichteten Antisense-Oligonukleotids auf die Proliferation glatter Muskelzellen
Die Proliferation glatter Muskelzellen ist eine Ursache der Blutgefäßstenose, beispielsweise bei einer Atherosklerose und Restenose nach einer Angioplastie. Zur Bestimmung der Wirkung von ISIS 11061 auf die Proliferation glatter Muskelzellen von A-10-Ratten wurden Experimente durchgeführt. Zellen wurden in Kultur mit und ohne ISIS 11061 (zuzüglich Lipofectin) vermehrt und die Zellproliferation wurde 24 und 48 Stunden nach einer Stimulation mit fetalem Kälberserum gemessen. Es wurde festgestellt, dass ISIS 11061 (500 nM) das mit Serum stimulierte Zellwachstum auf Dosis-abhängige Weise mit einer maximalen Inhibierung von 46% beziehungsweise 75% bei 24 Stunden beziehungsweise 48 Stunden inhibierte. Für diese Verbindung wurde ein IC50-Wert von 200 nM erhalten. Ein nicht verwandtes Kontrolloligonukleotid wies bei Dosen von bis zu 500 nM keine Wirkung auf.
Wirkungen von gegen c-raf gerichteten Antisense-Oligonukleotiden auf die Restenose in Ratten
Es wurde ein Modell einer die Halsschlagader betreffenden Verletzung der Angioplastierestenose bei Ratten entwickelt und zur Bewertung der Wirkungen von Antisense-Oligonukleotiden, die gegen das c-myc-Onkogen gerichtet waren, auf die Restenose verwendet. Bennett et al., J. Clin. Invest. 1994, 93, 820–828. Dieses Modell wird zur Bewertung der Wirkungen von Antisense-Oligonukleotiden, die gegen Ratten-c-raf gerichtet sind, insbesondere von ISIS 11061, auf die Restenose verwendet. Nach der Verletzung der Halsschlagader mit einem Ballonkatheder wurden die Oligonukleotide entweder durch intravenöse Injektion, fortlaufende intravenöse Verabreichung über eine Alzetpumpe oder durch direkte Verabreichung an die Halsschlagader in einer pluronen Gelmatrix, entsprechend der Beschreibung von Bennett et al., verabreicht. Nach ihrer Erholung wurden die Ratten geopfert, die Halsschlagadern mikroskopisch untersucht und die Wirkungen der Behandlung auf Luminalquerschnitte bestimmt.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele, die nur Erläuterungen sind und die keine Einschränkung der vorliegenden Erfindung auf spezifische Ausführungsformen beabsichtigen, erläutert.
BEISPIELE
Beispiel 1 Synthese und Charakterisierung von Oligonukleotiden
Auf einem DNA-Syntheseautomat (Applied Biosystems Modell 380B) wurden nicht modifizierte Oligonukleotide unter Verwendung von Standardphosphoramiditchemie mit Oxidation durch Iod synthetisiert. B-Cyanoethyldiisopropylphosphoramidite wurden von Applied Biosystems (Foster City, CA) gekauft. Für Phosphorthioatoligonukleotide wurde die Standardoxidationsflasche gegen eine 0,2 M Lösung von H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid in Acetonitril zur schrittweisen Thiolierung der Phosphitverknüpfungen ersetzt. Der Warteschritte des Thiolierungszyklus wurde auf 68 Sekunden erhöht und darauf folgte der Kappungsschritt. 2'-O-Methylphosphorthioatoligonukleotide wurden unter Verwendung von 2'-O-Methyl-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramiditen (Chemgenes, Needham MA) und dem Standardzyklus für nicht modifizierte Oligonukleotide, abgesehen davon, dass der Warteschritt nach dem Abgabeimpuls von Tetrazol und Base auf 360 Sekunden erhöht wurde, synthetisiert. Die zum Synthesestart verwendete 3'-Base war ein 2'-Desoxyribonukleotid. 2'-O-Propyloligonukleotide wurden durch eine leichte Modifikation dieses Verfahrens hergestellt.
2'-Fluorphosphorthioatoligonukleotide wurden unter Verwendung von 5'-Dimethoxytrityl-3'-phosphoramiditen synthetisiert und gemäß der Offenbarung in der U.S. Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 463,358, eingereicht am 11. Januar 1990 und 566,977, eingereicht am 13. August 1990 und die auf den gleichen Anmel der wie die vorliegende Anmeldung übertragen wurden, hergestellt. Die 2'-Fluoroligonukleotide wurde unter Verwendung von Phosphoramiditchemie und einer geringfügigen Modifikation des Standardsyntheseprotokolls hergestellt; die Entschützung wurde unter Verwendung von methanolischem Ammoniak bei Raumtemperatur durchgeführt.
Nach Abspaltung von der Säule mit Glas kontrollierter Poren (Applied Biosystems) und Deblockieren in konzentriertem Ammoniumhydroxid bei 55°C während 18 Stunden wurden die Oligonukleotide durch zweimalige Fällung aus 0,5 M NaCl mit 2,5 Volumen Ethanol gereinigt. Eine analytische Gelelektrophorese wurde in 20% Acrylamid, 8 M Harnstoff, 45 mM Trisboratpuffer, pH-Wert 7,0 ausgeführt. Ausgehend von der Elektrophorese wurde beurteilt, dass die Oligodesoxynukleotide und deren Phosphorthioatanaloga mehr als 80% der vollen Materiallänge aufwiesen.
Beispiel 2 Northern-Blot-Analyse der Inhibierung der c-raf-mRNA-Expression
Die menschliche Harnblasenkrebszelllinie T24 wurde aus der American Type Culture Collection (Rockville MD) erhalten. Die Zellen wurden in McCoys 5A Medium mit L-Glutamin (Gibco BRL, Gaithersburg MD), das mit 10% durch Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum und je 50 U/ml Penicillin und Streptomycin ergänzt wurde, vermehrt. Die Zellen wurden auf 100 mm Platten geimpft. Als sie eine Konfluenz von 70% erreichten wurden sie mit Oligonukleotid behandelt. Die Platten wurden mit 10 ml vorgewärmtem PBS und 5 ml des mit Opti-MEM reduzierten Serummediums, das 2,5 μl DOTMA enthielt, gewaschen. Dann wurde Oligonukleotid mit Lipofectin auf die gewünschte Konzentration zugegeben. Nach einer Behandlung während 4 Stunden wurde das Medium gegen McCoys Medium ersetzt. Die Zellen wurden 24 bis 72 Stunden nach der Oligonukleotidbehandlung geerntet und die RNA wurde unter Verwendung eines Standard-CsCl-Reinigungsverfahrens isoliert. Kingston, R. E., in Current Protocols in Molecular Biology, (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman und K. Strahl, Herausg.), John Wiley & Sons, NY. Die gesamte RNA wurde durch Zentrifugation von Zelllysaten über einem CsCl-Kissen isoliert. RNA-Proben wurden durch 1,2% Agarose-Formaldehydgele elektrophoresiert und auf Hybridisierungsmembranen durch Kapillardiffusion während einer Zeitdauer von 12–14 Stunden übertragen. Die RNA wurde an die Membran durch Bestrahlung mit UV-Licht in einem Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) vernetzt und an eine zufallsgeprimte ³²P-markierte c-raf-cDNA-Sonde (erhalten von ATCC) oder an eine G3PDH-Sonde als Kontrolle hybridisiert. Die RNA wurde unter Verwendung eines Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) quantitativ bestimmt.
Beispiel 3 Spezifische Inhibierung der c-raf-Kinase-Proteinexpression in T24-Zellen
T24-Zellen wurden mit Oligonukleotid (200 nM) und Lipofectin bei T = 0 und T = 24 Stunden behandelt. Proteinextrakte wurden bei T = 48 Stunden hergestellt, auf Acrylamidgelen elektrophoresiert und durch Western-Blot unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen c-raf (UBI, Lake Placid, NY) oder A-raf (Transduction Laboratories, Knoxville, TN) analysiert. Radioaktiv markierte sekundäre Antikörper wurde verwendet und das raf-Protein wurde unter Verwendung eines Phosphorimagers (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) quantitativ bestimmt.
Beispiel 4 Antisense-Inhibierung der Zellproliferation
T24-Zellen wurden am Tag 0 während 2 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen an Oligonukleotid und Lipofectin (50 nM Oligonukleotid in Gegenwart von 2 μg/ml Lipofectin; 100 nM Oligonukleotid und 2 μg/ml Lipofectin; 250 nM Oligonukleotid und 6 μg/ml Lipofectin oder 500 nM Oligonukleotid und 10 μg/ml Lipofectin) behandelt. Am Tag 1 wurden die Zellen zum zweiten Mal mit der gewünschten Oligonukleotidkonzentration während zwei Stunden behandelt. Am Tag 2 wurden die Zellen gezählt.
Beispiel 5 Wirkung von ISIS 5132 auf menschliche T24-Blasenkarzinomtumorxenotransplantate in nackten Mäusen
5 × 10⁶ T24-Zellen wurden subkutan in den inneren rechten Schenkel von nackten Mäusen implantiert. Die Oligonukleotide (ISIS 5132 und ein nicht verwandtes Kontrollphosphorthioatoligonukleotid, suspendiert in Salzlösung) wurden dreimal wöchentlich, beginnend am Tag 4 nach der Tumorzellinokulation, verabreicht. Eine Kon trolle aus reiner Salzlösung wurde ebenfalls verabreicht. Die Oligonukleotide wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Die Oligonukleotiddosierung betrug 25 mg/kg. Die Tumorgröße wurde gemessen und das Tumorvolumen wurde am elften, fünfzehnten und achtzehnten Tag der Behandlung berechnet.
Beispiel 6 Wirkung von ISIS 5132 auf menschliche MDA-MB 231-Brustkarzinomtumorxenotransplantate in nackten Mäusen
5 × 10⁶ MDA-MB-Zellen wurden subkutan in den inneren rechten Schenkel von nackten Mäusen implantiert. Die Oligonukleotide (ISIS 5132 und ein nicht verwandtes Kontrollphosphorthioatoligonukleotid, suspendiert in Salzlösung) wurden einmal täglich, beginnend am Tag 10 nach der Tumorzellinokulation, verabreicht. Eine Kontrolle aus reiner Salzlösung wurde ebenfalls verabreicht. Die Oligonukleotide wurden durch intravenöse Injektion mit einer Dosierung von 0,6 mg/kg oder 6,0 mg/kg verabreicht. Die Tumorgröße wurde gemessen und das Tumorvolumen wurde an den Tagen 10, 13, 16, 20, 23 und 27 nach der Tumorzellinokulation berechnet.
Für eine intraperitoneale Oligonukleotidverabreichung wurden die Oligonukleotide einmal täglich, beginnend am Tag 10 nach der Tumorzellinokulation verabreicht. Eine Kontrolle aus reiner Salzlösung wurde ebenfalls verabreicht. Die Oligonukleotide wurden durch intraperitoneale Injektion mit einer Dosierung von 0,6 mg/kg oder 6,0 mg/kg verabreicht. Die Tumorgröße wurde gemessen und das Tumorvolumen wurde an den Tagen 10, 13, 16, 20, 23 und 27 nach der Tumorzellinokulation berechnet.
Beispiel 7 Wirkung von ISIS 5132 auf menschliche Colo 205 Kolonkarzinom tumorxenotransplantate in nackten Mäusen
5 × 10⁶ Colo 205-Zellen wurden subkutan in den inneren rechten Schenkel von nackten Mäusen implantiert. Die Oligonukleotide (ISIS 5132 und ein nicht verwandtes Kontrollphosphorthioatoligonukleotid, suspendiert in Salzlösung) wurden einmal täglich, beginnend am Tag 5 nach der Tumorzellinokulation, verabreicht. Eine Kontrolle aus reiner Salzlösung wurde ebenfalls verabreicht. Die Oligonukleotide wurden durch intravenöse Injektion verabreicht. Die Oligonukleotiddosierung betrug 6 mg/kg. Die Tumorgröße wurde gemessen und das Tumorvolumen wurde a den Tagen 5, 8, 11, 14, 18, 22 und 25 nach der Tumorinokulation berechnet.
Beispiel 8 Diagnoseassay für mit c-raf assoziierte Tumore unter Verwendung von Xenotransplantanten in nackten Mäusen
Tumore, die aus der c-raf-Expression hervorgehen, werden unter Verwendung dieses Assays diagnostiziert und von anderen Tumoren unterschieden. Eine Biopsieprobe des Tumors wird zum Beispiel mit Collagenase oder Trypsin oder anderen Standardverfahren zur Trennung der Tumormasse behandelt. 5 × 10⁶ Tumorzellen werden subkutan innen in die Schenkel von zwei oder mehreren nackten Mäusen implantiert. Ein in Salzlösung suspendiertes Antisense-Oligonukleotid (zum Beispiel ISIS 5132) wird durch intraperitoneale Injektion einer oder mehreren Mäusen dreimal wöchentlich, beginnend am Tag 4 nach der Tumorzellinokulation verabreicht. Eine Kontrolle aus reiner Salzlösung wird einer Kontrollmaus verabreicht. Die Oligonukleotiddosierung beträgt 25 mg/kg. Die Tumorgröße wird gemessen und das Tumorvolumen wird am elften Tag der Behandlung berechnet. Das Tumorvolumen der mit Oligonukleotid behandelten Mäuse wird mit demjenigen der Kontrollmaus verglichen. Das Volumen der mit c-raf assoziierten Tumore ist in den behandelten Mäusen messbar kleiner als das der Tumore in der Kontrollmaus. Es wird nicht erwartet, dass Tumore, die von anderen Ursachen als der c-raf-Expression herrühren, auf die gegen c-raf gerichteten Oligonukleotide ansprechen, und daher sind die Tumorvolumina der mit Oligonukleotid behandelten Mäuse und der Kontrollmäuse gleich.
Beispiel 9 Nachweis der c-raf-Expression
Nach der Synthese werden die Oligonukleotide durch ³²P-Markierung an dem 5'-Ende mit Polynukleotidkinase radioaktiv markiert. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Band 2, Seiten 11.32–11.32. Die radioaktiv markierten Oligonukleotide werden mit Gewebe oder Zellproben, in denen eine c-raf-Expression vermutet wird, wie zum Beispiel Biopsieproben oder Hautproben, bei denen eine Psoriasis vermutet wird, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen eine spezifische Hybridisierung stattfinden kann, und die Probe wird zur Entfernung von ungebundenem Oligonukleotid gewa schen. Die restliche Radioaktivität in der Probe weist auf gebundenes Oligonukleotid hin und wird unter Verwendung eines Scintillationszählers oder anderer Routinemittel quantitativ bestimmt.
Die radioaktiv markierten Oligonukleotide der Erfindung werden ebenfalls in der Autoradiographie verwendet. Gewebeschnitte werden mit radioaktiv markiertem Oligonukleotid behandelt und, wie vorstehend beschrieben, gewaschen, dann einer photographischen Emulsion entsprechend Standardautoradiographieverfahren ausgesetzt. Nach Entwicklung ergibt die Emulsion ein Bild von Silberkörnern über die c-raf exprimierenden Regionen. Das Ausmaß der c-raf-Expression wird durch quantitative Bestimmung der Silberkörner bestimmt.
Analoge Assays zum Fluoreszenznachweis der c-raf-Expression verwenden Oligonukleotide der Erfindung, die mit Fluorescein oder anderen Fluoreszenzmarkern markiert sind. Markierte DNA-Oligonukleotide werden auf einem DNA-Syntheseautomaten (Applied Biosystems Modell 380B) unter Verwendung von Standardphosphoramiditchemie mit Oxidation durch Iod synthetisiert. β-Cyanoethyldiisopropylphosphoramidite werden von Applied Biosystems (Foster City, CA) gekauft. Fluorescein-markierte Amidite werden von Glen Research (Sterling VA) gekauft. Die Inkubation von Oligonukleotid und biologischer Probe wird entsprechend der Beschreibung für markierte Oligonukleotide ausgeführt, abgesehen davon, dass anstelle eines Scintillationszählers ein Fluorimeter oder Fluoreszenzmikroskop zum Nachweis der Fluoreszenz, die die c-raf-Expression anzeigt, verwendet wird.
Beispiel 10 A549-Xenotransplantate
5 × 10⁶ A549-Zellen wurden subkutan in den inneren rechten Schenkel von nackten Mäusen implantiert. Die in Salzlösung suspendierten Oligonukleotide (ISIS 5132 und ein zerhacktes raf-Kontrollphosphorthioatoligonukleotid, ISIS 10353) wurden einmal täglich durch intravenöse Injektion mit Dosierungen im Bereich von 0,006 bis 6,0 mg/kg verabreicht. Die resultierenden Tumore wurden an den Tagen 9, 12, 17 und 21 gemessen und Tumorvolumina wurden berechnet.
Beispiel 11 Wirkung eines Oligonukleotids auf die endogene c-raf-Expression
Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion mit einer Oligonukleotiddosis von 50 mg/kg an den Tagen 1, 2 und 3 behandelt. Am Tag 4 wurden die Tiere geopfert und Organe für einen c-raf-mRNA-Assay durch Northern-Blot-Analyse entfernt. Vier Tiergruppen wurden verwendet: 1) keine Oligonukleotidbehandlung (Salzlösung); 2) negatives Kontrolloligonukleotid ISIS 1082 (gegen das Herpes-simplex-Virus gerichtet); 3) negatives Kontrolloligonukleotid 4189 (gegen die Mausproteinkinase-C-α gerichtet); 4) gegen Nagetier-c-raf gerichtetes ISIS 11061.
Beispiel 12 Herzallotransplantatabstoßungsmodell
Herzen wurden in die Bauchhöhle von Ratten oder Mäusen (von einem von dem Donor verschiedenen Stamm) als primäre vaskularisierte Transplantate im wesentlichen entsprechend der Beschreibung von Isobe et al., Circulation 1991, 84, 1246–1255 transplantiert. Die Oligonukleotide wurden durch eine fortlaufende intravenöse Verabreichung über eine 7-Tage-Alzetpumpe verabreicht. Das Überleben des Herzallotransplantats wurde überwacht, indem auf das Vorhandensein eines zweiten Herzschlags in der Bauchhöhle gehorcht wurde.
Beispiel 13 Proliferationsassay unter Verwendung von glatten Ratten-A-10-muskelzellen
A10-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% fetalem Kälberserum ausgestrichen und man ließ sie während 24 Stunden anhaften. Die Zellen wurden durch Zugabe von DMEM + 0,2% dialysiertem fetalem Kälberserum während zusätzlichen 24 Stunden in einen Ruhezustand versetzt. Während der letzten 4 Stunden des Ruhezustands wurden die Zellen mit ISIS 11061 + Lipofectin (Gibco-BRL, Bethesda MD) in serumfreiem Medium behandelt. Dann wurde das Medium entfernt, gegen frisches Medium ersetzt und die Zellen wurden mit 10% fetalem Kälberserum stimuliert. Dann wurden die Platten in den Inkubator gestellt und das Zellwachstum wurde durch MTS-Umwandlung zu Formozan (Promega Zellproliferationskit) 24 und 48 Stunden nach der Serumstimulation bewertet. Ein Kontrolloligonukleotid ISIS 1082 (ein nicht verwandtes gegen das Herpes-simplex-Virus gerichtetes Oligonukleotid) wurde ebenfalls getestet.
Beispiel 14 Rattenhalsschlagaderrestenosemodell
Dieses Modell ist von Bennett et al., J. Clin. Invest. 1994, 93, 820–828 beschrieben worden. Eine Intimahyperplasie wurde durch eine Ballonkatheterdilatation der Halsschlagader der Ratte induziert. Die Ratten werden betäubt und eine allgemeine Verletzung der Halsschlagader wurde durch den Durchgang eines Ballonembolektomiekatheters, der mit 20 ml Salzlösung aufgebläht wird, induziert. Oligonukleotide werden auf die adventitielle Oberfläche der Arterienwand in einer pluronen Gellösung aufgebracht. Die Oligonukleotide werden in einer 0,25% pluronen Gellösung bei 4°C (F127, BASF Corp.) mit der gewünschten Dosis gelöst. 100 μl der Gellösung werden auf das entfernte Drittel der allgemeinen Halsschlagaderarterie unmittelbar nach der Verletzung aufgebracht. Kontrollratten werden entsprechend mit Gel, das ein Kontrolloligonukleotid oder kein Oligonukleotid enthält, behandelt. Die Halswunden werden geschlossen und man ließ eine Erholung der Tiere zu. 14 Tage später werden die Ratten geopfert, man lässt sie ausbluten und die Halsschlagadern werden in situ durch Durchspülen mit Paraformaldehyd und Glutaraldehyd fixiert, ausgeschnitten und für die Mikroskopie bearbeitet. Es werden Querschnitte der Arterien berechnet.
In einem zu der pluronen Gelverabreichung alternativen Verfahren werden Ratten durch intravenöse Injektion oder fortlaufende intravenöse Infusion (über eine Alzetpumpe) eines Oligonukleotids behandelt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligonukleotid mit einer Länge von 8 bis 50 Nukleotiden, umfassend SEQ ID Nr.: 8, 12, 22, 24, 26 oder 27, welches gegen die 3'-nichttranslatierte Region der menschliches c-raf kodierenden mRNA gerichtet ist und welches zur Inhibierung der c-raf-Expression befähigt ist.
Chimäres Oligonukleotid mit einer Länge von 8 bis 50 Nukleotiden, welches gegen die 3'-nichttranslatierte Region der menschliches c-raf kodierenden mRNA gerichtet ist und welches eine erste Region mit mindestens einem Nukleotid, das modifiziert ist, um die Zielaffinität zu steigern, und eine zweite Region, welche ein Substrat für RNAse H ist, enthält, wobei das chimäre Oligonukleotid zur Inhibierung der c-raf-Expression befähigt ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welches mindestens eine Phosphorothioatverknüpfung aufweist.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens eine der Nukleotideinheiten des Oligonukleotids an der 2'-Position der Zuckerkomponente modifiziert ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 4, wobei die Modifikation an der 2'-Position der Zuckerkomponente eine 2'-O-Alkyl- oder eine 2'-Fluor-Modifikation ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 2 oder einem der Ansprüche 3 bis 5 (wenn abhängig von Anspruch 2), wobei die Region, welche ein Substrat für RNAse N ist, mindestens ein 2'-Desoxynukleotid umfaßt.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 3 bis 5, welches die SEQ ID Nr.: 8, 24, 26 oder 27 umfaßt.
Oligonukleotid, welches die SEQ ID Nr.: 8 aufweist.
Oligonukleotid nach Anspruch 8, welches mindestens eine 2'-O-Methyl-Modifikation umfaßt.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Chimäres Oligonukleotid mit SEQ ID Nr.: 8, welches eine erste Region mit mindestens einem Nukleotid, das modifiziert ist, um die Zielaffinität zu steigern, und eine zweite Region, welche ein Substrat für RNAse H ist, enthält, wobei das chimäre Oligonukleotid zur Inhibierung der c-raf-Expression befähigt ist.
Verfahren zur Inhibierung der Expression von menschlichem c-raf in Geweben oder Zellen ex vivo, welches das Inkontaktbringen von Geweben oder Zellen, welche menschliches c-raf exprimieren, mit einem Oligonukleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 8 umfaßt.
Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 1 oder Anspruch 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Expression von menschlichem c-raf in Geweben oder Zellen.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Expression von menschlichem c-raf eine abnormale Expression ist.
Verfahren zur Inhibierung der Hyperproliferation von Zellen, welches das Inkontaktbringen der hyperproliferierenden Zellen ex vivo mit einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 8 umfaßt.
Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 1 oder Anspruch 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Hyperproliferation von Zellen.
Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 1 oder Anspruch 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer abnormalen Proliferationsbedingung in einem Patienten oder Zellen, Geweben oder einer Körperflüssigkeit des Patienten, welcher im Verdacht steht, eine abnormale Proliferationsbedingung aufzuweisen.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Bedingung eine hyperproliferative Erkrankung ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die hyperproliferative Erkrankung Krebs, Restenose, Psoriasis oder eine Erkrankung ist, welche durch T-Zell-Aktivierung und Wachstum gekennzeichnet ist.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 12–19, wobei das Oligonukleotid ein chimäres Oligonukleotid ist.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 20, wobei das chimäre Oligonukleotid die SEQ ID Nr.: 8, 24, 26 oder 27 umfaßt.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 12–21, wobei das Oligonukleotid mindestens eine Phosphorothioatverknüpfung aufweist.