DE69533666T2

DE69533666T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Quantifizierung eines Substrats in einer flüssigen Probe mit einem Biosensor

Info

Publication number: DE69533666T2
Application number: DE69533666T
Authority: DE
Inventors: Shin Katano-shi Ikeda; Toshihiko Osaka-shi Yoshioka; Shiro Hirakata-shi Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1995-07-10
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2015-07-11
Also published as: EP0732406A1; DE69535746T2; EP0732406B1; DE69533666D1; CA2153350C; EP1352969B1; EP1352969A1; US5582697A; CA2153350A1; DE69535746D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und auf eine Vorrichtung zum Quantifizieren eines Substrats unter Verwendung eines Biosensors, der ein Substrat (eine spezifische Komponente) in einer Probenflüssigkeit mit Geschwindigkeit und Genauigkeit leicht quantifizieren kann. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren und auf eine Vorrichtung zum Quantifizieren eines Substrats unter Verwendung eines Biosensors, der ein Substrat in einer Probenflüssigkeit durch elektrochemisches Messen der Menge eines Elektronenakzeptors, der durch Elektronen reduziert worden ist, die in einer Reaktion zwischen dem Substrat in der Probenflüssigkeit und einer Oxidoreduktase, die spezifisch mit dem Substrat reagiert, erzeugt worden sind, quantifizieren kann.
2. Beschreibung des verwandten Gebiets
Als Verfahren zur quantitativen Analyse von Sachariden wie etwa Sacharose und Glucose sind das optische Rotationsverfahren, das kolorimetrische Verfahren, das Reduktimetrieverfahren und weitere Verfahren entwickelt worden, die verschiedene Arten von Chromatographien verwenden. Wegen der verhältnismäßig niedrigen Spezifität gegenüber Sachariden kann aber keines dieser Verfahren eine hohe Genauigkeit liefern. Unter diesen Verfahren ist das optische Rotationsverfahren leicht zu bedienen, wird aber stark durch die Arbeitstemperatur beeinflusst. Somit ist es für die übliche Verwendung Zuhause und dergleichen ungeeignet.
Jüngst sind verschiedene Typen von Biosensoren entwickelt worden, die eine spezifische Katalyse eines Enzyms nutzen. Als ein Beispiel der Verfahren zum Quantifizieren eines Substrats in einer Probenflüssigkeit wird nun ein Verfahren zum Quantifizieren von Glucose beschrieben. Ein Verfahren zum elektrochemischen Quantifizieren von Glucose unter Verwendung von Glucoseoxidase (EC1.1.3.4; im Folgenden als GOD bezeichnet) und einer Sauerstoffelektrode oder einer Wasserstoffperoxidelektrode ist allgemein bekannt (z. B. "Biosensor", herausgegeben von Shuichi Suzuki, Kodansha Kabushiki Kaisha).
Die GOD oxidiert unter Verwendung von Sauerstoff als einem Elektronenakzeptor wahlweise (β-D-Glucose zu D-Glucono-δ-Lacton. In einer Oxidationsreaktion, die GOD in Anwesenheit von Sauerstoff verwendet, wird der Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. In dem oben erwähnten Verfahren wird die Menge des verringerten Sauerstoffs unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode gemessen oder wird die Menge des vermehrten Wasserstoffperoxids unter Verwendung einer Wasserstoffperoxidelektrode gemessen. Da die Mengen des verringerten Sauerstoffs und des vermehrten Wasserstoffperoxids in der Probenflüssigkeit proportional zum Glucosegehalt sind, kann die Glucose anhand der Menge des verringerten Sauerstoffs oder des vermehrten Wasserstoffperoxids quantifiziert werden.
Allerdings weist das oben erwähnte Verfahren ein Problem dahingehend auf, dass das Messergebnis, wie aus dem Reaktionsprozess vermutet werden kann, stark durch die Konzentration des Sauerstoffs in der Probenflüssigkeit beeinflusst wird. Außerdem kann das oben erwähnte Verfahren nicht angewendet werden, wenn in der Probenflüssigkeit kein Sauerstoff enthalten ist.
Um dieses Problem zu lösen, ist ein neuer Typ eines Glucosesensors entwickelt worden, in dem als ein Elektronenakzeptor anstelle von Sauerstoff eine organische Verbindung wie etwa Kaliumferricyanid, ein Ferrocenderivat und ein Chinonderivat oder ein Metallkomplex verwendet werden. In diesem Sensortyp wird die reduzierte Form eines Elektronenakzeptors, die sich aus der enzymatischen Reaktion ergibt, an einer Elektrode oxidiert und auf der Grundlage der Menge des gemessenen Oxidationsstroms die Konzentration der in der Probenflüssigkeit enthaltenen Glucose erhalten. Unter Verwendung einer organischen Verbindung oder eines Metallkomplexes als ein Elektronenakzeptor anstelle des Sauerstoffs kann eine bekannte Menge GOD und ihr Elektronenakzeptor stabil und genau an einer Elektrode gehalten werden, um eine Reaktionsschicht zu bilden. In diesem Fall kann die Reaktionsschicht in einem im Wesentlichen trockenen Zustand mit der Elektrode integriert sein. Somit ist kürzlich ein Einwegglucosesensor, der auf dieser Technik beruht, öffentlich beachtet worden. In diesem Einwegglucosesensor kann die Konzentration der Glucose in einer Probenflüssigkeit mit einer Messvorrichtung leicht gemessen werden, indem lediglich die Probenflüssigkeit in den Sensor eingeführt wird, der lösbar mit einer Messvorrichtung verbunden ist. Ein solches Verfahren kann nicht nur auf die Quantifizierung von Glucose, sondern auch auf die Quantifizierung irgendeines anderen in einer Probenflüssigkeit enthaltenen Substrats angewendet werden.
Die japanische offen gelegte Patentveröffentlichung Nr. 6-109688 offenbart einen Biosensor, wie er in 9 gezeigt ist. Der Biosensor enthält ein Substrat 40, eine Abdeckung 47 und einen Abstandshalter 46, der zwischen das Substrat 40 und die Abdeckung 47 gelegt ist. In dem Abstandshalter 46 ist ein Probenzufuhranschluss 48 ausgebildet und in der Abdeckung 47 ist ein Luftanschluss 49 ausgebildet. Wenn die Abdeckung 47 mit dem Abstandshalter 46 dazwischen über dem Substrat 40 angeordnet ist, so dass sie aneinander haften, ist durch das Substrat 40, den Abstandshalter 46 und die Abdeckung 47 ein Raum 50 definiert, der zu dem Probenzufuhranschluss 48 offen ist. Das andere Ende des Raums 50 steht mit dem Luftanschluss 49 in Verbindung.
Auf dem Substrat 40 sind jeweils eine Arbeitselektrode 41, eine Gegenelektrode 42, eine Elektrode 43 zum Erfassen eines Flüssigkeitsübergangs und die mit diesen Elektroden verbundenen Leitungen 41a, 42a und 43a ausgebildet. Über der Arbeitselektrode 41, der Gegenelektrode 42 und der Elektrode 43 ist eine Reaktionsschicht 51 zum Erfassen eines Flüssigkeitsübergangs ausgebildet. Das Bezugszeichen 52 bezeichnet in 9 eine Isolierschicht.
Die Elektrode 43 zum Erfassen eines Flüssigkeitsübergangs ist an einer Position ausgebildet, die weiter entfernt von dem Probenzufuhranschluss 48 als die Arbeitselektrode 41 und die Gegenelektrode 42 ist, so dass eine durch den Probenzufuhranschluss 48 zugeführte Probenflüssigkeit zuerst die Arbeitselektrode 41 und die Gegenelektrode 42 erreichen kann, bevor sie die Elektrode 43 erreicht.
Gemäß dem obigen herkömmlichen Biosensor kann die Tatsache, dass eine durch den Probenzufuhranschluss 48 zugeführte Probenflüssigkeit die Reaktionsschicht 51 erreicht hat, durch die Elektrode 43 erfasst werden. Wenn die Elektrode 43 diese Tatsache erfasst, wird zwischen der Arbeitselektrode 41 und der Gegenelektrode 42 eine Spannung angelegt, um eine Stromantwort zu erhalten. Somit wird ein Strom gemessen, der zwischen der Arbeitselektrode 41 und der Gegenelektrode 42 fließt, und anhand des Messergebnisses die Quantifizierung durchgeführt. Allerdings kann das Potential der Gegenelektrode 42, das als eine Referenz verwendet wird, wenn zwischen der Arbeitselektrode 41 und der Gegenelektrode 42 eine Spannung angelegt wird, um wie oben beschrieben eine Stromantwort zu erhalten, in einigen Fällen durch die Oxidations-Reduktions-Reaktion geändert werden, was Fehler und eine Abweichung in dem Messergeb nis der Menge des Substrats in der Probenflüssigkeit verursacht.
Außerdem kann auf EP-A-0502504 und EP-A-0537761 als Literaturhinweis Bezug genommen werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Aspekte der Erfindung sind in den Ansprüchen definiert.
In den bevorzugten Ausführungsformen wird ein Biosensor zum Quantifizieren eines Substrats in einer Probenflüssigkeit beschrieben. Der Biosensor kann das Substrat durch elektrochemisches Messen einer Menge eines Elektronenakzeptors quantifizieren, der durch Elektronen reduziert worden ist, die in einer Reaktion zwischen dem Substrat in der Probenflüssigkeit und einer Oxidoreduktase erzeugt worden sind. Der Biosensor enthält: ein elektrisch isolierendes Substrat; ein Elektrodensystem, das auf dem Substrat ausgebildet ist und eine Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode und eine dritte Elektrode, die für die Erfassung eines Flüssigkeitsübergangs verwendet wird, enthält; und eine Reaktionsschicht, die wenigstens über der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode des Elektrodensystems ausgebildet ist und die Oxidoreduktase enthält. Die Vorrichtung arbeitet durch: Anlegen einer Spannung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode; Zuführen der Probenflüssigkeit zu der Reaktionsschicht; Erfassen einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode, die durch die Zufuhr der Probenflüssigkeit zu der Reaktionsschicht hervorgerufen wird; Anlegen einer Spannung an die Arbeitselektrode nach der Erfassung unter Verwendung wenigstens der dritten Elektrode als eine Referenz; und Messen eines Stroms, der zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode erzeugt wird.
In einer Form enthält die Gegenelektrode einen Hauptelektrodenabschnitt, der in der Draufsicht im Wesentlichen C-förmig ist, und eine in dem Hauptelektrodenabschnitt ausgebildete Öffnung, wobei die Arbeitselektrode in der Gegenelektrode so angeordnet ist, dass sie voneinander elektrisch isoliert sind, und wobei eine Leitung, die mit der Arbeitselektrode verbunden ist, aus dem Innenraum der Gegenelektrode durch die Öffnung in die äußere Umgebung der Gegenelektrode geführt ist.
In einer Form ist ein Umfangsabschnitt der Gegenelektrode offen, um einen Elektrodenaufnahmeabschnitt zu schaffen, und ist die dritte Elektrode in dem Elektrodenaufnahmeabschnitt angeordnet.
In einer Form ist die dritte Elektrode weiter entfernt von einem Probenzufuhranschluss als die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode angeordnet, so dass eine durch den Probenzufuhranschluss zugeführte Probenflüssigkeit die dritte Elektrode erst erreicht, wenn sie die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode erreicht hat.
In einer Form ist die dritte Elektrode näher als die Arbeitselektrode bei dem Probenzufuhranschluss angeordnet, so dass eine durch den Probenzufuhranschluss zugeführte Probenflüssigkeit die dritte Elektrode erreicht, bevor sie die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode erreicht.
In einer Form enthält die Gegenelektrode einen Hauptelektrodenabschnitt, der in der Draufsicht im Wesentlichen C-förmig ist, und eine Öffnung, die in dem Hauptelektrodenabschnitt ausgebildet ist, wobei die Arbeitselektrode in der Gegenelektrode so angeordnet ist, dass sie voneinander elektrisch isoliert sind, wobei eine Leitung, die mit der Arbeitselektrode verbunden ist, von dem Innenraum der Gegenelektrode durch die Öffnung in die äußere Umgebung der Gegenelektrode geführt ist und wobei die dritte Elektrode zwischen der Gegenelektrode und der Arbeitselektrode angeordnet ist, so dass sie voneinander elektrisch isoliert sind.
Somit ermöglicht die hier beschriebene Erfindung die folgenden Vorteile: (1) Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zum Quantifizieren eines Substrats, in denen eine dritte Elektrode als eine Referenz verwendet wird, für die einfache, schnelle und genaue Quantifizierung eines spezifischen Substrats in einer Probenflüssigkeit, um Fehler und Abweichung in dem Messergebnis der Menge des Substrats in der Probenflüssigkeit zu verringern; und (2) Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zum Quantifizieren eines Substrats unter Verwendung eines Biosensors mit einer verhältnismäßig einfachen Konstruktion und den oben beschriebenen Eigenschaften.
Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann auf dem Gebiet beim Lesen und Verstehen der folgenden ausführlichen Beschreibung mit Bezug auf die beigefügten Figuren klar.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist ein beispielhafter Stromlaufplan für den in dieser Erfindung verwendeten Biosensor und für eine mit ihm verbundene Messvorrichtung.
2 ist ein weiterer beispielhafter Stromlaufplan für den in dieser Erfindung verwendeten Biosensor und für eine mit ihm verbundene Messvorrichtung.
3 ist eine perspektivische Explosionsdarstellung eines Glucosesensors als ein Beispiel eines in dieser Erfindung verwendeten Biosensors, von dem eine Reaktionsschicht entfernt ist.
4 ist eine Draufsicht eines Substrats mit einem Elektrodensystem, das in einem in 3 gezeigten Glucosesensor verwendet wird.
5 ist ein Stromlaufplan für den Biosensor aus 3 und für eine mit ihm verbundene Messvorrichtung.
6 ist eine Draufsicht eines Substrats mit einem in einem Glucosesensor verwendeten Elektrodensystem als ein nochmals weiteres Beispiel des in dieser Erfindung verwendeten Biosensors.
7 ist eine Draufsicht eines Substrats mit einem in einem Glucosesensor verwendeten Elektrodensystem als ein nochmals weiteres Beispiel des in dieser Erfindung verwendeten Biosensors.
8 ist eine Draufsicht eines Substrats mit einem in einem Glucosesensor verwendeten Elektrodensystem als ein nochmals weiteres Beispiel des in dieser Erfindung verwendeten Biosensors.
9 ist eine perspektivische Explosionsdarstellung eines herkömmlichen Biosensors.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein in dieser Erfindung verwendeter Biosensor enthält ein elektrisch isolierendes Substrat, ein Elektrodensystem, das auf dem Substrat ausgebildet ist und eine Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode und eine dritte Elektrode enthält, und eine Reaktionsschicht, die über der Arbeitselektrode und über der Gegenelektrode des Elektrodensystems ausgebildet ist. Vorzugsweise sind die Arbeitselektrode, die Gegenelektrode und die dritte Elektrode des Elektrodensystems in derselben Ebene auf dem Substrat ausgebildet.
Das elektrisch isolierende Substrat kann aus einer Platte ausgebildet sein, die aus einem Kunstharz wie etwa Polyethylenterephthalat oder aus irgendeinem anderen geeigneten im Gebiet bekannten Harz hergestellt ist.
Das Elektrodensystem, das die Arbeitselektrode, die der Arbeitselektrode entsprechende Gegenelektrode und die dritte Elektrode enthält, kann mit einem bekannten Verfahren auf dem Substrat ausgebildet werden. Beispielsweise werden die Arbeitselektrode, die Gegenelektrode und die dritte Elektrode nach Ausbildung von Leitungen auf dem Substrat ausgebildet, so dass sie mit den jeweiligen Leitungen verbunden und voneinander isoliert sind. Das Material für die Leitungen und für die Elektroden kann aus irgendwelchen bekannten leitenden Materialien wie etwa einer Silbermasse und einer Kohlenstoffmasse sein. Außerdem kann eine Silber-/Silberchloridelektrode verwendet werden.
Die Formen und die Positionen der jeweiligen Elektroden des Elektrodensystems können unterschiedlich geändert werden. Beispielsweise kann die Gegenelektrode in der Draufsicht ringförmig oder im Wesentlichen C-förmig sein. Die Arbeitselektrode kann in einem Raum in der ringförmigen oder C-förmigen Gegenelektrode positioniert sein, so dass sie elektrisch von ihr isoliert ist. Dadurch, dass die Arbeitselektrode in der Gegenelektrode vorgesehen ist, können diese Elektroden benachbart zueinander positioniert sein. In diesem Fall kann die Reaktionsschicht, die die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode bedeckt, leicht ausgebildet werden.
Wenn die Gegenelektrode in der Weise ausgebildet ist, dass sie einen im Wesentlichen C-förmigen Hauptelektrodenabschnitt besitzt und in dem Hauptelektrodenabschnitt eine Öffnung ausgebildet ist, ist aus dem Innenraum durch die Öffnung in die äußere Umgebung des Hauptelektrodenabschnitts eine Leitung geführt, die mit der in dem Hauptelektrodenabschnitt positionierten Arbeitselektrode verbunden ist.
In einem Umfangsabschnitt der Gegenelektrode kann ein Elektrodenaufnahmeabschnitt für die dritte Elektrode ausgebildet sein. Die Formen des Elektrodenaufnahmeabschnitts und der dritten Elektrode können gemäß der geforderten Anwendung unterschiedlich geändert werden. Außerdem kann die Position des Elektrodenaufnahmeabschnitts in der Gegenelektrode je nach Anwendung des Biosensors geändert werden.
Beispielsweise kann die dritte Elektrode weiter entfernt von einem Probenzufuhranschluss des Biosensors als die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode positioniert sein, so dass eine durch den Probenzufuhranschluss zugeführte Probenflüssigkeit die dritte Elektrode erreichen kann, nachdem sie die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode erreicht hat. Alternativ kann die dritte Elektrode näher an dem Probenzufuhranschluss als die Arbeitselektrode positioniert sein, so dass eine durch den Probenzufuhranschluss zugeführte Probenflüssigkeit die dritte Elektrode erreichen kann, bevor sie die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode erreicht.
Wenn die dritte Elektrode weiter entfernt von dem Probenzufuhranschluss als die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode positioniert ist, kann die Änderung eines Widerstandswerts zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode erst erfasst werden, wenn ein Raum, der alle drei Elektroden enthält, mit einer Probenflüssigkeit gefüllt ist. Dementsprechend kann durch Nutzung einer solchen dritten Elektrode zum Erfassen eines Flüssigkeitsübergangs eindeutig bestimmt werden, ob eine durch den Probenzufuhranschluss zugeführte Probenflüssigkeit die gesamte Reaktionsschicht bedeckt hat.
Demgegenüber wird die dritte Elektrode fehlerfrei mit der zugeführten Probenflüssigkeit benetzt, wenn die dritte Elektrode näher an dem Probenzufuhranschluss als die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode positioniert ist. Dementsprechend kann durch Nutzung einer solchen dritten Elektrode als eine Referenzelektrode ein Referenzpotential stärker stabilisiert werden, was dazu führt, dass eine Messung mit weniger Abweichung erreicht wird.
Außerdem kann die dritte Elektrode zwischen der Gegenelektrode und der Arbeitselektrode positioniert sein, so dass sie elektrisch davon isoliert ist.
Die Reaktionsschicht kann über der Arbeitselektrode und über der Gegenelektrode des Elektrodensystems ausgebildet sein. Alternativ kann die Reaktionsschicht nicht nur über der Arbeitselektrode und über der Gegenelektrode, sondern auch über der dritten Elektrode ausgebildet sein.
Die Reaktionsschicht kann mit einer Schicht oder mit zwei Schichten ausgebildet sein, wobei sie wenigstens ein Enzym (Oxidoreduktase) enthält und bevorzugter. ferner einen Elektronenakzeptor enthält. Wenn die Reaktionsschicht mit zwei Schichten ausgebildet ist, können die zwei Schichten eine erste Schicht, die aus einem hydrophilen Polymer hergestellt ist, das direkt auf dem Elektrodensystem ausgebildet ist, und eine zweite Schicht, die wenigstens ein Enzym und einen Elektronenakzeptor, die auf der ersten Schicht geschichtet sind, enthält, sein.
Beispiele des hydrophilen Polymers, das die erste hydrophile Polymerschicht bildet, umfassen Carboximethylcellulose (im Folgenden als CMC bezeichnet), Hydroxyethylcellulose (im Folgenden als HEC bezeichnet), Hydroxypropylcellulose (im Folgenden als HPC bezeichnet), Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose, Carboximethylethylcellulose, Polyvinylpyrrolidonpolyvinylalkohol, Polyaminosäuren wie etwa Polylysin, Polystyrolsulfonat, Gelatine und ihre Derivate, Acrylsäure oder ihr Salz, Methacrylsäure oder ihr Salz, Stärke oder ihr Derivat und Maleinsäureanhydrid oder ihr Salz. Unter den obigen sind CMC, HEC, HPC, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose und Carboximethylethylcellulose bevorzugt.
Die Art der in der Reaktionsschicht enthaltenen Oxidoreduktase hängt von einem zu quantifizierenden in einer Probenflüssigkeit enthaltenen Substrat ab und wird hier nicht spezifisch definiert. Beispiele der Oxidoreduktase umfassen Fruktosedehyrogenase, Invertase, Mutarotase, Glucoseoxidase, Alkoholoxidase, Milchsäureoxidase, Cholesterinoxidase, Xanthinoxidase und Aminosäureoxidase.
Beispiele des Elektronenakzeptors enthalten Kaliumferricyanid, p-Benzochinon, Phenazin, Methosulfat, Methylenblau und ein Ferrocenderivat. Als der Elektronenakzeptor können eines oder eine Kombination von zwei oder mehr der obigen verwendet werden.
Das Enzym und der Elektronenakzeptor können in einer Probenflüssigkeit aufgelöst sein, oder die Reaktionsschicht ist auf dem Substrat oder dergleichen stillge legt, so dass sich das Enzym und der Elektronenakzeptor nicht in der Probenflüssigkeit lösen können. Wenn das Enzym und der Elektronenakzeptor stillgelegt sind, enthält die Reaktionsschicht vorzugsweise das hydrophile Polymer.
Ferner kann die Reaktionsschicht einen pH-Puffer wie etwa Kaliumdihydrogenphosphat-Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat-Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat-Dikaliumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat-Dinatriumhydrogenphosphat, Zitronensäure-Dinatriumhydrogenphosphat, Zitronensäure-Dikaliumhydrogenphosphat, Zitronensäure-Natriumzitrat, Zitronensäure-Kaliumzitrat, Kaliumdihydrogenzitrat-Natriumhydroxid, Natriumdihydrogenzitrat-Natriumhydroxid, Natriumhydrogenmaleat-Natriumhydroxid, Kaliumhydrogenphthalat-Natriumhydroxid, Bernsteinsäure-Natriumtetraborat, Maleinsäure-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid, [N-(2-hydroxyethyl)-piperazin-N'-2-Ethansulfonsäure]-Natriumhydroxid, [N-Tris-(hydroxymethyl)-methyl-2-Aminoethansulfonsäure]-Natriumhydroxid und [Piperazin-N,N'-Bis-(2-Ethansulfonsäure)]-Natriumhydroxid enthalten.
Die Reaktionsschicht kann dadurch ausgebildet werden, dass auf ein Substrat eine Lösung getropft wird, die wenigstens das Enzym und bevorzugter ferner den Elektronenakzeptor enthält, und die getropfte Lösung trocknengelassen wird.
Wenn die Reaktionsschicht mit der ersten hydrophilen Polymerschicht und mit der zweiten Schicht, die das Enzym und den Elektronenakzeptor enthält und auf die erste Schicht geschichtet ist, ausgebildet wird, kann die zweite Schicht z. B. dadurch ausgebildet werden, dass eine gemischte Lösung des Enzyms und des Elektronenakzeptors auf die erste Schicht getropft wird.
Der auf diese Weise ausgebildete Biosensor kann lösbar mit einer in 1 oder 2 gezeigten Messvorrichtung A verbunden werden.
Wie in den 1 und 2 gezeigt ist, enthält der Biosensor B ein auf einem Substrat ausgebildetes Elektrodensystem, das eine Arbeitselektrode 5, eine Gegenelektrode 8 und eine zum Erfassen eines Flüssigkeitsübergangs verwendete dritte Elektrode 7 enthält. Die Arbeitselektrode 5 ist über eine Leitung 2 mit einem Anschluss 2a verbunden. Die Gegenelektrode 8 ist über eine Leitung 4 mit einem Anschluss 4a verbunden. Die dritte Elektrode 7 ist über eine Leitung 3 mit einem Anschluss 3a verbunden. Die in 1 gezeigte Messvorrichtung A enthält einen Verbinder 25 mit den Anschlüssen 31, 32 und 33, die mit den jeweiligen Anschlüssen 2a, 3a und 4a des Biosensors B verbunden werden können, die Strom/Spannungs-Umsetzungsschaltungen 26, die mit dem Anschluss 32 des Verbinders 25 verbunden sind, die A/D-Umsetzungsschaltungen 27, die mit den jeweiligen Strom/Spannungs-Umsetzungsschaltungen 26 verbunden sind; die Strom/Spannungs-Umsetzungsschaltungen 26a, die über einen Schalter 29 mit dem Anschluss 31 verbunden werden können, die A/D-Umsetzungsschaltungen 27a, die mit den jeweiligen Strom/Spannungs-Umsetzungsschaltungen 26a verbunden sind, und eine Steuereinrichtung 28, die einen Mikrocomputer und dergleichen enthält, der mit den jeweiligen A/D-Umsetzungsschaltungen 27 und 27a verbunden ist. Der oben erwähnte Schalter 29 wird durch die Steuereinrichtung 28 EIN/AUS gesteuert.
Es wird eine Operation einer Schaltung beschrieben, die den Biosensor B und die Messvorrichtung A aus 1 enthält.
Zunächst wird der Biosensor B mit der Messvorrichtung A verbunden. Zu diesem Zeitpunkt ist der Schalter 29 durch die Steuereinrichtung 28 von dem Anschluss 31 getrennt. Andererseits wird zwischen der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 eine vorgegebene Spannung (z. B. 0,5 Volt) angelegt. Wenn dem Biosensor B unter dieser Bedingung eine Probenflüssigkeit zugeführt wird, fließt zwischen der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 ein Strom. Der Wert dieses Stroms wird durch die Steuereinrichtung 28 erfasst. Anhand dieser Erfassung wird eine Zeit gemessen. Nach einer vorgegebenen Zeitdauer wird der Schalter 29 zu dem Anschluss 31 geschaltet und unter Verwendung wenigstens der dritten Elektrode als Referenz an die Arbeitselektrode 5 eine vorgegebene Spannung (z. B. 0,5 Volt) angelegt. Beispielsweise wird zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 eine feste Spannung (z. B. 0,5 Volt) angelegt, die erforderlich ist, um einen Antwortstrom zu erhalten. Ein somit zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 fließender Strom wird durch die Strom/Spannungs-Umsetzungsschaltungen 26a in eine Spannung umgesetzt, wobei der erhaltene Spannungswert durch die A/D-Umsetzungsschaltungen 27a in eine Anzahl von Impulsen in einer festen Zeitdauer umgesetzt wird. Die Steuereinrichtung 28 zählt die Anzahl der Impulse zusammen, berechnet einen Antwortwert und gibt das Ergebnis an.
Somit wird die Reaktionsschicht in der Probenflüssigkeit gelöst, wenn dem Biosensor B eine Probenflüssigkeit zugeführt wird, die ein Substrat (z. B. ein Kohlenhydrat) enthält. Nach einer vorgegebenen Zeitdauer seit der Zufuhr der Probenflüssigkeit wird zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 eine feste Spannung angelegt. Daraufhin wird nach einer vorgegebenen Zeitdauer ein Stromwert eines durch die Elektroden fließenden Stroms gemessen. Der erhaltene Stromwert ist proportional zur Konzentration des Substrats in der Probenflüssigkeit. Um die Beziehung zwischen der Konzentration und dem Stromwert zu erhalten, werden zuvor eine große Anzahl von Stromwerten hinsichtlich mehrerer Probenflüssigkeiten gemessen, die das Substrat in verschiedenen bekannten Konzentrationen enthalten. Daraufhin kann das in einer Probenflüssigkeit mit einer unbekannten Konzentration enthaltende Substrat durch Messung eines Stromwerts wie oben beschrieben quantifiziert werden.
Wenn in einem solchen Quantifizierungsverfahren, in dem die durch die Reaktion eines Enzyms und des Substrats in einer Probenflüssigkeit verursachte Konzentrationsänderung eines Substrats anhand einer durch Anlegen einer Spannung an die Arbeitselektrode 5 erhaltenen elektrochemischen Antwort gemessen wird, zusätzlich zu der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 die dritte Elektrode 7 als eine Referenzelektrode verwendet wird, kann die Abweichung des Referenzpotentials im Wesentlichen ignoriert werden.
Obgleich keine Notwendigkeit besteht, zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 eine Spannung für die Erfassung des Flüssigkeitsübergangs anzulegen, wie sie herkömmlich angelegt wird, kann außerdem die Zufuhr der Probenflüssigkeit fehlerfrei erfasst werden, wenn die dritte Elektrode 7 zum Erfassen eines Flüssigkeitsübergangs verwendet wird. Außerdem kann die Struktur des Elektrodensystems vereinfacht werden, wenn die dritte Elektrode 7 als eine Referenzelektrode und als eine Flüssigkeitsübergangs-Erfassungselektrode gemeinsam verwendet wird.
Die in 2 gezeigte Messvorrichtung A enthält einen Verbinder 25 mit den mit den jeweiligen Anschlüssen 2a, 3a und 4a des Biosensors B verbundenen Anschlüssen 31, 32 und 33, die über einen Schalter 29 mit den jeweiligen Anschlüssen 31 oder 32 des Verbinders 25 verbundenen Strom/Spannungs-Umsetzungsschaltungen 26, die mit den jeweiligen Strom/Spannungs-Umsetzungsschaltungen 26 verbundenen A/D-Umsetzungsschaltungen 27 und eine mit den jeweiligen A/D-Umsetzungsschaltungen 27 verbundene Steuereinrichtung 28, die einen Mikrocomputer und dergleichen enthält. Der oben erwähnte Schalter 29 wird durch die Steuereinrichtung 28 EIN/AUS gesteuert.
Es wird eine Operation einer Schaltung beschrieben, die den Biosensor B und die Messvorrichtung A aus 2 enthält.
Zunächst wird der Biosensor B mit der Messvorrichtung A verbunden. Zu diesem Zeitpunkt ist der Schalter 29 durch die Steuereinrichtung 28 mit dem Anschluss 32 verbunden. Zwischen der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 wird eine vorgegebene Spannung (z. B. 0,5 Volt) angelegt. Wenn dem Biosensor B unter dieser Bedingung eine Probenflüssigkeit zugeführt wird, fließt zwischen der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 ein Strom. Der Wert dieses Stroms wird durch die Steuereinrichtung 28 erfasst. Anhand dieser Erfassung wird eine Zeit gemessen. Nach einer vorgegebenen Zeitdauer wird der Schalter 29 zu dem Anschluss 31 geschaltet und an die Arbeitselektrode 5 eine vorgegebene Spannung (z. B. 0,5 Volt) angelegt. Zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 des Biosensors B wird eine feste Spannung (z. B. 0,5 Volt) angelegt, die erforderlich ist, um einen Antwortstrom zu erhalten.
Ein somit zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 fließender Strom wird durch die Strom/Spannungs-Umsetzungsschaltungen 26 in eine Spannung umgesetzt, wobei der erhaltene Spannungswert durch die A/D-Umsetzungsschaltungen 27 in die Anzahl der Impulse in einer festen Zeitdauer umgesetzt wird. Die Steuereinrichtung 28 zählt die Anzahl der Impulse zusammen, berechnet einen Antwortwert und gibt das Ergebnis an.
Die in 1 gezeigte Messvorrichtung A erfordert die Strom/Spannungs-Umsetzungsschaltungen 26 und 26a bzw. die A/D-Umsetzungsschaltungen 27 und 27a für die Arbeitselektrode 5 und die Gegenelektrode B. In der in 2 gezeigten Messvorrichtung A können die Strom/Spannungs-Umsetzungsschaltungen 26 und die A/D-Umsetzungsschaltungen 27 für die Arbeitselektrode 5 und für die Gegenelektrode 8 gemeinsam verwendet werden.
Gemäß dieser Erfindung können Sacharide in Obst sowie Sacharide in Blut, Lymphe, Urin und Speichel quantifiziert werden. Der Biosensor, der in dieser Erfindung verwendet werden kann, umfasst z. B. einen Fruktosesensor, einen Sacharosesensor, einen Glucosesensor, einen Alkoholsensor, einen Milchsäuresensor, einen Cholesterinsensor sowie einen Aminosäuresensor.
Beispiele
In den gesamten in der folgenden Beschreibung erwähnten Zeichnungen besitzt das gleiche Element ein gemeinsames Bezugszeichen, wobei die Beschreibung wie es die Umstände verlangen weggelassen wird.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wird ein Verfahren zum Quantifizieren von Glucose beschrieben. Es wurde ein in 3 gezeigter Glucosesensor verwendet. 3 ist eine perspektivische Explosionsdarstellung eines Glucosesensors, von dem eine Reaktionsschicht entfernt ist. Der Glucosesensor enthält ein aus Polyethylenterephthalat hergestelltes isolierendes Substrat 1, eine Abdeckung 9 und einen Abstandshalter 10, der zwischen das Substrat 1 und die Abdeckung 9 gelegt ist. Das Substrat 1, der Abstandshalter 10 und die Abdeckung 9 sind in der wie in 3 mit Strichlinien gezeigten Positionsbeziehung aneinander angehaftet, wodurch der Glucosesensor gebildet ist.
In dem Abstandshalter 10 ist ein Probenzufuhranschluss 11 ausgebildet und in der Abdeckung 9 ist ein Luftanschluss 12 ausgebildet. Wenn die Abdeckung 9 mit dem dazwischen gelegten Abstandshalter 10 an dem Substrat 1 angehaftet ist, bilden das Substrat 1, der Abstandshalter 10 und die Abdeckung 9 einen (nicht gezeigten) Raum, der mit dem Probenzufuhranschluss 11 in Verbindung steht, wobei der Endabschnitt des Raums mit dem Luftanschluss 12 in Verbindung steht.
Wie in 4 gezeigt ist, sind auf dem Substrat 1 eine Arbeitselektrode 5, eine dritte Elektrode 7, eine Gegenelektrode 8 und die jeweils elektrisch mit diesen Elektroden verbundenen Leitungen 2, 3 und 4 ausgebildet. Die Gegenelektrode 8 enthält einen im Wesentlichen C-förmigen Hauptelektrodenabschnitt und eine in dem Hauptelektrodenabschnitt ausgebildete Öffnung 21. Die mit der Arbeitselektrode 5 verbundene Leitung 2 ist aus dem Innenraum durch die Öffnung 21 in die äußere Umgebung der Gegenelektrode 8 geführt.
Die dritte Elektrode 7 ist weiter entfernt von einem Einlass 11a des Probenzufuhranschlusses 11 als die Arbeitselektrode 8 positioniert. Über dem Elektrodensystem mit Ausnahme der dritten Elektrode 7 (d. h. über der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8) ist eine (nicht gezeigte) Reaktionsschicht ausgebildet. Ein Bezugszeichen 6 bezeichnet in 1 eine Isolierschicht.
Die Arbeitselektrode 5, die Gegenelektrode 8 und die dritte Elektrode 7 liegen zu dem oben erwähnten Raum frei.
Dieser Glucosesensor wurde wie folgt hergestellt:
Auf das aus Polyethylenterephthalat hergestellte isolierende Substrat 1 wurde mit Siebdruck eine Silbermasse gedruckt, wodurch die Leitungen 2, 3 und 4 ausgebildet wurden. Daraufhin wurde auf das Substrat 1 eine leitende Kohlenstoffmasse gedruckt, die ein Harzbindemittel enthält, wodurch die Arbeitselektrode 5 und die Gegenelektrode 8 ausgebildet wurden. Die Arbeitselektrode 5 steht mit der Leitung 2 in Kontakt, während die Gegenelektrode 8 mit der Leitung 4 in Kontakt steht.
Nachfolgend wurde auf das sich ergebende Substrat 1 eine Isoliermasse gedruckt, wodurch die Isolierschicht 6 ausgebildet wurde. Die Isolierschicht 6 bedeckte den Umfang der Arbeitselektrode 5, um einen festen Bereich der Arbeitselektrode 5 freizulegen. Außerdem bedeckte die Isolierschicht 6 einen Teil der Leitungen 2, 3 und 4. Die dritte Elektrode 7 wurde durch Freilegen eines Endes der Leitung 3 ausgebildet.
Daraufhin wurde auf das sich ergebende Substrat 1 eine leitende Kohlenstoffmasse gedruckt, die ein Harzbindemittel enthält, wodurch die Gegenelektrode 8 in der Weise ausgebildet wurde, dass sie mit der Leitung 4 in Kontakt steht.
Nachfolgend wurde auf das Elektrodensystem mit Ausnahme der dritten Elektrode 7 (d. h. auf die Arbeitselektrode 5 und auf die Gegenelektrode 8) eine wässrige Lösung von CMC getropft und getrocknet, wodurch eine CMC-Schicht gebildet wurde. Außerdem wurde auf das Elektrodensystem mit Ausnahme der dritten Elektrode 7 (d. h. auf die Arbeitselektrode 5 und auf die Gegenelektrode 8) eine wässrige Lösung getropft, die GOD als ein Enzym und Kaliumferricyanid als einen Elektronenakzeptor enthält. Somit wurde die Reaktionsschicht ausgebildet.
Um eine gleichmäßigere Zufuhr einer Probenflüssigkeit zu der Reaktionsschicht zu erreichen, wurde von dem Einlass 11a des Probenzufuhranschlusses 11 über die gesamte Reaktionsschicht eine organische Lösungsmittellösung aus Lezithin (z. B. eine Toluollösung) gesprüht und getrocknet, wodurch eine Lezithinschicht ausgebildet wurde. Danach wurden das Substrat 1, die Abdeckung 9 und der Abstandshalter 10 wie in 1 mit Strichlinien gezeigt aneinander angehaftet. Auf diese Weise wurde der Glucosesensor hergestellt.
Daraufhin wurde der Glucosesensor B mit der Messvorrichtung A mit einer in 5 gezeigten Schaltung verbunden.
Der Glucosesensor B enthält das auf dem Substrat 1 ausgebildete Elektrodensystem mit der Arbeitselektrode 5, der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7, die zum Erfassen eines Flüssigkeitsübergangs verwendet wird. Die Arbeitselektrode 5 ist über eine Leitung 2 mit einem Anschluss 2a verbunden. Die Gegenelektrode 8 ist über eine Leitung 4 mit einem Anschluss 4a verbunden. Die dritte Elektrode 7 ist über eine Leitung 3 mit einem Anschluss 3a verbunden.
Die Messvorrichtung A enthält einen Verbinder 14 mit den Anschlüssen 16 und 15 und einem Erdungsanschluss 17, die jeweils mit den Anschlüssen 2a, 3a und 4a des Glucosesensors verbunden sind, einen mit dem Anschluss 15 des Verbinders 14 verbundenen Stromerfassungsabschnitt 18, eine A/D-Umsetzungsschaltung 19, die über einen Schalter 13 mit dem Anschluss 16 verbunden werden kann, und eine Steuereinrichtung 20, die aus einem Mikrocomputer und dergleichen gebildet ist.
An den Anschluss 3a wird eine feste Spannung angelegt. Dementsprechend erfasst der Stromerfassungsabschnitt 18 einen durch die Elektrode 7 fließenden Strom, wenn dem Glucosesensor B eine Probenflüssigkeit zugeführt wird, um ein System für die Erfassung der Zufuhr der Probenflüssigkeit zu aktivieren. Daraufhin wird über die Steuereinrichtung 20 ein Messzeitgeber gestartet.
Nachdem eine vorgegebene Zeitdauer vergangen ist, z. B. nach 55 Sekunden, wird der Schalter 13 durch ein Signal von der Steuereinrichtung 20 geschaltet, so dass er den Anschluss 16 mit der A/D-Umsetzungsschaltung 19 verbindet. Somit wird zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 des Glucosesensors B eine feste Spannung angelegt, die erforderlich ist, um einen Antwortstrom zu erhalten. Der zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 fließende Strom wird in eine Spannung umgesetzt. Der erhaltene Spannungswert wird wiederum durch die A/D-Umsetzungsschaltung 19 in eine Anzahl von Impulsen in einer festen Zeitdauer umgesetzt. Die Steuereinrichtung 20 zählt die Anzahl der Impulse, berechnet einen Antwortwert und gibt das Ergebnis an.
Dem Glucosesensor wurden durch den Probenzufuhranschluss 113 μl einer wässrigen Glucoselösung als eine Probenflüssigkeit zugeführt. Die Probenflüssigkeit erreichte durch den Raum den Luftanschluss 12, wobei die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem darin gelöst wurde.
Gleichzeitig mit der Zufuhr der Probenflüssigkeit wurde ein System zum Erfassen der Zufuhr einer Probenflüssigkeit, das auf der Änderung eines Widerstandswerts zwischen der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 beruht, betrieben, wodurch der Messzeitgeber betätigt wurde. Nach 55 Sekunden wurde an die Arbeitselektrode 5 ein gewünschtes Potential auf der Grundlage des Potentials an der dritten Elektrode 7 angelegt und nach 5 Sekunden ein Stromwert gemessen. In der Probenflüssigkeit wird eine Reaktion zwischen Ferricyanidionen, Glucose und GOD bewirkt, die zu der Oxidation der Glucose zu Gluconsäure-δ-Lacton und zur Reduktion der Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen führt. Durch Oxidation der Ferrocyanidionen kann eine Stromantwort erhalten werden. Auf diese Weise wurde ein Stromwert erhalten, der von der Konzentration der Glucose in der Probenflüssigkeit abhing.
In diesem Beispiel wurde der Fall beschrieben, in dem die Reaktionsschicht über der dritten Elektrode 7 nicht ausgebildet ist, wobei aber das gleiche Ergebnis erhalten wurde, wenn über der dritten Elektrode 7 eine Reaktionsschicht ausgebildet wurde.
Außerdem wurde in diesem Beispiel der Biosensor mit der Abdeckung 9 beschrieben, wobei aber ebenfalls eine von der Konzentration der Glucose abhängige Sensorantwort erhalten wurde, wenn ein Biosensor ohne die Abdeckung 9 verwendet wurde.
Beispiel 2
Das Elektrodensystem eines in diesem Beispiel verwendeten Glucosesensors ist in 6 gezeigt.
In diesem Glucosesensor ist ein Umfangsabschnitt, der weiter entfernt von einem Probenzufuhranschluss 11 entfernt ist, einer auf einem Substrat 1 ausgebildeten im Wesentlichen C-förmigen Gegenelektrode 8 geöffnet, um einen Elektrodenaufnahmeabschnitt 22 zu schaffen. In dem Elektrodenaufnahmeabschnitt 22 ist eine dritte Elektrode 7 vorgesehen. Nicht nur über einer Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8, sondern auch über der dritten Elektrode 7 ist eine Reaktionsschicht ausgebildet. Mit Ausnahme des obigen ist die Konfiguration dieses Glucosesensors im Wesentlichen gleich der aus Beispiel 1.
Mit Ausnahme dessen, dass die Reaktionsschicht über der dritten Elektrode 7 sowie über der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 ausgebildet wurde, wurde der Glucosesensor auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Dem Glucosesensor wurden durch den Probenzufuhranschluss 113 μl einer wässrigen Glucoselösung als Probenflüssigkeit zugeführt, wobei in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein Antwortstromwert gemessen wurde. Im Ergebnis wurde wie in Beispiel 1 eine Stromantwort erhalten, die von der Konzentration der Glucose in der Probenflüssigkeit abhing.
In dem Glucosesensor dieses Beispiels ist die dritte Elektrode 7 in dem an der Gegenelektrode 8 vorgesehenen Elektrodenaufnahmeabschnitt 22 ausgebildet, so dass die Reaktionsschicht über der dritten Elektrode 7 leicht ausgebildet werden kann. Außerdem ist ein Abstand zwischen der Arbeitselektrode 8 und der dritten Elektrode 7 verringert, was zur Reduzierung der Wirkung eines Spannungsabfalls beim Anlegen des Potentials führt.
Beispiel 3
Das Elektrodensystem eines in diesem Beispiel verwendeten Glucosesensors ist in 7 gezeigt.
In diesem Glucosesensor ist ein Umfangsabschnitt, der näher an einem Proben zufuhranschluss 11 ist, einer auf einem Substrat 1 ausgebildeten im Wesentlichen C-förmigen Gegenelektrode 8 geöffnet, um einen Elektrodenaufnahmeabschnitt 22 zu schaffen. In dem Elektrodenaufnahmeabschnitt 22 ist eine dritte Elektrode 7 vorgesehen. Nicht nur über einer Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8, sondern auch über der dritten Elektrode 7 ist eine Reaktionsschicht ausgebildet. Mit Ausnahme des obigen ist die Konfiguration dieses Glucosesensors im Wesentlichen gleich der aus Beispiel 1.
Mit Ausnahme dessen, dass die Reaktionsschicht über der dritten Elektrode 7 sowie über der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 ausgebildet wurde, wurde der Glucosesensor auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Dem Glucosesensor wurden durch den Probenzufuhranschluss 113 μl einer wässrigen Glucoselösung als Probenflüssigkeit zugeführt, wobei in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 ein Antwortstromwert gemessen wurde. Im Ergebnis wurde wie in Beispiel 1 eine Stromantwort erhalten, die von der Konzentration der Glucose in der Probenflüssigkeit abhing.
Da die dritte Elektrode 7 in dem Glucosesensor dieses Beispiels außerdem näher an dem Probenzufuhranschluss 11 auf dem Substrat 1 ausgebildet ist, kann die dritte Elektrode 7 fehlerfrei mit der zugeführten Probenflüssigkeit benetzt werden. Somit wird ein Referenzpotential stärker stabilisiert, wenn die dritte Elektrode 7 als eine Referenzelektrode verwendet wird, was zu weniger Abweichung der Antwortwerte führt.
Beispiel 4
Das Elektrodensystem eines in diesem Beispiel verwendeten Glucosesensors ist in 8 gezeigt.
In diesem Glucosesensor ist auf einem Substrat 1 eine im Wesentlichen C-förmige Gegenelektrode 8 vorgesehen, wobei in der Gegenelektrode 8 eine Arbeitselektrode 5 vorgesehen ist. In einem Raum 23 zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 ist eine im Wesentlichen C-förmige dritte Elektrode 7 ausgebildet. Nicht nur über der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8, sondern auch über der dritten Elektrode 7 ist eine Reaktionsschicht ausgebildet. Mit Ausnahme des obigen ist die Konfiguration dieses Glucosesensors im Wesentli chen gleich der aus Beispiel 1.
Der Glucosesensor wurde wie folgt hergestellt:
Auf das aus Polyethylenterephthalat hergestellte isolierende Substrat 1 wurde durch Siebdruck eine Silbermasse gedruckt, wodurch die Leitungen 2, 3 und 4 ausgebildet wurden. Daraufhin wurde auf das Substrat 1 eine leitende Kohlenstoffmasse gedruckt, die ein Harzbindemittel enthält, wodurch die Arbeitselektrode 5 und die dritte Elektrode 7 ausgebildet wurden, so dass die Arbeitselektrode 5 mit der Leitung 2 in Kontakt steht und die dritte Elektrode 7 mit der Leitung 3 in Kontakt steht.
Nachfolgend wurde auf das resultierende Substrat 1 eine isolierende Masse gedruckt, wodurch eine Isolierschicht 6 ausgebildet wurde. Die Isolierschicht 6 bedeckte die Umfänge der Arbeitselektrode 5 und der dritten Elektrode 7, wodurch feste Bereiche der Arbeitselektrode 5 und der dritten Elektrode 7 freigelegt wurden. Außerdem bedeckte die Isolierschicht 6 Teile der Leitungen 2, 3 und 4.
Daraufhin wurde auf das resultierende Substrat 1 eine leitende Kohlenstoffmasse gedruckt, die ein Harzbindemittel enthielt, wodurch die Gegenelektrode 8 in der Weise ausgebildet wurde, dass sie mit der Leitung 4 in Kontakt stand.
Die folgenden Herstellungsprozeduren waren gleich jenen im Beispiel 1, wobei auf diese Weise der Glucosesensor hergestellt wurde.
Dem Glucosesensor wurden durch den Probenzufuhranschluss 113 μl einer wässrigen Glucoselösung als Probenflüssigkeit zugeführt, wobei in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ein Antwortstrom gemessen wurde. Im Ergebnis wurde wie in Beispiel 1 eine Stromantwort erhalten, die von der Konzentration der Glucose in der Probenflüssigkeit abhing.
Da die dritte Elektrode 7 in dem Glucosesensor dieses Beispiels am Umfang der Arbeitselektrode 5 ausgebildet ist, kann unter Verwendung der dritten Elektrode 7 als eine Referenzelektrode außerdem die Potentialanlegung an die Arbeitselektrode 5 stärker stabilisiert werden. Im Ergebnis ist die Sensorantwortcharakteristik verbessert.

Claims

Verfahren zum Quantifizieren eines Substrats in einer Probenflüssigkeit unter Verwendung eines Biosensors, wobei der Biosensor das Substrat durch elektrochemisches Messen der Menge eines Elektronenakzeptors, der durch Elektronen reduziert worden ist, die in einer Reaktion zwischen dem Substrat in der Probenflüssigkeit und einer Oxidoreduktase erzeugt worden sind, quantifizieren kann, wobei das Verfahren umfasst: Vorsehen eines solchen Biosensors, der umfasst: ein elektrisch isolierendes Substrat; ein Elektrodensystem, das auf dem Substrat ausgebildet ist und eine Arbeitselektrode (5), eine Zählerelektrode (8) und eine dritte Elektrode (7), die für die Erfassung eines Flüssigkeitsübergangs verwendet wird, enthält; und eine Reaktionsschicht, die wenigstens über der Arbeitselektrode und der Zählerelektrode des Elektrodensystems ausgebildet ist und die Oxidoreduktase enthält, wobei das Verfahren ferner die folgenden Schritte umfasst: Anlegen einer Spannung zwischen der Zählerelektrode (8) und der dritten Elektrode (7); Zuführen der Probenflüssigkeit zu der Reaktionsschicht; Erfassen einer elektrischen Änderung zwischen der Zählerelektrode (8) und der dritten Elektrode (7), die durch die Zufuhr der Probenflüssigkeit zu der Reaktionsschicht hervorgerufen wird; Anlegen einer Spannung an die Arbeitselektrode (5) nach der Erfassung; und Messen eines Stroms, der zwischen der Arbeitselektrode (5) und der Zählerelektrode (7) erzeugt wird; gekennzeichnet durch das Verwenden wenigstens der dritten Elektrode (7) als eine Referenz während des Anlegens der Spannung an die Arbeitselektrode (5).
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zählerelektrode (8) einen Hauptelektrodenabschnitt, der in der Draufsicht im Wesentlichen C-förmig ist, und eine in dem Hauptelektrodenabschnitt ausgebildete Öffnung (21) enthält, die Arbeitselektrode (5) in der Zählerelektrode so angeordnet ist, dass sie voneinander elektrisch isoliert sind, und eine Leitung, die mit der Arbeitselektrode verbunden ist, aus dem Innenraum der Zählerelektrode durch die Öffnung in die äußere Umgebung der Zählerelektrode geführt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem ein Umfangsabschnitt (22) der Zählerelektrode (8) offen ist, um einen Elektrodenaufnahmeabschnitt zu schaffen, und die dritte Elektrode (7) in dem Elektrodenaufnahmeabschnitt angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die dritte Elektrode (7) weiter entfernt von einem Probenzufuhranschluss (12) als die Arbeitselektrode (5) und die Zählerelektrode (8) angeordnet ist, so dass eine durch den Probenzufuhranschluss zugeführte Probenflüssigkeit die dritte Elektrode (7) erst erreicht, wenn sie die Arbeitselektrode (5) und die Zählerelektrode (8) erreicht hat.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die dritte Elektrode (7) näher als die Arbeitselektrode (5) bei dem Probenzufuhranschluss (12) angeordnet ist, so dass eine durch den Probenzufuhranschluss (12) zugeführte Probenflüssigkeit die dritte Elektrode (7) erreicht, bevor sie die Arbeitselektrode (5) und die Zählerelektrode (8) erreicht.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zählerelektrode (8) einen Hauptelektrodenabschnitt, der in der Draufsicht im Wesentlichen C-förmig ist, und eine Öffnung (21), die in dem Hauptelektrodenabschnitt ausgebildet ist, enthält, die Arbeitselektrode (5) in der Zählerelektrode so angeordnet ist, dass sie voneinander elektrisch isoliert sind, eine Leitung, die mit der Arbeitselektrode verbunden ist, von dem Innenraum der Zählerelektrode durch die Öffnung in die äußere Umgebung der Zählerelektrode geführt ist und die dritte Elektrode (7) zwischen der Zählerelektrode (8) und der Arbeitselektrode (5) angeordnet ist, so dass sie voneinander elektrisch isoliert sind.
Vorrichtung zum Quantifizieren eines Substrats in einer Probenflüssigkeit, die einen Biosensor und eine Messvorrichtung, mit der der Biosensor lösbar verbunden ist, umfasst, wobei der Biosensor das Substrat durch elektrochemisches Messen einer Menge eines Elektronenakzeptors, der durch Elektronen reduziert worden ist, die in einer Reaktion zwischen dem Substrat in der Probenflüssigkeit und einer Oxidoreduktase erzeugt werden, quantifizieren kann, wobei der Biosensor umfasst: ein elektrisch isolierendes Substrat; ein Elektrodensystem, das auf dem Substrat ausgebildet ist und eine Arbeitselektrode (5), eine Zählerelektrode (8) und eine dritte Elektrode (7), die für die Erfassung eines Flüssigkeitsübergangs verwendet wird, umfasst; und eine Reaktionsschicht, die wenigstens über der Arbeitselektrode und der Zählerelektrode des Elektrodensystems ausgebildet ist und die Oxidoreduktase enthält, wobei die Vorrichtung umfasst: Mittel zum Erfassen einer elektrischen Änderung zwischen der Zählerelektrode (8) und der dritten Elektrode (7), die durch die Zufuhr der Probenflüssigkeit zu der Reaktionsschicht erzeugt wird; Mittel zum Anlegen einer Spannung an die Arbeitselektrode (5) nach der Erfassung; und Mittel zum Messen eines Stroms, der zwischen der Arbeitselektrode (5) und der Zählerelektrode (8) fließt; dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Anlegen einer Spannung an die Arbeitselektrode (5) die dritte Elektrode (7) als eine Referenz verwenden.
Vorrichtung nach Anspruch 7, bei der die Zählerelektrode (8) einen Hauptelektrodenabschnitt, der in der Draufsicht im Wesentlichen C-förmig ist, und eine Öffnung (21), die in dem Hauptelektrodenabschnitt ausgebildet ist, enthält, die Arbeitselektrode (5) in der Zählerelektrode angeordnet ist, so dass sie voneinander elektrisch isoliert sind, und eine Leitung, die mit der Arbeitselektrode verbunden ist, von dem Innenraum der Zählerelektrode durch die Öffnung zu der äußeren Umgebung der Zählerelektrode geführt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 7, bei der ein Umfangsabschnitt (22) der Zählerelektrode (8) geöffnet ist, um einen Elektrodenaufnahmeabschnitt zu schaffen und die dritte Elektrode (7) in dem Elektrodenaufnahmeabschnitt angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 9, bei der die dritte Elektrode (7) weiter entfernt als die Arbeitselektrode (5) und die Zählerelektrode (8) von einem Probenzufuhranschluss (12) angeordnet ist, so dass eine Probenflüssigkeit, die durch den Probenzufuhranschluss zugeführt wird, die dritte Elektrode (7) erreicht, nachdem sie die Arbeitselektrode (5) und die Zählerelektrode (8) erreicht hat.
Vorrichtung nach Anspruch 9, bei der die dritte Elektrode (7) näher als die Arbeitselektrode (5) bei dem Probenzufuhranschluss (12) angeordnet ist, so dass eine durch den Probenzufuhranschluss zugeführte Probenflüssigkeit die dritte Elektrode (7) erreicht, bevor sie die Arbeitselektrode (5) erreicht.
Vorrichtung nach Anspruch 7, bei der die Zählerelektrode (8) einen Hauptelektrodenabschnitt, der in der Draufsicht im Wesentlichen C-förmig ist, und eine Öffnung (21), die in dem Hauptelektrodenabschnitt ausgebildet ist, enthält, die Arbeitselektrode (5) in der Zählerelektrode so angeordnet ist, dass sie elektrisch voneinander isoliert sind, eine Leitung, die mit der Arbeitselektrode verbunden ist, von dem Innenraum der Zählerelektrode durch die Öffnung zu der äußeren Umgebung der Zählerelektrode geführt ist und die dritte Elektrode (7) zwischen der Zählerelektrode und der Arbeitselektrode angeordnet ist, so dass sie elektrisch voneinander isoliert sind.