DE69533261T2

DE69533261T2 - Behälter mit einer mehrphasigen zusammensetzung zur verwendung in diagnostischen und therapeutischen anwendungen

Info

Publication number: DE69533261T2
Application number: DE69533261T
Authority: DE
Inventors: C. Evan UNGER; O. Terry MATSUNAGA; David Yellowhair
Original assignee: ImaRx Pharmaceutical Corp
Current assignee: ImaRx Pharmaceutical Corp
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1995-07-26
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2015-07-27
Also published as: CA2200061A1; MX9701969A; DK0788348T3; DE69533261D1; EP1588699A3; JPH10505900A; DE69536012D1; DK1588699T3; EP1588699B1; CA2200061C; AU3146595A; BR9509011A; EP0788348A1; JP4004063B2; WO1996008234A1; ATE270878T1; AU708341B2; US5773024A; ES2225844T3; EP1588699A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Behälter, die Komponenten umfassen, die nach dem Schütteln Liposomen bilden, die bei der diagnostischen Bildgebung nützlich sind.
Ultraschall ist eine diagnostische Bildgebungstechnik, die eine Anzahl signifikanter Vorteile gegenüber anderen diagnostischen Verfahren bereitstellt. Anders als Bildgebungstechniken wie z.B. die Nuklearmedizin und Röntgenstrahlen setzt Ultraschall den Patienten nicht den schädlichen Effekten ionisierender Strahlung aus. Darüber hinaus ist Ultraschall relativ kostengünstig und kann als mobile Untersuchung durchgeführt werden.
Bei der Ultraschallbildgebung wird Schall über einen Wandler in einen Patienten oder ein Tier übertragen. Wenn sich die Schallwellen durch den Körper ausbreiten, treffen sie auf Grenzflächen von Geweben und Fluiden. Abhängig von den akustischen Eigenschaften der Gewebe und Fluide im Körper werden die Ultraschallwellen teilweise oder vollständig reflektiert oder absorbiert. Wenn Schallwellen von einer Grenzfläche reflektiert werden, werden sie vom Empfänger im Wandler erfasst und zur Erzeugung eines Bilds verarbeitet. Die akustischen Eigenschaften der Gewebe und Fluide innerhalb des Körpers bestimmen den Kontrast, der in dem resultierenden Bild erscheint.
Die WO 94/28780 beschreibt Liposomen, die mit einer gasförmigen Vorstufe gefüllt sind und z.B. bei Ultraschallbildgebungsanwendungen geeignet sind.
Die Magnetresonanzbildgebung (MRI) ist eine relativ neue Bildgebungstechnik, die anders als Röntgenstrahlen keine ionisierende Strahlung nutzt. Wie die Computertomographie kann die MRI Querschnittsbilder des Körpers erzeugen, jedoch hat die MRI den zusätzlichen Vorteil, dass damit Bilder in einer beliebigen Abtastebene erzeugt werden können (d.h. axial, koronal, sagittal oder orthogonal).
Bei der MRI werden ein Magnetfeld, Hochfrequenzenergie und Magnetfeldgradienten eingesetzt, um Bilder des Körpers zu erstellen. Der Kontrast oder die Signalintensitätsdifferenzen zwischen Geweben gibt bzw. geben vorwiegend die T1- und T2-Relaxationswerte und die Protonendichte (effektiv den Gehalt an freiem Wasser) der Gewebe wieder.
Bei der diagnostischen Ultraschalltechnologie und MRI-Technologie wurden in den letzten Jahren Fortschritte erzielt. Trotz der verschiedenen technologischen Verbesserungen sind Ultraschall und MRI jedoch nach wie vor bezüglich einer Anzahl von Aspekten keine perfekten Werkzeuge, insbesondere bezüglich der Bildgebung und der Erfassung von Erkrankungen der Leber und der Milz, der Nieren, dem Herzen und dem Gefäßsystem, einschließlich der Messung der Blutströmung. Das Vermögen zur Erfassung dieser Bereiche und zur Durchführung solcher Messungen hängt von der Differenz der akustischen Eigenschaften (Ultraschall) oder der T1- und T2-Signalintensität (MRI) zwischen Geweben oder Fluiden und den umgebenden Geweben oder Fluiden ab. Demgemäß bestand ein Bedarf für Kontrastmittel, welche diese Differenzen zwischen Geweben oder Fluiden und den umgebenden Geweben oder Fluiden erhöhen und die Ultraschall- oder Magnetresonanzbildgebung und -erfassung von Erkrankungen verbessern. Als Ergebnis dieser Bemühungen wurden neue und bessere Kontrastmittel entwickelt. Trotzdem ist ein immer wiederkehrendes Problem bei vielen derartigen Kontrastmitteln die Lagerstabilität, was eine Langzeitlagerung problematisch macht.
Die vorliegende Erfindung löst diese und andere Probleme durch die Bereitstellung eines zweckmäßigen Behälters, der eine wässrige Lipidsuspensionsphase und eine im Wesentlichen von der wässrigen Lipidsuspensionsphase getrennte Gasphase umfasst, die nach dem Schütteln vor der Verwendung ein hervorragendes gasgefülltes Liposomenkontrastmittel zur Verwendung in Anwendungen wie z.B. einer Ultraschall- oder Magnetresonanzbildgebung und anderen Anwendungen erzeugt. Da das Kontrastmittel unmittelbar vor der Verwendung erzeugt wird, werden die Lagerstabilitätsprobleme vermieden.
Die vorliegende Erfindung stellt einen geschlossenen Behälter mit einer darin enthaltenen sterilen Zusammensetzung bereit, wobei die sterile Zusammensetzung eine wässrige Lipidsuspensionsphase und einen im Wesentlichen getrennten Kopfraum, welcher ein im Wesentlichen unlösliches Gas kombiniert mit einem löslichen Gas enthält, umfasst, wobei die wässrige Lipidsuspensionsphase Phospholipide umfasst und die sterile Zusammensetzung, nach dem Schütteln vor der Verwendung, gasgefüllte Liposomen zur Verwendung als Kontrastmittel erzeugt.
Das erfindungsgemäße Vermögen zur Herstellung des Kontrastmittels unmittelbar vor der Verwendung vermeidet die Probleme der Lagerstabilität; die bei vielen Kontrastmitteln des Standes der Technik aufgetreten sind. Die in sich geschlossene Einheit der Erfindung ermöglicht auch eine einfache Sterilisation.
Diese und andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nachstehend detaillierter diskutiert.
Die 1 ist eine Seitenquerschnittsansicht eines mit einer wässrigen Suspension von Lipiden und einem im Wesentlichen getrennten Gas-Kopfraum gefüllten Behälters.
Die 2 ist ein Diagramm einer Schüttelvorrichtung, die zum Schütteln des Behälters von 1 verwendet werden kann, wodurch die wässrige Lipidsuspension und das Gas gemischt werden und ein Kontrastmittel für die Ultraschall- oder Magnetresonanzbildgebung erzeugt wird.
Die 3 ist eine Photomikrographie gasgefüllter Liposomen, die unter Verwendung des in der 1 gezeigten Behälters und der in der 2 gezeigten Schüttelvorrichtung erzeugt worden sind.
Der erfindungsgemäße Behälter umfasst eine wässrige Lipidsuspensionsphase und eine im Wesentlichen getrennte Gasphase. Vor der Verwendung können der Behälter und dessen Inhalt geschüttelt werden, wodurch das Lipid und die Gasphase gemischt werden, was zur Bildung gasgefüllter Liposomen führt, die das Gas einschließen. Die resultierenden gasgefüllten Liposomen stellen ein hervorragendes Kontrastmittel für die diagnostische Bildgebung bereit, insbesondere unter Verwendung einer Ultraschall- oder Magnetresonanzbildgebung.
In der wässrigen Lipidsuspensionsphase können viele verschiedene Lipide verwendet werden. Die Lipide können je nach dem gesättigt oder ungesättigt sein und in linearer oder verzweigter Form vorliegen. Solche Lipide können z.B. Fettsäuremoleküle umfassen, die einen weiten Bereich von Kohlenstoffatomen umfassen, vorzugsweise zwischen etwa 12 Kohlenstoffatome und etwa 22 Kohlenstoffatome. Es können auch Kohlenwasserstoffgruppen verwendet werden, die aus Isoprenoideinheiten, Prenylgruppen und/oder Sterolresten bestehen (z.B. Cholesterin, Cholesterinsulfat und Analoga davon). Die Lipide können auch Polymerketten aufweisen, wie z.B. gegebenenfalls die amphipatischen Polymere Polyethylenglykol (PEG) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Derivate davon (für eine in-vivo-Zielsteuerung), oder geladene Aminosäuren wie z.B. Polylysin oder Polyarginin (zum Binden einer negativ geladenen Verbindung), oder Kohlenhydrate (für eine in-vivo-Zielsteuerung), wie es in der US-PS 4,310,505 beschrieben ist, oder Glykolipide (für eine in-vivo-Zielsteuerung), oder Antikörper und andere Peptide und Proteine (für eine in-vivo-Zielsteuerung), usw. Solche Zielsteuerungs- oder Bindungsverbindungen können der wässrigen Lipidsuspensionsphase einfach zugesetzt werden oder spezifisch chemisch an die Lipide gebunden werden. Die Lipide können gegebenenfalls auch anionische oder kationische Lipide sein, so dass sie selbst andere Verbindungen wie z.B. Pharmazeutika, genetische Materialien oder andere Therapeutika binden können.
Beispiele für Klassen geeigneter Lipide und spezifisch geeignete Lipide umfassen: Phosphatidylcholine, wie z.B. Dioleoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Distearoylphosphatidylcholin; Phosphatidylethanolamine, wie z.B. Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), Dioleoylphosphatidylethanolamin und N-Succinyldioleoylphosphatidylethanolamin; Phosphatidylserine; Phosphatidylglycerine; Sphingolipide; Glykolipide, wie z.B. Gangliosid GM1; Glukolipide; Sulfatide; Glykosphingolipide; Phosphatidsäuren, wie z.B. Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA); Palmitinfettsäuren; Stearinfettsäuren, Arachidonfettsäuren, Laurinfettsäuren; Myristinfettsäuren; Lauroleinfettsäuren; Physeterinfettsäuren, Myristoleinfettsäuren; Palmitoleinfettsäuren; Petroselinfettsäuren; Ölfettsäuren; Isolaurinfettsäuren; Isomyristinfettsäuren; Isopalmitinfettsäuren; Isostearinfettsäuren; Cholesterin und Cholesterinderivate, wie z.B. Cholesterinhemisuccinat, Cholesterinsulfat und Cholesterin-(4'-trimethylammonio)-butanoat; Polyoxyethylenfettsäureester; Polyoxyethylenfettsäurealkohole; Polyoxyethylenfettsäurealkoholether; polyethoxylierte Sorbitanfettsäureester; Glycerinpolyethylenglykoloxystearat; Glycerinpolyethylenglykolrizinoleat; ethoxylierte Sojabohnensterole; ethoxyliertes Rizinusöl; Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Fettsäurepolymere; Polyoxyethylenfettsäurestearate; 12-(((7'-Diethylaminocumarin-3-yl)-carbonyl)-methylamino)-octadecansäure; N-[12-(((7'-Diethylaminocumarin-3-yl)-carbonyl)methylamino)octadecanoyl]-2-aminopalmitinsäure; 1,2-Dioleyl-sn-glycerin; 1,2-Dipalmitoylsn-3-succinylglycerin; 1,3-Dipalmitoyl-2-succinylglycerin und 1-Hexadecyl-2-palmitoylglycerophosphoethanolamin und Palmitoylhomocystein; Lauryltrimethylammoniumbromid (Lauryl- = Dodecyl-); Cetyltrimethylammoniumbromid (Cetyl- = Hexadecyl-); Myristyltrimethylammoniumbromid (Myristyl- = Tetradecyl-); Alkyldimethylbenzylammoniumchloride, wie z.B. diejenigen, bei denen die Alkylgruppe eine C₁₂-, C₁₄- oder C₁₆-Alkylgruppe ist; Benzyldimethyldodecylammoniumbromid; Benzyldimethyldodecylammoniumchlorid; Benzyldimethylhexadecylammoniumbromid; Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid; Benzyldimethyltetradecylammoniumbromid; Benzyldimethyltetradecylammoniumchlorid; Cetyldimethylethylammoniumbromid; Cetyldimethylethylammoniumchlorid; Cetylpyridiniumbromid; Cetylpyridiniumchlorid; N-[1-2,3-Dioleoyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA); 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propan (DOTAP) und 1,2-Dioleoyl-e-(4'-trimethylammonio)-butanoyl-sn-glycerin (DOTB).
Dem Fachmann ist klar, dass die vorstehende Aufzählung von Lipiden im Lichte der vorliegenden Offenbarung lediglich beispielhaft ist und dass auch andere geeignete Lipide, Fettsäuren und Derivate sowie Kombinationen davon verwendet werden können, wobei solche zusätzlichen Verbindungen auch unter den Begriff Lipid fallen, wie er hier verwendet wird. Dem Fachmann ist klar, dass solche Lipide und/oder Kombinationen davon beim Schütteln des Behälters Liposomen bilden (d.h. Lipidkügelchen mit einem inneren Hohlraum), die in ihrem inneren Hohlraum Gas von der Gasphase einschließen. Die Liposomen können eine einzelne Lipidschicht (eine Lipid-Monoschicht), zwei Lipidschichten (eine Lipid-Doppelschicht) oder mehr als zwei Lipidschichten umfassen (eine Lipid-Mehrfachschicht).
Es ist im Allgemeinen bevorzugt, dass die Lipide insbesondere während des Schüttelns im Gelzustand bleiben, d.h. unter der Phasenübergangstemperatur (T_m) des Lipidmaterials vom Gelzustand in den flüssigkristallinen Zustand. Die Phasenübergangstemperaturen verschiedener Lipide vom Gelzustand in den flüssigkristallinen Zustand sind bekannt. Solche Temperaturen können auch unter Verwendung bekannter Techniken einfach berechnet werden. Die nachstehende Tabelle 1 aus Derek Marsh, „CRC Handbook of Lipid Bilayers", Seite 139, CRC Press, Boca Raton, Florida (1990) zeigt z.B. die Hauptketten-Phasenübergangstemperaturen für verschiedene repräsentative gesättigte Phosphocholinlipide.
Tabelle 1 Gesättigte Diacyl-sn-glycero-(3)-phosphocholine: Hauptketten-Schmelzübergänge
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die wässrige Lipidphase ferner ein Polymer, vorzugsweise ein amphipatisches Polymer, und vorzugsweise ein Polymer, das direkt an das Lipid gebunden (d.h. chemisch gebunden) ist. Vorzugsweise ist das amphipatische Polymer Polyethylenglykol oder ein Derivat davon. Die am meisten bevorzugte Kombination ist das Lipid Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), das an Polyethylenglykol (PEG) gebunden ist, insbesondere an PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 5000 (DPPE-PEG5000). Das PEG oder ein anderes Polymer kann an das DPPE oder ein anderes Lipid mittels einer kovalenten Bindung gebunden sein, wie z.B. eine Amid-, Carbamat- oder Aminbindung. Alternativ können mit dem PEG oder einem anderen Polymer Ester-, Ether-, Thioester-, Thioamid- oder Disulfid-Bindungen (Thioester-Bindungen) verwendet werden, um das Polymer z.B. an Cholesterin oder andere Phospholipide zu binden. Eine besonders bevorzugte Kombination von Lipiden ist DPPC, DPPE-PEG5000 und DPPA, insbesondere in einem Verhältnis von etwa 82 %:8 %:10 % (mol-%), DPPC:DPPE-PEG5000:DPPA.
Zur Herstellung der wässrigen Phase kann das Lipid mit Wasser (vorzugsweise destilliertem Wasser), normaler (physiologischer) Kochsalzlösung, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder einer anderen Lösung auf Wasserbasis kombiniert werden, was dem Fachmann bekannt ist.
In der Gasphase der vorliegenden Erfindung können viele verschiedene Gase verwendet werden. Vorzugsweise sind die Gase in der wässrigen Lipidsuspensionsphase im Wesentlichen unlöslich. Mit im Wesentlichen unlöslich ist gemeint, dass das Gas eine Löslichkeit in Wasser bei 20°C und einem Druck von 1 atm von etwa 18 ml Gas pro kg Wasser oder weniger aufweist. Im Wesentlichen unlösliche Gase weisen als solche eine Löslichkeit auf, die geringer ist als die Löslichkeit von Stickstoffgas. Vorzugsweise beträgt die Löslichkeit etwa 15 ml Gas pro kg Wasser oder weniger, mehr bevorzugt etwa 10 ml Gas pro kg Wasser oder weniger bei 20°C und einem Druck von 1 atm. In einer bevorzugten Klasse von Gasen liegt die Löslichkeit zwischen etwa 0,001 und etwa 18 ml Gas pro kg Wasser oder zwischen etwa 0,01 und etwa 15 ml Gas pro kg Wasser oder zwischen etwa 0,1 und etwa 10 mg Gas pro kg Wasser oder zwischen etwa 1 und etwa 8 mg Gas pro kg Wasser oder zwischen etwa 2 und 6 ml pro kg Wasser bei der vorstehend genannten Temperatur und dem vorstehend genannten Druck. Perfluorkohlenstoffgase und das fluorierte Gas Schwefelhexafluorid weisen z.B. eine Löslichkeit von weniger als 10 ml Gas pro kg Wasser bei 20°C und einem Druck von 1 atm auf und sind deshalb bevorzugt. Gase, die gemäß der hier angegebenen Definition nicht im Wesentlichen unlöslich sind, werden als lösliche Gase bezeichnet.
Andere geeignete, im Wesentlichen unlösliche oder lösliche Gase umfassen unter anderem Hexafluoraceton, Isopropylacetylen, Allen, Tetrafluorallen, Bortrifluorid, 1,2-Butadien, 1,3-Butadien, 1,2,3-Trichlorbutadien, 2-Fluor-1,3-butadien, 2-Methyl-1,3-butadien, Hexafluor-1,3-butadien, Butadiin, 1-Fluorbutan, 2-Methylbutan, Decafluorbutan (Perfluorbutan), Decafluorisobutan (Perfluorisobutan), 1-Buten, 2-Buten, 2-Methyl-1-buten, 3-Methyl-1-buten, Perfluor-1-buten, Perfluor-1-buten, Perfluor-2-buten, 4-Phenyl-3-buten-2-on, 2-Methyl-1-buten-3-in, Butylnitrat, 1-Butin, 2-Butin, 2-Chlor-1,1,1,4,4,4-hexafluorbutin, 3-Methyl-1-butin, Perfluor-2-butin, 2-Brombutyraldehyd, Carbonylsulfid, Crotonnitril, Cyclobutan, Methylcyclobutan, Octafluorcyclobutan (Perfluorcyclobutan), Perfluorisobutan, 3-Chlorcyclopenten, Cyclopropan, 1,2-Dimethylcyclopropan, 1,1-Dimethylcyclopropan, Ethylcyclopropan, Methylcyclopropan, Diacetylen, 3-Ethyl-3-methyldiaziridin, 1,1,1-Trifluordiazoethan, Dimethylamin, Hexafluordimethylamin, Dimethylethylamin, Bis-(dimethylphosphin)amin, 2,3-Dimethyl-2-norbornan, Perfluordimethylamin, Dimethyloxoniumchlorid, 1,3-Dioxolan-2-on, 1,1,1,1,2-Tetrafluorethan, 1,1,1-Trifluorethan, 1,1,2,2-Tetrafluorethan, 1,1,2-Trichlor-1,2,2-trifluorethan, 1,1-Dichlorethan, 1,1-Dichlor-1,2,2,2-tetrafluorethan, 1,2-Difluorethan, 1-Chlor-1,1,2,2,2-pentafluorethan, 2-Chlor-1,1-difluorethan, 1-Chlor-1,1,2,2-tetrafluorethan, 2-Chlor-1,1-difluorethan, Chlorethan, Chlorpentafluorethan, Dichlortrifluorethan, Fluorethan, Nitropentafluorethan, Nitrosopentafluorethan, Perfluorethan, Perfluorethylamin, Ethylvinylether, 1,1-Dichlorethylen, 1,1-Dichlor-1,2-difluorethylen, 1,2-Difluorethylen, Methan, Sulfonylchloridtrifluormethan, Sulfonylfluoridtrifluormethan, (Pentafluorthio)trifluormethan, Bromdifluornitrosomethan, Bromfluormethan, Bromchlorfluormethan, Bromtrifluormethan, Chlordifluornitromethan, Chlordinitromethan, Chlorfluormethan, Chlortrifluormethan, Chlordifluormethan, Dibromdifluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlorfluormethan, Difluormethan, Difluoriodmethan, Disilanmethan, Fluormethan, Iodmethan-Iodtrifluormethan, Nitrotrifluormethan, Nitrosotrifluormethan, Tetrafluormethan, Trichlorfluormethan, Trifluormethan, Sulfenylchloridtrifluormethan, 2-Methylbutan, Methylether, Methylisopropylether, Methyllactat, Methylnitrit, Methylsulfid, Methylvinylether, Neopentan, Stickstoff (N₂), Distickstoffoxid, 1,2,3-Nonadecantricarbonsäure-2-hydroxytrimethylester, 1-Nonen-3-in, Sauerstoff (O₂), Sauerstoff 17 (¹⁷O₂), 1,4-Pentadien, n-Pentan, Dodecafluorpentan (Perfluorpentan), Tetradecafluorhexan (Perfluorhexan), Perfluorisopentan, Perfluorneopentan, 4-Amino-4-methyl-2-pentanon, 1-Penten, {cis}-2-Penten, {trans}-2-Penten, 3-Brom-1-penten, Perfluor-1-penten, Tetrachlorphthalsäure, 2,3,6-Trimethylpiperidin, Propan, 1,1,1,2,2,3-Hexafluorpropan, 1,2-Epoxypropan, 2,2-Difluorpropan, 2-Aminopropan, 2-Chlorpropan, Heptafluor-1-nitropropan, Heptafluor-1-nitrosopropan, Perfluorpropan, Propen, 1,1,1,2,3,3-Hexafluor-2,3-dichlorpropan, 1-Chlorpropylen, {trans}-Chlorpropylen, 2-Chlorpropylen, 3-Fluorpropylen, Perfluorpropylene, Propin, 3,3,3-Trifluorpropin, 3-Fluorstyrol, Schwefelhexafluorid, Decafluordischwefel (S₂F₁₀), 2,4-Diaminotoluol, Trifluoracetonitril, Trifluormethylperoxid, Trifluormethylsulfid, Wolframhe xafluorid, Vinylacetylen, Vinylether, Neon, Helium, Krypton, Xenon (insbesondere Rubidiumangereichertes hyperpolarisiertes Xenongas), Kohlendioxid, Helium und Luft. Fluorierte Gase (d.h. ein Gas, das ein oder mehrere Fluormoleküle enthält, wie z.B. Schwefelhexafluorid), Fluorkohlenstoffgase (d.h. ein fluoriertes Gas, bei dem es sich um ein fluoriertes Kohlenstoffgas handelt) und Perfluorkohlenstoffgase (d.h. ein Fluorkohlenstoffgas, das vollständig fluoriert ist, wie z.B. Perfluorpropan und Perfluorbutan) sind bevorzugt.
Während in der Gasphase der vorliegenden Erfindung theoretisch nahezu jedes Gas verwendet werden kann, kann ein bestimmtes Gas ausgewählt werden, um die gewünschten Eigenschaften des resultierenden Kontrastmediums zu optimieren und an die jeweilige diagnostische Anwendung anzupassen. Es wurde z.B. gefunden, dass bestimmte Gase beim Schütteln stabilere gasgefüllte Liposomen bilden als andere Gase, und solche Gase sind bevorzugt. Es wurde auch gefunden, dass bestimmte Gase bei der diagnostischen Bildgebung wie z.B. bei Ultraschall oder MRI bessere Bildgebungsergebnisse liefern.
Als ein Beispiel zunehmender Stabilität der gasgefüllten Liposomen wurde gefunden, dass Kohlendioxid < Sauerstoff < Luft < Stickstoff < Neon = Helium < Perfluorkohlenstoffgase gilt. Aus diesen und anderen Gründen sind fluorierte Gase, insbesondere Perfluorkohlenstoffgase bevorzugt.
Obwohl in manchen Fällen in der vorliegenden Erfindung lösliche Gase als Gasphase angemessen funktionieren, besteht bei im Wesentlichen unlöslichen Gasen eine Tendenz zu einer größeren Stabilität als bei Gasen mit höherer Löslichkeit, insbesondere bei der Erzeugung des Kontrastmittels beim Schütteln. Mit solchen unlöslichen Gasen ist es auch einfacher, vor dem Schütteln erfindungsgemäß eine Gasphase beizubehalten, die im Wesentlichen von der wässrigen Lipidphase getrennt ist. Folglich sind im Wesentlichen unlösliche Gase bevorzugt, wie sie weiter oben definiert worden sind.
Die Qualität von Ultraschallbildern und die Dauer solcher Bilder hängen auch mit der Löslichkeit des Gases in dem wässrigen Milieu zusammen. Eine Abnahme der Gaslöslichkeit liefert beim Ultraschall im Allgemeinen ein besser aufgelöstes Bild mit einer längeren Dauer.
Zusätzlich wurde allgemein gefunden, dass die Größe gasgefüllter Liposomen, die beim Schütteln erzeugt werden, mit der Löslichkeit des Gases in dem wässrigen Milieu korreliert, wobei Gase mit einer größeren Löslichkeit zu größeren gasgefüllten Liposomen führen. Es wird auch angenommen, dass die Größe der Liposomen von der Wechselwirkung des Gases mit der Innenwand der Liposomen beeinflusst werden kann. Insbesondere wird angenom men, dass die Wechselwirkung an der Grenzfläche die Spannung und folglich die nach außen gerichtete Kraft des innen befindlichen Gases auf die innere Lipidwand des Liposoms beeinflusst. Eine Abnahme der Spannung ermöglicht durch die Verminderung der Kraft, die durch das innen befindliche Gas ausgeübt wird, kleinere Liposomen, und ermöglicht es folglich der Kraft, die auf das Äußere des Liposoms durch das wässrige Milieu ausgeübt wird, das gasgefüllte Liposom zu kontrahieren.
Die Löslichkeit von Gasen in wässrigen Lösungsmitteln kann unter Verwendung des Henry'schen Gesetzes abgeschätzt werden, da dieses allgemein auf Drücke bis zu etwa 1 atm und für Gase angewandt werden kann, die geringfügig löslich sind (F. Daniels und R.A. Alberty, Physical Chemistry, 3. Auflage, Wiley & Sons, Inc., New York, 1966). Als Beispiel weist atmosphärische Luft eine Löslichkeit von 18,68 ml in 1 kg Wasser bei 25°C auf und Stickstoff weist eine Löslichkeit von etwa 18,8 ml kg^–1 bei 25°C auf. Schwefelhexafluorid weist andererseits eine Löslichkeit von etwa 5,4 ml kg^–1 bei 25°C auf.
Insgesamt sind die fluorierten Gase, die Fluorkohlenstoffgase und die Perfluorkohlenstoffgase aus Gründen der Stabilität, der Unlöslichkeit und der resultierenden Liposomengröße bevorzugt. Besonders bevorzugt sind das fluorierte Gas Schwefelhexafluorid und die Perfluorkohlenstoffgase Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorcyclobutan, Perfluormethan, Perfluorethan und Perfluorpentan, insbesondere Perfluorpropan und Perfluorbutan.
Es sollte beachtet werden, dass Perfluorkohlenstoffe mit weniger als fünf Kohlenstoffatomen bei Raumtemperatur Gase sind. Perfluorpentan ist z.B. bis etwa 27°C eine Flüssigkeit. Über dieser Temperatur wird es den Kopfraum des Behälters füllen. Es wurde jedoch gezeigt, dass Perfluorpentan selbst bei Raumtemperatur ebenfalls zur Füllung des Kopfraums verwendet werden kann (d.h. des Raums in dem Behälter über der Lipidsuspensionsphase). Durch Auswählen einer definierten Menge an flüssigem Perfluorpentan, die so berechnet worden ist, dass sie den Kopfraum füllt, und Einbringen der Flüssigkeit in den Behälter bei einer niedrigen Temperatur, z.B. bei –20°C, anschließend Evakuieren des Behälters (effektives Entfernen des Luft-Kopfraums) und dann Schließen des Behälters, wird das Perfluorpentan bei einer Temperatur, die niedriger ist als dessen Siedepunkt bei 1 atm, einem Übergang von der flüssigen Phase in die Gasphase unterliegen. Folglich wird es bei Raumtemperatur einen Teil des Kopfraums oder den gesamten Kopfraum als Gas füllen. Dem Fachmann ist klar, dass die Abnahme der Temperatur des Übergangs von der flüssigen Phase in die Gasphase unter Verwendung einer gebräuchlichen "Faustregel"-Abschätzung abgeschätzt werden kann. Insbesondere wird die Siedetemperatur bei jeder Abnahme des Drucks um die Hälfte um etwa 10°C sinken. Alternativ kann die Abnahme der Temperatur als Funktion eines verminderten Drucks unter Verwendung der Beziehungen auf der Basis des idealen Gasgesetzes basierend auf dem Boyle'schen Gesetz berechnet werden. Ein anderes Verfahren zum Füllen des Kopfraums mit Perfluorpentan besteht darin, dass zuerst der Kopfraum evakuiert wird und der Kopfraum dann bei über 27°C mit Perfluorpentangas gefüllt wird. Natürlich ist dieses Verfahren nicht auf Perfluorpentan allein beschränkt, sondern gilt für alle Perfluorkohlenstoffgase, sowie für Gase im Allgemeinen, mit der Maßgabe, dass der Siedepunkt des Gases bekannt ist.
Gegebenenfalls können zum Füllen des Kopfraums zwei oder mehr verschiedene Gase verwendet werden. Ein Gasgemisch kann eine Reihe von Vorteilen bei vielen verschiedenen Anwendungen der resultierenden gasgefüllten Liposomen aufweisen (wie z.B. bei Anwendungen in der Ultraschall-Bildgebung, der MR-Bildgebung, usw.). Es wurde gefunden, dass eine kleine Menge eines im Wesentlichen unlöslichen Gases mit einem löslichen Gas gemischt werden kann, um eine größere Stabilität bereitzustellen, als sie durch die Kombination erwartet werden würde. Beispielsweise kann eine kleine Menge eines Perfluorkohlenstoffgases (z.B. im Allgemeinen mindestens etwa 1 mol-%) mit Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid oder ein anderes, löslicheres Gas gemischt werden. Das nach dem Schütteln erzeugte Kontrastmittel aus gasgefüllten Liposomen kann dann stabiler sein als mit Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid oder den anderen, löslicheren Gasen allein.
Zusätzlich kann die Verwendung eines Gasgemischs dazu eingesetzt werden, die Zunahme der Größe gasgefüllter Liposomen zu kompensieren, die ansonsten in vivo stattfinden könnte, wenn Liposomen, die ein reines Perfluorkohlenstoffgas enthalten, in vivo injiziert werden. Es wurde gefunden, dass einige Perfluorkohlenstoffgase dazu neigen können, andere Gase wie z.B. Sauerstoff zu absorbieren oder aufzunehmen. Wenn das Perfluorkohlenstoffgas intravenös injiziert wird, kann es folglich den Sauerstoff oder andere lösliche Gase aufnehmen, die im zirkulierenden Blut gelöst sind. Die resultierenden Blasen können dann als Folge dieser Aufnahme in vivo wachsen. In Kenntnis dieses Phänomens kann das Perfluorkohlenstoffgas dann mit einem löslichen Gas wie Luft, Stickstoff, Sauerstoff oder Kohlendioxid vorgemischt werden, wodurch die Absorptions- oder Aufnahmeeigenschaften des Perfluorkohlenstoffs gesättigt werden. Folglich würde dies das Potenzial für eine Ausdehnung der gasgefüllten Liposomen im Blutstrom verzögern oder sogar beseitigen. Dies ist im Hinblick auf die Tatsache signifikant, dass dann, wenn ein Liposom zu einer Größe von mehr als 10 um wachsen sollte, potenziell gefährliche embolische Ereignisse stattfinden könnten, wenn diese in den Blutstrom verabreicht werden. Durch Füllen des Kopfraums mit Gasen, die eine größere Löslichkeit als ein Perfluorkohlenstoffgas aufweisen, zusammen mit dem Perfluorkohlenstoffgas, werden die gasgefüllten Liposomen im Allgemeinen nicht dieser Zunahme der Größe nach der Injektion in vivo unterliegen. Folglich kann das Problem embolischer Ereignisse als Ergebnis einer Liposomenausdehnung als Folge der vorliegenden Erfindung durch die Erzeugung von Liposomen umgangen werden, bei denen eine solche Ausdehnung beseitigt oder in ausreichender Weise verzögert ist.
Folglich kann erfindungsgemäß gegebenenfalls ein im Wesentlichen unlösliches Gas mit einem löslichen Gas kombiniert werden, um sehr effektive und stabile gasgefüllte Liposomen zu erzeugen.
Die nachstehende Tabelle 2 zeigt eine Analyse von Proben gasgefüllter Liposomen, die unter Verwendung variierender prozentualer Anteile des im Wesentlichen unlöslichen Gases Perfluorpropan (PFP) und Luft als Kopfraumgase hergestellt worden sind. Die Gase wurden durch Schütteln für 60 s bei 3300 U/min mit einer wässrigen Lipidphase kombiniert. Ein optisches Teilchengrößenanalysegerät (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) wurde zur Analyse der Größe und der Gesamtzahl gasgefüllter Liposomen verwendet. Für jede Analyse wurde ein Probenvolumen von 5 μl verwendet, wobei für jede Bestimmung vier Proben eingesetzt wurden.
Gemäß der Tabelle 2 wurden selbst dann, wenn nur 20 % des Gases PFP (ein im Wesentlichen unlösliches Gas) und 80 % des Gases Luft (ein Gemisch aus löslichen Gasen) waren, 100-fach mehr Liposomen erzeugt wie in dem Fall, bei dem Luft allein (0 % PFP) verwendet wurde. Wenn darüber hinaus Luft allein (0 % PFP) verwendet wurde, waren die Liposomen weniger stabil und eine größere Fraktion hatte eine Größe von mehr als 10 μm. Die Liposomen mit 20 % PFP und 80 % Luft erwiesen sich jedoch als so stabil wie die Liposomen mit 80 % PFP und 20 % Luft und wie die anderen Proben mit PFP-Zwischenkonzentrationen, und 20 % PFP mit 80 % Luft erzeugten etwa so viele gasgefüllte Liposomen wie 80 % PFP mit 20 % Luft.
Tabelle 2 Effekt des prozentualen Perfluorpropan-Anteils auf die Blasengröße und -anzahl
In der Tabelle 2 bedeuten STDev = Standardabweichung und CV = Varianzkoeffizient. Ferner steht E+ in der Tabelle 2 für einen Exponenten mit einer bestimmten Potenz, wie z.B. 5,45E+05 = 5,45 × 10⁵.
Zusammenfassend wurde gefunden, dass nur eine kleine Menge eines relativ unlöslichen Gases (wie z.B. PFP) zur Stabilisierung der Liposomen erforderlich ist, wobei der größte Teil des Gases ein lösliches Gas ist. Obwohl die effektive Löslichkeit der Kombination von zwei oder mehr Gasen, die mit der Formel
berechnet wird, sich von der Löslichkeit des löslichen Gases nur geringfügig unterscheiden kann, liegt nach wie vor eine große Anzahl gasgefüllter Liposomen vor und die Stabilität gasgefüllter Liposomen ist hoch, auch wenn nur eine kleine Menge eines unlöslichen Gases zugesetzt wird.
Obwohl eine Bindung an eine Theorie nicht erwünscht ist, wird angenommen, dass das im Wesentlichen unlösliche Gas für einen Membranstabilisierungseffekt wichtig ist. Tatsächlich wird angenommen, dass das im Wesentlichen unlösliche Gas (wie z.B. PFP) als Barriere gegen die Lipidmembran wirkt und möglicherweise effektiv eine Schicht auf der Innenfläche der Membran bildet, die das Austreten des löslichen Gases (wie z.B. Luft, Stickstoff, usw.) verzögert. Diese Erkenntnis ist sowohl überraschend als auch nützlich, da es dadurch möglich wird, nur eine kleine Menge des im Wesentlichen unlöslichen Gases zu verwenden (z.B. einen Perfluorkohlenstoff oder ein anderes fluoriertes Gas) und vorwiegend ein biologisch verträglicheres (ein potenziell weniger toxisches) Gas wie z.B. Luft oder Stickstoff für den größten Teil des Liposomenvolumens zu verwenden.
Die Menge der im Wesentlichen unlöslichen Gase und der löslichen Gase in einem beliebigen Gemisch kann in einem weiten Bereich variieren, was dem Fachmann bekannt ist. Typischerweise sind jedoch mindestens etwa 0,01 % der Gesamtmenge des Gases ein im Wesentlichen unlösliches Gas, mehr bevorzugt mindestens etwa 0,1 %, noch mehr bevorzugt mindestens etwa 1 % und insbesondere mindestens etwa 10 %. Geeignete Bereiche des im Wesentlichen unlöslichen Gases variieren abhängig von verschiedenen Faktoren wie z.B. dem löslichen Gas, das zusätzlich eingesetzt wird, der Art des Lipids, der jeweiligen Anwendung, usw. Beispiele für Bereiche umfassen zwischen etwa 0,01 % und etwa 99 % des im Wesentlichen unlöslichen Gases, vorzugsweise zwischen etwa 1 % und etwa 95 %, mehr bevorzugt zwischen etwa 10 % und etwa 90 % und insbesondere zwischen etwa 30 % und etwa 85 %.
Für Anwendungen, die von der diagnostischem Ultraschallbildgebung verschieden sind, wie z.B. Anwendungen in der diagnostischen Magnetresonanzbildgebung (MRI), werden zur Füllung des Kopfraums vorzugsweise paramagnetische Gase wie z.B. das stark paramagnetische Sauerstoff-17-Gas (¹⁷O₂), Neon, Xenon (insbesondere Rubidium-angereichertes hyperpolarisiertes Xenongas) oder Sauerstoff (der noch, wenn auch weniger stark, paramagnetisch ist) verwendet, obwohl auch andere Gase verwendet werden können. Insbesondere wird ¹⁷O₂-Gas, Neon, Rubidium-angereichertes hyperpolarisiertes Xenongas oder Sauerstoffgas mit einem im Wesentlichen unlöslichen Gas wie z.B. einem Perfluorkohlenstoffgas kombiniert. Paramagnetische Gase sind bekannt und geeignete paramagnetische Gase sind dem Fachmann bekannt. Das am meisten bevorzugte Gas für MRI-Anwendungen, und zwar entweder allein oder zusammen mit einem anderen Gas verwendet, ist ¹⁷O₂.
Durch die Verwendung einer Kombination von Gasen stellt das ¹⁷O₂ oder ein anderes paramagnetisches Gas den optimalen Kontrast bereit und der Perfluorkohlenstoff stabilisiert das ¹⁷O₂-Gas innerhalb des eingeschlossenen Gases nach dem Schütteln. Ohne die Zugabe des Perfluorkohlenstoffgases sind Gase wie z.B. ¹⁷O₂ im Allgemeinen weitaus weniger effektiv, da diese aufgrund ihrer Löslichkeit nach der intravenösen Injektion aus dem Lipideinschluss herausdiffundieren. Darüber hinaus ist ¹⁷O₂-Gas ziemlich teuer. Das Kombinieren des Perfluorkohlenstoffgases mit dem ¹⁷O₂-Gas erhöht die Effizienz des Produkts stark und vermindert die Kosten durch eine effizientere Nutzung des teuren ¹⁷O₂-Gases. Entsprechend können andere Gase mit den gewünschten paramagnetischen Eigenschaften, wie z.B. Neon, mit den Perfluorkohlenstoffgasen gemischt werden.
Wie es die nachstehende Tabelle 3 zeigt, können in einer MR-Bildgebungsanwendung viele verschiedene Gase eingesetzt werden. In der Tabelle 3 ist R2 (1/T2/mmol/L·s^–1) für verschiedene Gase in gasgefüllten Liposomen gezeigt. Gemäß der Tabelle 3 gibt es dramatische Unterschiede bei dem Relaxationsvermögen der verschiedenen gasgefüllten Liposomen, wobei die Liposomen als MR-Bildgebungsmittel umso effektiver sind, je höher die R2-Relaxationswerte sind. Von den gezeigten Gasen weist Luft den höchsten R2-Wert auf. Es wird angenommen, dass Luft aufgrund des paramagnetischen Effekts des Sauerstoffs in der Luft den höchsten Wert aufweist. Reiner Sauerstoff ist jedoch etwas weniger effektiv, und zwar wahrscheinlich aufgrund der höheren Löslichkeit des Sauerstoffs und der Äquilibrierung von Sauerstoff in das wässrige Milieu, das die Liposomen umgibt. Mit der Luft unterstützt der Stickstoff (Luft besteht zu etwa 80 % aus Stickstoff) die Stabilisierung des Sauerstoffs innerhalb der Liposomen. Stickstoff weist eine viel geringere Wasserlöslichkeit auf als Luft. Wie es vorstehend angegeben worden ist, kann bzw. können PFP oder andere Perfluorkohlenstoffgase mit einem magnetisch aktiveren Gas wie z.B. Luft, Sauerstoff, ¹⁷O₂ oder Rubidiumangereichertem hyperpolarisierten Xenon gemischt werden. Dabei können stabile, stark magnetisch aktive gasgefüllte Liposomen hergestellt werden.
Tabelle 3 Größenverteilung und Relaxationsvermögen
Der Kopfraum des Behälters kann je nach dem mit dem Gas bei Umgebungsdruck, vermindertem oder erhöhtem Druck gefüllt werden.
In dem erfindungsgemäßen Behälter ist die Gasphase im Wesentlichen von der wässrigen Lipidsuspensionsphase getrennt. Mit im Wesentlichen getrennt ist gemeint, dass vor dem Schütteln weniger als etwa 50 % des Gases mit der wässrigen Lipidphase vereinigt sind. Vorzugsweise sind weniger als etwa 40 %, mehr bevorzugt weniger als etwa 30 %, noch mehr bevorzugt weniger als etwa 20 % und insbesondere weniger als etwa 10 % des Gases mit der wässrigen Lipidphase vereinigt. Die Gasphase wird von der wässrigen Lipidphase bis zum Zeitpunkt des Gebrauchs, bei dem der Behälter geschüttelt und die Gasphase und die wässrige Lipidphase vereinigt werden, im Wesentlichen getrennt gehalten, so dass eine wässrige Suspension gasgefüllter Liposomen gebildet wird. Auf diese Weise wird ein hervorragendes Kontrastmittel für die Ultraschall- oder Magnetresonanzbildgebung erzeugt. Da das Kontrastmittel darüber hinaus unmittelbar vor der Verwendung erzeugt wird, werden Lagerstabilitätsprobleme minimiert.
Das Schütteln kann auf viele verschiedene Arten durchgeführt werden und ein mechanisches Schütteln und/oder ein Schütteln per Hand sowie ein Schütteln durch andere Mittel wie z.B. eine Sonifizierung (Schallwellen) umfassen. Das mechanische Schütteln und/oder das Schütteln per Hand ist bzw. sind bevorzugt. Das Schütteln kann z.B. durch Schütteln, Rühren, Vortexieren, Schwingungen, usw. durchgeführt werden. Vorzugsweise wird eine Schüttelvorrichtung verwendet, wie sie z.B. in der 2 gezeigt ist. Insbesondere ist in der 2 eine mechanische Schüttelvorrichtung (10) gezeigt. Das Schütteln kann durch die Verwendung des Start-Stop-Knopfs (11) begonnen und beendet werden. Die Schüttelvorrichtung (10) umfasst auch einen Drehknopf (12), der eine variable Einstellung der Geschwindigkeit (U/min) ermöglicht. Durch das Drehen des Drehknopfs (12) im Uhrzeigersinn wird eine zunehmende Schüttelgeschwindigkeit (in U/min) erreicht. Umgekehrt vermindert das Drehen des Drehknopfs (12) im Gegenuhrzeigersinn die Schüttelgeschwindigkeit. Der Inhalt eines erfindungsgemäßen Behälters kann durch Einbringen des Behälters in das Gehäusemodul (13) der Schüttelvorrichtung (10) geschüttelt werden. Das Gehäusemodul (13) dient als Schütteleinrichtung der Schüttelvorrichtung (10). Um den Behälter in dem Gehäusemodul zum Schütteln fest an Ort und Stelle zu halten, wird eine Schraube (14) verwendet.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Behälter kann in vielen verschiedenen Formen vorliegen. Die Form kann gemäß der 1 vorliegen, bei welcher der Behälter (1) einen Körper (2) und eine Kappe (3) aufweist, und einen Gas-Kopfraum (4) und eine Suspension von Lipiden (5) enthält, die im Wesentlichen voneinander getrennt sind. Alternativ kann der Behälter in Form einer vorgefüllten Spritze vorliegen, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren Filter(n) ausgestattet sein kann. In diesem Fall werden die Spritzen mit einer wässrigen Phase und einem Kopfraum aus einem vorausgewählten Gas gefüllt. Die Spritzen werden im Allgemeinen so auf der Schüttelvorrichtung montiert, dass ihre Längsachsen senkrecht zu der Schüttelrichtung orientiert sind. Nach dem Schütteln liegen die gasgefüllten Liposomen gebrauchsfertig in der Spritze vor. Der Behälter ist, unabhängig davon, ob es sich um einen Behälter des in der 1 gezeigten Typs, eine Spritze oder eine andere Art von Behälter handelt, zusammen mit dessen Inhalt steril.
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Behälters, einschließlich der Spritzen, können viele verschiedene Materialien verwendet werden, wie z.B. Glas, Borosilikatglas, Silikatglas, Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluorethylen, Polyacrylate, Polystyrol oder andere Kunststoffe. Die bevorzugten Behälter, einschließlich Spritzen, sind entweder gasundurchlässig oder werden vor dem Füllen mit Gas innerhalb einer äußeren gasundurchlässigen Barriere eingehüllt. Es ist natürlich bevorzugt, die Integrität des vorausgewählten Gases in dem Behälter beizubehalten. Beispiele für gasdichte Spritzenmaterialien umfassen unter anderem Silikat- oder Borosilikatglas, die mit Quarzspritzen oder Spritzen des Luenrerschluss-Typs und Kolben mit Teflonspitze oder teflonbeschichteten Kolben ausgestattet sind.
Dem Fachmann ist im Lichte der vorliegenden Beschreibung klar, dass in der wässrigen Lipidsuspensionsphase der Erfindung verschiedene Zusätze eingesetzt werden können, um diese Phase zu stabilisieren, oder um die gasgefüllten Liposomen beim Schütteln zu stabilisieren. Gegebenenfalls können diese Zusätze vor dem Schütteln der wässrigen Lipidphase zugesetzt werden oder sie können der Zusammensetzung nach dem Schütteln und der resultierenden Erzeugung der gasgefüllten Liposomen zugesetzt werden. Die Verwendung solcher Zusätze wird selbstverständlich von der für die resultierenden gasgefüllten Liposomen vorgesehenen jeweiligen Anwendung abhängen, was dem Fachmann klar ist.
Es steht eine Anzahl von Stabilisatoren zur Verfügung, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, einschließlich Xanthangummi, Akaziengummi, Agar, Agarose, Alginsäure, Alginat, Natriumalginat, Carragen, Dextran, Dextrin, Gelatine, Guargum, Tragant, Johannisbrot, Bassorin, Karaya, Gummiarabikum, Pektin, Casein, Bentonit, ungereinigter Bentonit, gereinigter Bentonit, Bentonitmagma, kolloidale Cellulose, Cellulose (mikrokristallin), Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Calciumcarboxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Carboxymethylcellulose-Natrium 12, sowie andere natürliche oder modifizierte natürliche Cellulosen, Polysorbat, Carbomer 934P, Magnesiumaluminiumsilikat, Aluminiummo nostearat, Polyethylenoxid, Polyvinylalkohol, Povidon, Polyethylenglykol, Propylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Siliziumdioxid, kolloidales Siliziumdioxid.
In der Lipidphase können als Stabilisatoren auch Verbindungen wie z.B. Perfluoroctylbromid (PFOB), Perfluoroctyliodid, Perfluortripropylamin und Perfluortributylamin verwendet werden. Perfluorkohlenstoffe mit mehr als 5 Kohlenstoffatomen werden bei Körpertemperatur im Allgemeinen flüssig sein und solche Perfluorkohlenstoffe sind als Stabilisatoren ebenfalls besonders bevorzugt. Geeignete Perfluorkohlenstoffe umfassen Perfluorhexan, Perfluorheptan, Perfluoroctan, Perfluordecalin und Perfluordodecalin. Darüber hinaus können auch perfluorierte Lipide oder partiell fluorierte Lipide verwendet werden, um bei der Stabilisierung zu unterstützen. Es ist dem Fachmann klar, dass viele verschiedene perfluorierte und partiell fluorierte Analoga der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Lipide verwendet werden können. Aufgrund ihres relativ hydrophoben Charakters bezüglich der Kohlenwasserstofflipide können solche perfluorierten oder partiell fluorierten Lipide sogar bezüglich der Stabilität Vorteile bereitstellen. Beispiele für perfluorierte oder partiell fluorierte Lipide sind F₆C₁₁-Phosphatidylcholin (PC) und F₈C₅PC. Solche Analoga sind z.B. in Santaella et al., Federation of European Biochemical Societies (FEBS), Band 336, Nr. 3, Seiten 418–484 (1993) beschrieben.
Zur Unterstützung der Stabilisierung können auch viele verschiedene biologisch verträgliche Öle verwendet werden, wie z.B. Erdnussöl, Canolaöl, Olivenöl, Safloröl, Maisöl, Mandelöl, Baumwollsaatöl, Pfirsichkernöl, Sesamöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, leichtes Mineralöl, Ethyloleat, Myristylalkohol, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Octyldodecanol, Propylenglykol, Glycerin, Squalen oder ein beliebiges anderes Öl, von dem allgemein bekannt ist, dass es aufgenommen werden kann. Diese können auch Lecithin, Sphingomyelin, Cholesterin, Cholesterinsulfat und Triglyceride umfassen.
Die Stabilisierung kann auch durch die Zugabe vieler verschiedener Viskositätsmodifizierer (d.h. Viskositätsmodifikationsmittel) bewirkt werden, die erfindungsgemäß als Stabilisatoren dienen können. Diese Verbindungsklasse umfasst unter anderem: 1) Kohlenhydrate und deren phosphorylierte und sulfonierte Derivate; 2) Polyether mit Molekulargewichtsbereichen zwischen 400 und 8000; 3) Di- und Trihydroxyalkane und deren Polymere im Molekulargewichtsbereich zwischen 800 und 8000. Liposomen können auch im Zusammenhang mit Emulgatoren und/oder Solubilisierungsmitteln verwendet werden, die unter anderem aus Akaziengummi, Cholesterin, Diethanolamin, Glycerinmonostearat, Lanolinalkoholen, Lecithin, Mono- und Diglyceriden, Monoethanolamin, Ölsäure, Oleylalkohol, Poloxamer, Polyoxyethylen-50-stearat, Polyoxyl-35-rizinusöl, Polyoxyl-10-oleylether, Polyoxyl-20-cetostearyl ether, Polyoxyl-40-stearat, Polysorbat 20, Polysorbat 40, Polysorbat 60, Polysorbat 80, Propylenglykoldiacetat, Propylenglykolmonostearat, Natriumlaurylsulfat, Natriumstearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonooleat, Sorbitanmonopalmitat, Sorbitanmonostearat, Stearinsäure, Trolamin, emulgierendes Wachs, Pluronic F61, Pluronic F64 und Pluronic F68 bestehen können.
Andere Mittel, die zugesetzt werden können, umfassen Tonizitätsmittel wie z.B. Polyalkohole wie Glycerin, Propylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyethylenglykol, Glukose, Mannit, Sorbit, Natriumchlorid und dergleichen.
Gegebenenfalls können in die Formulierung bakterizide Mittel und/oder Konservierungsmittel einbezogen werden. Solche Mittel umfassen Natriumbenzoat, alle quartären Ammoniumsalze, Natriumazid, Methylparaben, Propylparaben, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Natriumsorbat, Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol, Chlorbutanol, Dehydroessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Monothioglycerin, Kaliumbenzoat, Kaliummetahydrogensulfit, Kaliumsorbat, Natriumhydrogensulfit, Schwefeldioxid und organische Quecksilbersalze.
Gegebenenfalls kann zur Steuerung der Osmolarität ein Osmolaritätsmittel zugesetzt werden. Geeignete, osmotisch aktive Materialien umfassen physiologisch verträgliche Verbindungen wie z.B. Monosaccharidzucker, Disaccharidzucker, Zuckeralkohole, Aminosäuren und verschiedene synthetische Verbindungen. Geeignete Monosaccharidzucker oder Zuckeralkohole umfassen z.B. Erythrose, Threose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Allose, Altrose, Glukose, Mannose, Idose, Galaktose, Talose, Trehalose, Ribulose, Fruktose, Sorbit, Mannit und Sedoheptulose, wobei die bevorzugten Monosaccharide Fruktose, Mannose, Xylose, Arabinose, Mannit und Sorbit sind. Geeignete Disaccharidzucker umfassen z.B. Laktose, Saccharose, Maltose und Cellobiose. Geeignete Aminosäuren umfassen z.B. Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin und Histidin. Synthetische Verbindungen umfassen z.B. Glycerin, Propylenglykol, Polypropylenglykol, Ethylenglykol, Polyethylenglykol und Polyvinylpyrrolidon. Dem Fachmann sind verschiedene andere geeignete osmotisch aktive Materialien bekannt und sollen vom Ausdruck osmotisch aktives Mittel, wie er hier verwendet wird, umfasst sein.
Für viele verschiedene Zwecke und Anwendungen können auch verschiedene Polymere zugesetzt werden, wie z.B. diejenigen, die vorstehend diskutiert worden sind.
Dem Fachmann ist klar, dass in der wässrigen Lipidsuspensionsphase der Erfindung gegebenenfalls abhängig von der jeweiligen Endanwendung verschiedene Bereiche von Zusatzmengen, wie z.B. der vorstehend beschriebenen Suspensionsmittel, eingesetzt werden können. Solche Zusätze können im Allgemeinen zwischen 0,01 Vol.-% bis etwa 95 Vol.-% der resultierenden Kontrastmittelformulierung umfassen, obwohl auch größere oder kleinere Mengen eingesetzt werden können. Im Allgemeinen ist ein Suspensionsmittel typischerweise in einer Menge von mindestens etwa 0,5 Vol.-%, mehr bevorzugt von mindestens etwa 1 Vol.-% und insbesondere von mindestens etwa 10 Vol.-% vorhanden. Im Allgemeinen liegt das Suspensionsmittel typischerweise in einer Menge von weniger als etwa 50 Vol.-%, mehr bevorzugt von weniger als etwa 40 Vol.-% und insbesondere von weniger als etwa 30 Vol.-% vor. Eine typische Menge eines Suspensionsmittels könnte z.B. etwa 20 Vol.-% betragen. Typischerweise werden zum Erreichen allgemein bevorzugter Osmolaritätsbereiche weniger als etwa 25 g/Liter, mehr bevorzugt weniger als etwa 20 g/Liter, noch mehr bevorzugt weniger als etwa 15 g/Liter und insbesondere weniger als etwa 10 g/Liter der osmotisch aktiven Materialien verwendet und in manchen Fällen werden keine osmotisch aktiven Materialien verwendet. Ein am meisten bevorzugter Bereich osmotisch aktiver Materialien liegt im Allgemeinen zwischen etwa 0,002 g/Liter und etwa 10 g/Liter. Diese sowie andere geeignete Bereiche von Zusätzen sind dem Fachmann in Kenntnis der vorliegenden Erfindung bekannt.
In die wässrige Lipidsuspensionsphase können auch viele verschiedene therapeutische und/oder diagnostische Mittel einfach durch Zugeben der gewünschten therapeutischen oder diagnostischen Mittel zu dieser Phase eingebracht werden. Geeignete therapeutische und diagnostische Mittel und geeignete Mengen davon sind für den Fachmann im Lichte der vorliegenden Beschreibung offensichtlich. Diese Mittel können in die Lipidmembranen eingebracht oder auf diese aufgebracht oder in die resultierenden Liposomen eingekapselt werden.
Um den magnetischen Effekt der resultierenden gasgefüllten Liposomen für die MRI weiter zu verbessern, kann bzw. können z.B. ein oder mehrere MRI-kontrastverstärkende Mittel wie z.B. paramagnetische oder superparamagnetische kontrastverstärkende Mittel zugesetzt werden. Geeignete MRI-kontrastverstärkende Mittel umfassen paramagnetische Ionen wie z.B. Übergangsmetalle, einschließlich Eisen (Fe³⁺), Kupfer (Cu²⁺) und Mangan (Mn²⁺), und die Lanthanide, wie z.B. Gadolinium (Gd³⁺) und Dysprosium (Dy³⁺), Nitroxide, Eisenoxide (Fe₃O₄), Eisensulfide und paramagnetische Teilchen, wie z.B. Mangan-substituierte (Mn²⁺-substituierte) Hydroxyapatite. Weitere Beispiele für paramagnetische Ionen, die verwendet werden können, sind Mittel wie z.B. Chrom (Cr³⁺), Nickel (Ni²⁺), Cobalt (Co²⁺) und Europium (Eu²⁺). Es können auch andere kontrastverstärkende Mittel wie z.B. Nitroxidradikale oder ein beliebiges anderes Atom verwendet werden, das einen ungepaarten Elektronenspin mit paramagnetischen Eigenschaften aufweist. Idealerweise wird das kontrastverstärkende Mittel der wässrigen Lipidphase vor dem Schütteln zugesetzt und das kontrastverstärkende Mittel ist so gestaltet, dass es nach dem Schütteln in oder auf die Oberfläche des resultierenden gasgefüllten Liposoms einbezogen wird, obwohl auch eine Zugabe nach der Liposomenherstellung möglich ist. Das resultierende gasgefüllte Liposom kann ein stark verbessertes Relaxationsvermögen aufweisen, wodurch ein besonders effektives Kontrastmittel für die Magnetresonanzbilderzeugung bereitgestellt wird. Beispielsweise wird Mangan (Mn²⁺) in die Kopfgruppen des Lipids eingebaut, wenn in der wässrigen Lipidphase Phosphatidylcholin oder Phosphatidylserin verwendet wird. Gegebenenfalls können die Metalle unter Verwendung lipidlöslicher Verbindungen chelatisiert werden, wie es z.B, in Unger et al., US-PS 5,312,617 , gezeigt ist. Derartige lipidlösliche Verbindungen sind ziemlich nützlich, da sie leicht in die Liposomenmembran eingebaut werden. Eisenoxide und andere Teilchen sollten im Allgemeinen klein sein, vorzugsweise weniger als etwa 1 μm, mehr bevorzugt weniger als etwa 200 nm und insbesondere weniger als 100 nm, um einen optimalen Einbau in die oder auf der Liposomoberfläche zu erreichen. Für einen verbesserten Einbau können Eisenoxide verwendet werden, die mit aliphatischen oder lipophilen Verbindungen beschichtet sind, da diese dazu neigen, in die Lipidbeschichtung der Blasenoberfläche eingebaut zu werden.
Es liegt auch im Bereich der vorliegenden Erfindung, dass die wässrige Lipidsuspensionsphase einen Bestandteil enthält, der eine Gelierung mit Lipidpolymeren und Metallen bewirkt, die nicht spontan gelieren, oder dass zur Verstärkung der Gelierung Geliermittel wie z.B. mehrwertige Metallkationen, Zucker und Polyalkohole verwendet werden können. Beispiele für mehrwertige Metallkationen, die als Geliermittel geeignet sind, umfassen Calcium, Zink, Mangan, Eisen und Magnesium. Geeignete Zucker umfassen Monosaccharide wie z.B. Glukose, Galaktose, Fruktose, Arabinose, Allose und Altrose, Disaccharide wie z.B. Maltose, Saccharose, Cellobiose und Lactose, und Polysaccharide wie z.B. Stärke. Vorzugsweise ist der Zucker ein einfacher Zucker, d.h. ein Monosaccharid oder Disaccharid. Polyalkoholgeliermittel, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen z.B. Glycidol, Inosit, Mannit, Sorbit, Pentaerythrit, Galacitol und Polyvinylalkohol. Insbesondere ist das in der vorliegenden Erfindung verwendete Geliermittel Saccharose und/oder Calcium. Die jeweiligen Geliermittel, die in den verschiedenen Formulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt. Kombinationen von Lipiden, wie z.B. von Phosphatidsäure mit Calcium- oder Magnesiumsalzen und Polymeren wie z.B. Alginsäure, Hyaluronsäure oder Carboxymethylcellulose können zur Stabilisierung von Lipiden verwendet werden. Es wird vermutet, dass die zweiwertigen Kationen Metallbrücken zwischen den Lipiden und den Polymeren bilden, so dass die gasgefüll ten Liposomen innerhalb der Lipid/Polymer-Systeme stabilisiert werden. Entsprechend können Suspensionen hergestellt werden, die Gemische aus Chitosan (oder Materialien auf Chitinbasis), Polylysin, Polyethylenimin und Alginsäure (oder deren Derivate) oder Hyaluronsäure umfassen.
Es wurde gefunden, dass die Geschwindigkeit des Schüttelns, die Menge der Lipide, welche die wässrige Lipidphase bilden, und die Größe des geschlossenen Behälters die schließlich erreichte Größe der gasgefüllten Liposomen beeinflussen können. Darüber hinaus wurde gefunden, dass die Anteile dieser Mittel auch für die Größenverteilung der gasgefüllten Liposomen wichtig sein können. Es wird auch angenommen, dass die Oberflächenspannung an der Grenzfläche des gasgefüllten Liposoms und des wässrigen Milieus ein zusätzlicher bestimmender Faktor für die schließlich erreichte Größe des gasgefüllten Liposoms ist, wenn dieser zusammen mit der Schüttelgeschwindigkeit, der Behältergröße und der Lipidkonzentration berücksichtigt wird.
Es wurde auch gefunden, wie in einem sterilen Behälter, der mit einer wässrigen Phase und einem Gas-Kopfraum gefüllt ist, Veränderungen einfach durchgeführt werden können, so dass die Liposomengröße nach dem Schütteln verändert werden kann, um dadurch ein Produkt mit Liposomen mit der gewünschten Größenverteilung zu erhalten. Zusätzlich können zur weiteren Verfeinerung der Größenverteilung des Kontrastmittels nach dem Schütteln Filter verwendet werden. Nachstehend ist ein Überblick darüber angegeben, wie Veränderungen bei den Komponenten der Erfindung dazu eingesetzt werden können, die Liposomengröße zu modifizieren.
Als erstes wurde gefunden, dass die verschiedenen Materialien innerhalb der wässrigen Phase bei der Steuerung der Größe der resultierenden gasgefüllten Liposomen wichtig sein können. Die Tabelle 4 zeigt die Größen von Liposomen, die durch Schütteln steriler Behälter erzeugt worden sind, die mit einer wässrigen Phase und einem Stickstoff-Kopfraum gefüllt sind. In allen Fällen wurde die Liposomengröße mit einem Lichtverdunklungsteilchenklassierungsgerät, Modell 770, von Particle Sizing Systems (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) gemessen. Wie die Daten zeigen, beeinflusst der Anteil der Lipide in der wässrigen Phase die Größenverteilung der resultierenden gasgefüllten Liposomen. Insbesondere zeigt die nachstehende Tabelle 4 den Effekt der Lipidzusammensetzung auf die durchschnittliche Liposomengröße.
Tabelle 4 Effekt der Lipidzusammensetzung auf die durchschnittliche Liposomengröße
Die Tabelle 5 zeigt die Abhängigkeit der Konzentration eines definierten Lipidzusammensetzungsgemischs von der durchschnittlichen Liposomengröße. Gemäß der Tabelle 5 sind Variationen der Gesamtkonzentrationen an Lipid bei der Beeinflussung der Liposomengröße nach dem Schütteln ebenfalls wichtig. In diesen Experimenten wurde das Verhältnis der drei verschiedenen Lipidkomponenten konstant gehalten und die Lipidkonzentration wurde zwischen 0,5 und 5,0 mg ml^–1 in der wässrigen Phase variiert. Das verwendete Gas war Stickstoff. Die optimale Blasengröße für eine Ultraschalldiagnose mit einem Perfluorbutan-Kopfraum wurde erzeugt, wenn die Lipidkonzentration in der wässrigen Phase 1,0 mg ml^–1 betrug.
Tabelle 5 Effekt der Lipidkonzentration auf die durchschnittliche Liposomengröße
Die Größe der Liposomen kann zusätzlich zur Konzentration der stabilisierenden Medien, z.B. der Lipide, auch von der Zusammensetzung des Gases in dem Kopfraum abhängen. Beispielsweise wurde gefunden, dass eine Lipidkonzentration von 1,0 mg ml^–1 bei der Verwendung von Stickstoff gasgefüllte Liposomen mit etwa dem gleichen Durchmesser erzeugt, wie er bei der Lipidkonzentration von 5,0 mg ml^–1 mit Perfluorbutan erhalten wird. Es wurde jedoch gefunden, dass die höhere Konzentration zu einer Verteilung führen kann, die etwas mehr in Richtung größerer gasgefüllter Liposomen verschoben ist. Dieses Phänomen neigt dazu, die erhöhte Stabilität gasgefüllter Liposomen bei einer höheren Lipidkonzentration wiederzugeben. Es wird daher angenommen, dass die höhere Lipidkonzentration entweder dadurch zur Stabilität beiträgt, dass sie als Stabilisierungsmittel in der wässrigen Phase wirkt, oder dass sie mehr Lamellen um das Gas bereitstellt, wodurch diese stabiler werden und ein größerer Anteil der größeren Liposomen fortbestehen kann. Zusätzlich wurde gefunden, dass die Größe des Gas-Kopfraums ebenfalls dazu verwendet werden kann, die Größe der gasgefüllten Liposomen zu beeinflussen. Größere Kopfräume, die bezogen auf die Größe der wässrigen Phase proportional mehr Gas enthalten, werden im Allgemeinen größere Liposomen erzeugen als kleinere Kopfräume.
Die Schüttelgeschwindigkeit ist für die Erzeugung von Liposomen mit geeigneter Größe wichtig. Es wurde gefunden, dass Schüttelgeschwindigkeiten zwischen 100 und 10000 Umdrehungen pro Minute (U/min) zur Herstellung von Liposomen verwendet werden können, wobei es jedoch optimale Werte bezüglich einer schnellen und reproduzierbaren Herstellung von Liposomen mit einer definierten Größe gibt. Der Ausdruck eine Umdrehung bedeutet in dem hier verwendeten Sinn eine einzelne Bewegung vor und zurück, nach oben und unten, von Seite zu Seite, eine einzelne kreisförmige Bewegung, usw., wobei die Bewegung am Ursprung beginnt und endet (d.h. dorthin zurückkehrt). Die Tabelle 3 zeigt die Größen von Liposomen, die aus einer wässrigen Phase aus 82 mol-% Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) mit 10 mol-% Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA) mit 8 mol-% Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-PEG5000 (DPPE-PEG5000) und einem Kopfraum hergestellt worden sind, der Perfluorpropangas umfasste. Die Zubereitungen wurden zwei Minuten auf einem Wig-L-Bug^TM (Crescent Dental Mfg., Lyons, III.) geschüttelt. Unter Verwendung von braunen 2 ml-Behältern (Wheaton Industries, Millville, NJ; tatsächliches Volumen 3,7 ml), die mit einer wässrigen Lipidphase und einem Gas-Kopfraum gefüllt waren, wurde der erfindungsgemäße Mehrphasenbehälter auf dem Wig-L-Bug^TM platziert und die Geschwindigkeit wurde mit einem Code-Palmer-Modell 08210-Pistolengrifttachometer (Code-Palmer, Nile, III.) gemessen. Die Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse und den Effekt der Schüttelgeschwindigkeiten auf die resultierende durchschnittliche Liposomengröße.
Tabelle 6 Effekt der Schüttelgeschwindigkeit auf die durchschnittliche Liposomengröße
Es wurde gefunden, dass es eine optimale Schüttelgeschwindigkeit zur Erzeugung der Liposomen mit einer gewünschten Größe gibt. Bei der optimalen Geschwindigkeit bilden sich die gasgefüllten Liposomen sehr schnell, und zwar in weniger als 5 min, sogar innerhalb von einer Minute oder zwei, und selbst innerhalb von 30 s oder weniger. Es sollte beachtet werden, dass das Verfahren und die Bewegung des Schüttelns bei der Bildung von Liposomen mit geeigneter Größe signifikant sind. Insbesondere wurde gefunden, dass Liposomen mit optimaler Größe erhalten werden, wenn die Hin- und Herbewegung des Schüttelns in Form eines Bogens stattfindet. Es ist bevorzugt, dass das Ausmaß der Bogenbewegung zwischen 2° und 20° liegt. Es ist mehr bevorzugt, dass das Ausmaß der Bogenbewegung zwischen 4° und 10° liegt. Es ist noch mehr bevorzugt, dass das Ausmaß der Bogenbewegung zwischen 5° und 8° liegt. Es ist insbesondere bevorzugt, dass das Ausmaß der Bogenbewegung zwischen 6° und 7° liegt. Als weitere Ausführungsform dieser Erfindung wurde gefunden, dass die Anzahl der U/min vorzugsweise zwischen etwa 500 und etwa 10000, mehr bevorzugt zwischen etwa 1000 und etwa 5000 und insbesondere zwischen etwa 2500 und etwa 4000 liegt.
Es ist auch eine wichtige Erkenntnis dieser Erfindung, dass die Größe, die Form und die Menge des Kopfraums, der für den Flüssigkeitsinhalt zum Schütteln zur Verfügung steht, für die Bildung gasgefüllter Liposomen mit einer optimalen Größe ebenfalls von entscheidender Bedeutung ist. Beispielsweise wurde erfindungsgemäß gefunden, dass bei der Verwendung von Behältern mit einem Volumen von 3,7 ml (Wheaton 300 Borosilikatglas, Wheaton Industries, Millville, NJ, als 2 ml-Größe bezeichnet, Durchmesser × Höhe = 15 mm × 32 mm) das Volumen des Gas-enthaltenden Kopfraums vorzugsweise zwischen etwa 10 % und etwa 60 % des Gesamtvolumens des Behälters liegt. Im Allgemeinen beträgt der Gas-enthaltende Kopfraum in einem Behälter zwischen etwa 10 % und etwa 80 % des Gesamtvolumens des Behälters, obwohl abhängig von den jeweiligen Umständen und der gewünschten Anwendung mehr oder weniger Gas geeignet sein kann. Mehr bevorzugt umfasst der Kopfraum zwischen etwa 30 % und etwa 70 % des Gesamtvolumens. Es ist im Allgemeinen am meis ten bevorzugt, dass das Volumen des Gas-enthaltenden Kopfraums etwa 60 % des Gesamtvolumens des Behälters umfasst.
Aus der vorstehenden Diskussion der Erfindung ist klar, dass die optimale Größe von verschiedenen Faktoren abhängt, einschließlich der Intensität und der Bewegung des Schüttelns und der Größe, Form und dem Füllvolumen der Behälter.
Obwohl zur Herstellung der gasgefüllten Liposomen viele verschiedene Schüttelvorrichtungen verwendet werden können, wie z.B. Farbmischer, Tischschüttelvorrichtungen und Vortexiervorrichtungen, sind die Geometrie und die Geschwindigkeit des Schüttelns zur Optimierung der Herstellung der gasgefüllten Liposomen wichtig. Der Wig-L-Bug^TM ist die am meisten bevorzugte Schüttelvorrichtung.
Die Größe des sterilen Behälters, die Geometrie des Behälters und die Orientierung des Behälters bezüglich der Schüttelvorrichtung sind bei der Bestimmung der Größe der gasgefüllten Liposomen wichtig. Die Schüttelvorrichtung, wie z.B. der Wig-L-Bug^TM, wird das Schütteln im Allgemeinen langsamer durchführen, wenn das Gewicht des sterilen Behälters ein bestimmtes Maß übersteigt. Der Standard-Wig-L-Bug^TM schüttelt mit einem 2 ml-Behälter (tatsächliches Volumen: 3,7 ml) schneller wie mit einem 10 ml-Behälter. Dieses Experiment wurde mit einem farblosen 10 ml-Behälter (Wheaton Industries, Millville, New Jersey) und einem braunen 2 ml-Behälter (tatsächliches Volumen: 3,7 ml) (Wheaton Industries, Millville, New Jersey) durchgeführt. Unter Verwendung eines Code-Palmer-Pistolengrifftachometers (Code-Palmer, Nile, III.) wurde die Schüttelgeschwindigkeit gemessen. In der Tabelle 7 sind die Ergebnisse angegeben.
Die Tabelle 7 zeigt die Abhängigkeit der Schüttelgeschwindigkeit einer elektrischen Schüttelvorrichtung von der Größe des Behälters, der für das Schütteln verwendet wird.
Tabelle 7 Effekt der Behältergröße auf die Schüttelgeschwindigkeit des Wig-L-Bug^TM
Im Allgemeinen wird die Erfindung mit sterilen Behältern durchgeführt, in denen die wässrige Phase bereits innerhalb der Flasche vorliegt. Für ausgewählte Anwendungen können die Stabilisierungsmedien jedoch in einem getrockneten oder lyophilisierten Zustand innerhalb des Behälters gelagert werden. In diesem Fall wird die wässrige Lösung, z.B. eine sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung, dem sterilen Behälter unmittelbar vor dem Schütteln zugesetzt. Dabei werden die rehydratisierten Stabilisierungsmedien innerhalb der wässrigen Phase während des Schüttelns wieder mit dem Gaskopfraum in Wechselwirkung treten, so dass wie vorstehend gasgefüllte Liposomen erzeugt werden. Die Rehydratisierung eines getrockneten oder lyophilisierten Suspensionsmediums macht das Produkt zwangsläufig komplizierter und ist im Allgemeinen unerwünscht, kann jedoch für bestimmte Zubereitungen nützlich sein, um die Lagerstabilität des Produkts weiter zu verlängern. Beispielsweise könnten bestimmte therapeutische Mittel, wie z.B. Cyclophosphamid, Peptide und genetische Materialien (wie z.B. DNA) bei einer lang andauernden wässrigen Lagerung hydrolysiert werden. Durch die Rehydratisierung einer vorher lyophilisierten Probe zur Bildung der wässrigen Phase und des Kopfraums vor dem Schütteln können in der Praxis gasgefüllte Liposomen erzeugt werden, die Verbindungen enthalten, die ansonsten keine ausreichende Lagerstabilität aufweisen würden.
Vorstehend wurden verschiedene Parameter bei der Bestimmung der Größe gasgefüllter Liposomen angegeben. Die Liposomengröße ist bezüglich der Maximierung der Produkteffizienz und der Minimierung der Toxizität wichtig. Zusätzlich sollten die Liposomen so flexibel wie möglich sein, um sowohl die Effizienz zu maximieren als auch negative Einflüsse auf Gewebewechselwirkungen wie z.B. eine Ablagerung in den Lungen zu minimieren. Die vorliegende Erfindung erzeugt Liposomen mit der gewünschten Größe mit sehr dünnen elastischen Membranen. Da die Liposomenmembranen so dünn und elastisch sind, wobei z.B. nur 1 mg ml^–1 Lipid zur Stabilisierung der Membranen erforderlich ist, wurde gefunden, dass gasgefüllte Liposomen mit größerem Durchmesser verwendet werden können, ohne eine pulmonale Hypertonie zu erzeugen. Beispielsweise wurden Schweinen Dosen in einer Menge bis zum fünffachen der erforderlichen diagnostischen Bildgebungsdosis ohne ein Anzeichen einer pulmonalen Hypertonie verabreicht. Im Vergleich dazu verursachen viel kleinere Dosen Albumin-beschichteter Luftblasen mit kleinerem Durchmesser in diesen Tieren eine schwere pulmonale Hypertonie. Da die Liposomen der vorliegenden Erfindung so flexibel und verformbar sind, gleiten sie leicht durch die Lungenkapillaren. Zusätzlich vermindern die Beschichtungstechniken, die im Zusammenhang mit den vorliegenden Lipiden verwendet werden (z.B. Polyethylenglykol-aufweisende Lipide) nachteilige pulmonale Wechselwirkungen, während gleichzeitig die in vitro-Stabilität und die in vivo-Stabilität und die Effizienz des Produkts verstärkt werden.
Die gasgefüllten Liposomen zur Verwendung als allgemeine Ultraschallkontrastmedien sollten so groß wie möglich sein (ohne embolische Effekte zu verursachen), da die Rückstreuung oder der Ultraschalleffekt zum Radius in der sechsten Potenz proportional ist, wenn die Frequenzen derart sind, dass sich die gasgefüllten Liposomen im Rayleigh-Streuungsbereich befinden. Für die MRI sind auch größere Liposomen der Erfindung bevorzugt. Das Vermögen der vorliegenden Erfindung, größere Liposomen mit einem geringeren Potenzial an toxischen Effekten herzustellen und zu verwenden, erhöht deren Effizienz im Vergleich zu anderen Produkten.
Ein zusätzlicher Parameter, der den Ultraschallkontrast beeinflusst, ist die Elastizität der Liposomenmembran. Je größer die Elastizität ist, desto größer ist der Kontrasteffekt. Da die vorliegenden Liposomen mit ultradünnen Lipidmembranen beschichtet sind, ist die Elastizität der eines Gases als solchem ziemlich ähnlich und das Reflexionsvermögen und der Kontrasteffekt werden maximiert.
Das Schüttelverfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt Liposomen aus einer wässrigen Phase und einem Gas-Kopfraum innerhalb eines sterilen Behälters. Die Erfindung ist zur Herstellung von Liposomen mit stark bevorzugten Eigenschaften für Ultraschall- und Magnetresonanzbildgebungsanwendungen ausreichend. Für ausgewählte Anwendungen kann jedoch ein Filter verwendet werden, um Liposomen mit einer noch homogeneren Größenverteilung und mit den gewünschten Durchmessern zu erzeugen. Beispielsweise kann es zur Messung der in vivo-Drücke von Ultraschall unter Verwendung des harmonischen Phänomens gasgefüllter Liposomen nützlich sein, wenn sehr eng definierte Liposomendurchmesser innerhalb eines engen Größenbereichs vorliegen. Dies wird einfach dadurch erreicht, dass die Liposomen (die durch Schütteln des Behälters mit der wässrigen Phase und dem Gas-Kopfraum erzeugt werden) durch einen Filter mit einer definierten Größe injiziert werden. Die resultierenden Liposomen werden nicht größer sein, als es einer sehr guten Näherung der Größe der Filterporen in der Filtermembran entspricht. Wie es vorstehend erwähnt worden ist, ist es für viele Ultraschall- oder MRI-Anwendungen erwünscht, dass die gasgefüllten Liposomen so groß wie möglich sind. Für bestimmte Anwendungen können jedoch kleinere gasgefüllte Liposomen erwünscht sein. Bei der Zielsteuerung z.B. zu Tumoren oder anderen erkrankten Geweben kann es erforderlich sein, dass die gasgefüllten Liposomen den Gefäßraum verlassen und in das Gewebeinterstitium eindringen. Für diese Anwendungen können viel kleinere gasgefüllte Liposomen geeignet sein. Diese kleineren gasgefüllten Liposomen (z.B. mit einem Durchmesser deutlich unter einem Mikrometer) können vorwiegend durch Modifizierungen bei den Verbindungen der wässrigen Phase (Zusammensetzung und Konzentration) sowie des Kopfraums (Zusammensetzung des Gases und Volumen des Kopfraums) erzeugt werden, jedoch auch durch Injektion durch einen Filter. Sehr kleine gasgefüllte Liposomen mit einer im Wesentlichen homogenen Größe können durch Injizieren beispielsweise durch einen 0,22-Mikrometer-Filter erzeugt werden. Die resultierenden gasgefüllten Liposomen mit Nanometergröße weisen dann die gewünschten Eigenschaften für eine Zielsteuerung auf.
Die vorstehenden Beispiele für Lipidsuspensionen können auch mittels eines Autoklaven sterilisiert werden, ohne dass sich die Größe der Suspensionen wesentlich ändert. Die Sterilisation des Kontrastmittels kann mit einem Autoklaven und/oder eine Sterilfiltration erreicht werden, die entweder vor oder nach dem Schüttelschritt durchgeführt wird, oder mit einem anderen Mittel, das dem Fachmann bekannt ist.
Nach dem Füllen der Behälter mit der wässrigen Phase und dem Kopfraum mit dem vorausgewählten Gas können die geschlossenen Behälter unbegrenzt gelagert werden. Es liegen keine Teilchen, die ausfallen könnten, keine gasgefüllten Liposomen, die platzen könnten oder andere unerwünschte Wechselwirkungen zwischen gasgefüllten Liposomen, Teilchen, Kolloiden oder Emulsionen vor. Die Lagerstabilität des Behälters, der mit der wässrigen Phase und dem Gas-Kopfraum gefüllt ist, hängt nur von der Stabilität der Verbindungen innerhalb der wässrigen Phase ab. Diese Eigenschaften einer langen Lagerstabilität und einer Sterilisierbarkeit stellen wesentliche Vorteile der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf den Stand der Technik dar. Das Problem der Stabilität, wie z.B. bezüglich der Aggregation und des Ausfällens von Teilchen, das auf dem Gebiet der Ultraschallkontrastmittel häufig vorkam, wurde hier gelöst.
Es wurde gefunden, dass die gasgefüllten Liposomen, die durch Schütteln des erfindungsgemäßen Mehrphasenbehälters erzeugt werden, einen hervorragenden Nutzen als Kontrastmittel für die diagnostische Bildgebung aufweisen, wie z.B. für die Ultraschall- oder Magnetresonanzbildgebung. Die Liposomen sind zur Bildgebung eines Patienten im Allgemeinen und/oder zur spezifischen Diagnose der Gegenwart von erkranktem Gewebe in einem Patienten geeignet. Das Bildgebungsverfahren kann durch Verabreichen erfindungsgemäßer gasgefüllter Liposomen an einen Patienten und dann Abtasten des Patienten unter Verwendung von Ultraschall- oder Magnetresonanzbildgebung durchgeführt werden, um sichtbare Bilder einer inneren Region eines Patienten und/oder eines erkrankten Gewebes in dieser Region zu erhalten. Mit einer Region eines Patienten ist der gesamte Patient oder eine bestimmte Fläche oder ein bestimmter Abschnitt des Patienten gemeint. Das Liposomenkontrastmittel kann zur Bereitstellung von Bildern des Gefäßsystems, des Herzens, der Leber und der Milz und bei der Bildgebung der Gastrointestinalregion oder anderer Körperhohlräume oder in einer anderen Weise verwendet werden, wie es dem Fachmann bekannt ist, wie z.B. zur Gewebecharakterisierung, zur Bildgebung des Blutpools, usw. Bei der Durchführung der Erfindung können beliebige Arten von Ultraschall- oder Magnetresonanzbildgebungsvorrichtungen verwendet werden, wobei der spezielle Typ oder das spezielle Modell der Vorrichtung für das Verfahren der Erfindung nicht kritisch ist.
Die gasgefüllten Liposomen der Erfindung können auch zur Abgabe vieler verschiedener Therapeutika an einen Patienten zur Behandlung verschiedener Erkrankungen, Gebrechen oder Beschwerden verwendet werden, was dem Fachmann bekannt ist.
Zur Abschätzung des Drucks bei der MRI können auch magnetisch aktive Liposomen verwendet werden. Die Liposomen erhöhen die Volumensuszeptibilität und demgemäß die T₂-Relaxation und in noch höherem Maß die T₂*-Relaxation. Da die Effekte statischer Feldgradienten in Spinechoexperimenten weitgehend kompensiert werden (mittels des 180°-Hochfrequenz-Refokussierungspulses), ist der Effekt der Liposomen bei T₂-gewichteten Pulssequenzen weniger ausgeprägt als bei T₂*-gewichteten Pulssequenzen, bei denen statische Feldeffekte nicht kompensiert werden. Ein zunehmender Druck führt zu einem Verlust an Liposomen oder zu einem Platzen der Liposomen (bei löslicheren Gasen), sowie zu einer Abnahme des Liposomendurchmessers. Demgemäß nimmt 1/T₂ mit zunehmendem Druck ab. Nach dem Aufheben des Drucks dehnen sich einige der verbleibenden Liposomen wieder aus und 1/T₂ nimmt wieder geringfügig zu. Liposomen, die aus etwa 80 % PFP mit 20 Luft zusammengesetzt sind, zeigen eine erhöhte Stabilität und unter Druck einen geringen Abfall von 1/T₂, der nach dem Aufheben des Drucks wieder zu dem Grundwert zurückkehrt (d.h. die Liposomen sind stabil, zeigen jedoch einen geringfügigen 1/T₂-Druckeffekt). Wenn Gradientenechobilder erhalten werden und die Signalintensität gemessen wird, sind diese Effekte viel ausgeprägter. Die Signalintensität nimmt mit zunehmendem Druck zu (1/T*₂ nimmt mit zunehmendem Druck ab). Da das Experiment relativ schnell durchgeführt wird (die Durchführung der Gradientenechobilder erfordert weniger als 1/10 der Zeit, die zur Messung von T₂ erforderlich ist), ist die Dauer des Aussetzens gegenüber einem Druck viel kürzer und die Stickstoff-gefüllten Liposomen kehren nach der Aufhebung des Drucks nahezu zu dem Grundwert zurück (d.h. es gibt nur sehr geringe Liposomenverluste). Demgemäß kehrt die Signalintensität beim Gradientenecho nach der Rückkehr zum Umgebungsdruck nahezu auf den Grundwert zurück. Zur Messung des Drucks mittels MRI können die Liposomen so gestaltet werden, dass sie entweder mit steigendem Druck zerfallen oder stabil sind, wobei jedoch der Liposomendurchmesser mit zunehmendem Druck vermindert wird. Da der Liposo menradius bei der MRI 1/T*₂ beeinflusst, kann diese Beziehung zur Abschätzung des Drucks durch die MRI verwendet werden.
Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Verarbreichung der gasgefüllten Liposomen an den Patienten auf verschiedene Arten durchgeführt werden kann, wie z.B. intravenös oder intraarteriell durch Injektion, oral oder rektal. Die geeignete, zu verabreichende Dosis wird abhängig vom Alter, dem Gewicht und dem jeweiligen Säuger und der jeweiligen Region, die abgetastet oder behandelt werden soll, und dem jeweiligen einzusetzenden Kontrastmedium oder Therapeutikum variieren. Typischerweise wird die Dosierung bei einem niedrigeren Niveau begonnen und erhöht, bis die gewünschte Kontrastverstärkung oder der gewünschte therapeutische Effekt erreicht wird. Der Patient kann ein beliebiger Säuger sein, ist jedoch vorzugsweise ein Mensch.
Die folgenden praktischen Beispiele sollen die Anwendung der vorliegenden Erfindung und einige Bereiche des außerordentlichen Nutzens der Erfindung veranschaulichen.
Beispiele
Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)
Bildung Stickstoffgas-gefüllter Liposomen
Gasgefüllte Lipiddoppelschichten wurden in zwei 20 ml-Behältern mit 6 ml eines Verdünnungsmittels hergestellt, das normale (physiologische) Kochsalzlösung:Propylenglykol:Glycerin (8:1:1, V:V:V) enthielt. Dieser Lösung wurde in einer Endkonzentration von 5 mg ml^–1 ein Gemisch aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC):Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA):Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-PEG5000 (DPPE-PEG5000) in einem Molverhältnis von 82:10:8 (mol-%) zugesetzt. Die Proben wurden dann mit luftdichten und den Druck aufrechterhaltenden Septumkappen verschlossen. Sie wurden dann mindestens dreimal mit Stickstoffgas (99,98 %, Arizona Welding Co., Tucson, AZ) gespült und evakuiert. Die Proben wurden dann entweder 15 min bei 121 °C in einem Dampfsterilisator Modell C57835 von Barnstead (Barnstead/Thermolyne Corporation, Dubuque, Iowa) autoklaviert oder ein-bis dreimal durch einen Nuclepore 0,22 μm-Filter (Costar, Pleasanton, CA) sterilfiltriert. Die Proben wurden dann aus dem Autoklaven entnommen und etwa auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Proben wurden auf einem Wig-L-Bug-Vortexiergerät (Crescent Dental Mfg. Co., Lyons, IL) 2 min vortexiert. Die resultierenden Gemische waren dahingehend signifikant, dass gasgefüllte Doppelschichten gebildet worden sind, die einem Schaum ähnelten. Die gasgefüllten Lipiddoppelschichten wurden dann mit drei Verfahren mit einem Lichtverdunklungsdetektor, Modell 770, von Particle Sizing Systems (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA), einem optischen Mikroskop, Reichert-Jung Modell 150, das mit einem Kalibrierokular ausgestattet war (Cambridge Instruments, Buffalo, NY) und einem Coulter-Modell (Coulter Industries, Luton Beds, England) klassiert. Die Proben zeigten ein Zahlenmittel der Größe von etwa 5 bis 7 μm, wobei mindestens 95 % der Teilchen kleiner als 10 μm waren.
Beispiel 2
Bildung Perfluorpentangas-gefüllter Liposomen
Gasgefüllte Lipiddoppelschichten wurden in zwei 20 ml-Behältern mit 6 ml eines Verdünnungsmittels hergestellt, das normale (physiologische) Kochsalzlösung:Propylenglykol:Glycerin (8:1:1, V:V:V) enthielt. Dieser Lösung wurde in Endkonzentrationen, die zwischen 1 mg ml^–1 und 5 mg ml^–1 variierten, ein Gemisch aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC):Phosphatidsäure:Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-PEG5000 in einem Gewichtsverhältnis von 82:10:8 zugesetzt. Diesem Gemisch wurden 50 μl (30,1 μmol) Perfluorpentan (PCR, Gainesville, FL) zugesetzt. Die Proben wurden auf –20°C gebracht und mit luftdichten und den Druck aufrechterhaltenden Septumkappen verschlossen. Die Proben wurden dann 15 min bei 121 °C in einem Dampfsterilisator Modell C57835 von Barnstead (Barnstead/Thermolyne Corporation, Dubuque, Iowa) autoklaviert. Die Proben wurden dann aus dem Autoklaven entnommen und auf etwa 40°C abkühlen gelassen. Die Proben wurden dann auf einem Wig-L-Bug-Vortexiergerät (Crescent Dental Mfg. Co., Lyons, IL) 2 min vortexiert. Die resultierenden Gemische waren dahingehend signifikant, dass gasgefüllte Doppelschichten gebildet worden sind, die einem Schaum ähnelten. Das Volumen und die Höhe des Schaums wurden aufgezeichnet und eine Probe wurde in ein Gefriergerät (Marke Kenmore, Sears-Roebuck, Chicago, IL) bei –20°C eingebracht. Die Probe wurde dann nach 3 Stunden entnommen, wobei zu diesem Zeitpunkt festgestellt wurde, dass etwa 90 % des ursprünglichen Volumens verblieben waren. Die Probe wurde über Nacht in dem Gefriergerät belassen (etwa 17 Stunden) und entfernt, wobei festgestellt wurde, dass 50 % des ursprünglichen Volumens verblieben waren. Der verbleibende Behälter, der als Kontrolle verwendet wurde, wurde für den gleichen Zeitraum in einem 30°C-Inkubator belassen. Es wurde gefunden, dass kein Volumenverlust stattfand, was zeigt, dass das Kühlen das Gas innerhalb der gasgefüllten Doppelschichten kondensiert hatte, wodurch das Gasvolumen vermindert wurde. Schließlich wurde die kalte Probe dann in den 30°C-Inkubator eingebracht, wobei gefunden wurde, dass nach etwa 45 min 20 % des ursprünglichen Schaumvolumens wiederhergestellt worden sind. Dies zeigt, dass sich das kondensierte Gas wieder verflüchtigt und die gasgefüllten Liposomen vergrößert hat.
Beispiel 3
Bildung Perfluorpropangas-gefüllter Liposomen
Es wurde das gleiche Verfahren wie im Beispiel 1 eingesetzt, jedoch war das verwendete Gas Perfluorpropan (99,99 %, Alcon Surgical, Fort Worth, TX) und der eingesetzte Behälter war ein brauner 2 ml-Behälter (tatsächliches Volumen = 3,7 ml) (Wheaton, Millville, NJ). Die Behälter wurden mit 1,5 ml des Lipid/Verdünnungsvehikel-Gemischs gefüllt. Die Klassierung wurde mit dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurde eine Größe von 4 bis 6 μm erzeugt, wobei mehr als 95 % der Teilchen kleiner als 10 μm waren.
Beispiel 4
Bildung Perfluorbutangas-gefüllter Liposomen
Es wurde das gleiche Verfahren wie im Beispiel 1 eingesetzt, jedoch war das verwendete Gas Perfluorbutan (97+ %, Flura Corporation, Nashville, TN) und der eingesetzte Behälter war ein brauner 2 ml-Behälter (tatsächliches Volumen = 3,7 ml) (Wheaton, Millville, NJ). Die Behälter wurden mit 1,5 ml des Lipid/Verdünnungsvehikel-Gemischs gefüllt. Die Klassierung wurde mit dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurde eine Größe von 4 bis 6 μm erzeugt, wobei mehr als 95 % der Teilchen kleiner als 10 μm waren.
Beispiel 5
Bildung Perfluorcyclobutangas-gefüllter Liposomen
Es wurde das gleiche Verfahren wie im Beispiel 1 eingesetzt, jedoch war das verwendete Gas Perfluorcyclobutan (99,8 %, Pfaltz & Bauer, Waterbury, Conneticut) und der eingesetzte Behälter war ein brauner 2 ml-Behälter (tatsächliches Volumen = 3,7 ml) (Wheaton, Millville, NJ). Die Behälter wurden mit 1,5 ml des Lipid/Verdünnungsvehikel-Gemischs gefüllt. Die Klassierung wurde mit dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurde eine Größe von 4 bis 6 μm erzeugt, wobei mehr als 95 % der Teilchen kleiner als 10 μm waren.
Beispiel 6
Bildung Schwefelhexafluoridgas-gefüllter Liposomen
Es wurde das gleiche Verfahren wie im Beispiel 1 eingesetzt, jedoch war das verwendete Gas Schwefelhexafluorid (99,99 %, Alcon Surgical, Fort Worth, TX) und der eingesetzte Behälter war ein brauner 2 ml-Behälter (tatsächliches Volumen = 3,7 ml) (Wheaton, Millville, NJ). Die Behälter wurden mit 1,5 ml des Lipid/Verdünnungsvehikel-Gemischs gefüllt. Die Klassierung wurde mit dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurde eine Größe von 4 bis 6 μm erzeugt, wobei mehr als 95 % der Teilchen kleiner als 10 μm waren.
Beispiel 7
Stabilität Perfluorbutangas-gefüllter Liposomen unter Druck unter Verwendung eines Tests der akustischen Dämpfung in vitro Perfluorbutangas-gefüllte Lipiddoppelschichten wurden gemäß Beispiel 4 formuliert. Proben, die variierende Lipidkonzentrationen zwischen 1 mg ml^–1 und 5 mg ml^–1 aufwiesen, wurden in 200 μl-Aliquots bereitgestellt und in normaler Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel 10000:1 verdünnt. Die Proben wurden zunächst mit einem Magnetrührer gemischt, um eine Homogenität zu induzieren und dann wurde der Magnetrührer abgestellt. Eine Edelstahlplatte, die sich etwa 25 cm vom Ursprung des Wandlers entfernt befand, wurde als perfekter Reflektor verwendet. Der verwendete Wandler war ein nicht-fokussierter 5,0 MHz Breitbandimmersionswandler (Panametrics, Waltham, MA). Alle Daten wurden mittels eines 488,2 GPIB-Board (National Instruments, Austin, TX) übertragen und auf einem Gateway 2000-80486-Prozessor verarbeitet.
Vor der Probenahme der gasgefüllten Lipiddoppelschichten wurde eine Grundwertkontrolle nur in normaler Kochsalzlösung durchgeführt. Unmittelbar nach der Ermittlung der Bedingungen der Kontrolle wurde das 200 μl-Aliquot der Kochsalzlösung zugesetzt und die Daten wurden für 90 s bei Raumtemperatur (20°C) gesammelt. Die Dämpfung (siehe 4) des Schalls war bei einer Dämpfung von 2,0 ± 0,5 dB cm^–1 über die 90 s konstant. Es wurde eine zweite Probe bereitgestellt, bei welcher der Druck der Probe dann auf 120 mm Hg erhöht und die Dämpfung aufgezeichnet wurde. Wie bei dem Experiment bei Raumtemperatur blieb die Dämpfung mit nur geringen Schwankungen über den 90 s-Testzeitraum konstant, wobei jedoch die Dämpfung etwa 0,9 dB cm^–1 betrug. Dann wurde eine weitere Probe unter der Bedingung einer konstanten Temperatur von 37°C gemessen. Erneut war die Dämpfung über den 90 s-Zeitraum konstant und die Dämpfung erreichte etwa 0,9 dB cm^–1. Eine letzte Probe wurde bei 37°C und einem Druck von 120 mm Hg gemessen. Dabei nahm die Dämpfung während 90 s von 0,9 dB cm^–1 linear mit der Zeit auf 0,4 dB cm^–1 ab. Dies zeigte die erhöhte Stabilität dieser Formulierung bezüglich der Stickstoff-gefüllten Lipiddoppelschichten.
Beispiel 8 (Vergleichsbeispiel)
Stabilität Stickstoffgas-gefüllter Liposomen unter Druck unter Verwendung eines Tests der akustischen Dämpfung in vitro
Es wurden die gleichen Experimente wie im Beispiel 7 durchgeführt, jedoch waren die gasgefüllten Lipiddoppelschichten aus Stickstoffgas zusammengesetzt, wie es im Beispiel 1 beschrieben worden ist. Die Dämpfung war für eine stabile Dämpfung sowohl bei Raumtemperatur (20°C) als auch bei der Temperatur des menschlichen Körpers (37°C) signifikant. Bei einem Aussetzen der Inhalte der Verdünnung gegenüber einem Druck von 120 mm Hg fiel die Dämpfung jedoch steil auf einen Wert nahe den Grundkontrollwerten ab. Dies zeigt im Vergleich zu Perfluorbutan-gefüllten Lipiddoppelschichten einen Mangel an Stabilität bei Stickstoff-gefüllten Lipiddoppelschichten unter Druck.
Beispiel 9
Effekt der Lipidkonzentration auf das Zahlenmittel der Größe Perfluorcyclobutangas-gefüllter Liposomen
Perfluorcyclobutangas-gefüllte Lipiddoppelschichten wurden gemäß Beispiel 5 hergestellt, jedoch wurden 3 verschiedene Konzentrationen der Lipidformulierung verwendet. Die Formulierung umfasste ein Verdünnungsmittel, das normale (physiologische) Kochsalzlösung:Propylenglykol:Glycerin (8:1:1, V:V:V) enthielt. Dieser Lösung wurde in Endkonzentrationen, die zwischen 1 mg ml^–1 und 5 mg ml^–1 variierten, ein Gemisch aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC):Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA):Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-PEG5000 (DPPE-PEG-5000) in einem Molverhältnis von 82:10:8 (mol-%) zugesetzt. Die Proben wurden in 2 ml-Behältern (tatsächliches Volumen = 3,7 ml) (Wheaton Industries, Millville, NJ) hergestellt und auf einem Lichtverdunklungsklassierungssystem, Modell 770, von Particle Sizing Systems klassiert. Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse.
Die Tabelle 9 zeigt den Effekt der Lipidkonzentration auf die durchschnittliche Größe von Perfluorkohlenstoffgas-gefüllten Lipiddoppelschichten unter Verwendung von Perfluorcyclobutan als Beispiel.
Tabelle 9 Effekt der Lipidkonzentration auf Perfluorcyclobutangas-gefüllte Liposomen
Beispiel 10
Demonstration eines Fehlens hämodynamischer Veränderungen unter Verwendung von Liposomen, die mit einem im Wesentlichen unlöslichen Gas gefüllt sind
Proben gasgefüllter Lipiddoppelschichten, welche die in den Beispielen 3, 4, 5 und 6 beschriebenen Lipidgemische enthielten, wurden mit Lipidgesamtkonzentrationen von 1 mg ml^–1 und 3 mg ml^–1 Lipid unter Verwendung von Perfluorpropan (PFP), Perfluorcyclobutan (PFCB), Perfluorbutan (PFB) und Schwefelhexafluorid (SHF) hergestellt. Die Bildgebung wurde in einem Mischlingshund, der etwa 28 kg wog, unter Verwendung eines Ultraschallgeräts Modell 5200S von Acoustic Imaging durchgeführt, das mit einem 5 MHz-Wandler ausgestattet war. Das Tier wurde mit Natriumpentobarbital sediert, mit Raumluft beatmet und bezüglich des Lungenarteriendrucks, des systemischen arteriellen Drucks und der Pulsfrequenz überwacht. Die Bildgebung des Herzens wurde in der Position der kurzen Achse durchgeführt und das Tier erhielt Bolusdosierungen von 5 μl pro kg PFP, PFCB, PFB und SHF, wobei sowohl die 1 mg ml^–1- als auch die 3 mg ml^–1-Lipidkonzentration getestet wurde. Zwischen jeder Injektion wurden mindestens 15 min verstreichen gelassen, um eine Clearance jeglichen Restkontrasts zu ermöglichen. Alle Perfluorkohlenstoff-gefüllten Liposomen (PFP, PFCB und PFB) zeigten eine myokardiale Perfusionsverstärkung bei 1 mg ml^–1 Lipid, jedoch war PFB intensiver als die anderen. PFB zeigte bei 3 mg ml^–1 eine Verbesserung. Die SHF-gefüllten Liposomen zeigten keine nachweisbare myokardiale Perfusionsverstärkung bei 1 mg ml^–1 Lipid, jedoch eine ausgeprägte myokardiale Verstärkung bei 3 mg pro ml Lipid.
Die vorstehende Vorgehensweise wurde im Wesentlichen in einem anderen Hund wiederholt, wobei die gleichen Ergebnisse erhalten wurden.
In einem anderen Hund wurden unter Verwendung Perfluorpropan-gefüllter Liposomen hämodynamische Studien durchgeführt. Das Tier erhielt mehrere Dosen über einen schnellen Bolus von bis zu 300 μl pro kg, d.h. eine fünfzigmal höhere Dosis als die Bildgebungsdosis.
Das Tier zeigte trotz mehrerer Dosen absolut keine Änderungen der hämodynamischen Parameter, was die hohe hämodynamische Sicherheit des Mittels zeigt.
Beispiel 11
Bestimmung des therapeutischen Verhältnisses (Fensters) auf der Basis von Toxizitätstests in Balb/C-Mäusen Die Toxizitätstests wurden in Balb/C-Mäusen durchgeführt, die zwischen etwa 20 und 25 g wogen. Die LD₅₀-Werte von 1 mg ml^–1-Lipidkonzentrationen von Liposomen, die Proben von Perfluorpropan (PFP), Perfluorcyclobutan (PFCB), Perfluorbutan (PFB) und Schwefelhexafluorid (SHF) umfassten, wurden mittels eines schnellen Bolus getestet. Die LD₅₀-Werte der PFCB-, PFB- und PFP-Proben waren jeweils größer als 12 ml kg^–1 und bei den SHF-Gasgefüllten Lipiddoppelschichten größer als 30 mg kg^–1, was therapeutische Indizes von mehr als 2400:1 bzw. 6000:1 für diese Produkte anzeigt, die bei der Ultraschalldiagnose nützlich sind.
Beispiel 12
Verwendung Perfluorpentangas-gefüllter Liposomen als Ultraschallkontrastmittel
Weiße Neuseelandhasen wurden mit einer intramuskulären Injektion von 1 cm³ kg^–1 Rabbit Mix (8:5:2, V:V:V, Xylazin, 20 mg ml^–1:Ketamin, 10 mg ml^–1:Acepromazin, 100 mg ml^–1) anästhetisiert. Die Hasen wurden mit einem diagnostischen Ultraschallgerät Modell 5200 von Acoustic Imaging und einem diagnostischen Farbdopplergerät Modell 5200S von Acoustic Imaging (Acoustic Imaging, Phoenix, AZ) einer Bildgebung unterworfen. Bei den Hasen wurde eine Injektion über einen 23 G-Schmetterlingskatheter durch die Ohrrandvene durchgeführt. Den Hasen wurden während eines Zeitraums von 5 bis 10 s Dosen der Perfluorpentangefüllten Lipiddoppelschichten im Bereich von 0,01 cm³ kg^–1 bis 0,1 cm³ kg^–1 verabreicht. Ansichten der Längsachse unter Verwendung eines 7,5 MHz-Wandlers zeigten eine hervorragende Bildgebung aller vier Herzkammern und des Myokards für einen Zeitraum von 20 min bis über eine Stunde. Der Wandler wurde dann über den Leberbereich geführt, wo sich ein hervorragender Kontrast in der Lebervene, der Leberpfortenvene und den Leberhöhlen zeigte. Der Wandler wurde dann über der Niere platziert, wobei ein Kontrast in den Mark- und Rindenregionen sowie eine Visualisierung der Nierenarterie vorlag. Der diagnostische Ultraschallwandler wurde dann durch ein Farbdopplergerät ersetzt und es wurde ein anhaltender und hervorragender Kontrast in allen Gefäße aufweisenden Geweben des Tierkörpers festgestellt.
Beispiel 13
Effekt unterschiedlicher Konzentrationen an Perfluorpropan und Luft auf die Anzahl und Größe gasgefüllter Liposomen
Mehrere Proben von Lipidlösungen (1 mg pro ml; 82:10:8-mol-%-Verhältnisse von DPPC:DPPA:DPPE-PEG5000) in einem 8:1:1-Gewichtsverhältnis von normaler Kochsalzlösung:Glycerin:Propylenglykol in 2 ml-Behältern (tatsächliche Größe: 3,7 ml) von Wheaton Industries (Millville, NJ) wurden auf einem modifizierten Lyophilisiergerät, Modell SO₄, von Edwards mit einer Kapazität von vier Kubikfuß platziert und einem verminderten Druck ausgesetzt. In den Kopfraum der Behälter wurden dann 80 % PFP mit 20 % Luft, 60 % PFP mit 40 % Luft, 50 % PFP mit 50 % Luft, 20 % PFP mit 80 % Luft oder 100 % Luft eingebracht. Die prozentualen Gasanteile in den Kopfräumen der verschiedenen Proben wurden mittels Gaschromatographie auf einem Gaschromatographen Modell 1050L von Hewlett-Packard bestätigt, der mit der Hewlett-Packard Chem^TM-Software verbunden war. Der Detektionsmodus war eine Flammenionisationsdetektion. Die Proben wurden dann 60 s bei 3300 U/min unter Verwendung des Wig-L-Bug^TM geschüttelt und die Größen und die Anzahl der Liposomen wurden mit einer optischen Größenklassierung bestimmt, wie es vorstehend beschrieben worden ist. Die Ergebnisse sind in der vorstehenden Tabelle 2 gezeigt.

Claims

Geschlossener Behälter mit einer darin enthaltenen sterilen Zusammensetzung, wobei die sterile Zusammensetzung eine wäßrige Lipidsuspensionsphase und einen im wesentlichen getrennten Kopfraum, welcher ein im wesentlichen unlösliches Gas kombiniert mit einem löslichen Gas enthält, umfaßt, wobei die wäßrige Lipidsuspensionsphase Phospholipide umfaßt und die sterile Zusammensetzung, nach Schütteln vor Verwendung, gas-gefüllte Liposomen zur Verwendung als ein Kontrastmittel erzeugt.
Geschlossener Behälter nach Anspruch 1, wobei das im wesentlichen unlösliche Gas aus der Gruppe, bestehend aus Schwefelhexafluorid, Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorcyclobutan, Perfluormethan, Perfluorethan und Perfluorpentan, ausgewählt ist.
Geschlossener Behälter nach Anspruch 2, wobei das im wesentlichen unlösliche Gas aus der Gruppe, bestehend aus Perfluorpropan und Perfluorbutan, ausgewählt ist.
Geschlossener Behälter nach Anspruch 3, wobei das im wesentlichen unlösliche Gas Perfluorpropan ist.
Geschlossener Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das lösliche Gas aus der Gruppe, bestehend aus Luft, Sauerstoff, Kohlendioxid und Stickstoff, ausgewählt ist.
Geschlossener Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Phospholipid aus der Gruppe, bestehend aus Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidsäure und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, ausgewählt ist.
Geschlossener Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wäßrige Lipidsuspension weiter einen Zielliganden umfaßt.
Geschlossener Behälter nach Anspruch 7, wobei der Zielligand Polyethylenglykol ist.
Geschlossener Behälter nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Lipidsuspensionsphase Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidsäure oder Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-PEG5000 umfaßt.
Geschlossener Behälter nach Anspruch 9, wobei die wäßrige Lipidsuspensionsphase Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidsäure oder Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-PEG5000 in einem Molprozentverhältnis von etwa 82%:10%:8% umfaßt.
Geschlossener Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wäßrige Lipidsuspensionsphase weiter ein Suspensionsmittel umfaßt.
Geschlossener Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wäßrige Lipidsuspensionsphase weiter ein Viskositätsmodifikationsmittel umfaßt.
Geschlossener Behälter nach Anspruch 12, wobei das Viskositätsmodifikationsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Glycerin, Propylenglykol und Polyvinylalkohol, ausgewählt ist.
Geschlossener Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wäßrige Lipidsuspensionsphase weiter ein therapeutisches oder diagno stisches Mittel umfaßt.
Geschlossener Behälter nach Anspruch 14, wobei das diagnostische Mittel ein MRI-kontrastverstärkendes Mittel ist.
Geschlossener Behälter nach Anspruch 15, wobei das MRI-kontrastverstärkende Mittel ein paramagnetisches Ion ist.
Geschlossener Behälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wäßrige Lipidsuspensionsphase weiter ein Polymer umfaßt.