DE69533135T2

DE69533135T2 - In baculovirus exprimiertes aktives calpain

Info

Publication number: DE69533135T2
Application number: DE69533135T
Authority: DE
Inventors: Sheryl L. Meyer; Richard W. Scott; Robert Siman
Original assignee: Cephalon LLC
Current assignee: Cephalon LLC
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2015-07-07
Also published as: US6057143A; ATE268816T1; ES2222465T3; DK0773991T3; AU3003395A; DE69533135D1; JPH10503645A; EP0773991B1; PT773991E; EP0773991A1; CA2194763A1; JP4429385B2; WO1996002634A1; US5869336A; EP0773991A4

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinantes enzymatisch aktives humanes Calpain und ein Verfahren zu seiner Herstellung in einem Baculovirus-Insektenzellensystem unter Verwendung rekombinanter Technologie.
Hintergrund der Erfindung
A. Calpain
Calpain ist eine Calcium-aktivierte neutrale Protease, die ebenfalls als CANP, EC 3.4.22.17, bekannt ist. Es ist eine intrazelluläre Cysteinprotease, die überall in Säugergeweben exprimiert wird (Aoki et al., FEBS Letters 205:313-317, 1986). Calpain ist in vielen degenerativen Krankheiten, umfassend, aber nicht beschränkt auf Neurodegeneration (Alzheimer-Krankheit), Huntington-Krankheit und Parkinsonsche Krankheit), Muskelschwund, Schlag, Schädigung motorischer Neuronen, akute Verletzung des Zentralnervensystems (ZNS), Muskeldystrophie, Knochenresorption, Plättchenaggregation und Entzündung verwickelt.
Säuger-Calpain, einschließlich humanes Calpain ist multimer. Es besteht aus zwei verschiedenen Untereinheiten, die eine 30 kDa Untereinheit und eine 80 kDa Untereinheit sind, und daher ist es ein Heterodimer. Es gibt zwei Formen von Calpain, Calpain 1 (μ-Calpain, μCANP) und Calpain II (m-Calpain, mCANP), die sich in ihren Empfindlichkeiten bezüglich der zur Aktivierung notwendigen Calciumkonzentration unterscheiden. Calpain I erfordert zur Aktivierung nur geringe mikromolare Calciumkonzentrationen, wohingegen Calpain II hohe mikromolare oder millimolare Gehalte erfordert (Aoki et al. s.o. und DeLuca et al., Biochim. Biophys. Acta 1216:81-83, 1993). Beiden Formen ist dieselbe 30 kDa Untereinheit gemeinsam. Die zwei humanen Calpaine unterscheiden sich in den Sequenzen der DNA, die ihre 80 kDa Untereinheit kodiert, wobei sie eine gemeinsame Homologie von 62 % aufweisen. Es gibt Anzeichen dafür, dass die 80 kDa Untereinheit inaktiv ist, dass sie aber zu einer 76 kDa aktiven Form in Gegenwart von Calcium autolysiert wird (Zimmerman et al., Biochem. Biophys. Acta, 1078:192-198, 1991).
R. Siman in Neurotoxicity of Excitatory Amino Acids, A. Guidotti, Herausg., Raven Press, Ltd., New York (1990) berichtete über die Rolle von Calpain I in durch angeregte Aminosäure (EAA) induzierte Neurotoxizität, die schließlich zum neuronalen Zelltod führt. Siman förderte den Vorschlag, dass die Calpain I-Aktivierung in dem neurodegenerativen Prozess ein frühes Ereignis ist und nicht lediglich eine Sekundärreaktion auf den neuronalen Tod ist. Siman berichtete weiterhin, dass nur ein hoch selektiver Calpain-Blocker zu dieser Zeit verfügbar war – Calpastatin. Calpastatin wird jedoch nicht ohne weiteres von den Zellen aufgenommen, da es ein großes globuläres Protein mit näherungsweise 280 kDa ist. Siman berichtete ebenfalls, dass Proteaseinhibitoren von breiterer Spezifität, einschließlich Leupeptin, zum Verringern des EAA-induzierten Proteinversagens in vivo nicht erfolgreich waren. Leupeptin war unwirksam, weil es vermutlich daran scheiterte, in die Zellen einzudringen.
Iwamoto et al., Brain Research, 561:177-180 (1991), beschrieb, dass die Aktivierung von Calpain ein wichtiger Faktor in der abnormalen Proteolyse sein kann, die der Ansammlung von Plaque und Verwirrungen in Gehirngewebe von Menschen, die an Demenz vom Alzheimertyp litten, zugrunde liegt.
Saito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2628-2632 (1993) berichtete, dass synaptischer Verlust und neuronaler Zelltod stark mit dem Grad der cognitiven Beeinträchtigung bei der Alzheimer-Krankheit korreliert ist. Sie berichteten ebenfalls, dass Calpain I in menschlichem postmortalen Gehirn von Patienten mit Alzheimer-Krankheit signifikant aktiviert war, und dass der Grad der Aktivierung mit denjenigen Gehirnregionen korreliert ist, die das größte Degenerationsniveau zeigten. Es wurde vorgeschlagen, dass die Einflüsse der Calpain-Aktivierung zu der neurofibrillären Pathologie und der abnormalen amyloiden Vorläuferproteinverarbeitung beitragen, bevor in den anfälligsten neuronalen Populationen ein Synapsenverlust oder Zelltod verursacht wird. Aufgrund der Verbindung zwischen Calpain und Nervendegenerationskrankheiten verdient die pharmakologische Modulierung der Calpaine durch Inhibitoren, dass man sie als mögliche therapeutische Strategie für derartige Krankheiten, zum Beispiel für die Alzheimer-Krankheit, in Erwägung zieht.
Rami et al., Brain Research, 609:67-70 (1993) berichtete, dass sowohl der Calpain-Inhibitor I als auch Leupeptin Neuronen gegen ischärnische und hypoxische Schädi gung schützten, die aus der Ischämie resultierten, die durch Festklemmen beider Halsschlagadern als auch durch das Erniedrigen des arteriellen Blutdrucks von Ratten induziert wird.
Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7233-7237 (1991) lieferten einen Beweis, dass die Calcium-aktivierte Proteolyse im Prozeß des post-ischämischen Zelltods ein bedeutendes Ereignis ist, und sie berichteten, dass die Hemmung der Calciumaktivierten Proteolyse mittels des proteolytischen Inhibitors Leupeptin gegen die Degeneration anfälliger Hippocampusneuronen nach einer Ischämie schützte. Es wurde Leupeptin ausgewählt, weil es der einzige Proteaseinhibitor ist, von dem vorher gezeigt wurde, dass er eine durch ein Trauma hervorgerufene Calpain-Reaktion in vivo blockiert (Seubert et al., Brain Res., 459:226-232, 1988). Die Autoren bemerkten jedoch, dass der therapeutische Nutzen des Modulierens der Calcium-aktivierten Proteolyse wahrscheinlich von der Entwicklung durchlässiger, wirksamer und spezifischer Proteaseinhibitoren abhängen wird.
Wie aus dem Vorstehenden offensichtlich ist, können spezifische Calpaininhibitoren ein Mittel zur Behandlung jener neurodegenerativen Krankheiten, in die Calpain verwickelt ist, zur Verfügung stellen. Calpastatin bietet aufgrund seiner Zellenundurchlässigkeit einen eingeschränkten Nutzen. Proteaseinhibitoren mit breiteren Spezifitäten könnten in vivo nicht wirken und/oder könnten unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen. Daher müssen andere Calpaininhibitoren identifiziert werden und eine fertige, praktische sichere Calpainquelle wird die Suche nach derartigen Inhibitoren fördern.
B. Calpain-cDNA
Rekombinantes enzymatisch aktives humanes Calpain zum Testen für Inhibitoren bietet die Vorteile, dass 1) es eine beträchtlich praktischere, leicht verfügbare Quelle großer Enyzmmengen ist, 2) es einfacher zu reinigen ist und 3) frei von den Sicherheitsauflagen ist, nach denen man sich richten muss, wenn die Quelle menschliche Gewebe, besonders menschliche Blutzellen, das heißt möglicherweise gefährliche Viren sind. Natives humanes Calpain wird derzeit von menschlichen Erythrozyten isoliert und kann zu dem gereinigt werden, was die Autoren als augenscheinliche Homogenität charakterisieren (Hatanaka et al., Biomed. Res., 4:381-388, 1983). Abgesehen von den offensichtlichen Problemen mit einer Quelle kann das Reinigungsverfahren aufgrund der niedrigen Gehalte von Calpain im Bezug auf die Menge an Ausgangsmaterial jedoch ziemlich langwierig sein. Weiterhin wird natives Calpain in Gegenwart eines endogenen Inhibitors (Calpastatin), der während der Reinigung abgetrennt werden muss, isoliert. Eine gute Quelle für große Mengen an enzymatisch aktivem Calpain würde die Suche nach Calpaininhibitoren stark verbessern, indem 1) die Verfügbarkeit von Calpain zur Verwendung in reproduzierbaren Assays für Calpaininhibitoren erhöht wird und 2) die Kristallisation des Enzyms erleichtert wird, wodurch der Entwurf vernünftiger Inhibitoren gestattet wird. Ein rekombinantes System zur Herstellung erleichtert weiterhin die Herstellung gerichteter Mutanten zur Unterstützung in strukturellen Untersuchungen. Daher wird ein rekombinantes System zur Herstellung von aktivem Calpain benötigt.
Das Problem bei der Herstellung von enzymatisch aktivem Calpain durch rekombinante Mittels besteht im Exprimieren von zwei verschiedenen Genprodukten (die 80 kDa Untereinheit und die 30 kDa Untereinheit), imErreichen einer geeigneten Verarbeitung und im Falten der einzelnen Produkte und im Erhalten der richtigen Kombination der zwei Produkte zur Herstellung der enzymatisch aktiven Moleküle. Wie in der vorstehenden Diskussion angegeben wurde, ist aktiviertes Calpain im Abtöten neuronaler Zellen verwickelt. Leider würde dann erwartet werden, dass jedes in einem rekombinanten System hergestellte enzymatisch aktive Calpain für das Expressionssystem schädlich oder tödlich ist. Es wäre zu erwarten, dass alle für das verwendete Expressionssystem schädlichen Wirkungen zunehmen, wenn mehr aktiviertes Produkt exprimiert wird. Vor allem erzeugen viele Säugerzellen einen endogenen Calpaininhibitor, der eine bedeutende Kontrolle über die Aktivität einer ansonsten tödlichen Protease ausüben kann.
Aoki et al., s.o., beschrieb die vollständige Aminosäuresequenz der 80 kDa Untereinheit von humanem Calpain I (μCANP), die sie von der Sequenz eines cDNA-Klons von humanem Calpain ableiteten. Der cDNA-Klon von humanem Calpain wurde aus der cDNA-Bibliothek des menschlichen Skelettmuskels unter Verwendung einer cDNA für die große Untereinheit von Kaninchen-μCANP als Sonde isoliert. Die Expression der cDNA wird nicht berichtet.
Imajoh et al., Biochemistry, 27:8122-8128 (1988) beschrieb die Isolierung eines cDNA-Klons für die große Untereinheit von humanem Calpain II aus einer Bibliothek des menschlichen Skelettmuskels, mit Huhn-CANP und Kaninchen-mCANP als Sonde. Es wird berichtet, dass das abgeleitete Protein im Wesentlichen dieselben strukturellen Merkmale aufwies, wie sie für μCANP und Huhn-CANP beschrieben wurden. Es wurde berichtet, dass die Ähnlichkeiten in der Aminosäuresequenz von humanem mCANP zu humanem μCANP und Huhn-CANP 62 % beziehungsweise 66 % betrugen. Die Expression der cDNA wird nicht beschrieben oder vorgeschlagen.
Ohno et al., Nucleic Acids Research, 14:5559 (1986) beschrieb die Sequenz einer cDNA, die für die kleine Untereinheit (30 kDa) von humaner Calcium-aktivierter Protease kodiert, die aus einer Bibliothek der menschlichen Milz-cDNA isoliert wurde. Vergleiche mit den berichteten Aminosäuresequenzen der Kaninchen- und Schweinesequenzen zeigte nur 3 % Unterschiede.
DeLuca et al., s.o., berichtete über das molekulare Klonieren und die bakterielle Expression von cDNA für die Ratten-Calpain II (mCANP) 80 kDa Untereinheit. Die cDNA kodiert ein Protein, von dem berichtet wird, dass es eine Sequenzidentität mit humanem Calpain II von 93 % und mit humanem Calpain I von 61 % aufweist. Die Expression der cDNA fand in E. coli Bakterien in einem Phagemid-Expressionsvektor statt. Da das exprimierte Produkt nach Zellbeschallung unlöslich und inaktiv war konnte es nicht zum Screenen auf Calpaininhibitoren verwendet werden.
C Baculovirus-Expressionssysteme
V. Luckow, Current Opinion in Biotechnology, 4:546-572 (1993) und Kidd et al, Applied Biochem. and Biotech., 42:137-159 (1993) besprachen kürzlich Baculovirussystemefür die Expression humaner Genprodukte beziehungsweise die Verwendung von Baculoviren als Expressionsvektoren. Luckow erörterte die Herstellung einer Anzahl verschiedener Arten von Proteinen, einschließlich Enzymen. Es wird jedoch die Erzeugung von nur einem proteolytischen Enzym erwähnt, nämlich Metalloproteasestromelysin. Im Gegensatz zu Calpain ist dieses Enzym nicht multimer.
Kidd et al., erörterte die Verwendung von Proteinen, die von dem Baculovirus erzeugt wurden, für die Röntgenstrukturanalyse und zum Zusammenfügen der Untereinheiten unter Bildung funktioneller Moleküle mit mehreren Untereinheiten. Eine Zahl von Beispielen zeigte den geeigneten Zusammenbau der Untereinheiten zur Herstellung funktioneller Moleküle. Obwohl der Autor allgemein anmerkte, dass die Baculovirusexpression zu der strukturellen Vollständigkeit der gefalteten Moleküle und zu der vollständigen biologischen Funktion in so gut wie allen Fällen führt, wurde das Zusammenfügen von Untereinheiten dimerer oder multimerer Enzyme in ein funktionelles Enzym nicht berichtet. Weiterhin war in anderen Fällen, die Moleküle mit mehreren Untereinheiten betrafen, das heißt Na, K, ATP-ase, das System von Untereinheiten manchmal unwirksam. (Siehe DeTomaso et al., s.u.)
Andere berichteten über die Expression von Enzymen in dem Baculovirussystem. Vernet et al., J. Biol. Chem., 27:16661-16666 (1990) beschrieb die Absonderung eines Papinvorläufers aus Insektenzellen. Papain ist eine Cysteinprotease. Das Prepropapaingen wurde in den Transfervektor IpDC125 hinter den Polyhedronpromotor kloniert. Das rekombinante Konstrukt wurde durch homologe Rekombination in das Genom des Polyhedrosisvirus Autographa californica eingebaut. Ein enzymatisch inaktiver Papainvorläufer wurde aus Spodoptera frugiperda Sf9 Zellen, die mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert worden waren, gewonnen. In den infizierten Zellen fand keine geeignete Verarbeitung des Papainvorläufers zum Erzeugen eines aktiven Enzyms statt.
Fertig et al., Cytotechnology, 11:67-75 (1993) beschrieb die Herstellung von Pro-Kallikrein, das ein Vorläufer von Kallikrein, eine Serinprotease ist. Pro-Kallikrein wurde in Insektenzellen von Spodoptera frugiperda (Sf9) und Mamestra brassicae (IZD-Mb503), die mit einem rekombinanten Nuclear-Polyhedrosisvirus Autographa californica (AcNPV), Stamm E2, infiziert worden waren, erzeugt. Zum Erhalten eines aktiven Enzyms wurde das hergestellte Pro-Kallikrein unter Verwendung von Trypsin in vitro aktiviert.
Button et al., Gene, 133:75-81 (1993) beschrieb die Herstellung der Metalloprotease GP63 von Leishmania major in einem Baculovirus-Insektenzellen-Expressionssystem. Das Enzym wurde von Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen, die mit einem rekombinanten Nuclear-Hedrosisvirus Autographa californica (AcNPV) infiziert worden waren, als latente Protease, die nachfolgend zu voller Proteaseaktivität mittels HgCl₂-Behandlung aktiviert wurde, abgesondert.
Hirowatari et al., Arch. Virol., 133:349-356 (1993) beschrieb die Expression eines Polypeptids, von dem angenommen wurde, dass es zwei virale Proteaseaktivitäten aufweist, die für die Verarbeitung des viralen Vorläuferproteins des Hepatitis C Virus (HCV) erforderlich sind. Das Polypeptid wurde in der Insektenzelllinie Sf21, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert worden war, exprimiert. Es wurde der Baculotransfervektor pVL941 verwendet. Aus dem Vorhandensein eines gereiften 70 kDa Proteins wurde auf Proteaseaktivitäten geschlossen.
Obwohl die Herstellung enzymatisch aktiver multimerer Proteasen in dem Baculovirussystem, entsprechend der Kenntnis des Erfinders, nicht berichtet wurde, wurde das Baculovirussystem zum Exprimieren funktioneller multimerer Enzyme, die andere als Proteasen sind, verwendet. DeTomaso et al., J. Biol. Chem., 268(2):1470-1478 (1993) beschreibt die Expression funktioneller Ratten Na, K-ATPase unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems. Es wurde ein Expressionssystem unter Verwendung von Insektenzellen gewählt, weil manche Insektenzellen geringe oder keine Gehalte an Na, K-ATPase aufweisen. Ein Baculovirussystem wurde gewählt, weil mit dem Baculovirus infizierte Zellen hohe Gehalte an fremdem Protein erzeugen. Es wurden von Spodoptera frugiperda stammende Sf-9-Zellen verwendet. Der Baculovirus war Autographa californica. Da jedoch die Aktivität des Enzyms von Insektenzellen nur 20–25 % von derjenigen aus dem äußeren Hundenieremark betrug, schlossen die Autoren daraus, dass ein Teil des exprimierten Enzyms inaktiv war.
Wen-Ji et al., J. Biol. Chem., 268(13):9675-9680 (1993) beschreibt die Expression funktioneller Säugerprotein-Farnesyltransferase in einem Baculovirussystem unter Verwendung von Sf9-Zellen. Die spezifische Aktivität des exprimierten Proteins betrug 510 nM/mg/Std, wobei für diesen Wert angegeben wurde, dass er im Wesentlichen gleich zu demjenigen ist, der für das Rattengehirnenzym berichtet wurde. Es wurde jedoch angemerkt, dass die aus dem nativen Gewebe erhaltenen Proteinmengen vorher keinen direkten Assay der Proteinkonzentration gestatteten, daher ist dies das erste Mal, dass eine spezifische Aktivität des Proteins unter Verwendung eines Standard-Proteinassays bestimmt wurde.
Es gibt keine Offenbarung oder einen Vorschlag zur Exprimierung einer enzymatisch aktiven multimeren möglicherweise tödlichen Protease, wie zum Beispiel Calpain in irgendeinem Expressionssystem. Es wurde insbesondere erwartet, dass die Expression von Calpain I schwierig sein würde und das Vorhandensein eines Inhibitors erfordern würde, weil Calpain I bei extrem geringen Gehalten an Ca⁺⁺ aktiviert wird, die während des Infektionszyklus erreicht werden könnten. Überraschenderweise stellten die vorliegenden Erfinder unerwartet fest, dass enzymatisch aktives Calpain in dem Baculovirussystem und in Abwesenheit eines Inhibitors exprimiert werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von enzymatisch aktivem Säuger-Calpain durch rekombinante Mittel. Die Herstellung von rekombinantem enzymatisch aktiven humanen Calpain I in einem Baculovirus-Insektenzellensystem wird speziell beschrieben. So hergestelltes Calpain kann vorteilhaft in Assays zum Screenen wirksamer Calpaininhibitoren verwendet werden, wobei der Stand der Technik bereichert wird, indem eine schnelle und wirksame Auswahl von Calpaininhibitoren möglich wird, die zur Behandlung jener Krankheiten, in denen Calpain eine Rolle spielt, verwendet werden können, und ausreichend Calpain zur Kristallisation für die vernünftige Gestaltung von Calpaininhibitoren zur Verfügung gestellt wird. Auf diese Weise hergestelltes Calpain kann ebenfalls in anderen Anwendungen, einschließlich als Mittel zum Mürbemachen von Fleisch und als Blutklümpchenlöser verwendet werden.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung enzymatisch aktives Säuger-Calpain, das durch Rekombinationstechnologie hergestellt wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Plasmidvektoren, die eine Säuger-Calpain kodierende cDNA zur Herstellung von rekombinantem enzymatisch aktiven Säuger-Calpain umfassen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung rekombinante Baculoviren, die eine Säuger-Calpain kodierende cDNA zur Herstellung von rekombinantem enzymatisch aktiven Säuger-Calpain umfassen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktivem Säuger-Calpain durch rekombinante Mittel unter Verwendung eines Baculovirus-Insektenzellensystems.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt die Klonierungsstrategie für die 30 kDa Calpainuntereinheit dar.
2 stellt die Klonierungsstrategie für die 80 kDa Calpain I-Untereinheit dar.
3 stellt die Klonierungsstrategie für das doppelte Konstrukt dar.
4 stellt die Expression der Untereinheiten in Sf21-Zellen entsprechend der Bestimmung durch Immunoblot dar.
Die 5a–d stellen die Messung der Calcium-abhängigen Proteaseaktivität dar.
Die 6a–b stellten die Calcium-abhängige Verarbeitung der inaktiven 80 kDa Untereinheit zu der aktiven 76 kDa Form dar.
7 stellt die verbesserte Expression in serumfreiem Medium dar.
8 stellt die Messung der Calcium-abhängigen Proteaseaktivität der alleinig exprimierten 80 kDa Untereinheit dar.
9 stellt die Calciumaktivierungsprofile von rekombinantem und nativem menschlichen Calpain I dar.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Säuger-Calpain I, spezifisch enzymatisch aktivem Calpain I durch rekombinante Mittel. „Calpain", so wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf das Heterodimer, das aus den zwei Untereinheiten besteht. Diese Untereinheiten sind die kleinere Untereinheit mit einem Molekulargewicht von ungefähr 30 kDa und die größere Untereinheit mit einem Molekulargewicht von ungefähr 80 kDa in Abhängigkeit von ihrem Aktivierungszustand. Ein Verweis auf die 80 kDa Untereinheit umfasst wenigstens die 77 kDa und die 76 kDa Formen, die aus der Autolyse der 80 kDa Untereinheit resultieren. Wie für den Fachmann offensichtlich sein wird können die Untereinheiten von den unterschiedlichen Säugerspezies und sogar die Untereinheiten von unterschiedlichen Geweben derselben Säugerspezies (Hatanaka, s.o.) in dem Molekulargewicht variieren. Diese Variationen werden umfasst.
Der Begriff „enzymatisch aktiv", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit wenigstens ein bekanntes Calpainsubstrat, einschließlich Calpain selbst messbar zu hydrolysieren, das heißt als Folge der Autolyse. Die enzymatische Aktivität kann durch alle für den Fachmann akzeptierbaren Mittel zur Ausführung derartiger Bestimmungen gemessen werden, einschließlich aber nicht eingeschränkt auf Fluoreszenz- und kolorimetrische Mittel. Der Teil von jeder Untereinheit, der zum Beibehalten der enzymatischen Aktivität, wie sie vorstehend beschriebenen ist, ausreicht, wird umfasst. Das erfindungsgemäße Verfahren erleichtert die schnelle Bestimmung von denjenigen Regionen der kodierenden Sequenz (cDNA), die für die Enzymaktivität notwendig sind, und von den Änderungen in der Aktivität, die aus der absichtlichen Mutation der kodierenden Sequenz resultieren können. Der Ausdruck „enzymatisch aktiv nach der Expression", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Calpain oder eine Untereinheit davon mit einer messbaren enzymatischen Aktivität nach der Expression, ohne jegliche andere Manipulation zu erfordern, als das Vorhandensein von Calcium.
Der Begriff „Expression", wie er hier verwendet wird, umfasst, ist aber nicht eingeschränkt auf die in vitro Translation der in den erfindungsgemäßen Vektoren und Viren in Insekten- und anderen Zellen enthaltenen cDNA. Da normalerweise etwas Ca²⁺ während der Expression, insbesondere im Falle des Serum-enthaltenden Mediums, vorhanden ist, ist das so hergestellte Calpain nach der Expression enzymatisch aktiv.
Der Ausdruck „rekombinant", wie er hier verwendet wird, umfasst, ist aber nicht eingeschränkt auf ein Molekül, Mikroorganismus, Plasmid, Phage oder anderen Vektor, der eine neue Kombination von DNA-Sequenzen enthält. Der Ausdruck „Mikroorganismus" umfasst Viren und Bakterien. Die Ausdrücke „Plasmid", „Phage" und „Vektor" werden entsprechend ihren dem Fachmann bekannten Bedeutungen, wie zum Beispiel in A Dictionary of Genetic Engineering, Stephen G. Oliver und John M. Ward, Herausg., Cambridge University Press, Cambridge, 1988 definiert ist, verwendet.
Der Ausdruck „Säuger" umfasst alle Tiere der phylogenetischen Klasse „Säuger". Das Calpain ist vorzugsweise rekombinantes enzymatisch aktives humanes Calpain. Das Calpain ist bevorzugter rekombinantes enzymatisch aktives humanes Calpain I.
Der in der folgenden Offenbarung verwendete Caculovirus Autographa californica Nuclear-Polyhedrosisvirus (AcNPV) ist beispielhaft. Jedoch können andere Baculoviren, wie zum Beispiel Bombyx mori Nuclear-Polyhedrosisvirus (BmNPV), Heliothis zea Nuclear-Polyhedrosisvirus, Lymantria dispar Nuclear-Polyhedorsisvirus, so wie Orcytes Baculoviren, Viren der Poxviridae und Parvoviridae, Choristoneura und Amsacta anstelle von AcNPV in Betracht gezogen werden. Siehe „Insect Cell Expression Technology", Seiten 1–40, in Principles and Pracitce of Protein Engineering, Jeffrey L. Cleland & Charles S. Craik, (Herausg.), John Wiley & Sons, 605 Third Avenue, New York, NY 10158-0012.
Obwohl Zellen aus dem Insekt Spodoptera frugiperda zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, wurden über 400 Insektenzellen etabliert und können verwendet werden, insbesondere diejenigen von Trichoplusia ni. Siehe Cleland & Craik, s.o. Der Fachmann kein leicht eine zur Expression geeignete Insektenzelle bestimmen. Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass andere Zellen, wie zum Beispiel Hefe und Säugerzellen, mit dem geeigneten Vektor verwendet werden können, wobei deren Auswahl innerhalb des Könnens des Fachmanns liegt.
Die durch die Baculoviren zu exprimierenden heterologen Gene sind im allgemeinen unter der Kontrolle des Polyhedrin oder P10-Promotors von AcNPV, weil die Polyhedrin und P10-Gene zur Replikation oder Reifung des Virus nicht wesentlich sind und hochgradig transkribiert werden. Dies schränkt keineswegs die Verwendung anderer Promotoren zur Ausübung dieser Erfindung ein. Siehe Cleland & Craik, s.o.
Die Expression und Gewinnung des rekombinanten enzymatisch aktiven Calpains wird spezifisch offenbart. Dies war insbesondere wegen Calpain I, das in Gegenwart mikromolarer Mengen an Calcium aktiviert wird, unerwartet, weil Ca²⁺ in dem Gewebekulturmedium, in dem die Zellen für dessen Herstellung vermehrt werden, vorhanden ist. Da die infizierten Zellen im allgemeinen „undicht" werden, wurde erwartet, dass Ca²⁺ aus dem umgebenden Medium in einer Menge in die Zellen eintritt, die ausreicht, um jedes hergestellte Calpain I zu aktivieren, das wiederum für die Zellen tödlich wäre und bewirken würde, dass Calpain I durch Autolyse sich selbst verdaut.
Es wurde festgestellt, dass das rekombinant hergestelltes Calpain vollständig enzymologisch aktiv ist und ein zu nativem Calpain ähnliches Enzymaktivitätsprofil aufweist, das für die Verwendung eines derartig rekombinant abgeleiteten Calpains im Screening auf mögliche therapeutische Calpaininhibitoren von Bedeutung ist. Das rekombinant hergestellte Calpain wies eine zu bekannten Calpaininhibitoren ähnliche Empfindlichkeit und eine fehlende Empfindlichkeit gegen Inhibitoren von Serin oder Asparaginprotease auf. Die zum Erreichen von ½ V_maX erforderliche Calciummenge war für sowohl natives als auch rekombinantes Calpain im Wesentlichen dieselbe. Entsprechend waren die Geschwindigkeiten für die Substrathydrolyse, sowie die spezifischen Aktivitäten (Daten sind nicht gezeigt) ähnlich. Diese Merkmale sind wiederum für die vollständige Nutzbarmachung des erfindungsgemäßen Calpains wichtig.
Überraschenderweise wurde ermittelt, dass die spezifische Aktivität der 80 kDa Untereinheit allein näherungsweise 20–25 % von derjenigen des Heterodimers beträgt. Früher wurde ermittelt, dass die spezifische Aktivität der von dem Heterodimer dissoziierten 80 kDa Untereinheit nur 3 % von derjenigen des Heterodimers beträgt. (Kikuchi et al. Arch. Biochem. Biophys., 234:639-645, 1984). Folglich scheint die Struktur der rekombinant hergestellten 80 kDa Untereinheit von derjenigen der von nativem Calpain dissoziierten Untereinheit verschieden zu sein und könnte näher die Struktur der aktiven Untereinheit darstellen. Daher erleichtert die rekombinante Herstellung der Calpainuntereinheiten die Untersuchung der Struktur der einzelnen Untereinheiten.
In der vorliegenden Erfindung wurde die Expression von Calpain durch die Expression von sowohl der 80 kDa als auch der 30 kDa Untereinheit in denselben Insektenzellen durch entweder Coinfizieren der Zellen mit zwei getrennten Viren, die für jede Calpainuntereinheit eine cDNA umfassen, oder durch Infizieren der Insektenzellen mit einem einzelnen Virus, der die cDNA für beide Untereinheiten umfasst, erreicht. Es wurde ebenfalls entdeckt, dass eine erhöhte Menge der 80 kDa Untereinheit bei Coexpression der 30 kDa Untereinheit exprimiert wird, daher könnte die 30 kDa Untereinheit eine stabilisierende Wirkung auf die 80 kDa Untereinheit aufweisen.
Bei Infizierung der Zellen mit Viren, die beide Calpainuntereinheiten enthalten, sollten alle infizierten Zellen beide Untereinheiten exprimieren. Ohne Rücksicht auf die zugegebene Infektionsmultiplizität (MOI) ist bei der Infektion von Zellen mit einem Virus, der nur die eine oder die andere Untereinheit enthält, eine höhere MOI erforderlich, um die Expression beider Untereinheiten zu erzielen, zum Beispiel wird für jeden Virus ein MOI von 5 benötigt, damit 99 % der Zellen ein oder mehrere Teilchen von beiden Viren enthalten, und folglich beide Untereinheiten exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression durch Coexpression beider Untereinheiten in einer einzelnen Zelle ausgeführt.
Zum Aufbau der rekombinanten Calpain-Baculoviren wurden Sonden für einen Teil der kodierenden Regionen für sowohl die 30 kDa als auch die 80 kDa Untereinheit durch Polymerasekettenreaktion (PCR) aus einer cDNA-Bibliothek hergestellt ,und sie wurden zum Screening einer menschlichen cDNA-Phagenbibliothek verwendet. Die Phagen, die den größten Teil der jede der Untereinheiten kodierenden Regionen enthielten, wurden isoliert, und die Einschub-DNA wurde subkloniert. Alle in den isolierten Klonen nicht enthaltende Regionen wurden aus der Bibliothek PCR-amplifiziert, deren Sequenz wurde geprüft und sie wurden an die teilweisen Klone unter Herstellung der das gesamte Calpain kodierenden Region gehängt. Die aus gewählte menschliche cDNA-Bibliothek war eine Milzbibliothek, die von Clontech (Palo Alto, CA, #HL1134a) erhältlich ist. Eine Milzbibliothek wurde, basierend auf der berichteten reichlich vorhandenen Expression von Calpain I und II in der Rattenmilz, gewählt (Murachi, Trend Biochem. Sci. 8:167-169, 1983).
Tabelle I listet die synthetischen Oligonukleotidprimer auf, die für die Amplifikation der Teile der 80 kDa und 30 kDa Untereinheiten von humanem Calpain verwendet wurden. Die Primer wurden, basierend auf den veröffentlichten cDNA-Sequenzen für die 80 kDa Untereinheit von Calpain I (Aoki et al., FEBS Lett. 205:313-317, 1986) und die 30 kDa Untereinheit (Ohno et al., Nucl. Acids Res. 14:5559, 1986, auf deren Offenbarungsgehalte hier vollständig Bezug genommen wird), ausgewählt. Die Primer für die 80 kDa Untereinheit von Calpain I wurden weiterhin basierend auf ihrer Verschiedenheit zu dem betreffenden humanen Calpain II ausgewählt und die Primer für die 80 kDa Untereinheit von Calpain II wurden basierend auf ihrer Verschiedenheit zu menschlichem Calpain I ausgewählt. Innere Primer wurden so ausgewählt, dass sie gerade außerhalb der bekannten Restriktionsendonukleasestellen sind, wobei eine nachfolgende Verdauung an diesen Stellen für die Subklonierung der PCR-Fragmente in die Plasmidvektoren gestattet wurde. Alle Sequenzen in Tabelle I sind von 5' nach 3' aufgezeigt. „S" nach der Sequenz weist auf Sense hin. „AS" weist auf Antisense hin. Primer für die 30 kDa Untereinheit sind mit „30" angezeigt und Primer für die 80 kDa Untereinheiten von Calpain I und II sind mit „80I" beziehungsweise „80II" bezeichnet. Klammern unterhalb der Sequenzidentifikationsnummern stellen interne Laborbezeichnungen dar und diese werden in den nachfolgenden Beispielen verwendet.
Alle Polymerasekettenreaktionen wurden in einem Thermocycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) unter Verwendung von entweder2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI), 3 Einheiten UITma-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) oder 2 Einheiten Tli-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) in Gegenwart des bereitgestellten Puffers, 0,2 mM dNTPs (Taq- und Tli-DNA-Polymerasen) oder 40 μM dNTPs (UITma-DNA-Polymerase), 0,75–2 mM zugefügtes MgCl₂ und 0,25 μM von jedem Primer. Nach der anfänglichen Inkubation zur Denaturierung während 5 Minuten bei 94 °C wurden 30–35 Amplifikationszyklen, wie nachstehend aufgezeigt, gefolgt von einer Endverlängerung bei 72 °C während 7 Minuten durchgeführt. Das Templat war die 1–10 μl lambda-Phagenbibliothek oder teilweise gereinigter Phage, der zu einer minimalen Menge von 30 μl destilliertem Wasser gegeben wurde. Die DNA wurde zur Amplifikation durch dreimal aufeinanderfolgendes Gefrieren in Trockeneis/Ethanol, gefolgt von Tauen bei 37 °C freigesetzt.
Beispiel 1
Klonieren der 30 kDa Untereinheit von humanem Calpain
1 stellt die Strategie zum Klonieren der 30 kDa Untereinheit von menschlichem Calpain dar. Die Primer DL-13
5' > GGTGGAACGGCCATGCGCATC > 3' und SM36
5' > CGGGATCCTTAGGAATACATAGTCAGCTGCAGCC > 3' wurden zum Amplifizieren der Basenpaare #163–805 der humanen 30 kDa cDNA aus der HL1134a humanen Milz-λgt10-Bibliothek (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) zur Verwendung als Sonde, verwendet. Die Basenpaar- (bp) Nummerierung schließt sich durchwegs an die Zuordnung des Startcodons „ATG" als Basenpaar #1–3 an. Die Bedingungen für die PCR waren wie vorstehend, wobei 30 Amplifikationszyklen mit 1 Minute bei 94 °C, 1 Minute bei 55 °C und 1 Minute bei 72 °C verwendet wurden. Das 643-bp-Fragment wurde aus der niedrig schmelzenden Agarose nach Elektrophorese (SeaPlaque-GTG, FMC Bioproducts, Rockland, ME) isoliert und durch Extraktion mit Phenol-Chloroform gereinigt. Dann wurde das Fragment mit [32]P-dCTP (Amersham, Arlington, Heights, IL) durch zufällig geprimtes Markieren unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase, entsprechend dem bereitgestellten Verfahren (Promega Corp., Madison, WI) markiert und zum Screenen der Bibliothek folgendermaßen verwendet.
Die Bibliothek wurde zum Screening auf dem von Clontech gelieferten C600hfl-Wirt ausgestrichen. Es wurden näherungsweise 35000 Plaque-bildende Einheiten auf vierzehn Petrischalen mit einem Durchmesser von 150 mm ausgestrichen. Von diesen Schalen wurden doppelte Nitrozelluloseaufzüge gemäß den von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (zweite Auflage) S. 1–1626, Cold Spring Harbor, NY, beschriebenen Verfahren hergestellt. Hybridisierungsreaktionen mit der denaturierten markierten Sonde wurden über Nacht bei 68 °C in 6 × SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,8, 10 mg/ml Poly A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,2 mg/ml Heparin (Sigma Chemical Co., S. Lous, MO) und 0,5 % SDS, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 3 × SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur und zweimaligem Waschen mit 1 × SSC, 0,1 % SDS während 30 Minuten bei 55 °C ausgeführt. Die markierten Plaques wurden durch Autoradiographie nachgewiesen.
Es wurde festgestellt, dass die zwei Phagen Einschübe aufwiesen, die einen Teil der cDNA für die 30 kDa Untereinheit enthielten. Das gesamte 5'-Ende der cDNA, das mit der inneren EcoRI-Stelle bei bp #488 endete, war in dem mit 14.2.4 bezeichneten lambda-Phagen vorhanden. Der mit 4.1.1 bezeichnete lambda-Phage enthielt den größten Teil der Protein kodierenden Region. Der Plaque-gereinigte 4.1.1 Phage wurden dann zum PCR-Amplifizieren des 3'-Endes der cDNA verwendet. Es wurden die Primer SM-37
5' > CACCCTGATCTGAAGAC Y 3' und SM-36
5' > CGGGATCCTTAGGAATACATAGTCAGCTGCAGCC > 3' verwendet. Der Primer SM-36 fügt eine BamHI-Restriktionsstelle unmittelbar 3' zu dem Stoppcodon hinzu und ändert das Stoppcodon zu „TAA". Die Amplifikation wurde mit UITma-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer. Norwalk, CT) unter Verwendung des bereitgestellten Puffers unter Zugabe von 40 μM dNTPs und 0,75 mM MgCl₂ (für 10 μl Phagentemplat, 1,55 mM Mg²⁺-Endkonzentration) ausgeführt. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: 2 Minuten Denaturierungsschritt bei 97 °C vor der Zugabe der Polymerase, gefolgt von 30 Amplifikationszyklen mit 1 Minute bei 95 °C, 45 Sekunden bei 55 °C und 1 Minute bei 72 °C. Dann wurde das erhaltene Fragment mit EcoRI und BamHI verdaut, aus der niedrig schmelzenden Agarose wie vorstehend isoliert und in EcoRI, BamHI-verdautes pGEM-4Z (Promega Corp., Madison, WI) subkloniert.
Der 5'-Teil des Gens wurde in zwei Schritten erhalten. Zuerst wurde aus dem Plaque-gereinigten lambda-Phagen 14.2.4 isolierte DNA mit HindIII, das die lambda-DNA in der Region 5' zum Einschub schneidet, und BgIII, das die lambda-DNA in der Region 3' zum Einschub schneidet, verdaut. Das resultierende 2,5 kb Fragment wurde in BamHI, HindIII-verdautes pGEM-4Z subkloniert. Dann wurde ein Paar syntheti scher Oligonukleotide zum Modifizieren der Region 5' zu dem Startcodon verwendet, indem sowohl eine BamHI-Stelle zum Erleichtern des Klonierens in die Transfervektoren hinzugefügt wurde und die Sequenz CCTATAAAT von der 5'-untranslatierten Region des Polyhedrin-Gens unmittelbar vor dem Startcodon in dem Versuch eine optimale Baculovirustranslation zu erreichen, eingeschoben wurde. Das den lambda-Einschub enthaltende Plsmid wurde mit Xmal, das in der Mehrfachklonierungsstelle des pGEM-4Z-Vektors 5' zu der BamHI-Stelle schneidet, und Hpal, das bei Basenpaar #13 in der 30 kDa cDNA, die sich 3' zu der BamHI-Stelle befindet, schneidet, verdaut, um die Calpain-cDNA-Sequenzen 5' zu der HpaI-Stelle zu entfernen. Das verdaute Plasmid wurde aus niedrig schmelzender Agarose wie vorstehend isoliert. Wie in 1 gezeigt ist wurden zwei Oligonukleotide SM-65 5' > CCGGGATCCTATAAATATGTTCCTGGTT > 3' und SM-66 5' > AACCAGGAACATATTTATAGGATC > 3' durch Coinkubation in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,0, 50 mM NaCl bei den folgenden Temperaturen jeweils während 10 Minuten: bei 90 °C, 65 °C 42 °C, 37 °C und Raumtemperatur aneinander annealed. Die annealten Oligonukleotide wurden dann an das linearisierte verdaute Plasmid ligiert und die resultierenden Kolonien wurden auf das Vorhandensein der BamHI-Stelle, die durch diese Oligonukleotide hinzugefügt wurde, gescreent (1).
Dann wurde die cDNA der gesamten kodierenden Region aus den zwei vorstehend beschriebenen Plasmiden zusammengesetzt. Das den 5'-Teil der cDNA enthaltende Plasmid wurde mit EcoRI verdaut. Es gibt in der Vektor-Mehrfachklonierungsregion 5' zu der Xmal-Stelle eine EcoRI-Stelle und ebenfalls bei by #488 in der 30 kDa cDNA eine Stelle. Dann wurde dieses EcoRI-Fragment mit ungefähr 500 bp, dass alle Additionen an das 5'-Ende der 30 kDa cDNA enthielt, aus der niedrig schmelzenden Agarose wie vorstehend isoliert und an das EcoRI-verdaute Plasmid, das den 3'-Teil der cDNA enthielt, ligiert. Es wurde ein Plasmid mit dem EcoRI-Fragment in der richtigen Orientierung erhalten. Die Didesoxynukleotid-DNA-Sequenzierung (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977) der gesamten 30 kDa kodierenden Region bestätigte, dass die modifizierte cDNA die richtige Aminosäuresequenz für das humane Calpainprotein kodierte (Ohno et al., Nucl. Acids Res. 14:5559, 1986).
Dann wurde dieses Plasmid mit BamHI verdaut und das 820 Basenpaar-Fragment, das die gesamte humane 30 kDa Calpain-cDNA mit ihren Modifikationen für die Baculovirus-Expression enthielt: 1) Zugabe von CCTATAAAT unmittelbar 5' zu dem Startcodon um möglicherweise die Transkription zu verbessern, und 2) Änderung des Stoppcodons zu von dem Baculovirus bevorzugten TAA (Luckow et al., Virology, 170:31-39, 1989), wurde zur Expression einer einzelnen Untereinheit in den BamHI-verdauten pVL941-Transfervektor, der den Polyhedrinpromotor enthielt, subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit pVL941-hCANP30-6 bezeichnet. Zur Expression von zwei Untereinheiten wurde das 820-bp Fragment in entweder BamHI- oder BgIII-verdautes pACUW51 (PharMingen, San Diego, CA; bezeichnet mit Bam-CANP30 beziehungsweise p51-Bg1-CANP30), einen Transfervektor, der sowohl die p10 als auch die Polyhedrinpromotoren enthielt, subkloniert (siehe 3). Der pA-cUAW-51-Vektor wird so entworfen, dass er gleichzeitig zwei Proteine von demselben Virus exprimiert, wobei beide an den Polyhedrinlocus des Baculovirus eingeschoben werden. Dieser Vektor enthält zwei Promotoren -Polyhedrin und p10 – die starke Promotoren sind, die nach der Infektion die Transkription sehr spät beginnen (das heißt nach 18–24 Stunden). Die Promotoren sind in den Vektor in entgegengesetzter Ausrichtung eingeschoben, um eine Deletion der cDNAs durch homologe Rekombination aufgrund der Verdopplung des genetischen Materials zu minimieren (Weyer et al., J. Gen. Virol., 70:203-208 (1991)). Durch Restriktionsenzymanalyse wurde bestätigt, dass die resultierenden Plasmide nur einen Einschub in der zur Expression richtigen Orientierung aufweisen. (Daten sind nicht gezeigt).
Beispiel 2
Klonieren der 80 kDa Untereinheit von humanem Calpain
2 stellt die Strategie zum Klonieren der 80 kDa Untereinheit von humanem Calpain I dar. Die Primer SM-40
5' > GTACACTTGAAGCGTGACTTC > 3' und SM-41
5' > GAGGCAGCAAACGAAATTGTC > 3' wurden hergestellt und zum Amplifizieren der Basenpaare #1372–2037 der humanen 80 kDa cDNA aus der HL1134a humanen Milz-λgt10-Bibliothek (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) zur Verwendung als Sonde, verwendet. Die Bedingungen für die PCR waren wie vorstehend für die Taq- DNA-Polymerase, wobei die Lösung mit 2 mM in Bezug auf MgSO₄ hergestellt wurde, 5 μl der lambda-Bibliothek hinzugefügt wurden und 30 Amplifikationszyklen mit 1 Minute bei 94 °C, 1 Minute bei 60 °C und 2 Minuten bei 72 °C verwendet wurden. Das PCR-amplifizierte Fragment wurde von den Primern entsprechend den bereitgestellten Anweisungen mit dem Wizard PCR-Präparations-Kit (Promega, Madison, WI) abgetrennt. Dieses Fragment wurde mit Xmal und Sa/I verdaut. Das resultierende 538 bp Fragment wurde aus einem 1 % Seakem-GTG/2 % NuSieve- /FMC BioProducts, Rockland, ME) Agarosegel unter Verwendung des bereitgestellten Protokolls für das GeneClean II Kit (B101, La Jolla, CA) isoliert und dann in den Xmal., Sa/I-verdauten pGEM-4Z-Vektor (Promega, Madison, WI) ligiert.
Die DNA von dem vorstehenden teilweisen cDNA-Klon der 80 kDa Untereinheit wurde mit EcoRI und HindIII zum Freisetzen des Einschubs verdaut, gefolgt von der Isolierung des Fragments unter Verwendung des GeneClean II Kits nach Elektrophorese in einem 1 % Seakem-GTG/2 % NuSieve-Agarosegel. Dann wurde es mit [32]P-dCTP markiert und zum Screenen der humanen Milzbibliothek, wie vorstehend beschrieben ist, verwendet. Näherungsweise 500000 Plaque-bildende Einheiten wurde auf zehn Petrischalen mit einem Durchmesser von 150 mm ausgestrichen. Es wurden doppelte Nitrocelluloseaufzüge hergestellt und mit der denaturierten markierten Sonde über Nacht bei 68 °C in derselben Hybridisierungsmischung, wie sie für das 30 kDa-Screening vorstehend beschrieben ist, hybridisiert, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 2 × SSC, 0,1 % SDS während jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur und zweimaligem Waschen mit 1 × SSC, 0,1 % SDS während 1 Stunde bei jeweils 68 °C, und dem Nachweis der markierten Plaques durch Autoradiographie.
Es wurde festgestellt, dass ein Phage (lambda ca180-8a) einen Einschub aufwies, der 67 % des 3'-Endes der die cDNA für die 80 kDa Untereinheit kodierenden Region enthielt. Die DNA wurde aus einer flüssigen Kultur des Plaque-gereinigten Phagens, gemäß dem in Sambrook et al., s.o. beschriebenen Verfahren isoliert, mit Xbal und Sa/I verdaut und das einmalig vorhandene 1238 bp 80 kDa cDNA-Fragment wurde aus einem 1 % Seakem-GTG-Agarosegel unter Verwendung des für das GeneClean II Kit (B101, La Jolla, CA) bereitgestellten Protokolls isoliert. Dieses Fragment wurde in den Xbal-, Sa/I-verdauten pBluescript^® SK + Vektor (Stratagene, La Jolla, DA) li giert und die Identität des Einschubs wurde durch Didesoxynukleotid-DNA-Sequenzierung (Sanger et al., s.o.) von Teilen des Einschubs bestätigt.
Die anderen Teile der kodierenden Region der cDNA wurden durch PCR-Amplifikation entweder aus der humanen Milzbibliothek (5'-Ende) oder dem Plaquegereinigten lambda-Phagen ca180-8a (3'-Ende) erzeugt. Die Amplifikation des 3'-Endes wurde zum Entfernen der 3'-untranslatierten Sequenzen und zum Ändern des Stoppcodons in das von dem Baculovirus bevorzugte TAA durchgeführt. Für das erstere wurden die Primer SM-53 5' > CGCGGATCCTATAAATATGTCGGAGGAGATCATCACGCCG > 3' und SM-49 5' > ATTTGCGGATGGTCCGGCTCTTGA > 3' zum Amplifizieren der Basenpaare #1-1096 der humanen 80 kDa cDNA aus 10 ml der HL1134 humanen Milzbibliothek verwendet. Der Primer SM-53 fügt eine BamHI-Stelle zum Erleichtern des nachfolgenden Klonierens hinzu und schiebt die Sequenz CCTATAAAT unmittelbar vor dem Startcodon in dem Versuch, eine optimale Baculovirus-Translation zu erhalten, ein. Für das letztgenannte wurden die Primer SM-40 5' > GTACACTTGAAGCGTGACTTC > 3' und SM-47 5' > CGGGATCCTTATGCAAACATGGTCAGCTGCAACC > 3' zum Amplifizieren der Basenpaare #1372–2143 der humanen 80 kDa cDNA aus 1 μl lambda-Phage ca180-8a verwendet. Die Amplifikationen wurden mit UITma-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) unter Verwendung des bereitgestellten Puffers und unter Hinzufügen von 40 μM dNTPs und 1,5 mM zugegebenem Mg Cl₂ durchgeführt. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: 5 Minuten Denaturierungsschritt bei 95 °C vor der Zugabe der Polymerase, gefolgt von 30 Amplifikationszyklen mit 1 Minute bei 94 °C, 1 Minute bei 60 °C und 2 Minuten bei 72 °C.
Das 1096 bp Fragment mit dem 5'-Ende wurde unter Verwendung des GeneClean II-Kits nach Elektrophorese in einem 1 % Seakem-GTG/2 % NuSieve-Agarosegel isoliert. Dann wurde dieses Fragment mit BamHI und Xbal verdaut, nach Verdau unter Verwendung des GeneClean II-Kits wieder gereinigt und in den BamHI-, Xbalverdauten pBluescript^® SK + Vektor (Stratagene, La Jolla, DA) subkloniert. Das 3'-Ende des PCR-amplifizierten Fragments wurde von den Primern entsprechend den bereitgestellten Anweisungen mit dem Wizard PCR-Präparationskit (Promega, Madison, WI) abgetrennt. Dieses Fragment wurde dann mit Sa/I und BamHI verdaut, das resultierende 137 bp Fragment aus einem 1 % Seakem-GTG/2 % NuSieve- (FMC BioProducts, Rockland, ME) Agarosegel unter Verwendung des bereitgestellten Protokolls für das Mermaid Kit (B101, La Jolla, CA) isoliert und dann in den Sa/I-, Bam-HI-verdauten pBluescript^® SK + Vektor (Stratagene, La Jolla, DA) ligiert. Die Didesoxynukleotid-DNA-Sequenzierung (Sanger et al., S.O.) von beiden dieser Einschübe bestätigte, dass sie die richtige Aminosäuresequenz (Aoki et al., FEBS Lett. 205:313-317, 1986) für diesen Teil des Proteins kodieren, und sie wurde zum Beseitigen von Klonen mit Mutationen aus der Polymerasekettenreaktion verwendet.
Das BamHI, Xbal-Fragment mit dem modifizierten 5'-Ende der kodierenden Region, das Xbal, Sa/I-Fragment mit dem Mittelteil der kodierenden Region und das Sa/I, BamHI-Fragment aus dem 3'-Ende der kodierenden Region wurden mit den geeigneten Enzymen aus ihren Vektoren verdaut und die Fragmente wurden aus einem 1 % Seakem-GTG/2 % NuSieve- (FMC BioProducts, Rockland, ME) Agarosegel unter Verwendung des für das GeneClean II-Kit (B101, La Jolla, CA) bereitgestellten Protokolls isoliert. Dann wurden diese Fragmente in äquimolaren Mengen mit dem pVL941-Vektor (Luckow und Summers, Virology 170:31-39, 1989), der mit BamHI verdaut und mit alkalischer Garnelenphosphatase (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) entsprechend dem Protokoll des Herstellers behandelt worden war, gemischt und zusammen ligiert. Ein Klon (Plasmidbezeichnung pVL941-hCANPI80-4), der entsprechend der Bestimmung durch Restriktionsenzymanalyse das BamHI-Fragment mit der richtigen Größe in der richtigen Orientierung enthielt, wurde für die Herstellung des rekombinanten Baculovirus, der nur die 80 kDa Untereinheit emprimiert, verwendet (siehe nachstehend).
Das Plasmid PVL941-hCANI80-4 wurde ebenfalls mit BamHI verdaut und das 2153 bp Fragment, das die gesamte 80 kDa Untereinheit der humanem Calpain I-cDNA enthielt, wurde in entweder mit BamHI verdautes p51-Bg1-CANP30 oder in mit BgIII verdautes p51-Bam-CANP30 zur Herstellung der einzelnen Vektoren, die cDNAs für beide Untereinheiten enthalten, das heißt doppelte Konstrukte (siehe 3), subkloniert. Durch Restriktionsenzymanalyse wurde bestätigt, dass die resultierenden Plasmide (bezeichnet mit p51-hCANPI-1 beziehungsweise p51-hCANPI-2) nur einen neuen Einschub in der richtigen Orientierung zur Expression aufwiesen.
Das Vorstehende stellt das Verfahren dar, das zum Klonieren der cDNAs für humanes Calpain I verwendet wurde. Es gibt eine Anzahl von dem Fachmann bekannten vergleichbaren Verfahren, die es gestatten könnten, cDNA-Sequenzen von diesen zur rekombinanten Expression geeigneten Genen zu erhalten. Ähnliche Verfahren könnten ebenfalls zum Erhalten der cDNA für Calpain II zur rekombinanten Expression verwendet werden.
Dieselbe Strategie wurde zum Erzeugen einer Sonde zum Screening einer Bibliothek verwendet, um die 80 kDa cDNA von humanem Calpain II zu erhalten. Die cDNA für die kodierende Region der 80 kDa Untereinheit von Calpain II wird in Imajoh et al., s.o. berichtet. Die Primer SM-69 5' > CATTGATGATGGAGTCAGGAG > 3' und SM-70 5' > CTGAGAAACAGAGCCAAGAGA > 3' wurden zum Amplifizieren von bp #1587–2075 aus derselben humanen Milzbibliothek verwendet. Die Bedingungen für die PCR sind vorstehend beschrieben, wobei 2 Einheiten Tli-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) mit 0,75 Mm zugegebenem MgCl₂ und 10 μl lambda-Bibliothek verwendet wurden und 30 Amplifikationszyklen mit 1 Minute bei 94 °C, 1 Minute bei 55 °C und 1 Minute bei 72 °C verwendet wurden. Das 489 bp Fragment wurde aus einem 1 % Seakem-GTG/2 % NuSieve- (FMC BioProducts, Rockland, ME) Agarosegel unter Verwendung des für das GeneClean li-Kits (Bio101, LaJolla, CA) bereitgestellten Protokolls isoliert, mit PstI und BamHI verdaut und das gerade eben beschriebene Verfahren zum Isolieren des 377 bp PstI-, BamHI-Fragments nach Agarosegel-Elektrophorese verwendet. Das gereinigte Fragment wurde in den PstI-, BamHI-verdauten pGEM-4Z-Vektor (Promega, Madison, WI) ligiert.
Beispiel 3
Herstellung rekombinanter Bucoloviren
Spodoptera frugiperda Zellen (Sf21, Vaughn et al., In Vitro, 13:213-217, 1977) wurden von Dr. B.G. Corsaro von dem Boyce Thompson Institute for Plant Research, Cornell University, Ithaca, NY zur Verfügung gestellt. Diese Zellen wurden in einer Suspension bei 27 °C in ergänztem Grace-Medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS) unter Zugabe von 10 % definiertem fetalem Rinderserum (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT) vermehrt. Monolagenkulturen für einige Expressionsuntersuchungen und Plaqueassays wurden durch Impfen der in Suspension vermehrten Zellen in Gewebekulturkolben mit den für die Anwendungen angezeigten Dichten erhalten.
Rekombinante Baculoviren wurden durch Cotransfizieren von Sf21-Zellen in einer Monolagenkultur (näherungsweise 2 × 10⁶ Zellen in einem 25 cm³ Kolben) mit 0,5 mg linearisierter AcNPV-DNA (Baculogold^®, PharMingen, San Diego, CA) und 2 mg von einem der vier vorstehend beschriebenen Vektoren (nachstehend in Tabelle II aufgelistet) unter Verwendung von Insectin^® Liposomen, entsprechend dem bereitgestellten Protokoll von InVitrogen (San Diego, CA), hergestellt. Der resultierende Kulturüberstand, der vor allem rekombinante Baculoviren enthielt, wurde 2–5 Tage später geerntet und zum Anlegen von Plaqueplatten des extrazellulären Virus verwendet.
TABELLE II
Sf21-Zellen wurden auf 60 mm Kulturschalen (2 × 10⁶ Zellen/Schale) geimpft und während einer Stunde mit 1 ml 10-facher serieller Verdünnungen des Überstands der Cotransfektionskultur (10^–2 bis 10^–5) infiziert und nachfolgend mit 4 ml einer 1:1 Mischung aus 2× ergänztem Grace-Medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) und 2 Seakem-Agarose (FMC BioProducts, Rockland, ME) überschichtet. Mutmaßliche rekombinante Plaques wurde 5–7 Tage später durch visuelle Untersuchung auf Einschluß-Körper-negative Plaques unter Verwendung von sowohl einer Dissektion als auch einem Umkehrphasenmikroskop nach 7 Minuten Färben mit 0,05 % Neutralrot in Dulbeccos PBS identifiziert. Durch Hybridisierung von [32]P-markierten 30 kDa oder 80 kDa humanen Calpain I-Sequenzen an Blots von infizierten Zelllysaten wurde bestätigt, dass die Plaques rekombinant sind (Summers und Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricul tural Experiment Station Bulletin 1555:1-57, 1987). Dann vergrößerte man die Menge an rekombinantem Virus für die ersten zwei Durchgänge in Monolagen Sf21-Kulturen mit nachfolgenden Virusdurchgängen (minimal drei bis maximal fünf) unter Verwendung von Sf21-Kulturen. Alle Viruszunahmen wurden durch Infizieren von Sf21-Zellen mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von weniger als 0,5 und Sammeln des Mediums, das die extrazellulären Virusteilchen enthielt, 3–4 Tage nach der Infektion ausgeführt.
Sieben unabhängige Plaque-reinen rekombinanten Viren (rekombinante Viren sind mit AcNPV-hCANP30-1 bis beziehungsweise –7 bezeichnet) wurden von der Transfektion der Zellen mit pVL-hCANP30-6 isoliert. AcNPV-hCANP30-5 wurden am 2. Juni 1994 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776 (hier nachfolgend „ATCC") hinterlegt und trägt die ATCC-Bezeichnung ATCC VR 2459. Aus der Transfektion von Zellen mit pVLhCANPI80-4 wurden sechs unabhängige Plaque-reine rekombinante Viren (rekombinante Viren sind mit AcNPV-hCANPI80-1 bis beziehungsweise –6 bezeichnet) isoliert, wobei alle davon nur die DNA für die 80 kDa Untereinheit enthielten. AcNPV-hCANPI80-5 wurde am 2. Juni 1994 bei der ATCC hinterlegt und trägt die ATCC-Bezeichnung ATCC VR 2457. Aus den Cotransfektionen der Zellen mit p51-hCANPI-1 und p51-hCANPI-2 wurden zwölf unabhängige Plaque-reine rekombinante Viren (mit AcNPV-hCANPI-1-2, 1–5, 1–7 und 1–8 und AcNPV-hCANPI-2-1 bis beziehungsweise 2–8 bezeichnet) isoliert. Von den 12 isolierten rekombinanten Viren enthielten nur 5 die DNA für sowohl die 30 kDa als auch die 80 kDa Untereinheit. Diese 5 rekombinanten Viren waren AcNPV-hCANPI-1-5, AcNPChCANPI-1-7, AcNPV-hCANPI-1-8, AcNPV-hCANPI-2-3 und AcNPV-hCANPI-2-5. AcNPV-hCANPI-2-5 wurde am 2. Juni 1994 bei der ATCC hinterlegt und trägt die ATCC-Bezeichnung ATCC VR 2458. Die achtzehn ausgewählten erhaltenen rekombinanten Viren wurden dann auf ihre Fähigkeit, das Calpainprotein zu exprimieren, untersucht. Alle Hinterlegungen wurden untern den Bedingungen des Budapestervertrags für die International Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren durchgeführt. Alle Hinterlegungen wurden durch die ATCC geprüft und zum Zeitpunkt der Hinterlegung als lebensfähig bestimmt.
Beispiel 4
Expression und Rückgewinnung von rekombinantem Calpain des Baculoviruses
In Platten mit 24 Vertiefungen wurden Sf21-Zellen mit 1,5 × 10⁵ Zellen/cm³ in mit 10 % fetalem Rinderserum ergänztes Grace-Medium geimpft. Nach der Zellanhaftung wurde Virus (siehe nachstehend die spezifischen Virusbezeichnungen) mit einer MOI von zwischen 1 und 5 zugegeben. Die Zellen wurden manchmal nach 24 Stunden geerntet. Mit dem vorliegenden Expressionssystem wurde eine optimale Ausbeute mit einer Ernte zwischen 26–48 Stunden nach der Infektion erreicht. Für die Ernte wurde ein Lysepuffer mit 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 μg/ml Leupeptin und 0,1 % NP-40, pH-Wert 7,4 verwendet, gefolgt von Zentrifugieren der Homogenate in einem Eppendorfröhrchen mit 14000 × g während 10 Minuten bei 4 °C und Gewinnen von Calpain und anderen Zellproteinen. Die Proteine wurden durch Zugeben von 0,2 % SDS und Erhitzen der Proben während 5 Minuten bei 95 °C denaturiert. Dann wurden die Proben vor der Analyse bei – 70 °C gelagert.
Das exprimierte und gewonnene Calpain wurde durch Immunoblotanalyse folgendermaßen untersucht. Zehn bis zwanzig Mikrogramm des gesamten Proteins wurden durch SDS-PAGE (Laemmli, 1970) unter Verwendung von 10 % oder 12,5 % Acrylamidgele getrennt und auf 0,45 mm Nitrocellulose (Bio-Rad, Melville, NY) durch das Verfahren von Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354 (1979) übertragen. Das Calpainprotein wurde unter Verwendung von polyklonalem Anti-Calpainserum mit einer Verdünnung von 1:1000, das beide Untereinheiten nachweist, spezifisch nachgewiesen (Siman et al., J. Neurosci. 10:2400-2411, 1990). Das Antiserum wurde in 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, mit 150 mM NaCl und 5 % fettreier Nelkentrockenmilch (Blockierungspuffer) verdünnt. Unspezifische Antikörperbindungen wurden durch Waschen mit 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, mit 150 mM NaCl und 0,05 % Tween-20 entfernt. Dann wurde alkalisches Phosphatase-konjugierter Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Bio-Rad, Melville, NY) 1:1000 in Blockierungspuffer verdünnt zugegeben. Der sekundäre Antikörper wurde unter Verwendung des alkalische Phosphatase-konjugierten Substratkits (Bio-Rad, Melville, NY) nachgewiesen. Die Ergebnisse für die rekombinanten Viren AcNPV-hCANP30-5, AcNPV-hCANPI80-5 und AcNPV-hCANPI-2-5 sind in 4 gezeigt.
Die Expression der geeigneten einzelnen Calpainuntereinheit, die nur aus den mit den AcNPV-hCANP30-5- und AcNPV-hCANPI80-5-Viren infizierten Zellen resultierte, ist in den Spuren 2–3 beziehungsweise 4–5 dargestellt. Werden die Zellen mit zwei Viren coinfiziert, wobei einer das DNA-Konstrukt für die 30 kDa Calpainuntereinheit (AcNPV-hCANP30-5) enthält und die andere das DNA-Konstrukt für die 80 kDa Calpainuntereinheit (AcNPV-hCANPI80-5) enthält, so werden beide geeigneten Calpainuntereinheiten exprimiert. Dies ist in den Spuren 6–8 dargestellt. Werden entsprechend Zellen mit AcNPV-hCANPI-2-5 infiziert, das das DNA-Konstrukt für sowohl die 30 kDa als auch die 80 kDa Calpainuntereinheiten enthält, infiziert, werden beide Untereinheiten exprimiert (Spuren 9–10). Die Fähigkeit eines Anti-Calpainserums zum Nachweisen des rekombinanten Proteins bestätigte, dass das authentische Calpainprotein hergestellt wurde. Die Spur 1 stellt die Infektion mit dem Wildtyp-Virus dar. Es wurde keine Calpainexpression nachgewiesen.
Überraschenderweise wurde die angesammelte Menge der 80 kDa („katalytischen") Untereinheit durch Coexpression mit der 30 kDa („regulatorischen") Untereinheit, entweder durch Coinfektion der Zellen mit AcNPV-hCANP30-5 und AcNPV-hCANP80-5 (Spuren 6–8) oder durch Expression des doppelten Konstrukts AcNPV-hCANPI-2-5 (Spuren 9–10), im Vergleich zu der Expression in Abwesenheit der 30 kDa Unterinheit (Spuren 4–5) unerwartet erhöht (entsprechend der Bestimmung durch visuelle Untersuchung). Die frühere Forschung über die Rolle der 30 kDa Untereinheit würde es nicht gestatten, diese stabilisierende Wirkung auf die andere Untereinheit vorherzusagen.
Die Analyse aller AcNPV-hCANP30 und AcNPV-hCANP80 rekombinanten Viren in derselben Weise wie vorstehend zeigte vergleichbare Expressionsgehalte ihrer entsprechenden Untereinheiten (Daten sind nicht gezeigt). Obwohl alle fünf Virusisolate von AcNPV-hCANPI, die beide Calpainuntereinheiten enthielten, die unversehrte 80 kDa Untereinheit exprimierten, misslang es vier der isolierten Viren (das heißt AcNPV-hCANPI-1-5, AcNPV-hCANPI-1-7, AcNPV-hCANPI-1-8 und AcNPV-hCANPI-2-3) ebenfalls nachweisbare Mengen der 30 kDa Calpainuntereinheit zu exprimieren (Daten sind nicht gezeigt). Die Abwesenheit der 30 kDa Untereinheit wurde weiterhin durch den verringerten Expressionsgehalt der 80 kDa Untereinheit offensichtlich, was zum dem vergleichbar ist, was mit den AcNPV-hCANPI80-Viren beobachtet wurde und im Gegensatz zu dem mit den Coinfektionen von AcNPV-hCANP30 und AcNPV-hCANPI80 und mit der Infektion mit AcNPV-hCANPI-2-5 beobachteten erhöhten Gehalt steht. Auf das Vorkommen eines Selektionsdruck gegen die Insektenzellenexpression der gesamten Calpainprotease mit zwei Untereinheiten weist darauf hin, dass nur 5 von 12 der Viren mit doppelten Untereinheiten nach Rekombination und Selektion der rekombinanten Viren noch DNA-Sequenzen für beide Untereinheiten enthielten und, dass von diesen 5 nur einer gefunden wurde, der beide Proteinuntereinheiten coexprimierte. Dieses könnte eine Folge der Tödlichkeit von Calpain sein.
Die in 4 sichtbaren zusätzlichen Banden um die Banden der 80 kDa Untereinheit sind ein Ergebnis der autolytischen Enzymaktivität. Die in den Spuren 6–8 sichtbaren zwei Banden stellen die 80 kDa beziehungsweise die aus der Autolyse resultierenden 76 kDa Formen dar. Zwei Banden werden ebenfalls auf dem Blot in den Spuren 9 und 10 beobachtet, jedoch könnten sie in der Figur nicht sichtbar sein. In den Spuren 4 und 5 sind sogar drei Banden sichtbar. Zusätzlich zu den 80 kDa und den aus der Autolyse resultierenden 76 kDa Formen bildet sich bei niedriger Enzymkonzentration ein stabiles Zwischenprodukt von 77 kDa Formen, und über dieses wurde früher berichtet, dass es sich bei Autolyse der großen Untereinheit in einem mit Calcium unter verdünnten Bedingungen inkubierten Calpain I Heterodimer bildet. (Inomata, et al., J. Bio. Chem., 263:1973-1987, 1988.) Wie aus 4 hervorgeht, liegt das meiste gewonnene rekombinante humane Calpain in der 80 kDa Form vor, die für den Fall von Calpain in Anbetracht der möglichen Tödlichkeit für das System erwünscht ist. Da Calpain in Gegenwart von Calcium zu der aktiven Form autolysiert ist für die Aktivierung keine gesonderte Behandlung als das Zugeben von Calcium erforderlich.
Beispiel 5
Enzymaktivität von rekombinantem Calpain des Baculoviruses
Wiederum wurden in Platten mit 24 Vertiefungen Sf21-Zellen mit 1,5 × 10⁵ Zellen/cm³ geimpft und mit entweder dem Wildtyp-Virus infiziert, mit sowohl AcNPV-hCANP30-5 als auch AcNPV-hCANPI80-5 (MOI von 5 für jeden Virus) coinfiziert oder mit AcNPV-hCANPI-2-5 (MOI=5,7) infiziert. Die intrazellulären Proteine wurde 40 Stunden nach der Infektion mit 100 μl/Vertiefung des folgenden Lysepuffers: 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 % Triton-100, gefolgt von 10 Minuten Zentrifugieren bei 14000 × g bei 4 °C zum Pelletisieren der Kerne und einiger Membranen, geerntet. Die in vitro Enzymaktivität von 20 μl jeden Extrakts (12,5–20 μg gesamtes Protein) wurde unter Verwendung des synthetischen Peptidsubstrats Succinyl-Leucin-Tyrosin-Aminomethylcumarin (Succ-Leu-Tyr-AMC) mit einer Konzentration von 1 mM mit und ohne Zugabe von 5 mM CaCl₂, entsprechend dem Verfahren von Sasaki et al., J. Biol. Chem., 259:12489-12494 (1984) gemessen. Die erhaltene Aktivität wurde mit der Enzymaktivität von 2 μg teilweise gereinigtem nativen humanem Calpain I, das entsprechend dem Verfahren von Siman et al., s.o. hergestellt worden war, verglichen.
Die Aktivität in Gegenwart von Calcium wurden ebenfalls durch Zugeben von 12,5 μM Calpaininhibitor I, entsprechend dem von Sasaki et al., s.o. offenbarten Verfahren, gemessen. Die Ergebnisse sind in den 5a–d dargestellt. In den 5a–d stellen die nicht gefüllten Kreise die Aktivität ohne vorhandenes Calcium dar. Ausgefüllte Rauten stellen die Aktivität mit vorhandenem Calcium dar. Quadrate mit Kreuzen stellen die Aktivität mit vorhandenem Calcium und Calpaininhibitor I dar. Die Daten in den 5a–d zeigen 1) eine Calcium-abhängige Zunahme in der Substrathydrolyse durch natives humanes Calpain I, das durch den Calpaininhibitor I gehemmt wird (5a), 2) keine endogene Calcium-abhängige Substrathydrolyse in Zellen, die mit dem Wildtyp-Virus infiziert sind (5b), und 3), dass in Zellen, die entweder mit AcNPV-hCANP30 und AcNPV-hCANP80 coinfiziert sind (5c) oder nur mit AcNPV-hCANPI-2-5 infiziert sind (5d), es eine Calcium-anhängige Zunahme in der Substrathydrolyse gibt, die ebenfalls durch den Calpaininhibitor I gehemmt wird, genau wie es mit dem nativen Enzym sichtbar ist. Basierend auf diesen Ergebnissen weist das rekombinant hergestellte Calpain dasselbe Enzymaktivitätsprofil wie natives Calpain auf. Dies ist wiederum für eine wirkungsvolle Verwendung des rekombinanten enzymatisch aktiven Calpains zum Screenen möglicher Calpaininhibitor-Therapeutika wichtig.
Beispiel 6
Autolytische Enzymaktivität des rekombinanten Calpains des Baculoviruses
Die autolytische Enzymaktivität des rekombinanten Calpains wurde dargelegt, indem gezeigt wurde, dass das rekombinante Calpain die 80 kDa Untereinheit zu der „aktivierten" 76 kDa Form richtig autoprozessierte. Die 76 kDa Form wird in Gegenwart von Calcium durch autolytische Spaltung erzeugt und weist auf ein aktives Enzym hin. Lysate von Zellen, die entweder mit dem Wildtyp-AcNPV infiziert, mit sowohl AcNPV-hCANP30-5 als auch AcNPV-hCANPI80-5 coinfiziert oder mit AcNPV-hCANPI-2-5, infiziert sind und in Beispiel 5 hergestellt wurden, wurden mit oder ohne Zugabe von 6,7 mM CaCl₂ während 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Reaktion durch Zugeben von 6,7 mM EDTA und Sieden der Proben in SDS-PAGE-Gel-Beladungspuffer vor Lagerung bei –70 °C abgebrochen wurde. Die PAGE-Ergebnisse der Präparate sind in den 6a und b dargestellt. In den 6a und b ist das Vorhandensein und die Abwesenheit von Calcium mit „+" beziehungsweise „–" angezeigt. 6a stellt einen Anti-Calpain I Immunoblot mit und ohne in vitro Calcium-Inkubation dar. Das verwendete AB#4 Antiserumpräparat wurde gegen gereinigtes natives Calpain erzeugt. Es weist vor allem die 80 kDa Untereinheit nach, obwohl es ebenfalls das autolytische 76 kDa Spaltungsprodukt binden kann. Die Spuren 1 und 2 enthalten die teilweise gereinigte 80 kDa Untereinheit von nativem humanen Calpain I (gereinigt aus menschlichen roten Blutzellen, wie vorher beschrieben ist, siehe Kitahara, et al., s.o.). Die Spur 3 enthält den Proteinteil aus Zellen, die mit dem Wildtyp-Virus infiziert sind. Die Spuren 4 und 5 stellen die Proteinfraktion aus Zellen dar, die mit AcNPV-hCANP30-5 und AcNPV-hCANPI80-5 cotransfiziert sind. Die Spuren 6–7 steilen die Proteinfraktion aus Zeilen dar, die mit AcNPV-hCANPI-2-5 transfiziert sind. In Abwesenheit von zugegebenem Calcium weisen die Spuren 4 und 6 zwei immunreaktive Banden auf. Die Spur 1 (das von menschlichen roten Blutzellen gereinigte native humane Calpain I) weist nur eine Bande auf. Die oberen Banden der Spuren 4 und 6 wandern zusammen mit der 80 kDa Untereinheit des nativen teilweise gereinigten humanen Eythrozyten-Calpain I und die niedrigeren Banden wandern zusammen mit dem 76 kDa nativen menschlichen Calpain I, das mit Calcium inkubiert worden war (Spur 2). Die niedrigeren Ban den, die sogar in Abwesenheit von Calcium vorhanden sind, scheinen endogen aktiviertes Calpain zu sein, vermutlich aufgrund des intrazellulären Zuflusses von Calcium aus dem Medium, da manche Zellen während der Infektion durchlässig werden. In allen Proben, die mit Calcium inkubiert wurden, wird eine einzelne Bande nachgewiesen (Spuren 2,5 und 7) und sie wandert zusammen mit der Bande von 76 kDa nativem humanen Calpain I (Spur 2), das ebenfalls mit Calcium inkubiert worden ist.
Die Daten in 6b zeigen, dass das Proteinwandern als 76 kDa Bande das richtig gespaltene authentische 76 kDa autokatalytische Fragment darstellt. 6b enthält die Ergebnisse einer Immunoblotanalyse derselben Proben wie in 6a, außer, dass der verwendete AB#34-Antikörper gegen die ersten fünf Aminosäuren an dem N-Ende des 76 kDa Fragments erzeugt wurde (Anti-LGRHEC), (Saldo et al., J. Biochem. 111:81-96 (1992)). Dieser Antikörper erkennt spezifisch nur das richtig gespaltene native humane Enzym (das heißt 76 kDa, Spur 2) und nicht das unversehrte 80 kDa Calpain I (Spur 1). Sowohl die kleinen Mengen der großen Untereinheit des endogen gespaltenen rekombinanten Calpain I als auch die einzelne reichlich vorhandene 76 kDa Bande werden nach Zugabe von Calcium durch dieses Antiserum nachgewiesen. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass die gesamte Menge der rekombinanten 80 kDa Proteinuntereinheit in der Lage ist, durch die Zugabe von Calcium autokatalytisch aktiviert zu werden und, dass die aktivierte Untereinheit richtig gespalten ist.
Beispiel 7
Verbesserte Expression in serumfreiem Medium
Für die Baculovirus-Expression rekombinanter Proteine werden aufgrund der größeren Einfachheit in der Handhabung großer Zahlen von Zellen im Vergleich zu den Monolagenkulturen routinemäßig Spinnerkulturen von Insektenzellen verwendet. Es wurde ein Vergleich zwischen der Herstellung von Calpain in Sf21-Zellen, die in mit 10 % definiertem fetalen Rinderserum ergänztem Grace-Medium vermehrt worden waren, und der Herstellung von Calpain in Sf21.Zellen, die durch serielle zweifache Verdünnungen an serumfreies Medium zum Vermehren in ExCell-401 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) angepasst worden waren, durchgeführt. Sf21-Zellen der loga rithmischen Wachstumsphase, die in den beiden Medien vermehrt worden waren, wurden mit 150 × g während 10 Minuten zum Pelletisieren der Zellen zentrifugiert und mit 10⁷ Zellen pro ml in ihrem Wachstumsmedium, das den AcNPV-hCANPI-2-5-Virus mit MOI=2 enthielt, resuspendiert. Die Zellen zuzüglich des Viruses wurden bei Raumtemperatur während 1 Stunde unter gelegentlichem vorsichtigen Resuspendieren der Zellen von Hand inkubiert. Die gesamte Mischung wurde zu dem geeigneten Medium in 250 ml Spinnerkolben (Techne, Inc., Princeton, NJ) gegeben, um ein Endvolumen von 100 ml mit einer Zelldichte von 1,5 × 10⁶ Zellen pro ml zu erreichen. Für jedes Medium wurden zweifache Infektionen bei 27 °C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 80 Upm für die Serum-enthaltenden Kulturen und mit 100 Upm für die serumfreien Kulturen inkubiert. Von den Kulturen wurden nach 24 Stunden und 48 Stunden Proben genommen.
Im Anschluß an das Pelletisieren der Zellen durch Zentrifugieren mit 150 × g während 10 Minuten, dem Resuspendieren in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (Mediatech, Inc., Herndon, VA) und dann wiederum Zentrifugieren mit 150 × g während 10 Minuten wurden die Proben geerntet, um die Messung der Enzymaktivität, wie in Beispiel 5 beschrieben ist, zu gestatten. Die gesamten Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bio-Rad-Proteinassays (Bio-Rad Laboratories, Inc., Melville NY) entsprechend dem bereitgestellten Protokoll mit Rinderserumalbumin als Proteinbezugsstandard gemessen. Die serumfrei angepassten Zellen wiesen unerwartet niedrige Gehalte an rekombinantem Calpainprotein und an Aktivität nach 24 Stunden, jedoch unerwartet höhere Gehalte, als die Serum-Kulturen nach 48 Stunden auf (7). Bedeutender ist, dass es proportional weniger des aktivierten 76 kDa Proteins nach 48 Stunden in den serumfreien Kulturen in Vergleich zu den Serum-enthaltenden Kulturen gibt (Daten sind nicht gezeigt). Die größere Menge an aktiviertem Calpain nach 48 Stunden in den Serum-enthaltenden Kulturen ermöglichte es, unversehrtes nicht aktiviertes Calpain zu diesem Zeitpunkt zu reinigen (Daten sind nicht gezeigt), dementsprechend gestattete die Verwendung des serumfreien Mediums für die Expression eine Zunahme um das 3–4 fache in der Ausgangskonzentration an rekombinantem Calpain zur Reinigung im Vergleich zu dem Gehalt bei 24 Stunden in den Serum-enthaltenden Kulturen.
Beispiel 8
Enzymatische Aktivität der unabhängigen 80 kDa Untereinheit Zum Bestimmen der relativen Aktivität der rekombinant erzeugten 80 kDa Untereinheit wurde die enzymatische Aktivität der Untereinheit in nicht fraktionierten Extrakten von Sf21-Zellen, die mit AcNPV-hCANPI80-5 infiziert waren, untersucht. 1,5 × 10⁸ Sf21-Zellen wurden durch Zentrifugieren mit 150 × g pelletisiert, das Medium entfernt, dann mit 3 × 10⁸ pfu AcNPV-hCANPI80-5-Virus in 10 ml mit fetalem Rinderserum ergänztem Grace-Medium resuspendiert und während 1 Stunde bei 27 °C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Zellen zuzüglich dem Medium und dem Virus zu 90 ml desselben Mediums zugegeben und bei 27 °C in einem 250 ml Spinnerkolben während 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden wie in Beispiel 5 geerntet und das Extrakt wurde bezüglich der enzymatischen Aktivität, wie ebenfalls in Beispiel 5 beschrieben ist, untersucht. Die Ergebnisse von 33 μg nicht fraktioniertem Extrakt sind in 8 dargestellt. In 8 stellen die nicht gefüllten Quadrate die Aktivität ohne vorhandenes Calcium dar. Nicht gefüllte Rauten stellen die Aktivität mit vorhandenem Calcium dar. Nicht gefüllte Kreise stellen die Aktivität mit Calcium und vorhandenem Calpaininhibitor I dar. Dann ließ man dieselbe Menge an Enzymaktivität für sowohl die rekombinante 80 kDa Untereinheit als auch das rekombinante Calpain auf SDS-PAGE laufen und die Menge wurde von jedem qualitativ durch Immunoblotanalyse, wie vorstehend in Beispiel 4 beschrieben ist, bestimmt. Entsprechend der Bestimmung daraus, wird näherungsweise 4 bis 5 mal mehr an isoliertem 80 kDa Protein benötigt, um die gleiche Aktivität wie bei dem Heterodimerprotein zu ergeben. Folglich wurde experimentell bestimmt, dass die spezifische Aktivität des 80 kDa rekombinanten Calpain I näherungsweise 20–25 % von der des heterodimeren Calpain I beträgt. Dies ist näherungsweise das siebenfache von der der aus nativem Calpain I dissoziierten 80 kDa Untereinheit (Kikuchi et al., s.o.). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die Aktivität durch 12,5 μM Calpaininhibitor I, welcher das Heterodimerenzym ist, vollständig gehemmt wird (8).
Beispiel 9
Reinigung von rekombinantem enzymatisch aktiven Calpain
Wie nachstehend offenbart ist, wurde rekombinantes Calpain in vier Schritten, einschließlich drei chromatographischer Schritte, auf eine Reinheit von 94 % gereinigt, entsprechend der Umkerhphasen-HPLC-Analyse. Die Zellkultuvierungsbedingungen waren dieselben von Beispiel 7. Die Zellen wurden in einer Lösung, die 10 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 5 mM β-Mercaptoethanol, 5 mM Pepstatin, 0,1 mM PMSF und 10 mg/ml Aprotinin, pH-Wert 7,5 enthielt, lysiert und unter Verwendung eines 40 ml Dounce-Homogenisators (Wheaton, Millville, NJ) homogenisiert. Dann wurde das Material mit 2100 × g während 10 Minuten zum Pelletisieren der Kerne zentrifugiert, gefolgt von Zentrifugation mit 38700 × g während 1 Stunde zum Pelletisieren der Membranen. Der Überstand wurde mit Ammoniumsulfat gefällt und die Proteine, die zwischen 30 bis 45 % Ammoniumsulfat ausfielen, wurden in einer Pufferlösung, die 10 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 10 mM NaCl und 5 mM β-Mercaptoethanol, pH-Wert 7,4 enthielt, resuspendiert, über Nacht gegen denselben Puffer dialysiert und dann auf den folgenden Harzen unter Verwendung von Standardtechniken getrennt: Q-Sepharose Fast Flow, gefolgt von Phenyl-Sepharose CL-4B (beide von Pharmacia, Piscataway, NJ), dann Mimetic Red 2 (American International Chemical, Natick, MA). Im Anschluß an diese Technik wurden 5–6 mg hoch gereinigtes Protein aus 1 Liter Zellen isoliert. Eine 15,5-fache Reinigung wurde in drei (3) chromatographischen Trennungen ausgeführt, woraus sich ein Protein mit einem hohen Reinheitsgrad ergab. Die Reinigung von Calpain aus menschlichen Erythrozyten erforderte eine über 22000-fache Reinigung mit vier (4) chromatographischen Schritten (Hatanaka et al., s.o.). Ein Hauptvorteil dieser rekombinanten Expression besteht darin, dass einfach größere Mengen an Calpain gereinigt werden können, im Gegensatz zu der einfachen Durchführung aus nativen Quellen. Für jede Analyse wurde die Enzymaktivität durch Verfolgen der Hydrolysegeschwindigkeit in Gegenwart von Ca²⁺ des synthetischen fluorgenen Substrats Succ-Leu-Tyr-Methoxyl-β-naphthylamin (Succ-Leu-Tyr-MNA), entsprechend dem von Sasaki, T. et al., s.o. verwendeten Verfahren zur Messung der Hydrolyse von Succ-Leu-Tyr-AMC, bestimmt. Die Experimente wurden in Platten mit 96 Vertiefungen (Dynatech Kat # 011-010=7905, 14340 Sullyfield Circle, Chantilly, Virginia 22021) durchgeführt und die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Fluorimeters (Anregung = 340 nm, Emission = 430 nm, Titertek Fluoroskan II Finnland), zum Auslesen von Platten mit 96 Vertiefungen, nachgewiesen.
Beispiel 10
Vergleich der Empfindlichkeiten von nativem und rekombinantem enzymatisch aktiven Calpain gegen Inhibitoren
Natives und rekombinantes enzymatisch aktives Calpain I wurden bezüglich ihrer Empfindlichkeiten gegen eine Anzahl bekannter Calpain I-Inhibitoren verglichen. Zum Bewerten der Inhibitorempfindlichkeiten wurden Stammlösungen (40-fach konzentriert) von jedem zu testenden Inhibitor in 100 % wasserfreiem DMSO hergestellt und von jedem Inhibitorpräparat wurden 5 μl in jede von drei Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen unter Herstellung von Aliquoten gegeben. Von jedem Enzympräparat wurden Verdünnungen in Assaypuffer hergestellt (das heißt, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA und 5 mM β-Mercaptoethanol, pH-Wert 7,5, einschließlich 0,2 mM Succ-Leu-Tyr-MNA) und von jeder Verdünnung wurden 175 μl unter Herstellung von Aliquoten in dieselben Vertiefungen, die die unabhängigen Inhibitorstammlösungen enthielten, sowie in die Vertiefungen der positiven Kontrollen, die 5 μl DMSO aber keinen Inhibitor enthielten, gegeben. Zum Start der Reaktion wurden zu allen Vertiefungen der Platte mit Ausnahme von drei, die als Kontrollen für Hintergrundssignalgrundlinien verwendet wurden, 20 μl 50 mM CaCl₂ in Assaypuffer gegeben. Die Substrathydrolyse wurde alle 5 Minuten während insgesamt 30 Minuten überwacht. Die Substrathydrolyse war in Abwesenheit von Inhibitor bis zu 15 Minuten linear. Die Geschwindigkeit der Hydrolyse wurde als Änderung in Fluoreszenzeinheiten pro 10 Minuten Zeitintervall zwischen 5 und 15 Minuten bestimmt. Bei jeder getesteten Inhibitorkonzentration wurde die prozentuale Hemmung als prozentuale Abnahme in der Geschwindigkeit der Substrathydrolyse in Gegenwart von Inhibitor gegen die Geschwindigkeit in seiner Abwesenheit bestimmt. Die 50 % Hemmkonzentrations- (IC₅₀) Bestimmungen sind für drei strukturell verschiedene bekannte Calpaininhibitoren – Z-Leu-Phe-CONHEt, Z-Leu-Leu-Phe-CH₂S(+)Me₂Br(–) und Z-Leu-Nle-N – in nachstehender Tabelle III dargestellt. Es ist zu beachten, dass die für jeden Calpaininhibitor gegen rekombinantes humanes Calpain erhaltenen IC₅₀-Werte sich denjenigen annähern, die für das native Enzym gefunden wurden. Die Rangfolge der Inhibitorwirksamkeit war dieselbe. In dieser Bestimmung werden ebenfalls prototypische Inhibitoren von Serin (PMSF) und Asparaginproteasen (Pepstatin A) eingeschlossen. Sowohl die rekombinanten als auch die nativen Enzyme zeigten keine signifikante Hemmung ihrer Aktivitäten durch diese klassenspezifische Inhibitoren, wie durch die Unterschiede in der Größenordung von dem 5-6-fachen in den IC₅₀-Werten, die in Bezug auf die bekannten Calpaininhibitoren erhaltenen wurden, beispielhaft erläutert wird.
Tabelle III Inhibitorprofil
Beispiel 11
Vergleich der Calciumaktivierung von nativem und rekombinantem Calpain
Zur Bestimmung der für die Enzymaktivität erforderlichen Calciumkonzentration wurden Tests im Wesentlichen so durchgeführt, wie sie von Kitahara et al., J. Biochem., 95:1759-1766 (1984) beschrieben wurden. Zuerst wurden Enzympräparate über Nacht gegen 110 mM Imidazol-HCl/1 mM EGTA-Puffer bei pH-Wert 7,3, 5 mM β-Mercaptoethanol enthaltend, dialysiert. Zehnfach konzentrierte Ca²⁺/EGTA-Puffer wurden durch Zugeben variierender Mengen an CaCl₂ zu dem Imidazol/EGTA-Puffer hergestellt. Von jedem Puffer wurden zwanzig μl in drei Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Verdünnungen von dialysiertem Enzym wurden in dem Imidazol/EGTA-Puffer, der 1 mM Succ-Leu-Tyr-MNA enthielt, hergestellt und jedes Präparat wurde zu den die verschiedenen Ca/EGTA-Puffer enthaltenden Vertiefungen gegeben. Die Substrathydrolyse wurde alle 5 Minuten während 30 Minuten gemessen. ½ V_max wurde als die Geschwindigkeit der Substrathydrolyse gemessen, die 50 % der in Gegenwart der variierenden Calciummengen erreichten maximalen Geschwindigkeit betrug. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Der aufgelisteten ½ V_max-Wert ist eine Annäherung von [Ca²⁺] basierend of dem K_d von EGTA für Calcium in diesem Puffer bei der speziellen Ionenstärke, dem pH-Wert und der Temperatur (K_d = 5,5 × 10^–6 M). Die Calciumkonzentration, die erforderlich ist, um ½ V_max zu ergeben, war sowohl für das native Calpain als auch für das rekombinante Calpain der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen dieselbe – das heißt 15 μM beziehungsweise 14 μM. Die [Ca²⁺]-Aktivierungsprofile für sowohl die nativen als auch die rekombinanten Enzyme sind so gut wie identisch. In 9 stellen nicht gefüllte Quadrate mit inneren nicht gefüllten Kreisen rekombinantes humanes Calpain I (rhCANPI) dar. Gefüllte Quadrate mit inneren nicht gefüllten Kreisen stellen natives humanes Calpain I (nhCANPI) dar.
Beispiel 12
Assay für Calpaininhibitoren
Rekombinantes enzymatisch aktives Calpain wird zum Beispiel, wie in vorstehendem Beispiel 9 beschrieben ist, gereinigt. Dann kann das gereinigte Calpain in einem Assay zum Screening möglicher Calpaininhibitoren verwendet werden. Die Assaybedingungen können zu denjenigen, wie sie in den vorstehenden Beispielen 9 und 10 beschrieben sind, ähnlich sein. Zum Beispiel kann Succ-Leu-Tyr-MNA als Substrat verwendet werden. Der Calpaininhibitor I kann als Kontrolle zum Untersuchen der Hemmung von Calpain verwendet werden. Jedoch können andere Substrate und bekannte Inhibitoren verwendet werden. (Siehe Sasaki, s.o.) Proben ohne vorhandenen Calpaininhibitor I können als Kontrollen für die Enzymaktivität verwendet werden. Jede Verbindung, die als Calpaininhibitor getestet werden soll, wird zum Beispiel durch das in Beispiel 10 beschriebene Verfahren, in dem bekannte Inhibitoren untersucht wurden, untersucht. Jedoch können andere Verfahren verwendet werden.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Rekombinantes Baculovirus, welches eine Säuger-Calpain I kodierende cDNA umfaßt.
Rekombinantes Baculovirus nach Anspruch 1, wobei das Baculovirus ein Transfervektor ist.
Verfahren zum Herstellen von rekombinantem Säuger-Calpain, welches (a) das Infizieren von Insektenzellen mit einem rekombinanten Baculovirus, welches eine Säuger-Calpain I kodierende cDNA umfaßt, und (b) das Gewinnen von enzymatisch aktivem Calpain von den Zellen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Baculovirus ein Autographa californica Nuclear-Polyhedrosis-Virus ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Insektenzellen Spodoptera frugiperda-Zellen sind.
Verfahren nach Ansprüchen 3 bis 5, wobei das Calpain humanes Calpain ist.
Verfahren zum Herstellen von rekombinantem Säuger-Calpain, welches (a) das Herstellen von mindestens einem Baculovirus, welches cDNA, die eine Untereinheit von Calpain von etwa 80 kDa kodiert, und cDNA, die eine Untereinheit von Calpain von etwa 30 kDa kodiert, umfaßt, wobei das Calpain Calpain I ist, (b) das Infizieren von Insektenzellen mit dem rekombinanten Baculovirus, (c) das Ernten der Zellen nach mindestens etwa 24 Stunden Inkubation und (d) das Gewinnen von enzymatisch aktivem Calpain von den geernteten Zellen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Baculovirus Autographa californica Nuclear-Polyhedrosis-Virus ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Insektenzellen Spodoptera frugiperda-Zellen sind.
Verfahren zum Herstellen von rekombinantem Säuger-Calpain, welches (a) das Herstellen eines ersten Baculovirus, welches cDNA, die eine Untereinheit von Calpain von etwa 80 kDa kodiert, umfaßt, und eines zweiten Baculovirus, welches cDNA die eine Untereinheit von Calpain von etwa 30 kDa kodiert, umfaßt, wobei das Calpain Calpain I ist, (b) das Infizieren von Zellen mit den ersten und zweiten Baculoviren, (c) das Ernten der Zellen nach mindestens etwa 24 Stunden Inkubation und (d) das Gewinnen von enzymatisch aktivem Calpain von den geernteten Zellen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 10, wobei serumfreies Medium verwendet wird.
Verfahren nach Ansprüchen 7 bis 11, wobei das Calpain humanes Calpain ist.
Baculovirus nach Anspruch 1, wobei das Calpain humanes Calpain ist.
Baculovirus nach Anspruch 1, wobei das Baculovirus eine cDNA, die eine Untereinheit von Calpain von 80 kDa kodiert, und eine cDNA, die eine Untereinheit von Calpain von 30 kDa kodiert, umfaßt.