DE69532798T2

DE69532798T2 - Präparierung von knochen für die transplantation

Info

Publication number: DE69532798T2
Application number: DE69532798T
Authority: DE
Inventors: Smith Brenda MORSE; D. Clement DIOH
Original assignee: Osteotech Inc
Current assignee: Osteotech Inc
Priority date: 1994-01-21
Filing date: 1995-01-23
Publication date: 2005-03-17
Anticipated expiration: 2015-01-24
Also published as: JPH09508040A; AU689227B2; NO962874D0; WO1995019797A1; EP0740555A1; EP0740555A4; NO311007B1; ATE262930T1; MX9602719A; DE69532798D1; CN1143913A; EP0740555B1; BR9506498A; AU1833295A; NO962874L; ES2216008T3; CA2180447A1; US5513662A; CA2180447C

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Verarbeiten von Knochen zur Transplantation. Insbesondere ist die Erfindung auf die Bereitstellung von dekontaminiertem Knochen, dessen Transplantation die Aussetzung des Transplantatempfängers gegen kontaminierende Pathogene oder immunogenes Material erheblich minimiert, gerichtet.
Stand der Technik
Die Beschaffung und das Verarbeiten eines menschlichen Knochens zur Transplantation ist eine komplizierte Aufgabe, die aufeinander abgestimmte Anstrengungen mehrerer Gruppen, umfassend die Familie des Spenders, das Krankenhauspersonal, den ansässigen Beschaffungsverbund, das blutprobenverarbeitende Labor, das knochenverarbeitende Labor, den Transplantationspatienten und das Transplantationsteam, erfordert.
Ein Hauptgesichtspunkt ist das Minimieren des Risikos des Übertragens von möglicherweise gefährlichen Krankheiten auf Gewebeempfänger. Tatsächlich stellt das Bereitstellen von Knochengewebe, das sicher für die Transplantation ist, eine sehr spezielle Herausforderung dar, da immunogenes Material und auch Mikroorganismen und Viren tief in der inneren Matrix von Knochenproben gefunden werden können.
In diesem Hinblick können vom verarbeitenden Labor Blutproben auf eine Vielzahl von bekannten infektiösen Krankheitserregern analysiert werden, umfassend beispielsweise

menschlicher Immunschwächevirus (HIV-1)
menschlicher Immunschwächevirus (HIV-2)
menschlicher T-Zell-Leukämievirus (HTLV-1)
Hepatitis B
Hepatitis C
Zytomegalie-Virus (CMV)
Treponema pallidum (Syphilis)

Bezüglich der ernsten klinischen Konsequenzen, die aus dem Transplantieren von kontaminierten Knochen hervorgehen, siehe beispielsweise Kakaiya et al., „Tissue transplant-transmitted infections", Transfusion 31 (3), 1277-284, 1991; Shutkin, „Homologous-serum hepatitis following use of refrigerated bone-bank bones, report of a case", Journal of Bone and Joint Surgery, 16-A(1), 160-162, 1954. Die Übertragung des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) durch Knochen sowie Knochenmark wurde ebenfalls berichtet. „Transmission of HIV through bone transplantation case report and public health recommendations" Novbid. Mortal. Weekly Rep., 37, 597-599, 1988; Furlini et al., „Antibody response to human immunodeficiency virus after infected bone marrow transplant", Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 7(5) 554-665, 1988. HIV wurde sowohl aus frischem als auch aus gekühltem Knochen und gefriergetrocknetem Knochen kultiviert. Buck et al. „Human immunodeficiency virus cultured from bone. Implications for transplantation", Clin. Ortho., 251, 249-253, 1990. Außerdem ist aufgrund der ernst zu nehmenden Möglichkeit der Übertragung von HIV und Hepatitis B der Schutz des Laborpersonals in dem knochenverarbeitenden Labor ein großes Anliegen.
Eine weitere und sehr wichtige Überlegung bezüglich der Ausgestaltung von knochenverarbeitenden Verfahren ist das Vermeiden oder Minimieren einer Immunantwort (einschließlich Transplantatabstoßung) bei dem Empfängerpatienten gegenüber Spender-Makromolekülen, die in dem transplantierten Knochen verblieben sind, beispielsweise Kollagene und Zelloberflächenantigene des Haupthistokompatibilitätskomplexes oder andere Glykoproteine. Vergleiche beispielsweise Friedlander und Horowitz, Orthopedics, 15(10), 1171-1175 (1992), und Mankin, et al., ebd., 1147-1154.
Dementsprechend gibt es einen großen Bedarf für knochenverarbeitende Verfahren, die das Risiko einer immunologischen Antwort des Empfängers oder die Krankheitsübertragung, die mit der Verwendung und Herstellung und Beschaffung von transplantierbarem Knochen einhergeht, verringert. In diesem Hinblick ist es auch wichtig zu erkennen, dass selbst wenn Spender-Screening-Verfahren im Stand der Technik angewendet werden, neuere Infektionen in einem bestimmten Spender nicht nachgewiesen werden können und dadurch die Bedeutung von verbessertem Reinigen und dekontaminierenden Behandlungen, die prophylaktischen Schutz gegen mögliche oder bisher nicht nachgewiesene infektiöse Krankheitserreger bieten, unterstreichen.
Die Kombination von Spender-Screening und antibiotischen Behandlungen, die üblicherweise während des Knochenverarbeitens angewendet wird, vermindert, beschränkt aber nicht bis zu einem annehmbaren Grad das Risiko der Übertragung von bekannten viralen Verunreinigungen und einer Vielzahl von Bakterien. Siehe beispielsweise Scarborough, N.L., Orthopedics, 15(10) 1161-1167 (1992) und Malinin, T.I., „Acquisition and Banking of Bone Allografts", in Bone Grafts and Bone Substitutes, Habal und Reddi, Herausgeber, Kapitel 19, Seiten 206-225, W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA (1992). Wie vorstehend erwähnt, bieten die zur Zeit verfügbaren Verfahren keinen prophylaktischen Schutz gegenüber Viren, ausgewählten Bakterien und Pilzen, die eine allgemeine Flora in Menschen oder in einer Krankenhausumgebung sind. Obwohl die Empfindlichkeit und die Spezifität von Screening-Tests für solche Pathogene hoch sind, sind diese Screening-Tests nicht „narrensicher" und es können falsche Negativantworten hervorgehen, beispielsweise aus niedrigen Antikörperpegeln (z.B. kürzliche Infektion oder Immunschwäche) oder selbst durch Fehler des Laborpersonals. Ferner können Screening-Tests nur brauchbar sein, um bekannte infektiöse Krankheitserreger zu bestimmen. Zusätzlich töten die vorstehend genannten üblicherweise verwendeten antibiotischen, antibakteriellen Cocktails, die zur Zeit in Verwendung sind, nicht alle Typen von Bakterien ab. Beispielweise inaktiviert eine häufig verwendete Polymyxin/Bacitracin-Lösung (50 000 Einheiten Bacitracin/500 000 Einheiten Polymyxin B) nicht Proteus-Spezies. Ferner haben die üblichen antibiotischen Cocktails keine bedeutende Wirkung auf Viren oder Pilze.
Es gibt auch bedeutende Beschränkungen auf das Ausmaß, in dem dekontaminierende Agenzien erfolgreich verwendet wurden, um die Knochenmatrix zu durchdringen und zu dekontaminieren. Siehe Prolo und Oklund, „Sterilization of Bone by Chemicals" in Osteochondral Allografts-Biology, Banking and Clinical Applications, Friedlaender et al., Herausgeber, Kapitel 22, Seiten 233-238, Little, Brown and Company, Boston MA (1983). Knochenmatrix enthält potentiell entfernbare Materialien, beispielsweise Mark, Zellen und Lipid, die den Zugang von dekontaminierenden Agenzien tief in die Knochenmatrix hinein verhindern, in der, wie vorstehend erwähnt, die infektösen Krankheitserreger oder immunogenen Makromoleküle vorhanden sein können.
Einige der Schwierigkeiten, die das Entnehmen von entfernbaren Materialien aus der Knochenmatrix betreffen, wurden gemäß der britischen Patentbeschreibung 964, 545, die im Jahre 1964 veröffentlicht wurde, beschrieben, aber nicht gelöst.
Die '545 Beschreibung beschreibt ein Verfahren zum Verwenden eines Fettlösungsmittels (zum Beispiel einer Chloroform/Methanolmischung) zum Reinigen von Knochen. Dafür wird eine beträchtliche Zeitspanne benötigt, die nicht mit den bevorzugten Knochenbank-Verfahren, wie zum Beispiel schnelles Abgleichen eines Spender-Knochenstücks von geeigneter Größe für einen Empfänger einhergeht. Ein zusätzlich genannter, dem Verfahren innewohnender Nachteil ist, dass das Verfahren anscheinend auf eine bestimmte Folge von Schritten, die in einer bestimmten Reihenfolge durchgeführt werden müssen, beschränkt ist. Wenn das nicht getan wird, wird gesagt, dass immunogene Spender-Proteine wegen einer in situ Denaturierung, die durch das Fettlösungsmittel erzeugt wird, im Knochen verbleiben.
Diese und andere Schwierigkeiten, die mit der Bereitstellung von dekontaminiertem Knochen, der zur Transplantation geeignet ist, verbunden sind, werden bei der Ausführung der Erfindung gelöst.
Die SU 952189 offenbart das Verarbeiten von konserviertem Schwammknochentransplantat vor der Transplantation, umfassend eine Vakuumbehandlung in mehreren Schritten.
Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der die Entdeckung, dass die Veränderung des atmosphärischen Drucks, dem die innere Knochenmatrix während des Reinigens und/oder der Dekontamination ausgesetzt wird, bei der Bereitstellung eines zur Transplantation geeigneten Knochens besonders wirksam ist. Dementsprechend wird ein Verfahren zum Präparieren von Knochen zur Transplantation bereitgestellt, wobei der Knochen eine innere Matrix, die entfernbares Material umfasst, enthält, wobei das Verfahren den Schritt des Kontaktierens des Knochens mit einer Atmosphäre von weniger als Umgebungsdruck umfasst. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren einen weiteren Schritt des Kontaktierens des Knochens oder der Matrix desselben mit einer Lösung, die ein dekontaminierendes Agens oder ein Detergens umfasst.
Typische klinische Indikationen, die mit dem dekontaminierten Knochen, der gemäß der Ausführung der Erfindung hergestellt wurde, behandelt werden können, sind Knie- und Hüftchirurgie und Transplantationen von Oberschenkelknochenköpfen, proximalen Schienbeinknochen und distalen Oberschenkelknochen.
Gemäß der Ausführung der vorliegenden Entwicklung wurde auch bestimmt, dass Lipid in der Knochenmatrix das Reinigen und Dekontaminieren derselben beträchtlich stört. Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung stellt daher ein Verfahren zum Behandeln der inneren Knochenmatrix, die eine vorgegebene Menge von entfernbarem Material enthält, bereit, wobei die Matrix auch eine vorgegebenen Menge von Lipid, das das entfernbare Material beträchtlich immobilisiert, enthält, wobei das Verfahren den Schritt des Kontaktierens der Matrix mit einer Atmosphäre von weniger als Umgebungsdruck für einen Zeitraum, der wirksam ist, um den Lipidgehalt unter die vorgegebene Menge zu verringern, umfasst.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Behandeln von Knochen, der innere Matrix enthält, die eine vorgegebenen Menge von entfernbarem Material mit beträchtlicher Affinität zu dem Knochen umfasst, bereit, wobei das Verfahren den Schritt des Inkontaktbringens der Matrix mit einer Atmosphäre von weniger als Umgebungsdruck und anschließendes Aufrechterhalten des Kontakts mit der Atmosphäre für einen Zeitraum, der wirksam ist, um die Menge an entfernbarem Material unter die vorgegebene Menge zu verringern, umfasst.
Zusätzlich stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, wobei der Knochen einer erhöhten Temperatur vor, während oder nach dem Kontakt mit einer Atmosphäre von weniger als Umgebungsdruck unterworfen wird.
Diese und andere Ausführungsformen, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden entsprechend der genauen Beschreibung der Erfindung beschrieben, die direkt hiernach folgt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Darstellung eines Oberschenkelknochens, die die Stelle von gebohrten Löchern, die geeignet sind, den Zugang zu entfernbarem Material in dem Knochen zu ermöglichen, zeigt.
2 ist eine Darstellung eines Oberschenkelknochenkopfes, die die Stelle von gebohrten Löchern, die geeignet sind, den Zugang zu entfernbarem Material in dem Knochen zu ermöglichen, zeigt.
3 ist eine Darstellung eines Oberschenkelknochenkopfes, die die Stelle von gebohrten Löchern, die geeignet sind, den Zugang zu entfernbarem Material in dem Knochen zu ermöglichen, zeigt.
4 ist eine Darstellung eines rechten Oberschenkelknochens, die die Stelle von gebohrten Löchern, die geeignet sind, den Zugang zu entfernbarem Material in dem Knochen zu ermöglichen, zeigt.
5 ist eine Fotografie, die den verbesserten Knochen, der gemäß der Ausführung der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, zeigt.
Genaue Beschreibung der Stammerfindung
Gemäß der Erfindung wird ein einfaches, sicheres und wirksames Verfahren zum Behandeln von Knochen und zum Geeignetmachen für die Transplantation bereitgestellt, umfassend:

a) Inkontaktbringen des Knochens mit einem umfassenden dekontaminierenden Agens, das wirksam ist, um Bakterien, Pilze, Viren und Parasiten zu inaktivieren;
b) Reinigen des Knochens; und
c) schließlich Dekontaminieren des gereinigte Knochens durch Inkontaktbringen mit einem umfassenden dekontaminierenden Agens, das wirksam ist, um Bakterien, Pilze, Viren und Parasiten zu inaktivieren.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Reinigen von Knochen bereit, das in Schritt b) des Verfahrens, das vorstehend beschrieben wurde, verwendet werden kann und das Inkontaktbringen des Knochens mit Detergens unter Hochdruckwaschbedingungen bei erhöhten Temperaturen umfasst.
Für die Zwecke dieser Offenbarung wird der Begriff „Knochen" im allgemeinsten Sinne verwendet und umfasst alle Typen von menschlichen oder tierischen Knochengeweben, einschließlich ganzen Knochen, Knochenstücke, Knochenblöcke mit haftendem Bindegewebe, wie zum Beispiel Bänder und Sehnen, sowie auch gemahlene Knochenpräparate und gemahlene entmineralisierte Knochenpräparate.
Eine anfängliche oder primäre Dekontamination wird durch Inkontaktbringen des Knochens mit einem umfassenden dekontaminierenden Agens, das wirksam ist, um Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu inaktivieren, durchgeführt.
Die Kontaktzeit sollte ausreichend sein, um die infektiösen Krankheitserreger wirksam zu inaktivieren. Vorzugsweise wird der Knochen in der umfassenden dekontaminierenden Lösung für wenigstens 2 oder mehr Minuten getränkt, vorzugsweise 10 oder mehr Minuten, und am meisten bevorzugt wenigstens eine oder mehrere Stunden. Während dieser primären dekontaminierenden Tränkung kann der Knochen zur Debridierung (engt.: debridement) der Hauptmenge des äußeren Gewebes und des Fetts aus der Lösung entnommen werden und danach wieder in die Lösung zum weiteren Tränken zurückgegeben werden.
Das umfassende dekontaminierende Mittel sollte wirksam sein, um Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu inaktivieren. Vorzugsweise sind dekontaminierende Agenzien Iodophore. Geeignete Iodophore umfassen Polyvinylpyrrolidon-Iod (PVP-I oder Povidon-Iod), wobei Präparate im Handel bei Purdue-Frederick Company, ISP (früher GAF) und BASF erhältlich sind. PVP-I-Präparate, die bei der Ausführung der Erfindung verwendbar sind, umfassen solche mit einem Molekulargewicht von weniger als 20 000, beispielsweise PVP-Iod 17/12 von BASF.
Es wurde bestimmt, dass bevorzugte PVP-Präparate von einem Molekulargewicht von weniger als 100 000 und insbesondere mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 35 000 oder einem k-Wert von etwa 26 – 32 solche sind, wie beispielsweise PVP-Iod 30/06 von BASF.
Alternativ können geeignete Iodophor-Lösungen durch Zusammenmischen einer Lösung des Komplexierungsmittels (Polyvinyl-Pyrrolidon im Falle von PVP-I) mit dem gewünschten Molekulargewicht und molekularem Iod in Mengen, die ausreichend sind, um die erwünschte verfügbare Iodkonzentration zu ergeben, hergestellt werden. Beispielsweise kann eine verfügbare Iodkonzentration von etwa 1 Gew.-% durch Auflösen von 90 g PVP in Wasser, anschließendem Zusetzen von 10 g Iod unter Rühren und letztlich Zusetzen von genügend Wasser, um das Gesamtvolumen auf 1 Liter zu bringen, erhalten werden. Andere Verhältnisse von PVP und Iod können verwendet werden, um eine PVP-I-Lösung zu erhalten, die die erwünschte verfügbare Iodkonzentration bereitstellt. Geeignete verfügbare Iodkonzentrationen sind 0,03 bis 1 Gew.-% Iod in der Lösung, vorzugsweise 0,1 % bis 0,5 %.
Andere dekontaminierende Agenzien, die einen weiten Bereich von infektiösen Krankheitserregern (umfassend Bakterien, Pilze, Parasiten und Viren) inaktivieren, sind Wasserstoffperoxid, Ethanol, Ozon, Ethylenoxid, Bestrahlung und Verwendung der Vorstehenden in Kombinationen, und mit PVP-I.
Die umfassende dekontaminierende Lösung des Agens sollte eine Konzentration, die wirksam ist, um Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu inaktivieren, aufweisen. Die Iodophor-Konzentration einer primären dekontaminierenden Lösung liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 10 % und am meisten bevorzugt von 1 bis 5 Gew.-% mit einer verfügbaren Iodkonzentration von 0,05 bis 1 %, vorzugsweise von 0,1 bis 0,5 Gew.-%. Die PVP-I-Konzentration liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 10 % und am meisten bevorzugt von 1 bis 5 Gew.-% des PVP-I mit einer verfügbaren Iodkonzentration von 0,05 bis 1 %, vorzugsweise von 0,1 bis 0,5 Gew.%.
Die primäre dekontaminierende Lösung kann ein Detergens, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 5 % der Lösung, mehr bevorzugt von 1 bis 3 % und am meisten bevorzugt von 0,1 bis 1 Gew.-% umfassen. Anionische, kationische, amphoterische und nichtionische Detergentien sind geeignet. Bevorzugte Detergentien sind nichtionische Detergentien, beispielsweise Polyethoxyethylenether (z. B. jene, die unter dem eingetragenen Warenzeichen Triton^® von Rhom & Haas durch Union Carbide vermarktet werden) oder die Polyoxyethylensorbitanfettsäureester (Tween Serie, die unter anderen durch ICI und Sigma vermarktet werden). Am meisten bevorzugt ist das Detergens Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100^® Rhom & Haas). Von den Polyoxyethylensorbitanen ist Polyoxyethylen-(20)-Sorbitanmonooleat (Tween^® 80) das am meisten bevorzugte. Vorteilhafterweise wird die primäre Dekontamination durch Tränken des Knochens in einer Lösung von 0,1 bis 5 % PVP-I und 1 Gew.-% Triton X-100^® für wenigstens 2 oder mehr Minuten, vorzugsweise 10 oder mehr Minuten und am meisten bevorzugt von wenigstens einer oder mehr Stunden bewirkt.
Es wurde kürzlich bestimmt, dass ein am meisten vorteilhaftes primäres Dekontaminationsverfahren das Tränken des Knochens in einer Lösung von 1 bis etwa 5 % PVP-I ohne Detergens für wenigstens etwa 1 bis 2 Stunden umfasst. Aufgrund des Verhältnisses von freiem Iod zu komplexiertem Iod bei verschiedenen Konzentrationen von PVP-I wurde bestimmt, dass eine am meisten bevorzugte Modifikation dieses Schritts zuerst das Tränken des Knochens in 5 % PVP-1 für etwa ½ bis 1½ Stunden, gefolgt von einer Debridierung und einem weiteren Tränken in 1 % PVP-I für etwa ½ bis 1½ Stunden umfasst.
Wie Beispiel 1 zeigt, ist der einleitende Dekontaminierungsschritt der Erfindung wirksamer als der antibiotische Cocktail im Stand der Technik. PVP-I ist das bevorzugte dekontaminierende Agens aufgrund seiner schnellen Wirkung, dem breiten Spektrum gegenüber infektiösen Krankheitserregern, die es inaktivieren kann (Viren sowie auch Bakterien, Pilze und Parasiten) und seiner verhältnismäßig niedrigen Toxizität gegenüber menschlichem Gewebe. Ferner wurde für PVP-I gefunden, dass es HIV inaktiviert. Der einleitende Dekontaminierungsschritt schützt nicht nur den Knochenempfänger durch beträchtliches Vermindern des Infektionsrisikos durch den Knochen, sondern es schützt auch das Laborpersonal. Die primäre Dekontaminierungslösung, ob sie PVP-1 oder PVP-1 und Detergens enthält, erleichtert ferner durch anfängliches Lösen und Erweichen des weichen Gewebes, der Lipide und der Blutprodukte das Reinigen des Knochens.
Das Reinigen nach der primären Dekontamination kann durch herkömmliche Verfahren bewirkt werden, wird aber vorzugsweise durch Inkontaktbringen des Knochens mit einem Detergens in einer Weise, sodass Fett, Mark und andere Trümmer entfernt werden, bewirkt. Das Detergens zertstört Zellen (z. B. Blutzellen), löst Fett und solubilisiert Proteine, die das Knochenmark umfassen. Das Reinigungsverfahren kann Bewegung und/oder erhöhte Temperaturen umfassen. Eine heftige Bewegung ist am meisten bevorzugt und kann durch einen Rotationsschüttler bewirkt werden. Ein solches Waschen erzeugt einen Knochen, der vernachlässigbare(s) Mark, Zellen, Fett und Trümmer aufweist und trägt somit durch Entfernen von Zellen, die infektiösen Krankheitserreger beherbergen können, und/oder Biomolekülen, die eine Immunantwort erzeugen können, zu einem zusätzlichen Sicherheitsrahmen für den Transplantatempfänger bei.
Geeignete, bevorzugte und am meisten bevorzugte Detergentien sind die Gleichen wie vorstehend für den primären Dekontaminationsschritt beschrieben. Als Detergenskonzentration wird etwa 0,1 % bis 5 %, bevorzugterweise 1 bis 3 % und am meisten bevorzugt etwa 0,1 bis 1 Gew.-% empfohlen. Obwohl das Iodophor zu dem Detergens, das die Lösung in einer Konzentration von 0,1 bis 10 % enthält, zugegeben werden kann, wurde bestimmt, dass es bevorzugt ist, die Zugabe zu unterlassen.
Am meisten bevorzugt wird der Knochen mit einer Detergenslösung unter Hochdruck-Waschbedingungen bei erhöhten Temperaturen gereinigt. Hochdruck-Waschbedingungen stellen eine Kraft bereit, die ausreicht, um die Reinigungslösung in die innere Knochenmatrix zu treiben. Solche Hochdruck-Waschbedingungen umfassen beispielsweise heftiges Bewegen, wie z. B: mit einem Farbdosenschüttler, oder Hochdruckwaschen, wie z. B. mit einem Hochdruck- (oder Geschwindigkeits-) Flüssigkeitsstrahlstrom. Geeignete Farbdosenschüttler umfassen solche, die von Red Devil hergestellt sind, vorzugsweise Modell # 0-5400-OM (615 Upm und 0,25 PS). Der Druck des Flüssigkeitsstroms beträgt vorzugsweise 100 bis 3 000 psi und am meisten bevorzugt 500 bis 1 500 psi. Am meisten bevorzugt ist, dass der Flüssigkeitsstrom steril ist und Detergens umfasst. Das Reinigen wird deutlich beschleunigt und ist gründlicher, wenn es in einem Temperaturbereich von 20° bis 80°C, und vorzugsweise bei erhöhter Temperatur von 37°C bis 80°C und am meisten bevorzugt bei etwa 50° bis 65°C bewirkt wird. Das Hochdruckwaschen löst wirksam das Mark und entfernt zunehmend die Trümmerteile innerhalb der Spongiosamatrix. Im Anschluss an dieses Hochdruck-Waschverfahren ist der Knochen auffällig sauberer und weißer als ein Knochen, der durch die Standardverfahren behandelt wurde (vergleiche 5).
Um das Reinigen zu beschleunigen, kann die Lösung während des Reinigungsvorgangs ausgetauscht werden, beispielsweise durch Überführen des Knochens in frische Lösung. Vorzugsweise wird die Lösung wenigstens zweimal ausgetauscht. Nach dem Waschen kann das Detergens durch wiederholtes Waschen mit sterilem Wasser endgültig entfernt werden. Ein biologisch-verträglicher Alkohol, wie z. B. Ethanol, kann auch verwendet werden, um das Detergens zu entfernen. Wenn ein Alkohol verwendet wird, muss er durch Spülen mit sterilem Wasser entfernt werden.
Falls Knochenstücke mit anhaftendem Bindegewebe gereinigt werden sollen, sollte das Bindegewebe (beispielsweise Sehnen, Bänder, Menisken) während des Reinigungsverfahrens mit einer sterilen Abdeckung bedeckt werden, wie z. B. einer Plastikhülle oder einem sterilen Tuch, so dass der Kontakt mit dem Detergens verhindert wird.
Der Knochen kann durch Aussetzen gegenüber Wasserstoffperoxid, das auch bakterizide Eigenschaften aufweist, weiter gereinigt und dekontaminiert werden. Nach dem Waschen mit Detergens wird der Knochen in eine 0,5 bis 10 %-ige, vorzugsweise 3 %-ige, Wasserstoffperoxidlösung für einen Zeitraum, der ausreicht, um zusätzliches Weißen und Entfernen von Fettspuren zu ermöglichen, überführt. Bewegung kann angewendet werden. Die Inkubationszeit beträgt geeigneterweise 5 bis 120 Minuten, vorzugsweise 5 bis 60 Minuten und am meisten bevorzugt 15 bis 30 Minuten. Nach der Behandlung wird restliches Peroxid durch ausgedehntes Waschen mit sterilem Wasser entfernt.
Nach dem Reinigen wird der Knochen ein letztes Mal vor dem Verpacken dekontaminiert. Diese Enddekontaminierung wird durch Inkontaktbringen des Knochens mit einem umfassenden dekontaminierenden Agens für mindestens etwa 2 oder mehr Minuten, vorzugsweise mindestens etwa 10 oder mehr Minuten und am meisten bevorzugt für 30 bis 60 oder mehr Minuten bewirkt. Das am meisten bevorzugte umfassende dekontaminierende Agens ist 1 %-iges (Gew.-/Vol.) Polyvinylpyrrolidon-Iod.
Wenn Knorpel- oder Bindegewebe vorhanden ist, enthalten die dekontaminierenden und reinigenden Lösungen vorzugsweise Natriumchlorid oder ein anderes biologischverträgliches Salz in einer Menge, die ausreicht, um zu verhindern, dass sich PVP-I im Knorpel- oder Bindegewebe anreichert. Vorzugsweise werden 0,01 bis 0,75 M NaCl, und am meisten bevorzugt 0,15 M NaCl verwendet.
Das umfassende dekontaminierende Agens, das für die Enddekontaminierung verwendet wird, kann von dem Knochen durch Waschen mit sterilem Wasser entfernt werden, oder kann als eine dünne Beschichtung belassen werden, um den Knochen weiter gegen infektiöse Krankheitserreger zu schützen. Der so beschichtete Knochen kann lyophylisiert werden.
Am meisten bevorzugt ermöglicht man, dass sich eine PVP-I-Beschichtung bildet. Eine PVP-I-Lösung, die an dem Knochen anhaftet, verleiht eine kräftige goldene bernsteinfarbene Farbe, die als Indikator dienen kann, dass der Knochen behandelt wurde. Falls gewünscht, kann der bernsteinfarbene Knochen direkt lyophylisiert, verpackt und bei Raumtemperatur gelagert werden, vorzugsweise in bernsteinfarbenen Gefäßen. Während verschiedene Verfahren zum Lyophylisieren von Gewebe im Stand der Technik bekannt sind, ist ein Gefriertrocknen für etwa 10 bis 168 Stunden, vorzugsweise für etwa 20 bis 28 Stunden, ein Verfahren, das zum Lyophylisieren von Knochen als geeignet befunden wurde. Verbliebenes PVP-I auf dem lyophylisierten Knochen dient weiter als Schutz, bis es durch Waschen oder durch die Körpertlüssigkeiten nach der Implantation entfernt wird. Ähnlich kann der Knochen mit anderen geeigneten umfassenden dekontaminierenden Agenzien, PVP-I, oder Mischungen davon, überzogen werden.
Alternativ kann das verbliebene umfassende dekontaminierende Agens durch Spülen mit sterilem Wasser entfernt oder durch chemische Reaktion inaktiviert werden. Die ursprünglich gebrochen weiße Knochenfarbe kann so wieder hergestellt werden. Iodophore können chemisch durch Zusetzen eines Reduzierungsmittels, beispielsweise Natriumascorbat oder -thiosulfat, zu der Tränklösung, nachdem die erforderliche Tränkungszeit verstrichen ist, inaktiviert werden. Die reduzierende Lösung sollte von einer Molarität und Menge sein, die ausreicht, um das verbliebene molekulare Iod zu inaktivieren. Beispielsweise sollten 50 bis 100 μl einer 1M Natriumascorbatlösung ausreichend sein, um 10 ml 1 %-iges PVP-1 zu inaktivieren. Diese Behandlung verändert die Lösung wieder von dunkelbraun zu einer klaren Farbe zurück und gibt dem Knochen seine natürliche Farbe zurück.
Nach dem Enddekontaminierungsschritt kann der Knochen zur Lagerung lyophylisiert oder kältekonserviert oder frisch eingefroren werden.
Fachleute sollten erkennen, dass ein Knochen, der in der Weise wie hier offenbart behandelt wurde, für alle therapeutischen Verwendungen, für die ein Knochen benötigt wird, beispielsweise Knochentransplantationen, Hüftchirurgie und Kniechirurgie, geeignet ist.
Genaue Beschreibung der vorliegenden Erfindungs
Einführung
Es gibt einen erkannten Bedarf an Technologien, die zum Bereitstellen von Knochen zur Transplantation geeignet sind, die die ernsten Risiken von Infektiosität und Immunogenität, die mit den gängigen Transplantationsverfahren einhergehen, wirksam minimieren. Bedauerlicherweise hat sich gezeigt, dass die Präparation von Knochen für Transplantationszwecke aufgrund des Vorhandenseins einer Struktur im Knochen (der inneren Matrix), von der man weiss, dass sie das Eindringen von wirksamen Mengen von Substanzen, die beim Reinigen und Dekontaminieren verwendbar sind, in den Knochen wesentlich behindert, ein schwieriges Problem darstellt.
Ein Knochen ist eine spezialisierte Ausbildung von Bindegewebe, das seine Härte der Ablagerung von mineralischer Substanz in eine weiche organische Matrix verdankt. Die innere Knochenmatrix, wie sie im Fachgebiet verstanden wird, bezieht sich auf die Materialien, die innerhalb des Knochens gefunden werden, entweder vom (kompakten) kortikalen oder vom (schwammigen) (trabekularen) Spongiosatyp, die normalerweise darin strukturiert organisiert sind, und umfassen beispielsweise Knochenflüssigkeiten, extravaskuläre und vaskuläre Flüssigkeiten, verkalkte Knochenmatrix, Knochenmark (einschließlich rotem oder fettem Mark) und die Zellen davon, osteogene Zellen, extrazelluläre und intrazelluläre Lipide und Erythrocyten. Solche Materialien (im Allgemeinen ausgenommen verkalkte Knochenmatrix) werden im Stand der Technik als entfernbare Materialien erachtet, was bedeutet, dass sie vorzugsweise durch das Reinigen und/oder Dekontaminieren von dem Knochen entfernt werden, obwohl es auch anerkannt ist, dass solche Materialien eine Affinität, typischerweise eine beträchtliche Affinität, für Knochen und die darin definierten Räume, die sie einnehmen, aufweisen. Für die Zwecke der Erfindung bedeutet entfernbares Matrixmaterial, dass es eine beträchtliche Affinität für eine Knochenprobe aufweist, sodass eine auf Wasser basierende Reinigungs- oder Dekontaminierungslösung, die damit in Kontakt ist, einen beträchtlichen Anteil des Materials nicht ablösen kann, wenn die Lösung für etwa 1 bis 5 Minuten als ein Strom bei Raumtemperatur von einer Quelle mit etwa Standardhaushalts-Wasseranschlussdruck zugeführt wird.
Wie in der Stammausführungsform der Erfindung bereitgestellt, stören die vorstehend genannten Materialien der inneren Matrix das Reinigen und Dekontaminieren von Knochen beträchtlich. Allgemein gesagt, stellen die Entwicklungen der vorliegenden Ausführungsform der Erfindung die wichtige Entdeckung bereit, dass das Entfernen von solchen Matrixmaterialien entweder direkt oder indirekt aus einem Knochen, der zur Transplantation vorgesehen ist, durch das Anordnen der Knochenprobe in einer Umgebung, in der sie mit einer Atmosphäre von weniger als Umgebungsdruck kontaktiert (oder darin angeordnet) wird, wesentlich erleichtert. Bei der Anwendung der Erfindung wird unter Umgebungsdruck ein Gasdruck von etwa 1,0 Atmosphären verstanden.
Bei der Anwendung der Erfindung wurde auch entdeckt, dass Lipid, das entweder als extrazelluläres oder intrazelluläres Lipid in der Matrix vorliegt, dazu neigt, entfernbare Komponenten der Matrix (beispielsweise Mark, Zellen, antigene Makromoleküle oder Trümmer derselben und auch Lipid selbst) wesentlich zu immobilisieren und dabei das Entfernen von solchen Komponenten durch Reinigungs- und Dekontaminierungsverfahren, beispielsweise solche wie in der Stammausführungsform beschrieben werden, verhindert oder beschränkt. Ohne durch die Theorie beschränkt zu sein, wird angenommen, dass wässrige Reinigungs- oder Dekontaminierungslösungen aufgrund des Vorhandenseins von gepackten Knochenmarkszellen und einer hydrophoben Lipid-Schranke nicht wirksam in die innere Knochenmatrix eindringen können.
Diese Wirkung ist beträchtlich, da es wohlbekannt ist, dass beispielsweise Fettzellen eine wichtige Komponente der Knochenmatrix sind, wobei sich das gelbe Knochenmark fast ausschließlich aus Fettzellen zusammensetzt (siehe beispielsweise Tanaka, Y and Goodman, V.R., „Electron Microscopy of Human Blood Cells", Kapitel 7 auf Seite 380, Harper and Row, New York, NY 1972). Demgemäß umfasst ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Ausführungsform der Erfindung das Behandeln von innerer Knochenmatrix, die eine vorbestimmte Menge von entfernbarem Material enthält, wobei die Matrix auch eine vorbestimmte Menge an Lipid enthält, welche das entfernbare Material wesentlich immobilisiert, wobei das Verfahren den Schritt des Kontaktierens der Matrix mit einer Atmosphäre von weniger als Umgebungsdruck für eine Zeit, die wirksam ist, um den Lipidgehalt unter die vorbestimmte Menge zu verringern, umfasst.
Von einer Lipidmenge wird gesagt, dass sie das entfernbare Material der Knochenmatrix wesentlich immobilisiert, wenn eine auf Wasser basierende Reinigungs- oder Dekontaminierungslösung das Material nicht ablösen kann, wenn die Lösung in Kontakt mit der Knochenprobe für etwa 1 bis 5 Minuten als ein Strom bei Raumtemperatur aus einer Quelle mit etwa Standardhaushalts-Wasseranschlussdruck zugeführt wird.
Für die Zwecke der Erfindung umfasst „Lipid" alle Substanzen, die im Stand der Technik als solche anerkannt sind, umfassend beispielsweise Triglyceride, freie Fettsäuren, Cholesterin und Ester davon, und „polare" Fette, wie z. B. Lecithin und Sphingomyelin.
Herstellung von transplantierbarem Knochen
Knochen, der zur Transplantation geeignet ist, wird unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt, das den Schritt des Kontaktierens des Knochens mit einer Atmosphäre von weniger als Umgebungsdruck und mindestens einen weiteren Schritt, entweder vor oder nach dem Kontaktieren, umfasst, ebenso umfassend das Kontaktieren des Knochens mit einer Lösung, die ein Detergens oder ein dekontaminierendes Agens umfasst. Vorzugsweise wird nach dem Kontakt mit einer Niedrigdruck-Atmosphäre wenigstens ein solcher weiterer Schritt durchgeführt, um vom Öffnen von Kanälen in die Matrix, die durch Entfernen von Fett erzeugt werden, Vorteil zu ziehen. Die Stammausführungsform der Erfindung definiert eine große Anzahl von zusätzlichen Reinigungs- oder Dekontaminierungsschritten, umfassend jene, die bei erhöhter Temperatur durchgeführt werden, die zu einer Reihenfolge kombiniert werden können, um ein bestimmtes Reinigungs- oder Dekontaminierungsverfahren festzulegen. Bevorzugte dekontaminierende Agenzien umfassen wie vorstehend Ethylalkohol, Wasserstoffperoxid, Chlorhexidin, Hypochlorit und Iodophore, beispielsweise PVP-1 (insbesondere mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 100 000). In Verbindung damit bezieht sich die erhöhte Temperatur auf eine Temperatur von etwa 37°C oder höher, vorzugsweise etwa 37°C bis etwa 80°C und im Allgemeinen am meisten bevorzugt etwa 50°C bis etwa 65°C, obwohl optimale Temperaturen für die einzelnen Proben bestimmt werden können. Die Reinigungs- und Dekontaminierungsschritte können auch gemäß dem Verfahren der Stamm- und der vorliegenden Ausführungsformen der Erfindung unterhalb von 37°C durchgeführt werden. Bevorzugte und repräsentative Beispiele der vorliegenden Ausführungsform werden nachstehend in Beispielen 6 bis 9 bereitgestellt.
Der Begriff „Knochen", wie er gemäß der Anwendung der vorliegenden Entwicklung der Erfindung im allgemeinsten Sinn verwendet wird, umfasst alle Arten von menschlichen oder tierischen Knochengeweben, einschließlich ganze Knochen, Knochenstücke, Knochenblöcke mit anhaftendem Bindegewebe, wie beispielsweise Bänder und Sehnen, wobei die Probe geeignet ist, die natürliche Knochenintegrität in einem Patienten wieder herzustellen und an der Transplantationsstelle Gewicht zu tragen, wobei solche Knochenstücke typischerweise mindestens eine Dimension von etwa 10 mm oder größer aufweisen. Repräsentative Knochenproben, die bei dem Verfahren der Erfindung nützlich sind, umfassen die folgenden Produkte, die von Cryolife Orthopaedics, Inc., Marietta, GA (die typischerweise unter dem Markenzeichen VIP, Viral Inactivation Process verkauft werden) erhältlich sind: Spongiosablöcke, Spongiosawürfel, gesamter Gelenkkopf, kortikale Streifen und Streben, bikortikaler Cloward-Dübel, bikortikaler Crock-Dübel, trikortikaler Darmbein-Dübel, trikortikaler Kniescheiben-Crock-Dübel, distaler Oberschenkelknochen, Oberschenkelknochenkopf, ganzer Wadenbeinknochen, Oberarmknochen, ganzes Darmbein, Darmbeinschaufel, Unterkieferknochenhälfte, ganzes Becken, Rippe (Mittelteil), Rotatorenmanschette und ganze Elle. Von der Definition von Knochen ausgeschlossen sind hier gemahlene Knochenpräparate, gemahlene entmineralisierte Knochenpräparate und Knochenspäne, wobei all diese ausgeschlossenen Kategorien die folgenden Merkmale gemeinsam haben: (1) sie sind nicht-gewichtstragende Knochenstrukturen, wobei sie das Gewicht im therapeutischen Zusammenhang nicht stützen können, beispielsweise in dem sie weniger als etwa 5 mm Dicke des kortikalen Knochens eines Schienbeinknochens oder Oberschenkelknochens in einem Patienten ausmachen; und (2) aufgrund des sehr hohen Oberflächen/Volumen-Verhältnisses der Späne oder der gemahlenen Knochenprobe trägt deren Lipid nicht wesentlich zur Immobilisierung von entfernbarem Material bei.
Die Verwendung von jedem Druck von weniger als Umgebungswert liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung, obwohl man allgemein gefunden hat (siehe nachfolgende Beispiele 6 bis 10), dass ein Druck von etwa 0,7 Atmosphären oder darunter im Allgemeinen für eine brauchbare Wirkung benötigt werden, wobei ein Druck von etwa 0,3 Atmosphären bis etwa 0,1 Atmosphären am meisten bevorzugt ist. Es wird angemerkt, dass große Knochenstücke (beispielsweise Oberschenkelknochenköpfe, distaler Oberschenkelknochen und proximaler Schienbeinknochen) mit ziemlich großen Spongiosabereichen am besten bei einem Druck von etwa 0,2 bis 0,13 Atmosphären behandelt werden. Der optimale atmosphärische Druck zur Verwendung mit speziellen Knochenstücken kann für spezielle Anwendungen bestimmt werden und kann von der spezifischen Reihenfolge und Kombination mit anderen Reinigungs- und Dekontaminierungsschritten, die dem einen oder mehreren Niedrigatmosphärendruckkontaktschritten vorhergegangen sind, abhängig sein. Die optimale Temperatur, um den Kontakt des Knochens mit einem Druck unterhalb des Umgebungsdruck zu bewirken, beträgt im Allgemeinen etwa 20 bis 60°C. Ebenso liegen die optimalen Zeiten zum Aufrechterhalten des Drucks unterhalb des Umgebungsdrucks im Allgemeinen in einem Bereich von 30 bis 60 Minuten, können aber für jede Anwendung durch Überwachen des Fortschritts der Extraktion von Blut und Lipid (siehe Beispiel 10) bestimmt werden. Im Allgemeinen wird die Verwendung von Gasdruck unterhalb des Umgebungsdrucks für weniger als 2 Minuten unwirksam sein und die Verwendung für länger als 5 Stunden wird keinen weiteren Vorteil bringen.
In Verbindung mit der Anwendung der Erfindung und im Hinblick auf die Optimierung der Bedingungen des Niedrigatmosphärendrucks, der dafür nützlich ist, wurde jedoch bestimmt, dass die Verwendung von zu niedrigem Druck ebenfalls im Allgemeinen unwirksam ist. Die Verwendung von zu niedrigem Druck erzeugt eine Gefrierwirkung, die nicht unähnlich der ist, die in einer Lyophylisierungsapparatur beobachtet wird, was bedeutet, dass das entfernbare Material des Knochens den Knochen zuerst schnell verlässt, aber dann weiteres Reinigen oder Dekontaminieren aufgrund des in situ-Einfrierens des Materials einschließlich des Lipids fehlschlägt. Der genaue Niedrigdruck, bei dem solches Fehlschlagen auftritt, variiert als eine Funktion von zahlreichen Parametern, einschließlich der Gefriertemperatur der Lipide, des Blut und des Marks und der Fläche der Knochenoberfläche, wobei 0,001 Atmosphären repräsentativ für einen nicht annehmbaren Druck ist. Der Bereich eines nicht annehmbaren Niedrigdrucks kann für jede bestimmte Kombination von Knochenprobe bzw. Knochenproben und Ausstattung bestimmt werden.
Es wurde auch entdeckt, dass direkter oder indirekter Kontakt mit einer Atmosphäre von weniger als 1,0 Atmosphären Druck mit der inneren Matrix einer Knochenprobe durch das Bohren eines Loches oder mehrerer Löcher von ausreichender Tiefe in die Probe (siehe beispielsweise nachstehende Beispiele 7 bis 10 und Figuren 1 bis 4) erleichtert wird. In Verbindung mit diesem Aspekt der Erfindung dient das Folgende als Richtlinien für die Ausführung derselben:

(1) Wenn immer möglich, sollte das Loch oder sollten die Löcher in einen Bereich der Knochenprobe, der minimales Gewicht trägt, gebohrt werden, wie im Stand der Technik verstanden wurde. Siehe beispielsweise 1 bis 4 im Fall eines Oberschenkelknochens.
(2) Abhängig von der Beschaffenheit der Knochenprobe sind die Löcher vorzugsweise zwischen 5 und 100 mm tief, wobei etwa 10 bis etwa 30 mm Tiefe für viele menschliche Knochenproben (siehe Beispiele 7 bis 10), einschließlich des menschlichen Oberschenkelknochens bevorzugt sind. Vorzugsweise haben die Löcher einen Durchmesser zwischen etwa 0,5 und etwa 3 mm, obwohl die Anzahl, Größe und Tiefe und Anordnung von Löchern dem breiten Ermessen des Fachmanns unterliegen.

Die folgenden repräsentativen Beispiele dienen zur Veranschaulichung und zur genaueren Beschreibung der Stamm- und der vorliegenden Ausführungsformen der Erfindung.
Beispiel 1
Schritt 1: Primäre Dekontaminierung
Ein menschlicher Knochen wurde beschafft, kultiviert und mit einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen, umfassend:

Staphylococcus-Species (Coagulase negativ)
Enterococcus-Species
Candida albicans
Acinetobacter anitratus
Klebsiella pneumoniae,

Das Darmbein wurde in einer 5 %-igen PVP-1 (Polyvinylpyrrolidon-lod, C15 Komplex von GAF)-Lösung getränkt. Der Hauptteil des äußeren Gewebes und des Fetts wurde entfernt, der Knochen wurde in die 5 %-ige PVP-1 für eine Gesamtdauer von einer (1) Stunde zurückgelegt und der Knochen wurde (mit fünfmaligen Wiederholungen) auf verbleibende Kontamination überprüft. Die folgende Tabelle zeigt einen Vergleich des vorliegenden Verfahrens mit Inkubationen in einer Salzlösung, der Positivkontrolle und einem Bacitracin/Polymyxin-Cocktail.

Lösung Gesamtzahl an

Mikroorganismen/Knochen

Vor der Behandlung 8700

Nach der Behandlung

Salzlösung 11000

Antibiotischer Cocktail 4300

5 % PVP-I 330
Die Ergebnisse zeigen, dass die 5 %-ige PVP-I der antibiotischen Behandlung bei der Verminderung der Anzahl von infizierenden Organismen überlegen ist.
Schritt 2: Reinigung
Der Knochen wurde in ein Schraubdeckelbehältnis, das 1 % (Vol.) Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100°) bei 37°C enthielt, überführt und für 10 Minuten in einem Farbdosenschüttler (Modell Nr. 0-5400-OM, hergestellt von Red Devil) stark geschüttelt. Nach dem Überführen des Knochens in eine saubere Lösung von warmem 1 %-igen Triton X-100°, wurde der Knochen über Nacht inkubiert (etwa 15 bis 18 Stunden bei 37 bis 42°C) und für 10 Minuten stark geschüttelt. Der Knochen wurde in frisches 1 %-iges Triton X-100° überführt und wieder für 10 Minuten stark geschüttelt. Jegliches zurückgebliebenes Mark wurde durch Waschen mit sterilem Wasser entfernt.
Dann wurde der Knochen in 3 %-iges Wasserstoffperoxid gelegt, für 10 Minuten geschüttelt und für eine Gesamtdauer von 60 Minuten inkubiert.
Der gereinigte Knochen wurde gründlich durch Spülen mit sterilem Wasser und wiederholtes Abspülen gewaschen, bis kein Zeichen von Detergensschaum mehr vorhanden war.
Schritt 3: Enddekontaminierung
Der gereinigte Knochen wurde bei Raumtemperatur in 1 %-iges PVP-1 gelegt, für 10 Minuten stark geschüttelt und für eine Gesamtdauer von 30 Minuten inkubiert und aus der Lösung genommen.
Schritt 4: Aufbewahrung
Falls gewünscht, kann man das PVP-I auf dem Knochen trocknen lassen, was dem Knochen eine kräftige goldene Farbe und einen zusätzlichen Schutz gegen infektiösen Krankheitserreger verleiht. Der beschichtete Knochen kann dann lyophylisiert werden. Ebenso kann man, falls gewünscht, den Knochen mit PVP beschichten, wenn man das PVP auf dem Knochen trocknen lässt.
Beispiel 2
Schritt 1: Primäre Dekontaminierung
Ein menschliches Knie wird im Ganzen durch den ansässigen Beschaffungsverbund beschafft, verpackt und in nassem Eis zu einem knochenverarbeitendem Labor verschickt.
In dem verarbeitendem Labor wird das Knie für 10 bis 60 Minuten in 1 bis 5 %-iges PVP-1 mit 0,15 M Natriumchlorid, gelegt.
Schritt 2: Gewebepräparation und Reinigung
Die folgenden Kniegewebe mit den damit verbundenen Knochenblöcken werden entfernt:

– Kniescheibensehne
– hinteres Kreuzband
– vorderes Kreuzband
– Menisken

Die Stücke werden geputzt, um überschüssiges Gewebe und Fett zu entfernen. Das Band oder die Sehne wird in eine sterile Abdeckung (beispielsweise Plastikverpackung oder sterile Tücher) gewickelt, während die Knochenblöcke durch Spülung mit warmem (40 bis 65°C) 1 %-igem Triton X-100^®, gefolgt von gründlichem Spülen mit sterilem Wasser oder steriler Salzlösung, gereinigt werden.
Schritt 3: Endsterilisierung
Die Gewebe werden in 1 %-iges PVP-1, 0,15 M Natriumchlorid gelegt, für 1 Stunde bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt und gründlich mit sterilem Wasser oder steriler Salzlösung gespült. Jedes Stück wird kältekonserviert, verpackt und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Beispiel 2 (Ergänzung)
Es wurde für Schritt 2 des Beispieles 2 bestimmt, dass im Hinblick auf die Verwendung von Triton X-100° 0,1 % die bevorzugte Konzentration ist.
Beispiel 3
Schritt 1: Primäre Dekontaminierung
Menschliche Schaftknochen wurden durch den ansässigen Beschaffungsverbund beschafft, verpackt und in nassem Eis zu einem knochenverarbeitenden Labor verschickt.
Das verarbeitende Labor legte die Knochen für 10 Minuten bis 60 Minuten in 5 %-iges PVP-I, 1 %-iges Triton X-100^®.
Schritt 2: Gewebepräparation und Reinigung
Die Knochen wurden debridiert, um überschüssiges Gewebe und Fett zu entfernen und in 1 %-iges PVP-1, 1 %-iges Triton X-100° gelegt. Danach wurden die Knochen durch Spülen und Inkubieren in warmem (40 bis 65°C) 1 %-igem Triton X-100°, gefolgt von sorgfältigem Spülen mit sterilem Wasser, weiter gereinigt.
Die Knochen wurden in einer Knochenmühle zu Splitter gemahlen, mit sterilem Wasser gespült und lyophylisiert. Die Splitter wurden in einer Tekmar Mühle zu einer feineren Größe gemahlen.
Schritt 3: Entmineralisierung
Das Knochenpulver wurde mit kalter 0,6 N Salzsäure entmineralisiert und mit sterilem Wasser gespült.
Schritt 4: Endsterilisierung
Das entmineralisierte Pulver wurde für 1 Stunde in 1 %-iges PVP-1 gelegt und gründlich mit sterilem Wasser gespült. Das Pulver wurde in Behälter überführt, lyophylisiert, verpackt und bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Beispiel 4
Endsterilisierung mit Inaktivierung von PVP-I
Ein Knochen, der wie der Knochen von Beispiel 1 behandelt wurde, wurde in 20 ml 1 -iges PVP-I gelegt und für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,132 ml von 0,91 Natriumascorbat zugegeben. Die Lösung wurde beinahe sofort klar und nach 10 Minuten bekam der Knochen seine natürliche Farbe in gebrochenem Weiß zurück.
Beispiel 5
Dieses Beispiel vergleicht die Ergebnisse, die durch die Detergens-Reinigungsmethode mit Hochdruck/erhöhter Temperatur erhalten wurde, mit denen, die durch Standardverfahren erhalten wurden. Nach dem Reinigen wurden die Oberschenkelknochenköpfe gespalten, um den Grad der Reinigung besser zu zeigen.
Der Oberschenkelknochenkopf, der rechts gezeigt ist (5) wurde bei 60°C in 1 Vol.-% Tween 80 für 2 Tage mit regelmäßigem 10-minütigen Bewegen unter Verwendung eines Farbdosenschüttlers (Modell Nr. 0-5400-OM, hergestellt von Red Devil) inkubiert. Der Oberschenkelknochenkopf wurde dann mit warmem Wasser gespült, in 3 %-igem Wasserstoffperoxid für 20 Minuten inkubiert und dann wieder mit warmem Wasser gespült, um das Wasserstoffperoxid zu entfernen.
Der Oberschenkelknochenkopf, der links gezeigt wird, wurde gemäß Standardverfahren gereinigt. Er wurde mit 60°C Wasser für 15 Minuten gespült, in 3 -igem Wasserstoffperoxid für 15 bis 20 Minuten inkubiert, wieder mit 60°C Wasser gespült, um das Wasserstoffperoxid zu entfernen, 1 Stunde in 70 %-igem Ethanol inkubiert, und wieder mit 60°C Wasser gespült, um das Ethanol zu entfernen. 5 ist eine Fotografie der so gereinigten Knochen.
Beispiel 6
Behandlung eines menschlichen Oberschenkelknochens mit einer Atmosphäre von weniger als Umgebungsdruck
Ein Oberschenkelknochen eines menschlichen Spenders wird debridiert und etwa 15 cm vom distalen Ende geschnitten. Das distale Teil wurde aufrecht in einem Vakuumexsikkator angeordnet, so dass der Kopf des Oberschenkels am oberen und der Schaft am unteren Ende war. Ein Vakuum (ungefähr 25 Zoll Hg, das zu einem Kammerdruck von 0,15 atm führt) wurde für 1 Stunde unter Verwendung einer handelsüblichen Vakuumpumpe (Gast, Modell DOA-P104-AA) angelegt. Die Temperatur des Knochens blieb während des Verfahrens bei 20 bis 25°C. Ungefähr 37 ml Lipid wurden gesammelt.
Der Knochen wurde dann gewaschen und in einer wässrigen Lösung von 0,1 %-igem Triton X-100° bei 60°C angeordnet und wurde dann für 10 Minuten in einem Schüttler (ein handelsüblicher Farbschüttler, Red Devil Modell 5400-CM) stark geschüttelt. Die Inkubation wurde bei 60°C für 3 etwa Stunden fortgesetzt. Der Knochen wurde dann mit sterilem Wasser gespült.
Beispiel 7
Verwendung einer Atmosphäre von weniger als Umgebungsdruck, um das Ablösen von entfernbarem Material aus der inneren Matrix von mehreren Knochenproben zu erleichtern
Ein menschlicher Knochen wurde debridiert und in Stücke geschnitten, umfassend einen proximalen Oberschenkelknochen, proximalen Schienbeinknochen, spongiöse Dübel, und Darmbeinkeile. Die Knochenproben wurden dann in 5 %-iges Iodophor (PVP-1, wie vorstehend genannt, BASF-Produkt 30/06) bei 50 Minuten inkubiert, gefolgt von einer Überführung zu und Inkubation in 1 %-igem des vorstehend genannten Iodophors für 30 bis 60 Minuten. Dann wurden Löcher (zylindrisch 1 mm × 10 mm) in die Oberschenkelknochen- und die Schienbeinstücke gebohrt, wie in den 1 – 4 gezeigt (Dübel ausgenommen). Alle diese Stücke wurden dann in einen Vakuumexsikkator angeordnet, so dass die Knochenproben über einem Auffangbehälter für die Lipide positioniert waren. Das Vakuum wurde für 1 Stunde unter Verwendung der Gast Modell DOA-P104-AA-Pumpe angelegt, was zu einem Kammerdruck von 25 Zoll Hg (0,16 atm) führte, wobei der Knochen bei etwa 23°C gehalten wurde. Etwa 37 ml Lipid und 7,5 ml Blut wurden gesammelt.
Beispiel 8
Verwendung einer Atmosphäre von weniger als Umgebungsdruck, um die Ablösung von entfernbarem Material aus einem Darmbeinkeil zu erleichtern Ein Darmbeinkeil, der gemäß dem Verfahren in Beispiel 7 (etwa 1,5 Zoll in der Länge und 0,75 Zoll in Querrichtung) hergestellt wurde, wurde für 1 Stunde in einer Lösung von 0,1 % Triton X-100° in Wasser bei 60°C mit gelegentlichem schwachen Schütteln vorgewärmt und danach in ein 50 ml Probenröhrchen überführt. Das Vakuum (620 mm Hg) wurde für 80 Minuten angelegt, was zu einem Kammerdruck von 0,15 atm führte (wobei die Temperatur des Knochens bei 23°C gehalten wurde). Etwa 0,8 ml Lipid wurde während eines Zeitraums von 30 Minuten gesammelt.
Beispiel 9
Behandlung von menschlichen Oberschenkelknochenproben
Für dieses Verfahren wurden Proben des rechten und linken distalen Oberschenkelknochens eines menschlichen Spenders etwa 5,5 Zoll von den distalen Enden geschnitten. Die Probe des rechten Oberschenkels wurde durch das vorstehend beschriebene, im Stand der Technik anerkannten Verfahren unter Verwendung von Polymyxin/Bacitracinlösung behandelt, während die Probe des linken Oberschenkelknochens durch das virale Inaktivierungsverfahren, wie direkt nachstehend beschrieben (vergleiche ebenso Beispiel 1), behandelt wurde.
Dementsprechend wurde die Knochenprobe der linken Seite in 5 %-iger Iodophor-Lösung (5 % PVP-1, BASF-Produkt 30/06) für etwa 1 Stunde getränkt und dann in ein ½ Liter-Volumen einer frischen Iodophor-Lösung (1 %-ige PVP-I, BASF-Produkt 30/06) für etwa 1 Stunde überführt, um sie danach zu debridieren. Dann wurden etwa 5 Löcher (1 bis 2 mm Durchmesser und 10 bis 20 mm Tiefe) durch die kortikalen und auch die spongiösen Knochenregionen gebohrt, wie in 4 gezeigt.
Nach Waschen mit warmem Wasser und Trocknen wurde der Knochen in einem Vakuumexsikkator angeordnet und ein Vakuum von etwa 26 mm Hg wurde unter Verwendung einer Gast Modell DAA-V175-E8-Pumpe für 30 Minuten angelegt, was zu einem Druck von 0,132 Atmosphären auf den Knochen führte. Die Temperatur des Knochens betrug etwa 23 bis 35°C oder etwas wärmer. Etwa 30 ml Lipid wurden durch die Vakuumbehandlung entfernt.
Nach 5 Minuten Warmwasserspülung wurde der Knochen in einer 0,1 %-igen Tensidlösung angeordnet und wie in Beispieles 8 für 10 Minuten gerührt. Frische Tensidlösung wurde dann zugegeben und das Verfahren wurde wiederholt, bis die Lösung nahezu klar war. Der Knochen wurde dann für 3 Stunden mit einem zusätzlichen Volumen von Tensidlösung bei 60°C inkubiert. Nach einer Spülung mit Wasser wurde der Knochen für 5 bis 15 Minuten in eine wässrige Lösung von 3 %-igem Peroxid überführt und danach mit Wasser gespült. Der gereinigte Knochen wurde dann in eine 1 %-ige Iodophor-Lösung (PVP-1) für 1 Stunde überführt, mit Wasser gespült, wonach der Behälter mit Wasser wieder gefüllt wurde. Ein Reduzierungsmittel, Natriumthiosulfat, wurde zugegeben, um jegliches verbliebenes Iod zu Iodid umzuwandeln, und zur Aufbewahrung wurde der Knochen gründlich mit Wasser gespült.
Um den transplantierbaren Knochen gemäß der Erfindung mit dem, der mit herkömmlichen Verfahren zur Verfügung gestellt wird, zu vergleichen, wurde die Oberschenkelknochenprobe der rechten Seite, wie vorherstehend ausgeführt, gemäß dem im Stand der Technik anerkannten Polymyxin/Bacitracin-Verfahren behandelt. Dementsprechend wurde die Oberschenkelknochenprobe der rechten Seite debridiert und in einen Behälter mit warmem Wasser angeordnet. Der Behälter wurde von Hand geschüttelt, das Lipid-haltige Wasser verworfen und frisches heißes Wasser zugegeben. Das Verfahren wurde wiederholt, bis die Lipidmenge im Wasser minimal war (etwa 0,5 Stunden). Der Knochen, der mit dem herkömmlichen Verfahren erhalten wurde, behielt Eigenschaften, die seinen niedrigeren Grad klinischer Verwendbarkeit offensichtlich machen, beispielsweise eine rot-braune Farbe aufgrund von verbliebenem Blut und ölige Reste aufgrund von verbliebenem Lipid.
Beispiel 10
Demonstration des Blut- und Lipidflusses aus einem Oberschenkelknochen als Funktion des atmosphärischen Druckes (weniger als Umgebungsdruck)
Der wirksame atmosphärische Druck wurde für ein einzelnes Knochenstück (distaler menschlicher Oberschenkelknochen mit Löchern von 1 bis 2 mm, die wie in 4 gezeigt gebohrt wurden) bestimmt. Eine Handvakuumpumpe wurde verwendet, um den Luftdruck in Schritten von 2,5 Zoll Hg (jeweils etwa 0,08 atm) zu verringern. Der Knochen wurde bei jeder Vakuumeinstellung 5 Minuten gehalten und die Anzahl der erzeugten Blut- und/oder Lipid-Tröpfchen wurden in jeder Zeitperiode bestimmt. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 1 gezeigt.

Claims

Verfahren zum Vorbereiten von Knochen zur Transplantation, wobei der Knochen eine innere Matrix, die entfernbares Material umfasst, enthält, wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkontaktbringen des Knochens oder der Matrix mit einer Lösung, die ein Detergens oder ein dekontaminierendes Agens umfasst; (b) nachfolgendes Inkontaktbringen des Knochens oder der Matrix mit einer Atmosphäre, die einen Druck unterhalb des Umgebungsdruckes hat; und (c) nachfolgendes Inkontaktbringen des Knochens oder der Matrix mit einer Lösung, die ein Detergens oder ein dekontaminierendes Agens umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das dekontaminierende Agens die Fähigkeit hat, eine oder mehrere Spezies oder Stämme von Bakterien, Pilzen, Viren, Prionen oder Parasiten zu inaktivieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Knochen nach einer ersten Dekontamination mit einer Detergenslösung unter Hochdruck-Waschbedingungen bei erhöhten Temperaturen gereinigt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Hochdruck-Waschbedingungen eine Spülung mit einem Flüssigkeitsstrom von hoher Geschwindigkeit umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Hochdruck-Waschbedingungen heftiges Bewegen umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Knochen einer erhöhten Temperatur vor, während oder nach dem Kontakt mit der Atmosphäre unterworfen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die erhöhte Temperatur zwischen ca. 37°C und ca. 80°C liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die erhöhte Temperatur zwischen ca. 50°C und ca. 65°C liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das dekontaminierende Agens aus der Gruppe, die aus Ethylalkohol, Wasserstoffperoxid, Chlorhexidin, Hypochlorit und Iodophor besteht, ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Agens ein Iodophor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Iodophor Polyvinylpyrrolidon-lod mit einem Molekulargewicht von weniger als ca. 100 000 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Kontakt zwischen der Atmosphäre und der Matrix durch Bohren von einem oder mehreren Löchern in den Knochen erleichtert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei ein oder mehrere Löcher in einem Bereich des Knochens gebohrt werden, der das geringste Gewicht trägt.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Löcher einen Durchmesser zwischen ca. 0,5 und ca. 3 mm haben.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Löcher zwischen ca. 10 mm und ca. 30 mm tief sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Atmosphäre einen Druck von ca. 0,7 atm oder weniger hat und zwischen ca. 2 Minuten und ca. 5 Stunden mit dem Knochen in Kontakt bleibt.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Atmosphäre einen Druck von ca. 0,3 atm oder weniger hat und zwischen ca. 30 min und ca. 60 min mit dem in Kontakt Knochen bleibt.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Atmosphäre einen Druck von ca. 0,2 atm oder weniger hat und zwischen ca. 30 min und ca. 60 min mit dem Knochen in Kontakt bleibt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Virusinaktivierung erleichtert wird.
Verfahren zum Behandeln eines Knochens, der selbst eine innere Matrix enthält, die eine vorgegebene Menge an entfernbarem Material mit beträchtlicher Affinität zum Knochen umfasst, wobei das Verfahren den Schritt des Inkontaktbringens der Matrix mit einer Atmosphäre unterhalb des Umgebungsdruckes und nachfolgendem Aufrechterhalten der Atmosphäre in Kontakt damit für einen Zeitraum, der wirksam ist, um die Menge an entfernbarem Material unter den vorgegebenen Wert zu verringern, umfasst, wobei das Verfahren ferner das Inkontaktbringen des Knochens oder der Matrix vor oder nach dem Inkontaktbringen mit einer Atmosphäre unterhalb des Umgebungsdruckes mit einer Lösung, die ein Detergens oder dekontaminierendes Agens umfasst, umfasst.
Verfahren zum Behandeln einer inneren Matrix eines Knochens, der eine vorgegebene Menge an entfernbarem Material enthält, wobei die Matrix ebenfalls eine vorgegebene Menge an Lipid, welches das entfernbare Material wesentlich immobilisiert, enthält, wobei das Verfahren den Schritt des Inkontaktbringens der Matrix mit einer Atmosphäre unterhalb des Umgebungsdruckes für einen Zeitraum, der wirksam ist, um den Lipidgehalt unter die vorgegebene Menge zu verringern, umfasst, wobei das Verfahren ferner das Inkontaktbringen des Knochens oder der Matrix vor oder nach dem Inkontaktbringen mit einer Atmosphäre unterhalb des Umgebungsdruckes mit einer Lösung, die ein Detergens oder dekontaminierendes Agens umfasst, umfasst.
Verfahren zum Behandeln eines Knochens, wobei der Knochen einen Abschnitt an innerer Matrix enthält, der bei Umgebungsdruck und in einem definierten Raum davon eine vorgegebene Menge an entfernbarem Material aufweist, wobei das Verfahren das Unterwerfen des Raumes, der außerhalb von und in Kontakt mit der Matrix ist, gegenüber einer Atmosphäre unterhalb des Umgebungsdruckes für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Menge an entfernbarem Material, das in dem definierten Raum verbleibt, unterhalb die vorgegebene Menge zu verringern, umfasst, wobei das Verfahren ferner das Inkontaktbringen des Knochens oder der Matrix vor oder nach dem Inkontaktbringen mit einer Atmosphäre unterhalb des Umgebungsdruckes mit einer Lösung, die ein Detergens oder dekontaminierendes Agens umfasst, umfasst.
Knochen, der zur Transplantation in einen Patienten geeignet ist, erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 1.
Knochen, der zur Transplantation in einen Patienten geeignet ist, erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 21.