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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
das Gebiet der Medizin im Allgemeinen und die Verwendung von Antagonisten
des Vitronektin-Rezeptors im Besonderen.
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Hintergrund
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Integrine stellen eine Klasse zellulärer Rezeptoren
dar, von denen bekannt ist, dass sie extrazelluläre Matrixproteine binden und
daher Zell-Zell- sowie Zell-Extrazellulärmatrix-Interaktionen vermitteln, Prozesse, die
im Allgemeinen als Zelladhäsions-Ereignisse
bezeichnet werden. Obwohl jedoch viele Integrine und Liganden, die
an Integrine binden, in der Literatur beschrieben sind, ist die
biologische Funktion vieler Integrine noch unklar. Die Integrin-Rezeptoren
stellen eine Proteinfamilie dar, deren Mitglieder als gemeinsame
Struktur nicht-kovalente heterodimere Glykoproteinkomplexe, die
aus α- und β-Untereinheiten bestehen,
aufweisen.
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Der Vitronektin-Rezeptor, benannt
nach seiner ursprünglich
beschriebenen Eigenschaft, bevorzugt an Vitronektin zu binden, umfasst
nach derzeitigem Wissen drei unterschiedliche Integrine, die wie
folgt benannt werden: ανβ1, ανβ3,
und ανβ5,
Horton, Int. J. Exp. Pathol., 71: 741–759 (1990). ανβ1,
bindet an Fibronektin und Vitronektin. ανβ3 bindet
an eine große
Anzahl unterschiedlicher Liganden, einschließlich Fibrin, Fibrinogen, Laminin,
Thrombospondin, Vitronektin, von Willebrand's Faktor, Osteopontin und Knochen Sialoprotein
I ανβ5 bindet
an Vitronektin.
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Die besonderen Funktionen bei der
Zell-Adhäsion,
die diese drei Integrine bei den vielen zellulären Interaktionen in Geweben
spielen, ist noch Gegenstand der Forschung, es ist aber soweit klar,
dass es unterschiedliche Integrine mit unterschiedlichen biologischen
Funktionen gibt. Eine wichtige Erkennungsstelle für die Integrine
ist die Arginin-Glycin-Asparaginsäure- (RGD)
Tripeptid Sequenz im Liganden. Eine RGD-Sequenz wurde in allen oben
genannten Liganden für
die Vitronektin-Rezeptor-Integrine gefunden. Die RGD-Erkennungsstelle
kann durch Polypeptide ("Peptide") nachgeahmt werden,
die die RGD-Sequenz enthalten, solche RGD-Peptide sind als Inhibitoren
der Integrin-Funktion bekannt. Es ist jedoch wichtig festzustellen,
dass in Abhängigkeit
von der Sequenz und Struktur der RGD-Sequenz, die Spezifität der Inhibierung
so geändert werden
kann, dass sie auf spezifische Integrine gerichtet sind. Die RGD-Erkennungsstelle
wird in Pierschbacher et al., Nature, 309: 30–33 (1984) und Pierschbacher
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5985–5988 (1984) diskutiert. Verschiedene
RGD-Polypeptide verschiedener Integrinspezifität wurden schon beschrieben: Grant
et al., Cell, 58: 933– 943
(1989), Cheresh, et al., Cell, 58: 945–953 (1989), Aumailley et al.,
FEBS Letts., 291: 50–54
(1991), und Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269: 20233–20238 (1994),
und im U.S. Pat. Nos. 4,517,686, 4,578,079, 4,589,881, 4,614,517,
4,661,111, 4,792,525, 4,683,291, 4,879,237, 4,988,621, 5,041,380
und 5,061,693.
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Die Angiogenese beschreibt einen
Prozess der Gewebe-Vaskularisierung, der unter anderem im Wachstum
neu entwickelnder Blutgefässe
in ein Gewebe hinein besteht. Der Prozess, auch als Neovaskularisierung
genannt, wird durch eine Infiltration von Endothelzellen und glatten
Muskelzellen vermittelt. Man nimmt an, dass der Prozess auf einem
von drei möglichen
Wegen abläuft:
die Gefäße können aus
schon existierenden Gefäßen aussprossen,
Gefäße können de
novo aus Vorläuferzellen
entstehen (Vaskulogenese) oder existierende kleine Gefäße können ihren
Durchmesser vergrößern. Blood
et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032: 89–118 (1990). Von vaskulären Endothelzellen
ist bekannt, dass sie mindestens 5 RGD-abhängige Integrine enthalten,
einschliesslich des Vitronektin Rezeptors (ανβ3 oder ανβ5),
dem Kollagen Typ I und IV Rezeptor (α1β1),
des Laminin-Rezeptors (α2β2), des Fibronektin/Laminin/Kollagen Rezeptors
(α1β3) und des Fibronektin-Rezeptors (ανβ1).
Davis et al., J. Cell. Biochem., 51: 206–218 (1993). Man weiß, dass
die glatte Muskelzelle mindestens sechs RGD-abhängige
Integrine enthält,
einschließlich ανβ1, ανβ3 und ανβ5.
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Die Angiogenese ist ein wichtiger
Vorgang während
des neonatalen Wachstums, spielt aber auch eine wichtige Rolle bei
der Wundheilung und in der Pathogenese einer großen Anzahl verschiedener Krankheiten, einschließlich Gewebsentzündungen,
Arthritis, Tumorwachstum, diabetische Retinopathie, Makuladegeneration
durch Neovaskularisierung der Retina und ähnliche Zustände. Diese
klinischen Manifestationen, die mit der Angiogenese assoziiert sind,
werden auch also angiogene Krankheiten bezeichnet. Folkman et al.,
Science, 235: 442–447
(1987). Im Allgemeinen gibt es keine Angiogenese in adulten oder
reifen Geweben, sie tritt allerdings in der Wundheilung und beim
zyklischen Wachstum des Corpus Luteum auf. Siehe zum Beispiel, Moses
et al., Science, 248: 1408–1410
(1990).
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Es wurde vorgeschlagen, dass die
Inhibierung der Angiogenese eine nützliche Therapie für eine Hemmung
des Tumorwachstums sein könnte.
Weiter wurde vorgeschlagen, die Angiogenese dadurch zu hemmen, dass
(1) die Freisetzung "angiogener
Moleküle" wie β-FGF (Fibroblasten
Wachstumsfaktor) gehemmt wird, (2) angiogene Moleküle neutralisiert
werden, wie durch Verwendung von anti-β-FGF Antikörpern und (3) die Antwort von
Endothelzellen auf einen angiogenen Stimulus gehemmt wird. Letztere Strategie
hat eine große
Aufmerksamkeit erfahren und Folkman et al., Cancer Biology, 3: 89–96 (1992),
haben mehrere Inhibitoren beschrieben, die die Antwort der Endothelzellen
hemmen, einschließlich
Kollagenase-Inhibitor, Inhibitoren, die den Umsatz der Basalzellmembran
hemmen, angiostatische Steroide, Angiogenese-Inhibitoren aus Pilzen, Plättchenfaktor
4, Thrombospondin, Arthritis Medikamente wie D-Penicillamin und Gold Thiomalat, Vitamin
D3 Analoge, alpha-Interteron und ähnliche,
die verwendet werden könnten,
um die Angiogenese zu hemmen. Für weitere
vorgeschlagene Hemmstoffe der Angiogenese, siehe Blood et al., Bioch.
Biophys. Acta., 1032: 89–118 (1990),
Moses et al., Science, 248: 1408–1410 (1990), Ingber et al.,
Lab. Invest., 59: 44–51
(1988), und U.S. Pat. Nos. 5,092,885, 5,112,946, 5,192,744, und
5,202,352. Keiner der in den vorhergehenden Referenzen beschriebenen
Angiogenese-Inhibitoren
ist auf eine Inhibierung des ανβ3 Rezeptors
gerichtet. RGD-enthaltene Peptide, die den ανβ3 Vitronektin-Rezeptor
hemmen, wurden auch beschrieben. Aumailley et al., FEBS Letts., 291:
50–54
(1991), Choi et al., J. Vasc. Surg., 19: 125–134 (1994), Smith et al.,
J. Biol. Chem., 265: 12267–12271
(1990), und Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269: 20233–20238 (1994).
Bis zur vorliegenden Erfindung, wurde eine Rolle des ανβ3 Integrins
bei der Angiogenese jedoch nie beschrieben, auch wurde nie auf eine
solche Rolle hingewiesen.
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Die Hemmung der Zell-Adhäsion in
vitro durch Verwendung monoklonaler Antikörper, die immunspezifisch für verschiedene α- oder β-Untereinheiten
der Integrine sind, hat nahegelegt, dass ανβ3 bei
der Zell-Adhäsion
unterschiedlicher Zelltypen, einschließlich mikrovaskulärer Endothelzellen,
beteiligt ist. Davis et al., J. Cell. Biol., 51: 206–218 (1993).
Darüber
hinaus haben Nicosia et al., Am. J. Pathol., 138: 829–833 (1991)
die Verwendung des RGD-Peptids GRGDS für die in vitro Hemmung der
Bildung von Mikrogefäßen aus
der Rattenaorta, kultiviert im Kollagengel, beschrieben. Jedoch
ist die Hemmung der Bildung von Mikrogefäßen in vitro in Kollagengel-Kulturen
kein Modell für
die Hemmung der Angiogenese in einem Gewebe, weil bislang nicht gezeigt
wurde, dass die Mikrogefäßstrukturen
die gleichen sind, wie die der kapillären Sprosse, oder dass die Bildung
von Mikrogefäßen in Kollagengel-Kulturen
auf die gleiche Weise stattfindet wie das neovaskuläre Wachstum
in intakte Gewebe hinein, wie arthritisches Gewebe, Tumorgewebe
oder Krankheitsgewebe, wo die Hemmung der Angiogenese wünschenswert
ist.
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Daher, abgesehen von den beschriebenen
Studien, sind den Anmeldern irgendwelche anderen Hinweise nicht
bekannt, dass die Angiogenese in einem Gewebe durch die Verwendung
von Inhibitoren der Zell-Adhäsion
gehemmt werden kann. Im Besonderen wurde vorher nie gezeigt, dass
eine ανβ3 Funktion
für die
Angiogenese in einem Gewebe erforderlich ist oder dass ανβ3-Antagonisten
die Angiogenese in einem Gewebe inhibieren können.
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Kurze Beschreibung der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung offenbart,
dass für
Angiogenese in Geweben das ανβ3 Integrin
nötig ist,
und dass Hemmstoffe von ανβ3 die
Angiogenese inhibieren können.
Die Offenbarung zeigt auch, dass Antagonisten anderer Integrine,
wie ανβ5 oder ανβ1 die
Angiogenese nicht inhibieren, vermutlich, weil diese anderen Integrine nicht
essentiell für
den Prozess der Angiogenese sind.
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Die Erfindung beschreibt daher die
Verwendung eines ανβ3-Antagonisten
für die
Herstellung eines Medikaments für
die Behandlung von Arthritis, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration,
Restenose, Hämangiom
oder eine festen Tumor der Lunge, des Pankreas, der Brust, des Kolons,
des Kehlkopfs oder des Ovars, benanntes Medikament umfasst eine
Angiogenese hemmende Menge des benannten ανβ-Antagonisten.
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Das zu behandelnde Gewebe kann irgendein
Gewebe sein, in dem die Hemmung der Angiogenese wünschenswert
ist, wie in kranken Geweben, in dem Neovaskularisierung auftritt.
Beispiele für
solche Gewebe schließen
solide Tumoren, Gewebe, die sich im Prozess der Restenose befinden
und ähnliche
Gewebe ein.
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Ein ανβ3-Antagonist
für die
Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann an ανβ3 binden
und kompetitiv die Bindung von ανβ3 an
einen natürlichen
Liganden hemmen. Vorzugsweise zeigt der Antagonist Spezifität für ανβ3 im
Vergleich mit anderen Integrinen. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
hemmt der ανβ3-Antagonist
die Bindung von Fibrinogen oder anderen RGD-enthaltenden Liganden
an ανβ3,
hemmt aber nicht wesentlich die Bindung von Fibrinogen an αIIbβ3.
Ein bevorzugter ανβ3-Antagonist kann ein
Polypeptid oder ein monoklonaler Antikörper oder ein funktionelles
Fragment aus diesen sein, dass mit ανβ3 spezifisch reagiert.
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Kurze Beschreibung der
Abbildungen
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Die Abbildungen, die ein Teil dieser
Offenbarung darstellen, sind:
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Die 1A–1D zeigen die Gewebeverteilung
der Integrin-Untereinheiten β3 und β1 in normaler Haut und in Haut, die im Prozess
der Wundheilung begriffen ist, bezeichnet als Granulationsgewebe.
Die Immunhistochemie wurde mit Antikörpern, die gegen β3 und β1 gerichtet
sind, durchgeführt,
wie in Beispiel 3A beschrieben. Die 1A beziehungsweise 1B zeigen die Immunreaktivität von anti-β3 in
normaler Haut und in Granulationsgewebe. Die 1C beziehungsweise 1D zeigen die Immunreaktivität von anti-β1 in
normaler Haut und Granulationsgewebe.
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Die 2A–2D zeigen die Gewebeverteilung
des von Willebrand Faktors und des Ligandens für Laminin, die an die β3 beziehungsweise β1 Integrin
Untereinheiten binden, sowohl in normaler Haut als auch in Haut,
die sich im Prozess der Wundheilung befindet, als Granulationsgewebe
bezeichnet. Immunhistochemie mit Antikörpern gegen von Willebrand
Faktor (anti-vWF) und Laminin (anti-Laminin) wurde wie in Beispiel
3B beschrieben, durchgeführt.
Die 2A und 2B, zeigen jeweils die Immunreaktivität des anti-vWF
in normaler Haut und Granulationsgewebe. Die 2C und 2D zeigen
jeweils die Immunreaktivität
von anti-Laminin in normaler Haut und Granulationsgewebe.
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3A–3D zeigen die Gewebeverteilung
des Vitronektin Integrin Rezeptors, ανβ3,
jeweils in Gewebebiopsien aus Blasenkrebs, Kolonkrebs, Brustkrebs
und Lungenkrebs. Die Immunhistochemie mit dem LM609 Antikörper gegen ανβ3 wurde
wie in Beispiel 3C beschrieben, durchgeführt.
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4 zeigt
eine typische Fotomikrographie einer erfindungsgemäßen CAM
von einem 10 Tage alten unbehandelten Hühnerembryos, hergestellt wie
in Beispiel 5B beschrieben, dem die Blutgefäße fehlen.
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Die 5A–5C zeigen die Gewebeverteilung
der β1 und ανβ3-Integrine
im erfindungsgemäßen CAM Präparat. 5A zeigt die Verteilung
der β1 Untereinheit in einer unbehandelten 10
Tage alten CAM Präparation,
wie sie durch Immunfluoreszenz-Immunreaktivität mit CSAT, einem anti-β1 Antikörper, detektiert
werden kann. 5B zeigt
die Verteilung des ανβ3 Rezeptors
in einem unbehandelten 10 Tage alten CAM Präparat, wie sie durch Immunfluoreszenz-Immunreaktivität mit LM609,
einem anti-ανβ3 Antikörper detektiert
werden kann. Die 5C zeigt
die Verteilung des ανβ3 Rezeptors
in einer β-FGF
behandeltem 10 Tage altem CAM Präparat,
wie sie durch Immunfluoreszenz-Immunreaktivität mit LM609, einem anti-ανβ3-Antikörper detektiert werden
kann. Die Behandlungen und Ergebnisse sind in Beispiel 5C beschrieben.
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Die 6 zeigt
die Quantifizierung der relativen Expression von ανβ3 und β1 in
unbehandelten und β-FGF
behandelten 10 Tage alten CAMs, wie in Beispiel 6A beschrieben,
in einem Säulendiagramm.
Die mittlere Fluoreszenzintensität
ist auf der Y-Achse
aufgetragen, die Integrinprofile auf der X-Achse.
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Die 7A–7C zeigen das Erscheinungsbild
einer unbehandelten 10 Tage alten CAM beziehungsweise das einer β-FGF behandelten
CAM, die Vorgehensweisen und Ergebnisse sind in Beispiel 6A beschrieben.
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Die 8A–8E zeigen den Effekt einer
topischen Antikörper-Behandlung
von FGF-induzierter Angiogenese in einer 10 Tage alten CAM, wie
in Beispiel 7A1) beschrieben. 8A zeigt
ein unbehandeltes CAM Präparat,
dem die Blutgefäße fehlen. 8B zeigt die Infiltration
neuer Vaskulatur, ausgelöst
durch β-FGF Behandlung,
in ein Gebiet, das vorher gefäßfrei war.
Die 8C, 8D und 8E zeigen
die Effekte von Antikörpern
gegen β1 (anti-β1; CSAT), ανβ5 (anti-ανβ5;
P3G2) beziehungsweise ανβ3 (anti-ανβ3;
LM609).
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Die 9A–9C zeigen den Effekt einer
intravenösen
Injektion des synthetischen Peptids 6603 auf die Tumor-induzierte
Angiogenese, wie in Beispiel 7D2) beschrieben. Die 9A zeigt die Abwesenheit eines hemmenden
Effekts einer intravenösen
Injektion mit einem Kontroll-Peptid (Kontroll-Peptid Tumor) auf
die Angiogenese, die aus der Tumor-Induktion resultiert. Die Hemmung
einer solchen Angiogenese durch intravenöse Injektion mit dem Peptid
66203 (zyklisches RGD Tumor) ist in 9B gezeigt.
Die Abwesenheit eines hemmenden Effekts oder Zytotoxizität auf reife,
schon vorher existierende Gefäße in einem
Gebiet benachbart zu dem Tumor-behandelten Gebiet, folgend auf eine
intravenöse
Infusion mit dem Peptid 66203, ist in 9C gezeigt
(zyklisches RGD benachbart CAM).
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Die 10A–10C zeigen den Effekt einer
intravenösen
Injektion monoklonaler Antikörper
auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese, wie in Beispiel
7B1) beschrieben. 10A zeigt β-FGF-induzierte Angiogenese,
die nicht einer Antikörper-Behandlung
ausgesetzt war (Kontrolle). Keine Hemmung der Angiogenese resultiertw,
wenn eine ähnliche
Präparation
mit anti-ανβ3 Antikörper P3G2
behandelt wurde, wie in 10B gezeigt.
Eine Hemmung der Angiogenese resultierte aus einer Behandlung mit
anti-ανβ3 Antikörper LM609,
wie in 10C gezeigt.
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Die 11A und 11C zeigen den Effekt einer
topischen Applikation mit anti-Integrin
Antikörpern
auf die embryonale Angiogenese, wie in Beispiel 7C beschrieben.
Die Angiogenese wurde nicht durch die Behandlung einer 6 Tage alter
CAM mit anti-β1 und anti-ανβ5-Antikörpern gehemmt,
wie in den 11A und 11B gezeigt. Im Gegensatz
dazu resultierte die Behandlung mit anti-ανβ3 Antikörper LM609
in einer Hemmung der Blutgefäßbildung,
wie in 11C gezeigt.
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Die 12 zeigt
die Quantifizierung der Zahl der Gefäße, die in einem Tumor in einem
CAM Präparat hineinwachsen,
wie in Beispiel 7D1 beschrieben. Das Säulendiagramm gibt die Zahl
der Gefäße, auf
der Y-Achse aufgetragen, an, die aus einer topischen Applikation
von entweder CSAT (anti-β1), LM609 (anti-ανβ3) oder
P3G2 (anti-ανβ5)
resultiert.
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Die 13A–13D zeigen einen Vergleich
zwischen feuchten Tumorgewichten 7 Tage nach Behandlung und den
Tumorgewichten zu Beginn der Behandlung, wie in Beispiel 9A1)a beschrieben.
Jede Säule
repräsentiert
das Mittel ± SE
von 5–10
Tumoren pro Gruppe. Die Tumore sind von humanem Melanom- (M21-L), Pankreaskarzinom-(Fg), Lungenkarzinom-(UCLAP-3),
und Kehlkopfkarzinom- (HEp3) CAM Präparaten abgeleitet und wurden
intravenös
mit PBS, CSAT (anti-β1) oder LM609 (anti-ανβ3)
behandelt. Das Säulendiagramm zeigt
das Tumorgewicht, auf der Y-Achse aufgetragen, das aus intravenöser Applikation
von entweder CSAT (anti-β1), LM609 (anti-ανβ3)
oder PBS resultiert, wie auf der X-Achse angegeben.
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Die 14A und 14B zeigen histologische
Schnitte von Tumoren, die mit P3G2 (anti-ανβ5) (14A) beziehungsweise LM609
(anti-ανβ3)
(14B) behandelt und
mit Hämatoxylin
und Eosin gefärbt wurden,
wie in Beispiel 9A1)a beschrieben. Wie in 14A zu sehen, zeigen die Tumoren, die
mit dem Kontroll-Antikörper (P3G2)
behandelt wurden, zahlreiche lebende und aktiv sich teilende Tumorzellen,
angedeutet durch die mitotischen Abbildungen (Pfeilspitzen) sowie
durch zahlreiche Blutgefäße (Pfeile),
die das Tumor-Stroma durchziehen. Im Gegensatz dazu wurden wenige,
wenn nicht gar keine lebenden Tumorzellen oder Blutgefäße in Tumoren
detektiert, die mit LM609 (anti-ανβ3)
behandelt wurden, siehe 14B.
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Die 15A–15E korrespondieren zu M21L
Tumoren, die mit Peptiden, wie in Beispiel 9A1)b beschrieben, behandelt
wurden, und sind wie folgt: 15A,
zyklisches Kontroll-RAD Peptid (69601); 15B, zyklisches RGD-Peptid (66203); 15C, benachbartes CAM Gewebe,
das von den gleichen Embryonen entnommen wurde, die mit zyklischem
RGD-Peptid (66203) behandelt wurden und eine hohe Vergrößerung (13x)
von Tumoren, die mit Kontroll-RAD Peptid (69601), 15D, oder zyklischem RGD-Peptid (66203)
behandelt wurden (15E).
Die 15E zeigt genauer
Beispiele von unterbrochenen Blutgefäßen von mit zyklischem RGD-Peptid
(66203) behandelten Tumoren (Pfeile).
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Die 16A–16E zeigen die Hemmung der
Angiogenese durch Antagonisten der Angiogenese in dem in vivo Kaninchenaugen-Modell,
wie in Beispiel 10 beschrieben. Die A und B zeigen genauer die Angiogenese des Kaninchenauges
in der Anwesenheit von β-FGF
and mAb P1F6 (anti-ανβ5).
Die C, D und E zeigen genauer die Hemmung der Angiogenese
des Kaninchenauges in der Anwesenheit von β-FGF and mAb LM609 (anti-ανβ5).
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Die 17 zeigt
einen Arbeitsablauf, wie das in vivo Maus : Mensch chimäre Mausmodell
gewonnen wurde, wie in Beispiel 11A beschrieben. Ein Teil der Haut
einer SCID Maus wurde durch humane neonatale Vorhaut ersetzt und
einer 4 wöchigen Heilung
unterworfen. Nachdem das Transplantat geheilt war, wurde die menschliche
Vorhaut mit humanen Tumorzellen inokuliert. Während der folgenden Periode
von 4 Wochen bildete sich ein messbarer Tumor, der einem menschlichen
Tumor mit humaner Vaskulatur, die von der menschlichen Haut in den
menschlichen Tumor wächst,
entspricht.
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Die 18 zeigt
den Prozentsatz einzelner Zellen, die von mit mAb und Peptid behandelten
CAMs abstammen, mit Apop Tag gefärbt
und mittels FACS ausgewertet wurden, wie in den Beispielen 12A beziehungsweise
12B beschrieben. Die schwarzen und gepunkteten Säulen stellen Zellen von Embryonen
dar, die 24 beziehungsweise 48 Stunden vor dem Assay behandelt wurden.
Jede Säule
repräsentiert
das Mittel ± SE von
drei Wiederholungen. Die CAMs wurden mit mAb LM609 (anti-ανβ3)
oder CSAT (anti-β1) oder PBS wie in Beispiel 12A2) beschrieben,
behandelt. Die CAMs wurden auch mit dem zyklischen Peptid 69203
(cyclo-RGDfV, bezeichnet als Peptid 203) oder zyklischem Kontroll-Peptid
69601 (cyclo-RADfV, bezeichnet als Peptid 601) behandelt, wie in
Beispiel 12B beschrieben.
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Die 19 zeigt
die kombinierten Ergebnisse von Einzelzell-Suspensionen aus CAMs,
die von Embryonen stammen, die entweder mit CSAT (anti-β1)
oder LM609 (anti-ανβ3),
behandelt wurden, mit Apop Tag und Propidiumjodid gefärbt wurden
und mittels FACS analysiert wurden, wie in Beispiel 12C beschrieben.
Auf der Y-Achse ist die Zahl Apop Tag gefärbter Zellen (Apoptose) aufgetragen,
auf der X-Achse die Propidiumjodid Färbung (DNA Gehalt). Die horizontale
Linie repräsentiert
die Nachweisgrenze für
Apop Tag Färbung.
Die linken und rechten Bildabschnitte zeigen CAM Zellen von CSAT
(anti-β1)
beziehungsweise LM609 (anti-ανβ3) behandelten
Embryonen. Eine Zellzyklus-Analyse
wurde durch Analyse von ungefähr
8000 Ereignissen pro Zustand durchgeführt. 20A–20C stellen CAM Gewebe von
CSAT (anti-β1) behandelten Embryonen dar und 20D bis 20E zeigen CAM Gewebe von LM609 (anti-ανβ3)
behandelten Embryonen, wie in Beispiel 12C beschrieben. 20A und 20D zeigen genauer Gewebe, die mit Apop
Tag gefärbt
und mit Fluoreszenz (FITC) sichtbar gemacht wurden, überlagert
auf ein D. I. C. Bild. 20B und 20E zeigen genauer die gleichen
Gewebe, mit mAb LM609 (anti-ανβ3)
gefärbt
und sichtbar gemacht mit Fluoreszenz (Rhodamin). 20C und 20F stellen
zusammengefügte
Bilder der gleichen Gewebe dar, die mit Apop Tag und LM609 gefärbt wurden,
wobei die Gelbfärbung
eine Kolokalisation anzeigt. Der Maßstab entspricht 15 und 50 μm im linken
beziehungsweise rechtem Bildabschnitt.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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A. Definitionen
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Aminosäurereste: Eine Aminosäure, die
durch einen chemischen Verdau (Hydrolyse) eines Polypeptids an seinen
Peptidbindungen entsteht. Die Aminosäurereste, die hier beschrieben
werden, sind vorzugsweise die "L" Isomere. Jedoch
können
Aminosäurereste
als "D" Isomere jede der
L-Aminosäurereste
ersetzen, so lange wie die gewünschte
funktionale Eigenschaft im Polypeptid erhalten bleibt. NH2 bezieht
sich auf die freie Aminogruppe, die das aminoterminale Ende des
Polypeptids repräsentiert.
COOH bezieht sich auf die freie Karboxygruppe, die das karboxyterminale
Ende des Polypeptids repräsentiert.
Der Standard-Polypeptid Nomenklatur angepasst (beschrieben in J.
Biol. Chem., 243: 3552–59
(1969) und angepasst durch 37 CFR § 1.822(b)(2)), sind die Abkürzungen
für die
Aminosäurereste
in der folgenden Korrespondenz-Tabelle gezeigt:
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Es soll festgehalten werden, dass
alle Aminosäuresequenzen
hier durch Formeln repräsentiert
werden, deren linke und rechte Orientierung der konventionellen
Richtung des Amino- und Karboxyendes entspricht. Darüber hinaus
bedeutet ein Strich am Anfang oder Ende eines Aminosäurerestes
eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz mit einer oder mehreren
Aminosäureresten.
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Polypeptid: bezeichnet eine lineare
Kette aus Aminosäureresten,
die über
Peptidbindungen zwischen der α-Aminogruppe
und Karboxygruppe von benachbarten Aminosäureresten verbunden sind.
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Peptid: so wie es hier gebraucht
wird, meint es eine Kette von nicht mehr als ungefähr 50 Aminosäureresten,
die wie in Polypeptiden miteinander verbunden sind.
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Zyklisches Peptid: ist abgeleitet
von einem korrespondierenden linearen Peptid und bezeichnet ein Peptid,
in dem keine freien N- oder C-Termini existieren und von dem die
N-Termini der korrepondierenden linearen Peptide eine Amidbindung
mit dem C-terminalen
Karboxylat des benannten korrespondieren linearem Peptid bilden.
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Protein: bezeichnet eine lineare
Kette von mehr als 50 Aminosäureresten,
die wie in Polypeptiden miteinander verbunden sind.
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Synthetisches Peptid: bezieht sich
auf eine auf chemischem Weg hergestellte Kette an Aminosäureresten,
die über
Peptidbindungen miteinander verbunden sind und frei von natürlich vorkommenden
Proteinen oder deren Fragmenten sind.
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B. Allgemeine Betrachtungen
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich im Allgemeinen auf die Beobachtung, dass die Angiogenese durch
den spezifischen ανβ3 Vitronektin
Rezeptor vermittelt ist, und dass die Hemmung der ανβ3 Funktion
die Angiogenese inhibiert. Diese Beobachtung ist wichtig aufgrund
der Rolle, die die Angiogenese bei einer Vielzahl verschiedener
Krankheitsprozesse spielt. Durch Hemmung der Angiogenese kann in
die Krankheit eingegriffen werden, die Symptome verbessert werden
und in einigen Fällen
die Krankheit sogar geheilt werden.
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Wenn das Wachstum von neuen Blutgefäßen die
Ursache ist oder zur Pathologie einer Erkrankung beiträgt, wird
eine Hemmung der Angiogenese die schädlichen Effekte der Krankheit
reduzieren. Beispiele schließen
Rheumatoide Arthritis, diabetische Retinopathie, entzündliche
Erkrankungen, Restenose und ähnliche
ein. Wo das Wachstum neuer Blutgefäße erforderlich ist, um das
Wachstum schädlicher
Gewebe zu unterstützen,
wird eine Hemmung der Angiogenese die Blutzufuhr zu den Geweben
reduzieren und so dazu beitragen, dass die Gewebemasse zurückgeht,
da eine ausreichende Blutzufuhr nicht länger gewährleistet ist. Beispiele schließen das
Wachstum von Tumoren ein, in denen eine Neovaskularisierung permanent
erforderlich ist, damit der Tumor größer als ein paar Millimeter
in der Dicke wächst
und sich feste Tumormetastasen entwickeln können.
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Die Anwendungen der vorliegenden
Erfindung sind teilweise deswegen wirksam, weil die Therapie hoch
selektiv für
die Angiogenese und nicht für
andere biologische Prozesse ist. Wie in den Beispielen gezeigt, enthalten
nur neu wachsende Gefäße wesentliche
Mengen an ανβ3 und
daher beeinflussen die therapeutischen Methoden reife Gefäße nicht
nachteilig. Darüber
hinaus ist ανβ3 in
normalen Geweben nicht weit verbreitet, sondern ist selektiv auf
neuen Gefäßen lokalisiert,
so dass sichergestellt ist, dass die Therapie selektiv auf das Wachstum
neuer Gefäße abzielt.
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Die Beobachtung, dass allein die
Hemmung von ανβ3 wirksam
die Angiogenese inhibieren kann, erlaubt die Entwicklung therapeutischer
Zusammensetzungen mit einer potenziell hohen Spezifität, und daher relativ
geringer Toxizität.
Obwohl die Erfindung die Verwendung von Peptid-basierten Reagenzien
offenbart, die die Fähigkeit
haben, ein oder mehrere Integrine zu hemmen, können andere Reagenzien hergestellt
werden, die ανβ3 noch
selektiver hemmen, und daher nicht die Nebenwirkung aufweisen, andere
biologische Prozesse zu hemmen oder andere als die, die durch ανβ3 vermittelt
sind.
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Zum Beispiel ist es möglich, wie
die vorliegende Lehre zeigt, monoklonale Antikörper herzustellen, die hoch
selektiv für
Immunreaktionen mit ανβ3 sind
und, die ähnlich selektiv
für eine
Hemmung der ανβ3 Funktion sind.
Weiter können
RGD-enthaltende Peptide konzipiert werden, die selektiv für die Hemmung
von ανβ3 sind, wie
unten beschrieben ist.
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Vor den Beobachtungen der vorliegenden
Erfindung, war es nicht bekannt, dass die Angiogenese und irgendeiner
der Prozesse, die von der Angiogenese abhängen, in vivo durch die Verwendung
von Reagenzien gehemmt werden kann, die die biologische Funktion
von ανβ3 antagonisieren.
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C. Methoden der Hemmung
der Angiogenese
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Die Erfindung liefert eine Methode
für die
Hemmung der Angiogenese in einem Gewebe, wodurch auch Ereignisse
in den Geweben inhibiert werden, die von der Angiogenese abhängig sind.
Im Allgemeinen umfasst die Methode die Anwendung einer Zusammensetzung,
die eine Angiogenese-hemmenden Menge eines ανβ-Antagonisten
umfasst. Wie schon vorher beschrieben, schließt die Angiogenese eine Vielfalt
an Prozessen ein, an denen Neovaskularisierung von Geweben beteiligt
ist, einschließlich "Aussprossen", Vaskulogenese oder
Gefäßvergrößerung,
all diese Angiogenese Prozesse werden durch die Expression von ανβ3 vermittelt
und hängen
von dieser ab. Man glaubt, dass die Mehrheit der Angiogenese-Vorgänge, mit
Ausnahme der traumatischen Wundheilung, der Corpus Luteum Bildung
und der Embryogenese, mit Krankheitsprozessen verbunden ist, und
daher die Verwendung von den vorliegenden therapeutischen Methoden
selektiv für die
Ziel-Krankheiten sind und keine schädlichen Nebenwirkungen ausüben.
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Man nimmet an, dass es eine Vielzahl
an Krankheiten gibt, bei denen die Angiogenese eine wichtige Rolle
spielt, diese werden auch als angiogene Krankheiten bezeichnet.
Eingeschlossen, aber nicht darauf beschränkt sind entzündliche
Erkrankungen wie Immun- und nicht-Immun-Entzündungen, chronischer artikulärer Rheumatismus
und Psoriasis, Krankheiten, in denen eine ungeeignete und unpassende
Invasion von Gefäßen auftritt,
wie diabetische Retinopathie, neovaskuläres Glaukom, Restenose, Proliferation
von Kapillaren in atherosklerotischen Plaques und Osteoporosis sowie
mit Krebs in Verbindung gebrachte Erkrankungen, wie feste Tumoren,
feste Tumormetastasen, Angiofibrome, retrolentale Fibroplasie, Hämangiome,
Kaposi Sarkoma und ähnliche
Krebsarten, die eine Neovaskularisierung benötigen, um das Tumorwachstum
zu unterstützen.
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So können Methoden, die die Angiogenese
in einem Krankheitsgewebe hemmen, Krankheitssymptome verbessern
und, in Abhängigkeit
von der Krankheit, zur Heilung der Krankheit beitragen. Das Ausmaß der Angiogenese
in einem Gewebe und damit das Ausmaß der Hemmung, das durch die
vorliegenden Methoden erreicht wird, kann durch eine Vielfalt an
Methoden beurteilt werden, wie z. B. in den Beispielen beschrieben, wo
die Detektion von ανβ3-immunpositiven,
unreifen und in Entstehung begriffenen Gefäßstrukturen durch Immunhistochemie
gezeigt ist.
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Wie hier beschrieben, kann jedes
einer Vielfalt von Geweben oder Organen, die organisierte Gewebe umfassen,
die Angiogenese in Krankheitszuständen unterstützen, eingeschlossen
sind Haut, Muskel, Darm, Bindegewebe, Gelenke, Knochen und ähnliche
Gewebe in denen Blutgefäße auf einen
angiogenen Stimulus hin eindringen können.
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Der Patient in seinen vielen Ausgestaltungsformen
ist wünschenswerterweise
ein humaner Patient in der vorliegenden Erfindung, obwohl verstanden
werden soll, dass die Prinzipien der Erfindung zeigen, dass die
Erfindung alle Säuger
betrifft, die absichtlich in der Bezeichnung "Patient" eingeschlossen sind. In diesem Zusammenhang
wird ein Säuger
so verstanden, dass er jede Säugerart
einschließt,
in der die Behandlung von Krankheiten, die mit einer Angiogenese
verbunden sind, wünschenswert
ist, besonders landwirtschaftlich genutzte Säuger und Haustier-Säugerarten.
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In einer anderen verwandten Ausführungsform
ist das zu behandelnde Gewebe ein retinales Gewebe eines Patienten
mit diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, oder neovaskulärem Glaukom
und die zu hemmende Angiogenese ist Angiogenese in retinalem Gewebe,
in dem eine Neovaskularisierung des retinalen Gewebes auftritt.
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In einer weiteren damit in Beziehung
stehenden Ausführungsform,
ist das zu behandelnde Gewebe ein Tumorgewebe eines Patienten mit
einem festen Tumor, Brustkrebs, Hämangiom oder Angiofibrom und ähnliche
Krebsarten, und die zu inhibierende Angiogenese ist Angiogenese
in Tumorgeweben, in denen eine Neovaskularisierung des Tumorgewebes
vorkommt. Typische feste Tumorgewebe, die mit den vorliegenden Methoden
behandelt werden können,
schließen
Gewebe der Lunge, des Pankreas, der Brust, des Kolons, des Kehlkopfs,
der Ovarien und ähnliche
Gewebe ein. Exemplarische Angiogenese in Tumorgeweben und deren Hemmung
ist in den Beispielen beschrieben.
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Die Hemmung von Angiogenese in Tumorgeweben
ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform weil die Neovaskularisierung
eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum spielt. In der Abwesenheit
von Neovaskularisierung in Tumorgeweben erhält das Tumorgewebe nicht die
nötigen
Nährstoffe,
verlangsamt das Wachstum, stoppt zusätzliches Wachstum, entwickelt
sich zurück
und wird schließlich
nektrotisch, was letztlich zum Absterben des Tumors führt.
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In einer verwandten Ausführungsform
schlägt
Erfindung die Anwendung der vorliegenden Methoden in Verbindung
mit anderen Therapien vor, wie konventioneller Chemotherapie, die
auf feste Tumore gerichtet ist und zur Verhinderung der Ausbildung
von Metastasen dient. Die Anwendung von Angiogenese-Hemmstoffen
wird typischerweise während
oder nach der Chemotherapie durchgeführt, obwohl die Angiogenese
vorzugsweise nach einem Behandlungszyklus einer Chemotherapie zu
hemmen ist, zu Zeitpunkten, an denen das Tumorgewebe auf den toxischen
Angriff mit einer Induktion der Angiogenese antwortet, um die Versorgung der
Blut- und Nährstoffzufuhr
in das Tumorgewebe hinein wiederherzustellen. Darüber hinaus
ist es bevorzugt, die die Angiogenese hemmenden Methoden nach der
Operation anzuwenden, wenn die festen Tumore schon entfernt sind,
als Prophylaxe gegen die Ausbildung von Metastasen.
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Insoweit als die vorliegende Methode
auf die Hemmung von Tumor Neovaskularisierung anzuwenden ist, können die
Methoden auch auf eine Hemmung von Tumorgewebewachstum, zur Hemmung
der Bildung von Tumormetastasen und zur Rückentwicklung von ausgebildeten
Tumoren angewendet werden. Die Beispiele zeigen die Rückentwicklung
eines ausgebildeten Tumors, die auf eine einzelne intravenöse Injektion
eines erfindungsgemäßen ανβ-Antagonisten
folgt.
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Die Restenose ist ein Prozess, bei
dem glatte Muskelzellen (SMC) von der Stelle der perkutanen transluminalen
koronaren Angioplastie aus wandern und proliferieren, was den Erfolg
der Angioplastie beeinträchtigt.
Die Wanderung und Proliferation der SMCs während der Restenose kann als
ein Prozess der Angiogenese betrachtet werden, der durch die vorliegenden
Verfahren inhibiert werden kann. Daher schlägt die vorliegende Erfindung
die Hemmung der Restenose dadurch vor, dass die Angiogenese in einem
Patienten nachfolgend einer Angioplastie inhibiert wird. Zur Inhibierung
der Restenose wird der ανβ3-Antagonist
typischerweise nach der Angioplastie-Operation für ungefähr 2 bis 28 Tage angewendet
und noch typischer für
ungefähr die
ersten 4 Tage, die auf die Operation folgen.
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Die Dosis-Bereiche für die Anwendung
der ανβ-Antagonisten
hängen
von der Form und der Wirksamkeit des Antagonisten ab, wie weiter
unten hier beschrieben wird und davon, ob die Mengen ausreichend
sind, um den gewünschten
Effekt zu erzielen und die Angiogenese sowie die Angiogenese vermittelten
Krankheitssymptome zu verbessern. Die Dosis sollte nicht so hoch
sein, dass sie zu ungünstigen
Nebenwirkungen führt, wie
Hyperviskositätssyndrome,
Lungenödeme,
Herzinsuffizienz und ähnliche.
Im Allgemeinen wird die Dosis mit dem Alter, dem Zustand, dem Geschlecht
und dem Ausmaß der
Erkrankung im Patienten variieren und kann durch einen Fachmann
auf dem Gebiet bestimmt werden. Die Dosis kann auch durch den individuellen Arzt
in dem Fall einer Komplikation angepasst werden.
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Eine therapeutisch wirksame Menge
ist eine Menge eines ανβ-Antagonisten,
die ausreicht, um eine messbare Hemmung der Angiogenese in dem behandelten
Gewebe auszulösen,
d. h. eine die Angiogenese hemmende Menge. Die Hemmung der Angiogenese
kann in situ durch Immunhistochemie, wie hier beschrieben, oder
durch andere Methoden, die der Fachmann kennt, gemessen werden.
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Insofern als ein ανβ3-Antagonist
verschiedene Formen annehmen kann, wie die eines ανβ3 Mimetikums,
eines RGD-enthaltenden Peptids, eines anti-ανβ3 monoklonalen
Antikörpers
oder Fragmenten davon, sollte verstanden werden, dass die Wirksamkeit
und daher der Ausdruck einer "therapeutisch
effektiven" Menge
variieren kann. Wie jedoch durch die vorliegenden Methoden gezeigt,
kann ein Fachmann auf seinem Gebiet die Wirksamkeit eines Kandidaten
für einen
erfindungsgemäßen ανβ-Antagonisten
auf einfache Weise bestimmen.
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Die Wirksamkeit eines ανβ-Antagonisten
kann durch eine Vielfalt verschiedener Mittel gemessen werden, eingeschlossen
sind die Hemmung der Angiogenese im CAM Assay, in dem in vivo Kaninchenaugen-Assay,
in dem in vivo chimären
Maus : Mensch Assay und durch die Messung der Hemmung der Bindung
von natürlichen
Liganden an ανβ3,
Methoden, die alle hier beschrieben sind, und ähnliche Assays.
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Ein bevorzugter ανβ3-Antagonist
hat die Fähigkeit,
die Bindung eines natürlichem
Liganden, wie Fibrinogen oder Vitronektin, an ανβ3 in
Lösung
erheblich zu hemmen und das bei weniger als 0.5 mikromolar (μM), bevorzugt
weniger als 0.1 μM,
und bevorzugter weniger als 0.05 μM.
Mit "erheblich" ist gemeint, dass
eine mindestens 50%-ige Reduktion in der Bindung an Fibrinogen in
der Anwesenheit von dem ανβ-Antagonisten
beobachtet wird und eine 50%-ige Hemmung wird hier als IC50-Wert bezeichnet.
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Ein bevorzugterer ανβ3-Antagonist
zeigt Selektivität
für ανβ3 gegenüber anderen
Integrinen. Somit hemmt ein bevorzugter ανβ3-Antagonist
die Fibrinogenbindung an ανβ3 erheblich,
jedoch nicht wesentlich die Bindung von Fibrinogen an andere Integrine,
wie ανβ1, ανβ3 oder αIIbβ3.
Besonders bevorzugt ist ein ανβ3-Antagonist,
der eine 10-fach bis 100-fach niedrigere IC50-Aktivität für die Hemmung
der Fibrinogenbindung an ανβ3 aufweist,
im Vergleich zu den IC50-Aktivitäten bei
der Hemmung der Fibrinogenbindung an andere Integrine. Beispielhafte
Assays für
die Bestimmung der IC50-Aktivität für die Hemmung
von Fibrinogenbindung an ein Integrin sind in den Beispielen beschrieben.
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Eine therapeutisch wirksame Menge
eines erfindungsgemäßen ανβ-Antagonisten
in Form eines monoklonalen Antikörpers
ist typischerweise eine Menge die, wenn sie in einer physiologisch
tolerierbaren Zusammensetzung angewendet wird, ausreichend ist, um
eine Plasmakonzentration von ungefähr 0.01 Mikrogramm (μg) pro Milliliter
(ml) bis etwas 100 μg/ml,
bevorzugt von etwa 1 μg/ml
bis etwa 5 μg/ml
und normalerweise von etwa 5 μg/ml
zu erreichen. Anders ausgedrückt
kann die Dosis zwischen etwa 0.1 mg/kg bis etwa 300 mg/kg, bevorzugt
von etwa 0.2 mg/kg bis etwa 200 mg/kg, am meisten bevorzugt von
etwa 0.5 mg/kg bis etwa 20 mg/kg, in einer oder mehreren täglichen
Dosis-Anwendungen für
einen oder mehrere Tage variieren.
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Liegt der Antagonist in Form eines
Fragments eines monoklonalen Antikörpers vor, kann die Menge unmittelbar
aus der Masse des Fragments relativ zur Masse des gesamten Antikörpers abgeleitet
werden. Eine bevorzugte Plasmakonzentration in Molarität ist etwa
2 mikromolar (μM)
bis etwa 5 millimolar (mM) und bevorzugt etwa 100 μM bis 1 mM
des Antikörper-Antagonisten.
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Eine therapeutisch wirksame Menge
eines erfindungsgemäßen ανβ-Antagonisten
in der Form eines Polypeptids oder anderer ähnlich großer niedermolekularer α5β3 Mimetika,
ist typischerweise eine Menge eines Polypeptides, die wenn sie in
einer physiologisch tolerablen Zusammensetzung angewendet wird,
ausreichend ist, um eine Plasmakonzentration von etwas 0.1 Mikrogramm
(μg) pro
Milliliter (ml) bis etwa 200 μg/ml,
bevorzugt von etwa 1 μg/ml
bis 150 μg/ml
zu erreichen. Basierend auf einem Polypeptid mit einer Masse von
ungefähr
500 Gramm pro Mol, reicht die bevorzugte Plasmakonzentration in
Molarität
etwa von 2 mikromolar (μM) bis
5 millimolar (mM) und bevorzugt von etwa 100 μM bis 1 mM Polypeptid-Antagonist.
Anders ausgedrückt kann
die Dosis pro Körpergewicht
zwischen etwa 0.1 mg/kg bis etwa 300 mg/kg variieren und bevorzugt
von etwa 0.1 mg/kg bis etwa 300 mg/kg in einer oder mehreren täglichen
Dosis-Anwendungen für
einen oder mehrere Tage.
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Die monoklonalen Antikörper oder
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
parenteral durch Injektion oder graduelle Infusion über die
Zeit appliziert werden. Obwohl die zu behandelnden Gewebe typischerweise im
Körper
durch systemische Applikation erreicht werden können, und daher meistens durch
intravenöse
Injektion der therapeutischen Zusammensetzungen behandelt werden,
sind auch andere Gewebe und Freisetzungsmethoden denkbar, bei denen
es wahrscheinlich ist, dass die zu erreichenden Gewebe das Zielmolekül enthalten.
Somit können
monoklonale Antikörper
oder erfindungsgemäße Polypeptide
intravenös,
intraperitoneal, intramuskulär,
subkutan, intrakavitär
und transdermal angewendet werden und können mit peristaltischen Techniken
verabreicht werden.
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Die therapeutischen Zusammensetzungen,
die einen monoklonalen Antikörper
oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid
enthalten, werden konventionell intravenös angewendet, wie zum Beispiel
durch Injektion einer Dosiseinheit. Das Wort "Dosiseinheit", so wie es in der vorliegenden Erfindung
hinsichtlich einer therapeutischen Zusammensetzung gebraucht wird,
bezieht sich auf eine physikalisch diskrete Einheit, die als einzelne
Dosis für
das Subjekt geeignet ist, jede Einheit eine vorher bestimmte Menge
des aktiven Materials enthaltend, die so ausgerechnet wurde, das
die gewünschte
therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel,
z. B. Träger
oder Vehikel, eintritt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
wird der ανβ3-Antagonist
ist in einer einzelnen Dosis intravenös angewendet, wie in den Beispielen
gezeigt. Die Zusammensetzungen werden auf eine Art und Weise angewendet,
die kompatibel mit der Formulierung der Dosis ist und in einer therapeutisch
wirksamen Menge. Die Menge, die verabreicht wird und der Zeitpunkt
der Verabreichung hängen
von dem zu behandelten Subjekt ab, der Kapazität des Systems des Subjekts,
die aktiven Inhaltsstoffe zu nutzen und dem gewünschten Grad des therapeutischen
Effekts. Die genauen Mengen des aktiven Inhaltsstoffes, die für die Verabreichung
benötigt werden,
hängen
von der Beurteilung des Praktikers und ab und sind für jedes
Individuum besondere. Die geeigneten Dosisbereiche für die systemische
Anwendung sind jedoch hier beschrieben und hängen von der Art der Verabreichung
ab. Geeignete Therapiepläne
für die
Anwendung variieren auch, charakterisiert sind sie jedoch durch
eine anfängliche
Verabreichung, gefolgt von wiederholten Dosen in ein oder mehreren
Stunden-Intervallen durch eine nachfolgende Injektion oder andere
Art der Verabreichung. Alternativ wird eine kontinuierliche intravenöse Infusion
vorgeschlagen, um die Konzentrationen im Blut in den Bereichen zu
erhalten, die spezifisch für
in vivo Therapien sind.
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Wie in den Beispielen gezeigt, tritt
die Hemmung der Angiogenese und die Tumorregression schon 7 Tage
nach dem Anfangskontakt mit dem Antagonisten auf. Eine zusätzliche
oder verlängerte
Expositionen gegenüber
dem Antagonisten dauert vorzugsweise 7 Tage bis 6 Wochen, vorzugsweise
etwa 14 bis 28 Tage.
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In einer verwandten Ausführungsform
zeigen die Beispiele die Beziehung zwischen der Hemmung von ανβ3 und
der Apoptose-Induktion in den neovaskulären Zellen, die ανβ3 enthalten.
Die Apoptose manifestiert sich schnell, typischerweise etwa 38 Stunden
nach einem ersten Kontakt mit dem Antagonisten, wobei die Hemmung
der Angiogenese und die Tumorregression sich langsamer manifestiert,
wie hier beschrieben. Dieser Unterschied beeinflusst das therapeutische
Regimen hinsichtlich der Zeit der Verabreichung und des gewünschten
Effekts. Typischerweise kann die Verabreichung für die Apoptose-Induktion in
der Neovaskulatur für
24 Stunden bis etwa 4 Wochen dauern, obwohl 48 Stunden bis 7 Tage
bevorzugt ist.
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D. Therageutische Zusammensetzungen
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Wie hier beschrieben, enthalten die
erfindungsgemäßen therapeutischen
Zusammensetzungen einen physiologisch akzeptablen Träger zusammen
mit einem ανβ-Antagonisten, der
darin als ein aktiver Inhaltsstoff gelöst oder dispergiert vorliegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die therapeutische ανβ3-Antagonist Zusammensetzung
nicht immunogen, wenn sie an einem Säuger oder humanem Patienten
für therapeutische Zwecke
angewendet wird.
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So wie sie hier benutzt werden, sind
die Ausdrücke "pharmazeutisch akzeptabel, "physiologisch tolerabel" und grammatikalische
Varianten davon, wenn sie sich auf Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel
und Reagenzien beziehen, untereinander austauschbar und bedeuten,
dass die Stoffe in einer Weise Säugern
verabreicht werden können,
dass keine unerwünschten
Nebenwirkungen, wie Übelkeit,
Schwindel, Magenverstimmung und ähnliche
auftreten.
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Die Herstellung einer pharmakologischen
Zusammensetzung, die aktive, darin gelöste oder dispergierte Inhaltsstoffe
enthält,
gehört
zum Stand der Technik und eine Limitierung basierend auf der Formulierung ist
nicht erforderlich. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen
als injizierbare Lösungen
hergestellt, entweder in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen, jedoch
können
auch feste Formen, die für
eine Lösung
oder Suspension in Flüssigkeiten
geeignet sind, vor der Anwendung in Flüssigkeit hergestellt werden.
Die Präparation
kann auch emulgiert werden.
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Der aktive Inhaltsstoff kann mit
Arzneistoffträgern
gemischt werden, die pharmazeutisch akzeptabel und kompatibel mit
dem aktiven Inhaltsstoff sind und in Mengen, die für die Verwendung
in den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren geeignet sind.
Geeignete Arzneistoffträger
sind zum Beispiel Wasser, Salzlösung,
Dextrose, Glycerin, Äthanol
oder ähnliche
und Kombinationen aus diesen. Zusätzlich, falls gewünscht, kann
die Zusammensetzung kleinere Mengen von Hilfsstoffen enthalten,
wie z. B. Befeuchtungsmittel, Emulgatoren, den pH Wert puffernde
Agenzien und ähnliche,
die die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffes erhöhen.
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Die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung
kann pharmazeutisch akzeptable Salze ihrer Einzelbestandteile enthalten.
Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen Säureadditionssalze ein (gebildet
aus den freien Aminogruppen der Polypeptide), die mit anorganischen
Säuren,
wie zum Beispiel, Salzsäure
oder Phosphorsäure,
oder solchen organischen Säuren,
wie Essigsäure,
Weinsäure,
Mandelsäure
und ähnliche,
gebildet werden. Salze, die mit den freien Karboxygruppen gebildet
werden, können
auch von anorganischen Basen, wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-,
Ammonium-, Kalzium- oder Eisenhydroxyde, und solche organischen
Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Äthylamino-Äthanol, Histidin, Prokain und ähnliche
abgeleitet werden.
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Bei der Präparation der zyklischen Polypeptid ανβ-Antagonisten
sind die Salze der TFA und HCl besonders bevorzugt. Repräsentative
Salze der Peptide sind in den Beispielen beschrieben.
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Physiologisch tolerable Träger sind
dem Fachmann gut bekannt. Exemplarisch für flüssige Träger sind sterile flüssige Lösungen,
die keine Inhaltsstoffe zusätzlich
zu den aktiven Inhaltsstoffen und Wasser enthalten oder die einen
Puffer enthalten, wie Natriumphosphat bei physiologischen pH Wert,
physiologische Salzkonzentration oder beides, wie Phosphat-gepufferte
Salzlösung.
Darüber
hinaus können
wässrige
Träger
ein oder mehrere Puffersalze enthalten sowie Salze, wie Natrium-
und Kaliumchlorid, Dextrose, Polyethylenglykol und andere gelöste Stoffe.
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Flüssige Zusammensetzungen können auch
flüssige
Phasen zusätzlich
zu Wasser oder zum Ausschluss von Wasser enthalten. Exemplarisch
für solche
zusätzlichen
flüssigen
Phasen sind Glycerin, pflanzliche Öle wie Baumwollsamenöl und Wasser-Öl Emulsionen.
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Eine therapeutische Zusammensetzung
enthält
eine die Angiogenese inhibierende Menge eines ανβ-Antagonisten
der vorliegenden Erfindung, typischerweise so formuliert, dass sie
eine Menge von mindestens 0.1 Gewichtsprozent des Gewichts der therapeutischen
Zusammensetzung enthält.
So entspricht beispielsweise 0.1 Gewichtsprozent 0.1 Gramm eines
Inhibitors pro 100 Gramm der Gesamtzusammensetzung.
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E. ανβ3-Integrin-Antagonisten
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ανβ-Antagonisten
werden gemäß der vorliegenden
Erfindung für
die Inhibierung der Angiogenese in Geweben gebraucht und können eine
Vielfalt von Formen annehmen, die Bestandteile einschließen, die
mit ανβ3 in
einer Art reagieren, dass funktionelle Interaktionen mit natürlichen ανβ3-Liganden
verhindert werden. Exemplarische Antagonisten schließen ανβ3-Analoga
ein, die von der Liganden-Bindungsstelle von ανβ3 abgeleitet
sind, Mimetika von entweder ανβ3 oder
einem natürlichen
Liganden von ανβ3,
die die Strukturregion nachahmen, die an den ανβ3-Ligandenbindungs-Interaktionen
beteiligt ist, Polypeptide, die eine Sequenz aufweisen, die einer
funktionalen Bindungsdomäne
des natürlichen
Liganden entsprechen, der für ανβ3 spezifisch
ist, insbesondere den RGD-enthaltenden Domänen eines natürlichen
Liganden von ανβ3 entsprechen
und Antikörper,
die entweder mit ανβ3 oder
einem natürlichen
Liganden immunreagieren, all diese genannten üben eine antagonistische Wirkung
aus, wie sie hier definiert ist.
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1. Polypegtide
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In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ανβ-Antagonisten
in der Form von Polypeptiden. Ein Polypeptid (Peptid) ανβ3-Antagonist
kann die Sequenzcharakteristika von entweder einem natürlichem
Liganden von ανβ3 oder
die von ανβ3 selbst
in einer Region, die an der ανβ3-Liganden-Interaktion
beteiligt ist, aufweisen und, wie hier beschrieben, ανβ3-antagonistische
Aktivität
aufweist. Ein bevorzugter ανβ3-Peptid-Antagonist enthält das RGD-Tripeptid
und entspricht in der Sequenz dem natürlichen Liganden in der RGD-enthaltenden
Region.
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Bevorzugte RGD-enthaltende Polypeptide
weisen eine Sequenz auf, die der Aminosäuresequenz der RGD-enthaltenden
Region eines natürlichen
Liganden von ανβ3,
wie Fibrinogen, Vitronektin, von Willebrand Faktor, Laminin, Thrombospondin
und ähnlichen
Liganden entspricht. Die Sequenzen dieser ανβ3-Liganden sind
gut bekannt. So kann ein ανβ3-Peptid-Antagonist
von jedem der natürlichen
Liganden abgeleitet werden, obwohl Fibrinogen und Vitronektin bevorzugt
sind.
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Ein besonders bevorzugter ανβ3-Peptid
Antagonist hemmt vorzugsweise die Bindung von ανβ3,
an sein(en) natürlichen
Liganden) im Vergleich zu anderen Integrinen, wie oben beschrieben.
Die ανβ3-spezifischen
Peptide sind zumindest deswegen besonders bevorzugt, weil die ανβ3-Spezifität für das Auftreten
von unerwünschten
Nebenwirkungen, wie die Inhibierung anderer Integrine, reduziert.
Die Identifizierung von bevorzugten ανβ3 Peptid-Antagonisten,
die selektiv für ανβ3 sind,
kann verhältnismäßig leicht
in typischen Inhibitionsassays bestimmt werden, wie der in den Beispielen
beschriebene ELISA.
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In einer Ausführungsform umfasst ein Polypeptid
der vorliegenden Erfindung nicht mehr als 100 Aminosäurereste,
bevorzugt nicht mehr als 60 Reste, bevorzugter nicht mehr als 30
Reste. Die Peptide können linear
oder zyklisch sein, obwohl besonders die zyklischen Peptide bevorzugt
sind.
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Bevorzugte zyklische und lineare
Peptide und ihre Bezeichnungen sind in Tabelle 1 in den Beispielen gezeigt.
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Es sollte verstanden werden, dass
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
nicht identisch mit der Aminosäuresequenz
eines natürlichen
Liganden von ανβ3 sein
muss, so lange es die erforderliche Sequenz einschließt und es
in einem hier beschriebenem Assay ανβ3-antagonistische Aktivität aufweist.
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Ein erfindungsgemäßes Polypeptid schließt ein Analogon,
Fragment oder chemisches Derivat eines Polypeptids ein, dessen Aminosäuresequenz
hier gezeigt ist, so lange wie das Polypeptid ein ανβ3-Antagonist ist.
Daher können
an einem hier beschriebenem Polypeptid auch verschiedenen Veränderungen,
Substitutionen, Insertionen und Entfernungen vorgenommen werden,
so dass bestimmte bestimmte Vorteile im Gebrauch resultieren. In
dieser Hinsicht entsprechen, eher als dass sie identisch sind, die
erfindungsgemäßen ανβ3-Peptid-Antagonisten
der Sequenz eines der zitierten Peptide, wobei ein oder mehrere
Veränderungen
vorgenommen werden, ihre Fähigkeit
als ein ανβ3-Antagonist
in einem oder mehreren Assays, wie sie hier beschrieben sind, zu
wirken, bleibt dabei erhalten.
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Daher kann ein Polypeptid in jeder
einer Vielzahl verschiedener Formen von Peptid-Derivaten auftreten, einschließlich Amiden,
Konjugaten mit Proteinen, zyklischen Peptiden, polymerisierten Peptiden,
Analoga, Fragmente, chemisch modifizierte Peptide und ähnliche
Derivate.
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Der Ausdruck "Analogon" schließt ein Polypeptid ein, das
eine Aminosäuresequenz
aufweist, die im Wesentlichen identisch zu einer Sequenz ist, die
im speziellen hier gezeigt wird, in der ein oder mehrere Reste konservativ
durch einen funktionell ähnlichen
Rest ersetzt wurden, und die ανβ3-antagonistische
Aktivität,
wie hier beschrieben, aufweisen. Beispiele für konservative Austausche schließen den
Austausch eines nicht-polaren
(hydrophoben) Restes wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin
durch einen anderen dieser Reste ein, den Austausch eines polaren
(hydrophilen) Restes durch einen anderen polaren Rest, wie Arginin
durch Lysin, Glutamin durch Asparagin, Glycin durch Serin, den Austausch
eines basischen Restes wie Lysin, Arginin oder Histidin durch einen
anderen dieser Reste oder den Austausch einer Aminosäure, wie
Asparaginsäure
oder Glutaminsäure
füreinander
ein.
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Der Ausdruck "konservativer Austausch" schließt auch
die Verwendung von chemischen Derivaten der Aminosäurereste
an Stelle von nicht-derivatisierten Aminosäureresten ein, vorausgesetzt,
dass so ein Polypeptid die erforderliche inhibitorische Aktivität aufweist.
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Der Ausdruck "chemische Derivate" bezieht sich auf ein erfindungsgemäßes Polypeptid
mit einem oder mehreren Resten, die durch eine Reaktion einer funktionellen
Seitengruppe chemisch derivatisiert wurden. Solche derivatisierten
Moleküle
schließen
zum Beispiel solche Moleküle
ein, in denen freie Aminogruppen zu Aminohydrochloriden, p-Toluensulfonylgruppen,
Karbobenzoxygruppen, t-Butyloxycarbonylgruppen, Chloroacetlygruppen
oder Formylgruppen derivatiert wurden. Freie Karboxygruppen so derivatisiert
werden, dass Salze, Methyl- und Äthylester
oder andere Typen von Estern oder Hydraziden gebildet werden.
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Freie Hydroxylgruppen können so
derivatisiert werden, dass O-Acyl- oder O-Alkylderivate gebildet werden. Der Imidazol-Stickstoff
des Histidins kann so derivatisiert werden, dass er N-im-benzylhistidin
bildet. In den chemischen Derivaten sind auch solche Peptide eingeschlossen,
die ein oder mehrere natürliche
Aminosäurederivate
der 20 Standardaminosäuren
enthalten.
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Zum Beispiel: 4-Hydroxyprolin kann
Prolin ersetzen, 5-Hydroxylysin kann Lysin ersetzen, 3-Methylhistidin
kann Histidin ersetzen, Homoserin kann Serin ersetzen und Ornithin
kann Lysin ersetzen. Polypeptide der vorliegenden Erfindung schließen auch
jedes Polypeptid ein, das ein oder mehrere Additionen und/oder Entfernungen
aufweist oder Reste, die ähnlich
der Sequenz eines Polypeptids sind, dessen Sequenz hier gezeigt
ist, so lange die erforderliche Aktivität erhalten ist.
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Der Ausdruck "Fragment" bezieht sich auf irgendein erfindungsgemäßes Polypeptid,
dass eine Aminosäuresequenz
aufweist, die kürzer
ist, als die eines Polypeptids, dessen Aminosäuresequenz hier gezeigt ist.
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Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid
eine Sequenz aufweist, die nicht identisch mit der Sequenz eines
natürlichen
Ligandens von ανβ3 ist,
dann ist dies typischerweise deshalb der Fall, weil ein oder mehrere konservative
oder nicht-konservative Substitutionen vorgenommen wurden, üblicherweise
werden nicht mehr als ungefähr
30 % und vorzugsweise nicht mehr als 10% der Aminosäurereste
substituiert. Auch können
zusätzliche
Reste an jedem Terminus des Polypeptids angefügt werden, um einen "Linker" bereitzustellen,
mit dem die erfindungsgemäßen Polypeptide
leicht an eine Markierung, eine feste Matrix oder einem Träger angebunden
werden können.
Markierungen, feste Matrizes und Träger, die mit diesen erfindungsgemäßen Polypeptiden
verwendet werden können,
werden weiter unten beschrieben. Aminosäurerest-Linker sind normalerweise
mindestens einen Rest lang und können
40 oder mehr Reste lang sein, häufiger
1 bis 10 Reste, aber sie bilden keine ανβ3 Ligandenepitope.
Typische Aminosäurereste,
die für
die Verknüpfung
gebraucht werden, sind Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutaminsäure und
Asparaginsäure
oder ähnliche.
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Darüber hinaus kann sich ein erfindungsgemäßes Polypeptid,
so lange nicht anders spezifiziert, von der natürlichen Sequenz eine ανβ3-Ligandens
unterscheiden, indem die Sequenz durch terminale NH2-Acylierung,
zum Beispiel Acetylierung oder Thioglykolsäureamidierung, durch terminale
Karboxylamidierung, zum Beispiel mit Ammonium, Methylamin sowie ähnlichen
terminalen Modifikationen verändert
wird. Wie bekannt, sind terminale Modifikationen nützlich,
um die Empfindlichkeit gegenüber
einem proteolytischem Verdau, zu reduzieren, und daher dienen sie
der Verlängerung
der Halbwertszeit der Polypeptide in Lösungen, besonders biologischen
Flüssigkeiten,
in denen Proteasen vorliegen können.
In dieser Hinsicht ist die Zyklisierung der Polypeptide auch eine
nützliche
terminale Modifikation und ist besonders auch deswegen bevorzugt,
weil durch die Zyklisierung stabile Strukturen gebildet werden,
ebenso wie hinsichtlich der biologischen Aktivitäten, die für solche zyklischen Peptide
beobachtet werden, wie hier beschrieben.
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Jedes Peptid der vorliegenden Erfindung
kann in der Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes verwendet
werden. Geeignete Salze, die fähig
sind Salze mit Peptiden dieser Verbindung zu bilden, schließen anorganische
Säuren
ein, wie Trifluoressigsäure
(TFA), Salzsäure
(HCl), Hydrobromsäure,
Perchlorsäure,
Salpetersäure,
Blausäure,
Schwefelsäure,
Phosphorsäure,
Propionsäure,
Glykolsäure,
Milchsäure,
Brenztraubensäure,
Oxasäure,
Malonsäure,
Bernsteinsäure,
Maleinsäure,
Fumarsäure,
Anthranilsäure,
Zimtsäure, Naphthalensulfonsäure, Sulfanilinsäure oder ähnliche.
HCl und TFA sind besonders bevorzugt.
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Geeignete Basen, die Salze mit den
Peptiden der vorliegenden Erfindung bilden können, schließen anorganische
Basen ein, wie Natriumhydroxyd, Ammoniumhydroxyd, Kaliumhydroxyd
und ähnliche,
und organische Basen wie Mono-, Di-, Trialkyl- und Arylamine (z.
B. Triäthylamin,
Diisopropylamin, Methylamin, Dimethylamin und ähnliche) und optional substituierte Äthanolamine
(z. B. Äthanolamin,
Diäthanolamin
und ähnliche).
Ein Peptid der vorliegenden Erfindung, hier auch als erfindungsgemäßes Polypeptid
bezeichnet, kann mit verschiedenen Techniken, einschließlich rekombinanten
DNA Techniken synthetisiert werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet
der Polypeptide bekannt sind. Die Verfahren der synthetischen Chemie,
wie die Festphasen-Synthese vom Typ Merrifield, sind aus Gründen der
Reinheit, Antigenspezifität,
Abwesenheit von unerwünschten
Nebenprodukten, Einfachheit der Herstellung und ähnliches bevorzugt. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung
der vielen verschiedenen verfügbaren
Techniken kann in Steward et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co.,
San Francisco, 1969; Bodanszky, et al., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, Second Edition, 1976; J. Meienhofer, "Hormonal Proteins
and Peptides", Vol.
2, p. 46, Academic Press (New York), 1983; Merrifield, Ady. Enzymol.,
32: 221–96,
1969; Fields et al., Int. J. Peptide Protein Res., 35: 161–214, 1990;
und U.S. Pat. No. 4,244,946 für
Festphasen-Peptidsynthese, und Schroder et al., "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York),
1965 für
klassische Synthesen in Lösung.
Geeignete Schutzgruppen, die in solchen Synthesen verwendet werden,
sind in den obigen Texten und in J. F. W. McOmie, "Protective Groups
in Organic Chemistry",
Plenum Press, New York, 1973 beschrieben.
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Generell umfassen die hier offenbarten
Festphasen-Synthese-Verfahren die sequentielle Addition eines oder
mehrerer Aminosäurereste
oder geeigneter geschützter
Aminosäurereste
zu einer wachsenden Peptidkette. Normalerweise ist entweder die
Amino- oder Karboxygruppe des ersten Aminosäurerestes durch geeignete,
selektiv entfernbare Schutzgruppen geschützt. Eine unterschiedliche,
selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für die Aminosäuren verwendet,
die eine reaktive Seitengruppe, wie Lysin, enthalten.
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Bei der Verwendung der Festphasen-Synthese
beispielsweise, wird die geschützte
oder derivatisierte Aminosäure
durch ihre ungeschützte
Karboxy- oder Aminogruppe an ein inertes festes Trägermaterial
gebunden. Die Schutzgruppe der Amino- oder Karboxygruppe wird dann
selektiv entfernt und die nächste
Aminosäure
in der Sequenz, bei der die komplementäre (Amino oder Karboxy) Gruppe
in geeigneter Weise geschützt ist,
wird zugefügt
und reagiert unter Bedingungen, die für eine Amidbrückenbildung
geeignet sind, wobei der Rest schon an dem festen Trägermaterial
befestigt ist. Die Schutzgruppe der Amino- oder Karboxygruppe wird dann
von diesem neu zugefügtem
Aminosäurerest
entfernt, und die nächste
Aminosäure
(geeignet geschützt) wird
zugefügt
und so weiter. Nachdem alle der gewünschten Aminosäuren in
der richtigen Reihenfolge verknüpft
worden sind, werden die verbliebenen terminalen und Seiten-Schutzgruppen (und
das feste Trägermaterial)
nacheinander oder gleichzeitig entfernt, um letztlich das lineare
Polypeptid zu liefern.
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Die resultierenden linearen Polypeptide,
die z. B. wie oben beschrieben hergestellt werden, können so reagieren,
dass ihre entsprechenden zyklischen Peptide entstehen. Ein exemplarisches
Verfahren ist in Zimmer et al., Peptides 1992, pp. 393–394, ESCOM
Science Publishers, B. V., 1993 beschrieben. Typischerweise wird
ein mit Tertbutoxykarbonyl geschützter
Peptidmethylester in Methanol gelöst, Natriumhydroxydlösung zugefügt und die
Mischung bei 20°C
zur Reaktion gebracht, um die Methylester Schutzgruppe hydrolytisch
zu entfernen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels, wird das Tert-butoxykarbonyl-geschützte Peptid
aus der angesäuertem
wässrigen
Lösung
mit Äthylacetat
extrahiert: Die Tert-butoxykarbonyl Schutzgruppe wird dann mit Dioxan
als weiterem Lösungsmittel
unter milden sauren Bedingungen entfernt. Das so erhaltene, ungeschützte lineare
Peptid mit freien Amino- und Karboxyenden wird dann zu seinen entsprechenden
zyklischen Peptid umgesetzt, indem eine verdünnte Lösung des linearen Peptids in
einer Mischung aus Dichlormethan und Dimethylformamid, mit Dicyclohexylkarbodümide in
der Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol
und N-Methylmorpholin zur Reaktion gebracht wird. Das resultierende
zyklische Peptid wird anschließend
chromatographisch aufgereinigt.
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Ein besonders bevorzugtes Verfahren
zur Synthese von zyklischen Polypeptiden wurde von Gurrath et al.,
Eur. J. Biochem., 210: 911–921
(1992) veröffentlicht
und ist in den Beispielen beschrieben. Besonders bevorzugte Peptide
für die
Verwendung in den vorliegenden Verfahren sind c-(GrGDFV) (SEQ ID
NO 4), c-(RGDfV) (SEQ ID NO 5), c-(RADfV) (SEQ ID NO 6), c-(RGDFV) (SEQ
ID NO 7) und das lineare Peptid YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID NO 8), wobei "c-" ein zyklisches Peptid
anzeigt, die Grossbuchstaben entsprechen dem Einzelbuchstaben Code
für L-Aminosäuren und
die Kleinbuchstaben entsprechen dem Einzelbuchstaben Code für D-Aminosäuren. Die
Aminosäuresequenzen
dieser Peptide sind auch in SEQ ID Nos 4, 5, 6, 7 beziehungsweise
8 gezeigt.
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2. Monoklonale Antikörper
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Die vorliegende Erfindung beschreibt
in einer Ausführungsform ανβ-Antagonisten
in der Form monoklonaler Antikörper,
die mit ανβ3 immunreagieren
und die Bindung von ανβ3 an
seinen natürlichen
Liganden inhibieren, wie hier beschrieben. Hier sind auch Zelllinien,
die Antikörper
produzieren, Methoden zur Herstellung der Zelllinien und Methoden
für die
Herstellung monoklonaler Antikörper
beschrieben. Ein erfindungsgemäßer monoklonaler
Antikörper
umfasst Antikörpermoleküle, die
1) mit isoliertem ανβ3 immunreagieren
und 2) die Fibrinogen Bindung an ανβ3 inhibieren.
Bevorzugte monoklonale Antikörper,
die präferentiell
an ανβ3 binden, schließen monoklonale
Antikörper
ein, die die Immunreaktionscharakteristika des mAbs LM609, aufweisen, der
von der Hybridomzelllinie ATCC HB 9537 sezerniert wird. Die Hybridomzelllinie
ATCC HB 9537 wurde bei der ATCC gemäß den Erfordernissen des Budapester
Vertrags bei der American Type Culture Collection (ATCC), 1301 Parklawn
Drive, Rockville, Md., USA, on Sep. 15, 1987 hinterlegt.
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Der Ausdruck "Antikörper oder Antikörpermolekül" in den verschiedenen
grammatikalischen Formen wird hier als ein kollektives Substantiv
verwendet, das sich auf eine Population von, Immunglobulinmolekülen und/oder
immunologisch aktiven Teilen eines Immunglobulinmoleküls bezieht,
d. h. Moleküle
die eine Stelle enthalten, die eine Antikörper-Kombinationsstelle oder
ein Paratop enthalten.
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Eine "Antikörper-Kombinationsstelle" ist der Strukturanteil
eines Antikörpermoleküls, der
die variablen und hypervariablen Regionen der schweren und leichten
Kette umfasst, die spezifisch das Antigen binden.
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Beispielhafte Antikörper zur
Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind intakte Immunoglobulinmoleküle, die
in erheblichen Ausmaß mit
Immunoglobulinmolekülen
interagieren und die Anteile eines Immunoglobulinmoleküls, das
Paratop enthalten, einschließlich
der Anteile, die im Stand der Technik als Fab, Fab', F(ab')2 und
F(v) bezeichnet werden und auch als Antikörpertragmente bezeichnet werden.
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In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
offenbart die Erfindung ein verkürztes
Immunoglobulinmolekül,
das ein Fab Fragment umfasst, dass von einem monoklonalen erfindungsgemäßen Antikörper abgeleitet
ist. Das Fab Fragment, dem der Fc Rezeptor fehlt, ist löslich und
ermöglicht
therapeutische Vorteile in Bezug auf die Halbwertszeit im Serum
sowie auch diagnostische Vorteile hinsichtlich der Art und Weise,
wie das lösliche
Fab Fragment verwendet werden kann. Die Herstellung eines löslichen
Fab Fragments ist allgemein im Stand der Technik auf dem Gebiet
der Immunologie bekannt und kann durch eine Vielfalt an Verfahren erreicht
werden.
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Zum Beispiel werden die Fab und F(ab')2 Anteile
(Fragmente) der Antikörper
durch eine proteolytische Reaktion der im wesentlichen intakten
Antikörper
mit Papain beziehungsweise Pepsin, hergestellt, Verfahren, die gut
bekannt ist. Siehe zum Beispiel im U.S. Pat. No. 4,342,566 von Theofilopolous
and Dixon. Fab' Antikörperanteile
sind auch gut bekannt und werden aus F(ab')2 Anteilen
hergestellt, gefolgt von einer Reduktion der Disulfidbrücken, die
die zwei schweren Ketten verknüpfen,
zum Beispiel mit Mercaptoäthanol,
gefolgt von einer Alkylierung des resultierenden Proteinmercaptans
mit einem Reagenz wie Jodoacetamid. Ein Antikörper, der intakte Immunoglobulinmoleküle enthält, ist
bevorzugt und wird so verwendet, wie hier beschrieben.
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Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" in seinen verschiedenen grammatikalischen
Formen bezieht sich auf ein Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Spezies einer
Antikörperkombinationsstelle
enthält,
die fähig
ist mit einem bestimmten Epitop zu immunreagieren. Ein monoklonaler
Antikörper
weist demnach typischerweise eine einzige Bindungsaffinität für irgendein
Epitop auf, mit dem er immunologisch keuzreagiert. Ein monoklonaler
Antikörper
kann folglich ein Antikörpermolekül enthalten,
das eine Vielzahl an Kombinationsstellen eines Antikörpers enthält, wobei
jedes immunspezifisch für
ein unterschiedliches Epitop ist, z. B. ein bispezifischer monoklonaler
Antikörper.
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Ein monoklonaler Antikörper ist
typischerweise aus Antikörpern
zusammengesetzt, die von Einzelzellklonen, Hybridome genannt, sezerniert
(produziert) werden und die nur eine Art eines Antikörpers sezernieren. Die
Hybridomzelle entsteht durch Fusion einer Antikörper produzierenden Zelle mit
einem Myelom oder mit anderen sich selbst erhaltenden Zelllinien.
Die Herstellung solcher Antikörper
wurde zuerst von Köhler
and Milstein, Nature 256: 495–497
(1975) beschrieben. Weitere Methoden wurden von Zola, Monoclonal
Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) beschrieben.
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Die so gewonnennen Hybridomüberstände können auf
die Anwesenheit eine Antikörpermoleküls, das mit ανβ3 immunologisch
keuzreagiert oder, das die Bindung von ανβ3 an
seine natürlichen
Liganden inhibiert, durchgemustert werden.
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In Kürze, um die Hybridome zu bilden,
aus denen die monoklonale Antikörperzusammensetzung
gewonnen wird, werden Myelome oder andere sich selbst erhaltende
Zelllinien mit Lymphozyten fusioniert, die von der Milz eines mit ανβ3 hyperimmunisierten
Säugers
stammen, ανβ3 wurde
beispielsweise aus M21 humanem Melanomzellen isoliert, wie bei Cheresh
et al., J. Biol. Chem., 262: 17703–17711 (1987) beschrieben.
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Es ist bevorzugt, dass die Myelom-Zelllinie,
die verwendet wird, um das Hybridom herzustellen, von derselben
Tierart wie die Lymphozyten stammt. Typischerweise sind Mäuse des
Stammes 129 GIX+ die bevorzugte Säugerart.
Geeignete Mausmyelome zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
schließen
die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-sensitiven
(HAT) Zelllinien P3X63-Ag8.653 und Sp2/0-Ag14 ein, die von der American
Type Culture Collection, Rockville, Md., unter den Bezeichnungen
CRL 1580 beziehungsweise CRL 1581 erhältlich sind.
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Die Milzzellen werden typischerweise
mittels Polyethylenglycol (PEG) 1500 mit den Myelomzellen fusioniert.
Die fusionierten Hybride werden dann durch ihre Sensitivität gegenüber HAT
selektiert. Die Hybridome, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper
produzieren, werden durch Verwendung des "enzyme linked immunosorbant assay" ELISA wie in den
Beispielen beschrieben, identifiziert.
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Ein monoklonaler Antikörper der
vorliegenden Erfindung kann auch durch den Start einer monoklonalen
Hybridomkultur hergestellt werden, das Nährmedium umfassend, das ein
Hybridom enthält,
welches Antikörpermoleküle der geeigneten
Spezifität
sezerniert. Die Kultur wird unter den Bedingungen und für die Dauer gehalten,
die ausreichen, dass das Hybridom Antikörpermoleküle in das Medium sezerniert.
Das Antikörper enthaltende
Medium wird dann gesammelt. Die Antikörpermoleküle können dann weiter durch gut
bekannte Techniken isoliert werden.
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Kulturmedien, die für die Verwendung
dieser Zusammensetzungen verwendet werden können, sind in der Technik gut
bekannt und kommerziell erhältlich
und schließen
synthetische Nährmedien,
Inzucht-Mäuse und ähnliches
ein. Ein exemplarisches synthetisches Medium ist "Dulbecco's minimal essential
medium" (DMEM; Dulbecco
et al., Virol. 8: 396, 1959), angereichert mit 4.5 g/l Glukose,
20 mM Glutamin und 20% fötalem
Kälberserum.
Ein Beispiel für
einen Inzucht-Mausstamm ist der Balb/c Stamm. Andere Verfahren für die Herstellung
monoklonaler Antikörper,
einer Hybridom-Zelllinie oder einer Hybridom-Zellkultur sind gut
bekannt. Siehe z. B. das von Sastry, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 86: 5728–5732
(1989) und Huse et al., Science, 246: 1275–1281 (1989) beschriebene Verfahren,
monoklonale Antikörper
aus einem immunologischen Repertoire zu isolieren.
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Die vorliegenden Erfindung schlägt auch
Hybridomzellen und Kulturen vor, die Hybridomzellen enthalten, die
einen erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper
produzieren. Besonders bevorzugt ist die Hybridom-Zelllinie, die
den monoklonalen Antikörper
mAb LM609, bezeichnet als ATCC HB 9537, sezerniert. Der mAb LM609
wurde, wie bei Cheresh et al., J. Biol. Chem., 262: 17703–17711 (1987)
beschrieben, hergestellt und seine Präparation ist auch in den Beispielen
beschrieben.
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Die Erfindung betrifft in einer Ausführungsform
einen monoklonalen Antikörper,
der die Immunreaktionscharakteristika des mAb LM609 aufweist.
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Es ist auch ohne einen unzumutbaren
experimentellen Aufwand möglich,
festzustellen, ob ein monoklonaler Antikörper dieselbe (d. h. äquivalente)
Spezifität
(Immunreaktionscharakteristika) wie ein erfindungsgemäßen monoklonaler
Antikörper
aufweist, indem bestimmt wird, ob der Erstere verhindert, dass Letzterer
an ein vorher ausgewähltes
Zielmolekül
bindet. Wenn der zu testende monoklonale Antikörper mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper
konkurriert, wie in Standard-Kompetitionsassays
durch eine Abnahme der Bindung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers an
das an eine feste Phase gebundene Zielmolekül gezeigt werden kann, dann
ist es wahrscheinlich, dass die beiden monoklonalen Antikörper an dasselbe
oder an ein eng verwandtes Epitop binden.
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Eine weitere Möglichkeit zu bestimmten, ob
ein monoklonaler Antikörper
die Spezifität
eines erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörpers
besitzt, besteht darin, den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mit
dem Zielmolekül,
mit dem er normalerweise reagiert, vorzuinkubieren und dann den
zu testenden monoklonalen Antikörper
zufügt,
um zu ermitteln, ob der zu testende monoklonale Antikörper inhibiert
ist, an das Zielmolekül
zu binden. Ist der zu testende monoklonale Antikörper inhibiert, weist er aller
Wahrscheinlichkeit nach dieselbe oder eine funktionell äquivalente
Spezifität
für ein
Epitop wie der erfindungsgemäße monoklonale
Antikörper
auf.
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Eine weitere Methode zu bestimmen,
ob ein monoklonaler Antikörper
die Spezifität
eines erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörpers
aufweist, besteht darin, die Aminosäuresequenz in der CDR Region
der fraglichen Antikörper
zu ermitteln. Antikörpermoleküle, die
identische, oder funktionell äquivalente
Aminosäuresequenzen
in ihren CDR Regionen aufweisen, haben dieselbe Bindungsspezifität. Im Stand
der Technik sind Verfahren, Polypeptide zu sequenzieren, gut bekannt.
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Die Immunspezifität eines Antikörpers, seine
Kapazität
Zielmoleküle
zu binden und die damit verbundene Affinität, die der Antikörper gegenüber einem
Epitop aufweist, sind durch das Epitop bestimmt, mit dem der Antikörper immunologisch
keuzreagiert. Die Epitop-Spezifität ist zumindest teilweise durch
die Aminosäuresequenz
der variablen Region der schweren Kette des Immunglobulins des Antikörpers bestimmt
und zum Teil durch die Aminosäuresequenz
der leichten Kette.
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Die Verwendung des Ausdrucks "die Bindungsspezifität aufweisen
von" zeigt an, dass äquivalente
monoklonale Antikörper
dieselbe oder ähnliche
Immunreaktions- (Bindungs-) Charakteristika aufweisen und um die
Bindung ausgewählter
Zielmoleküle
konkurrieren.
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Humanisierte monoklonale Antikörper bieten
besondere Vorteile gegenüber
murinen monoklonalen Antikörpern,
besonders insofern als sie für
therapeutische Zwecke in Menschen verwendet werden können. Im
Besonderen werden humanisierte Antikörper nicht so schnell aus dem
Blutkreislauf entfernt wie "fremde" Antigene, und außerdem aktivieren
sie das Immunsystem nicht in der Weise wie fremde Antigene und fremde Antikörper. Verfahren
der Herstellung "humanisierter" Antikörper sind
im Stand der Technik gut bekannt und können unmittelbar auf die erfindungsgemäßen Antikörper angewendet
werden.
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Folglich schlägt die Erfindung in einer Ausführungsform
einen erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper
vor, der durch "grafting" humanisiert wurde,
um Komponenten des humanen Immunsystems einzuführen, ohne dass die Fähigkeit
des Antikörpers
Antigene zu binden, wesentlich beeinflusst ist.
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ανβ3-spezifische
Mimetika
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Die vorliegende Erfindung zeigt,
dass ανβ-Antagonisten
allgemein in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, diese
Antagonisten schließen
Polypeptide, Antikörper
und andere Moleküle, "Mimetika" genannt, ein, die
die Kapazität
aufweisen, mit der ανβ3-Funktion
zu interferieren. Besonders bevorzugt sind Antagonisten, die spezifisch
mit der ανβ3-Funktion
interferieren und nicht mit der Funktion anderer Integrine interferieren.
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In diesem Zusammenhang wird festgestellt,
dass eine Vielfalt von Reagenzien für eine Verwendung in den vorliegenden
Verfahren geeignet sein kann, so lange wie diese Reagenzien die
geforderte biologische Aktivität
aufweisen. Diese Reagenzien werden generisch als Mimetika bezeichnet,
weil sie die Fähigkeit
besitzen, eine Bindungsdomäne
von entweder ανβ3 oder
dem ανβ3-Liganden
nachzuahmen, die an der funktionellen Interaktion des Rezeptors
und Ligandens beteiligt ist, und dadurch mit der normalen Funktion
interferieren, d. h. diese inhibieren.
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Ein ανβ3-Mimetikum
ist irgendein Molekül,
außer
ein Antikörper
oder ein von einem Liganden abgeleitetes Peptid, das eine der oben
beschriebenen Eigenschaften aufweist. Es kann ein synthetisches
Analogon eines Peptids sein, eine Verbindung, die eine Form aufweist,
wie die Bindungstasche der oben beschriebenen Bindungsdomäne oder
andere Moleküle.
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Das Design eines ανβ3-Mimetikums
kann mit irgendeiner Vielfalt an Strukturanalyse-Verfahren für das Design von Pharmaka,
wie sir im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt werden,
einschließlich "molecular modeling", zweidimensionale
Kernspinresonanzanalyse (2-D NMR), Röntgenstrahl-Kristallographie,
zufälliges
Durchmustern von Peptiden, Peptidanaloga oder anderer chemischer
Polymer-Bibliotheken,
und ähnliche
Verfahren für
das Design von Pharmaka.
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Angesichts der in der vorliegenden
Beschreibung erläuterten,
guten strukturellen Hinweise, die zeigen, dass der Antagonist ein
kleines Polypeptid oder ein monoklonaler Antikörper sein kann, zwei völlig unterschiedliche
chemische Strukturen, die die funktionelle Eigenschaft einer selektiven
Hemmung von ανβ3 teilen, braucht
die Struktur des erfindungsgemäßen ανβ3-Antagonisten
für eine
Anwendung in den vorliegenden Verfahren nicht limitiert zu sein,
sondern schließt
jedes Mimetikum, so wie es hier definiert ist, ein.
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F. Verfahren zur Identifikation
von ανβ-Antagonisten
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Hier sind auch Testverfahren zur
Identifikation von Kandidaten für ανβ-Antagonisten
zur Verwendung gemäss
der vorliegenden Verfahren beschrieben. In diesen Testverfahren
werden Kandidatenmolelüle
auf ihre Wirksamkeit hinsichtlich einer Inhibition der ανβ3-Bindung an natürliche Liganden
untersucht und weiter wird ihre Effizienz, die Angiogenese in einem
Gewebe zu hemmen, ermittelt.
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Der erste Assay misst die Hemmung
einer direkten Bindung eines natürlichen
Liganden an ανβ3 und eine
bevorzugte Ausführungsform
ist in den Beispielen im Detail beschrieben. Der Assay misst typischerweise das
Maß der
Inhibition der Bindung eines natürlichen
Liganden, wie Fibrinogen, an isoliertes ανβ3 in
einer festen Phase durch ELISA.
-
Der Assay kann auch zur Identifikation
von Stoffen verwendet werden, die eine Spezifität für ανβ3 aufweisen,
aber nicht die Bindung von natürlichen
Liganden an andere Integrine hemmen. Der Spezifitätstest wird so
durchgeführt,
dass mehrere ELISAs parallel durchgeführt werden, in denen sowohl ανβ3 als
auch andere Integrine gleichzeitig in separaten Testkammern auf
ihre jeweiligen Eigenschaften hin durchgemustert werden, einen natürlichen
Liganden zu binden und es wird getestet, ob die Kandidatenmoleküle die jeweiligen
Eigenschaften der Integrine, an vorselektierte Liganden zu binden,
inhibieren. Bevorzugte Testformate, die für eine Durchmusterung geeignet
sind, werden in den Beispielen angegeben.
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Der zweite Assay misst die Angiogenese
in der Hühner-Chorioallantois-Membran
(CAM) und wir hier als CAM-Assay bezeichnet. Der CAM-Assay wurde
im Detail von anderen beschrieben und wurde sowohl zur Messung der
Angiogenese als auch der Neovaskularisierung von Tumorgeweben verwendet.
Siehe Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79: 597–618 (1975) und Ossonski et
al., Cancer Res., 40: 2300–2309
(1980). Der CAM-Assay ist ein gut bekanntes Assaymodell für die in
vivo Angiogenese, weil eine Neovaskularisierung eines gesamten Gewebes
auftritt und echte Hühnerembryonen-Blutgefäße in die
CAM hineinwachsen oder in die Gewebe, die auf der CAM wachsen, hineinwachsen.
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Der CAM-Assay zeigt eine Inhibierung
der Neovaskularisierung sowohl durch Veränderungen in der Menge als
auch des Ausmasses des Wachstums neuer Gefäße an, wie hier beschrieben.
Weiterhin ist es leicht, das Wachstum irgendeines Gewebes, das auf
die CAM transplantiert wurde, wie z. B. Tumorgewebe, zu verfolgen.
Schließlich
ist der Assay besonders nützlich,
weil er eine interne Toxizitätskontrolle
ermöglicht. Der
Hühnerembyo
wird irgendeinem Testreagenz ausgesetzt, so dass der Gesundheitszustand
des Embryos einen Hinweis auf Toxizität des Testreagenzes gibt. Der
dritte Assay misst die Angiogenese in dem in vivo Kaninchenaugen-Modell
und wird hier als Kaninchenauge-Assay bezeichnet. Der Kaninchenaugen-Assay
wurde im Detail von anderen beschrieben und wurde verwendet, um
sowohl die Angiogenese als auch die Neovaskulogenese in der Anwesenheit
von angiogenen Inhibitoren, wie z. B. Thalidomid, zu messen. Siehe
D'Amato, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 4082–4085 (1994).
-
Der Kaninchenaugen-Assay ist ein
gut bekanntes Assay-Modell für
die in vivo Angiogenese, weil der Prozess der Neovaskularisierung,
z. B. wenn Blutgefäße des Kaninchens
vom Rand der Kornea in die Kornea hineinwachsen, durch die natürliche Transparenz
der Kornea leicht erkennbar ist. Darüber hinaus kann sowohl das
Ausmaß als
auch die Menge der Stimulierung oder Hemmung die Neovaskulogenese
oder die Rückbildung
der Neovaskulogenese leicht über
die Zeit verfolgt werden.
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Schließlich wird das Kaninchen irgendeinem
Testreagenz ausgesetzt, so dass der Gesundheitszustand des Kaninchens
dann einen Hinweis auf Toxizität
des Assayreagenzes gibt.
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Der vierte Assay misst die Angiogenese
in einem chimären
Maus : Mensch Maus-Modell und wird hier als chimärer Maus-Assay bezeichnet.
Der Assay wurde im Detail von anderen beschrieben und wird hier
als ein Assay beschrieben, mit dem die Angiogenese, die Neovaskularisierung
und die Regression von Tumorgeweben gemessen werden kann. Siehe
Yan, et al., J. Clin. Invest., 91: 986–996 (1993). Der chimäre Maus-Assay
ist ein nützliches
Assay-Modell für
die in vivo Angiogenese, weil die transplantierten Hauttransplantate
der normalen humanen Haut histologisch sehr ähneln und die Neovaskularisierung
im gesamten Gewebe stattfindet, wobei echte humane Blutgefäße von der
transplantierten humanen Haut in das humane Tumorgewebe, das sich
auf der Oberfläche
der transplantierten humanen Haut befindet, hineinwachsen. Der Ursprung
der Neovaskularisierung in dem humanen Transplantat kann durch immunhistochemische
Färbeverfahren
der Neovaskulatur mit human-spezifischen Endothelzell-Markern nachgewiesen
werden.
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Wie hier beschrieben, zeigt der chimäre Maus-Assay
die Rückbildung
der Neovaskularisierung durch die Menge und das Ausmaß der Abnahme
neuen Gefäßwachstums
an. Weiterhin ist es einfach, die Effekte auf das Wachstum irgendeines
Gewebes, das auf die transplantierte Haut transplantiert wird, wie
z. B. Tumorgewebe, zu verfolgen. Schließlich ist der Assay auch nützlich,
weil eine interne Toxizitätskontrolle
in dem Testsystem gegeben ist. Die chimäre Maus wird irgendeinem Testreagenz
ausgesetzt, so dass der Gesundheitszustand der Maus ein Hinweis
auf die Toxizität
gibt.
-
BEISPIELE
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Die folgenden Beispiele, die sich
auf diese Erfindung beziehen, sind erläuternd und sollten selbstverständlich nicht
als die Erfindung spezifisch begrenzend aufgefasst werden. Weiter
sollten solche erfindungsgemäßen Varianten,
die schon jetzt bekannt sind oder später entwickelt werden und die
im Wissensbereich des Fachmanns auf diesem Gebiet liegen, so betrachtet
werden, dass sie in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen,
so wie er hier beansprucht wird. Die Beispiele beschreiben, inter
alia, die Behandlung von Melanomen, diese Behandlung wird nicht
beansprucht und wird nur aus illustrativen Zwecken beschrieben.
-
1. Herstellung synthetischer
Peptide
-
Die linearen und zyklischen Polypeptide,
die in Tabelle 1 aufgelistet sind, wurden nach Standard-Festphasen-Synthesetechniken
synthetisiert, z. B. wie in Merrifield, Adv. Enzymol., 32: 221–96, (1969)
und Fields, G. B. and Noble, R. L., Int. J. Peptide Protein Res.,
35: 161–214,
(1990) beschrieben.
-
Zwei Gramm (g) BOC-GIy-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe
(SEQ ID NO 1) wurden zuerst in 60 Millilitern (ml) Methanol gelöst und dann
1.5 ml 2 N Natriumhydroxydlösung
zugefügt,
um ein Gemisch zu erhalten. Dieses Gemisch wurde dann für 3 Stunden
bei 20°C
gerührt.
Nach Eindampfen wurde der Rückstand
in Wasser aufgelöst,
mit verdünnter
HCl auf einen pH Wert von 3 angesäuert und mit Äthylacetat
extrahiert. Der Extrakt wurde über
Na2SO4 getrocknet,
wieder eingedampft und das resultierende BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp Phe-Val-OH (SEQ
ID NO 2) für
2 Stunden mit 20 ml 2 N HCl in Dioxan bei 20°C gerührt. Das resultierende Gemisch
wurde verdampft, um N-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO 3) zu erhalten, dass nachfolgend
in einer Mischung aus 1800 ml Dichlormethan und 200 ml Demethylformamid
(DMF) gelöst
wurde und dann auf 0°C
abgekühlt
wurde. Danach wurden sukzessive 0.5 g Dicyclocarbodiimid (DCCl),
0.3 g 1-Hydroxybenzotriazol
(HOBt) und 0.23 ml N-Methylmorpholin unter Rühren zugegeben. Das resultierende
Gemisch wurde für
weitere 24 Stunden bei 0°C
gerührt
und dann bei 20°C
für weitere
48 Stunden. Die Lösung
wurde konzentriert und zur Salzentfernung mit einem gemischten Ionenaustauscherbett
behandelt. Nachdem das resultierende Granulat durch Filtration entfernt
worden war, wurde die geklärte
Lösung
verdampft und der Rückstand
durch Chromatographie aufgereinigt, so dass schließlich cyclo(-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)
(SEQ ID NO 4) erhalten wurde. Die folgenden Peptide, die in der
Tabelle 1 mit dem für
den Aminosäurecode üblichen Einzelbuchstaben-Abkürzungen
aufgelistet sind und durch ihre Peptidnummer gekennzeichnet sind,
werden analog erhalten: cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO
5); cyclo(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO 6); cyclo(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val)
(SEQ ID NO 9); cyclo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID NO 7). Ein Peptid, dass als
66203 bezeichnet wird und eine identische Sequenz zu der des Peptids
62184 aufweist, unterscheidet sich von letzterem nur dadurch, dass
es das Salz der HCl anstelle von TFA, wie bei 62184, enthält. In den
Angiogenese-Inhibierungsassays, in denen die synthetischen Peptide,
wie in dem Beispiel 7 beschrieben, eingesetzt wurden, war das 66203
Peptid mit HCl etwas wirksamer als das identische Peptid mit TFA
bei der Inhibierung der Angiogenese.
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Ein Peptid, das als 69601 bezeichnet
wird und eine identische Sequenz zu der des Peptids 62185 aufweist,
unterscheidet sich von Letzterem nur dadurch, dass es das Salz der
HCl anstelle der TFA, wie bei 62184, enthält. Es wurde gezeigt, dass
das zyklische c-RADfV-Peptid (69601) die Bindung von Fibrinogen
an ανβ3 inhibiert,
aber nicht die Bindung von Fibrinogen an die αIIbβ3-
oder ανβ1-Integrine
(Pfaff, et al., J. Biol. Chem., 269: 20233–20238, 1994). Daher ist das
c-RADfV-Peptid spezifisch für ανβ3.
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2. Monoklonale Antikörper
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Der von der Hybridomzelllinie ATCC
HB 9537 sezernierte Antikörper
LM609 wurde mittels Standard-Hybridom-Methoden durch Immunisierung
mit isoliertem ανβ3,
das an Sepharose-Linsenlektin-Perlen gekoppelt war, hergestellt.
Das ανβ3 wurde
aus humanen Melanomzellen, M21 genannt, isoliert und der Antikörper wie
bei Cheresh et al., J. Biol. Chem., 262: 17703–17711 (1987) beschrieben,
hergestellt. Die M21 Zellen wurden von Dr. D. L. Morton (University
of California, Los Angeles, CA) bereitgestellt und in Suspensionskulturen
in RPMI 1640 Zellkulturmedium, 2 mM L-Glutamin, 50 mg/ml Gentamycinsulfat
und 10% fötalem
Kälberserum
enthaltend, wachsen gelassen. Es wurde gezeigt, dass der monoklonale
Antikörper
LM609 spezifisch mit dem ανβ3-Komplex immunologisch
kreuzreagiert und nicht mit der αν-Untereinheit,
der β3-Unterheft oder mit anderen Integrinen.
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3. Charakterisierung der
Verteilung der ανβ3 Expression
im Gewebe
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A. Immunfluoreszenz mit
Anti-Integrinrezeptor-Antikörpern
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Während
der Wundheilung exprimieren die Basalmembranen der Blutgefäße zahlreiche
Adhäsionsproteine,
einschließlich
des von Willebrand-Faktors, Fibronektins und Fibrins. Darüber hinaus
sind zahlreiche Mitglieder der Integrinfamilie der Adhäsionsrezeptoren
auf der Oberfläche
kultivierter glatter Muskelzellen und Endothelzellen exprimiert.
Siehe Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 6471 (1987); Janat
et al., J. Cell Physiol., 151: 588 (1992); und Cheng et al., J.
Cell Physiol., 139: 275 (1989).
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Unter diesen Integrinen ist ανβ3 der
endotheliale Rezeptor für
den von Willebrand Faktor, Fibrinogen (Fibrin) und Fibronektin,
wie bei Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 6471 (1987) beschrieben.
Dieses Integrin vermittelt eine Kalzium-abhängige Signalkette, die zur
Wanderung der Endothelzellen führt
und daher eine fundamentale Rolle in der Gefäßbiologie spielt, wie bei Leavelsey
et al., J. Cell Biol., 121: 163 (1993) beschrieben.
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Zur Bestimmung der Expression von ανβ3 während der
Angiogenese wurde humanes Wundgranulationsgewebe oder benachbarte
normale Haut von Patienten, die in diese Prozedur eingewilligt hatten,
erhalten, das Gewebe mit 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen
und in O. T. C. Medium (Tissue Tek) eingebettet. Das eingebettete
Gewebe wurde für
30 bis 45 Sekunden in flüssigem
Stickstoff schockgefroren. Sechs Mikrometer dicke Schnitte wurden
dann aus den gefrorenen Blöcken
mit einem Kryostat-Mikrotom hergestellt und nachfolgend eine Immunperoxidase-Färbung mit
Antikörpern
durchgeführt,
die entweder spezifisch für
die β3-Integrine, (ανβ3 oder αIIbβ3)
oder die β1-Unterfamilie der Integrine waren.
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Die Ergebnisse einer Färbung von
normaler Haut und Wundgranulationsgewebe sind in den 1A–1D gezeigt.
Die monoklonalen Antikörper
AP3 und LM534, die gegen β3 bzw. β1 Integrine gerichtet sind, wurden für immunhistochemische
Analyse auf gefrorenen Schnitten verwendet. Die Experimente mit
Geweben, die von vier verschiedenen humanen Spendern erhalten wurden,
ergaben identische Resultate. Die mikroskopischen Fotos stellen
eine 300-fache Vergrößerung dar.
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Das ανβ3-Integrin
war sehr stark in den Blutgefäßen des
Granulationsgewebes exprimiert (1B), war
aber nicht in der Dermis und dem Epithelium normaler Haut desselben
Spenders nachzuweisen (1A). Im
Gegensatz dazu waren die β1-Integrine
sehr stark auf den Blutgefäßen und
Stromazellen sowohl in normaler Haut (1C)
als auch in Granulationsgewebe (1D)
exprimiert und, wie vorher von Adams et al., Cell 63: 425 (1991)
gezeigt, auf den Basalzellen innerhalb des Epitheliums.
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B. Immunfluoreszenz mit
Anti-Liganden Antikörpern
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Zusätzliche Schnitte der normalen,
humanen Haut und von Granulationsgeweben, herstellt, wie oben beschrieben,
wurden auch auf die Anwesenheit von Liganden für die β3- und β1-Integrine,
von Willebrand Faktor beziehungsweise Laminin untersucht. Der von
Willebrand Faktor war in den Blutgefäßen in normaler Haut (2A) und im Granulationsgewebe
(2B) nachzuweisen, wohingegen
Laminin in allen Blutgefäßen so wie
in der epithelialen Basalmembran beider Gewebepräparate auftrat (2C und 2D).
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C. Verteilung von Anti-ανβ3-Antikörpern auf
Krebsgeweben
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Zusätzlich zu den oben beschriebenen
Untersuchungen wurden auch Biopsien von Krebsgeweben humaner Patienten
auf die Anwesenheit und Verteilung von ανβ3 untersucht.
Die Gewebe wurden, wie in Beispiel 1A beschrieben, hergestellt,
mit der Ausnahme, dass sie mit dem monoklonalen Antikörper LM609,
hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben, der spezifisch für den Integrin-Rezeptor-Komplex ανβ3 ist,
gefärbt
wurden. Zusätzlich
wurden Tumoren auch für
die mikroskopisch-histologische Analyse präpariert, indem repräsentative
Beispiele von Tumoren in Bulins Fixativ für 8 Stunden fixiert wurden,
serielle Schnitte hergestellt und mit H & E gefärbt wurden.
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Die Ergebnisse der Immunperoxidase-Färbungen
von Blasen-, Kolon-, Brust und Lungenkrebsgeweben sind in den 3A, 3B, 3C beziehungsweise
3D gezeigt. ανβ3 ist
nur auf den Blutgefäßen stark
experimiert, die in den vier untersuchten Krebsbiopsien vorhanden
sind, nicht jedoch auf irgendeiner der anderen in den Geweben vorliegenden
Zellen. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen somit, dass der ανβ3-Integrin-Rezeptor
selektiv in spezifischen Gewebetypen, nämlich granuliertem metastatischen
Geweben und anderen Geweben, in denen Angiogenese stattfindet, exprimiert
ist und nicht in normalen Geweben, wo die Bildung der Blutgefäße gestoppt
ist. Diese Gewebe stellen somit einen idealen Angriffspunkt für therapeutische Behandlungen
gemäß dieser
Erfindung dar.
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4. Identifikation von ανβ3-spezifischen
synthetischen Peptiden, detektiert durch einen Liganden-Rezeptor-Bindungsassay
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Die synthetischen Peptide, synthetisiert,
wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden durch Bestimmen der Wirksamkeit,
mit der sie die ανβ3 und αIIbβ3-Rezeptor-Bindungsaktivität in gereinigten
Liganden-Rezeptor-Bindungsassays antagonisieren, durchgemustert.
Die Methoden für
diese Bindungsstudien wurden von Barbas et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 90: 10003–10007
(1993), Smith et al., J. Biol. Chem., 265: 11008–11013 (1990) und Pfaff et
al., J. Biol. Chem., 269: 20233–20238
(1994) beschrieben.
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Im Folgenden wird eine Methode zur
Identifizierung von Antagonisten in einem Liganden-Rezeptor-Bindungsassay
beschrieben, in dem der Rezeptor an ein unbewegliches festes Trägermaterial
gebunden ist und der Ligand und die Antagonisten löslich sind.
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Kurz gefasst werden ausgewählte, gereinigte
Integrine einzeln mit einer Konzentration von 50 Nanogramm (ng)
pro Reaktionskammer für
die Anheftung in "Titertek
Mikrotiterwells" immobilisiert.
Die für
den Liganden-Rezeptor-Bindungsassay benötigte Aufreinigung der Rezeptoren
kann leicht durch Anwendung von Methoden erhalten, die dem Fachmann
gut bekannt sind. Nach Inkubation bei 4°C für 18 Stunden wurden nichtspezifische
Bindungsstellen auf der Platte durch Zugabe von 10 Milligramm/Milliliter
(mg/ml) Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepufferter Salzlösung blockiert.
Für die
Inhibitionsuntersuchungen wurden unterschiedliche Konzentrationen
der aus Tabelle 1 ausgewählten
Peptide auf ihre Fähigkeit
getestet, die Bindung von J125-Vitronektin
oder J125-Fribrinogen an die ανβ3 und αIIbβ3-Integrine
zu hemmen.
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Obwohl diese Liganden an ein bestimmtes
Integrin optimal binden, Vitronektin an ανβ3 und
Fibrinogen an αIIbβ3, erlaubt die Hemmung der Bindung, unter
Verwendung von Peptiden, die die Bindung von Fibrinogen an beide
Rezeptoren blockieren, die genaue Bestimmung der Konzentration in
mikromolar (μM)
eines Peptids, die nötig
ist, um die Bindung des Rezeptors an den Liganden halbmaximal zu
hemmen. Radioaktiv markierte Liganden wurden in Konzentrationen
von 1 nM verwendet, und die Bindung wurde separat mit nicht-markierten synthetischen
Peptiden beeinflusst.
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Auf eine dreistündige Inkubation folgend, wurden
die freien Liganden durch Waschen entfernt und die gebundenen Liganden
durch Messung der Gammastrahlung ermittelt. Die Ergebnisse dieser
Assays, in denen ausgewählte,
in Tabelle 1 aufgelistete zyklische Peptide zur Hemmung der Bindung
der Rezeptoren und radioaktiv markiertem Fibrinogen an separat immobilisiertes ανβ3 und αIIbβ3,
verwendet wurden, waren hoch reproduzierbar mit Standardfehlern,
die zwischen den Datenpunkten lagen und typischerweise kleiner 11%
waren. Die IC50-Werte in mikromolar (IC50) μM
sind als Durchschnittswert von zwei Datenpunkten ausgedrückt. ± gibt die
Standardabweichung, wie in Tabelle 2 gezeigt, an.
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Somit wiesen die RGD-enthaltenden
oder RGD-derivatisierten zyklischen Peptide 62181, 62184, 62185
und 62187, die alle einen D-Aminosäurerest enthalten, eine bevorzugte
Hemmung der Fibrinogen-Bindung an den ανβ3-Rezeptor
auf. Dies zeigen die niedrigeren Peptidkonzentration, die für eine halbmaximale Hemmung
erforderlich sind, im Vergleich zu denen, die für die Hemmung des αIIβ3-Rezeptors
nötig sind.
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Im Gegensatz dazu waren die anderen
RGD-enthaltenden oder RGD-derivatisierten zyklischen Peptide 62186,
62175 und 62179 entweder nicht so wirksam in einer Hemmung der Fibrinogen-Bindung
an ανβ3 oder
zeigten eine bevorzugte Hemmung der Bindung von Fibrinogen an αIIbβ3 im
Vergleich mit ανβ3.
Diese Ergebnisse stimmen mit denen überein, die kürzlich von
Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269: 20233–20238 (1994) publiziert wurden,
in denen das zyklische Peptid RGDFV (wobei F eine D-Aminosäure anzeigt)
spezifisch die Bindung von Fibrinogen an das ανβ3-Integrin
und nicht an die αIIbβ3- oder ανβ1-Integrine
hemmt.
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Eine ähnliche Inhibierung von Ligandenbindung
in diesen Assays wurden mit linearisierten Peptiden durchgeführt, die
entweder ein RGD-Motiv aufwiesen oder nicht und deren Sequenzen
von der αν-Untereinheit, der αIIb-Rezeptor-Untereinheit
oder von Aminsäuren
des Vitronektin-Liganden abgeleitet waren. Die Sequenzen der linearen
Peptide 62880 (VN-abgeleitete Aminosäurereste 35–49), 62411 (αν-abgeleitete Aminosäurereste
676–687);
62503 (αν-abgeleitete
Aminosäurereste
655–667)
and 62502 (αIIb abgeleitete Aminosäurereste 296–306) sind
in Tabelle 1 aufgelistet. Jedes dieser Peptide wurde in separaten
Assays zur Hemmung der Bindung von entweder Vitronektin (VN) oder
Fibrinogen (FG) an entweder αIIbβ3 oder ανβ3 eingesetzt.
In Tabelle 3 sind die IC50-Werte in mikromolar
(IC50 μM)
eines individuellen Assays für
jedes Experiment angegeben.
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Die Ergebnisse der Hemmung der Ligandenbindung
an ausgewählte
Integrin-Rezeptoren
mit linearisierten Peptiden zeigen, dass nur Peptid 62880 wirksam
war, die halbmaximale Bindung von entweder FG oder VN an ανβ3 zu
hemmen, wie die niedrigere Peptidkonzentration zeigt, die für eine halb-maximale
Hemmung der Bindung an ανβ3 im
Vergleich zur Bindung an αIIbβ3 erforderlich ist. Keines der anderen linearisierten Peptide
konnte die Ligandenbindung an ανβ3 wirksam
blockieren, obwohl Peptid 62502 die Bindung von ανβ3 an
VN wirksam blockierte. Somit kann der Liganden-Rezeptor-Assay, so
wie er hier beschrieben ist, für
das Durchmustern sowohl von zyklischen als auch von linearisierten
Peptiden verwendet werden, die eine selektive Spezifität für einen
besonderen Integrin-Rezeptor aufweisen, insbesondere ανβ3,
und können
dann beim Ausüben
dieser Erfindung als Vitronektin-Rezeptor-(ανβ3)-Antagonisten
eingesetzt werden.
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5. Charakterisierung von
unbehandelten Hühnerembryo-Chorioallantois-Membranen
CT AM)
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A. Präparation der CAM
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Die Angiogenese kann auf der Chorioallantois-Membran,
nachdem die normale embryonale Angiogenese zur Bildung reifer Blutgefäße geführt hat,
induziert werden. Leibovich et al., Nature, 329: 630 (1987) und Ausprunk
et al., Am. J. Pathol., 79: 597 (1975) haben gezeigt, dass die Angiogenese
als Reaktion auf spezifische Zytokine oder Tumorfragmente induziert
ist. Die CAMs wurden aus Hühnerembryonen
präpariert,
um anschließend
eine Induktion bzw. Hemmung der Angiogenese in diesen zu induzieren,
wie in den Beispielen 6 und 7 beschrieben. 10 Tage alte Hühnerembryonen
wurden von Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) erhalten und bei 37°C bei 60%-iger
Luftfeuchtigkeit inkubiert. Dann wurde mit einem kleinen Bohrer
(Dremel, Division of Emerson Electronic CI. Racine Wisconsin) an
der Spitze des Eis, direkt über
der Luftblase, ein Loch in der Schale hergestellt. Ein zweites Loch
wurde dann auf der Breitseite des Eis, in einer Region, die frei
von embryonalen Blutgefäßen war,
wie vorher mittels Durchleuchten des Eis festgestellt wurde, hineingebohrt.
Dann wurde ein Unterdruck am ersten Einstichloch angelegt, so dass
die CAM (Chorioallantois-Membran) sich von der Eischalmembran ablöste und
eine Luftblase über
der CAM entstand. Mit Hilfe eines kleinen Schleifrads (Dremel) wurde
anschließend
ein 1 Zentimeter (cm) mal 1 cm großes Fenster über der
zurückgezogenen
CAM in die Schale geschnitten. Das kleine Fenster erlaubte den direkten
Zugang zu der darunter liegenden CAM.
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Das so hergestellte CAM-Präparat wurde
dann ohne zusätzliche
Behandlung entweder am Tag 6 der Embryogenese, einem Stadium, dass
durch aktive Neovaskularisierung gekennzeichnet ist, als Modell
für die Untersuchung
von Effekten auf die embryonale Neovaskularisierung verwendet oder
am Tag 10 der Embryogenese, einem Stadium zu dem die Angiogenese
schon nachlässt.
Letztere Präparation
wurde daher in dieser Erfindung verwendet, um die Angiogenese als
Antwort auf eine Zytokinbehandlung oder einen Tumorkontakt neu zu
stimulieren.
-
B. Histologie der CAM
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Um die mikroskopischen Strukturen
der Hühnerembryonen
CAMs und/oder humanen Tumoren zu analysieren, die aus dem Hühnerembryonen,
wie in Beispiel 8 beschrieben, herausgeschnitten wurden, wurden
die CAMs und Tumore zum Herstellen von Gefrierschnitten präpariert,
wie in Beispiel 3A beschrieben. Sechs Mikrometer dicke Schnitte
wurden für
eine nachfolgende Immunfluoreszenzanalyse mit einem Kryostat-Mikrotom aus den
gefrorenen Blöcken
herausgeschnitten.
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4 zeigt
ein typisches mikroskopisches Foto eines blutgefäßfreien Gebietes einer unbehandelten 10
Tage alten CAM. Da die Angiogenese in der CAM in diesem Embryogenesestadium
schon abklingt, ist dieses System für die Stimulation der Produktion
neuer Vaskulatur aus schon existierenden Gefäßen benachbarter Gebiete in
Regionen der CAM, die zu diesem Zeitpunkt überhaupt keine Gefäße aufweisen,
in dieser Erfindung nützlich.
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C. Interpringrofile in
der CAM detektiert durch Immunfluoreszenz
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Um die Gewebeverteilung der Integrin-Rezeptoren
in den CAM-Geweben zu verfolgen, wurden 6 Mikrometer (μm) dicke
Schnitte von sowohl Tumorgeweben als auch Hühnerembryonen-CAM-Geweben in
Aceton für
30 Sekunden fixiert und mittels Immunfluoreszenz mit 10 Mikrogramm/Milliliter
(μg/ml)
mAb CSAT, ein monoklonaler Antikörper,
der für
die β1-Integrin-Untereinheit spezifisch ist, gefärbt (siehe
Buck et al., J. Cell Biol., 107: 2351 (1988)) und somit für Kontrollen
verwendet oder die Schnitte wurden mit LM609 gefärbt, hergestellt, wie in Beispiel
2 beschrieben. Der Markierung durch den primären Antikörper folgte eine Inkubation mit
einem 1: 250 verdünnten
Ziege anti-Maus Rhodamin-markierten sekundären Antikörper (Tago), um das primäre Produkt
der Immunreaktion zu detektieren. Die Schnitte wurden dann an einem
Zeiss Immunfluoreszenz-Mikroskop analysiert.
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Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzanalyse
zeigen, dass die reifen Blutgefäße, die
in einem unbehandelten 10 Tage alten Hühnerembryo vorliegen, die β1-Integrin-Untereinheit exprimieren
(5A). Im Gegensatz dazu
konnte keine Immunreaktivität
mit LM609 in einer Schnittserie dieses Gewebes festgestellt werden
(5B). Somit folgt, dass
die ανβ3-Untereinheit,
die von dem LM609 Antikörper
erkannt wird, nicht aktiv in den reifen Blutgefäßen 10 Tage alter unbehandelter
Hühnerembryonen
exprimiert wird. Wie mit dem CAM-Modell gezeigt und ebenso in den
folgenden Beispielen, exprimieren die Blutgefäße, die während der normalen Embryogenese
neu entstehen, das ανβ3-Integrin,
ebenso wie die Blutgefässe
nach Induktion durch Zytokinen oder Tumoren. Sobald die Gefäße jedoch
nach der aktiven Neovaskulogenese aufhören, sich weiter zu entwickeln,
nimmt die Expression von ανβ3 auf
mit Immunfluoreszenz nicht mehr nachweisbare Mengen ab. Diese Regulation
der ανβ3-Expression
in Blutgefäßen, die
sich im Prozess der Angiogenese befinden, im Gegensatz zum Fehlen
einer Expression in reifen Gefäßen, ist
Grundlage für
die spezielle Anwendungsmöglichkeit
dieser Erfindung, die Angiogenese zu kontrollieren und zu inhibieren,
wie in den folgenden Beispielen aufgeführt und durch Verwendung des
CAM-Angiogenesesystems modellhaft gezeigt.
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6. Der CAM Angiogenese-Assay
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A. Wachstumsfaktor-induzierte
Angiogenese
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Es wurde gezeigt, dass die Angiogenese
durch Zytokine oder Wachstumsfaktoren induziert werden kann, Zitate
sind in Beispiel 5A aufgeführt.
In den hier beschriebenen Experimenten wurde die Angiogenese in
den CAM-Präparaten,
wie in Beispiel 5 beschrieben, durch Wachstumsfaktoren induziert,
die topisch auf die CAM Blutgefäße aufgebracht
wurden.
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Die Angiogenese wurde durch das Aufbringen
von 5 Millimeter (mm) mal 5 mm großen Whatman Filterpapierscheiben
(Whatman Filter paper No. 1) auf die CAM von 10 Tage alten Hühnerembryonen
in einer blutgefäßfreien
Region induziert, wobei die Filterscheiben mit Hanks Balanced Salt
Solution (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) oder HBSS plus 150 Nanogramm
rekombinanten basischen Fibroblasten Wachstumsfaktor (β-FGF) (Genzyme,
Cambridge, MA) gesättigt
waren und diese wurden anschließend
mit Klebefolie abgedichtet.
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In weiteren Assays war auch 125 ng/ml β-FGF geeignet,
das Blutgefäßwachstum
zu induzieren. Die Angiogenese wurde durch mikroskopische Fotografie
nach 72 Stunden verfolgt. Die CAMs wurden schockgefroren und 6 μm dicke Kryostat-Schnitte
wurden mit Aceton fixiert und mittels Immunfluoreszenz mit 10 μg/ml von
entweder anti-β1 monoklonalem Antikörper CSAT oder LM609 gefärbt, wie
in Beispiel 5C beschrieben. Die mikroskopischen Immunfluoreszenz-Fotos
in 5C zeigen eine gesteigerte ανβ3-Expression
während
der β-FGF-induzierten
Angiogenese auf der Hühner-CAM
im Gegensatz zu der fehlenden Expression in der unbehandelten Hühner-CAM,
wie in 5B gezeigt. ανβ3 konnte
auf vielen (75% bis 80%) Gefäßen der β-FGF behandelten
CAM leicht detektiert werden. Darüber hinaus veränderte sich
die β1-Integrin-Expression
nicht im Vergleich zu der in einer unbehandelten CAM, da β1 auch
unmittelbar auf stimulierten Gefäßen zu detektieren war.
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Die relative Expression von ανβ3 und β1-Integrinen
wurde dann während
der β-FGF-induzierten Angiogenese
durch konfokale Lasermikroskopie der CAM Kryostat-Schnitte und Bildanalyse
quantifiziert. Die gefärbten
Schnitte wurden dann mit einem konfokalen Lasermikroskop von Zeiss
analysiert. Fünfundzwanzig
Gefäße, die
mit LM609 und 15, die mit CSAT gefärbt waren (durchschnittliche
Größe ungefähr 1200
mm2, Bereich 350 bis 3500 mm2),
wurden aus zufälligen
Feldern ausgewählt,
und die durchschnittliche Rhodamin-Fluoreszenz für jedes Gefäß pro Flächeneinheit wurde in willkürlichen
Einheiten durch eine konfokale Laser-Bildanalyse bestimmt. Die Werte
sind als mittlere Fluoreszenzintensität der Gefäße in willkürlichen Einheiten ± Standardfehler
angegeben (SE).
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Die Ergebnisse, aufgetragen in 6, zeigen, dass die Färbung auf
CAMs, die mit β-FGF
behandelt waren, signifikant erhöht
war (4 mal höher),
wie der "Wilcoxon
Rank Sum Test" (P < 0.0001) zeigt,
wohingegen die β1-Färbung
durch die β-FGF
Behandlung nicht signifikant verschieden war.
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Der CAM-Assay wurde weiter verwendet,
um den Effekt eines anderen sehr wirksamen Angiogenese-Induzierers,
Tumornekrose Faktor-alpha (TNFα),
auf die Expression der β1- und β3-Integrine zu untersuchen. Filterscheiben,
die entweder mit β-FGF
oder TNFα getränkt waren
und auf die CAMs 10 Tage alter Embryonen aufgebracht wurden, stimulierten
die lokale Angiogenese nach 72 h.
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Die Ergebnisse sind in den mikroskopischen
Fotos der entweder unbehandelten CAMs (7A) oder CAMs, die mit β-FGF (7B) oder mit TNFα (7C) behandelt wurden, gezeigt.
Die Blutgefäße sind
unmittelbar sowohl in den β-FGF
als auch den TNFα behandelten
Präparaten
zu erkennen, jedoch nicht in der unbehandelten CAM. Somit resultierte
die topische Applikation von Wachstumsfaktoren/Zytokinen in der
Induktion der Angiogenese von reifen Gefäßen in einer benachbarten Region
in ein Gebiet hinein, dass ursprünglich
frei von Gefäßen war.
Hinsichtlich der β-FGF-induzierten Blutgefäße und der
gleichzeitigen ανβ3-Expression,
wie in 5C gezeigt, resultierte
die Behandlung mit TNF in vergleichbaren Aktivitäten. Diese Befunde zeigen,
dass sowohl in humanen als auch in Hühner-Geweben Blutgefäße, die
an der Angiogenese beteiligt sind, eine gesteigerte ανβ3-Expression
aufweisen. In Einklang mit dieser Beobachtung kann die Expression
von ανβ3 auf
kultivierten Endothelzellen durch verschiedene Zytokine in vitro
induziert werden, wie bei Janat et al., J. Cell Physiol., 151: 588
(1992); Enenstein et al., Exp. Cell Res., 203: 499 (1992) und Swerlick
et al., J. Invest. Derm., 99: 715 (1993) beschrieben ist.
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Die Wirkung von Antikörpern und
Peptid-Inhibitoren auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese wird
in den Beispielen 7A und 7B gezeigt.
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B. Embryonale Angiogenese
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Das CAM-Präparat, das für die Beurteilung
der Wirkung von Angiogenese-Inhibitoren auf die natürliche Ausbildung
der embryonalen Neovaskulatur verwandt wurde, stammte vom 6 Tage
alten Hühnerembryo ab,
wie vorher beschrieben. In diesem Entwicklungsstadium wachsen Blutgefäße de novo
und liefern so ein geeignetes Modellsystem, um zu ermitteln, ob ανβ3 an
der embryonalen Angiogenese mitwirkt. Das CAM-System wurde hergestellt-
wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass der Assay am Tag 6
anstelle von Tag 10 der embyonalen Entwicklung durchgeführt wurde.
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Der Einfluss von erfindungsgemäßen Antikörpern und
Peptiden auf die embryonale Angiogenese ist in Beispiel 7C gezeigt.
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C. Durch Tumoren ausgelöste Angiogenese
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Um die Rolle, die ανβ3 bei
der Tumor-induzierten Angiogenese spielt, zu untersuchen, wurden
verschiedene ανβ3-negative
humane Melanome und Karzinomfragmente in den CAM-Assay eingesetzt,
dabei wurden die CAMs vorher aus 17 Tage alten Hühnerembryonen, wie bei Brooks
et al., J. Cell Biol., 122: 1351 (1993) beschrieben, isoliert. Die
Fragmente induzierten eine ausgedehnte Neovaskularisierung in der
blossen Anwesenheit von Puffer.
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Die Angiogenese wurde in dem CAM-Assaysystem
durch direktes Aufbringen eines Tumorfragments auf die CAM induziert.
Die Präparation
der Hühnerembryonen-CAM
wurde genauso, wie oben beschrieben, vorgenommen. Anstelle einer
Filterpapierscheibe wurde ein 50 Milligramm (mg) bis 55 mg schweres
Fragment eines humanen Melanomtumors M21 L, eines humanen Lungenkarzinomtumors
UCLAP-3, einer humanen Pankreaskarzinom-Zelllinie Fg (Cheresh et
al., Cell 58: 945–953,
1989) oder einer humanen Kehlkopfkarzinom-Zellline HEp3, alle diese
Tumoren sind ανβ3-negativ,
auf die CAM in einem ursprünglich
blutgefäßfreien Gebiet
plaziert. Die M21 L humane Melanom-Zelllinie, UCLAP-3 humane Lungenkarzinom-Zelllinie,
FG Pankreaskarzinom-Zelllinie
oder die HEp3 humane Kehlkopfkarzinom-Zelllinie, alle ανβ3-negativ,
wurden verwendet, um einen festen Tumor auf den CAMs der Hühnerembryonen
wachsen zu lassen. Zuerst wurde einmalig eine Zellsuspension von
8 × 106 M21-L, UCLAP-3 und FG oder 5 × 105 HEp3 in einem Gesamtvolumen von 30 Mikrolitern
(μl) in
sterilem HBSS auf die CAM aufgebracht.
-
Die Fenster wurden dann mit Klebefolie
verschlossen und die Embryonen für
7 Tage inkubiert, um das Wachstum von humanen Tumorläsionen zu
ermöglichen.
Am Ende der 7 Tage, wenn der Embryo 17 Tage alt war, wurden die
Tumoren aus den CAMs herausgeschnitten und vom umgebenden CAM Gewebe
befreit. Die Tumoren wurden in 50 mg bis 55 mg dicke Tumorfragmente
geschnitten, um sie für
eine weitere Verwendung in entweder Angiogenese oder Tumorwachstums-Assays
vorzubereiten. Die Tumorfragmente wurden auf ein neues Set von 10
Tage alten Hühnerembryonen-CAMs in eine Blutgefäß- freie
Zone aufgebracht, wie in Beispiel 6A beschrieben.
-
Die Tumoren, die in vivo auf den
Hühnerembryonen-CAMs
gewachsen waren, wurden zur Detektion einer ανβ3-Expression
mit mAb LM609 gefärbt,
wie in Beispiel 3A beschrieben. Es konnte keine spezifische Färbung der
Tumorzellen beobachtet werden, was das Fehlen von ανβ3 anzeigt.
-
Die CAM-Tumorpräparate wurden dann nachfolgend
behandelt, wie in den Beispielen 7D und 7E beschrieben, um die Wirkung
der Antikörper
und Peptide auf die Tumorinduzierte Angiogenese zu messen. Die CAM-Tumorpräparate wurden
auch wie in den Beispielen 8, 9 und 12 beschrieben, behandelt, um
die Wirkung der Antikörper
und Peptide auf die Rückbildung
des Tumors und die Apoptose von angiogenen Blutgefäßen und
Gefäßzellen
zu messen.
-
7. Inhibierung der Angiogenese,
gemessen mit dem CAM-Assay
-
A. Inhibierung der Wachstumsfaktor-induzierten
Angiogenese durch topische Applikation der Inhibitoren
-
1) Behandlung mit monoklonalen
Antikörpern
-
Um zu bestimmen, ob ανβ3 eine
aktive Rolle bei der Angiogenese spielt, wurden mit β-FGF oder TNFα gesättigte Filterscheiben
auf die CAMs plaziert und anschließend wurden die monoklonalen
Antikörper
(auch als mAb bezeichnet) LM609 (spezifisch für ανβ3),
CSAT (spezifisch für β1)
oder P3G2 (spezifisch für ανβ5)
den Präparaten
zugefügt.
Die Angiogenese wurde auf den CAMs 10 Tage alter Hühnerembryonen
durch Filterscheiben, die mit β-FGF
gesättigt
waren, induziert. Die Scheiben wurden dann mit 50 ml HBSS, 25 mg
mAb in einem Gesamtvolumen von 25 μl sterilem HBSS enthaltend,
zu 0, 24 und 48 Stunden versetzt. Nach 72 Stunden wurden die CAMs
geerntet, in 35 mm Petrischalen überführt und
einmal mit 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen. Die Unterseite
des Filterpapiers und des CAM-Gewebes wurde dann durch zwei Beobachter
im Doppelblind-Modus an einem Olympus Stereomikroskop analysiert.
Die Inhibierung der Angiogenese wurde als signifikant erachtet,
wenn die CAMs eine > 50%-ige
Abnahme in der Blutgefäßinfiltration
direkt unter der Scheibe aufwiesen. Die Experimente wurden viermal
pro Antikörper
wiederholt, mit 6 bis 7 Embryonen pro Versuchsbedingung.
-
Die Ergebnisse der Auswirkungen der
mAb Behandlung auf die β-FGF-induzierte
Angiogenese ist in den 8A–8B gezeigt. Ein unbehandeltes
CAM Präparat,
das gefäßfrei war,
ist in 8A gezeigt, um
einen Vergleich mit der β-FGF-induzierten Blutgefäßbildung
und den Wirkungen der mAbs darauf, gezeigt in den 8C–8E, zu ermöglichen.
Ungefähr
75% dieser CAMs, die mit mAb LM609 behandelt waren, zeigten eine > 50%-ige Inhibierung
der Angiogenese, wie in 8E gezeigt
und viele dieser CAMs erschienen sogar frei von einer Gefäßinfiltration
zu sein.
-
Im Gegensatz dazu zeigten die Puffer-Kontrollen
(8A) und die Scheiben,
die mit mAbs CSAT (8C)
und P3G2 (8D) behandelt
wurden, durchwegs eine ausgedehnte Vaskularisierung.
-
Identische Ergebnisse wurden erhalten,
wenn die Angiogenese durch TNFα induziert
wurde. Um die Effekte der gleichen Antikörper auf schon vorher existierende,
reife Blutgefäße zu untersuchen,
die aus der normalen Gefäßentwicklung
resultierten und gefäßfreien
Gebieten benachbart waren, wurden mit mAbs gesättigte Filterscheiben auf die
vaskularisierten Gebiete der CAMs 10 Tage alter Embryonen plaziert,
die keine topische Applikation von Zytokinen erhielten. Keiner der
drei mAbs hatte einen Einfluss auf schon vorher existierende Gefäße, wie
durch Visualisierung am Stereomikroskop festgestellt wurde. Somit
hemmte der mAb LM609 spezifisch nur das Wachstum neuer Blutgefäße und hatte
keinen Einfluss auf reife Blutgefäße, die in benachbarten Gebieten
vorliegen. Die gleiche Wirkung wurde durch Aufbringen von synthetischen
Peptiden induziert, die entweder topisch oder intravenös, wie in
den Beispielen 7A2) beziehungsweise 7E2) beschrieben, angewendet
wurden.
-
2. Behandlung mit synthetischen
Peptiden
-
Die CAM-Assays wurden auch mit erfindungsgemäßen synthetischen
Peptiden durchgeführt,
um den Effekt der zyklischen und linearisierten Peptide auf die
Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese zu bestimmen. Die Peptide
wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt und 80 μg eines Peptide
lagen in einem Gesamtvolumen von 25 μl steriler HBSS vor. Die Peptidlösung wurde
sofort auf das CAM-Präparat
pipettiert und dann wieder nach 24 und 48 Stunden. Nach 72 Stunden
wurde das Filterpapier und das umgebende CAM Gewebe herausgeschnitten
und, wie oben beschrieben, betrachtet.
-
Die aus diesem Assay erhaltenen Ergebnisse
waren ähnlich
denen, die in 9A–9C gezeigt und im Beispiel
7E2) beschrieben sind, worin synthetische Peptide intravenös in Tumor-induzierte
Blutgefäße injiziert wurden.
Hier hatte das Kontroll-Peptid 62186 keinen Einfluss auf die β-FGF-induzierten
Blutgefäße, wie
in 9A gezeigt. Wenn
aber das zyklische RGD-Peptid 62814 auf das Filterpapier pipettiert
wurde, war die Bildung der Blutgefäße gehemmt, so dass das Gebiet
frei von neuer Vaskulatur blieb. Die Wirkung war ähnlich in
der Erscheinung zu der, die in 9B gezeigt
und im Beispiel 7E2) unten beschrieben ist. Ausserdem konnte keine
Wirkung topisch angewendeter synthetischer Peptide, ebenfalls in
Beispiel 9C für
intravenös
injizierte Peptide gezeigt, auf weiter außen liegende Gefäße gefunden
werden, in denen zwar reife Gefäße vorhanden
waren, die Wachstumsfaktor-gesättigte
Filterscheibe jedoch auf gefäßfreie Bereiche
plaziert wurde. Die inhibitorische Wirkung der Peptide auf die Angiogenese
ist somit auf Gebiete der durch Wachstumsfaktoren induzierten Angiogenese
beschränkt
und hat keinen Einfluss auf schon vorher existierende benachbarte, reife
Gefäße, noch
resultiert sie in irgendeiner schädlichen Zytotoxizität auf das
umgebende Gewebe. Ähnliche Assays
wurden mit den anderen synthetischen Peptiden, wie in Beispiel 1
hergestellt und in Tabelle 1 aufgelistet, durchgeführt.
-
B. Inhibierung der Wachstumsfaktor-induzierten
Angiogenese durch intravenöse
Anwendung der Inhibitoren
-
1) Behandlung mit monoklonalen
Antikörpern
-
Die Wirkung, die intravenös in die
CAM-Präparate
injizierte, monoklonale Antikörper
auf die durch Wachstumsfaktoren induzierte Angiogenese ausüben, wurde
zur Verwendung in dieser Erfindung auch untersucht. Die Präparation
der Hühnerembryonen-CAMs
für die
intravenöse
Injektion war grundlegend die gleiche, wie in Beispiel 7A beschrieben,
jedoch mit kleinen Modifikationen. Während der Durchleuchtung des
Eies wurden auffallende Blutgefäße ausgewählt und
auf der Eierschale markiert, um ihre Positionen anzuzeigen. Die Löcher wurden
in die Eierschale hineingebohrt, die CAMs absenken gelassen und β-FGF gesättigte Filterpapiere
wurden auf den CAMs plaziert, wie oben beschrieben. Die Fenster
wurden dann mit steriler Klebefolie abgedichtet und die Embryonen
in den Inkubator zurückgebracht.
Zwanzig Stunden später
wurde ein kleines, zweites Fenster vorsichtig in die laterale Seite
des Eies geschnitten, direkt über
den vorher ausgewählten,
prominenten Blutgefäßen. Die äußere Eierschale
wurde vorsichtig entfernt, so dass die embryonalen Membranen intakt
blieben. Die Membran wurde durch einen kleinen Tropfen Mineralöl (Perkin-Elmer
Corp., Norwalk, Conn.) transparent gemacht, so dass die Blutgefäße leicht
erkannt werden konnten. Mit einer 30 gauge Nadel wurden anschließend gereinigte,
sterile mAbs oder synthetische Peptide, letztere unten beschrieben,
direkt in die Blutgefäße in einer
Dosis von 200 μg
IgG pro Embryo, in einem Gesamtvolumen von 100 μl steriler PBS, injiziert. Die
Fenster wurden mit Klebefolie abgedichtet und die Embryonen bis
zu einem Alter von 72 Stunden inkubiert. Die Filterscheiben und
die umgebenden CAM-Gewebe wurden, wie oben beschrieben, analysiert. Um
die Lokalisation des LM609 mAbs in den CAM oder Tumorgeweben zu
bestimmen, wie hier und in den folgenden Beispielen gezeigt, wurden
die fixierten Schnitte, erhalten von mit LM609 intravenös injizierten
Tumoren, mit 2.5% BSA in HBSS für
1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt und dann mit dem 1 : 250 verdünnten Ziege
anti-Maus Rhodamin-markierten sekundären Antikörper (Tago) inkubiert. Die
Schnitte wurden anschließend
an einem Immunfluoreszenz-Mikroskop von Zeiss analysiert.
-
In den 10A–10C sind die Wirkungen dargestellt,
die eine intravenöse
Antikörper-Behandlung
auf β-FGF
induzierte Blutgefäße in den
CAM Präparaten
hatte. In 10A ist die
durch β-FGF
induzierte Angiogenese gezeigt. Keine Veränderung in der Anwesenheit
von β-FGF-induzierten
Vaskulatur konnte nach intravenöser
Injektion des mAbs P3G2, ein anti-ανβ5-Antikörper, beobachtet
werden, wie 10 B zeigt.
In Gegensatz dazu bewirkte eine Behandlung der β-FGF-induzierten Angiogenese in CAM-Präparaten
mit LM609, einem ανβ3-Antikörper, eine
vollständige
Inhibierung des Wachstums neuer Gefäße in die Filtergebiete hinein, wie
in 10C gezeigt. Der
inhibitorische Effekt auf die Angiogenese resultiert demnach aus
einer Hemmung der ανβ3-Rezeptoraktivität durch
den LM609 anti-ανβ3-spezifischen
Antikörper.
Da eine Blockade von ανβ5 die Bildung
von Neovaskulatur in die Gebiete der CAMs, auf denen die Filter
plaziert waren, nicht inhibiert, ist somit ανβ5 im
Vergleich zu ανβ3 als
nicht essentiell für
das Wachstum neuer Gefäße anzusehen.
-
2) Behandlung mit synthetischen
Peptiden
-
Die synthetischen Peptide, wie in
Beispiel 1 hergestellt, werden einzeln intravenös in die Wachstumsfaktor-induzierten
Blutgefäße der CAM-Präparate,
wie oben beschrieben, injiziert. Der Effekt der Peptide auf die
Lebensfähigkeit
der Gefäße wurde
in ähnlicher
Weise festgestellt.
-
D. Hemmung der embryonalen
Angiogenese durch topische Applikation
-
1) Behandlung mit monoklonalen
Antikörpern
-
Um zu bestimmen, ob ανβ3 an
der embryonalen Angiogenese beteiligt ist, wurde die Wirkung von LM609
auf das de novo Wachstum von Blutgefäßen auf CAMs in 6 Tage alten
Embryonen untersucht, ein Stadium, dass durch eine aktive Neovaskulogenese
gekennzeichnet ist, wie in Beispiel 5A beschrieben. Der CAM-Assay
wurde wie in Beispiel 6C beschrieben, durchgeführt, jedoch mit einer nachfolgenden,
topischen Applikation von mit mAbs gesättigten Filterscheiben, die
in Abwesenheit von Zytokinen auf CAMs von 6 Tage alten Embryonen
plaziert wurden. Nach 3 Tagen wurden die CAMs herausgeschnitten
und fotografiert. Jedes Experiment wurde mit 6 Embryonen pro Gruppe
durchgeführt
und wurde zweimal wiederholt.
-
Der Antikörper LM609 (11C), aber nicht CSAT (11A) oder P3G2 (11B) verhinderten ein Gefäßwachstum
unter diesen Bedingungen; dies zeigt, dass ανβ3 eine
wesentliche Rolle in der embryonalen Neovaskularisierung spielt,
die von zugesetzten Wachstumsfaktoren für eine Induktion der Angiogenese unabhängig war.
-
2) Behandlung mit synthetischen
Peptiden
-
Die in Beispiel 1 hergestellten Peptide
wurden einzeln zu den embryonalen CAM-Präparaten
zugefügt, hergestellt,
wie oben und in Beispiel 5A2) beschrieben, entweder durch topische
Applikation auf die CAM oder intravenöse Injektion in die Blutgefäße. Die
Wirkung der Peptide auf die Lebensfähigkeit der Gefäße wurde
in ähnlicher
Weise untersucht.
-
D. Hemmung der Tumor-induzierten
Angiogenese durch topische Applikation
-
1) Behandlung mit monoklonalen
Antikörpern
-
Zusätzlich zu den oben beschriebenen
Angiogenese-Assays, in denen die Wirkungen von ανβ-Antagonisten,
LM609 und den Peptiden 62181, 62184, 62185, 62187 und 62880 auf
die embryonale Angiogenese untersucht worden ist, wurde auch die
Rolle von ανβ3 in
der Tumor-induzierten Angiogenese analysiert. Für die Induktion wurden ανβ3-negative
humane M21-L Melanomfragmente, die vorher auf der CAM eines 17 Tage
alten Hühnerembryos
gewachsen waren und von diesen isoliert wurden, verwendet. Die Fragmente
wurden wie in Beispiel 6C beschrieben, isoliert.
-
Wie oben in Beispiel 7A1) beschrieben,
wurden die mAbs einzeln auf die Tumorfragmente in einer Konzentration
von 25 μg
in 25 μl
HBSS topisch appliziert und die Fenster wurden anschließend mit
Klebefolie abgedichtet. Die mAbs wurden in der gleichen Weise wieder
nach 24 und 48 Stunden zugefügt.
Nach 72 Stunden wurden die Tumoren und die umgebenden CAM Gewebe,
wie oben in Beispiel 7A1) beschrieben, analysiert.
-
Wie in Beispiel 6C beschrieben, wurden
die ersten Tumoren dadurch erhalten, dass kultivierte M21-L Zellen,
die das ανβ3 Integrin
nicht exprimieren, wie von Felding-Habermann et al., J. Clin. Invest.,
89: 2018 (1992) gezeigt, auf die CAMs 10 Tage alter Hühnerembryonen
transplantiert wurden. Diese ανβ3-negativen Fragmente
induzierten eine ausgedehnte Neovaskulogenese in der Anwesenheit
von Puffer alleine oder den mAbs CSAT (anti-β1) oder
P3G2 (anti-ανβ5).
Im Gegensatz dazu verhinderte der mAb LM609 (anti-ανβ3)
die Infiltration der meisten Gefäße in die
Tumormasse und die umgebende CAM.
-
Um die Wirkung der mAbs auf die Tumor-induzierte
Angiogenese zu quantifizieren, wurden die Blutgefäße, die
innerhalb einer Brennebene der CAM in den Tumor eintreten, von zwei
Beobachtern im Doppel-Blind-Modus mit Hilfe eines Stereomikroskops
ausgezählt.
Jede Säule
in 12 repräsentiert
die mittlere Gefäßzahl ± SE von
12 CAMs in jeder Gruppe, das Mittel aus zwei Experimenten darstellend.
-
Die quantitative Auswertung zeigte
eine dreifache Reduktion in der Zahl der Gefäße, die in den Tumor wachsen
nach mAb LM609 Behandlung im Vergleich zu den Tumoren, die nur mit
Puffer oder den anderen mAbs, wie P3G2 oder CSAT (P < 0.0001) behandelt
wurden, bestimmt mit den "Wilcoxon
Rank Sum Test".
Da die M21-L Tumoren kein ανβ3 exprimieren,
kann geschlossen werden, dass der mAb LM609 die Angiogenese durch
direkte Wirkung auf die Blutgefäße und nicht
auf die Tumorzellen hemmt. Diese Ergebnisse passen zu der histologischen
Verteilung von ανβ3 in
Krebsgewebe-Biopsien, wie in den 3A–3D gezeigt, wo die Verteilung
von ανβ3 auf
die Blutgefäße im Tumor
und nicht auf die Tumorzellen selbst beschränkt war.
-
2) Behandlung mit synthetischen
Peptiden
-
Die synthetischen Peptide, hergestellt
wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden topisch auf das Tumor-induzierte
angiogene CAM-Assaysystem appliziert, wir oben beschrieben. Die
Wirkungen der Peptide auf die Lebensfähigkeit der Gefäße wurde
in ähnlicher
Weise festgestellt.
-
E. Inhibierung der Tumor-induzierten
Angiogenese durch intravenöse
Anwendung
-
1) Behandlung mit monoklonalen
Antikörpern
-
Die Tumor-induzierten Blutgefäße, hergestellt
wie in Beispiel 7D1 beschrieben, wurden auch mit mAbs behandelt,
die mittels intravenöser
Injektion angewendet wurden. Die Tumoren wurden auf die CAMs platziert, wie
in Beispiel 7D1 beschrieben, die Fenster mit Klebefolie abgedichtet
und 24 Stunden später
wurden 200 μg gereinigte
mAbs auf einmal intravenös
in die Blutgefäße der Hühnerembryonen
injiziert, wie vorher beschrieben. Die Hühnerembryonen wurden dann für 7 Tage
inkubiert. Das Ausmaß der
Angiogenese wurde anschließend,
wie oben beschrieben, beobachtet. Wie in Beispiel 8 beschrieben,
wurden nach dieser Zeitspanne die Tumoren herausgeschnitten und über ihr
Gewicht analysiert, um die Wirkung der Antikörperexposition auf das Tumorwachstum
oder dessen Unterdrückung,
zu untersuchen.
-
2) Behandlung mit synthetischen
Peptiden
-
Die Wirkungen einer Peptidbehandlung
auf Tumor-induzierte Vaskulatur im CAM-Assaysystem wurde auch untersucht. Die
Tumor-CAM-Präparate
wurden verwendet, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass anstelle
einer intravenösen
Injektion eines mAbs, synthetische Peptide, hergestellt wie in Beispiel
1 und Beispiel 7A2) beschrieben, einzeln intravenös in sichtbare
Blutgefäße injiziert
wurden.
-
Die Ergebnisse der CAM-Assays mit
dem zyklischen Peptid 66203, das HCl-Salz enthaltend, und dem Kontroll-Peptid
62186 sind in den 9A–9C dargestellt. In 9A ist gezeigt, dass die
Behandlung mit dem Kontroll-Peptid keine Wirkung auf die reichlich
vorhandenen großen
Blutgefäße hatte,
die durch die Tumorbehandlung induziert waren, in Gebiete der CAM
zu wachsen, die ursprünglich
frei von Blutgefäßen waren. Im
Gegensatz dazu, wenn das zyklische RGD-Peptid 66203, ein Antagonist
von ανβ3,
auf die Filter appliziert wurde, war die Ausbildung von Blutgefäßen gehemmt,
so dass das Gebiet frei von neuer Vaskulatur blieb, wie in 9B gezeigt. Die inhibitorische
Wirkung des RGD-enthaltenden Peptids war spezifisch und trat nur
sehr lokal auf, wie das Fehlen jeglicher schädlicher Effekte auf Blutgefäße, die
dem Tumor benachbart waren, zeigte. Daher hatten inhibitorische,
intravenös
in das CAM-Assaysystem
injizierte Peptide auf schon vorher in der CAM existierende Gefäße, die
benachbart. aber in Distanz zum Ort der Tumorplatzierung waren,
keine Auswirkung, siehe 9C.
Die schon vorher an diesem Ort existierenden Gefäße wurden durch das inhibitorische
Peptid nicht beeinflusst, das in diesen Gefäßen nach Injektion vorlag,
obwohl die Ausbildung neuer Gefäße aus diesen
schon vorher existierenden Gefäßen in die
Tumormasse hinein gehemmt war.
-
Somit wurde jetzt gezeigt, dass die
synthetischen Peptide, einschließend 66203 und 62184, von denen
vorher in Liganden-Rezeptor-Assays in Beispiel 4 gezeigt wurde,
dass sie Antagonisten von ανβ3 sind,
die Angiogenese inhibieren, die auf Gefäße beschränkt ist, die sich im Prozess
der Entwicklung befinden und nicht auf reife schon vorher existierende
Gefäße. Darüber hinaus
resultiert die intravenöse
Injektion mit Peptiden nicht in irgendeiner schädlichen Zytotoxizität auf das
umgebende Gewebe, wie durch die intakte Vaskulatur in 9C gezeigt.
-
Ähnliche
Assays wurden mit anderen synthetischen Peptide, hergestellt wie
in Beispiel 1 und aufgeführt
in Tabelle 1, durchgeführt.
-
B. Hemmung des Tumorgewebewachstums
mit ανβ-Antagonisten
gemessen im CAM-Assay
-
Wie in Beispiel 7D1) beschrieben,
wurde zusätzlich
zum visuellen Ermitteln der Wirkung von ανβ-Antagonisten
auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese, der Effekt der Antagonisten
dadurch festgestellt, dass jegliche Änderung in der Tumormasse,
der Exposition folgend, gemessen wurde. Für diese Analyse wurde das Tumor-induzierte
Angiogenese CAM-Assaysystem hergestellt, wie in den Beispielen 6C
und 7D beschrieben. Am Ende der 7 tägigen Inkubationsperiode wurden
die resultierenden Tumoren aus den CAMs herausgeschnitten, von restlichem
CAM Gewebe befreit, mit 1 ml Phosphat-gepufterter Salzlösung gewaschen und
die Feuchtgewichte für
jeden Tumor bestimmt.
-
Darüber hinaus umfasste die Präparation
des Tumors für
die mikroskopischhistologische Analyse die Fixierung repräsentativer
Beispiele von Tumoren mit Bulins Fixativ für 8 Stunden und Einbettung
in Paraffin. Dann wurden Schnittserien angefertigt und mit Hämatoxylin
und Eosin (H & E)
für die
mikroskopische Analyse gefärbt.
Gladson, et al., J. Clin. Invest., 88: 1924 (1991). Die Schnitte
wurden an einem Mikroskop von Olympus bei 250-fachen Vergrößerung fotografiert.
-
A. Topische Applikation
-
Die Ergebnisse typischer humaner
Melanom-Tumorgewichte (M21 L), die aus einer topischen Applikation
mit Kontroll-Puffer (HBSS), P3G2 (anti-ανβ5)
oder LM609 (anti-ανβ3)
resultierten, sind in Tabelle 4 aufgelistet. Eine bestimmte Zahl
an Embryonen wurde für
jede Behandlung untersucht, das durchschnittliche Tumorgewicht in
Milligramm (mg) für
jede Behandlung wurde zusammen mit dem Standardfehler des Mittelwertes ausgerechnet,
wie am Ende der Tabelle gezeigt.
-
-
-
Die Exposition einer ανβ3-negativen
humanen Melanom-Tumormasse in dem CAM-Assaysystem mit LM609 verursachte eine
Abnahme des Tumorgewichts von 172 mg ± 26 (Durchschnittsgewicht
eines unbehandelten Tumors) auf 52 mg ± 13. Der P3G2 Antikörper hatte
keine Einfluss auf die Tumormasse. Somit verursachte die Blockade
des ανβ3-Rezeptors
durch topische Applikation des ανβ3-spezfischen
LM609 Antikörpers eine
Abnahme der Tumormasse, einhergehend mit einer Inhibierung der Angiogenese,
wie in den vorhergehenden Beispielen gezeigt. Der gemessene Durchmesser
der Tumormasse, der aus einer Behandlung mit P3G2 resultierte, war
durchschnittlich ungefähr
8 Millimeter bis 1 cm. Im Gegensatz dazu war der durchschnittliche
Durchmesser der LM609 behandelten Tumoren nur 2–3 mm.
-
Gefrierschnitte dieser Tumoren zeigten
eine intakte Tumor-Zytoarchitektur bei den Tumoren, die P3G2 exponiert
waren, in Gegensatz dazu fehlte den LM609-exponierten Tumoren eine
organisierte Zellstruktur. Eine ανβ3-Rezeptor-Aktivität ist daher
essentiell für ανβ3-negative
Tumoren, die ihre Masse durch Versorgung über die Entwicklung von ανβ3-exprimierender
Neovaskulatur erhalten. Die Blockade von ανβ3 mit
erfindungsgemäßen Antagonisten
resultiert in einer Hemmung der Angiogenese in die Tumoren hinein,
was sich letztlich in einer abnehmenden Tumormasse auswirkt.
-
B. Intravenöse Applikation
-
Die Ergebnisse typischer Karzinom-Tumorgewichte
(UCLAP-3), die aus einer intravenösen Applikation von Kontroll-Puffer
(PBS, Phosphat-gepufferte Salzlösung),
CSAT (anti-β1)
oder LM609 (anti-ανβ3)
resultieren, sind in Tabelle 5 aufgeführt. Eine bestimmte Zahl an
Embryonen wurde für
jede Behandlung untersucht und die durchschnittlichen Tumorgewichte
jeder Behandlung zusammen mit dem Standardfehler des Mittelwertes
berechnet, wie am Ende der Tabelle gezeigt ist.
-
-
Die LM609 Behandlung eines ανβ3-negativen
humanen Karzinom-Tumorgewebes in dem CAM-Assaysystem verursachte
eine Abnahme des Tumorgewichtes von 85 mg ± 7 mg (unbehandeltes durchschnittliches Tumorgewicht)
auf 30 mg ± 6
mg. Der CSAT Antikörper
dagegen hatte keine signifikante Auswirkung auf die Tumorgewichte.
Somit resultierte die Blockade des ανβ3-Rezeptors
durch intravenöse
Applikation von ανβ3-spezifischen LM609
Antikörper
in einer Rückbildung
des Karzinoms, so wie sie den Rückgang
der Melanom-Tumormasse einhergehend mit der Inhibierung der Angiogenese
verursachte, wie in den vorhergehenden Beispielen gezeigt. Darüber hinaus
war das humane Melanom-Tumorwachstum in ähnlicher Weise durch intravenöse Injektion
von LM609 gehemmt.
-
9. Rückbildung des Tumorgewebewachstums
durch ανβ-Antagonisten
gemessen im CAM-Assay
-
Um die Wirkung von ανβ3-Antagonisten
auf das Wachstum und das Überleben
von Tumoren zu untersuchen, wurden Fragmente humaner Melanome und
Karzinomfragmente der Lunge, des Pankreas und des Kehlkopfs auf
CAMs 10 Tage alter Embryonen platziert, wie in Beispiel 5A beschrieben.
-
A. Intravenöse Applikation
-
1) Behandlung mit monoklonalen
Antikörpern
-
a. Behandlung mit LM609
(anti-ανβ3 und
CSAT (anti-β1
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Vierundzwanzig Stunden nach Implantation
der CAM mit Karzinomfragmenten von ανβ3-negativen, humanem
Melanom M21-L, Pankreaskarzinom FG, humanem Lungenkarzinom UCLAP-3,
oder humanem Kehlkopfkarzinom HEp3, wurden die Embryonen intravenös mit PBS
alleine oder einer einzelnen Dosis (300 μg/100 μl) von entweder mAb LM609 (anti-ανβ3)
oder CSAT (anti-β1) injiziert. Den Tumoren wurden dann sechs Tage
Zeit gegeben, sich zu entwickeln. Am Ende der Inkubationsperiode
wurden die Tumoren vorsichtig herausgeschnitten und von dem umgebenden
CAM Gewebe befreit. Die Tumor-Resektionen wurden von zwei unabhängigen Forschern
durchgeführt,
die nur die leicht zu bestimmende, harte Tumormasse entfernten.
Die Tumoren wiesen gut erkennbare Grenzen auf, so dass die dünne halbtransparente
Membran (CAM) leicht von der festen Tumormasse unterscheidbar war
und, ohne die Tumormasse selbst zu verletzen, entfernt werden konnte,
Die entfernten Tumoren wurden gewogen und sowohl morphologisch als
auch histologisch untersucht. Wie in 13 gezeigt,
wurden die Tumorgewichte am Ende von Tag 7 ermittelt und mit den
anfänglichen
Tumorgewichten vor Beginn der Behandlungen verglichen. Jede Säule stellt
das Mittel ± SE
von 5–10
Tumoren pro Gruppe dar. Der mAb LM609 hemmte das Tumorwachstum im
Vergleich zur Kontrolle in allen untersuchten Tumoren signifikant
(p < 0.001). Die
Tumoren, die mit PBS oder CSAT behandelt wurden, nahmen in allen
Fällen
an Gewicht zu. Im Gegensatz dazu verhinderte der mAb LM609 nicht
nur das Wachstum dieser Tumore, sondern induzierte auch eine starke
Rückbildung
in den meisten Fällen.
Wichtig ist, festzustellen, dass diese Tumorzellen kein ανβ3-Integrin
exprimieren, was zeigt, das die Inhibierung des Tumors auf die anti-angiogenen Effekte
des Antikörpers
auf die Neovaskulatur, und nicht auf die Tumorzellen direkt, zurückzuführen ist.
-
b. Behandlung mit LM609
(anti-ανβ3)
und P3G2 (anti-ανβ5)
-
Humane M21-L Melanom-Tumorfragmente
(50 mg) wurden auf CAMs 10 Tage alter Embryonen gebracht, wie in
Beispiel 5A beschrieben. Zwanzig Stunden später wurden die Embryonen mit
PBS alleine oder mit einer einzelnen Dosis (300 μg/100 μl) von entweder mAb LM609 (anti-ανβ3)
oder P3G2 (anti-ανβ3)
intravenös
injiziert. Den Tumoren wurde dann Zeit gegeben, sich zu entwickeln,
wie in Beispiel 9A1) beschrieben und wurden sowohl morphologisch
als auch histologisch untersucht, wie oben beschrieben. Repräsentative
Beispiele von mit mAbs P3G2 (anti-ανβ5)
oder LM609 (anti-ανβ5)
M21-L behandelten Tumoren wurden morphologisch untersucht. Die P3G2-behandelten
Tumore waren groß (8
mm im Durchmesser) und gut vaskularisiert, wohingegen die, die mit
mAb LM609 behandelt wurden, viel kleiner (3 mm im Durchmesser) waren
und Blutgefäße in ihnen
nicht nachweisbar waren.
-
Die Tumoren wurden nach Präparation
von histologischen Schnitten weiter untersucht und mit Hämatoxylin
und Eosin, wie in Beispiel 9A1) beschrieben, gefärbt. Wie in 14A (oberer Bildabschnitt) gezeigt, lagen
in den mit mAb P3G2 (anti-ανβ5)
behandelten Tumoren zahlreiche lebende und aktiv aich teilende Tumorzellen
vor, was die mitotischen Figuren (Pfeilspitzen) sowie die zahlreichen
Blutgefäße (Pfeile)
innerhalb des Tumor-Stromas anzeigen. Im Gegensatz dazu konnten
nur wenige, wenn überhaupt,
lebende Tumorzellen oder Blutgefäße in Tumoren
detektiert werden, die mit dem mAbLM609 (anti-ανβ3)
behandelt wurden (14B).
Diese Ergebnisse zeigen, das ανβ3-Integrin-Antagonisten
die Tumor-induzierte Angiogenese hemmen und somit zu einem Wachstumsstillstand
und einer Rückbildung
einer Vielfalt von humanen Tumoren in vivo führen. Es ist wichtig, festzustellen,
dass die Embryonen, die nach 7 tägigem Tumorwachstum
(Tag 17 der Embryonalentwicklung) untersuchte wurden, nach einer
ersten Untersuchung normal aussahen, unabhängig davon, ob sie mit einem ανβ3-Antagonist behandelt
worden waren oder nicht. Diese Befunde sind ein Hinweis darauf,
dass Antagonisten dieses Rezeptors nicht toxisch für die entwickelnden
Embryonen sind.
-
2) Behandlung mit synthetischen
Peptiden
-
Humane M21-L Melanom-Tumortragmente
(50 mg) wurden auf CAMs 10 Tage alter Embryonen implantiert, wie
in Beispiel 5A beschrieben. Vierundzwanzig Stunden später erhielten
die Embryonen eine einzelne intravenöse Injektion von 300 μg/100 μl von entweder
einem cyclo-RADfV (69601) oder cyclo-RGFfV (66203) Peptid. Nach
insgesamt 72 Stunden wurden die Tumoren entfernt, morphologisch
untersucht und an einem Stereomikroskop fotografiert, wie in Beispiel
9A1) beschrieben. Die Bildabschnitte, die in den 15A bis 15E gezeigt
sind, entsprechen folgenden: 15A,
parallele Proben, behandelt mit cyclo-RADvF Peptid (69601); 15B, parallele Proben,
behandelt mit cyclo-RGDfV Peptid (66203); 15C, benachbarte CAM-Gewebe vom gleichen
Embryo, der mit cyclo-RGDfV Peptid (66203) behandelt wurde und 15D und 15E, eine hohe Vergrößerung (13x) eines Peptid-behandelten
Tumors. 15D zeigt genauer
normale Blutgefäße von mit
Kontroll-Peptid behandeltem Tumor (69601). 15E zeigt genauer Beispiele unterbrochener
Blutgefäße von mit
cyclo-RGDfV Peptid (66203) behandelten Tumoren (Pfeile).
-
Die Ergebnisse zeigen, dass nur das
Peptid 66203 die Gefäßbildung
inhibierte und darüber
hinaus, dass die Gefäße in dem
CAM Geweben, die dem Tumor benachbart waren, nicht beeinflusst waren.
-
10. Rückbildung des Tumorgewebewachstums
durch ανβ-Antagonisten
gemessen mit dem in vivo Kaninchenaugen-Modellassay
-
Die Auswirkungen von ανβ-Antagonisten
auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese kann in natürlich vorkommenden,
transparenten Strukturen, wie zum Beispiel der Hornhaut des Auges,
untersucht werden. Neue Blutgefäße wachsen
vom Rand der Hornhaut, die eine sehr gute Blutversorgung aufweist,
in Richtung des Hornhautzentrums, das normalerweise keine Blutversorgung
hat. Stimulatoren der Angiogenese, wie β-FGF, induzieren das Wachstum
neuer Blutgefäße vom Rand
der Hornhaut aus, wenn sie auf die Hornhaut appliziert werden. Auf
die Hornhaut applizierte Antagonisten der Angiogenese hemmen das
Wachstum neuer Blutgefäße vom Rand
der Hornhaut aus. So findet in der Hornhaut Angiogenese statt, indem
Endothelzellen vom Rand der Hornhaut aus in die dichten, kollagenreichen
Schichten des Hornhautgewebes eindringen, was leicht zu sehen ist.
Der Kaninchenaugen-Modellassay liefert daher ein in vivo Modell
für die
direkte Beobachtung einer Stimulation beziehungsweise Inhibierung
der Angiogenese, die auf einer Implantation von Substanzen direkt
in die Hornhaut des Auge folgen kann.
-
A. In vivo Kaninchenaugen-Modellassay
-
1) Durch Wachstumsfaktoren
induzierte Angiogenese
-
Die Angiogenese wurde in dem Kaninchenaugen-Modellassay
durch den Wachstumsfaktor β-FGF
induziert und wird im folgenden beschrieben.
-
a. Herstellung von Hydron-Pellets
die Wachstumsfaktoren und monoklonale Antikörper enthalten
-
Hydron-Polymer-Pellets, die Wachstumsfaktoren
und mAbs enthalten, wurden wie bei D'Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
91: 4082–4085
(1994) beschrieben, hergestellt. Die einzelnen Pellets enthielten
650 ng des β-FGF
Wachstumsfaktors gebunden an Sukralfat (Carafet, Marion Merrell
Dow Corporation) zur Stabilisierung des β-FGFs, und um eine langsame
Freisetzung in das umgebende Gewebe hinein zu bewirken. Zusätzlich wurden
Hydron-Pellets hergestellt, die entweder 40 μg des mAbs LM609 (anti-ανβ3)
oder des mAbs P1F6 (anti-ανβ5)
in PBS enthielten. Die Pellets wurden in besonderen Teflonvorrichtungen
hergestellt, die ein 2.5 mm großes
Loch enthielten, dass in ihre Oberflächen gebohrt war. Ungefähr 12 μl des einzugießenden Materials wurde
in jede Vertiefung gegeben und über
Nacht unter einer Sterilbank auspolymerisiert. Die Pellets wurden anschließend durch
Ultraviolett-Strahlung sterilisiert.
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b. Behandlung mit monoklonalen
Antikörpern
-
Jedes Experiment umfasste drei Kaninchen,
wobei jeweils in das eine Auge ein β-FGF und LM609 enthaltendes
Pellet implantiert wurde und in das andere Auge ein Pellet, dass β-FGF und
Maus mAb P1 F6 (anti-ανβ5)
enthielt. Die Verwendung paariger Augen, um den LM609 (anti-ανβ3)
mit anderen mAbs und PBS-Kontrollen zu vergleichen, ist eine geeignete
Methode, um signifikante Unterschiede zwischen den getesteten mAbs
zu ermitteln.
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Der P1 F6 mAb kreuzreagierte mit
dem ανβ5 Integrin,
das auf der Oberfläche
von vaskulären
Endothelzellen vorkommt, aber vermutlich nicht an der Angiogenese
beteiligt ist. Um zu bestimmen, ob der mAb P1 F6 an der Angiogenese
beteiligt war, wurden Pellets, die nur diesen Antikörper enthielten,
hergestellt und wie oben beschrieben getestet.
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Alle der getesteten Antikörper wurden
aus Ascites-Flüssigkeit
unter Verwendung von Protein-A-Sepharose CL-4B Affnitäts-Säulenchromatographie
gereinigt, gemäß gut bekannter
Methoden. Die eluierten Immunglobuline wurde dann gegen PBS dialysiert
und mit Detoxi-Gel zur Entfernung von Endotoxinen (Pierce Chemicals)
behandelt. Von den Endotoxinen ist bekannt, dass sie potente angiogene
und inflammatorische Stimulantien sind. Daher wurden die mAbs auf
die Anwesenheit von Endotoxinen mit dem chromogenen Limulus-Amoebozyten-Lysat-Assay
(Bio-Whittaker) getestet und nur die mAbs ohne nachweisbare Endotoxine wurden
in dem Kaninchenaugen-Modellassay eingesetzt.
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Ein Hydron-Pellet, β-FGF und
mAb LM609 (anti-ανβ3)
oder P1F6 (anti-ανβ5)
enthaltend, wurde in die im Kaninchenauge hergestellte Hornhauttasche
implantiert. Das Hydron-Pellet
enthielt auch Sukralfat zur Stabilisierung des β-FGFs während des Assays. Einzelne
Pellets wurden in chirurgisch präparierte "Taschen" innerhalb der mittleren
Stromaschicht der Kaninchenhornhaut implantiert. Diese chirurgische
Operation wurde unter sterilen Bedingungen an einem Operationsmikroskop
(Wild Model M691) durchgeführt,
das einen Strahlenteiler aufwies, an dem eine Kamera befestigt war,
um die Operation an den Hornhäuten
verfolgen zu können.
Eine 3 mm bis 5 mm große "Tasche" wurde im Hornhautstroma
geschaffen, indem ein 3 mm tiefer Einschnitt bis zur Hälfte der
Hornhautdicke mit einem "69
Beaver blade" Messer
vorgenommen wurde. Das Stroma wurde am Rand mit einem Irisspatel
entfernt und das Pellet mit seinem äußeren Rand 2 mm vom Limbus entfernt,
implantiert.
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Während
der nächsten
14 Tage diffundierten β-FGF
und der mAb aus dem implantierten Pellet in die umgebenden Gewebe
und beeinflussten dabei die Angiogenese vom Rand der Hornhaut aus.
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Repräsentative Ergebnisse von jeder
Behandlung sind in den 16A–16E dargestellt. Die Menge an
vorhandenen Gefäßen wurde
quantifiziert und mit Uhrzeigerstand-Bezeichnungen beschrieben,
wie nachfolgend definiert. Das Auge wurde in 12 gleiche Teile, in
der gleichen Weise wie die Uhr in Stunden eingeteilt ist, unterteilt. "Ein Uhr Gefäße" bezeichnen die Gefäße, die
das Gebiet eines Auges ausfüllen,
das äquivalent zu
ein Uhr ist.
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Die fünf Kaninchen, die nur mit β-FGF behandelt
wurden, zeigten eine ausgedehnte Angiogenese, bei der neue Blutgefäße vom Rande
der Hornhaut bis in das Zentrum der Hornhaut gewachsen waren, wo
normalerweise keine Blutgefäße zu finden
sind. Eines dieser Kaninchen zeigte nur 1 Uhr Gefäße am Pellet.
Zwei Kaninchen, die sowohl mit β-FGF als auch den
mAb LM609 behandelt wurden, wiesen absolut keine nachweisbare Angiogenese
bis zu 14 Tage nach der Operation auf. Eins dieser Kaninchen zeigte
drei haemorrhagische Punkte und Gefäß-Aussprossung am Tag 14. Zwei
der Kaninchen, die β-FGF
und mAb P3G2 (anti-ανβ5)
behandelt wurden, zeigten eine ausgedehnte Vaskularisierung, wobei
neue Blutgefäße vom Rande
der Hornhaut in das Innere der Hornhaut gewachsen waren. Eines dieser
Kaninchen wies nur 1–2
Uhr Gefäße am Pellet
auf.
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Wie im Kaninchenaugen-Modellassay
gezeigt, konnte keine angiogene Wirkung auf normale paralimbische
Gefäße in der
Anwesenheit des Wachstumsfaktors β-FGFs
in Kaninchen beobachtet werden, die mAb LM609 (anti-ανβ3)
behandelt waren. Im Gegensatz dazu trat Angiogenese in Anwesenheit
von β-FGF
in paralimbischen Gefäßen auf,
wenn die Kaninchen mit dem mAb P3G2 (anti-ανβ5)
behandelt waren. Die vollständige
Hemmung der Hornhaut-Angiogenese durch mAb LM609 ist wesentlich
größer als
die Wirkung irgendeines anderen vorher berichteten anti-angiogenen
Reagenzes.
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11. In vivo Rückbildung
von Tumorgewebewachstum durch ανβ-Antagonisten
gemessen mit dem chimären Maus
: Mensch Assay
-
Ein in vivo chimäres Maus : Mensch Modell wurde
dadurch hergestellt, dass ein Teil der Haut einer SCID Maus durch
humane neonatale Vorhaut (17)
ersetzt wurde. Nachdem die Hauttransplantation ausgebildet war,
wurde die humane Vorhaut mit Karzinomzellen inokuliert. Nach Ausbildung
eines messbaren Tumors wurde entweder mAb LM609 (anti-ανβ3)
oder PBS in die Schwanzvene der Maus injiziert. Nach 2–3 Wochen
wurde der Tumor schließlich
herausgeschnitten und durch Gewichtsbestimmung und Histologie untersucht.
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A. In vivo chimären Maus-Mensch
Assay
-
Das in vivo chimäre Maus-Mensch Modell wurde
im wesentlichen wie bei Yan et al., J. Clin. Invest., 91: 986–996 (1993)
beschrieben, hergestellt. In Kürze
wurde ein 2 cm2 großes Gebiet der Haut chirurgisch
von einer SCID Maus entfernt (6–8
Wochen alt) und durch humane Vorhaut ersetzt. Die Maus wurde betäubt und das
Haar von einem 5 cm2 großem Gebiet entfernt, indem
sie auf jeder Seite der lateralen Bauchregion rasiert wurde. Zwei
runde, 2 cm2 große Wundbetten für die Transplantate
wurden durch Entfernen der gesamten Dicke der Haut bis zum Bindegewebe
der Muskeln entfernt. Humane Hauttransplantate der gesamten Dicke
und der gleichen Größe wurden
von humaner neonataler Vorhaut gewonnen, auf die Wundbetten platziert
und mit einer Wundnaht festgenäht.
Das Transplantat wurde mit einem Pflaster, dass an Haut genäht wurde,
bedeckt. Kleinporige Stoffpflaster wurden auch verwendet, um die
Wunde zu bedecken.
-
Die M21-L humane Melanom-Zelllinie
oder MDA 23.1 Brustkarzinom-Zelllinie (ATCC HTB 26; ανβ3-negativ
auf Schnitten, festgestellt durch Immunreaktivität gegenüber mAb LM609) wurden auch
verwendet, um feste humane Tumoren auf den humanen Hauttransplantaten
auf SCID Mäusen
zu generieren. Eine einzelne Zellsuspension von 5 × 106 M21-L oder MDA 23.1 Zellen wurde intradermal
in die humanen Hauttransplantate injziert. Die Mäuse wurden dann für weitere
2–4 Wochen,
in denen messbare humane Tumoren wuchsen, beobachtet.
-
B. Intravenöse Applikation
-
1) Behandlung mit monoklonalen
Antikörpern
-
Nach Ausbildung messbarer Tumoren
wurden die SCID Mäuse,
die mit M21-L Tumorzellen injiziert wurden, intravenös in die
Schwanzvene mit 250 μg
von entweder dem mAb LM609 (anti-ανβ3)
oder PBS zweimal die Woche über
2–3 Wochen
injiziert. Anschließend
wurden die Tumoren aus der Haut herausgeschnitten und das umgebende
Gewebe entfernt. Mehrere Mäuse
wurden für
jede Behandlung ausgewertet und das durchschnittliche Tumorgewicht
von jeder Behandlung ausgerechnet, am Ende von Tabelle 6 gezeigt.
-
-
-
Der Kontakt von M21-L ανβ3-negativen
humanen Karzinom-Tumorgewebe in dem Maus : Mensch chimären Assaysystem
mit LM609 (anti-ανβ3)
verursachte eine Abnahme des durchschnittlichen Tumorgewichts von
198 mg in den PBS behandelten Tumoren auf 113 mg.
-
Repräsentative Beispiele von mit
mAb LM609 (anti-ανβ3)
und PBS behandelten M21-L Tumoren wurden morphologisch untersucht.
Die PBS-behandelten Tumoren waren groß (8–10 mm im Durchmesser) und in
erheblichem Ausmaß vaskularisiert,
wohingegen die, die mit dem mAb LM609 (anti-ανβ3)
behandelt waren, viel kleiner (3 bis 4 mm im Durchmesser) waren
und nachweisbare Blutgefäße fehlten.
-
Die Tumoren, die sich in den Hauttransplantaten,
die mit MDA 23.1 injiziert wurden, ausgebildet hatten, waren nachweisbar
und wiesen eine messbare Größe auf.
Die morphologische Untersuchung der entstandenen Tumoren zeigte,
dass eine Neovaskularisierung von dem transplantierten, humanen
Gewebe in die MDA 23.1 Tumorzellen stattgefunden hat.
-
Somit bewirkte die Blockade des ανβ3-Rezeptors
durch intravenöse
Injektion von ανβ3-spezifischem LM609
Antikörper
eine Rückbildung
eines Karzinoms in diesem Modellsystem, genauso wie im CAM und Kaninchenaugen-Modellsystem,
wie in den Beispielen 9 beziehungsweise 10 beschrieben.
-
12. Stimulierung von Gefäßzellen
durch Anwesenheit von ανβ-Antagonisten
in den Zellzyklus beziehungsweise den Prozess der Apoptose einzutreten
gemessen mit dem CAM-Assay
-
Der Angiogenese-Prozess hängt eindeutig
von der Eigenschaft der Zytokine, wie β-FGF und VEGF, ab, die Proliferation
von Gefäßzellen
zu stimulieren. Mignatti et al., J. Cell. Biochem., 471: 201 (1991);
Takeshita et al., J. Clin. Invest., 93: 662 (1994); und Koyama et
al., J. Cell. Physiol., 158: 1 (1994). Jedoch ist es offensichtlich,
dass auch Signaltransduktionsprozesse die Differenzierung dieser
Gefäßzellen
in reife Blutgefäße regulieren
können.
So ist es vorstellbar, dass eine Störung von Signalen, die entweder
auf das Wachstum oder die Differenzierung von Gefäßzellen
wirken, die im neuen Wachstum oder in Angiogenese begriffen sind, in
einer Störung
der Angiogenese resultieren kann. Es wurde gezeigt, dass die Bindung
an Integrine sowohl eine Rolle bei der Zell-Proliferation als auch
bei der Apoptose oder dem programmierten Zelltod in vitro spielt. Schwartz,
Cancer Res., 51: 1503 (1993); Meredith et al., Mol. Biol. Gell.,
4: 953 (1993); Frisch et al., J. Cell Biol., 124: 619 (1994); und
Ruoslahti et al., Cell, 77: 477 (1994). Eine genaue Untersuchung
der Wirkungen der ανβ3-Antagonisten
auf die Angiogenese zeigt das Vorliegen von diskontinuierlichen
und unterbrochenen Tumor-assoziierten
Gefäßen. Daher
ist er möglich,
dass der Verlust der Blutgefäß-Kontinuität auf eine
selektive Nekrose oder Apoptose zurückzuführen ist.
-
Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden
CAMs nach Angiogenese-Induktion mit dem Wachstumsfaktor β-FGF und
nach Behandlung mit den erfindungsgemäßen mAbs und erfindungsgemäßen zyklischen
Peptiden untersucht.
-
A. Behandlung mit monoklonalen
Antikörpern
-
Die Apoptose kann durch eine Vielfalt
an Methoden detektiert werden, eingeschlossen die direkte Untersuchung
isolierter DNA aus Geweben, um die Fragmentierung der DNA zu bestimmen
und die Detektion von 3'OH
Enden in intakten Geweben mittels Antikörpern, die spezifisch freie
3'OH-Gruppen fragmentierter DNA
erkennen.
-
1) Analyse der DNA Fragmentierung
-
Die Angiogenese wurde induziert,
indem mit β-FGF
gesättigte
Filterscheiben auf die CAMs 10 Tage alter Embryonen gebracht wurden,
wir in Beispiel 6A beschrieben. Eine immunhistologische Analyse
der mit LM609 (anti-ανβ3)
behandelten CAMs zeigte 12 bis 24 Stunden nach Auslösung der
Angiogenese mit β-FGF eine
maximale ανβ3-Expression
auf Blutgefäßen. 24
Stunden nach Stimulierung mit β-FGF
wurden die Embryonen daher mit 100 μl PBS alleine oder mit PBS,
300 μg von
entweder CSAT (anti-β1) oder LM609 (anti-ανβ3) enthaltend,
intravenös
injiziert.
-
Die DNA Fragmentierung wurde dadurch
detektiert, dass das CAM-Gewebe direkt unter dem β-FGF gesättigtem
Filter herausgeschnitten wurde und zwar 24 Stunden bis 48 Stunden
nach intravenöser
Injektion mit mAb LM609 (anti-ανβ3),
CSAT (anti-β1) oder PBS. Die
herausgeschnittenen CAM Gewebe wurden dreimal mit sterilem PBS gewaschen,
kleingeschnitten, in 0.25% bakterieller Kollagenase (Worthington
Biochemical; Freehold, NJ) resuspendiert und für 90 Minuten bei 37°C unter gelegentlichen
Mixen inkubiert. Die DNA wurde von einer gleichen Anzahl an CAM- Zellen von Einzelzellsuspensionen,
wie vorher beschrieben, extrahiert. Bissonette, et al., Nature,
359: 552 (1992). Kurz gefasst, wurde eine gleiche Anzahl an CAM
Zellen in 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA in 0.5% Triton-X-100
(Sigma, St. Louis, Mo.) lysiert. Die Zell-Lysate wurde dann bei
16 000 g für
15 min bei 4°C
zentrifugiert, um die lösliche,
fragmentierte DNA vom intakten Chromatin-Pellet zu trennen. Die
fragmentierte DNA wurde gewaschen, präzipitiert und auf einem 1.2%
(w/v) Agarosegel analysiert.
-
Die lösliche, fragmentierte DNA wurde
aus einer gleichen Anzahl an CAM-Zellen von jeder Behandlung isoliert,
elektrophoretisch auf einem Agarosegel aufgetrennt und durch Anfärbung mit
Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Nach einer 24 ständigen Behandlung
wurde kein Unterschied in der relativen Menge an DNA Fragmentierung,
resultierend aus den drei unterschiedlichen Behandlungen, ermittelt.
Jedoch 48 Stunden nach Start der Behandlung mit dem mAb LM609 (anti-ανβ3)
war eine signifikante Zunahme in der DNA Fragmentierung zu beobachten,
im Vergleich zu den Embryonen, die entweder mit mAb CSAT (anti-β1)
oder PBS alleine behandelt wurden.
-
2) Stimulierung der Gefäßzellen
in den Zellzyklus einzutreten
-
Um die Rolle von ανβ3 in
diesen Prozessen experimentell zu untersuchen, wurden von CAMs abstammende
Zellen, mit oder ohne β-FGF
Behandlung, mit Propidiumjodid gefärbt und der mAb LM609 (anti-ανβ3) zur
Immunreaktion verwendet.
-
Die 24 und 48 Stunden nach Start
der Behandlung mit den mAbs LM609 (anti-ανβ3),
CSAT (anti-β1) oder PBS isolierten CAMs wurden mit Hilfe
von Kollagenase zu Einzelzellsuspensionen dissoziiert, wie oben beschrieben.
Anschließend
wurden die Einzelzellen permeabilisiert und mit dem Apop Tag in
situ Detektionskit gefärbt,
entsprechend der Anleitung des Herstellers (Oncor, Gaithersburg,
Md.). Apop Tag ist ein Antikörper, der
spezifisch freie 3'OH-Gruppen
fragmentierter DNA erkennt. Die Erkennung solcher freien 3'OH-Gruppen ist eine
etablierte Methode für
die Detektion apoptotischer Zellen. Gavrieli et al., J. Cell Biol.,
119: 493 (1992).
-
Apop Tag gefärbte Zellen wurden mit 0.1%
(v/v) Triton-X-100 Lösung
in PBS gewaschen und in FACS Puffer, 0.5% (w/v) BSA, 0.02% (w/v)
Natriumazid und 200 μg/ml
RNAse A in PBS enthaltend, resuspendiert. Die Zellen wurden dann
für 1.5
Stunden inkubiert, gewaschen und durch Fluoreszenz-aktiviertes Sortieren
von Zellen analysiert. Die zelluläre Fluoreszenz wurde unter
Verwendung eines FACScan Durchfluss-Zytometers (Becton Dickinson,
Mountain View, Calif) gemessen und, wie unten beschrieben, analysiert.
Das seitliche Streulicht (SSC) und das vordere Streulicht (FSC)
wurden gleichzeitig bestimmt und alle Daten mit einem Hewlett Packard
(HP9000) Computer, ausgerüstet
mit einer FACScan Foschungs-Software (Becton Dickinson, Mountain
View, Calif). Die Daten wurden mit der P. C. Lysis Version 1 Software
ausgewertet (Becton Dickinson, Mountain View, Calif). Die negativen
Kontroll-Schwellenwerte
wurden von Zellsupsensionen erhalten, denen kein primärer Antikörper aus
dem Apop Tag Kit zugesetzt wurde. Identische Schwellenwerte wurde
auf beide Zellpopulationen angewendet, was in der Analyse von ungefähr 8000
Zellen pro experimenteller Bedingung resultierte.
-
Der Prozentsatz der Zellen, die von
den mit mAbs behandelten CAMs stammten und Apop Tag gefärbt waren,
bestimmt mittels FACS Analyse, ist in 18 gezeigt. Die schwarze Säule repräsentiert
Zellen von Embryonen, die 24 Stunden vor der Analyse behandelt wurden.
Die gepunktete Säule
entspricht Zellen von Embryonen, die 48 Stunden vor der Analyse
behandelt wurden. Jede Säule
stellt den Mittelwert ± SE
von drei Wiederholungen dar.
-
Wie in 18 gezeigt, zeigten die CAMs, die zwei
Tage vor der Analyse mit mAb LM609 (anti-ανβ3) behandelt
wurden, einen 4-fachen Anstieg in der Apop Tag Färbung, im Vergleich zu CAMs,
die mit PBS alleine oder CSAT (anti-β1) behandelt
wurden.
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B. Behandlung mit synthetischen
Peptiden
-
Die CAM-Assays mit Wachstumsfaktor-induzierter
Angiogenese wurden auch mit erfindungsgemäßen synthetischen Peptiden,
wie in Beispiel 6A beschrieben, durchgeführt, um die Wirkung der zyklischen
Peptide auf die Apoptose zu ermitteln. Die Peptide cyclo-RGDfV (66203)
und cyclo-RADfV (69601) wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
Die Peptid-Lösungen
oder PBS wurden in die CAM-Präparate
in einer Konzentration von 300 μg/ml
injiziert. Nach 24 und 48 Stunden wurde das Filterpapier und das
umgebende CAM Gewebe herausgeschnitten und mit Apop Tag zur Ermittlung
der Apoptose gefärbt,
wie oben in Beispiel 12A2) beschrieben.
-
Wie in 18 zu sehen, zeigen die CAMs, die zwei
Tage vor der Analyse mit dem Peptid 69203 (cyclo-RGDfV) behandelt
wurden, einen 3-4-fachen Anstieg in der Apop Tag Färbung im
Vergleich zu den CAMs, die entweder mit PBS alleine oder dem zyklischen
Kontroll-Peptid 69601 (cyclo-RADfV) behandelt wurden.
-
C. Wirkung der Behandlung
mit monoklonalen Antikörpern
auf die Apoptose und den Zellzyklus
-
Um die Wirkung der monoklonalen Antikörper auf
den Zellzyklus und die Apoptose zu bestimmen, wurden Einzelzellsuspensionen
mittels Propidiumjodid-Färbung
auf die Zahl der Kopien chromosomaler DNA untersucht, beziehungsweise
die Zellen mit Apop Tag gefärbt.
Einzelzell-Suspensionen von CAMs, die 24 und 48 Stunden vor der
Analyse mit mAb LM609 (anti-ανβ3)
oder CSAT (Anti-β1) oder PBS behandelt wurden, sind, wie in
Beispiel 12A1) beschrieben, hergestellt worden. Für die Färbung der
Zellen mit Apop Tag wurden die Zellsuspensionen dreimal mit Puffer,
2.5% (w/v) BSA und 0.25% (w/v) Natriumazid in PBS enthaltend, gewaschen.
Dann wurden die Zellen mit 1% (w/v) Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten
fixiert und anschließend dreimal,
wie oben beschrieben, gewaschen. Um eine unspezifische Bindung zu
verhindern, wurden die Einzelzellsuspensionen mit 5% (w/v) BSA in
PBS über
Nacht bei 4°C
geblockt. Die Zellen wurden dann, wie vorher, gewaschen, mit Apop
Tag gefärbt
und die Zell-Fluoreszenz
mit einem FACScan, wie oben in Beispiel 12A beschrieben, gemessen.
Die Zellen jeder experimentellen Bedingung wurden mit Propidiumjodid
(Sigma, St. Louis, Mo.) in einer Konzentration von 10 μg/ml in PBS
für 1 Stunde
gefärbt,
zweimal mit PBS gewaschen und dann auf für Apoptose typische Kern-Eigenschaften,
wie Chromatin-Kondensierung und Fragmentierung, hin untersucht.
Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde durch eine morphologische
Analyse der Zellen von mindesten 10–15 zufällig ausgewählten, mikroskopischen Feldern
bestimmt.
-
Die zusammengefassten Ergebnisse
der Einzelzellsuspensionen von embryonalen CAMs, die entweder mit
CSAT (anti-β1) oder LM609 (anti-ανβ3)
behandelt wurden, mit Apop Tag und Propidiumjodid gefärbt und mittels
FACS analysiert wurden, sind in 19 dargestellt.
Die Y-Achse stellt die Apop Tag Färbung (Apoptose) dar, die X-Achse
die Propidiumjodid-Färbung
(DNA-Gehalt). Die horizontale Linie gibt die Nachweisgrenze für die Apop
Tag Färbung
an. Die linken und rechten Bildabschnitte repräsentieren CAM Zellen von CSAT beziehungsweise
LM609 behandelten Embryonen. Die Zellzyklus-Analyse wurde durch
Untersuchung von ungefähr
8000 Ereignissen pro experimentelle Bedingung durchgeführt und
die Daten sind in einem Konturdiagramm dargestellt.
-
Die Proben einzelner Zellen, deren
DNA mit Propidiumjodid gefärbt
war, zeigten, dass 25–30%
der LM609-(anti-ανβ3)-behandelten
CAM-Zellen 48 Stunden nach Behandlungsbeginn eine Kern-Kondensation und/oder
Fragmentierung aufweisen. Diese Vorgänge sind charakteristisch für Zellen,
die sich im Prozess der Apoptose befinden. Im Gegensatz dazu zeigten
90–95%
der Zellen der mit CSAT (anti-β1) behandelten CAMs eine normale Kernfärbung zeigten.
-
Wie in 19 gezeigt, konnte eine signifikante
Anzahl an Zellen im Maximum gemessen werden, die weniger als eine
Kopie der DNA aufwiesen (AO), was konsistent mit einer Induktion
der Apoptose durch LM609 ist. Es wurde früher gezeigt, dass dieses Maximum
fragmentierte DNA in Zellen repräsentiert,
die sich in einem späten
Apoptose- Stadium
befinden, Telford et al., Cytometry, 13: 137 (1992). Darüberhinaus
färben
sich die AO Zellen leicht mit dem Apop Tag Kit, was die Eigenschaft
dieses Reagenzes belegt, apoptotische Zellen zu detektieren. Zusätzlich zur
Färbung
der Zellen in AO, wurde jedoch auch eine signifikante Zellzahl,
die mehr als eine DNA Kopie aufwiesen, mit Apop Tag gefärbt (19). Diese Ergebnisse zeigen,
dass LM609 die Fähigkeit
besitzt, die Apoptose von Gefäßzellen
zu fördern,
die schon in den Zellzyklus eingetreten sind. Im Gegensatz dazu
zeigten die von Kontroll-CAMs stammenden Zellen, die in den Zellzyklus
eingetreten waren, nur eine minimale Apop Tag Färbung, entsprechend den nur
wenigen, apoptotischen Zellen, die in unbehandelten CAMs detektiert
werden konnten.
-
Von den Zellen der β-FGF behandelten
CAMs, die in den Zellzyklus eingetreten waren (S und G2/M Phase),
zeigten 70% eine positive Färbung
mit LM609 (anti-ανβ3).
Im Vergleich dazu zeigten nur 10% der im Zellzyklus befindlichen
Zellen von nicht β-FGF
behandelten CAMs eine LM609 Färbung.
Diese Befunden zeigen, dass nach β-FGF
Induktion, die Mehrzahl der ανβ3-positiven
Zellen eine aktive Proliferation aufweist.
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Zusammen genommen, zeigen die Ergebnisse,
dass die intravenöse
Injektion des mAbs LM609 oder zyklischer Peptid-Antagonisten von ανβ3 die
Apoptose in der Hühner-CAM,
auf die Angiogenese Induktion folgend, fördert.
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Die CAMs wurden auch histologisch
durch Immunreaktivität
gegenüber
LM609 auf die Expression von ανβ3 untersucht,
ebenso wie für
Zellen, die sich im Prozess der Apoptose befinden, durch Immunreaktion
mit Apop Tag. CAM-Schnitte, die aus Embryonen erhalten wurden, die
48 Stunden vor der Analyse mit LM609 (anti-ανβ3),
CSAT (anti-β1) oder PBS behandelt wurden, hergestellt
wie in Beispiel 5A beschrieben, wurden in OTC (Baxter) eingebettet
und in flüssigem
Stickstoff schockgefroren. Sechs Mikrometer dicke Schnitte von CAM Geweben
wurden hergestellt, in Aceton für
30 Sekunden fixiert und bei –70°C bis zur
weiteren Verwendung gelagert. Die Gewebeschnitte wurden dann für die Färbung vorbereitet,
indem sie kurz mit 70%/v(v) Äthanol (EtOH)
gespült
wurden und dann dreimal mit PBS gewaschen wurden. Dann wurden die
Schnitte mit 5% (w/v) BSA in PBS für 2 Stunden blockiert, gefolgt
von der Inkubation mit 10 μg/ml
mAb LM609 für
2 Stunden. Die Schnitte wurden anschließend gewaschen und mit einer
1 : 50 verdünnten
Ziege anti-Maus IgG-Rhodamin-Konjugat (Fisher Scientific, Pittsburg,
Pa.) Lösung
für 2 Stunden
inkubiert. Schließlich
wurden die gleichen Schnitte gewaschen und mit Apop Tag gefärbt, wie
in Beispiel 12A2) beschrieben. Die gefärbten Gewebeschnitte wurden
befestigt und durch Konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert.
In 20 zeigen die Bildabschnitte
A bis C repräsentative,
embryonale CAM Gewebe von CSAT (anti-β1) behandelten
CAMs und die Bildabschnitte D-F repräsentative CAM Gewebe von LM609
(anti-ανβ3)
behandelten CAMs. Die Bildabschnitte A-D zeigen Gewebe, die Apop
Tag gefärbt
wurden und mit Fluoreszenz (FITC) sichtbar gemacht wurden, überlagert
auf ein D. I. C. Bild. Die Bildabschnitte B und E zeigen die gleichen
Gewebe mit LM609 (anti-ανβ3)
gefärbt
und durch Fluoreszenz (Rhodamin) sichtbar gemacht. Die Bildabschnitte
C und F zeigen überlagerte
Bilder des gleichen Gewebes, das sowohl mit Apop Tag als auch mit
LM609 gefärbt
wurde, wobei die Gelbfärbung
eine Kolokalisation anzeigt. Der Maßstab repräsentiert 15 und 50 μm in den
linken beziehungsweise rechten Bildabschnitten.
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Wie in 20A–C gezeigt, ist die Apop
Tag Färbung
nur minimal und eher zufällig
nach intravenöser Injektion
von CSAT oder PBS als Kontrolle, ein Hinweis für ein geringes Ausmaß an Apoptose
in diesem Gewebe. Im Gegensatz dazu zeigte die Mehrzahl der Gefäße aus embryonalen
CAMs, die mit LM609 oder zyklischem Peptid 203 behandelt waren,
eine intensive Apop Tag Färbung,
während
nur eine minimale Reaktivität in
den umgebenden nicht-vaskulären
Zellen beobachtet wurde ( 20D–F). Darüber hinaus konnte, wenn sowohl
Apop Tag als auch LM609 verwandt wurden, um diese Gewebe zu färben, eine
signifikante Kolokalisation dieser Marker nur in embryonalen CAMs
nach ανβ3-Antagonisten
Behandlung beobachtet werden (20F).
Diese Befunde zeigen, dass nach Induktion der in vivo Angiogenese,
die ανβ3-Inhibitoren
selektiv die Apoptose ανβ3-positiver
Blutgefäße fördern.
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Während
die Angiogenese ein komplexer Prozess ist, der viele molekulare
und zellbiologische Ereignisse einschließt, liegen zahlreiche Hinweise
darauf vor, dass das ανβ3-Gefäßzell-Integrin
eine relativ späte Rolle
bei diesem Vorgang spielt.
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Erstens zeigt die immunhistologische
Analyse, dass die ανβ3-Expression
auf Gefäßzellen
ihr Maximum erst 12–24
Stunden nach der Angiogenese-Induktion mit β-FGF erreicht. Zweitens stören ανβ3-Antagonisten die
durch multiple Aktivatoren induzierte Angiogenese, was nahe legt,
dass dieser Rezeptor Teil eines gemeinsamen Signaltransduktionswegs
ist, der möglicherweise
allen primären
Signaltransduktions-Ereignissen,
die zur Angiogenese führen,
nachgeschaltet ist.
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Drittens zeigen LM609 oder mit zyklischen
Peptiden behandelte CAMs keine signifikante Zunahme der Apoptose,
gemessen durch Ermittlung der DNA Fragmentierung bis zu 48 Stunden
nach Start der Behandlung mit diesen Antagonisten. Schließlich fördern Antagonisten
die Apoptose von Gefäßzellen,
die schon induziert worden sind, in den Zellzyklus einzutreten.
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Die Ergebnisse, die hier vorgestellt
wurden, liefern den ersten direkten Beweis, dass Integrin-Bindungsereignisse
das Überleben
von Zellen in vivo regulieren können.
Daher kann angenommen werden, dass sobald die Angiogenese beginnt,
einzelne Gefäßzellen sich
teilen und anfangen, in Richtung einer angiogenen Quelle zu wachen,
und anschließend
die Bindung an ανβ3 ein
Signal liefert, dass eine kontinuierliches Überleben der Zellen erlaubt
und zu einer Differenzierung und Ausbildung reifer Blutgefäße führt. Wenn
jedoch die Bindung an ανβ3 inhibiert
ist, erhält
die Zelle diesen molekularen Stimulus nicht und wird zwangsläufig apoptotisch.
Diese Annahme würde
auch voraussagen, dass nachdem die Differenzierung eingetreten ist,
für das Überleben
reifer Gefäße eine
Signaltransduktion via ανβ3 nicht
länger
erforderlich ist und diese dann unempfindlich gegenüber Antagonisten
dieses Integrins sind. Schließlich
belegen die hier vorgestellten Ergebnisse, dass ανβ-Antagonisten
einen sehr wirkungsvollen therapeutischern Ansatz für die Behandlung
von Neoplasie und anderen Krankheiten, die durch Angiogenese charakterisiert
sind, liefern können.
Erstens zerstören ανβ3-Antagonisten die
Ausbildung neuer Blutgefäße ohne
schon vorher existierende zu beeinflussen. Zweitens haben die Antagonisten
keinen signifikant toxischen Einfluss auf Hühnerembryonen, was nahe legt,
dass sie nicht toxisch sind. Drittens war die Angiogenese unabhängig vom
angiogenen Stimulus signifikant blockiert. Schließlich verursacht
die systemische Anwendung von ανβ3-Antagonisten
eine dramatische Rückbildung
einer Vielfalt an histologisch unterschiedlichen Tumoren.
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Somit zeigen die genannten Beispiele,
dass das ανβ3 Integrin
eine Schlüsselrolle
in der durch eine Vielfalt an Stimuli induzierten Angiogenese spielt,
und, dass das ανβ3 Integrin
zusammen mit den erfindungsgemäßen Antagonisten
einen wertvoller therapeutischen Angriffspunkt für die Behandlung von Krankheiten,
die durch Neovaskularisierung charakterisiert sind, liefert.
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Die vorausgegangene, schriftliche
Spezifizierung wird als ausreichend angesehen, dass ein Fachmann
auf seinem Gebiert die Erfindung ausführen kann. Die vorliegende
Erfindung soll nicht auf die Zelllinie in der Hinterlegung limitiert
sein, da die hinterlegte Ausführungsform
nur als eine beispielhafte Illustration eines Aspekts dieser Erfindung
dienen soll und irgendeine Zelllinie, die funktionell äquivalent
ist, im Bereich dieser Erfindung enthalten ist. Die Hinterlegung
von Material ist nicht als Zustimmung aufzufassen, dass die schriftliche
Beschreibung, die hier enthalten ist, die Ausführung irgendeinen Aspekts dieser
Erfindung nicht ermöglicht,
einschließlich
der besten Methode darin, noch ist sie dazu gedacht, den Bereich
der Erfindung auf die spezifischen Illustrationen, die sie repräsentiert,
zu limitieren. Tatsächlich
werden verschiedene Abänderungen dieser
Erindung, zusätzlich
zu den hier gezeigten und beschriebenen, dem Fachmann auf seinem
Gebiet aus der vorhergegangenen Beschreibung einfallen, diese fallen
auch in den Bereich der angehängten
Ansprüche.
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