DE69532133T2 - Geräte und verfahren, die strukturfelder zum binden von analyten verwenden - Google Patents

Geräte und verfahren, die strukturfelder zum binden von analyten verwenden Download PDF

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G. Michael LOWERY
M. Gary OOSTA
W. Neil LOOMIS
B. Eric SHAIN
G. Thomas SCHAPIRA
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Description

  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft analytische Vorrichtungen für die Detektion von Analyten in einer Testprobe. Die Vorrichtungen nutzen eine Anordnung von Strukturen in der Vorrichtung, um den Analyten einzufangen.
  • 2. Hintergrund der Erfindung
  • Die qualitative oder quantitative Bestimmung von Analyten in Testproben bleibt weiterhin bedeutend bei der Diagnose von physiologischen und nichtphysiologischen Zuständen. Die Analyse einer Testprobe, die mit Reagenzien gemischt ist, führt zu einem detektierbaren Signal, mit und ohne Hilfe von Messausrüstung.
  • Verfahren und Vorrichtungen sind bereitgestellt worden, welche Bestimmungen von einer Vielzahl von Analyten in einer Testprobe bereitstellen. Von besonderem Interesse für Zwecke der vorliegenden Erfindung sind kleine Wegwerfvorrichtungen. Solche Vorrichtungen umfassen im Allgemeinen entweder eine Streifen- oder eine Spurvorrichtung.
  • Poröse Vorrichtungen verwenden im Allgemeinen irgendeine Form von porösem Material, welches ein Fluid durch die Vorrichtung trägt. Diese Vorrichtungen sind allgemein in der Form von Bögen, Streifen, Tauchstäben usw. Streifenvorrichtungen haben vorteilhafterweise eine große Oberfläche und kleine Poren. Einer der Nachteile von Vorrichtungen, die solche Materialien verwenden, ist, dass poröses Material wegen des Zufallsprozesses bei der Bildung der Vorrichtungen von Charge zu Charge variieren kann. Die Variationen können Unterschiede in der Leistung der Vorrichtungen verursachen.
  • Spurvorrichtungen stellen einheitliche Oberflächen bereit, welche ohne weiteres reproduzierbar sind, jedoch einen zu großen Abstand bereitstellen, um Diffusion von Analyt und nachfolgendes
  • Einfangen an einer inneren Oberfläche in einer vernünftigen Zeitspanne zu erlauben.
  • Deshalb wäre es vorteilhaft, kleine Wegwerfvorrichtungen zu erzeugen, welche die Abmessungsreproduzierbarkeit von Spurvorrichtungen aufweisen und die kleinen Poren und großen Oberflächen von Vorrichtungen, die poröse Materialien verwenden. Die Probleme von porösen Vorrichtungen und Spurvorrichtungen würden dann gleichzeitig gelöst.
  • Mehrere Verfahren sind verwendet worden, um kleine Vorrichtungen in der Elektronikindustrie zu erzeugen. Zum Beispiel offenbaren Munchmeyer et al., Rev. Sci. Instrum. 63 (1) 713–721 (19992) LIGA-Technologie zur Herstellung optischer und elektrischer Mikrokomponenten unter Verwendung von Synchrotronstrahlungslithographie, um Master zu erzeugen. Angell et al., Scientific American, 248: 44–55 (1983) lehren das Ätzen durch Mikrobearbeitungstechnologie in Siliziumscheiben für Mikroelektronikzwecke. Manz et al., Trends in Analytical Chemistry, Vol. 10, Nr. 5, Seite 144–149 (1991) offenbaren reproduzierbar mikrobearbeitetes monokristallines Silizium und Glas zur Strömungsinjektionsanalyse und Detektorzellen, welche für schnellere chromatographische und elektrophoretische Trennungen sorgen.
  • Der Trend zu kleinen Vorrichtungen ist nicht beschränkt auf die Elektronikbranche. Sato et al., Sensors and Actuators, A21-A23, Seite 948–953 (1990) offenbaren mikromechanische Siliziumvorrichtungen, welche erlauben, dass Eins-zu-eins-Zellfusionsoperationen zwischen zwei unterschiedlichen Zellgruppen gleichzeitig ausgeführt werden. Es wurde herausgefunden, dass Zellen erfolgreich in den Mikrokammern verschmelzen.
  • US Patent 4.789.628 für Nayak offenbart eine Vielzahl von mit Abstand angeordneten Vorsprüngen, die nach oben aus dem Vertiefungsboden herausragen, um eine vergrößerte Oberfläche für Ligand: Antiligand-Assays bereitzustellen: Die Vielzahl von mit Abstand angeordneten Vorsprüngen bildet einen Verbindungskanal. Jedoch sorgen die großen Maße der Vorsprünge und die großen Weiten der Kanäle nicht für Mikrovolumenassays oder schnelle Signalentwicklung bei Analyten mit niedrigem Pegel.
  • WO 93/22053 A1 für Wilding et al. offenbart mikrogefertigte Detektionsvorrichtungen, welche einen Analyten in einer Testprobe detektieren. Die Vorrichtung hat einen Kanal im Mikrometermaßstab, der aus der Einlassöffnung herausragt. Die Kanäle wurden durch Mikrobearbeitung in Silizium geformt. Bindeglieder kleiden den Kanal aus, was für Analyt-Detektion sorgt.
  • Die aktuellen analytischen Techniken, namentlich poröse und Spurvorrichtungen, stellen keine Materialien bereit, welche zu einer befriedigenden Assayleistung führen. Es besteht ein Bedarf für eine reproduzierbare Vorrichtung, welche Mikrovolumen von Fluidfluss bei akzeptablen Geschwindigkeiten und Einfang von Analyt mit akzeptablen Wirkungsgraden erlaubt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 stellt eine Matrix von rhombusförmigen Strukturen dar. Die Oberflächen der Strukturen sind die Einfangsstellen für Analyt. Die Pfeile in den Figuren stellen die Richtung des Fluidflusses in der Vorrichtung dar. Die Reihen von Rhomben in der Matrix sind bezüglich der Richtung der Fluidflusses versetzt angeordnet.
  • 2 stellt eine Matrix von sechseckförmigen Strukturen dar, die in den analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
  • 3 stellt eine Matrix von dreiecksförmigen Strukturen dar, die in den analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
  • 4 stellt eine Matrix von kreisförmigen Strukturen dar, die in den analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
  • 5 zeigt die Ergebnisse eines hTSH-Assays, wie er in Beispiel 1 unter Verwendung einer analytischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird.
  • 6 stellt eine Ausführungsform der analytischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung dar.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft analytische Vorrichtungen zur Bestimmung der Anwesenheit oder einer Menge eines Analyten in einer Testprobe, die eine Matrix von Strukturen umfassen, worin die Strukturen eine Oberfläche haben, die eine Stelle zum Immobilisieren von Reagens bereitstellt. Das immobilisierte Reagens ist kovalent oder nicht kovalent an diese Oberfläche der Strukturen angeheftet und ist in der Lage, einen Analyten, ein Analyt-Analog, ein Hilfsbindeglied oder ein markiertes Reagens zu binden. Die analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch eine Vielzahl von Kanälen, worin eine Testprobe, die einen Analyten, ein Analyt-Analog, ein Hilfsbindeglied oder ein markiertes Reagens enthält, durch die Kanäle fließen kann, und der Analyt, das Analyt-Analog, das Hilfsbindeglied oder das markierte Reagens durch die Breite dieser Kanäle hindurch diffundieren kann, wodurch er bzw. es an das immobilisierte Reagens bindet. Das markierte Reagens umfasst ein spezifisches Bindeglied, das mit einer detektierbaren Markierung konjugiert ist, worin die detektierbare Markierung ein Signal erzeugt, das die Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Testprobe bestimmt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Nutzung der analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sowie Verfahren zur Herstellung solcher Vorrichtungen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen
  • Bevor mit der Beschreibung der verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, wird eine Anzahl von Ausdrücken, die hier verwendet werden, definiert werden.
  • "Spezifisches Hilfsbindeglied" bezieht sich auf jedes spezifische Bindeglied, welches in dem Assay, zusätzlich zu den spezifischen Bindegliedern des markierten Reagens oder immobilisierten Reagens, verwendet wird. Ein oder mehrere spezifische Hilfsbindeglieder können in einem Assay verwendet werden. Zum Beispiel kann ein spezifisches Hilfsbindeglied in der Lage sein, das markierte Reagens an den interessierenden Analyten zu binden, in Fällen, wo der Analyt selbst nicht direkt an das markierte Reagens angelagert werden könnte. Alternativ kann ein spezifisches Hilfsbindeglied in , der Lage sein, das immobilisierte Reagens an den interessierenden Analyten zu binden, in Fällen, wo der Analyt selbst nicht direkt an das immobilisierte Reagens angelagert werden könnte. Das spezifische Hilfsbindeglied kann in die Assayvorrichtung eingegliedert sein, zu der Probe hinzugesetzt werden oder als ein separates Reagens zugesetzt werden.
  • "Analyt" oder "interessierender Analyt" bezieht sich auf die Verbindung oder Zusammensetzung, die detektiert oder gemessen werden soll, welche mindestens ein Epitop oder eine Bindungsstelle besitzt. Der Analyt kann jede Substanz sein, für welche es ein natürlich vorkommendes Analyt-spezifisches Bindeglied gibt oder für welches ein Analyt-spezifisches Bindeglied hergestellt werden kann. Analyte umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Toxine, organische Verbindungen, Proteine, Lipide, Fettsäuren, Peptide, Mikroorganismen, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Hormone, Zucker, Steroide, Vitamine, Wirkstoffe (einschließlich solcher, die für therapeutische Zwecke verabreicht werden, sowie solcher, die illegal genommen werden), und Metabolite von oder Antikörper zu irgendeiner der obigen Substanzen. Der Ausdruck "Analyt" kann auch alle beliebigen antigenen Substanzen, Haptene, Antikörper, Makromoleküle und Kombinationen davon umfassen.
  • "Analyt-Analog" bezieht sich auf eine Substanz, welche mit dem Analyt-spezifischen Bindeglied kreuzreagiert, auch wenn sie dies in einem größeren oder einem kleineren Ausmaß als der Analyt selbst tun kann. Das Analyt-Analog kann einen modifizierten Analyten sowie einen fragmentierten oder synthetischen Abschnitt des Analytmoleküls umfassen, solange das Analyt-Analog mindestens eine Epitopstelle gemeinsam mit dem interessierenden Analyten besitzt. Ein Beispiel für ein Analyt-Analog ist eine synthetische Peptidsequenz, welche mindestens ein Epitop des Vollmolekül-Analyten dupliziert, so dass das Analyt-Analog an das Analyt-spezifische Bindeglied binden kann.
  • "Kapillare" bezieht sich auf eine feste Oberfläche, die einen Hohlraum umgibt, in welchem Luft vorzugsweise durch ein Fluid der richtigen Oberflächenspannung verdrängt werden kann. Der Mechanismus für Kapillarität ist, abhängig von der freien Oberflächenenergie des Systems. Damit sich spontane Ausbreitung des Fluids durch eine Kapillarität ereignet, muss die freie Oberflächenenergie des Systems während des Ausbreitungsprozesses abnehmen. Das kann für die hierin verwendeten Vorrichtungen erreicht werden, indem die geeigneten festen Oberflächen für das interessierende biologische Fluid ausgewählt werden.
  • "Einfangstelle" bezieht sich auf einen abgegrenzten oder definierten Abschnitt der Strukturen in der Art, dass sich die spezifische Bindungsreaktion zwischen dem immobilisierten Reagens und dem Analyten ereignet. "Kammer" bezieht sich auf einen geschlossen Raum oder eine geschlossene Höhle von definierten Abmessungen, die keine Kapillaren sind. Die Kammer kann Einlass- und Auslassöffnungen haben. Die Kammer kann durch Kapillarkräfte oder durch Differenzdruck gefüllt werden. Die Kontrolle der Dimensionen für eine einzelne Kammer ermöglicht die Kontrolle von Reagenzienzugaben, Fluss, Inkubation, Reaktionszonen oder Detektion. Zusätzlich kann Reagens kovalent oder nicht kovalent an die Oberfläche der Kammern angeheftet sein.
  • "Kanal/Kanäle" bezieht sich auf den Raum zwischen benachbarten Strukturen in der Vorrichtung. Die Kanäle können auch Kapillaren sein. Im Allgemeinen hat der Kanal Zugang zu einer Einlassöffnung, anderen Kapillaren oder einer Kammer. Die Kanallänge wird genügend lang sein für Analytbestimmungen und Detektionen.
  • "Konjugation" bezieht sich auf die chemische Kopplung von einer Komponente an eine andere, um ein Konjugat zu bilden. Kopplungsmittel für kovalente Konjugation an Protein sind beschrieben worden in US-Patent Nr. 5.053.520. Homobifunktionelle Kopplungsmittel zum Koppeln von Enzymen an Antikörper sind ebenfalls auf dem Gebiet bekannt, wie beschrieben in P. C. T. Publication Number WO 92/07268, veröffentlicht am 30. April 1992.
  • "Kopplungsmittel" bezeichnen bifunktionelle Quervernetzungs- oder Kopplungsmittel, d. h. Moleküle, die zwei reaktive Gruppen oder "Enden" haben, welche durch ein Zwischenstück angebunden sein können. Die reaktiven Enden können jeweils von einer Vielzahl von Funktionalitäten sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Aminoreaktionsenden wie N-Hydroxysuccinimid(NHS)-aktive Ester, Imidoester, Aldehyde, Epoxide, Sulfonylhalogenide, Isocyanate, Isothiocyanat und Nitroarylhalogenide; und Thiolreaktionsenden wie Pyridyldisulfide, Maleimide, Thiophthalimide und aktive Halogene. Heterobifunktionelle Quervernetzungsreagenzien haben zwei unterschiedliche reaktionsfähige Enden, z. B. ein Amino-reaktives Ende und ein Carboxyl-reaktives Ende, während homobifunktionelle Reagenzien ähnlich reaktionsfähige Komponenten an jedem Ende aufweisen.
  • Kommerziell erhältliche heterobifunktionelle Reagenzien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Maleimido-NHS-aktive Ester-Kopplungsmittel wie m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS); Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC); Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB) und Derivate davon, einschließlich Sulfosuccinimidylderivate wie Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC); m-Maleimidobenzoyl-sulfosuccinimidester (Sulfo-MBS) und Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (Sulfo-SMPB).
  • Andere heterobifunktionelle Reagenzien umfassen die kommerziell erhältlichen aktiven Halogen-NHS-aktiven Ester-Kopplungsmittel wie N-Succinimidylbromacetat und N-Succinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB) und die Sulfosuccinimidyl-Derivate wie Sulfosuccinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat (Sulfo-SIAB).
  • Eine andere Gruppe von Kopplungsmitteln sind die heterobifunktionellen und Thiol-spaltbaren Agenzien wie N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP). Thiol-spaltbare Agenzien wie N,N'-Didansyl-L-cystin und L-Cystindimethylesterdihydrochlorid können ebenfalls verwendet werden.
  • "Tote Zone(n)" bezieht sich auf Bereiche innerhalb der Kanäle, wo sich Fluide akkumulieren oder der Fluidfluss nicht in einer Vorwärtsrichtung von der Einlassöffnung zu dem Detektionsbereich der Vorrichtung ist.
  • "Diffusion" bezieht sich auf die zufällige Bewegung eines Gebildes aufgrund von Kollisionen von umgebenden Fluidmolekülen. Diffusion führt zu einer Nettobewegung des Gebildes von einem höheren zu einem niedrigeren Konzentrationspegel des Gebildes.
  • "Immobilisiertes Reagens" bezieht sich auf ein Reagens, das kovalent oder nicht kovalent an die Oberfläche der Struktur angeheftet ist. Das immobilisierte Reagens kann auf die Oberfläche der Struktur durch eine Vielzahl von Verfahren aufgebracht werden, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, z. B. Tauchen, Auftragen mit einem Stift, Abscheiden durch ein Kapillarrohr oder durch die Verwendung von Reagensstrahldrucken oder jede andere geeignete Abscheidungstechnik. Das Verfahren der Aufbringung und Anheftung ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch.
  • Im Allgemeinen ist das immobilisierte Reagens ein spezifisches Bindeglied, das kovalent oder nicht kovalent an eine Oberfläche der Struktur angeheftet ist, um eine "Einfangstelle" zu bilden. Typischerweise wird das immobilisierte Reagens so gewählt, dass es den Analyten, das markierte Reagens oder einen Komplex davon bindet. In bevorzugten Ausführungsformen bindet das immobilisierte Reagens an den Analyten für. die Vervollständigung eines Sandwich-Komplexes. Das immobilisierte Reagens kann gewählt werden, dass es direkt den Analyten bindet oder indirekt den Analyten mittels eines spezifischen Hilfsbindeglieds bindet, welches an den Analyten gebunden ist. Das immobilisierte Reagens kann auf der Struktur vor oder während der Durchführung des Assays mittels jedes geeigneten Anlagerungsverfahrens immobilisiert werden. Zusätzlich kann das immobilisierte Reages die Wanderung des Analyten und/oder markierten Reagens durch den Kanal verlangsamen. Das immobilisierte Reagens kann außerdem an die Struktur so angeheftet sein, dass es durch das Fluid entfernt werden kann. Zusätzlich kann die Einfangstelle markiert sein, zum Beispiel mit einem Farbstoff, so dass die Position der Einfangstelle auf den Strukturen visuell oder instrumentell bestimmt werden kann, selbst wenn keine Markierung an der Einfangstelle immobilisiert ist. Jeder Farbstoff kann für diesen Zweck verwendet werden, solange der Farbstoff nicht den Assay oder die Komponenten des Assays beeinträchtigt.
  • Das immobilisierte Reagens kann an einer einzigen Einfangstelle oder an mehreren Einfangstellen bereitgestellt werden. Das immobilisierte Reagens kann außerdem konfiguriert werden, eine Vielzahl von Konfigurationen bereitzustellen, d. h. unterschiedliche Detektions- oder Messformate zu bilden. Alternativ kann das immobilisierte Reagens über einen großen Abschnitt der Struktur auf eine im Wesentlichen gleichmäßige Art und Weise verteilt sein, um die Einfangstelle zu bilden. Das Ausmaß der Signalproduktion an der Einfangstelle steht mit der Menge von Analyt in der Testprobe in Beziehung.
  • "Einlassöffnung" oder "Eintrittsöffnung" oder "Probeneingag" sind Ausdrücke, die synonym verwendet werden. Sie bezeichnen die Stelle, wo die Testprobe in die analytische Vorrichtung eingeführt wird. Die Stelle verschafft Zugang zu einem aufnehmenden Bereich der Vorrichtung. Der aufnehmende Bereich der Vorrichtung kann eine Kammer, eine Kapillare oder ein Kanal sein.
  • "Markiertes Reagens" bezieht sich auf eine Substanz, die eine detektierbare Markierung umfasst, die an ein spezifisches Bindeglied angeheftet ist. Die Anheftung kann eine kovalente oder nicht kovalente Bindung sein, aber das Verfahren der Anheftung ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch. Das markierte Reagens produziert ein detektierbares Signal, das direkt oder indirekt mit der Menge von Analyt in der Probe in Beziehung steht. Die spezifische Bindegliedkomponente des markierten Reagens wird gewählt, dass sie direkt an den Analyten bindet, oder indirekt an den Analyten mittels eines spezifischen Hilfsbindeglieds bindet, was ausführlicher nachfolgend beschrieben wird. Zusätzlich kann das markierte Reagens eine detektierbare Markierung umfassen, die an ein spezifisches Bindeglied angeheftet ist, welches spezifisch an das immobilisierte Reagens bindet. Das markierte Reagens kann in die Testvorrichtung eingegliedert werden, es kann mit der Testprobe vereinigt werden, um eine Testlösung zu bilden, es kann zu der Vorrichtung getrennt von der Testprobe hinzugegeben werden, oder es kann an der Einfangstelle vorabgeschieden oder reversibel immobilisiert werden. Zusätzlich kann das markierte Bindeglied vor oder während der Durchführung des Assays mittels eines geeigneten Anlagerungsverfahrens markiert werden.
  • "Markierung" oder "markiert" verweist auf jede Substanz, welche in der Lage ist, ein Signal zu erzeugen, das visuell oder durch instrumentelle Mittel detektierbar ist. Verschiedene Markierungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Markierungen, welche Signale entweder durch chemische oder physikalische Mittel erzeugen. Solche Markierungen können Enzyme und Substrate umfassen; Chromogene; Katalysatoren; fluoreszente Verbindungen; chemilumineszente Verbindungen; radioaktive Markierungen; direkt sichtbare Markierungen einschließlich kolloidale Metallpartikel wie Gold, kolloidale Nichtmetallpartikel wie Selen, Farbstoffe oder farbige Partikel wie ein farbiger Kunststoff oder ein angefärbter Mikroorganismus, farbige oder färbbare organische Polymerlatexpartikel, und Liposome oder andere Bläschen, die direkt sichtbare Substanzen enthalten; und dergleichen. Kolloidale Metalle und Farbstoffpartikel sind offenbart in US-Patenten 4.313.734 und 4.373.932. Die Herstellung und Verwendung von Nichtmetallkolloiden ist offenbart in US-Patent 4.954.452. Organische Polymerlatexpartikel zur Verwendung als Markierungen sind offenbart in US-Patent 4.252.459.
  • Die Wahl einer einzelnen Markierung ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch, solange die Markierung in der Lage ist, ein detektierbares Signal entweder selbst zu erzeugen, wie z. B. ein visuell detektierbares farbiges organisches Polymerlatexpartikel, oder ein instrumentell detektierbares Signal, wie eine fluoreszente Verbindung, oder detektierbar ist in Verbindung mit einer oder mehreren zusätzlichen signalproduzierbaren Komponenten, wie ein Enzym/Substrat-Signal-erzeugendes System. Eine Vielzahl von unterschiedlich markierten Reagenzien kann gebildet werden durch Variieren entweder der Markierung oder der spezifischen Bindegliedkomponente des markierten Reagens; es wird für den Fachmann verständlich sein, dass die Wahl eine Berücksichtigung des Analyten, der zu detektieren ist, und des gewünschten Mittels für die Detektion einschließt.
  • "Reaktionsgemisch", wie es hier verwendet wird, bedeutet eine Mischung von der Testprobe und anderen biologischen, chemischen und physikalischen Substanzen und Reagenzien für die Detektion von Analyt in der Testprobe. Das Reaktionsgemisch kann außerdem Verdünnungsmittel und Puffer einschließen.
  • "Signalerzeugende Komponente" bezieht sich auf jede Substanz, die in der Lage ist, mit anderen Assayreagenzien oder mit dem Analyten zu reagieren, um ein Reaktionsprodukt oder Signal zu erzeugen, das die Anwesenheit des Analyten anzeigt und das visuell oder durch instrumentelle Mittel detektierbar ist. "Signalproduktionssystem", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf die Gruppe von Assayreagenzien, die benötigt werden, um das gewünschte Reaktionsprodukt oder Signal zu erzeugen. Zum Beispiel können ein oder mehrere Signal-erzeugende Komponenten mit der Markierung umgesetzt werden, um ein detektierbares Signal zu erzeugen. Wenn z. B. die Markierung ein Enzym ist, wird eine Verstärkung des detektierbaren Signals erhalten durch Umsetzung des Enzyms mit einem oder mehreren Substraten oder zusätzlichen Enzymen und Substraten, um ein detektierbares Reaktionsprodukt zu bilden.
  • "Spezifisches Bindeglied" bezieht sich auf ein Glied, das an ein anderes Molekül durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch bindet. Zusätzlich zu Antigen- und Antikörperspezifischen Bindegliedern umfassen andere spezifische Bindeglieder, als Beispiele ohne Beschränkung, Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lectine, komplementäre Nucleotidsequenzen, komplementäre Peptidsequenzen, Effektor- und Rezeptormoleküle, Enzymcofaktoren und Enzyme, Enzymhemmer und Enzyme, eine Peptidsequenz und einen Antikörper, der für die Sequenz oder das gesamte Protein spezifisch ist, Polymersäuren und Basen, Farbstoffe und Proteinbindemittel, Peptide und spezifische Proteinbindemittel (z. B. Ribonuclease, S-Peptid und Ribonuclease-S-Protein) und dergleichen. Außerdem können spezifische Bindeglieder Moleküle umfassen, die Analoga des ursprünglichen spezifischen Bindeglieds sind, zum Beispiel ein Analyt-Analog oder ein spezifisches Bindeglied, das durch rekombinante Techniken oder Molekültechnik hergestellt werden kann. Falls das spezifische Bindeglied ein Immunreaktant ist, kann es zum Beispiel ein Antikörper, Antigen, Hapten, oder ein Komplex davon sein, und falls ein Antikörper verwendet wird, kann es ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein, ein rekombinantes Protein oder ein rekombinanter Antikörper, ein chimärer Antikörper, eine Mischung(en) oder Fragment (e) davon, sowie eine Mischung von einem Antikörper und anderen spezifischen Bindegliedern. Die Einzelheiten der Herstellung von solchen Antikörpern und deren Geeignetheit zur Verwendung als spezifische Bindeglieder sind dem Fachmann gut bekannt.
  • "Strukturen" bezieht sich auf die physikalische Form, die sich aus der Basisschicht der Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung erhebt. Die Oberflächen der Strukturen stellen eine große Oberfläche bereit. Die Strukturen sind in einem Muster oder einer Matrix angeordnet, um ausreichend Analyteinfang an Einfangstellen auf den Oberflächen der Strukturen bereitzustellen. Eine Vielzahl von Formen kann für die Strukturen verwendet werden. Zum Beispiel können dreieckige Strukturen zum Einfangen von Analyt verwendet werden. Zusätzlich können mehrere unterschiedliche Formen zusammen in der gleichen Vorrichtung verwendet werden, z. B. können dreieckige Strukturen und rhombenförmige Strukturen in der gleichen Vorrichtung verwendet werden, um Reagens einzufangen.
  • "Testprobe" bezieht sich auf die Probe, die einen Analyten enthält, der unter Verwendung der vorliegenden Erfindung detektiert werden soll. Eine Testprobe kann andere Komponenten neben dem Analyten enthalten, kann die physikalischen Eigenschaften von Fluiden, biologischen Fluiden oder eines Feststoffes haben, wobei der Feststoff in einem Fluid gelöst werden kann, und kann von jeder Größe oder jedem Volumen sein, einschließlich zum Beispiel ein sich bewegender Strom von Fluid. Die Testprobe kann jede beliebige andere Substanz als den Analyten enthalten, solange die anderen Substanzen den Analyten oder das Analyt-Analog nicht beeinträchtigen. Beispiele für Testproben umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Serum, Plasma, Nahrungsmittel, Spinalflüssigkeit, Auswurf, Samenflüssigkeit, Fruchtwasser, Harn, Speichel, andere Körperflüssigkeiten, und Umgebungsproben wie Grundwasser oder Abwasser, Bodenextrakte und Pestizidrückstände.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung nutzen eine Matrix von Strukturen zum Einfangen von Analyt in einer Testprobe. Die Strukturen sind in einer Matrix angeordnet, um im Wesentlichen gleichförmige Kanäle zum Fluidtransport und eine große Oberfläche bereitzustellen. Der Analyt diffundiert in der Testprobe, wobei er durch ein spezifisches Bindeglied eingefangen wird, das an der Oberfläche der Strukturen gebunden ist. Die analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können als Bögen, Tauchstäbe, Streifen, Küvetten usw. verwendet werden. Zusätzlich kann die Anwesenheit oder Menge von mehr als einem Analyten in einer einzigen analytischen Vorrichtung bestimmt werden. Die vorliegende Erfindung stellt vorzugsweise Vorrichtungen und Verfahren bereit, wo die Vorrichtungen sich auf Kapillarwirkung oder Differenzdruck verlassen, um die Bewegung von Fluiden durch die Vorrichtung anzutreiben, um Messung von Fluiden, Inszenierung von Ereignissen, Einfang von Reagenzien oder Gebilden, Reaktionszeiten, Mischen von Reagenzien zu kontrollieren und ein detektierbares Signal zu bestimmen, usw. Durch Variation des Weges, durch welchen das Fluid fließt, kann man für eine Vielzahl von Aktivitäten wie Mischen, Inkubation, Reaktion und Detektion sorgen.
  • 1. Verfahren zur Herstellung der Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung
  • Die analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sind auf eine Matrix von Strukturen in der Vorrichtung zum Analyteinfang angewiesen. Die Strukturen können durch eine Vielzahl von Prozessen hergestellt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Lasern, Prägen, Lithographie-Galvano formung-Abformung (LIGA), Elektrobeschichtung, Elektroformen, Photolithographie, Ätzen mit reaktiven Ionen, Ionen-Strahl-Mahlen, Formpressen, Gießen, Reaktions-Spritzgießen, Spritzgießen und Mikrobearbeitung des Materials. Wie zu verstehen sein wird, sind die Verfahren, die zur Herstellung der Strukturen der vorliegenden Erfindung genutzt werden, nicht kritisch, solange das Verfahren zu großen Mengen von gleichmäßigen Strukturen und Vorrichtungen führt. Außerdem muss das Verfahren zu einer großen Oberfläche der Struktur führen, und die Strukturen müssen in dichter Nähe zueinander angeordnet sein, um enge Kanäle zu bilden. Die engen Kanäle ermöglichen, dass Analytdiffusion in dem Fluid vorkommt, um den Wirkungsgrad des Einfangens von Analyt und/oder markierten Reagens an der Einfangstelle zu steigern. Im Allgemeinen und vorzugsweise sind die Strukturen in der analytischen Vorrichtung aus dem gleichen Material hergestellt wie die Basisschicht der Vorrichtung.
  • Alle diese Techniken beginnen mit einer Technologie, welche einen Master produziert. Ein Werkzeug wird normalerweise von dem Master hergestellt, welches dann verwendet wird, um die analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung in großer Menge zu produzieren, oder in einigen Fällen können die Master in ausreichender Menge hergestellt werden, um direkt als die analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden.
  • Die in großen Mengen produzierten Strukturen werden vorzugsweise aus einer beliebigen Anzahl von Polymermaterialien gefertigt. Darin eingeschlossen sind, ohne dass sie darauf beschränkt sein sollen, Polyolefine wie Polypropylen und Polyethylen, Polyester wie Polyethylenterephthalat, Styrenenthaltende Polymere wie Polystyrol, Styrenacrylnitril und Acrylnitrilbutadienstyrol, Polycarbonat, Acrylpolymere wie Polymethylmethacrylat und Polyacrylnitril, Chlor-enthaltende Polymere wie Polyvinylchlorid und Polyvinylidenchlorid, Acetal- Homopolymere und -Copolymere, Cellulosen und deren Ester, Cellulosenitrat, Fluor-enthaltende Polymere wie Polyvinylidenfluorid, Polytetrafluorethylen, Polyamide, Polyamide, Polyetheretherketon, Schwefel-enthaltende Polymere wie Polyphenylensulfid und Polyethersulfon, Polyurethane, Silizium-enthaltende Polymere wie Polydimethylsiloxan. Zusätzlich können die Strukturen aus Copolymeren, Mischungen und/oder Laminaten von den obigen Materialien, Metallfolien wie Aluminiumfolie, metallisierten Folien und Metallen, die auf den obigen Materialien abgeschieden sind, sowie aus Glas und Keramikmaterialien gefertigt werden.
  • In einem solchen Verfahren kann ein Laser wie ein Excimer-Laser verwendet werden, um eine Photomaske zu beleuchten, so dass das Licht , das durch die Photomaske hindurchgeht, ein darunter liegendes Material an der Oberfläche abschmilzt, wobei Kanäle in dem Materialsubstrat gebildet werden. Sercel, J., et al., SPIE Proceedings, Vol. 998 (September 1988). Diese Technik kann verwendet werden, um einen Master herzustellen. Der Master kann direkt als eine Vorrichtung verwendet werden und in großen Mengen hergestellt werden, oder er kann als eine Vorlage verwendet werden, um ein Werkzeug zu fertigen, welches verwendet wird, um Vorrichtungen in großen Mengen zu reproduzieren.
  • Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Vorrichtungen ist die LISA-Technik, beschrieben von D. Munchmeyer et al., Rev. Sci. Instrum., 63 (1), 1992. Eine Röntgenstrahlen-Synchrotron-Quelle wird verwendet, um einen Photolack zu bestrahlen. Der entwickelte Photolack bildet einen Master, welcher mit Nickel elektrobeschichtet werden kann, um eine Gussformhöhle zu bilden. Ein flüssiges Polymer kann dann in die Nickelform gegossen oder injiziert werden. Diese Technik kann verwendet werden, um analytische Vorrichtungen direkt herzustellen oder um ein Werkzeug von einem Master zu fertigen.
  • Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung ist, Halbleiterfertigungstechniken zu verwenden wie, soll aber nicht darauf beschränkt sein, Photolitographie, Ätzen mit reaktiven Ionen und Ionen-Strahl-Mahlen, um geeignete Strukturen in Photolack oder anderen Materialien zu definieren. Diese Techniken können verwendet werden, um Vorrichtungen direkt herzustellen, oder sie können verwendet werden, um ein Werkzeug herzustellen, von welchem große Mengen von Vorrichtungen hergestellt werden können.
  • Noch ein anderes Verfahren zur Herstellung der Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung ist, diese durch Mikrotechniken zu bearbeiten. Mikrobearbeitung umfasst den Prozess der Nutzung feiner Werkzeuge, um Kanäle zu schneiden in Materialien wie, aber nicht beschränkt auf, Stahl, Kunststoff, synthetische und nicht synthetische Polymere; Siliziumscheibe, und andere Metalle, Keramik und Glas. Diese Techniken können verwendet werden, um Vorrichtungen direkt herzustellen, oder sie können verwendet werden, um ein Werkzeug herzustellen, von welchem große Mengen von Vorrichtungen hergestellt werden können.
  • Werkzeuge, welche für die Massenproduktion der analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung gefertigt werden, können durch die obigen Techniken hergestellt werden. Die Werkzeuge können durch ein Mittel hergestellt werden wie, soll aber nicht beschränkt sein auf, Elektrobeschichtung. Dieser Prozess erzeugt ein gehärtetes Werkzeug, wie Nickel, zur Reproduktion des Masters.
  • Sobald ein Werkzeug gefertigt worden ist, können die analytischen Vorrichtungen in großen Mengen hergestellt werden durch, soll aber nicht beschränkt sein auf, Prägen, Spritzgießen, Reaktions-Spritzgießen, Gießen und Formpressen. Prägen umfasst das Eindrücken eines erhitzten dauerfesten Werkzeugs in ein erhitztes Polymersubstrat. Alternativ kann ein kaltes Werkzeug in ein erhitztes Polymersubstrat eingedrückt werden. Spritzgießen verwendet ein geschmolzenes Polymer, das in eine Gussformhöhle einzuspritzen ist. Bei Reaktions-Spritzgießen wird ein flüssiges Harz eingespritzt, welches sich durch einen chemischen Prozess verfestigt. Gießen nutzt einen Niederdruckgießprozess. Formpressen nutzt ein erhitztes Werkzeug, welches die Vorrichtung aufschmilzt und formt.
  • 2. Konfiguration der Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung
  • Im Allgemeinen werden die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung eine Einlassöffnung umfassen, der die Testprobe anfänglich präsentiert wird. Allgemein sind die Kanäle Kapillaren und stellen den Transport der Testprobe bereit von der Einlassöffnung durch die Vorrichtung, eine Matrix von Strukturen, welche eine Einfangstelle bereitstellt, und eine Entlüftung, wie eine Ausgangsöffnung, welche Gase in der Vorrichtung entlüftet. Zusätzlich können Kammern und zusätzliche Kapillaren hinzugefügt werden, um eine Vorrichtung anzupassen. Im Allgemeinen ist die Testprobenbewegung durch die Vorrichtung auf Kapillarkräfte angewiesen. Zusätzlich können ein oder mehrere Kapillaren verwendet werden, um die Testprobe von der Einlassöffnung zu den Kanälen zu bringen. Zusätzlich können eine oder mehrere Kapillaren verwendet werden, um den Strukturenbereich der Vorrichtung zu verlassen. Jedoch kann anstelle von oder zusätzlich zu Kapillarkräften Differenzdruck verwendet werden, um Fluidfluss in den Vorrichtungen anzutreiben.
  • Anstelle einer Ausgangsöffnung können selbstentlüftende Materialien verwendet werden, um Gase in der Vorrichtung zu entlüften sowie zur Sauerstoffaufnahme in die Vorrichtung hinein. Der Sauerstoff kann in Reaktionen, z. B. Oxidasereaktionen, innerhalb der Vorrichtung verwendet werden. Selbstentlüftende Materialien und deren Verwendung in analytischen Vorrichtungen werden gelehrt in US-Patent 54 787.
  • Kanäle werden zwischen benachbarten Strukturen erzeugt, durch welche Fluid fließen kann. Sowohl die Kanal- als auch die Strukturgestaltung sind wichtig, um den Kontakt zwischen den Strukturoberflächen und Fluidmolekülen zu optimieren. Typischerweise erstreckt sich die Tiefe der Kanäle von etwa 1 Mikrometer (μm) bis etwa 1 Millimeter (mm). Die mittlere Breite der Kanäle erstreckt sich typischerweise von etwa 0,02 um bis 20 μm. Die Strukturenhöhe erstreckt sich typischerweise von etwa 1 μm bis 1 mm, und die mittlere Breite erstreckt sich typischerweise von 1 μm bis 1 mm. Jede beliebige Zahl von konfigurierten Matrizen kann gewählt werden, solange die Totzonen minimiert oder eliminiert werden. Die bevorzugten Konfigurationen der Matrix von Strukturen sind in einer Matrix angeordnet, wie eine Matrix von Rhomben, eine Matrix von Octagonen, eine Matrix von Hexagonalen oder dergleichen. Die bevorzugten Strukturen minimieren Totzonen. 1, 2, 3 und 4 zeigen die bevorzugten Konfigurationen der Strukturen. Zusätzlich kann mehr als ein Bereich von Strukturen in einer Serie angeordnet werden. Die Serie von Matrizen kann durch Kapillaren untereinander verbunden sein.
  • Assays, die in den Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, optimieren den Einfang an der Oberfläche der Struktur. Durch Nutzung der hier gelehrten Verfahren verbessert eine strenge Kontrolle der Einfangstellengeometrie die Gleichmäßigkeit und den Wirkungsgrad des Einfangens. Die engen, tiefen Kanäle und die große Oberfläche der Strukturen sorgen für Diffusion von Analyt und gesteigerten Analyteinfang. Die Kanalgestaltung beruht auf Diffusion eines Gebildes in der Testprobe, um mit immobilisiertem Reagens auf der Oberfläche der Strukturen in Wechselwirkung zu treten. Typischerweise ist das Gebilde zufällig in dem Querschnitt des Kanals verteilt. Das Gebilde diffundiert zu der Strukturoberfläche, wo das Gebilde mit immobilisiertem Reagens in Wechselwirkung tritt.
  • Immobilisiertes Reagens kann kovalent oder nicht kovalent an die Oberfläche der Strukturen angeheftet sein sowie innerhalb der Kapillaren und/oder Kammern. Das Reagens kann aufgebracht werden als ein zeitausgelöstes Reagens, ein räumlich getrenntes Reagens, oder auf die Oberfläche aufgeschichtet und getrocknet werden. Solche Techniken zum Platzieren von immobilisierten Reagens auf die Oberflächen sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Die Verfahren zur Nutzung von Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung schließen spezifische Bindeglieder ein, Die. Verfahren zur Detektion können die Bindung einer farbigen Markierung wie ein fluoreszenter Farbstoff oder ein farbiges Partikel einschließen. Alternativ kann die Detektion die Bindung eines Enzyms einschließen, welches ein farbiges Produkt bilden kann.
  • Da die Vorrichtungen auf Kapillaren oder andere Kammern angewiesen sind, um die Bewegung von Fluiden zu steuern, ist eine genaue Kontrolle der Dimensionen der inneren Kammern wesentlich. Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können in Agglutinations-, Kompetitiv-, Nicht-Kompetitiv- und Sandwich-Assays verwendet werden sowie mit klinischen chemischen Standard-Assays, z. B. für Glukose und Cholesterin. Assays können homogen sein, wo ein Trennmittel nicht notwendig ist, oder heterogen, wo ein Trennschritt genutzt wird. Typischerweise sind Assays, die in den Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, homogen.
  • Ein oder mehrere alternative Strömungswege können in den Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Kapillartransport der Testprobe von der Einlassöffnung verzweigt auf unterschiedliche Wege, den Hauptweg zu den Strukturen und die alternativen Wege. Die alternativen Wege können in einiger Entfernung von dem Verzweigungspunkt wieder in den Hauptweg eintreten. Falls der Fluidik-Widerstand des alternativen Weges ungefähr der gleiche ist wie der des Hauptweges, wird der Fluss von Testprobe gleichmäßig durch die Wege der Vorrichtung fortschreiten. Falls der alternative Weg einen Fluidik-Widerstand hat, der wesentlich größer ist als der des Hauptweges, wird der Fluss in dem alternativen Weg langsamer sein. Falls der alternative Weg einen kleineren Fluidik-Widerstand als der Hauptweg hat, wird der Fluss der Testprobe in dem alternativen Weg größer sein. Der Fluidik-Widerstand kann innerhalb jedes Weges variiert werden, indem die Querschnittsfläche des Flusses, die Oberflächenspannung, die Entlüftung und die Viskosität der Testprobe variiert werden. Diese Parameter und die Entfernung können die Zeit für den Wiedereintritt in den Hauptweg bestimmen. Alternativ kann jeder alternative Weg direkt zu seiner getrennten Matrix von Strukturen bei unabhängigen Strömungsgeschwindigkeiten fließen. Dies würde mehrere Einfangstellen erlauben und gleichzeitige Bestimmungen der Anwesenheit oder Menge von mehreren Analyten in einer einzigen Testprobe ermöglichen.
  • Die alternativen Wege können Bereiche zum Mischen von Reagenzien mit Testproben umfassen. Zum Beispiel können Kammern als Bereiche der Reagenszugabe verwendet werden. Die Kammer oder Kammern können in dem alternativen Weg sowie in dem Hauptweg platziert sein.
  • Zusätzlich können Einfangvorrichtungen in dem Vorrichtungsweg eingeschlossen sein, so dass Flüssigbestandteile über einer bestimmten Größe entfernt werden. Zum Beispiel können die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung Separatoren enthalten, z. B. um Plasma oder Serum von Vollblut zu trennen. Zum Beispiel kann eine Matrix aus hydrophilem gesinterten porösen Material ein rotes Blutzellen-Agglutinationsmittel auf ihrer Oberfläche aufgebracht haben. Die Matrix könnte in der Vorrichtung vor den Strukturen platziert sein. Die roten Blutzellen in der Vollblutprobe werden in den Zwischenräumen der Matrix eingefangen, während im Wesentlichen Blutzellen-freies Serum oder Plasma durch die Matrix hindurchgelangt und durch Kapillarwirkung zu dem Strukturenteil der Vorrichtung transportiert wird (siehe US-Patent 4.993.092).
  • Ein Vorteil der Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung ist, dass sie es ermöglichen, dass Mikrovolumen von Testproben auf die Anwesenheit oder Menge eines Analyten getestet werden. Zum Beispiel können Mikrovolumen von Serum oder Plasma von einer Vollblutprobe verwendet werden, um auf einen Analyten zu testet.
  • Testproben, die einen zu detektierenden Analyten enthalten, können ein Fluid sein, welches direkt wie von der Quelle erhalten verwendet wird, oder das auf eine Vielzahl von Arten vorbehandelt werden kann, um seinen Charakter zu modifizieren. Die Testprobe wird dann in die Vorrichtung durch eine Einlassöffnung eingeführt, welche Zugang zu einem aufnehmenden Bereich der Vorrichtung verschafft. Der aufnehmende Bereich der Vorrichtung wird entweder eine Kammer oder eine Kapillare sein. Die Testprobe wird dann über die Kapillare transportiert. Die Testprobe kann in den Kapillaren, den Kammern vor den Strukturen oder auf den Oberflächen der Strukturen auf ein oder mehrere Reagenzien stoßen. Die Reagenzien können ein System einschließen, von welchem ein detektierbares Signal erzeugt werden kann.
  • Jede flüssige Testprobe kann eingesetzt werden, wo die Testprobe eine vernünftige Geschwindigkeit des Flusses aufgrund der Kapillarwirkung oder des Differenzdrucks haben wird. Es sollte verstanden werden, dass die Kapillarwirkung oder der Differenzdruck die treibende Kraft für den Testprobentransport ist. Kapillarwirkung ist abhängig von drei kritischen Faktoren: (1) den Oberflächenenergien des Gases, der Oberfläche, über die das Fluid fließt, und des Fluids, (2) den Abmessungen des Kapillarkanals, und (3) dem Wirkungsgrad der Entlüftung. Die Fließgeschwindigkeit sowohl für Kapillarfluss als auch für Differenzdruckfluss wird beeinflusst durch die Geometrie der Kapillare oder Kammer und der Viskosität des Fluids. Die Fließgeschwindigkeit kann weiter beeinträchtigt werden durch Erhöhen oder Erniedrigen des Differenzdrucks. Verfahren zum Aufbringen von Differenzdrücken umfassen, sollen aber nicht beschränkt sein auf, manuell, Motoren, Pumpen, Vakuum oder dergleichen.
  • Falls die Testprobe zu viskos ist, kann sie verdünnt werden, um für eine Kapillarfließgeschwindigkeit zu sorgen, welche eine vernünftige Fließzeit ermöglicht, welche den Zeitraum für den Assay kontrollieren wird.
  • Die Testprobe kann von einer Quelle sein wie, soll aber nicht beschränkt sein auf, ein physiologisches Fluid wie Blut, Serum, Plasma, Speichel, Augenlinsenflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Eiter, Schweiß, Exzudat, Harn, Milch und dergleichen. Die Testprobe kann einer Vorbehandlung unterzogen werden wie, soll aber nicht beschränkt sein auf, Extraktion, Addition, Separation, Verdünnung, Konzentration, Filtration, Destillation, Dialyse oder dergleichen. Neben physiologischen Fluiden können andere flüssige Testproben eingesetzt werden, und die interessierenden Komponenten können entweder Flüssigkeiten oder Feststoffe sein, wobei die Feststoffe in einem flüssigen Medium gelöst oder suspendiert werden.
  • Das eingesetzte Testprobenmedium kann ein natürlich vorkommendes Medium sein, oder die Testprobe kann in ein flüssiges Medium eingeführt werden, welches die gewünschte Charakteristik bereitstellt, die für Kapillarwirkung und ein detektierbares Signal notwendig ist. Additive und Lösungsmittel können zu dem Testprobenmedium hinzugegeben werden, um Sättigung mit Sauerstoff, Stabilität und Fluidität zu erhöhen.
  • Verfahren zur Detektion umfassen, sollen aber nicht beschränkt sein auf, Änderungen der Farbe, Lichtabsorption oder Lichtdurchlässigkeit, pH, Leitfähigkeit, Fluoreszenz, Änderung der physikalischen Phase oder dergleichen.
  • Testproben können eine detektierbare Komponente des Detektionssystems bereitstellen, oder derartige Komponenten können hinzugegeben werden. Die Komponenten werden breit variieren abhängig von der Natur des Detektionssystems. Ein solches Detektionsverfahren wird die Verwendung von Partikeln einschließen, wobei Partikel für Lichtstreuung oder eine Änderung der Geschwindigkeit des Flusses sorgen. Partikel können sein, sollen aber nicht beschränkt sein auf, Zellen, Polymerpartikel, welche mit einem flüssigen System unvermischbar sind, Latexpartikel, Aktivkohlepartikel, Metallpartikel, Polysaccharide oder Proteinpartikel, Keramikpartikel, Nukleinsäurepartikel, agglutinierte Partikel oder dergleichen. Die Wahl von Partikeln wird abhängig sein von dem Verfahren zur Detektion, der Dispergierbarkeit oder der Stabilität der Dispersion, der Inertheit, der Partizipation an der Änderung des Flusses, oder dergleichen.
  • Die Bindung eines Analyten an ein spezifisches Bindeglied an der Einfangstelle kann wahlweise detektiert werden durch Überwachen des Drucks der Testprobe in der Vorrichtung. Zum Beispiel wird ein Druckdetektor, der mit dem Testprobe verbunden ist, die in den Kanal eintritt und diesen verlässt, die Detektion von Druckabfällen ermöglichen, die durch Analytbindung verursacht werden, was zu Kanalflusseinschränkung führt.
  • Ein anderes Verfahren zur Detektion umfasst Hybridisierungsassays. Die Oberfläche der Strukturen kann mit einem immobilisierten Reagens wie Polynucleotidsonden beschichtet sein. Nach Bindung des komplementären Analyt-Polynucleotids an die immoblisierte Polynucleotidsonde kann eine markierte Sonde, z. B. eine fluoreszent markierte Sonde hinzugegeben werden, um an das Analyt-Polynucleotid zu binden. Die Menge an Fluoreszenz ist direkt proportional zu der Menge von Analyt. in der Testprobe. Alternativ kann der Hybridisierungsassay in einem kompetitiven Format durchgeführt werden, wo ein Polynucleotid mit einer detektierbaren Markierung konjugiert wird. Das Polynucleotid-markierte Reagens konkurriert mit dem Analyten um die Bindung an das immobilisierte Polynucleotid.
  • Die Reaktion eines Analyten mit einem spezifischen Bindeglied an der Einfangstelle kann mittels Agglutination detektiert werden. Zum Beispiel kann ein fluoreszent oder lumineszent markiertes Molekül, das in der Lage ist, an den Analyten oder an den Analyt/spezifisches Bindeglied-Komplex an der Einfangstelle zu binden, verwendet werden, um auf die Anwesenheit oder die Menge von Analyt in der Testprobe zu detektieren. Zum Beispiel kann die Agglutination von Blutzellen an der Einfangstelle als ein positiver Test für die Blutgruppe der Testprobe dienen. Das immobilisierte Reagens auf der Oberfläche der Strukturen induziert Agglutination, wodurch sich ein positiver Test für die Blutgruppe ergibt.
  • Lumineszenz kann in Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung detektiert werden. Zum Beispiel kann Lumineszenzemission ohne weiteres detektierbar sein unter Verwendung eines Mikroplattenlesegerätes. Der Analyt kann detektiert werden durch ein spezifisches Bindeglied, das zwei Antikörper umfasst, die in der Lage sind, den Analyten zu binden, wobei ein Antikörper mit Fluoreszein markiert ist, welches Licht emittiert, und ein zweiter Antikörper mit Rhodamin markiert ist, welches Licht absorbiert. Wenn die Rhodamin- und Fluoreszein-markiertem Antikörper jeweils an den Analyten binden, kann ein Verlöschen des Fluoreszeins beobachtet werden, was die Anwesenheit des Analyten anzeigt. Ein anderes Beispiel ist, wo die Fluoreszeinantikörper an der Einfangstelle immobilisiert werden. Der Analyt und der Rhodamin-markierte Antikörper werden dann an die Einfangstelle geliefert und Verlöschen des Fluoreszeins wird beobachtet, was die Anwesenheit des Analyten anzeigt.
  • Noch ein anderes Detektionssystem kann chemische Detektion umfassen. Zum Beispiel korreliert Glukosemessung Änderungen der Absorption oder des Reflexionsvermögens des Mediums mit der Glukosekonzentration. Ein gebräuchliches Verfahren zur Glukosebestimmung nutzt Glukoseoxidase (GOD) und Peroxidase (POD) zusammen mit 4-Aminoantipyren (4-AAP) und Dichlorhydroxybenzensulfonat (DCHBS), um Glukosespiegel in Harn oder Serum zu messen. Alle Reagenzien werden in einer Wasser-quellbaren Matrix wie Gelatine vereinigt und über den Strukturen angeordnet. Die Strukturen werden mit einer durchsichtigen Folie wie Polyethylenterephthalat (PET) decklaminiert. Die Testprobe, normalerweise Serum oder Harn, wird in die Einlassöffnung eingeführt. Nach Kontakt mit der Testprobe quillt die Gelatine, die auf den Strukturen angeordnet wurde, und gibt die Reagenzien frei, welche mit Glukose reagieren. Nach Reaktion mit Glukose wird ein löslicher roter Farbstoff gebildet, welcher durch Extinktion, Reflexionsvermögen oder durch visuelle Beobachtung gemessen werden kann.
  • Alternativ können POD oder GOD auf den Strukturen immobilisiert werden und 4-AAP und DCHBS können mit der Testprobe eingeführt werden, wodurch die Reaktion initiiert wird.
  • Manchmal ist es bequem, die farbbildenden Reagenzien in einem Assay für Glukose, Cholesterin oder ähnliche Analyte zu immobilisieren. In diesem Fall können Ballastgruppen, langkettige Alkylgruppen, zu einem Teil des Farbstoffmoleküls hinzugegeben werden, um es weniger löslich zu machen. Beispiele für Farbstoffmoleküle, die durch die Einlagerung einer Ballastgruppe weniger löslich gemacht werden, sind zu finden in den Principles and Chemistry of Color Photography, Thirtle, J. R. in The Theory of the Photographic Process, 4. Ausgabe, T. H. James, Ed., MacMillian Publishing Co., Inc., New York, 1977, Seite 369–372. Mit Ballast versehene DCHBS-Analoga könnten direkt auf die Strukturen aufgeschichtet werden, wodurch es ermöglicht würde, dass Farbbildung nur in einem begrenzten Bereich der Strukturen vorkommen würde.
  • Die Detektion kann außerdem unter Verwendung von Enzymen vorgenommen werden. Das immobilisierte Reagens bindet spezifisch an den Analyten. Das markierte Reagens umfasst ein Enzym, das mit einem spezifischen Bindeglied des Analyten konjugiert ist. Ein Substrat für das Enzym wird hinzugegeben, wodurch eine enzymatische Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat verursacht wird. Die Menge des detektierten und gemessenen Enzyms kann korreliert werden mit der Menge von Analyt, die in der Probe vorhanden ist. Zum Beispiel wird alkalische Phosphatase für gewöhnlich als ein enzymatisches Detektionsreagens in Diagnoseassays verwendet, besonders in spezifischen Bindungsassayformaten. Alternativ kann das markierte Reagens ein Enzym und ein spezifisches Bindeglied umfassen, das spezifisch an das immobilisierte Reagens bindet. Ein Substrat für das Enzym wird hinzugegeben, wodurch eine enzymatische Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat verursacht wird. Die Menge des detektierten und gemessenen Enzyms kann korreliert werden mit der Menge von Analyt, die in der Testprobe vorhanden ist.
  • Die Analyten von Interesse sind breit variiert abhängig von den Zwecken des Assays und der Quelle der Testprobe. Analyte können ein Protein, ein Peptid, eine Aminosäure, ein Kohlenhydrat, ein Hormon, ein Steroid, ein Vitamin, ein Lipid, eine Nukleinsäure, ein Spurenelement, ein Wirkstoff, einschließlich solcher, die für therapeutische Zwecke verabreicht werden, sowie solcher, die illegal genommen werden, ein Bakterium, ein Virus und einen Metaboliten einschließen. Aggregation von Molekülen kann ebenfalls von Interesse sein, besonders natürlich vorkommende Aggregationen wie Viroide, Viren, prokaryotische und eukaryotide Zellen einschließlich einzellige Mikroorganismen, Säugerzellen wie Lymphozyten, Epithelzellen, neoplastische Zellen und dergleichen. Zusätzlich können Analyte jede beliebige Substanz sein, für die es ein natürlich vorkommendes Bindemolekül gibt (z. B. ein Antikörperbinderezeptor) oder für die ein Bindemolekül hergestellt werden kann, und der Analyt kann an ein oder mehrere Bindemoleküle in einem Assay binden. Analyt schließt somit antigene Substanzen, Haptene, Antikörper Kombinationen davon und dergleichen ein.
  • Andere Additive können für spezielle Zwecke eingeschlossen werden. Puffer können wünschenswert sein, um einen bestimmten pH beizubehalten. Enzymhemmer können ebenso eingeschlossen werden. Andere Reagenzien von Interesse sind, sollen aber nicht beschränkt sein auf, Antikörper, Enzyme, Antigene, Peptide, Biotin/Avidin, Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Aktivatoren, Enzymsubstrate und Cofaktoren, Oxidationsmittel, Reduktionsmittel oder dergleichen. Wie zu verstehen sein wird, sollten die Additive oder Reagenzien die Assayleistung nicht beeinträchtigen.
  • Zusätzlich kann ein Kontrollmittel verwendet werden, um ein Assayergebnis zu verifizieren. Ein Kontrollmittel umfasst einen Konfirmationsassay, der im Wesentlichen automatisch und gleichzeitig mit dem Assay für die Detektion von Analyt durchgeführt wird. In einer speziellen Ausführungsform wird die Testprobe, die den Analyten enthält, mit einer vorherbestimmten Menge von markiertem Reagens in Kontakt gebracht, um eine Mischung zu bilden, die einen Analyt/markiertes Reagens-Komplex enthält. Die resultierende Mischung wird durch die Vorrichtung durch Kapillarwirkung transportiert. Auf einem ersten Weg berührt die Mischung eine Einfangstelle, die ein immobilisiertes Anti-Analyt-spezifisches Bindeglied enthält, das den Analyt/ markiertes Reagens-Komplex bindet. Diese Einfangstelle ist die Testprobeneinfangstelle. Auf einem zweiten Weg berührt die Mischung zuerst eine Reagenszone, die ein positives Kontrollreagens enthält. Das positive Kontrollreagens ist ein mobiles spezifisches Bindeglied mit der gleichen Bindungspezifität für das markierte Reagens wie der Testprobenanalyt. Das positive Kontrollreagens kann entweder ein Analyt identisch zu dem der Testprobe oder ein entsprechendes Analyt-Analog sein. Wenn die Mischung die positive Kontrollreagenszone berührt, wird das positive Kontrollreagens wieder aufgelöst und bindet spezifisch mit dem ungebundenen markierten Reagens, um einen positiven Kontrollreagens/markiertes Reagenz-Komplex zu bilden. Dieser Komplex wandert zu der positiven Kontrolleinfangstelle. Die positive Kontrolleinfangstelle enthält das gleich immobilisierte Anti-Analyt-spezifische Bindeglied. wie der erste Weg. Deshalb ist die positive Kontrolleinfangstelle in der Lage, einen detektierbaren immobilisierten Komplex zu bilden. Ein detektierbares Signal an der positiven Kontrolleinfangstelle bestätigt, dass die Assayreagenzien funktionsfähig sind und das Testergebnis gültig ist. Wenn zum Beispiel kein Analyt in einer Testprobe vorhanden ist, wird das negative Ergebnis für die Testprobe bestätigt als ein gültiges Testergebnis, wenn die positive Kontrolleinfangstelle ein detektierbares Signal aufweist und die Testprobenstelle kein detektierbares Signal aufweist. Wenn Analyt in einer Testprobe vorhanden ist, wird das positive Ergebnis für die Patientenprobe bestätigt als ein gültiges Testergebnis, wenn die positive Kontrolleinfangstelle ein detektierbares Signal aufweist und die Testprobeneinfangstelle ein detektierbares Signal aufweist. Kein detektierbares Signal an der positiven Kontrolleinfangstelle selbst zeigt entweder an, dass die Reagenzien des Markierungssystems sich zersetzt haben, oder dass andere Faktoren in der Testprobe die Bindung des markierten Reagens an das positive Kontrollreagens oder die Bindung des markierten positiven Kontrollkomplexes an das immobilisierte spezifische Bindeglied, das sich an der positiven Kontrolleinfangstelle befindet, gestört haben.
  • Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können außerdem zusätzliche Kontrollmechanismen und/oder Bereiche eingliedern, z. B. um das Ende eines Assays anzuzeigen. Diese anderen Kontrollmechanismen sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Die Vorrichtung kann verschiedene Regionen haben, die für Reagenszugabe, Filtration und dergleichen verwendet werden können, sowie getrennte Bereiche, wo Kapillarwirkung und Differenzdruck getrennt den Fluidfluss antreiben.
  • Die Typen von Assays, die die analytischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung nutzen, sind zahlreich. In Sandwich-Assays wird dem markierte Reagens, welches ein spezifisches Bindeglied mit Affinität zu dem Antigen umfasst, erlaubt, den immobilisierten spezifischen Bindeglied/Analyt-Komplex zu binden. Die Signalantwort ist direkt proportional zu der Analytkonzentration.
  • In Kompetitiv-Assays besteht Konkurrenz zwischen den Analyten und dem markierten Reagens. Die Signalantwort ist umgekehrt proportional zu der Analytkonzentration.
  • Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können auch in der Form einer Küvette hergestellt werden. Die Strukturen können innerhalb eines Gehäuses gefertigt werden, welches ein transparentes Fenster besitzt, welches es ermöglicht, dass Messgeräte den Einfang an der Einfangstelle detektieren. Die Küvette kann in ein Spektrophotometer eingesetzt werden und gelesen werden. Zum Beispiel kann eine Küvette konstruiert werden, indem eine Decklage von Pilcher Hamilton-Folie (Pilcher Hamilton Corporation, Greer, S. C., 29651) oben auf die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung aufgebracht wird. Eine Einlassöffnung kann in der Decklage platziert werden oder kann als ein Teil der Vorrichtung bleiben. Ein doppelseitiges Klebeband (3M Corp., St. Paul, MN., 55144) wurde auf die Unterseite der Decklage aufgebracht. Eine Testprobe kann in die Einlassöffnung gebracht werden und Einfang findet an den Einfangstellen statt.
  • Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können außerdem in der Form eines Teststreifens hergestellt werden, worin ein Ende des Teststreifens in Kontakt mit einer flüssigen Testprobe gebracht wird, die einen Analyten enthält. Die Testprobe wird durch die Vorrichtung durch Kapillarwirkung transportiert, wo Einfang von Analyt an den Strukturen vorkommen wird. Solche Vorrichtungen können außerdem in der Form von Tauchstäben gefertigt werden (siehe US-Patent 5.200.317).
  • Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können außerdem mehrere Analyte in einer einzigen analytischen Vorrichtung testen. Unterschiedliche und/oder getrennte Regionen von Strukturen können gestaltet werden, auf die jeweils ein immobilisiertes Reagens, das für einen anderen Analyten spezifisch ist, aufgebracht ist, das den entsprechenden Analyten und/oder das markierte Reagens binden wird. Die getrennten Regionen von Strukturen können in einer Serie angeordnet sein, oder können mit mehreren Wegen angeordnet sein. Instrumentierung kann programmiert werden, die unterschiedlichen Regionen unabhängig zu lesen. Ein solches Beispiel ist ein Drogenmissbrauch-Assay, wobei auf eine Region der Strukturen Anti-Benzoylecognine-Antikörper immobilisiert ist, auf eine andere Region der Strukturen Anti-Cannaboid-Antikörper immobilisiert ist und auf eine weitere Region der Strukturen Anti-Amphetamin-Antikörper immobilisiert ist. Eine Testprobe, die Metabolite und/oder Moleküle von irgendeinem der Wirkstoffe oder von allen drei Wirkstoffen enthält, wird an den entsprechenden Regionen binden. Detektionen von positiven und negativen Proben können visuell und/oder durch Instrumentierung vorgenommen werden. Jede Region der Strukturen, die auf einen anderen Analyten prüft, kann spezifische Reagenzien für diesen Analyten immobilisiert haben.
  • 3. Kanalgestaltung zum Einfang von Gebildeen durch Diffusion
  • Das Folgende ist eine Zusammenfassung von Ausdrücken, die benötigt werden, um den Einfangwirkungsgrad in Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung näherungsweise zu bestimmen. Die Ausdrücke sind verallgemeinert worden zur Anwendung auf eine zufällige Querschnittsgeometrie der Kanäle. Diese Ausdrücke sollten eine breite Palette von möglichen Kanalgestaltungen ansprechen. Da die Ausdrücke für eine allgemeine Gestaltung gelten, liefern sie nicht direkt eine numerische Vorhersage des Einfangwirkungsgrades. Statt dessen muss die Kanalquerschnittsform zuerst definiert werden und die entsprechende Fluidgeschwindigkeit, U(y, z), muss unter Verwendung von Standardverfahren vorausberechnet werden. Dann kann durch Eingliedern dieser beiden Werte in die Ausdrücke eine eindeutige numerische Näherung des Einfangwirkungsgrades abgeleitet werden und gegen solche Parameter wie Kanallänge (L), Gebildedurchmesser (d) und Wandreaktionskoeffizient (k) korreliert werden. Zwei Beispielkanalquerschnitte, für welche ein numerisches Ergebnis ohne weiteres formuliert werden kann, umfassen eine rechteckige und eine kreisförmige Form. Es gibt jedoch keine Beschränkungen bezüglich der Art der Querschnittsform, welche bewertet werden kann.
  • Alle analytischen Annahmen, die durch die Ausdrücke impliziert werden, werden unten beschrieben. Damit wird ein Bereich von Kanalgestaltungen und Fließbedingungen definiert, für welchen die Ausdrücke gültig sind.
  • Wichtigste Annahmen für Berechnungen:
    • 1. Stationäre Fluidbedingungen: Das Fluid (mit Gebilden) füllt die Kanäle vollständig und die Fluidgeschwindigkeit variiert nicht mit der Zeit.
    • 2. Laminare inkompressible Strömung. Diese Annahme ist auf alle besprochenen Flüssigkeitsarten und Strömungsgeschwindigkeiten anwendbar.
    • 3. Gebildekonzentrationspegel verdünnen (weniger als 5 Vol-%). Dadurch wird sichergestellt, dass die Strömungsgeschwindig keitsverteilung unabhängig von der Anwesenheit von Gebilde gelöst werden kann, und dass keine vorhersagbaren Wechselwirkungen zwischen Gebilden während des Fluidtransportes vorkommen.
    • 4. Kanalquerschnittsform und -größe bleiben über die Gesamtlänge des Kanals konstant (konvergierende oder divergierende Fluidpassagen in der Einfangzone werden dadurch ausgeschlossen). Damit wird impliziert, dass alles Fluid ausschließlich in der Richtung des Kanals wandert und es keine Schwankungen der Geschwindigkeit entlang der Länge gibt.
  • Allgemeine Ausdrücke (dreidimensional):
  • Stationärer Transport von suspendierten Gebilden innerhalb des Kanals aufgrund von Fluidkonvektions- und -diffusionseffekten, wobei C = C(x, y, z) = lokaler Gebildekonzentrationspegel:
    Figure 00300001
    Normalisierte Raumkoordinaten und normalisierte Fluidgeschwindigkeit innerhalb des Kanals: x* = x/L U*x = Ux/U y* = y/W z* = z/W
  • Bindungsgeschwindigkeitgleichung von Gebildeen, die die Kanalwände berühren:
  • Figure 00300002
  • Strömungsgeschwindigkeit von Gebildeen, die in den Kanal gelangen und den Kanal verlassen:
  • Figure 00300003
  • Wert des Gebildeen-Einfangwirkungsgrads:
  • Figure 00310001
  • Lokale Dichte von eingefangenen Gebildeen entlang der Kanallänge:
  • Figure 00310002
  • Definitionen der Symbole:
    • C
    Lokaler Konzentrationspegel von suspendierten Gebilden innerhalb des Kanals = f(x, y, z).
    x
    Raumkoordinate in der Kanalfließrichtung (parallel zu Kanalwänden)
    y, z
    Raumkoordinaten senkrecht zu der Kanalfließrichtung
    W
    Charakteristischer Kanalbreitenwert
    L
    Kanallänge
    d
    Gebildedurchmesser
    D
    Gebildediffusionskoeffizient innerhalb des Fluids
    k
    Gebildebindungsreaktionskoeffizient an den Kanalwänden
    ϕ
    Kanaldispersionsparameter
    U
    mittlere Kanalströmungsgeschwindigkeit
    Ux
    Kanalfluidgeschwindigkeitsprofil = f(y, z)
    ny
    Gebildesnormalenvektor auf der Kanalwand, der in das Fluid gerichtet ist (y-Komponente des Vektors)
    nz
    Gebildesnormalenvektor auf der Kanalwand, der in das Fluid gerichtet ist (z-Komponente des Vektors)
    ε
    Gebildeeinfangwirkungsgradwert des Kanals
    ρ
    (x) Lokale Dichte von eingefangenen Gebilden entlang der Kanallänge (Gebilde/Gebildeslänge)
    Nin
    Gesamtmenge von Gebilden, die in den Kanal gelangen.
  • Die Vorrichtungsgestaltungsrichtlinien zum Maximieren des Gebildeeinfangs durch Diffusion sind: Minimieren der Kanalbreite und Strömungsgeschwindigkeiten bei Maximieren der Einfangoberfläche von den Strukturen. Die Verwendung von besonderen Struk turformen kann die Fluidtotzonen minimieren. Das ermöglicht, dass alles immobilisierte Reagens auf der Oberfläche der Strukturen dem Fluidfluss ausgesetzt wird.
  • Zusätzlich können die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung einen volumetrischen Fluidströmungsgeschwindigkeitskontrollaspekt haben. In anderen Kapillar-getriebenen Vorrichtungen zeigen Strömungsgeschwindigkeiten eine Abnahme über der Zeit, wenn sich Fluid durch die Vorrichtung bewegt, was zu einem sich ändernden Einfangwirkungsgrad über der Zeit führt. Die vorliegende Erfindung kann eine Abnahme der Kapillarabmessungen, eine Änderung der Querschnittsfläche oder eine Änderung der Benetzbarkeit einschließen, um die Gesamtströmungsgeschwindigkeit über der Zeit in der Vorrichtung konstant zu halten. Die volumetrische Strömungsgeschwindigkeitskontrolle in Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung ermöglicht einen kontrollierten Einfangwirkungsgrad.
  • Assays, die die vorliegende Erfindung nutzen, werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Beispiele sind beabsichtigt, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu sein, und es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf die Beispiele beschränkt ist. In den Beispielen sind die Strukturen in Reihen über der Breite der Vorrichtung angeordnet. In Beispiel 2–5 wird ein positives Ergebnis für Analyt in einer Testprobe einen sichtbaren Balken über der Breite der Vorrichtung an der Einfangstelle produzieren.
  • Beispiel 1:
  • Die Strukturen werden mit 0,5 Mikroliter (μl) einer Lösung mit 2 Milligramm pro Milliliter(mg/ml) Anti-Beta-Human-Thyroidstimulierendem Hormon (hTSH) (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, 60064) beschichtet und 90 Minuten lang bei 37°Celsius (C) inkubiert. Die Strukturen werden dann mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) in 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure (MOPS) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 63178)-Puffer, pH von 7,0, überschichtet und mindestens 4 Stunden inkubieren gelassen. Die Strukturen werden dann in Phopsphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, um alles ungebundene Protein zu entfernen.
  • Die Polystyrolstrukturen werden mit einer Vistexbeschichteten Polycarbonatfolienschicht mit Kleberücken deckbeschichtet.
  • Proben von 50 μl hTSH-Kalibratoren werden in eine Einlassöffnung der Vorrichtung eingeführt durch eine 250-μl-Hamilton-Spritze (Hamilton Co., Reno, NV, 89502), angetrieben durch eine Sage Instruments-Spritzenpumpe (Cole-Parmer Instruments, Chicago, IL, 60648), bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,55 μl/Minute. Die Proben werden mit orange-fluoreszierenden Mikropartikeln mit 282 Nanometer (nm) Durchmesser in Lösung (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, 97402) vorgemischt, wobei Anti-Alpha-hTSH (Abbott Laboratories) an die Mikropartikeloberfläche konjugiert ist.
  • Die Mischung enthält 1 Teil einer 0,1%igen Mikropartikellösung, 2 Teile IMx® Verdünnungsmittel (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) und 6 Teile der hTSH-Kalibratoren (50 l = 6 Teile). Der Assay wird ungefähr 5 Minuten lang durchgeführt.
  • Die Vorrichtungen werden analysiert mit einem Reflexionsgrad-Messgerät unter Verwendung eines 2-Millimeter(mm)-Spaltstrahls, abgebildet durch ein 485-nm-Extinktionsfilter, ein dichroitisches 505-nm-Filter und ein 560-nm-Emissionsfilter. Die Mikropartikel haben eine maximale Anregungswellenlänge von 505 nm und eine maximale Fluoreszenz bei 560 nm. Die Teile werden über ihre gesamte Länge von 15 mm mit einer Abtastfrequenz von 100 Punkten pro Millimeter gescannt. Mikropartikeleinfang durch strukturgebundenen Anti-Beta-hTSH-Antikörper ist direkt proportional zu der hTSH-Konzentration in der Probe.
  • Beispiel 2
  • Schwarze Polypyrrolpartikel werden mit polyklonalem Ziegenantikörper zu Hepatitis-B-Oberflächenantigen (Anti-HBsAg) beschichtet. Die beschichteten Polypyrrolpartikel werden auf die Oberfläche einer Kammer vor den Strukturen der Vorrichtung aufgebracht. Die Strukturen haben monoklonalen Maus-Anti-HBsAg- Antikörper auf ihren Oberflächen immobilisiert. Der monoklonale Mausantikörper ist reaktionsfähig gegenüber einem anderen Oberflächenantigenepitop als der polyklonale Ziegenantikörper.
  • Eine Testprobe, die HBsAg enthält, wird zu der Einlassöffnung der Vorrichtung hinzugegeben, wo sie in die Kammer transportiert wird. Die Testprobe wird mit den beschichteten Polypyrrolpartikeln gemischt, wodurch Testproben-HBsAg spezifisch an die Anti-HBsAg-beschichteten Partikel gebunden wird. Kapillarwirkung transportiert den Antigen-Antikörper-Partikel-Komplex aus der Kammer heraus und in die Matrix von Strukturen hinein. Der Antigen-Antikörper-Partikel-Komplex wird an der Einfangstelle im Verhältnis zu der Menge von Testproben-HBsAg akkumulieren. Eine visuelle Inspektion der Bildung eines schwarzen Balkens zeigt die Anwesenheit von HBsAg in der Testprobe an.
  • Beispiel 3
  • Schwarze Polypyrrolpartikel werden mit einem rekombinanten HBsAg-Astigen beschichtet. Die beschichteten Polypyrrolpartikel werden auf die Oberfläche einer Kammer vor den Strukturen der Vorrichtung aufgebracht. Die Strukturen werden mit einem anderen rekombinanten HBsAg-Antigen beschichtet. Eine Testprobe, die Anti-HBsAg-Antikörper enthält, wird zu der Einlassöffnung des Vorrichtung hinzugegeben, wo sie in die Kammer transportiert wird. Die Testprobe wird mit den beschichteten Polypyrrolpartikeln gemischt, wodurch Testproben-Anti-HBsAg-Antikörper spezifisch an die rekombinanten Anti-HBsAg-beschichteten Partikel gebunden wird. Kapillarwirkung transportiert den Antikörper-Antigen-Partikel-Komplex aus der Kammer heraus und in die Matrix von Strukturen hinein. Die Polypyrrolpartikel werden an der Einfangstelle im Verhältnis zu der Menge von Testproben-Anti-HBsAg-Antikörper akkumulieren. Die Anwesenheit des Anti-HBsAg-Antikörpers in der Testprobe wird durch die Bildung eines schwarzen Balkens bestimmt.
  • Beispiel 4
  • Schwarze Polypyrrolpartikel werden mit rekombinanten HIV-Antigen p41 beschichtet, welches sowohl für HIV-1 als auch HIV-2 gemeinsam ist. Die beschichteten Polypyrrolpartikel werden auf die Oberfläche einer Kammer vor den Strukturen der Vorrichtung aufgebracht. Die Strukturen werden mit rekombinantem p41-Antigen sowie mit p24-Antigen sowohl von HIV-1- als auch HIV-2-Virus beschichtet.
  • Eine Testprobe, die Anti-HIV-Antikörper enthält, wird zu der Einlassöffnung der Vorrichtung hinzugegeben, wo sie in die Kammer transportiert wird. Die Testprobe wird mit den beschichteten Polypyrrolpartikeln gemischt, wodurch Testproben-Anti-HIV-Antikörper, der spezifisch ist für das rekombinante HIV-Antigen, das auf die Partikel beschichtet ist, bindet. Kapillarwirkung transportiert den Antikörper-Antigen-Partikel-Komplex aus der Kammer heraus und in die Matrix von Strukturen hinein.
  • Die Polypyrrolpartikel werden an der Einfangstelle im Verhältnis zu der Menge von Testproben-Rnti-HIV-Antikörper akkumulieren.
  • Eine visuelle Inspektion der Bildung eines schwarzen Balkens zeigt die Anwesenheit von Anti-HIV-Antikörper in der Testprobe an.
  • Beispiel 5
  • Schwarze Polypyrrolpartikel werden mit einer Mischung von monoklonalen Antikörpern beschichtet, die spezifisch zu HIV-Antigen sind, das sowohl für HIV-1 als auch HIV-2 gemeinsam ist. Die Strukturen werden mit einer Mischung von monoklonalen Antikörpern beschichtet, die spezifisch zu HIV-Antigen sind, das sowohl für HIV-1 als auch HIV-2 gemeinsam ist.
  • Eine Testprobe, die HIV-Antigen enthält, das sowohl für HIV-1- als auch HIV-2-Virus gemeinsam ist, wird zu der Einlassöffnung der Vorrichtung hinzugegeben, wo sie durch Kapillarwirkung zu der Matrix von Strukturen transportiert wird. Das HIV-Antigen, das sowohl für HIV-1- als auch HIV-2-Virus gemeinsam ist, in der Testprobe wird spezifisch an die monoklonalen Antikörper gebunden, die auf die Oberfläche der Strukturen aufgeschichtet sind. Eine Lösung von beschichteten Polypyrrolpartikeln in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) wird zu der Einlassöffnung hinzugegeben und durch Kapillarkräfte zu den Strukturen transportiert, wo die Polystyrrolpartikel spezifisch an das HIV-Antigen binden, das an der Einfangstelle gefangen ist.
  • Die Polypyrrolpartikel werden an der Einfangstelle im Verhältnis zu der Menge von Testproben-HIV-Antigen akkumulieren. Eine visuelle Inspektion der Bildung eines schwarzen Balkens zeigt die Anwesenheit von HIV-Antigen in der Testprobe an.
  • Beispiel 6
  • Ein Polynucleotid wird an ein fluoreszent (Fluorescein) markiertes Partikel angelagert. Die beschichteten fluoreszenten Partikel werden auf die Oberfläche einer Kammer vor den Strukturen der Vorrichtung aufgebracht. Die Strukturen werden ebenfalls. mit einem Polynucleotid beschichtet, welches komplementär zu dem interessierenden Nucleotid ist.
  • Eine Testprobe, die eine interessierende Nucleotidsequenz enthält, die in einer Testprobe vorhanden ist oder durch Polymerasekettenreaktion (PCR) oder Ligasekettenreaktion (LCR) amplifiziert worden ist, wird zu der Einlassöffnung der Vorrichtung hinzugegeben, wo sie zu der Kammer transportiert wird. Die Testprobe wird mit den Polynucelotid-beschichteten fluoreszenten Partikeln gemischt, wodurch interessierendes Testprobennucleotid an die komplementären Polynucleotid-fluoreszent markierten Partikel bindet. Kapillarwirkung transportiert den Nucleotid-komplementäres Polynucleotid-fluoreszentes Partikel-Komplex aus der Kammer heraus und in die Matrix von Strukturen hinein.
  • Der Komplex wird an dem komplementären Polynucleotid an der Einfangstelle im Verhältnis zu der Menge von interessierendem Testprobennucleotid binden.
  • Beispiel 7
  • Ein polyanionisches Material wird an eine Mischung von monoklonalen Anti-HIV-Antikörpern gekoppelt, welche für HIV-Antigen spezifisch ist, das sowohl für HIV-1 als auch HIV-2 gemeinsam ist. Das polyanionische Material wird auf der Oberfläche einer Kammer vor den Strukturen der Vorrichtung platziert. Die Strukturen werden mit einer kationischen Lösung wie Polyglutaminsäure behandelt.
  • Eine Testprobe, die HIV-Antigen enthält, das sowohl für HIV-1 als auch HIV-2 gemeinsam ist, wird zu der Einlassöffnung der Vorrichtung hinzugegeben, wo sie durch Kapillarwirkung zu der Kammer transportiert wird. Die Testprobe wird mit den Antikörpern gemischt, die an das polyanionische Material gekoppelt sind, wodurch Testproben-HIV-Antigen, das sowohl für HIV-1 als auch HIV-2 gemeinsam ist, spezifisch an die Antikörper binden wird. Kapillarwirkung transportiert den HIV-Antigen-Anti-HIV-Antikörper-Polyanion-Komplex aus der Kammer heraus und in die Matrix von Strukturen hinein.
  • Das polyanionische Material wird durch das kationische Material auf den Oberflächen der Strukturen eingefangen werden. Fluoreszent (Fluorescein) markierte Partikel, die an Anti-HIV-Antikörper gekoppelt sind, welche zu HIV-Antigen spezifisch sind, das sowohl für HIV-1 als auch für HIV-2- gemeinsam ist werden zu der Einlassöffnung der Vorrichtung hinzugegeben. Kapillarwirkung transportiert die markierten Partikel, die an Anti-HIV-Antikörper gekoppelt sind, zu den Strukturen der Vorrichtung, wo sie an HIV-Antigen binden werden, das sowohl für HIV-1 als auch für HIV-2 gemeinsam ist, welches an der Einfangstelle eingefangen ist.
  • Die fluoreszent markierten Partikel, die an Anti-HIV-Antikörper gekoppelt sind, werden an der Einfangstelle im Verhältnis zu der Menge von Testproben-HIV-Antigen akkumulieren, das sowohl für HIV-1 als auch für HIV-2 gemeinsam ist.

Claims (12)

  1. Eine analytische Vorrichtung, zur Bestimmung der Anwesenheit oder einer Menge eines Analyten in einer Testprobe, die in Kombination folgendes umfasst: eine Basisschicht; eine Matrix von Strukturen, die eine mittlere Breite im Bereich von 1 μm bis 1 mm und eine Höhe im Bereich von 1 μm bis 1 mm haben, die sich von der Basisschicht erheben, wobei jede der Strukturen eine Oberfläche hat, die ein immobilisiertes Reagens bereitstellt, wobei das immobilisierte Reagens kovalent oder nicht kovalent an die Oberfläche der Struktur angeheftet ist, wobei das immobilisierte Reagens in der Lage ist, ein Glied zu binden, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Analyt, Analyt-Analog, Hilfsbindeglied und markiertes Reagens; und eine Vielzahl von Kanälen, die eine mittlere Breite im Bereich von 0,02 μm bis 20 μm und eine Tiefe im Bereich von 1 μm bis 1 mm haben, die angrenzend an die Strukturen sind, worin die Testprobe, die den Analyten, das Analyt-Analog, das Hilfsbindeglied oder das markierte Reagens enthält, durch die Kanäle fließt, wobei der Analyt, das Analyt-Analog, das Hilfsbindeglied oder das markierte Reagens durch die Bereite der Kanäle hindurch diffundiert, wobei er bzw. es an das immobilisierte Reagens bindet, dadurch gekennzeichnet, dass die Strukturen in Zeilen durch die Breite der Vorrichtung hindurch angebracht sind und eine ähnliche Form haben, wobei die Formen gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Diamanten, Hexagonen, Octagonen, Rechtecken, Quadraten, Kreisen, Halbkreisen, Dreiecken und Ellipsen.
  2. Die analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, worin der Analyt gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigen, Nukleotid-Sequenz, Lectin oder Avidin und worin das immobilisierte Reagens gewählt ist aus der Grupe bestehend aus Antikörper, komplementäre Nukleotid-Sequenz, Kohlenhydrat oder Biotin.
  3. Die analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Strukturen aus Copolymeren, Mischungen, Laminaten, metallisierten Folien, metallisierten Filmen oder Metallen, hergestellt sind, die auf einem Material abgelagert sind, gewählt aus der Gruppe bestehend aus: Polyolefinen, Polyestern, Styren-enthaltenden Polymeren, Polycarbonaten; Acrylsäure-Polymeren, Chlor-enthaltenden Polymeren, Acetal-Homopolymeren und -Copolymeren, Zellulosen und ihre Estern, Zellulosenitrat, Fluor-enthaltenden Polymeren, Polyamiden, Polyimiden, Polyetheretherketonen, Schwefel-enthaltenden Polymeren, Poylurethanen, Silizium-enthaltenden Polymeren, Glas und keramischen Materialien.
  4. Die analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Matrix von Strukturen relativ zur Flussrichtung der Testprobe versetzt sind.
  5. Die analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin einen Separator umfasst, der mit einem Agglutinationsmittel für rote Blutzellen behandelt ist.
  6. Die analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Matrix von Strukturen mehrere immobilisierte Reagenzien hat, um auf mehrere Analyten in der Testprobe hin zu testen.
  7. Die analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin eine Kammer für die Zugabe von Probe umfasst, wobei die Kammer eine Vielzahl von Durchgängen zum Transport der Testprobe von der Kammer hat, wobei jeder der Durchgänge zu einer Matrix der Strukturen führt.
  8. Die analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, worin das immobilisierte Reagens in der Lage ist, ein Glied in der Testprobe zu binden, das ausgewählt wird aus einer Gruppe bestehend aus Analyt, Analyt-Analog und einem Hilfsbindeglied, wobei die Vorrichtung weiterhin ein markiertes Reagens umfasst, das ein spezifisches Bindeglied umfasst, das mit einer detektierbaren Markierung konjugiert ist, wobei die detektierbare Markierung in der Lage ist, ein Signal am immobilisierten Reagens zu erzeugen, wobei das Signal die Anwesenheit oder die Menge des Analyten in der Testrobe anzeigt.
  9. Die analytische Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin eine Einlassöffnung und eine Lüftung umfasst.
  10. Ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder einer Menge eines Analyten in einer Testrobe, das eine analytische Vorrichtung verwendet, die in Kombination folgendes umfasst: eine Basisschicht; eine Einlassöffnung und eine Lüftung; eine Matrix von Strukturen, die eine mittlere Breite im Bereich von 1 μm bis 1 mm und eine Höhe im Bereich von 1 μm bis 1 mm haben, die sich von der Basisschicht erheben, wobei jede der Strukturen eine Oberfläche hat, die ein immobilisiertes Reagens bereitstellt, wobei das immobilisierte Reagens kovalent oder nicht kovalent an die Oberfläche der Struktur angeheftet ist, wobei das immobilisierte Reagens in der Lage ist, ein Glied zu binden, das gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Analyt, Analyt-Analog, Hilfsbindeglied und markiertem Reagens; und eine Vielzahl von Kanälen, die eine mittlere Breite im Bereich von 0,02 μm bis 20 μm und eine Tiefe im Bereich von 1 μm bis 1 mm haben, die angrenzend an die Strukturen sind, wobei das Verfahren die Zugabe der Testrobe an die Einlassöffnung umfasst, wobei die Vielzahl von Kanälen die Testprobe von der Einlassöffnung zur Matrix von Strukturen befördert; wobei die Testrobe in die Kanäle eintritt, der Analyt durch die Breite der Kanäle diffundiert, worin der Analyt an das immobilisierte Reagens gebunden wird; und die Detektierung des Analyten durch ein Analyt-Detektions-System, das ein spezifisches Bindeglied umfasst, das mit einer detektierbaren Markierung konjugiert ist, wobei die detektierbare Markierung in der Lage ist, ein Signal beim immobilisierten Reagens zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, dass die Strukturen in Zeilen durch die Breite der Vorrichtung hindurch angebracht sind und eine ähnliche Form haben, wobei die Formen gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Diamanten, Hexagonen, Octagonen, Rechtecken, Quadraten, Kreisen, Halbkreisen, Dreiecken und Ellipsen.
  11. Das Verfahren nach Anspruch 10, worin das immobilisierte Reagens ein polykationisches Material ist, das in der Lage ist, an ein Hilfsbindeglied zu binden, das ein polyanionisches Material ist, das an das Analyt-spezifische Bindeglied gekoppelt ist, wobei das Verfahren weiterhin den Schritt umfasst der Kombinierung des Hilfsbindeglieds mit der Testprobe, worin das Analyt-spezifische Bindeglied den Analyten vor der Zugabe der Testprobe an die Einlassöffnung bindet.
  12. Ein Verfahren zur Herstellung einer analytischen Vorrichtung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 von einem Master, wobei das Verfahren gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lasern, LIGA, Mikroverarbeitung, Photolithographie, Ätzen mit reaktiven Ionen, Ionen-Strahl-Malen, Prägen, Elektroformen, Elektrobeschichtung, Spitzgießen, Formpressen, Gießen oder Reaktions-Spritzgießen.
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