DE69531345T2

DE69531345T2 - Rekombinant pgp3, verfahren zu dessen herstellung, und dessen verwendung in der diagnose und therapie

Info

Publication number: DE69531345T2
Application number: DE69531345T
Authority: DE
Inventors: Giulio Ratti
Original assignee: CHIRON SpA SIENA; Chiron SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1994-04-19
Filing date: 1995-04-18
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2015-04-19
Also published as: JPH10503922A; DE69531345D1; AU2222795A; US6210968B1; EP0756630A1; EP0756630B1; US20060147474A1; WO1995028487A3; WO1995028487A2; US6649374B1; ATE245699T1; US5629167A; US7070791B2; CA2188316A1; US7485313B2; US20040053393A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine rekombinante Form von Plasmid-codiertem pgp3 von Chlamydia trachomatis, Serotyp D, und dessen Verwendung in einem Immuntest, insbesondere einem quantitativen Immuntest, wie ein Enzym-verknüpfter Immuntest (ELISA). Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Produktion von pgp3.
Hintergrund der Erfindung
Chlamydien sind Gram-negative Bakterien, die obligate interzelluläre Parasiten von eukaryontischen Zellen sind. Sie zeigen eine Form, die extrazellulär, infektiös und metabolisch praktisch inert ist, bekannt als elementarer Körper (EB) und eine interzelluläre replikative Form, die retikulärer Körper (RB) genannt wird.
Die retikulären Körper, nach der Vermehrung mittels binärer Teilung, werden in elementare Körper transformiert, die von der Wirtszelle freigesetzt werden und neue Zellen infizieren. Die Massen der retikulären und elementaren Körper innerhalb einer infizierten Zelle bilden charakteristische "Einschlüsse", die mit einem optischen Mikroskop sichtbar sind.
Chlamydia trachomatis (C. trachomatis oder CT) ist eine Bakterienart, die für den Menschen pathogen ist und ist das ätiologische Mittel des venerischen Lymphogranuloms (VLG), das verschiedene entzündliche Krankheitszustände des menschlichen Genitaltrakts und Trachom verursacht, einer chronischen Erkrankung, die 500 Millionen Menschen betrifft und Erblindung verursachen kann. Urethretis und Cervicitis, die von C. trachomatis induziert sind, können, wenn sie nicht frühzeitig behandelt werden, zu chronischen Entzündungen wie Vaginitis, Salpingitis und Beckenentzündung führen, was in Sterilität und Bauchhöhlenschwangerschaft resultieren kann. Darüber hinaus können die Neugeborenen von infizierten Müttern während der Geburt sich Infektionen der Lunge und/oder der Augen zuziehen.
Es besteht daher ein offensichtlicher und unerfüllter Bedarf an einer genauen diagnostischen Testtechnik zum Nachweis von C. trachomatis-Infektionen ebenso wie an immunologischen Zubereitungen zur Verwendung bei der Verhinderung einer Infektion und bei der Behandlung einer bereits existierenden Infektion.
C. trachomatis (15, 16) beinhaltet ein konserviertes Plasmid von 7,5 kb (pCT)(3; vgl. auch EP-A-0499681), das während natürlicher Infektionen unter positivem selektivem Druck zu sein scheint, da es praktisch in allen Stämmen und Isolaten gefunden wird. Die Rolle, die dieses genetische Element bei der Physiologie von C. trachomatis haben könnte, war das Ziel von Spekulationen; die Suche nach pCT-assoziierten Phänotypen wurde jedoch durch die Tatsache behindert, dass bisher kein Verfahren der genetischen Transformation für Chlamydien zur Verfügung stand.
Die Identifizierung und Charakterisierung von Plasmid-codierten Produkten ist von besonderem Interesse, weil pCT pathogene Faktoren der Chlamydien codieren könnten, wie es bei Plasmiden mehrere anderer pathogene Bakterein der Fall ist. Obwohl der Replikationsursprung identifizier wurde (28) und mehrere Eigenschaften der transkriptionellen Regulation von pCT bekannt sind, (20, 21, 5) sind die Mehrzahl der anderen Eigenschaften von pCT nur Hypothesen, die von den Daten der DNA-Sequenzierung abgeleitet sind (2, 3, 8, 27). Kürzlich wurde jedoch berichtet, dass ein Elektrophorese-Bande von 28 kDa in einem Western Blot von Extrakten von Chlamydien-Proteinen mit Antikörpern kreuzreagiert, die gegen ein chimäres Protein von 39 kDa erzeugt wurden, das durch Genfusion mit dem offenen Leserahmen 3 von pCT (ORF3) (4) erhalten worden war. Wir haben schlüssig eine Komponente von 28 kDa von elementaren Körpern (EBs) con C. trachomatis als das Plasmid-codierte Polypeptid pgp3 identifiziert. Auch unter Verwendung eines Immuntests mit einer gereinigten, rekombinanten Form dieses Proteins haben wir gezeigt, dass sie ein neues und möglicherweise wichtiges Immunogen bei der Chlamydien-Infektion des Menschen darstellt. Ursprüngliche Versuche der Entwicklung eines ELISA- Tests für menschliche Seren unter Verwendung des vorstehend beschriebenen (4) pgp3-Fusionsproteins von 39 kDa, das durch Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgelen gereinigt war, ergaben inkonsistente und nicht zufriedenstellende Resultate. Eines der Probleme war die Beobachtung, dass bei einigen Patientenseren die Antikörperreaktion mit geringen Verunreinigungen von E. coli stärker war als die Reaktion mit dem denaturierten Fusionsprotein.
Situationen wie diese können unter Verwendung der Technik des Western Blot in angemessener Weise gelöst werden, bei der die Signale von verschiedenen Antigenen getrennt gemessen werden können, die beim ELISA aber ein ernstes Problem werden. Zum Beispiel wurde das resultierende Produkt von 39 kDa verwendet, um zu zeigen, dass die pgp3-Epitope in Western Blots durch Antikörper erkannt werden können, die in Seren von Patienten mit Chlamydien-Infektionen vorhanden sind, nicht aber in Kontrollseren von gesunden Spendern.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines serologischen Testsystems, das besser als die Immunblottechnik zur Gewinnung von reproduzierbaren und quantitativen Daten von einer großen Zahl von klinischen Proben geeignet ist.
Wir versuchten, sowohl die Qualität des rekombinanten Antigens als auch die Reinigungsverfahren zu verbessern, um eine Reagens zu produzieren, das zur Verwendung bei einem ELISA geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher einen Enzym-verknüpften Immuntest, der auf einer neuen rekombinanten Form des pgp3-Proteins basiert, die für den Nachweis des Vorkommens von pgp3-Antikörpern in Personen mit C. trachomatis-Infektionen verwendet werden kann.
r-pgp3 wurde als stabiles Protein von 28 kDa erhalten, das in der Bakterienzelle wasserlöslich blieb, selbst wenn es durch das pT7-7-System überexprimiert wurde, und auch während des ganzen Reinigungsverfahrens. Da falsch gefaltete rekombinante Proteine üblicherweise einen proteolytischen Abbau erfahren oder zur Aggregation und Ausfällung neigen (34), legen die vorstehenden Eigenschaften nahe, dass r-pgp3 (das vier Cysteinreste enthält) korrekt in einer Struktur gefaltet ist, die seiner nativen Form nahe ist. Wir glauben, dass r-pgp3 auch seine antigene Struktur beibehalten kann, die in der Lage ist, Antikörper nachzuweisen, die gegen Konformationsepitope gerichtet sind, die bei der Immunblot-Analyse entgehen könnten.
Überraschenderweise wurde ein hoher Anteil an r-pgp3 im Periplasma von transformierten E. coli BL21-Zellen gefunden, und die Möglichkeit der Verwendung von Periplasma-Extrakten erleichtert die Reinigung.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde festgestellt, dass die Konformation von pgp3 für die Beibehaltung von essentiellen immunologischen Eigenschaften wichtig ist. Gemäß einem ersten Aspekt der Endung wird ein pgp3-Protein bereitgestellt, wie es in den Ansprüchen 1 bis 3 definiert ist.
Das rekombinante pgp3-Protein kann eine rekombinante Form von jeder der allelischen Varianten des pgp3-Proteins sein, die ein Molekulargewicht von etwa 28 kd hat, einschließlich zum Beispiel pgp3-D (das Allel vom C. trachomatis-Serotyp D) oder pgp3-L2 (das Allel vom C. trachomatis L2). pgp3-D ist ein Prototyp der Trachoma-Varianten von C. trachomatis und pgp3-L2 ist ein Prototyp der Lymphogranulom-Varianten von C. trachomatis.
Vorzugsweise ist das rekombinante Protein des ersten Aspekts der Erfindung im Wesentlichen in einer Konformation, die in der Lage ist, durch Antikörper in menschlichem Serum erkannt zu werden. Dieses Protein ist eine neue rekombinante Form von pgp3, die vorher nicht in der Literatur beschrieben wurde und die vorteilhafte Eigenschaften hat, wenn sie in einem Immuntest verwendet wird, insbesondere Enzym-verknüpften Immuntests.
Das Protein kann ein Derivat von pgp3, mit der Maßgabe, dass es die Konformation von nativem pgp3 annimmt. Es kann daher ein Fragment des vollständigen pgp3 oder ein Derivat davon sein, das auf eine Weise modifiziert wurde, die seine funktionellen Eigenschaften, insbesondere seine immunologischen Eigenschaften als ein Antigen, nicht wesentlich beeinträchtigt.
Vorzugsweise hat das rekombinante Protein seine native Aminosequenz und im Wesentlichen eine native Konformation.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein immundiagnostischer Test bereitgestellt, der mindestens einen Schritt umfaßt, der mindestens einen Bindungspartner umfaßt, ein rekombinantes Protein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, gegebenenfalls markiert oder an einen festen Träger gekoppelt.
Der immundiagnostischer Test kann jede Form eines Immuntests sein, der als essentielle Komponente ein diagnostisches Antigen verwendet.
Vorzugsweise ist der immundiagnostische Test jedoch ein enzymverknüpfter Festphasen-Immuntest (ELISA).
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein immundiagnostischer Kit zur Durchführung eines Tests gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung bereitgestellt, der mindestens ein rekombinante Protein gemäß dem ersten Aspekts der Erfindung umfaßt.
Gemäß einem vierten Aspekt der Endung wird ein Verfahren für die Produktion eines rekombinanten Proteins gemäß dem ersten Aspekts der Erfindung bereitgestellt, welches die Züchtung einer Wirtszelle umfaßt, die mit einem Vektor transformiert wurde, der ein rekombinantes Polynucleotid umfaßt, das das rekombinante Protein gemäß dem ersten Aspekts der Erfindung codiert und die Isolierung des rekombinanten Proteins.
Die Wirtszelle kann jeder geeignete Wirt sein, die in der Lage ist, das rekombinante Protein zu produzieren. Vorzugsweise ist die Wirtszelle jedoch ein Bakterium, passenderweise E. coli.
Am meisten bevorzugt wird das Protein durch Überexpression in einem E. coli-Expressionssystem produziert. Es wird oft gefunden, dass die Expression in E. coli eine unnatürliche Faltung ergibt und hier einer nicht nativen Konformation. Eine solche Expression erfordert eine sorgfältig kontrollierte Reinigungstechnik, die oft Denaturierung und Renaturierung erfordert, um das native Protein zu erhalten.
Wir haben überraschenderweise gefunden, dass im Falle von pgp3 das Protein durch E. coli in seiner nativen Form produziert wird, was den Bedarf an solchen Verfahren überflüssig macht, die nicht nur die Produktionskosten erhöhen, sondern auch Probleme bei der Qualitätskontrolle einführen, die mit der Möglichkeit der nicht ausreichenden Entfernung von Reagentien einhergehen, die bei der Reinigung verwendet wurden, wie starke Denaturierungsmittel.
Ein besonders geeignetes Expressionssystem ist der Plasmid-Expressionsvektor pT77, gegebenenfalls in dem E. coli-Stamm BL21. In diesem System ist die Expression von ORF3 unter der Kontrolle eines durch IPTG induzierbaren Promotors und ergibt die nicht modifizierte pgp3-Aminosäuresequenz.
Vorzugsweise wird das Protein unter nicht denaturierenden Bedingungen aus Extrakten von Wirtszellen gereinigt.
Vorzugsweise umfaßt die Reinigung einen Schritt der Ionenaustauscher-Säulenchromatographie auf zum Beispiel mit mono-Q vorgepackten Säule (Pharmacia) unter Verwendung eines NaCl-Elutionsgradienten in Piperazin-HCl-Puffer.
Die Extraktion aus der Wirtszelle kann jedes bekannte nicht denaturierende Verfahren verwenden, wie die Zelllyse, verwendet aber vorzugsweise einen Periplasma-Extrakt, der zum Beispiel unter Verwendung von Polymixin B erhalten wurde.
Wir haben überraschenderweise entdeckt, dass das pgp3-Protein in E. coli im Periplasma produziert wird, was die Reinigung wesentlich vereinfacht.
Wir nehmen aufgrund der experimentellen Daten, die wir jetzt haben, an, dass pgp3 ein Virulenzfaktor bei der Chlamydien-Infektion ist.
Der vierte Aspekt der Erfindung stellt auch das rekombinante pgp3-Protein bereit, das gemäß dem Verfahren der Erfindung produziert wurde, wie breit definiert oder wie spezifisch in der speziellen Beschreibung offenbart.
Gemäß einem fünften Aspekt der Erfindung stellen wir einen Impfstoff oder eine therapeutische Zusammensetzung bereit, die ein rekombinantes Protein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfaßt und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Gemäß einem sechsten Aspekt der Erfindung stellen wir einen Impfstoff oder eine therapeutische Zusammensetzung bereit, die ein rekombinantes Protein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfaßt und einen pharmazeutischen Träger.
Gemäß einem siebten Aspekt der Erfindung stellen wir ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers bereit, welches die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Impfstoffs oder einer therapeutischen Zusammensetzung gemäß dem sechsten Aspekt der Erfindung umfaßt, um eine Infektion mit C. trachomatis zu verhindern oder um eine solche Infektion zu behandeln.
Gemäß einem achten Aspekt der Erfindung stellen wir ein rekombinantes Protein nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Impfung gegen C. trachomatis-Infektion oder zur Behandlung einer solche Infektion bereit.
Definitionen
Die Ausführung der vorliegenden Endung wird, außer anders angezeigt, herkömmliche Verfahren der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie verwenden, die im Stand der Technik sind. Solche Verfahren sind in der Literatur vollständig erklärt. Vgl. z. B. Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989); DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D. N. Glover Hrsg. 1985); OLIGONUCLEOTID SYNTHESIS (M. J. Gait Hrsg. 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney Hrsg. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); die Serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller und M. P. Calos Hrsg. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Bd. 154 und Bd. 155 (Wu und Grossmann, und Wu, Hrsg.) Mayer und Walker, Hrsg. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, zweite Ausgabe (Springer Verlag, N. Y.), und HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, BÄNDE I-IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell Hrsg. 1986).
In dieser Beschreibung werden Standardabkürzungen für Nucleotide und Aminosäuren verwendet. Alle hier zitierten Publikationen, Patente und Patentanmeldungen sind durch Bezugnahme eingeschlossen.
Beispiele des Proteins, das in der vorliegenden Endung verwendet werden kann, umfassen Polypeptide mit kleinen Aminosäurevariationen gegenüber der natürlichen Aminosäuresequenz des Proteins; insbesondere kommen konservative Aminosäureersetzungen in Betracht. Konservative Ersetzungen sind diejenigen, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren vorkommen, die in ihrer Seitenkette verwandt sind. Genetisch codierte Aminosäuren werden im allgemeinen in vier Familien eingeteilt: (1) sauer = Asparaginsäure, Glutaminsäure; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystin, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal zusammen als aromatisch Aminosäuren bezeichnet. Man kann zum Beispiel sinnvoll voraussagen, dass ein isolierter Ersatz eines Leucin durch ein Isoleucin oder ein Valin, einer Asparaginsäure durch eine Glutaminsäure, eines Threonin durch ein Serin oder ein ähnlicher konservativer Ersatz einer Aminosäure durch eine strukturell verwandte Aminosäure keine größere Wirkung auf die biologische Aktivität haben wird. Polypeptidmoleküle, die im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie das Protein haben, die aber kleinere Aminosäuresubstitutionen haben, die die funktionellen Aspekte nicht wesentlich beeinflussen, fallen unter die Definition des Proteins.
Ein wesentlicher Vorteil der Produktion des Proteins durch Verfahren der rekombinanten DNA-Technik statt der Isolierung und Reinigung eines Proteins aus natürlichen Quelle ist, dass äquivalente Mengen des Proteins unter Verwendung von weniger Ausgangsmaterial produziert werden können, als für die Isolierung des Proteins aus einer natürlichen Quelle erforderlich wäre. Die Produktion des Proteins mittels rekombinanter Techniken erlaubt auch, dass das Protein in der Abwesenheit von einigen Molekülen isoliert wird, die normalerweise in Zellen anwesend sind. In der Tat können leicht Proteinzusammensetzungen isoliert werden, die vollkommen frei sind von jeder Spur an menschlicher Proteinverunreinigung, weil das einzige menschliche Protein, das von dem rekombinanten nicht-menschlichen Wirt produziert wird, das fragliche rekombinante Protein ist. Potentielle virale Mittel aus natürlichen Quellen und virale Komponenten, die für Menschen pathogen sind, werden auch vermieden.
Der Ausdruck "rekombinante Polynucleotide", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Polynucleotid von genomischem, cDNA-, semisynthetischem oder synthetischem Ursprung, das wegen seines Ursprung oder Manipulation: (1) nicht assoziiert ist mit einem oder dem Teil eines Polynucleotids, mit dem es in der Natur assoziiert ist, (2) mit einem anderen Polynucleotid verknüpft ist als demjenigen, mit dem es in der Natur verknüpft ist, oder (3) nicht in der Natur vorkommt.
Der Ausdruck "Polynucleotid", wie er hier verwendet wird, betrifft eine polymere Form von Nucleotiden jeder Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Dieser Ausdruck betrifft nur die Primärstruktur des Moleküls. Somit umfaßt dieser Ausdruck doppel- und einzelsträngige DNA und RNA. Er umfaßt auch bekannte Arten an Modifikationen, zum Beispiel im Stand der Technik bekannte Markierungen, Methylierung, "caps", Substitution von einem oder mehreren der natürlicherweise vorkommenden Nucleotide mit einem Analogon, Internucleotid-Modifikationen wie zum Beispiel solche mit ungeladenen Verknüpfungen (d. h. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate usw.) und mit geladenen Verknüpfungen (d. h. Phosphorothioate, Phosphorodithioate usw.), solche, die anhängende Gruppen enthalten, wie zum Beispiel Proteine (einschließlich z. B. Nucleasen, Toxinen, Antikörpern, Signalpeptiden, Poly-L-Lysin usw.), solche mit Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen usw.), solche, die Chelatoren enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidierende Metalle usw.), solche, die alkylierende Mittel enthalten, solche mit modifizierten Verknüpfungen (z. B. alpha-anomerische Nucleinsäuren usw.) ebenso wie unmodifizierte Formen des Polynucleotids.
Ein "Replicon" ist jedes genetische Element, d. h. ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Cosmid usw., das sich als autonome Einheit der Polynucleotidreplikation innerhalb einer Zelle verhält; d. h. zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle in der Lage ist. Dies kann einen selektierbaren Marker umfassen.
Ein "Vektor" ist ein Replicon, bei dem ein anderes Polynucleotidsegment angeheftet ist, um die Replikation und/oder Expression des angehefteten Segments zu erreichen.
"Kontrollsequenz" betrifft Polynucleotidsequenzen, die erforderlich sind, um die Expression der codierenden Sequenz zu bewirken, mit der sie ligiert sind. Die Natur einer solchen Kontrollsequenz unterscheidet sich in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus; in Prokaryonten umfassen solche Kontrollsequenzen im allgemeinen einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle und eine Transkriptions-Terminations-Sequenz; in Eukaryonten umfassen solche Kontrollsequenzen im allgemeinen Promotoren und eine Transkriptions-Terminations-Sequenz. Der Ausdruck "Kontrollsequenz" soll mindestens alle Komponenten umfassen, deren Anwesenheit für die Expression notwendig sind, und kann auch zusätzliche Komponenten umfassen, deren Anwesenheit vorteilhaft ist, zum Beispiel Leadersequenzen und Fusionspartnersequenzen.
"Operativ verknüpft" betrifft eine benachbarte Lage, bei der die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die es ihnen erlaubt, in der beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine mit einer codierenden Sequenz "operativ verknüpfte" Kontrollsequenz ist auf eine Weise ligiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Ein "offener Leserahmen" (ORF) ist eine Region der Polynucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert; diese Region kann einen Teil der codierenden Sequenz darstellen oder eine gesamte codierende Sequenz.
Eine "codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die in eine Polypeptid übersetzt wird, üblicherweise über mRNA, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Translations-Startcodon am 5'-Ende und ein Translations-Stopcodon am 3'-Ende bestimmt. Eine codierende Sequenz kann cDNA und rekombinante Polynucleotidsequenzen umfassen, ist aber nicht beschränkt darauf.
"PCR" betrifft die Technik der Polymerase-Kettenreaktion, wie sie in Saiki, et al., Nature 324: 163 (1986); und Scharf et al., Science (1986) 233: 1076–1078; und U.S. 4,683,195; und U.S. 4,683,202 beschrieben ist. Wie hier verwendet ist x "heterolog" in Bezug auf y, wenn x nicht natürlicherweise in identischer Weise mit y assoziiert ist; d. h. x ist in der Natur nicht mit y assoziiert oder x ist mit y nicht auf die gleiche Weise assoziiert, wie sie in der Natur gefunden wird.
"Homologie" betrifft ein Maß an Ähnlichkeit zwischen x und y. Die Übereinstimmung zwischen der Sequenz von einer Form zu einer anderen kann mittels Verfahren bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Sie können zum Beispiel durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformation des Polynucleotids bestimmt werden. Alternativ kann die Homologie durch Hybridisierung der Polynucleotide unter Bedingungen bestimmt werden, bei denen stabile Duplexe zwischen homologen Regionen gebildet werden (zum Beispiel denen, die vor dem S₁-Verdau verwendet würden, gefolgt von einem Verdau mit (einer) Einzelstrang-spezifischen Nuclease(n), gefolgt von der Größenbestimmung der verdauten Fragnmente).
Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck "Polypeptid" ein Polymer an Aminosäuren und nicht eine spezifische Länge des Produkts; somit schließt die Definition Polypeptid Peptide, Oligopeptide und Proteine ein. Dieser Ausdruck betrifft auch nicht Modifikationen des Polypeptids nach der Expression oder schließt sie aus, zum Beispiel Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen. In der Definition eingeschlossen sind zum Beispiel Polypeptide, die ein oder mehr Analoga einer Aminosäure enthalten (einschließlich zum Beispiel unnatürliche Aminosäuren usw.), Polypeptide mit substituierten Bindungen, ebenso wie andere Modifikationen, die im Stand der Technik bekannt sind, sowohl natürlicherweise vorkommend als auch nicht natürlicherweise vorkommend.
Eine Polypeptid- oder Aminosäuresequenz, die "abgeleitet von" einer vorgegebenen Nucleinsäuresequenz ist, betrifft ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die identisch ist zu der eines Polypeptids, das von der Sequenz codiert wird, oder einen Teil davon, wobei der Teil aus mindestens 3–5 Aminosäuren besteht, und mehr bevorzugt aus mindestens 8–10 Aminosäuren, und noch mehr bevorzugt aus mindestens 11–15 Aminosäuren, oder die immunologisch mit einem Polypeptid identifiziert werden kann, das von der Sequenz codiert wird. Diese Teminologie umfaßt auch ein Polypeptid, das von einer vorgegebenen Nucleinsäuresequenz exprimiert wird.
Das Protein kann zur Produktion von Antikörpern verwendet werden, die für das Protein spezifisch sind, entweder monoclonal oder plyclonal. Die Verfahren zur Produktion von Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zellkulturen" und andere solche Ausdrücke bedeuten zum Beispiel Mikroorganismen, Insektenzellen und Säugerzellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet wurden und umfassen die Nachkommen der ursprünglichen Zelle, die transformiert wurde. Es ist zu verstehen, dass die Nachkommen einer einzelnen Mutterzelle nicht notwendigerweise in der Morphologie oder der genomischen oder der Gesamt-DNA-Zusammensetzung mit den ursprünglichen Eltern vollständig identisch sind, wegen natürlicher, zufälliger oder gezielter Mutation. Beispiele für Säugerwirtszellen umfassen Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) und Affennierenzellen (COS).
Spezifisch betrifft "Zelllinie", wie hier verwendet, eine Population an Zellen, die in vitro zu kontinuierlichem oder verlängertem Wachstum und Teilung in der Lage sind. Oft sind Zelllinien clonale Populationen, die von einer einzigen Vorläuferzelle abgeleitet sind. Es ist im Stand der Technik weiterhin bekannt, dass spontane oder induzierte Veränderungen während der Lagerung oder Übertragung solcher clonalen Populationen im Karyotyp vorkommen können. Deshalb können Zellen, die von der bezüglichen Zelllinie abgeleitet sind, nicht genau identisch mit der ursprünglichen Zellen oder Kulturen sein, und die bezüglichen Zelllinien umfassen solche Varianten. Der Ausdruck "Zelllinien" umfaßt auch immortalisierte Zellen. Vorzugsweise umfassen Zelllinien nicht hybride Zelllinien oder Hybridome zu nur zwei Zellarten.
Wie hier verwendet umfaßt der Ausdruck "Mikroorganismen" prokaryontische und eukaryontische mikrobielle Arten wie Bakterien und Pilze, wobei die letzteren Hefe und filamentöse Pilze umfassen.
Wie hier verwendet betrifft "Transformation" die Inserierung eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, unabhängig vom für die Inserierung verwendeten Verfahren, zum Beispiel direkte Aufnahme, Transduktion, f-Mating oder Elektroporation. Das exogene Polynucleotid kann als ein nicht integrierender Vektor aufgenommen werden, zum Beispiel ein Plasmid, oder kann in das Wirtsgenom integriert werden.
Mit "genomisch" ist eine Sammlung oder Bibliothek von DNA-Molekülen gemeint, die von Restriktionsfragmenten abgeleitet sind, die in Vektoren cloniert wurden. Dies kann das gesamte oder einen Teil des genetischen Materials eines Organismus bedeuten.
Mit "cDNA" ist eine komplementäre mRNA-Sequenz gemeint, die mit einem komplementären Strang mRNA hybridisiert.
Mit "gereinigt" und "isoliert" ist gemeint, wenn es sich auf eine Polypeptid- oder Polynucleotidsequenz bezieht, gemeint, dass das angezeigte Molekül im Wesentlichen in der Abwesenheit anderer biologischer Makromoleküle derselben Art vorkommt. Der Ausdruck "gereinigt", wie hier verwendet, bedeutet, dass vorzugsweise mindestens 75 Gew.-%, mehr bevorzugt mindestens 85 Gew.-%, noch mehr bevorzugt mindestens 95 Gew.-%, und am meisten bevorzugt mindestens 98 Gew.-% an biologischen Makromolekülen derselben Art anwesend sind (es können aber Wasser, Puffer und andere kleine Molekülen, insbesondere Moleküle, die ein Molekulargewicht von weniger als 1000 haben, anwesend sein).
Expressionssyteme
Nachdem die geeignete codierende Sequenz isoliert ist, kann sie in einer Vielzahl von verschiedenen Expressionssystemen exprimiert werden; zum Beispiel diejenigen, die bei Säugerzellen, Baculoviren, Bakterien und Hefe verwendet werden.
i. Säugersysteme
Säugerexpressionssyteme sind im Stand der Technik bekannt. Ein Säugerpromotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Säuger-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription stromabwärts (3') einer codierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Region der Transkriptions-Initiation haben, die üblicherweise in der Nähe des 5'-Endes der codierenden Sequenz plaziert ist, und eine TATA-Box, die üblicherweise 25–30 Basenpaare (bp) stromaufwärts der Stelle der Transkriptions-Initiation liegt. Von der TATA-Box denkt man, dass sie die RNA-Polymerase II steuert, damit sie an der richtigen Stelle mit der RNA-Synthese beginnt. Ein Säugerpromotor wird auch ein stromaufwärts liegendes Promotorelement enthalten, üblicherweise 100 bis 200 bp stromaufwärts der TATA-Box gelegen. Ein Promotorelement stromaufwärts bestimmt die Rate, mit der die Transkription initiiert wird, und kann in jeder Richtung wirken [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Ausg.].
Gene von Säugerviren werden oft hoch exprimiert und haben ein breites Wirtsspektrum; deshalb stellen Sequenzen, die Gene von Säugerviren codieren, besonders geeignete Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen den frühen SV40-Promotor, den LTR-Promotor des Brustkrebsvirus der Maus, den späten Hauptpromotor des Adenovirus (Ad MLP) und den Promotor des Herpes simplex-Virus. Zusätzlich stellen auch Sequenzen, die von nicht-viralen Genen abgeleitet sind, wie das murine Metallotheionein-Gen, geeignete Promotorsequenzen bereit. Die Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein, in Abhängigkeit von dem Promotor kann sie in hormonabhängigen Zellen mit Glucocorticoid induziert werden.
Die Gegenwart von einem Verstärkerelement ("Enhancer"), kombiniert mit den vorstehend beschriebenen Promotorelementen, wird üblicherweise die Expressionsniveaus erhöhen. Ein Verstärker ist eine regulatorische DNA-Sequenz, die die Transkription bis zu 1000-fach stimulieren kann, wenn sie mit homologen oder heterologen Promotoren verknüpft ist, wobei die Synthese an der normalen RNA-Startstelle beginnt. Verstärker sind auch aktiv, wenn sie stromaufwärts oder stromabwärts von der Transkriptions-Initiationsstelle liegen, in normaler oder umgekehrter Orientierung, oder in einer Entfernung von mehr als 1000 Nucleotiden von dem Promotor [Maniatis et al. (1987) Science 236: 1237; Alberts et al (1989) Molecular Biology of the Cell, 2te Ausg.]. Von Viren abgeleitete Verstärkerelemente können besonders von Nutzen sein, weil sie üblicherweise ein breiteres Wirtsspektrum haben. Beispiele umfassen den frühen Genverstärker von SV40 [Dijkema et al (1985) EMBO J. 4: 761] und den Verstärker/die Promotoren, die von der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous Sarcoma-Virus [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777] und von humanem Cytomegalovirus [Boshart et al. (1985) Cell 41: 521]. Außerdem sind einige Verstärker regulierbar und werden nur in der Gegenwart eines Induktionsmittels aktiv, wie ein Hormon oder ein Metallion [Sasson-Corsi und Borelli (1986) Trends Genet. 2: 215; Maniatis et al. (1987) Science 236: 1237].
Ein DNA-Molekül kann in Säugerzellen intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft sein, in welchem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein wird, welche von dem ATG-Startcodon codiert wird. Wenn gewünscht, kann der N-Terminus durch in vitro-Inkubation mit Cyanogenbromid von dem Protein abgespalten werden.
In einer anderen Ausführungsform können fremde Proteine von der Zelle in das Wachstumsmedium sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersequenzfragment umfaßt, das die Sekretion des fremden Proteins in Säugerzellen bewirkt. Vorzugsweise werden zwischen dem Leaderfragment und dem fremden Gen Prozessierungsstellen codiert, die in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Der Adenovirus-Triparite-Leader ist ein Beispiel für eine Leadersequenz, die die Sekretion eines fremden Proteins in Säugerzellen bereitstellt.
Üblicherweise sind die Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen, die von Säugerzellen erkannt werden, regulatorische Regionen, die 3' vom Translations-Stopcodon liegen und somit zusammen mit den Promotorelementen die codierende Sequenz flankieren. Das 3'-Ende der reifen mRNA wird durch stellenspezifische post-transkriptionale Spaltung und Polyadenylierung gebildet [Birnstiel et al. (1985) Cell 41: 349; Proudfoot und Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and splicin (Hrsg. B. D. Hames und D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14: 105]. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid übersetzt wird, die von der DNA codiert wird. Beispiele für Transkriptionsbeendigungs/Polyadenylierungsignale umfassen diejenigen, die von SV40 abgeleitet sind [Sambrook et al (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manuall.
Einige Gene können effizienter exprimiert werden, wenn Introns (auch intervenierende Sequenzen genannt) vorhanden sind. Mehrere cDNAs wurde jedoch effizient von Vektoren exprimiert, denen Splicing-Signale fehlen (auch Splice-Donor und -Akzeptor-Stellen genannt [vgl. z. B. Gothing und Sambrook (1981) Nature 293: 620]. Introns sind intervenierende nicht codierende Sequenzen innerhalb einer codierenden Sequenz, die Splice-Donor und -Akzeptor-Stellen enthält. Sie werden durch einen Prozeß entfernt, den man "splicing" nennt, nach der Polyadenylierung des primären Transkripts [Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52: 441; Green (1986) Annu. Rev. Genet. 20: 671; Padgett et al. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55: 1119; Krainer und Maniatis (1988) "RNA splicing". In Transcription and Splicing (Hrsg. B. D. Hames und D. M. Glover)].
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsbeendigungssequenz umfassen, in Expressionskonstrukten zusammengebaut. Verstärker, Introns mit funktionellen Splice-Donor und -Akzeptor-Stellen und Leadersequenzen können, wenn erwünscht, auch in einem Expressionskonstrukt eingeschlossen sein. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon gehalten, wie ein extrachromosomales Element (z. B. Plasmide), das in der Lage ist, stabil in einem Wirt gehalten werden zu können, wie Säugerzellen oder Bakterien. Säugerreplikationssysteme umfassen diejenigen, die von Tierviren abgeleitet sind, die für die Replikation frans-agierende Faktoren brauchen. Zum Beispiel replizieren Plasmide, die das Replikationsystem der Papovaviren enthalten, wie SV40 [Gluzman (1981) Cell 23: 175], oder der Polyomaviren, in der Gegenwart des geeigneten viralen T-Antigens mit extrem hohen Kopiezahlen. Zusätzliche Beispiele für Säuger-Replicons umfassen diejenigen, die vom Rinder-Papillomavirus und Epstein-Barr-Virus abgeleitet sind. Außerdem kann das Replicon zwei Replikationsysteme haben, was erlaubt, dass es zum Beispiel in Säugerzellen für die Expression und in einem prokaryontischen Wirt für die Clonierung und Amplifikation gehalten werden kann. Beispiele solcher Säuger-Bakterien-Shuttle-Vektoren umfassen pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946] und pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074].
Das verwendete Transformationsverfahren hängt von dem zu transformierenden Wirt ab. Verfahren für die Einbringung von heterologen Polynucleotiden in Säugerzellen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphatfällung, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Verkapselung des Polynucleotids/der Polynucleotide in Liposomen und direkte Mikroinjektion von DNA in Kerne.
Säugerzelllinien, die als Wirte für die Expression zur Verfügung stehen, sind im Stand der Technik bekannt und umfassen viele immortalisierte Zelllinien, die bei der American Type Culture Collection (ATTC) verfügbar sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO), HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen (BHK), Affennierenzellen (COS), menschliche Leberzellcarcinomzellen (z. B. Hep G2) und eine Reihe von anderen Zelllinien.
ii. Baculovirus-Systeme
Das Polynucleotid, das das Protein codiert, kann auch in einen geeigneten Insekten-Expressionsvektor insertiert werden und ist operativ verknüpft mit den Kontrollelementen innerhalb dieses Vektors. Die Vektorkonstruktion verwendet Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Im allgemeinen umfassen die Komponenten des Expressionssystems einen Transfervektor, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, das sowohl ein Fragment des Baculovirus-Genoms als auch eine geeignete Restriktionsstelle für die Insertion des zu exprimierenden heterologen Gens oder der zu exprimierenden heterologen Gene enthält; einen Wildtyp-Baculovirus mit einer Sequenz, die zu dem Baculovirus-spezifischen Fragment in dem Transfervektor homolog ist (dies ermöglicht die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus-Genom); und geeignete Insektenwirtszellen und Wachstumsmedien.
Nach der Insertion der DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in den Transfervektor, werden der Vektor und virale Wildtyp-Baculovirusgenom in eine Insektenwirtszelle transfiziert, wo der Vektor und das virale Genom rekombinieren können. Das gepackte rekombinante Virus wird exprimiert und rekombinante Plaques werden identifiziert und gereinigt. Materialien und Verfahren für Baculovirus-/Insektenzellenexpressionsyteme sind kommerziell in Kit-Form unter anderem von Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac"-Kit) erhältlich. Diese Verfahren sind im allgemeinen dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet und in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987) vollständig beschrieben (hier nachstehend "Summers und Smith").
Vor der Insertion der DNA-Sequenz, die das Protein codiert, in das Baculovirusgenom werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, einschließlich eines Promotors, eines Leaders (wenn gewünscht), der codierenden Sequenz von Interesse und der Transkriptions-Terminationssequenz üblicherweise in einem intermediären Transplazierungskontrukt (Transfervektor) zusammengebaut. Dieses Konstrukt kann ein einzelnes Gen und operativ verknüpfte regulatorische Elemente enthalten; mehrere Gene, jedes mit seinem eigenen Satz an operativ verknüpften regulatorischen Elementen; oder mehrere Gene, jedes reguliert durch denselben Satz an regulatorischen Elementen. Intermediären Transplazierungskontrukte werden oft in einem Replicon wie einem extrachromosomalen Element (d. h. Plasmide) gehalten, das in der Lage der stabilen Erhaltung in einem Wirt wie einem Bakterium ist. Das Replicon wird ein Replikationssystem haben, was somit zuläßt, dass es in einem geeigneten Wirt für die Clonierung und Amplifikation gehalten wird.
Gegenwärtig ist pAc373 der am häufigsten benutzte Transfervektor für die Einbringung fremder Gene in AcNPV. Viele andere Vektoren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, wurden auch entworfen. Diese umfassen zum Beispiel pVL985 (welcher das Polyhedrin-Startcodon von ATG zu ATT verändert und der eine BamHI-Clonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts vom ATT einführt; vgl. Luckow und Summers, Virology (1989) 17: 31.
Das Plasmid enthält üblicherweise auch das Polyhedrin-Polyadenylierungssignal (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42: 177) und ein prokaryontisches Ampicillin-Resistenzgen (am und einen Replikationsursprung für die Selektion und Vermehrung in E. coli.
Baculovirus-Transfervektoren enthalten üblicherweise einen Baculovirus-Promotor. Ein Baculovirus-Promotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Baculovirus-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription stromabwärts (5' zu 3') einer codierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Region der Transkriptions-Initiation haben, die üblicherweise in der Nähe des 5'-Endes der codierenden Sequenz plaziert ist. Diese Region der Transkriptions-Initiation umfaßt üblicherweise eine Bindungsstelle für die RNA-Polymerase und eine Transkriptions-Initiationstelle. Ein Baculovirus-Transfervektor kann auch eine zweite Domäne haben, die Verstärker genannt wird, die, wenn anwesend, distal zum Strukturgen liegen. Die Expression kann reguliert oder konstitutiv sein.
Strukturgene, die zu späten Zeiten bei einer viralen Infektion reichlich transkribiert werden, stellen besonders nützliche Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen Sequenzen, die von dem Gen abgeleitet sind, das das virale Polyhedron-Protein codiert, Friesen et al., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression," in: The Molecular Biologe of Baculoviruses (Hrsg. Walter Doerfler); EPO-Offenlegungsnummern 127 839 und 155 476; und das Gen, das das p10-Protein codiert, Vlak et al., (1988) J. Gen. Virol. 69: 765.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte Insekten- oder Baculovirusproteine abgeleitet werden, so wie das Baculovirus-Polyhedringen (Carbonell et al. (1988) Gene, 73: 409). Da die Signale für die posttranslationalen Modifikationen für Säugerzellen (wie die Signalpeptidabspaltung, die proteolytische Spaltung und die Phosphorylierung) durch Insektenzellen erkannt zu werden scheinen und die Signale, die für die Sezernierung und die Anreicherung im Kern erforderlich sind, auch zwischen den Zellen von Wirbellosen und Zellen von Wirbeltieren konserviert zu sein scheinen, können auch Leader von nicht-Insekten-Ursprung, wie diejenigen, die von Genen abgeleitet sind, die menschliches α-Interferon codieren, Maeda et al., (1985), Nature 315: 592; menschliches Gastrin freisetzendes Peptid, Lebacq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8: 3129; menschliches IL-2, Smith et al., (1985) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 82: 8404; Maus-IL-3, Miyajima et al., (1987) Gene 58: 273; und menschliche Glucocerebrosidase, Martin et al. (1988) DNA, 7: 99, für die Sezernierung in Insekten verwendet werden.
Ein rekombinantes Polypeptid oder Polyprotein kann intrazellulär exprimiert werden oder es kann, wenn es mit den richtigen regulatorischen Sequenzen exprimiert wird, sezerniert werden. Eine gute intrazelluläre Expression von nicht fusionierten fremden Proteinen erfordert üblicherweise heterologe Gene, die Idealerweise eine kurze Leadersequenz haben, die geeignete Translations-Initiationssignale enthalten, die einem ATG-Startsignal vorausgehen. Wenn gewünscht kann das Methionin am N-Terminus von dem reifen Protein durch in vitro-Inkubation mit Cyanogenbromid abgespalten werden.
In einer anderen Ausführungsform können rekombinante Polyproteine oder Proteine, die nicht natürlicherweise sezerniert werden, von der Insektenzelle durch Schaffung von chimären DNA-Molekülen sezerniert werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein Leadersequenzfragment umfaßt, das die Sezernierung des fremden Proteins in Insekten bereitstellt. Das Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Translokation des Proteins in das endoplasmatische Retikulum steuern.
Nach der Inserierung der DNA-Sequenz und/oder des Gens, das den Vorläufer des Expressionsprodukts des Proteins codiert, wird ein Insektenzellwirt mit der heterologen DNA des Transfervektors und der genomischen DNA des Wildtyp-Baculovirus cotransformiert – üblicherweise durch co-Transfektion. Der Promotor und die Transkriptions-Beendigungssequenz des Konstrukts werden üblicherweise einen Abschnitt von 2-5-kb des Baculovirusgenoms enthalten. Verfahren für die Einbringung von heterologer DNA an der gewünschten Stelle des Baculovirus sind Stand der Technik bekannt. (Vgl. Summers und Smith vorstehend; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156 ; und Luckow und Summers (1989)). Zum Beispiel kann die Inserierung in ein Gen wie das Polyhedringen durch eine homologe doppelte über-Kreuz-Rekombination erfolgen; die Inserierung kann auch in eine Restriktionsenzymstelle erfolgen, die in das gewünschte Baculovirusgen eingebaut wurde. Miller et al., (1989) Bioessays 4: 91. Wenn die DNA-Sequenz anstelle des Polyhedringens in den Expressionsvektor cloniert wird, wird sie 5'und 3' von Polyhedrinspezifischen Sequenzen flankiert und sie ist stromabwärts vom Polyhedrinpromotor positioniert.
Der neu gebildete Baculovirus-Expressionsvektor wird anschließend in einen infektiösen rekombinanten Baculovirus verpackt. Die homologe Rekombination tritt mit geringer Häufigkeit auf (zwischen etwa 1% und etwa 5%); somit ist die Mehrzahl des Virus, der nach der co-Transfektion erhalten wird, immer noch Wildtyp-Baculovirus. Deshalb braucht man ein Verfahren, um rekombinante Viren zu identifizieren. Ein Vorteil des Expressionssystems ist eine visuelle Überprüfung zur Unterscheidung von rekombinanten Viren. Das Polyhedrinprotein, das von dem nativen Virus produziert wird, wird zu späten Zeiten nach der viralen Infektion mit sehr hohen Niveaus in den Kernen der infizierten Zellen produziert. Akkumuliertes Polyhedrinprotein bildet Ausschlußkörper, die auch eingebettete Partikel enthalten. Diese Ausschlußkörper, bis zu 15 μm groß, sind stark lichtbrechend, was ihnen ein helles, glänzendes Aussehen verleiht, das unter dem Lichtmikroskop leicht sichtbar zu machen ist. Zellen, die mit rekombinantem Virus infiziert sind, fehlen Ausschlußkörper. Um rekombinantes Virus von Wildtyp-Virus zu unterscheiden, wird mittels Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, der Transfektionsüberstand in Plaques auf eine Einzelschicht Insektenzellen gegeben. Die Plaques werden nämlich unter dem Lichtmikroskop auf die Anwesenheit (Hinweis auf Wildtyp-Virus) oder Abwesenheit (Hinweis auf rekombinantes Virus) von Ausschlußkörpern untersucht. "Cunent Protocols in Microbiology" Bd. 2 (Ausubel et al. Hrsg.) bei 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers und Smith vorstehend; Miller et al. (1989).
Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren wurden für die Infektion in eine mehrere Insektenzellen entwickelt. Zum Beispiel wurden rekombinante Baculoviren unter anderem entwicklet für: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanoagster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni (PCT Offenlegungsnummer WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56: 153; Wright (1986) Nature 321: 718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156; vgl. generell Fraser et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).
Zellen und Zellkulturmedien sind kommerziell für die direkte und Fusionsexpression von heterologen Polypeptiden in einem Baculovirus/Expressionssystem verfügbar; die Zellkulturtechnik ist dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet generell bekannt. Vgl. z. B. Summers und Smith vorstehend.
Die modifizierten Insektenzellen können dann in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, welches die stabile Erhaltung des/der in dem modifizierten Insektenwirt anwesenden Plasmids/Plasmide zuläßt. Wenn das Gen für das Expressionsprodukt unter induzierbarer Kontrolle ist, muß der Wirt bis zu hoher Dichte gezüchtet und die Expression induziert werden. Wenn die Expression in einer anderen Ausführungsform konstitutiv ist wird das Produkt kontinuierlich in das Medium exprimiert und das Nährmedium muß kontinuierlich zirkuliert werden, während das Produkt von Interesse entfernt und verbrauchte Nährstoffe ersetzt werden. Das Produkt kann mittels solcher Techniken wie der Chromatographie, gereinigt werden, z. B. HPLC, Affinitätschromatographie, Ionenaustauscherchromatographie usw.; Elektrophorese; Dichtegradientenzentrifugation; Lösungsmittelextraktion oder dergleichen. Wenn angezeigt, kann das Produkt, falls erforderlich, weiter gereinigt werden, um somit im Wesentlichen alle Insektenproteine zu entfernen, die auch in das Medium sezerniert werden oder die von der Lyse von Insektenzellen resultieren, um somit ein Produkt bereitzustellen, dass mindestens im Wesentlichen frei ist von Bestandteilen des Wirts, z. B. Proteine, Lipide und Polysaccharide.
Um die Proteinexpression zu erhalten werden rekombinante Wirtszellen, die von den Transformanten abgeleitet sind, unter Bedingungen inkuziert, die die Expression der das rekombinante Protein codierenden Sequenz zulassen. Diese Bedingungen werden in Abhängigkeit von der gewählten Wirtszelle variieren. Diese Bedingungen können jedoch durch den Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet festgestellt werden, basierend auf dem Wissen in dem Fachgebiet.
iii. Bakterielle Systeme
Bakterielle Expressionsverfahren sind im Stand der Technik bekannt. Ein bakterieller Promotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription stromabwärts (3'') einer codierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Region der Transkriptions-Initiation haben, die üblicherweise in der Nähe des 5'-Endes der codierenden Sequenz plaziert ist. Diese Region der Transkriptions-Initiation umfaßt üblicherweise eine Bindungsstelle für die RNA-Polymerase und eine Transkriptions-Initiationstelle. Ein bakterieller Promotor kann auch eine zweite Domäne haben, die Operator genannt wird, die mit einer benachbarten RNA- Polymerase-Bindungsstelle überlappen kann, an der die RNA-Synthese beginnt. Der Operator erlaubt die negativ regulierte (induzierbare) Transkription, da ein Gen-Repressorprotein an den Operator binden und damit die Transkription eines spezifischen Gens verhindern kann. Eine konstitutive Expression kann in der Abwesenheit von negativen regulatorischen Elementen wie dem Operator auftreten. Außerdem kann durch eine Bindungssequenz für ein Gen-Aktivatorprotein eine positive Regulation erreicht werden, die, wenn anwesend, üblicherweise in der Nähe (5') der Bindungssequenz der RNA-Polymerase ist. Ein Beispiel für ein Gen-Aktivatorprotein ist das Catabolit-Aktivatorprotein (CAP), das hilft, die Transkription des lac-Operons in Escherichia coli (E. coli) zu initiieren [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173]. Die regulierte Expression kann daher entweder positiv oder negativ sein, womit die Transkription erhöht oder reduziert wird.
Sequenzen, die metabolische Enzyme codieren, stellen besonders nützliche Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen Promotorsequenzen, die von Zucker metabolisierenden Enzymen abgeleitet sind, wie Galactose, Lactose (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198: 1056] und Maltose. Zusätzliche Beispiele umfassen Promotorsequenzen, die von biosynthetischen Enzymen abgeleitet sind, wie Tryptophan (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton et al. (1981) Nuc. Acids Res. 9: 731; U.S. Patent Nr. 4,738,921; EPO Offenlegungsnummern 036 776 und 121 775]. Das g-laotamase (bla)-Promotorsystem [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Hrsg. I. Gresser)], Bacteriophage lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128] und T5- [U.S. Patent Nr. 4,689,406]-Promotorsystem stellen auch nützliche Promotorsequenzen bereit.
Außerdem funktionieren auch synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, als bakterielle Promotoren. Zum Beispiel können die Transkriptions-Aktivierungssequenzen von einem bakteriellen oder Bakteriophagen-Promotor mit den Operon-Sequenzen eines anderen bakteriellen oder Bakteriophagen-Promotors verknüpft werden, wodurch ein synthetischer hybrider Promotor geschaffen wird [U.S. Patent Nr. 4,551,433]. Zum Beispiel ist der tac-Promotor ein hybrider trp-lac-Promotor, der Sequenzen vom trp-Promotor und lac-Operon umfaßt, der durch den lac-Repressor reguliert wird [Amann et al. (1983) Gene 25: 167; De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21]. Darüber hinaus kann ein bakterieller Promotor natürlicherweise vorkommende Promotoren nicht bakteriellen Ursprungs einschließen, die die Fähigkeit haben, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Ein natürlicherweise vorkommender Promotor nicht bakteriellen Ursprungs kann auch mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um hohe Niveaus an Expression einiger Gene in Prokaryonten zu produzieren. Das Bakteriophage T7 RNA-Polymerase-/Promotorsystem ist ein Beispiel eines gekoppelten Promotorsystems [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1074]. Außerdem kann ein hybrider Promotor auch einen Bakteriophagenpromotor und eine E. coli-Operatorregion umfassen (EPO Offenlegungsnummer 267 851).
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotorsequenz ist auch eine effiziente Ribosomenbindungsstelle von Nutzen für die Expression fremder Gene in Prokaryonten. In E. coli wird die Ribosomenbindungsstelle Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz genannt und umfaßt ein Initiationscodon (ATG) und eine Sequenz von 3–9 Nucleotiden Länge, die 3–11 Nucleotide stromaufwärts vom Initiationscodon liegt [Shine et al. (1975) Nature 254: 34]. Man denkt, dass die SD-Sequenz die Bindung der mRNA an das Ribosom durch Paarbildung der Basen zwischen der (SD)-Sequenz und dem 3'-Ende der 16S RNA von E. coli fördert [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Hrsg. R. F. Goldberger)]. Um eukaryontische und prokaryontische Gene mit schwacher Ribosomenbindungsstelle zu exprimieren [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escheria coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft sein, in welchem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus immer ein Methionin sein wird, das vom ATG-Startcodon codiert wird. Wenn gewünscht, kann das Methionin am N-Terminus von dem Protein durch in vitro-Inkubation mit Cyanogenbromid oder durch in vivo- oder in vitro-Inkubation mit einer bakteriellen Methionin-N-terminalen Peptidase abgespalten werden (EPO Offenlegungsnummer 219 237).
Fusionsproteine stellen eine Alternative zur direkten Expression bereit. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die die N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert mit dem 5'-Ende heterologer codierender Sequenzen fusioniert. Bei der Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion von zwei Aminosäuresequenzen bereitstellen. Zum Beispiel kann das Bakteriophage lambda-Zellgen mit dem 5'-Terminus des fremdem Gens verknüpft und in Bakterien exprimiert werden. Das resultierende Fusionsprotein enthält vorzugsweise eine Stelle für ein prozessierendes Enzym (Faktor Xa), um das Bakteriophagenprotein von dem fremden Gen abzuspalten [Nagai et al. (1984) Nature 309: 810]. Fusionsproteine können auch mit Sequenzen von den lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60: 197]-, trpE [Allen et al. (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135: 11]- und Chey [EPO Offenlegungsnummer 324 647]-Genen gemacht werden. Die DNA-Sequenz an der Verknüpfung der beiden Aminosäuresequenzen kann eine Spaltstelle codieren, oder auch nicht. Ein anders Beispiel ist das Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin-Region gemacht, die vorzugsweise eine Stelle für ein prozessierendes Enzym enthält (d. h. eine Ubiquitin-spezifische prozessierende Protease), um das Ubiquitin von dem fremdem Protein abzuspalten. Mit diesem Verfahren können native fremde Proteine isoliert werden [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7 :698].
In einer anderen Ausführungsform können fremde Proteine auch durch Schaffung von chimären DNA-Molekülen von der Zelle sezerniert werden, die ein Fusionsprotein codieren, die ein Signalpeptidsequenzfragment umfassen, das die Sekretion des fremden Proteins in Bakterien bereitstellt [U. S. Patent Nr. 4,336,336]. Das Signalsequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Sekretion des Proteins von der Zelle steuern. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium sezerniert (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, der zwischen der inneren und äußeren Membran der Zelle liegt (Gram-negative Bakterien). Vorzugsweise gibt es Prozessierungsstellen, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können und die zwischen dem Signalpeptidfragment und dem fremden Gen codiert werden.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte bakterielle Proteine abgeleitet werden, wie das Gen für das äußere Membranprotein von E. coli (ompA) [Masui et al. (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3: 2437] und die Signalsequenz der alkalischen Phosphatase von E. coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212]. Als ein zusätzliches Beispiel kann die Signalsequenz des alpha-Amylase-Gens von verschiedenen Bacillus-Stämmen verwendet werden, um heterologe Proteine aus B. subtilis zu sezernieren [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Offenlegungsnummer 244 042].
Üblicherweise sind Transkriptions-Terminationssequenzen, die von Bakterien erkannt werden, regulatorische Regionen, die 3' zum Transkriptions-Stopcodon liegen und deshalb zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das von der DNA codierte Polypeptid übersetzt werden kann. Die Transkription-Terminationssequenzen umfassen häufig DNA-Sequenzen von etwa 50 Nucleotiden, die in der Lage sind, Stammloop-Strukturen zu bilden, die bei der Beendigung der Transkription helfen. Beispiele umfassen Transkription-Terminationssequenzen, die von Genen mit starken Promotoren abgeleitet sind, wie das trp-Gen in E. coli, ebenso wie andere biosynthetische Gene.
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, eine Signalsequenz (wenn gewünscht), die codierende Sequenz von Interesse und eine Transkription-Terminationssequenz umfassen, in Expressionskonstrukten zusammengebaut. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon gehalten, wie ein extrachromosomales Element (z. B. Plasmide), das in der Lage ist, stabil in einem Wirt gehalten werden zu können, wie Bakterien. Das Replicon wird ein Replikationssystem haben, was somit zuläßt, dass es in einem prokaryontischen Wirt für die Expression oder für die Clonierung und Amplifikation gehalten wird. Zusätzlich kann ein Replicon ein Plasmid mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl wird im allgemeinen eine Kopienzahl haben, die von etwa 5 bis etwa 200 reicht, und üblicherweise etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält, wird vorzugsweise mindestens etwa 10 und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide enthalten. Ein Vektor mit hoher oder niedriger Kopienzahl kann ausgewählt werden, in Abhängigkeit von der Wirkung des Vektors und des fremden Proteins auf den Wirt.
In einer anderen Ausführungsform können die Expressionskonstrukte mit einem Integrationsvektor in das bakterielle Genom integriert werden. Integrationsvektoren enthalten üblicherweise eine Sequenz, die zu dem bakteriellen Genom homolog ist, was dem Vektor die Integration ermöglicht. Die Integration scheint aus Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem bakteriellen Chromosom zu resultieren. Zum Beispiel integrieren Integrationsvektoren, die mit DNA von verschiedenen Bacillus-Stämmen konstruiert wurden, in das Bacillus-Chromosom (EPO Offenlegungsnummer 127 328). Integrationsvektoren können auch aus Bakteriophagen- oder Transposonsequenzen bestehen.
Üblicherweise können extrachromosomale und Integrationsexpressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, die die Selektion der bakteriellen Stämme ermöglichen, die transformiert wurden. Selektierbare Marker können in dem bakteriellen Wirt exprimiert werden und können Gene umfassen, die den Bakterien Resistenz gegen Wirkstoffe wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469]. Selektierbare Marker können auch biosynthetische Gene umfassen, wie diejenigen des Histidin-, Tryptophan- und Leucinbiosynthesewegs.
In einer anderen Ausführungsform können einige der vorstehend beschriebenen Komponenten in Transformationvektoren zusammengebaut werden. Transformationvektoren bestehen üblicherweise aus einem selektierbaren Marker, der entweder in einem Replicon gehalten wird oder zu einem Integrationsvektor entwickelt wird, wie vorstehend beschrieben.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replicons oder Integrationsvektoren, wurden für die Transformation von vielen Bakterien entwickelt. Zum Beispiel wurden unter anderem Expressionsvektoren für die folgenden Bakterien entwickelt: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Offenlegungsnummern 036 259 und 063 953; PCT Offenlegungsnummer WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128; Amann et al. (1985) Gene 40: 183, Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; EPO Offenlegungsnummern 036 776, 136 829 und 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [U.S. Patent Nr. 4,745,056].
Verfahren zur Einbringung von exogener DNA in bakterielle Wirte sind im Stand der Technik wohlbekannt und umfassen üblicherweise die Transformation von Bakterien, die mit CaCl₂ oder anderen Mitteln wie divalenten Kationen und DMSO behandelt wurden. DNA kann auch mittels Elektroporation in bakterielle Zellen eingebracht werden. Transformationsverfahren werden üblicherweise mit der zu transformierenden Bakterienart variieren. Vgl. z. B. [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Offenlegungsnummern 036 259 und 063 953; PCT Offenlegungsnummer WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (Hrsg. H. W. Boyer und S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44 :173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170: 38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in Streptococcal Genetics (Hrsg. J. Ferretti und R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32: 1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, Streptococcus].
iv. Hefeexpression
Hefeexpressionssysteme sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt. Ein Hefepromotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription stromabwärts (3') einer codierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Region der Transkriptions-Initiation haben, die üblicherweise in der Nähe des 5'-Endes der codierenden Sequenz plaziert ist. Diese Region der Transkriptions-Initiation umfaßt üblicherweise eine Bindungsstelle für die RNA-Polymerase (die "TATA-Box") und eine Transkriptions-Initiationstelle. Ein Hefepromotor kann auch eine zweite Domäne haben, die stromaufwärts-Aktivatorsequenz (UAS) genannt wird, die, wenn anwesend, üblicherweise distal zum Strukturgen liegt. Die UAS erlaubt die regulierte (induzierbare) Expression. Die konstitutive Expression geschieht in der Abwesenheit von UAS. Die regulierte Expression kann positiv oder negativ sein, womit die Transkription verstärkt oder reduziert wird.
Hefe ist ein fermentierender Organismus mit einem aktiven Metabolismus, deshalb stellen Sequenzen, die Enzyme der metabolischen Wege codieren, besonders nützliche Promotorsequenzen bereit. Beispiele umfassen die Alkoholdehydrogenase (ADH) (EPO Offenlegungsnummer 284 044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglycerat-Mutase und Pyruvat-Kinase (PyK) (EPO Offenlegungsnummer 329 203). Das PHO5-Gen der Hefe, das saure Phosphatase codiert, stellt auch nützliche Promotorsequenzen bereit [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1]
Zusätzlich funktionieren synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, als Hefepromotoren. Zum Beispiel können die UAS-Sequenzen von einem Hefepromotor mit der Transkriptionsaktivierungsregion eines anderen Hefepromotors verknüpft werden, wodurch ein synthetischer Hybridpromotor entsteht. Beispiele für solche Hybridpromotoren umfassen die regulatorische ADH-Sequenz, verknüpft mit der GAP-Transkriptionsaktivierungsregion (U. S. Patente Nr. 4,876,197 und 4,880,734). Andere Beispiele für Hybridpromotoren umfassen Promotoren, die aus den regulatorischen Sequenzen von ADH2-, GAL4-, GAL10- oder PHO5-Gene bestehen, kombiniert mit der Transkriptionsaktivierungsregion eines glycolytischen Enzyms wie GAP oder PyK (EPO Offenlegungsnummer 164 556). Weiterhin kann ein Hefepromotor natürlicherweise vorkommende Promotoren von nicht-Hefe-Ursprung umfassen, die die Fähigkeit haben, an die Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Beispiele für solche Promotoren umfassen unter anderem [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff et. al. (1981) Nature 283: 835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Hrsg. K. N. Timmis und A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11: 163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2: 109;].
Ein DNA-Molekül kann in Hefe intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft sein, in welchem Fall die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein wird, das vom ATG-Startcodon codiert wird. Wenn gewünscht, kann das Methionin am N-Terminus von dem Protein durch in vitro-Inkubation mit Cyanogenbromid abgespalten werden.
Fusionsproteine stellen eine Alternative für Hefeexpressionssyteme dar, wie auch bei Säuger-, Baculovirus- und bakteriellen Expressionsystemen. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen Hefeproteins codiert, oder eines anderen stabilen Proteins, mit dem 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen verknüpft. Bei der Expression wird dieses Konstrukt eine Fusion der zwei Aminosäuresequenzen bereitstellen. Zum Beispiel kann das Superoxid-Dismutase (SOD)-Gen der Hefe oder des Menschen am 5'-Ende eines fremdem Gens verknüpft werden und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verknüpfung der beiden Aminosäuresequenzen kann eine Spaltstelle codieren, oder auch nicht. Vgl. z. B. EPO Offenlegungsnummer 196 056. Ein anders Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin-Region gemacht, die vorzugsweise eine Stelle für ein prozessierendes Enzym enthält (d. h. eine Ubiquitinspezifische prozessierende Protease), um das Ubiquitin von dem fremdem Protein abzuspalten. Mit diesem Verfahren kann daher natives fremdes Protein isoliert werden (vgl. z. B. PCT Offenlegungsnummer WO 88/024066).
In einer anderen Ausführungsform können fremde Proteine auch durch Schaffung von chimären DNA-Molekülen von der Zelle in das Wachstumsmedium sezerniert werden, die ein Fusionsprotein codieren, die ein Leadersequenzfragment umfasst, das die Sekretion des fremden Proteins in Hefe bereitstellt. Vorzugsweise sind zwischen dem Leaderfragment und dem fremdem Gen Prozessierungsstellen codiert, die entweder in vivo oder in vitro abgespalten werden können. Das Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Sekretion des Proteins von der Zelle steuern.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sezernierte Hefeproteine abgeleitet werden, wie das Hefe-Invertasegen (EPO Offenlegungsnummer 012 873; JPO Offenlegungsnummer 62,096,086) und das Gen für A-Faktor (U.S. Patent Nr. 4,588,684). In einer anderen Ausführungsform existieren Leader anderen Ursprungs als Hefe, wie ein Interferon-Leader, die auch die Sekretion in Hefe bereitstellen (EPO Offenlegungsnummer 060 057).
Eine bevorzugte Klasse an Sekretionsleadern sind diejenigen, die ein Fragment des Gens für alpha-Faktor der Hefe verwenden, welches sowohl eine "prä"-Signalsequenz als auch eine "pro"-Region enthält. Die Arten an alpha-Faktor-Fragmenten, die verwendet werden können, umfassen den prä-pro-alpha-Faktor-Leader voller Länge (etwa 83 Aminosäurereste), ebenso wie verkürzte alpha-Faktor-Leader (üblicherweise etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) (U.S. Patente Nr. 4,546,083 und 4,870,008; EPO Offenlegungsnummer 324 274). Zusätzliche Leader, die ein alpha-Faktor-Leaderfragment verwenden, das die Sekretion bereitstellt, umfassen hybride alpha-Faktor-Leader, die mit einer prä-Sequenz einer ersten Hefe und mit einer pro-Region von einem zweiten alpha-Faktor der Hefe gemacht wurden (vgl. z. B. PCT Offenlegungsnummer WO89/02463).
Üblicherweise sind Transkriptions-Terminationssequenzen, die von Hefe erkannt werden, regulatorische Regionen, die 3' vom Translations-Stopcodon liegen und somit zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das von der DNA codierte Polypeptid übersetzt werden kann. Beispiele von Transkriptions-Terminationssequenzen und von anderen, von Hefe erkannten Terminationssequenzen sind diejenigen, die für glycolytische Enzyme codieren.
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, einen Leader (wenn gewünscht), die codierende Sequenz von Interesse und eine Transkription-Terminationssequenz umfassen, in Expressionskonstrukten zusammengebaut. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replicon gehalten, wie ein extrachromosomales Element (z. B. Plasmide), das in der Lage ist, stabil in einem Wirt gehalten werden zu können, wie eine Hefe oder Bakterien. Das Replicon kann zwei Replikationssysteme haben, was somit zuläßt, dass es zum Beispiel in Hefe für die Expression und in einem prokaryontischen Wirt für die Clonierung und Amplifikation gehalten wird. Beispiele solcher Hefe-Bakterien-Shuttlevektoren umfassen YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8: 17–24], pCl/l [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642–4646] und YRp17 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158: 157]. Zusätzlich kann ein Replicon ein Plasmid mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl wird im allgemeinen eine Kopienzahl haben, die von etwa 5 bis etwa 200 reicht, und üblicherweise etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält, wird vorzugsweise mindestens etwa 10 und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide enthalten. Die Einführung eines Vektors mit hoher oder niedriger Kopienzahl kann gewählt werden in Abhängigkeit von der Wirkung des Vektors und des fremdem Proteins im Wirt. Vgl. z. B. Brake et al. vorstehend.
In einer anderen Ausführungsform können die Expressionskonstrukte mit einem Integrationsvektor in das Hefegenom integriert werden. Integrationsvektoren enthalten üblicherweise mindestens eine Sequenz, die zu dem Hefechromosom homolog ist, was dem Vektor die Integration ermöglicht, und enthält vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Die Integration scheint aus Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Hefechromosom zu resultieren [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101: 228–245]. Ein Integrationsvektor kann gegen einen spezifischen Lokus in Hefe gerichtet sein, indem man die geeignete homologe Sequenz zur Einbringung in den Vektor auswählt: Vgl. Orr-Weaver et al. vorstehend. Ein oder mehrere Expressionskonstrukte können integrieren, was möglicherweise die Niveaus an produziertem rekombinantem Protein beeinflußt [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750]. Die in den Vektor eingebauten chromosomalen Sequenzen können entweder als ein einzelnes Segment im Vektor auftreten, was in der Integration des gesamten Vektors resultiert, oder als zwei Segmente, die zu benachbarten Segmenten im Chromosom homolog sind und das Expressionskonstrukt im Vektor flankieren, was in der stabilen Integration nur des Expressionskonstrukts resultieren kann.
Üblicherweise können extrachromosomale und Integrationexpressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, die die Selektion von Hefestämmen zulassen, die transformiert wurden. Selektierbare Marker können biosynthetische Gene umfassen, die in dem Hefewirt exprimiert werden können, wie ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, und das G418-Resistenzgen, was Hefezellen Resistenz gegen Tunicamycin und G418 verleiht. Zusätzlich kann ein geeigneter selektierbarer Marker Hefe auch die Fähigkeit verleihen, in der Gegenwart von toxischen Substanzen wie einem Metall zu wachsen. Zum Beispiel erlaubt die Anwesenheit von CUP1 Hefe in der Gegenwart von Kupferionen zu wachsen [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51: 351].
In einer anderen Ausführungsform können einige der vorstehend beschriebenen Komponenten in Transformationvektoren zusammengebaut werden. Transformationvektoren bestehen üblicherweise aus einem selektierbaren Marker, der entweder in einem Replicon gehalten wird oder zu einem Integrationsvektor entwickelt wird, wie vorstehend beschrieben.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replicons oder Integrationsvektoren, wurden für die Transformation von vielen Hefen entwickelt. Zum Beispiel wurden unter anderem Expressionsvektoren für die folgenden Hefen entwickelt: Candida albicans [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142], Candida maltosa [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141]. Hansenula polymorpha [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302], Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8: 135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141], Pichia pastoris [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; U. S. Patent Nr. 4,837,148 und 4,929,555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163], Schizosaccharomyces pombe [Beach und Nurse (1981) Nature 300: 706] und Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10: 380471 Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10: 49].
Verfahren zur Einbringung von exogener DNA in Hefewirte sind im Stand der Technik wohlbekannt und umfassen üblicherweise entweder die Transformation von Sphäroplasten oder von intakten Hefezellen, die mit Alkalikationen behandelt wurden. Die Transformationsverfahren variieren üblicherweise mit der zu transformierenden Hefeart. Vgl. z. B. [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302 ; Hansenula]; [Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; U. S. Patent Nr. 4,873,148 und 4,929,555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163; Saccaromyces]; [Beach und Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces]; [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].
Nucleinsäuretests
Polynucleotidsonden von etwa 8 Nucleotiden oder mehr können hergestellt werden, die mit dem positiven Strang/den positiven Strängen der RNA oder ihrem komplementären Strang hybridisieren, ebenso wie mit cDNAs. Diese Polynucleotide dienen als Sonde für den Nachweis, die Isolierung und/oder Markierung von Polynucleotiden, die Nucleotidsequenzen enthalten, und/oder als Primer für die Transkription und/oder Replikation der gesuchten Sequenzen. Jede Sonde enthält eine Suchpolynucleotidsequenz, die aus Nucleotiden besteht, die komplementär zu einer Zielnucleotidsequenz sind; die Sequenz ist von ausreichender Länge und Komplementarität mit der Sequenz, um einen Duplex zu bilden, der für den beabsichtigten Zweck ausreichende Stabilität hat. Wenn zum Beispiel der Zweck die Isolierung eines Analyten, der eine Zielsequenz enthält, mittels Immobilisierung ist, werden die Sonden eine Polynucleotidregion enthalten, die von ausreichender Länge und Komplementarität mit der gesuchten Sequenz ist, um ausreichende Duplexstabilität zu verleihen, um den Analyten unter den Isolierungsbedingungen auf einer festen Oberfläche zu immobilisieren. Wenn die Polynucleotidsonden zum Beispiel auch als Primer für die Transkription und/oder Replikation von Zielsequenzen dienen sollen, werden die Sonden eine Polynucleotidregion enthalten, die von ausreichender Länge und Komplementarität mit der gesuchten Sequenz ist, um die Replikation zuzulassen. Wenn die Polynucleotidsonden zum Beispiel auch als Markiersonden verwendet werden sollen, oder an Multimere binden sollen, wäre die suchende Polynucleotidregion von ausreichender Länge und Komplementarität, um mit den Markiersonden und/oder Multimeren stabile hybride Duplexstrukturen zu bilden, um einen Nachweis des Duplex zuzulassen. Die Sonden können mindestens 4 aufeinanderfolgende Nucleotide enthalten, die komplementär mit der gesuchten Sequenz sind; üblicherweise werden die Oligomeren mindestens etwa 8 aufeinanderfolgende Nucleotide enthalten, die komplementär zu der gesuchten Sequenz sind; und vorzugsweise werden sie mindestens etwa 14 aufeinanderfolgende Nucleotide enthalten, die komplementär zu der gesuchten Sequenz sind.
Die Sonden müssen jedoch nicht nur aus der Sequenz bestehen, die komplementär zu der gesuchten Sequenz ist. Sie können zusätzliche Nucleotidsequenzen oder andre Gruppen enthalten. Wenn zum Beispiel die Sonden als Primer für die Amplifikation von Sequenzen mittels PCR verwendet werden sollen, können sie Sequenzen enthalten, die, wenn im Duplex, Restriktionsenzymstellen bilden, die die Clonierung der amplifizierten Sequenzen erleichtern. Wenn zum Beispiel die Sonden auch als "Capture-Sonden" in Hybridisierungstests verwendet werden sollen, werden sie an einen "Bindungspartner" gebunden sein, wie vorstehend definiert. Die Herstellung der Sonden geschieht mittels Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich zum Beispiel Verfahren, die Ausschneiden, Transkription oder chemische Synthese umfassen.
Immundiagnostische Tests
In Immuntests können Antigene verwendet werden, um Antikörperniveaus nachzuweisen (oder umgekehrt können Antikörper verwendet werden, um Antigenniveaus nachzuweisen) und es kann eine Korrelation mit einer Krankheit gemacht werden. Immuntests, die auf gut definierten rekombinanten Antigenen basieren, können entwickelt werden, um die invasiven diagnostischen Verfahren zu ersetzen, die heute verwendet werden. Antikörper gegen Proteine in biologischen Proben, einschließlich zum Beispiel Blut- oder Serumproben, können nachgewiesen werden. Die Planung von Immuntests unterliegt einer großen Variation, und eine Reihe davon sind im Stand der Technik bekannt. Protokolle für Immuntests können zum Beispiel auf Kompetition beruhen, oder direkter Bindung oder auf einer Art Sandwich-Test. Protokolle können zum Beispiel auch feste Träger verwenden oder können vermittels Immunpräzipitation sein. Die meisten Tests umfassen die Verwendung von markiertem Antikörper oder Polypeptid; die Markierungen könne zum Beispiel fluoreszierend, chemilumineszierend, radioaktiv oder Farbstoffmoleküle sein. Tests, die die Signale von der Sonde verstärken, sind auch bekannt; Beispiele dafür sind Tests unter Verwendung von Biotin und Avidin und Enzym-markierte und vermittelte Immuntests, wie ELISA-Tests.
Kits, die geeignet für die Immundiagnose sind und die die entsprechenden markierten Reagentien enthalten, werden durch Verpacken der entsprechenden Materialien, einschließlich der Zusammensetzungen der Erfindung, in geeigneten Behältnissen konstruiert, zusammen mit den restlichen Reagentien und Materialien (zum Beispiel geeignete Puffer, Salzlösungen usw.), die zur Durchführung des Tests erforderlich sind, ebenso wie geeignete Anweisungen für den Test.
Impfstoffe
Impfstoffe können entweder prophylaktisch (um die Infektion zu verhindern) oder therapeutisch (um die Krankheit nach der Infektion zu behandeln) sein.
Solche Impfstoffe umfassen Antigen oder Antigene, üblicherweise in Kombination mit "pharmazeutisch verträglichen Trägern", welche jeden Träger umfassen, der nicht selbst die Produktion von Antikörpern induziert, die für das Individuum schädlich sind, das die Zusammensetzung erhält. Geeignete Träger sind üblicherweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere, Lipidaggregate (wie Öltröpfchen oder Liposomen) und inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Zusätzlich können solche Träger als immunstimulierende Mittel ("Adjuvantien") fungieren. Darüber hinaus kann das Antigen mit einem bakteriellen Toxoid konjugiert sein, wie das Toxoid der Pathogene von Diphtherie, Tetanus, Cholera, H. Pylori usw.
Bevorzugte Adjuvantien zur Erhöhung der Wirksamkeit der Zusammensetzung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: (1) Aluminiumsalze (alum) wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat usw.; (2) Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierungen (mit oder ohne andere spezifische immunstimulierende Mittel wie Muramylpeptiden (siehe nachstehend) oder Bakterienzellwandkomponenten), wie zum Beispiel (a) MF59 (PCT Offenlegungsnummer WO 90/14837), das 5% Squalen, 0,5% Tween 80 und 0,5% Span 85 (ggf. verschiedene Mengen an MTP-PE (siehe nachstehend) enthaltend, aber nicht erforderlich), unter Verwendung eines Microfluidizers wie dem Modell 110Y Microfluidizer (Microfluidics, Newton, MA) in Submicron-Partikel formuliert, (b) SAF, das 10% Squalen, 0,4% Tween 80,5% pluronisch geblocktes Polymer L121 und thr-MDP (siehe nachstehend) enthält, entweder in einer Submicron-Emulsion microfluid gemacht oder mit einer Vortex behandelt, um eine Emulsion mit größeren Partikeln zu erzeugen, und (c) das Ribi^TM-Adjuvans-System (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), das 2% Squalen, 0,2% Tween 80 und eine oder mehr Bakterienzellwandkomponenten aus der Gruppe enthält, die aus Monophosphorylipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM) und Zellwandskelett (CWS) besteht, vorzugsweise MPL + CWS (Detox^TM); (3) Saponin-Adjuvantien wie Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) können verwendet werden oder daraus hergestellte Partikel wie ISCOMs (immunstimulierende Komplexe); (4) Vollständiges Freunds Adjuvans (CFA) oder Unvollständiges Freunds Adjuvans (IFA); (5) Cytokine wie Interleukine (IL-1, IL-2 usw.), Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF), Tumor-Nekrosis-Faktor (TNF) usw.; und (6) andere Substanzen, die als immunstimulierende Mittel wirken, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu erhöhen. Alum und MF59 sind bevorzugt.
Wie vorstehend erwähnt, umfassen Muramylpeptide, sind aber nicht beschränkt auf, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE), usw.
Die immunogenen Zusammensetzungen (z. B. das Antigen, der pharmazeutische verträgliche Träger und das Adjuvans) werden typischerweise Verdünnungsmittel enthalten, wie Wasser, Salzlösung, Glycerin, Ethanol, usw. Zusätzlich können Hilfssubstanzen wie Feuchtigkeits-oder emulgierende Mittel, pH-Puffersubstanzen und dergleichen in solchen Vehikeln anwesend sein.
Typischerweise werden die immunogenen Zusammensetzungen als injizierbare Mittel hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, geeignet für die Lösung in, oder die Suspension in, flüssigen Trägern vor der Injektion können auch hergestellt werden. Die Herstellungen können für eine erhöhte Adjuvanswirkung auch in Liposomen emulgiert oder verkapselt werden, wie vorstehend unter pharmazeutisch verträglichen Trägern diskutiert.
Immunogene Zusammensetzungen, die als Impfstoffe verwendet werden, umfassen eine immunologisch wirksame Menge der antigenen Polypeptide, ebenso wie jede andere der vorstehend erwähnten Komponenetn, wenn erforderlich. Mit "immunologisch wirksamer Menge" ist gemeint, dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum, entweder in einer einzelnen Dosis oder als Teil einer Serie, für die Behandlung oder Prophylaxe wirksam ist. Diese Menge variiert in Abhängigkeit von der Gesundheit und des physischen Zustands des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z. B. nicht-menschlicher Primat, Primat usw.), der Kapazität des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, dem erwünschten Maß an Schutz, der Formulierung des Impfstoffs, der Einschätzung der medizinischen Situation durch den behandelnden Arzt, und anderer relevanter Faktoren. Es ist zu erwarten, das die Menge in einem relativ breiten Bereich liegen wird, der durch Routineversuche bestimmt werden kann.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden üblicherweise parenteral verabreicht, d. h. durch subkutane oder intramuskuläre Injektion. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Verabreichungswege geeignet sind, umfassen orale und lungengängige Formulierungen, Zäpfchen und transdermale Verabreichungen. Das Dosierungsschema kann ein Einzeldosisschema oder ein Mehrfachdosisschema sein. Der Impfstoffe kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A zeigt einen Teil eines mit Silber gefärbten Gels, das Chlamydien-EB-Proteine mit einem M_r zwischen 25.000 und 40.000 zeigt und pI-Werten zwischen 4 und 5 (nicht linearer pH-Gradient). EBs. Der Pfeil zeigt den Fleck, der für die N-terminale Aminosäuresequenzierung eluiert wurde.
1B zeigt einen Teil eines Immunblots der links gezeigten Kartenregion, der mit einem pgp3-spezifischen Kaninchenserum entwickelt wurde.
2 zeigt mit Coomassie-Blau gefärbte Gele nach einer SDS-PAGE nach Expression von r-pgp3 in E. coli BL21 (DE3) und Reinigung. Spur A: Größenmarker. Spuren B, C: Pellet (B)- und Überstand (C)-Fraktionen von pgp3 exprimierenden E. coli-Zellen nach Behandlung mit Polymyxin B und Zentrifugation. Spuren D, E: Pellet (D)- und Überstand (E)-Proben von periplasmatischen Fraktionen (wie in Spur C) nach Dialyse gegen Piperazin-HCL-Puffer, pH 5,4 und Zentrifugation. Spur F: vereinte Peakfraktionen nach Ionenaustauscherchromatographie.
3 zeigt die Immunblotanalyse von menschlichen Seren mit gereinigtem r-pgp3. Es werden typische positive und negative Ergebnisse gezeigt (A und C). Immunblots mit rohen E. coli-Extrakten sind auch gezeigt (B und D): diese ergaben variable Muster der Reaktivität der E. coli-Antigene, sie dienten zur Patientenidentifikation und als positive Kontrolle für negative Proben. Blots A und B: Serum eines Patienten, der von Salpingitis betroffen und MIF-positiv für C. trachomatis ist. Die ELISA-Antwort dieses Serums ist in 4C gezeigt (Kurve mit der unmittelbaren Antwort). Blots C und D: Serum von einem gesunden Blutspender, MIF-negativ für C. trachomatis. Dieses Serum wurde in der vorliegenden Studie als negative ELISA-Kontrolle verwendet.
4(i) ist eine graphische Darstellung, die die Reaktion zwischen an Plastik gebundenem rekombinantem pgp3-Protein der vorliegenden Endung und verschiedenen menschlichen Seren zeigt. Die Seren C, A und 3 waren von Frauen mit Salpingitis. Serum B war von einem Mann mit bei der Isolierung positiver Chlamydien-Urethritis und Serum 13 war von einem gesunden Blutspender.
4(ii) zeigt typische positive und negative pgp3-ELISA-Ergebnisse. Halblogarithmische Auftragung der OD-Ergebnisse (jeder Punkt ist der Mittelwert von doppelten Proben) gegen 2-fache Verdünnungen der Seren, beginnend mit 1/100. A: zehn Seren von gesunden Blutspender, die negative MIF-Ergebnisse mit gereinigten Chlamydien-EBs von allen drei Arten zeigten und im Immunblot nicht mit r-pgp3 reagierten. Die obere Kurve (gepunktete Vierecke) wurde von einem positiven Kontrollserum gezeigt (Immunblot-positiv, MIF-positiv) das auf derselben Mikrotiterplatte getestet wurde. B: zehn Seren von Patienten mit einer C. pneumoniae-Infektion (MIF >512). Die obere Kurve (offene Vierecke) ist die positive Kontrolle. Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denjenigen, die mit gesunden Individuen in A erhalten wurden. C: positive pgp3-ELISA-Ergebnisse, die mit 10 von 46 untersuchten Salpingitis-Seren erhalten wurden; positive und negative Kontrollseren (obere und untere Kurven) sind eingeschlossen. D: 5 negative (Kurven mit OD <0,25) und 2 positive pgp3-ELISA-Ergebnisse (volle Rhomben und Dreiecke), die mit 7 von 40 untersuchten männlichen Urethritis-Seren erhalten wurden. Eine positive (gepunktete Vierecke) und eine negative (offene Dreiecke) Kontrolle sind ebenfalls gezeigt.
5 zeigt die Verbreitung von anti-pgp3-IgGs in menschlichen Seren und den Vergleich mit der Verbreitung von anti-EB-Oberflächen-IgGs (MIF). Oberer Teil: mit einer Gruppe von 40 männlichen Urethritis-Seren (NGU) erhaltene Ergebnisse. Mittlerer Teil: mit 46 Salpingitis-Seren erhaltene Ergebnisse. Der Einfachheit halber wurde in dieser Darstellung der allgemeinere Ausdruck PID (für entzündliche Erkrankung des Beckens) verwendet. Unterer Teil: Zusammenfassung aller Ergebnisse, einschließlich derer von 10 C. pneumoniae-positiven Seren, 50 gesunden Blutspenderseren und von Resultaten, die von einer Gruppe von 24 Seren von Frauen mit verschiedenen Symptomen von Genitaltraktinfektionen oder sekundärer Sterilität erhalten wurde.
Detaillierte Beschreibung von Ausführungsformen
Die hier dargestellten Beispiele werden als weitere Anleitung für den Praktiker und Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bereitgestellt und sollten nicht als Einschränkung der Erfindung in irgendeiner Weise ausgelegt werden.
Produktion von rekombinantem pgp3 in E. coli.
ORF3-DNA (pCT-Segment von by 4054 bis by 5013, gemäß Ref. 3) wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (22) unter Verwendung von 10 ng von Plasmid pUC8-pCTD (3) als Matrize und 20 p-Molen von jedem der folgenden Primer erhalten:
Taq-DNA-Polymerase und der GeneAmp-Kit (Perkin-Elmer) wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Die Primer wurden mit NdeI- und PstI-Restriktionsstellen (kleingeschriebene Buchstaben in den vorstehenden Sequenzen) an ihren 5'-Enden geplant, um die amplifizierten DNA-Fragmente in die entsprechenden Stellen des Expressionsplasmidvektors pT7-7 (29, 30, 35) zu dirigieren. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung von Centricon-Kartuschen gereinigt, mit NdeI-/PstI-Endonucleasen (Boehringer) verdaut und in pT7-7 ligiert. Das Ligierungs-Reaktionsgemisch wurde verwendet, um den E. coli-Stamm DHS (7) zu transformieren, der dann auf LB-Agar (23) ausplattiert wurde, der 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Die Kolonien wurden mittels Hybridisierung mit ORF3-spezifischen synthetischen Oligonucleotiden, die am Ende mit ³²P markiert waren (23), auf die Anwesenheit der ORF3-Insertion durchmustert. Die DNA von positiven Kolonien wurde dann verwendet, um E. coli BL21 (DE3)-kompetente Zellen (29, 30) zu transformieren, die zunächst auf Ampicillin-LB-Agarplatten (23) selektiert wurden und dann mittels ihrer Fähigkeit, das rekombinante Protein zu exprimieren.
Bakterien von positiven Kolonien wurden übernacht in 10 ml LB-Medium wachsen gelassen, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Die Übernachtkulturen wurde mit frischem LB-Medium ohne Ampicillin verdünnt (1 : 200) und bei 37°C bis zu einer O.D.₅₉₀ = 0,6 wachsen gelassen. Da die Expression in dem pT7-7BL21 (DE3)-System unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotors ist, wurde die Expression von ORF3 durch Zugabe von 0,4 mM IPTG zum Medium und weitere 2,5 Stunden Inkubation unter heftigem Schütteln erreicht. Bakterienzellen, die durch Zentrifugation gewonnen wurden, wurden in 1/20 des ursprünglichen Volumens an 25% Sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 8, resuspendiert, das 1 mg/ml an Polymyxin B-Sulfat (Sigma Chemicals) (18) enthielt, und 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation (10 Min. in einer Eppendorf-Zentrifuge) wurde das meiste r-pgp3 im Überstand gefunden (periplasmatische Fraktion). Die Unversehrtheit der Bakterienzellen wurde überprüft, indem sichergestellt wurde, dass die cytoplasmatische beta-Galactosidase-Aktivität (14) vollständig im Pellet verblieb.
r-pgp3 wurde mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von 12,5% Polyacrylamid, 1% SDS-Gelen (SDS/PAGE) gemäß Laemmli (12) nachgewiesen. Die Gele wurden mit Coomassiebrilliantblau (0,05% Gew./Vol.) in 10% (Vol./Vol.) Essigsäure, 30% (Vol./Vol.) Methanol gefärbt. Eine Immunblot-Analyse (31) wurde, wie beschrieben, mit einem pgp3-spezifischen Kaninchenserum durchgeführt (3). Ein Expressions-kompetenter E. coli-Clon wurde schließlich für die weitere Arbeit selektiert. Das rekombinante pT7-7-Konstrukt, das dieser Clon enthielt, wurde durch Sequenzierung unter Verwendung des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens (25) und des Sequenase-Kits (US Biochemicals) überprüft und war die gesamte ORF3-DNA-Insertion, die identisch war zu der Sequenz, die ursprünglich für ORF3 beschrieben wurde.
Reinigung von rekombinantem pgp3
Rohe periplasmatische Fraktionen wurden wie vorstehend beschrieben aus 40 ml oder 200 ml Bakterienkultur erhalten und gegen 30 mM Piperazin-HCl, pH 5,4, dialysiert. Dies verursachte reichliche Proteinfällung, aber r-pgp3 blieb in Lösung. Eine weitere Reinigung wurde durch Ionenaustauscherchromatographie auf vorgepackten Mono-Q-Säulen (Pharmacia) in demselben Piperazin-HCl-Puffer erhalten. Die selektive Elution wurde mit einem NaCl-Konzentrationsgradienten von 0 bis 1M erreicht. Es wurde ein FPLC-Gerät (Pharmacia) verwendet. Bei einem typischen Lauf wurden insgesamt 4 mg Protein aufgetragen und es wurden 1 ml-Fraktionen gesammelt und mittels SDS/PAGE analysiert, gefolgt von Coomassieblau-Färbung und Immunblot-Analyse, wie vorstehend beschrieben. Peakfraktionen, die gereinigtes pgp3 enthielten, wurden vereint und gegen steriles PBS (10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 15 mM NaCl) dialysiert. Die Reinheit von pgp3 wurde durch eine Bestimmung des gesamten Proteins (Biorad Proteintest) und PAGE zusammen mit Proteinstandards (steigende Mengen an titrierter Rinderserumalbuminlösung), gefolgt von Coomassieblau-Färbung und Photodensimetrie-Messungen unter Verwendung eines Ultroscan XL Densitometers (LKB) auf >90% abgeschätzt.
Zweidimensionale Elektrophorese-Anayse von EB-Proteinen.
Herstellungen großen Umfangs von elementaren Körpern von C. trachomatis L2/343Bu (EB) wurden aus Vero-Zellkulturen in Rollerflaschen gemäß beschriebener Verfahren (1) erhalten. EBs wurden mittels zweier Zyklen Dichtegradientenzentrifugation (1) und bei –20°C für die anschließende Elektrophorese-Analyse aufbewahrt.
Eine zweidimensionale Gelelektrophorese wurde unter Verwendung des Immobiline/Polyacrylamid-Systems durchgeführt, im Wesentlichen wie von Hochstrasser et al. (1988) und Hughes et al. (1992) beschrieben. Etwa 45 μg (analytischer Lauf) oder 1 mg (präparativer Lauf) an EB-Protein insgesamt wurden für jeden Lauf verwendet. EBs wurden durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert und in 8 M Harnstoff, 4% CHAPS (3-[(3 Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1-propansulfonat), 40 mM Tris-Base, 65 mM Dithioerythritol (DTE) und Spurenmengen an Bromphenolblau resuspendiert. Die erste Dimension wurde auf Immobilin-Streifen durchgeführt, die einen nicht linearen pH-Gradienten bereitstellten (IPG-Streifen, Pharmacia), der von pH-Wert 3 bis 10 reichte. Die Spannung wurde während der ersten drei Stunden linear von 300 auf 3500 V erhöht und dann 22 Stunden bei 5000 V stabilisiert (insgesamtes Volt.Stunde-Produkt 110 kVh). Nach der Elektrophorese wurden die IPG-Streifen 12 Min. gegen 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 2% SDS, 0,05 M Tris.HCl, pH 6,8, 2% DTE äquilibriert und anschließend 5 Min. in derselben Harnstoff/SDS/Tris-Pufferlösung, aber unter Ersatz der 2% DTE durch 2,5% Jodacetamid. Die zweite Dimension wurde auf 9–16% linearen Polyacrylamid-Gradientengelen (18 cm × 20 cm × 1,5 mm) bei konstantem Strom von 40 mA/Gel für etwa 5 Std. durchgeführt, bis die Farbfront das Ende des Gels erreichte. Analytische Gele wurden mit ammonischem Silbernitrat gefärbt, wie beschrieben (9, 17).
Der pH-Gradient wurde mit carbamylierter Creatinkinase (CPK-Standard, B. D. H.) verfolgt und am nicht linearen sauren Ende gemäß der internen EP-Protein-Referenzflecken korrigiert, die mittels Immunblotting mit monoclonalen Antikörpern identifiziert wurden, die für bekannte Chlamydien-Proteine spezifisch sind (eine Gabe von G. Christiansen und S. Birkelund).
N-terminale Sequenzierung des nativen Chlamydien-Antigens von 28 kDa.
Für die Bestimmung der N-terminalen Primärstruktur wurden Proteinflecken von den Gelen auf Polyvinylidendifluorid-Membranen (BioRad PVDF-Membranen 20 × 20 cm, 0,2 Mikron Porengröße) gemäß Matsudaira (1987) elektroeluiert. Die Flecken wurden mit 0,1% (Gew./Vol.) Coomassiebrilliantblau R250 in 50% wäßrigem Methanol 5 Minuten gefärbt und in 40% Methanol, 10% Essigsäure entfärbt. Die Membranen wurden bei 37°C getrocknet (24) und für die weitere Analyse bei –20°C aufbewahrt. Die Membranenfläche, die den hauptsächlichen pgp3-Proteinfleck enthielt, wurde aus den 5 identischen Blots ausgeschnitten und das vereinte Material wurde unter Verwendung eines automatischen Protein-/Peptid-Sequenziergeräts (Mod. 470A; Applied Biosystems Inc.), das online mit einem Phenylthiohydantoin-Aminosäureanalysegerät Modell 120A und einem Kontroll/Daten-Modul Modell900A (Applied Biosystems Inc.) verbunden war, dem Edman-Abbau unterworfen.
Enzym verknüpfter Immuntest
Das gereinigte pgp3-Antigen wurde verwendet, um einen Enzym-verknüpften Immunabsorbierenden Test (ELISA) herzustellen. 200 ng Protein wurden an Plastikmulden von Maxisorb Mikrotiterplatten (NUNC) in 100 μl Beschichtungspuffer (PBS, pH 8,0, 0,005% Tween 20, 0,02% NaN₃) absorbiert, zunächst 2 Stunden bei 37°C und dann übernacht bei 4°C. Nach Waschen mit dem Beschichtungspuffer wurden die Mulden mit 200 μl 2,7% Polyvinylpyyrolidon 2 Stunden gesättigt und erneut gewaschen. 100 μl der Serumproben, falls erforderlich mit Beschichtungspuffer verdünnt, wurden zu den einzelnen Mulden zugegeben und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach wiederholtem Waschen wurden gebundene Serum- Antikörper durch 2 Stunden Inkubation bei 37°C mit mit alkalischer Phosphatase markiertem anti-Kaninchen- oder anti-Mensch-IgG-Antikörper (Cappel), 1 : 5000 verdünnt mit Beschichtungspuffer, nachgewiesen. Für den colorimetrischen Nachweis der Enzymaktivität wurden ELISA-Substrat und Puffer (Sclavo Diagnostic srl) verwendet, wie von dem Hersteller empfohlen. Messungen der optischen Dichte wurden mit einem Multiscan MCC Densitometer (Titertek) nach einer Stunde Farbentwicklung durchgeführt.
Mikroimmunfluoreszenz
Zweifache Verdünnungen von Seren wurden durch Einzelgen-Mikroimmunfluoreszenz (MIF) (33) unter Verwendung von mittels Sucrosegradienten gereinigten EBs von C. trachomatis L2/434/Bu und Serotyp D-Stamm Go/86, C. psittaci 6BC und A22, und C. pneumoniae IOL-207 titriert. Fluorescein-konjugierte Kaninchen-anti-Mensch IgGs (Dako) wurden für den Nachweis mit einem UV-Mikroskop (Zeiss) verwendet. Seren, bei denen eine mögliche Kreuzreaktion zwischen C. trachomatis – und C. pneumoniae-Antikörpern vermutet wurde, wurden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits noch einmal überprüft, der zwischen der Antwort auf C. trachomatis und C. pneumoniae unterscheidet (Immunocomb, PBS Orgenics, Israel). In diesem Fall wurden die Titer aus der Messung bei einer einzigen Verdünnung (1 : 200) gemäß den Empfehlungen des Herstellers abgeleitet.
Klinische Proben
Seren von Patienten, die sich einer laparoskopischen Untersuchung wegen vermuteter Salpingitis unterzogen hatten, wurden am Centre Hospitalo-Universitaire, University of Picardie, Amiens, Frankreich gesammelt. Andere Seren wurden von Frauen erhalten, die das Laboratoire Departemental de 1a Somme, Amiens, wegen Symptomen einer Infektion des Genitaltrakts besuchten. Eine dritte Gruppe an Seren wurde aus der Sammlung der Biobanque de Picardie, Amiens, ausgewählt; diese umfaßte Seren von gesunden seronegativen Individuen, die Gruppe von C. pneumoniae positiven Seren und Seren von Freiwilligen, die akzeptierten, sich der periodischen klinischen Untersuchung am Centre de Prevention et d'examen de Sante d'Amiens zu unterziehen. Alle vorstehenden Seren wurden in Harzröhrchen von 200 Mikroliter aufgeteilt und bei –80°C bei der Biobanque de Picardie aufbewahrt. Seren von gesunden Blutspendern und von Männern mit Urethritis wurden von Patienten, die die STD-Klinik des St Orsola Hospital, Bologna aufsuchten, vom Instiut für Mikrobiologie, Universität Bologna, Bologna, Italien, gesammelt. Für die männlichen Patienten mit Urethritis wurde der Ausschluß einer Gonokokken-Infektion und die Isolierung von C. trachomatis von Harnröhrenabstrichen (positiv in 50% der Fälle), wie zuvor beschrieben (19), durchgeführt.
Identifikation von nativem pgp3
Elemantare Körper von C. trachomatis L2/434/Bu wurden Vero-Zellkulturen wachsen gelassen und mit zwei Zyklen Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Teilmengen dieser Präparation (insgesamt 45 μg oder 1 mg an Protein für analytische oder präparative Läufe) wurden in Harnstoff/CHAPS/Tris/DTE-Lösung aufgelöst und durch Elektrophorese auf IPG Immobiline-Streifen nach ihrer Ladung fraktioniert. Nach dem Erreichen des isoelektrischen Gleichgewichts wurden die IPG-Streifen mit einem neuen Puffer äquilibriert, mit 2,5% gepuffertem Jodacetamid behandelt und für die Proteintrennung entsprechend der Größe auf 18 × 20 cm Polyacrylamidgele geladen. Zwei Gele wurden unter identischen Bedingungen geladen (ursprüngliche Beladung von insgesamt 0,05 mg EB-Protein): das erste wurde mit Silber gefärbt und das zweite wurde mittels Elektroblotting auf eine Cellulosenitratmembran übertragen und mit pgp3-spezifischem Kaninchenserum hybridisiert. Das mit Silber gefärbte Gel zeigte ein Muster von >500 einzelnen Flecken im Bereich 10–150 kDa und pI = 3,5–9. Die Immunblot-Analyse der EB-Proteinkarte zeigte, dass nur zwei Flecken durch das anti-pgp3-Serum erkannt wurden: ein größerer mit Koordinaten, die M_r=28.000 und pI = 4,6 entspricht und ein kleinerer mit ähnlichem M_T, aber zur sauren Seite der Karte verschoben (1B). Dieser kleinere Fleck wurde nicht weiter untersucht, die Anwesenheit von einem oder mehreren Satellitenspots ("Ladungszüge") mit demselben Molekulargewicht, abnehmender Intensität und zunehmender negativer Ladung neben einer Hauptproteinart ist jedoch ein typisches Muster, das oft in zweidimensionalen Elektrophoresekarten beobachtet wird. Diese Muster entstehen üblicherweise fortschreitende Desamidierung von Asn- oder Gln-Resten was die entsprechenden negativ geladenen sauren Reste ergibt. Durch Zusammenführen der Immunblots mit dem Silber-gefärbten Gel wurde das immunreaktive Protein von 28 kDa auf der Karte identifiziert (1A).
Um dieses Protein für die weitere Analyse zu reinigen, wurden 5 mg von gesamtem EB-Protein mittels zweidimensionaler Elektrophorese auf fünf identischen Gelen getrennt (1 mg Gesamtprotein/Gel) und mittels Elektroblotting auf Polyvinylidenmembranen übertragen. Diese wurden dann mit Coomassieblau leicht gefärbt und der große immunreaktive Proteinfleck von 28 kDa auf jedem Blot wurde durch Mustervergleich mit der Silber-gefärbten Proteinkarte lokalisiert und sorgfältig ausgeschnitten. Das Protein von den sechs Flecken wurde für die Aminosäuresequenzanalyse vereint. Die ersten 10 N-terminalen Reste dieses Proteins konnten klar in der folgenden Sequenz identifiziert werden: Gly-Asn-Ser-Gly-Phe-Leu-Leu-Tyr-Asn. Diese Sequenz ist identisch zu der zuvor vom ORF3 (2, 3) vorhergesagten, außer eines Met-Restes am Anfang, der aus der Übersetzung des ersten ATG-Codon abzuleiten ist, in dem aus den EBs gereinigten Protein aber nicht anwesend ist.
Expression von ORF3 in E. coli und Reinigung von rekombinantem pgp3
ORF3-DNA wurde in den Plasmidvektor pT7-7 cloniert und unter der Kontrolle eines T7-Bakteriophagenpromotors, der indirekt durch Zugabe von IPTG zum Medium aktiviert werden kann, in E. coli BL21-Zellen exprimiert. Von Extrakten von einem ausgewählten E. coli BL21-Clon wurde mittels PAGE-Analyse gezeigt, dass sie große Mengen an rekombinantem pgp3 (r-pgp3) produzieren. Es wurde auch beobachtet, dass ein großer Teil des r-pgp3 in der periplasmatischen Fraktion vorhanden war, die entweder durch kontrollierte Behandlung der Bakterien mit Polymyxin B (Ref. 18; 2: B und C) oder durch osmotischen Schock erhalten wurde (Ref. 6; Ergebnisse nicht gezeigt). Da periplasmatische Extrakte eine reduzierte Proteinkomplexität hatten, wurden Überstände als Ausgangsmaterial für die weiter r-pgp3-Reinigung verwendet, die durch Zentrifugation von mit Polymyxin B behandelten BL21-Zellen erhalten wurden (2C). Vorläufige Tests zeigten, dass die Ionenaustauscher-Chromatographie an Mono-Q-Säulen (Pharmacia) ein effektives Reinigungsverfahren sein könnte. Vor der Aufbringung auf Mono-Q-Säulen wurden die Bakterienextrakte gegen Piperazin-HCl-Puffer, pH 5,4, dialysiert. Währen der Dialyse bildeten mehrer Proteinarten einen Niederschlag, der durch Zentrifugation entfernt wurde, während r-pgp3 in Lösung blieb (2: D und E). Die Chromatographie der dialysierten Extrakte wurde in demselben Piperazin-HCl-Puffer, pH 5,4, durchgeführt und die Elution erfolgte mit einem NaCl-Konzentrationsgradienten. Das meiste r-pgp3 wurde in einem Hauptpeak mit einer Reinheit von >90% gewonnen, beurteilt mittels PAGE, Coomassieblau-Färbung und Photodensitometry (2F). Einige kleinere Banden im Bereich 80–90kDa wurden gemeinsam mit r-pgp3 gereinigt. Da die Western Blot- und ELISA-Ergebnisse zeigten, dass diese Verunreinigungen keinen merklichen Untergrund im Test mit menschlichen Seren ergaben, wurde keine weitere Reinigung versucht.
Spezifischer Nachweis von anti-pgp3-Antikörpern mittels ELISA
Gereinigtes r-pgp3 wurde ursprünglich auf seine Fähigkeit getestet, an Mulden von NUNC Mikrotiterplatten zu binden. Es wurde gefunden, dass die einfache Imkubation in PBS-0,05% Tween zufriedenstellend war. Kaninchenseren, die entweder gegen das Fusionsprotein von 39 kDa oder das hier beschriebene r-pgp3 von 28 kDa erzeugt worden waren, wurden ursprünglich verwendet, um den Test aufzubauen. Verschiedene Mengen (500 ng bis 50 ng) an gereinigtem Antigen in jeder Mulde wurden gegen die anti-pgp3-Kaninchenseren getestet und die Menge von 200 ng/Mulde wurde schließlich als Standardtestbedingung gewählt. Um zu testen, ob normale menschliche Serumkomponenten mit dem Nachweis der anti-pgp3-Antikörper interferieren, wurde der pgp3-ELISA mit ausgewählten Gruppen von menschlichen Seren getestet, die zuvor auf die Anwesenheit/Abwesenheit von anti-Chlamydien-Antikörpern (IgGs) mittels MIF und auf anti-pgp3-IgGs mittels Immunblotanalyse mit gereinigten r-pgp3-Präparationen analysiert wurden.
Experiment 1
In einem ersten Experimentwurde ein Satz an 21 menschlichen Seren verwendet, um die Leistungsfähigkeit des ELISA mit klinischen Proben zu testen. Alle Seren ergaben ein negatives MIF-Ergebnis mit C. psitacci und C. pneumoniae. Wenn sie unter Verwendung von gereinigten L2-Serotyp EBs auf C. trachomatis -Antikörper getestet wurden, wurde 15 Seren als MIF-negativ eingestuft und 6 positiv, wobei die Titer zwischen 1 : 32 und 1 : 256 lagen. Diese Seren wurden auch auf ihre Fähigkeit getestet, mit den gereinigten pgp3-Präparationen bei Western Blots zu reagieren: alle MIF-negativen Seren ergaben negative Ergebnisse, während die MIF-positiven Seren in verschiedenem Maße nur mit der Bande von 28 kDa reagierten.
Die zweifachen seriellen Verdünnungen der Seren wurden mit doppelten Proben mit dem pgp3-ELISA getestet. Nach 30 Min., 1 Std und Lagerung übernacht in der Kälte (–20°C) wurden OD-Messungen vorgenommen. Alle 15 negativen Seren ergaben einheitlich niedrige OD-Werte (unter 0,1), während die 6 positiven Seren eindeutig höhere OD-Werte, die mit der Serumkonzentration in der Probe proportional abnahmen. Die [OD vs. Verdünnung]-Kurven der bisher getesteten positiven Seren korrelierten mit den MIF-Titern.
Die Ergebnisse der verschiedenen reagierenden menschlichen Seren bei Verdünnungen von 200- bis 6800-fach mit dem an Plastik gebundenen rekombinanten pgp3-Protein sind graphisch in der 4(i) dargestellt.
OD-Werte sind Mittelwerte von doppelten Proben. Die MIF-Titer von C. trachomatis der Seren (von oben nach unten) waren 1 : 256; 1 : 128; 1 : 128; 1 : 132; null. Die Seren C, A und 3 waren von Frauen mit Salpingitis; das Serum B war von einem Mann mit bei der Isolierung positiver Chlamydien-Urethritis; Serum 13 war von einem gesunden Blutspender.
Experiment 2
In einem zweiten Experiment wurde ein Satz von 10 menschlichen Seren, die eine MIF-positive Antwort auf C. trachomatis-EB s ergaben (CT-MIF-positiv) mit Titern >64, und 50 Seren von gesunden, CT-MIF-negativen Blutspender bewertet. Alle CT-MIF-positiven Seren reagierten bei Immunblots nur mit der r-pgp3-Bande, während alle CT-MIF-negativen Seren auch beim Immunblot negativ für pgp3 waren. Diese Seren wurde dann mittels des ELISA gegen r-pgp3 getestet, das an NUNC-Mikrotiterplatten gebunden war. Von jedem Serum wurden zweifache serielle Verdünnungen mit dreifachen Proben getestet. Die OD-Messungen wurden nach 1 Std. Farbentwicklung vorgenommen. Alle MIF- und Immunblot-negativen Seren ergaben einheitlich niedrige OD-Ergebnisse (unter 0,1, vgl. 4(ii)A), während die MIF- und Immunblot-positiven Seren variable, aber einheitlich höhere OD-Ergebnisse ergaben, die mit der Serumverdünnung in der Probe proportional abnahmen. Unter Berücksichtigung der in der Literatur berichteten starke Verbreitung von Antikörpern gegen C. pneumoniae testeten wir mittels des pgp3-ELISA auch eine Gruppe von 10 Seren von Patienten mit Symptomem des Atemwegs, die MIF-negativ für C. trachomatis waren, aber hohe MIF-Titer (>521) an Antikörpern gegen C. pneumoniae hatten. Diese Seren ergaben pgp3-ELISA-Antworten ähnlich denen, die mit den Kontrollseren der gesunden Blutspender erhalten wurden (4(ii)B). Wir schließen, dass Kreuzreaktionen zwischen pgp3 und Antikörpern, die sich als Antwort auf eine C. pneumoniae-Infektion entwickelten, wahrscheinlich nicht auftreten.
Durchmusterung von Patientenseren mit dem pgp3-ELISA
Um die Verbreitung von anti-pgp3-Antikörpern in Individuen abzuschätzen, die eine Immunantwort auf eine C. trachomatis-Infektion entwickelten oder entwickeln, untersuchten wir drei Gruppen von Patienten mit Symptomen einer Entzündung des Urogenitaltrakts: 46 weibliche Patienten mit einer laparoskopisch bestätigten Salpingitis; 24 Patienten mit verschiedenen Zuständen, die oft mit C. trachomatis-Infektionen assoziiert sind (Entzündung des unteren Genitaltrakts, sekundäre Sterilität); 40 Fälle von nicht durch Gonokokken verursachter Urethritis (NGU) bei Männern.
Alle Seren wurden anfänglich von Fachleuten am Herkunftskrankenhaus unter Verwendung von gereinigten EBs von C. trachomatis und C. pneumoniae mittels MIF bewertet. Die 40 NGU-Fälle wurden nach den pgp3-ELISA-Tests mittels MIF erneut bewertet. Die 70 Seren von Frauen in Behandlung bei den Biobanque laboratoires wurden auch mit einem kommerziell erhätlichen Bestätigungstest bewertet, der wirksam zwischen C. trachomatis- und C. pneumoniae-Antworten unterscheidet (Orfila et al., nicht publizierte Ergebnisse).
Unter Berücksichtigung der Möglichkeit von Kreuzreaktionen zwischen immundominanten EB-Oberflächenkomponenten (z. B. LPS) in verschiedenen Chlamydienarten (11), wurden Seren, die eine positive MIF-Reaktion mit C. trachomatis-EBs, die aber auch gleiche odre höhere Titer gegen C. pneumoniae-EBs hatten, gemäß dem Bestätigungstest bewertet: d. h. die Seren von dieser Gruppe, die der Immunocomb-Test als positiv für C. pneumoniae-Antikörper anzeigte, aber negativ für C. trachomatis-Antikörper, wurden bei dieser Untersuchung so betrachtet, als gäben sie falsch-positive CT-MIF-Ergebnisse.
Alle vorstehenden Seren wurden mittels pgp3-ELISA in zweifachen Ansätzen von sechs zweifachen Verdünnungen von 1 : 100 bis 1 : 3.200 in PBS analysiert. Im allgemeinen waren die informativsten (d. h. maximale Differenz zwischen Probe und negativer Kontrolle) Probenverdünnungen diejenigen zwischen 1 : 100 und 1 : 400. Dosis/Antwort-Kurven mit halblogarithmischer Auftragung wurden verwendet, um die einzelnen Proben zu bewerten. Die Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen, die mit positiven und negativen Kontrollseren erhalten wurden, die in jede Experimentserie eingebracht wurden. Im Wesentlichen wurden Seren als anti-pgp3-positiv eingestuft, wenn die ELISA-Messungen durchweg höher waren als diejenigen des negativen Referenzserums für mehrere übereinstimmende Verdünnungswerte. Seren, die OD-Werte ergaben, die durchweg zwei- oder dreifach niedriger waren als die negativen Kontrollen, wurde als negativ eingestuft.
Typische Ergebnisse sind in 4(ii)C und 4(ii)D gezeigt. Eine Zusammenfassung der CT-MIF- und pgp3-ELISA-Ergebnisse ist in 5 und Tabelle I gezeigt.
TABELLE I
Die Verfügbarkeit eines pgp3-spezifischen ELISA ließ die Bewertung der Verbreitung von humoralen anti-pgp3-Antworten in Patienten mit Symptomen einer Infektion des Urogenitaltrakts zu. Insgesamt 130 menschliche Seren wurden mit dem pgp3-ELISA untersucht: für alle von ihnen wurde die Anwesenheit oder Abwesenheit einer humoralen Antwort auf Oberflächenantigene von Chlamydien mittels MIF festgestellt. Bei 81,5% aller untersuchten Seren stimmten MIF und pgp3-ELISA beim Nachweis einer positiven oder negativen Antwort ihrer jeweiligen Antigene überein (5, unterer Teil).
Von 110 untersuchten Seren von STD-Patienten waren 68 CT-MIF-positiv und 42 waren CT-MIF-negativ; von diesen waren 81% in der ersten Gruppe und 26% in der zweiten Gruppe auch beim pgp3-ELISA positiv. Diese Ergebnisse zeigen insgesamt an, dass die meisten Patienten, die eine Immunantwort gegen C. trachomatis-Oberflächenantigene entwickeln, auch Antikörper gegen pgp3 machen (p < 0,0005).
Wenn die beiden Gruppen von STD-Patienten mit einem relativ gut definierten pathologischen Zustand (NGU und Salpingitis) ausgewertet werden, zeigen die Resultate eine gewisse interessante Variation. Die 40 männlichen NGU-Fälle (positive CT-MIF-Verbreitung 32,5%) zeigen insgesamt eine anti-pgp3-Verbreitung von 32,5%, die in der CT-MIF-positiven Untergruppe 76,9% wird. CT-MIF und anti-pgp3-ELISA stimmen in 85% der Fälle beim Ergebnis einer positiven oder negativen Antwort überein (75% für die 20 bei der Isolierung positiven Proben und 95% für die 20 bei der Isolierung negativen Proben). Die statistische Korrelation zwischen der Anwesenheit von anti-pgp3-Antikörpern und positivem MIF-Befund in der NGU-Gruppe ist wiederum signifikant (p < 0,0005). Für diese Patienten wurde auch Zellkulturisolierungen von lebensfähigen Chlamydien von Harnröhrenabstrichen durchgeführt und es mag interessant sein festzuhalten, dass von den 13 ELISA-positiven NGU-Fällen 11 (84,6%) auch bei der Kultur positiv waren (p = 0,007), während von den 27 ELISA-negativen Fällen 9 (33,3%) bei der Kultur positiv waren und 18 (66,6%) bei der Kultur negativ waren. Die Gruppe der 46 Salpingitis-Fälle (positive CT-MIF-Verbreitung 67,4%) zeigen eine Verbreitung von anti-pgp3-Antikörpern von 71,7%, die bei der CT-MIF-positiven Untergruppe 80,6% wird. Für diese Gruppe von Seren war die Übereinstimmung zwischen CT-MIF und dem anti-pgp3-ELISA bei positiven oder negativen Antworten niedriger (69,6% der Proben) als beim Rest der Seren, und die Anwesenheit von anti-pgp3-Antikörpern korrelierte nicht gut mit dem positiven MIF-Ergebnis (p = 0,115).
Elf (26%) der 42 CT-MIF-negativen STD-Patienten waren beim pgp3-ELISA positiv: von diesen gehörten 8 (53,3%) zu der Salpingitis-Gruppe und 3 (11,1%) zu der NGU-Gruppe. Ein solches Antikörpermuster könnte in einigen Fällen durch Unterschiede bei den Niveaus und der Persistenz von anti-EB-Oberflächen- gegenüber anti-pgp3-Antikörpern entstehen. Alternativ könnte der pgp3-ELISA Kreuzreaktionen mit Antikörpern nachweisen, die durch Infektion mit anderen Mikroorganismen als Chlamydien erzeugt wurden oder durch andere pathologische Zustände, wie Autoimmunität. Die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens von positiven pgp3-ELISA-Ergebnissen wegen der spezifischen Kreuzreaktionen muß in weiteren Untersuchungen bei größeren und gut definierten Populationen bewertet werden; die mit tierischen Seren vor der Immunisierung (nicht gezeigt) und mit 60 CT-MIF-negativen menschlichen Seren (Gesunde, oder nicht-STD-Patientengruppen) erhaltenen Resultate zeigen jedoch, dass falsch positive Resultate beim pgp3-ELISA wegen der spezifischen Bindung von normalen Serumkomponenten wahrscheinlich nicht auftreten, da keines dieser Seren eine positives Antwort ergab.
Im Gegensatz dazu zeigten dreizehn (19%) von 68 STD-Patientenseren, die CT-MIF-positiv waren, keine nachweisbaren Niveaus von anti-pgp3-IgGs. Diese Gruppe kann Patienten mit einer kürzlichen ersten Infektion umfassen, die bereits eine anti-EB-Oberflächenantwort entwickelt haben, aber noch keine signifikante Antwort auf pgp3. Tatsächlich gehören zwei Seren von Freiwilligen, die sich einer regelmäßigen Kontrolle unterziehen, und die sicherlich nach einer kürzlichen Infektion entnommen wurden, zu dieser Gruppe. Eine andere Möglichkeit ist, dass einige Patienten wegen gewisser Besonderheiten ihres Immunantwort vielleicht keine anti-pgp3-Antwort gegen die Chlamydieninfektion entwickeln.
Der Zweck der hier gezeigten serologischen Übersicht ist zu zeigen, dass Patienten mit einer mit C. trachomatis zusammenhängenden Krankheit pgp3 erkennen; weitere epidemiologische Studien können jedoch vielleicht die Häufigkeit und Bedeutung solcher Antikörpermuster besser bewerten. Auch etablierte Tiermodelle für die Chlamydieninfektion könnten sinnvoll angewendet werden, um den relativen Zeitverlauf des Erscheinens von anti-pgp3- und anti-EB-Oberflächenantikörpern festzustellen.
Die Funktion und die Rolle von pgp3 in der Chlamydienzelle und beim Lebenszyklus sind noch unbekannt; da man jedoch bei der von Chlamydien hervorgerufenen Krankheit annimmt, dass sie vor allem durch die Immunantwort des Wirts auf die Infektion bestimmt ist, zeigen die hier berichteten Ergebnisse, dass pgp3 eines von mehreren Molekülen ist, die potentiell wichtig für die Pathogenität der Chlamydieninfektion des Urogenitaltrakts sind.
Es sollte verstanden werden, dass die Erfindung vorstehend nur beispielhaft beschrieben ist und dass im Geist und Umfang der Erfindung Variationen möglich sind.
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Claims

Aufgereinigtes Chlamydia trachomatis-pgp3-Protein, dadurch gekennzeichnet, dass (i) das Protein Konformationsepitope besitzt, die im nativen pgp3-Protein vorhanden sind, und (ii) das Protein durch gegen diese Epitope gerichtete Antikörper in menschlichem Serum erkannt werden kann.
Aufgereinigtes Chlamydia trachomatis-pgp3-Protein, welches eine antigene Struktur beibehält, die den Nachweis durch Antikörper ermöglicht, die gegen pgp3-Konformationsepitope gerichtet sind.
Chlamydia trachomatis-pgp3-Protein nach Anspruch 1 oder 2, erhältlich durch ein Verfahren umfassend: – Transformieren einer E.coli-Zelle mit einem Vektor, der Chlamydia trachomatis-pgp3-Protein codiert; – Züchten der Zelle unter Bedingungen, unter denen dieses Protein exprimiert wird; – Isolieren der periplasmatischen Fraktion der resultierenden Zellen; – Dialysieren der Fraktion gegen Piperazin-HCl-Puffer, pH 5,4; – Aufbringen der dialysierten Lösung auf eine Ionenaustauschersäule; – Eluieren der Säule mit einem NaCl-Gradienten; – Sammeln der pgp3 enthaltenden Fraktionen; und – Rückdialysieren von pgp3 in eine physiologische Pufferlösung.
Immundiagnostischer Test, umfassend mindestens einen Schritt, der als mindestens einen Bindungspartner ein Protein, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, beinhaltet, gegebenenfalls markiert oder an einen festen Träger gekoppelt.
Immundiagnostischer Test nach Anspruch 5, wobei der Test ein ELISA ist.
Immundiagnostischer Kit zur Durchführung eines Tests nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, umfassend mindestens ein Protein, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert ist, der ein Polynucleotid umfasst, welches ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert, und das Isolieren des Proteins.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Vektor das ORF3-Gen einer beliebigen Chlamydia trachomatis-Serotypenvariante unter IPTG-induzierbarer Expressionskontrolle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Wirtszelle E.coli ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Isolieren einen oder mehrere Aufreinigungsschritte unter nicht-denaturierenden Bedingungen beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Isolieren den Schritt einer Ionenaustauschchromatographie beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei das Isolieren den Schritt der Herstellung eines periplasmatischen Extrakts beinhaltet.
Impfstoff oder therapeutische Zusammensetzung, umfassend das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen pharmazeutischen Träger.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in der Herstellung eines Medikaments zur Impfung gegen eine Chlamydia trachomatis-Infektion der Behandlung einer solchen Infektion.