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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Erzeugung, Interkonversion und Anwendung von Bibliotheken aus
polyclonalen Antikörpern,
Zelloberflächenrezeptoren
und anderen Proteinen mit variablen Regionen. Diese variablen Regionen
werden verknüpft,
in Expressionsvektoren cloniert, die wie gewünscht bereitgehalten, selektiert
und amplifiziert werden können,
und die Bibliotheken oder Sub-Bibliotheken von variablen Regionen werden
ohne Verlust von Gesamtdiversität
oder -komplexität
in andere Expressionsvektoren transferiert. Die so erhaltenen Bibliotheken
von variablen Regionen und Bibliotheken von Gesamtproteinen können zur
Behandlung, Vorbeugung oder Diagnose spezifischer Krankheiten und
Störungen,
darunter Neoplasien, Bösartigkeiten,
Infektionen und genetische Defekte und Defizite verwendet werden.
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Lymphocyten bilden etwa 20% der Blut-Leukocyten
und sind der Hauptbestandteil des Antigen-Erkennungssystems der
Säuger,
wobei sie vorwiegend in zwei Formen, nämlich B-Zellen und T-Zellen
vorkommen. T-Zellen differenzieren in der Thymusdrüse und möglicherweise
in anderen Geweben in cytotoxische Zellen (TC),
Helfer-Zellen (TH) und Suppressor-Zellen
(TS). Diese T-Zellen erkennen fremdes Antigen
in Verbindung mit dem Haupt-Histokompatibilitätskomplex- (MHC)- Antigen über einen
spezifischen T-Zellen-Rezeptor (TcR). Dieser Rezeptor ist hochgradig
polymorph und clonal verteilt. Der typische TcR ist ein Disulfidverbundenes
Heterodimer, das aus einem α-
und einem β-Polypeptid
besteht, und auf der Oberfläche
von reifen T-Zellen exprimiert wird. Die beiden Ketten sind von ähnlicher
Größe und besitzen
einen Transmembranabschnitt, der von einer konstanten Region und
einer polymorphen variablen Region, die beträchtliche strukturelle Homologie
zu Immunglobulinen aufweist, eingeschlossen ist. Jede variable Region
wird von einem variablen Segment (V), einem Verbindungssegment (J)
und einem Diversitätssegment
(D; nur β-Ketten),
die in die polymorphe Region eingegliedert sind. Eine solche Diversität ist für die T-Zellen
nötig,
um auf eine große
Vielfalt von Antigenen reagieren zu können.
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B-Zellen differenzieren im Knochenmark
adulter Säuger,
indem sie sich von Vorläufer-B-Zellen zu antikörperproduzierenden
Plasmazellen entwickeln. Die Bedeutung von B-Zellen für das Immunsystem
wird durch jene seltenen Immunschwächekrankheiten unterstrichen,
bei denen der Patient nur durch wiederholte Gammaglobulin-Injektionen überleben
kann. Einer der faszinierenden Aspekte von B-Zellen ist die Heterogenität ihrer
Antikörper-Expression.
Nach Beobachtungen wurde geschätzt,
daß nicht
mehr als zwei von 108 verschiedenen Antikörper identisch
sind. Kein Wunder, daß die
für solche
Diversität
verantwortlichen Mechanismen noch nicht vollständig erforscht sind. Antikörper und
TcRs, die beide konstante und variable Region haben, zählen zur
sogenannten Immunglobulin-Überfamilie.
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Der Prozeß der Immunglobulin-Expression
wird durch die Aktivierung von ruhenden B-Zellen gestartet. Im T-Zellen-unabhängigen Reaktionsweg
bindet Mitogen an die Oberflächenrezeptoren
von B-Zellen und stimuliert die Expression von IgM-Monomeren von
ziemlich niedriger Affinität.
Bei der Erkennung von fremdem Antigen kreuzverbinden sich diese
IgM-Monomere an der Zelloberfläche
und werden in die Zelle eingeschleust. Dann schaltet die Antikörperexpression
auf die Transkription und Translation von IgG, IgE, IgA oder pentamerem
IgM um. Beim T-Zellen-abhängigen
Reaktionsweg ist wiederum Mitogen erforderlich, um die ruhende B-Zelle
zu stimulieren, jedoch wird das Antigen nach der Einschleusung innerhalb
der Zelle verarbeitet, um dann wieder assoziiert mit MHC-Molekülen der
Klasse II auf der Zelloberfläche
aufzutauchen. Wie eine Antigen-präsentierende Zelle (APC), werden
Antigen-MHC-Komplexe erkannt und stimulieren die Aktivierung der T-Zellen und Produktion
einer Anzahl von löslichen
T- und B-Zell-Vermittlern. Die von diesen Oberflächenkomplexen empfangene Information
wird über
Second-Messenger zum Zellkern der B-Zellen übertragen, was neben anderen
Auswirkungen zu einem erhöhten
zyklischen Nucleotidstoffwechsel und einer Proteinkinase C-Aktivität führt. Sowohl
im T-Zellen-abhängigen als
auch im T-Zellen-unabhängigen
Reaktionsweg entwickeln sich die B-Zellen zu funktionell reifen,
antikörperproduzierenden
Zellen
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Antikörper sind bifunktionelle Moleküle, die
zwei schwere (H) und zwei leichte (L) Ketten umfassen, die mit Zwischenketten-Disulfidbindungen
verbunden sind. Jede Kette enthält Konstante
(C) und variable (V) Regionen, die in Domänen mit den Bezeichnungen CH1, CH2 CH3 und VH, und CL und VL aufgeteilt
werden können.
IgM existiert als Zelloberflächen-Monomer oder zirkulierendes
Pentamer, das von einem als J-Kette bezeichneten 137-Aminosäuren-Peptid
zusammengehalten wird. Auch die IgA-Moleküle zirkulieren, jedoch in Paaren,
die mit J-Ketten verbunden sind und eine kleine sekretorische Komponente
(SC) enthalten, die am Transport durch die epithelialen Membranen
beteiligt ist. Der Antikörper
bindet über
die Domänen
der variablen Region, die im Fab-Abschnitt enthalten sind, an das
Antigen und interagiert nach der Bindung mit dem Rest des Immunsystems
durch die Effektorfunktionen der Domäne der konstanten Region, hauptsächlich durch
den Fc-Abschnitt. Die Effektorfunktionen beinhalten die Aktivierung
der Komplementierungskaskade, die Interaktion mit Effektorzellen,
wie Lymphocyten, und die Kompartimentierung von Immunglobulinen.
Auch von den konstanten Regionen nimmt man an, daß sie die
Stabilität
der verschiedenen Immunglobuline beeinflussen. IgG zum Beispiel
ist relativ stabil, mit einer Zirkulations-Halblebensdauer von etwa
23 Tagen. IgG ist auch der Immunglobulin-Responder, der mit der
sekundären
Immunantwort verbunden ist. Dieses Immunglobulin bindet durch die
klassische Komplementierungskaskade Komplement und hat die Fähigkeit,
Macrophagen und Neutrophile zu rekrutieren. Pentameres IgM ist ein
anderer sehr starker Aktivator der klassischen Komplementierungskaskade,
und es hat eine Serum-Halblebensdauer von etwa fünf Tagen. IgA hat eine Serum-Halblebensdauer
von fünf
bis sechs Tagen, aktiviert Komplement durch den alternativen Reaktionsweg
und ist der wichtigste Antikörper
in Schleimsekreten.
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Die antigenbindenden Domänen, die
variablen Regionen, werden von den Genen der variablen Regionen
codiert, die etwas verstreut im Genom liegen, und die durch einen „somatische
Rekombination" genannten
Vorgang zusammengebracht werden müssen. Bei diesem Vorgang werden
die V-, D- und die (nicht mit der J-Kette verwandten) J-Segmente
des Wirtsgenoms zusammengebracht, so daß sie eine Genregion bilden. Diese
Region wird mit der mRNA, die die Domäne der konstanten Region des
Antikörpers
codiert, gespleißt und
so zusammen als Polypeptid und letztlich als Antikörpermolekül exprimiert.
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Konstante Antikörperregionen sind die bestimmenden
Hauptmerkmale der Antikörperklasse
sowohl für
die schweren als auch für
die leichten Ketten, und sie werden von etwa 15 verschiedenen Genen
codiert. Die fünf
Klassen von Genen der schweren Ketten werden als Alpha (α), Gamma
(γ), Delta
(δ), Mü (μ) und Epsilon
(ε), und
die zwei Gene der leichten Ketten als Kappa (κ) und Lambda (λ) bezeichnet.
Die variablen Regionen, die auch die Antigen- Bindungsstelle enthalten, werden von über 1000
verschiedenen genetischen Regionen codiert. Diese Regionen rekombinieren
selektiv und erzeugen so die zur Erkennung und Bindung des Zielantigens
nötige
Aminosäurenkombination.
Die Bindungsstellenvariabilität
ist nicht gleichmäßig verteilt,
vielmehr enthält
jede Domäne
eine Anzahl hochgradig variabler Abschnitte, die hypervariablen
Regionen (HVR) oder komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR),
und es sind diese Regionen, die mit dem Antigen interagieren.
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Die Generierung von Bindungsstellen-Diversität ist eine
Kombination von mehreren Faktoren; (1) die Kombination von verschiedenen
VH- und VL-Domänen, (2)
die Kombination von verschiedenen V-, D- und J-Regionen, die die
variable Domäne
bilden, (3) die Generierung neuer Diversität an Domänenverbindungen, die als Verbindungsdiversität bezeichnet
wird, und (4) Diversität
aufgrund somatischer Mutationen. Somatische Mutationen sind auch
großenteils
für die
Reifung der Immunantwort verantwortlich, wobei die B-Zellen-Clone,
die sich während
der Entwicklung der humoralen Antwort vermehren, eine immer höhere Affinität zum Antigen
haben. Die Kombination dieser Vorgänge erlaubt theoretisch einem
Organismus, gegen fast jedes Antigen eine spezifische Immunantwort
zu generieren.
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Auf der Stimulation einer Antikörperantwort
beruhen die meisten Formen der Impfungstherapie und -prophylaxe.
Zur Prophylaxe wird einem Patienten Antigen in Form von getöteten oder
abgeschwächten
Mikroorganismen oder gereinigtem Protein verabreicht. Man hofft,
daß die
Verabreichung dieser Impfung das Immunsystem des Patienten auf die
mögliche
spätere
Erkennung des gleichen Antigens in Form einer Infektion vorbereitet.
Wenn die Infektion frühzeitig
abgefangen werden kann, wenn mit anderen Worten anti-Antigen-Antikörper nach
einem anfänglichen
oder früheren
Kontakt mit dem Organismus im Körper
zirkulieren, könnte
der Organismus aus dem Körper
eliminiert werden, bevor er Fuß fassen
oder eine voll ausgeprägte
Infektion verursachen kann. Dieser Aspekt wurde schon vor sehr langer
Zeit erkannt; sogar bevor die Grundstruktur des Antikörpers bekannt
war. Antikörperbehandlungen
beinhalten passive Impfungen mit vereinigtem Serum in Form von Gammaglobulin.
Das Blutplasma wird von konvaleszenten Personen oder Tieren gewonnen,
die sich von der jeweiligen Krankheit erholt haben, und es wird
in die Protein- oder Gammaglobulinfraktion raffiniert, die ihre
Bezeichnung der Tatsache verdankt, daß sie vorwiegend IgG-Moleküle enthält. Die
Impfungen dieses Gammaglobulins werden viele Male über einen
Zeitraum von Stunden oder Tagen verabreicht; gewöhnlich unmittelbar nach dem
Kontakt mit dem infektiösen
Organismus oder der giftigen Substanz, um den Patienten mit einem
Kurzzeitschutz gegen die Infektion zu ver sehen. Beispielsweise wird
Personen, die von einem Tier, gebissen wurden, das als Träger des
Tollwutvirus, eines Rhabdovirus verdächtig ist, eine Gammaglobulinbehandlung
verabreicht, um das Virus an einer Infektion zu hindern, denn wenn
einmal eine Infektion stattgefunden hat, ist der Ausgang unweigerlich
ziemlich schlecht. Wenn aber die Behandlung frühzeitig begonnen wird, kann
die Prognose ziemlich optimistisch sein.
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Die Verwendung von Antikörpern zur
Krebstherapie (oder -prophylaxe) basiert auf der Prämisse, daß das antigene
Profil einer Krebszelle von dem von normalen Zellen verschieden
ist. Wie schematisch in 1 dargestellt,
könnten
diese Unterschiede potentiell folgendes beinhalten: (1) Antigene
Determinanten, die ausschließlich
auf der Oberfläche
von Tumorzellen vorkommen, (2) intrazelluläre Moleküle, die sich ausschließlich in
Tumorzellen finden, die als Peptide auf der Zelloberfläche in Verbindung
mit MHC-Molekülen
dargebracht werden, (3) Antigene, die nur auf einigen normalen Zellen
vorkommen, und (4) quantitative Unterschiede in der Menge der Expression
bestimmter Antigene auf der Oberfläche der Tumorzellen im Vergleich
zu anderen Nicht-Tumor-Zelltypen. Diese Prämisse wurde durch die Entdeckung
sogenannter Tumor-assoziierter Antigene erhärtet, die auf den Oberflächen normaler
Zellen nicht in signifikanter oder meßbarer Menge exprimiert werden
(M. Herlyn und H. Koprowski, Ann. Rev. Immunol. 6: 283–308, 1988).
Diese tumorspezifischen Peptide werden auf der Zelloberfläche in Verbindung
mit MHC-Antigenen der Klasse I dargebracht.
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Im Gegensatz zu polyclonalen Antikörper umfassen
monoclonale Antikörper
eine Kollektion identischer Moleküle, die von einem gemeinsamen
B-Zellen-Clon hergestellt werden, und die gegen eine einzelne antigene
Determinante gerichtet sind. Monoclonale Antikörper lassen sich vom polyclonalen
Antikörpern
dadurch unterscheiden, daß monoclonale
Antikörper
einzeln selektiert werden müssen,
während
polyclonale Antikörper
in Gruppen von mehr als einem, oder mit anderen Worten in großer Menge
selektiert werden. Große Mengen
von monoclonalen Antikörpern
können
durch die Immortalisierung einer polyclonalen B-Zellen-Population mit Hilfe
der Hybridomtechnologie hergestellt werden. Jede immortalisierte
B-Zelle kann sich
teilen, und zwar vermutlich beliebig oft, und so bildet sie eine
clonale Population von Zellen, von denen jede ein identisches Antikörpermolekül exprimiert.
Die einzelnen immortalisierten B-Zellen-Clone, die Hybridome, werden abgetrennt
und separat gezüchtet.
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Die Therapie mit monoclonalen Antikörpern wurde
in zunehmendem Maß bei
der Krebstherapie und -diagnose benützt, weist jedoch einige Unzulänglichkeiten
auf (H. Thomas und K. Sikora, Rev. Oncol. 4: 107–120, 1991). Oft treten Tumorzellen-Varianten
auf, denen die einzelne antigene Determinante fehlt, die der monoclonale
Antikörper
erkennt, und die von der Behandlung nicht erfaßt werden. Weil jeder monoclonale
Antikörper
gegen eine einzelne antigene Determinante auf der Ziel-Krebszelle
gerichtet ist, ist die Dichte dieser Determinanten auf der Zelloberfläche gewöhnlich nicht
hoch genug, um die Zerstörung
der Zelle zu ermöglichen.
Außerdem
sind die Effektormechanismen, die durch die FC-Regionen der gebundenen
Antikörpermoleküle vermittelt
werden, wie die, Komplementbindung der Wert und die gleichzeitige
Produktion von C3b, Opsonisation/Phagocytose und Antikörper-abhängige, zellvermittelte
Cytotoxizität
(ADCC) nicht aktiviert. Nur bei hohen Antikörperdichten wird Komplement
aktiviert oder werden genügend
FC-Rezeptoren in Betrieb genommen, so daß die vorgesehenen
Funktionen der Effektorzellen ausgelöst werden. Demzufolge sind
monoclonale anti-Tumor-Antikörper
zur vollständigen
Ausschaltung der Zielzellen gewöhnlich
unwirksam.
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Um einige von diesen Problemen zu
umgehen, wurden Verfahren entwickelt, die darauf abzielen, die Tötungswirksamkeit
von monoclonalen Antikörpern
mit radioaktiven Isotopen, Giften oder Medikamenten zu erhöhen. Diese
Zusätze
können
jedoch ihrerseits schädliche
Nebenwirkungen verursachen (T. A. Waldmann, Sci. 252: 1657–62, 1991).
Selbst wenn ein monoclonaler Antikörper (mit Zusätzen oder
ohne Zusätzen)
zu Eliminierung von Krebszellen ziemlich effektiv ist, und Rückfälle dokumentiert
wurden, bricht der Krebs in den meisten Fällen von neuem aus, da Tumorzellen-Varianten,
die die antigene Zieldeterminante verloren haben, entkommen und
sich vermehren (R. A. Miller et al., N. Engl. J. Med. 306: 517–22, 1982).
Dieses Problem könnte
teilweise durch die Verwendung von Kollektionen von monoclonalen
anti-Tumor-Antikörper
gelöst
werden, die den Vorteil hätten,
daß sie
das gleiche, schon existierende Reagens für viele Patienten verwenden.
Obwohl dies ein Vorteil wäre,
da einzelne Tumore so variabel sind, ist es kein alltägliches
Ereignis, daß für einen
Krebstyp spezifische mehrfache Antigene gefunden werden, die auf
allen Krebsen des betreffenden Typs vorhanden sind (D. Berd et al.,
Cancer Res. 49: 6840–44,
1989). Selbst wenn für
Patienten mit einigen Krebstypen eine wirksame Behandlung mit Kollektionen
von monoclonalen Antikörpern
gefunden wird, ist es unwahrscheinlich, daß diese gegen viele Formen
von Neoplasie wirksam ist.
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Die Technologie der monoclonalen
Antikörper
ist beim derzeitigen Entwicklungszustand auf die Anwendung nicht
menschlicher monoclonaler Antikörper
fokussiert. Dies stellt oft ein Problem dar, da die Patienten Antikörper gegen
die nichtmenschlichen Regionen des Proteins, und zwar sowohl gegen
die konstante als auch gegen die variable Region entwickeln. Anti körper, die
gegen die Antigenbindungsstelle, also gegen die variable Region
eines anderen Antikörpers
reaktiv sind, nennt man anti-idiotypische Antikörper. Es wurde gezeigt, daß monoclonale
Antikörper
von Mäusen,
die am leichtesten herstellbaren und häufigsten, eine humorale Antwort
beim Menschen auslösen,
welche als menschliche anti-Maus-Antwort oder HAMA-Antwort (human
anti-mouse antibody response) bezeichnet wird (D. L. Sawler et al.,
J. Immunol. 135: 1530–35,
1985). Eine signifikante HAMA-Antwort bei Patienten, die sich einer
solchen Therapie unterziehen, macht nicht nur jeden möglichen
Behandlungserfolg zunichte, sondern führt auch noch zu zahlreichen
Komplikationen, darunter Störungen
des Immunkomplexes.
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Im den letzten Jahren wurden diese
Probleme teilweise durch die Herstellung und Anwendung chimärer Antikörper gelöst. Chimäre Antikörper haben
V-Regionen, die aus den tumorspezifischen monoclonalen Mäuse-Antikörpern, doch
menschlichen C-Regionen (S. L. Morrison und V. T. Oi, Adv. Immunol.
44: 65–92, 1989)
abgeleitet sind. Bei solchen Formen ist die HAMA-Antwort signifikant
verringert (wenn auch nicht vollkommen eliminiert), ein Problem
bleibt aber noch die anti-idiotypische Antwort. Im Bemühen, die
anti-idiotypische Antwort auszuschalten, wurden Antikörper entworfen,
bei denen nur die CDRs von Mäuseantikörper abgeleitet
sind, das Gerüst
und die C-Regionen aber menschlichen Ursprungs sind. Dies sind die
sogenannten humanisierten Antikörper
(P. C. Caron et al., Cancer Res. 52: 6761–67, 1992). Diese Antikörper sind
sehr schwierig herzustellen; es sind mehrere Clonierungsschritte
erforderlich, und es könnten
dabei immer noch anti-idiotypische Antikörper hervorgebracht werden
(The Third Annual IBC International Conference on Antibody Engineering,
14.–16.
Dezember 1992, San Diego). Monoclonale Antikörper komplett menschlichen
Ursprungs werden derzeit entwickelt; man erhofft sich, daß diese
keine anti-idiotypischen Antikörper
hervorbringen werden (C. J. Fisher et al., Critical Care Med. 18:
1311–15,
1990). Da aber Mäuse
perfekt dazu in der Lage sind, anti-idiotypische Antikörper gegen
Antikörper
zu erzeugen, die aus der gleichen Art, ja sogar aus dem gleichen, durch
Inzucht hervorgebrachten Stamm abgeleitet sind, wird die Erzeugung
anti-idiotypischer Antikörper
nach der Injektion von großen
Mengen von Antikörpern
mit identischen V-Regionen immer ein Problem bleiben, solange monoclonale
Antikörper
verwendet werden.
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Die Verwendung polyclonaler Antikörper würde einige
der Nachteile überwinden,
die mit der Therapie mit monoclonalen Antikörpern verbunden sind. Im Gegensatz
zu den monoclonalen Antikörpern
sind polyclonale Antikörper
gegen viele verschiedene antigene Determi nanten auf der Oberfläche der
Zielzellen gerichtet und würden
mit ausreichender Dichte binden, um den Effektormechanismen des
Immunsystems ein wirkungsvolles Arbeiten zu ermöglichen; sie würden damit
auch möglicherweise
die Notwendigkeit radioaktiver oder toxischer Zusätze eliminieren.
Weiterhin ist die Chance verschwindet gering, daß evasive Tumorzellenvarianten ("escape variants") von auftreten,
die die Reaktivität
mit allen polyclonalen Antikörpern
verloren haben. Es ist nicht zu erwarten, daß die anti-idiotypische Reaktivität für Patienten
ein Problem wird, da keine V-Region-Kombination in ausreichender
Menge vorhanden sein dürfte,
um eine signifikante Antwort auszulösen.
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Die Verwendung konventioneller polyclonaler
Antikörper
bringt mehrere Probleme mit sich. Erstens sind polyclonale Antikörper in
Form von Gammaglobulin nur in sehr beschränkter, für die Behandlung von Menschen
in großem
Maßstab
nicht ausreichender Menge verfügbar.
Zweitens werden viele von den polyclonalen Antikörpern, wenn sie bei einem Patienten
angewandt werden, von dessen normalen Zellen und Geweben absorbiert.
Die Zahl der verschiedenen Antikörper,
die nach der Absorption übrigbleiben,
wäre sehr
gering, möglicherweise
zu gering für
eine heilende Wirkung. Drittens erfordert diese Menge, abgesehen
davon, daß sie gar
nicht ausreichend ist, einen großen Reinigungsaufwand, um unerwünschtes
Material, wie Cytokine und immunregulatorische Proteine zu entfernen,
die unerwünschte
Immunantworten und Nebenwirkungen auslösen könnten. Es besteht auch ein
substantielles Kontaminationsrisiko, das mit infektiösen Organismen
wie HIV oder mit Toxinen wie Lipopolysacchariden zusammenhängt, die
in der Quelle vorhanden sein könnten.
Diese Probleme sind aufgrund der Variabilität der Zusammensetzung des aus
verschiedenen biologischen Quellen stammenden Materials schwer zu
lösen.
Die rekombinante Produktion polyclonaler Antikörper würde einige dieser Probleme
lösen,
doch die Gene, die diese Antikörper
codieren, sind nicht leicht zu bestimmen, und die Technologie zur
wirkungsvollen Arbeit mit Kollektionen von Antikörpergenen muß erst noch
entwickelt werden.
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Neuerdings wurden antigenbindende
Antikörperfragmente
auf der Oberfläche
von fädigen
Phagen exprimiert (G. P. Smith, Sci. 228: 1315, 1985). Bibliotheken
von variablen H- und L-Regionen-cDNAs
sind aus tierischen und menschlichen B-Zellen gewonnen worden und
in Paaren in zufälligen
H-L-Kombinationen in Phagendisplayvektoren cloniert worden, um so
kombinatorische Bibliotheken zu erhalten, die Fab oder Einzelketten-Fv-Fragmente
aufweisen (W. D. Huse et al., Sci. 246: 1275–81, 1989). Fab wird durch
die Assoziierung der L-Kette mit VH und
CH1-Domänen
der H-Kette gebildet, die Fd-Region. In Phagendisplaybibliotheken
ist das carboxy-terminale Ende der Fd- oder Fv-Region an ein Fragment
eines Phagen-Hüllproteins,
wie cpIII oder cpVIII angelagert, das das Fab-Fragment an der Oberfläche des
Phagen verankert. Sowohl in Fab- als auch in Fv- Fragmenten wird
die Antigenbindungsstelle bei intakten Antikörpern aus der Kombination der
VH- und VL- Domänen gebildet.
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Phagendisplaybibliotheken können nach
ihrer Bindung an spezifische Antigene durch Affinitätschromatogaphie
(R. E. Hawkins et al.; J. Mol. Biol. 226: 889, 1992) oder durch
Ausstreichen von Phagen auf antigenbeschichteten Oberflächen (C.
F. Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363, 1991) selektiert
werden. Da die DNA-Segmente, die die selektierten Antikörperfragmente
codieren, auf Phagenpartikeln liegen, können die selektierten Phagenpartikel,
die monoclonale Antikörperfragmente
codieren, isoliert und unbegrenzt propagiert werden. Die selektierten
Phagenclone können
modifiziert werden, um Antikörperfragmente ohne
Hüllproteineinheit
zu erzeugen, die ebenfalls von den Bakterienzellen sekretiert werden
können.
Aus solchen kombinatorischen Phagendisplaybibliotheken wurden Antikörperfragmente,
die für
Haptene, Proteine und mehrere menschliche Viren spezifisch sind,
gewonnen (J. D. Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581, 1991; R. A.
Williamson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4141, 1993).
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Ein Hauptnachteil dieser kombinatorischen
Bibliotheken ist, daß die
VH- und VL-Regionen,
die die Antigenbindungsdomäne
bilden, zufällig
assoziiert sind. Die ursprünglichen
Kombinationen von H- und L-Ketten, die durch das Antigen in vivo
so wirkungsvoll selektiert wurden, gehen verloren (J. McCafferty
et al., Nature 348: 552–54,
1990). Die Chance, H- und L-Kombinationen mit hoher Affinität zum Antigen
von Interesse zu finden, ist sehr klein. Die Anzahl der Clone, die
nach einer spezifischen Bindung an das Antigen abgesucht werden
müßten, wächst um
die Größenordnung
des Mehrfachen.
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Ein Verfahren zur Amplifikation und
zur Verbindung der exprimierten Gene der VH-
und VL-Regionen innerhalb einzelner Zellen
in einer Population von Zellen wurde in allerjüngster Zeit vorgestellt (M.
J. Embleton et al., Nuc. Acids Res. 20: 3831–37, 1992). Dieses Verfahren
wurde durch ein Beispiel mit zwei Mäuse-Hybridomzellinien veranschaulicht,
von denen jede ein bekanntes und unterschiedliches Immunglobulin-
(Ig-) Produkt erzeugt. Die beiden Zellpopulationen wurden vermischt,
mit Formaldehyd fixiert und mit dem Detergens NP-40 permeabilisiert.
Mittels reverser Transskriptase und zu den 3'-Enden der VH-
und VL-mRNAs komplementärer Primer wurden cDNAs synthetisiert.
Die cDNAs wurden dann durch PCR amplifiziert und in der gleichen
Reaktion verknüpft,
wobei zusätzlich
zu den cDNA-Primern ein Primer vom 3'-Ende des VH-Gens
und ein Primer vom 5'-Ende
des VL-Gens verwendet wurden. Diese Primer
enthielten auch komplementäre
Schwänze von
zusätzlichen
Sequenzen für
die Selbstzusammenstellung von VH- und VL-Genen. In einer zweiten PCR wurden nach
dem Waschen der Zellen die verknüpften
VH- und VL-Region-Gene
mit terminalen „nested" Primern amplifiziert,
und ergaben so eine Population von DNA-Fragmenten, die die VH- und VL-Sequenzen
in Kopf-Schwanz-Transkriptionsrichtung vom codierten. Diese DNA-Fragmente
wurden aus den Zellüberständen gewonnen.
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Obwohl dieser Bericht behauptete,
daß fast
alle untersuchten VH-VL-Kombinationen
von nur einer der Hybridomzellinien abgeleitet waren, führt das
Verfahren zu gemischten VH-VL-Kombinationen, bei
denen VH und VL aus
unterschiedlichen Zellen abgeleitet sein können. Auch theoretische Betrachtungen
lassen augenscheinlich werden, daß VH-VL-Vermischung vorkommen kann. Da die verknüpften VH-VL-Kombinationen
aus dem Überstand
der fixierten/permeabilisierten Zellen gewonnen werden, die Poren
in den Membranen dieser Zellen aber den freien Durchgang solcher
verknüpfter
DNA-Moleküle
erlauben, ist zu erwarten, daß die
kleineren VH- und VL-DNA-Moleküle die Zellen
verlassen können
und außerhalb
der Zellen verknüpft
und weiter amplifiziert werden könnten,
wobei eine freie Vermischung von VH und
VL aus verschiedenen Zellen vorkommen kann.
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Die vorliegende Erfindung überwindet
die Probleme und Nachteile, die mit den derzeitigen Strategien und
Konzepten verbunden sind und liefert neue Zusammensetzungen und
Verfahren für
die Prophylaxe und Behandlung bestimmter Krankheiten und Störungen.
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Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern haben
eine höhere
Komplexität
als monoclonale Antikörper oder
Antikörper-Cocktails,
da sie gegen viele verschiedene antigene Determinanten gerichtet
sind, und beinhalten die Option der Verwendung von radioaktiven,
toxischen und anderen Zusätzen
sowohl für
die Therapie als auch für
die Diagnose. Eine Ausführungsform
der Erfindung zielt auf die Verfahren zur Behandlung neoplastischer
Störungen
unter Verwendung von Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern, die
spezifisch gegen eine Krankheit oder Störung gerichtet sind. Von einem
Patienten wird eine Probe von neoplastischem Gewebe gewonnen. Die
Probe wird in eine Zellpopulation eingeführt, die in der Lage ist, Antikörper zu
erzeugen, wie die Milzzellen eines Säugers. Die Zellpopulation wird
fixiert, permeabilisiert, und die VH- und
VL-mRNA-Moleküle werden in VH-
und VL-cDNA-Sequenzen
revers transkribiert. Die cDNA-Sequenzen werden PCR-amplifiziert,
und die amplifizierten Sequenzen verknüpft, und zwar vorzugsweise
in einer Kopf-Kopf amplifizierten Sequenzen verknüpft, und zwar vorzugsweise
in einer Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung. Die verknüpften Sequenzen
werden abermals PCR-amplifiziert, und so wird eine Population von
DNA-Fragmenten erzeugt, die die VH- und
VL-Antikörperregionen
codieren. Diese DNA-Fragmente werden in Expressionsvektoren cloniert und
die verschiedenen Populationen von Expressionsvektoren in den transfizierten
Wirt expandiert. Die Expressionsvektoren, die eine Bibliothek von
rekombinanten anti-neoplastischen Antikörpern codieren, werden selektiert
und die Subpopulationen oder Subbibliotheken abermals expandiert.
Dann werden die rekombinanten anti-neoplastischen Antikörper, die
von diesen Vektoren hergestellt werden, den Patienten verabreicht.
Die neoplastischen Störungen,
die behandelt werden können,
beinhalten Leukämien,
Lymphome, Sarcome, Carcinome, neutrale Zelltumore, schuppige Zellcarcinome,
Keimzellentumore, Metastasen, undifferenzierte Tumore, Seminome,
Melanome, Neuroblastome, gemischte Zelltumore, durch infektiöse Mittel
verursachte Neoplasien und andere Bösartigkeiten.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf die in-vivo-Diagnose einer neoplastischen Störung durch Sichtbarmachen des
erkrankten Gewebes in einem Patienten. Es wird eine Bibliothek von
patientenspezifischen, anti-neoplastischen Antikörpern wie in dieser Arbeit
beschrieben erzeugt, und diese mit einem feststellbaren Marker markiert.
Die Antikörper
können
ganze Antikörper
oder Fragmente von Antikörpern,
wie Fab-Fragmente sein. Die markierte Bibliothek wird dem Patienten
verabreicht und der Marker beispielsweise mittels Radioaktivitätsdetektion,
visueller Inspektion, nuklearmagnetischer Resonanz (NMR) oder anderen
Mitteln zur Feststellung von Markern in Körpergewebe, in Körperausscheidungen
oder im gesamten Körper
selbst festgestellt. Mit diesen Verfahren können bis dahin nicht bemerkte
Neoplasien festgestellt werden, die einer Feststellung mit anderen
Mitteln entgangen sind. Auch kann eine einmal festgestellte Neoplasie
in Verlauf einer Behandlung wirksam überwacht werden.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf Verfahren zur Erzeugung von patientenspezifischen oder Antigen
spezifischen Bibliotheken aus polyclonalen Antikörper. Diese Bibliotheken, die
wie oben beschrieben erzeugt werden, sind für die Behandlung oder Prophylaxe
einer Anzahl von Krankheiten von Nutzen, darunter Neoplasien, Bösartigkeiten,
Infektionen, genetische Defekte und genetische Defizite. Die Bibliotheken
können
Vektoren umfassen, die DNA enthalten, die die variablen Regionen
codiert, solche, die den gesamten Antikörper codiert oder Antikörper oder
Antikörperfragmente.
Ist sie einmal isoliert und clo niert, kann die Bibliothek expandiert
werden, um sicherzustellen, daß alle
Mitglieder des antigenen Profils vertreten sind, und sie kann leicht
auf andere Vektoren transferiert werden.
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Eine weitere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf Zusammensetzungen, die Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern oder
genetischen Expressionsvektoren, die diese Antikörper codieren, enthalten. Die Bibliothek
oder die selektierte Subbibliothek aus Antikörpern kann mit einem feststellbaren
Marker markiert werden und/oder einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
enthalten. Die Zusammensetzungen können dem Patienten für Diagnose- oder Behandlungsverfahren
verabreicht werden. Alternativ können
dem Patienten Vektor-Bibliotheken
für die
in-vivo-Expression von Antikörpern
oder Antikörperfragmenten
verabreicht werden.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf Diagnosehilfen oder Kits und Verfahren zur Verwendung dieser
Kits zur Feststellung von Krankheiten und Störungen. Die Diagnosehilfen
oder Kits umfassen eine Bibliothek aus polyclonalen Antikörpern, die
mit einem feststellbaren Marker markiert sein kann, zu der eine
Probe hinzugefügt
wird, die im Verdacht steht, das Zielantigen zu enthalten. Die Probe
kann eine Probe einer Körperflüssigkeit,
wie Blut, Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit,
Lymphe oder Urin sein. Das Vorhandensein oder Fehlen von Zielantigen
zeigt das Vorliegen einer bestimmten Krankheit, Störung oder
eines kontaminierenden Stoffes an. Die Proben können biologische Proben von
einem Patienten oder biologische Proben aus einer Umweltquelle sein,
die im Verdacht steht, einen kontaminierenden Stoff zu enthalten.
Die Probe wird mit der Bibliothek vermischt und das Vorhandensein
von Antigen durch die Bindung einer signifikanten Antikörperzahl
und Feststellen des Markers bestimmt.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf Verfahren zur Erzeugung und Anwendung von Bibliotheken von Rezeptorproteinen,
die variable Regionen besitzen. Zu den Rezeptorproteinen, die zur
Erzeugung einer Bibliothek verwendet werden können, zählen T-Zellen-Rezeptoren, B-Zellen-Rezeptoren,
natürliche
Killerzellen-Rezeptoren, und Macrophagen-Rezeptoren. Es wird eine
Probe biologischen Gewebes in eine Zellpopulation, die in der Lage
ist, Rezeptorproteine zu erzeugen, eingeführt. Die mRNAs von Rezeptorproteinen
der variablen Region werden revers in cDNA-Sequenzen transkribiert,
die mit PCR amplifiziert werden, und die so erhaltenen DNA-Fragmente
werden in Expressionsvektoren cloniert. Die Expressionsvektoren, die
das rekombinante Rezeptorprotein codieren, werden selektiert, und
eine Subpopulation wird expandiert, um die Bibliothek zu erzeugen.
Diese Bibliotheken können
dazu benützt
werden, Krankheiten und Störungen, darunter
Neoplasien, Infektionen, genetische Defekte und Defizite zu diagnostizieren,
sichtbar zu machen oder zu behandeln. Zusätzlich können mit den gleichen Verfahren
Bibliotheken von chimären
Proteinen, die sowohl Abschnitte des Antikörpers, als auch solche des
Rezeptorproteins enthalten, erzeugt und angewandt werden.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf Nucleinsäurevektoren,
die dazu benützt
werden können,
antigenspezifische Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern herzustellen.
Diese Vektoren umfassen Erkennungsstellen von Restriktionsenzymen,
die ein bequemes Clonieren von Nucleinsäurefragmenten und -Sequenzen
zur wirkungsvollen PCR-Amplifikation
der cDNA-Fragmente erlauben. Die Vektoren sind so entworfen, daß sie ein
oder mehrere Paare von genetischen Fragmenten aufweisen, die in
Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung insertiert sind, und daß sie weiterhin
wahlweise transkriptions- und translationssteuernde Sequenzen, wie
TATA-Boxen, CAT-Boxen, Ribosomenbindungsstellen, RNA-Polymerase-Initiations-
und -Terminationsstellen, Leadersequenzen, starke Transkriptionspromotoren,
die differenziell gesteuert werden können, oder Teile oder Kombinationen
davon enthalten.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf Verfahren zum Transferieren einer Bibliothek von Nucleinsäurefragmenten
zwischen verschiedenen Vektoren ohne signifikanten Verlust der Diversität der Bibliothek.
Die Bibliothek von Fragmenten wird in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung in erste Vektoren
insertiert und bildet rekombinante Vektoren. Die Inserts dieser
rekombinanten Vektoren werden, beispielsweise durch PCR-Amplifikation
der insertierten Sequenzen oder durch Restriktionsenzymclonierung
ohne signifikanten Diversitätsverlust
der Bibliothek in zweite Vektoren transferiert.
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Andere Ausführungsformen und Vorteile der
Erfindung sind teilweise in den folgenden Beschreibungen dargelegt,
zum anderen Teil werden sie aus dieser Beschreibung offensichtlich,
oder sie werden sich im Zug der Anwendung der Erfindung erschließen.
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Beschreibung der Figuren
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1:
Schematischer Vergleich der Dichte- und Diversitätsunterschiede von Antigenen
auf der Oberfläche
von normalen Zellen im Vergleich zu Tumorzellen.
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2:
Schematische Darstellung des Aufbaus von (a) pUC19-Cκ-CH1, (b)
pUC119-Cκ-CH1, (c) plPPl2 und
(d) pJS.
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3:
Partialkarten der Phagemiden-Expressionsvektoren (a) pComb3, (b)
phh3, (c) plPPl und (d) phh3mu oder phh3hu; nicht maßstäblich dargestellt.
Die Aminosäuren,
die von den Vektoren beigesteuert werden, sind im Ein-Buchstaben-Code
vor den Fd- und L-Ketten-Genen
gezeigt. P = Promotor, 1 = Leadersequenz, lmod = Leadersequenz mit
modifizierter Nucleotidsequenz.
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4:
Schematisches Diagramm (a) eines murinen Dualvektors, pMDV, (b)
eines chimären
Dualvektors, pCDV; hierbei bedeuten: P = Promotor, E = Enhancer,
1 = Leadersequenz, ss = Spleißstelle,
hum = human; und (c) der Transfer variabler Regionen in großer Zahl
(bulk) zwischen Bakterien- und Säuger-Vektoren.
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5:
Schematische Darstellung der cDNA-Synthese- und der PCR-Reaktionen.
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6:
Agarose-Gel Analyse von PCR Produkten.
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7:
Transfer von innerhalb der Zelle verknüpften VH-VL-Kombinationen in einen murinen Expressionsvektor
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8:
Zellüberstandsanalyse
durch (a) Western Blot und (b) ELISA.
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9:
Untersuchung der Phagenbindung an Ars-BSA durch (a) direktbindende
ELISA und (b) Inhibitions-ELISA.
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10:
Erzeugung von (a) bakteriellen und (b) Säuger-Vektoren zur Expression
von Fab-Phagendisplay-Bibliotheken
oder intakten Antikörpern,
abgeleitet aus Kopf-Kopfverknüpften
VH-VL-Kombinationen.
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Wie hier dargestellt und ausführlich beschrieben,
umfaßt
die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung und Verwendung
von Bibliotheken verwandter Proteine, wie Antikörper, Rezeptoren einschließlich T-Zellen-Rezeptoren
und anderer mit dem Immunsystem zusammenhängender Proteine.
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Während
einer Immunantwort werden viele Tausende verschiedener B-Zellen-Clone,
die für
jede antigene Determinante spezifisch sind, erzeugt, und sie vermehren
sich und erzeugen so eine große
Vielfalt von Antikörpern.
Diese Vielfalt wird durch somatische Hypermutationsmechanismen,
die in antigenstimulierten B-Zellen wirken, weiter erhöht. Diese äußerst wirkungsvollen
Vorgänge,
die während
der Reifung der Immunantwort ablaufen, führen zu einer sehr großen Auswahl
von Antikörpern
mit erhöhter
Affinität
zum Antigen. Die derzeit übliche
Antikörpertherapie
hat jedoch ihren Schwerpunkt auf die Verwendung von monoclonalen Antikörpern gelegt,
und wenn B-Zellen-Clone durch Hybridombildung im mortalisiert werden,
ist nur ein kleiner Bruchteil der B-Zellen-Clone repräsentiert.
Weiter sind, da nur teilende Zellen an der Bildung von stabilen
Zellhybriden teilnehmen können,
terminal differenzierte Plasmazellen, die Antikörper hoher Affinität erzeugen, wahrscheinlich
nicht in der Population vertreten.
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Eine Ausführungsform der Erfindung zielt
auf Verfahren zur Behandlung neoplastischer Störungen durch Verwendung von
patientenspezifischen oder krankheitsspezifischen anti-Tumor-Bibliotheken
aus polyclonalen Antikörpern.
Von solchen Bibliotheken erwartet man, daß sie das volle Spektrum einer
Antikörperantwort
gegen Tumorzellen sehr viel wirkungsvoller umfassen als von Hybridomen
erzeugte monoclonale Antikörper
oder monoclonale Antikörper-Cocktails.
Diese Bibliotheken sind auch leicht reproduzierbar und können in der
ganzen Diversität
erzeugt und bereitgehalten werden, die mit einer natürlichen
Immunantwort verbunden ist. Obwohl die Komplexität jeder Bibliothek aus polyclonalen
Antikörpern
nicht unmittelbar bekannt ist, steht zu erwarten, daß sie sehr
hoch ist, und daß sie
die Fähigkeit
beinhaltet, alle Effektorfunktionen zu aktivieren, die mit einer
Immunantwort verbunden sind.
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Eine Bibliothek wird hergestellt,
indem eine Probe von neoplastischem Gewebe von einem Patienten mit
einer bestimmten Störung
gewonnen wird. Das neoplastische Gewebe kann aus Tumorgeweben, Blut
und mit Blut verwandten Geweben, Biopsiegeweben, krebsartigen Geweben,
bösartigen
Geweben, metastasierten Geweben und Kombinationen von solchen gewonnen
werden. Die Proben können
aus der Biopsie von erkranktem Gewebe, primären oder immortalisierten Zellkulturen
von verwandten Zelltypen, oder aus Zellen, die künstlich zur Präsentation
eines bestimmten antigenen Profils stimuliert wurden, gewonnen werden.
Das neoplastische Gewebe kann auch zuerst in einem immundefizitären Tier,
wie einem Mäusemodell
propagiert werden, um die ungehinderte Expression von Antigen zu
unterstützen.
Nutzbare Mäusemodelle
sind unter anderen die Nacktmaus, die SCID-Maus und die verstrahlte
Maus. Von Geburt an thymuslose Nacktmäuse, die in ihrer T-Zellen-Funktion
defizitär
sind, erlauben die in-vivo-Aufzucht von menschlichen Tumoren. Auch
von SCID- (severe combined immunodeficient)- Mäusen mit schweren, kombinierten
Immundefiziten, denen funktionierende B- und T-Zellen fehlen, und
von subletal verstrahlten Mäusen,
deren T- und B-Zellen
zerstört
sind, wurde gezeigt, daß sie
das Wachstum von allogenen und xenogenen Tumoren ermöglichen.
Nacktmäuse
und SCID-Mäuse
sind für
das Wachstum normaler menschlicher Zellen permissiv und können mit
Leukocyten aus menschlichem peripherem Blut (Hu-PBL), beispielsweise
durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von etwa 1–5 × 107 Zellen rekonstituiert werden.
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Alternativ kann das neoplastische
Gewebe der Reinigung unterworfen werden, um ein einzelnes Zielantigen,
Gruppen von Antigenen oder antigenhaltigen Extrakt zu gewinnen.
Diese Vorgehensweise ist besonders nützlich, wenn das Risiko besteht,
unerwünschte
oder gefährliche
Bestandteile aus lebenden und getöteten Zellen in den Prozeß einzuschleppen,
oder einfach aus Gründen
der Bequemlichkeit oder Lagerung. Wenn z. B. menschliche Blutzellen
verwendet werden, besteht das Risiko, infektiöse Viren, wie HIV-1- oder Hepatitisviren
einzuschleppen, und es wäre
wünschenswert,
dieses Risiko zu eliminieren. Aus den Zellen mit stark verringerter
Konzentration normaler Antigene und/oder erhöhter Konzentration neoplastischer
Antigene werden Extrakte präpariert.
Im allgemeinen sind Zelloberflächen-,
Membran- oder Gesamtzellenextrakte
vorzuziehen, und sie können
bei 4°C, –20°C, –80°C oder in
flüssigem
Stickstoff hergestellt und gelagert oder lyophilisiert und etwa
bei Raumtemperatur gelagert werden. Verfahren zur Proteinreinigung
und der Herstellung von Extrakten sind dem Durchschnittsfachmann
wohlbekannt. Viele dieser Vorgehensweisen sind im Guide to Protein
Purification (Methods in Enzymology Bd. 182, Herausgeber M. P. Deutscher,
Academic Press, San Diego CA, 1990) beschrieben. Schließlich kann
Probenantigen auch synthetisch, mit Verfahren der organischen Chemie
hergestellt werden, wenn dies angemessen oder bequem ist.
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Die Probe von neoplastischem Gewebe
oder Antigen wird dann entweder in vitro oder in vivo in eine Zellpopulation
eingeführt,
die in der Lage ist, Antikörper
herzustellen. Verwendbare in vitro-Zellpopulationen sind unter anderen
Zellen von Mäusen,
Schafen, Schweinen, Primaten, Menschen, transformierte, fusionierte oder
immortalisierte Zellen, oder Kombinationen daraus. Die antikörperproduzierenden
Zellen werden dem Tier oder der Zellkultur entnommen und dem Antigen
ausgesetzt. Die antigenstimulierten Zellen können direkt verwendet werden
oder mit einer immortalisierten Zellinie, wie einem Myelom fusioniert
werden, um eine Population von antikörperproduzierenden Hybridomen
zu erzeugen. Zu bevorzugen sind in vivo-Zuchtverfahren; sie beinhalten
die direkte Injektion von Probe in ein Tier, das eine zur Antwort
befähigte
Population von antikörperproduzierenden
Zellen enthält.
Das Tier kann ein Mensch oder ein anderer Primate, eine Maus, eine
Ziege, ein Kaninchen oder ein anderer Säuger sein. Werden Tiere verwendet,
sind mehrfache Injektionen mit Adjuvans das bevorzugte Verfahren,
und dies führt
oft zu einer hohen Konzentration von antigenspezifi schen antikörperproduzierenden
Zellen mit sehr starker Affinität
zum Antigen. Die antikörperproduzierenden
Zellen, die gewöhnlich
aus der Milz gewonnen werden, doch möglicherweise auch aus peripherem
Blut oder Lymphe, können
leicht ärztlich,
nicht ärztlich
oder auf anderem Weg, wie geeignet, isoliert werden.
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Antigenstimulierte antikörperproduzierende
Zellen, die entweder aus in vivo oder aus in vitro-Quellen gewonnen
wurden, wie etwa nach der Fusion mit einer Myelom- oder Hybridom-Zellinie
werden mit einer Fixiererlösung
wie Streck Tissue Fixative (Streck Labs; Omaha, NE) oder mit einer
Lösung,
die eine Chemikalie wie Carbohydrazin, Glutaraldehyd oder Osmiumtetroxid,
vorzugsweise jedoch Formaldehyd oder Kombinationen dieser Chemikalien
enthält.
Zum Beispiel werden 104 bis 108 präzipitierte
Zellen in 0,1 bis 2,0 ml 10% Formaldehydlösung plus 0,15 M NaCl suspendiert.
Die Zellen werden eine Zeitlang auf Eis aufbewahrt, gewaschen und
präzipitiert.
Dann werden diese fixierten Zellen mit einer permeabilisierenden
Lösung,
die Chemikalien wie Nonidet P-40 (NP-40), Brij, Tween, zum Beispiel
Tween-20, Polysorbat, Triton X-100 (TX-100), CHAPS, Sorbitan oder
Kombinationen davon enthält,
durchlässig
gemacht. Die Permeabilisierungslösung kann
zum Beispiel 0,5% NP-40 enthalten, das zum fixierten Zellpräzipitat
hinzugefügt
wird; das Gemisch wird eine Zeitlang auf Eis inkubiert, gewaschen,
präzipitiert
und das Präzipitat
in PBS mit 0,1 M Glycin dispergiert, um die Gesamtstruktur der Zellen
zu erhalten. Alternativ kann die Permeabilisierung die Behandlung
der fixierten Zellen mit Enzymen wie Proteinase K umfassen. Die
Fixierung und Permeabilisierung soll den Zellen die geeignete Porösität verleihen,
um das Eindringen von Enzymen ohne unnötige Zerstörung der Zellabteilungen oder
der Nucleinsäuren
innerhalb der Abteilungen zu ermöglichen.
Die Permeabilisierung erlaubt Enzymen, Nucleotiden und anderen benötigten Reagentien
in die einzelnen Zellen, nunmehr fixierte Zellabteilungen, zu gelangen,
die zelluläre
VH- und VL-mRNA
in VH- und VL-cDNA-Sequenzen
revers zu transkribieren. Der feste Träger kann jeder Träger sein,
der geeignet und für
den Vorgang nicht hinderlich ist, wie eine Glas- oder Plastikoberfläche oder
ein Membranpolymer. Die Zellen sollten räumlich so konzentriert wie
möglich
sein, um das Gesamtvolumen zu minimieren. Ein kleineres Volumen
erlaubt es, geringere Mengen und konzentriertere Lösungen von
Enzymen hinzuzufügen.
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Die reverse Transkription kann in
einem einzelnen Schritt oder wahlweise in einem kombinierten Vorgang
aus reverser Transkription und PCR erfolgen. Die erste Enzymlösung enthält z. B.
reverse Transkriptase, wie AMV- oder MMTV-Reverstranskriptase, eine
balancierte Salzlösung,
die Tris-HCl, pH 8–8.5,
Dithiothreitol (DTT), Kaliumchlorid (KCl) und Magne siumchlorid (MgCl2), ausreichende Mengen aller vier dNTPs
und Primer, die an die mRNA binden und eine 3'-Hydroxylgruppe für die reverse Transkriptase
zur Initiation der Polymerisation liefern. Wahlweise kann ein RNase-Inhibitor,
wie RNasin (Promega; Madison, WI) hinzugefügt werden, um das Degradieren
der RNA zu verhindern. Obwohl jede zur mRNA komplementäre Primersequenz
verwendet werden kann, sind zur Erleichterung der Selektion der
Botschaften von variablen Regionen Primer vorzuziehen, die zum 3'-Ende der VH- und VL-mRNA-Moleküle komplementär sind.
Die Synthese des ersten Stranges wird beispielsweise etwa 60 min
lang bei etwa 42 °C
durchgeführt.
Molekularbiologische Verfahren zur Optimierung enzymatischer Verfahren
in der Ausführung
dieser Erfindung, wie dieses und andere hier beschriebenen, sind
in Current Protocolls in Molecular Biology, Hrsg. F. M. Ausubel
et al., John Wiley & Sons,
NY, 1989) offenbart. Nach dem Abschluß der Reaktion werden die Zellen
präzipitiert,
zur Entfernung der Reaktionsreagentien gewaschen und in PBS resuspendiert.
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Die so erhaltenen cDNA-Sequenzen
werden unter Verwendung von Primern, die für Immunglobulingene und vorzugsweise
für die
terminalen Regionen der VH- und VL-Nucleinsäuren spezifisch sind, mit PCR amplifiziert.
Verfahren der PCR-Amplifikation sind im US-Patent Nr. 4,683,195 offenbart. Vorzugsweise
werden die cDNAs PCR-amplifiziert und in der gleichen Reaktion verknüpft, wozu
zusätzlich
zur cDNA Primer verwendet werden, und zwar ein Primer für das 5'-Ende des Gens der
VH-Region und ein weiterer für das 5'-Ende des Gens der
VL-Region. Diese Primer enthalten auch komplementäre Schwänze zusätzlicher
Sequenz, um die Selbstzusammenstellung der VH-
und VL-Gene zu ermöglichen. Nach der PCR-Amplifikation und
Verkettung ist die Wahrscheinlichkeit, gemischte Produkte – mit anderen
Worten gemischte variablen Regionen – zu erhalten, minimal, da
die Amplifikations- und Verkettungsreaktionen innerhalb jeder Zelle
durchgeführt
wurden. Das Vermischungsrisiko kann weiter verringert werden, indem
sperrige Reagentien, wie Dioxigenin-markierte Nucleotide verwendet
werden, um zusätzlich
sicherzustellen, daß die
cDNA-Paare der V-Region die zellulären Abteilungen nicht verlassen
und sich vermischen, sondern zur PCR-Amplifikation und Verkettung
innerhalb der Zelle verbleiben. Die amplifizierten Sequenzen werden
durch Hybridisierung komplementärer
terminaler Sequenzen verknüpft.
Nach der Verkettung können
die Sequenzen aus den Zellen gewonnen werden. Zum Beispiel können die
Zellen nach der Verkettung mit einer Lösung von Natriumdodecylsulfat
(SDS) gewaschen werden. Das SDS schlägt sich nach einer Inkubation
auf Eis außerhalb
der Zelle nieder, und der Überstand kann in
ein Agarose- oder Acrylamidgel elektrophoresiert werden. Alternativ
oder in Kombination mit dem SDS-Prozeß können die DNA-Produkte innerhalb
der Zelle verbleiben und amplifiziert werden, wenn ein Reagens wie Dioxigenin-gebundene
Nucleotide verwendet wird. Das verknüpfte Produkt wird durch Elektrophorese
des Überstands
gewonnen.
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Nach der Elektrophorese des Überstands
wird die Gelscheibe, die dem passenden Molekulargewicht des verknüpften Produktes
entspricht, entfernt und die DNA beispielsweise auf Silikakügelchen
isoliert. Die gewonnene DNA kann nötigenfalls mit terminalen Primern
PCR-amplifiziert und in Vektoren cloniert werden, die Plasmide,
Phagen, Cosmide, Phagemiden, virale Vektoren oder Kombinationen
davon sein können.
In die hybridisierten Sequenzen können Schnittstellen für bequemen
Einsatz von Restriktionsenzymen eingebaut werden, um ein Clonieren
zu erleichtern. Diese Vektoren können
auch als Bibliothek verknüpfter,
variabler Regionen für
spätere
Verwendung aufbewahrt werden.
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Alternativ können die verknüpften Gene
der VH- und VL-Regionen
unter Verwendung von terminalen „nested" Primern ein zweites Mal PCR-amplifiziert
werden, wodurch man eine Population von DNA-Fragmenten erhält, die
die verknüpften
genetischen Regionen von VH und VL codieren. Diese DNA-Fragmente werden aus
Zellüberständen gewonnen.
Die Gruppierung von VH- und VL-Kombinationen
ist ein Vorteil dieses Verfahrens und erlaubt den Massen- oder Gruppentransfer
von allen Clonen und allen DNA-Fragmenten während dieser und aller Clonierungsvorgänge. Vorzugsweise
werden die VH- und VL-cDNAs
in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung
(← →), also
im Gegensinn zur Kopf-Schwanz-Transkriptionsrichtung (→ → oder ← ←) verknüpft. Diese
Transkriptionsrichtung erlaubt den leichten Transfer von Paaren
der V-Region zwischen Vektoren, sowie die Erzeugung intakter Antikörper oder
Antikörperfragmente,
wie Fab-Fragmente, ohne die ursprüngliche H- und L-Ketten-Kombinationen,
die in der ursprünglichen
Population polyclonaler Antikörper
vorhanden waren, zu verlieren.
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Außerdem erlaubt diese Clonierungsrichtung
die Gruppierung der Transkriptionssteuerungsequenzen in einer einzigen
Region und die gesteuerte Expression eines jeden Gens. Die einzelne
Steuerungsregion kann als Kassette angelegt und mit mehreren Restriktionsenzymstellen
versehen werden, damit sie leicht zwischen verschiedenen Vektoren
transferiert werden kann. Auch erlaubt das Vorliegen der verknüpften Sequenzen
in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung einen Mengentransfer von DNA-Fragmenten,
die beide variablen Regionen umfassen, in einen Expressionsvektor
in einem einzigen Schritt. Kopf-Schwanz-Transkriptionsrichtungen
erfordern im allgemeinen mehrfache Clonierungsschritte.
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Manchmal kann es wünschenswert
sein, die Gensequenzen der variablen Region mit einem Mutagen zu
behandeln. Mutagene erzeugen Punktmutationen, Lücken, Deletionen oder Additionen
in der genetischen Sequenz, die allgemein oder spezifisch, zufällig oder
stellengerichtet sein können.
Verwendbare Mutagene sind unter anderem am Ultraviolettlicht, Gammastrahlung,
Chemikalien wie Ethidiumbromit, Psoralen und Nucleinsäureanaloga,
oder DNA-modifizierende Enzyme, wie Restriktionsenzyme, Transferasen,
Kinasen und spezifische und nichtspezifische Nucleasen und Polymerasen.
Besonders Zufallsmutationen können
durch oligonucleotidgerichtete Mutagenese in die CDRs der Gene der
VH- und VL-Regionen
eingeführt
werden. In die Gensequenzen eingeführte Mutationen werden im Endeffekt
die Komplexität
der Bibliothek wie auch ihre Affinität zu Antigen erhöhen, was
die Nützlichkeit
der Bibliothek für
die Behandlung weiter erhöhen
kann. Weiterhin kann solche Mutagenese an einem einzelnen VH-VL-Paar oder einer
definierten Gruppe von solchen Paaren angewandt werden, um de novo
eine Bibliothek zu erzeugen.
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Das Clonieren geschieht z. B. durch
Spaltung der cDNA- und Vektorsequenzen mit einem Restriktionsenzym,
wobei nötigenfalls
bestimmte Nucleinsäurefragmente
isoliert, in Gegenwart von Ligase in einer geeigneten ausbalancierten
Salzlösung
zusammengemischt werden, und das Gemisch unter enzymatisch akzeptablen
Bedingungen über
einen vorgeschriebenen Zeitraum inkubiert wird. Durch Verwendung
verschiedener Enzymerkennungsstellen an jedem Ende der cDNAs, kann
die Clonierungsrichtung vorbestimmt werden. Die Vektoren werden
in verträgliche
Wirtszellkulturen transformiert und die Kulturen amplifiziert, um
die verschiedenen Vektorpopulationen, die die Bibliothek bilden,
zu expandieren. Die Wirtszellen für prokaryontische Vektoren
können
eine Bakterienkultur wie Escherichia coli sein. Die Wirtszellen
für eukaryontische
Vektoren können
eine Kultur von eukaryontischen Zellen sein, wie jede beliebige
Säuger-,
Insekten-, oder Hefen-Zellinie, die für Gewebekultur geeignet ist.
Bakterielle Zellen werden mit Vektoren durch Calciumchlorid-Hitze-Schock
oder Elektroporation transformiert. Eukaryontische Zellen werden
mit Calciumphosphatpräzipitation
oder Elektroporation transfiziert, obwohl es viele verschiedene
Transformationsverfahren gibt, die ebenfalls akzeptabel wären. Die
DNA-Fragmente können
in prokaryontische oder eukaryontische Expressionsvektoren, chimäre Vektoren
oder Dualvektoren cloniert werden. Der Expressionsvektor kann ein
Plasmid, Cosmid, Phage, viraler Vektor, Phagemid und Kombinationen davon
sein, ist jedoch vorzugsweise ein Phagendisplayvektor, bei dem das
rekombinante Produkt auf der Phagenoberfläche exprimiert wird, um das
Absuchen und die Selektion zu erleichtern. Auf dem Expressionsvektor
können
nützliche
Transkriptions- und Translationsstellen plaziert werden, darunter
RNA-Polymerase-Erkennungsregionen, wie eine TATA-Box-Stelle, eine CAT-Stelle, ein
Enhancer, geeignete Spleißstellen,
wenn nötig
eine AT-reiche Terminalregion und eine Transkriptions-Initiationsstelle.
Nützliche
Stellen zur Erleichterung der Translation sind unter anderen Translations-Start-
und -Stoppstellen und Ribosomenbindungsstellen. Typischerweise sind
einige der nützlicheren
Stellen für
eine wirkungsvolle eukaryontische Expression, wie die SV40-, CMV-,
HSV- oder Baculovirus-Promotor/Enhancer-Region von Viren abgeleitet.
Der erhaltene rekombinante Antikörper
kann von der murinen Klasse IgG1, IgG2A, IgG2B, IgM, IgA,
IgD oder IgE, der menschlichen Klasse IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD oder IgE oder von Kombinationen oder
Fragmenten davon sein. Vorzugsweise ist die Bibliothek aus chimären Antikörpern primär aus IgG-Antikörpern oder
Fab-Antikörperfragmenten
zusammengesetzt.
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Die Amplifikation der Vektorenpopulation
geschieht durch Inkubation und Expansion der rekombinanten Zellkulturen.
Bakterielle Zellkulturen werden beispielsweise in L-Nährmedium über Nacht
bei 37°C
gezüchtet.
Eukaryontische Zellen werden beispielsweise bei 37°C bei hoher
Feuchtigkeit, im CO2-Inkubator 1–7 Tage oder
länger
pro Durchgang inkubiert. An diesem Punkt ist eine ziemlich hohe
Komplexität
der Bibliothek zu erwarten, mit großen Zahlen von Vektoren für jede verschiedene
Vektorpopulation. Die Population enthält eine repräsentative
Nucleinsäuresequenz
für jede
oder fast jede variable Region, die als Antwort auf das anfängliche
Antigen erzeugt wurde.
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Ein Merkmal der Erfindung ist die
Leichtigkeit, mit der Paare genetischer Elemente, die intakte und
exprimierbare variable Regionen enthalten, innerhalb von und zwischen
Vektoren, wie prokaryontischen, eukaryontischen und Säugervektoren
transferiert werden können.
Ganze Bibliotheken oder Sub-Bibliotheken können mit gleicher Wirksamkeit
transferiert werden. Der Transfer geschieht durch Öffnung des
Vektors, vorzugsweise mit Restriktionsenzymen zwecks Stellenspezifität, zwischen
den codierenden Regionen der Aminoenden der Proteine der variablen
Region. In diesem Bereich können
Kassetten mit Promotor- und Leadersequenzen in Kopf-Kopf-Richtung
(Leader-Promoter-Promoter-Leader; IPPI), eingefügt werden, die von Prokaryonten oder
von Säugern
stammen können,
um die vorhandene Steuerungsregion zu ersetzen, oder als erste Steuerungsregion.
Die DNA-Bereiche, die die Gene der variablen Region und die lPPl-Kassette
umfassen, werden dann unter Verwendung von geeigneten Primern PCR-amplifiziert
und zwischen Vektoren transferiert. Gruppen verknüpfter V-Regionen
mit oder ohne Promotor-Leader-Regionen, wie ganze Bibliotheken oder
Teile von Bibliotheken können
schnell und leicht nach Belieben transferiert werden. Diese DNA-Segmente
können
zur schnellen Analyse in die DNA von Phagendisplayvektoren eingebaut
werden, zur langfristigen Aufbewahrung in Cosmide, oder zur anschließenden Expression
in Säugervektoren.
Die Expression kann zum Zweck der Herstellung polyclonaler Antikörper oder
zum Absuchen von Oberflächen-Phagendisplaybibliotheken,
die prokaryontisch oder eukaryontisch sein können, geschehen, um eine oder
mehrere Sub-Bibliotheken zu isolieren. Ein anderes Merkmal der Erfindung
ist die Fähigkeit,
zusätzliche
Sequenzen in die Vektoren einzubauen, um die Handhabung zu erleichtern,
etwa mit zusätzlichen
Restriktionsenzymstellen oder zusätzlichen Transkriptions- oder
Translationssteuerungs-Regionen, um die Proteinexpression zu erleichtern
oder noch weitergehend zu steuern.
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Bibliotheken von Säuger- oder
bakteriellen Expressionsvektoren, die rekombinante antineoplastische Antikörper oder
Antikörperfragmente
codieren, können
in Sub-Bibliotheken selektiert werden, in denen das rekombinante
Partikel, das eine eukaryontische oder prokaryontische Zelle oder
ein Virus sein kann, an neoplastisches oder nicht-neoplastisches
Gewebe adsorbiert wird. Die Selektion wird die gesamte Komplexität der Bibliothek
verringern, doch die antigenspezifische Komplexität der Sub-Bibliothek
dürfte
nicht nennenswert beeinträchtigt
sein. Das Gewebe kann eine weitere Probe des gleichen Gewebes sein,
aus dem die antikörperproduzierenden
Zellen gewonnen wurden, oder ein anderes Gewebe eines anderen oder
desselben Patienten. Beispielsweise können nicht-neoplastische Gewebe
desselben Patienten am nützlichsten
seien, um nicht-neoplastische antigenbindende Antikörper zu
entfernen, die auf der Oberfläche
des präsentierenden
Phagen exprimiert werden. Alternativ kann neoplastisches Gewebe
vom gleichen oder von einem anderen Patienten am nützlichsten
sein, um die spezifischen anti-neoplastischen Antikörper zu
isolieren. In jedem Fall können
Gewebe oder Antigene auf einem festen Träger fixiert werden und Expressionsvektoren
massenhaft beispielsweise Affinitätschromatographieverfahren
unterworfen werden, wobei nach Belieben entweder der Durchfluß oder die
Spülungen
isoliert werden können.
Auch kann die Vektorenpopulation durch beispielsweise Western Blot-Analyse
des exprimierten Antigens oder Southern Blot- oder Northern Blot-Analyse
zur Bestimmung der Nucleinsäure
abgesucht werden. Die so erhaltenen selektierten Vektoren oder Sub-Bibliotheken
werden durch Züchtung
und Expandieren der Population des Wirtsorganismus amplifiziert.
Wenn nötig
können
DNA-Fragmente in
bakteriellen Expressionsvektoren in Säuger -Expressionsvektoren transferiert
werden, z. B. als Kassetten, da die geschaffenen verknüpften Regionen
von Restriktionsenzymstellen flankiert sind. Eine Eigenschaft dieses
Aspekts der Erfindung ist, daß mehr
als 99,9% der Bibliothek während
der Selektion entfernt werden können,
doch die verbleibende Vektorenpopulation, die Subpopulation, noch
amplifiziert werden kann, um große Zahlen von Vektoren oder
eine große
Menge von Protein zu erzeugen. Effektiv geht nichts von der spezifischen
Komplexität
der selektierten oder der Sub-Bibliothek verloren, und diese Sub-Bibliothek kann ebenso leicht
wie die ursprüngliche
Bibliothek intakt und in großer
Menge zwischen Vektoren übertragen
werden.
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Die expandierten und amplifizierten
Populationen der selektierten Expressionsvektoren können für eine spätere Anwendung
aufbewahrt werden, einem Patienten direkt verabreicht werden, wenn
es die Sicherheitsbedingungen erlauben, oder die Produkte können transkribiert
und übersetzt
und die exprimierten neoplastischen Antikörper dem Patienten verabreicht
werden. Die Verabreichung kann auf parenteralem, sublingualem, rektalem
oder enteralem Weg erfolgen. Gewöhnlich
wird die parenterale Verabreichung bevorzugt, zu der auch die intravenöse (i.v.)
Injektion, die subcutane (s.c.) Injektion, die intramuskuläre (i.m.)
Injektion, die intraarterielle Injektion, die intrathecale Injektion,
die intraperitoneale (i.p.) Injektion oder die direkte Injektion
in den Bereich einer Neoplasie gehören. Es können sowohl Antikörper als
auch Vektoren verabreicht werden, jedoch sind Antikörper vorzuziehen,
da die wirkungsvolle Expression aus dem Vektor und Umständen weitere Komplikationen
aufwerfen kann, oder es können
Sicherheitsbedenken in bezug auf das Einschleusen rekombinanter
Vektoren-DNA in das Tier bestehen.
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Die neoplastischen Störungen,
die mit diesen Verfahren behandelt werden können, sind zahlreich und beinhalten
Leukämien,
Lymphome, Sarcome, Carcinome, neutrale Zelltumore, schuppige Zellcarcinome, Keimzellentumore,
Metastasen, undifferenzierte Tumore, Seminome, Melanome, Neuroblastome,
gemischte Zelltumore, durch infektiöse Mittel verursachte Neoplasien
und andere Bösartigkeiten.
Die universelle Anwendbarkeit des Verfahrens ist zum Teil auf seine
Fähigkeit
zurückzuführen, Proben
von fast jedem beliebigen Antigen ausnützen zu können. Vorzugsweise ist der
zu behandelnde Patient ein Mensch, doch ist auch jeder Säuger mit
einem funktionierenden humoralen Immunsystem ebenfalls behandelbar.
Die Patienten können
je nach Notwendigkeit therapeutisch oder prophylaktisch nach vorgeschriebenen Verfahren
behandelt werden. Beispielsweise durchlaufen bestimmte Krebserkrankungen
aufeinanderfolgende Zyklen von Progression und Regression, die sich über Monate
und Jahre erstrecken. Die Bibliotheken können kurz vor der Progressionsphase
hergestellt und verabreicht werden, um das Wachstum des Krebses,
den Befall andere Gewebe oder den Vorgang der Metastasenbildung
zu hemmen. Die Bibliotheken können
auch als große
Pillen verabreicht werden, um den Krebs mit einer einzigen Dosis
oder mit einer Anzahl von Dosen zu eliminieren.
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Die Bibliothek kann auch im Zusammenwirken
mit einem anti-neoplastischen Mittel, das das Immunsystem des Patienten
stärkt,
verabreicht werden, wie zum Beispiel T-Zellen-Wachstumsfaktor, B-Zellen-Wachstumsfaktor,
Granulocyten/Macrophagen-Wachstumsfaktor, Granulocyten-Wachstumsfaktor,
Macrophagen-Wachstumsfaktor, Stammzellen-Wachstumsfaktor, transformierender
Wachstumsfaktor, Erythropoietin, Stahlfaktor, morphogenes Knochenprotein,
Differtierungsmittel, Interleukin, Interferon, Hormone, Bestandteile
des Komplementsystems oder eine Kombination davon. Das Behandlungsverfahren
des Patienten kann auch andere Therapieformen einschließen, wie
Chemotherapie, Bestrahlungstherapie, Diät oder Imunotoxintherapie.
nützliche
chemotherapeutische Mittel sind unter anderen alkylierende Mittel,
Purin- und Pyrimidinanaloga, Vincamin und vincaminartige Alkaloide,
Etoposide und etoposidartige Wirkstoffe, Antibiotika, Corticosteroide,
Nitroharnstoffe, Antimetabolite, auf Platin basierende cytotoxische
Gifte, hormonale Antagonisten, Anti-Androgene und Anti-Östrogene.
Diese Behandlung Formen können
in ein Gesamtbehandlungsverfahren für die Neoplasie des Patienten
einbezogen werden.
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Die immuntoxische Therapie kann durch
die hier offenbarten Verfahren erleichtert werden. Zum Beispiel
können
rekombinante DNA-Fragmente, die sowohl die VH-
als auch die VL-Antikörperfragmente codieren, in
Expressionsvektoren cloniert werden, die die konstante Region des
Antikörpers
und eine giftige Substanz codieren. Die exprimierten Fusionsprodukte
werden daher eine höhere
Anzahl verschiedener Antikörper
für die
Zielneoplasie aufweisen, von denen jeder mit einer giftigen Substanz,
wie einem tierischen, pflanzlichen bakteriellen, fungalen, viralen
oder parasitischen Toxin verbunden ist. Die Verabreichung der Antikörperbibliothek
an dem Patienten ruft nicht nur die Immunabwehr des Wirtes auf den
Plan, sondern bringt das Toxin in direkten Kontakt mit der erkrankten
Zelle, was die Zerstörung
der Neoplasie unter Umständen
erleichtern kann. Zu den besonders nützlichen Giftstoffen zählen aus bestimmten
Pflanzen und Bakterien abgeleitete Toxine, wie die Pseudomonas-Toxin,
Diphteria-Toxin, Escherichia-Toxin und Ricin.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf ein Verfahren zum Sichtbarmachen einer neoplastischen Störung bei
einem Patienten. Eine Bibliothek patientenspezifischer antineoplastischer
Antikörper wird
wie vorstehend beschrieben erzeugt und mit einem pharmazeutisch
verträglichen
Träger,
wie Wasser, einem Salz oder einer gepufferten Lösung, Glycerin, Öl, einem
Saccharid oder Polysaccharid, Cellulose oder Stärke, Alkohol oder Kombinationen
daraus vermischt. Die Antikörper
der Bibliothek werden mit einem feststellbaren Marker markiert und
dem Patienten verabreicht. Die Antikörper wandern durch den Körper und
binden an ein Ziel, das die Neoplasie oder eine neoplastische Metastase
sein kann, und die Markierung wird im Patienten sichtbar gemacht.
Feststellbare Marker, die für
diese Vorgehensweise nützlich
sein können,
sind unter anderen Radioisotope, stabile Isotope, Enzyme, fluoreszierende
Verbindungen, lumineszierende Verbindungen, färbende Verbindungen, Metalle
oder elektrische Ladungen. Die nunmehr markierte Neoplasie kann durch
geeignete Mittel festgestellt werden, und zwar je nach Marker mit
einem Geigerzähler,
einem Abbildungsgerät
für nuklearmagnetische
Resonanz (NMR), Sichtdetektoren oder einfach nach Sicht, oder durch Autoradiographie.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf eine Zusammensetzung, die eine patientenspezifische Bibliothek
anti-neoplastischer Antikörper
oder Antikörperfragmente
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfaßt.
Die Zusammensetzungen werden an Patienten mit der charakteristischen
Neoplasie, gegen die die hergestellten Antikörper gerichtet sind, verabreicht.
Der pharmazeutisch verträgliche
Träger
ist eine Verbindung oder ein Medium, die/das die Verabreichung erleichtert,
die mögliche
Aufbewahrungsdauer der Zusammensetzung verlängert oder den Nutzen der Zusammensetzung
für den
Patienten, beispielsweise durch Steigerung der Zirkulation oder
des Serum-Halblebens erhöht.
Nutzbare Träger
sind unter anderen Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol, Glykole, darunter
Polyethylenglykol, Öl,
Polysaccharide, Salze, Glycerin, Stabilisatoren, Emulgatoren und
Kombinationen davon. Die Zusammensetzung kann Antikörper oder
Antikörperfragmente,
vorzugsweise Fab-Fragmente umfassen, die aus der Gruppe bestehend
aus den murinen Klassen IgG1, IgG2A, IgG2B, IgM, IgA,
IgD und IgE, den menschlichen Klassen IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD oder IgE oder Kombinationen oder Fragmenten
davon ausgewählt
wird. Die Zusammensetzung kann auch durch Dialyse oder Lyophilisierung
des Proteins, um alle Flüssigkeit
zu entfernen, über
lange Zeiträume
aufbewahrt werden. Lyophilisierte Antikörper können bei Raumtemperatur jahrelang
stabil bleiben.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf Verfahren zur Herstellung und Anwendung einer Bibliothek von
antigen- oder gewebespezifischen polyclonalen Antikörpern oder
Antikörperfragmenten
wie vorstehend beschrieben. Es wird eine Probe von biologischem
Gewebe oder von einem auf natürlichem,
rekombinantem oder synthetischem Weg isolierten Antigen genommen,
und zwar möglichst
von dem zu behandelnden Patienten oder von einem Patienten mit einer
verwandten Störung.
Das biologische Gewebe oder Antigen, das zur Stimulation der antikörperproduzierenden
Zellen verwendet wird, kann von Tumorgeweben, Blut und mit Blut
verwandten Geweben, Biopsiegeweben, infizierten Geweben, Bakterien,
Pilzen, Parasiten, bösartigen Geweben,
genetisch abnormen Geweben oder Kombinationen davon abgeleitet sein,
oder aus einer Quelle der Umwelt stammen, wie einem Wasservorkommen,
aus dem Boden, aus Abfall menschlichen und natürlichen Ursprungs oder Biomasse.
Die Probe wird zu einer Zellpopulation gegeben, die in der Lage
ist, Antikörper zu
erzeugen. Die VH- und VL-mRNA
der Zellpopulation werden revers in VH-
und VL-cDNA-Sequenzen transkribiert, die PCR-amplifiziert
werden, wobei die so erhaltenen amplifizierten Sequenzen verknüpft werden.
Die verknüpften
Sequenzen werden PCR-amplifiziert, um eine Population von DNA-Fragmenten
zu erzeugen, die VH- und VL-Antikörperfragmente
codieren, die in Expressionsvektoren cloniert werden, und die Population
clonierter Expressionsvektoren wird expandiert. Die Expressionsvektoren,
die antigen- oder gewebespezifische Antikörper oder Antikörperfragmente
codieren, können
selektiert und die selektierte Subpopulation expandiert werden,
um die Bibliothek zu erzeugen. Die Bibliothek aus polyclonalen Fragmenten
kann im Leserahmen in andere Expressionsvektoren cloniert werden,
die Gensequenzen der konstanten Antikörperregionen codieren, um polyclonale
Antikörper
oder Antikörperfragmente
zu exprimieren. Diese Antikörper
können
dann zwecks systemischer Infektion dem Patienten intravenös oder subcutan
injiziert, zur örtlichen
Behandlung direkt auf eine Wunde aufgetragen oder je nach Bedarf
dem Patienten auf andere Art und Weise verabreicht werden.
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Krankheitsspezifische oder antigenspezifische
Bibliotheken können
in Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung solcher Störungen wie
viraler, Pilz-, Parasiten- oder bakterieller Infektionen, genetischer
Abnormitäten
und Vergiftungen angewandt werden. Zum Beispiel können Bibliotheken
von Antikörpern
gegen das gp120-Protein des HIV-1-Virus, das das Immunschwächesyndrom
(AIDS) verursacht, erzeugt und AIDS-Patienten verabreicht werden,
um den Virus-induzierten Zelltod, die Virusladung oder die Infektiosität zu verringern,
oder als Prophylaxe, um einer möglichen
Infektion nach einem Kontakt oder bei der Gefahr eines Kontaktes
vorzubeugen. Die Bibliotheken können
dazu verwendet werden, andere Formen der passiven Immuntherapie
zu ersetzen oder zu ergänzen,
wie Gammaglobulinbehandlungen bei solchen Krankheiten wie Tollwut,
Hepatitis, Varicella-Zoster-Virus, Herpes oder Röteln. Beispielsweise kann eine
anti- Röteln-Bibliothek nach
Bedarf schwangeren Frauen periodisch verabreicht werden, die Gefahr
laufen, seitens eines anderen Familienangehörigen mit Röteln infiziert zu werden. Das
ist frei von schädlichen
Nebenwirkungen und wirkungsvoll. Anti-Herpes-Antikörper könnten nichtinfizierten Personen
seitens infizierter Partner übertragen
werden. Gehirnhautentzündung
kann besonders bei Kindern eine lebensbedrohliche Krankheit sein,
da eine wirkungsvolle Behandlung nicht immer bestimmt und schnell
verabreicht werden kann. Im Gegensatz dazu können Bibliotheken polyclonaler
Anti-Meningitis-Antikörper
gelagert und dann angewandt werden, wenn ein Verdachtsfall vorliegt,
denn das Risiko von Komplikationen bei der Behandlung ist sehr niedrig.
Polyclonale Antikörper, die
mit diesen Verfahren erzeugt wurden, können konventionelle Influenza-Impfungen
ergänzen,
indem sie kurzfristig Schutz gegen Influenza bieten, bis das eigene
Immunsystem des Wirtes eine ausreichende Antikörperantwort auf das Antigen
liefern kann.
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Polyclonale Bibliotheken können auch
zur Prophylaxe oder Behandlung bei Patienten mit Verbrennungen nützlich sein,
die gegen eine Vielzahl von im Spital erworbenen Infektionen empfindlich
sind, z. B. durch Staphylococcus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria,
Pseudomonas und die Actinomyceten. Die Bibliotheken können dazu
verwendet werden, die bakterielle Sepsis durch Erzeugung und Verabreichung
von Bibliotheken gegen Lipopolysaccharide (LPS), Lipid A, Tumornekrosefaktor
oder LPS-bindende Proteine zu behandeln, ihnen vorzubeugen oder
die damit einhergehenden Symptome zu lindern. Auch andere Vergiftungen können mit
Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern behandelt werden, wie
von bakteriellen oder viralen Mikroorganismen hervorgerufene Störungen des
Magen-Darm-Traktes,
durch Hefen- oder andere mykotische Infektionen hervorgerufene Toxikosen
oder durch Umwelteinflüsse
verursachte Vergiftung mit schädlichen
Metallen, wie Blei oder Aluminium, Pestiziden, Industrieabfällen, Krebserregern
und anderen schädlichen
organischen oder anorganischen Verbindungen.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf einen Diagnosekit zur Feststellung einer Krankheit oder Störung bei
einem Patienten, oder eines verseuchenden Stoffes in der Umgebung,
der eine Bibliothek von antigen-, gewebe- oder patientenspezifischen
Antikörpern
oder Antikörperfragmenten
umfaßt.
Der Diagnosekit kann dazu verwendet werden, Krankheiten, wie bakterielle,
virale, Parasiten- oder mykotische Infektionen, Neoplasien oder
genetische Defekte und Defizite festzustellen. Die biologische Probe
kann Blut, Urin, Gallenflüssigkeit,
Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit,
Lymphe, Fruchtwasser oder Peritonealflüssigkeit sein, die vorzugsweise
von einem Menschen gewonnen wurden. Bibliotheken, die aus Umweltproben
gewonnen wurden, können
dazu verwendet werden, verseuchende Stoffe in Proben aus Flüssen und
Strömen,
Salz- oder Süßwasservorkommen,
Boden oder Fels oder Proben von Biomasse festzustellen. Der Antikörper kann
ein ganzer Antikörper,
wie etwa ein IgG oder ein Antikörperfragment,
wie ein Fab-Fragment sein. Die Bibliothek kann mit einem feststellbaren
Marker markiert werden, oder der Kit kann außerdem einen markierten sekundären Antikörper enthalten,
der Antigen-Antikörper-Komplexe
erkennt und an diese bindet. Vorzugsweise ist der feststellbare
Marker visuell feststellbar, wie ein Enzym, eine fluoreszierende
Chemikalie, lumineszierende Chemikalie, oder färbende Chemikalie, was die
Bestimmung der Testergebnisse seitens des Anwenders oder Arztes
erleichtert. Das Diagnosemittel kann weiterhin Agentien zur Erhöhung der
Stabilität,
der Haltbarkeit, solche zur Hemmung oder Verhinderung der Kontamination
des Produktes und zur Steigerung der Geschwindigkeit der Feststellung
umfassen. Nützliche
Stabilisierungsmittel sind unter anderen Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol,
Glykole, darunter Polyethylenglykol, Öl, Polysaccharide; Salze, Glycerin,
Stabilisatoren, Emulgatoren und Kombinationen davon. Nützliche
antibakterielle Mittel sind unter anderen Antibiotika, bakteriostatische
und bakterizide Chemikalien. Mittel zum Optimieren der Feststellungsgeschwindigkeit,
wie Salze und Puffer, können
die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen.
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Eine weitere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von Rezeptorproteinen
oder beliebiger anderer Proteine, die Variabilität aufweisen. Als Rezeptorproteine
können
bei diesem Verfahren beliebige eukaryontische oder prokaryontische
Proteine verwendet werden, die variable Regionen haben, darunter
T-Zellen-Rezeptoren,
wie TcR, B-Zellen Rezeptoren einschließlich Immunglobulinen, natürliche Killer-Zellen-
(NK-) Rezeptoren, Macrophagen-Rezeptoren und Teile und Kombinationen davon.
Kurz gesagt, wird eine Probe eines biologischen Gewebes, wie normales
Gewebe, neoplasti sches Gewebe, infiziertes Gewebe, Gewebe, das extrazelluläres Matrixprotein
(ECM) enthält,
oder ein beliebiges abnormes Gewebe in eine Zellpopulation eingeführt, die
in der Lage ist, die Rezeptorproteine zu erzeugen. Die Zellpopulation
wird fixiert und die Zellen werden permeabilisiert. Die mRNAs der
variablen Region des Rezeptorproteins werden mittels einer reversen
Transkriptase in cDNA-Sequenzen revers transkribiert. Die cDNA-Sequenzen
werden PCR-amplifiziert und verknüpft, und zwar vorzugsweise
durch Hybridisierung komplementärer
Sequenzen an den terminalen Regionen dieser cDNAs. Die verknüpften Sequenzen
werden PCR-amplifiziert und so eine Population von DNA-Fragmenten
erzeugt, die die variablen Regionen des Rezeptorproteins codieren.
Diese DNA-Fragmente enthalten die variablen Regionen vorzugsweise
in einer Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung und werden massenhaft
in Expressionsvektoren cloniert. Nützliche Expressionsvektoren
sind unter anderen Phagen, wie Display-Phagen, Cosmide, virale Vektoren,
Phagemiden oder Kombinationen davon, und die in Wirtsorganismen
transformierten Vektoren und die verschiedenen Organismenpopulationen
werden expandiert. Die Expressionsvektoren, die das rekombinante
Rezeptorprotein codieren, werden selektiert und die Subpopulation
wird expandiert. Die Subpopulation kann wenn nötig in Expressionsvektoren
cloniert werden, die im selben Leserahmen Gene konstanter Rezeptorregionen
enthalten, und die Bibliothek kann nochmals expandiert und exprimiert
werden, um die Sub-Bibliothek selektierter Rezeptorproteine zu bilden.
Chimäre
Bibliotheken können
leicht durch Clonieren der selektierten Gene der variablen Regionen
in Expressionsvektoren, die die Gene der konstanten Region anderer
Proteine, wie Gene konstanter Antikörperregionen oder T-Zellen-Rezeptor-Gene
enthalten, hergestellt werden. Die selektierten Subbibliotheken
können
direkt verwendet werden oder vor der Transfektion in Wirtszellen
in andere Expressionsvektoren transferiert werden. Die Wirtszellen
können
T-Zellen sein, die vom Patienten abgeleitet sind, und die die Rezeptorenbibliothek
auf ihrer Oberfläche
exprimieren, wenn sie wieder in den Patienten eingeführt werden.
Diese An von T-Zellen-Therapie kann dazu verwendet werden, eine
Immunantwort zu stimulieren, um die gleichen Krankheiten wie die
bei der Antikörpertherapie
beschriebenen zu heilen.
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Durch Verwendung der vorstehend diskutierten
Verfahren zur Herstellung von Bibliotheken aus polyclonalen Antikörpern und
von Bibliotheken von T-Zellen-Rezeptoren, können Bibliotheken chimärer Fusionsproteine
hergestellt werden, die die variablen Regionen von Antikörpern verbunden
mit den konstanten Regionen von T-Zellen-Rezeptoren enthalten. Solche
Bibliotheken können
nützlich
für die
Behandlung oder zur Vorbeugung von Krankhei ten und Störungen sein,
indem sie wie vorstehend beschrieben die Immunantwort eines Patienten
stimulieren oder verstärken.
Die Bindung des Antigens an den T-Zellen-Rezeptor ist beispielsweise
ein integraler Bestandteil der Immunantwort. Durch Bereitstellung
einer Bibliothek aus chimären
Antikörpern/TcR-Protein
und durch Transfektion dieser Bibliothek in eine T-Zellen-Population
eines Patienten kann die eigene Immunantwort des Patienten verstärkt werden,
um eine Krankheit oder Störung
abzuwehren, die sonst nicht erfolgreich bekämpft werden könnte.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf Nucleinsäurevektoren,
die dazu verwendet werden können,
die antigenspezifischen Bibliotheken und Sub-Bibliotheken aus polyclonalen
Antikörpern
zu erzeugen. Diese Vektoren umfassen Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme,
die ein bequemes Clonieren erlauben, und Sequenzen, um rekombinante
Nucleinsäurefragmente
wirkungsvoll durch PCR zu amplifizieren. Geeignete Vektoren sind
unter anderen Plasmide, Phagen, Phagemiden, Display Phagen, Cosmide,
virale Vektoren und Kombinationen davon. Die Vektoren sind so entworfen,
daß sie
ein oder mehrere Paare genetischer Fragmente haben, wie cDNA-Fragmente,
die in Kopf-Kopf-Transskriptionsrichtung insertiert sind. Vorzugsweise
sind die Vektoren Expressionsvektoren und können prokaryontischer, eukaryontischer
oder kombinierter oder teilweise solcher An sein. Diese Vektoren
enthalten auch vorzugsweise transkriptions- und translationssteuernde
Sequenzen, wie TATA-Boxen,
CAT-Boxen, Ribosomenbindungsstellen, RNA-Polymerase-Initiations-
und Terminationsstellen, Leader-Sequenzen, starke Transkriptionspromotoren,
die gesteuert sein können,
oder Teile oder Kombinationen davon.
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Beispielsweise kann ein nützlicher
Vektor wie in 2 graphisch
dargestellt konstruiert werden. Zuerst kann das Rückgrat des
Vektors wie in 2B gezeigt
aus einem handelsüblichen
Phagemidenvektor, wie pUC119 (United States Biochemical; Cleveland,
OH) gewonnen werden. Zwei Primer werden zur Amplifikation eines
pUC119-Rückgrats
verwendet, wobei am Ende eines lacZ' begonnen und am Beginn von lacI aufgehört wird.
Der Vorwärtsprimer
ist zum Ende des lacZ' komplementär und hat
einen nichthybridisierenden Schwanz, der eine BglII-Stelle enthält. Der
Rückwärtsprimer
ist zum Anfang von lacI komplementär und hat einen nichthybridisierbaren
Schwanz, der eine BstEII-Stelle enthält. Nach der PCR-Amplifikation wird
dieses Rückgrat mit
BglII und BstEII verdaut und mit einem BstEII-Insert ligiert (2B). Das BstEII-Insert wird
folgendermaßen gewonnen
(2A): zuerst wird der
Polylinker von pUC19 (New England Biolabs; Beverly, MA) durch einen Polylinker
er setzt, der BglII-EcoRI-HindIII-BstEII enthält, wobei alle Restriktionsstellen
durch 6 Nucleotide voneinander getrennt sind. Das Ersetzen geschieht
durch Verdauung von pUC19 mit EcoRI und HindIII, wobei die Überhänge mit
S1-Nuclease entfernt werden und das Rückgrat mit einem doppelsträngigen synthetischen
Linker mit den Stellen BgIII-EcoRI-HindIII-BstEII ligiert wird, und so einen modifizierter
pUC (pUC19mod) erzeugt wird. (Man bemerke, daß pUC19 nur dazu verwendet
wird, einen Polylinker mit Restriktionsenzymstellen zu liefern.
Es könnte
auch jeder beliebige andere, schon existierende oder leicht herzustellende
Vektor verwendet werden, der einen Polylinker mit geeigneten Restriktionsstellen
enthält.)
Ein Cκ-Gen
wird von aus menschlichen Leukocyten abgeleiteter RNA revers transkribiert
und unter Verwendung eines reversen Primers, der einen nichthybridisierenden
5'-Schwanz mit einer
BstEII-Restriktionsstelle, eine Translations-Terminationsstelle (Stop-Stelle)
und eine XbaI-Stelle umfaßt,
sowie eines Vorwärts-Primers,
der einen nichthybridisierenden 5'-Schwanz mit einer HindIII-Retriktionsstelle
umfaßt,
durch PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt
wird mit BstEII und HindIII verdaut und mit einem BstEII-HindIII-pUC19mod-Rückgrat ligiert, und so pUC19-Cκ erzeugt.
Es wird ein EcoRI-BgIII-DNA-Fragment synthetisiert, das das menschliche γ1-CH1-Gen
enthält,
angelagert an das gIII-Gensegment, das ein Fragment des cp-III-Phagenhüllproteins
(Aminosäuren
198–407)
enthält.
Kurz gesagt, wird ein cpIII-Hüllprotein-Genfragment
von einem M13-Vektor, wie M13mp18 (New England Biolabs; Beverly,
MA) amplifiziert, wobei ein Rückwärts-Primer,
der zur Endsequenz des cpIII-Fragments komplementär ist, jedoch
mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der eine BglII-Stelle, eine
Translations-Terminationsstelle (Stop-Stelle) und eine NheI-Stelle
enthält,
verwendet wird. Der Vorwärts-Primer
für die
Amplifikation des cpIII-Fragments ist zu cpIII komplementär und hat
einen nichthybridisierenden 5'-Schwanz,
der eine zum Ende des CH1-Gens komplementäre Sequenz und eine SpeI-Stelle
enthält.
Ein menschliches CH1-Gen wird von RNA, die aus menschlichen Leukocyten
abgeleitet ist, revers transkribiert und PCR-amplifiziert, wozu ein Rückwärts-Primer,
der zum Ende des γ1-CH1-Gens
komplementär
ist, mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der eine SpeI-Stelle enthält, verwendet
wird. Der Vorwärts-Primer
ist zum Anfang des CH1-Gens komplementär, mit einem nichthybridisierenden
5'-Schwanz, der
eine EcoRI-Stelle enthält.
Da der Vorwärts- und
der Rückwärts-Primer komplementäre Sequenzen
enthalten, werden die cpIII- und CH1-PCR-Produkte durch Überlappungsextensions-PCR
unter Verwendung des cpIII-Rückwärts-Primers
und des CH1-Vorwärtsprimers
angelagert. Das so erhaltene PCR-Produkt wird mit EcoRI und BgIII
ge schnitten und mit einem aus pUC19-Cκ abgeleiteten EcoRI-BgIII-Rückgrat ligiert,
wodurch pUC19-Cκ-CH1
erzeugt wird. Das BglII-BstEII-Insert wird entfernt und mit dem
aus pUC19 abgeleiteten BglII-BstEII-Rückgrat ligiert, wodurch der phh3hu-artige
Vektor pUC119-Cκ-CH1 (2B) erzeugt wird.
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Auch eine Kassette vom lppl-Typ kann
leicht erzeugt werden (2C).
Ein BamHI-XhoI-Fragment wird
aus dem tac-Promotor (Ptac) und pe1B-Leadersequenzen zusammengebaut.
Die pe1B-Leadersequenz wird durch PCR-Amplifikation aus dem Vektor
pET-22b (Novagen, Inc.; Madison, WI), gewonnen, wozu ein Vorwärts-Primer
und ein Rückwärts-Primer
mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der eine XhoI-Stelle und Codons
für LKVQA
enthält,
verwendet werden. Die Ptac-Sequenz wird durch PCR-Amplifikation
aus dem Vektor pDR540 (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) gewonnen,
wobei ein Vorwärts-Primer
mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der eine BamHI-Stelle enthält und ein
Rückwärts-Primer mit einem
nichthybridisierenden 5'-Schwanz,
der komplementär
zur Anfangssequenz des pe1B-Leaders in pET-22b ist, verwendet werden.
Der pe1B-Leader und die Ptac-Produkte können über ihre komplementären Enden
hybridisieren und werden durch Überlappungsextensions-PCR
unter Verwendung der BamHI- und XhoI-enthaltenden Primer angelagert.
Das so erhaltene PCR-Produkt wird mit XhoI und BamHI verdaut, und
mit einem XhoI-BamHI-Rückgrat,
das aus pUC19Xho abgeleitet ist, ligiert, wodurch pPl erzeugt wird.
(Das pUC 19Xho-Rückgrat
wird durch Verdauung von pUC 19 mit HindIII, Ausfüllen der Überhänge mit
Klenow und Ligierung des Rückgrates
mit einem XhoI-Linker gebildet.) Ein BamHI-SacI-Fragment wird aus dem lacZ-Promotor
(PlacZ) und gIII-Leadersequenz des cpIII-Hüllproteins von M13 zusammengestellt.
Die gIII-Leadersequenz erhält
man durch PCR-Amplifikation von M13mp18 unter Verwendung eines Vorwärts-Primers
und eines Rückwärts-Primers, der einen nichthybridisierenden
5'-Schwanz mit einer
SacI-Stelle und die Codons für
EA enthält.
Die PlacZ-Sequenz erhält
man durch PCR-Amplifikation von pUC119 unter Verwendung eines Vorwärts-Primers,
mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz mit einer BamHI-Stelle und
eines Rückwärts-Primers
mit einem nichthybridisierenden 5'-Schwanz, der komplementär zur Anfangssequenz
des gIII-Leaders ist. Die gIII-Leader- und PlacZ-PCR-Produkte können durch
ihre komplementären
Enden hybridisieren und werden durch Überlappungsextensions-PCR unter
Verwendung der BamHI- und SacI-enthaltenden Endprimer angelagert.
Das so erhaltene PCR-Produkt wird mit SacI und BamHI verdaut und
mit einem SacI-BamHI-Rückgrat,
das aus pPl abgeleitet ist, ligiert, wodurch der plPPl-artige Vektor
plPPl2 erzeugt wird. Wie in 2D gezeigt
wird, können in
den Vektor pUC119-Cκ-CH1
Kopf-Kopf-verknüpfte Gene
der VH- und VL-Region
insertiert werden. Die erhaltenen Vektoren können mit XhoI und SacI geöffnet werden,
um eine lPPl-Kassette aus dem Vektor plPPl2 zu insertieren und so
pJS zu erzeugen.
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Eine andere Ausführungsform der Erfindung zielt
auf ein Verfahren zum Transfer einer Bibliothek von Nucleinsäurefragmenten
zwischen verschiedenen Vektoren ohne signifikanten Verlust an Bibliotheksdiversität. Die Bibliothek
kann eine Bibliothek von cDNA-Fragmenten, Fragmenten genomischer
DNA, rekombinanten Nucleinsäuren,
RNA, oder eine Kombination davon sein. Die Fragmente werden in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung
in einen ersten Vektor insertiert. Die Insertion kann durch Ligierung
der Nucleinsäuren
in Vektoren geschehen, die durch Spaltung mit Restriktionsenzymen
geöffnet
wurden. Die Fragmente können
vor der Insertion modifiziert werden, wie etwa durch Hinzufügen von
Linkem und Restriktionsenzymen oder anderen Stellen, oder durch
Anfügen
von zusätzlichen
codierenden Sequenzen. Der Erst- und der Zweitektor können prokaryontische
oder eukaryontische Vektoren sein, und sie sind vorzugsweise Expressionsvektoren.
Die insertierten Sequenzen werden aus den ersten Vektoren gewonnen
und ohne signifikanten Verlust von Bibliotheksdiversität in zweite
Vektoren reinsertiert. Die Fragmente können durch Spaltung der rekombinanten
ersten Vektoren mit den geeigneten Restriktionsenzymen in großer Menge
gewonnen werden. Alternativ können
die Sequenzen der Fragmente durch PCR-Amplifikation der insertierten
Sequenzen gewonnen werden. Die Reinsertion geschieht durch Ligierung
der Sequenzen in die zweiten Vektoren, doch die Sequenzen können wenn
gewünscht
vor der Ligierung wie beschrieben modifiziert werden. Die Gesamtdiversität der Bibliothek
umfaßt mehr
als mindestens 10 verschiedene Fragmente, vorzugsweise 100 verschiedene
Fragmente, stärker
vorzuziehen 1000 verschiedene Fragmente, noch stärker vorzuziehen wenigstens
10.000 verschiedene Fragmente, und möglicherweise noch viel mehr,
wie 105, 106, 107, 108 und 109 verschiedene Fragmente. Nach dem Transfer
ist zu erwarten, daß die
Diversität
der Bibliothek, wie durch Analyse der erhaltenen Rekombinanten festgestellt
werden kann, um weniger als 90%, vorzugsweise um weniger als 50%,
stärker
bevorzugt um weniger als 10%, noch stärker bevorzugt um weniger als
1%, und noch stärker
bevorzugt um weniger als 0,1% verringert ist, obwohl dies stärker von
dem jeweiligen Bibliothekstyp abhängen kann, der hergestellt
wird.
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Die folgenden Beispiele veranschaulichen
Ausführungsformen
der Erfindung, sollen jedoch nicht als den Schutzbereich der Erfindung
einschränkend
betrachtet werden.
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Beispiele
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Beispiel 1: In vivo- und
in vitro-Präparation
von Tumorproben
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Pathologische Abfälle von menschlichen Tumoren
und normalen Geweben wurden aus der Chirurgischen Pathologie am
Boston University Medical Center bezogen. Von den präparierten
Tumoren waren drei Eierstock-Carcinome, zwei waren Gebärmutter-Adenocarcinome,
einer war ein Mesotheliom des Bauchfells und einer war ein Mundtumor
vom Mundboden. Zwei Stück
des Tumorgewebes und zwei Stück
eines beliebigen, verfügbaren
normalen Gewebes wurden in OCT (Polyvinylalkohol, Benzalkonchlorid,
Polyethylenglykol, alle in destilliertem Wasser; Miles Laboratories;
Kankakee, IL) schockgefroren, um anschließend tiefgefrorene (Kryostat-)
Schnitte herzustellen. War genügend
normales Gewebe verfügbar,
wurden ein paar Proben für
die anschließende
Präparation
von Membranen für
die spätere
Antikörperabsorption
ohne OCT schockgefroren.
-
Die Tumorgewebe wurden in etwa 1
mm3 große
Stückchen
zerkleinert und 45 Minuten lang bei 37°C mit einen Enzymgemisch aus
1 mg/ml Kollagenase Typ IA, 1 mg/ml Kollagenase Typ N, 200 pg/ml
DNase und 100 Einheiten/ml Hyaluronidase in Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) verdaut.
Das Gemisch wurde durch Nitex gefiltert, um unverdaute Stücke zu entfernen
und Zellsuspensionen zu gewinnen, die zur subcutanen (s.c.) Injektion
von BALB/c-Nacktmäusen
verwendet wurden, worauf sich Tumore entwickelten, Explantatkulturen
in D-Val-angereichertem Medium angelegt und Aliquote davon in 90%
menschlichem Serum/10% Dimethylsulfoxid (DMSO) eingefroren wurden.
-
Die suspendierten Zellen wurden mit
IMDM gewaschen und auf einen Percoll/Phosphatgepufferte Kochsalzlösung- (PBS)-
Stufengradienten geladen. Die Tumorzellen wurden zwischen 1,07 g/ml
Percoll und dem PBS vom Träger
isoliert. Die isolierten Tumorzellen wurden BALB/c-Mäusen i.p.
injiziert, um anti-Tumor-Antikörper
zu erhalten, BALB/c-Nacktmäusen
s.c. injiziert, um Tumore zu bilden, in D-Val-Medium, das mit 30%
eines dialysierten Gemisches aus gleichen Teilen menschlichem Serum,
fötalem
Rinderserum (FBS) und Ratten-Fibroblastenkultur-Zellüberstand
angereichert war, zur Kultur angesetzt, um Zellinien zu etablieren
und in Aliquoten mit 90% menschlichem Serum/10% DMSO für den späteren Gebrauch
eingefroren.
-
Einer der verarbeiteten Eierstock-Tumore
wurde als mäßig differenziertes
Adenocarcinom diagnostiziert. Folgende Proben wurden vom Patienten
am Tag der Operation gewonnen: Eine Tumorprobe aus dem Eierstock,
eine Lymphknotenmetastase und normales Myometrium, Endometrium und
Dünndarm.
Die Tumor- und normalen Gewebeproben wurden wie oben beschrieben
verarbeitet. Die mit Tumorzellen angereicherte Fraktion, die auf
dem Percoll-Gradienten
isoliert wurde, bestand in erster Linie aus kleinen Klumpen von
großen
Zellen, und eine direkte Zellzählung
konnte nicht durchgeführt
werden. Die Zellzahl wurde nach der Zentrifugierung aufgrund der
Erfahrung mit Zellen ähnlicher
Größe geschätzt. Die
Ausbeute wurde auf 2 × 108 Zellen von dem Eierstocktumor geschätzt. Eine
anschließende
Cytospin-Präparation
der Zellen wurde analysiert, und es wurde festgestellt, daß sie größtenteils
Tumorzellen enthielt. Vier BALB/c-Mäusen wurden je 0,25 ml dieser
Zellsuspension in IMDM (auf 107 Zellen pro
Maus geschätzt)
i.p. injiziert, um anti-Tumor-Antikörper zu erzeugen.
-
Einer Nacktmaus wurden 0,2 ml zerkleinerter,
aus dem Eierstock abgeleiteter Tumor in IMDM s.c. injiziert. Einer
anderen Nacktmaus wurden 0,2 ml zerkleinerter, aus dem Lymphknoten
abgeleiteter Tumor in IMDM s.c. injiziert. Beide Nacktmäuse entwickelten
subcutane Tumore. Die Tumore waren 15–18 Tage nach der Injektion
sichtbar. Die Maus, der der aus dem Eierstock abgeleitete Tumor
injiziert worden war, wurde 1 Monat nach der Injektion getötet, als
der Tumor etwa 1,5 cm × 1
cm × 0,5
cm groß war.
Die Analyse eines Cytospin-Präparats von
Zellen, die durch Percollgradienten-Zentrifugierung aus ihrem Tumor
isoliert worden waren, zeigte, daß er menschlichen Ursprungs
und vom gleichen Typ wie der ursprüngliche Eierstocktumor war.
Dieser Tumor konnte sowohl in Nacktmäusen als auch in SCID-Mäusen durch
s.c.-Injektion von entweder frischen, zerkleinerten Tumorstückchen oder
Tumorstücken,
die in 90% menschlichem Serum/10% DMSO eingefroren und für die Injektion
aufgetaut worden waren, weiter propagiert werden.
-
Der Tumor, der sich in den Nacktmäusen entwickelte,
denen aus den Lymphknotenmetastasen abgeleiteten Tumorstückchen injiziert
worden waren, wurde weiter verarbeitet. Nach dem Schockgefrieren
einer Probe in flüssigem
Stickstoff wurde der Tumor in 1 cm große Stückchen zerkleinert. Die Hälfte der
zerkleinerten Stücke
wurde in Aliquoten von 0,4 ml (gepackte Tumorstücke) in 90% menschlichem Serum/10%
DMSO und in flüssigem
Stickstoff aufbewahrt. Die andere Hälfte wurde dazu benützt, eine
Tumorzellen Suspension durch Percoll-Dichtegradientenzentrifugierung
wie oben beschrieben durchzuführen.
Die gewonnenen Zellen wurden in zwei Aliquoten von je ungefähr 4 × 107 Zellen in 90% menschlichem Serum/10% DMSO
gefroren und in flüssigem
Stickstoff aufbewahrt. Die Percoll-isolierten Zellsuspensionen des
OC2-Tumors wurden dazu verwendet, i.p. und s.c. Tumore in einer Nacktmaus
zu erzeugen. Die OC2-Tumore sowohl in BALB/c-Nacktmäusen als
auch in SCID-Mäusen
wurden durch i.p. Injektion von Tumorstücken (0,25 ml) propagiert.
OC2-Tumorgewebe
konnte in immundefizitären
Mäusen
propagiert werden, und sowohl subcutane als auch intraperitoneale
Tumore entwickelten sich in einer Nacktmaus und in einer SCID-Maus.
-
Aufgrund der erfolgreichen Propagierung
des OC2-Tumors sowohl in Nacktmäusen
als auch in SCID-Mäusen
wurde vom OC2-Patienten eine heparinisierte Blutprobe von 10 cc
genommen. Die Leukocytenfraktion (1,4 × 107 Zellen)
wurde isoliert, in 90% menschlichem Serum/10% DMSO tiefgefroren
und in flüssigem
Stickstoff aufbewahrt. Es wurden noch weitere Blutproben von dem
Patienten genommen. Die normale Myometrium-Probe wurde vom Patienten
am Tag der Operation gewonnen und in flüssigem Stickstoff tiefgefroren,
um Membranpräparate
zu erhalten. Das tiefgefrorene Gewebe wurde mit einem Stößel in einem
Mörser in
flüssigem
Stickstoff zerkleinert, in einer Pufferlösung mit den Proteaseinhibitoren
Leupeptin, Aprotinin, Pepstatin und PMSF homogenisiert und 10 Minuten
lang bei 1200 × g
zentrifugiert, um die Zelltrümmer
zu entfernen. Durch 90minütige
Zentrifugierung bei 150.000 × g
wurden membranhaltige Präzipitate
gewonnen, die bei –80°C in Aliquoten
mit 10% Glycerin aufbewahrt wurden.
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Das OC2-Carcinom wurde sowohl in
BALB/c-Nacktmäusen
als auch in SCID-Mäusen
durch s.c. oder i.p. Injektion von entweder frischen oder vorher
tiefgefrorenen zerkleinerten Tumorstückchen propagiert. Zusätzlich zum
ständigen
Nachschub von frischem menschlichem Tumor, der in den Nacktmäusen oder
in den SCID-Mäusen
propagiert worden war, wurden gefrorene Aliquote von zerkleinertem
Tumor und von Percollgradienten-isolierten Tumorzellen hergestellt,
die aus dem ersten Durchgang der OC2-Lymphknotenmetastasen durch
eine Nacktmaus abgeleitet waren. Direkt vom Patienten gewonnene
Zellen und Gewebestückchen wurden
in 90% menschlichem Serum/10% DMSO gefroren und in flüssigem Stickstoff
aufbewahrt. Darunter waren auch 14 Aliquote Percoll-separierter
OC2-Tumorzellen, jeweils von geschätzten 107 Zellen,
die aus dem Eierstock des Patienten abgeleitet waren, drei Aliquote
von jeweils etwa 0,75 ml von zerkleinerten OC2-Lymphknotenmetastasen
vom Patienten, fünf
Aliquote von jeweils 2,8 × 106 Patienten-PBLs und Proben des Eierstocktumors.
Die Lymphknotenmetastasen, das Myometrium, Endometrium und der Dünndarm wurden
mit oder ohne OCT in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei –80°C aufbewahrt.
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Beispiel 2: Erzeugung
und Testen von OC2-Immunseren von Mäusen
-
Vier BALB/c-Mäuse wurden einmal i.p. mit
etwa 107 aus dem Eierstock abgeleiteten
OC2-Zellen immunisiert.
Die Mäuse
wurden am Tag 30 mit etwa 5 × 106 OC2-Tumorzellen aus der ursprünglichen
Zubereitung, die in 90% menschlichem Serum/10% DMSO eingefroren,
in flüssigem
Stickstoff aufbewahrt und vor der Anwendung aufgetaut und gewaschen
worden waren, durch i.p. Impfung aufgefrischt. Die Antiseren wurden an
den Tagen 12 und 30 nach der Primärimmunisierung und am Tag 11
nach der Sekundärimmunisierung
gewonnen. Den Mäusen
können
weitere Auffrischungsimpfungen, sowohl i.p. als auch i.v. verabreicht
werden, bis keine weitere Steigerung der Antwort mehr erreicht wird.
Die Reaktivität
der Antiseren mit den OC2-Tumorzellen im Vergleich zur Reaktivität der Präimmunseren
wird durch Festphasen-ELISA bestimmt; dazu werden OC2-Tumormembranpräparat-beschichtete
Schalen und Alkaliphosphatse-markierte anti-Maus Immunglobuline
von Ziegen und Nitroblautetrazol- (NBT-) plus Indolylphosphat- (BCIP-)
Substrat (Promega; Madison, WI) als Entwicklersubstanzen verwendet.
-
Die Reaktivität von Antiseren mit 4Mikron-Kryostatschnitten
des OC2-Tumors kann immunhistochemisch bestimmt werden. In Aceton
fixierte Proben werden mit 0,3% H2O2 in Methanol behandelt, um die endogene
Peroxidaseaktivität
zu zerstören,
und dann in PBS/1% FBS rehydratiert. Dann werden sie mit dem Antiserum
etwa 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, gespült und mit
biotinyliertem anti-Maus Ig von Kaninchen inkubiert. Die Färbung wird
mit Avidin-Merrettichperoxidase und Diaminobenzidin entwickelt. Die
Schnitte werden mit Methylgrün
gegengefärbt.
-
Beispiel 3: Generierung
bakterieller und von Säuger-Expressionsvektoren
-
Es wurden sowohl bakterielle als
auch Säuger-Expressionsvektoren
hergestellt, in denen verknüpfte Kombinationen
von Genen der VH- und VL-Regionen
in großer
Menge aus den B-Zellen,
in denen sie exprimiert werden, in bakterielle Expressionsvektoren
und ohne die Kombinationen zu verlieren in Säuger-Expressionsvektoren transferiert
werden können.
Die H- und L-Ketten sind in beiden Vektoren in umgekehrter Transkriptionsrichtung
mit Kopf-Kopf-Promotoren
angeordnet. In dieser Richtung kann die V-Region-Genkombination
als Einheit zwischen Vektoren transferiert werden. Weiterhin können die
Vektoren, soweit sie zirkulär
sind, durch Restriktionsenzyme zwischen den Genen der VH-
und VL-Regionen geöffnet werden, um intervenierende DNA-Fragmente,
wie Promotoren ohne Verlorst der VH-VL-Kombination,
die auf dem selben DNA-Stück
bleibt, zu insertieren.
-
Chimäre Proteine können auf
der Oberfläche
von fädigen
(M13) Phagen exprimiert werden, wenn sie an ein Phagen-Hüllprotein
wie cpIII oder cpVIII gebunden sind. Für diese Studien wurde der zirkuläre Phagemiden-Expressionsvektor
pComb3 benützt,
der eine insertierbare Stelle im selben Rahmen mit cpIII enthält; es können aber
auch andere ähnliche, üblicherweise
erhältliche
Vektoren verwendet werden. Es wurde eine pComb3-Phagemidenvektor-DNA
erzeugt, die einen Fd-Abschnitt (VH und
CH1-Domänen)
eines Antikörpers codiert.
Die den Antikörperabschnitt
codierende Genregion wurde an das Gen gIII gebunden, daß das Carboxyl-Ende
von cpIII codiert (3).
Der Vektor ist kreisförmig
und die Verdauung mit SpeI und NheI, die kompatible kohäsive Enden
erzeugt, führt
zur Entfernung des gIII-Hüllproteinfragments
und ermöglicht
nach der Religierung die Produktion freier Fabs. Phagendisplaybibiliotheken
von 107 Mitgliedern können nach einer Co-Infektion
von XLI-Blue E.
coli mit Helfer-Phagen erhalten werden und durch Ausstreichen auf
antigenbeschichteten Oberflächen
auf Antigenbindung selektiert werden. Die Gene, die die selektierten
Fab-Fragmente codieren,
sind in den Phagenpartikeln enthalten und damit sofort für Clonierung
und Sequenzierung verfügbar.
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Der pComb3-Vektor codiert auch freie
L-Kette (VL- und CL-Kappa-Domänen), die
mit der an das Hüllprotein
gebundenen Fd-Region assoziiert, und so Fab-Fragmente bildet, die
auf der Pagenoberfläche
dargeboten werden. Das Fusionsprotein Fd-cpIII und die L-Kette werden
von ihrem eigenen (lacZ) Promotor in Kopf-Schwanz-Transkriptionsrichtung
exprimiert. Um eine Phagenreihe erhalten, die Antikörper hoher
Affinität exprimiert,
die gegen eine Vielzahl von Antigenen gerichtet sind, wie jene auf
der Oberfläche
einer Tumorzelle, ist es wirkungsvoller, die H- und L-Ketten-Kombinationen
in vivo als Antwort auf eine Immunisierung generieren zu lassen.
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Um einen bakteriellen Vektor zu erhalten,
bei dem die Gene der VH- und VL-Region
im Gegensinn der Transkriptionsrichtung angeordnet sind, wurde der
pComb3-Phagendisplayvektor modifiziert. Dieser modifizierte pComb3-Vektor
(phh3, 3b) enthält den LacZ- und den tac-Promotor
in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung, die die Transkription der Kappa- bzw. der Fd-Gene
der Maus treiben. Die CH1-Domäne des Fd-Gens
ist aus dem IgG2b abgeleitet. Obwohl die
Leadersequenzen für
beide Ketten die pelB-Leader-Aminosäuresequenz haben, unterscheiden
sich die Nucleotidsequenzen an vielen Stellen. Diese Vorsichtsmaßnahme wurde
getroffen, um Deletionen vorzubeugen. Die Integrität dieses
Phagemidenvektors sowohl in der Doppel- als auch in der Einzelstrangform
wurde durch diagnostische Restriktions enzymanalyse, durch Sequenzierung
und PCR-Amplifikation bestimmter Abschnitte überprüft.
-
Das DNA-Segment, das die bakteriellen
Kopf-Kopf-Promotor- und Leadersequenzen von phh3, eine bakterielle
lPPl-Kassette enthält,
wurde durch Subclonieren in pBluescript II KS (Stratagene; La Jolla,
CA) erzeugt. Der phh3-Vektor wurde durch Ersetzen der Gene der variablen
Region und der Leader- und Promotorsequenzen durch eine Stück irrelevante
DNA modifiziert, und so phh3mu hergestellt, das die murinen Gene Cκ und γ2b CH1
enthält
(d). Ein zusätzlicher bidirektionaler Phagendisplayvektor,
der die menschlichen Gene Cκ und γ1 CH1
enthält
(phh3hu; 3d), wurde
aus phh3mu durch Ersetzen der murinen C-Gene durch menschliche C-Gene
abgeleitet.
-
Sowohl phh3mu als auch phh3hu sind
zur Clonierung verknüpfter
VL-VH-Paare in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung
nützlich.
Diese zirkulären
Vektoren können
zwischen deen Aminoenden der Gene der VL-
und VH-Region geöffnet werden, um eineaus plPPL
abgeleitete lPPl-Kassette zu insertieren und eine bidirektionale Phagendisplaybibliothek
zu erzeugen. Wie in 4c dargestellt,
können
die VL-VH-Paare,
in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung verknüpft, leicht in großer Menge
zwischen einem zirkulären
bidirektionalen Phagendisplayvektor und einem zirkulären Säugerexpressionsvektor
transferiert werden. Der Transfer erfordert das Öffnen des Vektors zwischen
den VL- und VH-Aminoenden
und den Austausch der Kassetten, die entweder prokaryontische oder
Säuger-Leadersequenzen
enthalten, nämlich
der lPPl-Kassetten. Die VL-VH-Paare
einschließlich
der lPPl-Kassetten werden durch PCR aus einem Vektor entnommen und
in einen anderen Vektor insertiert. Zur Insertion in den Säugervektor
enthalten die nichthybridisierenden Schwänze der PCR-Primer Spleißstellen
(ss = Spleißstelle; 3c).
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Es wurde ein muriner Doppelvektor,
pMDV (4a) konstruiert,
der in er Lage ist, eine Mäuse-IgG2b-H-Kette und eine Mäuse-Kappa-L-Kette zu exprimieren,
und dazu verwendet, IgG2b-Antikörper durch Transfektion
in die Nullhybridom-Zellinie Sp2/0-Ag14, die keine endogenen H-
oder L-Ketten produziert, zu exprimieren. Das IgG2b-C-Region-Gen
wird durch enzymatische Manipulationen wie in Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (Hrsg. J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor
Laboratory; Cold Spring Harbor, NY, 1989) beschrieben gegen das
IgG2a-C-Region-Gen ausgetauscht. Der murine
Doppelvektor kann auch modifiziert werden, indem die murinen Cγ2b -und
Cκ -Gene
gegen menschliche Cγ1- bzw. Cκ-Gene
ausgetauscht, um den in 4b gezeigten
chimären
Doppelvektor zu erzeugen. Der selek tierbare Marker Eco gpt verleiht
in säugerzellen
Resistenz gegen Mycophenolsäure,
wenn im Medium Xanthin vorhanden ist.
-
Beispiel 4: Zellfixierung
und Permeabilisierung
-
Die Zellen wurden im wesentlichen
wie von Embleton et al. (Nuc. Acids Res. 20: 3831–37, 1992)
beschrieben, mit geringfügigen
Abweichungen fixiert. Die Zellen wurden bei 3–5 × 107 in
einem konischen 50 ml-Röhrchen
(Costar; Cambridge, MA) dreimal in 10 ml PBS, pH 7.2 bei Raumtemperatur
gewaschen. Das Zellpräzipitat
wurde in 1,0 ml 150 mM NaCl resuspendiert, anschließend wurde
1,0 ml eiskaltes 20% Formaldehyd (Sigma Chemical; St. Louis, MO)/150
mM NaCl tropfenweise unter sanftem Vortexen (Schütteln) hinzugefügt. Die
Zellen wurden auf Eis aufbewahrt und 1 Stunde lang alle 10 Minuten
gevortexed (geschüttelt),
dann drei Mal bei 4°C
mit eiskalter PBS bei 350 × g
gewaschen. Das Röhrchen
wurde angetippt, um das Präzipitat zwischenden
Waschvorgängen
zu dispergieren. Das Präzipitat
wurde in 1,0 ml 0,5% NP-40 (Sigma Chemical; St. Louis, MO) in Wasser
resuspendiert. Die Zellen wurden eine Stunde lang unter gelegentlichem
Vortexen (Schütteln)
auf Eis gelagert, dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen transferiert und 3 Minuten
lang bei 14.000 U/min bei 4°C
zentrifugiert. Es folgten drei Waschgänge mit eiskalter PBS und ein
Waschgang mit eiskalter PBS/100 mM Glycin. Zwischen den Waschgängen wurde
das Präzipitat
durch kräftiges
Antippen des Mikrozentrifugenröhrchens
dispergiert. Die Zellen wurden mit einer Mikropipette in PBS/100
mM Glycin resuspendiert, um das Zellpräzipitat zu dispergieren und
sichtbare Zellklumpen zu entfernen. Aliquote von 106 Zellen
in PBS/100 mM Glycin wurden auf Trockeneis eingefroren und bis zu
drei Wochen lang bei –80°C gelagert.
-
Beispiel 5: Verkettung
der H- und L-Ketten-Gene der V-Region innerhalb der Zelle
-
Es wurde ein innerhalb der Zelle
ablaufendes PCR-Verfahren entwickelt, bei dem cDNAs der VH- und der VL-Region
in einer Population von fixierten/permeabilisierten Zellen in situ
synthetisiert wurden. Es wurden zwei transfizierte Zellinien erzeugt,
von denen eine einen Mäuse-IgG2b(κ)-Antikörper, der
für das
Hapten p-Azophenylarsonat (Ars; J. Sharon et al., J. Immunol. 142:
596–601,
1989) spezifisch ist. Die andere Zellinie produziert einen chimären IgG2b(κ)-Antikörper, der
mit dem anti-Ars-Antikörper
sowohl auf der Aminosäuren- als
auch auf der Nucleotidebene identisch ist, mit Ausnahme der komplementaritätsbestimmenden
Regionen (CDRs), die von einem anti-Dextran-Antikörper abgeleitet
sind. Diese zwei Zellinien wurden verwendet, da die Primer für die cDNA-Synthese
und PCR, die die CDRs nicht be inhalten, die gleiche Komplementarität zu den H-
und den L-Genen beider Zellinien haben, die resultierenden verknüpften VH-VL-Kombinationen
aber durch Sequenzieren in die CDRs unterschieden werden könnten.
-
Die cDNA-Synthese und PCR-Amplifikationen
in fixierten/permeabilisierten Zellen wurde mit geringfügigen Abweichungen
im wesentlichen so ausgeführt,
wie von M. J. Embleton et al. beschrieben (Nuc. Acids Res. 20: 3831
n37, 1992). 2 × 106 fixierte/permeabilisierte Zellen wurden
ein Mal mit Wasser gewaschen und in einer 50 μl-Reaktion zur cDNA-Synthese
verwendet. Es wurden 40 Einheiten Reverse Transkriptase Superscript
(GibcoBRL; Grand Island, NY), Erststrangpuffer (GibcoBRL; Grand
Island, NY) und jeweils 25 pmol der Vorwärtsprimer 3A-CL und 1A-CH1
(Operon Technologies; Alameda, CA) verwendet. Nach der cDNA-Synthese
wurden die Zellen mikrozentrifugiert (3 Minuten bei 14.000 U/min
bei 4°C),
in 200 μl
PBS/100 mM Glycin gewaschen und in 10 μl des gleichen Puffers resuspendiert.
Die PCRs wurden mit AmpliTaq-DNA-Polymerasekit (Perkin-Elmer Cetus;
Norwalk, CT) in einem DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer Cetus;
Norwalk, CT) über
30 Zyklen ausgeführt.
Jeder Zyklus bestand aus 30 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 65°C und 30 Sekunden
bei 72°C.
Die Endkonzentration von MgCl2 war 2,5 mM.
Eine 20 μl
PCR-Kontrolle, die
ein 1,2 Kilobasenpaare-Produkt ergab, gehörte dazu.
-
In der ersten PCR wurden je 10 pmol
der Verkettungsprimer 4L und 2H zusammen mit je 25 pmol der Vorwärtsprimer
3A-CL und 1A-CH1 verwendet.
-
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-
-
-
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Nach der ersten PCR wurden die Zellen
mikrozentrifugiert und der Überstand
aufgenommen. Für
die zweite PCR wurden nach zwei Waschgängen mit 200 μl PBS/100
mM Glycin, je 25 pmol der „nested" Primer 3L und 1H
hinzugefügt.
Nach Vollendung der 30 Zyklen wie vorstehend beschrieben, wurden
die Zellen mikrozentrifugiert und die Überstände aufgenommen. Die Reaktionsprodukte,
die nach der ersten und zweiten PCR erhalten wurden, werden in 6 gezeigt. Eine Bande von
777 bp, die der verknüpften
VH-VL-Kombination (durch
einen Pfeil angegeben) entspricht, wurde nach der zweiten PCR beobachtet.
Die Produkte, die als erstes und zweites PCR-Produkt erhalten wurden,
werden in den Reihen 1 bzw. 2 gezeigt. m und M sind eine 123-bp-Leiter,
bzw. eine HindIII-Verdauung von Kappa-Phagen-DNA, wobei die Größen in Basenpaaren
für einige
Banden angegeben werden. Die beobachtete Bande wies die richtige
Größe auf,
die für
die VH-VL-Kombination
erwartet wurde. Diese Bande wurde Gel-gereinigt und nach der Verdauung
mit EcoRI und HindIII in die EcoRI-HindIII-Stellen von M13mp19 cloniert.
-
Eine schematische Darstellung der
Reverstranskriptasen- und PCR-Reaktion innerhalb der Zelle und der
erhaltenen Produkte wird in 5 gezeigt.
Nach der cDNA-Synthese mit den Primern 1A-CH1 und 3A-CL (beide Gegensinn),
die zum Beginn der CH1- und Cκ-Gene für die mRNAs
der H- bzw. L-Ketten komplementär sind,
wurden die gleichen Primer plus zwei Verbindungsprimer, 2H und 4L
(beide Sinn) in einer ersten PCR-Reaktion verwendet. Die Verbindungsprimer
liefern nicht nur eine Möglichkeit,
die VH-VL-Kombination
innerhalb von Zellen zu verketten, sondern führen auch Restriktionsstellen
(XhoI und SacI) für
die anschließende
Clonierung von Promotorsequenzen zwischen VH und
VL ein. Der Primer 2H hybridisiert mit dem
Anfang der VH-Sequenz, einschließlich eines Teils der Leadersequenz,
hat eine XhoI-Restriktionsenzymstelle, die den Aminosäurepositionen
5 und 6 der VH-Region entspricht, und enthält einen 30 Nucleotide langen
Schwanz von Zufallssequenz. Der Primer 4L hybridisiert mit dem Anfang
der Vκ-Sequenz
einschließlich
eines Teils der Leadersequenz, hat eine SacI-Restriktionsenzymstelle,
die den Aminosäurepositionen
1 und 2 der Vκ-Regionen entspricht,
und enthält
einen 30 Nucleotide langen Schwanz, der das reverse Komplement vom
Schwanz des Primers 2H ist.
-
Da die Schwänze der Primer 2H und 4L komplementär sind,
wurden die amplifizierten VH- und VL-Fragmente während der PCR durch Überlappungsextension
verknüpft.
Nach dem Waschen der Zellen wurde zur Entfernung extrazellulärer, nichtinkorporierter
Primer und etwaiger aus den Zellen ausgetretener PCR-Produkte eine
zweite PCR mit den „nested" Primern 1H und 3L
angesetzt; beide Gegensinn-Primer und nicht mit den Primern 1A-CHL
und 3A-CL überlappend.
Der Primer 1H ist zum äußersten
Anfang der CH1-Domäne
des IgGγ2b und zu einem Teil von JH2 komplementär. Zusätzlich enthält er eine
HindIII-Restriktionsstelle und eine Spleißstelle. Der Primer 3L ist
zum äußersten
Anfang der Cκ-Domäne und zu
einem Teil von Jκ1
komplementär.
Er enthält
eine EcoRI-Restriktionsstelle und eine Spleißstelle. Die Spleißstellen
und Restriktionsstellen in den Primern 1H und 3L sind dazu gedacht,
eine spätere
Clonierung der verknüpften
VH-VL-Kombinationen
in die in 4 gezeigten
dualen Säuger-Expressionsvektoren
zu ermöglichen.
-
Beispiel 6: Erzeugung
intakter IgG-Antikörper
nach DNA-Synthese und PCR-Amplifikation innerhalb der Zelle
-
Um festzustellen, ob die innerhalb
der Zelle amplifizierten VH-VL-Kombinationen
in Myelom- oder Hybridomzellen als IgG-Antikörper exprimiert werden können, wurden
Kopf-Kopf-Säugerpromotoren
bereitgestellt (7).
Ein Clon, der eine verknüpfte
VH-VL-Kombination enthielt,
die die V-Regionen des anti-Ars-Antikörpers codiert, wurde mit XhoI
und SacI verdaut und mit einem XhoI-SacI-DNA-Fragment ligiert, das
einen H-Ketten-Promotor,
eine Leadersequenz und DNA, die die ersten vier Aminosäuren der
reifen H-Kette in Kopf-Kopf-Richtung zu einer Kappa-Ketten-Promotor-
und Leadersequenz codiert, enthielt. Aus dem so erhaltenen Vektor
wurde ein 2,25 kb EcoRI-HindIII-DNA-Fragment, das die Promotoren
und V-Region-Gene enthielt, isoliert und in das EcoRI-HindIII-Rückgrat,
das aus dem murinen Dualvektor IgG2b abgeleitet
war, ligiert. Der so erhaltene Expressionsvektor (7) wurde durch Elektoporierung in Sp2/0-Ag14
Nullhybridomzellen transfiziert.
-
Die Transfektanten zeigten eine Produktion
intakter IgG-Antikörper,
ausweislich der Western-Blot-Analyse ihrer Überstände (8a), die wie von H. Towbin et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350–54,
1979) beschrieben ausgeführt
wurde. Die Position des 150 KDa-IgG-Produktes
ist mit einem Pfeil markiert. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker
in Kda sind ebenfalls angegeben, und zwar als: E = die aus der innerhalb
der Zelle verknüpften
VH-VL-Kombination
abgeleitete Versuchs-Transfektante; – C = negative Kontrolle (parentale
Sp2/0-Ag14-Zellinie); M = vorab gefärbter Molekulargewichtsmarker;
+ C = positive Kontrolle (eine anti-Ars-IgG2b-Transfektante; – A = eine
Transfektante, die einen mutierten IgG2b-Antikörper, der
die Ars-Bindung verloren hat, erzeugt. Wie mit Festphasen-Enzymgebundenen
Immuntests (ELISA) mit Ars-BSA-beschichteten Schalen und alkaliphosphatase markiertem
anti-Maus-IgG von Ziegen (Fc-spezifisch; 8b) im ProtoBlot-System (Promega, Madison,
WI) nachgewiesen wurde, banden die Transfektanten an Ars.
-
In einem zusätzlichen Versuch wurde ein
aus einem murinen Antikörper
gegen p-Azophenylarsonat (Ars) abgeleitetes VH-VL-Paar zusammen mit der intervenierenden
Säuger-lPPl-Kassette
durch PCR aus dem Säuger-Expressionsvektor
entnommen und in phh3mu transferiert. Die Säuger-lPPl-Kassette wurde dann
gegen die prokaryontische lPPl-Kassette, die die Kopf-Kopf-gerichteten
lacZ- und tac-Promotoren und die zwei pelB-Leadersequenzen enthielt,
ausgetauscht und so phh3-Ars erzeugt. Wie in 9 gezeigt, banden die aus dem Vektor
phh3-Ars hergestellten Phagen (9A,
direkte ELISA) spezifisch an eine mit Ars-Rinderserumalbumin (Ars-BSA) beschichtete
Schale. Weiterhin konnte die Bindung an die Ars-BSA-beschichtete
Schale durch lösliche
Ars-BSA inhibiert werden, nicht jedoch durch lösliche BSA (9B).
-
Die Ergebnisse zeigen, daß die durch
PCR innerhalb der Zelle amplifizierten und verkknüpften VH-VL-Kombinationen
erfolgreich in einen Expressionsvektor transferiert werden können. Die
verknüpften VH-VL-Kombinationen
könnten
auch leicht zuerst in den Phagemiden-Oberflächendisplayvektor phh3 und
in murine oder Chimäre duale Expressionsvektoren
(4) transferiert werden,
und daß der
bidirektionale Phagendisplayvektor erfolgreich für den Transfer eines Kopf-Kopf-verknüpften VH-VL-Paares zur Erzeugung
von Phagenpartikeln, die antigenbindende Fab-Fragmente präsentieren
verwendet werden kann.
-
Beispiel 7: PCR-Amplifikation
und Verkettung der VH- und VL-Region-Kombinationen
aus untransformierten Zellen innerhalb der Zelle
-
Milzzellen und Lymphknotenzellen
von immunisierten Mäusen
werden nach der Lyse der roten Blutkörperchen präpariert, kombiniert, in 10%
Formaldehyd fixiert, mit 0,1% NP-40 permeabilisiert und bei –80°C in Aliquoten
von 107 Zellen bis zur Verwendung für die PCR
innerhalb der Zelle gelagert. Weitere Mäuse werden mit aus Patienten
abgeleiteten Percollisolierten OC2-Zellen aus den tiefgefrorenen
Aliquoten immunisiert. Ein Aliquot von fixierten/permeabilisierten
Milzzellen plus aus den OC2-Immunmäusen abgeleiteten Lymphknotenzellen,
abgeleitet, wird der cDNA-Synthese und PCR-Amplifikation und -Verkettung
unterworfen, doch mit einem Vorrat von Primern und mit „nested" Primern, um die
Amplifikation aller oder der meisten Gene der V-Region sicherzustellen.
Die für
diese Reaktionen verwendeten Primer sind dafür entworfen, das gesamte Immunglobulinrepertoire,
einschließlich
der Antikörper
gegen Proteinepitope, Kohlenhydratepitope und flüssige Epitope zu erweitern.
-
Für
die cDNA-Synthese der VH-Regionen wird ein
Vorrat von Primern (1A-CH1, Gegensinn) verwendet, der zum Beginn
der CH1-Domänen
jedes der Mäuse-Serum-Isotypen
komplementär
ist (5). Der Vorrat
besteht aus sieben 1A-CH1-Primern: 1A-CH1-γ1, 1A-CH1-γ2a, 1A-CH1-γ2b, 1A-CH1-γ3, 1A-CH1-μ, 1A-CH1-ε und 1A-CH1-α. Für die cDNA-Synthese der VL-Regionen wird ein Vorrat von Primern (3A-CL,
Gegensinn) verwendet, der zum Beginn der Cκ- und Cλ-Domänen komplementär ist. Die
vier 3A-CL-Primer sind: 3A-CL-κ,
3A-CL-λ1,
3A-CL-λ2
und 3A-CL-λ3.
-
Die gleichen Primervorräte (1A-CH1
und 3A-CL) sowie Verkettungsprimer werden für die erste PCR verwendet.
Die Verkettungsprimer für
die VH-Regionen (2H, Sinn) sind zum Beginn
der VH-Sequenz einschließlich eines Teils der Leadersequenz
komplementär,
haben eine XhoI-Restriktionsenzymstelle, die den Aminosäurepositionen
5 und 6 der VH-Region entspricht, und enthalten zusätzlich einen
30 Nucleotide langen Schwanz aus Zufallssequenz. Die neun 2H-Primer,
die auf den von A. S. Kang et al. (Methods 2: 111–18, 1991) verwendeten
Primern beruhen, werden als 2H1 bis 2H9 bezeichnet. Die Verkettungsprimer
für die
VL-Regionen
(4L, Sinn) sind zum Beginn der Vκ-
und Vλ-Sequenzen
einschließlich
eines Teils der Leadersequenz komplementär, haben eine SacI-Stelle,
die den Aminosäurepositionen
1 und 2 der VL-Region entspricht, und enthalten
zusätzlich
einen 30 Nucleotide langen Schwanz, der das reverse Komplement des
Schwanzes von Primer 2H ist. Die 4L-Primer, die bei Vκ ebenfalls
auf den von A. S. Kang et al. (Methods 2: 111–18, 1991), bei Vκ auf den
von E. A. Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest,
5. Auflage, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) verwendeten
Primern beruhen (es gibt nur zwei Vκ-Gene in der Maus) sind: 4L-Vκ1 bis 4L-Vκ7, 4L-Vλ1 und 4L-Vλ2.
-
Die komplementären Schwänze der 2H- und 4L-Primer verbinden
die amplifizierten Fragmente der VH- und
VL-Region durch Überlappungsextensions-PCR (H.
A. Erlich, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification,
W. H. Freeman & Co.,
NY, NY, 1992). Die durch diese Primer eingeführten XhoI- und SacI-Stellen
ermöglichen
die nachfolgende Clonierung von Promotorsequenzen zwischen die VH- und VL-Sequenzen.
Nach dem Waschen der Zellen, um die Primer und etwaige PCR-Produkte,
die aus den Zellen ausgetreten sein könnten, zu entfernen, wird eine
zweite PCR angesetzt, um die verknüpften VH-VL-Regionen-Kombinationen
unter Verwendung der „nested" Primer (JH und JL;
alle Gegensinn) weiter zu amplifizieren. Diese Primer wurden für die anschließende Clonierung
der verknüpften
VH-VL-Kombinationen
in den Phagemidenvektor phh3mu oder phh3hu entworfen (3). Die JH-Primer, die als
JH1 bis JH4 bezeichnet werden, sind zu einem Teil eines JH-Gens komplementär (es gibt
vier JH-Gene in der Maus) und enthalten eine zusätzliche EcoRI-Restriktionsstelle
an ihren 5'-Enden.
Der andere Primervorrat (JL) ist jeweils zu einem Teil des Jκ- oder Jλ-Gens (es
gibt vier funktionelle Jκ-
und drei funktionelle Jλ-Gene
in der Maus) und enthalten eine zusätzliche HindIII-Restriktionsstelle
an ihren 5'-Enden.
Diese Primer sind: Jκ1,
Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jλ1, Jλ2 und Jλ3.
-
Das erste und das zweite PCR-Produkt
werden durch Agarose-Gelelektrophorese auf die Gegenwart von DNA-Fragmenten
getestet. Nach der zweiten PCR wird ein 0,8 kb-Fragment erwartet.
Diese Bande, die die amplifizierten VH-VL-Kombinationen enthält, wird mittels Geneclean
II (Bio101; La Jolla, CA) gelisoliert.
-
Beispiel 8: Erzeugung
einer Fab-Phagendisplaybibliothek und löslichen Fab-Bibliothek aus
den verknüpften VH-VL-Kombinationen
-
Die gelisolierten VH-VL-Kombinationen werden mit EcoRI und HindIII
verdaut und mit dem EcoRI-HindIII-Rückgrat aus dem phh3-Phagemidenvektor
(oder dem phh3hu-artigen Vektor) verknüpft, und so eine Population
von Phagemiden-Expressionsvektoren phh3/VH-VL, wie in den 2D und 10 gezeigt, erzeugt. Die bakterielle
Transformation und die Erzeugung der Phagenbibliothek geschehen
wie beschrieben (C. F. Barbas und R. A. Lerner, Methods 2: 119–24, 1991).
Da diese Vektoren Phagemiden sind, werden sie durch Transformation
und Wachstum von XLI-Blue-E. coli in carbenicillin- und tetracyclinhaltigem
Kulturmedium propagiert. Die Kolonien, die Phagemiden enthalten,
werden durch Ausplattieren eines Aliquotes der Kultur auf Agar gezüchtet. Um
Phagen zu erhalten, werden die Bakterien mit einem Überschuß an Helfer-Phagen
VCSM13 überinfiziert,
wodurch man gepackte Phagemiden erhält, die XLI-Blue-E. coli infizieren.
-
Das phh3/VH-VL-Ligierungsgemisch
wird durch Elektroporation mit einer Transformationseffizienz von
5 × 109 koloniebildenden Einheiten (cfu) pro μg DNA (Stratagene;
La Jolla, CA) in kompetente XLI-Blue-SURE-Bakterienzellen transformiert,
und es werden Aliquote der transformierten Zellkulturen zum Ausplattieren
entnommen, um die Bibliotheksgröße und die
Zahl der ursprünglichen
Mitglieder zu bestimmen. Eine gute Bibliothek hat im allgemeinen
wenigstens 107 cfu. Nach dem Expandieren
des Restes der bakteriellen Kultur, wird doppelsträngige Phagemiden-DNA
präpariert
und mit SacI und XhoI verdaut. Das große Fragment wird mit einem
SacI-XhoI-Fragment, das die aus phh3 abgeleiteten bakteriellen Promotoren
in Kopf-Kopf-Anordnung enthält,
und so phh3B/VH-VL erzeugt (10).
-
phh3B/VH-VL-artige Vektoren erhält man durch
Transformation des Ligierungsgemisches in elektrokompetente SURE-Zellen.
Es werden Aliquote ausplattiert, die eine Transformationseffizienz
von mindestens 107 Gesamt-cfu garantieren.
Der Rest der transformierten Bakterien wird bei 1012 plaquebildenden
Einheiten (pfu) mit dem Helfer-Phagen VCSM13 überinfiziert, wodurch man gepackte
Phagemiden erhält,
die Fab-Fragmente präsentieren.
Dieser letzte Schritt vergrößert die
Bibliothek, indem er die zahlenmäßige Vertretung
jedes ursprünglichen
Mitglieds erhöht.
Die Plaques werden mit Polyethylenglykol aus dem Zellüberstand
gefällt und
in PBS resuspendiert. Dies ist die ursprüngliche Bibliothek.
-
Lösliches
Fab wird aus der Phagemidenbibliothek durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen
SpeI und NheI, um das gIII-Hüllprotein-DNA-Segment
zu entfernen, und Religierung hergestellt (10). Die Verdauung mit SpeI und NheI
erzeugt kompatible kohäsive
Enden, die ligiert werden. Das DNA-Fragmente, dem der gIII-Hüllproteinabschnitt
fehlt, wird gelgereinigt, selbstligiert und in elektrokompetente
SURE-Zellen transformiert. Die Titer der Bibliothek werden durch
Ausplattieren von Aliquoten bestimmt. Es wird erwartet, daß die Bibliothek
aus mindestens 107 cfu besteht. Die Expression
von Fab in der Kultur wird mit IPTG induziert (sowohl für den lacZ-als
auch den tac-Promotor) und die Zellen werden durch drei Einfrier-/Auftauzyyklen
zwischen –80°C und 37°C lysiert,
und ergeben so Fab-haltige Lysate.
-
Beispiel 9: Testen der
Reaktivität
der ursprünglichen
Fab-Bibliothek
-
Die Phagendisplaybibliothek wird
mit dem OC2-Tumor und mit normalen Patienten-/menschlichen Geweben
immunhistochemisch auf ihre Reaktivität getestet. Aus dem OC2-Tumor
werden Kryostatschnitte (4 Mikron dick) präpariert, wozu sowohl der aus
den Eierstöcken
abgeleitete Tumor als auch der aus den Lymphmetastasen und Lymphknotenmetastasen
und aus den Myometrium-, Endometrium- und Dünndarmproben, die vom OC2-Patienten gewonnen
wurden, verwendet werden. In Aceton fixierte Cytospin-Präparate der
PBL des Patienten und von PBL eines anderen Menschen werden wie
in Current Protocols in Immunology (Hrsg. J. E. Coligan et al.,
John Wiley & Sons,
NY, NY, 1992) beschrieben getestet. Andere Kryostatschnitte aus
menschlichen Geweben, wie Leber, Nieren, Herz, Lunge, Milz, Speiseröhre, Zwolffingerdarm
(Jejunum) werden aus Operationsproben und/oder Autopsien hergestellt,
die 6 bis 18 Stunden nach dem Tod vorgenommen wurden. Die Immunhistochemie
wird sowohl an den Kryostat- als auch an den Cytospin-Präparaten
vorgenommen, außer
daß zur
Detektion gebundener Fab- (M13-) Phagenpartikeln statt der vorher verwendeten
Avidin-Peroxidase der anti-M13 vom Schaf und anschließend der
biotinylierte anti-Schaf-Antikörper
vom Esel (5 Prime → 3 Prime;
Boulder, CO) verwendet werden. Alternativ werden die Schnitte mit
löslichem
Fab behandelt, der aus der Fab-Phagendisplaybibliothek
hergestellt worden war; es folgte biotinylierter anti-Maus-Kappa
vom Kaninchen und dann Avidin-Peroxidase. In diesem Stadium reagieren
die Bibliotheken mit den Tumorzellen und mit normalen Zellen.
-
Beispiel 10: Selektion
der Fab-Phagendisplaybibliothek auf ihre Reaktivität mit den
OC2-Tumorzellen
-
Wenn die VH-VL-Kombinationen aus Mäusen, die gegen den OC2-Tumore
immun sind, amplifiziert werden, werden auch Antikörper vertreten
sein, die nicht gegen die Tumorzellen oder irgendwelche anderen menschlichen
Gewebe gerichtet sind vertreten sein. Um diese irrelevanten Antikörper und über repräsentierte anti-Tumor-Antikörper aus
der Bibliothek zu eliminieren, wird die Fab-Phagendisplaybibliothek
mit Percollgradienten-isolierten OC2-Tumorzellen auf ihre Reaktivität selektiert.
Intakte, unfixierte Tumorzellen werden dazu verwendet, die Integrität der antigenen
Determinanten auf den Zellmembranen zu bewahren. Ein 100 μl-Aliquot der Bibliothek,
das 1011 cfu enthält, wird mit 107 gewaschenen
OC2-Zellen 3 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Die
Zellen werden durch Zentrifugieren gefällt, der Überstand wird entfernt, und
die Zellen werden 3 Mal mit PBS gewaschen, um nicht gebundene Phagen
zu entfernen. Gebundene Phagen werden von den Zellen mit 0,1 M Glycin/HCl,
pH 2.2, mit 1 mg/ml BSA entfernt. Nach 5 Minuten wird die Zellsuspension mit
6 μl 2 M
Trizma-Base neutralisiert und 1 : 10 mit SOC-Medium verdünnt. Diese
Behandlung führt
nicht zur Lyse von Säugerzellen.
Die große
Mehrheit bleibt während
des Vorgangs intakt, doch kann ein gewisses Anschwellen der Zellen
beobachtet werden. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gefällt, und
der Überstand, der
den eluierten Phagen enthält,
wird zur Infektion von E. coli-XLI-BIue-Zellen verwendet. Aus den
transformierten Zellkulturen werden Aliquote zum Ausplattieren entnommen,
um die Zahl der gepackten Phagemiden zu bestimmen, die aus der Schale
ausgewaschen worden waren. Die Kulturen werden mit Helfer-Phagen VCSM13
infiziert, um mehr gepackte Phagemiden zu erzeugen. Diese werden
mit einer limitierenden Zahl von OC2-Tumorzellen geschüttelt – und zwar
jener Zahl, die vorab durch Retitrieren von ungebundenem Phagenpartikeln
als limitierend bestimmt wurde. Die Amplifikation des eluierten
Phagen und das weitere Binden an eine limitierende Zahl von OC2-Zellen,
mit nachfolgender Elution werden drei oder vier Mal wiederholt,
um die Tumorspezifität
der selektierten Bibliothek sicherzustellen. Diese selektierte Bibliothek
wird durch Immunhistochemie auf ihre Reaktivität mit dem OC2-Tumor und mit
normalem Gewebe getestet. Sie zeigt eine stärkere Reaktivität, doch
mit einem ähnlichen
Muster, wie es bei der ursprünglichen
Bibliothek beobachtet worden war.
-
Beispiel 11: Absorption
der Tumor-selektierten Bibliothek mit normalen Menschen-/Patientengeweben
und PBL
-
Die Tumor-selektierte Bibliothek
zeigt starke Kreuzreaktivität
mit normalem menschlichem Gewebe. Das Gros dieser Kreuzreaktivität könnte von
normalem Gewebe, das aus jeder beliebigen menschlichen Quelle abgeleitet
ist, absorbiert werden, da die große Mehrheit der menschlichen
Antigene bei verschiedenen Individuen identisch sind (Molecular
Biology of the Cell, Hrsg. B. Alberts et al., Garland Publishing,
Inc., NY, NY, 1989). Die Histokompatibilitätsantigene unterscheiden sich
jedoch von Individuum zu Individuum aufgrund polymorpher Determinanten.
Während
die Reaktivitäten
gegen die nichtpolymorphen Determinanten der Histokompatibilitätsantigene
durch Gewebe von jedem Menschen absorbiert werden können, wird
vom Patienten abgeleitetes Gewebe benötigt, um beliebige Fab-Phagen
zu absorbieren, die mit polymorphen Determinanten dieser Antigene
reagieren. Leukocyten aus peripherem Blut sind für diesen Zweck besonder gut
geeignet, da sie alle Histokompatibilitätsantigene kollektiv exprimieren,
darunter auch MHC-Antigene Klasse I, die in allen Körperzellen
mit Zellkern vorkommen, und MHC-Antigene Klasse II, die meist in
B-Zellen, Monocyten und Dendritenzellen vorkommen.
-
Die Fab-Phagendisplaybibliothek wird
zuerst mit normalen menschlichen PBL absorbiert, dann mit einem
Gemisch aus Festgewebepräparaten,
die von Menschen im Allgemeinen und von OC2-Patienten im Besonderen
abgeleitet sind. Zuletzt wird die Bibliothek mit PBLs vom OC2-Patienten
absorbiert. Nach jeder Absorption wird die Bibliothek reamplifiziert
und durch Immunhistochemie auf ihre Reaktivität gegen den OC2-Tumor und gegen
normale Menschen-/Patientengewebe und PBLs getestet, wobei Kryostatschnitte
und Cytospinpräparate
verwendet werden. Die Reabsorptionen mit neuen Festgewebepräparaten
oder PBLs und die anschließenden
Reamplifikationen der Bibliothek werden fortgesetzt, bis die absorbierte
Bibliothek viel stärker mit
dem OC2-Tumor reagiert als mit jedem beliebigen der getesteten normalen
Menschen-/Patientenzellen oder -gewebe.
-
Für
die Absorption mit normalen menschlichen PBL werden frisch präparierte
ganze Zellen verwendet. Ein Aliquot der Tumor-selektierten Fab-Phagendisplaybibliothek
wird bei Raumtemperatur 3 Stunden lang mit 1 × 108 PBLs
geschüttelt. Überschüssige Zellen
werden entfernt, um sicherzustellen, daß die meisten reaktiven Phagenpartikel
entfernt wurden.
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Für
die Absorption mit Festgeweben werden Membranen verwendet. Eine
Membranfraktion war schon aus der Myometriumprobe vom OC2-Patienten
zubereitet und bei –80°C tiefgefroren
aufbewahrt worden. Die Endometrium- und Dünndarmproben vom OC2-Patienten,
die in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei –80°C aufbewahrt worden waren, wurden
zur Präparation
der Membranen in der gleichen Weise verarbeitet. Darüberhinaus
werden andere Proben von normalem menschlichem Gewebe aus Operationsproben
und Autopsien gewonnen und die Membranfraktionen präpariert
und in Aliquoten mit 10% Glycerin bei –80°C gelagert. Nach dem Auftauen
werden annähernd
gleiche Membranaliquote aller Gewebe vereinigt und bei Raumtemperatur
3 Stunden lang mit einem Aliquot der mit menschlichen PBL absorbierten
Fab-Phagendisplaybibliothek geschüttelt. Der Überstand, der den unadsorbierten
Phagen enthält,
wird nach Fällung
der Membranen bei 150.000 × g
gewonnen.
-
Die Schlußabsorption der Fab-Phagendisplaybibliothek
mit PBL vom OC2-Patienten geschieht wie vorstehend beim normalen
menschlichen PBL beschrieben, außer der Tatsache, daß aufgrund
des geringen verfügbaren
Vorrats nur 5 × 106 Zellen pro Absorption verwendet werden.
Da die Bibliothek mit normalem Gewebe wie Endometrium, Myometrium
und Dünndarm,
die vom OC2-Patienten abgeleitet sind, schon absorbiert wäre, und
die MHC-Klasse I-spezifischen/patientenspezifischen
Fab-Phagen schon drastisch vermindert wären, ist die Absorption mit
den PBL des Patienten dazu gedacht, nur die MHC-Klasse II-spezifischen,
patientenspezifischen Fab-Phagen zu vermindern.
-
Beispiel 12: Abschätzung der
Komplexität
der Bibliothek
-
Die optimale (absorbierte) Bibliothek
zielt auf viele verschiedene Epitope (antigene Determinanten). Obwohl
die Tumorzellen, die zur Immunisierung von Mäusen verwendet werden, dem
Immunsystem viele Epitope präsentieren,
sind wahrscheinlich nur wenige immundominant, so daß Antikörper gegen
sie in der ursprünglichen
Bibliothek überrepräsentiert
sein werden. Antikörper
gegen andere Epitope werden daher in der ursprünglichen Bibliothek unterrepräsentiert
sein. Obwohl dies bei einem konventionellen polyclonalen Antiserum
zu großer
Sorge Anlaß geben
würde,
umgeht die Fab-Phagendisplaybibliothek dieses Problem. Die Bindung
der Bibliothek an limitierende Konzentrationen von OC2-Tumorzellen
mit anschließender
Reamplifikation der gebundenen Fab-Phagenpartikel erhöht die Vertretung
der weniger immunogenen Epitope. Die anschließende Absorption der Tumor-selektierten
Bibliothek mit normalen Geweben und PBL verringert die Vertretung mancher
Epitope in der Fab-Phagendisplaybibliothek
drastisch.
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Eine Abschätzung der Zahl der verschiedenen
Epitope, auf die die tumorselektierte/normalgewebeabsorbierte Bibliothek
zielt, erhält
man durch Clonieren einiger der Mitglieder der Bibliothek. Aliquote
von mit der absorbierten Fab-Phagendisplaybibliothek infizierten
XLI-Blue E. coli werden ausplattiert und einzelne Kolonien ausgewählt. Die
doppelsträngigen
Phagemidenvektoren werden isoliert und ihre V-Region-Nucleotidsequenzen
bestimmt. Die Sequenzen werden mit dem Homologie-Suchprogramm BLAST
(S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–10, 1990), das von der Molecular
Biology Computer Research Resource erhältlich ist, untersucht, um
die Untergruppe der V-Region, die Verwendung der D-Gene und der
J-Gene zu bestimmen. Diese Analyse liefert ein erstes Maß der Komplexität der Bibliothek,
da sie anzeigte, ob die analysierten Clone von vielen oder von sehr
wenigen ursprünglichen
B-Zellen-Clones abgeleitet sind.
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Als zweites Maß der Komplexität wird die
Fähigkeit
der Fab-Fragmente von verschiedenen Clones bestimmt, um die Bindung
an die OC2-Tumorzellen zu kreuzkompetieren; dies geschieht durch
ELISA unter Verwendung von Schalen mit OC2-Membranpräparaten und/oder durch Immunhistochemie.
Lösliche
Fab-Fragmente von verschiedenen Clones kompetieren mit der Bindung
von phagengebundenen Fab-Fragmenten von einem der Clone, bei dem
die Bindung von Phagen mit anti-M13-Antikörpern vom Schaf und anschließend biotinylierten
anti-Schaf-Antikörpern
vom Esel und Avidin-Peroxidase festgestellt wird. Wenn zwei Clone
nicht kreuzkompetieren, nimmt man an, daß sie gegen verschiedene Epitope
gerichtet sind. Aufgrund der Zahl der kreuzkompetierenden Clone
in einem gegebenen Satz von Clones und der Zahl der cfu in der Bibliothek
wird die Komplexität
der Bibliothek abgeschätzt.
Diese Art der Analyse gibt nur einen Hinweis auf die Zahl der Epitope
unter antigenen Determinanten, auf die die Bibliothek zielt. Sie
offenbart nicht, auf wieviele verschiedene Antigene gezielt wird.
Dies kann jedoch abgeschätzt
werden, indem die Bibliothek mit Zellbestandteilen reagieren gelassen
wird, die durch 2-dimensionale Elektrophorese getrennt wurden.
-
Beispiel 13: Erzeugung
einer anti-Tumor IgG2a Bibliothek von Mäusen
-
Um festzustellen, welches der murinen
IgG-Isotope am wirksamsten Effektorfunktionen zur Eliminierung der
CD4+-Zellen vermittelt, wurden chimäre Antikörper auf ihre Fähigkeit
ge testet, in vitro komplementabhängige
Cytotoxizität,
in vivo Zellentleerung und Verlängerung
des Überlebens
bei allogener Hauttransplantation und Unterdrückung der allo-Antikörperproduktion
zu vermitteln. Insgesamt wurde bei diesen Tests als wirkungsvollster
Mäuse-Idiotyp IgG2a bestimmt. Auch andere haben gezeigt, daß IgG2a der beste Mäuse-Isotyp hinsichtlich der
Fc-vermittelten Effektorfunktionen ist. Der menschliche Isotyp IgG1, der wahrscheinlich der zum Mäuse IgG2a am meisten analoge Isotyp ist, hat sich
als einer der beiden besten menschlichen Isotypen hinsichtlich der
Fc-vermittelten Effektorfunktionen erwiesen (J. L. Dangl et al.,
EMBO J. 7: 1989–94,
1988).
-
Die Kombinationen der variablen H-
und L-Regionen werden von der Phagemidenbibliothek als murine IgG2a Antikörper
exprimiert. Vor dem Transfer der verknüpften VH-VL-Kombinationen
in den murinen Dualvektor IgG2a (4a) wird das SacI-XhoI-DNA-Fragment, das die
Kopf-Kopf-gerichteten bakteriellen Promotoren und Leadersequenzen
im Phagemidenvektor phh3B/VH-VL enthält (10a), gegen ein SacI-XhoI-DNA-Fragment
ausgetauscht, das die murinen H- und L-Promotoren und Leadersequenzen
in Kopf-Kopf-Transkriptionsrichtung
enthält,
und so phh3M/VH-VL erzeugt (10b).
Die verknüpften
VH-VL-Kombinationen
einschließlich der
Säuger-Promotoren
werden durch PCR-Amplifikation aus dem phh3M/VH-VL-Vektor herausgenommen, wozu
die 3L- und 3H-Primervorräte
verwendet werden (3).
-
Der 1H-Primervorrat (Gegensinn) ist
zum unmittelbaren Beginn der IgGγ2b-CH1-Domäne und zu einem Teil eines
JH-Gens (vier Primer; einer für
jedes der murinen JH-Gene) komplementär. Zusätzlich enthält dieser Primervorrat eine
HindIII-Restriktionsstelle und eine Spleißstelle und eliminiert die
vorher existierende EcoRI-Stelle des phh3B/VH-VL-Vektors (10a). Die 3L-Primer (Gegensinn)
ist zum unmittelbaren Beginn der Cκ-Domäne und zu einem Teil des JL-Gens
(7 Primer; für
die 4 funktionellen Jκ-Gene
und die 3 funktionellen Jλ-Gene) komplementär. Zusätzlich enthält dieser
Primervorrat eine EcoRI-Restriktionsstelle und eine Spleißstelle
und eliminiert die vorher existierende HindIII-Stelle des phh3B/VH-VL-Vektors (10a).
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Die PCR-amplifizierten DNA-Fragmente
werden gelisoliert, mit EcoRI und HindIII verdaut und mit dem EcoRI-HindIII-Rückgrat des
murinen Dualvektors IgG2a ligiert (4a). Das Ligierungsgemisch
wird mit einer Transformationsfrequenz größer als 1010 pro μg DNA in
elektrokompetente DH101B-Zellen transformiert (Gibco/BRL; Grand
Island, NY) und so eine IgG2a-Expressionsbibliothek
erzeugt (IgG2a/lib-Vektor). Um die Komplexität der Biblio thek
während
dieser Manipulationen zu erhalten, werden Bakterienzellen hoher
Transformationseffizienz und Säugerzellen
hoher Transfektionseffizienz verwendet.
-
Beispiel 14: Expression
der Mäuse
IgG2a Bibliothek in Hybridomzellen, Reinigung
der Antikörper,
Abschätzung der
Komplexität
der Bibliothek
-
Nach der Linearisierung durch Restriktionsenzymverdauung
an der einzigen SaII-Stelle, wird der IgG2a/lib-Vektor
durch Elektroporation in die Nullhybridomzellenlinie Sp2/0-Ag14
transfiziert, außer
der Tatsache, daß pro
Küvette
1 ml-Aliquote mit je 2 × 107 Zellen verwendet werden. Die Transfektanten
werden in selektivem Medium mit Xanthin und Mycophenolsäure gewonnen.
Die Transfektionsfrequenz der Sp2/0-Ag14-Zellinie beträgt etwa
1 von 104 Zellen, und etwa 50% der Transfektome
erzeugen nennenswerte Mengen von Immunglobulin, wie mit Western-Blot-Analyse
abgeschätzt
wurde.
-
Für
die Transfektion der Bibliothek werden 5 × 108 Sp2/0-Ag-14-Zellen
und eine Gesamtmenge von 500–1000 μg IgG2a Bibliotheks-Vektor-DNA verwendet, in der
Erwartung, etwa 25.000 Clone zu erhalten. Die transfizierten Zellen
werden 20 Stunden lang gezüchtet,
und danach wird selektives Medium mit Xanthin und Mycophenolsäure hinzugefügt. Es werden
Aliquote entnommen und in selektiven Medium auf Weichagar ausplattiert,
um die Bibliothek zu titrieren. Der Rest wird in 4-Liter Rollerflaschen
in selektivem Medium gezüchtet, um
alle außer
den stabil transfizierten Zellen absterben zu lassen und um eine
Zelldichte von 2 × 106 Zellen/ml zu erreichen.
-
Die Antikörper werden aus dem Kulturüberstand
auf Protein A- oder Protein G-Sepharose (Pharmacia Biotech; Piscataway,
NJ) gereinigt, und die Reinheit wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(PAGE) getestet. Auf der Basis der bisherigen Erfahrungen mit dieser
Art von Transfektanten wird die Gewinnung von 5–10 μg IgG pro ml Kulturüberstand
erwartet, also waren voraussichtlich 60 mg IgG2a Bibliotheksantikörper aus 8
1 Kulturüberstand
zu erhalten.
-
Obwohl es keine Schätzung der
Komplexität
der absorbierten Fab-Phagendisplaybibliothek gibt, muß diese
geringer als 107, der Größe der ursprünglichen
(nicht absorbierten) Fab-Phagendisplaybibliothek sein. Verwendet
man eine Säugerbibliothek,
die 400 mal kleiner ist als die ursprüngliche Fab-Phagendisplaybibliothek,
(25.000) kann es sein, daß nicht
alle einzigartigen Mitglieder der absorbierten Fab-Phagendisplaybibliothek
in der Mäuse-IgG2a-Bibliothek
vertreten sein werden. Dies ist nicht wahrscheinlich, da ein sehr
hoher Prozentsatz der Bibliotheksmitglieder während der Absorption mit normalen
Menschen/Patienten- Geweben
und PBL eliminiert wird. Darüber
hinaus enthält
die ursprüngliche
Fab-Phagendisplaybibliothek
von 107 Mitgliedern zahlreiche aus dem selben
B-Zellen-Clon abgeleitete Mitglieder, was ihre tatsächliche
Komplexität
verringert. Weiterhin ist, da stabile Transfektion durch Elektroporation
zur Einbeziehung mehrerer Kopien des transfizierten Vektors pro
Zelle führt,
die Größe der Säugerbibliothek
wahrscheinlich größer als
25.000. Nichtsdestoweniger besteht eine Wahrscheinlichkeit verschieden
von Null, das die Säugerbibliotheken
weniger komplex als die Fab-Phagendisplaybibliothek sein werden,
aus der sie abgeleitet sind. Jedoch könnte die Komplexität der Säugerbibliotheken
realistischerweise nicht um mehr als eine halbe Größenordnung
erhöht
werden, ohne daß die
Größe des Transfektionsversuchs
diesen technisch undurchführbar
machen würde.
-
Wegen der vorstehenden Überlegungen
und, noch wichtiger, weil einzelne Hybridomzellentransfektanten
innerhalb einer Population dazu neigen, mit verschiedenen Wachstumsraten
zu wachsen, verschiedene Mengen von Immunglobulin zu erzeugen und
manchmal die Immunglobulinproduktion zu verlieren, werden die Säuger-IgG-Bibliotheken
nicht durch Amplifikation aus einem kleinen Zellenaliquot weiter
propagiert. Stattdessen werden die Bibliotheken de novo aus der
absorbierten Fab-Phagendisplaybibliothek erzeugt. Die anfängliche
Expansion der Säugerbibliothek
für mögliche zukünftige klinische
Anwendungen wird von größerem Ausmaß sein.
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Nach der Expansion der Säugerbibliotheken
erhält
man eine Absetzung ihrer Komplexität aus der Nucleotidsequenz
der exprimierten Gene der V-Region. Es wird die cDNA-Synthese innerhalb
der Zelle und die Verkettung der exprimierten Gene der H- und L-Kette
der V-Region ausgeführt.
Dann werden die verknüpften VH-VL-Kombinationen
in phh3 transferiert und die Nucleotidsequenzen von 30 bis 40 Phagemidenclones
bestimmt.
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Beispiel 15: Auswirkung
der Mäuse-IgG2a Bibliothek auf das Wachstum des OC2-Tumors
in Nacktmäusen
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Die Fähigkeit von Antikörpern mit
murinen C-Regionen, in einer Maus Effektorfunktionen zu vermitteln, die
zur Eliminierung von Zielzellen eines bestimmten menschlichen Tumors
führen,
ist ein Indikator für
die Fähigkeit
derselben Antikörper,
in Menschen Effektorfunktionen zu vermitteln, die zur Eliminierung
von Zielzellen jenes Tumors führen,
wenn sie mit menschlichen C-Regionen zur Verfügung gestellt werden. Deshalb
wird die Nacktmaus als Modell verwendet, um das Potential der anti-Tumor-Bibliothek
bei der Eliminierung von Tumor-Zielzellen in vivo zu testen. BALB/c-Nacktmäusen werden
0,25 ml OC2-Tumorstücke oder
107 OC2-Tumorzellen sowohl s.c. als auch
i.p. injiziert. Auch intravenöse
Injektionen von Tumorzellensuspensionen werden verwendet, wenn das
Wachstum des OC2-Tumors in einem beliebigen Organ nachgewiesen werden kann,
beispielsweise in der Milz oder dem Eierstock. Den Mäusen werden
gleichzeitig oder hintereinander die IgG2a-Antikörperbibliothek
oder im Fall der Kontrollgruppe eine äquivalente Menge Mäuse-IgG2a injiziert. Die Wirkung der Antikörper Behandlung
wird durch visuelle und taktile Untersuchung auf Entwicklung eines
subcutanen Tumors bestimmt. Dessen Ausmaße werden zu verschiedenen
Zeiten nach der Antikörperbehandlung
im Vergleich zur Kontrollgruppe gemessen. Die Mäuse, denen intraperitoneal
Tumor injiziert worden war, werden zu einer Zeit getötet, die
aufgrund der Untersuchung von Kontrollmäusen, die einen sichtbaren
Tumor in der Bauchhöhle
entwickeln, im voraus bestimmt wird (ungefähr nach 3–5 Wochen), und auf Tumorwachstum geprüft. Es werden
alle getöteten
Mäuse,
einschließlich
aller i.v. mit Tumorzellsuspensionen geimpften auf Metastasen und
Tumornekrose geprüft.
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Das Wachstum der subcutanen Tumore
kann schwieriger zu hemmen sein als das Wachstum der intraperitonealen
Tumore oder der Tumore an anderen Stellen, da die letzteren besser
für Antikörper und
Effektorzellen zusätzlich
zugänglich
sein könnten.
Es werden sowohl s.c. als auch i.p. Tumore getestet, denn wenn s.c.
Tumore schwieriger zu hemmen sind, ist ihre Hemmung ein zusätzliches
Maß für die Stärke der
Antikörperbibliothek.
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Es werden 100 μg IgG2a-anti-Tumor-Antikörperbibliothek
durch i.p. Injektion 3 Tage nach der Injektion der Tumorstücke verabreicht.
Um den Prozeß zu
optimieren werden je nach den Ergebnissen Antikörper zu einem früheren oder
späteren
Zeitpunkt injiziert. Abermals werden, je nach den Ergebnissen, verschiedenen Dosen
von IgG2a Antikörper, mehr oder weniger als
100 μg pro
Maus, durch wiederholte Injektionen auf i.v. Injektionsweg verabreicht.
Es können
auch verschiedene Dosen von Tumorstücken und OC2-Tumorzellen verabreicht
werden. Zuerst werden für
jedes Versuchsverfahren nur zwei Mäuse und für die Kontrolle (nicht-spezifisches Mäuse-IgG2a) drei Mäuse verwendet. Dann werden
die Versuchsverfahren, wenn sie wirkungsvoll waren, an einer Gruppe
von 5 Mäusen
und 5 Mäusen
in der Kontrollgruppe getestet.
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Beispiel 16: Erzeugung
einer chimären
Maus/Mensch-IgG1-Bibliothek und Wirkung
der chimären Maus/Mensch-IgG1-Bibliothek auf das Wachstum des OC2-Tumors
bei HU-PBL-SCID-Mäusen
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Einen Abschnitt des EcoRI-HindIII-DNA-Fragmentpräparates,
das die verknüpften
VH-VL-Kombinationen einschließlich der
Säuger-Promotoren
und Spleißstellen
enthält,
wird mit dem EcoRI-HindIII für
Rückgrat des
chimären
dualen Vektors IgG1 (4b) und in elektrokompetente DH101-B-Zellen
transformiert, um eine chimäre
Maus/Mensch IgG1-Expressionsbibliothek zu
erzeugen. Die Fähigkeit
der chimären
Maus/Mensch IgG1-Bibliothek, das Wachstum
des OC2-Tumors zu hemmen, wird sowohl in Nacktmäusen als auch in SCID-Mäusen ohne und mit Rekonstitution
der SCID-Mäuse
mit menschlichen PBL getestet. Es wurde gezeigt, daß menschliche
Fc-Regionen murine Fc-Rezeptoren binden, und daher ist es möglich, daß die chimäre IgG1-Bibliothek das Wachstum des OC2-Tumors
hemmen wird. Es werden sowohl da subcutane als auch das intraperitoneale
Tumorwachstum getestet.
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Die Fähigkeit der chimären IgGI-Antikörperbibliothek,
das Wachstum des OC2-Tumors in HU-PBL-SCID-Mäusen zu hemmen, wird getestet,
um festzustellen, ob die menschlichen Effektorzellen einen zusätzlichen
Vorteil verleihen. Um HU-PBL-SCID-Mäuse zu erzeugen, werden SCID-Mäuse intraperitoneal
mit 2–5 × 107 adulten PBLs transplantiert, die vom Gesamtblut
durch vier Ficoll-Plaque Dichtegradientenzentrifugierungen zum Zeitpunkt
der ersten Injektion der chimären
IgG1-Antikörperbibliothek abgetrennt wurde.
Der Großteil
der menschlichen PBL verbleibt in der Bauchhöhle und erscheint erst 3 bis
6 Wochen nach der Rekonstitution in der Milz und im Blut (als 1–10% der
gesamten Zellen nach der Lyse der roten Blutkörperchen), und daher erstreckt
sich der Test nur auf die Inhibition des intraperitonealen Tumorwachstums.
Durch Ausscheiden EBV-positiver Proben und/oder Tumore werden Komplikationen
aufgrund des Auftretens von Epstein-Barr-Virus- (EBV-) induzierten
Lymphomen bei Mäusen,
die mit PBL von einigen EBV-seropositiven Spendern rekonstituiert
wurden, vermieden. Die Zeit des Auftretens dieser Lymphome variiert
zwischen 6 und 20 Wochen nach der Rekonstitution, aber sie ist für einen
gegebenen EBV-seropositiven Spender reproduzierbar. PBLs von manchen
EBV-seropositiven Spendern verursachen nie Lymphome. Die PBLs von
einigen wenigen Spendern werden vorab getestet, und es werden nur
die Spender verwendet, deren PBL nicht zur frühen Entwicklung von Lymphomen
bei den rekonstituierten Mäusen
führen.
Weiterhin wird eine Kontrollgruppe von Mäusen, denen der OC2-Tumor nicht injiziert
wurde, in die Versuche einbezogen. Die Strategie in bezug auf die
Anti körperdosen
und die Reihenfolge und den Zeitpunkt der Injektionen der Antikörperbibliothek
und des OC2-Tumors ist dieselbe, die bei der Mäuse-IgG2a-Bibliothek beschrieben
wurde.
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Dem Fachmann werden sich aus der
Lektüre
dieser Beschreibung und Ausführung
der darin offenbarten Erfindung noch andere Ausführungsformen und Anwendungen
dieser Erfindung ergeben. Die Beschreibung und die Beispiele sollen
nur als exemplarisch betrachtet werden; der tatsächliche Schutzbereich der Erfindung
wird in den nachfolgenden Ansprüchen
angegeben.