DE69530353T2

DE69530353T2 - Acylierte Insulinanalogen

Info

Publication number: DE69530353T2
Application number: DE69530353T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Clayton Indianapolis Baker; Jose Michael Martinsville Hanquier
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1994-11-17
Filing date: 1995-11-14
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2015-11-15
Also published as: MX9703508A; EP0712861A3; KR970706842A; ES2194890T3; DE69530353D1; TR199501420A2; CZ145797A3; CA2205060A1; HUT77030A; ATE237635T1; US5693609A; TW434259B; NO972169L; CO4520284A1; WO1996015804A1; RU2160118C2; FI972031A0; JPH10511644A; EP0712861B1; BR9509653A

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet von Diabetes. Genauer gesagt betrifft die Erfindung acylierte Insulinanaloga mit einer verlängerten Wirkdauer.
Die Verfügbarkeit der Insulinersatztherapie hat die Morbidität und Morbidität von akuten Komplikationen bei Diabetes mellitus verhindert. Jedoch bleiben chronische diabetische Komplikationen ein Hauptgesundheitsproblem aufgrund eines andauernden metabolischen Ungleichgewichts, was prinzipiell durch eine schlechte Kontrolle der Blutglucose auftritt. Die Ergebnisse aus der Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) zeigen, daß eine Verringerung von 1% beim HbAlc mit mehr als 35% Verbessenrung beim Auftreten der Retinopathie korreliert.
Um eine normale Glykämie zu erreichen, maß die Therapie so angelegt sein, daß sie so eng wie möglich dem Muster der endogenen Insulinsekretion bei normalen Individuen folgt. Der tägliche physiologischie Bedarf für Insulin fluktuiert und kann in zwei Phasen unterteilt werden: (a) Der absorptiven Phase, die einer Ausschüttung von Insulin bedarf, um den mit der Mahlzeit zusairunenhängenden Blutglucoseschwall zu entsorgen und (b) der postadsorptiven Phase, die eine anhaltende Menge an Insulin erfordert, um den Glucoseausstoß der Leber zur Aufrechterhaltung der optimalen Blutglucose während der Fastenperiode zu regulieren.
Demnach umaßt eine wirksame Therapie die kombinierte Verwendung von zwei Typen an exogenem Insulin: Einem schnell wirkenden Insulin während der Mallzeit und einem langanhaltenden basalen Insulin.
Um eine langanhaltende basale Wirkung zu erreichen, wird Insulin derzeit unter Bedingungen formuliert, die die Bildung einer hexameren Konformation in einem unlöslichen, kristallinen Zustand favorisieren. Diese langanhaltenden Formulierungen sind Ultralente, Lente und semi-Lente. Jedoch hat sich gezeigt, daß die Unlöslichkeit der derzeitigen langwirksarnen Präparationen Probleme hinsichtlich der Inkonsistent der Dosisreaktion wie auch der Urvorhersagbarkeit der zeitlichen Wirkung verursacht. Zusätzlich ist eine derzeit erhältliche langanhaltende Insulinpräparation, nämlich Rinder-Ultralente, immunogen. Das Vorkommnen von Antikörpern, die aus der Imununogenität des Rinder-Ultralente resultieren, verändert die Pharmakokinetik von schnell wirkenden Insulinen.
Während die Wirkung über die Zeit der unlösliclen Ultralente Formulierung ein bequemes Einmal-am-Tag Insulin darstellt, bevorzugen viele Ärzte derzeit die Verwendung eines mittellang wirkenden Insulins, nämlich einer Insulin-Protamin-Formulierung, die herkömmlich als Insulin-NPH bezeichnet wird. Insulin-NPH wird zweimal am Tag als basales Insulin verwendet, da es vergleichbar einfacher ist, die optimale Dosis mit einem Arzneimittel mit kürzerer zeitlicher Wirkung einzustellen. Als Ergebnis machen die unmittelbar wirkenden Insuline 70% in den USA, 64% in Japan, 45% in Europa und insgesamt 55% des weltweiten Insulinmarktes aus.
Jedoch sind sowohl unlösliches Insulin-NPH als auch unlösliches Ultralente Insulin Suspensionsformulierangen. Daher sind die Formulierungen inhärent weniger vorhersagbar als lösliche Formulierungen und führen zu einer schlechteren Kontrolle der Blutglucose und zu einer größeren Anfälligkeit für lebensbedroliende hypoglykämische Vorfälle. Daher bleibt ein Bedarf für ein lösliches, langwirkendes Basalinsulin, um die erfolgreiche intensive Insulinersatztherapie zu erreichen. Die vorliegende Erfindung liefert acylierte Insulinanaloga, die unter Bereitstellung einer löslichen, basalen Insulintherapie formuliert werden können.
Die Acylierung von Schweine-, Rinder- oder Humaninsulin wird von Muranishi und Kiso in der JP I-254 699 A beschieben. Die folgenden Verbindungen sind spezifisch beschrieben: B29-N^ε-Palmitoylinsulin (die ε-Aminogruppe ist acyliert), B 1-N^α-Palinitoylinsulin (die N-terininale α-Aminogruppe der B-Kette ist acyliert) und B1,B29-N^αN^ε-Dipalmitoylinsulin (sowohl die ε-Amino- als auch die N-terminale α-Aminogruppe sind acyliert). Muranishi und Kiso besclhreiben, daß acyliertes Insulin ein biologisches Profil besitzt, das zu Insulin ähnlich ist, liefern aber keine Dosierungen, Verabreichungswege oder andere Bedingungen des in vivo Modells, um es dem Fachmann zu erlauben, die Aktivität oder Wirkdauer des acylierten Insulins zu beurteilen.
Ähnlich beschreiben Hashimoto et al. in Pharmaceutical Research, 6, 171–176 (1989) B1-N^α-Palrmitoylinsulin (die N-terminale α-Aminogruppe ist acyliert) und B 1,B29-N^αN^ε-Dipalmitoylinsulin (sowohl die ε-Aminogruppe als auch die N-terminale α-Aminogruppe sind acyliert). Hashimoto et al. untersuchten den hypoglykämischen Effekt von B1-N^α-Palinitoylinsulin und B 1,B29-N^αN^ε-Dipalinitoylinsulin in männlichen Ratten mit 25 E/ml, einer extrem hohen Dosis. Bei diesen Dosen zeigt die 5 von Hashimoto eine sehr geringe Aktivität bei einer intravenösen Verabreichung. Wenn es intramuskulär verabreicht wird, werden nur ein kurzer hypoglykämischer Effekt von B 1-N^α-Palinitoylinsulin und ein vernachlässigbarer Effekt von B 1,B29-N^αN^ε-Dipalmitoylinsulin in 6 von Hashimoto beschrieben.
Zusätzlich zu den in vivo Berichten von Muranishi und Kiso und Hashimoto et al. beschreiben Walder et al in der WO 92/01476 A, daß die Halbwertszeit von Proteinen und Peptiden in vivo durch die chemische Verknüpfung der Proteine mit einer apolaren Gruppe, speziell einem Fettsäurederivat, ausgedehnt werden kann. Die Fettsäure liefert eine Brückengruppe zwischen dein Protein und Albumin. Walder et al. beschreiben auch, daß die apolare Gruppe vorzugsweise auf eine bestimmte Stelle oder bestimmte Stellen im Protein beschränkt ist und stellen beispielsgeinäß die Bindung der Cysteinreste von Hämoglobin vor. Diese Literaturstelle beschreibt allgemein Fettsäurederivate von Insulin. Jedoch werden keine Fettsäuredertvate von Insulin spezifisch beschrieben oder beispielhaft dargestellt und es werden keine Daten veröffentlicht, um zu zeigen, daß die biologische Aktivität der Fettsäuredertvate von Insulin erhalten bleibt.
Es wurde nun festgestellt, daß die selektive Acylierung einer freien Aminogruppe eines monomeren Insulinanalogons eine wirksame Insulingrundaktivität bereitstellt. Die herin beschriebenen nicht-acylierten Insulinanaloga sind entwickelt, um ein schnelles Einsetzen der Wirkung und eine schnelle Clearance bereitzustellen. Diese Analoga sind in der Technik als monomere Insulinanaloga bekannt. Die Fähigkeit zur Modifizierung solcher Analoga zur Bereitstellung der Grundaktivität ist am unerwartetsten.
Die vorliegende Erfindung liefert ein monoacyliertes Insulinanalogon, daß bei einer Verwendung eine verlängerte Wirkdauer zeigt. Die Analoga können in löslichen Formulierungen hergestellt werden, was Vorteile gegenüber der derzeitigen basalen Insulintherapie bietet. Die vorliegenden Analoga besitzen auch eine ausgezeichnete Vorhersagbarkeit bei der Dosisreaktion, eine ausgezeichnete Vorhersagbarkeit bei der zeitlichen Wirkung, das Fehlen eines distinkten Peaks im Zeit-Wirkungsprofil und sind ideal zur Herstellung der Gemischormulierungen geeignet, die ein Insulinanalogon und ein acyliertes Insulinanalogon enthalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert ein monoacyliertes Insulinanalogon der Formel
korrekt vernetzt mit SEQ ID Nr. 2
worin
Xaa an der Position 1 von SEQ ID Nr. 1 (Insulin-A-Kette) für Gly steht oder für acyliertes Gly, wenn Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 für Phe steht, Xaa an der Position 28 der SEQ D Nr. 2 für Asp, Lys, Leu, Val oder Ala steht und Xaa and der Position 29 der SEQ D Nr. 2 für Lys oder Pro steht,
Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 (Insulin-B-Kette) für Phe steht oder für acyliertes Phe, wenn Xaa an der Position 1 der SEQ m Nr. 1 für Gly steht, Xaa an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 für Asp, Lys, Leu, Val oder Ala steht und
Xaa an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 für Lys oder Pro steht, Xaa an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 für Asp, Lys, Leu, Val, Ala steht oder für acyliertes Lys, wenn Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 1 für Gly steht, Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 für Phe steht und Xaa an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 für Pro steht, und Xaa an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 für Lys, Pro oder acyliertes Lys steht, wenn Xaa an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 für Asp, Lys, Leu, Val oder Ala steht, Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 1 für Gly steht und Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 für Phe steht.
Die Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Behandlung der Hyperglykämie durch die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine wirksaine Menge eines acylierten Insulinanalogons der Erfindung in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen enthält, an einen Patienten, der dessen bedarf.
Ebenfalls werden parenterale pharmazeutische Formulierungen beansprucht, die ein acyliertes Insulinanalogon der vorliegenden Erfindung zusammen mit einein oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Konservierungsstoffen, Isotonizitätsmitteln oder Puffern entlialten.
Der Ausdruck "Vernetzung" bezieht sich auf die Bildung von Disulfidbrücken zwischen den Cysteinresten. Ein korrekt vernetztes Humaninsulin oder Insulinanalogon enthält 3 Disulfidbrücken. Die erste Disulfidbrücke wird zwischen den Cysteinresten an den Positionen 6 und 11 der A-Kette gebildet. Eine zweite Disulfidbrücke verbindet den Cysteinrest an der Position 7 der A-Kette init dein Cystein an der Position 7 der B-Kette. Die dritte Disulfidbrücke verbindet das Cystein an der Position 20 der A-Kette mit dem Cystein an der Position 19 der B-Kette.
Die Ausdrücke "acyliertes Gly", "acyliertes Phe" und "acyliertes Lys" beziehen sich auf Gly, Phe und Lys, die mit einer C₆-C₂₁ Fettsäure acyliert sind. Der Ausdruck "Acylierungsgruppe" bezieht sich auf die Fettsäure, die chemisch an die α-Aminogruppe oder ε-Aminogruppe des Insulinanalogons gebunden ist. Die freien Aminogruppen an den Positionen A1 und B1 sind α-Aminogruppen. Die freie Aminogruppe von Lys an der Position B28 oder B29 ist eine ε-Aminogruppe.
Der Ausdruck "Acylierung" meint die Einführung einer Acylgruppe, die an eine freie Aminogruppe eines Proteins kovalent gebunden ist. Der Ausdruck "selektive Acylierung" meint die bevorzugte Acylierung der ε-Aminogruppe(n) gegenüber den α-Aminogruppen.
Der Ausdruck "Fettsäure" meint eine gesättigte oder ungesättigte C₆-C₂₁ Fettsäure. Die bevorzugten Fettsäuren zur Durchführung der Erfindung sind gesättigt und umfassen Myristinsäure (C14), Pentadecylsäure (C15), Palmitinsäure (C16), Heptadecylsäure (C17) und Stearinsäure (C18). Am bevorzugtesten ist die Fettsäure Palmitinsäure. Die erfindungsgemäßen Verbindungen stellen monoacylierte Insulinanalog dar. Die Insulinanaloga sind an einer α-Aminogruppe oder ε-Aminogruppe mit einer C₆-C₂₁ Fettsäure acyliert. Vorzugsweise sind die Analoga an der ε-Aminogruppe von Lysin monoacyliert.
Der Ausdruck "aktivierter Fettsäureester" meint eine Fettsäure, die mittels der allgemeinen Techniken aktiviert wurde, die in Methods of Enzymology, 25, 494–499 (1972) und Lapidot et al., in J. of Lipid Res. 8: 142–145 (1967) beschrieben wurden. Aktivierte Fettsäureester umfassen Derivate von herkömmlich verwendeten Acylierungsmitteln, wie Hydroxybenzotriazid (HOBT), N-Hydroxysuccinimid und Derivate hiervon. Der bevorzugte aktivierte Ester ist N-Succinimidylpalmitat.
Der Ausdruck "löslich" zeigt an, daß eine ausreichende Menge an Ester in der flüssigen Phase vorhanden ist, um das Insulinanalogon zu acylieren. Vorzugsweise befinden sich 1 bis 2 Moläquivalente des aktivierten Esters pro Mol Analogon in der flüssigen Phase.
Der Ausdruck "monomeres Insulinanalogon" oder "Insulinalogon" wird als ein schnell wirkendes Insulinanalogon verwendet, das gegenüber einer Dimerisierung oder Selbstassoziierung weniger empfindlich ist. Ein monomeres Insulinanalogon ist Humaninsulin, worin Pro an der Position B28 durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala ersetzt ist und Lys an der Position B29 Lysin oder Prolin ist. Monomere Insulinanaloga werden in Chance et aI., US Patentanmeldung 07/388 201 ( EP 0 383 472 A ) und Brange et al, EP 0 214 826 A beschrieben Der Fachmann erkennt, daß andere Modifikationen beim monomeren Insulinanalogon möglich sind und in der Technik gut bekannt sind. Diese Modifikationen umfassen den Austausch des Histidinrests an der Position B10 durch Asparaginsäure, den Austausch des Phenylalaninrests an der Position B1 durch Asparaginsäure, den Austausch des Phenylalaninrests an der Position B1 durch Asparaginsäure, den Austausch des Threoninrests an der Position B30 durch Alanin, den Austausch des Serinrests an der Position B9 durch Asparaginsäure, die Deletion der Aminosäuren an der Position B1 alleine oder in Kombination mit einer Deletion an der Position B2 und die Deletion des Threonins von der Position B30.
Der Ausdruck "basische Bedingungen", wie er hierin verwendet wird, bezielit sich auf die Basizität der Reaktion. Um ein Insulinanalogon selektiv an der ε-Aminogruppe zu acylieren, muß die Reaktion mit einer im wesentlichen vollständigen Deprotonierung der freien Aminosäuren ausgeführt werden muß. In einem wässrigen Lösemittel oder Co-Lösemittel meint basische Bedingungen, daß die Reaktion bei einem pH von mehr als 9,0 ausgeführt wird. In einein organischen Lösemittel wird die Reaktion in Gegenwart einer Base mit einer Basizität ausgeführt, die zu einem pK_a von mehr oder mindestens 10,75 in Wasser äquivalent ist.
Die SEQ ID Nr. 1 bezieht sich auf die erste Sequenz, die in der Sequenzliste aufgeführt ist und meint ein Analogon der humanen Insulin-A-Kette mit der folgenden Sequenz:
worin Xaa an der Position 1 von SEQ ID Nr. 1 (Insulin-A-Kette) für Gly steht oder für acyliertes Gly, wenn Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 für Phe steht, Xaa an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 für Asp, Lys, Leu, Val oder A1a steht und Xaa and der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 für Lys oder Pro steht.
Die SEQ ID. Nr. 2 bezieht sich auf die zweite Sequenz, die in der Sequenzliste aufgeführt ist und meint ein Analogon der Humaninsulin-B-Kette mit der folgenden Sequenz:
worin Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 (Insulin-B-Kette) für Phe steht oder für acyliertes Phe, wenn Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 1 für Gly steht, Xaa an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 für Asp, Lys, Leu, Val oder Ala steht und Xaa an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 für Lys oder Pro steht, Xaa an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 für Asp, Lys; Leu, Val, Ala steht oder für acyliertes Lys, wenn Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 1 (Insulin-A-Kette) für Gly steht, Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 (Insulin-B-Kette) für Phe steht und Xaa an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 für Pro steht, und Xaa an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 für Lys, Pro oder acyliertes Lys steht, wenn Xaa an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 für Asp, Lys, Leu, Val oder Ala steht, Xaa an der Position 1 der SEQ 1D Nr. 1 (Insulin-A-Kette) für Gly steht und Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 (Insulin-B-Kette) für Phe steht.
Wie oben erwähnt liefert die vorliegende Erfindung ein monoacyliertes Insulinanalogon der Formel SEQ ID Nr. 1 korrekt vernetzt mit SEQ ID Nr. 2 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon. Der bevorzugte Aminosäurerest an der Position 1 der SEQ ID Nr. I (Insulin-A-Kette) ist Gly. Phenylalanin ist die bevorzugte Aminosäure an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 (Insulin-B-Kette). Der bevorzugte Aminosäurerest an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 ist Asp oder acyliertes Lys, wenn der Aminosäurerest an der Position 29 der SEQ 17) Nr. 2 Pro ist. Der bevorzugte Aminosäurerest an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 ist Lys oder Pro, wenn der Aminosäurerest an der Position 28 der SEQ lD Nr. 2 acyliertes Lys ist. In Standardausdrücken der Biochemie, die dem Fachmann bekannt ist, ist das am meisten bevorzugte Analogon monoacyliertes Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin. Die bevorzugtesten acylierten Insulinanaloga sind mit einer C₈ bis C₁₈ Fettsäure, vorzugsweise einer C₁₄ bis C₁₆ Fettsäure monoacyliert. Bevorzugte Fettsäuren sind daher Octanoyl (C8), Nonanoyl (C9), Decanoyl (C10), Undecanoyl (C11), Lauroyl (C12), Tridecanoyl (C13), Myristoyl (C14), Pentadecanoyl (C15), und Palmitoyl (C16). Die bevorzugten Verbindungen der vorliegenden Erfindung uinfassen daher B²⁹-N^ε-AspB²⁹-Palmitoylhumaninsulin (B²⁸ steht für Asp, B²⁹ steht für acyliertes Lys), B²⁸-N^ε-Palinitoyl-Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin (B²⁸ steht für acyliertes Lys, B²⁹ steht für Pro), B28-N^ε-Octanoyl-Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, B28-N^ε-Octanoyl-Lys^B28Pro^B29-Huinaninsulin, B28-N^ε-Myristoyl-Lys^B28ProB²⁹-Humaninsulin und B28-N^ε-Undecanoyl-Lys^B29Pro^B29-Humaninsulin.
Die Acylierung von freien Aminogruppen in Proteinen, einschließlich Insulin, ist in der Technik bekannt. Allgemeine Acylierungsverfahren sind in Methods of Enzymology, 25, 494-499 (1972) beschrieben und umfassen die Verwendung von aktivierten Estern, Säurehalogeniden oder Säureanhydriden. Die Verwendung von aktivierten Estern, insbesondere N-Hydroxysuccinimidestern von Fettsäuren ist ein besonders vorteilhaftes Mittel zur Acylierung der freien Aininosäure init einer Fettsäure. Lapidot et al., J. of Lipid Res. 8, 142–145 (1967). Lapidot et al., beschreiben die Herstellung von N-Hydrolysuccinimidestern und ihre Verwendung bei der Herstellung von N-Lauroylglycin, N-Lauroyl-L-serin und N-Lauroyl-L-glutaminsäure.
Zur selektiven Acylierung der ε-Aminogruppe können verschiedene Schutzgruppen zur Blockierung der ε-Aminogruppen wälirend der Kupplung verwendet werden. Die Auswahl einer geeigneten Schutzgruppe ist dem Fachmann bekannt und umfaßt p-Methoxyaybenzoaycarbonyl (pmZ). Vorzugsweise wird die ε-Aminogruppe in einer Einschrittsynthese ohne der Verwendung von Aminoschutzgruppen acyliert. Die Acylierung wird durch die Umsetzung der aktivierten Fettsäureester mit der ε-Aminogruppe des Proteins unter basischen Bedingungen in einem polaren Löseinittel ausgeführt. Die Basizität der Reaktion muß ausreichend sein, um alle freien Aininogruppen des Insulinanalogons zu deprotonieren. Unter schwach basischen Bedingungen sind alle freien Aminogruppen nicht deprotoniert und dies füht zu einer präferentiellen Acylierung der N-terminalen oder α-Aminogruppen. In einem wäßrigen Lösemittel oder Co-Lösemittel meinen basische Bedingungen, daß die Umsetzung bei einem pH von mehr als 9,0 ausgeführt wird. Da ein Proteinabbau bei einein pH von mehr als 12,0 erfolgt, beträgt der pH des Reaktionsgemisches vorzugsweise 10,0 bis 11,5 und am bevorzugtesten 10,5. Die pH Messung der Reaktion im Reaktionsgemisch in einem gemischten organischen und wäßrigen Lösemittel entspricht dein pH des wäßrigen Lösemittels vor dem Mischen.
In einein nicht-wäßrigen Lösemitel wird die selektive Acylierung der ε-Aminogruppe in Gegenwart einer Base mit einer Basizität ausgeführt, die einem pKa von größer oder gleich 10,75 in Wasser entspricht, um die ε-Aminogruppe ausreichend zu deprotonieren. Das heißt, daß die Base mindestens so stark sein muß wie Triethylamin. Vorzugsweise ist die Base Tetramethylguanidin, Diisoproylethylamin oder Tetrabutylammoniumhydroxid. Die Verwendung einer schwächeren Base resultiert in der Acylierung der α-Aminogruppen.
Die Wahl des Lösemittels ist nicht entscheidend und hängt stark von der Löslichkeit des Insulinanalogons und des Fettsäureesters ab. Das Lösemittel kann vollkommen organisch sein. Im allgemeinen annehmbare organische Lösemittel umfassen DMSO, DMF und dergleichen. Wäßrige Lösemittel und Gemische von wäßrigen und organischen Lösemitteln sind ebenfalls durchführbar. Die Auswahl der polaren Lösemittel ist nur durch die Löslichkeit der Reagenzien beschränkt. Bevorzugte Lösemittel sind DMSO, DMF, Acetonitril und Wasser, Aceton und Wasser, Ethanol und Wasser, Isopropylalkohol und Wasser, Isopropylalkohol, Ethanol und Wasser und Ethanol, Propanol und Wasser. Vorzugsweise ist das Lösemittel Acetonitril und Wasser, am bevorzugtesten 50% Acetonitril. Der Fachmann erkennt, daß andere polare Lösemittel ebenfalls funktionieren.
Im allgemeinen ist es bevorzugt, daß der aktivierte Fettsäureester im molaren Überschuß vorkommt. Vorzugsweise wird die Reaktion init 1 bis 4 Moläquivalenten, am bevorzugtesten 1 bis 2 Moläquivalenten des Esters ausgeführt. Der Fachmann erkennt, daß bei sehr großen Mengen des aktivierten Esters bis- oder triacyliertes Produkt in einer signifikanten Menge gebildet wird.
Die Temperatur der Reaktion ist nicht entscheidend. Die Reaktion wird zwischen 20 bis 40°C ausgeführt und ist im allgemeinen in 15 Minuten bis 24 Stunden vollständig.
Nach der Acylierung wird das Produkt durch Standardverfahren gereinigt, wie Umkehrphase oder hydrophobe Chromatographie. Danach wird das Produkt durch Standardverfahren gewonnen, wie Gefriertrocknung oder durch Kristallisation.
Die monomeren Insulinanaloga der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielzahl an anerkannten Peptidsynthesetechniken hergestellt werden, einschließlich klassischer Verfahren (Lösung), Festphasenverfahren, semisynthetischen Verfahren und seit kurzem rekombinanten DNA Verfahren. Beispielswiese beschreiben Chance et al., US Patentanmeldung 07/388 201, EP 0 383 472 A und Brange et al EP 0 214 826 A die Herstellung von verschiedenen Insulinanaloga und sind hiermit eingeführt. Die A- und B-Ketten der erfindungsgemäßen Insulinanaloga können auch durch ein Proinsulin-ähnliches Vorläufermolekül mittels rekombinanter Techniken hergestellt werden. Siehe Frank et al., Peptides: Synthesis-Structure-Funktion, proc. Seventh Am. pept. Symp., Herausgeber D. Rich und E. Gross (1981).
Das folgende Beispiel wird nur bereitgestellt, um die Erfindung weiter zu erläutern. Der Umfang der Erfindung soll nicht so verstanden werden, daß er nur aus dem folgenden Beispiel besteht.
Beispiel 1
Acylierung von Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin mittels N-Succinimidylpalmitat in Acetonitril und Wasser
Lys^B2BPro^B29-Humaninsulinkristalle (2,22 g) werden in 100 ml an 50 mM Borsäurelösung bei pH 2,5 gelöst. Der pH der Lösung wird inittels 10% HCl auf 2,5 eingestellt und die Lösung wird gerührt bis die Kristalle sich durch visuelle Überprüfung aufgelöst haben. Eine Lösung des aktivierten Esters (N-Succinimidylpalmitat) wird durch Zugabe von 270 mg des festen aktivierten Esters zu 27 ml Acetonitril, das auf 50°C vorgewärmt war, und starkes Rühren bis durch visuelle Überprüfung alle aktivierten Esterpartikel in Lösung sind, hergestellt. Der pH der Lösung wird durch die Zugabe von 10% NaOH auf etwa 10,22 eingestellt und die Lösung kann bei 4°C für 15 Minuten rühren. Acetonitril (73 ml) wird zur Lösung mit eingestelltem pH gegeben, wonach die Zugabe der vorher hergestellten Esterlösung erfolgt. Die Reaktion kann bei 4°C für 85 Minuten weiterlaufen und wird durch die Zugabe von 1 N Essigsäure (600 ml) gestoppt, was zu einein pH von 2,85 führt. Die Reaktionsausbeute, die als die Menge an B28-N^ε-Palmitoyl-Lys^B2BPro^B29-Humaninsulin in der gestoppten Lösung dividiert durch die anfängliche Menge an Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin berechnet wird, beträgt 72,5 %.
Beispiel 2
C8(B28)Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin
Lys(B28), Pro B29-Humaninsulinkristalle (KPB) (2,0 g) werden in 200 ml an 50 mM Borsäurepuffer mit pH 2,5 gelöst. Der pH der Lösung wird mittels 10% HCl erneut auf 2,5 eingestellt und die Lösung wird gerührt, bis sich die Kristalle nach visueller Überprüfung vollständig aufgelöst haben. Eine Lösung des aktivierten Esters (1-Octanoyl-N-liydroλysucciniinidester) wird durch die Zugabe von 175 mg des festen aktivierten Esters zu 25,62 ml Acetonitril und starkem Rühren hergestellt, bis alle Partikel des aktivierten Esters gemäß visueller Untersuchung gelöst sind. Der pH der KPB Lösung wird durch die Zugabe von 10% NaOH auf etwa 10,4 eingestellt und die Lösung kann bei Raumtemperatur für etwa 5 Minuten rühren. Acetonitril (176 ml) wird zur KPB Lösung, bei der der pH eingestellt wurde, gegeben, wonach die Zugabe der vorher hergestellten aktivierten Esterlösung erfolgt. Die Reaktion kann für 90 Minuten bei Umgebungstemperatur weiterlaufen und wird dann durch die Zugabe von 5,5 ml an 10% HCl (2,75% V/V) und drei Volumina (1200 ml) kaltem dH₂O gestoppt, was zu einem schließlichen pH von 2,70 führt. Die Reaktionsausbeute, die als Menge an LysB29(C8)KPB in der gestoppten Lösung dividiert durch die anfängliche Menge an BHI berechnet wurde, beträgt 75,5%. Die Lösung wird in zwei 800 ml Aliquots zur Reinigung durch hydrophobe Chromatographie aufgeteilt (SP20SS). Nach der Säulenchromatographie erfolgt eine Ultrafiltration und Lyophilisierung.
Wie vorher erwähnt, sind die erfindungsgemäßen Insulinanaloga bei der Behandlung der Hyperglykämie durch die Verabreichung einer wirksamen Menge eines monoacylierten Insulinanalogons an einen behandlungsbedürftigen Patienten wirksam. Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "wirksame Menge" auf die Menge eines oder mehrerer acylierter Insulinanaloga der vorliegenden Erfindung, die zur Verringerung oder Konstanthaltung der Blutzuckerspiegel entweder therapeutisch oder prophylaktisch erforderlich ist. Diese Menge kann typischerweise von etwa 10 Einheiten oder mehr pro Tag reichnen (oder etwa 0,3 bis etwa 2 ing, wobei etwa 29 Einheiten pro mg angenommen werden). Jedoch ist es verständlich, daß die Menge der tatsächlich verabreichten Insulinanaloga von einein Arzt in Anbetracht der relevanten Umstände bestimmt wird, einschließlich des zu behandelnden Zustands (das heißt der Ursache der Hyperglykämie), dein im einzelnen zu verabreichenden Analogon, dem gewählten parenteralen Verabreichungsweg, dein Alter, dein Gewicht und der Reaktion des einzelnen Patierten und der Schwere der Symptome des Patienten. Daher sollen die obigen Dosierungsbereiche den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise beschränken.
Die erfindungsgemäßen acylierten Insulinanaloga werden einem Patienten, der dessen bedarf (das heißt ein Patient, der an Hyperglykämie leidet) durch pharmazeutische Zusammensetzungen verabreicht, die eine wirksame Menge zumindest eines monoacylierten Insulinanalogons in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen oder Trägern enthält. Für diese Zwecke können die pharmazeutischen Zusammensetzungen typischerweise so formuliert werden, daß sie etwa 100 Einheiten pro ml oder ähnliche Konzentrationen und somit eine wirksame Menge der acylierten Insulinanaloga enthalten. Diese Zusammensetzungen sind typischerweise aber nicht notwendigerweise von der Art her parenteral und können durch jede einer Vielzahl an Techniken mittels herkömmlicher Hilfsstoffe oder Träger für parenterale Produkte hergestellt werden, die in der Technik bekannt sind. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ansgabe, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1985), das hiermit eingeführt ist. Beispielsweise können Dosierungsformen zur parenteralen Verabreichung durch Suspendierung oder Lösen der gewünschten Menge zumindest eines monoacylierten Insulinanalogons in einein nicht toxishen flüssigen zur Injektion geeigneten Träger, wie einem wäßrigen Medizin, und Sterilisation der Suspension oder Lösung hergestellt werden. Alternativ dazu kann eine abgemessene Menge der Verbindung in eine Ampulle gegeben werden und die Ampulle und deren Inhalt können sterilisiert und versiegelt werden. Es kann eine begleitende Ampulle oder ein Träger zur Vermischung vor der Verabreichung bereitgestellt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für eine parenterale Verabreichung vorgesehen sind, verwenden Verdünnungsmittel, Hilfsstoffe und Träger, wie Wasser und wassermischbare organische Lösemittel, wie Glycerin, Sesamöl, Erdnußöl, wäßriges Propylenglycol, N,N-Dimethylformamid und dergleichen. Beispiele für solche phannazeutischen Zusammensetzungen beinhalten sterile, isotonische, wäßrige Kochsalzlösungen der monoacylierten Insulinanaloga, die mit einein pharmazeutisch annehmbaren Puffer gepuffert sein können und die pyrogenfrei sind. Zusätzlich kann die parenterale pharmazeutische Formulierung Konservierungsstoffe entlhalten, wie meta-Cresol oder andere Mittel zur Einstellung des pH des schließlichen Produkts, wie Natriumhydroxid oder Chlorwasserstoffsäure.
Die acylierten Insulinanaloga der vorliegenen Erfindung können auch als Gemische formuliert werden. Die Gemischformulierungen umfassen nicht-acyliertes Insulin oder nicht-acylierte Insulinanaloga und ein acyliertes Insulinanalogon. Das Verhältnis des Insulins oder des Insulinanalogons zum acylierten Analogon beträgt 1 : 99 bis 99 : 1 auf Gewichtsbasis. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis 75 : 25 bis 25 : 75, bevorzugter 40 : 60 bis 6 : 40 und vor allein 50 : 50. Die Gemischformulierungen werden durch Mischen der gewünschten Volumina der Komponenten in einem Strandardverdünnungsmittel für parenterale Formulierungen liergestellt. Standardverdünnungsmittel umfassen ein Isotonizitätsmittel, Zink, einen physiologisch tolerierten Puffer und einen Konservierungsstoff. Der physiologisch tolerierte Puffer ist vorzugsweise ein Phosphatpuffer, wie dibasisches Natriumphosphat. Andere physiologisch tolerierte Puffer umfassen TRIS oder Natriumacetat. Die Auswahl und die Konzentration des Puffers sind in der Technik bekannt. Pharmazeutisch annehmbare Konservierungsstoffe umfassen Phenol, m-Cresol, Resorcin und Methylparaben. Die Gemischformulierungen der vorliegenden Erfindung sind besonders vorteilhaft, da sowohl das relativ schnell wirkende Insulin oder Insulinanalogon und als auch das monoacylierte Insulinanalogon in der Formulierung löslich sind. So wird eine vorhersagbare Dauer des Wirkungsprofils bereitgestellt.
Das folgende Formulierungsbeispiel ist nur erläuternd und soll den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken.
Formulierung 1
Eine parenterale Formulierung kann folgendermaßen hergestellt werden:

Menge

Phenol 30mM

Glycerin 16mg/ml

Acyliertes Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin 100E

Zink 0,7%

Natriumacetat 3,8mg/ml
Die Lösung der obigen Inhaltsstoffe wird durch Injektion in einen Patienten verabreicht, der einer solchen Beliandlung bedarf.
Um die Wirksarnkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren wird B28-N^ε-Palmitoyl-Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin in einem Hundemodell bei Bewußtsein getestet. Die Experimente werden bei erwachsenen (1-2 Jahre alten) männlichen und weiblichen Beagles getestet, die 8–15 kg wiegen und über Nacht gefastet haben und bei Bewusstsein sind. Zumindest 10 Tage vor der Studie werden die Tiere mit Isofluran betäubt und es wird ein Schnitt in die linke oder rechte Inguinalregion gemacht. Es werden silastische Katheter in die Arteria femoralis und in die proximal kaudale Vena femoralis eingebracht und mit einem 4–0 Faden befestigt. Die freien Enden der Katheter werden subkutan mittels eines Trokars auf den Rücken geführt. Die Katheter werden dann mit einer Glycerin/Heparin-Lösung (3 : 1, V/V, Heparinendkonzentration von 250 KIU/ml) gefüllt und die freien Enden werden verknotet und in eine subkutane Tasche gegeben, um das vollständige Verschließen der Haut zu erlauben. Keflex wird sowohl präoperativ (20 mg/kg, i. v. und 20 mg/kg i. m.) als auch postoperativ (250 mg p. o. einmal am Tag für sieben Tage) verabreicht, um Infektionen zu vermeiden. Torbugesic (1,5 mg/kg i. m.) wird postoperativ verabreicht, um die Schmerzen zu kontrollieren.
Es wird Blut direkt vor dein Untersuchungstag entnommen, um die Gesundheit des Tieres zu bestimmen. Es werden nur Tiere init Hämatokriten über 38% und Leukozytenzahlen unter 16 000 pro mm³ verwendet. Am Nachmittag vor dem Experiment werden die freien Enden der Katheter aus der subkutanen Tasche durch einen kleinen Schnitt freigelegt, der unter einer lokalen Betäubung (2% Lidocain) ausgeführt wird und der Hund wird mit einer Leinensystemjacke und einer Halsbandausstattung versehen.
Am Morgen des Experiments wird der Inhalt des arteriellen Katheters abgesaugt (es wird für diese Studie nur die arterielle Linie verwendet), der Katheter wird mit Kochsalzlösung gespült und es wird eine Verlängerungsleitung (geschützt durch einen Edelstalhtether) an den Katheter angebracht. Der Hund wird in einem metabolischen Käfig gegeben und die Katheterverlängerungsleitung und die Leinen werden an ein Schwenksystem angebracht, um es dem Hund zu ermöglichen, sich frei im Käfig zu bewegen. Nach 15 Minuten Ruhezeit (45 Minuten für die Kontrolle) wird Blut (2–3,5 ml) zur Bestimmung der Plasmaglucosekonzentration entnommen. Eine zweite Grundzustandsprobe wird 15 Minuten später gezogen (Zeitpunkt 0). Die Testsubstanz (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder 10,5 mmol/kg B28-N^ε-Palmitoyl-LysB²⁸ProB²⁹-Humaninsulin, dies entspricht einem Moläquivalent von 1,75 E/kg Humaninsulin) wird subkutan dorsal am Genick verabreicht.
Es werden dann arterielle Blutproben (2–3,5 ml) zumindest alle 30 Minuten für die nächsten zwei (Kontrolle) bis sechs Stunden (B28-N^ε-Palmitoyl-LysB²⁸ProB²⁹-Humaninsulin) entnommen. Es werden Proben in Vakuumblutsammelröhrchen gesammelt, die Dinatrium-EDTA enthalten und sofort auf Eis gestellt. Die Proben werden zentrifugiert und das entstehende Plasma wird in Polypropylenteströhrchen überführ und auf Eis gelagert oder fiir die Dauer der Studie gekühlt.
Am Ende des Experiments wird das Tier betäubt (Isofluran), der Katheter wird mit frischer Kochsalzlösung gespült und mit dem Glycerin/Heparin-Gemisch gefüllt, wobei das freie Ende des Katheters verknotet und subkutan plaziert wird, wie dies vorher beschrieben wurde und das Antibiotikum wird verabreicht (300 mg Keflex, i. m.). Die Plasmaglucosekonzentrationen werden am Tag der Studie mittels eines Glucoseoxidaseverfahrens in einein Beckman Glucoseanalysegerät bestimmt. Die aufgeführten Werte sind der Mittelwert ± der Standardabweichung vom Mittelwert (SEM).
Die Plasniaglucosekonzentraion verändert sich nicht signifikant von der Grundlinie während der zweistündigen Beobachtungsperiode nach der Injektion der Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (Tabelle 1). Während derselben Zeitspanne führt die subkutane Verabreichung von B28-N^ε-Palmitoyl-Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin zu einer Abnahme von 15% (17 mg/dl) in der Plasmaglucosekonzentration. Die Plasinaglucosekonzentration bei dem mit B28-N^ε-Palmitoyl-Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin behandelten Tier fällt stufenweise während der nächsten vier Stunden auf einen Glucosespiegel von 41 mg/dl unter die Grundlinie (35% Abnahme) sechs Stunden nach der Injektion.
Es ist in der Literatur bekannt, daß Plasmaglucosekonzentrationen beim normalen Hund nicht signifikant fallen, sogar nach einer Woche Fasten. Die Abnahme der Glucose, die in dieser Studie beobachtet wird, beruht auf der Verabreichung von B28-N^ε-Palmitoyl-Lys^B2BPro^B29-Humaninsulin, was die Insulin-ähnliche Aktivität dieser Verbindung zeigt.
Tabelle 1 Plasmaglucosekonzentrationen nach einer subkutanen Injektion von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (Kontrolle) oder von ^B28-N^ε-Palmitoyl-LysB²⁸ProB²⁹-Humaninsulin
Sequenzliste

(I) Allgemeine Information:
(i) Anmelder: Eli Lilly and Company
(B) Straße: Lilly Corporate Center
(C) Stadt: Indianapolis
(D) Staat: Indiana
(E) Land: Vereinigte Staaten von Amerika
(F) Postleitzahl: 46285
(ii) Titel der Erfindung: Acylierte Insulinanaloga
(iii) Anzahl an Sequenzen: 2
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: C. M. Hudson
(B) Straße: Erl Wood Manor
(C) Stadt: Windlesham
(D) Staat: Surrey
(E) Land: Vereinigtes Königreich
(F) Postleitzahl: GU20 6PH
(v) Computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: Diskette
(B) Computer: Macintosh
(C) Betriebssystem: Macintosh 7.0
(D) Software: Microsoft Word
(2) Information für SEQ ID Nr:1
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 2l Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Polypeptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Variable Stelle
(B) Lage: 1
(C) Identifizierungsverfahren:
(D) Andere Information: "Xaa steht an der Position 1 der SEQ ID Nr. 1 (Insulin-A-Kette) für Gly oder acyliertes Gly, wenn Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 für Phe steht, Xaa an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 steht für Asp, Lys, Leu, Val oder Ala und Xaa and der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 steht für Lys oder Pro".
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr:l
(3) Information für SEQ ID Nr: 2
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 30 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Polypeptid
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Variable Stelle
(B) Lage: 1
(C) Identifizierungsverfahren:
(D) Andere Information: "Xaa steht an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 für Phe oder für acyliertes Phe, wenn Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 1 für Gly steht, Xaa steht an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 für Asp, Lys, Leu, Val oder Ala und Xaa steht an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 für Lys oder Pro."
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Variable Stelle
(B) Lage: 28
(C) Identifizierungsverfaliren:
(D) Andere Information: Xaa steht an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 für Asp, Lys, Leu, Val, Ala oder für acyliertes Lys, wenn Xaa an der Position 1 der SEQ ID Nr. 1 für Gly steht, Xaa steht an der Position 1 der SEQ II) Nr. 2 für Phe und Xaa steht an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 für Pro".
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Variable Stelle (B) Lage: 29
(C) Identifizierungsverfahren:
(D) Andere Information: Xaa steht an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 für Lys, Pro oder acyliertes Lys, wenn Xaa an der Position 28 der SEQ II) Nr. 2 für Asp, Lys, Leu, Val oder Ala steht, Xaa steht an der Position 1 der SEQ ID Nr. 1 für Gly und Xaa steht an der Position 1 der SEQ ID Nr. 2 für Phe".
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr:2

Claims

Monoacyliertes Insulinanalogoen der Formel der SEQ ID Nr. 1 korrekt quervernetzt mit der SEQ ID Nr. 2 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon, worin Xaa an der Position 28 der SEQ ID Nr. 2 acyliertes Lys ist und Xaa an der Position 29 der SEQ ID Nr. 2 Pro ist.
Acyliertes Insulinanalogon nach Anspruch 1, worin die acylierende Gruppe eine C₆-C₁₇ Fettsäure ist.
Acyliertes Insulinanalogon nach Anspruch 1, worin die acylierende Gruppe eine C₁ ₃-C₁₇ Fettsäure ist.
B28-N^ε-Palmitoyl-Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin.
B28-N^ε-Myristoyl-Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin.
Parenterale pharmazeutische Formulierung, die ein Insulinanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Konservierungsmitteln, Isotonizitätsimitteln oder Puffern enthält.
Parenterale pharmazeutische Formulierung, die ein Gemisch aus Insulin oder Insulinanalogon und ein acyliertes Insulianalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält, worin das Gewichtsverhältnis der zwei Komponenten etwa 1-99 : 99-1 beträgt.
Parenterale pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 7, worin das Gemisch Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und B28-N^ε-acyliertes Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin ist.
Verwendung des acylierten Insulinanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der an Hyperglykämie leidet.
Verfahren zur Herstellung einer parenteralen pharmazeutischen Formulierung, gekennzeichnet durch Mischen der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, eines Isotonizitätsmittels und eines physiologisch tolerierten Puffers.
Acyliertes Insulinanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes mellitus.