DE69528670T2 - Nachweis von nukleinsäuren durch nuklease-katalysierte produktbildung - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
  • Zur Untersuchung der Identität und zum Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäuren wurde die Nukleinsäurehybridisierung eingesetzt. Die Hybridisierung beruht auf komplementärer Basenpaarung. Werden komplementäre einzelsträngige Nukleinsäuren zusammen inkubiert, paaren sich die komplementären Basensequenzen zur Ausbildung von doppelsträngigen Hybridmolekülen. Die Fähigkeit einzelsträngiger Desoxyribonukleinsäure (ssDNA) oder Ribonukleinsäure (RNA), eine wasserstoffverbrückte Struktur mit einer komplementären Nukleinsäuresequenz zu bilden, wurde als analytisches Werkzeug in der molekularbiologischen Forschung eingesetzt. Die Verfügbarkeit radioaktiver Nukleosidtriphosphate mit hoher spezifischer Aktivität und die 32P-Markierung von DNA mit T4-Polynukleotidkinase ermöglichten die Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung verschiedener biologisch interessanter Nukleinsäuresequenzen. Die Nukleinsäurehybridisierung besitzt großes Potential bei der Diagnose von mit einmalig vorhandenen Nukleinsäuresequenzen assoziierten Krankheitszuständen. Diese einmalig vorhandenen Nukleinsäuresequenzen können das Ergebnis einer genetischen Veränderung oder einer Umgebungsveränderung in der DNA durch Insertionen, Deletionen, Punktmutationen oder durch Aufnahme von Fremd-DNA oder -RNA mittels Infektion mit Bakterien, Schimmelpilzen, Pilzen und Viren sein. Bis jetzt wurde die Nukleinsäurehybridisierung vorwiegend in akademischen und industriellen molekularbiologischen Labors eingesetzt. Aufgrund der häufig sehr niedrigen Konzentrationen von mit einer Krankheit zusammenhängender, in der Körperflüssigkeit eines Patienten vorkommender DNA oder RNA und der Nichtverfügbarkeit eines ausreichend empfindlichen Verfahrens zur Nukleinsäurehybridisierungsanalyse ist die Anwendung der Nukleinsäurehybridisierung als Diagnosewerkzeug in der klinischen Medizin eingeschränkt.
  • Bei den derzeitigen Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen wird die Zielnukleinsäure im allgemeinen auf einem festen Träger wie Nitrocellulosepapier, Cellulosepapier, diazotiertem Papier oder einer Nylonmembran immobilisiert. Nach dem Fixieren der Zielnukleinsäure auf dem Träger wird dieser mit einer in geeigneter Weise markierten Nukleinsäuresonde etwa zwei bis achtundvierzig Stunden in Kontakt gebracht. Nach Ablauf der obigen Zeitdauer wird der feste Träger mehrmals unter Temperaturkontrolle zur Entfernung von nicht hybridisiertem Sondenmaterial gewaschen. Der Träger wird danach getrocknet und das hybridisierte Material über Autoradiographie oder spektrometrische Verfahren bestimmt.
  • Die derzeitigen Verfahren sind, falls sehr niedrige Konzentrationen nachgewiesen werden müssen, langsam und arbeitsaufwendig, und nichtisotopische Markierungen, die sich gegenüber radioaktiven Markierungen weniger leicht nachweisen lassen, sind häufig nicht geeignet. Daher ist ein Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit wünschenswert, um die Verwendung einfacher, schneller, nichtisotopischer, homogener oder heterogener Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuresequenzen zu ermöglichen.
  • Kürzlich wurde ein als Polymerasekettenreaktion (PCR) bekanntes Verfahren zur enzymatischen Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte beschrieben. Dieser in-vitro-Amplifikationsprozeß verwendet zwei oder mehr unterschiedliche Oligonukleotidprimer für unterschiedliche Stränge der Zielnukleinsäure und beruht auf wiederholten Zyklen von Denaturierung, Oligonukleotidprimer-Rnnealing und Primerverlängerung mittels einer thermophilen Polymerase, was zu einem exponentiellen Anstieg von Kopien des von den Primern begrenzten Bereichs führt. Die an entgegengesetzte Stränge der DNA annealenden unterschiedlichen PCR-Primer werden so positioniert, daß das Produkt der von der Polymerase katalysierten Verlängerung des einen Primers als Vorlagenstrang für den zweiten Primer dienen kann, wodurch sich diskrete Fragmente anreichern, dessen Länge durch den Abstand zwischen den 5'-Enden der Oligonukleotidprimer definiert ist.
  • Weitere Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation sind die Einzelprimeramplifikation, Ligasekettenreaktion (LCR), die Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis (NASBA) und das Q-Beta-Replikaseverfahren. Unabhängig von der verwendeten Amplifikation muß jedoch das amplifizierte Produkt bestimmt werden.
  • Je nachdem, welches der obigen Amplifikationsverfahren eingesetzt wird, werden in den Verfahren im allgemeinen sieben bis zwölf oder mehr Reagenzien eingesetzt. Weiterhin sehen die obigen Verfahren die exponentielle Amplifikation eines Ziel- oder Reporteroligonukleotids vor. Dementsprechend ist es notwendig, die Verunreinigung der Testlösungen mit den amplifizierten Produkten mit allen Mitteln zu vermeiden, um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden. Für einige der obigen Verfahren benötigt man teure Thermocycler-Instrumentierung, und zusätzliche Reagenzien und Schritte für die Handhabung der Proben werden zur Bestimmung des amplifizierten Produkts benötigt.
  • Bei den meisten Testverfahren, die keine Amplifikation einer Ziel-DNA beinhalten, wird das Verunreinigungsproblem vermieden, aber diese Verfahren sind weder hinreichend empfindlich noch einfach. Bei einigen Verfahren kommt eine gewisse Art von Größentrennung, wie z. B. die Elektrophorese, zum Einsatz, was diese Verfahren weiter verkompliziert.
  • Bei einem Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren werden Nukleinsäuresonden eingesetzt. Ein Verfahren zur Benutzung solcher Sonden ist im U. S . -Patent Nr. 4, 868, 104 beschrieben, dessen Offenbarung hiermit unter Bezugnahme aufgenommen wird. Eine Nukleinsäuresonde kann oder kann potentiell mit einer Reportergruppe markiert oder kann oder kann potentiell an einen Träger gebunden werden.
  • Der Signalnachweis hängt von der Beschaffenheit der Markierung oder der Reportergruppe ab. Handelt es sich bei der Markierung oder der Reportergruppe um ein Enzym, so gehören Enzymsubstrate usw. ebenfalls zu dem signalproduzierenden System. Bei dem Produkt der Enzymreaktion handelt es sich vorzugsweise um ein lumineszierendes Produkt oder um einen Fluoreszenz- oder Nicht-Fluoreszenzfarbstoff, der jeweils spektrophotometrisch bestimmt werden kann, oder um ein Produkt, das mit anderen spektrometrischen oder elektrometrischen Mitteln bestimmt werden kann. Ist die Markierung ein Fluoreszenzmolekül, läßt sich das Medium bestrahlen und die Fluoreszenz bestimmen. Falls die Markierung eine radioaktive Gruppe ist, kann man die Radioaktivität im Medium durch Zählen bestimmen.
  • Es ist daher wünschenswert, über ein empfindliches, einfaches Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuren zu verfügen. Durch das Verfahren sollten die Anzahl und Komplexität der Schritte und Reagenzien auf ein Minimum reduziert werden. Die Notwendigkeit einer Sterilisation und anderer zur Verhinderung einer Verunreinigung der Testmischungen benötigter Schritte sollte vermieden werden.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen werden in Duck, et al., im U.S.-Patent Nr. 5, 011, 769 sowie in der entsprechenden internationalen Patentanmeldung WO 89/10415 erörtert. Ein Verfahren zur Spaltung eines Nukleinsäuremoleküls ist aus der europäischen Patentanmeldung 0 601 834 Al (Dahlberg, et al.) bekannt.
  • Von Holland, et al., Clinical Chemistrv (1992) 38: 462-463, wird der Nachweis eines spezifischen Polymerasekettenreaktionsprodukts durch Ausnutzung der 5'- nach -3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase aus Thermus aguaticus beschrieben. In Longley, et al., Nucleic Acids Research (1990) 18: 7317–7322 wird die Charakterisierung der mit der DNA-Polymerase aus Thermus aguaticus assoziierten 5`- nach -3'-Exonuklease erörtert. Aus Lyamichev, et al., Science (1993) 260: 778–783, ist die strukturspezifische endonukleolytische Spaltung von Nukleinsäuren durch eubakterielle DNA-Polymerasen bekannt.
  • Ein Verfahren zum Amplifizieren, Bestimmen und/oder Klonieren von Nukleinsäuresequenzen ist aus den U.S.-Patenten Nr. 4, 683, 195, 4, 683, 202, 4, 800, 159, 4, 965, 188 und 5,008,182 bekannt. Die Sequenzpolymerisation mittels Polymerasekettenreaktion wird von Saiki, et al., (1986), Science, 230: 1350-1354 beschrieben. Die primergerichtete enzymatische DNA-Amplifikation mit einer thermostabilen DNA-Polymerase wird von Saiki, et al., Science (1988) 239: 487 beschrieben.
  • In den U.S.-Patentanmeldungen mit den Serien-Nrn. 07/299,282 und 07/399,795, eingereicht am 19. Januar 1989 bzw. 29. August 1989 (die der EP-Patentschrift Nr. 379,369 entsprechen), wird die Nukleinsäureamplifikation mit einem einzigen Polynukleotidprimer beschrieben.
  • Weitere, eine Nukleinsäureamplifikation herbeiführende Verfahren sind in Van Brunt Bio/Technoloav (1990) 8(Nr.4): 291–294 beschrieben. Zu diesen Verfahren zählen die Ligasekettenreaktion (Ligase Chain Reaction, LCR), die Amplifikation auf Nukleinsäurebasis (Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA) sowie die Amplifikation von RNA mittels Q-beta-Replikase. Die LCR wird ebenfalls in den europäischen Patentanmeldungen Nr. 439,182 (Backman I) und 473,155 (Backman II) erörtert.
  • Bei der NASBA handelt es sich um ein Promotorgesteuertes, isothermes enzymatisches Verfahren, bei dem in vitro eine kontinuierliche, homogene und isotherme Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäure durchgeführt wird.
  • Das Q-beta-Replikaseverfahren beruht auf der Fähigkeit der Q-beta-Replikase, sein RNA-Substrat unter isothermen Bedingungen exponentiell zu amplifizieren.
  • Ein weiteres Verfahren zum Durchführen einer Amplifikation von Nukleinsäuren wird als Strangverdrängungsamplifikation (Strand Displacement Amplification, SDA) bezeichnet. Bei der SDA handelt es sich um eine isotherme, in-vitro DNA-Amplifikationstechnik, die auf der Fähigkeit eines Restriktionsenzyms, den unmodifizierten Strang einer Hemiphosphorothioatform seiner Restriktionsstelle zu „nicken", sowie der Fähigkeit einer DNR-Polymerase, die Replikation an diesem „Nick" zu initiieren und den stromabwärts gelegenen Nichtvorlagenstrang in intakter Form zu verdrängen, beruht. Die exponentielle Amplifikation wird von den die Erkennungsstellen für das „Nicking"-Restriktionsenzym enthaltenden Primern gesteuert.
  • Ein weiteres Amplifikationsverfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren ist unter dem Namen 3SR bekannt, wobei es sich um ein RNA-spezifisches Zielverfahren handelt, durch das RNA in einem isothermen Prozeß, in dem Promotor-gesteuerte RNA-Polymerase, reverse Transkriptase und RNase H mit der Ziel-RNA kombiniert werden, amplifiziert wird.
  • In WO 92/02638 wird ein Nachweisverfahren, bei dem eine 5`-Nuklease, ein Primer und ein Oligonukleotid verwendet werden, gelehrt. Eine Reaktion unter isothermen Bedingungen bei oder in der Nähe der Schmelztemperatur des Sonde/Ziel-Komplexes, wobei die Sonde und das Ziel reversibel hybridisieren oder wobei sich ein Gleichgewicht zwischen dem Ziel, der Sonde und dem Sonde/Ziel-Komplex einstellt, wird dort allerdings nicht erwähnt.
  • In EP-A 0 601 834 wird die Inkubation einer Spaltstruktur (an ein Polynukleotid hybridisiertes Zielmolekül) und eines Spaltmittels unter Bedingungen, bei denen eine Spaltung stattfinden kann, gelehrt. In EP-A 0 601 834 ist das Zielmolekül und nicht das Oligonukleotid das zu spaltende Molekül. Weiterhin werden in EP-A 601 834 keine Reaktionsbedingungen bei oder in der Nähe der Schmelztemperatur des Ziel/Oligonukleotid-Komplexes, wobei die Sonde und das Ziel reversibel hybridisieren oder wobei sich ein Gleichgewicht zwischen der Sonde, dem Ziel und dem Sonde/Ziel-Komplex einstellt, erwähnt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bei einem Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Veränderung eines Oligonukleotids. Das Verfahren umfaßt das Inkubieren des Oligonukleotids mit einem Polynukleotid sowie einer 5'-Nuklease, wobei wenigstens ein Anteil des Oligonukleotids unter isothermen Bedingungen bei oder in der Nähe der Schmelztemperatur des Hybridisierungskomplexes reversibel an das Polynukleotid hybridisiert wird. Das Oligonukleotid wird dabei gespalten, um (i) ein erstes Fragment, das mit dem Polynukleotid weiterhin nicht hybridisierbar ist und höchstens fünf Nukleotide vom 5'-Ende des Anteils beinhaltet, und (ii) ein zweites Fragment, das bezüglich des intakten Oligonukleotids 3' vom ersten Fragment liegt und mit dem Polynukleotid weitgehend hybridisierbar ist, bereitzustellen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis eines Polynukleotidanalyten, wie in Anspruch 7 definiert. Dabei wird ein Oligonukleotid unter isothermen Bedingungen reversibel mit einem Polynukleotidanalyten und einer 5'-Nuklease hybridisiert. Der Polynukleotidanalyt dient als ein Erkennungselement, um einer 5'-Nuklease die Spaltung des Oligonukleotids zu ermöglichen, so daß (i) ein erstes Fragment, das mit dem Polynukleotidanalyten weitgehend nicht hybridisierbar ist, und (ii) ein zweites Fragment, das 3' vom ersten Fragment (im intakten Oligonukleotid) liegt und das mit dem Polynukleotidanalyten weitgehend hybridisierbar ist, bereitgestellt werden. Man erhält mindestens einen 100-fachen molaren Überschuß des ersten Fragments und/oder des zweiten Fragments relativ zur Molmenge des Polynukleotidanalyten. Die Anweisenheit des ersten Fragments und/oder des zweiten Fragments wird bestimmt und zeigt die Anwesenheit des Polynukleotidanalyten an.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Polynukleotidanalyten um DNA.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Bei den 1-3 handelt es sich um schematische Darstellungen unterschiedlicher Ausführungsformen im Sinne der vorliegenden Erfindung.
  • Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung gestattet die katalysierte Spaltung eines Oligonukleotids, das durch einen Anteil eines Polynukleotidanalyten, wie z. B. eines eine Zielpolynukleotidsequenz, an die ein Teil des Oligonukleotids hybridisiert, umfassenden Polynukleotids, moduliert wird. Somit sorgen die Verfahren der vorliegenden Erfindung für sehr hoch empfindliche Tests für Polynukleotidanalyten. Die Verfahren sind einfach durchzuführen, und ein Temperaturcycling ist nicht erforderlich. Folglich wird keine teure thermocyclische Instrumentation benötigt. Weiterhin werden nur wenige Reagenzien verwendet, so daß sich der Kosten- und Arbeitsaufwand für einen Test weiter verringert. Außerdem erlaubt das Fehlen amplifizierter Produkte, die potentielle Amplifikationsziele darstellen, den Einsatz von weniger starken Mitteln zur Vermeidung der Verunreinigung von Testlösungen mit Zielsequenzen, die zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnte.
  • Bevor mit einer Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, sollen eine Reihe von Ausdrücken definiert werden.
  • Polynukleotidanalyt -- eine zu messende Verbindung oder Zusammensetzung, bei der es sich um ein polymeres Nukleotid handelt, das in seinem intakten natürlichen Zustand etwa 20 bis 500.000 oder mehr Nukleotide und in einem isolierten Zustand etwa 30 bis 50.000 oder mehr Nukleotide, gewöhnlich etwa 100 bis 20.000 Nukleotide, häufiger 500 bis 10.000 Nukleotide, aufweisen kann. Die Isolierung von Analyten aus dem natürlichen Zustand, insbesondere von denen mit einer großen Anzahl an Nukleotiden, führt häufig zu einer Fragmentierung. Zu den Polynukleotidanalyten gehören Nukleinsäuren aus jeder beliebigen Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, einschließlich DNA (dsDNA und ssDNA) und RNA, einschließlich t-RNA, m-RNA, r-RNA, mitochondriale DNA und RNA, Chloroplasten-DNA und -RNA, DNA-RNR-Hybride oder deren Mischungen, Gene, Chromosomen, Plasmide, die Genome von biologischem Material wie z. B. Mikroorganismen, z. B. Bakterien, Hefen, Viren, Viroide, Schimmelpilze, Pilze, Pflanzen, Tiere, Mensch, und deren Fragmente, und ähnliches. Bevorzugte Polynukleotidanalyte sind doppelsträngige DNA (dsDNA) und einzelsträngige DNA (ssDNA). Der Polynukleotidanalyt kann lediglich einen kleineren Anteil einer komplexen Mischung wie z. B. einer biologischen Probe darstellen. Der Analyt kann aus verschiedenem biologischem Material mittels im Fachgebiet gut bekannter Verfahren erhalten werden. Einige Beispiele für ein solches biologisches Material sind zur Erläuterung, aber nicht einschränkend, in der folgenden Tabelle I offenbart.
  • Tabelle I
  • Zu den infragekommenden Mikroorganismen gehören:
    Figure 00100001
    Figure 00110001
    Figure 00120001
    Figure 00130001
    Gegebenenfalls kann der Polynukleotidanalyt zur Spaltung des Analyten behandelt werden, um ein eine Zielpolynukleotidsequenz enthaltendes Polynukleotid zu erhalten, zum Beispiel durch Scherung oder durch Behandlung mit einer Restriktionsendonuklease oder einem anderen stellenspezifischen chemischen Spaltungsverfahren. Es ist jedoch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß der Polynukleotidanalyt in seinem isolierten Zustand ohne weitere Spaltung verwendet werden kann.
  • Im Sinne dieser Erfindung wird der Polynukleotidanalyt oder ein aus dem Polynukleotidanalyten erhaltenes Spaltpolynukleotid normalerweise mindestens teilweise denaturiert oder liegt in einzelsträngiger Form vor oder wird so behandelt, daß er bzw. es in denaturierter oder einzelsträngiger Form vorliegt. Solche Behandlungen sind im Fachgebiet gut bekannt und schließen beispielsweise Wärme- oder Alkalibehandlung ein. So läßt sich beispielsweise doppelsträngige DNA auf 90 bis 100°C über eine Zeitdauer von etwa 1 bis 10 Minuten zur Herstellung von denaturiertem Material erhitzen.
  • 3'- bzw. 5'-Ende eines Oligonukleotids -- in der hier verwendeten Form bezieht sich diese Formulierung auf einen Anteil eines Oligonukleotids, der den 3'- bzw. 5'-Terminus des Oligonukleotids umfaßt.
  • 3'- bzw. 5' -Terminus eines Oligonukleotids -- in der hier verwendeten Form bezieht sich dieser Ausdruck auf das terminale Nukleotid am 3'- bzw. 5'-Ende eines Oligonukleotids.
  • Zielpolynukleotidsequenz -- eine Sequenz zu identifizierender Nukleotide, bei der es sich um den Polynukleotidanalyten handeln kann, die jedoch normalerweise innerhalb eines den Polynukleotidanalyten umfassenden Polynukleotids vorkommt. Die Identität der Zielpolynukleotidsequenz ist in einem ausreichenden Maß bekannt, so daß die Herstellung eines Oligonukleotids mit einem Anteil oder einer Sequenz, der bzw. die mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert, ermöglicht wird. Im allgemeinen hybridisiert bei der Verwendung eines Oligonukleotids dieses mit dem 5'-Ende der Zielpolynukleotidsequenz. Wird ein zweites Oligonukleotid eingesetzt, so hybridisiert dieses an einer Stelle der Zielpolynukleotidsequenz, die sich 3' von der Stelle, an der das erste Oligonukleotid hybridisiert, befindet. (Es sollte hier angemerkt werden, daß sich die Beziehung in bezug auf das bei der Hybridisierung des ersten und des zweitenOligonukleotids an das Polynukleotid gebildete Doppelstrangmolekül betrachten läßt. In einem solchen Zusammenhang liegt das zweite Oligonukleotid 5' -wärts vom erstenOligonukleotid in bezug auf den „Strang", der das erste und das zweite Oligonukleotid umfaßt.) Die oben beschriebenen Beziehungen sind unter Bezugnahme auf 3 klarer zu erkennen. Die Zielpolynukleotidsequenz enthält gewöhnlich etwa 10 bis 1.000 Nukleotide, vorzugsweise 15 bis 100 Nukleotide und weiter bevorzugt 20 bis 70 Nukleotide. Die Zielpolynukleotidsequenz ist Teil eines Polynukleotids, bei dem es sich um den gesamten Polynukleotidanalyten handeln kann. In der Zielpolynukleotidsequenz wird die geringst mögliche Anzahl an Nukleotiden ausgewählt, um sicherzustellen, daß die Anwesenheit der Zielpolynukleotidsequenz in einer Probe ein spezifischer Indikator für die Anwesenheit des Polynukleotidanalyten in einer Probe ist. Sehr grob gesagt, ist die Sequenzlänge normalerweise größer als etwa 1,6 log L Nukleotide, wobei L die Anzahl an Basenpaaren im Genom der biologischen Quelle der Probe ist. Die Anzahl an Nukleotiden in der Zielsequenz ist normalerweise die Gesamtlänge von denjenigen Anteilen der Oligonukleotide, die mit der Zielsequenz hybridisieren, plus die Anzahl an Nukleotiden, die zwischen den Anteilen der Zielsequenz, die mit den Oligonukleotiden hybridisieren, liegen.
  • Oligonukleotid -- ein Polynukleotid, üblicherweise ein synthetisches Polynukleotid, üblicherweise einzelsträngig, das so konstruiert wird, daß wenigstens ein Anteil davon mit der Zielpolynukleotidsequenz des Polynukleotids hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide besitzen normalerweise eine Länge von 10 bis 150 Nukleotiden und sind vorzugsweise Desoxyoligonukleotide mit einer Länge von 15 bis 100 Nukleotiden, und weiter bevorzugt 20 bis 60 Nukleotiden.
  • Das erste Oligonukleotid bzw. „das"Oligonukleotid, falls kein zweites Oligonukleotid eingesetzt wird, weist ein 5'-Ende mit einer Länge von etwa 0 bis 100 Nukleotiden, vorzugsweise 1 bis 20 Nukleotiden, welches nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert, sowie normalerweise eine Sequenz aus 10 bis 40 Nukleotiden auf, die mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert. Im allgemeinen verringert sich mit zunehmender Länge des Anteils des Oligonukleotids, der nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert, der Amplifikationsgrad etwas. Das erste Oligonukleotid kann auch eine Sequenz an seinem 3'-Ende aufweisen, die nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert. Das zweite Oligonukleotid hybridisiert vorzugsweise an seinem 3'-Ende mit der Zielpolynukleotidsequenz, und zwar an einer Stelle auf der Zielpolynukleotidsequenz, die 3'- von der Bindungsstelle des ersten Oligonukleotids liegt. Die Länge des Anteils des zweiten Oligonukleotids, der mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert, ist normalerweise größer als die Länge des Anteils des ersten Oligonukleotids, der mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert, und beträgt normalerweise 20 bis 100 Nukleotide. Die Schmelztemperatur des an die Zielpolynukleotidsequenz hybridiserten zweiten Oligonukleotids ist vorzugsweise wenigstens so hoch wie und besonders bevorzugt wenigstens 5°C höher als die Schmelztemperatur des an die Zielpolynukleotidsequenz hybridisierten ersten Oligonukleotids.
  • Bei den Oligonukleotiden kann es sich um Oligonukleotid-Mimics, wie z. B. Polynucleopeptide, Phosphorothioate oder Phosphonate, handeln, außer daß das erste Oligonukleotid normalerweise wenigstens eine Phosphodiesterbindung zu dem Nukleosid am 5'-Ende der Sequenz, die mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert, aufweist. Werden Oligonukleotid-Mimics, die für eine sehr starke Bindung sorgen, verwendet, wie z. B. Polynucleopeptide, so läßt sich die Länge des Anteils des zweiten Oligonukleotids, der mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert, auf weniger als 20 und, vorzugsweise, mehr als 10 Nukleotide verkleinern.
  • Zur Herstellung eines Oligonukleotids oder anderer in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polynukleotide lassen sich verschiedene Techniken einsetzen. Diese können mittels biologischer Synthese oder chemischer Synthese erhalten werden. Für kurze Oligonukleotide (bis zu etwa 100 Nukleotiden) ist die chemische Synthese häufig wirtschaftlicher als eine biologische Synthese. Neben Wirtschaftlichkeit stellt die chemische Synthese einen bequemen Weg zur Verfügung, niedrigmolekulare Verbindungen und/oder modifizierte Basen während des Syntheseschrittes einzubauen. Weiterhin zeigt sich die chemische Synthese sehr flexibel bei der Wahl der Länge und des Bereichs der Zielpolynukleotidsequenz. Die Oligonukleotide lassen sich mit Standardverfahren wie etwa denjenigen, die in kommerziellen automatischen Nukleinsäuresyntheseapparaturen verwendet werden, synthetisieren. Die chemische Synthese von DNA an geeignet modifiziertem Glas oder Harz führt zu kovalent an diese Oberfläche gebundener DNA. Dadurch können sich Vorteile beim Waschen und Handhaben der Probe ergeben. Für längere Sequenzen lassen sich in der Molekularbiologie eingesetzte Standardreplikationsverfahren verwenden, wie z. B. die Verwendung von M13 bei einzelsträngiger DNA, wie beschrieben von J. Messing (1983) Methods Enzymol, 101, 20–78.
  • Neben Standardklonierungstechniken können in vitro enzymatische Verfahren wie z. B. Polymerase-katalysierte Reaktionen verwendet werden. Für die Herstellung von RNA lassen sich T7-RNA-Polymerase und eine geeignete DNA-Vorlage verwenden. Für DNA sind die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Einzelprimeramplifikation geeignet.
  • Weitere chemische Verfahren zur Polynukleotid- oder Oligonukleotidsynthese schließen die Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren (Narang, et al., Meth. Enzvmol (1979) 68: 90) und Synthese auf einem Träger (Beaucage, et al., Tetrahedron (1981) Letters 22: 1859–1862) ebenso wie Phosphoramidattechniken, Caruthers, M. H., et al., „Methods in Enzymology", Band 154, Seiten 287–314 (1988) und weitere in „Synthesis and Applications of DNA and RNA", S. A. Narang, Herausgeber, Academic Press, New York, 1987 und den darin zitierten Literaturstellen beschriebenen Verfahren ein.
  • Fragment – im allgemeinen wird im vorliegenden Verfahren dasOligonukleotid (bzw. das erste Oligonukleotid, falls ein zweites Oligonukleotid eingesetzt wird) nur dann gespalten, wenn wenigstens ein Anteil davon reversibel mit einer Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert wird und somit die Zielpolynukleotidsequenz als ein Erkennungselement für die Spaltung des Oligonukleotids dient, wodurch sich zwei Anteile ergeben. Ein Fragment ist weitgehend nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisierbar. Das andere Fragment is weitgehend mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisierbar und liegt 3'- von dem anderen Fragment in bezug auf das Oligonukleotid in seiner ungespaltenen Form.
  • 5'-Nuklease – ein sequenz-unabhängiges Desoxyribonuklease-Enzym, das die Spaltung eines Oligonukleotids in Fragmente nur dann katalysiert, wenn wenigstens ein Anteil des Oligonukleotids an die Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert ist. Das Enzym spaltet das Oligonukleotid selektiv in der Nähe des 5'-Terminus des gebundenen Anteils, und zwar höchsten 5 Nukleotide davon entfernt, vorzugsweise 1 bis 2 Nukleotide davon entfernt, und spaltet dabei weder das nicht hybridisierte Oligonukleotid noch die Zielpolynukleotidsequenz. Zu diesen Enzymen zählen sowohl 5'-Exonukleasen als auch 5'-Endonukleasen, jedoch nicht Ribonukleasen wie z. B. RNAse H und ebenso nicht Restriktionsenzyme. Für die vorliegende Erfindung geeignete 5'-Nukleasen müssen unter den im vorliegenden Verfahren verwendeten isothermen Bedingungen stabil sein und daher handelt es sich bei ihnen normalerweise um temperaturstabile Nukleotidpolymerasen mit 5'-Exonukleaseaktivität, wie z. B. Taq-DNA-Polymerase (z. B. AmpliTaq(TM) von Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, N.J.), Thermalase Tbr(TM) DNA-Polymerase (von Amresco, Solon, Ohio), Ultra Therm(TM) DNA-Polymerase (von Bio/Can Scientific, Ontario, Canada), Replitherm(TM) DNA-Polymerase (von Epicentre, Madison, Wisconsin), Tfl(TM) DNA-Polymerase (von Epicentre), Panozyme(TM) DNA-Polymerase (von Panorama Research, Mountain View, California), Tth(TM) DNR-Polymerase (von Epicentre), rBst(TM) DNA-Polymerase (von Epicentre), Heat Tuff(TM) DNA-Polymerase (von Clontech, Palo Alto, California) u. ä., die aus einer beliebigen Quelle wie z. B. Zellen, Bakterien wie z. B. E. coli, Pflanzen, Tieren, Viren, thermophilen Bakterien usw. stammen können, wobei die Polymerase zur Herbeiführung von Temperaturstabilität und/oder erhöhter Aktivität chemisch oder gentechnisch modifiziert werden kann.
  • Isotherme Bedingungen – eine gleichmäßig verteilte oder konstante Temperatur, bei der die Modifikation des Oligonukleotids im Sinne der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird. Die Temperatur wird so gewählt, daß das durch Hybridisierung des Oligonukleotids an ein Polynukleotid mit einer Zielpolynukleotidsequenz gebildete Duplex im Gleichgewicht mit dem freien oder unhybridisiertenOligonukleotid und der freien oder unhybridisierten Zielpolynukleotidsequenz steht, eine Bedingung, die hier anderswo als „reversibles Hybridisieren" des Oligonukleotids mit einem Polynukleotid bezeichnet wird. Normalerweise wird mindestens 1%, vorzugsweise 20 bis 80%, üblicherweise weniger als 95% des Polynukleotids unter den isothermen Bedingungen an das Oligonukleotid hybridisiert.
  • Entsprechend gibt es unter isothermen Bedingungen Polynukleotidmoleküle, die mit dem Oligonukleotid oder Teilen davon hybridisiert sind und in dynamischem Gleichgewicht mit Molekülen, die nicht mit dem Oligonukleotid hybridisiert sind, stehen. Die Temperatur kann etwas schwanken und dennoch die Vorzüge der vorliegenden Erfindung erzielen. Diese Schwankung ist im allgemeinen zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung unnötig und bietet üblicherweise keine wesentliche Verbesserung.
  • Entsprechend schließt der Ausdruck „isotherme Bedingungen" die Verwendung von Temperaturschwankungen, besonders von beliebigen oder unkontrollierten Temperaturschwankungen ein, doch ist die als Thermocycling bezeichnete Temperaturschwankung, die in einigen bekannten Amplifikationsverfahren, z. B. der Polymerasekettenreaktion, eingesetzt wird, spezifisch ausgeschlossen.
  • Polynukleotidprimer bzw. Oligonukleotidprimer – ein Oligonukleotid, das normalerweise in einer Kettenverlängerung an einer Polynukleotidmatrize eingesetzt wird.
  • Nukleosidtriphosphate – Nukleoside mit einem 5'-Triphosphatsubstituenten. Bei den Nukleosiden handelt es sich um Pentosezuckerderivate stickstoffhaltiger Basen, die sich entweder von Purin oder Pyrimidin ableiten und kovalent an den 1'-Kohlenstoff des Pentosezuckers, der üblicherweise eine Desoxyribose oder eine Ribose ist, gebunden sind. Zu den Purinbasen gehören Adenin (A), Guanin (G), Inosin sowie deren Derivate und Analoge. Zu den Pyrimidinbasen zählen Cytosin (C), Thymin (T), Uracil (U) sowie deren Derivate und Analoge. Zu den Nukleosidtriphosphaten gehören Desoxyribonukleosidtriphosphate wie z. B. dATP, dCTP, dGTP und dTTP und Ribonukleosidtriphosphate wie z. B. rATP, rCTP, rGTP und rUTP. Der Ausdruck „Nukleosidtriphosphate" schließt ebenfalls Derivate und Analoge davon ein.
  • Nukleotid – eine Basen-Zucker-Phosphatkombination, die die Monomereinheit von Nukleinsäurepolymeren, d. h. DNA und RNA, darstellt.
  • Nukleotid – ist eine Basen-Zuckerkombination oder ein Nukleotid ohne einen Phosphatanteil.
  • Nukleotidpolymerase – ein Katalysator, üblicherweise ein Enzym, zur Bildung einer Verlängerung eines Oligonukleotids entlang einer Polynukleotid-Vorlage, wobei die Verlängerung dazu komplementär ist. Die Nukleotidpolymerase ist einevorlageabhängige Polynukleotidpolymerase und verwendet Nukleosidtriphosphate als Bausteine für die Verlängerung des 3'-Endes eines Oligonukleotids, um eine Sequenz zur Verfügung zu stellen, die zu dem einzelsträngigen Teil des Polynukleotids, an den das Oligonukleotid unter Ausbildung eines Duplex hybridisiert, komplementär ist.
  • Hybridisierung (hybridisieren) und Bindung – im Zusammenhang mit Nukleotidsequenzen werden diese Ausdrücke hier miteinander austauschbar verwendet. Die Fähigkeit zweier Nukleotidsequenzen, miteinander zu hybridisieren, beruht auf dem Komplementaritätsgrad der zwei Nukleotidsequenzen, der wiederum auf dem Anteil an passenden komplementären Nukleotidpaaren beruht. Je mehr zu einer anderen Sequenz komplementäre Nukleotide in einer gegebenen Sequenz vorliegen, desto stringenter dürfen die Bedingungen für die Hybridisierung sein und desto spezifischer ist die Bindung der zwei Sequenzen. Eine erhöhte Stringenz läßt sich durch Erhöhung der Temperatur, Erhöhung des Cosolventienverhältnisses, Erniedrigung der Salzkonzentration und ähnliches erzielen.
  • Homolog oder im wesentlichen identisch – Im allgemeinen sind zwei Polynukleotidsequenzen, die entweder identisch sind oder jeweils an die gleiche Polynukleotidsequenz hybridisieren können, homolog. Die beiden Sequenzen sind homolog oder im wesentlichen identisch, wenn die Sequenzen jeweils mindestens 90%, vorzugsweise 100%, derselben oder analogen Basensequenz besitzen, wobei Thymin (T) und Uracil (U) als gleich angesehen werden. Somit nimmt man die Ribonukleotide A, U, C und G als Analoge für die Desoxynukleotide dA, dT, dC bzw. dG. Von zwei homologen Sequenzen können beide aus DNA oder eine aus DNA und die andere aus RNA bestehen.
  • Komplementär – Zwei Sequenzen sind komplementär, wenn die eine Sequenz an die andere Sequenz in einer antiparallelen Weise binden kann, wobei das 3'-Ende jeder Sequenz an das 5'-Ende der jeweils anderen Sequenz bindet und jedes A, T(U), G und C der einen Sequenz auf jeweils ein T (U), A, C bzw. G der anderen Sequenz ausgerichtet wird.
  • Kopie – bedeutet eine Sequenz, die eine direkte identische oder homologe Kopie einer einzelsträngigen Polynukleotidsequenz ist, im Unterschied zu einer Sequenz, die komplementär zu der Sequenz eines solchen einzelsträngigen Polynukleotids ist.
  • Mitglied eines spezifischen Bindungspaars („sbp-Mitglied") – eines von zwei unterschiedlichen Molekülen, mit einer auf der Oberfläche oder in einer Höhlung befindlichen Fläche, die spezifisch an eine besondere räumliche und polare Struktur des anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaars werden auch als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Bei diesen kann es sich um Mitglieder eines immunologischen Paares wie z. B. Antigen-Antikörper oder um Operator-Repressor-, Nuklease-Nukleotid-, Biotin-Avidin-, Hormon-Hormonre.zeptor-Paare, Nukleinsäureduplexe, IgG-Protein A-, DNA-DNA-, DNA-RNA- und ähnliche Paare handeln.
  • Ligand – eine beliebige Verbindung, für die es natürlicherweise einen Rezeptor gibt oder für die ein solcher Rezeptor hergestellt werden kann.
  • Rezeptor („Antiligand") – eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die zur Erkennung einer besonderen räumlichen und polaren Struktur eines Moleküls, z. B. eines Epitops oder einer Determinante, fähig ist. Zu beispielhaften Rezeptoren zählen natürlich vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nukleinsäuren, Repressoren, Schutzenzyme, Protein A, Komplementkomponente C1q, DNA-bindende Proteine oder Liganden und ähnliche.
  • Kleines organisches Molekül – eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500, vorzugsweise 100 bis 1000, weiter bevorzugt 300 bis 600, wie z. B. Biotin, Fluorescein, Rhodamin und andere Farbstoffe, Tetracyclin und andere proteinbindende Moleküle, und Haptene, usw. Bei dem kleinen organischen Molekül kann es sich um ein Mittel zur Anbindung einer Nukleotidsequenz an eine Markierung oder an einen Träger handeln oder es kann selbst eine Markierung darstellen.
  • Träger oder Oberfläche – ein poröses oder nichtporöses wasserunlösliches Material. Der Träger kann hydrophil sein oder hydrophil gemacht werden und umfaßt anorganische Pulver wie z. B. Silica, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche Polymermaterialien, besonders Cellulosematerialien und aus Cellulose abgeleitete Materialien wie z. B. faserhaltige Papiere, z. B. Filterpapier, Chromatographiepapier, usw.; synthetische oder modifizierte, natürlich vorkommende Polymere wie z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, quervernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat), usw.; entweder allein oder in Verbindung mit anderen Materialien verwendet; als Bioglass erhältliches Glas, Keramik, Metalle und ähnliches. Natürliche oder synthetische Zusammensetzungen wie z. B. Liposomen, Phospholipidvesikel und Zellen lassen sich ebenfalls einsetzen.
  • Die Bindung von sbp-Mitgliedern an einen Träger oder an eineOberfläche kann mittels bekannter Techniken, die üblicherweise aus der Literatur erhalten werden, bewerkstelligt werden. Siehe beispielsweise „Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245: 3059 (1970). Die Oberfläche kann in einer Anzahl von Formen, wie z. B. Streifen, Stäbchen, Partikel, einschließlich Kügelchen, und ähnliches, vorliegen.
  • Markierung oder Reportergruppe oder Reportermolekül – ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems. üblicherweise ist die Markierung oder die Reportergruppe oder das Reportermolekül an ein Oligonukleotid oder ein Nukleosidtriphosphat konjugiert oder wird daran gebunden oder davon getrennt und ist in der Lage, direkt oder durch eine spezifische Bindungsreaktion bestimmt zu werden, und kann ein bestimmbares Signal produzieren. Allgemein läßt sich jede bestimmbare Markierung verwenden. Die Markierung kann isotop oder nichtisotop, üblicherweise nichtisotop, sein und kann ein Katalysator, z. B. ein Enzym oder ein katalytischer Polynukleotid, ein Promotor, Farbstoff, fluoreszentes Molekül, Chemilumineszierer, Coenzym, Enzymsubstrat, eine radioaktive Gruppe, ein kleines organisches Molekül, eine amplifizierbare Polynukleotidsequenz, ein Partikel, z. B. ein Partikel aus Latex oder Kohlenstoff, ein Metallsol, Kristallit, Liposom, eine Zelle usw. sein, und kann gegebenenfalls weiter mit einem Farbstoff, Katalysator oder einer anderen bestimmbaren Gruppe und ähnlichem markiert sein. Zu den Markierungen zählt auch eine Oligonukleotid- oder spezifische Polynukleotidsequenz, die eine Vorlage zur Amplifikation oder Ligation liefert oder als Ligand, z. B. für ein Repressorprotein, fungiert. Die Markierung ist ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems und kann ein bestimmbares Signal entweder allein oder zusammen mit anderen Mitgliedern des signalproduzierenden Systems erzeugen. Die Markierung kann entweder direkt an eine Nukleotidsequenz gebunden sein oder kann daran gebunden werden, indem sie an ein sbp-Mitglied, das komplementär zu einem an eine Nukleotidsequenz gebundenen sbp-Mitglied ist, gebunden wird.
  • Signalproduzierendes System – Das signalproduzierende System kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei es sich bei mindestens einer Komponente um die Markierung oder die Reportergruppe oder das Reportermolekül handelt. Das signalproduzierende System erzeugt ein Signal, das in Beziehung zur Anwesenheit oder Menge einer Zielpolynukleotidsequenz oder eines Polynukleotidanalyten in einer Probe steht. Das signalproduzierende System enthält alle Reagenzien, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals benötigt werden. Wenn die Markierung nicht an eine Nukleotidsequenz konjugiert ist, ist sie normalerweise an ein sbp-Mitglied gebunden, welches komplementär zu einem sbp-Mitglied, das an eine Nukleotidsequenz gebunden oder Teil dieser Nukleotidsequenz ist, ist. Andere Komponenten des signalproduzierenden Systems können in einer Entwicklerlösung enthalten sein und können Substrate, Verstärker, Aktivatoren, Chemilumineszierer, Cofaktoren, Inhibitoren, Scavenger-Moleküle, Metallionen, zur Bindung an signalerzeugende Substanzen benötigte spezifisch bindende Substanzen und ähnliches umfassen. Weitere Komponenten des signalproduzierenden Systems können Coenzyme, Substanzen, die mit enzymatischen Produkten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und ähnliches sein. Das signalproduzierende System liefert ein Signal, das über externe Mittel, über die Verwendung elektromagnetischer Strahlung und wünschenswerterweise über visuelle Untersuchung bestimmt werden kann. Das signalproduzierende System wird ausführlicher in der U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 07/555,323, eingereicht am 19. Juli 1990 (entspricht der EP0-Veröffentlichungsnummer 469,755), beschrieben, deren entsprechende Offenbarung hiermit unter Bezugnahme aufgenommen wird.
  • Amplifikation von Nukleinsäuren oder Polynukleotiden – jedes beliebige Verfahren, das zur Bildung eines oder mehrerer Kopien oder Komplemente einer Nukleinsäure oder eines Polynukleotidmoleküls, üblicherweise eine in einem Medium vorhandene Nukleinsäure oder einen Polynukleotidanalyt, führt.
  • Exponentielle Amplifikation von Nukleinsäuren oder Polynukleotiden – jedes beliebige Verfahren, das zur Bildung eines oder mehrerer Kopien einer in einem Medium vorhandenen Nukleinsäure oder Polynukleotidmoleküls, üblicherweise einer Nukleinsäure oder eines Polynukleotidanalyten, führt.
  • Zu den Verfahren für die enzymatische Amplifikation spezifischer doppelsträngiger DNA-Sequenzen gehören die oben beschriebenen, wie z. B. die Polymerasekettenreaktion (PCR), Amplifikation eines einzelsträngigen Polynukleotids mit einem einzelnen Polynukleotidprimer, Ligasekettenreaktion (LCR), Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis (NASBA), Q-beta-Replikaseverfahren, Strangverdrängungsamplifikation (SDA) sowie 3SR.
  • Die Bedingungen zur Durchführung einer Amplifikation variieren somit, je nachdem welches Verfahren gewählt wird. Einige dieser Verfahren, wie z. B. PCR, benutzen ein Temperaturcycling, um die Denaturierung von Duplexen, das Annealing von Oligonukleotidprimern und die Primerverlängerung mit thermophiler vorlageabhängiger Polynukleotidpolymerase zu erreichen. Andere Verfahren, wie z. B. NASBA; Q-Beta-Replikaseverfahren, SDA und 3SR, sind isotherm. Wie man sieht, gibt es eine Vielfalt bekannter Amplifikationsverfahren und viele verschiedene Bedingungen, unter denen diese Verfahren. ausgeführt werden, um eine exponentielle Amplifikation zu erzielen.
  • Lineare Amplifikation von Nukleinsäuren oder Polynukleotiden – jedes beliebige Verfahren, das zur Bildung einer oder mehrerer Kopien von lediglich dem Komplement einer in einem Medium vorhandenen Nukleinsäure oder Polynukleotidmoleküls, üblicherweise einer Nukleinsäure oder eines Polynukleotidanalyten, führt. Somit besteht ein Unterschied zwischen linearer Amplifikation und exponentieller Amplifikation darin, daß letztere Kopien des Polynukleotids produziert, wohingegen erstere nur den komplementären Strang des Polynukleotids produziert. In der linearen Amplifikation ist die Anzahl der gebildeten Komplemente im Prinzip direkt proportional zu der Reaktionszeit, im Gegensatz zur exponentiellen Amplifikation, bei der die Kopienanzahl im Prinzip von der Zeit oder der Anzahl an Temperaturzyklen in exponentieller Weise abhängt.
  • Hilfsmaterialien – verschiedene Hilfsmaterialien werden häufig in den im Sinne der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahren und Tests eingesetzt. So sind normalerweise Puffer ebenso im Testmedium vorhanden wie Stabilisatoren für dieses Testmedium und die Testkomponenten. Zusätzlich zu diesen Zusatzstoffen können häufig Proteine, z. B. Albumine, organische Lösungsmittel, z. B. Formamid, quaternäre Ammoniumsalze, Polykationen, z. B. Dextransulfat, Tenside, insbesondere nichtionische Tenside, Bindungsverstärker, z. B. Polyalkylenglykole, oder ähnliches enthalten sein.
  • Wie oben erwähnt, liegt eine Hauptanwendung der vorliegenden Erfindung in Verfahren zum Nachweis eines Polynukleotidanalyten. In einem Aspekt der Erfindung wird einOligonukleotid mit einem Polynukleotidanalyten in Gegenwart einer 5'-Nuklease unter isothermen Bedingungen reversibel hybridisiert. Auf diese Weise dient der Polynukleotidanalyt als ein „Erkennungselement", um der 5'-Nuklease die spezifische Spaltung des Oliqonukleotids unter Ausbildung eines ersten und eines zweiten Fragments zu ermöglichen, wenn das Oligonukleotid reversibel an den Polynukleotidanalyten hybridisiert wird. Das erste Fragment umfaßt das 5'-Ende des Oligonukleotids (mit Bezug auf das intakte bzw. originale Oligonukleotid), ist mit dem Polynukleotidanalyten weitgehend nicht hybridisierbar und kann als Markierung dienen. Das erste Fragment schließt im allgemeinen wenigstens einen Anteil desjenigen Teils des 5'-Endes des ursprünglichen Oligonukleotids ein, der nicht an den Polynukleotidanalyten hybridisiert wurde, wenn der Anteil des Oligonukleotids, der mit dem Polynukleotidanalyten hybridisierbar ist, daran reversibel hybridisiert wird.
  • Das erste Fragment kann zusätzlich Nukleotide (normalerweise nicht mehr als 5, vorzugsweise nicht mehr als 2, besonders bevorzugt nicht mehr als 1 solcher Nukleotide) einschließen, die von der 5`-Nuklease vom 5'-Ende desjenigen Anteils (bzw. derjenigen Sequenz) des ursprünglichenOligonukleotids, der bzw. die an den Polynukleotidanalyten hybridisiert wurde, abgespalten werden. Daher ist in dem obigen Zusammenhang das erste Fragment mit dem Polynukleotidanalyten „weitgehend nicht hybridisierbar". Das zweite Fragment umfaßt die Sequenz von Nukleotiden am 3'-Ende des Oligonukleotids, die an den Polynukleotidanalyten reversibel hybridisiert wurden, minus derjenigen Nukleotide, die von der 5`-Nuklease gespalten werden, wenn das ursprüngliche Oligonukleotid reversibel an den Polynukleotidanalyten hybridisiert wird. Dementsprechend ist das zweite Fragment, nachdem es aus demjenigen Anteil des Oligonukleotids, der mit dem Polynukleotidanalyten reversibel hybridisiert, entstand, mit dem Polynukleotidanalyten „weitgehend hybridisierbar".
  • Wie oben erwähnt, kann das 3'-Ende des Oligonukleotids ein oder mehrere Nukleotide einschließen, die nicht mit dem Polynukleotidanalyten hybridisieren und eine Markierung umfassen können. Man erhält mindestens einen 100-fachen molaren Überschuß des ersten Fragments und/oder des zweiten Fragments relativ zur Molmenge des Polynukleotidanalyten. Die Sequenz mindestens eines der Fragmente bleibt während der Reaktion weitgehend erhalten. Die Anwesenheit des ersten Fragments und/oder des zweiten Fragments wird bestimmt und zeigt dabei die Anwesenheit des Polynukleotidanalyten an.
  • Die 5'-Nuklease ist im allgemeinen in einer Menge vorhanden, die ausreicht, um die Spaltung des Oligonukleotids, wenn dieses reversibel an den Polynukleotidanalyten hybridisiert wird, mindestens halb so schnell wie die mit überschüssigem Enzym erreichbare Maximalgeschwindigkeit, vorzugsweise mit mindestens 75% der Maximalgeschwindigkeit, ablaufen zu lassen. Die Konzentration der 5'-Nuklease wird üblicherweise empirisch bestimmt. Vorzugsweise wird eine insoweit ausreichende Konzentration verwendet, daß ein weiterer Konzentrationsanstieg die Amplifikationszeit nicht mehr als um das 5-fache, vorzugsweise Doppelte, reduziert. Im allgemeinen ist der limitierende Faktor in erster Linie die Kosten für das Reagens. Diesbezüglich liegen daher der Polynukleotidanalyt, oder wenigstens die Zielpolynukleotidsequenz, sowie das Enzym im allgemeinen in einer katalytischen Menge vor. Das von dem Enzym gespalteneOligonukleotid liegt normalerweise in großem Uberschuß, vorzugsweise 10-9 M bis 10-5 M, vor und wird in einer Menge eingesetzt, die zu einem Maximum der Gesamtgeschwindigkeit seiner Spaltung gemäß der vorliegenden Erfindung führt, wobei die Geschwindigkeit wenigstens 10%, vorzugsweise 50%, besonders bevorzugt 90%, der maximal möglichen Reaktionsgeschwindigkeit beträgt.Oligonukleotidkonzentrationen von weniger als 50% können eingesetzt werden, um den Nachweis des Fragments bzw. der Fragmente, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, zu ermöglichen. Die Oligonukleotidmenge ist wenigstens so groß wie die gewünschte Anzahl an Produktmolekülen. Die Oligonukleotidkonzentration ist normalerweise 0,1 nanomolar bis 1 millimolar, vorzugsweise 1 nanomolar bis 10 mikromolar. Es sollte hier angemerkt werden, daß eine Erhöhung der Oligonukleotidkonzentration dazu führt, daß die Reaktionsgeschwindigkeit einem Grenzwert zustrebt, der von der Oligonukleotidsequenz, der Temperatur, der Konzentration der Zielpolynukleotidsequenz sowie der Enzymkonzentration abhängt. Bei vielen Nachweisverfahren können sehr hohe Oligonukleotidkonzentrationen den Nachweis erschweren.
  • Die Menge an zu kopierender Zielpolynukleotidsequenz kann nur ein bis zwei Moleküle in einer Probe betragen, kann jedoch im allgemeinen von etwa 102 bis 1010, üblicher von 103 bis 108 Molekülen in einer Probe variieren und beträgt vorzugsweise mindestens 10-21 M in der Probe und kann 10-10 bis 10-19 M, üblicher 10-14 bis 10-19 M betragen.
  • Bei der Durchführung des Verfahrens im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein wäßriges Medium eingesetzt. Als Cosolventien lassen sich auch andere polare Lösungsmittel einsetzen, üblicherweise oxygenierte organische Lösungsmittel mit 1 bis 6, üblicher mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einschließlich Alkoholen, Ethern und ähnlichen. Üblicherweise liegen diese Cosolventien, falls sie verwendet werden, in weniger als etwa 70 Gew.-%, üblicher in weniger als etwa 30 Gew.-% vor.
  • Der pH-Wert des Mediums liegt üblicherweise im Bereich von etwa 4, 5 bis 9, 5, üblicher im Bereich von etwa 5, 5 bis 8,5 und vorzugsweise im Bereich von etwa 6 bis B. Der pH-Wert und die Temperatur werden so gewählt, daß die reversible Hybridisierung oder der Gleichgewichtszustand, bei dem die Spaltung eines Oligonukleotids stattfindet, im Sinne der vorliegenden Erfindung erreicht wird. In einigen Fällen wird bei den Reaktionsparametern ein Kompromiß eingegangen, um die Geschwindigkeit, Effizienz und Spezifität dieser Schritte des vorliegenden Verfahrens zu optimieren. Zur Erzielung des gewünschten pH-Werts und Beibehaltung dieses pH-Werts während der Bestimmung können verschiedene Puffer verwendet werden. Zu den beispielhaften Puffern gehören Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und ähnliche. Der jeweilige verwendete Puffer ist nicht kritisch für diese Erfindung, jedoch kann bei einzelnen Verfahren ein Puffer gegenüber einem anderen bevorzugt sein.
  • Wie oben erwähnt, wird die Reaktion im Sinne der vorliegenden Erfindung unter isothermen Bedingungen durchgeführt. Die Reaktion wird bei einer Temperatur durchgeführt, die in der Nähe der Schmelztemperatur des Oligonukleotid : Polynukleotidanalyt-Komplexes liegt. Entsprechenderweise hängt die verwendete Temperatur von einer Reihe von Faktoren ab. Üblicherweise beträgt die Temperatur für die Spaltung des Oligonukleotids im Sinne der vorliegenden Erfindung etwa 35°C bis 90°C, je nach Länge und Sequenz des Oligonukleotids. Üblicherweise ist die Verwendung einer relativ hohen Temperatur von 60°C bis 85°C wünschenswert, um für eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit zu sorgen. Die Menge an gebildeten Fragmenten hängt von der Inkubationszeit und -temperatur ab. Im allgemeinen wird zur Durchführung der Verfahren typischerweise eine gemäßigte Temperatur eingesetzt. Die genaue verwendete Temperatur variiert ebenfalls je nach Salzkonzentration, pH-Wert, verwendeten Lösungsmitteln sowie der Länge und Zusammensetzung der Zielpolynukleotidsequenz ebenso wie des Oligonukleotids, wie oben erwähnt.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist in 1 dargestellt. Das OligonukleotidOL wird mit dem Polynukleotidanalyten PA, der eine Zielpolynukleotidsequenz TPS aufweist, und mit einer 5'-Nuklease, bei der es sich beispielsweise um eine Taq-Polymerase handeln kann, kombiniert. In dieser Ausführungsform wird OL markiert (*), und zwar in einem Bereich, der als erstes Fragment bezeichnet wird und nach Spaltung des Oligonukleotids im Sinne der vorliegenden Erfindung entsteht. Die Länge von OL beträgt in dieser Ausführungsform üblicherweise mindestens 10 Nukleotide, vorzugsweise etwa 10 bis 50 Nukleotide, besonders bevorzugt 15 bis 30 oder mehr Nukleotide. Allgemein sollte die Länge des OL ausreichen, so daß ein Anteil mit TPS hybridisieren kann, wobei die Länge eines solchen Anteils der Länge der TPS nahe kommt. In dieser Ausführungsform wird die Länge des OL so gewählt, daß nach Abspaltung von nicht mehr als 5, vorzugsweise nicht mehr als 1 bis 3, besonders bevorzugt 1 bis 2 Nukleotiden, davon zwei Fragmente entstehen. Das mit LN bezeichnete erste Fragment ist nicht länger als 5 Nukleotide, vorzugsweise 1 bis 3 Nukleotide lang, besonders bevorzugt 1 bis 2 Nukleotide lang, und das mit DOL bezeichnete zweite Fragment ist nicht mehr als 5, vorzugsweise nicht mehr als 1 bis 3, besonders bevorzugt nicht mehr als 1 bis 2, Nukleotide kürzer als die Länge desOL.
  • Wie in 1 gezeigt, hybridisiert OL mit TPS unter Bildung des Duplex I. Die Hybridisierung wird unter isothermen Bedingungen durchgeführt, so daß OL reversibel mit TPS hybridisiert. OL in Duplex I wird unter Bildung von DOL und LN gespalten, wobei LN ein markiertes Nukleotid (*) enthält. In der in 1 dargestellten Ausführungsform ist DOL mit Ausnahme der am 5'-Ende fehlenden Nukleotide das Komplement zu TPS. Da während des Verlaufs der isothermen Reaktion das 5'-Ende von PA am oder in der Nähe des 5'-Endes von TPS gespalten werden kann, kann DOL an seinem 3'-Ende ebenfalls 0 bis 5 Nukleotide aufweisen, die einen Überhang bilden und nicht mit dem restlichen Anteil der TPS hybridisieren können. Die isothermen Bedingungen werden so gewählt, daß zwischen dem Duplex I und seinen einzelsträngigen Bestandteilen, nämlich PA und OL, ein Gleichgewicht besteht. Nach Spaltung von OL im Duplex I stellt sich zwischen dem Duplex I und seinen einzelsträngigen Bestandteilen, PA und DOL, ebenfalls ein Gleichgewicht ein. Da OL normalerweise in einem großen Überschuß relativ zur in der Reaktion gebildeten Menge an DOL vorliegt, gibt es üblicherweise viel mehr OL enthaltende Duplexe als DOL enthaltende Duplexe. Die oben beschriebene Reaktion für Duplex I produziert kontinuierlich zusätzliche DOL-Moleküle.
  • Man läßt die Reaktion solange weiterlaufen, bis sich eine ausreichende Anzahl an DOL- und LN-Molekülen gebildet hat, um den Nachweis des markierten LN (LN*) und somit des Polynukleotidanalyten zu gestatten. Auf diese Weise wird die enzymkatalysierte Abspaltung von Nukleotiden vom 5'-Ende des OL durch die Anwesenheit des Polynukleotidanalyten moduliert und steht daher mit dieser in Beziehung. Je nach der vorliegenden Menge an PA läßt sich eine für den Nachweis ausreichende Anzahl von Molekülen erhalten, wobei die Reaktionszeit von etwa 1 Minute bis zu 24 Stunden betragen kann. Vorzugsweise läßt sich die Reaktion in weniger als 5 Stunden durchführen. Zweckmäßigerweise ist es gewöhnlich wünschenswert, die Zeitdauer zu minimieren, solange die erforderliche Anzahl an Molekülen des nachweisbaren Fragments erreicht wird. Im allgemeinen läßt sich die Zeitdauer für einen gegebenen Spaltungsgrad minimieren, indem die Reaktionstemperatur optimiert wird und Konzentrationen an 5'-Nuklease sowie an Oligonukleotid eingesetzt werden, die für Reaktionsgeschwindigkeiten sorgen, die nahe am mit einem Überschuß an diesen Reagenzien erreichbaren Maximum liegen. Der Nachweis des Polynukleotidanalyten wird indirekt durch den Nachweis der Markierung im Fragment LN* erzielt. Alternativ läßt sich DOL beispielsweise nachweisen, indem die Markierung als ein Mittel zur Abtrennung von LN' und OL aus der Reaktionsmischung verwendet und danach das zurückgebliebene DOL nachgewiesen wird.
  • Der Nachweis des markierten Fragments kann auf vielfache Weise erleichtert werden. So läßt sich beispielsweise ein Mitglied eines spezifischen Paars, wie z. B. Biotin, oder eine direkt nachweisbare Markierung wie z. B. Fluorescein verwenden. Das niedrigmolekulare LN' läßt sich durch Elektrophorese, Gelausschlußchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Ultrafiltration und dergleichen abtrennen und durch beliebige zweckmäßige Mittel wie z. B. einem kompetitiven Bindungsassay oder durch direkten Nachweis der Markierung nachweisen. Alternativ kann das Oligonukleotid innerhalb des zweiten (DOL-)Fragments mit einem spezifischen Bindungsmitglied wie z. B. einem Liganden, einem kleinen organischen Molekül, einer Polynukleotidsequenz oder einem Protein, oder mit einer direkt nachweisbaren Markierung wie z. B. einem direkt nachweisbaren kleinen organischen Molekül, z. B. Fluorescein, einem Sensitizer, einem Coenzym und dergleichen markiert werden. Der Nachweis hängt dann davon ab, zwischen dem Oligonukleotid mit Markierungen an beiden Enden und einfach markierten Fragmenten, wobei ein markiertes Ende abgeschnitten wurde, zu unterscheiden. In diesem Fall ist es wünschenswert, ein Ende des OL mit einem spezifischen Bindungsmitglied, das die Entfernung desOL sowie des die Markierung behaltenden Fragments erleichtert, indem ein an einen Träger gebundenes komplementäres sbp-Mitglied verwendet wird, zu markieren. Die restlichen markierten Fragmente, die die zweite Markierung tragen, werden dann durch Verwendung eines zum Nachweis dieser Markierung geeigneten Verfahrens nachgewiesen.
  • Ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren ist der Einsatz von Nukleinsäuresonden. Weitere Test- und Nachweisformate sind in den U.S.-Patentanmeldungen mit den Serien Nr. 07/229, 282 bzw. 07/399, 795, eingereicht am 19. Januar 1989 bzw. 29. August 1989 (die beide jeweils der EP0-Veröffentlichungsnummer 379,369 entsprechen), der U.S.-Patentanmeldung mit der Serien Nr. 07/555,323, eingereicht am 19. Juli 1990 (entspricht der EPO-Veröffentlichungsnummer 469,755), der U.S.-Patentanmeldung mit der Serien Nr. 07/555,968 (nun U.S.-Patent 5,439,793) sowie der U.S.-Patentanmeldung mit der Serien Nr. 07/776,538 (entspricht der EPO-Veröffentlichungsnummer 549,107), eingereicht am 11. Oktober 1991, offenbart.
  • Beispiele für bestimmte Markierungen oder Reportermoleküle und ihr Nachweis lassen sich der U.S.-Patentanmeldung mit der Serien Nr. 07/555,323, eingereicht am 19. Juli 1990 (entspricht der EPO-Veröffentlichung 469,755) entnehmen.
  • Der Nachweis des Signals hängt von der Beschaffenheit des verwendeten signalproduzierenden Systems ab. Handelt es sich bei der Markierung oder der Reportergruppe um ein Enzym, so gehören Enzymsubstrate usw. ebenfalls zu dem signalproduzierenden System. Bei dem Produkt der Enzymreaktion handelt es sich vorzugsweise um ein lumineszierendes Produkt oder um einen Fluoreszenz- oder Nicht-Fluoreszenzfarbstoff, der jeweils spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann, oder um ein Produkt, das mit anderen spektrometrischen oder elektrometrischen Mitteln nachgewiesen werden kann. Handelt es sich bei der Markierung um ein fluoreszierendes Molekül, läßt sich das Medium bestrahlen und die Fluoreszenz bestimmen. Falls es sich bei der Markierung um eine radioaktive Gruppe handelt, kann man die Radioaktivität im Medium durch Zählen bestimmen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in 2 dargestellt. Das OligonukleotidOL' weist einen ersten Anteil bzw. eine erste Sequenz SOL1 auf, der bzw. die nicht an TPS' hybridisiert wird, sowie einen zweiten Anteil bzw. eine zweite Sequenz SOL2, der bzw. die an TPS' hybridisiert wird. OL' wird mit dem Polynukleotidanalyten PA', der die Zielpolynukleotidsequenz TPS' aufweist, sowie mit einer 5'-Endonuklease (5'-Endo), bei der es sich beispielsweise um Taq-DNA-Polymerase und dergleichen handeln kann, kombiniert. OL` und 5'-Endo liegen im allgemeinen in Konzentrationen wie oben beschrieben vor. In der Ausführungsform der 2 wirdOL' innerhalb der Sequenz SOL1 markiert (*), wobei SOL1 die Markierung intrinsisch enthalten oder extrinsisch mit einem spezifischen Bindungsmitglied bzw. einer direkt nachweisbaren Markierung markiert werden kann. Die Länge von SOL2 ist wie in der Ausführungsform der 1 beschrieben. Im allgemeinen sollte die Länge von SOL2 zur Hybridisierung mit TPS' ausreichen und entspricht normalerweise etwa der Länge der TPS'. SOL1 kann beliebig lang sein, solange sie die Spaltung des OL` nicht wesentlich stört und ist vorzugsweise relativ kurz um solche Störungen zu vermeiden. Normalerweise beträgt die Länge der SOL1 etwa 1 bis 100 Nukleotide, vorzugsweise 8 bis 20 Nukleotide.
  • In dieser Ausführungsform führt die Abspaltung der SOL1 von der SOL2 zu zwei Fragmenten. Die Spaltung in SOL2 findet weniger als 5 Nukleotide von der SOL1 und SOL2 in OL' verknüpfenden Bindung statt. Der genaue Ort der Spaltung ist nicht kritisch, solange das Enzym OL' nur dann spaltet, wenn dieses an TPS' gebunden ist. Die beiden Fragmente werden mit LNSOL1 und DSOL2 bezeichnet. LNSOL1 umfaßt das 5'-Ende von OL' und DSOL2 umfaßt das 3'-Ende von OL '. Die Sequenz von wenigstens einem der Moleküle LNSOL1 und DSOL2 bleibt während der Spaltreaktion weitgehend in Takt. Wie in 2 gezeigt, hybridisiert SOL2 von OL' mit TPS' unter Ausbildung des Duplex I'. Die Hybridisierung wird unter isothermen Bedingungen durchgeführt, so daß OL' reversibel mit TPS` hybridisiert wird. OL' in Duplex I' wird unter Bildung von DSOL2 und LNSOL1 gespalten, wobei das letztere eine Markierung enthält. In der in 2 dargestellten Ausführungsform stellt DSOL2 das Komplement zu TPS` dar, mit Ausnahme derjenigen Nukleotide, die am 5'-Ende davon als Ergebnis der Spaltung der Spaltreaktion fehlen, und derjenigen, am 3'-Ende von OL ' anhängenden Nukleotide (in 2 nicht gezeigt), die nicht mit TPS` hybridisieren.
  • Die isothermen Bedingungen werden so gewählt, daß ein Gleichgewicht zwischen Duplex I' und seinen einzelsträngigen Bestandteilen, d. h. PA' und OL ', besteht. Nach Spaltung von OL' im Duplex I' stellt sich ebenfalls ein Gleichgewicht zwischen Duplex I' und seinen einzelsträngigen Komponenten, PA' und DSOL2, ein. Da OL` normalerweise in großem Überschuß relativ zur in der Reaktion gebildeten Menge an DSOL2 vorliegt, gibt es normalerweise viel mehr Duplexe mit OL' als mit DSOL2. Die oben für Duplex I' beschriebene Reaktion produziert kontinuierlich DSOL2- und LNSOL1-Moleküle. Man läßt die Reaktion weiterlaufen, bis sich eine ausreichende Anzahl an DSOL2- und LNSOL1-Molekülen gebildet hat, um den Nachweis eines oder beider dieser Fragmente zu gestatten. Auf diese Weise wird die enzymkatalysierte Abspaltung des LNSOL1 vom 5'-Ende des an PA' hybridisierten Anteils an OL' durch die Anwesenheit des Polynukleotidanalyten moduliert und steht daher mit dieser in Beziehung. Die Reaktionsparameter und der Nachweis von DSOL2 und/oder LNSOL1 sind im allgemeinen wie oben für die Ausführungsform der 1 beschrieben.
  • Es lassen sich verschiedene Wege zur Kontrolle der Spaltung des Oligonukleotids einsetzen. So läßt sich beispielsweise die Spaltstelle durch Einführung einer kleinen organischen Gruppe, wie z. B. Biotin, in das Nukleotid am 5'-Terminus des OL' oder das an der Verknüpfungsstelle von SOL2 und SOLI befindliche Nukleotid in SOL2 kontrollieren.
  • Eine Ausführungsform, bei der ein zweites Oligonukleotid eingesetzt wird, ist in 3 dargestellt. Das zweite Oligonukleotid (0L2) hybridisiert an einer Stelle TPS2 auf PA'', die 3' von der Hybridisierungsstelle (TPS1) der Sequenz SOL2'' des ersten Oligonukleotids, nämlich OL'', liegt. In der gezeigten Ausführungsform hybridisiert 0L2 vollständig mit TPS2, und zwar in beispielhafter und nicht in einschränkender Weise. Das zweite Oligonukleotid kann an seinem 5'-Ende Nukleotide einschließen, die mit der Zielpolynukleotidsequenz nicht hybridisiert sind, jedoch ist sein 3'-Ende vorzugsweise hybridisierbar. Vorzugsweise bindet 0L2 an eine Stelle (TPS2), die sich unmittelbar an die Stelle, an der SOL2'' hybridisiert (TPS1), anschließt. Es liegt jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß das zweite Oligonukleotid mit PA'' 1 bis 5 Nukleotide, vorzugsweise 1 Nukleotid, von der Stelle, an der SOL2'' hybridisiert, entfernt hybridisiert. Das zweite Oligonukleotid, 0L2, ist normalerweise wenigstens genauso lang wie und vorzugsweise länger als SOL2'', vorzugsweise mindestens 2 Nukleotide länger als SOL2''. Im allgemeinen beträgt die Länge des zweiten Oligonukleotids etwa 20 bis 100 Nukleotide, vorzugsweise 30 bis 80 Nukleotide, je nach Länge des SOL2''. Typischerweise wird das zweite Oligonukleotid so gewählt, daß es vom Duplex I'' bei einer höheren Temperatur dissoziiert als diejenige, bei derOL'' dissoziiert, normalerweise mindestens 3°C, vorzugsweise mindestens 5 oder mehr °C, höher.
  • Die Anwesenheit von 0L2 im Duplex I'' kann die Spaltstelle des OL'' beeinflussen. Insbesondere kann bei Bindung von 0L2 an einen PA'', der sich nicht unmittelbar an die SOL2''-Hybridisierungsstelle anschließt, sich die Spaltstelle um ein oder mehrere Nukleotide verschieben.
  • Die Konzentration des in dieser Ausführungsform eingesetzten zweiten Oligonukleotids beträgt normalerweise mindestens 1 picomolar, liegt jedoch vorzugsweise oberhalb 0,1 nanomolar, um die schnelle Bindung an PA'' zu erleichtern, und besonders bevorzugt mindestens 1 nanomolar bis 1 mikromolar. Im Sinne der Ausführungsform der 3 wird OL'' im Duplex I'' durch 5'-Endo unter Bildung von DSOL2'' und LNSOL1'' gespalten. Man läßt die Reaktion solange weiterlaufen, bis sich die gewünschte Anzahl an Molekülen des markierten Fragments gebildet hat. Die Reaktionsparameter sowie der Nachweis von DSOL2'' und/oder LNSOL1'' sind ähnlich zu den für die Ausführungsform der 1 oben beschriebenen.
  • Im allgemeinen und spezifisch in einer der Ausführungsformen der 1 bis 3 oben kann das 3'-Ende des ersten Oligonukleotids, beispielsweise OL,OL' und OL'', ein oder mehrere Nukleotide aufweisen, die nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisieren und die daher als Markierung dienen können, aber nicht müssen.
  • Ebenso liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, ein einzelnes Nukleotidtriphosphat in einer der obigen Ausführungsformen einzusetzen, je nach der bestimmten, für die obige Spaltung gewählten 5'-Endonuklease. Die Entscheidung über die Verwendung eines Nukleosidtriphosphats sowie die Wahl des Nukleosidtriphosphats werden empirisch getroffen, basierend auf seiner Fähigkeit, die Reaktion im Sinne der vorliegenden Erfindung zu beschleunigen. Es handelt sich dabei vorzugsweise um ein Nukleosidtriphosphat, das in das erste Oligonukleotid als Folge der Bindung des Oligonukleotids an die Zielpolynukleotidsequenz nicht eingebaut werden kann. In dieser besonderen Ausführungsform liegt das zugegebene Nukleosidtriphosphat in einer Konzentration von 1 mikromolar bis 10 millimolar, vorzugsweise 10 mikromolar bis 1 millimolar und besonders bevorzugt 100 mikromolar bis 1 millimolar, vor. Es liegt ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung, das zugegebene Nukleosidtriphosphat zur Kettenverlängerung des 3'-Terminus des zweitenOligonukleotids zu verwenden, um dieses unmittelbar an diejenige Stelle auf der Zielpolynukleotidsequenz, an der das erste Oligonukleotid hybridisiert, anschließen zu lassen. Bei diesem Ansatz dient das zweite Oligonukleotid als ein Polynukleotidprimer für die Kettenverlängerung. Zusätzlich wird das Nukleosidtriphosphat entsprechend ausgewählt, um eine solche Kettenverlängerung zu erzielen, und die 5'-Nuklease wird danach ausgewählt, daß sie auch eine vorlagenabhängige Nukleotidpolymeraseaktivität aufweist. In jedem Fall ist ein solcher Ansatz in erster Linie auf die Situation anwendbar, bei der die Bindungsstelle dieses zweiten Oligonukleotids, TPS2, durch eine Sequenz von einer oder mehreren identischen Basen, die zu dem zugegebenen Nukleosidtriphosphat komplementär sind, von der Bindungsstelle des ersten Oligonukleotids, TPS1, getrennt ist.
  • In der Ausführungsform der 3 wird die PA'', OL'', das zweite Oligonukleotid 0L2 sowie das Nukleosidtriphosphat enthaltende Mischung bei einer geeigneten isothermen Temperatur, bei der OL'' und PA'' sich im Gleichgewicht mit dem Duplex I'' befinden, wobei die PA''- und Duplex I''-Moleküle größtenteils an 0L2 hybridisiert sind, inkubiert. Während der Zeit, in der ein Molekül OL'' an PA'' gebunden ist, führt die 5'-Endo zur hydrolytischen Spaltung von OL'' im Sinne der vorliegenden Erfindung. Wenn dann der verbliebene Anteil des gespaltenen Oligonukleotids (DSOL2'') vom PA'' dissoziiert, wird daraufhin ein intaktes Molekül OL'' hybridisiert, wonach sich der Prozeß wiederholt.
  • In einem Experiment im Sinne der obigen Ausführungsform führte eine 3stündige Inkubation bei 72°C zur Produktion von mehr als 1011 Molekülen DSOL2'' und LNSOL1'' , was einen Anstieg von mehr als 104 gegenüber der Anzahl an PA''-Molekülen, die anfänglich in der Reaktionsmischung vorlagen, bedeutete. OL'' wurde mit einem 32P-Phosphat am 5'-Terminus markiert. Das Spaltprodukt LNSOL1'' wurde nachgewiesen, indem die Mischung auf ein Elektrophoresegel aufgetragen und eine Bande, die schneller als die mit OL'' assoziierte Bande wanderte, nachgewiesen wurde. Es konnte gezeigt werden, daß das Auftreten dieser Bande mit der Anwesenheit von und Menge an PA` ` assoziiert ist, wobei ein Minimum von 10(unlesbar) Molekülen in PA'' nachgewiesen wurde.
  • In der obigen Ausführungsform lassen sich auch alternative Ansätze zum Nachweis von LNSOL1'' und/oder DSOL2'' einsetzen. So wird beispielsweise in einem Ansatz Biotin an einen beliebigen Teil von SOL2'', der durch die 5-Endonuklease vom OL'' abgespalten wird, gebunden. Das Fragment DSOL2'' sowie OL'', die das Biotin enthalten, werden von LNSOL1'' beispielsweise durch Präzipitation mit Streptavidin und Filtration getrennt. Das nicht präzipitierte, markierte Fragment LNSOL1'' wird dann über einen beliebigen Standard-Bindungstest, entweder ohne Trennung (homogen) oder mit Trennung (heterogen) von irgendeinem der Testkomponenten oder -produkte, nachgewiesen.
  • Als Beispiel für homogene Immunassays dienen die in Rubenstein et al., U.S.-Patent Nr. 3,817,837, Spalte 3, Zeile 6 bis Spalte 6, Zeile 64 offenbarten „Enzyme Multiplied Immunoassay"-Techniken („EMIT"), Immun fluoreszenzverfahren, wie z. B. die in Ullman, et al., U.S.-Patent Nr. 3, 996, 345, Spalte 17, Zeile 59 bis Spalte 23, Zeile 25 offenbarten; Enzym-Channeling-Techniken, wie z. B. die in Maggio, et al., US-Patent Nr. 4,233,402, Spalte 6, Zeile 25 bis Spalte 9, Zeile 63 offenbarten; und andere Enzym-Immunassays, wie z. B. der „Enzyme-Linked Immunosorbant Assay (ELISA)'' werden in Maggio, E . T . supra diskutiert. Ein Beispiel für heterogene Tests ist der Radioimmunassay, offenbart in Yalow, et al., J. Clin. Invest. 39: 1157 (1960). Für eine ausführlichere Erörterung der obigen Immunassaytechniken, siehe „Enzyme-Immunoassay", von Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Siehe auch z. B. U.S.-Patente Nr. 3, 690, 839; 3, 791, 932; 3, 817, 837; 3, 850, 578; 3, 853, 987; 3, 867, 517; 3, 901, 654; 3, 935, 074; 3, 984, 533; 3, 996, 345 und 4,098,876, wobei es sich hier nicht um eine vollständige Liste handeln soll.
  • Heterogene Tests beinhalten üblicherweise einen oder mehrere Trennschritte und können kompetitiv oder nichtkompetitiv sein. Verschiedene kompetitive und nichtkompetitive Testformate sind in Davalian, et al., U.S.-Patent Nr. 5, 089, 390, Spalte 14, Zeile 25 bis Spalte 15, Zeile 9 offenbart. Ein typischer nichtkompetitiver Test ist ein in David, et al., U.S.-Patent Nr. 4,986,530, Spalte 8, Zeile 6 bis Spalte 15, Zeile 63 offenbarter Sandwich-Test.
  • Ein weiterer Bindungstestansatz umfaßt den Lumineszenz-Immunassay, beschrieben im U.S.-Patent mit der Serien Nr. 07/704,569, eingereicht am 22. Mai 1991 unter dem Titel „Assay Method Utilizing Induced Luminescence" (entspricht der PCT-Veröffentlichungsnummer W095/14928 und der Taiwan-Patentnummer 62, 088).
  • Zweckmäßigerweise können vorbestimmte Mengen an in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Reagenzien in abgepackter Kombination in einem Kit zur Verfügung gestellt werden. Dabei kann ein Kit in abgepackter Kombination (a) ein erstes Oligonukleotid mit der Eigenschaft, daß es bei reversibler Hybridisierung an einen Anteil eines nachzuweisenden Polynukleotids unter isothermen Bedingungen von einer 5'-Nuklease abgebaut wird, um (i) ein erstes Fragment, das mit dem Polynukleotid weitgehend nicht hybridisierbar ist, und (ii) ein zweites Fragment, das 3' vom ersten Fragment liegt und mit dem Polynukleotid weitgehend hybridisierbar ist, bereitzustellen, (b) ein zweites Oligonukleotid mit der Eigenschaft, daß wenigstens ein Anteil davon an eine Stelle auf dem Polynukleotid hybridisiert, die 3' von der Stelle liegt, an der das erste Oligonukleotid hybridisiert, wobei das Polynukleotid weitgehend vollständig an einen solchen Anteil des zweiten Oligonukleotids unter isothermen Bedingungen hybridisiert wird, und (c) die obige 5'-Nuklease umfassen. Der Kit kann weiterhin ein einzelnes Nukleosidtriphosphat umfassen.
  • Die obigen Kits können weiterhin Mitglieder eines signalproduzierenden Systems sowie ebenfalls verschiedene gepufferte Medien, von denen einige ein oder mehrere der obigen Reagenzien enthalten können, einschließen. Ebenso können die obigen Kits eine schriftliche Beschreibung eines oder mehrerer Verfahren im Sinne der vorliegenden Erfindung zum Nachweis eines Polynukleotidanalyten einschließen.
  • Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien in den Kits lassen sich über einen weiten Bereich variieren, um für Reagenskonzentrationen zu sorgen, die die während des vorliegenden Verfahrens stattfindenden Reaktionen wesentlich optimieren, und weiterhin die Empfindlichkeit eines beliebigen Tests wesentlich zu optimieren. Unter entsprechenden Umständen können ein oder mehrere Reagenzien als trockenes, üblicherweise lyophilisiertes Pulver zur Verfügung gestellt werden, einschließlich Hilfsstoffen, die nach Auflösung für eine Reagenslösung mit den für die Durchführung eines Verfahrens oder Tests im Sinne der vorliegenden Erfindung geeigneten Konzentrationen sorgen. Jedes Reagens kann entweder in getrennte Behältnisse abgepackt werden, oder aber einige Reagenzien können in einem Behältnis kombiniert werden, falls dies im Hinblick auf Kreuzreaktivität und Haltbarkeit zulässig ist.
  • BEISPIELE
  • Die Erfindung wird mit den folgenden veranschaulichenden Beispielen weiter demonstriert. Falls nicht anders angegeben, sind Temperaturen in Grad Celsius (°C) und Anteile bzw. Gewichtsprozente aufgeführt.
  • BEISPIEL 1 Eine einzelsträngige Ziel-DNA (2 × 108 Moleküle) (M13mp19 von Gibco, BRL, Bethesda, Maryland) (die „Ziel-DNA") wurde mit einer 5'32P-markiertenOligonukleotidsonde, Sonde 1, (10 μM) (5'CGT-GGG-ARC-AAA-CGG-CGG-AT3') (SEQ ID NO: 1) synthetisiert auf einem Pharmacia Gene Assembler (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), einem nichtmarkiertenOligonukleotid, Sonde 2, (1 μM) (5'TTC-ATC-AAC-ATT-AAA-TGT-GAG-CGA-GTA-ACA-ACC-CGT-CGG-ATT-CTC3' (SEQ ID NO: 2) synthetisiert auf einem Pharmacia Gene Assembler (Pharmacia Biotech), sowie 7,5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase (von Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, N.J.) in 50 μL Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 50 mM KCl, 7,5 mM MgCl2, 100 μM dATP) kombiniert. Bei der Sonde 1 handelte es sich um ein 20 Basen langes Oligonukleotid, das zur Ziel-DNA vollständig komplementär war und eine Markierung am 5'-Nukleotid aufwies. Sonde 2, die nichtmarkierte Sonde, wurde konstruiert, um an die Ziel-DNA 3' von der und direkt anschließend an die Stelle, an der die markierte Sonde an die Ziel-DNA annealte, zu annealen. Es konnte gezeigt werden, daß dATP die Geschwindigkeit der Spaltung durch die Polymerase erhöht. Es wurden jedoch auch gute Ergebnisse in Abwesenheit von dATP erzielt.
  • Die Reaktionsmischung wurde bei 72°C inkubiert und die Anreicherung von Produkt, einem Mononukleotid, nämlich 5'32P-C-OH, wurde durch Sichtbarmachung mittels Autoradiographie nach einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Der Amplifikationsfaktor wurde mittels Flüssigszintillationspektrometrie von ausgeschnittenen Reaktionsprodukten bestimmt. Eine 105fache Amplifikation wurde beobachtet.
  • Das obige Reaktionsprotokoll wurde unter Verwendung, anstelle der Sonde 1, einer markierten Sonde, Sonde 3, (5'-TCG-TGG-GRA-CAA-ACG-GCG-GAT3' (SEQ ID NO: 3) hergestellt unter Verwendung eines Pharmacia Gen Assembler), die 21 Nukleotide aufwies, mit einer Base am 5'-Ende, die nicht komplementär war und nicht mit der Ziel-DNA hybridisierte, wiederholt. Das Produkt dieser Reaktion war ein Dinukleotid, nämlich 5'32P-TC-OH, das eine 105fache Amplifikation repräsentierte.
  • Das obige Reaktionsprotokol wurde bei unterschiedlichen Temperaturen und unterschiedlichen Reagenskonzentrationen wiederholt. Alle Reaktionen, einschließlich der obenerwähnten, wurden über einen Zeitraum von 3 Stunden ausgeführt. In der folgenden Tabelle sind die Reagenzien sowie die Reaktionsparameter und die während des Optimierungsverfahrens erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt.
  • Figure 00470001
  • BEISPIEL 2
  • Das in Beispiel 1 beschriebene Reaktionsprotokoll wurde unter Verwendung der folgenden Sonden anstelle der Sonde 1 bzw. Sonde 3 wiederholt:
    Sonde 4: 5'TTA-TTT-CGT-GGG-AAC-AAA-CGG-CGG-AT3' (SEQ ID NO: 4) (von Oligos Etc., Inc., Wilsonville, OR). Sonde 4 besaß 26 Nukleotide, wobei sechs Nukleotide an ihrem 5'-Ende mit der Ziel-DNA weder komplementär noch hybridisierbar waren. Die Sonde 4 lag in einer Konzentration von 1 mikromolar vor. Das Produkt dieser Reaktion war ein intaktes, sieben Nukleotide langes Fragment, nämlich 5'32P-TTATTTC-OH, was einer 1,5 × 104fachen Amplifikation entsprach.
  • Sonde 5: 5'GAT-TAG-GAT-TAG-GAT-TAG-TCG-TGG-GAA-CAA-ACG-GCG-GAT3' (SEQ ID NO: 5) wurde unter Verwendung eines Pharmacia Gen Assembler hergestellt und wies 39 Nukleotide auf, wobei 19 Nukleotide an ihrem 5'-Ende mit der Ziel-DNA weder komplementär waren noch mit ihr hybridisierten. Das Produkt dieser Reaktion war ein intaktes, 20 Nukleotide langes Fragment, nämlich 5'32P-GAT-TRG-GAT-TAG-GAT-TAG-TC-OH (SEQ ID NO: 6), entsprechend einer 1,5 × 104fachen Amplifikation.
  • Bei Wiederholung der obigen Reaktionen in Abwesenheit von Sonde 2 wurde zwar ein Produkt beobachtet, aber die Intensität des Flecks auf dem Polyacrylamidgel war deutlich geringer als in Gegenwart der Sonde 2. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in dem Fall beobachtet, wo ein 1-Nukleotid Abstand zwischen dem 3'-Ende von Sonde 2 und der zweiten Sonde bestand, wenn beide Sonden an die Ziel-DNA hybridisiert wurden.
  • BEISPIEL 3
  • Das in Beispiel 1 beschriebene Reaktionsprotokoll wurde unter Verwendung von 2 × 109 Zielmolekülen sowie der Sonde 5 (siehe Beispiel 2) in einer Konzentration von 1 mikromolar anstelle der Sonde 1 wiederholt. Die Reaktionen wurden über einen Zeitraum von 3 Stunden bei einer Temperatur von 72°C durchgeführt, wobei eine von sechs verschiedenen DNA-Polymerasen, nämlich AmpliTaq DNA-Polymerase, Replitherm(TM) DNA-Polymerase (Epicentre), Tfl(TM) DNA-Polymerase (Epicentre), Ultra Therm(TM) DNA-Polymerase (Bio/Can Scientific), Thermalase Tbr(TM) DNR-Polymerase (Amresco) und Panozyme(TM) DNA-Polymerase verwendet wurde. Das Produkt der Reaktion war ein 20 Nukleotide langes Fragment (siehe Beispiel 2). Im Folgenden ist eine Zusammenfassung der erhaltenen Ergebnisse dargestellt.
    Enzym Fragment (picomol als Einheit)
    AmpliTaq 32
    Replitherm 18
    Tfl 5
    Ultra Therm 27
    Tbr 16
    Panozyme 25
  • Die obigen Experimente zeigen, daß nachweisbare Spaltprodukte in einer zielspezifischen Weise bei einer einzigen Temperatur erzeugt wurden, wobei Enzyme mit einer 5'-Nukleaseaktivität sowie ein markiertes Oligonukleotid verwendet wurden. Die Anreicherung an Produkt wurde durch die Anwesenheit eines zweiten Oligonukleotids, das eine größere Länge als das erste markierte Oligonukleotid aufwies und das an eine Zielpolynukleotidsequenz 3' von der Hybridisierungsstelle des ersten markierten Oligonukleotids annealt wurde. Die Reaktionen wurden bei Temperaturen durchgeführt, die sehr nahe an der Schmelztemperatur (Tm) des markierten Oligonukleotids mit der Zielpolynukleotidsequenz lagen.
  • Die obige Diskussion schließt gewisse Theorien über die an der vorliegenden Erfindung beteiligten Mechanismen ein. Diese Theorien sollten nicht so verstanden werden, als daß sie die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise einschränken, da gezeigt wurde, daß die vorliegende Erfindung die beschriebenen Ergebnisse erzielt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001

Claims (16)

  1. Verfahren zur Veränderung eines Oligonukleotids, das Verfahren umfassend das Inkubieren des Oligonukleotids, eines Polynukleotids sowie einer 5'-Nuklease unter isothermen Bedingungen, wobei das Oligonukleotid und das Polynukleotid einen Komplex bilden, der das Oligonukleotid und das Polynukleotid umfaßt und in dem wenigstens ein Anteil desOligonukleotids reversibel an das Polynukleotid hybridisiert ist, wobei die isothermen Bedingungen am oder in der Nähe des Schmelzpunkts des Komplexes liegen und wobei das Oligonukleotid bei Hybridisierung des Anteils an das Polynukleotid von der 5'-Nuklease gespalten wird, um (i) ein erstes Fragment, das mit dem Polynukleotid weitgehend nicht hybridisierbar ist und höchstens fünf Nukleotide vom 5'-Ende des Anteils beinhaltet, und (ii) ein zweites Fragment, das bezüglich des intakten Oligonukleotids 3' vom ersten Fragment liegt und mit dem Polynukleotid weitgehend hybridisierbar ist, bereitzustellen, wodurch dasOligonukleotid verändert wird.
  2. Verfahren des Anspruchs 1, wobei die Menge an gebildeten Fragmenten mindestens das 100-fache der Menge an Polynukleotid beträgt.
  3. Verfahren des Anspruchs 1, wobei ein zweites Oligonukleotid während der Inkubation zugegen ist, wobei das zweite Oligonukleotid an eine Stelle des Polynukleotids hybridisiert, die in 3'-Richtung von der Stelle, an der das Oligonukleotid hybridisiert ist, liegt, und wobei das zweite Oligonukleotid weitgehend nicht reversibel an das Polynukleotid unter den isothermen Bedingungen hybridisiert ist.
  4. Verfahren des Anspruchs 3, wobei das zweite Oligonukleotid an das Polynukleotid an einer Stelle hybridisiert, die unmittelbar an die Stelle auf dem Polynukleotid, an der das Oligonukleotid hybridisiert, grenzt.
  5. Verfahren des Anspruchs 4, wobei die Menge an gebildeten Fragmenten mindestens das 100-fache der Menge an Polynukleotid beträgt.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Schmelztemperatur des an das Polynukleotid hybridisierten zweiten Oligonukleotids wenigstens um 3 °C über der Schmelztemperatur des an das Polynukleotid hybridisierten ersten Oligonukleotids liegt.
  7. Verfahren zum Nachweis eines Polynukleotidanalyten, wobei das Verfahren: (a) das Herstellen einer Mischung aus einer mutmaßlich einen Polynukleotidanalyten enthaltenden Probe, einem Oligonukleotid sowie einer 5'-Nuklease und (b) das Inkubieren der Mischung bei einer Temperatur, bei der das Oligonukleotid reversibel an den Polynukleotidanalyten hybridisiert, wobei das Oligonukleotid einen 5'-Rnteil, der bei dieser Temperatur mit dem Polynukleotidanalyten weitgehend nicht hybridisiert, und einen 3'-Anteil, der bei dieser Temperatur mit dem Polynukleotidanalyten weitgehend hybridisiert, aufweist, wodurch ein Polynukleotidkomplex gebildet wird, der, mindestens den Polynukleotidanalyten und das Oligonukleotid umfaßt, wobei diese Temperatur bei oder in der Nähe der Schmelztemperatur des Komplexes liegt und wobei der Komplex als Substrat für die 5'-Nuklease dient und wobei die 5'-Nuklease während der Inkubation das Oligonukleotid spaltet, wenn das Oligonukleotid an den Polynukleotidanalyten hybridisiert ist, so daß (i) ein erstes Fragment, das mit dem Polynukleotidanalyten weitgehend nicht hybridisierbar ist, und (ii ein zweites Fragment, das bezüglich des intakten Oligonukleotids 3' vom ersten Fragment liegt und mit dem Polynukleotidanalyten weitgehend hybridisierbar ist, bereitgestellt wird, und (c) das Nachweisen der Anwesenheit des' ersten Fragments, des zweiten Fragments oder des ersten und zweiten Fragments, wobei dessen bzw. deren Anwesenheit die Anwesenheit des Polynukleotidanalyten anzeigt, umfaßt.
  8. Verfahren des Anspruchs 7, wobei wenigstens entweder das erste Fragment oder das zweite Fragment eine Markierung aufweist.
  9. Verfahren des Anspruchs 7, wobei das erste Fragment nicht mehr als 5 Nukleotide vom 5'-Ende des reversibel an den Polynukleotidanalyten hybridisierenden Oligonukleotidanteils beinhaltet.
  10. Verfahren des Anspruchs 7, wobei das erste Fragment nicht mehr als ein Nukleotid vom 5'-Ende des an den Polynukleotidanalyten weitgehend hybridisierenden Oligonukleotidanteils beinhaltet.
  11. Verfahren des Anspruchs 7, wobei die Mischung weiterhin ein zweites Oligonukleotid, das an eine Stelle des Polynukleotidanalyten hybridisiert, die in 3'-Richtung von der Stelle liegt, an der das Oligonukleotid hybridisiert, umfaßt und wobei das zweiteOligonukleotid bei der Temperatur weitgehend komplett an den Polynukleotidanalyten hybridisiert ist.
  12. Verfahren des Anspruchs 11, wobei das zweite Oligonukleotid weitgehend nicht reversibel an das Polynukleotid hybridisiert ist.
  13. Verfahren des Anspruchs 11 oder 12, wobei das zweite Oligonukleotid an den Polynukleotidanalyten an einer Stelle hybridisiert, die unmittelbar an die Stelle auf dem Polynukleotidanalyten, an der das Oligonukleotid hybridisiert, grenzt.
  14. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Schmelztemperatur des an das Polynukleotid hybridisierten zweiten Oligonukleotids wenigstens um 3 °C über der Schmelztemperatur des an das Polynukleotid hybridisierten ersten Oligonukleotids liegt.
  15. Verfahren des Anspruchs 8, wobei die Markierung aus der Gruppe bestehend aus einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaars, Farbstoffen, Fluoreszenzmolekülen, Chemilumineszenzmolekülen, Coenzymen, Enzymsubstraten, radioaktiven Gruppen sowie suspendierbaren Partikeln ausgewählt wird.
  16. Verfahren des Anspruchs 7, wobei es sich bei dem Polynukleotidanalyten um DNA handelt.
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