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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
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Zur Untersuchung der Identität und zum
Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäuren wurde die Nukleinsäurehybridisierung
eingesetzt. Die Hybridisierung beruht auf komplementärer Basenpaarung.
Werden komplementäre
einzelsträngige
Nukleinsäuren
zusammen inkubiert, paaren sich die komplementären Basensequenzen zur Ausbildung
von doppelsträngigen
Hybridmolekülen.
Die Fähigkeit
einzelsträngiger
Desoxyribonukleinsäure
(ssDNA) oder Ribonukleinsäure
(RNA), eine wasserstoffverbrückte
Struktur mit einer komplementären
Nukleinsäuresequenz
zu bilden, wurde als analytisches Werkzeug in der molekularbiologischen
Forschung eingesetzt. Die Verfügbarkeit
radioaktiver Nukleosidtriphosphate mit hoher spezifischer Aktivität und die 32P-Markierung von DNA mit T4-Polynukleotidkinase
ermöglichten
die Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung verschiedener
biologisch interessanter Nukleinsäuresequenzen. Die Nukleinsäurehybridisierung
besitzt großes
Potential bei der Diagnose von mit einmalig vorhandenen Nukleinsäuresequenzen
assoziierten Krankheitszuständen.
Diese einmalig vorhandenen Nukleinsäuresequenzen können das
Ergebnis einer genetischen Veränderung
oder einer Umgebungsveränderung
in der DNA durch Insertionen, Deletionen, Punktmutationen oder durch
Aufnahme von Fremd-DNA oder -RNA mittels Infektion mit Bakterien,
Schimmelpilzen, Pilzen und Viren sein. Bis jetzt wurde die Nukleinsäurehybridisierung
vorwiegend in akademischen und industriellen molekularbiologischen
Labors eingesetzt. Aufgrund der häufig sehr niedrigen Konzentrationen von
mit einer Krankheit zusammenhängender,
in der Körperflüssigkeit
eines Patienten vorkommender DNA oder RNA und der Nichtverfügbarkeit
eines ausreichend empfindlichen Verfahrens zur Nukleinsäurehybridisierungsanalyse
ist die Anwendung der Nukleinsäurehybridisierung
als Diagnosewerkzeug in der klinischen Medizin eingeschränkt.
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Bei den derzeitigen Verfahren zum
Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen
wird die Zielnukleinsäure
im allgemeinen auf einem festen Träger wie Nitrocellulosepapier,
Cellulosepapier, diazotiertem Papier oder einer Nylonmembran immobilisiert.
Nach dem Fixieren der Zielnukleinsäure auf dem Träger wird
dieser mit einer in geeigneter Weise markierten Nukleinsäuresonde
etwa zwei bis achtundvierzig Stunden in Kontakt gebracht. Nach Ablauf
der obigen Zeitdauer wird der feste Träger mehrmals unter Temperaturkontrolle
zur Entfernung von nicht hybridisiertem Sondenmaterial gewaschen.
Der Träger
wird danach getrocknet und das hybridisierte Material über Autoradiographie
oder spektrometrische Verfahren bestimmt.
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Die derzeitigen Verfahren sind, falls
sehr niedrige Konzentrationen nachgewiesen werden müssen, langsam
und arbeitsaufwendig, und nichtisotopische Markierungen, die sich
gegenüber
radioaktiven Markierungen weniger leicht nachweisen lassen, sind
häufig
nicht geeignet. Daher ist ein Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit wünschenswert,
um die Verwendung einfacher, schneller, nichtisotopischer, homogener
oder heterogener Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuresequenzen
zu ermöglichen.
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Kürzlich
wurde ein als Polymerasekettenreaktion (PCR) bekanntes Verfahren
zur enzymatischen Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte beschrieben.
Dieser in-vitro-Amplifikationsprozeß verwendet
zwei oder mehr unterschiedliche Oligonukleotidprimer für unterschiedliche
Stränge
der Zielnukleinsäure
und beruht auf wiederholten Zyklen von Denaturierung, Oligonukleotidprimer-Rnnealing
und Primerverlängerung
mittels einer thermophilen Polymerase, was zu einem exponentiellen
Anstieg von Kopien des von den Primern begrenzten Bereichs führt. Die
an entgegengesetzte Stränge
der DNA annealenden unterschiedlichen PCR-Primer werden so positioniert,
daß das
Produkt der von der Polymerase katalysierten Verlängerung
des einen Primers als Vorlagenstrang für den zweiten Primer dienen
kann, wodurch sich diskrete Fragmente anreichern, dessen Länge durch
den Abstand zwischen den 5'-Enden der Oligonukleotidprimer definiert
ist.
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Weitere Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation
sind die Einzelprimeramplifikation, Ligasekettenreaktion (LCR),
die Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis
(NASBA) und das Q-Beta-Replikaseverfahren. Unabhängig von der verwendeten Amplifikation
muß jedoch
das amplifizierte Produkt bestimmt werden.
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Je nachdem, welches der obigen Amplifikationsverfahren
eingesetzt wird, werden in den Verfahren im allgemeinen sieben bis
zwölf oder
mehr Reagenzien eingesetzt. Weiterhin sehen die obigen Verfahren
die exponentielle Amplifikation eines Ziel- oder Reporteroligonukleotids
vor. Dementsprechend ist es notwendig, die Verunreinigung der Testlösungen mit
den amplifizierten Produkten mit allen Mitteln zu vermeiden, um falsch-positive
Ergebnisse zu vermeiden. Für
einige der obigen Verfahren benötigt
man teure Thermocycler-Instrumentierung, und zusätzliche Reagenzien und Schritte
für die
Handhabung der Proben werden zur Bestimmung des amplifizierten Produkts
benötigt.
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Bei den meisten Testverfahren, die
keine Amplifikation einer Ziel-DNA beinhalten, wird das Verunreinigungsproblem
vermieden, aber diese Verfahren sind weder hinreichend empfindlich
noch einfach. Bei einigen Verfahren kommt eine gewisse Art von Größentrennung,
wie z. B. die Elektrophorese, zum Einsatz, was diese Verfahren weiter
verkompliziert.
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Bei einem Verfahren zum Nachweis
von Nukleinsäuren
werden Nukleinsäuresonden
eingesetzt. Ein Verfahren zur Benutzung solcher Sonden ist im U.
S . -Patent Nr. 4, 868, 104 beschrieben, dessen Offenbarung hiermit
unter Bezugnahme aufgenommen wird. Eine Nukleinsäuresonde kann oder kann potentiell
mit einer Reportergruppe markiert oder kann oder kann potentiell
an einen Träger
gebunden werden.
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Der Signalnachweis hängt von
der Beschaffenheit der Markierung oder der Reportergruppe ab. Handelt
es sich bei der Markierung oder der Reportergruppe um ein Enzym,
so gehören
Enzymsubstrate usw. ebenfalls zu dem signalproduzierenden System.
Bei dem Produkt der Enzymreaktion handelt es sich vorzugsweise um
ein lumineszierendes Produkt oder um einen Fluoreszenz- oder Nicht-Fluoreszenzfarbstoff,
der jeweils spektrophotometrisch bestimmt werden kann, oder um ein
Produkt, das mit anderen spektrometrischen oder elektrometrischen
Mitteln bestimmt werden kann. Ist die Markierung ein Fluoreszenzmolekül, läßt sich das
Medium bestrahlen und die Fluoreszenz bestimmen. Falls die Markierung
eine radioaktive Gruppe ist, kann man die Radioaktivität im Medium
durch Zählen
bestimmen.
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Es ist daher wünschenswert, über ein
empfindliches, einfaches Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuren zu
verfügen.
Durch das Verfahren sollten die Anzahl und Komplexität der Schritte
und Reagenzien auf ein Minimum reduziert werden. Die Notwendigkeit
einer Sterilisation und anderer zur Verhinderung einer Verunreinigung
der Testmischungen benötigter
Schritte sollte vermieden werden.
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Beschreibung
des Standes der Technik
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Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen
werden in Duck, et al., im U.S.-Patent Nr. 5, 011, 769 sowie in
der entsprechenden internationalen Patentanmeldung WO 89/10415 erörtert. Ein
Verfahren zur Spaltung eines Nukleinsäuremoleküls ist aus der europäischen Patentanmeldung
0 601 834 Al (Dahlberg, et al.) bekannt.
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Von Holland, et al., Clinical Chemistrv
(1992) 38: 462-463, wird der Nachweis eines spezifischen Polymerasekettenreaktionsprodukts
durch Ausnutzung der 5'- nach -3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase
aus Thermus aguaticus beschrieben. In Longley, et al., Nucleic Acids
Research (1990) 18: 7317–7322
wird die Charakterisierung der mit der DNA-Polymerase aus Thermus
aguaticus assoziierten 5`- nach -3'-Exonuklease
erörtert.
Aus Lyamichev, et al., Science (1993) 260: 778–783, ist die strukturspezifische
endonukleolytische Spaltung von Nukleinsäuren durch eubakterielle DNA-Polymerasen
bekannt.
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Ein Verfahren zum Amplifizieren,
Bestimmen und/oder Klonieren von Nukleinsäuresequenzen ist aus den U.S.-Patenten Nr. 4, 683,
195, 4, 683, 202, 4, 800, 159, 4, 965, 188 und 5,008,182 bekannt.
Die Sequenzpolymerisation mittels Polymerasekettenreaktion wird
von Saiki, et al., (1986), Science, 230: 1350-1354 beschrieben.
Die primergerichtete enzymatische DNA-Amplifikation mit einer thermostabilen
DNA-Polymerase wird von Saiki, et al., Science (1988) 239: 487 beschrieben.
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In den U.S.-Patentanmeldungen mit
den Serien-Nrn. 07/299,282 und 07/399,795, eingereicht am 19. Januar
1989 bzw. 29. August 1989 (die der EP-Patentschrift Nr. 379,369
entsprechen), wird die Nukleinsäureamplifikation
mit einem einzigen Polynukleotidprimer beschrieben.
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Weitere, eine Nukleinsäureamplifikation
herbeiführende
Verfahren sind in Van Brunt Bio/Technoloav (1990) 8(Nr.4): 291–294 beschrieben.
Zu diesen Verfahren zählen
die Ligasekettenreaktion (Ligase Chain Reaction, LCR), die Amplifikation
auf Nukleinsäurebasis
(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA) sowie die Amplifikation
von RNA mittels Q-beta-Replikase. Die LCR wird ebenfalls in den
europäischen
Patentanmeldungen Nr. 439,182 (Backman I) und 473,155 (Backman II)
erörtert.
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Bei der NASBA handelt es sich um
ein Promotorgesteuertes, isothermes enzymatisches Verfahren, bei
dem in vitro eine kontinuierliche, homogene und isotherme Amplifikation
einer spezifischen Nukleinsäure durchgeführt wird.
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Das Q-beta-Replikaseverfahren beruht
auf der Fähigkeit
der Q-beta-Replikase, sein RNA-Substrat unter isothermen Bedingungen
exponentiell zu amplifizieren.
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Ein weiteres Verfahren zum Durchführen einer
Amplifikation von Nukleinsäuren
wird als Strangverdrängungsamplifikation
(Strand Displacement Amplification, SDA) bezeichnet. Bei der SDA
handelt es sich um eine isotherme, in-vitro DNA-Amplifikationstechnik,
die auf der Fähigkeit
eines Restriktionsenzyms, den unmodifizierten Strang einer Hemiphosphorothioatform
seiner Restriktionsstelle zu „nicken",
sowie der Fähigkeit
einer DNR-Polymerase, die Replikation an diesem „Nick" zu initiieren und den
stromabwärts
gelegenen Nichtvorlagenstrang in intakter Form zu verdrängen, beruht.
Die exponentielle Amplifikation wird von den die Erkennungsstellen
für das „Nicking"-Restriktionsenzym
enthaltenden Primern gesteuert.
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Ein weiteres Amplifikationsverfahren
zur Amplifikation von Nukleinsäuren
ist unter dem Namen 3SR bekannt, wobei es sich um ein RNA-spezifisches
Zielverfahren handelt, durch das RNA in einem isothermen Prozeß, in dem
Promotor-gesteuerte RNA-Polymerase, reverse Transkriptase und RNase
H mit der Ziel-RNA kombiniert werden, amplifiziert wird.
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In WO 92/02638 wird ein Nachweisverfahren,
bei dem eine 5`-Nuklease, ein Primer und ein Oligonukleotid verwendet
werden, gelehrt. Eine Reaktion unter isothermen Bedingungen bei
oder in der Nähe
der Schmelztemperatur des Sonde/Ziel-Komplexes, wobei die Sonde
und das Ziel reversibel hybridisieren oder wobei sich ein Gleichgewicht
zwischen dem Ziel, der Sonde und dem Sonde/Ziel-Komplex einstellt,
wird dort allerdings nicht erwähnt.
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In EP-A 0 601 834 wird die Inkubation
einer Spaltstruktur (an ein Polynukleotid hybridisiertes Zielmolekül) und eines
Spaltmittels unter Bedingungen, bei denen eine Spaltung stattfinden
kann, gelehrt. In EP-A 0 601 834 ist das Zielmolekül und nicht
das Oligonukleotid das zu spaltende Molekül. Weiterhin werden in EP-A 601
834 keine Reaktionsbedingungen bei oder in der Nähe der Schmelztemperatur des
Ziel/Oligonukleotid-Komplexes, wobei die Sonde und das Ziel reversibel
hybridisieren oder wobei sich ein Gleichgewicht zwischen der Sonde,
dem Ziel und dem Sonde/Ziel-Komplex einstellt, erwähnt.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Bei einem Aspekt der vorliegenden
Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Veränderung
eines Oligonukleotids. Das Verfahren umfaßt das Inkubieren des Oligonukleotids
mit einem Polynukleotid sowie einer 5'-Nuklease, wobei wenigstens
ein Anteil des Oligonukleotids unter isothermen Bedingungen bei
oder in der Nähe
der Schmelztemperatur des Hybridisierungskomplexes reversibel an
das Polynukleotid hybridisiert wird. Das Oligonukleotid wird dabei
gespalten, um (i) ein erstes Fragment, das mit dem Polynukleotid
weiterhin nicht hybridisierbar ist und höchstens fünf Nukleotide vom 5'-Ende des
Anteils beinhaltet, und (ii) ein zweites Fragment, das bezüglich des
intakten Oligonukleotids 3' vom ersten Fragment liegt und mit dem
Polynukleotid weitgehend hybridisierbar ist, bereitzustellen.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis eines Polynukleotidanalyten,
wie in Anspruch 7 definiert. Dabei wird ein Oligonukleotid unter
isothermen Bedingungen reversibel mit einem Polynukleotidanalyten
und einer 5'-Nuklease hybridisiert. Der Polynukleotidanalyt dient
als ein Erkennungselement, um einer 5'-Nuklease die Spaltung des
Oligonukleotids zu ermöglichen,
so daß (i)
ein erstes Fragment, das mit dem Polynukleotidanalyten weitgehend
nicht hybridisierbar ist, und (ii) ein zweites Fragment, das 3'
vom ersten Fragment (im intakten Oligonukleotid) liegt und das mit
dem Polynukleotidanalyten weitgehend hybridisierbar ist, bereitgestellt
werden. Man erhält
mindestens einen 100-fachen molaren Überschuß des ersten Fragments und/oder
des zweiten Fragments relativ zur Molmenge des Polynukleotidanalyten.
Die Anweisenheit des ersten Fragments und/oder des zweiten Fragments
wird bestimmt und zeigt die Anwesenheit des Polynukleotidanalyten
an.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Polynukleotidanalyten um DNA.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Bei den 1-3 handelt
es sich um schematische Darstellungen unterschiedlicher Ausführungsformen
im Sinne der vorliegenden Erfindung.
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Beschreibung
der spezifischen Ausführungsformen
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Die vorliegende Erfindung gestattet
die katalysierte Spaltung eines Oligonukleotids, das durch einen Anteil
eines Polynukleotidanalyten, wie z. B. eines eine Zielpolynukleotidsequenz,
an die ein Teil des Oligonukleotids hybridisiert, umfassenden Polynukleotids,
moduliert wird. Somit sorgen die Verfahren der vorliegenden Erfindung
für sehr
hoch empfindliche Tests für
Polynukleotidanalyten. Die Verfahren sind einfach durchzuführen, und
ein Temperaturcycling ist nicht erforderlich. Folglich wird keine
teure thermocyclische Instrumentation benötigt. Weiterhin werden nur
wenige Reagenzien verwendet, so daß sich der Kosten- und Arbeitsaufwand für einen
Test weiter verringert. Außerdem
erlaubt das Fehlen amplifizierter Produkte, die potentielle Amplifikationsziele
darstellen, den Einsatz von weniger starken Mitteln zur Vermeidung
der Verunreinigung von Testlösungen
mit Zielsequenzen, die zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnte.
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Bevor mit einer Beschreibung der
spezifischen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, sollen eine Reihe
von Ausdrücken
definiert werden.
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Polynukleotidanalyt -- eine zu messende
Verbindung oder Zusammensetzung, bei der es sich um ein polymeres
Nukleotid handelt, das in seinem intakten natürlichen Zustand etwa 20 bis
500.000 oder mehr Nukleotide und in einem isolierten Zustand etwa
30 bis 50.000 oder mehr Nukleotide, gewöhnlich etwa 100 bis 20.000
Nukleotide, häufiger
500 bis 10.000 Nukleotide, aufweisen kann. Die Isolierung von Analyten
aus dem natürlichen
Zustand, insbesondere von denen mit einer großen Anzahl an Nukleotiden,
führt häufig zu
einer Fragmentierung. Zu den Polynukleotidanalyten gehören Nukleinsäuren aus
jeder beliebigen Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form,
einschließlich
DNA (dsDNA und ssDNA) und RNA, einschließlich t-RNA, m-RNA, r-RNA,
mitochondriale DNA und RNA, Chloroplasten-DNA und -RNA, DNA-RNR-Hybride
oder deren Mischungen, Gene, Chromosomen, Plasmide, die Genome von
biologischem Material wie z. B. Mikroorganismen, z. B. Bakterien,
Hefen, Viren, Viroide, Schimmelpilze, Pilze, Pflanzen, Tiere, Mensch,
und deren Fragmente, und ähnliches.
Bevorzugte Polynukleotidanalyte sind doppelsträngige DNA (dsDNA) und einzelsträngige DNA
(ssDNA). Der Polynukleotidanalyt kann lediglich einen kleineren
Anteil einer komplexen Mischung wie z. B. einer biologischen Probe
darstellen. Der Analyt kann aus verschiedenem biologischem Material
mittels im Fachgebiet gut bekannter Verfahren erhalten werden. Einige
Beispiele für
ein solches biologisches Material sind zur Erläuterung, aber nicht einschränkend, in
der folgenden Tabelle I offenbart.
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Tabelle I
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Zu den infragekommenden Mikroorganismen
gehören:
Gegebenenfalls
kann der Polynukleotidanalyt zur Spaltung des Analyten behandelt
werden, um ein eine Zielpolynukleotidsequenz enthaltendes Polynukleotid
zu erhalten, zum Beispiel durch Scherung oder durch Behandlung mit
einer Restriktionsendonuklease oder einem anderen stellenspezifischen
chemischen Spaltungsverfahren. Es ist jedoch ein Vorteil der vorliegenden
Erfindung, daß der
Polynukleotidanalyt in seinem isolierten Zustand ohne weitere Spaltung
verwendet werden kann.
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Im Sinne dieser Erfindung wird der
Polynukleotidanalyt oder ein aus dem Polynukleotidanalyten erhaltenes
Spaltpolynukleotid normalerweise mindestens teilweise denaturiert
oder liegt in einzelsträngiger
Form vor oder wird so behandelt, daß er bzw. es in denaturierter
oder einzelsträngiger
Form vorliegt. Solche Behandlungen sind im Fachgebiet gut bekannt
und schließen
beispielsweise Wärme-
oder Alkalibehandlung ein. So läßt sich
beispielsweise doppelsträngige
DNA auf 90 bis 100°C über eine
Zeitdauer von etwa 1 bis 10 Minuten zur Herstellung von denaturiertem
Material erhitzen.
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3'- bzw. 5'-Ende eines Oligonukleotids
-- in der hier verwendeten Form bezieht sich diese Formulierung auf
einen Anteil eines Oligonukleotids, der den 3'- bzw. 5'-Terminus
des Oligonukleotids umfaßt.
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3'- bzw. 5' -Terminus eines Oligonukleotids
-- in der hier verwendeten Form bezieht sich dieser Ausdruck auf
das terminale Nukleotid am 3'- bzw. 5'-Ende eines Oligonukleotids.
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Zielpolynukleotidsequenz -- eine
Sequenz zu identifizierender Nukleotide, bei der es sich um den
Polynukleotidanalyten handeln kann, die jedoch normalerweise innerhalb
eines den Polynukleotidanalyten umfassenden Polynukleotids vorkommt.
Die Identität
der Zielpolynukleotidsequenz ist in einem ausreichenden Maß bekannt,
so daß die
Herstellung eines Oligonukleotids mit einem Anteil oder einer Sequenz,
der bzw. die mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert, ermöglicht wird.
Im allgemeinen hybridisiert bei der Verwendung eines Oligonukleotids
dieses mit dem 5'-Ende der Zielpolynukleotidsequenz. Wird ein zweites
Oligonukleotid eingesetzt, so hybridisiert dieses an einer Stelle
der Zielpolynukleotidsequenz, die sich 3' von der Stelle, an der
das erste Oligonukleotid hybridisiert, befindet. (Es sollte hier
angemerkt werden, daß sich
die Beziehung in bezug auf das bei der Hybridisierung des ersten
und des zweitenOligonukleotids an das Polynukleotid gebildete Doppelstrangmolekül betrachten
läßt. In einem
solchen Zusammenhang liegt das zweite Oligonukleotid 5' -wärts vom
erstenOligonukleotid in bezug auf den „Strang", der das erste und
das zweite Oligonukleotid umfaßt.)
Die oben beschriebenen Beziehungen sind unter Bezugnahme auf 3 klarer zu erkennen. Die
Zielpolynukleotidsequenz enthält
gewöhnlich
etwa 10 bis 1.000 Nukleotide, vorzugsweise 15 bis 100 Nukleotide und
weiter bevorzugt 20 bis 70 Nukleotide. Die Zielpolynukleotidsequenz
ist Teil eines Polynukleotids, bei dem es sich um den gesamten Polynukleotidanalyten
handeln kann. In der Zielpolynukleotidsequenz wird die geringst
mögliche
Anzahl an Nukleotiden ausgewählt,
um sicherzustellen, daß die
Anwesenheit der Zielpolynukleotidsequenz in einer Probe ein spezifischer
Indikator für
die Anwesenheit des Polynukleotidanalyten in einer Probe ist. Sehr
grob gesagt, ist die Sequenzlänge
normalerweise größer als
etwa 1,6 log L Nukleotide, wobei L die Anzahl an Basenpaaren im
Genom der biologischen Quelle der Probe ist. Die Anzahl an Nukleotiden
in der Zielsequenz ist normalerweise die Gesamtlänge von denjenigen Anteilen
der Oligonukleotide, die mit der Zielsequenz hybridisieren, plus
die Anzahl an Nukleotiden, die zwischen den Anteilen der Zielsequenz,
die mit den Oligonukleotiden hybridisieren, liegen.
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Oligonukleotid -- ein Polynukleotid, üblicherweise
ein synthetisches Polynukleotid, üblicherweise einzelsträngig, das
so konstruiert wird, daß wenigstens
ein Anteil davon mit der Zielpolynukleotidsequenz des Polynukleotids
hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide
besitzen normalerweise eine Länge
von 10 bis 150 Nukleotiden und sind vorzugsweise Desoxyoligonukleotide
mit einer Länge
von 15 bis 100 Nukleotiden, und weiter bevorzugt 20 bis 60 Nukleotiden.
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Das erste Oligonukleotid bzw. „das"Oligonukleotid,
falls kein zweites Oligonukleotid eingesetzt wird, weist ein 5'-Ende
mit einer Länge
von etwa 0 bis 100 Nukleotiden, vorzugsweise 1 bis 20 Nukleotiden,
welches nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert, sowie
normalerweise eine Sequenz aus 10 bis 40 Nukleotiden auf, die mit
der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert. Im allgemeinen verringert
sich mit zunehmender Länge
des Anteils des Oligonukleotids, der nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz
hybridisiert, der Amplifikationsgrad etwas. Das erste Oligonukleotid
kann auch eine Sequenz an seinem 3'-Ende aufweisen, die nicht mit der
Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert. Das zweite Oligonukleotid
hybridisiert vorzugsweise an seinem 3'-Ende mit der Zielpolynukleotidsequenz,
und zwar an einer Stelle auf der Zielpolynukleotidsequenz, die 3'- von
der Bindungsstelle des ersten Oligonukleotids liegt. Die Länge des
Anteils des zweiten Oligonukleotids, der mit der Zielpolynukleotidsequenz
hybridisiert, ist normalerweise größer als die Länge des
Anteils des ersten Oligonukleotids, der mit der Zielpolynukleotidsequenz
hybridisiert, und beträgt
normalerweise 20 bis 100 Nukleotide. Die Schmelztemperatur des an
die Zielpolynukleotidsequenz hybridiserten zweiten Oligonukleotids
ist vorzugsweise wenigstens so hoch wie und besonders bevorzugt
wenigstens 5°C
höher als
die Schmelztemperatur des an die Zielpolynukleotidsequenz hybridisierten
ersten Oligonukleotids.
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Bei den Oligonukleotiden kann es
sich um Oligonukleotid-Mimics,
wie z. B. Polynucleopeptide, Phosphorothioate oder Phosphonate,
handeln, außer
daß das
erste Oligonukleotid normalerweise wenigstens eine Phosphodiesterbindung
zu dem Nukleosid am 5'-Ende der Sequenz, die mit der Zielpolynukleotidsequenz
hybridisiert, aufweist. Werden Oligonukleotid-Mimics, die für eine sehr
starke Bindung sorgen, verwendet, wie z. B. Polynucleopeptide, so
läßt sich
die Länge
des Anteils des zweiten Oligonukleotids, der mit der Zielpolynukleotidsequenz
hybridisiert, auf weniger als 20 und, vorzugsweise, mehr als 10
Nukleotide verkleinern.
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Zur Herstellung eines Oligonukleotids
oder anderer in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polynukleotide
lassen sich verschiedene Techniken einsetzen. Diese können mittels
biologischer Synthese oder chemischer Synthese erhalten werden.
Für kurze
Oligonukleotide (bis zu etwa 100 Nukleotiden) ist die chemische
Synthese häufig
wirtschaftlicher als eine biologische Synthese. Neben Wirtschaftlichkeit
stellt die chemische Synthese einen bequemen Weg zur Verfügung, niedrigmolekulare
Verbindungen und/oder modifizierte Basen während des Syntheseschrittes
einzubauen. Weiterhin zeigt sich die chemische Synthese sehr flexibel bei
der Wahl der Länge
und des Bereichs der Zielpolynukleotidsequenz. Die Oligonukleotide
lassen sich mit Standardverfahren wie etwa denjenigen, die in kommerziellen
automatischen Nukleinsäuresyntheseapparaturen
verwendet werden, synthetisieren. Die chemische Synthese von DNA
an geeignet modifiziertem Glas oder Harz führt zu kovalent an diese Oberfläche gebundener
DNA. Dadurch können
sich Vorteile beim Waschen und Handhaben der Probe ergeben. Für längere Sequenzen
lassen sich in der Molekularbiologie eingesetzte Standardreplikationsverfahren
verwenden, wie z. B. die Verwendung von M13 bei einzelsträngiger DNA,
wie beschrieben von J. Messing (1983) Methods Enzymol, 101, 20–78.
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Neben Standardklonierungstechniken
können
in vitro enzymatische Verfahren wie z. B. Polymerase-katalysierte
Reaktionen verwendet werden. Für
die Herstellung von RNA lassen sich T7-RNA-Polymerase und eine geeignete
DNA-Vorlage verwenden.
Für DNA
sind die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Einzelprimeramplifikation
geeignet.
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Weitere chemische Verfahren zur Polynukleotid-
oder Oligonukleotidsynthese schließen die Phosphotriester- und
Phosphodiesterverfahren (Narang, et al., Meth. Enzvmol (1979) 68:
90) und Synthese auf einem Träger
(Beaucage, et al., Tetrahedron (1981) Letters 22: 1859–1862) ebenso
wie Phosphoramidattechniken, Caruthers, M. H., et al., „Methods
in Enzymology", Band 154, Seiten 287–314 (1988) und weitere in „Synthesis and
Applications of DNA and RNA", S. A. Narang, Herausgeber, Academic
Press, New York, 1987 und den darin zitierten Literaturstellen beschriebenen
Verfahren ein.
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Fragment – im allgemeinen wird im vorliegenden
Verfahren dasOligonukleotid (bzw. das erste Oligonukleotid, falls
ein zweites Oligonukleotid eingesetzt wird) nur dann gespalten,
wenn wenigstens ein Anteil davon reversibel mit einer Zielpolynukleotidsequenz
hybridisiert wird und somit die Zielpolynukleotidsequenz als ein
Erkennungselement für
die Spaltung des Oligonukleotids dient, wodurch sich zwei Anteile
ergeben. Ein Fragment ist weitgehend nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz
hybridisierbar. Das andere Fragment is weitgehend mit der Zielpolynukleotidsequenz
hybridisierbar und liegt 3'- von dem anderen Fragment in bezug auf das
Oligonukleotid in seiner ungespaltenen Form.
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5'-Nuklease – ein sequenz-unabhängiges Desoxyribonuklease-Enzym,
das die Spaltung eines Oligonukleotids in Fragmente nur dann katalysiert,
wenn wenigstens ein Anteil des Oligonukleotids an die Zielpolynukleotidsequenz
hybridisiert ist. Das Enzym spaltet das Oligonukleotid selektiv
in der Nähe
des 5'-Terminus des gebundenen Anteils, und zwar höchsten 5
Nukleotide davon entfernt, vorzugsweise 1 bis 2 Nukleotide davon
entfernt, und spaltet dabei weder das nicht hybridisierte Oligonukleotid
noch die Zielpolynukleotidsequenz. Zu diesen Enzymen zählen sowohl
5'-Exonukleasen als auch 5'-Endonukleasen, jedoch nicht Ribonukleasen wie
z. B. RNAse H und ebenso nicht Restriktionsenzyme. Für die vorliegende
Erfindung geeignete 5'-Nukleasen müssen unter den im vorliegenden
Verfahren verwendeten isothermen Bedingungen stabil sein und daher handelt
es sich bei ihnen normalerweise um temperaturstabile Nukleotidpolymerasen
mit 5'-Exonukleaseaktivität,
wie z. B. Taq-DNA-Polymerase
(z. B. AmpliTaq(TM) von Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, N.J.),
Thermalase Tbr(TM) DNA-Polymerase
(von Amresco, Solon, Ohio), Ultra Therm(TM) DNA-Polymerase (von Bio/Can
Scientific, Ontario, Canada), Replitherm(TM) DNA-Polymerase (von
Epicentre, Madison, Wisconsin), Tfl(TM) DNA-Polymerase (von Epicentre),
Panozyme(TM) DNA-Polymerase (von Panorama Research, Mountain View,
California), Tth(TM) DNR-Polymerase (von Epicentre), rBst(TM) DNA-Polymerase
(von Epicentre), Heat Tuff(TM) DNA-Polymerase (von Clontech, Palo
Alto, California) u. ä.,
die aus einer beliebigen Quelle wie z. B. Zellen, Bakterien wie
z. B. E. coli, Pflanzen, Tieren, Viren, thermophilen Bakterien usw.
stammen können, wobei
die Polymerase zur Herbeiführung
von Temperaturstabilität
und/oder erhöhter
Aktivität
chemisch oder gentechnisch modifiziert werden kann.
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Isotherme Bedingungen – eine gleichmäßig verteilte
oder konstante Temperatur, bei der die Modifikation des Oligonukleotids
im Sinne der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird. Die Temperatur wird
so gewählt,
daß das
durch Hybridisierung des Oligonukleotids an ein Polynukleotid mit
einer Zielpolynukleotidsequenz gebildete Duplex im Gleichgewicht
mit dem freien oder unhybridisiertenOligonukleotid und der freien oder
unhybridisierten Zielpolynukleotidsequenz steht, eine Bedingung,
die hier anderswo als „reversibles
Hybridisieren" des Oligonukleotids mit einem Polynukleotid bezeichnet
wird. Normalerweise wird mindestens 1%, vorzugsweise 20 bis 80%, üblicherweise
weniger als 95% des Polynukleotids unter den isothermen Bedingungen
an das Oligonukleotid hybridisiert.
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Entsprechend gibt es unter isothermen
Bedingungen Polynukleotidmoleküle,
die mit dem Oligonukleotid oder Teilen davon hybridisiert sind und
in dynamischem Gleichgewicht mit Molekülen, die nicht mit dem Oligonukleotid
hybridisiert sind, stehen. Die Temperatur kann etwas schwanken und
dennoch die Vorzüge
der vorliegenden Erfindung erzielen. Diese Schwankung ist im allgemeinen
zur Durchführung
der Verfahren der vorliegenden Erfindung unnötig und bietet üblicherweise
keine wesentliche Verbesserung.
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Entsprechend schließt der Ausdruck „isotherme
Bedingungen" die Verwendung von Temperaturschwankungen, besonders
von beliebigen oder unkontrollierten Temperaturschwankungen ein,
doch ist die als Thermocycling bezeichnete Temperaturschwankung,
die in einigen bekannten Amplifikationsverfahren, z. B. der Polymerasekettenreaktion,
eingesetzt wird, spezifisch ausgeschlossen.
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Polynukleotidprimer bzw. Oligonukleotidprimer – ein Oligonukleotid,
das normalerweise in einer Kettenverlängerung an einer Polynukleotidmatrize
eingesetzt wird.
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Nukleosidtriphosphate – Nukleoside
mit einem 5'-Triphosphatsubstituenten. Bei den Nukleosiden handelt
es sich um Pentosezuckerderivate stickstoffhaltiger Basen, die sich
entweder von Purin oder Pyrimidin ableiten und kovalent an den 1'-Kohlenstoff
des Pentosezuckers, der üblicherweise
eine Desoxyribose oder eine Ribose ist, gebunden sind. Zu den Purinbasen
gehören
Adenin (A), Guanin (G), Inosin sowie deren Derivate und Analoge.
Zu den Pyrimidinbasen zählen
Cytosin (C), Thymin (T), Uracil (U) sowie deren Derivate und Analoge.
Zu den Nukleosidtriphosphaten gehören Desoxyribonukleosidtriphosphate
wie z. B. dATP, dCTP, dGTP und dTTP und Ribonukleosidtriphosphate
wie z. B. rATP, rCTP, rGTP und rUTP. Der Ausdruck „Nukleosidtriphosphate"
schließt
ebenfalls Derivate und Analoge davon ein.
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Nukleotid – eine Basen-Zucker-Phosphatkombination,
die die Monomereinheit von Nukleinsäurepolymeren, d. h. DNA und
RNA, darstellt.
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Nukleotid – ist eine Basen-Zuckerkombination
oder ein Nukleotid ohne einen Phosphatanteil.
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Nukleotidpolymerase – ein Katalysator, üblicherweise
ein Enzym, zur Bildung einer Verlängerung eines Oligonukleotids
entlang einer Polynukleotid-Vorlage, wobei die Verlängerung
dazu komplementär
ist. Die Nukleotidpolymerase ist einevorlageabhängige Polynukleotidpolymerase
und verwendet Nukleosidtriphosphate als Bausteine für die Verlängerung
des 3'-Endes eines
Oligonukleotids, um eine Sequenz zur Verfügung zu stellen, die zu dem
einzelsträngigen
Teil des Polynukleotids, an den das Oligonukleotid unter Ausbildung
eines Duplex hybridisiert, komplementär ist.
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Hybridisierung (hybridisieren) und
Bindung – im
Zusammenhang mit Nukleotidsequenzen werden diese Ausdrücke hier
miteinander austauschbar verwendet. Die Fähigkeit zweier Nukleotidsequenzen,
miteinander zu hybridisieren, beruht auf dem Komplementaritätsgrad der
zwei Nukleotidsequenzen, der wiederum auf dem Anteil an passenden
komplementären
Nukleotidpaaren beruht. Je mehr zu einer anderen Sequenz komplementäre Nukleotide
in einer gegebenen Sequenz vorliegen, desto stringenter dürfen die
Bedingungen für die
Hybridisierung sein und desto spezifischer ist die Bindung der zwei
Sequenzen. Eine erhöhte
Stringenz läßt sich
durch Erhöhung
der Temperatur, Erhöhung
des Cosolventienverhältnisses, Erniedrigung
der Salzkonzentration und ähnliches
erzielen.
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Homolog oder im wesentlichen identisch – Im allgemeinen
sind zwei Polynukleotidsequenzen, die entweder identisch sind oder
jeweils an die gleiche Polynukleotidsequenz hybridisieren können, homolog.
Die beiden Sequenzen sind homolog oder im wesentlichen identisch,
wenn die Sequenzen jeweils mindestens 90%, vorzugsweise 100%, derselben
oder analogen Basensequenz besitzen, wobei Thymin (T) und Uracil
(U) als gleich angesehen werden. Somit nimmt man die Ribonukleotide
A, U, C und G als Analoge für
die Desoxynukleotide dA, dT, dC bzw. dG. Von zwei homologen Sequenzen
können
beide aus DNA oder eine aus DNA und die andere aus RNA bestehen.
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Komplementär – Zwei Sequenzen sind komplementär, wenn
die eine Sequenz an die andere Sequenz in einer antiparallelen Weise
binden kann, wobei das 3'-Ende jeder Sequenz an das 5'-Ende der
jeweils anderen Sequenz bindet und jedes A, T(U), G und C der einen
Sequenz auf jeweils ein T (U), A, C bzw. G der anderen Sequenz ausgerichtet
wird.
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Kopie – bedeutet eine Sequenz, die
eine direkte identische oder homologe Kopie einer einzelsträngigen Polynukleotidsequenz
ist, im Unterschied zu einer Sequenz, die komplementär zu der
Sequenz eines solchen einzelsträngigen
Polynukleotids ist.
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Mitglied eines spezifischen Bindungspaars
(„sbp-Mitglied") – eines
von zwei unterschiedlichen Molekülen,
mit einer auf der Oberfläche
oder in einer Höhlung
befindlichen Fläche,
die spezifisch an eine besondere räumliche und polare Struktur
des anderen Moleküls
bindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Die Mitglieder
des spezifischen Bindungspaars werden auch als Ligand und Rezeptor
(Antiligand) bezeichnet. Bei diesen kann es sich um Mitglieder eines
immunologischen Paares wie z. B. Antigen-Antikörper oder um Operator-Repressor-, Nuklease-Nukleotid-,
Biotin-Avidin-, Hormon-Hormonre.zeptor-Paare,
Nukleinsäureduplexe,
IgG-Protein A-, DNA-DNA-, DNA-RNA- und ähnliche Paare handeln.
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Ligand – eine beliebige Verbindung,
für die
es natürlicherweise
einen Rezeptor gibt oder für
die ein solcher Rezeptor hergestellt werden kann.
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Rezeptor („Antiligand") – eine beliebige
Verbindung oder Zusammensetzung, die zur Erkennung einer besonderen
räumlichen
und polaren Struktur eines Moleküls,
z. B. eines Epitops oder einer Determinante, fähig ist. Zu beispielhaften
Rezeptoren zählen
natürlich
vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme,
Fab-Fragmente, Lectine, Nukleinsäuren,
Repressoren, Schutzenzyme, Protein A, Komplementkomponente C1q,
DNA-bindende Proteine oder Liganden und ähnliche.
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Kleines organisches Molekül – eine Verbindung
mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500, vorzugsweise 100
bis 1000, weiter bevorzugt 300 bis 600, wie z. B. Biotin, Fluorescein,
Rhodamin und andere Farbstoffe, Tetracyclin und andere proteinbindende
Moleküle,
und Haptene, usw. Bei dem kleinen organischen Molekül kann es
sich um ein Mittel zur Anbindung einer Nukleotidsequenz an eine
Markierung oder an einen Träger
handeln oder es kann selbst eine Markierung darstellen.
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Träger oder Oberfläche – ein poröses oder
nichtporöses
wasserunlösliches
Material. Der Träger
kann hydrophil sein oder hydrophil gemacht werden und umfaßt anorganische
Pulver wie z. B. Silica, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche Polymermaterialien,
besonders Cellulosematerialien und aus Cellulose abgeleitete Materialien
wie z. B. faserhaltige Papiere, z. B. Filterpapier, Chromatographiepapier,
usw.; synthetische oder modifizierte, natürlich vorkommende Polymere
wie z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid,
quervernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen,
Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat),
Nylon, Poly(vinylbutyrat), usw.; entweder allein oder in Verbindung
mit anderen Materialien verwendet; als Bioglass erhältliches
Glas, Keramik, Metalle und ähnliches.
Natürliche
oder synthetische Zusammensetzungen wie z. B. Liposomen, Phospholipidvesikel und
Zellen lassen sich ebenfalls einsetzen.
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Die Bindung von sbp-Mitgliedern an
einen Träger
oder an eineOberfläche
kann mittels bekannter Techniken, die üblicherweise aus der Literatur
erhalten werden, bewerkstelligt werden. Siehe beispielsweise „Immobilized
Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas,
J. Biol. Chem., 245: 3059 (1970). Die Oberfläche kann in einer Anzahl von
Formen, wie z. B. Streifen, Stäbchen,
Partikel, einschließlich
Kügelchen,
und ähnliches,
vorliegen.
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Markierung oder Reportergruppe oder
Reportermolekül – ein Mitglied
eines signalproduzierenden Systems. üblicherweise ist die Markierung
oder die Reportergruppe oder das Reportermolekül an ein Oligonukleotid oder
ein Nukleosidtriphosphat konjugiert oder wird daran gebunden oder
davon getrennt und ist in der Lage, direkt oder durch eine spezifische
Bindungsreaktion bestimmt zu werden, und kann ein bestimmbares Signal
produzieren. Allgemein läßt sich
jede bestimmbare Markierung verwenden. Die Markierung kann isotop oder
nichtisotop, üblicherweise
nichtisotop, sein und kann ein Katalysator, z. B. ein Enzym oder
ein katalytischer Polynukleotid, ein Promotor, Farbstoff, fluoreszentes
Molekül,
Chemilumineszierer, Coenzym, Enzymsubstrat, eine radioaktive Gruppe,
ein kleines organisches Molekül,
eine amplifizierbare Polynukleotidsequenz, ein Partikel, z. B. ein
Partikel aus Latex oder Kohlenstoff, ein Metallsol, Kristallit,
Liposom, eine Zelle usw. sein, und kann gegebenenfalls weiter mit
einem Farbstoff, Katalysator oder einer anderen bestimmbaren Gruppe und ähnlichem
markiert sein. Zu den Markierungen zählt auch eine Oligonukleotid-
oder spezifische Polynukleotidsequenz, die eine Vorlage zur Amplifikation
oder Ligation liefert oder als Ligand, z. B. für ein Repressorprotein, fungiert.
Die Markierung ist ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems
und kann ein bestimmbares Signal entweder allein oder zusammen mit
anderen Mitgliedern des signalproduzierenden Systems erzeugen. Die
Markierung kann entweder direkt an eine Nukleotidsequenz gebunden
sein oder kann daran gebunden werden, indem sie an ein sbp-Mitglied,
das komplementär
zu einem an eine Nukleotidsequenz gebundenen sbp-Mitglied ist, gebunden
wird.
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Signalproduzierendes System – Das signalproduzierende
System kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei es sich
bei mindestens einer Komponente um die Markierung oder die Reportergruppe
oder das Reportermolekül
handelt. Das signalproduzierende System erzeugt ein Signal, das
in Beziehung zur Anwesenheit oder Menge einer Zielpolynukleotidsequenz
oder eines Polynukleotidanalyten in einer Probe steht. Das signalproduzierende
System enthält
alle Reagenzien, die zur Erzeugung eines meßbaren Signals benötigt werden.
Wenn die Markierung nicht an eine Nukleotidsequenz konjugiert ist,
ist sie normalerweise an ein sbp-Mitglied gebunden, welches komplementär zu einem
sbp-Mitglied, das an eine Nukleotidsequenz gebunden oder Teil dieser
Nukleotidsequenz ist, ist. Andere Komponenten des signalproduzierenden
Systems können
in einer Entwicklerlösung
enthalten sein und können
Substrate, Verstärker,
Aktivatoren, Chemilumineszierer, Cofaktoren, Inhibitoren, Scavenger-Moleküle, Metallionen,
zur Bindung an signalerzeugende Substanzen benötigte spezifisch bindende Substanzen
und ähnliches
umfassen. Weitere Komponenten des signalproduzierenden Systems können Coenzyme,
Substanzen, die mit enzymatischen Produkten reagieren, andere Enzyme
und Katalysatoren und ähnliches
sein. Das signalproduzierende System liefert ein Signal, das über externe
Mittel, über
die Verwendung elektromagnetischer Strahlung und wünschenswerterweise über visuelle
Untersuchung bestimmt werden kann. Das signalproduzierende System
wird ausführlicher
in der U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 07/555,323, eingereicht am
19. Juli 1990 (entspricht der EP0-Veröffentlichungsnummer 469,755),
beschrieben, deren entsprechende Offenbarung hiermit unter Bezugnahme
aufgenommen wird.
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Amplifikation von Nukleinsäuren oder
Polynukleotiden – jedes
beliebige Verfahren, das zur Bildung eines oder mehrerer Kopien
oder Komplemente einer Nukleinsäure
oder eines Polynukleotidmoleküls, üblicherweise
eine in einem Medium vorhandene Nukleinsäure oder einen Polynukleotidanalyt,
führt.
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Exponentielle Amplifikation von Nukleinsäuren oder
Polynukleotiden – jedes
beliebige Verfahren, das zur Bildung eines oder mehrerer Kopien
einer in einem Medium vorhandenen Nukleinsäure oder Polynukleotidmoleküls, üblicherweise
einer Nukleinsäure
oder eines Polynukleotidanalyten, führt.
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Zu den Verfahren für die enzymatische
Amplifikation spezifischer doppelsträngiger DNA-Sequenzen gehören die
oben beschriebenen, wie z. B. die Polymerasekettenreaktion (PCR),
Amplifikation eines einzelsträngigen
Polynukleotids mit einem einzelnen Polynukleotidprimer, Ligasekettenreaktion
(LCR), Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis (NASBA), Q-beta-Replikaseverfahren,
Strangverdrängungsamplifikation (SDA)
sowie 3SR.
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Die Bedingungen zur Durchführung einer
Amplifikation variieren somit, je nachdem welches Verfahren gewählt wird.
Einige dieser Verfahren, wie z. B. PCR, benutzen ein Temperaturcycling,
um die Denaturierung von Duplexen, das Annealing von Oligonukleotidprimern
und die Primerverlängerung
mit thermophiler vorlageabhängiger
Polynukleotidpolymerase zu erreichen. Andere Verfahren, wie z. B.
NASBA; Q-Beta-Replikaseverfahren, SDA und 3SR, sind isotherm. Wie
man sieht, gibt es eine Vielfalt bekannter Amplifikationsverfahren und
viele verschiedene Bedingungen, unter denen diese Verfahren. ausgeführt werden,
um eine exponentielle Amplifikation zu erzielen.
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Lineare Amplifikation von Nukleinsäuren oder
Polynukleotiden – jedes
beliebige Verfahren, das zur Bildung einer oder mehrerer Kopien
von lediglich dem Komplement einer in einem Medium vorhandenen Nukleinsäure oder
Polynukleotidmoleküls, üblicherweise
einer Nukleinsäure
oder eines Polynukleotidanalyten, führt. Somit besteht ein Unterschied
zwischen linearer Amplifikation und exponentieller Amplifikation
darin, daß letztere
Kopien des Polynukleotids produziert, wohingegen erstere nur den
komplementären
Strang des Polynukleotids produziert. In der linearen Amplifikation
ist die Anzahl der gebildeten Komplemente im Prinzip direkt proportional
zu der Reaktionszeit, im Gegensatz zur exponentiellen Amplifikation,
bei der die Kopienanzahl im Prinzip von der Zeit oder der Anzahl
an Temperaturzyklen in exponentieller Weise abhängt.
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Hilfsmaterialien – verschiedene Hilfsmaterialien
werden häufig
in den im Sinne der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahren
und Tests eingesetzt. So sind normalerweise Puffer ebenso im Testmedium vorhanden
wie Stabilisatoren für
dieses Testmedium und die Testkomponenten. Zusätzlich zu diesen Zusatzstoffen
können
häufig
Proteine, z. B. Albumine, organische Lösungsmittel, z. B. Formamid,
quaternäre
Ammoniumsalze, Polykationen, z. B. Dextransulfat, Tenside, insbesondere
nichtionische Tenside, Bindungsverstärker, z. B. Polyalkylenglykole,
oder ähnliches
enthalten sein.
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Wie oben erwähnt, liegt eine Hauptanwendung
der vorliegenden Erfindung in Verfahren zum Nachweis eines Polynukleotidanalyten.
In einem Aspekt der Erfindung wird einOligonukleotid mit einem Polynukleotidanalyten
in Gegenwart einer 5'-Nuklease unter isothermen Bedingungen reversibel
hybridisiert. Auf diese Weise dient der Polynukleotidanalyt als
ein „Erkennungselement",
um der 5'-Nuklease die spezifische Spaltung des Oliqonukleotids
unter Ausbildung eines ersten und eines zweiten Fragments zu ermöglichen,
wenn das Oligonukleotid reversibel an den Polynukleotidanalyten
hybridisiert wird. Das erste Fragment umfaßt das 5'-Ende des Oligonukleotids
(mit Bezug auf das intakte bzw. originale Oligonukleotid), ist mit
dem Polynukleotidanalyten weitgehend nicht hybridisierbar und kann
als Markierung dienen. Das erste Fragment schließt im allgemeinen wenigstens
einen Anteil desjenigen Teils des 5'-Endes des ursprünglichen
Oligonukleotids ein, der nicht an den Polynukleotidanalyten hybridisiert
wurde, wenn der Anteil des Oligonukleotids, der mit dem Polynukleotidanalyten
hybridisierbar ist, daran reversibel hybridisiert wird.
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Das erste Fragment kann zusätzlich Nukleotide
(normalerweise nicht mehr als 5, vorzugsweise nicht mehr als 2,
besonders bevorzugt nicht mehr als 1 solcher Nukleotide) einschließen, die
von der 5`-Nuklease vom 5'-Ende desjenigen Anteils (bzw. derjenigen
Sequenz) des ursprünglichenOligonukleotids,
der bzw. die an den Polynukleotidanalyten hybridisiert wurde, abgespalten
werden. Daher ist in dem obigen Zusammenhang das erste Fragment
mit dem Polynukleotidanalyten „weitgehend
nicht hybridisierbar". Das zweite Fragment umfaßt die Sequenz von Nukleotiden
am 3'-Ende des Oligonukleotids, die an den Polynukleotidanalyten reversibel
hybridisiert wurden, minus derjenigen Nukleotide, die von der 5`-Nuklease
gespalten werden, wenn das ursprüngliche
Oligonukleotid reversibel an den Polynukleotidanalyten hybridisiert
wird. Dementsprechend ist das zweite Fragment, nachdem es aus demjenigen
Anteil des Oligonukleotids, der mit dem Polynukleotidanalyten reversibel
hybridisiert, entstand, mit dem Polynukleotidanalyten „weitgehend
hybridisierbar".
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Wie oben erwähnt, kann das 3'-Ende des Oligonukleotids
ein oder mehrere Nukleotide einschließen, die nicht mit dem Polynukleotidanalyten
hybridisieren und eine Markierung umfassen können. Man erhält mindestens
einen 100-fachen molaren Überschuß des ersten
Fragments und/oder des zweiten Fragments relativ zur Molmenge des
Polynukleotidanalyten. Die Sequenz mindestens eines der Fragmente
bleibt während
der Reaktion weitgehend erhalten. Die Anwesenheit des ersten Fragments
und/oder des zweiten Fragments wird bestimmt und zeigt dabei die
Anwesenheit des Polynukleotidanalyten an.
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Die 5'-Nuklease ist im allgemeinen
in einer Menge vorhanden, die ausreicht, um die Spaltung des Oligonukleotids,
wenn dieses reversibel an den Polynukleotidanalyten hybridisiert
wird, mindestens halb so schnell wie die mit überschüssigem Enzym erreichbare Maximalgeschwindigkeit,
vorzugsweise mit mindestens 75% der Maximalgeschwindigkeit, ablaufen
zu lassen. Die Konzentration der 5'-Nuklease wird üblicherweise
empirisch bestimmt. Vorzugsweise wird eine insoweit ausreichende
Konzentration verwendet, daß ein weiterer
Konzentrationsanstieg die Amplifikationszeit nicht mehr als um das
5-fache, vorzugsweise Doppelte, reduziert. Im allgemeinen ist der
limitierende Faktor in erster Linie die Kosten für das Reagens. Diesbezüglich liegen
daher der Polynukleotidanalyt, oder wenigstens die Zielpolynukleotidsequenz,
sowie das Enzym im allgemeinen in einer katalytischen Menge vor.
Das von dem Enzym gespalteneOligonukleotid liegt normalerweise in
großem
Uberschuß,
vorzugsweise 10-9 M bis 10-5 M,
vor und wird in einer Menge eingesetzt, die zu einem Maximum der
Gesamtgeschwindigkeit seiner Spaltung gemäß der vorliegenden Erfindung
führt,
wobei die Geschwindigkeit wenigstens 10%, vorzugsweise 50%, besonders
bevorzugt 90%, der maximal möglichen
Reaktionsgeschwindigkeit beträgt.Oligonukleotidkonzentrationen
von weniger als 50% können
eingesetzt werden, um den Nachweis des Fragments bzw. der Fragmente,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt werden, zu ermöglichen. Die Oligonukleotidmenge
ist wenigstens so groß wie
die gewünschte
Anzahl an Produktmolekülen.
Die Oligonukleotidkonzentration ist normalerweise 0,1 nanomolar
bis 1 millimolar, vorzugsweise 1 nanomolar bis 10 mikromolar. Es
sollte hier angemerkt werden, daß eine Erhöhung der Oligonukleotidkonzentration
dazu führt,
daß die
Reaktionsgeschwindigkeit einem Grenzwert zustrebt, der von der Oligonukleotidsequenz,
der Temperatur, der Konzentration der Zielpolynukleotidsequenz sowie
der Enzymkonzentration abhängt.
Bei vielen Nachweisverfahren können
sehr hohe Oligonukleotidkonzentrationen den Nachweis erschweren.
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Die Menge an zu kopierender Zielpolynukleotidsequenz
kann nur ein bis zwei Moleküle
in einer Probe betragen, kann jedoch im allgemeinen von etwa 102 bis 1010, üblicher
von 103 bis 108 Molekülen in einer
Probe variieren und beträgt
vorzugsweise mindestens 10-21 M in der Probe
und kann 10-10 bis 10-19 M, üblicher
10-14 bis 10-19 M
betragen.
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Bei der Durchführung des Verfahrens im Sinne
der vorliegenden Erfindung wird ein wäßriges Medium eingesetzt. Als
Cosolventien lassen sich auch andere polare Lösungsmittel einsetzen, üblicherweise
oxygenierte organische Lösungsmittel
mit 1 bis 6, üblicher
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einschließlich Alkoholen, Ethern und ähnlichen. Üblicherweise
liegen diese Cosolventien, falls sie verwendet werden, in weniger
als etwa 70 Gew.-%, üblicher
in weniger als etwa 30 Gew.-% vor.
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Der pH-Wert des Mediums liegt üblicherweise
im Bereich von etwa 4, 5 bis 9, 5, üblicher im Bereich von etwa
5, 5 bis 8,5 und vorzugsweise im Bereich von etwa 6 bis B. Der pH-Wert
und die Temperatur werden so gewählt,
daß die
reversible Hybridisierung oder der Gleichgewichtszustand, bei dem
die Spaltung eines Oligonukleotids stattfindet, im Sinne der vorliegenden
Erfindung erreicht wird. In einigen Fällen wird bei den Reaktionsparametern
ein Kompromiß eingegangen,
um die Geschwindigkeit, Effizienz und Spezifität dieser Schritte des vorliegenden
Verfahrens zu optimieren. Zur Erzielung des gewünschten pH-Werts und Beibehaltung
dieses pH-Werts während
der Bestimmung können
verschiedene Puffer verwendet werden. Zu den beispielhaften Puffern
gehören
Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und ähnliche. Der jeweilige verwendete Puffer
ist nicht kritisch für
diese Erfindung, jedoch kann bei einzelnen Verfahren ein Puffer
gegenüber
einem anderen bevorzugt sein.
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Wie oben erwähnt, wird die Reaktion im Sinne
der vorliegenden Erfindung unter isothermen Bedingungen durchgeführt. Die
Reaktion wird bei einer Temperatur durchgeführt, die in der Nähe der Schmelztemperatur
des Oligonukleotid : Polynukleotidanalyt-Komplexes liegt. Entsprechenderweise
hängt die
verwendete Temperatur von einer Reihe von Faktoren ab. Üblicherweise
beträgt
die Temperatur für
die Spaltung des Oligonukleotids im Sinne der vorliegenden Erfindung
etwa 35°C
bis 90°C,
je nach Länge
und Sequenz des Oligonukleotids. Üblicherweise ist die Verwendung
einer relativ hohen Temperatur von 60°C bis 85°C wünschenswert, um für eine hohe
Reaktionsgeschwindigkeit zu sorgen. Die Menge an gebildeten Fragmenten
hängt von der
Inkubationszeit und -temperatur ab. Im allgemeinen wird zur Durchführung der
Verfahren typischerweise eine gemäßigte Temperatur eingesetzt.
Die genaue verwendete Temperatur variiert ebenfalls je nach Salzkonzentration,
pH-Wert, verwendeten Lösungsmitteln
sowie der Länge
und Zusammensetzung der Zielpolynukleotidsequenz ebenso wie des
Oligonukleotids, wie oben erwähnt.
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Eine Ausführungsform der Erfindung ist
in 1 dargestellt. Das
OligonukleotidOL wird mit dem Polynukleotidanalyten PA, der eine
Zielpolynukleotidsequenz TPS aufweist, und mit einer 5'-Nuklease,
bei der es sich beispielsweise um eine Taq-Polymerase handeln kann,
kombiniert. In dieser Ausführungsform
wird OL markiert (*), und zwar in einem Bereich, der als erstes
Fragment bezeichnet wird und nach Spaltung des Oligonukleotids im
Sinne der vorliegenden Erfindung entsteht. Die Länge von OL beträgt in dieser
Ausführungsform üblicherweise
mindestens 10 Nukleotide, vorzugsweise etwa 10 bis 50 Nukleotide,
besonders bevorzugt 15 bis 30 oder mehr Nukleotide. Allgemein sollte
die Länge
des OL ausreichen, so daß ein
Anteil mit TPS hybridisieren kann, wobei die Länge eines solchen Anteils der
Länge der
TPS nahe kommt. In dieser Ausführungsform
wird die Länge
des OL so gewählt,
daß nach
Abspaltung von nicht mehr als 5, vorzugsweise nicht mehr als 1 bis
3, besonders bevorzugt 1 bis 2 Nukleotiden, davon zwei Fragmente
entstehen. Das mit LN bezeichnete erste Fragment ist nicht länger als
5 Nukleotide, vorzugsweise 1 bis 3 Nukleotide lang, besonders bevorzugt
1 bis 2 Nukleotide lang, und das mit DOL bezeichnete zweite Fragment
ist nicht mehr als 5, vorzugsweise nicht mehr als 1 bis 3, besonders
bevorzugt nicht mehr als 1 bis 2, Nukleotide kürzer als die Länge desOL.
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Wie in 1 gezeigt,
hybridisiert OL mit TPS unter Bildung des Duplex I. Die Hybridisierung
wird unter isothermen Bedingungen durchgeführt, so daß OL reversibel mit TPS hybridisiert.
OL in Duplex I wird unter Bildung von DOL und LN gespalten, wobei
LN ein markiertes Nukleotid (*) enthält. In der in 1 dargestellten Ausführungsform ist DOL mit Ausnahme
der am 5'-Ende fehlenden Nukleotide das Komplement zu TPS. Da während des
Verlaufs der isothermen Reaktion das 5'-Ende von PA am oder in der
Nähe des
5'-Endes von TPS gespalten werden kann, kann DOL an seinem 3'-Ende
ebenfalls 0 bis 5 Nukleotide aufweisen, die einen Überhang
bilden und nicht mit dem restlichen Anteil der TPS hybridisieren
können.
Die isothermen Bedingungen werden so gewählt, daß zwischen dem Duplex I und
seinen einzelsträngigen
Bestandteilen, nämlich
PA und OL, ein Gleichgewicht besteht. Nach Spaltung von OL im Duplex
I stellt sich zwischen dem Duplex I und seinen einzelsträngigen Bestandteilen,
PA und DOL, ebenfalls ein Gleichgewicht ein. Da OL normalerweise
in einem großen Überschuß relativ
zur in der Reaktion gebildeten Menge an DOL vorliegt, gibt es üblicherweise viel
mehr OL enthaltende Duplexe als DOL enthaltende Duplexe. Die oben
beschriebene Reaktion für
Duplex I produziert kontinuierlich zusätzliche DOL-Moleküle.
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Man läßt die Reaktion solange weiterlaufen,
bis sich eine ausreichende Anzahl an DOL- und LN-Molekülen gebildet
hat, um den Nachweis des markierten LN (LN*) und somit des Polynukleotidanalyten
zu gestatten. Auf diese Weise wird die enzymkatalysierte Abspaltung
von Nukleotiden vom 5'-Ende des OL durch die Anwesenheit des Polynukleotidanalyten
moduliert und steht daher mit dieser in Beziehung. Je nach der vorliegenden
Menge an PA läßt sich
eine für
den Nachweis ausreichende Anzahl von Molekülen erhalten, wobei die Reaktionszeit
von etwa 1 Minute bis zu 24 Stunden betragen kann. Vorzugsweise
läßt sich
die Reaktion in weniger als 5 Stunden durchführen. Zweckmäßigerweise
ist es gewöhnlich
wünschenswert,
die Zeitdauer zu minimieren, solange die erforderliche Anzahl an
Molekülen
des nachweisbaren Fragments erreicht wird. Im allgemeinen läßt sich
die Zeitdauer für
einen gegebenen Spaltungsgrad minimieren, indem die Reaktionstemperatur
optimiert wird und Konzentrationen an 5'-Nuklease sowie an Oligonukleotid
eingesetzt werden, die für Reaktionsgeschwindigkeiten
sorgen, die nahe am mit einem Überschuß an diesen
Reagenzien erreichbaren Maximum liegen. Der Nachweis des Polynukleotidanalyten
wird indirekt durch den Nachweis der Markierung im Fragment LN*
erzielt. Alternativ läßt sich
DOL beispielsweise nachweisen, indem die Markierung als ein Mittel
zur Abtrennung von LN' und OL aus der Reaktionsmischung verwendet
und danach das zurückgebliebene DOL
nachgewiesen wird.
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Der Nachweis des markierten Fragments
kann auf vielfache Weise erleichtert werden. So läßt sich
beispielsweise ein Mitglied eines spezifischen Paars, wie z. B.
Biotin, oder eine direkt nachweisbare Markierung wie z. B. Fluorescein
verwenden. Das niedrigmolekulare LN' läßt sich durch Elektrophorese,
Gelausschlußchromatographie,
Dünnschichtchromatographie,
Ultrafiltration und dergleichen abtrennen und durch beliebige zweckmäßige Mittel
wie z. B. einem kompetitiven Bindungsassay oder durch direkten Nachweis
der Markierung nachweisen. Alternativ kann das Oligonukleotid innerhalb
des zweiten (DOL-)Fragments mit einem spezifischen Bindungsmitglied
wie z. B. einem Liganden, einem kleinen organischen Molekül, einer
Polynukleotidsequenz oder einem Protein, oder mit einer direkt nachweisbaren
Markierung wie z. B. einem direkt nachweisbaren kleinen organischen
Molekül,
z. B. Fluorescein, einem Sensitizer, einem Coenzym und dergleichen
markiert werden. Der Nachweis hängt
dann davon ab, zwischen dem Oligonukleotid mit Markierungen an beiden Enden
und einfach markierten Fragmenten, wobei ein markiertes Ende abgeschnitten
wurde, zu unterscheiden. In diesem Fall ist es wünschenswert, ein Ende des OL
mit einem spezifischen Bindungsmitglied, das die Entfernung desOL
sowie des die Markierung behaltenden Fragments erleichtert, indem
ein an einen Träger gebundenes
komplementäres
sbp-Mitglied verwendet wird, zu markieren. Die restlichen markierten
Fragmente, die die zweite Markierung tragen, werden dann durch Verwendung
eines zum Nachweis dieser Markierung geeigneten Verfahrens nachgewiesen.
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Ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren ist
der Einsatz von Nukleinsäuresonden.
Weitere Test- und Nachweisformate sind in den U.S.-Patentanmeldungen
mit den Serien Nr. 07/229, 282 bzw. 07/399, 795, eingereicht am
19. Januar 1989 bzw. 29. August 1989 (die beide jeweils der EP0-Veröffentlichungsnummer
379,369 entsprechen), der U.S.-Patentanmeldung mit der Serien Nr.
07/555,323, eingereicht am 19. Juli 1990 (entspricht der EPO-Veröffentlichungsnummer
469,755), der U.S.-Patentanmeldung
mit der Serien Nr. 07/555,968 (nun U.S.-Patent 5,439,793) sowie der U.S.-Patentanmeldung
mit der Serien Nr. 07/776,538 (entspricht der EPO-Veröffentlichungsnummer
549,107), eingereicht am 11. Oktober 1991, offenbart.
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Beispiele für bestimmte Markierungen oder
Reportermoleküle
und ihr Nachweis lassen sich der U.S.-Patentanmeldung mit der Serien
Nr. 07/555,323, eingereicht am 19. Juli 1990 (entspricht der EPO-Veröffentlichung
469,755) entnehmen.
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Der Nachweis des Signals hängt von
der Beschaffenheit des verwendeten signalproduzierenden Systems
ab. Handelt es sich bei der Markierung oder der Reportergruppe um
ein Enzym, so gehören
Enzymsubstrate usw. ebenfalls zu dem signalproduzierenden System.
Bei dem Produkt der Enzymreaktion handelt es sich vorzugsweise um
ein lumineszierendes Produkt oder um einen Fluoreszenz- oder Nicht-Fluoreszenzfarbstoff,
der jeweils spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann, oder
um ein Produkt, das mit anderen spektrometrischen oder elektrometrischen
Mitteln nachgewiesen werden kann. Handelt es sich bei der Markierung
um ein fluoreszierendes Molekül,
läßt sich
das Medium bestrahlen und die Fluoreszenz bestimmen. Falls es sich
bei der Markierung um eine radioaktive Gruppe handelt, kann man
die Radioaktivität
im Medium durch Zählen
bestimmen.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist in 2 dargestellt.
Das OligonukleotidOL' weist einen ersten Anteil bzw. eine erste
Sequenz SOL1 auf, der bzw. die nicht an TPS' hybridisiert wird, sowie
einen zweiten Anteil bzw. eine zweite Sequenz SOL2, der bzw. die
an TPS' hybridisiert wird. OL' wird mit dem Polynukleotidanalyten
PA', der die Zielpolynukleotidsequenz TPS' aufweist, sowie mit einer
5'-Endonuklease (5'-Endo), bei der es sich beispielsweise um Taq-DNA-Polymerase und dergleichen
handeln kann, kombiniert. OL` und 5'-Endo liegen im allgemeinen
in Konzentrationen wie oben beschrieben vor. In der Ausführungsform
der 2 wirdOL' innerhalb
der Sequenz SOL1 markiert (*), wobei SOL1 die Markierung intrinsisch
enthalten oder extrinsisch mit einem spezifischen Bindungsmitglied
bzw. einer direkt nachweisbaren Markierung markiert werden kann.
Die Länge
von SOL2 ist wie in der Ausführungsform
der 1 beschrieben. Im
allgemeinen sollte die Länge
von SOL2 zur Hybridisierung mit TPS' ausreichen und entspricht normalerweise
etwa der Länge
der TPS'. SOL1 kann beliebig lang sein, solange sie die Spaltung
des OL` nicht wesentlich stört
und ist vorzugsweise relativ kurz um solche Störungen zu vermeiden. Normalerweise
beträgt
die Länge der
SOL1 etwa 1 bis 100 Nukleotide, vorzugsweise 8 bis 20 Nukleotide.
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In dieser Ausführungsform führt die
Abspaltung der SOL1 von der SOL2 zu zwei Fragmenten. Die Spaltung
in SOL2 findet weniger als 5 Nukleotide von der SOL1 und SOL2 in
OL' verknüpfenden
Bindung statt. Der genaue Ort der Spaltung ist nicht kritisch, solange
das Enzym OL' nur dann spaltet, wenn dieses an TPS' gebunden ist.
Die beiden Fragmente werden mit LNSOL1 und DSOL2 bezeichnet. LNSOL1
umfaßt
das 5'-Ende von OL' und DSOL2 umfaßt das 3'-Ende von OL '. Die
Sequenz von wenigstens einem der Moleküle LNSOL1 und DSOL2 bleibt
während
der Spaltreaktion weitgehend in Takt. Wie in 2 gezeigt, hybridisiert SOL2 von OL'
mit TPS' unter Ausbildung des Duplex I'. Die Hybridisierung wird
unter isothermen Bedingungen durchgeführt, so daß OL' reversibel mit TPS` hybridisiert
wird. OL' in Duplex I' wird unter Bildung von DSOL2 und LNSOL1 gespalten,
wobei das letztere eine Markierung enthält. In der in 2 dargestellten Ausführungsform stellt DSOL2 das
Komplement zu TPS` dar, mit Ausnahme derjenigen Nukleotide, die
am 5'-Ende davon als Ergebnis der Spaltung der Spaltreaktion fehlen,
und derjenigen, am 3'-Ende von OL ' anhängenden Nukleotide (in 2 nicht gezeigt), die nicht
mit TPS` hybridisieren.
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Die isothermen Bedingungen werden
so gewählt,
daß ein
Gleichgewicht zwischen Duplex I' und seinen einzelsträngigen Bestandteilen,
d. h. PA' und OL ', besteht. Nach Spaltung von OL' im Duplex I'
stellt sich ebenfalls ein Gleichgewicht zwischen Duplex I' und seinen
einzelsträngigen
Komponenten, PA' und DSOL2, ein. Da OL` normalerweise in großem Überschuß relativ
zur in der Reaktion gebildeten Menge an DSOL2 vorliegt, gibt es
normalerweise viel mehr Duplexe mit OL' als mit DSOL2. Die oben
für Duplex
I' beschriebene Reaktion produziert kontinuierlich DSOL2- und LNSOL1-Moleküle. Man
läßt die Reaktion
weiterlaufen, bis sich eine ausreichende Anzahl an DSOL2- und LNSOL1-Molekülen gebildet
hat, um den Nachweis eines oder beider dieser Fragmente zu gestatten.
Auf diese Weise wird die enzymkatalysierte Abspaltung des LNSOL1
vom 5'-Ende des an PA' hybridisierten Anteils an OL' durch die Anwesenheit
des Polynukleotidanalyten moduliert und steht daher mit dieser in
Beziehung. Die Reaktionsparameter und der Nachweis von DSOL2 und/oder LNSOL1
sind im allgemeinen wie oben für
die Ausführungsform
der 1 beschrieben.
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Es lassen sich verschiedene Wege
zur Kontrolle der Spaltung des Oligonukleotids einsetzen. So läßt sich
beispielsweise die Spaltstelle durch Einführung einer kleinen organischen
Gruppe, wie z. B. Biotin, in das Nukleotid am 5'-Terminus des OL'
oder das an der Verknüpfungsstelle
von SOL2 und SOLI befindliche Nukleotid in SOL2 kontrollieren.
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Eine Ausführungsform, bei der ein zweites
Oligonukleotid eingesetzt wird, ist in 3 dargestellt. Das zweite Oligonukleotid
(0L2) hybridisiert an einer Stelle TPS2 auf PA'', die 3' von der
Hybridisierungsstelle (TPS1) der Sequenz SOL2'' des ersten Oligonukleotids,
nämlich
OL'', liegt. In der gezeigten Ausführungsform hybridisiert 0L2
vollständig
mit TPS2, und zwar in beispielhafter und nicht in einschränkender
Weise. Das zweite Oligonukleotid kann an seinem 5'-Ende Nukleotide
einschließen,
die mit der Zielpolynukleotidsequenz nicht hybridisiert sind, jedoch
ist sein 3'-Ende vorzugsweise hybridisierbar. Vorzugsweise bindet
0L2 an eine Stelle (TPS2), die sich unmittelbar an die Stelle, an
der SOL2'' hybridisiert (TPS1), anschließt. Es liegt jedoch im Rahmen
der vorliegenden Erfindung, daß das
zweite Oligonukleotid mit PA'' 1 bis 5 Nukleotide, vorzugsweise
1 Nukleotid, von der Stelle, an der SOL2'' hybridisiert, entfernt
hybridisiert. Das zweite Oligonukleotid, 0L2, ist normalerweise
wenigstens genauso lang wie und vorzugsweise länger als SOL2'', vorzugsweise
mindestens 2 Nukleotide länger
als SOL2''. Im allgemeinen beträgt
die Länge
des zweiten Oligonukleotids etwa 20 bis 100 Nukleotide, vorzugsweise
30 bis 80 Nukleotide, je nach Länge
des SOL2''. Typischerweise wird das zweite Oligonukleotid so gewählt, daß es vom
Duplex I'' bei einer höheren
Temperatur dissoziiert als diejenige, bei derOL'' dissoziiert, normalerweise
mindestens 3°C,
vorzugsweise mindestens 5 oder mehr °C, höher.
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Die Anwesenheit von 0L2 im Duplex
I'' kann die Spaltstelle des OL'' beeinflussen. Insbesondere kann bei
Bindung von 0L2 an einen PA'', der sich nicht unmittelbar an die
SOL2''-Hybridisierungsstelle anschließt, sich die Spaltstelle um
ein oder mehrere Nukleotide verschieben.
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Die Konzentration des in dieser Ausführungsform
eingesetzten zweiten Oligonukleotids beträgt normalerweise mindestens
1 picomolar, liegt jedoch vorzugsweise oberhalb 0,1 nanomolar, um
die schnelle Bindung an PA'' zu erleichtern, und besonders bevorzugt
mindestens 1 nanomolar bis 1 mikromolar. Im Sinne der Ausführungsform
der 3 wird OL'' im Duplex
I'' durch 5'-Endo unter Bildung von DSOL2'' und LNSOL1'' gespalten.
Man läßt die Reaktion
solange weiterlaufen, bis sich die gewünschte Anzahl an Molekülen des
markierten Fragments gebildet hat. Die Reaktionsparameter sowie
der Nachweis von DSOL2'' und/oder LNSOL1'' sind ähnlich zu den für die Ausführungsform
der 1 oben beschriebenen.
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Im allgemeinen und spezifisch in
einer der Ausführungsformen
der 1 bis 3 oben kann das 3'-Ende des
ersten Oligonukleotids, beispielsweise OL,OL' und OL'', ein oder
mehrere Nukleotide aufweisen, die nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz
hybridisieren und die daher als Markierung dienen können, aber
nicht müssen.
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Ebenso liegt es im Rahmen der vorliegenden
Erfindung, ein einzelnes Nukleotidtriphosphat in einer der obigen
Ausführungsformen
einzusetzen, je nach der bestimmten, für die obige Spaltung gewählten 5'-Endonuklease.
Die Entscheidung über
die Verwendung eines Nukleosidtriphosphats sowie die Wahl des Nukleosidtriphosphats
werden empirisch getroffen, basierend auf seiner Fähigkeit,
die Reaktion im Sinne der vorliegenden Erfindung zu beschleunigen.
Es handelt sich dabei vorzugsweise um ein Nukleosidtriphosphat,
das in das erste Oligonukleotid als Folge der Bindung des Oligonukleotids
an die Zielpolynukleotidsequenz nicht eingebaut werden kann. In dieser
besonderen Ausführungsform
liegt das zugegebene Nukleosidtriphosphat in einer Konzentration
von 1 mikromolar bis 10 millimolar, vorzugsweise 10 mikromolar bis
1 millimolar und besonders bevorzugt 100 mikromolar bis 1 millimolar,
vor. Es liegt ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung, das
zugegebene Nukleosidtriphosphat zur Kettenverlängerung des 3'-Terminus des
zweitenOligonukleotids zu verwenden, um dieses unmittelbar an diejenige
Stelle auf der Zielpolynukleotidsequenz, an der das erste Oligonukleotid
hybridisiert, anschließen
zu lassen. Bei diesem Ansatz dient das zweite Oligonukleotid als
ein Polynukleotidprimer für
die Kettenverlängerung.
Zusätzlich
wird das Nukleosidtriphosphat entsprechend ausgewählt, um
eine solche Kettenverlängerung
zu erzielen, und die 5'-Nuklease wird danach ausgewählt, daß sie auch
eine vorlagenabhängige
Nukleotidpolymeraseaktivität
aufweist. In jedem Fall ist ein solcher Ansatz in erster Linie auf
die Situation anwendbar, bei der die Bindungsstelle dieses zweiten
Oligonukleotids, TPS2, durch eine Sequenz von einer oder mehreren
identischen Basen, die zu dem zugegebenen Nukleosidtriphosphat komplementär sind,
von der Bindungsstelle des ersten Oligonukleotids, TPS1, getrennt
ist.
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In der Ausführungsform der 3 wird die PA'', OL'', das zweite Oligonukleotid
0L2 sowie das Nukleosidtriphosphat enthaltende Mischung bei einer
geeigneten isothermen Temperatur, bei der OL'' und PA'' sich im
Gleichgewicht mit dem Duplex I'' befinden, wobei die PA''- und Duplex
I''-Moleküle
größtenteils
an 0L2 hybridisiert sind, inkubiert. Während der Zeit, in der ein
Molekül
OL'' an PA'' gebunden ist, führt
die 5'-Endo zur hydrolytischen Spaltung von OL'' im Sinne der vorliegenden
Erfindung. Wenn dann der verbliebene Anteil des gespaltenen Oligonukleotids
(DSOL2'') vom PA'' dissoziiert, wird daraufhin ein intaktes Molekül OL'' hybridisiert,
wonach sich der Prozeß wiederholt.
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In einem Experiment im Sinne der
obigen Ausführungsform
führte
eine 3stündige
Inkubation bei 72°C zur
Produktion von mehr als 1011 Molekülen DSOL2''
und LNSOL1'' , was einen Anstieg von mehr als 104 gegenüber der
Anzahl an PA''-Molekülen,
die anfänglich
in der Reaktionsmischung vorlagen, bedeutete. OL'' wurde mit einem 32P-Phosphat am 5'-Terminus markiert. Das
Spaltprodukt LNSOL1'' wurde nachgewiesen, indem die Mischung auf
ein Elektrophoresegel aufgetragen und eine Bande, die schneller
als die mit OL'' assoziierte Bande wanderte, nachgewiesen wurde.
Es konnte gezeigt werden, daß das
Auftreten dieser Bande mit der Anwesenheit von und Menge an PA`
` assoziiert ist, wobei ein Minimum von 10(unlesbar) Molekülen in PA'' nachgewiesen
wurde.
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In der obigen Ausführungsform
lassen sich auch alternative Ansätze
zum Nachweis von LNSOL1'' und/oder DSOL2'' einsetzen. So wird beispielsweise
in einem Ansatz Biotin an einen beliebigen Teil von SOL2'', der
durch die 5-Endonuklease vom OL'' abgespalten wird, gebunden. Das
Fragment DSOL2'' sowie OL'', die das Biotin enthalten, werden von
LNSOL1'' beispielsweise durch Präzipitation
mit Streptavidin und Filtration getrennt. Das nicht präzipitierte,
markierte Fragment LNSOL1'' wird dann über einen beliebigen Standard-Bindungstest,
entweder ohne Trennung (homogen) oder mit Trennung (heterogen) von
irgendeinem der Testkomponenten oder -produkte, nachgewiesen.
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Als Beispiel für homogene Immunassays dienen
die in Rubenstein et al., U.S.-Patent Nr. 3,817,837, Spalte 3, Zeile
6 bis Spalte 6, Zeile 64 offenbarten „Enzyme Multiplied Immunoassay"-Techniken
(„EMIT"),
Immun fluoreszenzverfahren, wie z. B. die in Ullman, et al., U.S.-Patent
Nr. 3, 996, 345, Spalte 17, Zeile 59 bis Spalte 23, Zeile 25 offenbarten;
Enzym-Channeling-Techniken, wie z. B. die in Maggio, et al., US-Patent
Nr. 4,233,402, Spalte 6, Zeile 25 bis Spalte 9, Zeile 63 offenbarten;
und andere Enzym-Immunassays, wie z. B. der „Enzyme-Linked Immunosorbant
Assay (ELISA)'' werden in Maggio, E . T . supra diskutiert. Ein
Beispiel für
heterogene Tests ist der Radioimmunassay, offenbart in Yalow, et
al., J. Clin. Invest. 39: 1157 (1960). Für eine ausführlichere Erörterung
der obigen Immunassaytechniken, siehe „Enzyme-Immunoassay", von Edward T. Maggio,
CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980. Siehe auch z. B. U.S.-Patente
Nr. 3, 690, 839; 3, 791, 932; 3, 817, 837; 3, 850, 578; 3, 853,
987; 3, 867, 517; 3, 901, 654; 3, 935, 074; 3, 984, 533; 3, 996,
345 und 4,098,876, wobei es sich hier nicht um eine vollständige Liste
handeln soll.
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Heterogene Tests beinhalten üblicherweise
einen oder mehrere Trennschritte und können kompetitiv oder nichtkompetitiv
sein. Verschiedene kompetitive und nichtkompetitive Testformate
sind in Davalian, et al., U.S.-Patent Nr. 5, 089, 390, Spalte 14,
Zeile 25 bis Spalte 15, Zeile 9 offenbart. Ein typischer nichtkompetitiver Test
ist ein in David, et al., U.S.-Patent Nr. 4,986,530, Spalte 8, Zeile
6 bis Spalte 15, Zeile 63 offenbarter Sandwich-Test.
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Ein weiterer Bindungstestansatz umfaßt den Lumineszenz-Immunassay, beschrieben
im U.S.-Patent mit der Serien Nr. 07/704,569, eingereicht am 22.
Mai 1991 unter dem Titel „Assay
Method Utilizing Induced Luminescence" (entspricht der PCT-Veröffentlichungsnummer
W095/14928 und der Taiwan-Patentnummer 62, 088).
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Zweckmäßigerweise können vorbestimmte
Mengen an in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Reagenzien
in abgepackter Kombination in einem Kit zur Verfügung gestellt werden. Dabei
kann ein Kit in abgepackter Kombination (a) ein erstes Oligonukleotid
mit der Eigenschaft, daß es
bei reversibler Hybridisierung an einen Anteil eines nachzuweisenden
Polynukleotids unter isothermen Bedingungen von einer 5'-Nuklease abgebaut
wird, um (i) ein erstes Fragment, das mit dem Polynukleotid weitgehend
nicht hybridisierbar ist, und (ii) ein zweites Fragment, das 3'
vom ersten Fragment liegt und mit dem Polynukleotid weitgehend hybridisierbar
ist, bereitzustellen, (b) ein zweites Oligonukleotid
mit der Eigenschaft, daß wenigstens
ein Anteil davon an eine Stelle auf dem Polynukleotid hybridisiert,
die 3' von der Stelle liegt, an der das erste Oligonukleotid hybridisiert,
wobei das Polynukleotid weitgehend vollständig an einen solchen Anteil
des zweiten Oligonukleotids unter isothermen Bedingungen hybridisiert
wird, und (c) die obige 5'-Nuklease umfassen. Der Kit kann weiterhin
ein einzelnes Nukleosidtriphosphat umfassen.
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Die obigen Kits können weiterhin Mitglieder eines
signalproduzierenden Systems sowie ebenfalls verschiedene gepufferte
Medien, von denen einige ein oder mehrere der obigen Reagenzien
enthalten können, einschließen. Ebenso
können
die obigen Kits eine schriftliche Beschreibung eines oder mehrerer
Verfahren im Sinne der vorliegenden Erfindung zum Nachweis eines
Polynukleotidanalyten einschließen.
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Die relativen Mengen der verschiedenen
Reagenzien in den Kits lassen sich über einen weiten Bereich variieren,
um für
Reagenskonzentrationen zu sorgen, die die während des vorliegenden Verfahrens
stattfindenden Reaktionen wesentlich optimieren, und weiterhin die
Empfindlichkeit eines beliebigen Tests wesentlich zu optimieren.
Unter entsprechenden Umständen
können
ein oder mehrere Reagenzien als trockenes, üblicherweise lyophilisiertes
Pulver zur Verfügung
gestellt werden, einschließlich
Hilfsstoffen, die nach Auflösung für eine Reagenslösung mit
den für
die Durchführung
eines Verfahrens oder Tests im Sinne der vorliegenden Erfindung
geeigneten Konzentrationen sorgen. Jedes Reagens kann entweder in
getrennte Behältnisse
abgepackt werden, oder aber einige Reagenzien können in einem Behältnis kombiniert
werden, falls dies im Hinblick auf Kreuzreaktivität und Haltbarkeit
zulässig
ist.
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BEISPIELE
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Die Erfindung wird mit den folgenden
veranschaulichenden Beispielen weiter demonstriert. Falls nicht anders
angegeben, sind Temperaturen in Grad Celsius (°C) und Anteile bzw. Gewichtsprozente
aufgeführt.
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BEISPIEL 1 Eine einzelsträngige Ziel-DNA
(2 × 108 Moleküle)
(M13mp19 von Gibco, BRL, Bethesda, Maryland) (die „Ziel-DNA")
wurde mit einer 5'32P-markiertenOligonukleotidsonde,
Sonde 1, (10 μM) (5'CGT-GGG-ARC-AAA-CGG-CGG-AT3')
(SEQ ID NO: 1) synthetisiert auf einem Pharmacia Gene Assembler (Pharmacia
Biotech, Piscataway, N.J.), einem nichtmarkiertenOligonukleotid,
Sonde 2, (1 μM) (5'TTC-ATC-AAC-ATT-AAA-TGT-GAG-CGA-GTA-ACA-ACC-CGT-CGG-ATT-CTC3' (SEQ ID
NO: 2) synthetisiert auf einem Pharmacia Gene Assembler (Pharmacia
Biotech), sowie 7,5 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase (von Perkin-Elmer
Corporation, Norwalk, N.J.) in 50 μL Puffer (10 mM Tris-HCl, pH
8,5, 50 mM KCl, 7,5 mM MgCl2, 100 μM dATP) kombiniert.
Bei der Sonde 1 handelte es sich um ein 20 Basen langes Oligonukleotid,
das zur Ziel-DNA vollständig
komplementär
war und eine Markierung am 5'-Nukleotid aufwies. Sonde 2, die nichtmarkierte
Sonde, wurde konstruiert, um an die Ziel-DNA 3' von der und direkt
anschließend
an die Stelle, an der die markierte Sonde an die Ziel-DNA annealte,
zu annealen. Es konnte gezeigt werden, daß dATP die Geschwindigkeit
der Spaltung durch die Polymerase erhöht. Es wurden jedoch auch gute
Ergebnisse in Abwesenheit von dATP erzielt.
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Die Reaktionsmischung wurde bei 72°C inkubiert
und die Anreicherung von Produkt, einem Mononukleotid, nämlich 5'32P-C-OH, wurde durch Sichtbarmachung mittels
Autoradiographie nach einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt.
Der Amplifikationsfaktor wurde mittels Flüssigszintillationspektrometrie
von ausgeschnittenen Reaktionsprodukten bestimmt. Eine 105fache Amplifikation wurde beobachtet.
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Das obige Reaktionsprotokoll wurde
unter Verwendung, anstelle der Sonde 1, einer markierten Sonde, Sonde
3, (5'-TCG-TGG-GRA-CAA-ACG-GCG-GAT3' (SEQ ID NO: 3) hergestellt
unter Verwendung eines Pharmacia Gen Assembler), die 21 Nukleotide
aufwies, mit einer Base am 5'-Ende, die nicht komplementär war und
nicht mit der Ziel-DNA hybridisierte, wiederholt. Das Produkt dieser
Reaktion war ein Dinukleotid, nämlich
5'32P-TC-OH, das eine 105fache
Amplifikation repräsentierte.
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Das obige Reaktionsprotokol wurde
bei unterschiedlichen Temperaturen und unterschiedlichen Reagenskonzentrationen
wiederholt. Alle Reaktionen, einschließlich der obenerwähnten, wurden über einen
Zeitraum von 3 Stunden ausgeführt.
In der folgenden Tabelle sind die Reagenzien sowie die Reaktionsparameter und
die während
des Optimierungsverfahrens erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt.
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BEISPIEL 2
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Das in Beispiel 1 beschriebene Reaktionsprotokoll
wurde unter Verwendung der folgenden Sonden anstelle der Sonde 1
bzw. Sonde 3 wiederholt:
Sonde 4: 5'TTA-TTT-CGT-GGG-AAC-AAA-CGG-CGG-AT3'
(SEQ ID NO: 4) (von Oligos Etc., Inc., Wilsonville, OR). Sonde 4
besaß 26
Nukleotide, wobei sechs Nukleotide an ihrem 5'-Ende mit der Ziel-DNA
weder komplementär
noch hybridisierbar waren. Die Sonde 4 lag in einer Konzentration
von 1 mikromolar vor. Das Produkt dieser Reaktion war ein intaktes,
sieben Nukleotide langes Fragment, nämlich 5'32P-TTATTTC-OH,
was einer 1,5 × 104fachen Amplifikation entsprach.
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Sonde 5: 5'GAT-TAG-GAT-TAG-GAT-TAG-TCG-TGG-GAA-CAA-ACG-GCG-GAT3' (SEQ ID NO:
5) wurde unter Verwendung eines Pharmacia Gen Assembler hergestellt
und wies 39 Nukleotide auf, wobei 19 Nukleotide an ihrem 5'-Ende
mit der Ziel-DNA weder komplementär waren noch mit ihr hybridisierten.
Das Produkt dieser Reaktion war ein intaktes, 20 Nukleotide langes
Fragment, nämlich 5'32P-GAT-TRG-GAT-TAG-GAT-TAG-TC-OH (SEQ ID
NO: 6), entsprechend einer 1,5 × 104fachen Amplifikation.
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Bei Wiederholung der obigen Reaktionen
in Abwesenheit von Sonde 2 wurde zwar ein Produkt beobachtet, aber
die Intensität
des Flecks auf dem Polyacrylamidgel war deutlich geringer als in
Gegenwart der Sonde 2. Ähnliche
Ergebnisse wurden auch in dem Fall beobachtet, wo ein 1-Nukleotid
Abstand zwischen dem 3'-Ende von Sonde 2 und der zweiten Sonde bestand,
wenn beide Sonden an die Ziel-DNA hybridisiert wurden.
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BEISPIEL 3
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Das in Beispiel 1 beschriebene Reaktionsprotokoll
wurde unter Verwendung von 2 × 10
9 Zielmolekülen sowie der Sonde 5 (siehe
Beispiel 2) in einer Konzentration von 1 mikromolar anstelle der
Sonde 1 wiederholt. Die Reaktionen wurden über einen Zeitraum von 3 Stunden
bei einer Temperatur von 72°C
durchgeführt,
wobei eine von sechs verschiedenen DNA-Polymerasen, nämlich AmpliTaq DNA-Polymerase,
Replitherm(TM) DNA-Polymerase (Epicentre), Tfl(TM) DNA-Polymerase (Epicentre),
Ultra Therm(TM) DNA-Polymerase (Bio/Can Scientific), Thermalase
Tbr(TM) DNR-Polymerase (Amresco) und Panozyme(TM) DNA-Polymerase verwendet
wurde. Das Produkt der Reaktion war ein 20 Nukleotide langes Fragment
(siehe Beispiel 2). Im Folgenden ist eine Zusammenfassung der erhaltenen
Ergebnisse dargestellt.
Enzym | Fragment
(picomol als Einheit) |
| |
AmpliTaq | 32 |
Replitherm | 18 |
Tfl | 5 |
Ultra
Therm | 27 |
Tbr | 16 |
Panozyme | 25 |
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Die obigen Experimente zeigen, daß nachweisbare
Spaltprodukte in einer zielspezifischen Weise bei einer einzigen
Temperatur erzeugt wurden, wobei Enzyme mit einer 5'-Nukleaseaktivität sowie
ein markiertes Oligonukleotid verwendet wurden. Die Anreicherung
an Produkt wurde durch die Anwesenheit eines zweiten Oligonukleotids,
das eine größere Länge als
das erste markierte Oligonukleotid aufwies und das an eine Zielpolynukleotidsequenz
3' von der Hybridisierungsstelle des ersten markierten Oligonukleotids
annealt wurde. Die Reaktionen wurden bei Temperaturen durchgeführt, die
sehr nahe an der Schmelztemperatur (Tm) des markierten Oligonukleotids
mit der Zielpolynukleotidsequenz lagen.
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Die obige Diskussion schließt gewisse
Theorien über
die an der vorliegenden Erfindung beteiligten Mechanismen ein. Diese
Theorien sollten nicht so verstanden werden, als daß sie die
vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise einschränken, da
gezeigt wurde, daß die
vorliegende Erfindung die beschriebenen Ergebnisse erzielt.
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