DE69509925T3

DE69509925T3 - Verfahren und vorrichtung zur herstellung von mikromatrizen für biologische proben

Info

Publication number: DE69509925T3
Application number: DE69509925T
Authority: DE
Inventors: Dari SHALON Tidhar; O. BROWN Patrick
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 2012-07-19
Anticipated expiration: 2015-06-17
Also published as: AU2862995A; JPH10503841A; CA2192005A1; ES2134481T3; EP0804731A1; ES2134481T5; DK0804731T3; EP0804731B1; ATE180570T1; EP0913485A1; GR3030430T3; WO1995035505A1; EP0804731A4; EP0804731B2; CA2192095C; US5807522A; US6110426A; CA2192005C; DE69509925T2; DK0804731T4

Description

Arbeitsgebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Apparatur zur Herstellung von Mikromatrizen von biologischen Proben für Absuchverfahren im großen Maßstab, wie z. B. Matrizen von DNA-Proben, die für DNA-Hybridisierungstests in der genetischen Forschung und Diagnostik eingesetzt werden können.
Referenzen

Abouzied et al., Journal of AOAC International 77 (2) (1994), 495–500;
Bohlander et al., Genomics 13 (1992), 1322–1324;
Drmanac et al., Science 260 (1993), 1649–1652;
Fodor et al., Science 251 (1991), 767–773;
Khrapko et al., DNA Sequence 1 (1991), 375–388;
Kuriyama et al., An ISFET Biosensor, Applied Biosensors, (Donald Wise, Hrsg.), Butterworths (1989), S. 93–114;
Lehrach et al., Hybridization Fingerprinting in Genome Mapping and Sequencing, Genome Analysis, Bd. 1, (Davies und Tilgham, Hrsg.), Cold Spring Harbor Press (1990), S. 39–81;
Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989);
Nelson et al., Nature Genetics 4 (1993), 11–18;
Pirrung et al., US-Patent Nr. 5 143 854 (1992);
Riles et al., Genetics 134 (1993), 81–150;
Schena, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 3894–3898;
Southern et al., Genomics 13 (1992), 1008–1017.

Stand der Technik
Zur Zeit sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Matrizen von biologischen Makromolekülen verfügbar, z. B. Matrizen von Nucleinsäuremolekülen oder Proteinen. Zur Herstellung geordneter DNA-Matrizen auf einer porösen Membran kann ein ”Dot-Blot”-Verfahren verwendet werden. In diesem Verfahren überträgt ein Vakuumverteiler eine große Anzahl, z. B. 96, von wäßrigen DNA-Proben von Vertiefungen mit einem Durchmesser von 3 mm auf eine poröse Membran. Eine herkömmliche Variante dieses Verfahrens ist ein ”Slot-Blot”-Verfahren, wobei die Vertiefungen stark in die Länge gezogene, ovale Formen aufweisen.
Die DNA wird auf der porösen Membran immobilisiert, indem die Membran gebacken oder einer UV-Bestrahlung ausgesetzt wird. Hierbei handelt es sich um einen manuellen Arbeitsgang, mit dem jeweils eine Matrix hergestellt wird, wobei jede Matrix normalerweise auf 96 Proben beschränkt ist. Aus diesem Grund sind ”Dot-Blot”-Verfahren ungeeignet für Anwendungen, bei denen viele tausend Proben getestet werden müssen.
Eine effizientere Technik zur Herstellung geordneter Matrizen von genomischen Fragmenten besteht darin, eine Matrix von Stiften zu verwenden, die in die Vertiefungen, z. B. die 96 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, eingetaucht werden, wodurch eine Matrix von Proben auf ein Substrat, z. B. eine poröse Membran, übertragen werden kann. Eine Matrix umfaßt Stifte, die so angeordnet sind, daß sie eine Membran in einem Zick-Zack-Muster tüpfeln, wodurch eine Matrix von 9216 Punkten auf einer Fläche von 22×22 cm erzeugt wird (Lehrach et al., 1990). Eingeschränkt wird dieses Verfahrens durch die Tatsache, daß das Volumen der DNA, die auf den jeweiligen Punkt der jeweiligen Matrix getüpfelt wird, sehr variabel ist. Außerdem ist die Anzahl der Matrizen, die mit jedem Eintauchen hergestellt werden können, normalerweise ziemlich gering.
Ein anderes Verfahren zur Erzeugung geordneter Matrizen von Nucleinsäuresequenzen wird von Pirrung et al. (1992) und auch von Fodor et al. (1991) beschrieben. Das Verfahren umfaßt die Synthese verschiedener Nucleinsäuresequenzen in bestimmten unterschiedlichen Bereichen eines Trägers. Bei diesem Verfahren erfolgt die Synthese anhand sorgfältig ausgearbeiteter Schemata, wobei die Vorgehensweise im allgemeinen auf relativ kurze Nucleinsäureproben beschränkt ist, z. B. auf Proben mit weniger als 20 Basen. Ein verwandtes Verfahren wurde von Southern et al. (1992) beschrieben.
Khrapko et al. (1991) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung einer Oligonucleotidmatrix, wobei die DNA auf eine dünne Schicht von Polyacrylamid getüpfelt wird. Das Tüpfeln erfolgt manuell mit einer Mikropipette.
Keines der nach dem Stand der Technik beschriebenen Verfahren oder Vorrichtungen wurde für eine Massenproduktion von Mikromatrizen entwickelt, die gekennzeichnet sind (i) durch eine große Zahl von Mikro-Testbereichen, die durch einen Abstand von 50 bis 200 μm oder weniger voneinander getrennt sind, und (ii) durch eine definierte Menge, typischerweise im Picomol-Bereich, des Analyts, das mit dem jeweiligen Bereich der Matrix assoziiert ist.
Außerdem ist die herkömmliche Technologie darauf ausgerichtet, daß solche Tests jeweils einzeln an einer einzigen Matrix von DNA-Molekülen erfolgen. Das gebräuchlichste Verfahren zur Durchführung von DNA-Hybridisierungen mit Matrizen, die auf eine poröse Membran getüpfelt sind, umfaßt z. B. das Versiegeln der Membran in einem Kunststoffbeutel (Maniatis et al., 1989) oder in einem rotierenden Glaszylinder (Robbins Scientific), wobei die markierte Hybridisierungssonde in der geschlossenen Kammer vorliegt. Bei Matrizen, die auf nicht-porösen Oberflächen hergestellt werden, wie z. B. einem Mikroskop-Objektträger, wird jede Matrix mit der markierten Hybridisierungssonde, abgedeckt mit einem Deckgläschen, inkubiert. Bei diesen Techniken ist für jede Matrix eine eigene geschlossene Kammer erforderlich, weshalb das Absuchen und die Handhabung von vielen Matrizen umständlich und zeitaufwendig ist.
Abouzied et al., (1994), beschreiben ein Verfahren, wobei waagerechte Linien von Antikörpern auf eine Nitrocellulosemembran gedruckt werden und die Bereiche der Membran durch senkrechte Streifen eines hydrophoben Materials voneinander getrennt werden. Anschließend wird jeder senkrechte Streifen mit einem anderen Antigen umgesetzt und die Reaktion zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem jeweiligen Antigen nachgewiesen, wobei eine herkömmliche kolorimetrische ELISA-Technik angewendet wird. Die Technik von Abouzied ermöglicht das gleichzeitige Absuchen vieler eindimensionaler Matrizen auf einem einzigen Nitrocellulosebogen. Abouzied macht die Nitrocellulose etwas hydrophob, indem er mit einem ”PAP-Pen” (Research Products International) eine Linie zieht. Jedoch ist die von Abouzied beschriebene Technologie nicht in der Lage, die Poren der Nitrocellulose vollständig zu verschließen. Die Poren der Nitrocellulose sind physikalisch noch offen und somit können die Testreagenzien während längeren Inkubationen bei einer hohen Temperatur oder in Gegenwart von Detergenzien durch die hydrophobe Schranke auslaufen, weshalb die Technik von Abouzied für DNA-Hybridisierungstests nicht geeignet ist.
Es gibt poröse Membranen mit aufgedruckten Mustern von hydrophilen/hydrophoben Bereichen für bestimmte Anwendungen, wie z. B. geordnete Matrizen von Bakterienkolonien. QA Life Sciences (San Diego, CA) stellt eine solche Membran mit einem darauf gedruckten Gittermuster her. Jedoch weist diese Membran den gleichen Nachteil auf wie die Technik von Abouzied, da die Reagenzien noch zwischen den gitterförmigen Matrizen durchfließen können, weshalb sie für getrennte DNA-Hybridisierungstests nicht geeignet sind.
Die Pall Corporation stellt eine Platte mit 96 Vertiefungen mit einem porösen Filter her, das mit dem Boden der Platte durch Hitze versiegelt wird. In diesen Platten können in jeder Vertiefung andere Reagenzien enthalten sein, ohne daß eine Kreuz-Verunreinigung stattfindet. Jedoch soll jede Vertiefung nur ein Zielelement enthalten, während durch die hier beschriebene Erfindung in jedem unterteilten Bereich des festen Trägers eine Mikromatrix von vielen Biomolekülen hergestellt wird. Außerdem sind die Platten mit 96 Vertiefungen mindestens 1 cm dick, weshalb die Vorrichtung bei vielen kolorimetrischen, fluoreszierenden und radioaktiven Nachweisverfahren nicht eingesetzt werden kann, da hierfür die Membran auf der Oberfläche der Nachweisvorrichtung glatt aufliegen muß. Bei der hier beschriebenen Erfindung ist nach dem Testschritt keine weitere Bearbeitung erforderlich, da die Barriereelemente flach sind und den Nachweisschritt nicht stören, was deutliche Vorteile bietet.
Die Hyseq Corporation hat ein Verfahren zur Herstellung einer ”Matrix von Matrizen” auf einem nicht-porösen festen Träger beschrieben, die zu ihrer ”Sequenzierung durch Hybridisierungs”-Technik eingesetzt werden kann. Das von Hyseq beschriebene Verfahren umfaßt die Modifizierung der Chemie des festen Substrats, so daß ein hydrophobes Gittermuster entsteht, wobei jeder unterteilte Bereich eine Mikromatrix von Biomolekülen enthält. Bei dem flachen hydrophoben Muster von Hyseq erfolgt keine physikalische Blockierung als weitere Maßnahme, um eine Kreuz-Verunreinigung zu verhindern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung umfaßt in einem Aspekt ein Verfahren zur Herstellung einer Mikromatrix von Analyt-Testbereichen auf einem festen Träger, wobei jeder Bereich in der Matrix eine bekannte Menge eines ausgewählten Analyt-spezifischen Reagens aufweist. Das Verfahren umfaßt zuerst das Einfüllen einer Lösung eines ausgewählten Analyt-spezifischen Reagens in eine Reagens-Ausgabevorrichtung, die einen in die Länge gezogenen Kapillarkanal aufweist, der (i) durch mit einem Abstand angeordnete, in die Länge gezogene Einheiten von gleicher Ausdehnung gebildet wird, der (ii) so konstruiert ist, daß er eine bestimmte Menge der Reagenslösung faßt und der (iii) einen Spitzenbereich aufweist, in welchem die wäßrige Lösung im Kanal einen Meniskus bildet. Der Kanal wird vorzugsweise durch ein Paar von mit einem Abstand angeordneten, spitz zulaufenden Elementen gebildet.
Die Spitze der Ausgabevorrichtung wird an einer definierten Stelle der Trägeroberfläche mit einem Impuls gegen den festen Träger getippt, der bewirkt, daß der Meniskus im Kapillarkanal gebrochen und ein ausgewähltes Volumen der Lösung auf die Oberfläche aufgetragen wird, vorzugsweise ein ausgewähltes Volumen im Bereich von 0,01 bis 100 nl. Die zwei Schritte werden so lange wiederholt, bis die gewünschte Matrix hergestellt ist.
Das Verfahren kann durchgeführt werden, indem eine große Anzahl solcher Matrizen hergestellt wird, wobei in jedem Wiederholungszyklus bei jedem von einer großen Anzahl von festen Trägern der Schritt zum Auftragen der Lösung an einer ausgewählten Stelle erfolgt.
Die Ausgabevorrichtung kann mit einer neuen Lösung gefüllt werden, wobei die folgenden Schritte erfolgen: (i) Eintauchen des Kapillarkanals der Vorrichtung in eine Waschlösung, (ii) Entfernen der in den Kapillarkanal aufgezogenen Waschlösung und (iii) Eintauchen des Kapillarkanals in die neue Reagenslösung.
Außerdem umfaßt die Erfindung eine automatische Apparatur zur Herstellung einer Mikromatrix von Analyt-Testbereichen auf einer großen Anzahl von festen Trägern, wobei jeder Bereich in der Matrix eine bekannte Menge eines ausgewählten Analyt-spezifischen Reagens aufweist. Die Apparatur besitzt einen Halter, mit dem eine Vielzahl von ebenen Trägern in bekannten Positionen gehalten werden können, und eine Reagens-Ausgabevorrichtung der vorstehend beschriebenen Art, wobei der Kapillarkanal seitlich offen ist.
Die Apparatur umfaßt ferner eine Positionierungskonstruktion, mit der die Ausgabevorrichtung an einer ausgewählten Matrixstelle, bezogen auf einen in diesem Halter vorliegenden Träger, positioniert wird, und eine Ausgabekonstruktion, mit der die Ausgabevorrichtung auf den festen Träger zu bewegt und mit einem ausgewählten Impuls dagegen getippt wird, wodurch ein ausgewähltes Volumen auf die Oberfläche aufgetragen wird, z. B. ein ausgewähltes Volumen im Volumenbereich von 0,01 bis 100 nl.
Die Positionierungs- und Ausgabekonstruktionen werden durch eine Steuereinheit in der Apparatur gesteuert. Die Einheit arbeitet folgendermaßen: (i) die Ausgabevorrichtung wird an der Füllstation plaziert, (ii) der Kapillarkanal in der Vorrichtung wird an der Füllstation in ein ausgewähltes Reagens eingetaucht, wodurch die Ausgabevorrichtung mit dem Reagens gefüllt wird, und (iii) das Reagens wird an einer definierten Matrixposition auf jeden der Träger, die auf dem Halter vorliegen, aufgetragen. Die Einheit kann außerdem so arbeiten, daß am Ende des Ausgabezyklus die Ausgabevorrichtung gewaschen wird, indem (i) die Ausgabevorrichtung an einer Waschstation plaziert wird, (ii) der Kapillarkanal in der Vorrichtung in eine Waschflüssigkeit eingetaucht wird, so daß die Ausgabevorrichtung mit der Flüssigkeit gefüllt wird, und (iii) die Waschflüssigkeit entfernt wird, bevor die Ausgabevorrichtung mit einem ausgewählten frischen Reagens gefüllt wird.
Die Ausgabevorrichtung in der Apparatur kann zusammen mit einer großen Anzahl solcher Vorrichtungen auf dem Arm angebracht sein, so daß unterschiedliche Analyt-Testreagenzien an ausgewählten, mit Abstand angeordneten Matrixpositionen ausgegeben werden können.
In einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung ein Substrat mit einer Oberfläche, die in einem Oberflächenbereich von weniger als etwa 1 cm² eine Mikromatrix von mindestens 10³ verschiedenen Polynucleotid-Biopolymeren aufweist. Jedes einzelne Biopolymer wird (i) an einer unterschiedlichen definierten Position in der Matrix aufgetragen, weist (ii) eine Länge von mindestens 50 Untereinheiten auf und liegt (iii) in einer definierten Menge zwischen etwa 0,1 Femtomol und 100 Nanomol vor.
In einer Ausführungsform ist die Oberfläche eine Glasobjektträger-Oberfläche, die mit einem polykationischen Polymer beschichtet ist, wie z. B. Polylysin, und die Biopolymere sind Polynucleotide mit einer Länge von mindestens 50 Untereinheiten. In einer anderen Ausführungsform besitzt dieses Substrat eine wasserundurchlässige Unterlage, einen auf der Unterlage angebrachten wasserdurchlässigen Film und ein auf dem Film angeordnetes Gitter. Das Gitter besteht aus sich überschneidenden wasserundurchlässigen Gitterelementen, die sich von der Unterlage bis über die Oberfläche des Films heraus erstrecken, und teilt den Film in eine große Anzahl von wasserundurchlässigen Zellen ein. Innerhalb jeder Vertiefung wird eine Biopolymermatrix ausgebildet.
Dieses Substrat wird bereitgestellt, um die Bindung von markierten Polynucleotiden an eines oder mehrere von einer Vielzahl von immobilisierten Polynucleotiden mit unterschiedlichen Sequenzen nachweisen zu können. Dieses Substrat umfaßt in einem Aspekt einen Glasträger, eine Beschichtung mit einem polykationischen Polymer, wie z. B. Polylysin, auf der Oberfläche des Trägers und eine Matrix von unterschiedlichen Polynucleotiden, die elektrostatisch, nicht-kovalent an die Beschichtung gebunden sind, wobei jedes einzelne Biopolymer an einer unterschiedlichen definierten Position einer Oberflächenmatrix von Polynucleotiden aufgetragen ist.
In einem anderen Aspekt umfaßt dieses Substrat eine wasserundurchlässige Unterlage, einen auf der Unterlage angeordneten wasserdurchlässigen Film und ein auf dem Film angeordnetes Gitter, wobei das Gitter aus sich überschneidenden wasserundurchlässigen Gitterelementen besteht, die sich von der Unterlage bis über die Oberfläche des Films heraus erstrecken, wodurch eine große Anzahl von wasserundurchlässigen Zellen hergestellt wird. Innerhalb jeder Zelle wird eine Biopolymermatrix ausgebildet.
Die Aufgaben der Erfindung werden durch die Merkmale der Ansprüche gelöst. Außerdem werden die Aufgaben und Merkmale der Erfindung durch die folgende genaue Beschreibung der Erfindung und die beigefügten Figuren verdeutlicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Seitenansicht einer Reagens-Ausgabevorrichtung mit einem offen-kapillaren Ausgabekopf, die für die Verwendung in einer Ausführungsform der Erfindung konstruiert wurde;
die 2A bis 2C erläutern die Schritte beim Auftragen eines Tropfens mit einem bestimmten Volumen auf eine hydrophobe Oberfläche unter Verwendung des Ausgabekopfes von 1 gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
3 zeigt einen Teil einer zweidimensionalen Matrix von Analyt-Testbereichen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung konstruiert wurde;
4 zeigt die Draufsicht von Komponenten einer automatischen Apparatur zur Herstellung von Matrizen gemäß der Erfindung;
5 zeigt das Fluoreszenzbild einer echten 20×20-Matrix von 400 Fluoreszenz-markierten DNA-Proben, immobilisiert auf einem mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger, wobei die Gesamtfläche, die durch die 400-Elemente-Matrix bedeckt ist, 16 mm² beträgt;
6 zeigt das Fluoreszenzbild einer 1,8 cm×1,8 cm-Mikromatrix, die Lambda-Clone mit Hefeinsertionen enthält, wobei das Fluoreszenzsignal durch die Hybridisierung mit der Matrix zustande kommt, bei der etwa die Hälfte des Hefegenoms mit einem grünen Fluorophor und die andere Hälfte mit einem roten Fluorophor markiert ist;
7 zeigt die Übersetzung des Hybridisierungsbildes von 6 in den Karyotyp des Hefegenoms, wobei die Elemente der Mikromatrix von 6 DNA-Sequenzen der Hefe enthalten, die vorher in Hefegenom physikalisch kartiert worden waren;
8 zeigt ein Fluoreszenzbild einer 0,5 cm×0,5 cm-Mikromatrix von 24 cDNA-Clonen, wobei die Mikromatrix gleichzeitig mit der Gesamt-cDNA aus einer Arabidopsis-Wildtyppflanze, markiert mit einem grünen Fluorophor, und der Gesamt-cDNA aus einer transgenen Arabidopsis-Pflanze, markiert mit einem roten Fluorophor, hybridisiert wurde und der Pfeil auf den cDNA-Clon zeigt, der das in die transgene Arabidopsis-Pflanze eingeführte Gen darstellt;
9 zeigt die Draufsicht eines Substrats, das eine Matrix von Zellen aufweist, die durch Barriereelemente in Form eines Gitters gebildet werden;
10 zeigt die vergrößerte Draufsicht von einer der Zellen in dem Substrat von 9, wobei eine Matrix von Polynucleotidbereichen in der Zelle dargestellt ist;
11 zeigt einen vergrößerten Querschnitt des Substrats von 9, der entlang einer Schnittlinie in dieser Figur aufgenommen wurde; und
12 zeigt ein gescanntes Bild eines festen Nitrocelluloseträgers von 3 cm × 3 cm, der in jedem der vier Quadranten vier identische Matrizen von M13-Clonen enthält, wobei jeder Quadrant gleichzeitig mit einem unterschiedlichen Oligonucleotid unter Verwendung eines ”open face”-Hybridisierungsverfahrens hybridisiert wurde.
Genaue Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Sofern nicht anders angegeben haben die nachstehend definierten Begriffe die folgende Bedeutung:
”Ligand” bezieht sich auf den einen Partner eines Ligand/Antiligand-Bindungspaares. Der Ligand kann z. B. einer der Nucleinsäurestränge in einem Bindungspaar eines komplementären hybridisierten Nucleinsäuredoppelstranges; ein Effektormolekül in einem Effektor/Rezeptor-Bindungspaar; oder ein Antigen in einem Antigen/Antikörper- oder Antigen/Antikörperfragment-Bindungspaar sein.
”Antiligand” bezieht sich auf den anderen Partner eines Ligand/Antiligand-Bindungspaares. Der Antiligand kann der andere Nucleinsäurestrang in einem Bindungspaar eines komplementären hybridisierten Nucleinsäuredoppelstranges; ein Rezeptormolekül in einem Effektor/Rezeptor-Bindungspaar; oder ein Antikörper oder ein Antikörperfragment in einem Antigen/Antikörper- bzw. Antigen/Antikörperfragment-Bindungspaar sein.
”Analyt” oder ”Analytmolekül” bezieht sich auf ein Molekül, typischerweise ein Makromolekül, wie z. B. ein Polynucleotid oder Polypeptid, dessen Vorliegen, Menge und/oder Identität bestimmt werden sollen. Das Analyt ist der eine Partner eines Ligand/Antiligand-Bindungspaares.
”Analyt-spezifisches Testreagens” bezieht sich auf ein Molekül, das spezifisch an ein Analytmolekül binden kann. Das Reagens ist der andere Partner eines Ligand/Antiligand-Bindungspaares.
Eine ”Matrix von Bereichen auf einem festen Träger” ist eine lineare oder zweidimensionale Matrix von vorzugsweise getrennten Bereichen, die jeweils eine begrenzte Fläche aufweisen, hergestellt auf der Oberfläche eines festen Trägers.
Eine ”Mikromatrix” ist eine Matrix von Bereichen mit einer Dichte von getrennten Bereichen von mindestens etwa 100/cm² und vorzugsweise von mindestens etwa 1000/cm². Die Bereiche in einer Mikromatrix zeigen typische Abmessungen, z. B. Durchmesser im Bereich zwischen etwa 10 und 250 μm, und haben zu den anderen Bereichen in der Matrix etwa den gleichen Abstand.
Eine Trägeroberfläche ist ”hydrophob”, wenn ein auf die Oberfläche aufgetragenes Tröpfchen eines wäßrigen Mediums sich im wesentlichen nicht über den Bereich des aufgetragenen Tröpfchens hinaus ausbreitet. Das heißt, die Oberfläche bewirkt durch hydrophobe Wechselwirkung mit dem Tröpfchen, daß die Ausbreitung des auf die Oberfläche aufgetragenen Tröpfchens verhindert wird.
Ein ”Meniskus” bedeutet eine konkave oder konvexe Oberfläche, die an der Unterseite einer Flüssigkeit in einem Kanal als Folge der Oberflächenspannung der Flüssigkeit entsteht.
”Verschiedenartige Biopolymere”, wie bei den Biopolymeren zur Herstellung einer Mikromatrix verwendet, bezeichnen einen Matrixpartner, der sich von anderen Matrixpartnern unterscheidet aufgrund einer unterschiedlichen Biopolymersequenz und/oder unterschiedlicher Konzentrationen der gleichen oder verschiedenartiger Biopolymere und/oder unterschiedlicher Gemische aus verschiedenartigen Biopolymeren oder aus Biopolymeren mit unterschiedlichen Konzentrationen. Somit bedeutet eine Matrix von ”verschiedenartigen Polynucleotiden” eine Matrix, die als Partner enthält: (i) verschiedenartige Polynucleotide, wobei von jedem Partner eine definierte Menge vorliegen kann, (ii) unterschiedliche abgestufte Konzentrationen von Polynucleotiden mit einer bestimmten Sequenz und/oder (iii) Gemische mit unterschiedlicher Zusammensetzung aus zwei oder mehr verschiedenartigen Polynucleotiden.
”Zelltyp” bedeutet eine Zelle aus einer bestimmten Quelle, z. B. einem Gewebe oder Organ, oder eine Zelle in einem bestimmten Differenzierungsstadium oder eine Zelle, die mit einer bestimmten Pathologie oder genetischen Aufmachung assoziiert ist.
II. Verfahren zur Herstellung einer Mikromatrix
Dieser Abschnitt beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Mikromatrix von Analyt-Testbereichen auf einem festen Träger oder Substrat, wobei jeder Bereich in der Matrix eine bekannte Menge eines ausgewählten Analyt-spezifischen Reagens enthält.
1 erläutert in teilweise schematischer Ansicht eine Reagens-Ausgabevorrichtung 10, die für die Durchführung des Verfahrens geeignet ist. Die Vorrichtung umfaßt im allgemeinen ein Reagens-Ausgabegerät 12, das einen in die Länge gezogenen, offenen Kapillarkanal 14 aufweist, der so konstruiert ist, daß er eine bestimmte Menge der Reaktionslösung, mit 16 bezeichnet, enthalten kann, wie nachstehend beschrieben. Der Kapillarkanal wird durch ein Paar von mit einem Abstand angeordneten, in die Länge gezogenen Einheiten mit gleicher Ausdehnung, 12a und 12b, gebildet, die aufeinander spitz zulaufen und sich an einer Spitze oder in einem Spitzenbereich 18 am unteren Ende des Kanals nähern. Allgemeiner wird der offene Kanal durch mindestens zwei in die Länge gezogene, mit einem Abstand angeordnete Einheiten gebildet, die so konstruiert sind, daß sie eine bestimmte Menge der Reaktionslösungen fassen und einen Spitzenbereich aufweisen, in welchem die wäßrige Lösung im Kanal einen Meniskus bildet, wie z. B. den in 2A mit 20 bezeichneten konkaven Meniskus. Die Vorteile der Konstruktion des Ausgabegerätes als offener Kanal werden nachstehend diskutiert.
Weiterhin mit Bezug auf 1 umfaßt die Ausgabevorrichtung außerdem eine Konstruktion, womit das Ausgabegerät rasch auf eine Trägeroberfläche zu und von ihr weg bewegt werden kann, so daß eine bekannte Menge einer in dem Ausgabegerät vorliegenden Lösung auf einen Träger aufgetragen werden kann, wie nachstehend mit Bezug auf die 2A bis 2C beschrieben wird. In der gezeigten Ausführungsform umfaßt diese Konstruktion ein Solenoid 22, das aktiviert werden kann, so daß es einen Solenoid-Kolben 24 rasch nach unten zieht und den Kolben anschließend freigibt, z. B. durch eine Federwirkung, wodurch er in die normale, erhöhte Position zurückgeht, wie dargestellt. Das Ausgabegerät ist mit dem Kolben über eine Verbindungseinheit 26 verbunden, wie dargestellt. Das vorstehend beschriebene Bewegungsinstrument wird hier auch als Ausgabeinstrument bezeichnet, womit das Ausgabegerät bewegt werden kann, so daß es mit einem festen Träger in Kontakt kommt, um ein bekanntes Volumen einer Flüssigkeit auf den Träger auszugeben.
Die gerade beschriebene Ausgabevorrichtung ist auf einem Arm 28 befestigt, der entweder linear oder in einer x-y-Ebene bewegt werden kann, so daß das Ausgabegerät an einer ausgewählten Verabreichungsstelle positioniert werden kann, wie noch beschrieben wird.
Die 2A bis 2C erläutern das Verfahren zum Auftragen einer bekannten Menge der in dem gerade beschriebenen Ausgabegerät vorliegenden Reagenslösung auf die Oberfläche eines festen Trägers, z. B. des mit 30 bezeichneten Trägers. Der Träger ist ein Polymer, ein Glas oder ein anderes festes Substrat, das eine mit 31 bezeichnete Oberfläche aufweist.
In einer allgemeinen Ausführungsform ist die Oberfläche eine relativ hydrophile, d. h. eine benetzbare Oberfläche, z. B. eine Oberfläche, die native, gebundene oder kovalent angelagerte geladene Gruppen aufweist. Eine solche Oberfläche, die nachstehend beschrieben wird, ist eine Glasoberfläche mit einer absorbierten Schicht eines polykationischen Polymers, wie z. B. Poly-L-Lysin.
In einer anderen Ausführungsform besitzt die Oberfläche einen relativ hydrophoben Charakter, oder sie wird so bearbeitet, daß sie einen relativ hydrophoben Charakter aufweist, d. h. einen, der bewirkt, daß ein auf die Oberfläche aufgetragenes wäßriges Medium als Tropfen vorliegt. Verschiedene bekannte hydrophobe Polymere, wie z. B. Polystyrol, Polypropylen oder Polyethylen besitzen die gewünschten hydrophoben Eigenschaften, wie auch Glas und verschiedenste Gleitmittel oder andere hydrophobe Filme, die auf der Oberfläche des Trägers aufgetragen werden können.
Als erstes wird das Ausgabegerät mit einer ausgewählten Analyt-spezifischen Reagenslösung gefüllt, indem man z. B. die Spitze des Ausgabegerätes nach dem Waschen in eine Lösung des Reagens eintaucht, so daß der Kanal des Ausgabegerätes durch Kapillarwirkung gefüllt wird. Sodann wird das Ausgabegerät zu einer ausgewählten Stelle auf einer Trägeroberfläche bewegt, wobei die Spitze des Ausgabegerätes direkt über der Stelle der Trägeroberfläche plaziert wird, an der das Reagens aufgetragen werden soll. Während dieser Bewegung befindet sich die Spitze des Ausgabegerätes in der erhöhten Position, vgl. 2A, wobei sich die Spitze typischerweise mindestens mehrere 1 bis 5 mm über der Oberfläche des Substrats befindet.
Wenn das Ausgabegerät jetzt richtig positioniert ist, wird das Solenoid 22 aktiviert, so daß sich die Spitze des Ausgabegerätes rasch auf die Oberfläche des Substrats zu und wieder davon weg bewegt, so daß ein kurzer Kontakt mit der Oberfläche entsteht, wobei die Spitze des Ausgabegerätes tatsächlich gegen die Trägeroberfläche tippt. Die Tippbewegung der Spitze gegen die Oberfläche bewirkt, daß der Meniskus der Flüssigkeit im Kanal an der Spitze gebrochen wird, so daß die Flüssigkeit in der Spitze mit der Trägeroberfläche in Kontakt kommt. Dies hat seinerseits ein Ausfließen der Flüssigkeit in den Kapillarraum zwischen der Spitze und der Oberfläche zur Folge, wodurch bewirkt wird, daß Flüssigkeit aus dem Kanal des Ausgabegerätes herausgezogen wird, wie in 2B zu sehen ist.
2C zeigt den Ausfluß der Flüssigkeit aus der Spitze auf die Trägeroberfläche, die in diesem Fall eine hydrophobe Oberfläche ist. In der Figur wird erläutert, daß die Flüssigkeit so lange aus dem Ausgabegerät auf die Trägeroberfläche ausfließt, bis ein Flüssigkeitstropfen 32 entstanden ist. Bei einer bestimmten Tropfengröße, d. h. bei einem bestimmten Volumen, wird die Tendenz der Flüssigkeit, auf die Oberfläche auszufließen, im Gleichgewicht gehalten durch die hydrophobe Oberflächen-Wechselwirkung des Tropfens mit der Trägeroberfläche, welche bewirkt, daß der gesamte Tropfenbereich auf der Oberfläche begrenzt wird, und durch die Oberflächenspannung des Tröpfchens, die eine bestimmte Tropfenrundung anstrebt. Zu diesem Zeitpunkt ist ein bestimmtes Tropfenvolumen erreicht, wobei der weitere Kontakt der Spitze des Ausgabegerätes mit dem Tropfen, wenn die Spitze des Ausgabegerätes zurückgezogen wird, nur noch eine geringe oder gar keine Auswirkung auf das Volumen des Tropfens hat.
Wenn eine Flüssigkeit auf eine hydrophilere Oberfläche ausgegeben wird, zeigt die Flüssigkeit eine geringere Tendenz, einen Tropfen zu bilden, und das ausgegebene Volumen ist empfindlicher gegenüber der gesamten Verweilzeit der Spitze des Ausgabegerätes in unmittelbarer Nähe der Trägeroberfläche, z. B. in den Positionen, die in den 2B und 2C dargestellt sind.
Das gewünschte Auftragevolumen, d. h. das Tropfenvolumen, das durch dieses Verfahren erzeugt wird, liegt vorzugsweise im Bereich von 2 pl (Picoliter) bis 2 nl (Nanoliter), wobei jedoch auch Volumina bis zu einer Größe von 100 nl oder mehr ausgegeben werden können. Es soll so verstanden werden, daß das gewählte ausgegebene Volumen abhängig ist von (i) dem ”Fußabdruck” der Spitze des Ausgabegerätes, d. h. der Größe der durch die Spitze bedeckten Fläche, (ii) der Hydrophobie der Trägeroberfläche und (iii) der Kontaktzeit mit der Trägeroberfläche und der Geschwindigkeit des Zurückziehens der Spitze von der Trägeroberfläche. Außerdem kann die Größe des Tropfens reduziert werden, indem die Viskosität des Mediums erhöht wird, wodurch in Wirklichkeit die Ausflußzeit der Flüssigkeit aus dem Ausgabegerät auf die Trägeroberfläche reduziert wird. Die Größe des Tropfens kann weiterhin beschränkt werden, indem der Tropfen auf einen hydrophilen Bereich aufgetragen wird, der von einem hydrophoben Gittermuster auf der Trägeroberfläche umgeben ist.
In einer typischen Ausführungsform wird die Spitze des Ausgabegerätes rasch gegen die Trägeroberfläche getippt, wobei die Verweilzeit in Kontakt mit dem Träger insgesamt weniger als etwa 1 msec und die Geschwindigkeit der Aufwärtsbewegung von der Oberfläche weg etwa 10 cm/sec beträgt.
Wenn man annimmt, daß der Tropfen, der sich beim Kontakt mit der Oberfläche bildet, ein halbkugelförmiger Tropfen ist, der einen Durchmesser aufweist, der etwa gleich groß ist wie die Breite der Spitze des Ausgabegerätes, wie in 2C dargestellt, besteht zwischen dem Volumen des gebildeten Tropfens und der Breite der Spitze des Ausgabegerätes (d) der in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigte Zusammenhang. Wie zu sehen ist, liegt das Volumen des Tropfens bei einer zunehmenden Breite von etwa 20 bis auf 200 μm im Bereich zwischen 2 pl und 2 nl. Tabelle 1

d Volumen (nl)

20 μm 2 × 10^–3

50 μm 3,1 × 10^–2

100 μm 2,5 × 10^–1

200 μm 2
Bei einer bestimmten Spitzengröße kann das Volumen des Tropfens auf gesteuerte Art und Weise reduziert werden, indem die Hydrophobie der Oberfläche erhöht, die Kontaktzeit der Spitze mit der Oberfläche verkürzt, die Geschwindigkeit der Bewegung der Spitze weg von der Oberfläche gesteigert und/oder die Viskosität des Mediums erhöht wird. Wenn diese Parameter festgelegt sind, läßt sich ein gewähltes Volumen in einem gewünschten pl- bis nl-Bereich wiederholbar auftragen.
Nach dem Auftragen eines Tropfens an einer ausgewählten Stelle auf einem Träger wird die Spitze typischerweise zu einer entsprechenden Stelle auf einem zweiten Träger bewegt, sodann wird an dieser Stelle ein Tropfen aufgetragen und dieses Verfahren so lange wiederholt, bis auf jedem von einer großen Anzahl von Trägern ein Flüsskeitstropfen des Reagens an einer ausgewählten Stelle aufgetragen ist.
Sodann wird die Spitze gewaschen, um die Reagensflüssigkeit zu entfernen, anschließend wird sie mit einer anderen Reagensflüssigkeit gefüllt, und nun wird dieses Reagens an einer anderen Matrixposition jedes Trägers aufgetragen. In einer Ausführungsform wird die Spitze gewaschen und wiedergefüllt, wobei die folgenden Schritte erfolgen: (i) Eintauchen des Kapillarkanals der Vorrichtung in eine Waschlösung, (ii) Entfernen der in den Kapillarkanal aufgezogenen Waschlösung und (iii) Eintauchen des Kapillarkanals in die neue Reagenslösung.
Aus dem Vorstehenden ist zu ersehen, daß die Pinzettenartige, offen-kapillare Spitze des Ausgabegerätes die folgenden Vorteile bietet: (i) der offene Kanal der Spitze erleichtert ein rasches, effizientes Waschen und Trocknen, bevor die Spitze wieder mit einem neuen Reagens gefüllt wird, (ii) die Probe kann direkt durch passive Kapillarwirkung aus einer herkömmlichen Mikrotiterplatte eingefüllt werden, so daß eine ausreichende Menge der Probe in dem offen-kapillaren Reservoir verbleibt, um zahlreiche Matrizen herstellen zu können, (iii) offene Kapillaren neigen weniger zu Verstopfung als geschlossene Kapillaren und (iv) bei offenen Kapillaren ist keine perfekt geglättete Oberfläche der Unterseite für das Auftragen der Flüssigkeit erforderlich.
Ein Teil einer Mikromatrix 36, die auf der Oberfläche 38 eines festen Trägers 40 gemäß dem gerade beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, ist in 3 dargestellt. Die Matrix besteht aus einer großen Anzahl von Analyt-spezifischen Reagensbereichen, wie den Bereichen 42, wobei jeder Bereich ein unterschiedliches Analyt-spezifisches Reagens umfassen kann. Wie vorstehend angegeben, beträgt der Durchmesser jedes Bereichs vorzugsweise zwischen etwa 20 und 200 μm. Der Abstand zwischen jedem Bereich und seinem nächsten (nicht-diagonalen) Nachbarn, gemessen von Mittelpunkt zu Mittelpunkt (mit 44 bezeichnet), liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis 400 μm. Somit enthält eine Matrix, die z. B. einen Abstand von Mittelpunkt zu Mittelpunkt von etwa 250 μm aufweist, etwa 40 Bereiche pro cm oder 1600 Bereiche pro cm². Nach der Herstellung der Matrix wird der Träger behandelt, um die Flüssigkeit des Tropfens, das den jeweiligen Bereich bildet, zu verdampfen, so daß eine gewünschte Matrix von getrockneten, relativ flachen Bereichen erhalten wird. Diese Trocknung kann durch Erhitzen oder unter Vakuum erfolgen.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, die Tropfen, die die Analyt-Reagenzien enthalten, zuerst zu rehydratisieren, so daß mehr Zeit für die Adsorption an den festen Träger zur Verfügung steht. Auch besteht die Möglichkeit, die Analyt-Reagenzien in einer feuchten Umgebung auszutüpfeln, so daß die Tropfen nicht trocknen, bis die Herstellung der Matrix abgeschlossen ist.
III. Automatische Apparatur zur Herstellung von Matrizen
In einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung eine automatische Apparatur zur Herstellung einer Matrix von Analyt-Testbereichen auf einem festen Träger, wobei jeder Bereich in der Matrix eine bekannte Menge eines ausgewählten Analyt-spezifischen Reagens enthält.
Die Apparatur ist in 4 in Draufsicht und in teilweise schematischer Ansicht dargestellt. Eine Ausgabevorrichtung 72 in der Apparatur weist die vorstehend mit Bezug auf 1 beschriebene Basiskonstruktion auf und umfaßt ein Ausgabegerät 74, das einen offenen Kapillarkanal besitzt, der mit einer Spitze endet, im wesentlichen wie in den 1 und 2A bis 2C dargestellt.
Das Ausgabegerät ist in der Vorrichtung so angebracht, daß es auf eine Ausgabeposition hin und von ihr weg bewegt werden kann, wo die Spitze des Ausgabegerätes eine Trägeroberfläche antippt, wodurch ein ausgewähltes Volumen der Reagenslösung ausgegeben wird, wie vorstehend beschrieben. Diese Bewegung wird durch ein Solenoid 76 bewirkt, wie vorstehend beschrieben. Das Solenoid 76 wird durch eine Steuereinheit 77 gesteuert, deren Arbeitsweise nachstehend beschrieben wird. Das Solenoid wird hier auch als Ausgabeinstrument bezeichnet, mit dessen Hilfe die Vorrichtung mit einem Träger in Tippkontakt gebracht werden kann, wenn die Vorrichtung an einer definierten Matrixstelle, bezogen auf diesen Träger, positioniert wird.
Die Ausgabevorrichtung ist auf einem Arm 74 angebracht, der über ein Gewinde auf einem Schneckengewinde 80 montiert ist, welches durch einen Schrittschaltmotor 82 in eine gewünschte Richtung angetrieben (rotiert) wird, der auch durch die Einheit 77 gesteuert wird. An seinem linken Ende in der Figur wird das Gewinde 80 in einer Muffe 84 gehalten, so daß es um die Gewindeachse rotieren kann. An seinem anderen Ende ist das Gewinde an der Antriebswelle des Schrittschaltmotors befestigt, die ihrerseits an einer Muffe 86 befestigt ist. Die Ausgabevorrichtung, das Schneckengewinde, die zwei Muffen zur Befestigung des Schneckengewindes und der Schrittschaltmotor, die zur Bewegung der Vorrichtung in der Figur in ”x”-Richtung (horizontal) dienen, bilden zusammen die Einheit, die hier insgesamt mit Verschiebungseinheit 86 bezeichnet wird.
Die Verschiebungseinheit ist so konstruiert, daß eine genaue Bewegung im Mikrobereich in der Richtung des Gewindes erfolgen kann, d. h. entlang einer x-Achse in der Figur. In einem Modus bewirkt die Einheit, daß das Ausgabegerät entlang der x-Achse in Schritten mit einem gewählten Abstand im Bereich von 5 bis 25 μm bewegt wird. In einem anderen Modus kann das Ausgabegerät entlang der x-Achse in genauen Schritten von mehreren Mikrometer (μm) oder größeren Schritten bewegt werden, so daß das Ausgabegerät an zugeordneten entsprechenden Stellen auf nebeneinander liegenden Trägern positioniert wird, wie nachstehend beschrieben.
Die Verschiebungseinheit ihrerseits ist so montiert, daß sie in der ”y”-Achse (vertikal) der Figur bewegt werden kann, wodurch das Ausgabegerät an einer gewählten Stelle der y-Achse positioniert werden kann. Die Konstruktion, auf der die Einheit montiert ist, umfaßt ein feststehendes Stäbchen 88, das zwischen einem Paar von Rahmenstäben, 90, 92, starr befestigt ist, und ein Schneckengewinde 94, das zwischen einem Paar von Rahmenstäben, 96, 98, zur Rotation befestigt ist. Das Schneckengewinde wird durch einen Schrittschaltmotor 100 angetrieben (rotiert), der durch die Einheit 77 gesteuert wird. Der Motor ist auf dem Stab 96 befestigt, wie dargestellt.
Der gerade beschriebene Aufbau, der das Schneckengewinde 94 und den Motor 100 umfaßt, ist so konstruiert, daß eine genaue Bewegung im Mikrobereich in der Richtung des Gewindes erfolgen kann, d. h. entlang einer y-Achse in der Figur. Wie vorstehend bewirkt der Aufbau in einem Modus, daß das Ausgabegerät entlang der y-Achse in Schritten mit einem gewählten Abstand im Bereich von 5 bis 250 μm bewegt wird, und in einem zweiten Modus, daß das Ausgabegerät entlang der y-Achse in genauen Schritten von mehreren Mikrometer (μm) oder größeren Schritten bewegt wird, so daß das Ausgabegerät an zugeordneten entsprechenden Stellen auf nebeneinander liegenden Trägern positioniert wird.
Die Verschiebungseinheit und die Konstruktion zur Bewegung dieser Einheit in der y-Achse werden hier zusammen als Positionierungsinstrument bezeichnet, mit dem die Ausgabeeinheit an einer ausgewählten Matrixstelle, bezogen auf einen Träger, positioniert werden kann.
Ein Halter 102 in der Apparatur ist so konstruiert, daß er eine große Anzahl von Trägern enthält, wie z. B. die Träger 104, auf denen durch die Apparatur die Mikromatrizen der Reagensbereiche hergestellt werden sollen. Der Halter umfaßt mehrere eingesenkte Ausschnitte, wie z. B. den Ausschnitt 106, die die Träger aufnehmen und sie an bestimmten ausgewählten Positionen positionieren, bezogen auf die Rahmenstäbe, auf denen das Instrument montiert ist, welches das Ausgabegerät bewegt.
Wie vorstehend beschrieben, setzt die Steuereinheit in der Vorrichtung die zwei Schrittschaltmotoren und das Solenoid des Ausgabegerätes in einer bestimmten Reihenfolge in Gang, so daß die Apparatur automatisch arbeiten kann, wodurch auf jedem von einer Vielzahl von Trägern eine ausgewählte Mikromatrix von Reagensbereichen hergestellt werden kann.
Die Steuereinheit ist wie eine herkömmliche Mikroprozessorsteuerung aufgebaut, so daß in einer bestimmten Zeitfolge und mit einer geeigneten Signalzeit geeignete Signale jeweils an das Solenoid und die Schrittschaltmotoren abgegeben werden. Die Konstruktion der Einheit und die Einstellungen, die durch den Anwender so gewählt werden, daß ein gewünschtes Matrixmuster erhalten wird, sind aus der folgenden Beschreibung einer typisch arbeitenden Apparatur ersichtlich.
Als erstes wird ein Träger oder werden mehrere Träger in einen oder mehrere Ausschnitte im Halter eingebracht. Sodann wird das Ausgabegerät zu einer Position direkt über einer Vertiefung bewegt (nicht dargestellt), die eine Lösung des ersten Reagens enthält, das auf den Träger (die Träger) ausgegeben werden soll. Das Ausgabegerät-Solenoid wird nun in Gang gesetzt, so daß die Spitze des Ausgabegerätes in diese Vertiefung eingetaucht wird, wodurch sich der Kapillarkanal im Ausgabegerät füllt. Nun werden die Motoren 82 und 100 in Gang gesetzt, um das Ausgabegerät an einer ausgewählten Matrixposition auf dem ersten der Träger zu positionieren. Sodann bewirkt der Antrieb des Ausgabegerätes durch das Solenoid, daß ein Tropfen mit einem ausgewählten Volumen dieses Reagens an dieser Stelle ausgegeben wird. Wie vorstehend beschrieben, bewirkt dieser Arbeitsgang, daß ein ausgewähltes Volumen, vorzugsweise zwischen 2 pl und 2 nl, der Reagenslösung ausgegeben wird.
Das Ausgabegerät wird anschließend zu der entsprechenden Stelle auf einem benachbarten Träger bewegt und ein gleiches Volumen der Lösung wird an dieser Stelle ausgegeben. Das Verfahren wird so lange wiederholt, bis das Reagens auf jedem Träger an dieser vorher festgelegten Stelle ausgegeben wurde.
Wenn gewünscht wird, ein einziges Reagens an mehr als zwei Matrixpositionen auf einem Träger auszugeben, kann das Ausgabegerät auf jedem Träger an verschiedene Matrixpositionen bewegt werden, bevor das Ausgabegerät zu einem neuen Träger bewegt wird, oder die Lösung kann von den einzelnen Positionen auf jedem Träger, an der einen ausgewählten Position ausgegeben werden und anschließend der Zyklus für jede neue Matrixposition wiederholt werden.
Um das nächste Reagens auszugeben, wird das Ausgabegerät über einer Waschlösung in Stellung gebracht (nicht dargestellt) und die Spitze des Ausgabegerätes so lange in diese Lösung eingetaucht und wieder herausgezogen, bis die Reagenslösung im wesentlichen von der Spitze abgewaschen ist. Die Lösung kann nach jedem Eintauchen von der Spitze durch Vakuum, durch Ausblasen mit Druckluft, durch einen Schwamm oder dergleichen entfernt werden.
Die Spitze des Ausgabegerätes wird sodann in eine Vertiefung mit einem zweiten Reagens eingetaucht und die gefüllte Spitze zu einer zweiten ausgewählten Matrixposition auf dem ersten Träger hinbewegt. Sodann wird das Verfahren zur Ausgabe des Reagens an jeder der entsprechenden zweiten Matrixpositionen wie vorstehend ausgeführt. Dieses Verfahren wird so lange wiederholt, bis auf jedem Träger eine vollständige Mikromatrix von Reagenslösungen hergestellt ist.
IV. Mikromatrix-Substrat
Dieser Abschnitt beschreibt Ausführungsformen eines Substrats mit einer Mikromatrix von biologischen Polymeren, die auf der Substratoberfläche enthalten sind. Der Unterabschnitt A beschreibt ein Mehrzellen-Substrat, wobei jede Zelle eine Mikromatrix und vorzugsweise eine identische Mikromatrix von verschiedenartigen Biopolymeren, wie z. B. verschiedenartigen Polynucleotiden, enthält, die auf einer porösen Oberfläche aufgebracht wurden. Der Unterabschnitt B beschreibt eine Mikromatrix von verschiedenartigen Polynucleotiden, die an einen mit einem polykationischen Polymer beschichteten Glasobjektträger gebunden sind.
A. Mehrzellen-Substrat
In 9 wird ein gemäß der Erfindung konstruiertes Substrat 110 in Draufsicht erläutert. Das Substrat weist eine rechteckige 8×12-Matrix 112 von auf der Oberfläche des Substrats vorliegenden Zellen auf, z. B. die Zellen 114 und 116. Wie in 10 zu sehen ist, umfaßt jede Zelle, z. B. die Zelle 114, ihrerseits eine Mikromatrix 118 von verschiedenartigen Biopolymeren, wie z. B. Polypeptiden oder Polynucleotiden, an bekannten adressierbaren Bereichen der Mikromatrix. Zwei solche Bereiche, die die Mikromatrix darstellen, sind mit 120 bezeichnet und entsprechen den Bereichen, z. B. den Bereichen 42, die eine Mikromatrix von verschiedenartigen Biopolymeren darstellen, wie in 3 gezeigt.
Die in 9 dargestellte 96-Zellen-Matrix weist typischerweise eine Matrixgröße zwischen etwa 12 und 244 mm Breite und 8 und 400 mm Länge auf, wobei die Zellen in der Matrix eine Breite und Länge von 1/12 bzw. 1/8 der Matrixbreite bzw. -länge aufweisen, d. h. zwischen etwa 1 und 20 mm breit und 1 und 50 mm lang sind.
Die Konstruktion des Substrats ist in 11 als Querschnitt dargestellt, die eine vergrößerte Teilansicht entlang der Schnittlinie 124 zeigt. Das Substrat umfaßt eine wasserundurchlässige Unterlage 126, wie z. B. einen Glasobjektträger oder einen Bogen aus einem starren Polymermaterial. Auf der Oberfläche der Unterlage ist ein wasserdurchlässiger Film 128 angebracht. Der Film besteht aus einem porösen Membranmaterial, wie z. B. einer Nitrocellulosemembran, oder aus einem porösen Gewebematerial, wie z. B. Nylon, Polypropylen oder einem porösen PVDF-Polymermaterial. Die Dicke des Films liegt vorzugsweise zwischen etwa 10 und 1000 μm. Der Film kann auf die Unterlage aufgebracht werden, indem ungehärtetes Material auf die Unterlage aufgesprüht, oder die Unterlage damit beschichtet wird oder indem eine vorher ausgebildete Membran auf die Unterlage aufgebracht wird. Die Unterlage und der Film können als eine vorgeformte Einheit von einem Hersteller bezogen werden, z. B. als Nitrocellulosefilm mit Kunststoffrücken, verfügbar von der Schleicher und Schuell Corporation.
Weiterhin mit Bezug auf 11 wird die mit dem Film bedeckte Oberfläche im Substrat durch wasserundurchlässige Gitterlinien, wie z. B. die Linien 130 und 132, in eine gewünschte Matrix von Zellen eingeteilt, wobei diese den Film bis hinunter zur Unterlage durchdringen und über die Oberfläche des Films hinausragen, wie dargestellt, typischerweise mit einem Abstand von 100 bis 2000 μm zu der Filmoberfläche.
Die Gitterlinien werden auf dem Substrat hergestellt, indem man eine ungehärtete oder auf andere Weise fließbare Harz- oder Elastomerlösung in Form eines Matrixgitters aufbringt, das Material den porösen Film bis hinunter zur Unterlage durchdringen läßt und anschließend die Gitterlinien aushärtet oder auf andere Weise hart werden läßt, so daß das Zellmatrix-Substrat erzeugt wird.
Ein bevorzugtes Material für das Gitter ist ein fließbares Silicon, das von der Loctite Corporation verfügbar ist. Das Barrierematerial kann durch eine dünne Spritze (z. B. 22-Gauge) unter Verwendung von Druckluft oder mechanischem Druck aufgespritzt werden. Die Spritze wird über den festen Träger bewegt, so daß die Barriereelemente als Gittermuster aufgedruckt werden. Das aufgetragene Siliconmaterial dringt in die Poren des festen Trägers ein und härtet aus, wodurch eine flache, wasserdichte Barriere hergestellt wird, welche die Bereiche des festen Trägers abtrennt.
In anderen Ausführungsformen kann das Barriereelement ein Material auf Wachs-Basis oder ein in Wärme aushärtendes Material, z. B. ein Epoxymaterial, sein. Das Barrierematerial kann auch ein durch UV aushärtendes Polymer sein, das UV-Licht ausgesetzt wird, nachdem es auf den festen Träger gedruckt wurde. Das Barrierematerial kann auch unter Verwendung von Drucktechniken auf den festen Träger aufgebracht werden, wie z. B. durch Siebdruck. Außerdem kann das Barrierematerial durch ein Heißsiegelstempeln des porösen festen Trägers erhalten werden, wodurch seine Poren verschlossen und ein wasserundurchlässiges Barriereelement erzeugt wird. Das Barrierematerial kann auch ein flaches Gitter sein, das an den festen Träger geklebt oder anderweitig angebracht wird.
Der feste Träger kann außer einer Nitrocellulose mit Kunststoffrücken im wesentlichen jede beliebige poröse Membran mit oder ohne eine nicht-poröse Unterlage sein. Solche Membranen sind von zahlreichen Händlern verfügbar und bestehen aus Nylon, PVDF, Polysulfon und dergleichen. In einer anderen Ausführungsform kann das Barriereelement auch dazu dienen, die poröse Membran an einer nicht-poröse Unterlage zu befestigen, zusätzlich zu seiner Funktion als Barriere zur Verhinderung einer Kreuzverunreinigung der Testreagenzien.
In einer anderen Ausführungsform kann der feste Träger aus nicht-porösem Material bestehen. Die Barriere kann aufgedruckt werden, bevor die Mikromatrix von Biomolekülen auf den festen Träger gedruckt wird oder danach.
Es soll so verstanden werden, daß die Zellen, die durch die Gitterlinien und die darunter liegende Unterlage hergestellt werden, wasserundurchlässig sind, wobei sie Seitenbarrieren besitzen, die über den porösen Film der Zellen hinausragen. Somit können in jede Vertiefung Proben mit einem definierten Volumen eingebracht werden, ohne daß die Gefahr einer Kreuzverunreinigung mit Probenmaterial der daneben liegenden Zellen besteht. In 11 sind in den Zellen Proben mit einem definierten Volumen dargestellt, wie z. B. die Probe 134.
Wie vorstehend beschrieben, enthält jede Vertiefung eine Mikromatrix von verschiedenartigen Biopolymeren. In einer allgemeinen Ausführungsform sind die Mikromatrizen in der Vertiefung identische Matrizen von verschiedenartigen Biopolymeren, z. B. Polynucleotiden mit unterschiedlicher Sequenz. Solche Matrizen können gemäß den in Abschnitt II beschriebenen Verfahren hergestellt werden, indem ein erstes ausgewähltes Polynucleotid in jeder Zelle auf der gleichen ausgewählten Mikromatrixstelle aufgetragen wird, indem anschließend ein zweites Polynucleotid an einer anderen Mikromatrixstelle in jeder Vertiefung aufgetragen wird, und so weiter, bis in jeder Zelle eine vollständige identische Mikromatrix entstanden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält jede Mikromatrix etwa 10³ verschiedenartige Polynucleotid- oder Polypeptidbiopolymere pro Oberflächenbereich von weniger als etwa 1 cm². Außerdem liegen in einer bevorzugten Ausführungsform die Biopolymere in jedem Mikromatrixbereich in einer definierten Menge zwischen etwa 0,1 Femtomol und 100 Nanomol vor. Die Fähigkeit zur Herstellung von Biopolymermatrizen mit einer hohen Dichte, wobei jeder Bereich aus einer definierten Menge eines aufgetragenen Materials besteht, kann gemäß dem in Abschnitt II beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Mikromatrizen erzielt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Biopolymere Polynucleotide, die eine Länge von mindestens etwa 50 bp aufweisen, d. h. sie sind wesentlich länger als die Oligonucleotide, die in Matrizen mit einer hohen Dichte durch Schemata hergestellt werden können, wobei an der Matrixoberfläche eine parallele schrittweise Polymersynthese erfolgt.
Im Fall einer Polynucleotidmatrix wird in einem Testverfahren in jeder Zelle ein kleines Volumen des markierten DNA-Sondengemisches in einer herkömmlichen Hybridisierungslösung aufgetragen. Die Lösung verteilt sich so weit, daß sie die gesamte Mikromatrix bedeckt, und wird an den Barriereelementen aufgehalten. Sodann wird der feste Träger in einer Feuchtluftkammer bei der geeigneten Temperatur inkubiert, wie es für den Test erforderlich ist.
Jeder Test kann in einem ”open-face”-Modus durchgeführt werden, wobei kein weiterer Versiegelungsschritt erforderlich ist, da die Hybridisierungslösung durch den Wasserdampf in der Feuchtluftkammer in der richtigen hydratisierten Form gehalten wird. Am Ende des Inkubationsschrittes wird der ganze feste Träger, der die zahlreichen Mikromatrizen enthält, rasch genug gespült, um die Testreagenzien so weit zu verdünnen, daß keine wesentliche Kreuzverunreinigung erfolgt. Anschließend wird der ganze feste Träger gegebenenfalls mit Nachweisreagenzien umgesetzt und unter Verwendung herkömmlicher kolorimetrischer, radioaktiver oder fluoreszierender Nachweisverfahren analysiert. Alle Arbeits- und Nachweisschritte werden bei allen Mikromatrizen auf dem festen Träger gleichzeitig durchgeführt, wodurch für alle Mikromatrizen auf dem festen Träger gleiche Testbedingungen sichergestellt sind.
B. Glasobjektträger-Polynucleotidmatrix
5 zeigt ein Substrat 136, das gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung hergestellt wird und das verwendet werden kann, um die Bindung markierter Polynucleotide an eines oder mehrere von einer großen Anzahl verschiedener Polynucleotide nachzuweisen. Das Substrat umfaßt ein Glassubstrat 138, das auf seiner Oberfläche eine Beschichtung mit einem polykationischen Polymer, vorzugsweise mit einem kationischen Polypeptid, wie z. B. Polylysin oder Polyarginin, aufweist. Auf der polykationischen Beschichtung wurde eine Mikromatrix 140 von verschiedenartigen Polynucleotiden hergestellt, die jeweils in bekannten ausgewählten Matrixbereichen liegen, wie z. B. den Bereichen 142.
Der Objektträger wird beschichtet, indem ein Film eines polykationischen Polymers, z. B. Poly-L-Lysin, mit gleichmäßiger Dicke auf der Oberfläche eines Objektträgers aufgebracht und der Film getrocknet wird, wodurch eine getrocknete Beschichtung hergestellt wird. Die Menge des zugegebenen polykationischen Polymers ist ausreichend groß, um auf der Glasoberfläche mindestens eine monomolekulare Schicht zu erzeugen.
Der Polymerfilm ist durch elektrostatische Bindung zwischen den negativ geladenen Silyl-OH-Gruppen auf der Oberfläche und den geladenen Amingruppen in den Polymeren an die Oberfläche gebunden. Die mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträger können im Handel bezogen werden, z. B. von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
Zur Herstellung der Mikromatrix werden definierte Volumina von verschiedenartigen Polynucleotiden auf den Polymer-beschichteten Objektträger aufgetragen, wie in Abschnitt II beschrieben. Gemäß einem wichtigen Merkmal des Substrats verbleiben die aufgetragenen Polynucleotide nicht-kovalent gebunden an die beschichtete Objektträgeroberfläche, wenn eine wäßrige DNA-Probe auf das Substrat unter Bedingungen aufgetragen wird, die eine Hybridisierung Reporter-markierter Polynucleotide in der Probe mit (einzelsträngigen) Polynucleotiden mit komplementärer Sequenz in der Substratmatrix erlauben. Das Verfahren wird in den Beispielen 1 und 2 erläutert.
Um dieses Merkmal zu erläutern, wurde ein Substrat der gerade beschriebenen Art, das jedoch eine Matrix von Polynucleotiden der gleichen Sequenz aufwies, mit fluoreszierend markierter komplementärer DNA unter Hybridisierungsbedingungen gemischt. Nach dem Waschen zur Entfernung des nicht-hybridisierten Materials wurde das Substrat mittels Niedrigenergie-Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Matrix kann durch das relativ gleichmäßige Markierungsmuster der Matrixbereiche sichtbar gemacht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält jede Mikromatrix mindestens 10³ verschiedenartige Polynucleotid- oder Polypeptidbiopolymere pro Oberflächenbereich von weniger als etwa 1 cm². In der in 5 dargestellten Ausführungsform enthält die Mikromatrix 400 Bereiche in einer Fläche von etwa 16 mm², oder 2,5 × 10³ Bereiche pro cm². In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen die Biopolymere in dem jeweiligen Mikromatrixbereich in einer definierten Menge, im Fall von Polynucleotiden, zwischen etwa 0,1 Femtomol und 100 Nanomol vor. Wie vorstehend kann die Fähigkeit zur Herstellung von Matrizen mit einer hohen Dichte dieser Art, wobei jeder Bereich aus einer definierten Menge des aufgetragenen Materials besteht, gemäß dem in Abschnitt II beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Mikromatrizen erzielt werden.
Die Polynucleotide weisen Längen von mindestens etwa 50 bp auf, d. h. sie sind wesentlich länger als die Oligonucleotide, die in Matrizen mit hoher Dichte durch verschiedene in situ-Syntheseschemata hergestellt werden können.
V. Nutzen
Mikromatrizen von immobilisierten Nucleinsäuresequenzen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, können für Hybridisierungstests im großen Maßstab für zahlreiche genetische Anwendungen eingesetzt werden, umfassend genetische und physikalische Kartierung von Genomen, Überwachung der Genexpression, DNA-Sequenzierung, genetische Diagnose, Gentypisierung von Organismen und Verteilung von DNA-Reagenzien an Forscher.
Zur Genkartierung wird ein Gen oder ein cloniertes DNA-Fragment mit einer geordneten Matrix von DNA-Fragmenten hybridisiert und die Identität der auf die Matrix aufgetragenen DNA-Elemente durch den nachgewiesenen Matrixpunkt oder das nachgewiesene Muster der Matrixpunkte eindeutig bestimmt. Die Verwendung solcher Matrizen zur Erstellung einer Genkarte wird von Nelson et al., (1993), beschrieben. Bei der Konstruktion physikalischer Karten des Genoms werden Matrizen von immobilisierten clonierten DNA-Fragmenten mit anderen clonierten DNA-Fragmenten hybridisiert, um festzustellen, ob sich die clonierten Fragmente im Sondengemisch mit den immobilisierten Clonen in der Matrix überlappen und somit an sie angrenzend liegen. Ein solches Verfahren wird z. B. von Lehrach et al. beschrieben.
Die Matrizen von immobilisierten DNA-Fragmenten können auch für genetische Diagnostika eingesetzt werden. So kann z. B. eine Matrix, die mehrere Formen eines mutierten Gens oder Gene enthält, mit einem markierten Gemisch einer Patienten-DNA getestet werden, die vorzugsweise lediglich mit einer der immobilisierten Versionen des Gens in Wechselwirkung tritt.
Der Nachweis dieser Wechselwirkung kann zu einer medizinischen Diagnose führen. Matrizen von immobilisierten DNA-Fragmenten können auch in DNA-Sonden-Diagnostika eingesetzt werden. Z. B. kann die Identität eines pathogenen Mikroorganismus eindeutig festgestellt werden, indem eine DNA-Probe des unbekannten Pathogens mit einer Matrix hybridisiert wird, die viele verschiedene DNAs von bekannten Pathogenen enthält. Eine ähnliche Technik kann auch für die eindeutige Gentypisierung eines beliebigen Organismus eingesetzt werden. Andere Moleküle von genetischem Interesse, wie z. B. cDNAs und RNAs, können auf der Matrix immobilisiert werden, oder sie können alternativ als markiertes Sondengemisch eingesetzt werden, das auf die Matrix aufgetragen wird.
In einer Anwendung wird eine Matrix von cDNA-Clonen, die bestimmte Gene darstellen, mit der gesamten cDNA aus einem Organismus hybridisiert, wobei die Genexpression zum Zweck der Forschung oder Diagnose überwacht werden kann. Wenn man die gesamte cDNA aus einer normalen Zelle mit einem Fluorophor mit einer bestimmten Farbe und die gesamte cDNA aus einer kranken Zelle mit einem Fluorophor mit einer anderen Farbe markiert und sodann gleichzeitig die zwei cDNA-Proben mit der gleichen Matrix von cDNA-Clonen hybridisiert, kann durch Messung des Verhältnisses der zwei Fluorophor-Intensitäten die differentielle Genexpression bestimmt werden. Dieses Zwei-Farben-Experiment kann eingesetzt werden, um die Genexpression in verschiedenen Gewebetypen, in verschiedenen Krankheitsstadien, als Antwort auf Arzneistoffe oder als Antwort auf Umweltfaktoren zu überwachen. Ein Beispiel dieser Vorgehensweise wird in Beispiel 2 erläutert, das mit Bezug auf 8 beschrieben wird.
Ein solches Verfahren könnte eingesetzt werden, um viele Patienten gleichzeitig auf alle bekannten Mutationen in einem Krankheitsgen abzusuchen, wobei dies lediglich als Beispiel dienen soll und den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken soll. Diese Erfindung könnte z. B. in Form von 96 identischen Mikromatrizen zu 0,9 cm×2,2 cm verwendet werden, die auf einem einzigen Bogen von 12 cm × 18 cm einer mit Kunststoffrücken versehenen Nitrocellulose gefertigt sind, wobei jede Mikromatrix z. B. 100 DNA-Fragmente enthalten könnte, die alle bekannten Mutationen eines bestimmten Gens darstellen. Der Bereich von Interesse aus jeder der DNA-Proben von 96 Patienten kann amplifiziert, markiert und mit den 96 einzelnen Matrizen hybridisiert werden, wobei jeder Test in 100 μl Hybridisierungslösung durchgeführt wird. Die etwa 1 dicken Silicongummi-Barriereelemente zwischen den einzelnen Matrizen verhindern eine Kreuzverunreinigung der Patientenproben, indem sie die Poren der Nitrocellulose versiegeln und eine physikalische Barriere zwischen den einzelnen Mikromatrizen bilden. Der feste Träger, der alle 96 Mikromatrizen enthält, die mit den 96 Patientenproben getestet werden, wird als einziger Bogen eines Materials inkubiert, gespült, nachgewiesen und analysiert, wobei herkömmliche radioaktive, fluoreszierende oder kolorimetrische Nachweisverfahren eingesetzt werden (Maniatis et al., 1989). Bisher wären für ein solches Verfahren die Handhabung, Bearbeitung und Anordnung von 96 getrennten Membranen in 96 getrennten versiegelten Kammern erforderlich gewesen. Dadurch, daß alle 96 Matrizen auf einem einzigen Bogen eines Materials bearbeitet werden, kann deutlich Zeit und Kosten eingespart werden.
Das Matrixformat kann auch umgekehrt angeordnet werden, wobei die Patienten- oder Organismus-DNA als Matrixelemente immobilisiert wird und jede Matrix mit einem anderen mutierten Allel oder genetischen Marker hybridisiert wird. Der gitterförmige feste Träger kann auch für parallele Nicht-DNA-ELISA-Tests eingesetzt werden. Außerdem kann die Erfindung für alle herkömmlichen Nachweisverfahren verwendet werden, ohne daß die flachen Barriereelemente bei der Durchführung des Nachweisschrittes entfernt werden müssen.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen genetischen Anwendungen können durch die in dieser Erfindung beschriebenen Vorrichtungen Matrizen von ganzen Zellen, Peptiden, Enzymen, Antikörpern, Antigenen, Rezeptoren, Liganden, Phospholipiden, Polymeren, Arzneistoffpräparaten oder chemischen Substanzen für Tests zum Absuchen im großen Maßstab in der medizinischen Diagnostik, Arzneistoff-Forschung, Molekularbiologie, Immunologie und Toxikologie hergestellt werden.
Der erfindungsgemäße Aspekt des Mehrzellen-Substrats ermöglicht ein rasches und einfaches Absuchen vieler DNA-Sonden auf vielen geordneten Matrizen von DNA-Fragmenten. Hierdurch wird bei der Durchführung von Massenabsuchverfahren in der genetischen Forschung und Diagnostik vermieden, daß viele Matrizen einzeln bearbeitet und nachgewiesen werden müssen. Zahlreiche Mikromatrizen können auf dem gleichen festen Träger hergestellt werden, und jede Mikromatrix kann mit einer anderen DNA-Sonde umgesetzt werden, während der feste Träger als einziger Bogen eines Materials bearbeitet wird.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, wobei sie jedoch in keiner Weise ihren Umfang einschränken sollen.
Beispiel 1
Genomisch-komplexe Hybridisierung mit DNA-Mikromatrizen, die das Genom der Hefe Saccharomyces cerevisiae darstellen, mit einem Nachweis durch zweifarbige Fluoreszenz
Die Matrixelemente waren zufallsamplifizierte PCR-Produkte (Bohlander et al., 1992), wobei physikalisch kartierte Lambda-Clone von genomischer S. cerevisiae-DNA als Matrizen verwendet wurden (Riles et al., 1993). Die PCR erfolgte direkt mit Lysaten der Lambda-Phagen, was eine Amplifikation sowohl des 35 kb-Lambda-Vektors als auch der 5 bis 15 kb-großen Hefe-Insertions-Sequenzen zur Folge hatte und PCR-Produkte ergab, deren Längen sich gleichmäßig in einem Bereich zwischen 250 und 1500 bp verteilten. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung einer Sephadex G50-Gelfiltration (Pharmacia, Piscataway, NJ) gereinigt und durch Eindampfen zur Trockene bei Raumtemperatur über Nacht eingeengt. Jeder der 864 amplifizierten Lambda-Clone wurde in 15 μl 3 × SSC rehydratisiert, wodurch ein Präparat für die Tüpfelung auf das Glas erhalten wurde.
Die Mikromatrizen wurden auf Mikroskop-Objektträgern hergestellt, die mit einer Lage Poly-L-Lysin (Sigma) beschichtet waren. Mit der in Abschnitt IV beschriebenen automatischen Apparatur wurde 1 μl des eingeengten Lambda-Clon-PCR-Produktes in 3 × SSC direkt von den zur Lagerung verwendeten Platten mit 96 Vertiefungen in das offen-kapillare Druckerelement eingefüllt und auf jeden von 40 Objektträgern etwa 5 nl Probe pro Objektträger mit einem Abstand von 380 μm zwischen den Punkten aufgetragen. Das Verfahren wurde für alle 864 Proben und 8 Kontrollpunkte wiederholt. Nach Beendigung des Auftüpfelns wurden die Objektträger zwei Stunden in einer Feuchtluftkammer rehydratisiert, sodann zwei Stunden in einem trockenen 80°C-Vakuumofen gebacken, zur Entfernung von nicht-absorbierter DNA gespült und anschließend mit Bernsteinsäureanhydrid behandelt, um die nicht-spezifische Adsorption der markierten Hybridisierungssonde an die mit Poly-L-Lysin beschichtete Glasoberfläche zu reduzieren. Unmittelbar vor der Verwendung wurde die immobilisierte DNA auf der Matrix in destilliertem Wasser zwei Minuten bei 90°C denaturiert.
Für das Experiment mit einem Chromosomen-Pool wurden die 16 Chromosomen von Saccharomyces cerevisiae in einer CHEF-Agarosegel-Apparatur (Biorad, Richmond, CA) aufgetrennt. Die sechs größten Chromosomen wurden in einem ersten Gelscheibchen und die zehn kleinsten Chromosomen in einem zweiten Gelscheibchen isoliert. Die DNA wurde unter Verwendung eines Gelextraktions-Kits (Qiagen, Chatsworth, CA) gewonnen. Die zwei Chromosomen-Pools wurden zufallsamplifiziert, wobei ein ähnliches Verfahren wie bei den Ziel-Lambda-Clonen eingesetzt wurde. Nach der Amplifikation wurden jeweils 5 μg der amplifizierten Chromosomen-Pools getrennt voneinander unter Verwendung von Klenow-Polymerase (Amersham, Arlington Heights, IL) mittels Zufallsprimer markiert, wobei beim Pool, der die sechs größten Chromosomen enthielt, ein Lissamin-konjugiertes Nucleotidanalogon (Dupont NEN, Boston, MA) und beim Pool, der die zehn kleinsten Chromosomen enthielt, ein Fluorescein-konjugiertes Nucleotidanalogon (BMB) eingesetzt wurde. Die zwei Pools wurden gemischt und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon, Danvers, MA) eingeengt.
Fünf μg der Hybridisierungssonde, die aus den beiden Chromosomen-Pools in 7,5 μl TE bestand, wurden in einem kochenden Wasserbad denaturiert und anschließend rasch auf Eis abgekühlt. 2,5 μl der eingeengten Hybridisierungslösung (5 × SSC und 0,1% SDS) wurden zugegeben und die gesamten 10 μl auf die Matrixoberfläche überführt, mit einem Deckgläschen abgedeckt, in eine speziell für einen Objektträger gebaute Feuchtluftkammer gegeben und 12 Stunden bei 60° inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger bei Raumtemperatur in 0,1 × SSC und 0,1% SDS fünf Minuten gespült, mit Deckgläschen versehen und gescannt.
Zum Nachweis der zweifarbigen Hybridisierungssignale der 1,8 cm×1,8 cm-Matrix mit einer Auflösung von 20 μm wurde ein speziell gebauter Laser-Fluoreszenzscanner verwendet. Das gescannte Bild wurde mit einem Raster versehen und unter Verwendung einer speziellen Bildanalyse-Software analysiert. Nach Korrektur der optischen Überschneidung der Fluorophoren aufgrund ihrer überlappenden Emissionsspektren wurden die roten und grünen Hybridisierungswerte für jeden Clon auf der Matrix der bekannten physikalischen Kartenposition des Clons zugeordnet, wodurch man einen mittels Computer erstellten Farb-Karyotyp des Hefegenoms erhielt.
In 6 ist das Hybridisierungsmuster der zwei Chromosomen-Pools dargestellt. Ein rotes Signal zeigt an, daß der Lambda-Clon auf der Matrixoberfläche ein cloniertes genomisches DNA-Segment aus einem der sechs größten Hefechromosomen enthält. Ein grünes Signal zeigt an, daß die Lambda-Clon-Insertion von einem der zehn kleinsten Hefechromosomen stammt. Orange Signale weisen auf repetitive Sequenzen hin, die mit beiden Chromosomen-Pools hybridisierten. Durch die Kontrollpunkte auf der Matrix wird bestätigt, daß die Hybridisierung spezifisch und reproduzierbar ist.
Die Lage auf der physikalischen Karte der genomischen DNA-Fragmente in den jeweiligen Clonen, die als Matrixelemente verwendet wurden, wurde früher von Olson und Mitarbeitern (Riles et al.) bestimmt, wodurch die automatische Herstellung des in 7 dargestellten Farb-Karyotyps ermöglicht wurde. Die Farbe eines Chromosomenabschnitts auf dem Karyotyp entspricht der Farbe des Matrixelementes, das den Clon aus diesem Abschnitt enthält. Die schwarzen Bereiche des Karyotyps stellen falsch-negative dunkle Punkte auf der Matrix (10%) oder Bereiche des Genoms dar, die nicht von der Clon-Genbank von Olson abgedeckt werden (90%). Zu beachten ist, daß die sechs größten Chromosomen hauptsächlich rot sind, während die zehn kleinsten Chromosomen hauptsächlich grün sind, was mit der ursprünglichen CHEF-Gel-Isolierung der Hybridisierungssonde übereinstimmt. Bereiche der roten Chromosomen, die grüne Punkte enthalten, und umgekehrt, sind möglicherweise auf Fehler durch falsches Kennzeichnen der Proben bei der Herstellung der ursprünglichen Genbank und bei den Amplifikations- und Auftüpfelverfahren zurückzuführen.
Außerdem wurden die Hefegenommatrizen zum Zweck der physikalischen Kartierung mit einzelnen Clonen oder Pools von Clonen getestet, die fluoreszierend markiert waren. Die Hybridisierungssignale dieser Clone mit der Matrix wurden in eine Position auf der physikalischen Karte der Hefe übersetzt.
Beispiel 2
Gesamt-cDNA, hybridisiert mit Mikromatrizen von cDNA-Clonen, mit einem Nachweis durch zweifarbige Fluoreszenz
24 Clone, die cDNA-Insertionen von der Pflanze Arabidopsis enthielten, wurden unter Verwendung von PCR amplifiziert. Die gereinigten PCR-Produkte wurden bis zu einer Endkonzentration von 3 × SSC mit Salz versetzt. Die cDNA-Clone wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Mikroskop-Objektträger getüpfelt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Unter den cDNA-Clonen war ein Clon, der den Transkriptionsfaktor HAT4 darstellte, der früher schon zur Herstellung einer transgenen Linie der Pflanze Arabidopsis verwendet worden war, in der dieses Gen dann im Vergleich zum Arabidopsis-Wildtyp in zehnfacher Menge vorlag (Schena et al., 1992).
Gesamt-Poly-A-mRNA aus dem Arabidopsis-Wildtyp wurde durch herkömmliche Verfahren (Maniatis et al., 1989) isoliert und in Gesamt-cDNA revers transkribiert, wobei zur Markierung des cDNA-Produktes ein Fluorescein-Nucleotidanalogon eingesetzt wurde (grüne Fluoreszenz). Ähnlich wurde mit der transgenen Linie von Arabidopsis verfahren, wobei der Transkriptionsfaktor HAT4 unter Verwendung herkömmlicher Gentransfer-Verfahren in das Genom eingefügt wurde. Die cDNA-Kopien der mRNA aus der transgenen Pflanze wurden mit einem Lissamin-Nucleotidanalogon markiert (rote Fluoreszenz). Jeweils 2 μg der cDNA-Produkte von jedem Pflanzentyp wurden vereinigt und in einer 10 μl-Hybridisierungsreaktion mit der cDNA-Clon-Matrix hybridisiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Spülen und der Nachweis der Hybridisierung erfolgten auch wie in Beispiel 1. Das resultierende Hybridisierungsmuster der Matrix ist in 8 dargestellt.
Gene, die gleichermaßen im Wildtyp und in der transgenen Arabidopsis-Pflanze exprimiert werden, erscheinen gelb, aufgrund der gleichwertigen Verteilung der grünen und der roten Fluoreszenz im endgültigen Signal. Die Punkte mit verschiedenen Gelb-Intensitäten weisen auf unterschiedliche Stärken der Genexpression hin. Der cDNA-Clon, der den Transkriptionsfaktor HAT4 darstellt, der in der transgenen Linie von Arabidopsis exprimiert wird, dessen Expression im Arabidopsis-Wildtyp jedoch nicht nachweisbar ist, erscheint als ein roter Punkt (der Pfeil deutet auf ihn), was die bevorzugte Expression des Transkriptionsfaktors in der rot-markierten transgenen Arabidopsis-Pflanze und das relative Fehlen der Expression des Transkriptionsfaktors im grün-markierten Arabidopsis-Wildtyp anzeigt.
Ein Vorteil der Hybridisierung im Mikromatrixformat für Untersuchungen der Genexpression besteht in der hohen partiellen Konzentration jeder cDNA-Spezies, die in dem 10 μl-Hybridisierungs-Reaktionsansatz erreicht werden kann. Diese hohe partielle Konzentration ermöglicht einen Nachweis von seltenen Transkripten, ohne daß eine PCR-Amplifikation der Hybridisierungssonde erforderlich wäre, wodurch die tatsächliche genetische Darstellung der jeweiligen bestimmten cDNA-Spezies beeinflusst werden könnten.
Untersuchungen der Genexpression wie diese können in der Genomforschung eingesetzt werden, um festzustellen, welche Gene in welchen Zelltypen, in welchen Krankheitsstadien, in welchen Entwicklungsstadien oder bei welchen Umweltbedingungen exprimiert werden. Untersuchungen der Genexpression können auch zur Diagnose von Krankheiten eingesetzt werden, indem Genexpressionsmuster empirisch auf Krankheitsstadien bezogen werden.
Beispiel 3
Vervielfachte kolorimetrische Hybridisierung auf einem mit Gitter versehenen festen Träger
Ein Bogen von Nitrocellulose mit Kunststoffrücken wurde mit einer Gitterstruktur von aus Silicongummi bestehenden Barriereelementen versehen, wie in Abschnitt IV-A beschrieben. Der Bogen wurde in 10 × SSC eingetaucht und trocknen gelassen.
Wie in 12 dargestellt, wurden 192 M13-Clone, jeweils mit einer unterschiedlichen Hefe-Insertion, in vier Quadranten des festen Trägers als Matrix mit einem Abstand von 400 μm aufgetragen, wobei die in Abschnitt III beschriebene automatische Apparatur verwendet wurde. Der Quadrant links unten diente als negative Kontrolle für die Hybridisierung, während die drei anderen Quadranten gleichzeitig mit je einem unterschiedlichen Oligonucleotid hybridisiert wurden, wobei die in Abschnitt IV-A beschriebene ”open face”-Hybridisierungstechnik eingesetzt wurde. Die ersten zwei und die letzten vier Elemente jeder Matrix sind positive Kontrollen für den kolorimetrischen Nachweisschritt.
Die Oligonucleotide wurden mit Fluorescein markiert, das unter Verwendung eines Anti-Fluorescein-Antikörpers nachgewiesen wurde, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert war, die einen NBT/BCIP-Farbstoff auf den festen Träger ausfällte (Amersham). Perfekte Paarungen zwischen den markierten Oligos und den M13-Clonen ergaben dunkle Flecken, die mit bloßem Auge sichtbar waren und unter Verwendung eines optischen Scanners (HP ScanJet II) nachgewiesen wurden, der an einen PC angeschlossen war. Die Hybridisierungsmuster sind in jedem Quadranten unterschiedlich, was zeigt, daß jedes Oligo unter den 192 M13-Clonen mehrere einmalige M13-Clone mit einer perfekten Sequenzpaarung fand. Zu beachten ist, daß die mit offener Kapillare druckende Spitze auf der Nitrocellulose nachweisbare Grübchen hinterläßt, die zur automatischen Anordnung und Analyse der Bilder genutzt werden können.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Mikroanordnung von Analyt-spezifischen Testbereichen auf einem festen Träger oder auf einer Vielzahl von festen Trägern, umfassend: (a) Einfüllen einer Lösung eines Analyt-spezifischen Testreagenzes in eine Reagens-Ausgabevorrichtung, die einen in die Länge gezogenen Kapillarkanal aufweist, der (i) durch mit einem Abstand angeordnete, in die Länge gezogene Einheiten von gleicher Ausdehnung gebildet wird, der (ii) so konstruiert ist, dass er eine bestimmte Menge der Reagenslösung fasst, und der (iii) einen Spitzenbereich aufweist, in welchem die Reagenslösung im Kanal einen Meniskus bildet, (b) Tippen der Spitze der Ausgabevorrichtung gegen den festen Träger an einer definierten Stelle des festen Trägers mit einem Impuls, der bewirkt, dass der Meniskus im Kapillarkanal gebrochen und ein ausgewähltes Volumen der Reagenslösung auf den (die) festen Träger aufgetragen wird, und (c) Wiederholung der Schritte (a) und (b) mit verschiedenen Analyt-spezifischen Testreagenzien, die an unterschiedlichen definierten Stellen auf den (die) festen Träger aufgetragen werden, bis die Mikroanordnung (Mikroanordnungen) hergestellt ist (sind).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroanordnung einzelne Analyt-spezifische Testbereiche hat und jeder einzelne Bereich in der Mikroanordnung ein ausgewähltes Analyt-spezifisches Testreagens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das ausgewählte Volumen zwischen 0,002 und 2 nl beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Analyt-spezifischen Testreagenzien Nucleinsäurestränge sind und wobei die Mikroanordnung mindestens etwa 1000 einzelne Bereiche pro cm² des festen Trägers aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Nucleinsäurestränge einzelne Polynucleotide sind und wobei jedes einzelne Polynucleotid sich in einem getrennten Bereich der Mikroanordnung befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das nach Durchführung der Schritte (a) und (b) den Schritt umfasst, bei dem die Reagens-Ausgabevorrichtung wieder mit einer neuen Analyt-spezifischen Testreagenslösung durch die folgenden Schritte aufgefüllt wird: (i) Eintauchen des Kapillarkanals der Vorrichtung in eine Waschlösung, (ii) Entfernen der in den Kapillarkanal aufgezogenen Waschlösung und (iii) Eintauchen des Kapillarkanals in die neue Reagenslösung.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, umfassend den Schritt, bei dem die einzelnen Polynucleotide auf den getrennten Bereichen der Mikroanordnung immobilisiert werden.
Apparatur, die zur Herstellung einer Mikroanordnung von Analyt-Testbereichen auf einer Vielzahl von festen Trägern eingesetzt werden kann, wobei jeder Bereich ein ausgewähltes Analyt-spezifisches Reagens enthält, umfassend: (a) einen Halter, der eine große Anzahl von ebenen Trägern in bekannten Positionen hält, (b) eine Reagens-Ausgabevorrichtung, die einen in die Länge gezogenen offenen Kapillarkanal aufweist, der durch mit einem Abstand angeordnete, in die Länge gezogene Einheiten von gleicher Ausdehnung gebildet wird, der so konstruiert ist, dass er eine bestimmte Menge der Reagenslösung fasst, und der einen Spitzenbereich aufweist, in welchem die Reagenslösung im Kanal einen Meniskus bildet, (c) ein Positionierungsinstrument, mit dem die Ausgabevorrichtung an einer ausgewählten Anordnungsposition, bezogen auf einen Träger in dem Halter, positioniert wird, (d) ein Ausgabeinstrument, mit dem die Vorrichtung mit einem Träger mit einem ausgewählten Impuls in Tippkontakt gebracht wird, wenn die Ausgabevorrichtung an einer definierten Mikroanordnungsstelle, bezogen auf diesen Träger, positioniert ist, wobei ein Impuls eingesetzt wird, der bewirkt, dass der Meniskus der Flüssigkeit im Kapillarkanal gebrochen und ein ausgewähltes Volumen der Lösung auf die Oberfläche aufgetragen wird, und (e) ein Steuerinstrument zur Steuerung und Positionierung des Ausgabeinstruments.
Apparatur nach Anspruch 8, wobei die Reagens-Ausgabevorrichtung zwischen etwa 0,002 und 100 nl des Analyt-spezifischen Testreagenzes auf jeden Bereich der Mikroanordnung aufträgt.
Substrat mit einer Oberfläche, umfassend eine Mikroanordnung von verschiedenartigen Polynucleotiden, wobei (i) die Mikroanordnung mindestens etwa 1000 einzelne Bereiche von Polynucleotiden pro cm² Substratoberfläche aufweist, (ii) jedes unterschiedliche Polynucleotid in einem getrennten Bereich der Mikroanordnung liegt und (iii) jedes unterschiedliche Polynucleotid mindestens eine Länge von 50 Untereinheiten aufweist.
Substrat mit einer Oberfläche, umfassend eine Mikroanordnung von verschiedenartigen Polynucleotiden mit einer Länge von mindestens 50 Untereinheiten, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Mikroanordnung mindestens etwa 1000 einzelne Bereiche von verschiedenartigen Polynucleotiden pro cm² Substratoberfläche aufweist.
Substrat nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Substratoberfläche hydrophob ist.
Substrat nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Substrat Glas ist.
Substrat nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Polynucleotide von mRNA abgeleitete Sequenzen, genomische DNA-Sequenzen oder Fragmente davon sind.