DE69434980T2 - Stabile bakterizide Proteine, welche die Permeabilität erhöhen und pharmazeutische Zusammensetzungen, diese enthaltend - Google Patents

Stabile bakterizide Proteine, welche die Permeabilität erhöhen und pharmazeutische Zusammensetzungen, diese enthaltend Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Proteinprodukte und stabile pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die diese enthalten.
  • Lipopolysaccharid (LPS) ist eine Hauptkomponente der äußeren Membran von Gramnegativen Bakterien und besteht aus Serotyp-spezifischen O-Seitenketten-Polysacchariden, die an eine konservierte Region aus Kern-Oligosaccharid und Lipid A besteht. Raetz, Ann. Rev. Biochem., 59:129-170 (1990). LPS ist ein wichtiger Mediator in der Pathogenese von Gram-negativem septischem Schock, einer der Haupttodesursachen auf Intensivstationen in den Vereinigten Staaten. Morrison, et al., Ann. Rev. Med. 38:417-432 (1987).
  • Man hat LPS-Bindungsproteine in verschiedenen Säugegeweben identifiziert. Morrison, Microb. Pathol., 7:389-398 (1989); Roeder, et al., Infect., Immun., 57:1054-1058 (1989). Unter den am intensivsten studierten LPS-Bindungsproteinen ist bakterizides/permeabilitätserhöhendes Protein (BPI), ein basisches Protein, das in azurophilen Granula von polymorphonuklearen Leukocyten gefunden wird. Menschliches BPI-Protein ist aus polymorphonuklearen Neutrophilen durch Säureextraktion, kombiniert mit entweder Ionenaustauschchromatographie [Elsbach, J. Biol. Chem., 254:11000 (1979)] oder E. coli-Affinitäts-Chromatographie [Weiss, et al., Blood, 69:652 (1987)] isoliert worden und weist eine potente bakterizide Aktivität gegen ein breites Spektrum Gram-negativer Bakterien auf.
  • Während das BPI-Protein gegen viele Gram-negative Bakterien cytotoxisch ist, weist es keine berichtete cytotoxische Aktivität gegenüber Gram-positiven Bakterien, Pilzen oder Säugerzellen auf. Die Aminosäuresequenz des gesamten menschlichen BPI-Proteins, ebenso wie der das Protein codierenden DNA, ist in 1 von Gray, et al., J. Biol. Chem., 264:9505 (1989) vollständig aufgeklärt worden (SEQ ID NOs.: 1 und 2). Die Publikation von Gray et al. beschreibt die Isolierung von menschlichem BPI-codierender cDNA aus einer cDNA-Genbank, die aus DMSO-induzierten Zellen der menschlichen promyelocytischen Leukämie HL-60-Zellinie (ATTC CCL 240) abgeleitet ist. Mehrfache PCR-Amplifikationen von DNA aus einer frisch hergestellten cDNA-Genbank, die von derartigen DMSO-induzierten HL-60-Zellen abgeleitet ist, haben die Existenz von menschlichen BPI-codierenden cDNAs enthüllt, wobei das Codon, das Valin an Aminosäureposition 151 spezifiziert, entweder GTC (wie angegeben in SEQ ID NO.: 1) oder GTG ist. Darüber hinaus hat man auch gefunden, dass cDNA-Spezies, die GTG verwenden, um Valin an Position 155 zu spezifizieren, auch entweder Lysin (AAG) für die Aminosäure, an Position 185 (wie in SEQ ID NOs.: 1 und 2) oder einen Glutaminsäurerest (GAG) an dieser Position spezifizieren.
  • Ein proteolytisches Fragment entsprechend dem N-terminalen Teil von menschlichem BPI-Holoprotein besitzt die antibakterielle Effizienz des natürlich abgeleiteten 55 kDa menschlichen BPI-Holoproteins. Im Gegensatz zum N-terminalen Teil zeigt die C-terminale Region des isolierten menschlichen BPI-Proteins nur geringe nachweisbare antibakterielle Aktivität. Ooi, et al., J. Exp. Med., 174:649 (1991). Ein N-terminales BPI-Fragment, das in etwa die ersten 199 Aminosäuren des menschlichen BPI-Holoproteins umfaßt, ist durch rekombinante Mittel als ein 23 kD-Protein hergestellt worden. Gazzano-Santoro et al., Infect. Immun. 60:4754-4761 (1992), (siehe auch WO 92/03535 ( PCT/US91/05758 ), die Analoga und Varianten des BPI-Proteins beschreibt).
  • Die projizierte klinische Verwendung von BPI-Produkten zur Behandlung von Gramnegativer Sepsis beim Menschen hat wesentliche Bestrebungen ausgelöst, große Mengen an rekombinanten BPI(rBPI)-Produkten zu produzieren, die für den Einbau in stabile, homogene pharmazeutische Präparate geeignet sind. Zum Beispiel offenbart die ebenfalls eigene, ebenfalls anhängige U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/072,063 , offengelegt als WO 93/23540 ( Europäische Patentanmeldung Nr. 93913992.9 ) von Grinna neue Verfahren zur Reinigung rekombinanter BPI-Produkte, die exprimiert sind in und sekretiert werden von genetisch transformierten Säugerwirtszellen in Kultur. Die Wirksamkeit der Reinigungsverfahren ist darin im Zusammenhang mit Produkten von transformierten CHO-Zellen gezeigt, die DNA exprimieren, die die 31 Aminosäure "Leader"-Sequenz von menschlichem BPI codieren und die anfänglichen 199 Amino-terminalen Reste des reifen Proteins (d. h. entsprechend den Aminosäuren –31 bis 199 von SEQ ID NO: 2). Die ebenfalls eigene und anhängige U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/064,693 , veröffentlicht als WO 93/23434 von Theofan, et al., betrifft neue, rekombinant-produzierte BPI-Proteinanalog-Produkte, die aus der Expression von DNA resultieren, die die BPI-Leadersequenz und entweder 191 oder 199 Amino-terminale Reste von menschlichem BPI, das an DNA fusioniert ist, die eine konstante Region einer schweren Kette von Immunglobulin codiert.
  • Bemühungen, BPI-Produkte mit einem pharmazeutischen Reinheitsgrad für die Behandlung von Gram-negativer Sepsis beim Menschen zu produzieren haben nicht zu einheitlich zufriedenstellenden Ergebnissen geführt. Ein Hauptgrund für dies besteht in der Natur der Aminosäuresequenz von menschlichem BPI und der Natur der rekombinanten Wirtszellenumgebung, in der die Produkte produziert werden. Als ein Beispiel können biologisch aktive rBPI-Produkte in guter Ausbeute gereinigt werden, welche die anfänglichen 199 Reste von BPI[rBPI(1-199)] umfassen, die als sekretorische Produkte von transfizierten CHO-Wirtszellen hergestellt werden. Die isolierten BPI-Produkte umfassen jedoch anfangs ebenso dimere Formen von BPI, wie Cystein-Addukt-Spezies. Darüber hinaus können die BPI-Produkte nach Lagerung bei physiologischer Temperatur und pH instabil sein, was zur Bildung von zusätzlichen Dimeren und Adduktspezies führt. Derartige Dimere und Adduktspezies, während sie ihre biologische Aktivität beibehalten, sind nicht bevorzugt für den Einbau in pharmazeutische Präparate, die für die menschliche Verwendung bestimmt sind. Die Dimerbildung und die Bildung von Cystein-Addukten sind das mutmaßliche Ergebnis der Tatsache, dass BPI drei Cysteinaminosäurereste enthält, von denen alle drei innerhalb der biologisch aktiven Amino-terminalen Region von BPI positioniert sind, d. h. an Positionen 132, 135 und 175. Die Bildung einer einzelnen Disulfidbrücke zwischen zwei der drei Cysteine erlaubt die Dimerbildung oder Bildung von Cystein-Addukten, wobei sich das verbleibende freie Cystein im Wirtszellcytoplasma und/oder dem Zellkulturüberstand befand.
  • Selbst monomere rBPI-Produkte zeigen unterschiedliche Grade von Mikroheterogenitäten hinsichtlich der Anzahl von Carboxy-terminalen Resten, die in derartigen Produkten vorhanden sind. Zum Beispiel ist es schwierig, Expressionsprodukte in der vollständigen Länge in einem Medium nachzuweisen, das Wirtszellen enthält die mit DNA transformiert oder transfiziert sind, die rBPI(1-199) codiert. Statt dessen stellen die aus solchen Zellen erhaltenen Expressionsprodukte eine heterogene Anordnung von Carboxy-terminal verkürzten Spezies des rBPI N-terminalen Fragmentes dar. In der Tat wird das erwartete Produkt in seiner ganzen Länge (1-199) nicht als unter den rBPI-Spezies, vorhanden nachgewiesen die in dem heterogenen Array vorhanden sind. Die Heterogenität der Carboxyterminalen Aminosäuresequenz von rBPI(1-199)-Produkten scheint aus der Aktivität von Carboxypeptidasen in Cytoplasma der Wirtszellen und/oder dem Kulturüberstand zu resultieren.
  • Ein weiteres bei der Herstellung von BPI-Produkten mit pharmazeutischem Reinheitsgrad angetroffenes Problem ist die Bildung von makroskopischen Partikeln, die die Homogenität des Produktes ebenso wie seine Aktivität verringern. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung, die rBPI-Produkte gemäß der Erfindung enthält, umfaßt die Kombination von einem Poloxamer (Polyoxypropylen-polyoxyethylen-Block-Copolymer)-Oberflächenaktiven Mittel und einem Polysorbat (Polyoxyethylen-sorbitan-Fettsäureester)-Oberflächenaktiven Mittel über derartige Kombinationen wird in der ebenfalls eigenen, gleichfalls anhängigen und gleichzeitig eingereichten U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/012,360 , veröffentlicht als WO 94/17819 ( Europäische Patentanmeldung Nr. 94907963.6 ) gelehrt, dass sie synergistischen Wirkungen bei der Stabilisierung pharmazeutisch aktiver Polypeptide gegen Partikelbildung aufweisen. Am meisten bevorzugt ist eine Zusammensetzung, bei der das rBPI-Produkt in einer Konzentration von 1 mg/ml in Citratgepufferter Saline (0,02 M Citrat, 0,15 M NaCl, pH 5,0), die 0,1 Gew.-% Poloxamer 188 (Pluronic F-68, BASF Wyandotte, Parsippany, NJ) und 0,002 Gew.-% Polysorbat 80 (Tween 80, ICI Americas Inc., Wilmington, DE) vorhanden ist.
  • Es besteht weiterhin ein Bedarf in der Technik für verbesserte rBPI-Produkte, die für den Einbau in stabile homogene pharmazeutische Präparate geeignet sind. Derartige Produkte würden idealerweise in großer Ausbeute von transformierten Wirtszellen erhältlich sein, würden die bakteriziden und LPS-bindenden biologischen Eigenschaften von BPI beibehalten und wären hinsichtlich ihrer Kapazität, dimere Spezies und Cystein-Addukte zu bilden beschränkt und wären durch eine begrenzte Variation ihrer Carboxytermini gekennzeichnet.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue, biologisch aktive, rekombinant-produzierte BPI ("rBPI")-Protein- und Proteinfragment-Produkte, die durch eine Resistenz gegenüber Dimerisierung und Cystein-Addukt-Bildung gekennzeichnet sind, was diese Produkte in höchstem Maße für die pharmazeutische Anwendung geeignet machen. Ebenfalls werden rBPI-Produkte offenbart, die durch eine verringerte molekulare Heterogenität am Carboxy-Terminus gekennzeichnet sind. Neue DNA-Sequenzen, die rBPI-Produkte und – analogprodukte codieren, Plasmidvektoren, welche die DNA enthalten, Wirtszellen, die stabil mit den Plasmiden transformiert oder transfiziert sind, rekombinant-präparative Methoden, stabile pharmazeutische Zusammensetzungen und Behandlungsverfahren werden durch die Erfindung auch offenbart.
  • Es werden rBPI-Protein-Analoga beschrieben, die ein N-terminales Fragment von BPI umfassen, worin ein Cystein an Aminosäureposition 132 oder 135 durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, bevorzugterweise eine nicht-polare Aminosäure, wie Serin oder Alanin. In einem bevorzugten Beispiel wird der Cysteinrest an Position 132 eines Polypeptids, das die ersten 199 N-terminalen Reste von BPI umfaßt, durch einen Alaninrest in einem rekombinanten Produkt ersetzt, das als "rBPI(1-199)ala132" bezeichnet wird. Auch ist in einem bevorzugten Beispiel das Cystein an Position 135 eines BPI-Fragmentes, das die ersten 199 N-terminalen BPI-Reste umfaßt, durch ein Serin ersetzt ist, was zu einem rekombianten Produkt fuhrt, das als "rBPI(1-199)ser135" bezeichnet wird. Besonders bevorzugt ist ein rekombinantes Protein, das als "rBPI(1-193)ala132" bezeichnet wird, das durch verringerte Heterogenität, was die Identität seiner Carboxy-terminalen Reste anbelangt gekennzeichnet ist. Ebenfalls wird ein Polypeptid offenbart, welches die ersten 193 Amino terminalen Reste von BPI umfasst und welches ein Stopp-Codon unmittelbar nach. dem Codon für Leucin an Position 193 aufweist.
  • Es werden DNA-Sequenzen beschrieben, die für das oben beschriebene rBPI-Protein und Proteinfragment-Produkte einschließlich Analogprodukten codieren. Derartige DNA-Sequenzen können auch für die 31 Reste lange BPI-Leadersequenz und das BPI-Polyadenylierungssignal codieren. Ebenfalls werden autonom replizierende DNA-Plasmidvektoren offenbart, die DNA umfassen, welche die oben erwähnten Produkte und Analoga codieren, so wie Wirtszellen, die mit dieser DNA in einer Art und Weise stabil transformiert und transfiziert sind, die ausreichend ist, um ihre Expression zu erlauben. Transformierte oder transfizierte Wirtszellen entsprechend der Erfindung sind von augenscheinlicher Nützlichkeit bei Verfahren für die Produktion von rBPI-Protein-Produkten der Erfindung in großem Maßstab.
  • Es werden auch rBPI-Protein-Analog-Produkte in der Form von Fusionsproteinen offenbart, die, am Amino-Terminus, rBPI-Protein-Analog-Produkte der Erfindung und, am Carboxy-Terminus, eine konstante Region einer schweren Immunglobulinkette oder einer allelischen Variante davon umfassen. BPI/Immunglobulin-Fusionsproteine mit natürlicher Sequenz werden gelehrt in der ebenfalls anhängigen und ebenfalls eigenen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/064,693 , veröffentlicht als WO 93/23434 , von Theofan, et al. Es werden weiterhin Verfahren zur Herstellung der zuvor erwähnten Fusionsproteine vorgeschlagen.
  • Ebenfalls offenbart sind DNA-Sequenzen, die biologisch aktive rBPI-Proteinfragment-Produkte mit von etwa 176 bis etwa 198 der N-terminalen Aminosäuren von BPI codieren. Diese DNAs erlauben die Produktion von BPI-Produkten in eukaryontischen Wirtszellen, so wie CHO-Zellen, wobei die Produkte eine geringere Heterogenität hinsichtlich der vorhandenen Carboxy-terminalen Reste zeigen. Gegenwärtig bevorzugt sind DNAs, die 193 N-terminale Reste von BPI codieren (z. B. DNAs, welche die 31 Aminosäure-Leadersequenz von BPI, die anfänglichen 193 N-terminalen Aminosäuren und einen oder mehrere Stopp-Codons codieren) zur Verfügung gestellt. Am meisten bevorzugt sind solche DNAs, die zusätzlich für Proteine codieren, worin das Cystein an Position 132 oder 135 ersetzt ist (z. B. rBPI(1-193ala132).
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein bakterizides/permeabilitätserhöhendes Protein der SEQ ID NO: 2 zur Verfügung gestellt, in dem der Aminosäurerest in der Position 185 ausgewählt wird aus Leucin oder Glutaminsäure oder ein Fragment davon, das bakterizid/permeabilitäts-erhöhende Aktivität aufweist, wobei ein Cysteinrest in der Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt wird.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, umfassend ein bakterizides/permeabilitätserhöhendes Protein oder ein Fragment davon, das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Aktivität aufweist, wobei ein Cysteinrest in der Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, Adjuvans oder einen Träger, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung bei der Behandlung von Gramnegativen bakteriellen Infektionen und deren Sequelae brauchbar ist, einschließlich dem mit Endotoxin-zusammenhängenden Schock und einem oder mehreren Zuständen die damit assoziiert sind, wie z.B. disseminierte intravaskuläre Koagulation, Anämie, Thrombozytopenie, Leukopenie, adultes respiratorisches Stresssyndrom, Nierenversagen, Bluthochdruck, Fieber und metabolische Acidose.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, umfassend ein hybrides Fusionsprotein und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Träger, wobei das hybride Fusionsprotein am N-terminalen Ende ein bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein oder ein Fragment davon umfasst, das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Aktivität aufweist, wobei ein Cysteinrest in der Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt, ist und an seinem C-Terminus zumindest eine konstante Domäne der schweren Kette eines Immunglobulins oder einer allelischen Variation davon umfasst, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung bei der Behandlung von Gram-negativen bakteriellen Infektionen und deren Sequelae brauchbar ist, einschließlich des mit Endotoxin-zusammenhängenden Schocks und einem oder mehreren Zuständen, die damit assoziiert sind wie z.B. disseminierte intravaskuläre Koagulation, Anämie, Thrombozytopenie, Leukopenie, adultes respiratorisches Stresssyndrom, Nierenversagen, Bluthochdruck, Fieber und metabolische Acidose.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine DNA-Sequenz zur Verfügung gestellt, die für ein bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein der SEQ ID NO: 2 codiert, in dem der Aminosäurerest in der Position 185 ausgewählt ist aus Leucin oder Glutaminsäure, oder die für ein Fragment davon codiert, das bakterizide/permeabilitätserhöhende Aktivität aufweist, wobei der Cysteinrest in der Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine DNA zur Verfügung gestellt, die für ein bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein der SEQ ID NO: 2 oder einem Fragment davon, das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Aktivität aufweist, codiert, wobei ein Cysteinrest in der Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt wird und das Codon für den Valinrest in der Position 151 aus GTC oder GTG ausgewählt wird.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine DNA zur Verfügung gestellt, die eine 31-Aminosäure lange "Leader"-Sequenz und die ersten 193 N-terminalen Reste eines bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins codieren, in dem ein Cysteinrest in der Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und wobei die DNA ein Stoppcodon aufweist, das unmittelbar dem Codon für den Leucinrest in der Position 193 folgt, wobei die Sequenz, die die ersten vier Aminosäuren des 31-Aminosäure langen "Leader"-Sequenz codiert, entfernt ist.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine DNA zur Verfügung gestellt, die eine 31-Aminosäure lange "Leader"-Sequenz und die ersten 199 N-terminalen Reste eines bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins codieren, in dem der Cysteinrest in der Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und wobei die DNA ein Stoppcodon aufweist, das unmittelbar dem Codon für den Isoleucinrest in der Position 199 folgt und wobei die Sequenz, die die ersten vier Aminosäuren der 31-Aminosäure langen "Leader"-Sequenz codiert, entfernt ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein autonom replizierbarer DNA-Vektor zur Verfügung gestellt, der eine DNA umfasst, die für ein bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein oder für ein Fragment davon, das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Aktivität aufweist codiert, wobei der Cysteinrest in der Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt wird und wobei der Vektor weiterhin Selektionsmarkergen aufweist.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine CHO-Wirtszelle zur Verfügung gestellt, die mit einer DNA, die ein bakterizid/permeabilitäts-erhöhendes Protein oder ein Fragment davon, das bakterizid/permeabilitäts-erhöhende Aktivität aufweist, codiert, wobei ein Cysteinrest in der Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, in einer Weise stabil transformiert oder transfiziert ist, die die Expression des genannten Polypeptids in der genannten Wirtszelle ermöglicht.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Insektenzelle zur Verfügung gestellt, die mit einer DNA, die für ein bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein oder ein Fragment davon, das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Aktivität aufweist, codiert, wobei ein Cysteinrest in der Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, in einer Weise stabil transformiert oder transfiziert ist, die die Expression des genannten Polypeptids in der genannten Wirtszelle ermöglicht.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein oder ein Fragment davon, dass bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Aktivität aufweist zur Verfügung gestellt, wobei ein Cysteinrest in der Position 135 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine DNA zur Verfügung gestellt, die ein bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein oder ein Fragment davon, das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Aktivität aufweist, codiert, wobei ein Cysteinrest in der Position 135 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
  • Zuletzt stellt die folgende Erfindung auch stabile, homogene pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die die BPI-Proteinprodukte der Erfindung in pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln, Adjuvanzien und Trägern umfassen. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen sind gegenüber der Bildung von rBPI-Produktpartikeln resistent. Solche Zusammensetzungen sind bei der Behandlung von Gramnegativer bakterieller Infektion und den Sequelae dadurch brauchbar, einschließlich mit Endotoxin-zusammenhängendem Schock und einer oder mehrerer Zustände, die damit assoziiert sind, wie zum Beispiel disseminierte intravaskuläre Koagulationen, Anämie, Thrombozytopenie, Leukopenie, adultes respiratorisches Streßsyndrom, Nierenversagen, Bluthochdruck, Fieber und metabolische Acidose.
  • Viele zusätzliche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden nach Studium der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung für die Fachleute offensichtlich werden, die besonders bevorzugte Ausführungsformen davon beschreibt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
  • 1 stellt die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse von rBPI(1-199)-Produkten dar.
  • 2 stellt die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse von rBPI(1-193) und rBPI(1-199)ala132-Produkten dar.
  • 3 stellt die Ergebnisse der Kationenaustausch-HPLC-Analyse von rBPI(1-199)-Produkten dar.
  • 4 zeigt die Ergebnisse der Kationenaustausch-HPLC-Analyse von rBPI(1-199)ala132-Produkten dar.
  • 5 stellt die Ergebnisse von Umkehrphasen-HPLC-Lauf von rBPI(1-199)-Produkten dar.
  • 6 stellt die Ergebnisse von Umkehrphasen-HPLC-Lauf von rBPI(1-199)ala132-Produkten dar.
  • 7 stellt die Ergebnisse von Trübungs-Untersuchungen von pharmazeutischen Zusammensetzungen dar, die rBPI-Produkte mit oder ohne Poloxamer/Polysorbat-Oberflächen-aktiven Mittel-Bestandteilen bei pH 7,0 und 57°C enthalten.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Die folgende detaillierte Beschreibung betrifft die Herstellung und die Eigenschaften verschiedener rBPI-Produktpräparate, die eine Aminosäuresubstitution an einem Cysteinreste und/oder hoch einheitlicher Carboxy-Termini umfassen. Genauer gesagt, betrifft Beispiel 1 ein exemplarisches Mittel, durch das Basensubstitutionen in die Nukleotidsequenz eingeführt werden, die ein beispielhaftes N-terminales Fragment von dem BPI-Protein codieren und den Einbau einer derartig mutierten Sequenz in Plasmid-Vektoren. Beispiel 2 betrifft die Einführung von Vektoren aus Beispiel 1 in geeignete Wirtszellen und beschreibt weiter die Expression von rekombinanten BPI-Protein-Polypeptid-Produkten einschließlich rekombinanten BPI-Protein-Polypeptid-Produkten der Erfindung. Beispiel 3 betrifft die Konstruktion von DNAs, die Cysteinaustausch-Produkte einschließlich Cysteinaustausch-Analog-Produkten codieren und die Verwendung davon in in vitro Transkriptions/Translations-Verfahrensweisen. Beispiel 4 betrifft Eigenschaften von rBPI-Produkt-Polypeptiden einschließlich rBPI-Produkt-Polypeptiden der Erfindung.
  • BEISPIEL 1
  • Konstruktion von Vektoren, die BPI-Cystein-Austausch-Analoga enthalten
  • A. Konstruktion von Plasmiden pING4519 und pING4520
  • Der Expressionsvektor, pING4503, wurde als eine Quelle von DNA, die ein rekombinantes Expressionsprodukt codierte, und als rBPI(1-199) bezeichnet wird verwendet, d. h. dass es ein Polypeptid codiert mit der 31-Reste-Signalsequenz und den ersten 199 Aminosäuren des N-Terminus des reifen menschlichen BPI, wie in SEQ ID NOs: 1 und 2 angegeben mit der Ausnahme, dass Valin an Position 151 durch GTG anstelle von GTC spezifiziert wird und Rest 185 Glutaminsäure ist (spezifiziert durch GAG) anstelle von Lysin (spezifiziert durch AAG).
  • Plasmid pING4503 ist beschrieben worden in der ebenfalls anhängigen und ebenfalls eigenen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/064,693 , veröffentlicht als WO 93/23434 , von Theofan, et al. Kurz gesagt, basiert die Konstruktion von pING4503 auf Plasmid pING2237N, welches das Enhancerelement der schweren Immunglobulinkette der Maus enthält, das LTR-Enhancer-Promotor-Element der Abelson-murinen Leukämie-Virus (A-MuLv)-DNA, die SV40 19S/16S-Splice-Verbindung am 5'-Ende des zu exprimierenden Gens, und die menschliche genomische gamma-1-Polyadenylierungsstelle am 3'-Ende des zu exprimierenden Gens. Plasmid pING2237N weist auch einen Dehydrofolat-Reduktase (DHFR) selektierbaren Marker von der Maus auf. Die rBPI(1-199) codierende DNA, einschließlich 30 bp der natürlichen 5' untranslatierten Region und die Basen, welche die 31 Aminosäuresignalsequenz codieren, ebenso wie 199 N-terminale Aminosäuren von BPI, wird zwischen die einzige SalI- und SstII-Restriktionsschnittstelle in pING4503 inseriert.
  • Zwei Vektoren, pING4519 und pING4520, wurden auf der Basis von pING4503 zur Expression von rBPI(1-199)-Cysteinaustauschanalogen konstruiert, in denen eine der drei natürlicherweise auftretenden Cysteinreste von BPI durch eine andere Aminosäure ausgetauscht ist. Eine PvuII-Stelle (CAGCTG), die nur einmal in der DNA vorkommt, die rBPI(1-199) codiert und die zwischen Cystein 132 und Cystein 135 angeordnet ist, wurde in diesen Konstrukten verwendet. Da mehrere zusätzliche PvuII-Stellen in pING4503 existieren, war es zuerst erforderlich, das SalI-SstII-Fragment aus pING4503 durch Verdau mit SalI und SstII zu isolieren, die das Insert enthielt, das rBPI(1-199) codierte,. Das gereinigte SalI-SstII-rBPI(1-199)-Insert wurde dann mit PvuII verdaut, was zu einem etwa 529 bp SalI-PvuII-Fragment und einem etwa 209 bp PvuII-SstII-Fragment führte, von denen jedes getrennt gereinigt wurde.
  • Plasmid pING4519 ist identisch mit pING4503 mit der Ausnahme, dass pING4519 ein DNA-Insert enthält, das ein rBPI(1-199) codiert, bei dem ein Codon für Alanin das Codon ersetzt, das das native Cystein an Position 132 spezifiziert. Wie oben festgehalten, wird das rekombinante Produkt, das aus der Wirtszellexpression und dem sekretorischen Prozessieren eines solchen Inserts resultiert, als "rBPI(1-199)ala132" bezeichnet. Um pING4519 zu erzeugen, wurden BPI-DNA-Sequenzen aus pING4503 PCR-amplifiziert unter Verwendung des Primers BPI-6: AAGCTTGTCGACCAGGCCTTGAGGT (SEQ ID NO: 3), der eine SalI-Restriktionsstelle am 5'-Ende der 30 bp BPI-nicht-translatierten Region einfügte, und BPI-14: CTGGAGGCGGTGATGGTG (SEQ ID NO: 4), der eine Hälfte der PvuII-Stelle und der Basensubstitutionen einfügte, die erforderlich sind, um für Alanin an Position 132 zu codieren. Die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung des GeneAmp PCR-Kits (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) entsprechend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit SalI verdaut, was zu einem blunt, etwa 529 bp SalI-Fragment führte, was dann in einer Drei-Stück-Ligation verwendet wurde, zusammen mit dem oben beschriebenen, etwa 209 bp PvuII-SstII-Fragment und dem großen Fragment, das aus dem SalI- und SstII-Verdau von pING4503 resultierte, um so pING4519 zu erzeugen.
  • Plasmid pING4520 ist identisch mit pING4519 mit der Ausnahme, dass pING4520 ein DNA-Insert enthält, das ein rBPI(1-199)-Analog codiert, in dem ein Serin-Codon an die Stelle des Codons tritt, das das native Cystein an Position 135 spezifiziert. Wie oben festgehalten, wird das rekombinante Produkt, das aus der Wirtszellexpression eines derartigen Inserts resultiert, als "rBPI(1-199)ser135" bezeichnet. Um pING4520 zu erzeugen, wurden BPI-DNA-Sequenzen aus pING4513 PCR-amplifiziert, einem Plasmid, das im wesentlichen pING4503 ähnlich ist mit der Ausnahme, dass der Selektionsmarker gpt anstelle von DHFR ist und das cDNA-Insert die Signalsequenz und BPI in seiner ganzen Länge (456 Reste) anstelle von nur dem rBPI(1-199)-Teil codiert.
  • Die Amplifikation durch PCR wurde unter Verwendung von Primer BPI-15: CTCCAGCAGCCACATCAAC (SEQ ID NO: 5) erreicht, worin das 5'-Ende die Hälfte einer mutierten PvuII-Stelle einbringt (worin "CTG" zu "CTC" geändert ist) und die Basensubstitutionen, die notwendig sind, um für Serin an Position 135 zu codieren; und Primer BPI-7: GAACTTGGTTGTCAGTCG (SEQ ID NO: 6), der rBPI-codierende Sequenzen darstellt, die stromabwärts der Region angeordnet sind, die für BPI-Rest 199 codiert. PCR-Fragment wurde mit BstBI verdaut, das stromabwärts der Cystein 135-Mutagenesestelle schneidet, und das resultierende glatte etwa 100 bp blunt BstBI-Fragment wurde Gel-gereinigt. eine Drei-Stück-Ligation mit dem oben beschriebenen 529 bp SalI-PvuII-BPI-Restriktionsfragment, dem glatten 100 bp blunt BstBI-Fragment und einem großen Fragment, das aus BstBI-SalI-Verdau von pING4503 resultiert durchgeführt, um so pING4520 zu erzeugen.
  • B. Konstruktion von Plasmid pING4530
  • Ein weiterer Vektor, pING4530, wurde konstruiert, der den Alanin-anstelle-von-Cystein-Austausch enthielt, wie in pING4519, der aber den gpt-selektierbaren Marker (der für Mycophenolsäureresistenz codiert) anstelle von DHFR-Marker enthielt, der von pING4503 auf pING4519 mit übernommen wurde. Um pING4530 zu konstruieren, wurde ein 1629-bp-SalI-DraIII-Restriktionsfragmentn aus pING4519 isoliert. Dieses Fragment umfaßte die gesamte rBPI(1-199)ala132-codierende Region, ebenso wie eine zusätzliche etwa 895 bp Vektor-Sequenz am 3'-ende der codierenden Region. Dieses Fragment wurde ligiert an das große (etwa 7.230 bp) DraIII-SalI-Vektorfragment, das aus pING4513 isoliert wurde, um pING4530 zu erzeugen.
  • C. Konstruktion von Plasmid pING4533
  • Plasmid pING4533 wurde konstruiert für die Expression von rBPI(1-199)ala132, worin da Codon, das die fünfte Aminosäure der BPI-Signalsequenz codiert, Methionin (ATG) an Position –27 ausgetauscht wurde im Kontext der Konsensus-Kozak-Translationsinitiationssequenz GCCACCRCCATGG (SEQ ID NO: 7) [Kozak, Nucl. Acid. Res., 15:8125 (1987)] und in der die DNA-Sequenz, die für die ersten vier Aminosäuren des BPI-Signals codiert, entfernt wurde. Dies wurde erreicht durch PCR-Amplifikation von BPI-Sequenzen von einem Plasmid, das die menschliche BPI-cDNA in ihrer ganzen Länge enthielt [in pGEM-7zf(+)] unter Verwendung des PCR-Primers BPI-23: ACTGTCGACGCCACCATGGCCAGGGGC (SEQ ID NO: 8), einbauend eine SalI-Restriktionsstelle und die Nukleotide GCCACC vor dem ATG (Methionin) an Position –27 des BPI-Signals und den Primer BPI-2: CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT (SEQ ID NO: 9), entsprechend dem 3'-Ende der rBPI(1-199) codierenden Sequenz.
  • Die etwa 700 bp PCR-amplifizierte Dna wurde mit SalI und EcoRI verdaut und das resultierende 270 bp-Fragment, einschließlich etwa des ersten Drittels der BPI(1-199)-codierenden Sequenz, gereinigt. Dieses SalI-EcoRI-Fragment wurde an 2 andere Fragment ligiert: (1) ein 420 bp EcoRI-SstII-Fragment aus pING4519, das den Rest von BPI(1-199) codierte, worin Alanin Cystein an Position 132 ersetzte; und (2) ein etwa 8000 bp SstII-SalI-Vektorfragment aus pING4502 (ein Vektor, der im wesentlichen ähnlich ist zu pING4503 mit der Ausnahme, dass es nicht die 30 bp 5'-nicht-translatierte Sequenz aufweist und einen gpt-Marker anstelle von DHFR aufweist), um pING4533 zu erzeugen, das einen gpt-Marker enthält.
  • D. Konstruktion der Plasmide pING4221, pING4222 und pING4223
  • Vektoren ähnlich pING4533 wurden konstruiert, die ein Insert aufweisen, das die optimierte Kozak-Translations-Initiationsstelle enthält entsprechend dem Methionylrest –27 der Signalsequenz und eine Alanin-anstelle-von-Cystein-Ersetzung an Position 132. Die das BPI-Fragment codierende Sequenz endete jedoch an Rest 193 in diesen Konstruktionen. Wie oben festgehalten, wird das rekombinante Produkt, das aus Wirtszell-Expression dieser DNA resultiert, als "rBPI(1-193)ala132" bezeichnet. Vektoren, die diese Inserts enthalten, wurde hergestellt, indem zuerst pING4533 mit SalI verdaut wurden, das am 5'-Ende des BPI-DNA-Inserts schneidet und AlwNI, welches einen 3'-Überhang von drei bp an Rest 192 hinterläßt. Das resultierende etwa 700 bp-Fragment wurde dann gereinigt. Dieses Fragment wurde religiert in das große Fragment, das aus dem pING4533-Verdau mit SstII-SalI resultierte, zusammen mit zwei annelierten komplementären Oligonukleotiden, BPI-30: CTGTAGCTCGAGCCGC (SEQ ID NO: 10) und BPI-31: GGCTCGAGCTACAGAGT (SEQ ID NO: 11). Dies ersetzt die Region zwischen den AlwNI- und SstII-Stellen mit dem Codon für Rest 193 (Leucin), einem Stopp-Codon und einer XhoI-Restriktionsstelle 5' zu der SstII-Stelle und führte zur Regeneration von sowohl der AlwNI- als auch der SstII-Stellen und Plazierung des Stopp-Codons, TAG, unmittelbar nach dem Codon (CTG) für Aminosäure 193 (Leucin). Das resultierende Plasmid wurde als pING4223 bezeichnet und wies den gpt-Marker auf. Ähnliche Konstruktionen wurden genauso gemacht wie für pING4223 beschrieben, mit der Ausnahme, dass verschiedene SstII-SalI-Vektorfragmente verwendet wurden, um Vektoren zu erzeugen mit verschiedenen Selektionsmarkern. Zum Beispiel ist pING4221 identisch mit pING4223 mit der Ausnahme, dass es den his-Marker (der Resistenz gegenüber Histidinol verleiht) anstelle von gpt, und pING4222 ist identisch mit pING4223 mit Der Ausnahme, dass es den DHFR-Marker anstelle von gpt enthält.
  • E. Konstruktion der Plasmide pING4537, pING4143, pING4146, pING4150 und pING4154
  • Eine Serie von Vektoren wurde konstruiert, die ein Insert enthielten, das rBPI(1-193)ala132 enthielt, die optimierte Kozak-Translationsinitiationsstelle und verschiedene Selektionsmarker, die im wesentlichen identisch sind zu den im Zusammenhang mit pING4221, pING4222 und pING4223 beschriebenen, mit der Ausnahme, dass die menschliche genomische gamma-1 schwere Ketten-Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminations-Region am 3'-Ende der SstII-Stelle ersetzt wurde durch eine menschliche Polyadenylierungssequenz der leichten Kette, gefolgt von genomischen Transkriptionsterminations-Sequenzen der leichten Kette (kappa) der Maus. In collateralen Genexpressionsstudien schien das Polyadenylierungssignal der leichten Kette und die Transkriptionsterminationsregion verantwortlich zu sein für 2,5-5-fache Steigerungen der BPI-Expressionsspiegel in Sp2/0- und CHO-K1-Zellen.
  • Die vorerwähnten Vektoren wurden konstruiert, indem zuerst pING4537 konstruiert wurde, ein Vektor ähnlich pING4533, der das rBPI(1-199)ala132-Insert enthält. pING4537 enthält jedoch die Polyadenylierungssequenzen von menschlicher leichter Kette anstelle von Sequenzen menschlicher schwerer Kette. Die 3'-Sequenzen von Kappa der Maus wurden erhalten von pING3170, einem Expressionsvektor, der eine cDNA von menschlicher leichter Kette codiert und eine 3'-Transkriptionsterminations-Sequenz der genomischen leichten Kette der Maus enthält. Dies wurde vorgenommen durch Verdauen mit SstI, welches 35 bp stromaufwärts des Stopp-Codons der leichten Kette der Maus schneidet, Behandeln mit T4-DNA-Polymerase, um Gradienten zu machen, dann Schneiden mit BamHI und Reinigen eines etwa 1350 bp-Fragmentes, welches die 3'-Sequenzen von Kappa von Maus enthielt. Das resultierende Fragment besteht aus etwa 250 bp des 3'-Teils der cDNA der konstanten Region von menschlicher leichter Kette und dem Polyadenylierungssignal, gefolgt von einem BamHI-Linker, wie beschrieben in dem als Δ8 in Lui et al., J. Immunol. 139: 3521, (1987) bezeichneten Konstrukt. Der Rest des etwa 1350 bp-Fragmentes besteht aus einem 3'-genomischen BglII-BamHI-Fragment von Kappa der Maus [Fragment "D" von Xu et al., J. Biol. Chem. 261:3838, (1986)], welches Transkriptionsterminations-Sequenzen bereitstellt. Dieses Fragment wurde in einer Drei-Stück-Ligation verwendet mit zwei Fragmenten von pING4533: ein 3044 bp-Fragment, welches das gesamte BPI-Insert und einen Teil des Vektors enthielt, das durch Verdau von SstII, T4 Polymerase-Behandlung und NotI-Verdau (das das gesamte BPI-Insert und einen Teil des Vektors enthielt) und ein ungefähr 4574 bp-BamHI-NotI-Fragment. Der resultierende Vektor, pING4537, ist identisch mit pING4533 mit der Ausnahme der oben angegebenen Unterschiede in der genomischen 3'-nicht-translatierten Region.
  • Zusätzliche Vektoren, die die 3'-nicht-translatierten Sequenzen von Kappa enthielten, wurden konstruiert unter Verwendung von pING4537 als die Quelle des Kappa-3'-Fragmentes. Die 3'-nicht-translatierten Sequenzen von Kappa wurden isoliert durch Verdau von pING4537 mit XhoI (eine einzige Stelle, die unmittelbar nach dem BPI-Stopp-Codon auftritt) und BamHI. Das resultierende etwa 1360 bp XhoI-BamHI-Fragment wurde verwendet in einer Serie von 3-Stück-Ligationen, um die folgenden vier Vektoren zu generieren, die alle Inserts enthalten, die rBPI(1-193)ala132 codieren und die die optimierte Kozak-Translationsinitiationsstelle an Rest –27 des Signals enthalten: (1) pING4143 (gpt-Marker), erhalten durch Ligation eines pING4223 4574 bp BamHI-Notl-Fragmentes (gpt-Marker), ein pING4223 NotI-XhoI-BPI-Insert-enthaltendes Fragment mit etwa 3019 bp und das pING4537 XhoI-BamHI-Fragment; (2) pING4146 (DHFR-Marker), erhalten durch Ligation eines pING4222 BamHI-NotI-Fragmentes mit etwa 4159 bp (DHFR-Marker), ein pING 4223 NotI-XhoI-BPI-Insertenthaltendes Fragment mit etwa 3019 bp und das pING4537 XhoI-BamHI-Fragment; (3) pING4150 (his-Marker), erhalten durch Ligation eines pING4221 his-enthaltenden BamHI-Notl-Fragmentes mit etwa 4772 Basenpaaren, ein pING4222 NotI-XhoI-bp-Insertenthaltendes Fragment und das pING4537 XhoI-BamHI-Fragment; und (4) pING4154 (neo-Marker), erhalten durch Ligation eines pING3174-neo-enthaltenden BamHI-Bsal-Fragmentes mit etwa 4042 Basenpaaren, ein pING4221 BsaI-XhoI-BPI-Insert-enthaltendes Fragment mit etwa 3883 Basenpaaren und das pING4537 XhoI-BamHI-Fragment. Plasmid pING3174 enthält ein Insert, das DNA für die schwere Antikörperkette codiert und einen neo-Marker enthält. Das neo-Gen und seine flankierenden Sequenzen wurden erhalten aus dem von Southern et al., J. Mol. App.. Genet., 1:327 (1982) berichteten pSv2 neo-Plasmid.
  • F. Konstruktion der Plasmide pING4144 und pING4151
  • Es wurden zwei Plasmide, pING4144 und pING4151, konstruiert, die identisch waren mit pING4143 bzw. pING4150 mit der Ausnahme, dass die Expression von rBPI-codierenden Sequenzen unter der Kontrolle von unmittelbarem frühen Enhancer/Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (hCMV) anstelle des Abelson Murin Leukämie-Virus (A-MuLv)-LTR-Promotor standen. Deshalb enthielten sowohl pING4144 als auch pING4151 die Mutation des Cysteins an Position 132 zu Alanin, die optimierte Kozak-Translationsinitations-Sequenz und die menschliche poly-A Leichtketten-/genomische Maus-Kappa-Transkriptionsterminationsregion. Die Region zwischen den Nukleotiden 879 und 1708 des ursprünglichen Wechsels (pING4143 und pING4150) wurde ersetzt durch eine Region des hCMV-Enhancers/Promotors, entsprechend den Nukleotiden –598 bis +174, wie in 3 von Boshart et al., Cell 41:521 (1985) gezeigt. Um die hCMV-Promotorregion in BPI-Expressionsvektoren einzuführen, wurde zuerst das Plasmid pING4538 konstruiert, in dem das etwa 1117 bp umfassende EcoRI-SalI/A-MuLv-Promotor-enthaltende Fragment von pING4222 mit einem etwa 1054 bp langen EcoRI-SalI/hCMV-Promotor-enthaltenden Fragment aus Plasmid pING2250, welches den hCMV-Promotor enthält, der die Expression eines leichten Antikörper-Ketten-Inserts antreibt. Um pING4144 zu konstruieren, wurden drei Fragment miteinander ligiert: (1) das rBPI(1-193)-enthaltende NotI-XhoI-Fragment mit etwa 2955 bp aus pING4538; (2) das XhoI-BamHI-Fragment mit etwa 1360 bp aus pING4537; und (3)das BamHI-NotI-Fragment mit etwa 4770 bp, das das his-Gen aus pING4221 enthält.
  • G. Konstruktion der Plasmide pING4145, pING4148 und pING4152 Die Plasmide pING4145, pING 4148 und pING4152 wurden konstruiert und waren identisch mit pING4143, pING4146 bzw. pING4150, mit der Ausnahme, dass sie das Wildtyp (natürliche Sequenz)-Cystein an Position 132 anstelle einer Alanin-Substitution aufwiesen. Somit enthielten alle das rBPI(1-193)-Insert, die optimierte Kozak-Translationsinitiations-Sequenz und die menschliche poly-A Leichtketten-/genomische Maus-Kappa-Transkriptionsterminationsregion. Diese drei Plasmide wurden wie folgt konstruiert. Um pING4145 zu konstruieren, wurden die drei Fragmente miteinander ligiert: (1) das NotI-XhoI-BPI(1-193)-enthaltende Fragment mit etwa 3000 Basenpaaren aus pING4140 (pING4140 ist identisch mit pING4221 mit der Ausnahme, dass es das Wildtyp-Cystein an Position 132 enthält); (2) das Xhol-BamHI-Fragment aus pING4537 mit etwa 1360 bp; und (3) das BamHI-NotI-Fragment mit etwa 4570 bp, das das gpt-Gen aus pING4223 enthält. Um pING4148 zu konstruieren, wurden drei Fragmente miteinander ligiert: (1) das NotI-XhoI-Fragment aus pING4140; (2) das XhoI-BamHI-Fragment aus pING4537; und (3) das BamHI-NotI-Fragment mit etwa 4150 bp, das das DHFR-Gen aus pING4222 enthielt. Um pING4152 zu konstruieren, wurden drei Fragmente miteinander ligiert: (1) das NotI-XhoI-Fragment mit etwa 3000 bp aus pING4142 (pING4142 ist identisch mit pING4223 mit der Ausnahme, dass es das Wildtpy-Cystein an 132 enthält); (2) das XhoI-BamHI-Fragment aus pING4537; und (3) das BamHI-NotI-Fragment mit etwa 4770 bp, das das his-Gen aus pING4221 enthält.
  • Tabelle I, unten, faßt den Inhalt der Plasmide zusammen, deren Herstellung in den Abschnitten A bis G oben beschrieben ist. TABELLE
    Plasmid BPI-Produkt Signalsequenz Marker 3'-terminal Promotor
    pING4519 (1-199)Ala132 31AA DHFR* Menschliches genomisches HC Gamma-1 Poly-A A-MuLv
    pING4520 (1-199)Ser135 31AA DHFR* Menschliches genomisches HC Gamma-1 Poly-A A-MuLv
    pING4530 (1-199)Ala132 31AA gpt Menschliches genomisches HC Gamma-1 Poly-A A-MuLv
    pING4533 (1-199)Ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal gpt Menschliches genomisches HC Gamma-1 Poly-A A-MuLv
    pING4223 (1-193)Ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal gpt Menschliches genomisches HC Gamma-1 Poly-A A-MuLv
    pING4221 (1-193)Ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal his Menschliches genomisches HC Gamma-1 Poly-A A-MuLv
    pING4222 (1-193)Ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal DHFR Menschliches genomisches HC Gamma-1 Poly-A A-MuLv
    pING4537 (1-199)Ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal gpt Menschliches Kappa-Poly-A/genomische Maus-Kappa-Transkriptionstermination A-MuLv
    pING4143 (1-193)Ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal gpt Menschliches Kappa-Poly-A/genomische Maus-Kappa-Transkriptions A-MuLv
    termination
    pING4146 (1-193)Ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal DHFR Menschliches Kappa-Poly-A/genomische Maus-Kappa-Transkriptionstermination A-MuLv
    pING4150 (1-193)Ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal his Menschliches Kappa-Poly-A/genomische Maus-Kappa-Transkriptionstermination A-MuLv
    pING4144 (1-193)Ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal gpt Menschliches Kappa-Poly-A/genomische Maus-Kappa-Transkriptionstermination hCMV
    pING4145 (1-193) Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal gpt Menschliches Kappa-Poly-A/genomische Maus-Kappa-Transkriptionstermination A-MuLv
    pING4148 (1-193) Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal DHFR Menschliches Kappa-Poly-A/genomische Maus-Kappa-Transkriptionstermination A-MuLv
    pING4152 (1-193) Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal his Menschliches Kappa-Poly-A/genomische Maus-Kappa-Transkriptionstermination A-MuLv
    pING4151 (1-193)ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal his Menschliches Kappa-Poly-A/genomische Maus-Kappa-Transkriptionstermination hCMV
    pING4154 (1-193)ala132 Kozak-Initiations-Seq; 27AA-Signal neo Menschliches Kappa-Poly-A/genomische Maus-Kappa-Transkriptionstermination A-MuLv
  • BEISPIEL 2
  • Transfektion von Zellen für die Expression der rBPI-Cystein-Austausch-Analoga und Fragmente
  • Säugerzellen sind bevorzugte Wirtszellen für die Produktion von rBPI-Protein-Produkten entsprechend der Erfindung, da derartige Zellen eine geeignete Sekretion, Faltung und posttranslationale Modifikation der exprimierten Proteine erlaubt. Derzeit bevorzugte Säugerwirtszellen für die Produktion von rBPI Protein-Produkten der Erfindung umfassen Zellen von Fibroblasten und lympoiden Ursprungs, wie: CHO-K1-Zellen (ATCC CCL61); CHO-DG44 Zellen, eine Dihydrofolat-Reduktase-Defiziente [DHFR–]-Mutante von CHO Toronto, die von Dr. Lawrence Chasin, Columbia University, erhalten wurde; CHO-DXB-11, eine DHFR--Mutante von CHO-K1, erhalten von Dr. Lawrence Chasin; Vero-Zellen (ATCC CRL81); Babyhamsternieren (BHK)-Zellen (ATCC CCL10); Sp2/O-Ag14-Hybridoma-Zellen (ATCC CRL1581); und NSO-Myelom (ECACC Nr. 85110503).
  • Die Transfektion von Säugerzellen kann vorgenommen werden durch eine Vielzahl von Verfahren. Ein gemeinsamer Ansatz umfaßt Calciumphosphat-Präzipitation von Expressionsvektor-DNA, die nachfolgend von Wirtszellen aufgenommen werden wird. Ein weiterer allgemeiner Ansatz, Elektroporation, verursacht die Zellen, DNA durch Membranporen aufzunehmen, die durch die Erzeugung eines starken elektrischen Feldes generiert werden [(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 16,30-16,31 (1989)]. Die Selektion für transfizierte Zellen wird erleichtert durch Einbau eines Gens in den Expressionsvektor, dessen Produkt in transfizierten Zellen zu überleben erlaubt und unter selektiven Bedingungen zu wachsen. Eine Anzahl derartiger Gene ist identifiziert worden. Diese umfassen, unter anderem: (1) neo, ein prokaryontisches Gen, das Resistenz gegen das Aminoglycosid-Antibiotikum G418 verleiht; (2) E. coli-Guaninphosphoribosyltransferase (gpt), welche Resistenz gegen Myophenolsäure (MPA) in Gegenwart von Xanthin codiert, [Mulligan et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78:2072-2076 (1981)]; (3) Dihydrofolatreduktase (DHFR), welche Wachstum von DHFR'-Zellen in Abwesenheit von Nukleosiden erlaubt und Genamplifikation in der Gegenwart zunehmender Konzentration von Methotrexat; (4) das hisD-Gen von Salmonella typhimurium, das Wachstum in Gegenwart von Histidinol erlaubt [Hartman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:8047-8051, (1988)]; (5) das trpB-Gen von E. coli [Hartman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:8047-8051, (1988)], das Wachstum in Gegenwart von Indol (ohne Tryptophan) erlaubt; und (6) das Glutaminsynthetasegen, das Wachstum in Medien erlaubt, denen Gutamin fehlt. Die Verfügbarkeit dieser selektiven Marker, entweder alleine oder in verschiedenen Kombinationen, sieht eine Flexibilität in der Erzeugung von Säugerzellinien vor, die rekombinante Produkte im großen Maßstab exprimieren.
  • A. Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pING4533
  • Das Plasmid pING4533 enthält Gensequenzen, die rBPI(1-199)ala132 codieren, die an den A-MuLv-Promotor fusioniert sind, die optimierte Kozak-Translationsinitationssequenzen, die 3'-nicht-translatierte Region der menschlichen schweren gamma-1-Kette, und den gpt-Marker für Selektion von MPA-resistenten Zellen.
  • Die CHO-K1-Zellinie wird gehalten in Ham's F12-Medium plus 10 % fötalem Rinderserum (FBS), das mit Glutamin/Penicillin/Streptomycin (Irvine Scientific, Irvine, CA) supplementiert ist. Die Zellen wurden durch Elektroporation mit 40 μg pING4533-DNA transfiziert, die zuerst mit NotI verdaut wurde, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert wurde. Nach der Elektroporation erlaubte man den Zellen, sich für 24 Stunden in nicht-selektivem Ham's F12-Medium zu erholen. Die Zellen wurden dann trypsiniert, bei einer Konzentration von 5 × 104 Zellen/ml in Ham's F12-Medium, das mit MPA (25 μg/ml) und Xanthin (250 μg/ml) supplementiert war und dann zu 104 Zellen/Napf in 96-Napf-Platten ausplattiert. Nicht transfizierte CHO-K1-Zellen sind nicht in der Lage, in diesem Medium zu wachsen infolge der Inhibierung der Pyrimidinsynthese durch MPA.
  • Nach zwei Wochen wurden Kolonien bestehend aus transfizierten Zellen in den Platten mit 96 Näpfen beobachtet. Die Überstände von Näpfen, die einzelne Kolonien enthielten, wurden auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch anti-BPI-ELISA unter Verwendung von rBPI(1-199) als ein Standard analysiert. In diesem Test waren Immulon-II-Platten mit 96 Näpfen (Dynatech, Chantilly, VA) vorbeschichtet mit Affinitäts-gereinigtem Kaninchen-Anti-rBPI(1-199)-Antiserum. Überstandproben wurden hinzugefügt und der Nachweis wurde durchgeführt unter Verwendung von Affinitäts-gereinigtem, biotinylierten Kaninchen-Anti-rBPI(1-199)-Antiserum und Peroxidase-markiertem Avidin.
  • Etwa 800 Kolonien wurden auf diese Weise gescreent. 31 Kolonien mit der höchsten Produktion wurden in Platten mit 24 Näpfen für die Bewertung der Produktivität überführt. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz in einer Platte mit 24 Näpfen in Ham's F12-Medium, das mit 10 % FBS supplementiert war, angezogen. Wenn die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurde das Ham's F12-Medium entfernt und 1 ml HB-CHO-Serum-freies Medium (Irvine Scientific) plus 40 μl sterile S-Sepharose-Kügelchen (Pharmacia, Piscataway, NJ) hinzugegeben, wie in der ebenfalls eigenen, gleichzeitig anhängigen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/072,063 , veröffentlicht als WO 93/23540 ( Europäische Patentanmeldung Nr. 93913992.9 ) von Grinna. Die Zellen wurden dann für 7 Tage inkubiert, wonach die S-Sepharose-Kügelchen entfernt wurden und mit 0,1 M NaCl in 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5) gewaschen wurden. Das Produkt wurde von den Kügelchen durch Hinzufügen von 1,0 M NaCl Tris-Puffer eluiert und durch ELISA, wie oben beschrieben, quantifiziert. Die am meisten produzierende Transformante, bezeichnet als A153, sekretierte etwa 3 μg/ml in diesem Test und wurde adaptiert, um in Excell 301 Serum-freiem Medium (JRH Scientific, Lenexa, KS) zu wachsen. Die adaptierten Zellen wurden in 1,5 1 Fermentern in Excell 301-Medium in Gegenwart von S-Sepharose-Kügelchen angezogen. Die Produktivität wurde nach 120-140 Stunden durch C4-HPLC-Analyse von Produkt bewertet, das von den S-Sepharose-Kügelchen eluiert war (Aliquots von 50 ml). Die Produktivität war 15-25 μg/l in diesem Stadium der Fermentation.
  • B. Transfektion von CHO-DG44-Zellen mit pING4222
  • Plasmid pING4222 enthält DNA, die das rBPI(1-193)Ala132-Analog codiert, das an den A-MuLv-Promotor fusioniert ist, die optimierte Kozak-Initationssequenz, die 3'-nicht-translatierte Region der menschlichen schweren gamma-1-Kette und das Maus-DHFR-Gen für die Selektion von transfizierten Zellen in einem Nukleosid-freien Medium.
  • Die Zellinie, CHO DG44, wurde in Ham's F12-Medium plus 10 % FBS mit Glutmain/Penicillin/Streptomycin gehalten. Die Zellen wurden transfiziert mit linearisierter pING4222 DNA (40 μg verdaut mit PvuI, extrahiert mit Phenol-Chloroform, mit Ethanol präzipitiert) unter Verwendung des Calciumphosphatverfahrens von Wigler et al., Cell, 11:223 (1977). Nach der Behandlung mit Calciumphosphat wurden die Zellen in Platten mit 96 Näpfen mit etwa 104 Zellen/Napf plattiert und Transfektanten wurden erhalten durch Wachstum in selektivem Medium, das aus αMEM bestand, dem Nukleoside fehlten (Irvine Scientific), und supplementiert mit dialysiertem FBS (100 ml Serum dialysiert gegen 4L kaltes 0,15 M NaCl unter Verwendung eines Molekulargewichtsausschlusses von 6000-8000, 16 Stunden, 4°C). Nicht transfizierte CHO-DG44-Zellen sind nicht in der Lage, in diesem Medium zu wachsen infolge der DHFR-Mutation und des Fehlens von Nukleosiden in dem Medium, das mit dialysiertem Serum supplementiert ist.
  • Nach 2 Wochen enthielt jeder Napf etwa 2-3 Kolonien. Die Überstände aus Näpfen einer Platte mit 96 Näpfen wurden analysiert auf die Anwesenheit von rBPI(1-193)ala132 durch ELISA, wie in Abschnitt A. Die 24 am höchsten produzierenden Klone wurden in Platten mit 24 Näpfen expandiert in selektivem αMEM-Medium, das mit 0,05 μM Methotrexat supplementiert war, um Genamplifikation der rBPI-Analog-codierenden DNA zu induzieren. Nach Beobachtung von Wachstum wurden die Zellen in eine neue Platte mit 24 Näpfen überführt und die Produktivität bewertet von S-Sepharose-Eluaten, wie oben beschrieben für die pING4533/CHO-K1-Transfektanten. Die fünf am stärksten produzierenden Klone wurden kombiniert und durch beschränkende Verdünnung in Platten mit 96 Näpfen subkloniert. Die Überstände von Näpfen, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf Titer von rBPI(1-193)ala132 durch ELISA getestet. Die am meisten produzierenden 20 Subklone wurden als nächstes in Platten mit 24 Näpfen expandiert und waren Gegenstand einer weiteren Amplifikation in Gegenwart von 0,4 μM Methotrexat und das Ausmaß der Produktexpression für die amplifizierten wurde durch ELISA bestimmt. Die stärksten Produzenten, die Klone 4, 75 und 80 sekretierten 25-37 μg/ml am Tag 7 in einer Platte mit 24 Näpfen, die S-Sepharose enthielten.
  • C. Transfektion von Sp2/O-Zellen mit pING4223 und pING4221
  • Eine Strategie, die angewandt wurde in dem Bestreben, optimale Expression von erwünschten rBPI-Produkten zu erreichen, umfaßte die Transfektion von Zellen mit einem ersten Expressionsplasmid mit einem ersten Marker, Screenen auf die stärksten Produzenten und dann Transfizieren derselben Zellen mit einem zweiten Expressionsplamid mit einem verschiedenen Marker. Diese Strategie ist unten unter Verwendung von Sp2/O-Zellen beschrieben.
  • Das Plasmid pING4223 enthält DNA, die rBPI(1-193)ala132BPI enthält, das an den A-MuLv-Promotor, die optimierte Kozak-Translationsinitiationsssequenz, die 3'-nicht-translatierten Sequenzen von menschlicher schwerer gamma-1-Kette und den gpt-Marker zur Selektion auf MPA-resistente Zellen fusioniert ist.
  • Die Sp2/O-Zellinie wurde in DMEM-Medium gehalten, das mit 10 % FBS mit Glutamin/Penicillin/Streptomycin supplementiert war. Die Sp2/0-Zellen wurden durch Elektroporation mit 40 μg pING4223 DNA transfiziert, die mit NotI verdaut, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert wurde. Nach Elektroporation erlaubte man den Zellen, sich für 48 Stunden in nicht-selektivem DMEM-Medium zu erholen. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und mit einer Konzentration von 5 × 104 Zellen/ml in DMEM-Medium resuspendiert, das mit MPA (6 μg/ml) und Xanthin (250 μg/ml) supplementiert war und zu 104-Zellen/Napf in Platten mit 96 Näpfen ausplattiert. Nicht-transfizierte Sp2/O-Zellen waren nicht in der Lage, in diesem Medium zu wachsen infolge der Inhibierung der Pyrimidin-Synthese durch die MPA. Nach 1,5-2 Wochen wurden Kolonien beobachtet, die aus transfizierten Zellen bestanden, in den Platten mit 96 Näpfen. Die Überstände von Näpfen, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf die Anwesenheit von Produkt-reaktivem Protein mittels ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in eine Platte mit 24 Näpfen überführt und die Produktivität wurde in abgestorbenen Kulturen aus 24 Napf-Zellen bewertet, die in Gegenwart oder Abwesenheit von 10–7 M Dexamethason gewachsen waren, das eine Erhöhung der Expression durch den A-MuLv-Promotor als ein Ergebnis der Wechselwirkung mit dem Glucocorticoid-Rezeptor verursacht. Der stärkste Produzent, Klon 2X3, sekretierte etwa 3 μg/ml und 7 μg/ml in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Dexamethason.
  • Der Klon 2X3 wurde als nächstes durch Elektroporation mit pING4221 transfiziert, der das his-Gen für Selektion von Transfektanten enthält. Nach Erholung für 48 Stunden in DMEM plus 10 % FBS-Medium wurden die Platten in Platten mit 96 Näpfen mit etwa 104 Zellen/Napf in DMEM/FBS, das mit 6 μg/ml MPA, 250 μg/ml Xanthin und 8 mM Histidinol supplementiert war, ausplattiert. Nicht-transfizierte Zellen waren nicht in der Lage, in der Gegenwart von Histidinol und MPA zu wachsen. Nach 1,5-2 Wochen wurden transfizierte Zellen in den Platten mit 96 Näpfen beobachtet. Die Überstände von Näpfen, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf die Anwesenheit von rBPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert.
  • Die stärksten Produzenten wurden in einen Platte mit 24 Näpfen überführt. Die Produktivität wurde als extinkte 24-Napf-Kulturen hinsichtlich Zellwachstum in Gegenwart und Abwesenheit von 10–7 M Dexamethason bewertet. Der stärkste Produzent, Klon 2X3-130, sekretierte etwa 15 μg/ml und 30 μg/ml in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Dexamethason. Das Isolat wurde als nächstes subkloniert durch beschränkende Verdünnung in Platten mit 96 Näpfen. Die Näpfe, die Einzelkolonien enthielten, wurden durch ELISA sekretiert und die stärksten Produzenten expandiert und in 24-Napf-Kulturen erneut in Gegenwart und Abwesenheit von 10–7 M Dexamethason getestet. Der am stärksten produzierende Subklon, Nr. 25, sekretierte etwa 16 μg/ml bzw. 33 μg/ml in der Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Dexamethason.
  • D. Transfektion von Sp2/0-Zellen mit pING4143 und pING4150
  • Das Plasmid pING4143 enthält DNA, die für rBPI(1-193)ala132 codiert, das an den A-MuLv-Promotor, optimierte Kozak-Translationsinitationssequenz und 3'-nicht-translatierte Sequenzen der leichten Kappa-Kette von Maus fusioniert ist zusammen mit dem gpt-Gen für die Selektion von MPA-resistenten Zellen. Die Sp2/0-Zellen wurden durch Elektroporation transfiziert mit 40 μg pING4143-DNA, die zuerst mit NotI verdaut, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert war. Nach Elektroporation erlaubte man den Zellen, sich für 48 Stunden in nicht-selektivem DMEM-Medium zu erholen. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und mit einer Konzentration von 5 × l04 Zellen/ml in DMEM-Medium, das mit MPA (6 μg/ml) und Xanthin (250 μg/ml) supplementiert war, resuspendiert und mit etwa 104 Zellen/Napf in Platten mit 96 Näpfen ausplattiert.
  • Nach etwa 2 Wochen wurden Kolonien aus transfizierten Zellen in den Platten mit 96 Näpfen beobachtet. Die Überstände aus Näpfen, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in eine Platte mit 24 Näpfen überführt. Die Produktivität wurde bewertet als extinkte 24-Napf-Kulturen hinsichtlich Zellwachstum in Gegenwart und Abwesenheit von 10–7 M Dexamethason. Der stärkste Produzent, Klon 134, sekretierte etwa 12 μg/ml und etwa 28 μg/ml in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Dexamethason.
  • Der Klon 134 wurde durch Elektroporation mit dem Vektor, pING4150, transfiziert, der DNA enthielt, die für rBPI(1-193)ala132 codierte, das an den A-MuLv-Promotor und die 3'-nicht-translatierte Region der leichten Kette der Maus mit dem his-Gen für Selektion von Transfektanten fusioniert war. Vor der Elektroporation wurde der Vektor zuerst verdaut und mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Nach Erholung für 48 Stunden in DMEM plus 10 % FBS-Medium wurden die Zellen in Platten mit 96 Näpfen plattiert mit etwa 104 Zellen/Napf in DMEM/FBS, supplementiert mit 6 μg/ml MPA plus 250 μg/ml Xanthin und 8 mM Histidinol. Nicht-transfizierte Zellen sind nicht in der Lage, in Gegenwart von MPA und Histidinol zu wachsen. Nach etwa 2 Wochen wurden Kolonien bestehend aus transfizierten Zellen in den Platten mit 96 Näpfen beobachtet. Die Überstände aus Näpfen, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in eine Platte mit 24 Näpfen transferiert. Die Produktivität wurde als extinkte 24-Napf-Kulturen hinsichtlich Zellwachstum in Gegenwart und Abwesenheit von 10–7 M Dexamethason bewertet. Der stärkste Produzent, Klon 134-11, wurde umbenannt zu C1770. Klon C1770 sekretierte 36 μg/ml ohne Dexamethason und mehr als 42 μg/ml in Gegenwart von Dexamethason. Dieser Klon (c1770) wurde mit der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852 als Zugangsnummer HB 11247 hinterlegt.
  • E. Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pING4143
  • Die CHO-K1-Zellinie wurde mit pING4143 DNA transfiziert in der Art und Weise, wie sie in Abschnitt A für die Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pING4533 beschrieben wurde. Nach etwa 2 Wochen wurden Überstände von etwa 800 Näpfen, die Einzelkolonien enthielten, auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in Platten mit 24 Näpfen transferiert. Die stärksten Produzenten, die etwa 9-13 μg/ml sekretierten, können als nächstes an Serum-freies Medium in Vorbereitung auf Wachstum in Fermentern adaptiert werden. Diese können auch mit einem Vektor erneut transfiziert werden, wie pING4150 oder pING4154, mit his bzw. neo selektive Marker, um eine Zellinie bereitzustellen, die sogar höhere Titer an rBPI-Produkt produziert.
  • F. Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pING4144
  • Das Plasmid pING4144 ist ähnlich zu pING4143 mit der Ausnahme, dass es den menschlichen Cytomegalovirus-Promotor (hCMV) anstelle des A-MuLv-Promotors enthält. Die CHO-K1-Zellinie wurde transfiziert mit pING4144-DNA in der Art und Weise, wie in Abschnitt A beschrieben. Nach etwa 2 Wochen wurden Überstände von etwa 200 Näpfen, die Einzelkolonien enthielten, auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in Platten mit 24 Näpfen überführt und die rBPI-Expression bestimmt in Platten mit 24 Näpfen, die Natriumbutyrat enthielten. Der stärkste Produzent (Klon 174) sekretierte etwa 3-5 μg/ml ohne Butyrat und etwa 15-18 μg/ml in Gegenwart von 5 mM Butyrat in diesem Test. Dieser Klon, umbenannt zu Klon C1771, wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20851 als ATCC-Zugangsnummer CRL 11246. Die stärksten Produzenten können als nächstes in Vorbereitung auf das Wachstum in Fermentern an Serum-freies Medium adaptiert werden. Diese können auch re-transfiziert werden mit einem Vektor, wie pING4151 oder pING4155, die das rBPI-Gen unter der Kontrolle des hCMV-Promotors enthalten, aber mit his bzw. neo als selektive Marker, um eine Zellinie bereitzustellen, die sogar noch höhere Titer an BPI produziert.
  • G. Transfektion von NSO-Zellen mit pING4143
  • NSO-Zellen wurden mit pING4143-DNA durch Elektroporation transfiziert. Nach etwa 3 Wochen beobachtete man Kolonien, die aus transfizierten Zellen bestanden, in den Platten mit 96 Näpfen. Die Überstände aus Näpfen, die Einzelkolonien enthielten, wurden analysiert auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA. Die stärksten Produzenten wurden in eine Platte mit 24 Näpfen überführt. Die Produktivität wurde als extinkte 24-Napf-Kulturen bewertet. Die stärksten Produzenten sekretierten 15-16 μg/ml. Die stärksten Produzenten wurden mit einem Vektor, wie pING4150, erneut transfiziert, wie oben beschrieben, um noch stärkere Produzenten zu ergeben.
  • H. Transfektion von NSO-Zellen mit pING4232
  • NSO-Zellen wurden durch Elektroporation mit pING4132 transfiziert, der DNA enthält, die für rBP(1-193)ala132 codiert, die fusioniert ist an die optimale Kozak-Translationsinitationssequenz, die in den Vektor pEE13 cloniert ist [Bebbington, et al., Biotechnology, 10:169-175 (1992)]: Vektor pEEl3 enthält das Glutamin-Synthetasegen für Selektion von Transfektanten, die in der Lage sind, in Medium zu wachsen, dem Glutamin fehlt. Nach etwa drei Wochen wurden Kolonien, bestehend aus transfizierten Zellen, beobachtet in Platten mit 96 Näpfen. Die Überstände aus Näpfen, die Einzelkolonien enthielten, wurden durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in eine Platte mit 24 Näpfen transferiert. Die Produktivität wurde als extinkte 24-Napf-Kulturen bewertet. Die stärksten Produzenten, die 7-15 μg in extinkten 24-Napf-Kulturen sekretierten, können als nächstes einer Amplifikation in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von Methioninsulfoximin unterzogen werden.
  • I. Transfektion von Sp2/0-Zellen mit pING4145
  • Das Plasmid pING4145 enthält DNA, das für rBP'(1-193) codiert, das an den A-MuLv-Promotor, die optimierte Kozak-Translationsinitationssequenz, 3'-nicht-translatierte Sequenzen der leichten Kappa-Kette von Maus, und einem gpt-Gen zur Selektion auf MPA-resistente Zellen, fusioniert ist. Die Sp2/0-Zellen wurden durch Elektroporation mit 40 μg pING4145 DNA transfiziert, die zuerst mit NotI verdaut, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert war. Nach Elektroporation erlaubte man den Zellen, sich für 48 Stunden in nicht-selektivem DMEM-Medium zu erholen, sie wurden zentrifugiert und mit einer Konzentration von 5 × 104 Zellen/ml in DMEM-Medium resuspendiert, das mit MPA (6 μg/ml) und Xanthin (250 μg/ml) supplementiert war. Die Zellen können dann mit etwa 104 Zellen/Napf in Platten mit 96 Näpfen supplementiert werden. Nach etwa 2 Wochen wurden Kolonien, die aus transfizierten Zellen bestanden, in Platten mit 96 Näpfen beobachtet. Die Überstände aus Zellen, die Einzelkolonien enthalten, können dann auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert werden. Die stärksten Produzenten werden in eine Platte mit 24 Näpfen überführt und die Produktivität wird bestimmt als 24-Napf-Kulturen hinsichtlich Zellwachstum in Gegenwart und Abwesenheit von 10–7 M Dexamethason.
  • Um die Expression von BPI zu exprimieren, kann der am stärksten produzierende Sp2/0-Transfektant durch Elektroporation mit einem Vektor transfiziert werden, der Gensequenzen enthält, die für rBPI(1-193) codieren, die an den A-MuLv-Promotor und die 3'-nicht-translatierte Region der leichten Kette der Maus fusioniert sind. mit dem his-Gen für Selektion von Transfektanten.
  • J. Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pING4145
  • Die Zellinie CHO-K1 wurde mit pING4145 DNA in der in Abschnitt A beschriebenen Art und Weise transfiziert. Nach etwa 2 Wochen wurden Überstände von etwa 500-800 Näpfen, die Einzelkolonien enthielten, auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in Platten mit 24 Näpfen transferiert und die BPI-Expression in Platten mit 24 Näpfen, die S-Sepharose enthielten, bestimmt. Die stärksten Produzenten werden als nächstes an Serum-freies Medium in Vorbereitung auf das Wachstum in Fermentern adaptiert. Diese können auch re-transfiziert werden mit einem Vektor, der einen anderen selektiven Marker enthält, um eine Zellinie bereitzustellen, die sogar noch höhere Titer an rBPI-Produkt produziert.
  • K. Expression von rBPI-Produkten aus Insektenzellen
  • Ein weiteres eukaryontisches System, in dem rBPI-Produkte exprimiert werden können, sind Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert worden sind, der DNA enthält, der ein rBPI-Produkt codiert. Die Systeme zum Erzeugen von rekombinantem Virus und zum Erreichen der Expression von rekombinanten Produkten davon sind kommerziell erhältlich (Invitrogen, San Diego, CA). DNA, die für rBPI(1-199) codiert, einschließlich der Signalsequenz aus 31 Aminosäuren, wurde in eine Nhel-Stelle in einen pBlueBac-Transfer-Vektor (Invitrogen) cloniert. Sf9-Insektenzellen (BRL; ATCC CRL 1711) wurden cotransfiziert mit diesem Vektor und dem Wildtyp-AcMNPV (Autographa californica multiple nuclear polyhidrosis virus, Invitrogen). Rekombinante virale Plaques wurden dann identifiziert, gereinigt und verwendet, um hoch-Titer rekombinantes virales Material zu erzeugen, wie beschrieben in den Protokollen, die von BRL erhältlich sind.
  • Der rekombinante Baculaovirus wurde dann dazu verwendet, um weitere Sf9-Zellen zu infizieren. Um dies zu tun, wurden 8 getrennte 60 mm-Kulturschalen von Sf9-Zellen mit dem Baculovirus infiziert. Aus jeder der 8 Schalen wurde zu verschiedenen Zeiten während des Tages Proben genommen, durch Sammeln von Medium aus einer Schale infizierter Zellen. Nach dem Sammeln wurde das Medium bei 1000 U/min zentrifugiert und der Überstand bei 4°C gelagert. Die Zellen wurden dann einmal mit 4 ml PBS gespült und mit 100μl/Schale NP40 Lysepuffer (1% NP4, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) durch Inkubieren auf Eis für 30 Minuten lysiert. Die Zellen wurden dann in einem Eppendorf-Röhrchen mit einem Zellschaber gesammelt. Zellysate wurden dann in einer Mikrofuge für 2 Minuten zentrifugiert. Der Lysatüberstand wurde in neues Röhrchen überführt und bei –20°C gelagert. Medienproben von einem jeden täglichen Zeitpunkt wurden hinsichtlich BPI-Gehalt durch ELISA analysiert und die Lysate wurden durch Western unter Verwendung eines Anti-BPI-Antikörpers analysiert.
  • In den Medien war mittels ELISA an den Tagen 1-4 nach der Infektion kein rBPI-Produkt nachweisbar. An den Tagen 5-6 nach der Infektion wurde jedoch ein Peak von 200-500 ng/ml rBPI-Produkt in den Medienproben nachgewiesen. Western-Analyser der Lysate zeige eine BPI-reaktive Bande von etwa 23 kD am Tag 2 nach der Infektion. Die Bande zeigte eine zunehmende Intensität bis zum Tag 6.
  • In Tabelle II, unten, sind die detailliert in Abschnitten A-J oben beschriebenen Tranfektionen zusammengefaßt. TABELLE II
    Wirtszelle Transfiziert mit
    CHO-DG44 pING4222
    CHO-K1 pING4533, pING4143, pING4144, pING4145
    NSO pING4143, pING4232
    SP2/O pING4223 gefolgt von pING4221, pING4143 gefolgt von pING4150, pING4145
  • BEISPIEL 3
  • Konstruktion von Plasmiden für in vitro-Transkription und Translation von rBPI(1-199)ala132 und rBPI(1-199)Ser135
  • In vitro-Transkriptions-/Translationsstudien wurden durchgeführt unter Verwendung von Plasmid pIC127 als eine Quelle von DNA, die für rBPI(1-199) codierte. Die Konstruktion von pIC127 wurde wie folgt durchgeführt. DNA, die für rBPI(1-199) codierte, einschließlich der Signalsequenz aus 31 Aminosäuren, wurde mit PCR amplifiziert aus einem Plasmid, das die vollständige cDNA enthielt, die BPI in pGEM-72f(+) codierte. Die Amplifikation wurde so durchgeführt, dass eine SalI-Stelle am 5'-Ende eingeführt wurde, und XhoI- und SstII-Stellen wurden eingebaut am 3'-Ende der rBPI-codierenden Sequenz unter Verwendung der Primer BPI-3: GTCGACGCATGCGAGAGAACATGGC (SEQ ID NO: 12) und BPI-2: CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT (SEQ ID NO: 9). Das resultierende PCR-amplifizierte Fragment wurde in die SmaI-Stelle der Mehrfachklonierungsregion von Plasmid pT7T3 18u (Pharmacia LKB Technology, Piscataway NJ) glattendig eincloniert, um pIC102 zu erzeugen.
  • Das pIC102-Insert, das rBPI(1-199) und das Signal aus 31 Aminosäuren enthielt, wurde dann durch Verdau des Plasmids mit BamHI und Asp7181 ausgeschnitten. Eine BamHI-Stelle flankiert die SalI-Stelle in pIC102 und eine Asp718I-Stelle flankiert die SstII-Stelle in pIC102. Die Enden des ausgeschnittenen Fragmentes wurden glattendig gemacht mit T4 DNA-Polymerase, und das glatte Fragment wurde dann in Plasmid pGEM1 (ProMega, Madison, WI) cloniert, das zuerst verdaut worden war mit PstI und EcoRI und glatt gemacht mit T4 DNA-Polymerase. Die resultierende Konstruktion wurde als pIC124 bezeichnet und umfaßt das rBPI(1-199)-codierende Insert, das so orientiert ist, dass ein 5'-Ende benachbart ist zum Sp6-Promotor in pGEM1.
  • Die Signalsequenz aus 31 Aminosäuren in dem pIC124-Insert wurde dann ausgeschnitten durch Entfernen der Region zwischen zwei HincII-Stellen in pIC124, um pIC127 zu erzeugen. Die ausgeschnittene Region wurde dann durch einen Linker ausgetauscht, der das Startcodon (ATG) wieder herstellte und die Sequenz, die die erste Aminosäuresequenz von BPI codierte. Es wurden zwei Fragmente aus dem pIC124-Verdau mit HincII und SstII isoliert: (1) Das HincII-SstII-Fragment, das die rBPI(1-199) codierende Region mit Ausnahme des Codons für die erste Aminosäure enthielt; und (2) das SstII-HincII-Fragment, das den Rest des Plasmides umfaßt. Der erste Codon in der BPI-codierenden Sequenz und ein Codon für Methionin vor der BPI-Sequenz wurden inseriert durch die Verwendung von Linker, die aus zwei komplementären zusammenhybridisierten Oligonukleotiden bestanden, BPI-28: GACGCCACCATGGTC (SEQ ID NO: 13) und BPI-29: GACCATGGTGGCGTC (SEQ ID NO: 14). Diese zwei Oligonukleotide wurden aneinander ligiert mit den HincII-SstII- und SstII-HincII-Fragmenten von pIC124, um pIC127 zu bilden.
  • Zwei Plasmide, pML101 und pML102, wurden konstruiert unter Verwendung von pIC127 für die in vitro-Transkription/Translation von rBPI(1-199)ala132 und rBPI(1-199)ser135. Um dies zu bewerkstelligen wurde pIC127 mit SstII und EcoRI verdaut und das große SstII-EcoRI-Fragment gereinigt. Um pmL101 zu konstruieren, das ein rBPI(1-199)ala132-Insert enthielt, wurde das EcoRI-SstII-Fragment aus pING4519 an das SstII-EcoRI-Fragment aus PIC127 ligiert. Um pML102 zu konstruieren, das das rBPI(1-199)Ser135-Insert enthält, wurde das EcoRI-sstII-Fragment aus pING4520 in das sstII-EcoRI-Fragment von pIC 127 ligiert.
  • rBPI(1-199), rBPI(1-199)ser135 und BPI(1-199)ala132 wurden in vitro von Plasmiden pIC127, pML101 und pML102 exprimiert unter Verwendung des TNT SP6-gekoppelten Retikulocytenlysatsystems von ProMega (Madison, WI.). Das System erlaubt in vitro die gekoppelte Transkription und Translation von klonierten Genen unter Verwendung eines eukaryontischen Translationssystems. Jede gekoppelte Transkription/Translation wurde durchgeführt unter Verwendung des Protokolls des Herstellers mit 2 μg Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 25 μl, einschließlich 35S-Methionin, um markiertes Protein zu erzeugen. Die markierten Protein-Produkte wurden in 5 μl Aliquots zu einem 20 μl Harnstoffprobenpuffer hinzugegeben und für 3 Minuten bei 95°C erhitzt. Aliquots (10 μl) einer jeden Probe wurden auf einem 15 % SDS-Polyacrylamidgel entweder mit oder ohne DTT (50 mM) laufengelassen. Nach Fixieren und Trocknen des Gels wurden die markierten Proteinbanden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse der Autoradiographie zeigen, dass cDNA, die für rBPI(1-199), rBPI(1-199)ala132, und rBPI(1-199)cys135 codiert, Protein-Produkte mit der erwarteten Größe von etwa 23 kD für ein N-terminales BPI-Fragment exprimierten. Darüber hinaus waren alle drei Expressionsprodukte, rBPI(1-199), rBPI(1-199)ala132 und rBPI(1-199)cys135, in der Lage, hochmolekulare Spezies der für BPI(1-199)-Dimere erwarteten Größe zu erzeugen, ebenso wie größere Spezies, die alle nach Reduktion mit DTT verschwanden. Man glaubt, dass die Expression von dimeren Spezies in rBPI(1-199)cys135-und rBPI(1-199)ala132-Produkten das Ergebnis der Verwendung eines zellfreien in vitro Transkriptions-/Translationssystems sein kann. Ein derartiges System erlaubt nicht das geeignete post-translationale Prozessieren, Falten etc., das normalerweise bei zellulärer Translation erfolgen würde. Somit kann es sein, dass richtige Disulfidverbindungen sich nicht immer in dem in vitro-System ausbilden, was in einigen Fällen zur Bildung von Dimeren führt.
  • Markierte Proteine, die in dem oben beschriebenen in vitro-Expressionssystem gebildet wurden, wurden als nächstes hinsichtlich ihrer LPS-Bindungsaktivität getestet. Näpfe von Mikrotiterplatten wurden mit LPS von Salmonella minnesota R7 (Rd-Mutante) (5 mg/ml in Methanolstammlösung) in 0,1 M Na2CO3/20 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) bei pH 9,4 beschichtet (insgesamt 2 μg LPS in einem 50 μl-Napf). Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Näpfe mit Wasser gewaschen und bei 37°C getrocknet. Die Näpfe wurden dann mit 215 μl Dulbecco's-PBS/0,1 % BSA für 3 Stunden bei 37°C blockiert. Die Blockierungslösung wurde dann verworfen und die Näpfe mit PBS/0,2 % Tween-20 gewaschen. Die rBPI-Proben wurden dann hinzugegeben (2 μl des Translationsreagens) zu insgesamt 50 μl PBS/0,2 % Tween. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Näpfe dreimal mit PBS/0,2 % Tween gewaschen und die Menge an markiertem Protein, das in einem jeden Napf verblieb, wurde durch Flüssig-Szintillationszählen bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass in etwa gleiches LPS-Binden für alle drei BPI-Spezies, wie oben angegeben, erfolgt ist. rBPI(1-199) zeigte ein Binden von 48.690 cpm; rBPI(1-199)ala132 zeigte ein Binden von 59.911 cpm; und rBPI(1-199)cys135 zeigte eine Bindung von 52.537 cpm. Ein jeder der vorerwähnten Werte stellt den Mittelwert von Dreifachbestimmungen dar. Die durchschnittliche Bindung der Kontrolle (keine DNA) betrug 5.395 cpm.
  • BEISPIEL 4
  • Produktcharakterisierung
  • A. Physikalische Charakterisierung
  • Die Charakterisierung von rBPI-Produkten wurde durchgeführt unter Verwendung von Umkehrphasen (C4)-HPLC, Kationenaustausch (MA7C)-HPLC, SDS-PAGE und Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS). Die rBPI-Produkte, die charakterisiert werden sollten, wurden aus Rollerflaschen oder aus einem 10 Liter Fermenter gereinigt, die entweder durch ein Bin-Schritt-Reinigungsverfahren oder Mehrschrittverfahren geerntete wurden. Das Ein-Schritt-Verfahren war im wesentlichen jenes, das in der ebenfalls eigenen und anhängigen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/072,063 , veröffentlicht als WO 93/23540 ( Europäische Patentanmeldung Nr. 93913992.9 ) von Grimm beschrieben ist mit dem Hinzufügen eines zweiten Waschschrittes. Kurz gesagt, wurden S-Sepharose-Kügelchen zu einem Wachstumsmedium hinzugefügt, das rBPI-Produkte enthielt. Die S-Sepharose wurde dann aus dem Medium entfernt und mit 20 mM Natriumacetat und 100 mM Natriumchlorid bei pH 4,0 gewaschen. Ein zweites Waschen wurde durchgeführt mit 20 mM Natriumacetat und 700 mM Natriumchlorid bei pH 4,0. Die gereinigten rBPI-Produkte wurden eluiert mit 20 mM Natriumacetat und 1000 mM Natriumchlorid bei pH 4,0.
  • Das Mehrschritt-Reinigungsverfahren umfaßte die Reinigung von vereinigten Ansätzen von rBPI-Produkten, die zuerst getrennt gereinigt worden waren, wie oben beschrieben. Nach Reinigung eines jeden der 20 einzelnen rBPI-Produktansätze durch das Ein-Schritt-Verfahren wurden die Ansätze vereinigt und erneut gereinigt durch ein erstes Verdünnen der Salzkonzentration der vereinigten Ansätze auf 200 mM. Die vereinigte Probe wurde dann auf einen S-Sepharose-Säule gegeben und bei pH 4,0 mit 20 mM Natriumacetat und 200 mM Natriumchlorid gewaschen, gefolgt von 700 mM Natriumchlorid. Die rBPI-Produkte wurden eluiert unter Verwendung von 20 mM Natriumacetat und 1000 mM Natriumchlorid bei pH 4,0. Die gereinigten rBPI-Produkte wurden dann analysiert, um ihre physikalischen Charakteristika zu bestimmen.
  • 1. SDS-PAGE-Analyse von rBPI-Produkten
  • Die SDS-PAGE-Analyse von rBPI-Produkten wurden durchgeführt unter Verwendung von 14 % Polyacrylamidgelen und einem tris-Glycin-Puffersystems unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen. Die Proteinbanden wurden gefärbt mit entweder Coomassie-Blau oder Silberfärbung zur Sichtbarmachung.
  • Wie in 1 gezeigt, erschien das nicht-reduzierte rBPI(1-199) als eine Hauptbande bei etwa 23 kD und eine kleine Bande bei etwa 40 kD. Die Hauptbande wurde als rBPI(1-199) durch Vergleich mit gleichzeitig gelaufenen Standards identifiziert, und die kleinere Bande wurde identifiziert als eine dimere Form von rBPI(1-199) durch Immunfärbung. Nach Hinzufügen eines 1/20 Volumens von 0,4 M Dithiothreitol (DDT) zu einer getrennten Probe von rBPI(1-199) zeigte SDS-PAGE eine einzelne, gut definierte Bande entsprechend der 23 kD monomeren Spezies von rBPI(1-199), das unter den nicht-reduzierenden Bedingungen, wie oben beschrieben, identifiziert wurde.
  • Die SDS-PAGE-Analyse des rBPI(1-199)ala132-Produktes zeigte eine einzelne Bande, die mit der einzelnen 23 kD rBPI(1-199) Bande unter reduzierenden Bedingungen wanderte. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen wanderte rBPI(1-199)ala132 mit der schneller wandernden der zwei eng beabstandete Banden, die für rBPI(1-199) (entsprechend der 23 kD-Bande) beobachtet wurde. Diese Ergebnisse, dargestellt in 2, zeigen, dass rBPI(1-199)ala132 nach der Reinigung in im wesentlichen monomerer Form vorliegt. Somit zeigen rBPI-Produkte, bei denen ein Cysteinrest durch Alanin ersetzt ist, eine signifikante Resistenz gegenüber Dimerbildung.
  • 2. Kationenaustausch-HPLC-Analyse von rBPI-Produkten
  • Kationenaustausch-HPLC unter Verwendung einer MA7C-Säule wurde ebenfalls verwendet, um den Dimer-Gehalt von rBPI-Produkten zu messen. Eine Bio-Rad MA7C-Kartusche (4,6 × 30 mm, Bio-Rad Katalog Nr. 125-00556) equilibriert mit 40 % Puffer B (20 mM MES, 1 M NaCl, pH 5,5) wurde mit 1,0 ml/min verwendet. Das rBPI(1-199)-Produkt wurde analysiert durch Verdünnen einer 1ml-Probe auf 100 μg/ml und 200 μl der verdünnten Probe wurden auf die Säule aufgespritzt. Das rBPI wurde eluiert mit einem Gradienten aus 40 % bis 100 % Puffer B über 6 Minuten. Puffer A umfaßte 20 mM MES bei pH 5,5. Die Absorption wurde bei 229 nm überwacht.
  • Die Analyse von rBPI(1-199) zeigte zwei Peaks. Ein erster Peak eluierte mit einer Retentionszeit von etwa 3 Minuten, wie in 3 gezeigt. Ein zweiter, kleinerer Peak eluierte bei etwa 6 Minuten. Der erste Peak, in 3 dargestellt, stellt rBPI(1-199)-Monomer dar, und der zweite Peak in 3 stellt rBPI(1-199)-Dimer dar, wie bestimmt durch Vergleich der Retentionszeiten von gereinigten Monomer und Dimer-Standards. Der zweite (Dimer-)Peak erschien nicht, wenn die Proben mit DTT reduziert wurden, bevor sie auf die Säule gespritzt wurden.
  • Identische Verfahrensweisen wurden verwendet, um das Elutionsmuster von rBPI(1-199)ala132 zu bestimmen. Wie in 4 gezeigt, eluiert rBPI(1-199)ala132 als ein einzelner Peak mit einer Retentionszeit entsprechend derjenigen, die für den rBPI(1-199)-Monomer-Peak beobachtet wurde. Es gab keinen Beleg für Dimer in der rBPI(1-199)ala132-Probe.
  • 3. Umkehrphasen (C4)-HPLC und Elektronenspray-Ionisations-Massenspektrometrie-Analyse von rBPI-Produkten
  • Die Mikroheterogenität von rBPI-Produkten wurde durch Umkehrphasen-HPLC und Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) aufgezeigt. Für die HPLC-Analyse wurde eine Brownlee BU-300 C4-Säule mit 37 % mobiler Phase B equilibriert (80 % Acetonitril/0,065 % TFA) bei einer Flußrate von 0,5 ml/min. Die Proben (jeweils 1 ml) von rBPI(1-199) wurden auf 100 μg/ml verdünnt und 50 μl der Probe wurde injiziert. Die Säule wurde mit 37% Mobiler Phase B für 2,5 Minuten gewaschen und dann unter Verwendung eines Gradienten von 37 % bis 50 % Mobiler Phase B über 20 Minuten eluiert. Die Mobile Phase A war 5 % Acetonitril/0,1 % TFA, und die Absorption wurde bei 220 nm überwacht.
  • Die Ergebnisse der Umkehrphasen-HPLC-Analyse von rBPI(1-199)-Produkten sind in 5 gezeigt. rBPI(1-199)-Produkte eluieren als ein zweiter (Haupt-)Peak mit einem teilweise aufgelösten ersten (kleineren) Peak an der führenden Seite des zweiten Peaks. Nach Reduktion mit DTT eluiert nur ein Peak, entsprechend dem zweiten Peak, von der Säule.
  • Identische Verfahrensweisen wurden verwendet, um rBPI(1-199)ala132-Produkte zu analysieren. Wie in 6 gezeigt, eluierte rBPI(1-199)ala132 als ein einzelner Peak entsprechend dem zweiten (Haupt-)Peak, von dem oben berichtet wurde.
  • Die Eluate entsprechend dem ersten und zweiten HPLC-Peak, die oben beschrieben wurde, von den drei getrennten Ansätzen von rBPI(1-199) wurden isoliert und analysiert, um ihren Gehalt durch ESI-MS zu bestimmen. Die Analyse des Eluats, das den zweiten (Haupt-)Peak von dem rBPI(1-199)-Lauf produzierte, lieferte eine etwas geringere Masse wie die von einem 199-Aminosäreprotein erwartete. Diese Daten zeigten an, dass der größte Teil der Masse, der in dem zweiten Peakeluat gefunden wurde, zu einem 1-193 rBPI-Protein-Fragment korrespondierte. Es sind jedoch auch andere Spezies mit einem Größenbereich von 1-198 bis 1-194 vorhanden. Die Analyse des Eluats, das den einzelnen Peak produzierte, der von HPLC auf rBPI(1-199)ala132 erhalten wurde, erbrachte Ergebnisse ähnlich denjenigen, die von dem Eluat erhalten wurde, das den obigen zweiten (Haupt-)Peak produzierte. Diese Ergebnisse sind konsistent mit Peptidkartierungsdaten, die verkürzte Carboxytermini in rBPI(1-199)-Produkten ergaben.
  • Wenn die gleiche Analyse an rBPI(1-193)Produkten durchgeführt wurde, wurde eine signifikant verringerte C-terminale Heterogenität beobachtet. Die von rBPI(1-193)-Produkten erhaltenen ESI-MS-Daten zeigten, dass etwa 85 % des Proteins entweder die ersten 199, 193 oder 193 (+ ein N-terminales Alanin) Aminosäuren des N-Terminus von BPI enthalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt. TABELLE III Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie-Ergebnisse für rBPI(1-193) und rBPI(1-199)-HPLC-Monomer-Peaks
    Erwartetes rBPI-Produkt Ungefähre Molekülmasse Vorhergesagte Aminosäurereste Ungefähre relative Intensität*
    rBPI(1-199) 21407 1-193 50,9 %
    21606 1-195 28,9 %
    21505 1-194 20,1 %
    21738 1-196 <10 %
    21846 1-197 <10 %
    21966 1-198 <10 %
    rBPI(1-193) 21408 1-193 36,2 %
    21193 1-191 34,1 %
    21293 1-192 <10 %
    21477 1-193 +N-terminales Alanin 14,5 %
    20924 1-198 15,2 %
    • * Es wurden nur Spezies quantifiziert, die als in Mengen von mehr als 10 % vorhanden nachgewiesen wurden. Diese Spezies wurden dann auf 100 % normalisiert.
  • Diese Daten zeigen, dass, während die rBPI(1-199)-codierende DNA kein Protein in seiner gesamten Länge (d. h. Aminosäuren 1-199 des N-Terminus von BPI) produzierte, die rBPI(1 193)-codierende DNA signifikante Mengen des rBPI(1-193)-Proteins produzierte. Auf der Grundlage dieser und anderer Daten erscheint es so, dass signifikante Verringerungen der Heterogenität und signifikante Erhöhungen der Produktivität des beabsichtigten Proteins (d. h. dasjenige, für das das DNA-Insert codiert, erhalten werden können), während optimale Bakterizide und LPS-bindende Aktivität aufrechterhalten werden kann durch Verwendung verkürzter Formen der rBPI-codierenden DNA. Es wird erwartet, dass die Verkürzung der zu exprimierenden DNA signifikante Verringerungen der Heterogenität des Expressionsproduktes in dem Umfang ergeben werden, wie die zu exprimierende DNA nicht über das Cystein am Aminosäurerest 175 hinaus verkürzt wird. Von Expressionsprodukten von verkürzten Formen von DNA, die für rBPI-Proteine codieren, die in dem Bereich der ersten 176 Aminosäuren des N-Terminus von BPI bis zu den ersten 193 Aminosäuren des N-Terminus von BPI aufweisen, wird auch erwartet, dass sie auch die volle bakterizide und LPS-Bindungsaktivität beibehalten.
  • Die ESI-MS-Daten zeigten auch die Anwesenheit von Mikroheterogenität am Aminoterminus von rBPI-Produkten. Es wurden Formen von rBPI-Produkt mit einem Alaninrest am Aminoterminus gefunden und durch Sequenzieren tryptischer Peptide bestätigt.
  • Wie in 5 gezeigt, ergab die ESI-MS-Studie des Eluats, das den ersten (kleineren) Umkehrphasen-HPLC-Peak produzierte, Proteine mit einer Massenverteilung ähnlich jener, die den zweiten (Haupt-)Peak bildeten, mit der Ausnahme, dass jeder Massenwert um etwa 119-120 Dalton höher war. Diese Daten schlagen vor, dass das Eluat, das den ersten (kleineren) HPLC-Peak produzierte, wie oben beschrieben, ein Disulfid-verknüpftes Cystein-Addukt enthält, da dies zu einer einheitliche Verschiebung der Massenwerte fuhren könnte.
  • Um die Hypothese zu testen, dass der erste (kleinere) Umkehrphasen-HPLC-Peak, der durch rBPI(1-199) produziert wurde, Cystein-Addukte darstellte, wurde rBPI(1-199) Ellman's Reagenz ausgesetzt (Dithionitrobenzoesäure, DTNB), das an freie Sulfhydrylgruppen in etwa molaren Äquivalenten bindet. Eine derartige Behandlung zeigte, dass es weniger als ein Mol freies Sulfhydryl pro Mol rBPI(1-199) gibt. Mit Blick auf die Anwesenheit dreier Cysteinreste in BPI (an den Positionen 132, 135 und 175) unterstützen diese Ergebnisse die Vorstellung, dass es entweder eine intramolekulare Disulfid-Verbindung in den rBPI-Produkten gibt, oder dass zwei der Sulhydrylgruppen sterisch nicht verfügbar sind. rBPI(1-199)ala132 zeigte keine Reaktivität mit dem Ellman's Reagens.
  • 4. Lagerstabilität von rBPI(1-199)-Produkten
  • Proben von rBPI(1-199) (1 mg/ml) in einem Puffer umfassend 20 mM Natriumcitrat, 0,15 M Natriumchloridpuffer, 0,1 % Poloxamer und 0,002 % Polysorbat 80 bei pH 5,0 wurden analysiert, um ihre Lagerstabilität über eine Dauer von 8 Wochen bei der empfohlenen Lagertemperatur von 2°-8°C und bei höheren Temperaturen von 22°C und 37°C zu bestimmen.
  • Die Ergebnisse für Lagerung bei 2°C-8°C, dargestellt in Tabelle N, zeigen einen Anstieg in Gegenwart von Dimer (von 1 % bis 4 %), aber keine signifikante Erhöhung der Cystein-Addukt- oder Partikelbildung in der Probe.
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • 5. Trübung von pharmazeutischen Zusammensetzungen von rBPI
  • Experimente wurden durchgeführt, um die Trübung verschiedener rBPI-enthaltender pharmazeutischer Zusammensetzungen zu bestimmen. In diesem Zusammenhang bezeichnet Trübung die Tendenz pharmazeutischer Zusammensetzungen, sich an Entfaltung (d. h. Verlust der tertiären Proteinstruktur) zu beteiligen und/oder Partikelbildung (Wechselwirkungen zwischen einzelnen Proteinen, um große (> 10 μm) Partikel zu bilden). Die getesteten pharmazeutischen Zusammensetzungen enthielten entweder rBPI(1-199), rBPI(1-199)ala132 oder rBPI(1-193)ala132 in entweder einem Citratpuffer (20 mM Natriumcitrat/150 mM Natriumchlorid, pH 5,0) oder einen Citratpuffer, der 0,1 % Poloxamer 188 (ein Poloxamer-Oberflächen-aktives Mittel, das zusammengesetzt ist aus Polyoxpropylen-polyoxyethylen-block-copolymer) und 0,002 % Polysorbat 80 (ein Polysorbat-Oberflächen-aktives Mittel, das Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester enthält), umfaßt. Wie oben ausgeführt, stabilisiert die Verwendung einer Kombination aus Poloxamer/Polysorbat-Oberflächen-aktiven Mittelsystemen pharmazeutische Zusammensetzungen, wie gelehrt in der ebenfalls eigenen und ebenfalls anhängigen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/012,360 , eingereicht am 02. Februar 1993, veröffentlicht als WO 94/17819 ( Europäische Patentanmeldung Nr. 94907963.6 von McGregor et al.
  • Proben wurden analysiert, um ihre Resistenz gegenüber Trübung über die Zeit bei zunehmenden Temperaturen und entweder pH 7,0 oder 5,0 zu bestimmen. Vor der Analyse wurden alle Proben verdünnt auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml in entweder 50 mM Kaliumphosphat oder 20 mM Citratpuffer bei pH 7,0. Trübungs-Messungen wurden erhalten, in dem Proben in Quarzküvetten zur Verwendung in einem Shimadzu UV-160 UV-Vis-Spektrophotometer (Shimadzu, Pleasanton, CA), ausgerüstet mit einem Temperaturkontrollierten Küvettenhalter, der an ein rezirkulierendes Wasserbad angeschlossen war, gegeben wurden. Nach Äquilibrieren des Küvettenhalters auf die erwünschte Temperatur (57°C, 65°C oder 85°C, siehe unten) wurde die Absorption bei 280 nm gemessen, um zu bestätigen, dass die Proben auf die geeignete Konzentration verdünnt worden waren. Danach wurde die Absorption der Proben bei 350 nm alle 2 Minuten für eine Stunde gemessen, um die Änderung der Absorption über die Zeit zu bestimmen.
  • Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt; worin "formuliert" das rBPI-Produkt in Citratpuffer bezeichnet, der die Poloxamer/Polysorbat-Kombination enthält, auf die oben hingewiesen wurde, und "unformuliert" rBPI-Verbindungen in Citratpuffer alleine bezeichnet. Eine geringere Änderungsrate hinsichtlich der Trübung (d. h. eine geringere Rate der Erhöhung der Absorption über die Zeit) zeigt erhöhte Stabilität gegenüber Entfaltung und Partikelbildung an. Wie in 7 gezeigt, führt das Hinzufügen der vorerwähnten Kombination aus Oberflächen-aktiven Verbindungen zu erhöhter Stabilität (Resistenz gegenüber Partikelbildung und Entfaltung) aller getesteter Zusammensetzungen. Darüber hinaus zeigten rBPI(1-199)ala132 und rBPI(1-193)ala132 eine stark erhöhte Resistenz gegenüber Entfaltung und Partikelbildung verglichen mit den Zusammensetzungen des Wildtyps - unabhängig davon, ob die Kombination aus Oberflächenaktivem Mittel vorhanden war. Ähnliche Ergebnisse wurden bei pH 5,0 und 65°C, bei pH 5,0 und 75°C bzw. bei 85°C erhalten.
  • Zusammengefaßt zeigten die Zusammensetzungen mit der Kombination aus Oberflächenaktiven Mitteln und/oder der Cysteindeletion eine stark erhöhte Stabilität über die Zeit und bei Temperaturerhöhungen, verglichen mit Zusammensetzungen, die kein Oberflachen-aktives Mittel enthielten und/oder die N-terminale BPI(1-199)-Konstruktion vom Wildtyp enthielten.
  • B. In vitro-Aktivitäts-Charakterisierungen
  • In vitro-Aktivität von rBPI(1-199)ala132-Produkten wurde bestimmt durch Binden der Produkte an LPS, durch den LAL-Inhibitionstest und durch die bakterizide Potenz der Produkte.
  • 1. Binden von rBPl(1-199)ala132 an LPS
  • Proben (jeweils 20 μg bis 60 μg) von E. coli (Stamm 0111-B4) oder S. minnesota (Rd-Mutante)-Lipopolysaccharid (Sigma Chemical, St. Louis, Mo) wurden verwendet, um die Fähigkeit von rBPI(1-199)ala132-Produkten an LPS zu binden.
  • Die LPS-Proben wurden der Größe nach fraktioniert durch SDS-PAGE und Silber-gefärbt zur Sichtbarmachung oder elektrotransferiert auf eine Nitrozellulosemembran (BA25, Schleicher und Schuell, Keene, N.M.) mit geeigneten vorgefärbten Standards. Die LPS-Blots wurden verarbeitet durch Eintauchen der Membran in 50 mM Tris, 0,2 M NaCl (TBS) und 30 mg/ml Rinder-Serumalbumin (BSA) bei pH 7,4 für 30 Minuten bei 37°C. Die Membranen wurden dann inkubiert in einer Lösung, die 2-4 μg gereinigtes oder teilweise gereinigtes rBPI(1-199)ala132 oder ein Kontrollprotein (entweder rBPI(1-199) oder rBPI-Holoprotein) enthielten für 12-18 Stunden bei 21°C bis 42°C. Nach Inkubation wurden die Membranen dann mit TBS-BSA gewaschen. Die Lösung wurde wenigstens dreimal über eine Zeit von 30 Minuten ausgetauscht. Die gewaschenen Membranen wurden dann für drei Stunden in einer Verdünnung von 1:1000 von Kaninchen-anti-rBPI(1-199) in TBS, das 1 mg/ml BSA enthält, inkubiert. Die Membranen wurden als nächstes wenigstens dreimal gewaschen und entwickelt unter Verwendung des chemilumineszenten Nachweissystems (Tropix Systems, Redford, MA) entsprechend den Anweisungen der Hersteller, unter Verwendung von 5 × PBS und 0,25 % Gelatine (Bio-Rad) anstelle von I-Block.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass rBPI(1-199)ala132 ebenso gut oder besser als rBPI(1-199) an LPS bindet, das Nitrozellulose gebunden ist.
  • 2. E. coli-Wachstumsinhibierungstest
  • Der E. coli-Kulturmediumwachstumstest wurde durchgeführt, um die bakterizide Potenz der rBPI-Produkte zu ermitteln, durch Behandeln von E. coli mit rBPI(1-199) oder rBPI(1-199)ala132-Analoga und Überwachen der Inhibierung von Mediumwachstum als ein Maß der bakteriziden Aktivität. Ein "rauher" Stamm von E. coli mit Kurzketten-LPS, bezeichnet als J5 (eine rauhe UDP-4-Epimerase-Mangel-Mutante von E. coli-Stamm 0111:B4), wurde in diesem Test verwendet. Die Zellen wurden in einem mit Triethanolamin gepufferten Mineralsalzmedium angezogen (Simon, et al., Proc. Nat. Acad Sci, 51:877 (1964), das E. coli besonders empfindlich für BPI machte. Die Zellen wurden gewaschen und in 0,9 % NaCl auf eine Dichte von etwa 5 × 108 Zellen/ml resuspendiert.
  • Etwa 5 × 106 bis 1 × 10 E. coli-Zellen wurden für 30 bis 60 Minuten mit entweder rBPI(1-199) oder mit rBPI(1-199)ala132-Analogen bei einer Konzentration von 5 μg/ml mit einer gepufferten Lösung (10 % Hanks Balanced Salts, 40mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 % Casaminosäuren) in einem Volumen von 200 bis 400 ml inkubiert. Zusätzlich wurde der Test parallel durchgeführt mit entweder rBPI(1-199) oder rBPI(1-199)ala132-Analog und 100 mM MgCl2. Nach der Inkubation wurden die Zellen verdünnt mit 10 Volumen Nutrient Broth, der mit 0,9 % NaCl supplementiert war. Kulturmediumwachstum wurde dann für mehrere Stunden überwacht.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass rBPI(1-199)ala132-Analoga bakterizide Aktivität so potent wie oder potenter als rBPI(1-199) besitzen. Die bakterizide Aktivität von sowohl rBPI(1-199)ala132-Analoga und derjenigen von rBPI(1-199) wurden, wie erwartet, durch MgCl2 verringert.
  • 3. LAL-Inhibierungstest
  • Der LAL-Inhibierungstest wurde verwendet, um die Fähigkeit von rBPI(1-193)ala132 zu bestimmen, an LPS zu binden. Ein LAL-Inhibitionstest ist beschrieben in Gazzano-Santoro, Infect. Immun., 60: 4754-4761 (1992). Die Ergebnisse des LAL-Tests zeigen, dass rPBI(1-193)ala132 einen IC-50-Wert von 10 aufweist, der gleich ist zu dem von rBPI(1-199). Diese Daten zeigen an, dass das Analogon ebenso wie das rBPI-Produkt vom Wildtyp um die Bindung an LPS kompetitiv ist.
  • C. Wirksamkeit von rBPI(1-199)ala132 in einem Tiermodell tödlicher Endotoxämie Ein Tiermodell für Endotoxämie wurde verwendet, um die vergleichbare Wirksamkeit von rBPI(1-199)ala132 und rBPI(1-199) gegen endotoxischen Schock zu bewerten.
  • Männliche ICR-Mäuse erhielten intravenöse Injektionen von 800 μg/kg Actinomycin-D und entweder 0,5 μg/kg oder 1,0 μg/kg eines Endotoxins (E. coli, Stamm 0111:B4). Unmittelbar nach der Injektion von Endotoxin erhielten die Mäuse eine intravenöse Injektion (0,5 mg/kg oder 5,0 mg/kg) von entweder rBPI(1-199) oder rBPI(1-199)ala132. Gepufferter Träger wurde als Kontrolle verwendet. Todesfälle wurden dann über eine 7-tägige Zeitspanne aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle VI gezeigt. TABELLE VI
    BPI-Dosis # Tote/Gesamt % Mortalität
    Nur Puffer 0 14/15 93
    rBPI23 0,5 mg/kg 5,0 mg/kg 7/15 8/15 47 53
    rBPI23-cys 0,5 mg/kg 5,0 mg/kg 14/15 8/16 93 50
  • Wie aus Tabelle VI ersichtlich, gewährleistete sowohl rBPI(1-199)ala132 als auch rBPI(1-199) einen wesentlichen Schutz gegen die töd1ichen Wirkungen des Endotoxins.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung im Hinblick auf ihre bevorzugten Ausführungsformen dargestellt worden ist, weiß der Fachmann, dass viele Modifikationen und Substitutionen innerhalb des Umfanges der vorliegenden Lehre sind. Z.B. kann die Substitution des Cysteins in den Positionen 132 oder 135 eines BPI N-terminalen Fragmentes mit nicht-polaren Aminosäuren, bei denen es sich nicht um Alanin oder Serin handelt, im Rahmen der Erfindung in Erwägung gezogen werden. Daher der Umfang der angefügten Ansprüche und jeglicher zukünftiger Änderungen daran. SEQUENZ-PROTOKOLL
    Figure 00490001
    Figure 00500001
    Figure 00510001
    Figure 00520001
    Figure 00530001
    Figure 00540001
    Figure 00550001
    Figure 00560001
    Figure 00570001
    Figure 00580001

Claims (16)

  1. Ein bakterizides/Permeabilitäts-erhöhendes Protein der SEQ ID NO: 2, in welchem der Aminosäurerest an Position 185 ausgewählt ist aus Lysin oder Glutaminsäure oder ein Fragment davon, das bakterizide/Permeabilitäts-erhöhende Aktivität besitzt, wobei ein Cysteinrest an Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
  2. Ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 umfassend die ersten 193 amino-terminalen Aminosäurereste des bakteriziden/Permeabilitäts-erhöhenden Proteins.
  3. Ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 umfassend die ersten 199 amino-terminalen Aminosäurereste des bakteriziden/Permeabilitäts-erhöhenden Proteins.
  4. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, Adjuvants oder einen Trägerstoff.
  5. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein bakterizides/Permeabilitäts-erhöhendes Protein oder ein Fragment davon, das bakterizide/Permeabilitäts-erhöhende Aktivität besitzt, wobei ein Cysteinrest entsprechend der Position 132 der SEQ ID NO: 2 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, Adjuvants oder einen Trägerstoff, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von gram-negativen bakteriellen Infektionen und Folgekrankheiten davon einschliesslich Endotoxin-ähnlichem Schock und einem oder mehreren damit verbundenen Zuständen einschliesslich disseminierter intravaskulärer Gerinnung, Anämie, Thrombocytopenie, Leukopenie, adultem Atmungsnotleidens-Syndrom, Nierenversagen, Hypotonie, Fieber und metabolischer Acidose benutzt wird.
  6. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein hybrides Fusionsprotein und einen pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsstoff, Adjuvants oder einen Trägerstoff, wobei das hybride Fusionsprotein an seinem amino-terminalen Ende ein bakterizides/Permeabilitäts-erhöhendes Protein oder ein Fragment davon umfasst, das bakterizide/Permeabilitäts-erhöhende Aktivität besitzt, wobei ein Cysteinrest entsprechend der Position 132 der SEQ ID NO: 2 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und an seinem carboxy-terminalen Ende wenigstens eine konstante Domäne einer immunoglobulären schweren Kette oder einer allelischen Variation davon umfasst, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von gram-negativen bakteriellen Infektionen und Folgekrankheiten davon einschliesslich Endotoxin-ähnlichem Schock und einem oder mehreren damit verbundenen Zuständen einschliesslich disseminierter intravaskulärer Gerinnung, Anämie, Thrombocytopenie, Leukopenie, adultem Atmungsnotleidens-Syndrom, Nierenversagen, Hypotonie, Fieber und metabolischer Acidose benutzt wird.
  7. Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 oder 6 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von gram-negativen bakteriellen Infektionen und Folgekrankheiten davon einschliesslich Endotoxin-ähnlichem Schock und einem oder mehreren damit verbundenen Zuständen einschliesslich disseminierter intravaskulärer Gerinnung, Anämie, Thrombocytopenie, Leukopenie, adultem Atmungsnotleidens-Syndrom, Nierenversagen, Hypotonie, Fieber und metabolischer Acidose.
  8. Eine DNA kodierend für ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
  9. Eine DNA kodierend für ein bakterizides/Permeabilitäts-erhöhendes Protein der SEQ ID: NO. 2, in welchem der Aminosäurerest an Position 185 ausgewählt ist aus Lysin oder Glutaminsäure, oder für ein Fragment davon, das bakterizide/Permeabilitäts-erhöhende Aktivität besitzt, wobei ein Cysteinrest an Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
  10. Eine DNA kodierend für ein bakterizides/Permeabilitäts-erhöhendes Protein der SEQ ID: NO. 2 oder für ein Fragment davon, das bakterizide/Permeabilitäts-erhöhende Aktivität besitzt, wobei ein Cysteinrest an Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist und wobei das Codon für den Valinrest an Position 151 ausgewählt ist aus GTC oder GTG.
  11. Eine DNA kodierend für die 31 Aminosäuren umfassende Anfangssequenz und für die ersten 193 N-terminalen Reste eines bakteriziden/Permeabilitäts-erhöhenden Proteins, in welchem ein Cysteinrest entsprechend der Position 132 der SEQ ID NO: 2 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, wobei die DNA ein Stopcodon besitzt, das unmittelbar auf das Codon für den Leucinrest entsprechend der Position 193 der SEQ ID NO: 2 folgt, und wobei die Sequenz, die für die ersten vier Aminosäuren der 31 Aminosäureanfangssequenz kodiert, entfernt ist.
  12. Eine DNA kodierend für die 31 Aminosäuren umfassende Anfangssequenz und die ersten 199 N-terminalen Reste eines bakteriziden/Permeabilitäts-erhöhenden Proteins, in welchem ein Cysteinrest entsprechend der Position 132 der SEQ ID NO: 2 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, wobei die DNA ein Stopcodon besitzt, das unmittelbar auf das Codon für den Isoleucinrest entsprechend der Position 199 der SEQ ID NO: 2 folgt, und wobei die Sequenz, die für die ersten vier Aminosäuren der 31 Aminosäureanfangssequenz kodiert, entfernt ist.
  13. Ein autonom replizierender DNA-Vektor umfassend eine DNA kodierend für ein bakterizides/Permeabilitäts-erhöhendes Protein oder für ein Fragment davon, das bakterizide/Permeabilitäts-erhöhende Aktivität besitzt, wobei ein Cysteinrest entsprechend der Position 132 der SEQ ID NO: 2 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, wobei der Vektor darüberhinaus ein Selektionsmarkergen umfasst.
  14. Eine CHO-Wirtszelle, die stabil ist mit einer DNA kodierend für ein bakterizides/Permeabilitäts-erhöhendes Protein oder für ein Fragment davon, das bakterizide/Permeabilitäts-erhöhende Aktivität besitzt, wobei ein Cysteinrest entsprechend der Position 132 der SEQ ID NO: 2 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, in einer Art und Weise transformiert oder transfiziert, die die Expression des besagten Polypeptids in besagter Wirtszelle erlaubt.
  15. Eine CHO-Wirtszelle gemäß Anspruch 14, ausgewählt aus einer CHO-K1(ATCC CCL 61)-Zelle, einer CHO-DG44-Zelle oder einer CHO-DXB-11-Zelle.
  16. Eine Insektenzelle, die stabil ist mit DNA kodierend für ein bakterizides/Permeabilitäts-erhöhendes Protein oder für ein Fragment davon, das bakterizide/Permeabilität-erhöhende Aktivität besitzt, wobei ein Cysteinrest entsprechend der Position 132 der SEQ ID NO: 2 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, in einer Art und Weise transformiert oder transfiziert, die die Expression des besagten Polypeptides in besagter Wirtszelle erlaubt.
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