DE69434875T2

DE69434875T2 - BMP-11 Zusammenstellungen

Info

Publication number: DE69434875T2
Application number: DE69434875T
Authority: DE
Inventors: Anthony Joseph Groton Celeste; John Martin Hudson Wosney
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1993-05-12
Filing date: 1994-05-12
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2014-05-13
Also published as: EP2272959A1; HK1060898A1; DE69433530T2; EP1378572B1; EP1378572A1; DK1378572T3; EP1770161A3; FI955419A; KR100227406B1; JPH09501304A; CA2161808A1; OA10191A; PT1378572E; US6437111B1; US5700911A; NO954492D0; EP0698094A1; US5639638A; US7175997B2; JP3681069B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie von gereinigten Proteinen, die als BMP-11 bezeichnet werden, DNA-Moleküle, die sie codieren, und Verfahren, um sie zu erhalten. Die Erfinder haben zuvor die BMP-11-Proteine als Activin WC bezeichnet. Die BMP-11-Proteine können nützlich sein, um die Erzeugung von Knochen und/oder Knorpel zu fördern, und bei der Wundheilung und bei der Wiederherstellung von Gewebe oder bei der Steigerung der Aktivität von anderen Knochenmorphogenetischen Proteinen. Die BMP-11-Proteine können ebenfalls nützlich sein, um die Herstellung des Follikel stimulierenden Hormons zur Schwangerschaftsverhütung zu regulieren, um das Überleben von neuronalen Zellen zu fördern, um die Hämatopoese zu stimulieren und um die Entwicklung von Gonadentumoren zu unterdrücken.
Das Vereinigte Staaten-Patent Nr.: 4,798,885 offenbart eine DNA, welche die α- und β-Ketten des Präpro-Inhibins codiert. Das Vereinigte Staaten-Patent Nr.: 5,071,834 offenbart Arzneimittel von Activin mit zwei beta_B-Ketten, die in einem pharmazeutisch verträglichen Träger formuliert sind.
Das Vereinigte Staaten-Patent Nr.: 5,102,807 offenbart ein gereinigtes Inhibin-Protein, das die Herstellung von FSH unterdrückt, ohne die Herstellung des luteinisierenden Hormons zu unterdrücken.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das BMP-11-Protein ist ein Mitglied der TGF-β-Superfamilie von Proteinen. Die TGF-β-Superfamilie schließt die Familie der Proteine ein, die als Knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) bekannt sind, sowie eine Gruppe von Proteinen, die als Inhibin-β bezeichnet werden. Wie hierin des weiteren diskutiert wird, wird erwartet, dass das BMP-11-Protein eine BMP-11-Aktivität zeigt, wenn es mit einem anderen BMP-11 dimerisiert (Homodimer), wie des weiteren hierin beschrieben wird; dies kann gemäß der Analysen gemessen werden, die hierin in den Beispielen beschrieben werden. Wenn es als ein Heterodimer mit Inhibin-α-Proteinen oder mit anderen Inhibin-β-Proteinen dimerisiert, wird erwartet, dass das Inhibin-β/BMP-11-Heterodimer Wirkungen auf die Herstellung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) zeigt, wie des weiteren hierin beschrieben wird. Es wird außerdem erwartet, dass BMP-11 in einer homodimeren Form oder in einer heterodimeren Form mit einem anderen Mitglied der Familie der Knochenmorphogenetischen Proteine BMP-Aktivität zeigen wird, das heißt die Fähigkeit, die Erzeugung von Knochen, Knorpel und/oder anderem Bindegewebe zu fördern. Daher kann BMP-11 in Abhängigkeit von dem Umfeld von BMP-11 Dimere erzeugen, die entweder eine Activin- oder eine Inhibin-Aktivität oder eine Knochen, Knorpel und/oder anderes Bindegewebe induzierende Aktivität zeigen. Dementsprechend wird die BMP-11-Aktivität als die Fähigkeit, die Herstellung von FSH in der Analyse, die hierin in Beispiel 8 beschrieben wird, zu regulieren, oder als die Fähigkeit definiert, die Erzeugung von Knochen, Knorpel und/oder anderem Bindegewebe in den Analysen, die in den Beispielen 5 bis 7 hierin beschrieben werden, zu induzieren.
Die Proteine, die als Inhibine und Activine bezeichnet werden, werden in den Gonaden hergestellt und sind normalerweise in der follikulären Flüssigkeit enthalten. Diese Proteine wirken auf der Ebene der vorderen Hypophyse, um die Freisetzung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) zu hemmen (Inhibine) oder zu stimulieren (Activine) [für Übersichtsartikel vergl. z.B. Ying S-Y, Endocr Rev 9:267-293 (1988) oder Ling N et al., Vitamins and Hormones 44:1-46 (Academic Press 1988)]. Kurz zusammengefasst, dimere Proteine, die aus einer Kette des Inhibin-α und einer Kette des Inhibin-β (β_A oder β_B) bestehen, werden als Inhibine bezeichnet und sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, die Freisetzung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) zu hemmen, während andere dimere Proteine, die zwei Ketten von Inhibin-β (β_A oder β_B) umfassen, als Activine bezeichnet werden und durch ihre Fähigkeit, die Freisetzung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) zu stimulieren, gekennzeichnet sind [vergl. z.B. Ling et al., Nature 321:779-782 (1986) oder Vale et al., Nature 321:776-779 (1986) oder Mason et al., Nature 318:659-663 (1985) oder Forage et al., Proc Natl Acad Sci USA 83:3091-3095 (1986)].
Es ist bekannt, dass FSH die Entwicklung von Eiern in den Eierstöcken von Säugern stimuliert [Ross et al., in Textbook of Endocrinology, Hrsg. Williams, S. 355 (1981)] und dass die übermäßige Stimulierung der Eierstöcke mit FSH zu einer vielfachen Ovulation führt. FSH ist ebenfalls wichtig für die Funktion des Hodens.
Daher kann BMP-11 in Heterodimeren mit einem Mitglied der Inhibin-α-Familie als ein Verhütungsmittel nützlich sein, das auf der Fähigkeit der Inhibine basiert, die Fruchtbarkeit in weiblichen Säugern zu vermindern und die Spermatogenese in männlichen Säugern zu vermindern. Die Verabreichung von ausreichenden Mengen anderer Inhibine kann die Unfruchtbarkeit in diesen Säugern induzieren. BMP-11 als ein Homodimer oder als ein Heterodimer mit anderen Proteinuntereinheiten der Inhibin-β-Gruppe kann als ein Fruchtbarkeit induzierendes Therapeutikum nützlich sein, das auf der Fähigkeit der Activin-Moleküle basiert, die Freisetzung von FSH von Zellen der vorderen Hypophyse zu stimulieren. Vergl. zum Beispiel das Vereinigte Staaten-Patent Nr.: 4,798,885. BMP-11 kann ebenfalls nützlich für die Förderung des Einsetzens der Fruchtbarkeit in sexuell unreifen Säugern sein, um die lebenslängliche Fortpflanzungsleistung von Haustieren wie z.B. von Kühen, Schafen und Schweinen zu erhöhen. Es wird des weiteren in Erwägung gezogen, dass BMP-11 bei der Förderung des Überlebens von neuronalen Zellen nützlich sein kann [vergl. z.B. Schubert et al., Nature 344:868-870 (1990)], bei der Modulierung der Hämatopoese durch die Induktion der Differenzierung von erythroiden Zellen [vergl. z.B. Broxmeyer et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:9052-9056 (1988) oder Eto et al., Biochem Biophys Res Comm 142:1095-1103 (1987)], für die Unterdrückung der Entwicklung von Gonadentumoren [vergl. z.B. Matzuk et al., Nature 360:313-319 (1992)] oder bei der Steigerung der Aktivität von Knochenmorphogenetischen Proteinen [vergl. z.B. Ogawa et al., J Biol Chem 267:14233-14237 (1992)].
BMP-11-Proteine können des weiteren durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet werden, die Freisetzung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) in etablierten in vitro-Bioanalysen zu modulieren, wobei Zellen der vorderen Hypophyse von Ratten verwendet werden, wie beschrieben wurde [vergl. z.B. Vale et al., Endocrinology 91:562-572 (1972); Ling er al., Nature 321:779-782 (1986) oder Vale et al., Nature 321:776-779 (1986)]. Es wird in Erwägung gezogen, dass das BMP-11-Protein der Erfindung, wenn es als ein Homodimer oder als ein Heterodimer mit anderen Inhibin-β-Ketten zusammengesetzt ist, stimulierende Wirkungen auf die Freisetzung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) aus den Zellen der vorderen Hypophyse zeigen wird, wie beschrieben wurde [Ling et al., Nature 321:779-782 (1986) oder Vale et al., Nature 321:776-779 (1986)]. Zusätzlich wird in Erwägung gezogen, dass das BMP-11-Protein der Erfindung, wenn es als Heterodimer mit der Inhibin-α-Kette zusammengesetzt ist, die Freisetzung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) aus den Zellen der vorderen Hypophyse hemmen wird, wie beschrieben wurde [vergl. z.B. Vale et al., Endocrinology 91:562-572 (1972)]. In Abhängigkeit von der bestimmten Zusammensetzung wird daher erwartet, dass das BMP-11-Protein der Erfindung konträre und entgegengesetzte Wirkungen auf die Freisetzung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) aus der vorderen Hypophyse besitzt.
Es wurde gezeigt, dass Activin A (die homodimere Zusammensetzung von Inhibin β_A) eine die Erythropoese stimulierende Aktivität besitzt (vergl. z.B. Eto et al., Biochem Biophys Res Commun 142:1095-1103 (1987) und Murata et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:2434-2438 (1988) und Yu et al., Nature 380:765-767 (1987)]. Es wird in Betracht gezogen, dass das BMP-11-Protein der Erfindung eine ähnliche Erythropoese stimulierende Aktivität besitzt. Diese Aktivität des BMP-11-Proteins kann des weiteren durch die Fähigkeit des BMP-11-Proteins gekennzeichnet werden, eine Erythropoetin-Aktivität in der biologischen Analyse zu zeigen, die unter Verwendung der menschlichen Zelllinie K-562 durchgeführt wird, wie beschrieben wurde [Lozzio et al., Blood 45:321-334 (1975) und US-Patent Nr. 5,071,834].
Die Strukturen von mehreren Proteinen, die als BMP-1 bis BMP-9 bezeichnet werden, wurden zuvor aufgeklärt. Die einzigartigen induktiven Aktivitäten dieser Proteine, zusammen mit ihrem Vorhandensein im Knochen, deuten darauf hin, dass sie wichtige regulatorische Proteine von Heilungsprozessen im Knochen sind und an der normalen Erhaltung von Knochengewebe beteiligt sein können. Das BMP-11-Protein der vorliegenden Erfindung ist mit den vorstehenden Proteinen verwandt und es wird erwartet, dass es die BMP-Aktivitäten wie z.B. die Fähigkeit, Knochen, Knorpel und/oder anderes Bindegewebe wie z.B. Sehne und Band zu induzieren und die Wundheilungsaktivitäten der BMPs teilt. Zusätzlich wird erwartet, dass die Proteine der Erfindung zusammen oder vielleicht synergistisch mit anderen verwandten Proteinen oder Wachstumsfaktoren wirken können. Weitere therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung umfassen daher eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem BMP-11-Protein der Erfindung mit einer therapeutisch wirksamen Menge von mindestens einem der anderen BMP-Proteine, die in Patenten und Anmeldungen des gleichen Anmelders, die nachfolgend beschrieben werden, offenbart wurden. Solche Kombinationen können verschiedene Moleküle der BMP-Proteine oder Heteromoleküle umfassen, die aus verschiedenen BMP-Einheiten bestehen. Des weiteren können BMP-11-Proteine mit anderen nützlichen Wirkstoffen für die Behandlung eines Knochen- und/oder Knorpeldefekts, von Wunden oder in Frage kommendem Gewebe kombiniert werden. Diese Wirkstoffe schließen verschiedene Wachstumsfaktoren wie z.B. den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), den von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktor (PDGF), die transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β), den k-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (kFGF), das Parathormon (PTH), den Leukämie hemmenden Faktor (LIF/HILDA/DIA), die Insulin ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF-II) ein. Teile dieser Wirkstoffe können ebenfalls in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die DNA-Sequenz des Rinder-BMP-11 (SEQ ID Nr.: 1) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 2) und die DNA-Sequenz des menschlichen BMP-11 (SEQ ID Nr.: 10) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 11) werden hierin in dem Sequenzprotokoll dargelegt. Activin-Proteine sind in der Lage, die Herstellung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) zu regulieren, und daher kann BMP-11 als ein Verhütungsmittel oder als ein die Fruchtbarkeit induzierendes Therapeutikum nützlich sein. Es wird erwartet, dass das gereinigte BMP-11-Protein in der homodimeren Form oder als Heterodimere mit Proteinen der Inhibin-β-Gruppe eine Activin-Aktivität zeigt und dass es verwendet werden kann, um FSH zu stimulieren. Zusätzlich wird erwartet, dass das gereinigte BMP-11-Protein für die Induktion von Knochen, Knorpel und/oder von anderem Bindegewebe nützlich sein kann.
Eine isolierte DNA-Sequenz, die ein BMP-11 codiert, wird vorzugsweise aus einer Gruppe ausgewählt, die aus

(a) Nucleotid #375 oder #390 bis #704 von SEQ ID Nr.: 1;
(b) Nucleotid #76 oder #775 bis #1086 von SEQ ID Nr.: 10; und
(c) Sequenzen, die daran unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und ein Protein codieren, das eine BMP-11-Aktivität besitzt, besteht.

Die DNA von BMP-11 der Erfindung umfasst vorzugsweise eine DNA-Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus:

(a) Nucleotiden, welche die Aminosäuren 1 oder 6 bis 109 von SEQ ID Nr.: 2 codieren;
(b) Nucleotiden, welche die Aminosäuren 1 oder 6 bis 109 von SEQ ID Nr.: 11 codieren; und
(c) einer Sequenz, die daran unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und ein Protein codiert, das eine BMP-11-Aktivität besitzt, besteht.

Rinder-BMP-11 kann durch die Züchtung einer Zelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, welche das Nucleotid #375 bis Nucleotid #704 umfasst, wie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt wird, und durch die Gewinnung und Reinigung eines Proteins, das durch die Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, welche die Aminosäure #1 bis #109 umfasst, wie in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt wird, im Wesentlichen frei von anderen proteinartigen Substanzen, mit denen es zusammen hergestellt wird, aus dem Kulturmedium hergestellt werden.
Es wird erwartet, dass menschliches BMP-11 homolog zu Rinder-BMP-11 ist. Die Erfindung schließt daher Verfahren zur Erhaltung der DNA-Sequenzen, die menschliches BMP-11 codieren, die DNA-Sequenzen, die durch diese Verfahren erhalten werden, und das menschliche Protein, das durch diese DNA-Sequenzen codiert wird, ein. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung der Nucleotidsequenz des Rinder-BMP-11 oder von Teilen davon, um Sonden zu entwerfen, um Bibliotheken nach menschlichen Genen oder Fragmenten davon unter Verwendung von Standard-Techniken abzusuchen. Eine DNA-Sequenz, die einen Teil des menschlichen BMP-11-Proteins codiert (SEQ ID Nr.: 3), und die entsprechende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 4) werden im Sequenzprotokoll dargelegt. Diese Sequenzen können ebenfalls verwendet werden, um Sonden zu entwerfen, um das vollständige menschliche BMP-11-Gen mittels Standardtechniken zu erhalten. Das menschliche BMP-11 kann durch die Züchtung einer Zelle, die mit der DNA-Sequenz von BMP-11 transformiert wurde, und durch die Gewinnung und Reinigung von BMP-11 aus dem Kulturmedium hergestellt werden. Das gereinigte, exprimierte Protein ist im Wesentlichen frei von anderen proteinartigen Substanzen, mit denen es zusammen hergestellt wird, sowie von anderen kontaminierenden Stoffen.
Es wird in Erwägung gezogen, dass das gewonnene, gereinigte Protein die Fähigkeit zeigt, die Herstellung von FSH zu regulieren. Die Proteine der Erfindung können des weiteren durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet werden, die Herstellung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) in etablierten in-vitro-Bioanalysen zu regulieren, wobei Zellen der vorderen Hypophyse von Ratten verwendet werden. BMP-11-Proteine können ebenfalls durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet werden, die Erzeugung von Knochen, Knorpel und/oder anderem Bindegewebe zum Beispiel in der Erzeugungsanalyse von Rattenknochen, die nachfolgend beschrieben wird, zu induzieren.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt Arzneimittel zur Verfügung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines BMP-11-Proteins in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel oder Träger umfassen. BMP-11-Zusammensetzungen der Erfindung können für die Regulierung des Follikel stimulierenden Hormons nützlich sein und sie können bei der Verhütung nützlich sein. Zusammensetzungen der Erfindung können des weiteren mindestens einen anderen therapeutisch nützlichen Wirkstoff wie z.B. die BMP-Proteine BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, die zum Beispiel in den Vereinigten Staaten-Patenten Nr.: 5,108,922; 5,013,649; 5,116,738; 5,106,748; 5,187,076; und 5,141,905 offenbart wurden; BMP-8, das in der PCT-Veröffentlichung WO 91/18098 offenbart wurde; und BMP-9, das in der PCT-Veröffentlichung WO 93/00432 offenbart wurde; und BMP-10, das in der Patentanmeldung des gleichen Anmelders mit der Seriennummer 08/061,695, eingereicht am 12. Mai, 1993, offenbart wurde, einschließen. Die BMP-11-Zusammensetzungen können ebenfalls für eine Anzahl von Verwendungen nützlich sein, welche die Regulierung der Produktion des Follikel stimulierenden Hormons, einschließlich der Verhütung, einschließen. Diese Verfahren beinhalten gemäß der Erfindung die Verabreichung einer effektiven Menge von BMP-11 an einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können zusätzlich zu einem BMP-11-Protein andere Mitglieder der Inhibin-β-Gruppe von Proteinen oder Inhibin-α-Proteine sowie andere therapeutisch nützliche Wirkstoffe einschließlich Wachstumsfaktoren wie z.B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), transformierender Wachstumsfaktor (TGF-α und TGF-β) und Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF) umfassen.
Die BMP-11-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls nützlich für die Behandlung von einer Reihe von Knochen- und/oder Knorpeldefekten, periodontalen Erkrankungen und verschiedenen Arten von Wunden sein. Diese Verfahren beinhalten gemäß der Erfindung die Verabreichung einer wirksamen Menge eines BMP-11-Proteins an einen Patienten, der eine Erzeugung von Knochen und/oder Knorpel, eine Wundheilung oder Gewebereparatur benötigt. Diese Verfahren können ebenfalls die Verabreichung eines Proteins der Erfindung zusammen mit mindestens einem der neuen BMP-Proteine beinhalten, die in den Patenten und Anmeldungen der gleichen Anmelder, die vorstehend beschrieben wurden, offenbart wurden. Zusätzlich können diese Verfahren auch die Verabreichung eines BMP-11-Proteins mit anderen Wachstumsfaktoren einschließlich EGF, FGF, TGF-α, TGF-β und IGF einschließen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung sind DNA-Sequenzen, welche die Expression eines BMP-11-Proteins codieren. Solche Sequenzen schließen die Sequenz der Nucleotide in einer 5' zu 3'-Richtung, die in SEQ-ID Nr.: 1 dargestellt wird, oder DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr.: 1 hybridisieren und die ein Protein codieren, das eine BMP-11-Aktivität besitzt, ein. Außerdem sind allelische oder andere Variationen der Sequenzen von SEQ ID Nr.: 1 in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, unabhängig davon, ob solche Veränderungen der Nucleotide zu Veränderungen in der Peptidsequenz führen oder nicht.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind DNA-Sequenzen, welche die Expression eines BMP-11-Proteins codieren. Solche Sequenzen schließen die Sequenz der Nucleotide in einer 5' zu 3'-Richtung, die in SEQ-ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 dargestellt wird, und DNA-Sequenzen ein, die abgesehen von der Degeneration des genetischen Codes identisch zu der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 sind und die das Protein von SEQ ID Nr.: 2 oder von SEQ ID Nr.: 11 codieren. Des weiteren sind in der vorliegenden Erfindung DNA-Sequenzen eingeschlossen, die unter stringenten Bedingungen mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr. 10 hybridisieren und die ein Protein codieren, das eine BMP-11-Aktivität besitzt. Letztlich sind allelische oder andere Variationen der Sequenzen von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, unabhängig davon, ob solche Veränderungen der Nucleotide zu Veränderungen in der Peptidsequenz führen oder nicht, wobei jedoch die Peptidsequenz noch eine BMP-11-Aktivität besitzt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt Vektoren ein, die eine DNA-Sequenz, wie vorstehend beschrieben, in einer funktionellen Bindung mit einer Sequenz zur Expressionskontrolle umfassen.
Diese Vektoren können in einem neuen Verfahren zur Herstellung eines BMP-11-Proteins der Erfindung verwendet werden, in dem eine Zelllinie, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die ein BMP-11-Protein in einer funktionellen Bindung mit einer Sequenz zur Expressionskontrolle codiert, in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet wird und ein BMP-11-Protein davon gewonnen und gereinigt wird. Dieses Verfahren kann eine Anzahl von bekannten Zellen, sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Zellen, als Wirtszellen für die Expression des Polypeptids verwenden.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls die Verwendung der DNA-Sequenzen und Vektoren der Erfindung in der Gentherapie ein. In einer solchen Verwendung können die Vektoren in die Zellen eines Patienten in vitro transfiziert werden und die Zellen können wieder in einen Patienten eingeführt werden. In einer anderen Ausführungsform können die Vektoren in einen Patienten in vivo durch eine zielgerichtete Transfektion eingeführt werden.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach der Berücksichtigung der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und der bevorzugten Ausführungsformen davon offensichtlich sein.
Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID Nr.: 1 ist eine unvollständige Nucleotidsequenz des Rinder-BMP-11, die das reife Rinder-BMP-11-Polypeptid codiert.
SEQ ID Nr.: 2 ist die Aminosäuresequenz eines unvollständigen Propeptids und des vollständigen reifen Rinder-BMP-11-Polypeptids, die durch SEQ ID Nr.: 1 codiert wird.
SEQ ID Nr.: 3 ist eine unvollständige Nucleotidsequenz des menschlichen BMP-11.
SEQ ID Nr.: 4 ist eine unvollständige Aminosäuresequenz des menschlichen BMP-11-Polypeptids, das durch SEQ ID Nr.: 3 codiert wird.
SEQ ID Nr.: 5 und 6 sind Primer für das Rinder-BMP-11, die verwendet werden, um das menschliche BMP-11- oder andere BMP-11-Proteine zu isolieren.
SEQ ID Nr.: 7 ist eine DNA-Sequenz, die in pMT2 CXM eingebracht wird, um eine Erkennungsstelle für XhoI in der Nähe des SV40-Replikationsursprungs zuzufügen.
SEQ ID Nr.: 8 ist eine DNA-Sequenz, die in pMT21 eingebracht wird, um eine Erkennungsstelle für XhoI stromaufwärts des DHFR-Gens einzubringen.
SEQ ID Nr.: 9 ist eine DNA-Sequenz, die einen Teil der EMC-Virus-Leader-Sequenz umfasst.
SEQ ID Nr.: 10 ist eine DNA-Sequenz, die ein unvollständiges Propeptid und das vollständige reife menschliche BMP-11-Protein codiert.
SEQ ID Nr.: 11 ist die Aminosäuresequenz eines unvollständigen Propeptids und des vollständigen reifen menschlichen BMP-11-Proteins, die durch SEQ ID Nr.: 10 codiert werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
BMP-11
Die Nucleotidsequenz des Rinder-BMP-11 (SEQ ID Nr.: 1) und die codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 2) und die Nucleotidsequenz des menschlichen BMP-11 (SEQ ID Nr.: 10) und die codierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 11) werden hierin in dem Sequenzprotokoll dargestellt. Gereinigte Rinder-BMP-11-Proteine der vorliegenden Erfindung werden durch die Züchtung einer Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, welche die codierende DNA-Sequenz von SEQ ID Nr.: 1 von Nucleotid #375 bis #704, oder die codierende DNA-Sequenz von SEQ ID Nr.: 10 von Nucleotid #760 bis #1086 codiert, umfasst, und durch die Gewinnung und die Reinigung eines Proteins, das die Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz enthält, die durch die Aminosäuren #1 bis #109 von SEQ ID Nr.: 2 oder durch die Aminosäuren #1 bis #109 von SEQ ID Nr.: 11 dargestellt wird, aus dem Kulturmedium hergestellt. Für die Herstellung der BMP-11-Proteine in Säugerzellen umfasst die DNA-Sequenz des weiteren ein geeignetes Propeptid, das im Leseraster mit den vorstehend beschriebenen codierenden DNA-Sequenzen für BMP-11, verbunden ist. Das Propeptid kann das native Propeptid von BMP-11 oder ein Propeptid eines anderen Mitglieds der TGF-β-Superfamilie sein.
Die Sequenz des menschlichen BMP-11 der vorliegenden Erfindung wird erhalten, wobei die vollständige DNA-Sequenz des Rinder-BMP-11 oder Fragmente davon oder die unvollständige Sequenz des menschliche BMP-11 von SEQ ID Nr.: 3 als eine Sonde verwendet wird. Daher umfasst die DNA-Sequenz des menschlichen BMP-11 die DNA-Sequenz der Nucleotide #28 bis #185 von SEQ ID Nr.: 3. Das menschliche BMP-11-Protein umfasst die Aminosäuresequenz der Aminosäuren #1 bis #52 von SEQ ID Nr.: 4.
Es wird erwartet, das BMP-11, wenn es durch Säugerzellen wie z.B. CHO-Zellen exprimiert wird, als eine heterogene Population von aktiven Spezies des BMP-11-Proteins mit verschiedenen N-Enden existiert. Es wird erwartet, dass die aktiven Spezies eine Aminosäuresequenz umfassen werden, die mindestens mit dem Cysteinrest bei der Aminosäure #6 der SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 oder weiter in Richtung des N-Endes starten werden. Daher wird erwartet, dass die DNA-Sequenzen, welche die aktiven BMP-11-Proteine codieren, die Nucleotide #375 oder #390 bis #701 von SEQ ID Nr.: 1 oder die Nucleotide #760 oder #775 bis #1086 von SEQ ID Nr.: 10 umfassen, und sie können zusätzliche Nucleotidsequenzen in der 5'-Richtung von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 umfassen.
Das N-Ende des menschlichen BMP-11 wurde experimentell durch die Expression in E. coli als die nachfolgende Sequenz bestimmt: [M]NLGLDXDEHSSE, wobei X einen Aminosäurerest mit einem unklaren Signal kennzeichnet, was mit einer Lage eines Cysteins an dieser Position übereinstimmt. Es wird daher erwartet, dass diese Spezies von BMP-11 ein N-Ende bei der Aminosäure #1 von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 besitzt und dass DNA-Sequenzen, welche diese Spezies codieren, die Nucleotide #375 bis #701 von SEQ ID Nr.: 1 (Rind) oder die Nucleotide #760 bis #1086 von SEQ ID Nr.: 10 (Mensch) umfassen werden. Durch SDS-PAGE wurde das offensichtliche Molekulargewicht eines menschlichen BMP-11-Monomers auf etwa 12 kd bestimmt. Das menschliche BMP-11-Protein existiert in 0,1% Trifluoressigsäure als eine klare, farblose Lösung.
Die aus dem Kulturmedium gewonnenen BMP-11-Proteine werden durch die Isolierung von anderen proteinartigen Substanzen, mit denen sie zusammen hergestellt werden, und von anderen vorhandenen kontaminierenden Stoffen gereinigt.
Die BMP-11-Protine können durch die Fähigkeit, die Herstellung von FSH zu regulieren, gekennzeichnet werden. Die BMP-11-Proteine können des weiteren durch die Fähigkeit, die Freisetzung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) in etablierten in-vitro-Bioanalysen unter Verwendung von Zellen der vorderen Hypophyse von Ratten zu modulieren, wie beschrieben wurde [vergl. z.B. Vale et al., Endocrinology 91:562-572 (1972); Ling et al., Nature 321:779-782 (1986) oder Vale et al., Nature 321:776-779 (1986)], gekennzeichnet werden. Die BMP-11-Proteine können ebenfalls durch die Fähigkeit gekennzeichnet werden, die Erzeugung von Knochen, Knorpel und/oder anderem Bindegewebe zu induzieren. Eine solche Gewebe induzierende Aktivität von BMP-11 kann des weiteren durch die Fähigkeit gekennzeichnet werden, die Erzeugung von Knochen, Knorpel und/oder anderem Bindegewebe in den Analysen, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben werden, zu induzieren.
Die BMP-11-Proteine, die hierin zur Verfügung gestellt werden, schließen ebenfalls Faktoren ein, die durch Sequenzen codiert werden, die ähnlich zu solchen von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 sind, in denen aber Modifikationen auf eine natürliche Weise zur Verfügung gestellt werden (z.B. allelische Variationen in der Nucleotidsequenz, die zu Veränderungen in den Aminosäuren in dem Polypeptid führen können) oder die absichtlich durch Manipulation eingebracht werden. Zum Beispiel können synthetische Polypeptide vollständig oder unvollständig fortlaufende Sequenzen der Aminosäurereste von SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 11 verdoppeln. Diese Sequenzen können, weil sie die primären, sekundären oder tertiären Strukturen und die konformativen Kennzeichen mit den Inhibin-β-Polypeptiden von SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 11 teilen, eine BMP-11-Aktivität, die sie mit ihnen gemeinsam haben, besitzen. Sie können daher als biologisch aktive Ersatzstoffe für natürlich vorkommende BMP-11-Polypeptide in therapeutischen Verfahren verwendet werden.
Andere spezifische Mutationen der Sequenzen der BMP-11-Proteine, die hierin beschrieben werden, beziehen die Modifikationen von Glycosylierungsstellen ein. Diese Modifikationen können O-gebundene oder N-gebundene Glycosylierungsstellen einbeziehen. Zum Beispiel erfolgt das Fehlen einer Glycosylierung oder eine unvollständige Glycosylierung durch Substitutionen oder Deletionen von Aminosäuren an Asparagin gebundenen Erkennungsstellen für die Glycosylierung. Die Asparagin gebundenen Erkennungsstellen für die Glycosylierung umfassen Tripeptid-Sequenzen, die spezifisch von geeigneten zellulären Glycosylierungsenzymen erkannt werden. Diese Tripeptid-Sequenzen sind entweder Asparagin-X-Threonin oder Asparagin-X-Serin, wobei X im Allgemeinen jede Aminosäure sein kann. Eine Vielfalt von Aminosäuresubstitutionen oder Deletionen von einer oder von beiden der ersten oder der dritten Aminosäurepositionen einer Erkennungsstelle für die Glycosylierung (und/oder Deletionen einer Aminosäure an der zweiten Position) führt zu der nicht-Glycosylierung an der modifizierten Tripeptid-Sequenz. Außerdem führt die Expression des BMP-11-Proteins in bakteriellen Zellen zu einem nicht-glycosylierten Protein, wobei die Erkennungsstellen für Glycosylierung nicht verändert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem die neuen DNA-Sequenzen, die frei von der Assoziation mit DNA-Sequenzen sind, die andere proteinartige Substanzen codieren, und welche die Expression von BMP-11-Proteinen codieren. Diese DNA-Sequenzen schließen solche ein, die in SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 in einer 5' zu 3'-Richtung dargestellt werden, und solche Sequenzen, die daran unter stringenten Hybridisierungsbedingungen wie z.B. 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 65°C hybridisieren [vergl. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboraton Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seite 387 bis 389] und ein Protein codieren, das eine BMP-11-Aktivität besitzt. Diese DNA-Sequenzen schließen ebenfalls solche ein, welche die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr.: 3 umfassen, und solche, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen daran hybridisieren und die ein Protein codieren, das eine BMP-11-Aktivität besitzt.
Gleichermaßen codieren die DNA-Sequenzen, die die BMP-11-Proteine codieren, die von den Sequenzen von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 codiert werden, die sich aber in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes oder aufgrund von allelischen Variationen (natürlich vorkommende Basenveränderungen in der Speziespopulation, die zu einer Aminosäureveränderung führen können oder nicht) unterscheiden, die neuen Faktoren, die hierin beschrieben werden. Variationen in den DNA-Sequenzen von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10, die durch Punktmutationen verursacht werden oder durch Modifikationen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution) induziert werden, um die Aktivität, die Halbwertszeit oder die Herstellung der codierten Polypeptide zu erhöhen, sind ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein neues Verfahren zur Herstellung von BMP-Proteinen zur Verfügung. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Züchtung einer geeigneten Zelllinie, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die ein BMP-11-Protein der Erfindung unter der Kontrolle von bekannten regulatorischen Sequenzen codiert. Die transformierten Wirtszellen werden gezüchtet und die BMP-11-Proteine werden aus dem Kulturmedium gewonnen und gereinigt. Die gereinigten Proteine sind im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit denen sie zusammen hergestellt werden, sowie von anderen kontaminierenden Stoffen.
Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugerzellen wie z.B. die Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) sein. Die Auswahl von geeigneten Säugerwirtszellen und Verfahren zur/zum Transformation, Züchtung, Amplifikation, Absuchen, Herstellung und Reinigung des Produkts sind auf dem Fachgebiet bekannt. Vergl. z.B. Gething und Sambrook, Nature 293:620-625 (1981) oder alternativ Kaufman et al., Mol Cell Biol 5(7):1750-1759 (1985) oder Howley et al., US-Patent Nr.: 4,419,446. Eine andere geeignete Säugerzelllinie, die in den beigefügten Beispielen beschrieben wird, ist die Affen-Zelllinie COS-1. Die Säugerzelle CV-1 kann ebenfalls geeignet sein.
Bakterielle Zellen können ebenfalls geeignete Wirte sein. Die verschiedenen Stämme von E. coli (z.B. HB101, MC1061) sind zum Beispiel als Wirtszellen im Bereich der Biotechnologie gut bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas oder von anderen Bakterien und dergleichen können ebenfalls in diesem Verfahren verwendet werden.
Viele Stämme von Hefezellen, die dem Fachmann bekannt sind, können ebenfalls als Wirtszellen zur Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung erhältlich sein. Wenn es erwünscht wird, können außerdem Insektenzellen als Wirtszellen in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vergl. z.B. Miller et al., Genetic Engineering 8:277-298 (Plenum Press 1986) und die Referenzen, die darin zitiert werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Vektoren zur Verwendung in dem Verfahren der Expression dieser neuen BMP-11-Polypeptide zur Verfügung. Vorzugsweise enthalten die Vektoren die vollständigen neuen DNA-Sequenzen, die vorstehend beschrieben wurden, welche die neuen Faktoren der Erfindung codieren. Außerdem enthalten die Vektoren geeignete Kontrollsequenzen der Expression, welche die Expression der BMP-11-Proteinsequenzen erlauben. In einer anderen Ausführungsform sind Vektoren, die modifizierte Sequenzen einschließen, wie vorstehend beschrieben wurde, ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Zusätzlich können die Sequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 oder andere Sequenzen, die BMP-11-Proteine codieren, manipuliert werden, um ein reifes BMP-11 zu exprimieren, indem die codierenden Sequenzen des BMP-11-Propeptids deletiert und durch Sequenzen ersetzt werden, die das vollständige Propeptid von anderen BMP-Proteinen, Activin-Proteinen oder anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie codieren.
Die Vektoren können in dem Verfahren zur Transformierung der Zelllinien verwendet werden und sie können ausgewählte regulatorische Sequenzen in einer funktionellen Assoziation mit der DNA enthalten, welche die Sequenzen der Erfindung codiert, die in der Lage sind, die Replikation und Expression davon in ausgewählten Wirtszellen zu lenken. Regulatorische Sequenzen für solche Vektoren sind dem Fachmann bekannt und können in Abhängigkeit von den Wirtszellen ausgewählt werden. Eine solche Auswahl ist Routine und ist kein Teil der vorliegenden Erfindung. Für die Expression in Säugerwirtszellen kann der Vektor eine codierende Sequenz umfassen, die ein Propeptid, das zur Sekretion von Proteinen durch die Wirtszelle geeignet ist, codiert, und die im richtigen Leseraster zu der codierenden Sequenz für ein reifes BMP-11-Protein gebunden ist. Geeignete Sequenzen, die Propeptide codieren, können von einer DNA erhalten werden, die Proteine der TGF-β-Proteinsuperfamilie codiert, zum Beispiel einschließlich BPM-2 bis BPM-9. Vergl. zum Beispiel das Vereinigte Staaten-Patent Nr.: 5,168,150, in dem eine DNA, die einen Vorläufer-Anteil eines anderen Säugerproteins als BMP-2 codiert, an eine DNA fusioniert ist, die ein reifes BMP-2-Protein codiert, wobei die Offenbarung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die vorliegende Erfindung schließt daher chimäre DNA-Moleküle ein, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ein Propeptid von einem Mitglied der TGF-β-Proteinsupertamilie umfasst, das im richtigen Leseraster an eine DNA-Sequenz gebunden ist, die ein BMP-11-Polypeptid codiert. Der Ausdruck "chimär" wird verwendet, um zu kennzeichnen, dass das Propeptid von einem anderen Polypeptid als BMP-11 stammt.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung, das die Herstellung von FSH reguliert, besitzt eine mögliche Anwendung bei der Förderung der Fruchtbarkeit, wenn es in einer Zusammensetzung als ein Homodimer oder als ein Heterodimer mit anderen Proteinen der Inhibin-β-Familie exprimiert wird. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können ebenfalls nützlich für eine Verhütung sein, wenn sie in einer Zusammensetzung als ein Heterodimer mit Proteinen der Inhibin-α-Familie exprimiert werden.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung, das die Erzeugung von Knorpel und Knochen unter solchen Umständen induziert, in denen Knochen normalerweise nicht erzeugt wird, besitzt eine Anwendung bei der Heilung von Knochenbrüchen und Defekten im Knorpel bei Menschen und anderen Tieren. Eine solche Herstellung, die ein BMP-11-Protein verwendet, kann eine prophylaktische Verwendung bei der Verminderung von geschlossenen als auch offenen Knochenbrüchen und ebenfalls bei der verbesserten Fixierung von künstlichen Gelenken haben. Eine Erzeugung von Knochen de novo, die durch ein osteogenetisches Mittel induziert wird, trägt zu der Wiederherstellung von erblich bedingten, Trauma induzierten oder durch onkologische Resektion induzierten Schädeldefekten bei und ist außerdem nützlich in der plastischen Schönheitschirurgie. Ein BMP-11-Protein kann bei der Behandlung einer Parodontalerkrankung oder bei anderen Verfahren der Zahnwiederherstellung verwendet werden. Solche Wirkstoffe stellen eine Umgebung zur Verfügung, die knochenbildende Zellen anziehen, das Wachstum von knochenbildenden Zellen stimulieren oder die Differenzierung von Vorläufern der knochenbildenden Zellen induzieren. Die BMP-11-Polypeptide der Erfindung können ebenfalls bei der Behandlung von Osteoporose nützlich sein. Eine Vielfalt von osteogenen, knorpelinduzierenden und knocheninduzierenden Faktoren wurde beschrieben. Vergl. z.B. die Europäische Patentanmeldungen Nr.: 148,155 und 169,016 für die Diskussion darüber.
Die Proteine der Erfindung können ebenfalls bei der Wundheilung und bei der damit in Zusammenhang stehenden Gewebereparatur verwendet werden. Die Arten von Wunden schließen Verbrennungen, Schnitte und Geschwüre ein, sind aber nicht darauf beschränkt. (Verg. z.B. PCT-Veröffentlichung WO 84/01106 für die Diskussion der Wundheilung und der damit in Zusammenhang stehenden Gewebereparatur).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein therapeutisches Verfahren und eine Zusammensetzung zur Reparatur von Knochenbrüchen und anderen Zuständen, die mit Defekten von Knorpel und/oder Knochen oder mit Periodontalerkrankungen verwandt sind. Die Erfindung umfasst des weiteren therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen für die Wundheilung und die Gewebereparatur. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der BMP-11-Proteine der Erfindung in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel, Träger oder Bindemittel.
Eine solche Herstellung, die ein BMP-11-Protein verwendet, kann ebenfalls das neuronale Überleben fördern und ist daher bei der Transplantation und der Behandlung von Bedingungen, die eine Verminderung des neuronalen Überlebens zeigen, nützlich.
Es wird erwartet, dass die BMP-Proteine der Erfindung zusammen oder vielleicht synergistisch mit anderen verwandten Proteinen und Wachstumsfaktoren wirken. Weitere therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung umfassen daher eine therapeutische Menge von mindestens einem BMP-11-Protein der Erfindung mit einer therapeutischen Menge von mindestens einem der BMP-Proteine oder der anderen Wachstumsfaktoren, die in Patenten und Anmeldungen des gleichen Anmelders, die vorstehend beschrieben wurden, offenbart wurden. Solche Kombinationen können einzelne Moleküle oder Heteromoleküle umfassen, die aus verschiedenen Einheiten bestehen. Ein Verfahren und eine Zusammensetzung der Erfindung können zum Beispiel ein Disulfid gebundenes Dimer umfassen, das eine BMP-11-Proteinuntereinheit und eine Untereinheit von einem Inhibin-α-Protein, einem Inhibin-β-Protein oder einem BMP-Protein wie z.B. BMP-1 bis BMP-10 umfasst. Die Wirkstoffe, die mit BMP-11 nützlich sind, können verschiedene Wachstumsfaktoren wie z.B. der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktor (PDGF), die transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) und den Insulin ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF) umfassen. Weitere therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung umfassen eine therapeutische Menge von mindestens einem BMP-11-Protein der Erfindung mit einer therapeutischen Menge von mindestens einem der BMP-Proteine, die in den Patenten und Anmeldungen des gleichen Anmelders, die vorstehend beschriebenen wurden, offenbart wurden. Solche Kombinationen können einzelne Moleküle der BMP-Proteine oder Heteromoleküle umfassen, die aus verschiedenen BMP-Einheiten bestehen. Ein Verfahren und eine Zusammensetzung der Erfindung können zum Beispiel ein Disulfid gebundenes Dimer umfassen, das eine BMP-11-Proteinuntereinheit und eine Untereinheit von einem der "BMP"-Proteine umfasst, die vorstehend beschrieben wurden. Die vorliegende Erfindung schließt daher ein gereinigtes BMP-11-Polypeptid ein, das ein Heterodimer ist, wobei eine Untereinheit mindestens die Aminosäuresequenz von Aminosäure #1 bis Aminosäure #109 von SEQ ID Nr.: 2 oder SEQ ID Nr.: 11 umfasst und eine Untereinheit eine Aminosäuresequenz für ein Knochenmorphogenetisches Protein umfasst, das von der Gruppe ausgewählt wurde, die aus BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 und BMP-9 besteht. Eine weitere Ausführungsform kann ein Heterodimer aus BMP-11-Einheiten umfassen. Des weiteren können BMP-11-Proteine mit anderen Wirkstoffen kombiniert werden, die günstig für die Behandlung eines Knochen- und/oder Knorpeldefekts, einer Wunde oder eines in Frage kommenden Gewebes sind. Diese Wirkstoffe schließen verschiedene Wachstumsfaktoren wie z.B. den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), den von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktor (PDGF), die transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) und den k-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (kFGF), das Parathormon (PTH), den Leukämie hemmenden Faktor (LIF/HILDA/DIA), die Insulin ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF-II) ein. Teile von diesen Wirkstoffen können ebenfalls in Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die BMP-11-Proteine der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in Zusammensetzungen verwendet werden, die mit Knochenmorphogenetischen Proteinen kombiniert werden. Vergl. zum Beispiel Ogawa et al., WO 92/14481 (1992); Ogawa et al., J Biol Chem 267:14233-14237 (1992). Die Knochenmorphogenetischen Proteine, die in solchen Zusammensetzungen nützlich sind, schließen BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7, die zum Beispiel in den Vereinigten Staaten-Patenten Nr.: 5,108,922; 5,013,649; 5,116,738; 5,106,748; 5,187,076; und 5,141,905 offenbart wurden; BMP-8, das in der PCT-Veröffentlichung WO 91/18098 offenbart wurde; und BMP-9, das in der PCT-Veröffentlichung WO 93/00432 offenbart wurde; und BMP-10, das in der Patentanmeldung des gleichen Anmelders mit der Seriennummer 08/061,695, eingereicht am 12. Mai, 1993, offenbart wurde, ein.
Die Herstellung und Formulierung solcher physiologisch verträglichen Proteinzusammensetzungen mit Berücksichtigung des pH-Werts, Isotonität, Stabilität und dergleichen liegen innerhalb des Fachgebiets. Die therapeutischen Zusammensetzungen sind zur Zeit aufgrund des Fehlens einer Artspezifität in BMP- und TGF-Proteinen ebenfalls wertvoll für tierärztliche Anwendungen. Insbesondere Haustiere und reinrassige Pferde sind, zusätzlich zu Menschen, erwünschte Patienten für eine solche Behandlung mit dem BMP-11 der vorliegenden Erfindung.
Das therapeutische Verfahren schließt die Verabreichung der Zusammensetzung lokal, systemisch oder lokal als ein Implantat oder eine Vorrichtung ein. Wenn die therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung in dieser Erfindung verabreicht wird, liegt sie natürlich in einer Pyrogen freien, physiologisch verträglichen Form vor. Des weiteren kann es wünschenswert sein, dass die Zusammensetzung verkapselt ist oder dass sie in einer viskosen Form zur Verabreichung an der Stelle des Knochen-, Knorpel- oder Gewebeschadens injiziert wird. Die örtliche Verabreichung kann für die Wundheilung und die Gewebereparatur geeignet sein. Andere therapeutisch nützliche Wirkstoffe als die BMP-11-Proteine, die gegebenenfalls auch in der Zusammensetzung, die vorstehend beschrieben wurde, eingeschlossen werden können, können alternativ oder zusätzlich gleichzeitig oder nacheinander mit der BMP-11-Zusammensetzung in den Verfahren der Erfindung verabreicht werden.
Für die Erzeugung von Knochen, Knorpel oder von anderem Bindegewebe schließt die Zusammensetzung vorzugsweise eine Matrix ein, die in der Lage ist, BMP-11 oder andere BMP-Proteine an den Ort des Gewebeschadens, der wiederhergestellt werden soll, zu verabreichen, wobei eine Struktur für den sich entwickelnden Knochen und Knorpel zur Verfügung gestellt wird, die optimal von dem Körper resorbiert werden kann. Die Matrix kann die langsame Freisetzung von BMP-11 und/oder eines anderen Knochen induzierenden Proteins sowie die richtige Präsentation und die geeignete Umgebung für eine zelluläre Infiltration zur Verfügung stellen. Solche Matrizen können aus Substanzen erzeugt werden, die gegenwärtig bei anderen implantierten medizinischen Anwendungen verwendet werden. Die Auswahl des Matrixmaterials basiert auf der Bioverträglichkeit, der biologischen Abbaubarkeit, mechanischen Eigenschaften, dem kosmetischen Erscheinungsbild und Grenzflächeneigenschaften. Die bestimmte Anwendung der BMP-11-Zusammensetzungen wird die geeignete Formulierung definieren. Mögliche Matrizen für die Zusammensetzungen können biologisch abbaubares und chemisch definiertes Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, Polymilchsäure und Polyanhydride sein. Andere mögliche Substanzen sind biologisch abbaubar und biologisch gut definiert, wie z.B. Knochen, Sehne oder Hautkollagen. Weitere Matrizen bestehen aus reinen Proteinen oder Komponenten der extrazellulären Matrix. Andere mögliche Matrizen sind biologisch nicht abbaubar und chemisch definiert wie z.B. gesintertes Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate oder andere Keramiken. Matrizen können aus Kombinationen von jedem der vorstehend erwähnten Arten von Material wie z.B. Polymilchsäure und Hydroxyapatit oder Kollagen und Tricalciumphosphat bestehen. Die Biokeramiken können in einer Zusammensetzung wie z.B. in Calcium-Aluminat-Phosphat verändert werden und verarbeitet werden, um die Porengröße, Partikelgröße, Partikelform und die biologische Abbaubarkeit zu verändern.
Der Fortschritt kann durch die periodische Beurteilung des Knochenwachstums und/oder der Knochenreparatur überwacht werden. Der Fortschritt kann zum Beispiel durch Röntgenstrahlen, histomorphometrische Bestimmungen und Markierung mit Tetracyclin überwacht werden.
Das Dosierungsschema wird durch den behandelnden Arzt bestimmt, der verschiedene Faktoren berücksichtigt, welche die Wirkung des BMP-11-Proteins beeinflussen, wie z.B. das Alter, Geschlecht und die Ernährungsweise des Patienten, die Schwere einer Infektion, der Zeitpunkt der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Die Dosis kann mit der Art des BMP-Proteins oder des Wachstumsfaktors, das/der in der Zusammenfassung vorhanden ist, variieren. Die Dosis kann ebenfalls mit der Art der verwendeten Matrix variieren.
Die nachfolgenden Beispiele zeigen die Durchführung der vorliegenden Erfindung bei der Gewinnung und Charakterisierung des Rinder-BMP-11-Proteins und bei seiner Verwendung zur Gewinnung des menschlichen BMP-11-Proteins und von anderen BMP-11-Proteinen, bei der Erhaltung des menschlichen Proteins und bei der Expression der Proteine mittels rekombinanter Techniken.
BEISPIEL 1
Rinder-BMP-11
800.000 rekombinante Moleküle einer Rinder-Genom-Bibliothek, die in dem Vektor λEMBL3 konstruiert ist, werden mit einer Dichte von 8000 Plaques rekombinanter Bakteriophagen pro Platte auf 100 Platten ausplattiert. Nitrocellulosekopien der Plaques der rekombinanten Bakteriophagen werden in Duplikaten von diesen Platten hergestellt und amplifiziert. Ein Fragment der menschlichen BMP-7-DNA, das den Nucleotiden #1081 bis #1403 (4, Vereinigte Staaten-Patent Nr.: 5,141,905) entspricht, wird mit ³²P durch das Zufalls-Priming-Verfahren von Feinberg et al. [Anal Biochem 132:6-13 (1983)] markiert und an eine Gruppe von Filtern in einem Standard-Hybridisierungspuffer (SHB) (5 × SSC, 0,170 SDS, 5 × Denhardt, 100 μg/ml Lachssperma-DNA) bei 60°C für 2 bis 3 Tage hybridisiert. Die Filter werden unter weniger stringenten Bedingungen (4 × SSC, 0,1% SDS bei 60°) gewaschen. Mehrere positive Hybridisierungs-Rekombinanten werden beobachtet. 52 positive hybridisierende Plaques der rekombinanten Bakteriophagen werden ausgewählt und erneut ausplattiert. Nitrocellulosekopien der rekombinanten Plaques werden in Duplikaten von diesen 52 zusätzlichen Platten hergestellt und amplifiziert. Eine Gruppe der Nitrocellulosefilter wird mit der menschlichen BMP-7-DNA-Sonde hybridisiert, wie vorstehend beschrieben wurde, und unter den gleichen, weniger stringenten Bedingungen gewaschen. Die andere Gruppe von Filtern wird mit einem Gemisch aus einer BMP-5-, BMP-6- und BMP-7-Sonde in SHB bei 65°C übernacht hybridisiert und mit einem 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C gewaschen (stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen). Die gemischte Sonde besteht aus relativ gleichen Mengen von ³²P markierten DNA-Fragmenten, welche die Nucleotide #1452 bis #2060 (4, Vereinigte Staaten-Patent Nr.: 5,106,748) der menschlichen BMP-5-Sequenz, die Nucleotide #1395 bis #1698 (4, Vereinigte Staaten-Patent Nr.: 5,187,076) der menschlichen BMP-6-Sequenz und die Nucleotide #1081 bis #1403 (4, Vereinigte Staaten-Patent Nr.: 5,141,905) der menschlichen BMP-7-Sequenz umfassen. Die BMP-5-, BMP-6- und BMP-7-DNA-Fragmente werden mittels des Zufalls-Priming-Verfahrens mit ³²P markiert und die gleiche Anzahl von Zählimpulsen pro Minute (ZpM) jeder Sonde werden kombiniert und zu dem SHB zugegeben, der die andere Gruppe der Kopien aus Nitrocellulosefilter der 52 zusätzlichen Platten enthält. 14 rekombinante Plaques, die positiv an die menschliche BMP-7-Sonde unter weniger stringenten Bedingungen hybridisierten und ein schwache oder keine Hybridisierung mit der gemischten BMP-5/6/7-Sonde unter hoch stringenten Bedingungen zeigten, werden für eine weitere Analyse ausgewählt. Jeder der 14 rekombinanten Plaques, die diese Hybridisierungskennzeichen zeigten, werden plaquegereinigt und Bakteriophagen-DNA wird von jedem hergestellt. Die positive Hybridisierungsregion von einem der 14 Rekombinanten, die diese Hybridisierungskennzeichen zeigen, die vorstehend beschrieben wurden, λ7r-30 genannt, liegt in einem 0,5 kb großem SacI-Restriktionsfragment. Dieses Fragment wird in einen Plasmidvektor (pGEM-3) subcloniert und eine DNA-Sequenz-Analyse wird durchgeführt. Die unvollständige DNA-Sequenz (SEQUENZ ID Nr.: 1) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQUENZ ID Nr.: 2) des Clons λ7r-30 werden in dem Sequenzprotokoll gezeigt.
Der Bakteriophage λ7r-30 wurde bei der ATCC am 7. April 1993 hinterlegt und bekam die Zugangsnummer ATCC 75439 zugeteilt. Diese Hinterlegung erfüllt die Erfordernisse unter dem Budapester Vertrag zur Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zecke des Patentverfahrens und der zugrundeliegenden Regulierungen.
Der λ7r-30-Clon codiert mindestens einen Teil des Rinder-BMP-11-Proteins der vorliegenden Erfindung. Die Nucleotidsequenz des Clons λ7r-30 enthält einen offenen Leserahmen von 456 Nucleotiden #246-701 der SEQ ID Nr.: 1. Die Nucleotidsequenz #324 bis #701 von SEQ ID Nr.: 1 definiert einen offenen Leserahmen von 378 Nucleotiden, die mindestens 126 Aminosäuren des C-terminalen Teils eines Rinder-BMP-11-Proteins codieren, wie durch die Ausrichtung mit anderen BMP-Proteinen und anderen Proteinen innerhalb der TGF-β-Familie bestimmt wurde. Die Nucleotidsequenz #246 bis #323 definiert einen offenen Leserahmen, der an der Sequenz angrenzt, welche das vorhergesagte 126 Aminosäuren große BMP-11-Peptid codiert, ein verminderter Grad der Aminosäurenidentität des Peptids, das von dieser Region der DNA-Sequenz (#246 bis #323) abgeleitet wird, zu anderen BMP-Proteinen und anderen Proteinen der TGF-β-Familie und die Anwesenheit von vielfachen möglichen Spleiß-Akzeptor-Konsensussequenzen macht es jedoch schwierig, die 5'-Grenze dieses Exons des Rinder-BMP-11-Gens zu definieren. Das Vorhandensein eines Stopp-Codons, das im Leserahmen liegt, an den Nucleotidpositionen #243 bis #245 deutet darauf hin, das die Nucleotidsequenz von Clon λ7r-30 mindestens eine Exon/Intron-Grenze des Rinder-BMP-11-Gens enthält.
Basierend auf dem Wissen über die anderen Proteine innerhalb der TGF-β-Familie wird vorhergesagt, dass das BMP-11-Vorläufer-Polypeptid an der Multibasen-Sequenz ARG-SER-ARG-ARG gemäß einer vorgeschlagenen Konsensussequenz zur proteolytischen Prozessierung von ARG-X-X-ARG gespalten wird. Es wird erwartet, dass die Spaltung des BMP-11-Vorläufer-Polypeptids ein 109 Aminosäuren großes, reifes Peptid erzeugt, das mit der Aminosäure ASN an Position #1 beginnt. Es wird erwartet, dass die Prozessierung von BMP-11 in die reife Form die Dimerisierung und die Entfernung der N-terminalen Region in einer Weise involviert, die analog zu der Prozessierung des verwandten Proteins TGF-β ist [Gentry et al., Molec & Cell Biol 8:4162 (1988); Derynck et al., Nature 316:701 (1985)].
Es wird daher in Betracht gezogen, dass die reife aktive Spezies von BMP-11 ein Homodimer von zwei Polypeptid-Untereinheiten umfasst, wobei jede Untereinheit die Aminosäuren #1 bis #109 mit einem vorhergesagtem Molekulargewicht von etwa 12.000 Dalton umfasst. Es werden weitere aktive Spezies in Betracht gezogen, welche die Aminosäuren #6 bis #109 umfassen, wobei sie den ersten konservierten Cysteinrest einschließen. Wie mit anderen Mitgliedern der TGF-β-Proteinfamilie zeigt die carboxy-terminale Region des BMP-11-Proteins eine größere Sequenzkonservierung als die eher am Amino-Ende gelegene Region. Die prozentuale Aminosäureidentität des BMP-11-Proteins in der Cystein reichen, C-terminalen Domäne (Aminosäuren #6 bis #109) zu der entsprechenden Region von anderen Proteinen innerhalb der TGF-β-Familie ist, wie nachfolgend beschrieben wird: BMP-2, 39%; BMP-3, 37%; BMP-4, 37%; BMP-5, 42%; BMP-6, 45%; BMP-7, 42%; BMP-8, 39%; BMP-9, 40%; Vgl, 39%; GDF-1, 34%; TGF-β1, 36%; TGF-β2, 38%; TGF-β3, 38%; Inhibin-β(B), 41 %; Inhibin-β(A), 39%.
BEISPIEL 2
Menschliches BMP-11
Es wird erwartet, dass das Rinder-BMP-11-Gen und das menschliche BMP-11-Gen deutlich homolog sind, weswegen die codierende Sequenz des Rinder-BMP-11 oder ein Teil davon als eine Sonde verwendet wird, um eine menschliche Genom-Bibliothek abzusuchen, oder als eine Sonde verwendet wird, um ein/e menschliche/s Zelllinie oder Gewebe zu identifizieren, welches das analoge menschliche Protein synthetisiert. Eine menschliche Genom-Bibliothek wie z.B. Stratagene-Katalog #944201 kann mit einer solchen Sonde abgesucht werden und vermutliche Positive werden isoliert und die DNA-Sequenz wird erhalten. Der Nachweis, dass diese Rekombinanten einen Teil des menschlichen BMP-11 codieren, vertraut auf die Homologien des Rinder/menschlichen Proteins und der Genstrukturen.
Wenn ein rekombinanter Bakteriophage, der DNA enthält, die einen Teil des menschlichen BMP-11-Moleküls codiert, erhalten wird, kann die menschliche codierende Sequenz als eine Sonde verwendet werden, um ein/e menschliche/s Zelllinie oder Gewebe zu identifizieren, die das BMP-11-mRNA synthetisiert. In einer anderen Ausführungsform kann die codierende Sequenz des Rinder-BMP-11 als eine Sonde verwendet werden, um ein/e solche/s menschliche/s Zelllinie oder Gewebe zu identifizieren. Kurz zusammengefasst, die RNA wird von einer ausgewählten Zelle oder Gewebequelle extrahiert und entweder elektrophoretisch auf einem Formaldehyd-Agarose-Gel aufgetrennt und auf Nitrocellulose transferiert oder man lässt sie mit Formaldehyd reagieren und trägt sie direkt auf Nitrocellulose auf. Die Nitrocellulose wird anschließend mit einer Sonde hybridisiert, die von einer codierenden Sequenz des Rinder-BMP-11 oder des menschlichen BMP-11 abgeleitet wird. In einer anderen Ausführungsform wird die codierende Sequenz des Rinder-BMP-11 verwendet, um Oligonucleotid-Primer zu entwerfen, die spezifisch einen Teil der codierenden Sequenz des BMP-11 amplifizieren, der in der Region zwischen den Primern gelegen ist, die verwendet werden, um die spezifische Amplifikationsreaktion durchzuführen. Es wird in Erwägung gezogen, dass die Sequenzen des Rinder-BMP-11 und des menschlichen BMP-11 ermöglichen, dass die entsprechende codierende Sequenz des menschlichen BMP-11 von mRNA, cDNA oder genomischen DNA-Matrizen spezifisch amplifiziert werden. Wenn eine positive Quelle durch eine der vorstehend beschriebenen Verfahren identifiziert wird, wird die mRNA durch Oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie ausgewählt und die cDNA wird synthetisiert und in λgt10 oder in andere λ-Bakteriophagen-Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind (das heißt λZAP), durch bekannte Verfahren (Toole et al., vorstehend) cloniert. Es ist ebenfalls möglich, die Oligonucleotid-Primer gerichtete Amplifikationsreaktion, die vorstehend beschrieben wurde, direkt an einer zuvor etablierten menschlichen cDNA- oder Genom-Bibliothek, die in einen λ-Bakteriophagen-Vektor cloniert wurde, durchzuführen. In solchen Fällen kann eine Bibliothek, die ein spezifisch amplifiziertes DNA-Produkt enthält, das einen Teil des menschlichen BMP-11-Proteins codiert, direkt abgesucht werden, wobei das Fragment der amplifizierten, BMP-11 codierenden DNA als eine Sonde verwendet wird.
Es wird erwartet, dass Oligonucleotid-Primer, die auf der Basis der DNA-Sequenz des genomischen Clons λ7r-30 des Rinder-BMP-11 entworfen werden, die spezifische Amplifikation der codierenden Sequenzen des menschlichen BMP-11 ermöglichen. Der nachfolgende Oligonucleotid-Primer wird auf der Basis der Nucleotide #501 bis #521 der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt wird, entworfen und in einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert.
Primer C: TAGTCTAGATGCTCCGGCCAGTGCGAGTAC
Die ersten neun Nucleotide des Primers C (unterstrichen) umfassen die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease XbaI, die verwendet werden kann, um die Manipulation einer spezifisch amplifizierten DNA-Sequenz, die das BMP-11-Protein der Erfindung codiert, zu erleichtern, und sind daher nicht von der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt wird, abgeleitet.
Der nachfolgende Oligonuclotid-Primer wird auf der Basis der Nucleotide #701 bis #678 der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt wird, entworfen und in einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert.
Primer D: TGCGGATCCGGAGCAGCCACAGCGATCCAC
Die ersten neun Nucleotide des Primers D (unterstrichen) umfassen die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease BamHI, die verwendet werden kann, um die Manipulation einer spezifisch amplifizierten DNA-Sequenz, die das BMP-11-Protein der Erfindung codiert, zu erleichtern, und sind daher nicht von der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt wird, abgeleitet.
Die Standardsymbole für Nucleotide in den vorstehend identifizierten Primern sind wie nachfolgend:
A, Adenosin, C, Cytosin, G, Guanin; und T, Thymin.
Die vorstehend identifizierten Primer C und D werden als Primer verwendet, um die Amplifikation eines spezifischen Nucleotids von der menschlichen genomischen DNA zu ermöglichen. Die Amplifikationsreaktion wird wie nachfolgend durchgeführt:
Menschliche genomische DNA (Quelle: periphere Blut-Lymphocyten) wird bei 100°C für 5 Minuten denaturiert und anschließend auf Eis abgekühlt, bevor sie zu einem Reaktionsgemisch zugegeben wird, das 200 μM von jedem Desoxynucleotid-Triphosphat (dATP, dGTP, dCTP und dTTP), 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% Gelatine, 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase, 100 pM Oligonucleotid-Primer C und 100 pM Oligonucleotid-Primer D enthält. Dieses Reaktionsgemisch wird anschließend Wärmezyklen in der nachfolgenden Weise ausgesetzt: 3 Minuten bei 94°C, 1 Minute bei 50°C, 1 Minute bei 72°C für einen Zyklus, anschließend 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C, 1 Minute bei 72°C für 39 Zyklen.
Die DNA, die durch diese Reaktion spezifisch amplifiziert wird, wird von den im Überschuss vorliegenden Oligonucleotid-Primern C und D, die verwendet werden, um die Amplifikation zu initiieren, durch die Verwendung eines auf einem DNA-Reinigungs-Harz basierenden Protokolls unter den Bedingungen, die vom Hersteller vorgeschlagen werden, getrennt. Das so erhaltene DNA-Produkt wird mit den Restriktionsendonucleasen XbaI und BamHI gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert. Der Pufferaustausch und die Entfernung von kleinen DNA-Fragmenten, die von der XbaI/BamHI-Restriktionsspaltung stammen, wird durch die Verdünnung des gespaltenen DNA-Produkts in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0; mM EDTA, gefolgt von einer Zentrifugation durch einen Centricon^TM-30-Mikroconcentrator (WR Grace & Co., Beverly, MA, Produkt #4209) erreicht. Das so erhaltene, XbaI/BamHI gespaltene, amplifizierte DNA-Produkt wird in einen Plasmid-Vektor (pBluescript) zwischen den XbaI- und BamHI-Restriktionsstellen der Polylinkerregion subcloniert. Die DNA-Sequenz-Analyse der so erhaltenen Subklone deutet darauf hin, dass das spezifisch amplifizierte DNA-Sequenzprodukt einen Teil des menschlichen BMP-11-Proteins dieser Erfindung codiert. Die DNA-Sequenz (SEQ ID Nr.: 3) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 4) dieses spezifisch amplifizierten DNA-Fragments wird im Sequenzprotokoll dargelegt.
Die Nucleotide #1 bis #27 dieser Sequenz umfassen einen Teil des Oligonucleotid-Primers C und die Nucleotide #186 bis #213 umfassen einen Teil des Oligonucleotid-Primers D, die verwendet werden, um die spezifische Amplifikationsreaktion durchzuführen. Aufgrund der Funktion der Oligonucleotid-Primer C und D (entwickelt auf der Basis der Rinder-BMP-11-DNA-Sequenz) bei der Initiation der Amplifikationsreaktion müssen sie nicht genau der eigentlichen Sequenz, die ein humanes BMP-11-Protein codiert, entsprechen und werden daher nicht in der vorstehenden Herleitung der Aminosäuresequenz translatiert. Die DNA-Sequenz von Nucleotid #28 bis #185 der SEQ ID Nr.: 3 oder Teile davon, die spezifisch von der menschlichen genomischen DNA-Matrize amplifiziert wurden, können als eine Sonde verwendet werden, um zusätzliche, menschliches BMP-11 codierende Sequenzen von menschlichen genomischen oder menschlichen cDNA-Bibliotheken durch Standard-Hybridisierungs/Absuchtechniken, die dem Fachmann bekannt sind, zu identifizieren.
1.200.000 Rekombinante einer menschlichen fötalen Gehirn-cDNA-Bibliothek (Stratagene-Katalog #936206), die in dem λZAPII-Vektor konstruiert wurde, wird mit einer Dichte von 24.000 Plaques der rekombinanten Bakteriophagen pro Platte auf 50 Platten ausplattiert. Nitrocellulosekopien in Duplikaten der rekombinanten Bakteriophagenplaques werden von diesen Platten hergestellt. Eine Oligonucleotidsonde, die auf der Basis der Nucleotide #53-#82 der SEQ ID Nr.: 3 entwickelt wurde, wird in einem automatisiertem DNA-Synthesegerät synthetisiert. Diese Oligonucleotid-Sonde wird mit λ³²P-ATP radioaktiv markiert und mit beiden Gruppen der Duplikate der Nitrozellulosekopien in SHB bei 65°C hybridisiert. Neun positive Hybridisierungsrekombinanten werden beobachtet. Eine der positiven Hybridisierungsrekombinanten, die λFB30.5 genannt wird, wird aus dem Plaque gereinigt. Bakteriophagen-Stammplatten des gereinigten λFB30.5-cDNA-Klons werden hergestellt und die Bakteriophagen-DNA wird isoliert. Ein Bakterien-Plasmid, das FB30.5 genannt wird und das durch das in-vivo-Ausschneide-Protokoll, das durch den Anbieter (Stratagene) beschrieben wird, hergestellt wird und das die gesamte Insertion des λFB30.5-Bacterionhagen-cDNA-Klons enthält, wurde bei der ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA unter den Erfordernisses des Budapester Vertrags hinterlegt und als ATCC # 69619 bezeichnet. Ein Teil der DNA-Sequenz des Clons FB30.5 wird in SEQ ID Nr.: 10 dargelegt.
1.000.000 Rekombinante einer menschlichen genomischen Bibliothek (Stratagene Katalog # 944201), die in dem λFIX-Vektor konstruiert wurde, wird mit einer Dichte von 20.000 Plaques rekombinanter Bakteriophagen pro Platte auf 50 Platten ausplattiert. Nitrocellulosekopien in Duplikaten der rekombinanten Bakteriophagenplaques werden von diesen Platten hergestellt. Eine Oligonucleotidsonde, die auf der Basis der Nucleotide #57-#86 der SEQ ID Nr.: 10 mit Ausnahme einer versehentlichen Substitution von CAC für GCG bei den Nucleotiden #59-#61 der SEQ ID Nr.: 10 entwickelt wurde, wird in einem automatisierten DNA-Synthesegerät synthetisiert. Diese Oligonucleotid-Sonde wird mit λ³²P-ATP radioaktiv markiert und mit beiden Gruppen der Duplikate der Nitrocellulosekopien in SHB bei 65°C hybridisiert. Fünf positive Hybridisierungsrekombinanten werden beobachtet. Eine der positiven Hybridisierungsrekombinanten, die 30GEN.4 genannt wird, wird aus dem Plaque gereinigt. Bakteriophagen-Stammplatten des gereinigten genomischen Clons 30GEN.4 werden hergestellt und die Bakteriophagen-DNA wird isoliert. Eine Bakteriophagenstammlösung dieses genomischen Clons wurden bei der ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA unter den Erfordernissen des Budapester Vertrags hinterlegt und als ATCC #75775 bezeichnet. Ein Teil der DNA-Sequenz des Clons 30GEN.4 ist in SEQ ID Nr.: 10 dargelegt. Es wurde nachgewiesen, dass ein Teil der DNA-Sequenz des genomischen Clons 30GEN.4 zu einem Teil der DNA-Sequenz des cDNA-Clons FB30.5 identisch ist. Der Umfang dieser Überlappung (Nucleotide #1-#198) von SEQ ID Nr.: 10 wurde als eine Grundlage verwendet, um die unvollständige codierende Sequenz des BMP-10- Proteins zu erarbeiten. Es wird erwartet, dass der genomische Klon 30GEN.4 zusätzliche 5'-codierende Sequenzen des menschlichen BMP-11-Proteins enthält, von denen erwartet wird, dass sie den Rest des Vorläuferproteins von BMP-11 codieren, einschließlich des Initiator-Methionins. Die Teilsequenz des menschlichen BMP-11 wird in SEQ ID Nr.: 10 dargestellt und es sollte beachtet werden, dass nachgewiesen wurde, dass die Nucleotide #1-#198 sowohl im genomischen Clon 30GEN.4 als auch in dem cDNA-Clon FB30.5 vorhanden sind, während die Nucleotide #199-#1270 ausschließlich von dem cDNA-Clon FB30.5 abgeleitet sind. SEQ ID Nr.: 10 sagt ein menschliches BMP-11-Vorläuferprotein mit einer Länge von mindestens 362 Aminosäuren vorher.
Basierend auf dem Wissen über andere BMPs und anderer Proteine innerhalb der TGF-β-Familie wird vorhergesagt, dass das Vorläuferpolypeptid an der Multibasensequenz ARG-SER-ARG-ARG (Aminosäuren #-4 bis #-1 von SEQ ID Nr.: 11) gemäß der vorgeschlagenen Konsensussequenz zur proteolytischen Prozessierung von ARG-X-X-ARG gespalten wird. Die Spaltung des menschlichen Vorläuferpolypeptids von BMP-11 an dieser Stelle würde ein 109 Aminosäuren großes, reifes Peptid erzeugen, das mit der Aminosäure ASN an Position #1 von SEQ ID Nr.: 11 beginnt. Es wird erwartet, dass die Prozessierung des menschlichen BMP-11 in die reife Form eine Dimerisierung und das Entfernen der N-terminalen Region in einer Weise involviert, die analog zur der Prozessierung des verwandten Proteins TGF-β ist [LE Gentry et al., Molec & Cell Biol 8:4162 (1988); R Derynck et al., Nature 316:701 (1985)]. Es wird in Erwägung gezogen, dass die reife aktive Spezies des menschlichen BMP-11 ein Homodimer von zwei Polypeptid-Untereinheiten umfasst, wobei jede Untereinheit die Aminosäuren #1-#108 von SEQ ID Nr.: 11 mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 12.000 Dalton umfasst. Es wird in Erwägung gezogen, dass weitere aktive Spezies die Aminosäuren #7-#108 von SEQ ID Nr.: 11 umfassen, wodurch sie den ersten konservierten Cysteinrest umfassen. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass heterodimere Moleküle eine Untereinheit von BMP-11 und eine andere Untereinheit eines anderen Mitglieds der BMP/TGF-β-Superfamilie umfassen.
BEISPIEL 3
Expression von BMP-11
Um BMP-11-Proteine von Rind, Mensch oder anderen Säugern herzustellen, wird die codierende DNA in einen geeigneten Expressionsvektor übertragen und in Säugerzellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte durch konventionelle Verfahren der Gentechnik eingebracht. Es wird in Erwägung gezogen, dass das bevorzugte Expressionssystem für biologisch aktives, rekombinantes menschliches BMP-11 stabil transformierte Säugerzellen sind.
Ein Fachmann kann durch die Verwendung der Sequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 oder von anderen DNA-Sequenzen, die BMP-11-Proteine codieren, oder von anderen modifizierten Sequenzen und bekannten Vektoren wie z.B. pCD (Okayama et al., Mol Cell Biol 2:161-170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J 4:645-653 (1985)] und pMT2 CXM Säuger-Expressionsvektoren konstruieren.
Der Säuger-Expressionsvektor pMT2 CXM ist ein Derivat von p91023 (b) [Wong et al., Science 228:810-815 (1985)], wobei er sich von diesem darin unterscheidet, dass er das Ampicillin-Resistenzgen anstelle des Tetracyclin-Resistenzgens enthält und des weiteren eine XhoI-Stelle zur Insertion von cDNA-Clonen enthält. Die funktionellen Elemente von pMT2 CXM wurden beschrieben [Kaufmann RJ, Proc Natl Acad Sci USA 82:689-693 (1985)] und schließen Gene des Adenovirus VA, den SV40-Replikationsursprung einschließlich des 72 bp-Enhancers, den späten Adenovirus-Hauptpromotor einschließlich einer 5'-Spleißstelle und den größten Teil der dreiteiligen Adenovirus-Leader-Sequenz, die auf späten mRNAs von Adenoviren vorhanden ist, eine Spleiß-Akzeptorstelle, eine DHFR-Insertion, die frühe SV40-Polyadenylierungsstelle (SV40) und die pBR322-Sequenzen, die zur Vermehrung in E. coli benötigt werden, ein.
Das Plasmid pMT2 CM wird durch die Spaltung mit EcoRI des pMT2-VWF erhalten, der bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA unter der Zugangsnummer ATCC #67122 hinterlegt wurde. Die Spaltung mit EcoRI schneidet die cDNA-Insertion heraus, die im pMT2-VWF enthalten ist, wobei pMT2 in einer linearen Form erhalten wird, die ligiert werden und verwendet werden kann, um E. coli HB101 oder DH-5 zum Erhalt einer Resistenz gegen Ampicillin zu transformieren. Die pMT2-Plasmid-DNA kann durch konventionelle Verfahren hergestellt werden. PMT2 CXM wird anschließend konstruiert, wobei die Loopout/In- Mutagenese verwendet wird [Morinaga et al., Biotechnology 84:636 (1984)]. Dies entfernt die Basen 1075 bis 1145 relativ zu der HindIII-Stelle in der Nähe des SV40-Replikationsursprungs und der Enhancer-Sequenzen von pMT2. Zusätzlich wird die nachfolgende Sequenz bei Nucleotid 1145 eingefügt:
5' PO-CATGGGCAGCTCGAG-3'
Diese Sequenz enthält die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease XhoI. Ein Derivat von pMT2 CXM, pMT23 genannt, enthält die Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen PstI, EcoRI, SalI und XhoI. Die Plasmid-DNA von pMT2 CXM und pMT23 können durch konventionelle Verfahren hergestellt werden.
pEMC2β1, das von pMT21 abgeleitet ist, kann ebenfalls bei der Anwendung der Erfindung geeignet sein. pMT21 ist von pMT2 abgeleitet, das seinerseits von pMT2-VWF abgeleitet ist. Wie vorstehend beschrieben wurde, schneidet die Spaltung mit EcoRI die cDNA-Insertion in pMT-VWF heraus, wodurch pMT2 in einer linearen Form erhalten wird, die ligiert werden und verwendet werden kann, um E. coli HB101 oder DH-5 für den Erhalt einer Resistenz gegen Ampicillin zu transformieren. Die pMT2-Plasmid-DNA kann durch konventionelle Verfahren hergestellt werden.
pMT21 wird von pMT2 durch die nachfolgenden zwei Modifikationen abgeleitet. Zuerst werden 76 bp der nicht translatierten 5'-Region der DHFR-cDNA, die eine Ausdehnung von 19 G-Resten vom G/C-End für die Clonierung der cDNA einschließt, deletiert. In diesem Verfahren wird eine XhoI-Stelle eingebracht, um die nachfolgende Sequenz direkt stromaufwärts von DHFR zu erhalten:
Als zweites wird eine einzigartige ClaI-Stelle durch die Spaltung mit EcoRV und XbaI, Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und Ligierung an einen ClaI-Linker (CATCGATG) eingeführt. Dieses deletiert ein 250 bp großes Segment von der Adenovirus assoziierten RNA (VAI)-Region, aber behindert nicht die Genexpression oder Funktion der VAI-RNA. pMT21 wird mit EcoRI und XhoI gespalten und verwendet, um den Vektor pEMC2B1 abzuleiten.
Ein Teil des EMCV-Leaders wird von pMT2-ECAT1 [SK Jung et al., J Virol 63:1651-1660 (1989)] durch die Spaltung mit EcoRI und PstI erhalten, was zu einem 2752 p großem Fragment führt. Dieses Fragment wird durch TaqI gespalten, was ein EcoRI-TagI-Fragment von 508 bp ergibt, das durch Elektrophorese in einem Agarosegel mit einem niedrigen Schmelzpunkt gereinigt wird. Ein 68 bp großer Adapter und sein komplementärer Strang werden mit einem vorstehenden 5'-TapI-Ende und einem vorstehenden 3'-XhoI-Ende synthetisiert, der die nachfolgende Sequenz besitzt:
Diese Sequenz entspricht der EMC-Virus-Leader-Sequenz von Nucleotid 763 bis 827. Sie ändert ebenfalls das ATG an Position 10 innerhalb des EMC-Virus-Leaders zu einem ATT und wird gefolgt von einer XhoI-Stelle. Eine Drei-Wege-Ligierung des pMT21-EcoRI-XhoI-Fragments, des EMC-Virus-EcoRI-TagI-Fragments und des 68 bp großen Oligonucleotid-TagI-XhoI-Adapters führt zu dem Vektor pEMC2β1.
Dieser Vektor enthält den SV40-Replikationsursprung und den Enhancer, den späten Adenovirus-Haupt-Promotor, eine cDNA-Kopie des Hauptteils der dreiteiligen Adenovirus-Leader-Sequenz, eine kleine Hybrid-Zwischensequenz, ein SV40-Polyadenylierungssignal und das Adenovirus-VA 1-Gen, die DHFR- und β-Lactamase-Markierungen und eine EMC-Sequenz in geeigneten Verhältnissen, um den hohen Expressionsspiegel der gewünschten cDNA in Säugerzellen zu steuern.
Der Aufbau der Vektoren kann die Modifizierung der BMP-11-DNA-Sequenzen involvieren. Die BMP-11-cDNA kann zum Beispiel durch das Entfernen der nicht codierenden Nucleotide an den 5'- und 3'-Enden der codierenden Region modifiziert werden. Die deletierten, nicht codierenden Nucleotide können durch andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie für die Expression nützlich sind, ausgetauscht werden oder nicht. Diese Vektoren werden in geeignete Wirtszellen für die Expression der BMP-11-Proteine transformiert. Zusätzlich kann die Sequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 oder von anderen Sequenzen, die BMP-11-Proteine codieren, manipuliert werden, um ein reifes BMP-11-Protein zu exprimieren, indem die BMP-11 codierenden Propeptid-Sequenzen deletiert werden und sie durch Sequenzen ausgetauscht werden, die das vollständige Propeptid von anderen BMP-Proteinen, Activin-Proteinen oder anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie codieren.
Der Fachmann kann die Sequenzen von SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 10 durch die Entfernung oder durch den Austausch der regulatorischen Sequenzen der Säuger, welche die codierende Sequenz flankieren, durch bakterielle Sequenzen manipulieren, um bakterielle Vektoren für die intrazelluläre oder die extrazelluläre Expression durch bakterielle Zellen zu erzeugen. Die codierenden Sequenzen können zum Beispiel weiter manipuliert werden (z.B. an andere bekannte Linker ligiert oder durch die Deletion von nicht codierenden Sequenzen davon oder durch die Veränderung von Nucleotiden davon durch andere bekannte Techniken modifiziert werden). Die modifizierte BMP-11 codierende Sequenz kann anschließend in einen bekannten bakteriellen Vektor eingebracht werden, wobei Verfahren verwendet werden, wie sie z.B. in T. Taniguchi et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:5230-5233 (1980) beschrieben werden. Dieser beispielhafte bakterielle Vektor kann anschließend in bakterielle Wirtszellen transformiert werden und ein BMP-11-Protein kann dadurch exprimiert werden. Für eine Strategie für die Herstellung einer extrazellulären Expression von BMP-11-Proteinen in bakteriellen Zellen, vergl. z.B. die Europäische Patentanmeldung EPA 177,343.
Ähnliche Manipulationen können für den Aufbau eines Insektenvektors für die Expression in Insektenzellen durchgeführt werden [Vergl. z.B. die Verfahren, die in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 155,476 beschrieben wurden]. Ein Hefevektor kann ebenfalls aufgebaut werden, wobei regulatorische Sequenzen der Hefe für die intrazelluläre oder extrazelluläre Expression der Faktoren der vorliegenden Erfindung durch die Hefezellen verwendet werden [Vergl. z.B. die Verfahren, die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 86/00639 und der Europäischen Patentanmeldung EPA 123,289 beschrieben wurden].
Ein Verfahren zur Herstellung von großen Mengen eines BMP-11-Proteins der Erfindung in Säugerzellen kann den Aufbau der Zellen involvieren, die mehrere Kopien der heterologen BMP-11-Gene enthalten. Das heterologe Gen wird an eine Markierung, die amplifiziert werden kann, gebunden, wie z.B. das Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-Gen, auf die die Zellen, die eine erhöhte Anzahl von Genkopien enthalten, durch die Vermehrung in steigenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) gemäß der Verfahren von Kaufmark und Sharp, J Mol Biol 159:601-629 (1982), selektiert werden können. Dieser Ansatz kann bei einer Anzahl von unterschiedlichen Zellarten angewendet werden.
Ein Plasmid, das eine DNA-Sequenz für ein BMP-11 der Erfindung in einer funktionellen Bindung mit anderen Plasmidsequenzen enthält, welche die Expression davon ermöglichen und das DHFR-Expressionsplasmid pAdA6SV(A)3 [Kaufman and Sharp, Mol Cell Biol 2:1304 (1982)] können in DHFR defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII, durch verschiedene Verfahren einschließlich der Calcium-Phosphat-Kopräzipitation und der Transfektion, Elektroporation oder Protoplasten-Fusion gemeinsam eingebracht werden. DHFR exprimierende Transformanten werden auf Wachstum in Alpha-Medium mit dialysiertem fötalem Kälberserum selektiert und anschließend auf Amplifikation auf Wachstum in steigenden Konzentrationen von MTX (z.B. durch sequentielle Schritte in 0,02, 0,2, 1,0 und 5 μM MTX) selektiert, wie in Kaufman et al. Mol Cell Biol 5:1750 (1983) beschrieben wurde. Die Transformanten werden cloniert und die biologisch aktive BMP-11-Expression wird durch eine oder durch mehrere BMP-11-Aktivitätsanalysen überwacht, wie in den nachfolgenden Beispielen 5 bis 8 beschrieben wird. Die BMP-11-Expression sollte mit steigendem Grad der MTX-Resistenz steigen. Die BMP-11-Polypeptide werden charakterisiert, wobei Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie z.B. die Puls-Markierung mit [35-S]-Methionin oder -Cystein und die Polyacrylamidgelelektrophorese verwendet werden. Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um andere verwandte BMP-11-Proteine herzustellen.
BEISPIEL 4
Biologische Aktivität der Expression von BMP-11
Um die biologische Aktivität der exprimierten BMP-11-Proteine zu messen, die in dem vorstehenden Beispiel 3 erhalten wurden, werden die Proteine von der Zellkultur gewonnen und durch die Isolation der BMP-11-Proteine von anderen proteinartigen Substanzen, mit denen sie zusammen hergestellt werden, sowie von anderen kontaminierenden Stoffen gereinigt. Das gereinigte Protein kann gemäß der Analysen für die BMP-11-Aktivität, die nachfolgend in den Beispielen 5 bis 8 beschrieben werden, analysiert werden.
BEISPIEL 5
W-20-Bioanalysen
A. Beschreibung der W-20-Zellen
Die Verwendung der Knochenmark-Stromazellen W-20 als eine Indikator-Zelllinie basiert auf der Umformung dieser Zellen zu osteoblastenähnlichen Zellen nach der Behandlung mit einem BMP-Protein [Thies et al., Journal of Bone and Mineral Research 1:305 (1990); und Thies et al., Endocrinology 130:1318 (1992)]. W-20-Zellen sind genaugesagt eine clonierte Knochenmark-Stromazelllinie, die von adulten Mäusen von Wissenschaftlern im Labor von Dr. D. Nathan, Children's Hospital, Boston, MA, abgeleitet wurde. Die Behandlung von W-20-Zellen mit bestimmten BMP-Proteinen führt (1) zu einer erhöhten Herstellung der alkalischen Phosphatase, (2) zur Induktion von PTH stimuliertem cAMP und (3) zur Induktion der Synthese von Osteocalcin durch die Zellen. Während (1) und (2) Kennzeichen repräsentieren, die mit dem Phänotyp des Osteoblasten assoziiert sind, ist die Fähigkeit, Osteocalcin zu synthetisieren, eine phänotypische Eigenschaft, die nur von reifen Osteoblasten gezeigt wird. Des weiteren wurde die Umformung der Stromazellen W-20 zu osteoblastenähnlichen Zellen von uns nur nach der Behandlung mit BMPs beobachtet. In dieser Weise korrelieren die in vitro gezeigten Aktivitäten der BMP behandelten W-20-Zellen mit der knochenbildenden in vivo-Aktivität, die für BMPs bekannt ist.
Nachfolgend werden zwei in-vitro-Analysen, die für den Vergleich von BMP-Aktivitäten von neuen knocheninduzierenden Molekülen nützlich sind, beschrieben.
B. Alkalische Phosphatase-Analyse-Protokoll für W-20-Zellen
W-20-Zellen werden in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung in 200 μl Medium (DME mit 10% Hitze inaktiviertem, fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 100 Einheiten/ml Penicillin + 100 μg/ml Streptomycin) ausplattiert. Man lässt die Zellen übernacht in einem 95% Luft, 5% CO₂ Inkubator bei 37°C sich festsetzen.
Die 200 μl Medium werden von jeder Vertiefung mit einer Multikanal-Pipette entfernt und mit dem gleichen Volumen der Testprobe, die in DME mit 10% Hitze inaktiviertem, fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin verabreicht wird, ersetzt. Die Testsubstanzen werden in dreifach analysiert.
Man lässt die Testsubstanzen und Standards für einen Zeitraum von 24 Stunden mit den W-20-Indikatorzellen inkubieren. Nach den 24 Stunden werden die Platten von dem 37°C-Inkubator entfernt und die Testmedien werden von den Zellen entfernt.
Die W-20-Zellschichten werden dreimal mit 200 μl pro Vertiefung einer Calcium/Magnesium freien Phosphat gepufferten Kochsalzlösung gewaschen und diese Waschlösungen werden verworfen.
50 μl von Glas destilliertem Wasser werden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Analyseplatten werden anschließend für ein schnelles Einfrieren in ein Trockeneis/Ethanol-Bad gestellt. Sobald die Analyseplatten gefroren sind, werden sie aus dem Trockeneis/Ethanol-Bad entfernt und bei 37°C aufgetaut. Dieser Schritt wird 2 weitere Male für insgesamt 3 Einfrier-Auftau-Zyklen wiederholt. Wenn dieses vollständig durchgeführt wurde, ist die Membran gebundene alkalische Phosphatase zur Messung benutzbar.
50 μl eines Analysegemisches (50 mM Glycin, 0,05% Triton-X-100, 4 mM MgCl₂, 5 mM p-Nitrophenolphosphat, pH-Wert = 10,3) werden zu jeder Analyse-Vertiefung zugegeben und die Analyse-Platten werden anschließend für 30 Minuten bei 37°C in einem Schüttelwasserbad bei 60 Schwingungen pro Minute inkubiert.
Am Ende der Inkubationszeit von 30 Minuten wird die Reaktion durch die Zugabe von 100 μl 0,2 N NaOH in jede Vertiefung und Stellen der Analyse-Platten auf Eis beendet.
Die spektrophotometrische Absorption wird für jede Vertiefung bei einer Wellenlänge von 405 Nanometer gemessen. Diese Werte werden anschließend mit bekannten Standardwerten verglichen, um eine Schätzung der Aktivität der alkalischen Phosphatase in jeder Probe zu geben. Zum Beispiel werden die Absorptionswerte erzeugt, indem bekannte Mengen von p-Nitrophenolphosphat verwendet werden. Dies wird in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle I
Die Absorptionswerte für bekannte Mengen von BMPs können bestimmt und in μMol p-Nitrophenolphosphat, das pro Zeiteinheit gespalten wird, umgerechnet werden, wie in Tabelle II gezeigt wird.
Tabelle II
Diese Werte werden anschließend verwendet, um die Aktivitäten von bekannten Mengen von BMP-11 bis BMP-2 zu vergleichen.
C. Osteocalcin-RIA-Protokoll
W-20-Zellen werden mit 10⁶ Zellen pro Vertiefung in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen in 2 ml DME, das 10% hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin enthält, ausplattiert. Man lässt die Zellen übernacht in einer Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO₂ bei 37°C sich festsetzen.
Am nächsten Tag wird das Medium gegen DME, das 10% hitzeinaktiviertes, fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und die Testsubstanz enthält, mit einem Gesamtvolumen von 2 ml ausgetauscht. Jede Testsubstanz wird den Dreifach-Vertiefungen verabreicht. Die Testsubstanzen werden mit den W-20-Zellen für eine Gesamtzeit von 96 Stunden inkubiert, wobei ein Austausch mit den gleichen Test-Medien nach 48 Stunden durchgeführt wird.
Am Ende der 96 Stunden werden 50 μl des Testmediums von jeder Vertiefung entnommen und auf die Herstellung von Osteocalcin untersucht, wobei eine Radioimmunanalyse für Osteocalcin der Maus verwendet wird. Die genauen Angaben der Analyse werden in dem Kit, der von Biomedical Technologies Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072, hergestellt wird, beschrieben. Die Reagenzien für die Analyse werden als die Produktnummern BT-431 (Standard für Osteocalcin der Maus), BT-432 (Ziege-anti-Maus-Osteocalcin), BT-431 R (jodiniertes Osteocalcin der Maus), BT-415 (normales Serum der Ziege) und BT-414 (Esel-anti-Ziege-IgG) gefunden. Das RIA-Protokoll für Osteocalcin, das von den W-20-Zellen als Antwort auf die Behandlung mit BMP synthetisiert wird, wird durchgeführt, wie in dem Protokoll beschrieben wird, das von dem Hersteller zur Verfügung gestellt wird.
Die Werte, die für die Testproben erhalten wurden, werden mit den Werten für bekannte Standards von Osteocalcin der Maus und den Mengen Osteocalcin, das von den W-20-Zellen als Antwort auf die Herausforderung mit bekannten Mengen BMP-2 hergestellt wird, verglichen. Die Werte der BMP-2 induzierten Synthese von Osteocalcin durch die W-20-Zellen werden in Tabelle III gezeigt.
Tabelle III
BEISPIEL 6
Rosen-modifizierte Sampath-Reddi-Analyse
Eine modifizierte Version der Erzeugungsanalyse von Rattenknochen, die in Sampath und Reddi, Proc Natl Acad Sci USA 80:6591-6595 (1983) beschrieben wurde, wird verwendet, um die induzierende Aktivität von BMP-11-Proteinen auf Knochen, Knorpel und/oder anderes Bindegewebe zu beurteilen. Diese modifizierte Analyse wird hierin als Rosen-modifizierte Sampath-Reddi-Analyse bezeichnet. Der Ethanol-Präzipitationsschritt des Sampath-Reddi-Verfahrens wird durch die Dialyse (wenn die Zusammensetzung eine Lösung ist) oder durch eine Diafiltrierung (wenn die Zusammensetzung eine Suspension ist) der Fraktion, die analysiert werden soll, gegen Wasser ersetzt. Die Lösung oder Suspension wird anschließend mit 0,1% TFA äquilibriert. Die so erhaltene Lösung wird anschließend zu 20 mg einer Rattenmatrix gegeben. Eine Pseudo-Rattenmatrixprobe, die nicht mit dem Protein behandelt wird, dient als Kontrolle. Dieses Material wird gefroren und lyophilisiert und das so erhaltene Pulver wird in #5-Gelatinekapseln eingeschlossen. Die Kapseln werden subkutan in die abdominale Brustregion von 21-49 Tage alten, männlichen Long Evans-Ratten implantiert. Die Implantate werden nach 7-14 Tage entfernt. Die Hälfte von jedem Implantat wird für die Analyse der alkalischen Phosphatase verwendet [vergl. Reddi et al., Proc Natl Acad Sci 69:1601 (1972)].
Die andere Hälfte von jedem Implantat wird fixiert und für eine histologische Analyse weiter verarbeitet. 1 μm Glycolmethacrylat-Schnitte werden mit Von-Kossa und saurem Fuschin gefärbt, um die Menge der induzierten Knochen- oder Knorpelerzeugung, die in jedem Implantat vorhanden ist, zu beurteilen. Die Ausdrücke +1 bis +5 repräsentieren das Gebiet jedes histologischen Schnitts von einem Implantat, das durch neue Knochen und/oder Knorpelzellen und Matrix besetzt ist. Eine Bewertung von +5 bedeutet, dass mehr als 50% des Implantats aus neuem Knochen und/oder Knorpel besteht, der als eine direkte Folge des Proteins in dem Implantat hergestellt wurde. Eine Bewertung von +4, +3, +2 und +1 würde bedeuten, dass mehr als 40%, 30%, 20% beziehungsweise 10% des Implantats neuen Knorpel und/oder Knochen enthält.
Die BMP-11-Proteine dieser Erfindung können nach ihrer Aktivität mittels dieser Analyse beurteilt werden.
BEISPIEL 7
Biologische Aktivität von exprimiertem BMP-11
Um die biologische Aktivität von den exprimierten BMP-11-Proteinen, die vorstehend in Beispiel 3 erhalten wurden, zu messen, werden die Proteine aus der Zellkultur gewonnen und durch die Isolation der BMP-11-Proteine von anderen proteinartigen Substanzen, mit denen sie zusammen hergestellt werden, sowie von anderen kontaminierenden Stoffen gereinigt. Das gereinigte Protein kann gemäß der Erzeugungsanalyse von Rattenknochen, die in Beispiel 6 beschrieben wurde, analysiert werden.
Die Reinigung wird unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt.
Die Proteinanalyse wird durchgeführt, wobei Standardtechniken wie z.B. Acrylamid-SDS-PAGE [Laemmli, Nature 227:680 (1970)], Silberfärbung [Oakley et al., Anal Biochem 105:361 (1980)] und Immunblot-Verfahren [Towbin et al., Proc Natl Acad Sci USA 76:4350 (1979)] verwendet werden.
Die vorstehenden Beschreibungen schildern ausführlich die derzeitig bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Es wird erwartet, dass zahlreiche Modifikationen und Variationen bei deren Anwendung durch den Fachmann nach Berücksichtigung dieser Beschreibungen vorgenommen werden.
Man geht davon aus, dass diese Modifikationen und Variationen im Umfang der hieran angehängten Ansprüche eingeschlossen sind.
BEISPIEL 8
Tests zur Bestimmung der Activin-Aktivität von BMP-11
Die Reinigung wird durchgeführt, wobei Standardtechniken verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Es wird in Erwägung gezogen, dass die Reinigung wie bei den anderen Proteinen der TGF-β-Superfamilie die Verwendung von Heparin-Sepharose einschließen kann.
Die Proteinanalyse wird durchgeführt, wobei Standardtechniken wie z.B. Acrylamid-SDS-PAGE [Laemmli, Nature 227:680 (1970)], Silberfärbung [Oakley et al., Anal Biochem 105:361 (1980)] und Immunblot-Verfahren [Towbin et al., Proc Natl Acad Sci USA 76:4350 (1979)] verwendet werden.
BMP-11-Proteine können weiter durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet werden, die Freisetzung des Follikel stimulierenden Hormons (FSH) in etablierten in-vitro-Bioanalysen zu modulieren, wobei die Zellen der vorderen Hypophyse von Ratten verwendet werden, wie zum Beispiel in Vale et al., Endocrinology 91:562-572 (1972); Ling et al., Nature 321:779-782 (1986) oder Vale et al., Nature 321:76-79 (1986) beschrieben wird, wobei die Offenbarungen daraus hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
In einer anderen Ausführungsform kann BMP-11 durch seine Fähigkeit gekennzeichnet werden, Erythropoietin-Aktivität in der menschlichen Zelllinie K-562 zu stimulieren, wie von Lozzio et al., Blood 45:321-334 (1975) und in dem Vereinigten Staaten-Patent Nr.: 5,071834, Spalte 15, beschrieben wird, wobei die Offenbarungen daraus hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Zusätzlich kann BMP-11 durch seine Aktivität in Zell-Überlebensanalysen gekennzeichnet werden, wie in Schubert, Nature 344:868-870 (1990), beschrieben wird, wobei die Offenbarung daraus durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Die vorstehenden Beschreibungen schildern ausführlich die derzeitigen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Es wird erwartet, dass zahlreiche Modifikationen und Variationen bei deren Anwendung durch den Fachmann nach Berücksichtigung dieser Beschreibungen vorgenommen werden.
Man geht davon aus, dass diese Modifikationen und Variationen im Umfang der hieran angehängten Ansprüche eingeschlossen sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Förderung des Überlebens neuronaler Zellen in vitro, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung, die ein gereinigtes BMP-11-Polypeptid umfasst, an eine Zelle, wobei das BMP-11-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer DNA-Sequenz codiert wird, ausgewählt aus: (a) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotide 375 oder 390 bis 701 von SEQ ID NO: 1; (b) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotide 760 oder 775 bis 1086 von SEQ ID NO: 10; (c) DNA-Sequenzen, welche dieselbe Aminosäuresequenz wie die DNA-Sequenzen von (a) oder (b) codieren; (d) natürlich vorkommenden allelischen Variationen der DNA-Sequenz von (a) oder (b), die ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codieren; und (e) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit den DNA-Sequenzen von (a), (b) oder (c) hybridisieren und ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das BMP-11-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer DNA-Sequenz codiert wird, ausgewählt aus: (a) den Nucleotiden 375 oder 390 bis 701 von SEQ ID NO: 1; (b) den Nucleotiden 760 oder 775 bis 1086 von SEQ ID NO: 10; (c) DNA-Sequenzen, welche dieselbe Aminosäuresequenz wie die DNA-Sequenzen von (a) oder (b) codieren; (d) natürlich vorkommenden allelischen Variationen der DNA-Sequenz von (a) oder (b), die ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codieren; und (e) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit den DNA-Sequenzen von (a), (b) oder (c) hybridisieren und ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das BMP-11-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus: (a) einer Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 108 von SEQ ID NO: 11; (b) einer Aminosäuresequenz von Aminosäure 7 bis 108 von SEQ ID NO: 11; (c) einer Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 109 von SEQ ID NO: 11; und (d) einer Aminosäuresequenz von Aminosäure 6 bis 109 von SEQ ID NO: 11.
Verwendung eines BMP-11-Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands, wobei der Zustand durch eine Verringerung des neuronalen Überlebens charakterisiert ist, und wobei das BMP-11-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer DNA-Sequenz codiert wird, ausgewählt aus: (a) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotide 375 oder 390 bis 701 von SEQ ID NO: 1; (b) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotide 760 oder 775 bis 1086 von SEQ ID NO: 10; (c) DNA-Sequenzen, welche dieselbe Aminosäuresequenz wie die DNA-Sequenzen von (a) oder (b) codieren; (d) natürlich vorkommenden allelischen Variationen der DNA-Sequenz von (a) oder (b), die ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codieren; und (e) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit den DNA-Sequenzen von (a), (b) oder (c) hybridisieren und ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codieren.
Verwendung eines BMP-11-Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments zur Förderung des neuronalen Überlebens bei der Transplantationsbehandlung, wobei das BMP-11-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer DNA-Sequenz codiert wird, ausgewählt aus: (a) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotide 375 oder 390 bis 701 von SEQ ID NO: 1; (b) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotide 760 oder 775 bis 1086 von SEQ ID NO: 10; (c) DNA-Sequenzen, welche dieselbe Aminosäuresequenz wie die DNA-Sequenzen von (a) oder (b) codieren; (d) natürlich vorkommenden allelischen Variationen der DNA-Sequenz von (a) oder (b), die ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codieren; und (e) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit den DNA-Sequenzen von (a), (b) oder (c) hybridisieren und ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codieren.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, wobei das BMP-11-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer DNA codiert wird, ausgewählt aus: (a) den Nucleotiden 375 oder 390 bis 701 von SEQ ID NO: 1; (b) den Nucleotiden 760 oder 775 bis 1086 von SEQ ID NO: 10; und (c) DNA-Sequenzen, welche dieselbe Aminosäuresequenz wie die DNA-Sequenzen von (a) oder (b) codieren.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, wobei das BMP-11-Polypeptid ein Dimer ist.
BMP-11-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus: (a) einer Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis 108 von SEQ ID NO: 11; und (b) einer Aminosäuresequenz von Aminosäure 7 bis 108 von SEQ ID NO: 11.
BMP-11-Polypeptid, umfassend ein Homodimer von zwei Polypeptiduntereinheiten, wobei jede Untereinheit die Aminosäuren 7 bis 108 von SEQ ID NO: 11 umfasst.
BMP-11-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die von einer DNA-Sequenz codiert wird, ausgewählt aus: (a) den Nucleotiden 375 oder 390 bis 701 von SEQ ID NO: 1; (b) den Nucleotiden 760 oder 775 bis 1086 von SEQ ID NO: 10; und (c) natürlich vorkommenden allelischen Sequenzen und äquivalenten, degenerativen Codon-Sequenzen von (a) und (b) zur Verwendung als Medikament.
BMP-11-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus: (a) einer Aminosäuresequenz von -17 bis -1 von SEQ ID NO: 2; (b) einer Aminosäuresequenz von -253 bis -1 von SEQ ID NO: 11; (c) einer Aminosäuresequenz, die von der Sequenz der Nucleotide 1 bis 759 von SEQ ID NO: 10 codiert wird; (d) einer Aminosäuresequenz, die von natürlich vorkommenden allelischen Sequenzen und äquivalenten, degenerativen Codon-Sequenzen der Nucleotidsequenz von (c) codiert wird; und (e) einer Aminosäuresequenz, die von einer DNA-Sequenz codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz von (c) hybridisiert und ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codiert.
BMP-11-Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt von: (a) einer Aminosäuresequenz von -17 bis -1 von SEQ ID NO: 2; (b) einer Aminosäuresequenz von -253 bis -1 von SEQ ID NO: 11; (c) einer Aminosäuresequenz, die von der Sequenz der Nucleotide 1 bis 759 von SEQ ID NO: 10 codiert wird; (d) einer Aminosäuresequenz, die von natürlich vorkommenden allelischen Sequenzen und äquivalenten, degenerativen Codon-Sequenzen der Nucleotidsequenz von (c) codiert wird; und (e) einer Aminosäuresequenz, die von einer DNA-Sequenz codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz von (c) hybridisiert und ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codiert.
BMP-11-Polypeptid nach einem der Ansprüche 8 bis 12 zur Verwendung als Medikament.
Arzneimittel, umfassend das BMP-11-Polypeptid nach Anspruch 13.
Arzneimittel, umfassend ein BMP-11-Protein, das von einer DNA-Sequenz codiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotide 375 oder 390 bis 701 von SEQ ID NO: 1; (b) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotide 760 oder 775 bis 1086 von SEQ ID NO: 10; (c) DNA-Sequenzen, die die Aminosäuren 1 oder 6 bis 109 von SEQ ID NO: 2 codieren; (d) DNA-Sequenzen, die die Aminosäuren 1 oder 6 bis 109 von SEQ ID NO: 11 codieren; (e) DNA-Sequenzen, die natürlich vorkommende allelische Sequenzen und degenerierte Codon-Sequenzen nach einem der Punkte (a) bis (d) umfassen; und (f) DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit den DNA-Sequenzen nach einem der Punkte (a) bis (e) hybridisieren und die ein Polypeptid mit BMP-11-Aktivität codieren, wobei die BMP-11-Aktivität ausgewählt ist aus Regulierung der Herstellung von Follikelstimulierendem Hormon, Förderung des Überlebens neuronaler Zellen, Stimulieren von Hämatopoiesie und Suppression der Entwicklung von gonadalen Tumoren.
Arzneimittel nach Anspruch 15, wobei die DNA-Sequenz zusätzlich eine zweite DNA-Sequenz umfasst, die ein geeignetes Poopeptid 5' codiert und im Leserahmen mit der DNA-Sequenz verbunden ist.
Arzneimittel nach Anspruch 16, wobei das Propeptid von einem Mitglied der TGF-β-Überfamilie von Proteinen ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 14 bis 17, zusätzlich umfassend mindestens ein Knochen-morphogenetisches Protein.
Verwendung des Arzneimittels nach einem der Ansprüche 14 bis 18 für die Herstellung eines Arzneimittels zum Regulieren der Produktion von Follikelstimulierendem Hormon, zur Empfängnisverhütung oder für die Behandlung von Knochen- und/oder Knorpeldefekten, Periodontalerkrankung oder Wunden.