DE69434067T2 - Menschliche neuronale nikotin-acetylcholin-rezeptor-verbindungen und methoden ihres einsatzes - Google Patents

Menschliche neuronale nikotin-acetylcholin-rezeptor-verbindungen und methoden ihres einsatzes Download PDF

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor

Description

  • Diese Erfindung betrifft Nukleinsäuren, welche für Proteinuntereinheiten eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodieren, sowie die Proteine selbst. Insbesondere werden Nukleinsäuren, die für eine α-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodieren, α-Untereinheitsproteine, für eine β-Untereinheit kodierende Nukleinsäuren, β-Untereinheitsproteine und Kombinationen davon bereitgestellt.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Liganden-gesteuerte Ionenkanäle bieten ein Mittel zur Kommunikation zwischen Zellen des Zentralnervensystems. Diese Kanäle überführen ein Signal (z.B. eine chemische Substanz, die als Neurotransmitter bezeichnet wird), welches von einer Zelle freigesetzt wird, in ein elektrisches Signal, das sich entlang einer Ziel-Zellmembran ausbreitet. In den zentralen und peripheren Nervensystemen existiert eine Vielfalt von Neurotransmittern und Neurotransmitter-Rezeptoren. Fünf Familien von liganden-gesteuerten Rezeptoren, einschließlich der nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren (NAChRs) neuromuskulären und neuronalen Ursprungs, wurden identifiziert (Stroud et al. (1990), Biochemistry 29: 11009–11023). Die Art und Weise in der die Vielfalt von Rezeptoren unterschiedliche Antworten auf Neurotransmitter oder andere modulierende Liganden in verschiedenen Bereichen des Nervensystems hervorruft, ist jedoch wenig verstanden.
  • Die nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren (NAChRs) sind Proteine neuromuskulären und neuronalen Ursprungs aus mehreren Untereinheiten. Diese Rezeptoren bilden liganden-gesteuerte Ionenkanäle, welche die synaptische Transmission zwischen Nerv und Muskel und zwischen Neuronen nach Wechselwirkung mit dem Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) vermitteln. Nachdem verschiedene Untereinheiten eines nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors (NAChR) existieren, gibt es eine Vielfalt von NAChR-Zusammensetzungen (d.h. Kombinationen von Untereinheiten). Die verschiedenen NAChR-Zusammensetzungen weisen unterschiedliche Spezifitäten für verschiedene Liganden auf und sind dadurch pharmakologisch unterscheidbar. So wurden die nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren, die an der neuromuskulären Verbindungsstelle von Vertebraten in sympathetischen Ganglien von Vertebraten und im Zentralnervensystem von Vertebraten exprimiert werden, auf Grundlage der Wirkungen verschiedener Liganden unterschieden, welche an verschiedene NAChR-Zusammensetzungen binden. Beispielsweise blockieren die Elapid-α-Neurotoxine, welche die Aktivierung von nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren an der neuromuskulären Verbindungsstelle blockieren, nicht die Aktivierung einiger neuronaler nikotinerger Acetylcholin-Rezeptoren, welche auf verschiedenen unterschiedlichen Zellinien neuronalen Ursprungs exprimiert werden.
  • Muskel-NAChR ist ein Glycoprotein, das aus fünf Untereinheiten mit der Stöchiometrie α2β(γ oder ε)δ aufgebaut ist. Jede der Untereinheiten hat eine Masse von etwa 50–60 Kilodalton (kD) und wird von einem verschiedenen Gen kodiert. Der α2β(γ oder ε)δ-Komplex bildet funktionelle Rezeptoren, welche zwei Ligandenbindungsstellen und einen liganden-gesteuerten Transmembrankanal enthalten. Nach Wechselwirkung mit einem cholinergen Agonisten leiten nikotinerge Muskel-AChRs Natriumionen. Der Einstrom von Natriumionen unterbricht schnell den normalen Ionengradienten, welcher über der Plasmamembran aufrechterhalten wird, und depolarisiert damit die Membran. Durch Verringerung der Potentialdifferenz über die Membran wird ein chemisches Signal in ein elektrisches Signal überführt, welches eine Muskelkontraktion an der neuromuskulären Verbindungsstelle signalisiert.
  • Funktionelle nikotinerge Muskel-Acetylcholin-Rezeptoren wurden mit αβδγ-Untereinheiten, αβγ-Untereinheiten, αβδ-Untereinheiten, αδγ-Untereinheiten oder αδ-Untereinheiten gebildet, jedoch nicht mit nur einer Untereinheit (siehe beispielsweise Kurosaki et al. (1987), FEBS Lett. 214: 253–258; Camacho et al. (1993), J. Neuroscience 13: 605–613). Im Gegensatz dazu können funktionelle neuronale AChRs (nAChRs) aus α-Untereinheiten allein oder Kombinationen von α- und β-Untereinheiten gebildet werden. Von der größeren α-Untereinheit wird gewöhnlich angenommen, dass es die ACh-bindende Untereinheit ist, und von der β-Untereinheit mit geringerem Molekulargewicht wird gewöhnlich angenommen, dass es sich um die strukturelle Untereinheit handelt, obwohl nicht definitiv demonstriert wurde, dass die β-Untereinheit nicht das Vermögen zur Bindung von ACh besitzt. Jede der Untereinheiten, welche an der Bildung eines funktionellen Ionenkanals beteiligt sind, sind in dem Ausmaß, in dem sie zur Struktur des resultierenden Kanals beitragen, "strukturelle" Untereinheiten, ungeachtet ihres Vermögens (oder Unvermögens) zur Bindung von ACh. Neuronale AChRs (nAChRs), welche ebenfalls liganden-gesteuerte Ionenkanäle sind, werden in Ganglien des autonomen Nervensystems und im Zentralnervensystem (wo sie die Signalübertragung vermitteln) an postsynaptischen Positionen (wo sie die Transmission modulieren) und an prä- und extrasynaptischen Positionen (wo sie zusätzliche Funktionen besitzen mögen) exprimiert.
  • Nukleinsäuren, die für NAChRs kodieren, wurden aus mehreren Quellen isoliert. Aufgrund der Information, die aus solchen Arbeiten zur Verfügung steht, war seit einiger Zeit ersichtlich, dass NAChRs, die im Muskel, in autonomen Ganglien und im Zentralnervensystem exprimiert werden, funktionell unterschiedlich sind. Diese funktionelle Unterschied lichkeit könnte zumindest teilweise auf die große Anzahl verschiedener existierender NAChR-Untereinheiten zurückzuführen sein. Es ist jedoch nicht vollständig verstanden, wie (und welche) NAChR-Untereinheiten kombinieren, um einmalige NAChR-Subtypen zu bilden, insbesondere in neuronalen Zellen. In der Tat gibt es Befunde, dass nur bestimmte NAChR-Subtypen bei Krankheiten wie der Alzheimer-Krankheit eine Rolle spielen könnten. Darüber hinaus ist nicht klar, ob NAChRs von analogen Geweben oder Zelltypen speziesübergreifend ähnlich sind. Séguela et al. (J. Neuroscience, Feb. 1993, 13(2): 596–604) berichten über einen Vollängen-Klon, kodierend für die nikotinerge α1-Untereinheit der Ratte, der aus einer cDNA-Bank adulter Gehirne isoliert und in Xenopus-Oozyten exprimiert wurde.
  • Dementsprechend besteht Bedarf für die Isolierung und Charakterisierung von Nukleinsäuren, die für jede humane neuronale NAChR-Untereinheit kodieren, rekombinante Zellen, die solche Untereinheiten enthalten, und davon hergestellte Rezeptoren. Es besteht auch Bedarf für die Gewinnung isolierter (vorzugsweise gereinigter) humaner neuronaler nikotinerger AChRs und isolierter (vorzugsweise gereinigter) humaner neuronaler nikotinerger AChR-Untereinheiten, um die Funktion humaner neuronaler AChRs zu untersuchen und um krankheitsspezifische pharmakologische Wirkstoffe zu erhalten. Darüber hinaus besteht auch Bedarf zur Entwicklung von Assays, um solche pharmakologischen Wirkstoffe zu identifizieren.
  • Die Verfügbarkeit solcher Nukleinsäuren, Zellen, Rezeptor-Untereinheiten und Rezeptor-Zusammensetzungen wird die Unsicherheit der Spekulation über die Struktur und Funktion humaner nNAChR, welche auf Voraussagen basiert, die anhand von Daten nicht-humaner nNAChR oder Daten humaner oder nicht-humaner Muskel- oder Ganglien-NAChR getroffen wurden, beseitigen.
  • Deshalb besteht hier eine Aufgabe darin, Nukleinsäuren zu isolieren und zu charakterisieren, welche für Untereinheiten von humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren kodieren. Es besteht hier auch eine Aufgabe darin, Verfahren zur rekombinanten Herstellung humaner neuronaler nikotinerger Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten bereitzustellen. Es besteht hier auch eine Aufgabe darin, gereinigte Rezeptor-Untereinheiten bereitzustellen und Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereitzustellen, um Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität humaner neuronaler AChRs modulieren.
  • Diese und andere Aufgaben werden Fachleuten auf dem Gebiet nach weiterem Studium der Patentbeschreibung und der Ansprüche ersichtlich werden.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nukleinsäuren bereitgestellt, die für neue humane Alpha- und Beta-Untereinheiten neuronaler NAChRs kodieren. Insbesondere wird isolierte DNA, kodierend für humane α7-Untereinheiten neuronaler NAChRs, bereitgestellt. mRNA und Polypeptide, die von den oben beschriebenen Nukleinsäuren kodiert werden, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Ferner werden gemäß der vorliegenden Erfindung rekombinante humane neuronale nikotinerge AChR-Untereinheiten, einschließlich von α7-Untereinheiten, bereitgestellt sowie Verfahren zu deren Herstellung. Darüber hinaus werden rekombinante humane neuronale nikotinerge Acetylcholin-Rezeptoren, die mindestens eine humane neuronale nikotinerge AChR-Untereinheit enthalten, ebenfalls bereitgestellt sowie Verfahren zu deren Herstellung. Ferner werden rekombinante neuronale nikotinerge AChRs, welche eine Mischung von einer oder mehreren NAChR-Untereinheit(en), die von einer Wirtszelle kodiert werden, und einer oder mehreren nNAChR-Untereinheit(en), die von heterologer DNA oder RNA (d.h., DNA oder RNA wie hier beschrieben, welche in die Wirtszelle eingeführt wurde) kodiert werden, enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung bereitgestellt.
  • Plasmide, enthaltend DNA, welche für die oben beschriebenen Untereinheiten kodiert, werden ebenfalls bereitgestellt. Rekombinante Zellen, enthaltend die oben beschriebene(n) DNA, mRNA oder Plasmide, werden ebenfalls hier bereitgestellt. Solche Zellen sind beispielsweise von Nutzen zur Replizierung von DNA, zur Herstellung humaner NAChR-Untereinheiten und rekombinanter Rezeptoren und zur Herstellung von Zellen, welche Rezeptoren exprimieren, die eine oder mehrere humane Untereinheit(en) enthalten.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden auch Verfahren bereitgestellt, um Zellen zu identifizieren, welche funktionelle nikotinerge Acetylcholin-Rezeptoren exprimieren. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität von NAChRs modulieren, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Die hier bereitgestellte(n) DNA, mRNA, Vektoren, Rezeptor-Untereinheiten, Rezeptor-Untereinheitskombinationen und Zellen erlaubt/erlauben die Herstellung ausgewählter neuronaler nikotinerger AChR-Untereinheiten und spezifischer Kombinationen davon sowie von Antikörpern gegen die Rezeptor-Untereinheiten. Dies bietet ein Mittel zur Herstellung von synthetischen oder rekombinanten Rezeptoren und Rezeptor-Untereinheiten, welche im wesentlichen frei von Verunreinigung von vielen anderen Rezeptorproteinen sind, deren Anwesenheit die Analyse einer einzelnen NAChR-Untereinheit stören kann. Die Verfügbarkeit gewünschter Rezeptor-Untereinheiten ermöglicht es, die Wirkung einer Wirkstoffsubstanz auf einen speziellen Rezeptor-Subtyp zu beobachten und dadurch ein erstes in vitro-Screening der Arzneiwirkstoffsubstanz in einem Testsystem durchzuführen, welches spezifisch für Menschen ist und spezifisch für einen humanen neuronalen nikotinergen AChR-Subtyp.
  • Die Verfügbarkeit von untereinheits-spezifischen Antikörpern ermöglicht die Anwendung der Technik der Immunhistochemie, um die Verteilung und Expressionsdichte verschiedener Untereinheiten (z.B. in normalem gegenüber erkranktem Gehirngewebe) zu überprüfen. Solche Antikörper können auch für diagnostische und therapeutische Anwendungen eingesetzt werden.
  • Das Vermögen zum Screenen von Arzneiwirkstoffsubstanzen in vitro zur Bestimmung der Wirkung des Arzneiwirkstoffes auf spezifische Rezeptor-Zusammensetzungen sollte die Entwicklung und das Screenen von rezeptor-subtyp-spezifischen oder krankheitsspezifischen Wirkstoffen erlauben. Auch liefert das Testen einzelner Rezeptor-Untereinheiten oder spezifischer Rezeptor-Untereinheitskombinationen mit einer Vielfalt von potentiellen Agonisten oder Antagonisten zusätzliche Informationen bezüglich der Funktion und Aktivität der individuellen Untereinheiten und sollte zur Identifizierung und Entwicklung von Verbindungen führen, welche zu einer sehr spezifischen Wechselwirkung mit einem oder mehreren Rezeptor-Subtype(n) in der Lage sind. Die resultierenden Arzneiwirkstoffe sollten weniger unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen als Wirkstoffe, welche durch Screenen mit Zellen identifiziert wurden, die eine Vielfalt von Subtypen exprimieren.
  • Hinsichtlich Arzneiwirkstoffentwicklung und therapeutischer Behandlung verschiedener Krankheitszustände ermöglicht ferner die Verfügbarkeit von Nukleinsäuren, die für humane nNAChR-Untereinheiten kodieren, die Identifizierung etwaiger Abweichungen solcher Gene (z.B. Mutationen), welche mit dem Auftreten bestimmter Krankheitszustände korrelieren könnten. Darüber hinaus wird die Schaffung von Tiermodellen solcher Krankheitszustände möglich, indem spezifisch solche Mutationen in synthetische DNA-Sequenzen eingeführt werden, welche dann in Labortiere oder in vitro-Assaysysteme eingeführt werden können, um deren Wirkungen festzustellen.
  • Kurzbeschreibung der Figur
  • 1 stellt eine Restriktionskarte von zwei Vektoren auf Basis des pCMV-Promotors, pCMV-T7-2 und pCMV-T7-3, dar.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung haben wir Nukleinsäuren isoliert und charakterisiert, welche für neue humane Alpha- und Beta-Untereinheiten neuronaler NAChRs kodieren. Speziell werden hier isolierte DNAs beschrieben, die für humane α7-Untereinheiten neuronaler NAChRs kodieren. Rekombinante Boten-RNA (mRNA) und rekombinante Polypeptide, welche von den oben beschriebenen Nukleinsäuren kodiert werden, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Wie hier verwendet, bedeutet isoliert (oder im wesentlichen rein) als nähere Bestimmung von DNA, RNA, Polypeptiden oder Proteinen, dass die so bezeichnete(n) DNA, RNA, Polypeptide oder Proteine von ihren zellulären in vivo-Umgebungen durch menschliche Leistungen getrennt wurden. Somit bezieht sich isolierte (oder im wesentlichen reine) DNA, wie hier verwendet, auf DNAs, die nach Standardtechniken, welche von Fachleuten eingesetzt werden (siehe beispielsweise Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), gereinigt wurden.
  • Gleichermaßen bedeutet "rekombinant", wie hier verwendet, als nähere Bestimmung von DNA, RNA, Polypeptiden oder Proteinen, dass die so bezeichnete(n) DNA, RNA, Polypeptide oder Proteine durch menschliche Leistungen hergestellt wurden, beispielsweise durch Klonierung, rekombinante Expression und dgl. Somit bedeuten rekombinante Proteine, wie hier verwendet, beispielsweise Proteine, welche von einem rekombinanten Wirt produziert werden, der Nukleinsäuren exprimiert, welche diesem Wirt durch menschliche Leistungen hinzugefügt wurden.
  • Wie hier verwendet, ist ein humanes Alpha-Untereinheitsgen ein Gen, welches für eine Alpha-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert. Die Alpha-Untereinheit ist ein Untereinheit des NAChR, an die ACh bindet. Die Zuordnung der Bezeichnung "Alpha" zu einer mutmaßlichen nNAChR-Untereinheit, gemäß Deneris et al. [Tips (1991) 12: 34–40], basiert auf der Konservierung benachbarter Cysteinreste in der mutmaßlichen extrazellulären Domäne der Untereinheit, welche die Homologen der Cysteine 192 und 193 der Torpedo-Alpha-Untereinheit sind (siehe Noda et al. (1982), Nature 299: 793–797). Wie hier verwendet, bezieht sich eine Alpha-Untereinheit auf eine humane nNAChR-Untereinheit, die von Nukleinsäuren kodiert wird, welche unter Bedingungen hoher Stringenz mit mindestens einer der für eine nNAChR-Alpha-Untereinheit kodierenden Nukleinsäuren (oder hinterlegten Klonen) wie hier offenbart hybridisieren. Eine Alpha-Untereinheit bindet auch an ACh unter physiologischen Bedingungen und in physiologischen Konzentrationen und bildet, in der optionalen Anwesenheit einer Beta-Untereinheit (d.h. einige Alpha-Untereinheiten sind alleine funktionell, während andere die Anwesenheit einer Beta-Untereinheit erfordern), gewöhnlich einen funktionellen AChR, wie mit hier beschriebenen oder Fachleuten auf diesem Gebiet bekannten Verfahren festgestellt.
  • Ebenfalls berücksichtigt werden Alpha-Untereinheiten, die von Nukleinsäuren kodiert werden, welche für Alpha-Untereinheiten wie oben definiert kodieren, welche jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes nicht notwendigerweise mit den offenbarten Nukleinsäuren oder hinterlegten Klonen unter bestimmten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Solche Untereinheiten sind auch bei der Bildung eines funktionellen Rezeptors, gewöhnlich mit einer oder mehreren Beta-Untereinheit(en), beteiligt, wie mit den hier beschriebenen oder Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren festgestellt. Soweit eine Alpha-Untereinheit nicht von RNA kodiert wird, welche das Ergebnis eines alternativen Splicings ist (d.h., eine Splice-Variante), weisen alpha-kodierende Nukleinsäuren und die davon kodierte Alpha-Untereinheit typischerweise eine substantielle Sequenzhomologie mit mindestens einer der Alpha-Untereinheits-Nukleinsäuren (und davon kodierten Proteinen) auf, welche hier beschrieben oder hinterlegt wurden. Es versteht sich, dass DNA oder RNA, die für eine Splice-Variante kodiert, insgesamt weniger als 90% Homologie mit der hier bereitgestellten DNA oder RNA aufweisen kann, jedoch Bereiche von nahezu 100%iger Homologie mit einem hier beschriebenen DNA-Fragment oder hinterlegten Klon aufweisen und für einen offenen Leserahmen kodieren kann, welcher Start- und Stopcodons einschließt und für eine funktionelle Alpha-Untereinheit kodiert.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich eine Splice-Variante auf für NAChR-Untereinheits-Varianten kodierende Nukleinsäure(n), hergestellt durch unterschiedliche Prozessierung eines primären Transkripts oder primärer Transkripte von genomischer DNA, was zur Bildung von mehr als einem mRNA-Typ führt. cDNA, die von unterschiedlich prozessierter genomischer DNA stammt, wird für NAChR-Untereinheiten kodieren, welche Bereiche vollständiger Aminosäureidentität und Bereiche mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen aufweisen. Somit kann dieselbe genomische Sequenz zur Bildung multipler, verwandter mRNAs und Proteine führen. Sowohl die resultierenden mRNAs als auch die Proteine werden hier als "Splice-Varianten" bezeichnet.
  • Die Stringenz der Hybridisierung wird hier verwendet, um Bedingungen anzugeben, unter denen Polynukleinsäurehybride stabil sind. Wie Fachleuten bekannt, wird die Stabilität von Hybriden durch die Schmelztemperatur (Tm) der Hybride reflektiert. Tm kann durch die folgende Formel angenähert werden: 81,5°C – 16,6(log10[Na+]) + 0,41(% G + C) – 600/l;wobei l die Länge der Hybride in Nukleotiden ist. Die Tm sinkt mit jeweils 1% Abnahme der Sequenzhomologie um etwa 1–1,5°C. Im allgemeinen ist die Stabilität eines Hybrids eine Funktion der Natriumionenkonzentration und Temperatur. Typischerweise wird die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen niedrigerer Stringenz durchgeführt, gefolgt von Waschschritten variierender, jedoch höherer Stringenz. Eine Bezugnahme auf die Hybridisierungsstringenz bezieht sich auf solche Waschbedingungen. Wie hier verwendet, bezieht sich somit:
    • (1) HOHE STRINGENZ auf Bedingungen, welche die Hybridisierung nur derjenigen Nukleinsäuresequenzen erlauben, die stabile Hybride in 0,018 M NaCl bei 65°C erlauben (d.h., falls ein Hybrid in 0,018 M NaCl bei 65°C nicht stabil ist, wird es unter hoch stringenten Bedingungen, wie hier betrachtet, nicht stabil sein). Bedingungen hoher Stringenz können beispielsweise bereitgestellt werden durch Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denhardts Lösung, 5 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C, gefolgt von Waschen in 0,1 × SSPE und 0,1% SDS bei 65°C;
    • (2) MODERATE STRINGENZ auf Bedingungen, die einer Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denhardts Lösung, 5 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C, gefolgt von Waschen in 0,2 × SSPE, 0,2% SDS, bei 65°C, äquivalent sind, und
    • (3) NIEDRIGE STRINGENZ auf Bedingungen, die einer Hybridisierung in 10% Formamid, 5 × Denhardts Lösung, 6 × SSPE, 0,2% SDS, gefolgt von Waschen in 1 × SSPE, 0,2% SDS, bei 50°C, äquivalent sind.
  • Es versteht sich, dass diese Bedingungen unter Verwendung einer Vielfalt von Puffern und Temperaturen reproduziert werden können und dass sie nicht notwendigerweise präzise sind.
  • Denhardts Lösung und SSPE (siehe z.B. Sambrook, Fritsch und Maniatis in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) sind Fachleuten auf dem Gebiet ebenso wohlbekannt wie andere geeignete Hybridisierungspuffer. Beispielsweise ist SSPE phosphatgepufferte 0,18 M NaCl, pH 7,4. SSPE kann beispielsweise als eine 20 × Stammlösung durch Lösen von 175,3 g NaCl, 27,6 g NaH2PO4 und 7,4 g EDTA in 800 ml Wasser, Einstellen des pH-Werts auf 7,4 und dann Zugeben von Wasser auf 1 Liter hergestellt werden. Denhardts Lösung (siehe Denhardt (1966), Biochem. Biophys. Res. Commun. 23: 641) kann beispielsweise hergestellt werden als 50 × Stammlösung durch Mischen von 5 g Ficoll (Typ 400, Pharmacia LKB Biotechnology, INC., Piscataway NJ), 5 g Polyvinylpyrrolidon, 5 g Rinderserumalbumin (Fraktion V; Sigma, St. Louis MO), Wasser auf 500 ml und Filtrieren, um teilchenförmiges Material zu entfernen.
  • Der Begriff "substantielle Sequenzhomologie" wird hier in Bezug auf die Nukleotidsequenz von DNA, die Ribonukleotidsequenz von RNA oder die Aminosäuresequenz von Protein verwendet, welche leichte und nicht aufeinander folgende Sequenzvariationen von den hier offenbarten tatsächlichen Sequenzen aufweist. Spezies mit substantieller Sequenzhomologie werden als äquivalent zu den offenbarten Sequenzen betrachtet und werden als solche vom Umfang der beigefügten Ansprüche umfasst. Diesbezüglich bedeutet "leichte und nicht aufeinander folgende Sequenzvariationen", dass "homologe" Sequenzen, d.h. Sequenzen, welche eine substantielle Homologie zu den hier offenbarten und beanspruchten DNA, RNA oder Proteinen aufweisen, funktionell äquivalent zu den hier offenbarten und beanspruchten Sequenzen sind. Funktionell äquivalente Sequenzen werden im wesentlichen auf dieselbe Weise funktionieren, um im wesentlichen dieselben Zusammensetzungen wie die hier offenbarten und beanspruchten Nukleinsäure- und Aminosäurezusammensetzungen zu bilden. Insbesondere kodieren funktionell äquivalente Nukleinsäuren für Proteine, welche dieselben wie die hier offenbarten sind oder die konservative Aminosäurevariationen aufweisen, wie z.B. den Austausch eines nicht-polaren Rests gegen einen anderen nichtpolaren Rest oder eines geladenen Rests gegen einen ähnlich geladenen Rest. Diese Austausche schließen diejenigen ein, welche von Fachleuten auf dem Gebiet als solche erkannt werden, welche die Tertiärstruktur des Proteins nicht wesentlich ändern.
  • In der Praxis bedeutet der Begriff "im wesentlichen dieselbe Sequenz", dass DNA oder RNA, welche für zwei Proteine kodieren, unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren und für Proteine kodieren, welche dieselbe Sequenz von Aminosäuren aufweisen oder Änderungen in der Sequenz aufweisen, welche deren Struktur oder Funktion nicht ändern. Wie hier verwendet, weisen im wesentlichen identische Sequenzen von Nukleotiden mindestens etwa 90% Identität und im wesentlichen identische Aminosäuresequenzen weisen mehr als 95%ige Aminosäureidentität auf. Es versteht sich jedoch, dass Proteine (und DNA oder mRNA, die für solche Proteine kodieren), enthaltend weniger als den oben beschriebenen Homologiegrad, die sich als Splice-Varianten ergeben oder durch konservative Aminosäuresubstitutionen (oder Substitution von degenerierten Codons) modifiziert sind, als innerhalb des Umfang der vorliegenden Erfindung betrachtet werden.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich "α4-Untereinheits-DNA" auf DNA, die für eine neuronale nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit derselben Bezeichnung kodiert. Eine solche DNA kann auf eine Reihe von Arten charakterisiert werden, beispielsweise
    kann die DNA für die in SEQ-ID-Nr. 6 angegebene Aminosäuresequenz kodieren, oder
    diese DNA kann für die von dem Klon HnAChRα4.2, hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69239, kodierte Aminosäuresequenz kodieren, oder
    die 5'-Nukleotide dieser DNA können für die Aminosäuresequenz kodieren, welche von dem Klon HnAChRα4.1, hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69152, kodiert wird.
  • Derzeit bevorzugte, für α4 kodierende DNAs können wie folgt charakterisiert werden,
    die DNA kann mit der in SEQ-ID-Nr. 5 angegebenen kodierenden Sequenz (vorzugsweise mit im wesentlichen der gesamten kodierenden Sequenz davon, d.h. Nukleotide 173–2056) unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren, oder
    die DNA kann unter Bedingungen hoher Stringenz mit der Sequenz (vorzugsweise im wesentlichen der gesamten Sequenz) des α4-kodierenden Inserts des Klons HnAChRα4.2, hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69239, hybridisieren oder
    die 5'-Nukleotide der DNA können unter Bedingungen hoher Stringenz mit der Sequenz des α4-kodierenden Inserts des Klons HnAChRα4.1, hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69152, hybridisieren.
  • Besonders bevorzugte α4-kodierende DNAs der Erfindung sind wie folgt charakterisiert,
    DNA mit im wesentlichen derselben Nukleotidsequenz wie der in SEQ-ID-Nr. 5 angegebene kodierende Bereich (d.h., die Nukleotide 173–2056 davon) oder
    DNA mit im wesentlichen derselben Nukleotidsequenz wie das α4-kodierende Insert des Klons HnAChRα4.2, hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69239, oder
    die 5'-Nukleotide der DNA haben im wesentlichen dieselbe Sequenz wie das α4-kodierende Insert des Klons HnAChRα4.1, hinterlegt unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69152.
  • Soweit eine α4-Untereinheit nicht das Ergebnis einer Splice-Variante ist, wird eine für α4 kodierende DNA typischerweise eine wesentliche Sequenzhomologie (d.h. mehr als etwa 90%) mit den hier beschriebenen oder hinterlegten α4-DNAs aufweisen. DNA oder RNA, die für eine Splice-Variante kodiert, kann weniger als 90% gesamte Sequenzhomologie mit der hier bereitgestellten DNA oder RNA aufweisen, jedoch würde eine solche Splice-Variante Bereiche von nahezu 100%iger Homologie mit den oben beschriebenen DNAs einschließen.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich "α7-Untereinheits-DNA" auf DNA, die für eine neuronale nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit derselben Bezeichnung kodiert. Eine solche DNA kann auf eine Reihe von Arten charakterisiert werden, beispielsweise können die Nukleotide der DNA für die in SEQ-ID-Nr. 8 angegebene Aminosäuresequenz kodieren. Derzeit bevorzugte, für α7 kodierende DNAs können als DNA charakterisiert werden, welche unter Bedingungen hoher Stringenz mit der in SEQ-ID-Nr. 7 angegebenen kodierenden Sequenz hybridisiert (vorzugsweise mit dem wesentlichen der gesamten kodierenden Sequenz davon, d.h. Nukleotide 73–1581). Besonders bevorzugte, für α7 kodierende DNAs der Erfindung sind charakterisiert als im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie die in SEQ-ID-Nr. 7 angegebene kodierende Sequenz (d.h., die Nukleotide 73–1581 davon) aufweisend.
  • Soweit eine α7-Untereinheit nicht das Ergebnis einer Splice-Variante ist, wird eine für α7 kodierende DNA typischerweise eine wesentliche Sequenzhomologie (mehr als etwa 90%) mit den hier beschriebenen oder hinterlegten α7-DNAs aufweisen. DNA oder RNA, die für eine Splice-Variante kodiert, kann weniger als 90% gesamte Sequenzhomologie mit der hier bereitgestellten DNA oder RNA aufweisen, jedoch würde eine solche DNA Bereiche von nahezu 100%iger Homologie mit der oben beschriebenen DNA einschließen.
  • Bei den von der oben beschriebenen DNA abgeleiteten α7-Untereinheiten steht zu erwarten, dass sie an das Neurotoxin α-Bungarotoxin (α-bgtx) binden. Die Aktivität von AChRs, welche α7-Untereinheiten kodieren, sollte nach Wechselwirkung mit α-bgtx inhibiert werden. Es wird angenommen, dass die Aminosäurereste 210 bis 217, wie in SEQ-ID-Nr. 8 angegeben, wichtige Elemente bei der Bindung von α-bgtx sind (siehe beispielsweise Chargeaux et al. (1992), 13: 299–301).
  • Wie hier verwendet, ist ein humanes Beta-Untereinheits-Gen ein Gen, welches für eine Beta-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert. Die Zuordnung der Bezeichnung "Beta" zu einer mutmaßlichen nNAChR-Untereinheit gemäß Deneris et al., oben, basiert auf dem Fehlen benachbarter Cysteinreste (welche charakteristisch für Alpha-Untereinheiten sind). Die Beta-Untereinheit wird häufig als die strukturelle NAChR-Untereinheit bezeichnet (obwohl es möglich ist, dass Beta-Untereinheiten ebenfalls ACh-Bindungseigenschaften aufweisen). Die Kombination von (einer) Beta-Untereinheit(en) mit (einer) geeigneten Alpha-Untereinheit(en) führt zur Bildung eines funktionellen Rezeptors. Wie hier verwendet, bezieht sich eine Beta-Untereinheit auf eine nNAChR-Untereinheit, welche von DNA kodiert wird, die unter Bedingungen hoher Stringenz mit mindestens einer der hier offenbarten nNAChR-kodierenden DNAs (oder den hinterlegten Klonen) hybridisiert. Eine Beta-Untereinheit bildet mit (einer) geeigneten Alpha-Untereinheit(en) einen funktionellen NAChR, wie mit den hier beschriebenen oder Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren festgestellt.
  • Ebenfalls berücksichtigt werden Beta-Untereinheiten, kodiert von DNAs, welche für Beta-Untereinheiten wie oben definiert kodieren, welche jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes nicht notwendigerweise mit der offenbarten DNA oder den hinterlegten Klonen unter den angegebenen Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Solche Untereinheiten bilden in Kombination mit (einer) geeigneten Alpha-Untereinheit(en) ebenfalls funktionelle Rezeptoren, wie mit den hier beschriebenen oder Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren festgestellt. Soweit eine Beta-Untereinheit nicht von RNA kodiert wird, welches das Ergebnis einer Splice-Variante ist, weist die für Beta kodierende DNA und die davon kodierte Beta-Untereinheit typischerweise eine wesentliche Sequenzhomologie mit der beta-kodierenden DNA und dem Beta-Untereinheitsprotein wie hier beschrieben auf. Es versteht sich, dass DNA oder RNA, die für eine Splice-Variante kodiert, weniger als 90% Gesamthomologie mit der hier bereitgestellten DNA oder RNA aufweisen kann, jedoch wird eine solche DNA Bereiche von nahezu 100%iger Homologie mit der hier beschriebenen DNA einschließen.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich "β4-Untereinheits-DNA", auf DNA, die für eine neuronale nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit derselben Bezeichnung kodiert. Eine solche DNA kann auf eine Reihe von Arten charakterisiert werden, beispielsweise können die Nukleotide der DNA für die in SEQ-ID-Nr. 12 angegebene Aminosäuresequenz kodieren. Derzeit bevorzugte β4-kodierende DNAs können charakterisiert werden als DNA, welche unter Bedingungen hoher Stringenz mit der in SEQ-ID-Nr. 11 angegebenen kodierenden Sequenz hybridisiert (vorzugsweise mit dem wesentlichen der gesamten kodierenden Sequenz davon, d.h. Nukleotide 87–1583). Besonders bevorzugte β4-kodierende DNAs der Erfindung sind charakterisiert als im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz aufweisend wie in SEQ-ID-Nr. 11 angegeben.
  • Soweit eine β4-Untereinheit nicht das Ergebnis einer Splice-Variante ist, wird für β4 kodierende DNA eine wesentliche Sequenzhomologie (mehr als etwa 90%) mit den hier beschriebenen oder hinterlegten β4-DNAs aufweisen. DNA oder RNA, die für eine Splice-Variante kodiert, kann weniger als 90% gesamte Sequenzhomologie mit der hier bereitgestellten DNA oder RNA aufweisen, jedoch würde eine solche DNA Bereiche von nahezu 100%iger Homologie mit der oben beschriebenen DNA einschließen.
  • DNA, die für Alpha- und Beta-Untereinheiten eines humanen neuronalen nikotinergen AChR kodiert, kann durch Screenen geeigneter humaner cDNA-Banken oder humaner genomischer Banken unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit hier offenbarter DNA (einschließlich von Nukleotiden, die von irgendeiner der SEQ-ID-Nrn. 5, 7 oder 11 abgeleitet sind), oder mit irgendeinem der hier genannten hinterlegten Klone (z.B. ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69239 oder 69152) isoliert werden. Geeignete Banken können aus neuronalen Gewebeproben, Hippocampusgewebe oder Zellinien, wie z.B. der Human-Neuroblastom-Zelllinie IMR32 (ATCC-Hinterlegungsnummer CCL127), und dgl. erstellt werden. Die Bank wird vorzugsweise mit einem Abschnitt von DNA gescreent, welcher die gesamte untereinheits-kodierende Sequenz davon einschließt, oder die Bank kann mit einer geeigneten Sonde gescreent werden.
  • Wie hier verwendet, ist eine Sonde einzelsträngige DNA oder RNA, welche eine Sequenz von Nukleotiden aufweist, die mindestens 14 zusammenhängende Basen umfaßt, welche die gleichen sind wie (oder das Komplement von) beliebige(n) 14 Basen, die in irgendeiner der SEQ-ID-Nrn. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 angegeben sind, oder in der untereinheits-kodierenden DNA in irgendeinem der hier beschriebenen hinterlegten Klone (z.B. ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69239 oder 69152). Bevorzugte Bereiche zur Konstruktion von Sonden beinhalten die 5'- und/oder 3'-kodierenden Sequenzen, Sequenzen, von denen vorausgesagt wird, dass sie für Transmembrandomänen kodieren, Sequenzen, von denen vorausgesagt wird, dass sie für die zytoplasmatische Schleife kodieren, Signalsequenzen, Bindungsstellen für Acetylcholin (ACh) und α-Bungarotoxin (α-bgtx) und dgl. Die Aminosäuren 210–220 sind typischerweise an der ACh- und α-bgtx-Bindung beteiligt. Die ungefähren Aminosäurereste, von denen vorausgesagt wird, dass sie solche Bereiche für andere bevorzugte Sonden umfassen, sind in der folgenden Tabelle angegeben:
  • Figure 00130001
  • Alternativ können Abschnitte der DNA als Primer zur Amplifizierung ausgewählter Fragmente in einer speziellen Bank eingesetzt werden.
  • Nach dem Screenen der Bank werden positive Klone durch Nachweis eines Hybridisierungssignals identifiziert; die identifizierten Klone werden durch Restriktionsenzymkartierung und/oder DNA-Sequenzanalyse charakterisiert und dann untersucht durch Vergleich mit den hier angegebenen Sequenzen oder mit den hier beschriebenen hinterlegten Klonen, um festzustellen, ob sie DNA einschließen, welche für eine vollständige Alpha- oder Beta-Untereinheit kodiert. Falls die ausgewählten Klone unvollständig sind, können sie zum erneuten Screenen derselben oder einer anderen Bank eingesetzt werden, um überlappende Klone zu erhalten. Gewünschtenfalls kann die Bank erneut mit positiven Klonen gescreent werden, bis überlappende Klone erhalten werden, welche für eine vollständige Alpha- oder Beta-Untereinheit kodieren. Falls die Bank eine cDNA-Bank ist, werden die überlappenden Klone einen offenen Leserahmen einschließen. Falls die Bank genomisch ist, können die überlappenden Klone Exons und Introns einschließen. In beiden Fällen können vollständige Klone durch Vergleich mit der DNA und den davon kodierten Proteinen, die hier bereitgestellt werden, identifiziert werden.
  • Komplementäre DNA-Klone, welche verschiedene humane nNAChR-Alpha- und -Beta-Untereinheiten kodieren, wurden isoliert. Jede Untereinheit scheint von einem unterschiedlichen Gen kodiert zu werden. Die hier bereitgestellten DNA-Klone können durch Screenen von Banken, die aus verschiedenen neuralen Geweben hergestellt wurden, zur Isolierung von genomischen Klonen, die für jede Untereinheit kodieren, und zur Isolierung etwaiger Splice-Varianten eingesetzt werden. Nukleinsäureamplifizierungstechniken, welche im Stand der Technik wohlbekannt sind, können zur Lokalisierung von Splice-Varianten humaner NAChR-Untereinheiten eingesetzt werden. Dies erfolgt durch Einsatz von Oligonukleotiden, die auf DNA-Sequenzen in der Umgebung einer divergenten Sequenz oder divergenter Sequenzen basieren, als Primer für die Amplifizierung humaner RNA oder genomischer DNA. Größen- und Sequenzbestimmungen der Amplifizierungsprodukte können die Existenz von Splice-Varianten offenbaren. Ferner kann die Isolierung von humanen genomischen DNA-Sequenzen durch Hybridisierung DNA ergeben, die mehrere Exons enthält, separiert durch Introns, welche unterschiedlichen Splice-Varianten von Transkripten, kodierend für humane NAChR-Untereinheiten, entsprechen.
  • Es wurde festgestellt, dass nicht alle Untereinheiten in allen neuralen Geweben oder in allen Teilen des Gehirns exprimiert werden. Deshalb ist es zur Isolierung von cDNA, die für spezielle Untereinheiten oder Splice-Varianten solcher Untereinheiten kodiert, bevorzugt, Banken zu screenen, die aus unterschiedlichen neuronalen oder neuralen Geweben hergestellt wurden. Bevorzugte Banken zum Erhalt von DNA, die für jede Untereinheit kodiert, umfassen: Hippocampus zur Isolierung von humaner α4- und α5-kodierender DNA, IMR32 (Human-Neuroblastom-Zellen, ATCC-Hinterlegungs-Nr. CCL127) zur Isolierung von humaner α3-, α5-, α7- und β4-kodierender DNA, Thalamus zur Isolierung von α2- und β2-kodierender DNA und dgl.
  • Es scheint so, dass sich die Verteilung der Expression von humanen neuronalen nikotinergen AChRs von der Verteilung solcher Rezeptoren in der Ratte unterscheidet. Beispielsweise ist RNA, welche für die Ratten-α4-Untereinheit kodiert, im Ratten-Thalamus häufig, jedoch nicht häufig im Ratten-Hippocampus (siehe beispielsweise Wada et al. (1989), J. Comp. Neurol 284: 314–335). Es konnten jedoch keine α4-kodierenden Klone aus einer humanen Thalamus-Bank erhalten werden. Statt dessen wurden humane α4-Klone schließlich von einer Human-Hippocampus-Bank erhalten. Somit scheint die Verteilung der α4-nNAChR-Untereinheit bei Menschen und Ratten ziemlich unterschiedlich zu sein.
  • Die Ratten-α3-Untereinheit scheint eine ZNS-assoziierte Untereinheit zu sein, welche stark im Thalamus und schwach im Gehirnstamm exprimiert wird (siehe z.B. Boulter et al. (1986), Nature 319: 368–374; Boulter et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7763–7767 und Wada et al. (1989), J. Comp. Neurol 284: 314–335). Bei Versuchen zur Klonierung von DNA, welche für die α3-Untereinheit des humanen nikotinergen AChR kodiert, wurden jedoch mehrere humane Banken, einschließlich einer Thalamus-Bank, ohne Erfolg gescreent. Überraschenderweise wurden Klone, die für eine humane α3-Untereinheit kodieren, schließlich aus einer Gehirnstammbank erhalten und aus IMR32-Zellen, welche Berichten nach wenig, falls überhaupt, funktionelle nikotinerge Acetylcholin-Rezeptoren exprimieren (siehe z.B. Gotti et al. (1986), Biochem. Biophys. Res. Commun. 137: 1141–1147, und Clementi et al. (1986), J. Neurochem. 47: 291–297).
  • Ein Ratten-α7-Untereinheits-Transkript wird Berichten nach stark im Hippocampus exprimiert (siehe Seguela et al. (1993), J. Neurosci. 13: 596–604). Versuche zur Klonierung von DNA, die für eine humane α7-Untereinheit kodiert, aus einer humanen Hippocampus-Bank (1 × 106 Rekombinante) waren nicht erfolgreich. Überraschenderweise wurden Klone, die für eine humane NAChR-α7-Untereinheit kodieren, schließlich aus einer IMR32-Zell-cDNA-Bank erhalten.
  • Die oben beschriebenen Nukleotidsequenzen können zur weiteren Manipulation in Vektoren inkorporiert werden. Wie hier verwendet, bezieht sich Vektor (oder Plasmid) auf diskrete Elemente, welche zur Einführung heterologer DNA in Zellen für entweder deren Expression oder Replikation eingesetzt werden. Die Selektion und die Verwendung solcher Vehikel liegt ohne weiteres im Rahmen der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns.
  • Wie hier verwendet, werden heterologe oder fremde DNA oder RNA austauschbar verwendet und beziehen sich auf DNA oder RNA, welche nicht natürlicherweise als Teil des Genoms der Zelle vorkommt, in der sie vorliegt, oder auf DNA oder RNA, welche an einer Stelle oder an Stellen in dem Genom gefunden wird, welche sich von derjenigen unterscheidet/n, an der sie in der Natur vorkommt. Typischerweise bezieht sich heterologe oder fremde DNA und RNA auf DNA oder RNA, welche für die Wirtszelle nicht endogen ist und künstlich in die Zelle eingeführt wurde. Beispiele heterologer DNA schließen DNA ein, welche für eine humane neuronale nikotinerge AChR-Untereinheit kodiert, DNA, welche für RNA oder Proteine kodiert, welche die Expression endogener DNA durch Beeinflussung der Transkription, Translation oder anderer regulierbarer biochemischer Prozesse und dgl. vermitteln oder verändern. Die Zelle, welche heterologe DNA exprimiert, kann DNA enthalten, die für die gleichen oder verschiedene Expressionsprodukte kodiert. Heterologe DNA braucht nicht exprimiert werden und kann in das Wirtszellgenom integriert oder episomal aufrechterhalten werden.
  • Ein Expressionsvektor schließt Vektoren ein, welche in der Lage sind, DNAs zu exprimieren, welche funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen, wie z.B. Promotorbereichen, verknüpft sind, die in der Lage sind, die Expression solcher DNA-Fragmente zu beeinflussen. Somit bezieht sich ein Expressionsvektor auf ein rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt, wie z.B. ein Plasmid, ein Phage, rekombinantes Virus oder ein anderer Vektor, welches nach Einführung in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der klonierten Nukleinsäuren führt. Geeignete Expressionsvektoren sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und schließen diejenigen ein, welche in eukaryotischen Zellen und/oder prokaryotischen Zellen replizierbar sind, und diejenigen, welche episomal bleiben oder diejenigen, welche sich in das Wirtszellgenom integrieren. Derzeit bevorzugte Plasmide für die Expression von erfindungsgemäßen AChR-Untereinheiten in eukaryotischen Wirtszellen, insbesondere Säugerzellen, umfassen den Cytomegalovirus (CMV)-Promotor enthaltende Vektoren wie pCMV, pcDNA1 und dgl. sowie den MMTV-Promotor enthaltende Vektoren, wie pMAMneo und dgl.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich ein Promotorbereich auf ein Segment von DNA, welches die Transkription von DNA kontrolliert, mit der es funktionsfähig verknüpft ist. Der Promotorbereich schließt spezifische Sequenzen ein, welche für die RNA-Polymerase-Erkennung, -Bindung und -Transkriptionsinitiation ausreichend sind. Dieser Teil des Promotorbereichs wird als Promotor bezeichnet. Darüber hinaus umfasst der Promotorbereich Sequenzen, welche diese Erkennungs-, Bindungs- und Transkriptionsinitiationsaktivität von RNA-Polymerase modulieren. Diese Sequenzen können cis wirken oder auf trans wirkende Faktoren ansprechen. Promotor können in Abhängigkeit von der Art der Regulierung konstitutiv oder reguliert sein. Beispielhafte Promotoren, welche zur Verwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung in Betracht kommen, umfassen den frühen SV40-Promotor, den Cytomegalovirus (CMV)-Promoter, den steroid-induzierbaren Maus-Mammatumor-Virus (MMTV)-Promotor, den Maus-Moloney-Leukämie-Virus (MMLV)-Promotor und dgl.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "funktionsfähig verknüpft" auf die funktionelle Beziehung von Nukleinsäuren zu regulatorischen Sequenzen und Effektorsequenzen von Nukleotiden, wie z.B. Promotoren, Enhancer, transkriptionalen und translationalen Stoppstellen und anderen Signalsequenzen. Beispielsweise bezieht sich die funktionsfähige Verknüpfung von Nukleinsäuren mit einem Promotor auf die physische und funktionelle Beziehung zwischen den Nukleinsäuren und dem Promotor, so dass die Transkription solcher Nukleinsäuren von dem Promotor durch eine RNA-Polymerase initiiert wird, welche die Nukleinsäuren spezifisch erkennt, daran bindet und diese transkribiert. Zur Optimierung der Expression und/oder in vitro-Transkription kann es erforderlich sein, 5'- und/oder 3'-untranslatierte Teile der Klone zu entfernen, um zusätzliche potentielle alternative Translationsinitiations (d.h. Start)-Codons oder andere Sequenzen zu entfernen, welche die Expression stören oder verringern, entweder auf der Ebene der Transkription oder der Translation. Alternativ können Konsensus-Ribosomenbindungsstellen (siehe beispielsweise Kozak (1991), J. Biol. Chem. 266: 19867–19870) unmittelbar 5' des Startcodons inseriert werden, um die Expression zu erhöhen. Ferner kann es zur Expression von NAChR-Untereinheiten in Amphibien-Oozyten wünschenswert sein, die für die Untereinheit kodierende Sequenz zur optimalen Proteinproduktion mit 5'- und 3'-untranslatierten Sequenzen des Xenopus-β-Globin-Gens zu umgeben. Beispielsweise können für eine NAChR-Untereinheit kodierende Sequenzen in den Vektor pSP64T [siehe Krieg und Melton in Nucleic Acids Research 12: 7057–7070 (1984)], eine modifizierte Form von pSP64 (erhältlich von Promega, Madison, WI), inkorporiert werden. Die kodierende Sequenz wird zwischen den 5'- und 3'-untranslatierten Sequenzen des β-Globin-Gens, die sich stromabwärts des SP6-Promotors befinden, inseriert. In vitro-Transkripte können dann von dem resultierenden Vektor erzeugt werden. Die Erwünschtheit (oder die Notwendigkeit) einer solchen Modifizierung kann empirisch festgestellt werden.
  • Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass eine Vielfalt von Promotoren, Enhancer, Signalsequenzen und dgl. eingesetzt werden kann, um die Expression der hier beschriebenen klonierten Sequenzen zu fördern. Darüber hinaus wird unschwer erkannt, dass die in einem gegebenen Konstrukt eingesetzten regulatorischen Elemente nicht von derselben Quelle erhalten werden müssen. In der Tat können die in einem gegebenen Konstrukt eingesetzten regulatorischen Elemente aus unterschiedlichen Quellen erhalten werden, so dass verschiedene Kombinationen regulatorischer Elemente in einem speziellen Konstrukt für die Expression kombiniert werden können.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich Expression auf den Prozess, mit dem Polynukleinsäuren in mRNA transkribiert und in Peptide, Polypeptide oder Proteine translatiert werden. Falls die Polynukleinsäure von genomischer DNA abgeleitet ist, kann die Expression das Splicing der mRNA beinhalten, falls eine geeignete eukaryotische Wirtszelle oder ein geeigneter eukaryotischer Organismus ausgewählt wird.
  • Besonders bevorzugte Vektoren zur Transfektion von Säugerzellen sind die pSV2dhfr-Expressionsvektoren, welche den frühen SV40-Promotor, das Maus-dhfr-Gen, SV40-Polyadenylierungs- und -Splice-Stellen und Sequenzen, welche zur Aufrechterhaltung des Vektors in Bakterien erforderlich sind, enthalten, Vektoren auf Basis des Cytomegalovirus (CMV)-Promotors, wie z.B. pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA), und Vektoren auf Basis des MMTV-Promotors, wie z.B. pMAMneo (Clontech, Palo Alto, CA), und Modifizierungen davon.
  • Vollängen-DNAs, welche für humane neuronale NAChR-Untereinheiten kodieren, wurden in den Vektor pCMV-T7 inseriert, einen Säugerzell-Expressionsvektor auf Basis von pUC19, welcher den CMV-Promotor/Enhancer, SV40-Splice/Donor-Stellen unmittelbar stromabwärts des Promotors, einen Polylinker stromabwärts der Splice/Donor-Stellen, gefolgt von einem SV40-Polyadenylierungssignal, enthält. Die Plazierung der NAChR-Untereinheits-DNA zwischen dem CMV-Promotor und SV40-Polyadenylierungssignal ergibt eine konstitutive Expression der fremden DNA in einer Säugerwirtszelle, die mit dem Konstrukt transfiziert ist. Zur induzierbaren Expression von für eine humane NAChR-Untereinheit kodierender DNA in einer Säugerzelle kann die DNA in ein Plasmid wie pMSG inseriert werden. Dieses Plasmid enthält den Maus-Mammatumor-Virus (MMTV)-Promotor für die steroid-induzierbare Expression von funktionsfähig verknüpfter fremder DNA. Falls die Wirtszelle keine endogenen Glucocorticoid-Rezeptoren exprimiert, welche zur Aufnahme von Glucocorticoiden (d.h. Inducer des MMTV-Promotors) in die Zelle erforderlich sind, ist es nötig, die Zelle zusätzlich mit DNA zu transformieren, welche für den Glucocorticoid-Rezeptor kodiert (ATCC-Hinterlegungs-Nr. 67200). Humane Vollängen-DNA-Klone, kodierend für humane α3, α4, α7, β2 und β4, wurden zur Synthese von in vitro-Transkripten auch in pIBI24 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) oder pCMV-T7-2 subkloniert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Zellen bereitgestellt, welche die oben beschriebenen Polynukleinsäuren (d.h. DNA oder mRNA) enthalten. Solche Wirtszellen wie Bakterienzellen, Hefezellen, Amphibien- und Säugerzellen können zur Replikation von DNA und zur Produktion von (einer) nAChR-Untereinheit(en) eingesetzt werden. Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren, Herstellung von in vitro-Transkripten, Transfektion von DNA in Säugerzellen, Injektion von Oozyten und die Durchführung elektrophysiologischer und anderer Analysen zur Feststellung der Rezeptorexpression und -funktion wie hier beschrieben werden auch in den PCT-Anmeldungen Nr. PCT/US91/02311 (nun als WO 91/15602 veröffentlicht), PCT/US91/05625 (nun als WO 92/02639 veröffentlicht) und PCT/US92/11090 (nun als WO 93/13423 veröffentlicht) und in den parallel anhängigen US-Patentanmeldungen der Serien-Nrn. 07/504,455, 07/563,751 und 07/812,254 beschrieben. Der Gegenstand jeder dieser Anmeldungen ist hier durch die Bezugnahme in seiner Gesamtheit mit eingeschlossen.
  • Die Inkorporation von klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, die Transfektion eukaryotischer Zellen mit einem Plasmidvektor oder einer Kombination von Plasmidvektoren, die jeweils für ein oder mehrere unterschiedliche Gene kodieren, oder mit linearer DNA und die Selektion transfizierter Zellen sind im Stand der Technik wohlbekannt (siehe z.B. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Heterologe DNA kann in Wirtszellen nach irgendeinem Verfahren eingeführt werden, welches Fachleuten bekannt ist, wie z.B. Transfektion mit einem Vektor, welcher für die heterologe DNA kodiert, durch CaPO4-Präzipitation (siehe z.B. Wigler et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 1373–1376) oder Lipofektamin (GIBCO BRL #18324-012). Rekombinante Zellen können dann unter Bedingungen kultiviert werden, unter denen die Untereinheit(en), welche von der DNA kodiert wird/werden, exprimiert wird/werden. Bevorzugte Zellen umfassen Säugerzellen (z.B. HEK 293-, CHO-, GH3- und Ltk-Zellen), Hefezellen (z.B. methylotrophe Hefezellen, z.B. Pichia pastoris), Bakterienzellen (z.B. Escherichia coli) und dgl. Besonders bevorzugte Zellen sind diejenigen, welche auch zur Expression endogener oder heterologer spannungsabhängiger Calciumkanäle in der Lage sind (siehe beispielsweise PCT-Anmeldung Nr. US92/06903, nun als WO 93/04083 veröffentlicht).
  • Während die hier bereitgestellten Nukleinsäuren in einer beliebigen eukaryotischen Zelle, einschließlich Hefezellen (wie z.B. P. pastoris (siehe US-Patente Nr. 4,882,279, 4,837,148, 4,929,555 und 4,855,231), Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Hansenula polymorpha und dgl.), exprimiert werden können, sind Säuger-Expressionssysteme, einschließlich im Handel erhältlicher Systeme und anderer solcher Systeme, die Fachleuten bekannt sind, zur Expression von Nukleinsäuren, welche für die hier bereitgestellten humanen neuronalen nikotinergen AChR-Untereinheiten kodieren, derzeit bevorzugt. Xenopus-Oozyten sind zur Expression von RNA-Transkripten der DNA bevorzugt.
  • In bevorzugten Ausführungsformen wird DNA in einen Vektor ligiert und in geeignete Wirtszellen eingeführt, um transformierte Zellinien herzustellen, welche eine spezifische humane nNAChR-Rezeptor-Untereinheit exprimieren oder spezielle Kombinationen von Untereinheiten. Die resultierenden Zellinien können dann in großer Menge für die reproduzierbare quantitative Analyse der Wirkungen von Arzneiwirkstoffen auf die Rezeptorfunktion hergestellt werden. In anderen Ausführungsformen kann mRNA durch in vitro-Transkription von DNA, die für jede Untereinheit kodiert, hergestellt werden. Diese mRNA, entweder aus einem einzigen Untereinheits-Klon oder aus einer Kombination von Klonen, kann dann in Xenopus-Oozyten injiziert werden, wobei die mRNA die Synthese der humanen Rezeptor-Untereinheiten steuert, welche dann funktionelle Rezeptoren bilden. Alternativ können die untereinheits-kodierenden Nukleinsäuren direkt in Oozyten zur Expression funktioneller Rezeptoren injiziert werden. Die transfizierten Säugerzellen oder injizierten Oozyten können dann in den hier bereitgestellten Verfahren zum Arzneiwirkstoffscreening eingesetzt werden.
  • Klonierte Vollängen-DNA, kodierend für irgendwelche der Untereinheiten von humanen neuronalen nikotinergen AchR, kann in einen Plasmidvektor zur Expression in einer eukaryotischen Zelle eingeführt werden. Eine solche DNA kann genomische DNA oder cDNA sein. Wirtszellen können mit einem Plasmid oder einer Kombination von Plasmiden transfiziert werden, von denen jedes mindestens für eine humane neuronale nikotinerge AChR-Untereinheit kodiert.
  • Eukaryotische Zellen, in die DNA oder RNA eingeführt werden kann, umfassen beliebige Zellen, welche mit einer solchen DNA oder RNA transfizierbar sind, oder in die solche DNA oder RNA injiziert werden kann. Bevorzugte Zellen sind diejenigen, welche transient (vorübergehend) oder stabil transfiziert werden können und auch die DNA und RNA exprimieren. Derzeit am meisten bevorzugte Zellen sind diejenigen, welche rekombinante oder heterologe humane neuronale nikotinerge AChRs, umfassend eine oder mehrere Untereinheiten, die von der heterologen DNA kodiert werden, bilden können. Solche Zellen können empirisch identifiziert werden oder aus denjenigen ausgewählt, von denen bekannt ist, dass sie unschwer einer Transfektion oder Injektion unterworfen werden können.
  • Beispielhafte Zellen zur Einführung von DNA schließen Zellen ein, die von Säugern stammen (z.B. COS-Zellen, Maus-L-Zellen, Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), humane embryonale Nierenzellen, Zellen der afrikanischen Grünen Meerkatze, GH3-Zellen und andere solche Zellen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind), Amphibienzellen (z.B. Xenopus laevis-Oozyten), Hefezellen (z.B. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) und dgl. Beispielhafte Zellen zur Expression injizierter RNA-Transkripte schließen Xenopus laevis-Oozyten ein. Zellen, welche zur Transfektion von DNA bevorzugt sind, sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt oder können empirisch identifiziert werden und umfassen HEK 293 (welche von ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. CRL1573 erhältlich sind), Ltk-Zellen (welche von ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. CCL1.3 erhältlich sind), COS-7-Zellen (welche von ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. CRL1651 erhältlich sind), GH3-Ratten-Hypophysen-Tumorzellen (ATCC-Hinterlegungs-Nr. CCL82.1) und DG44-Zellen (dhfr-CHO-Zellen, siehe z.B. Urlaub et al. (1986), Cell. Molec. Genet. 12: 555). Derzeit bevorzugte Zellen umfassen DG44-Zellen, GH3- und HEK 293-Zellen, insbesondere HEK 293-Zellen, welche für das Wachstum in Suspension adaptiert wurden und welche in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann aufgetaut und erneut gezüchtet werden können. HEK 293-Zellen werden beispielsweise im US-Patent Nr. 5,024,939 von Gorman (siehe auch Stillman et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 2051–2060) beschrieben. Derzeit bevorzugte Zellen schließen auch diejenigen ein, welche zur Expression endogener oder heterologer spannungsabhängiger Calciumkanäle in der Lage sind.
  • Nukleinsäuren können unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren stabil in Zellen inkorporiert oder vorübergehend eingeführt werden. Stabil transfizierte Säugerzellen können hergestellt werden durch Transfektion von Zellen mit einem Expressionsvektor, der ein selektierbares Markergen aufweist (wie z.B. das Gen für Thymidinkinase, Dihydrofolatreduktase, Neomycinresistenz und dgl.) und Züchtung der transfizierten Zellen unter Bedingungen, welche selektiv sind für Zellen, die das Markergen exprimieren. Zur Herstellung solcher Zellen sollten die Zellen mit einer ausreichenden Konzentration an untereinheits-kodierenden Nukleinsäuren transfiziert werden, um humane neuronale nikotinerge AChRs zu bilden, welche die von heterologer DNA kodierten humanen Untereinheiten enthalten. Die genauen Mengen und Verhältnisse von DNA, welche für die Untereinheiten kodiert, kann empirisch bestimmt und für eine bestimmte Kombination von Untereinheiten, Zellen und Assay-Bedingungen optimiert werden. Rekombinante Zellen, die einen neuronalen nikotinergen AChR exprimieren, welcher Untereinheiten enthält, die nur von der heterologen DNA oder RNA kodiert werden, sind besonders bevorzugt.
  • Heterologe DNA kann in der Zelle als episomales Element aufrechterhalten werden oder in die chromosomale DNA der Zelle integriert werden. Die resultierenden rekombi nanten Zellen können dann von einer solchen Kultur oder einer Subkultur davon kultiviert oder subkultiviert werden (oder, im Falle von Säugerzellen, Passagen unterworfen werden). Verfahren zur Transfektion, Injektion und Kultivierung rekombinanter Zellen sind dem geschulten Fachmann bekannt. Gleichermaßen können die humanen neuronalen nikotinergen AChR-Untereinheiten unter Anwendung von Proteinreinigungsverfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, gereinigt werden. Beispielsweise können Antikörper oder andere Liganden, welche spezifisch an eine oder mehrere der Untereinheiten binden, für die Affinitätsreinigung der Untereinheit oder humaner neuronaler nikotinerger AChRs, welche die Untereinheiten enthalten, eingesetzt werden.
  • Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Antikörper bereitgestellt, welche gegen die oben beschriebenen Untereinheitsproteine gebildet wurden. Solche Antikörper können zur Untersuchung der Rezeptorgewebelokalisierung, Untereinheitszusammensetzung, Struktur funktioneller Domänen sowie in diagnostischen Anwendungen, therapeutischen Anwendungen und dgl. eingesetzt werden. Vorzugsweise werden die eingesetzten Antikörper für therapeutische Anwendungen monoklonale Antikörper sein.
  • Die oben beschriebenen Antikörper können unter Anwendung von Standardtechniken, wie sie Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Untereinheitsproteine oder Teile davon als Antigene für die Antikörperproduktion hergestellt werden. Sowohl Anti-Peptid- als auch Anti-Fusionsprotein-Antikörper können eingesetzt werden [siehe beispielsweise Bahouth et al. (1991), Trends Pharmacol Sci. Bd. 12: 338–343, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrsg.), John Wiley and Sons, New York (1989)]. Faktoren, welche bei der Auswahl von Teilen der NAChR-Untereinheiten zur Verwendung als Immunogen (als entweder ein synthetisches Peptid oder ein rekombinant hergestelltes bakterielles Fusionsprotein) zu berücksichtigen sind, umfassen die Antigenizität, Zugänglichkeit (d.h. extrazelluläre und zytoplasmatische Domänen), Einmaligkeit für die spezielle Untereinheit etc.
  • Die Verfügbarkeit von untereinheits-spezifischen Antikörpern ermöglicht die Anwendung der Technik der Immunhistochemie, um die Verteilung und Expressionsdichte verschiedener Untereinheiten (z.B. in normalem gegenüber krankheitsbefallenem Gehirngewebe) zu überwachen. Solche Antikörper könnten auch für diagnostische und therapeutische Anwendungen eingesetzt werden.
  • Ebenfalls beschrieben sind hier Verfahren zur Modulierung der Ionenkanalaktivität eines Rezeptors oder von Rezeptoren der Erfindung durch Kontaktieren des Rezeptors bzw. der Rezeptoren mit einer wirksamen Menge der oben beschriebenen Antikörper.
  • Die Antikörper der Erfindung können einem Individuum unter Anwendung von Standardverfahren, wie z.B. durch intraperitoneale, intramuskuläre, intravenöse oder subkutane Injektion, Implantation oder transdermale Verabreichungswege und dgl., verabreicht werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann unschwer Dosierungsformen, Behandlungspläne etc. in Abhängigkeit von dem eingesetzten Verabreichungsweg festlegen.
  • Verfahren zur Herstellung von Zellen, welche humane neuronale nikotinerge AChR-Untereinheiten und funktionelle Rezeptoren exprimieren, sind ebenfalls beschrieben. Bei einem solchen Verfahren werden Wirtszellen mit DNA transfiziert, welche für mindestens eine Alpha-Untereinheit eines neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors und mindestens eine Beta-Untereinheit eines neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert. Unter Anwendung von Verfahren wie Northernblot- oder Slot-Blot-Analyse können transfizierte Zellen ausgewählt werden, welche für eine Alpha- und/oder Beta-Untereinheit kodierende DNA oder RNA enthalten. Transfizierte Zellen werden auch analysiert, um diejenigen zu identifizieren, welche NAChR-Protein exprimieren. Die Analyse kann beispielsweise erfolgen durch Messen des Vermögens von Zellen zur Bindung an Acetylcholin, Nikotin oder einen Nikotin-Agonisten im Vergleich zu dem Nikotinbindungsvermögen von untransfizierten Wirtszellen oder anderen geeigneten Kontrollzellen, durch elektrophysiologische Überwachung der Ströme durch die Zellmembran in Reaktion auf einen Nikotin-Agonisten und dgl.
  • In besonders bevorzugten Aspekten exprimieren eukaryotische Zellen, welche heterologe DNAs enthalten, solche DNA und bilden rekombinante funktionelle neuronale nikotinerge AChR(s). In bevorzugteren Aspekten ist die Aktivität des rekombinanten neuronalen nikotinergen AChR unschwer nachweisbar, da sie ein Typ ist, welcher bei der untransfizierten Wirtszelle fehlt oder von einer Größe ist, welche die untransfizierte Zelle nicht zeigt. Solche Zellen, welche rekombinante Rezeptoren enthalten, könnten beispielsweise hergestellt werden, indem Zellen, welche mit DNA, kodierend für die humanen neuronalen nikotinergen AChR-α3- und -β4-Untereinheiten, transfiziert worden sind, zur Expression der entsprechenden Proteine veranlasst werden. Die resultierenden synthetischen oder rekombinanten Rezeptoren würden nur die α3- und β4-nNAChR-Untereinheiten enthalten. Solche Rezeptoren wären von Nutzen für eine Vielfalt von Anwendungen, beispielsweise als Teil eines Assay-Systems, welches frei von den Störungen ist, die häufig bei Assay-Systemen im Stand der Technik unter Anwendung von nicht-humanen Rezeptoren oder humanen Gewebepräparationen auftreten. Ferner würde das Testen von einzelnen Rezeptor-Untereinheiten mit einer Vielfalt potentieller Agonisten oder Antagonisten zusätzliche Informationen bezüglich der Funktion und Aktivität der individuellen Untereinheiten ergeben. Es steht zu erwarten, dass solche Informationen zur Identifizierung von Ver bindungen führen, welche zu einer sehr spezifischen Wechselwirkung mit einer oder mehreren der Rezeptor-Untereinheiten in der Lage sind. Eine solche Spezifität könnte sich von großem Wert bei der medizinischen Anwendung erweisen.
  • Ebenfalls hier beschrieben sind funktionelle Peptidfragmente und funktionelle Kombinationen davon, welche von den DNAs der Erfindung kodiert werden. Solche funktionellen Peptidfragmente können von Fachleuten auf dem Gebiet ohne übermäßige Versuche hergestellt werden durch Eliminierung einiger oder aller der Aminosäuren in der Sequenz, welche für die Funktion des Peptids als NAChR nicht essentiell sind. Eine Bestimmung der Aminosäuren, welche für die NAChR-Funktion essentiell sind, geschieht beispielsweise durch systematische Verdauung der DNAs, welche für die Peptide kodieren, und/oder durch die Einführung von Deletionen in die DNAs. Die modifizierten (z.B. deletierten oder verdauten) DNAs werden beispielsweise durch Transkription der DNA und anschließende Einführung der resultierenden mRNA in Xenopus-Oozyten, wo die Translation der mRNAs stattfinden wird, exprimiert. Eine funktionelle Analyse der so in den Oozyten exprimierten Proteine erfolgt durch Exposition der Oozyten gegenüber Liganden, welche bekanntermaßen an NAChR binden und diese funktionell aktivieren, und anschließende Überprüfung der Oozyten, um festzustellen, ob wiederum endogene Kanäle aktiviert werden. Falls Ströme nachgewiesen werden, sind die Fragmente als NAChR funktionell.
  • Somit kann DNA, die für eine oder mehrere humane neuronale nikotinerge AChR-Untereinheit(en) kodiert, in geeignete Wirtszellen (z.B. eukaryotische oder prokaryotische Zellen) zur Expression individueller Untereinheiten und funktioneller NAChRs eingeführt werden. Bevorzugte Kombinationen von Alpha- und Beta-Untereinheiten können in Zellen eingeführt werden: solche Kombinationen umfassen Kombinationen von einer oder mehrerer von α1, α2, α3, α4, α5 und α7 mit β2 oder β4. Sequenzinformation für α1 wird in Biochem. Soc. Trans. (1989), 17: 219–220, angegeben, Sequenzinformation für α5 wird in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89: 1572–1576, angegeben und Sequenzinformation für α2, α3, α4, α7, β2 und β4 wird in dem hier bereitgestellten Sequenzverzeichnis angegeben. Derzeit bevorzugte Kombinationen von Untereinheiten umfassen irgendeine oder mehrere von α1, α2, α3 oder α4 mit β4, oder α2, α3 oder α4 in Kombination mit entweder β2 oder β4. Es ist bekannt, dass einige der Untereinheiten eine Ionentransportfunktion in Abwesenheit weiterer Untereinheiten aufweisen können. Beispielsweise könnte die α7-Untereinheit in Abwesenheit irgendeiner zugegebenen Beta-Untereinheit funktionieren.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich "α2-Untereinheits-DNA" auf DNA, welche für eine humane neuronale nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit derselben Bezeichnung kodiert, und auf DNA, welche unter Bedingungen hoher Stringenz mit der DNA von SEQ-ID-Nr. 1 hybridisiert oder mit der DNA des hinterlegten Klons mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 68277 oder mit DNA, welche für die in SEQ-ID-Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz kodiert. Soweit nicht eine α2-Untereinheit das Ergebnis einer Splice-Variante ist, weist eine α2-DNA typischerweise eine wesentliche Sequenzhomologie (mehr als etwa 90%) mit der hier beschriebenen α2-DNA auf. DNA oder RNA, die für eine Splice-Variante kodiert, kann weniger als 90% gesamte Sequenzhomologie mit der hier beschriebenen DNA oder RNA aufweisen, jedoch würde eine solche Splice-Variante Bereiche von nahezu 100%iger Homologie mit der oben beschriebenen DNA einschließen.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich "α3-Untereinheits-DNA" auf DNA, welche für eine neuronale Untereinheit derselben Bezeichnung kodiert, und auf DNA, welche unter Bedingungen hoher Stringenz mit der DNA von SEQ-ID-Nr. 3 hybridisiert oder mit der DNA des hinterlegten Klons mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 68278 oder mit DNA, welche für die in SEQ-ID-Nr. 4 angegebene Aminosäuresequenz kodiert. Soweit eine α3-Untereinheit nicht das Ergebnis einer Splice-Variante ist, weist eine α3-DNA typischerweise eine wesentliche Sequenzhomologie (mehr als etwa 90%) mit der hier beschriebenen α3-DNA auf. DNA oder RNA, die für eine Splice-Variante kodiert, kann weniger als 90% gesamte Sequenzhomologie mit der hier bereitgestellten DNA oder RNA aufweisen, jedoch würde eine solche Splice-Variante Bereiche von nahezu 100%iger Homologie mit der oben beschriebenen DNA einschließen.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich "α5-Untereinheits-DNA" auf DNA, welche für eine humane neuronale nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit derselben Bezeichnung kodiert, wie beispielsweise beschrieben von Chini et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1572–1576.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich "β2-Untereinheits-DNA" auf DNA, welche für eine neuronale Untereinheit derselben Bezeichnung kodiert, und auf DNA, welche unter Bedingungen hoher Stringenz mit der DNA von SEQ-ID-Nr. 9 hybridisiert oder mit der DNA des hinterlegten Klons HnAChRβ2, mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 68279, oder mit DNA, welche für die in SEQ-ID-Nr. 10 angegebene Aminosäuresequenz kodiert. Soweit nicht eine β2-Untereinheit das Ergebnis einer Splice-Variante ist, weist eine β2-DNA typischerweise eine wesentliche Sequenzhomologie (mehr als etwa 90%) mit der hier beschriebenen β2-DNA auf. DNA oder RNA, die für eine Splice-Variante kodiert, kann insgesamt mehr als 90% Homologie mit der hier bereitgestellten DNA oder RNA aufweisen, jedoch würde eine solche Splice-Variante Bereiche von nahezu 100%iger Homologie mit der oben beschriebenen DNA einschließen.
  • In bestimmten Ausführungsformen werden eukaryotische Zellen mit heterologen humanen neuronalen nikotinergen AChRs hergestellt durch Einführung in die Zelle einer ersten Zusammensetzung, welche mindestens ein RNA-Transkript enthält, das in der Zelle in eine Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen AChR translatiert wird. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die translatierten Untereinheiten eine Alpha-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen AChR. Bevorzugter enthält die Zusammensetzung, welche eingeführt wird, ein RNA-Transkript, welches für eine Alpha-Untereinheit kodiert, und enthält auch ein RNA-Transkript, welches für eine Beta-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen AChR kodiert. RNA-Transkripte können von Zellen erhalten werden, die mit DNAs, kodierend für humane neuronale nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten, transfiziert wurden, oder durch in vitro-Transkription von untereinheits-kodierenden DNAs. Verfahren zur in vitro-Transkription klonierter DNA und Injektion der resultierenden mRNA in eukaryotische Zellen sind im Stand der Technik wohlbekannt. Amphibien-Oozyten sind besonders bevorzugt zur Expression von in vitro-Transkripten der hier bereitgestellten humanen nNAChR-DNA-Klone. Siehe beispielsweise Dascal (1989), CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 317–387, hinsichtlich eines Überblicks der Verwendung von Xenopus-Oozyten zur Untersuchung von Ionenkanälen.
  • So ist die paarweise (oder schrittweise) Einführung von DNA oder RNA, die für Alpha- und Beta-Untereinheiten kodiert, in Zellen möglich. Die resultierenden Zellen können mit den hier bereitgestellten oder Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Verfahren getestet werden, um funktionelle AChR-Aktivität nachzuweisen. Solche Tests werden die Identifizierung von Paaren von Alpha- und Beta-Untereinheiten, welche funktionelle AChRs bilden, sowie individueller Untereinheiten, welche funktionelle AChRs bilden, erlauben.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich ein rekombinanter oder heterologer humaner neuronaler nikotinerger AChR auf einen Rezeptor, welcher eine oder mehrere Untereinheit(en) enthält, kodiert von heterologer DNA, welche in Zellen, die zur Expression von Rezeptorprotein in der Lage sind, eingeführt und darin exprimiert wurden. Ein rekombinanter humaner neuronaler nikotinerger AChR kann auch Untereinheiten einschließen, welche von DNA, die der Wirtszelle endogen ist, gebildet werden. In bestimmten Ausführungsformen können rekombinante oder heterologe humane neuronale nikotinerge AChR nur Untereinheiten enthalten, welche von heterologer DNA kodiert werden.
  • Rekombinante Rezeptoren auf Oberflächen rekombinanter eukaryotischer Zellen können eine oder mehrere Untereinheit(en) enthalten, welche von der DNA oder mRNA, kodierend für humane neuronale nikotinerge AChR-Untereinheiten, kodiert wird/werden oder können eine Mischung von Untereinheiten, die von der Wirtszelle kodiert werden, und Untereinheiten, die von heterologer DNA oder mRNA kodiert werden, enthalten. Rekombinante Rezeptoren können homogen sein oder eine Mischung von Subtypen. Mischungen von DNA oder mRNA, kodierend für Rezeptoren verschiedener Spezies, wie z.B. Ratten und Menschen, können ebenfalls in die Zellen eingeführt werden. So kann eine Zelle hergestellt werden, welche rekombinante Rezeptoren exprimiert, die nur α3- und β4-Untereinheiten enthalten oder irgendeine andere Kombination von hier bereitgestellten Alpha- und Beta-Untereinheiten. Beispielsweise können α4- und/oder α7-Untereinheiten der vorliegenden Erfindung mit β2- und/oder β4-Rezeptor-Untereinheiten koexprimiert werden, gleichermaßen können β4-Untereinheiten der vorliegenden Erfindung mit α2-, α3-, α4-, α5- und/oder α7-Rezeptor-Untereinheiten koexprimiert werden. Wie oben angegeben, können einige der nNAChR-Untereinheiten zur Bildung funktioneller Rezeptoren in Abwesenheit anderer Untereinheiten in der Lage sein, somit ist eine Koexpression nicht immer erforderlich, um funktionelle Rezeptoren herzustellen.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich die Aktivität eines humanen neuronalen nikotinergen AChR auf irgendeine Aktivität, welche für einen NAChR charakteristisch ist. Eine solche Aktivität kann typischerweise durch eine oder mehrere in vitro-Methode(n) gemessen werden und entspricht häufig einer in vivo-Aktivität eines humanen neuronalen nikotinergen AChR. Eine solche Aktivität kann nach irgendeinem Fachleuten bekannten Verfahren gemessen werden, wie z.B. Messen der Strommenge, welche durch den rekombinanten Kanal als Reaktion auf einen Stimulus fließt.
  • Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Aktivität humaner neuronaler nikotinerger AChRs umfassen Assays, welche die Nikotin-Bindung, den 86Rb-Ionenfluß, Ca2+-Einstrom, die elektrophysiologische Reaktion der Zellen, die elektrophysiologische Reaktion von Zellen, die mit RNA aus den Zellen transfiziert wurden, und dgl. messen. Insbesondere werden hier Verfahren bereitgestellt zur Messung oder zum Nachweis einer AChR-vermittelten Reaktion auf den Kontakt von Zellen, welche die DNA oder mRNA enthalten, mit einer Testverbindung.
  • Wie hier verwendet, ist ein funktioneller neuronaler nikotinerger AChR ein Rezeptor, welcher eine Aktivität von neuronalen nikotinergen AChRs aufweist, wie mit irgendeinem hier offenbarten in vitro- oder in vivo-Assay oder solchen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, festgestellt. Der Besitz irgendeiner solchen Aktivität, welche durch irgendein Fachleuten bekanntes Verfahren ermittelt werden kann, ist ausreichend, um einen Rezeptor als funktionell zu bezeichnen. Verfahren zum Nachweis von NAChR-Protein und/oder -Aktivität umfassen beispielsweise Assays, welche die Nikotin-Bindung, den 86Rb-Ionenfluß, Ca2+-Einstrom, die elektrophysiologische Reaktion von Zellen, die heterologe DNA oder mRNA, kodierend für eine oder mehrere Rezeptor-Untereinheit(en), enthalten, und dgl. messen. Nachdem nicht alle Kombinationen von Alpha- und Beta-Untereinheiten funktionelle Rezeptoren bilden mögen, sollten zahlreiche Kombinationen von Alpha- und Beta-Untereinheiten getestet werden, um eine spezielle Untereinheit und Zellen, welche diese produzieren, vollständig zu charakterisieren. Somit bedeutet "funktionell" bezüglich eines rekombinanten oder heterologen humanen neuronalen nikotinergen AChR, wie hier verwendet, dass der Rezeptor-Kanal in der Lage ist, den Eintritt von Ionen, welche humane neuronale nikotinerge AChR passieren können, wie z.B. Na+, K+, Ca2+ oder Ba2+, als Reaktion auf einen Stimulus zu ermöglichen und zu regulieren, und/oder Liganden mit Affinität für den Rezeptor zu binden. Vorzugsweise ist eine solche humane neuronale nikotinerge AChR-Aktivität beispielsweise durch elektrophysiologische, pharmakologische und andere Mittel, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, von irgendeiner endogenen nikotinergen AChR-Aktivität unterscheidbar, welche von der Wirtszelle produziert werden kann.
  • Gemäß einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Säugerzellen oder Oozyten, die einen humanen neuronalen nikotinergen AChR exprimieren, mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden und die modulierende Wirkung(en) davon kann dann durch Vergleichen der AChR-vermittelten Reaktion in Anwesenheit und Abwesenheit der Testverbindung oder durch Vergleichen der AChR-vermittelten Reaktion von Testzellen oder Kontrollzellen (d.h., Zellen, welche keine nNAChRs exprimieren) auf die Anwesenheit der Verbindung beurteilt werden.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich eine Verbindung oder ein Signal, welches "die Aktivität eines neuronalen nikotinergen AChR moduliert", auf eine Verbindung oder ein Signal, welche(s) die Aktivität eines NAChR ändert, so dass die Aktivität des NAChR in Anwesenheit der Verbindung oder des Signals anders ist als in Abwesenheit der Verbindung oder des Signals. Insbesondere umfassen solche Verbindungen oder Signale Agonisten und Antagonisten. Der Begriff Agonist bezieht sich auf eine Substanz oder ein Signal, wie z.B. ACh, welche(s) die Rezeptorfunktion aktiviert, und der Begriff Antagonist bezieht sich auf eine Substanz, welche die Rezeptorfunktion stört. Typischerweise wird die Wirkung eines Antagonisten als Blockierung der Aktivierung durch einen Agonisten beobachtet. Antagonisten umfassen kompetitive und nicht-kompetitive Antagonisten. Ein kompetitiver Antagonist (oder kompetitiver Blocker) wechselwirkt mit oder in der Nähe der Stelle, welche für den Agonisten (z.B. Ligand oder Neurotransmitter) spezifisch ist, bei derselben oder nahe gelegenen Stelle. Ein nicht-kompetitiver Antagonist oder Blocker inaktiviert die Funktion des Rezeptors durch Wechselwirkung mit einer anderen Stelle als der Stelle, weiche mit dem Agonisten wechselwirkt.
  • Wie für Fachleute auf dem Gebiet ersichtlich, erfordern Assay-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität eines humanen neuronalen nikotinergen AChR modulieren (z.B. Agonisten und Antagonisten), im allgemeinen den Vergleich mit einer Kontrolle. Ein Typ einer "Kontroll"-Zelle oder "Kontroll"-Kultur ist eine Zelle oder Kultur, welche im wesentlichen auf dieselbe Weise behandelt wird wie die Zelle oder Kultur, welche der Testverbindung ausgesetzt wird, mit der Ausnahme, dass die Kontrollkultur nicht der Test verbindung ausgesetzt wird. Beispielsweise kann dieselbe Zelle in Verfahren, bei denen elektrophysiologische Spannungsklemmen-Verfahren angewandt werden, in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung getestet werden, indem lediglich die externe Lösung, in der die Zelle badet, ausgetauscht wird. Ein weiterer Typ einer "Kontroll"-Zelle oder "Kontroll"-Kultur kann eine Zelle oder eine Kultur von Zellen sein, welche mit den transfizierten Zellen identisch sind, mit Ausnahme dessen, dass die für die Kontrollkultur eingesetzten Zellen keine funktionellen humanen neuronalen nikotinergen AChRs exprimieren. In diesem Fall wird die Reaktion der Testzelle auf die Testverbindung mit der Reaktion (oder mangelnden Reaktion) einer rezeptor-negativen (Kontroll)-Zelle auf die Testverbindung verglichen, wenn Zellen oder Kulturen eines jeden Zelltyps im wesentlichen denselben Reaktionsbedingungen in Gegenwart der zu testenden Verbindung ausgesetzt werden.
  • Der funktionelle rekombinante humane neuronale nikotinerge AChR umfasst mindestens eine Alpha-Untereinheit oder eine Alpha-Untereinheit und eine Beta-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen AChR. Eukaryotische Zellen, welche diese Untereinheiten exprimieren, wurden durch Injektion von RNA-Transkripten und durch Transfektion von DNA hergestellt. Solche Zellen zeigten eine nikotinerge AChR-Aktivität, welche humanen neuronalen nikotinergen AChRs zuschreibbar ist, die eine oder mehrere der heterologen humanen neuronalen nikotinergen AChR-Untereinheiten enthalten. Beispielsweise zeigten Xenopus laevis-Oozyten, denen in vitro-Transkripte der für die humanen neuronalen nikotinergen AChR-α3- und -β4-Untereinheiten kodierenden DNA injiziert wurden, durch einen AChR-Agonisten induzierte Ströme, wohingegen Zellen, denen Transkripte von entweder der α3- oder β4-Untereinheit allein injiziert worden waren, dies nicht taten. Darüber hinaus zeigten HEK 293-Zellen, welche mit DNA, kodierend für die α3- und β4-Untereinheiten eines humanen neuronalen NAChR, kotransfiziert worden waren, AChR-Agonist-induzierte Zunahmen der intrazellulären Calciumkonzentration, wohingegen Kontroll-HEK 293-Zellen (d.h. Zellen, welche nicht mit α3- und β4-kodierender DNA transfiziert worden waren) keinerlei AChR-Agonist-induzierte Zunahmen der intrazellulären Calciumkonzentration aufwiesen.
  • Bezüglich der Messung der Aktivität funktioneller heterologer humaner neuronaler nikotinerger AChRs sollte endogene AChR-Aktivität und, gewünschtenfalls, Aktivität von AChRs, welche eine Mischung von endogenen Wirtszell-Untereinheiten und heterologen Untereinheiten enthalten, falls möglich, in einem signifikanten Ausmaß durch chemische, pharmakologische und elektrophysiologische Mittel inhibiert werden.
  • Hinterlegungen
  • Die hinterlegten Klone wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20852, gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinsichtlich der Internationalen Anerkennung von Hinterlegungen von Mikroorganismen für die Zwecke einer Patenterteilung und der gemäß diesem Vertrag erlassenen Regeln hinterlegt. Proben des hinterlegten Materials sind für Patentämter und andere Personen, welche gemäß den Bedingungen des Vertrags und der Regeln und ansonsten in Übereinstimmung mit den Patentgesetzen und Regelwerken der Vereinigten Staaten von Amerika und aller anderen Nationen oder internationalen Organisationen, bei denen diese Anmeldung oder eine Anmeldung, welche die Priorität dieser Anmeldung beansprucht, eingereicht wird oder bei denen irgendein Patent, das auf irgendeiner solchen Anmeldung basiert, erteilt wird, gesetzlich zu deren Empfang berechtigt sind, jetzt und in Zukunft verfügbar. Insbesondere werden nach Erteilung eines US-Patents, das auf dieser oder irgendeiner Anmeldung, welche die Priorität dieser Anmeldung beansprucht oder diese Anmeldung durch die Bezugnahme mit einschließt, basiert, alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit des hinterlegten Materials unwiderruflich wegfallen.
  • Die Erfindung wird nun detaillierter unter Bezugnahme auf die folgenden nichtbeschränkenden Beispiele beschrieben werden.
  • BEISPIEL 1
  • Isolierung von DNA, welche für humane nNAChR-Untereinheiten kodiert
  • A. DNA, welche für eine humane nNAChR-β4-Untereinheit kodiert
  • Statistische Primer wurden eingesetzt zur Synthese von cDNA aus RNA, die aus der Human-Neuroblastom-Zellinie IMR32 isoliert worden war (die Zellen waren in 1 mM Dibutyryl-cAMP 10 Tage lang vor der Erstellung der Bank gezüchtet worden). Die aus den cDNAs erstellte Bank wurde mit einem Fragment einer cDNA einer nikotinergen Ratten-AChR-β4-Untereinheit gescreent. Die Hybridisierung wurde bei 42°C in 5 × SSPE, 5 × Denhardts Lösung, 50% Formamid, 200 μg/ml Heringssperma-DNA und 0,2% SDS durchgeführt. Waschungen wurden in 0,1 × SSPE, 0,2% SDS bei 65°C durchgeführt. Fünf Klone wurden identifiziert, welche mit der Sonde hybridisierten.
  • Die fünf Klone wurden plaquegereinigt und durch Restriktionsenzym-Kartierung und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Die Insert-DNA eines der fünf Klone enthielt die vollständige kodierende Sequenz einer β4-Untereinheit eines humanen nikotinergen AChR (siehe Nukleotide 87–1583 von SEQ-ID-Nr. 11). Die aus der Nukleotidsequenz des Volllängen-Klons abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt ~82% Identität mit der Aminosäuresequenz, welche von der DNA der nikotinergen AChR-β4-Untereinheit der Ratte abgeleitet worden war. Mehrere Regionen der abgeleiteten Ratten- und Human-β4-Aminosäuresequenzen sind bemerkenswert unähnlich: die Aminosäuren 1–23 (die humane Sequenz hat nur ~36% Identität mit der Rattensequenz), 352–416 (die Humansequenz hat nur ~48% Identität mit der Rattensequenz) und 417–492 (die humane Sequenz hat nur ~78% Identität mit der Rattensequenz). Ferner sind die Aminosäuren 376–379 in der Ratten-β4-Untereinheit nicht in der humanen β4-Untereinheit enthalten.
  • B. DNA, welche für eine humane nNAChR-α7-Untereinheit kodiert
  • Eine amplifizierte IMR32-Zell-cDNA-Bank (1 × 106 Rekombinante; die Zellen wurden vor der Erstellung der Bank 10 Tage lang mit 1 mM Dibutyryl-cAMP behandelt) wurde mit einem Fragment einer cDNA einer nikotinergen Ratten-AChR-α7-Untereinheit gescreent. Die Hybridisierungsbedingungen waren identisch mit den oben beschriebenen zum Screenen einer IMR32-Zell-cDNA-Bank mit der Ratten-β4-Untereinheits-DNA. Waschungen wurden in 0,2 × SSPE, 0,2% SDS bei 65°C durchgeführt. Sieben positive Klone wurden durch Hybridisierung mit der markierten Ratten-DNA-Sonde identifiziert. Sechs der Klone wurden plaquegereinigt und durch Restriktionsenzym-Kartierung und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Einer der Klone enthält die vollständige kodierende Sequenz eines humanen AChR-Rezeptor-α7-Untereinheits-Gens (siehe Nukleotide 73–1581 von SEQ-ID-Nr. 7).
  • C. DNA, welche für eine humane nNAChR-α4-Untereinheit kodiert
  • Statistische Primer wurden bei der Synthese von cDNA aus RNA, die aus humanem Hippocampus-Gewebe isoliert worden war, eingesetzt. cDNAs, die größer als 2,0 kb waren, wurden in den Phagenvektor λgt10 inseriert, um eine cDNA-Bank zu erstellen. Etwa 1 × 106 Rekombinante wurden mit einem Fragment einer DNA, kodierend für eine nikotinerge Ratten-AChR-α4-Untereinheit, unter Anwendung derselben Hybridisierungs- und Waschbedingungen wie oben zum Screenen einer IMR32-Zell-cDNA-Bank für α7-Untereinheits-cDNAs beschrieben gescreent. Drei Klone hybridisierten stark mit der Sonde. Zwei dieser drei Klone, bezeichnet als KEα4.1 und KEα4.2, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) hinterlegt und erhielten die Hinterlegungs-Nrn. 69152 bzw. 69239.
  • Die Charakterisierung der plaquegereinigten Klone offenbarte, dass einer der Klone, KEα4.2, die vollständig kodierende Sequenz eines humanen nikotinergen AChR-α4-Untereinheits-Gens enthält (die kodierende Sequenz dieser humanen α4-Untereinheits-cDNA ist als Nukleotide 173–2056 in SEQ-ID-Nr. 5 bereitgestellt). Ein Vergleich der 5'-Enden der kodierenden Sequenzen der Human- und Ratten-α4-Untereinheits-cDNAs offenbart, neben anderen Unterschieden, dass die Rattensequenz ein 18-Nukleotide-Segment enthält, das in der humanen Sequenz nicht vorhanden ist.
  • D. DNA, welche für humane nNAChR-α2-, -α3- & -β2-Untereinheiten kodiert
  • Plasmide, enthaltend DNA, welche für Nukleinsäuren kodiert, die für humane neuronale nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten α2, α3 und β2 kodieren, und/oder welche zur Isolierung dieser Nukleinsäuren verwendet werden kann, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt. Die Klonbezeichnungen und Hinterlegungs-Nrn. sind:
  • Figure 00310001
  • Darüber hinaus sind DNA-Sequenzen, welche für α2-, α3- und β2-Untereinheiten vollständiger Länge kodieren, in den SEQ-ID-Nrn. 1, 3 bzw. 9 angegeben.
  • BEISPIEL 2
  • Herstellung von Konstrukten zur Expression von rekombinanten humanen neuronalen nikotinergen AChR-Untereinheiten
  • Isolierte cDNAs, kodierend für humane neuronale nikotinerge AChR-Untereinheiten, wurden inkorporiert in Vektoren zur Verwendung bei der Expression der Untereinheiten in Säugerwirtszellen und zur Verwendung bei der Herstellung von in vitro-Transkripten für die Expression in Xenopus-Oozyten. Mehrere verschiedene Vektoren wurden zur Herstellung der Konstrukte wie folgt verwendet.
  • A. Konstrukt zur Expression einer humanen nNAChR-α3-Untereinheit
  • DNA, kodierend für eine humane neuronale nikotinerge AChR-α3-Untereinheit, wurde in den allgemeinen Expressionsvektor pCMV-T7-2 subkloniert, um pCMV-KEα3 zu schaffen. Das Plasmid pCMV-T7-2 (siehe 1) ist ein Vektor auf pUC19-Basis, welcher einen CMV-Promotor/Enhancer, SV40-Splice-Donor/Splice-Akzeptor-Stellen unmittelbar stromabwärts des Promotors, einen stromabwärts der SV40-Splice-Stellen gelegenen T7-Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor, ein SV40-Polyadenylierungssignal stromabwärts des T7-Promotors und einen Polylinker zwischen dem T7-Promotor und dem Polyadenylierungssignal enthält. Dieser Vektor enthält so alle regulatorischen Elemente, welche zur Expression von heterologer DNA in einer Säugerwirtszelle erforderlich sind, wobei die heterologe DNA an dem Polylinker in den Vektor inkorporiert wurde. Nachdem sich der T7-Promotor gerade stromaufwärts des Polylinkers befindet, kann dieses Plasmid darüber hinaus zur Synthese von in vitro-Transkripten von heterologer DNA, welche am Polylinker in den Vektor subkloniert wurde, eingesetzt werden. 1 zeigt auch eine Restriktionskarte von pCMV-T7-3. Dieses Plasmid ist identisch mit pCMV-T7-2, mit der Ausnahme, dass die Restriktionsstellen in dem Polylinker im Vergleich zur Reihenfolge, in der sie in pCMV-T7-2 auftreten, in entgegengesetzter Reihenfolge vorliegen.
  • Ein SfiI (glattendig)/EcoRI-DNA-Fragment von 1,7 kb, enthaltend die Nukleotide 27–1757 von SEQ-ID-Nr. 3 (d.h., die gesamte für die α3-Untereinheit kodierende Sequenz plus 12 Nukleotide 5'-untranslatierter Sequenz und 204 Nukleotide 3'-untranslatierter Sequenz), wurde mit EcoRV/EcoRI-verdautem pCMV-T7-2 ligiert, um pCMV-KEα3 zu erzeugen. Das Plasmid pCMV-KEα3 wurde zur Expression der α3-Untereinheit in Säugerzellen und zur Herstellung von in vitro-Transkripten von der α3-Untereinheits-DNA eingesetzt.
  • B. Konstrukte zur Expression einer humanen nNAChR-β4-Untereinheit
  • Ein 1,9-kb-EcoRI-DNA-Fragment, enthaltend die Nukleotide 1–1915 von SEQ-ID-Nr. 11 (d.h., die gesamte für die β4-Untereinheit kodierende Sequenz plus 86 Nukleotide 5'-untranslatierter Sequenz und 332 Nukleotide 3'-untranslatierter Sequenz), wurde mit EcoRI-verdautem pGEM7Zf(+)(Promega-Katalog # P2251; Madison, WI) ligiert. Das resultierende Konstrukt, KEβ4.6/pGEM, enthält den T7-Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit zwei hintereinander liegenden β4-Untereinheits-DNA-Inserts (in der gleichen Orientierung) und wurde zur Herstellung von in vitro-Transkripten von der DNA eingesetzt.
  • Das gleiche 1,9-kb-EcoRI-DNA-Fragment, enthaltend die Nukleotide 1–1915 von SEQ-ID-Nr. 11, wurde als einziges Insert mit EcoRI-verdautem pCMV-T7-3 ligiert, um pCMV-KEβ4 zu erzeugen. Das Plasmid pCMV-KEβ4 wurde zur Expression der β4-Untereinheit in Säugerzellen und zur Erzeugung von in vitro-Transkripten der β4-Untereinheits-DNA eingesetzt.
  • C. Konstrukte zur Expression einer humanen nNAChR-α7-Untereinheit
  • Zwei Konstrukte auf pCMV-T7-Basis wurden hergestellt zur Verwendung bei der rekombinanten Expression einer humanen neuronalen nikotinergen AChR-α7-Untereinheit. Das erste Konstrukt, pCMV-KEα7.3, wurde hergestellt durch Ligieren eines 1,9-kb-XhoI-DNA-Fragments, enthaltend die Nukleotide 1–1876 von SEQ-ID-Nr. 7 (d.h., die gesamte für die α7-Untereinheit kodierende Sequenz plus 72 Nukleotide 5'-untranslatierter Sequenz und 295 Nukleotide 3'-untranslatierter Sequenz), mit SalI-verdautem pCMV-T7-3. Das zweite Konstrukt, pCMV-KEα7, wurde hergestellt durch Ersetzen der 5'-untranslatierten Sequenz des oben beschriebenen 1,9-kb-XhoI-α7-Untereinheits-DNA-Fragments mit einer Konsensus- Ribosomenbindungsstelle (5'-GCCACC-3'; siehe Kozak (1987), Nucl. Acids Res. 15: 8125–8148). Das resultierende modifizierte Fragment wurde als 1,8-kb-BglII/XhoI-Fragment mit BglII/SalI-verdautem pCMV-T7-2 ligiert, um pCMV-KEα7 herzustellen. Somit geht in pCMV-KEα7 dem Translationsinitiationscodon der kodierenden Sequenz der α7-Untereinheits-cDNA unmittelbar eine Konsensus-Ribosomenbindungsstelle voraus.
  • D. Konstrukte zur Expression einer humanen nNAChR-β2-Untereinheit
  • DNA-Fragmente, kodierend für Teile einer humanen neuronalen nikotinergen AChR-β2-Untereinheit, wurden miteinander ligiert, um eine für eine β2-Untereinheit kodierende Sequenz vollständiger Länge, enthaltend in dem Plasmid pIBI24 (International Biotechnologies, Inc. (IBI), New Haven, CT), zu erzeugen. Das resultierende Konstrukt, Hβ2.1F, enthält die Nukleotide 1–2448 von SEQ-ID-Nr. 9 (d.h., die gesamte für die β2-Untereinheit kodierende Sequenz plus 264 Nukleotide 5'-untranslatierter Sequenz und 675 Nukleotide 3'-untranslatierter Sequenz) in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem T7-Promotor.
  • Nachdem die 5'-untranslatierte Sequenz der β2-Untereinheits-DNA ein potentielles alternatives Translationsinitiationscodon (ATG), beginnend 11 Nukleotide stromaufwärts (Nukleotide 254–256 in SEQ-ID-Nr. 9) des korrekten Translationscodons (Nukleotide 265–267 in SEQ-ID-Nr. 9), enthält und nachdem die Verwendung der stromaufwärts gelegenen ATG-Sequenz zur Initiierung der Translation der β2-DNA zur Erzeugung eines nicht funktionsfähigen Peptids führen könnte (da sich das stromaufwärts gelegene ATG nicht im korrekten Leserahmen befindet), wurde ein weiteres β2-kodierendes Konstrukt wie folgt hergestellt. Ein KspI (glattendig)/EcoRI-DNA-Fragment von 2,2 kb, enthaltend die Nukleotide 260–2448 von SEQ-ID-Nr. 9, wurde mit NotI (glattendig)/EcoRI-verdautem pCMV-T7-3 in funktionsfähiger Verknüpfung mit dem T7-Promotor des Plasmids ligiert, um pCMV-KEβ2 herzustellen. Die in pCMV-KEβ2 enthaltene β2-Untereinheits-DNA enthält nur 5 Nukleotide 5'-untranslatierter Sequenz stromaufwärts des korrekten Translationsinitiationscodons.
  • DNA, kodierend für eine humane NAChR-β2-Untereinheit, wurde auch in den Expressionsvektor pSP64T inkorporiert. Der Vektor pSP64T [siehe Krieg und Melton in Nucleic Acids Research 12: 7057–7070 (1984)] ist eine modifizierte Form des Vektors pSP64 (Promega). Die für eine humane NAChR-β2-Untereinheit kodierende Sequenz (der die Konsensus-Ribosomenbindungsstelle vorangeht) plus 405 Nukleotide des 3'-untranslatierten Bereichs wurden in pSP64T bei einer nur einmal vorkommenden Restriktionsenzym-Klonierungsstelle inkorporiert, welche von 5'- und 3'-untranslatierten Sequenzen aus dem Xenopus-β-Globin-Gen flankiert wird. Diese Sequenzen befinden sich stromabwärts des in pSP64T enthaltenen SP6-Promotors. Der resultierende Vektor, pSP64T-KEβ2RBS1, enthält die für die humane β2-Untereinheit kodierende Sequenz in funktionsfähiger Verknüpfung mit den regulatorischen Bereichen der Transkription von SP6 zur Herstellung von in vitro-Transkripten der heterologen DNA unter Verwendung des MEGAscript-SP6-Kits (Ambion, Katalog-Nr. 1330).
  • E. Konstrukte zur Expression einer humanen nNAChR-α4-Untereinheit
  • Ein Teil des Inserts des Klons KEα4.2 (siehe Beispiel 1C), enthaltend eine für eine humane nNAChR-α4-Untereinheit kodierende Sequenz, wurde in einen modifizierten Vektor pIBI24 wie folgt inkorporiert. Der Vektor pIBI24 wurde modifiziert durch Insertion einer Konsensus-Ribosomenbindungsstelle in den Polylinker gerade stromaufwärts einer NotI-Stelle. Der Vektor wurde mit HindIII und NcoI verdaut. Ein NcoI-HindIII-Fragment, enthaltend eine für eine humane nNAChR-α4-Untereinheit kodierende Sequenz, wurde erhalten durch Verdauung eines Plasmids, das eine humane nNAChR-α4-Untereinheits-DNA enthielt, mit HindIII (welches in einem Polylinker unmittelbar 3' der 3'-untranslatierten Sequenz von KEα4.2 spaltet (siehe SEQ-ID-Nr. 5)), gefolgt von partieller Verdauung mit NcoI (um eine interne NcoI-Stelle, d.h. die Position 1956, SEQ-ID-Nr. 5, beizubehalten), um an der Verbindungsstelle des Translationsinitiationscodons und der 5'-untranslatierten Sequenz der für die α4-Untereinheit kodierenden cDNA zu spalten. Das resultierende 3,25-kb-Fragment wurde mit dem HindIII-NcoI-Fragment des modifizierten Vektors pIBI24 ligiert, um pIBI-KEα4RBSf zu erzeugen. Somit enthält pIBI-KEα4RBSf eine Konsensus-Ribosomenbindungsstelle, unmittelbar gefolgt von der für eine humane nNAChR-α4-Untereinheit kodierenden Sequenz (Nukleotide 173–2056 von SEQ-ID-Nr. 5) und ~1400 Nukleotide 3'-untranslatierter Sequenz (einschließlich der Nukleotide 2057–2363 von SEQ-ID-Nr. 5). Da dieses Konstrukt einen T7-Promotor stromaufwärts der für die α4-Untereinheit kodierenden Sequenz enthält, kann es zur Herstellung von in vitro-Transkripten von α4-DNA eingesetzt werden.
  • BEISPIEL 3
  • Expression von rekombinantem humanem nikotinergem AChR in Oozyten
  • Xenopus-Oozyten wurden in vitro-Transkripte injiziert, welche von Konstrukten, die für α3-, α7-, β2- und β4-Untereinheiten kodierende DNA enthielten, hergestellt worden waren. Elektrophysiologische Messungen der Oozyten-Transmembranströme erfolgten unter Anwendung der Zweielektroden-Spannungsklemmen-Technik (siehe z.B. Stuhmer (1992), Meth. Enzymol. 207: 319–339).
  • 1. Herstellung von in vitro-Transkripten
  • Rekombinante, mit einem Cap versehene Transkripte von pCMV-KEα3, pCMV-KEβ2, KEβ4.6/pGEM und pCMV-KEβ4 wurden von linearisierten Plasmiden unter Einsatz des mCAP-RNA-Capping-Kits (Katalog # 200350 von Stratagene, Inc., La Jolla, CA) synthetisiert. Rekombinante, mit einem Cap versehene Transkripte von pCMV-KEα7, pCMV-KEα7.3, pIBI-KEα4RBSf und Hβ2.1 F wurden von linearisierten Plasmiden unter Verwendung des in-vitro-Transkriptionskits MEGAscript-T7 nach dem vom Hersteller zur Verfügung gestellten Protokoll für mit einem Cap versehene Transkripte (Katalog # 1334 von AMBION, Inc., Austin, TX) synthetisiert. Die Masse eines jeden synthetisierten Transkripts wurde mittels UV-Extinktion bestimmt und die Integrität eines jeden Transkripts wurde mittels Elektrophorese durch ein Agarosegel festgestellt.
  • 2. Elektrophysiologie
  • Xenopus-Oozyten wurden entweder 12,5, 50 oder 125 ng eines Transkripts einer humanen nikotinergen AChR-Untereinheit pro Oozyt injiziert. Die Präparation und Injektion von Oozyten wurde durchgeführt wie beschrieben von Dascal (1987) in Crit. Rev. Biochem. 22: 317–387. Zwei bis sechs Tage nach der mRNA-Injektion wurden die Oozyten unter Anwendung der Zweielektroden-Spannungsklemmen-Technik untersucht. Die Zellen wurden in Ringer'scher Lösung (115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,3), enthaltend 1 μM Atropin mit oder ohne 100 μM d-Tubocurarin, gebadet. An die Zellen wurden Spannungsklemmen mit –60 bis –80 mV angelegt. Daten wurden mit Axotape-Software bei 2–5 Hz ermittelt. Die Agonisten Acetylcholin (ACh), Nikotin und Cytisin wurden bei Konzentrationen im Bereich von 0,1 μM bis 100 μM zugegeben. Die Ergebnisse der elektrophysiologischen Analysen der Oozyten sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
  • Tabelle 1
    Figure 00360001
  • a. Oozyten, denen α3-, α4- und/oder β4-Transkripte injiziert worden waren
  • Oozyten, denen 12,5 ng des α3-Transkripts oder 12,5 ng des β4-Transkripts injiziert worden waren, reagierten nicht auf die Anwendung von bis zu 100 μM ACh, Nikotin oder Cytisin. Somit scheint es so, dass diese Untereinheiten keine funktionellen homomeren nikotinergen AChR-Kanäle bilden. Im Gegensatz dazu wiesen Oozyten, denen 12,5 oder 125 ng des α3-Transkripts und 12,5 ng oder 125 ng des β4-Transkripts injiziert worden waren, nachweisbare einwärts gerichtete Ströme als Reaktion auf ACh, Nikotin und Cytisin bei den getesteten Konzentrationen (0,1 μM bis 10 μM) auf. Es wurden einige Unterschiede in der Kinetik der Reaktionen auf Cytisin im Vergleich zu Nikotin und ACh beobachtet. Die relative Wirksamkeit der Agonisten schien Cytisin > ACh > Nikotin zu sein, was sich von den Ergebnissen ähnlicher Studien von Oozyten unterscheidet, denen Transkripte der α3- und β4-Untereinheiten des nikotinergen Ratten-AChR injiziert wurden (siehe beispielsweise Luetje et al. (1991), J. Neurosci. 11: 837–845).
  • Die Reaktionen auf ACh und Nikotin wurden durch d-Tubocurarin reproduzierbar blockiert. Beispielsweise wurde eine vollständige Blockade der Reaktion auf ACh in Gegenwart von 100 μM d-Tubocurarin beobachtet. Die Inhibierung schien reversibel zu sein. Die Reaktionen auf ACh, Nikotin und Cytisin wurden ebenfalls mindestens teilweise durch 100 nM Mecamylamin blockiert.
  • Die Stromreaktion von α34-injizierten Oozyten auf 10 μM ACh wurde auch als Membranspannung untersucht. In diesen Experimenten wurden die Zellen in Gegenwart von ACh Spannungsstufen ausgesetzt. Der Graph von Strom gegen Spannung schien typisch für Reaktionen, welche für Na+-, K+-permeable Kanäle beobachtet wurden. Beispielsweise ist das Nullstromniveau (Umkehrpotential) geringer als –40 mV. Der Beitrag des Ca++-Flusses zum Gesamtstrom kann ermittelt werden durch Variieren der Calciumkonzentration im äußeren Medium und Vornahme mehrfacher Strommessungen bei verschiedenen Haltepotentialen um das Umkehrpotential herum. Solche Studien weisen darauf hin, dass der Kanal, welcher den als Reaktion auf eine ACh-Behandlung von α34-injizierten Oozyten erzeugten Strom trägt, für Na+, K+ und Ca++ permeabel ist.
  • Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigten Oozyten, denen 125 ng des α4-Transkripts und 125 ng des β4-Transkripts injiziert worden waren, ebenfalls nachweisbare einwärts gerichtete Ströme als Reaktion auf Acetylcholin.
  • b. Oozyten, denen α7-Untereinheits-Transkripte injiziert worden waren
  • Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zwei Konstrukte hergestellt zur Verwendung bei der Expression der humanen neuronalen nikotinergen AChR-α7-Untereinheit. Das Plasmid pCMV-KEα7.3 enthält die für die α7-Untereinheit kodierende Sequenz mit 72 Nukleotiden 5'- untranslatierter Sequenz stromaufwärts des Translationsinitiationscodons. Das Plasmid pCMV-KEα7 enthält die für die α7-Untereinheit kodierende Sequenz ohne irgendeine 5'-untranslatierte Sequenz und enthält ferner eine Konsensus-Ribosomenbindungsstelle unmittelbar stromaufwärts der kodierenden Sequenz.
  • Oozyten, denen 125 ng eines α7-Transkripts, synthetisiert von pCMV-KEα7, injiziert worden war, zeigten einwärts gerichtete Ströme als Reaktion auf 10 oder 100 μM ACh. Diese Reaktion wurde durch 100 μM d-Tubocurarin blockiert.
  • Oozyten, denen 125 ng eines α7-Transkripts, synthetisiert von pCMV-KEα7.3, injiziert worden war, zeigten ACh-induzierte Ströme, welche erheblich schwächer waren als diejenigen von Oozyten, denen ein α7-Transkript, synthetisiert von pCMV-KEα7, injiziert worden war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Transkripte einer humanen neuronalen nikotinergen AChR-α7-Untereinheit, erzeugt von α7-Untereinheits-DNA, die eine Ribosomenbindungsstelle anstelle von 5'-untranslatierter Sequenz enthält, zur Expression des α7-Rezeptors in Oozyten vorzuziehen sein mag.
  • c. Oozyten, denen α3- und β2-Untereinheits-Transkripte injiziert worden waren
  • Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zwei Konstrukte zur Verwendung für die Expression der humanen neuronalen nikotinergen AChR-β2-Untereinheit hergestellt. Das Plasmid Hβ2.1 F enthält die für die β2-Untereinheit kodierende Sequenz mit 266 Nukleotiden 5'-untranslatierter Sequenz stromaufwärts des Translationsinititationscodons. Das Plasmid pCMV-KEβ2 enthält die für die β2-Untereinheit kodierende Sequenz und nur 5 Nukleotide 5'-untranslatierter Sequenz stromaufwärts des Translationsinitiationscodons.
  • Oozyten, denen Transkripte von pCMV-KEα3 und pCMV-KEβ2 injiziert worden waren, zeigten im wesentlichen keinen Strom als Reaktion auf nikotinerge AChR-Agonisten. Im Gegensatz dazu zeigten Oozyten, denen Transkripte von pCMV-KEα3 und Hβ2.1 F injiziert worden waren, ~20 nA einwärts gerichtete Ströme als Reaktion auf 100 μM ACh und einwärts gerichtete Ströme von ~80 nA als Reaktion auf 300 μM ACh. Die Stromreaktion wurde durch 100 μM d-Tubocurarin blockiert.
  • BEISPIEL 4
  • Rekombinante Expression humaner nNAChR-Untereinheiten in Säugerzellen
  • Humane Embryo-Nieren (HEK) 293-Zellen wurden transient (vorübergehend) und stabil mit DNA transfiziert, die für α3- und β4- oder α7-Untereinheiten eines humanen neuronalen nikotinergen AChR kodierte. Transiente Transfektanten wurden hinsichtlich Expression von nikotinergem AChR mit Hilfe verschiedener Assays analysiert, beispiels weise elektrophysiologische Methoden, Assays auf Basis von Ca2+-sensitiven Fluoreszenzindikatoren und [125I]-α-Bungarotoxin-Bindungsassays.
  • 1. Transiente Transfektion von HEK-Zellen
  • Es wurden zwei transiente Transfektionen durchgeführt. Bei einer Transfektion wurden HEK-Zellen transient mit DNA, kodierend für eine α3-Untereinheit (Plasmid pCMV-KEα3) und eine β4-Untereinheit (Plasmid pCMV-KEβ4), kotransfiziert. Bei der anderen Transfektion wurden HEK-Zellen transient mit DNA, kodierend für die α7-Untereinheit (Plasmid pCMV-KEα7), transfiziert. Bei beiden Transfektionen wurden ~2 × 106 HEK-Zellen transient mit 18 μg der/des angegebenen Plasmids(e) nach Standard-CaPO4-Transfektionsverfahren [Wigler et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373–1376] transfiziert. Darüber hinaus wurden 2 μg des Plasmids pCMVβgal (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA), welches das Escherichia coli-β-Galactosidasegen in Fusion mit dem CMV-Promotor enthält, als Reportergen zur Überprüfung der Transfektionseffizienz kotransfiziert. Die Transfektanten wurden hinsichtlich β-Galactosidase-Expression durch Messung der β-Galactosidase-Aktivität analysiert [Miller (1972), Experiments in Molecular Genetics, S. 352–355, Gold Spring Harbor Press]. Transfektanten können auch hinsichtlich β-Galactosidase-Expression analysiert werden durch direkte Anfärbung des Produkts einer Reaktion unter Beteiligung von β-Galactosidase und des X-gal-Substrats [Jones (1986), EMBO 5: 3133–3142].
  • Die Transfektionseffizienz von HEK-Zellen mit pCMV-KEα3/pCMV-KEβ4 war typisch für Standardeffizienzen, wobei die Transfektionseffizienz der HEK-Zellen mit pCMV-KEα7 unterhalb der Standardniveaus lag.
  • 2. Stabile Transfektion von HEK-Zellen
  • HEK-Zellen wurden unter Anwendung des Calciumphosphat-Transfektionsverfahrens transfiziert [Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, Wiley Inter-Science, Suppl. 14, Teil 9.1.1-9.1.9 (1990)]. 10-cm-Platten, jeweils ein bis zwei Millionen HEK-Zellen enthaltend, wurden mit 1 ml DNA/Calciumphosphat-Präzipitat, enthaltend 9,5 μg pCMV-KEα3, 9,5 μg pCMV-KEβ4 und 1 μg pSV2neo (als selektierbarer Marker), transfiziert. Nach 14 Tagen Wachstum in Medium, enthaltend 1 μg/ml G418, hatten sich Kolonien gebildet und wurden individuell mit Hilfe von Klonierungszylindern isoliert. Die Isolate wurden einer Grenzverdünnung unterworfen und gescreent, um diejenigen zu identifizieren, welche das höchste Niveau an nikotinergem AChR exprimierten, wie im folgenden beschrieben.
  • 3. Analyse von Transfektanten
  • a. Assays auf Fluoreszenzindikator-Basis
  • Die Aktivierung des liganden-gesteuerten nikotinergen AChR durch Agonisten führt zu einem Einstrom von Kationen, einschließlich Ca++, durch den Rezeptorkanal. Der Ca++-Eintritt in die Zelle durch den Kanal kann die Freisetzung von Calcium, welches in intrazellulären Speichern enthalten ist, induzieren. Der Eintritt eines einwertigen Kations in die Zelle durch den Kanal kann durch Depolarisation der Membran und anschließende Aktivierung von spannungsabhängigen Calciumkanälen ebenfalls zu einer Erhöhung von zytoplasmatischen Ca++-Niveaus führen. Deshalb können Verfahren zum Nachweis vorübergehender Erhöhungen in der intrazellulären Calciumkonzentration für die Analyse von funktioneller nikotinerger AChR-Expression angewandt werden. Ein Verfahren zur Messung von intrazellulären Calciumniveaus beruht auf calcium-sensitiven Fluoreszenzindikatoren.
  • Calcium-sensitive Indikatoren, wie z.B. Fluo-3 (Katalog Nr. F-1241, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), sind als Acetoxymethylester verfügbar, welche membran-permeabel sind. Wenn die Acetoxymethylesterform des Indikators in eine Zelle gelangt, wird die Estergruppe durch zytosolische Esterasen entfernt, wodurch der freie Indikator im Zytosol eingeschlossen wird. Die Wechselwirkung des freien Indikators mit Calcium führt zu einer erhöhten Fluoreszenz des Indikators; deshalb kann eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration von Zellen, welche den Indikator enthalten, direkt als Zunahme der Fluoreszenz ausgedrückt werden. Ein automatisiertes Fluoreszenznachweissystem für den Assay von nikotinergen AChR wurden in der allgemein genannten anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 07/812,254 und der entsprechenden PCT-Patentanmeldung Nr. US92/11090 beschrieben.
  • HEK-Zellen, welche transient oder stabil mit DNA, welche für α3- und β4-Untereinheiten kodiert, kotransfiziert worden waren, wurden unter Anwendung des automatischen Assays auf Basis eines Fluoreszenzindikators hinsichtlich Expression von funktionellem rekombinanten nikotinergen AChR analysiert. Das Assayverfahren war wie folgt.
  • Untransfizierte HEK-Zellen (oder HEK-Zellen, welche mit pCMV-T7-2 transfiziert worden waren) und HEK-Zellen, welche mit pCMV-KEα3 und pCMV-KEβ4 kotransfiziert worden waren, wurden in den Mulden einer 96-Mulden-Mikrotiterplatte ausplattiert und mit Fluo-3 durch Inkubation für 2 Stunden bei 20°C in einem Medium, enthaltend 20 μM Fluo-3, 0,2% Pluronic F-127 in HBS (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,62 mM MgSO4, 6 mM Glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4), beladen. Die Zellen wurden dann mit Assay-Puffer (d.h. HBS) gewaschen. Der Antagonist d-Tubocurarin wurde einigen der Mulden in einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben. Die Mikrotiterschale wurde dann in ein Fluoreszenzplattenlesegerät plaziert und die Grundfluoreszenz einer jeden Mulde wurde gemessen und vor der Zugabe von 200 μM Nikotin zu den Mulden aufgezeichnet. Die Fluoreszenz der Mulden wurde wiederholt während eines Zeitraums von etwa 60 Sekunden nach Zugabe von Nikotin überprüft.
  • Die Fluoreszenz der untransfizierten HEK-Zellen (oder HEK-Zellen, welche mit pCMV-T7-2 transfiziert worden waren) veränderte sich nicht nach Zugabe von Nikotin. Im Gegensatz dazu nahm die Fluoreszenz der kotransfizierten Zellen in Abwesenheit von d-Tubocurarin nach Zugabe von Nikotin zu den Mulden dramatisch zu. Diese nikotin-stimulierte Zunahme der Fluoreszenz wurde nicht beobachtet bei kotransfizierten Zellen, welche dem Antagonisten d-Tubocurarin ausgesetzt worden waren. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die kotransfizierten Zellen funktionelle rekombinante AChR exprimieren, welche durch Nikotin aktiviert und durch d-Tubocurarin blockiert werden.
  • b. α-Bungarotoxin-Bindungsassays
  • HEK 293-Zellen, die transient mit pCMV-KEα7 transfiziert worden waren, wurden hinsichtlich [125I]-α-Bungarotoxin (BgTx)-Bindung analysiert. Sowohl ganze transfizierte Zellen als auch Membranen, die aus transfizierten Zellen präpariert worden waren, wurden in diesen Assays untersucht. Rattengehirnmembranen waren in den Assays als positive Kontrolle eingeschlossen.
  • Rattengehirnmembranen wurden nach dem Verfahren von Hampson et al. (1987), J. Neurochem 49: 1209, präpariert. Die Membranen wurden von den HEK-Zellen, welche mit pCMV-KEα7 transfiziert worden waren, und HEK-Zellen, welche nur mit dem Plasmid pUC19 transient transfiziert worden waren (negative Kontrolle), nach dem Verfahren von Perez-Reyes et al. (1989), Nature 340: 233, präpariert. Ganze transfizierte und negative Kontrollzellen wurden erhalten durch Besprühen der Gewebekulturplatten mit phosphat-gepufferter Salzlösung, die 0,1% (Gew./Vol.) BSA enthielt. Die Zellen wurden dann mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, einmal gewaschen, in Assay-Puffer (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 20 mM HEPES, 0,1% (Gew./Vol.) BSA, 0,05% (Gew./Vol.) Bacitracin und 0,5 mM PMSF, pH 7,5) resuspendiert und gezählt.
  • Die spezifische Bindung von [125I]-α-BgTx an Rattengehirnmembranen wurde im wesentlichen wie von Marks et al. (1982), Molec. Pharmacol. 22: 554–564, beschrieben mit mehreren Modifizierungen bestimmt. Die Membranen wurden zweimal in Assay-Puffer gewaschen. Der Assay wurde in Polypropylenreagenzröhrchen von 12 × 75 mm in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml Assay-Puffer durchgeführt. Die Membranen wurden mit 10 nM [125I]-α-BgTx (New England Nuclear, Boston, MA) eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Assay-Mischungen wurden dann mit 2300 × g 10 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Pellets wurden zweimal mit 2-ml-Aliquots an eiskaltem Assay-Puffer gewaschen. Die Überstände wurden erneut dekantiert und die Radioaktivität der Pellets wurde in einem γ-Zähler gemessen. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 1 μM unmarkiertem α-BgTx bestimmt. Die spezifische Bindung wurde bestimmt durch Subtraktion der unspezifischen Bindung von der Gesamtbindung. Die spezifische Bindung von [125I]-α-BgTx an Membranen, die von transfizierten und negativen Kontrollzellen präpariert worden waren, wurde bestimmt wie für die Bestimmung der spezifischen Bindung an Rattengehirnmembranen beschrieben, mit Ausnahme dessen, dass der Assay-Puffer kein BSA, Bacitracin und PMSF enthielt. Die spezifische Bindung von [125I]-α-BgTx an transfizierte und negative ganze Kontrollzellen wurde grundsätzlich bestimmt wie für die Bestimmung der spezifischen Bindung an Rattengehirnmembranen beschrieben.
  • Die (125I]-α-BgTx-Bindung wurde als Funktion der Membrankonzentration und als Funktion der Inkubationszeit beurteilt. Die [125I]-α-BgTx-Bindung an Rattengehirnmembranen nahm in linearer Weise mit zunehmenden Mengen an Membran zu (im Bereich zwischen 25–500 μg). Das gesamte Signal-Rausch-Verhältnis der Bindung (d.h., Verhältnis von Gesamtbindung zu unspezifischer Bindung) betrug 3:1. Obwohl etwas Bindung von [125I]-α-BgTx an transfizierte Zellmembranen nachgewiesen wurde, war es hauptsächlich unspezifische Bindung und nahm mit zunehmenden Mengen an Membran nicht zu. Die [125I]-α-BgTx-Bindung an die Transfektanten und negativen Kontrollzellen schien ähnlich zu sein.
  • Zur Überprüfung der [125I]-α-BgTx-Bindung an Rattengehirnmembranen und an ganze transfizierte Zellen und negative Kontrollzellen wurden 300 μg Membran oder 500.000 Zellen mit 1 nM bzw. 10 nM [125I]-α-BgTx bei 37°C für verschiedene Zeiträume im Bereich von 0–350 Min. inkubiert. Aliquots der Assay-Mischung wurden zu verschiedenen Zeitpunkten in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und zentrifugiert. Die Pellets wurden zweimal mit Assay-Puffer gewaschen. Die [125I]-α-BgTx-Bindung an Rattengehirnmembranen nahm mit der Zeit zu und war nach drei Stunden maximal. Die Bindungsprofile der transfizierten Zellen und negativen Kontrollzellen waren gleich und unterschieden sich von denjenigen von Rattengehirnmembranen.
  • BEISPIEL 5
  • Charakterisierung von Zellinien, die nNAChRs exprimieren
  • Rekombinante Zellinien, welche durch Transfektion mit DNA, kodierend für humane neuronale nikotinerge AChRs, wie die in Beispiel 3 beschriebenen, hergestellt wurden, können durch eines oder mehrere der folgenden Verfahren weiter charakterisiert werden.
  • A. Northern- oder Slot-Blot-Analyse hinsichtlich Expression von α- und/oder β-Untereinheits-kodierenden mRNAs
  • Gesamt-RNA wird aus ~1 × 107 Zellen isoliert und 10–15 μg RNA eines jeden Zelltyps wird zur Northern- oder Slot-Blot-Hybridisierungsanalyse verwendet. Die Inserts von Plasmiden, welche für einen humanen neuronalen NAChR kodieren, können "nick-translatiert" und als Sonde verwendet werden. Darüber hinaus kann die β-Actin-Gensequenz (Cleveland et al. (1980), Cell 20: 95–105) nick-translatiert und als Kontrollsonde auf Duplikat-Filtern verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von RNA auf jedem Blot zu bestätigen und um einen groben Standard für die Anwendung bei der quantitativen Bestimmung von Unterschieden in α- oder β-spezifischen mRNA-Niveaus zwischen Zellinien zu liefern. Typische Northern- und Slot-Blot-Hybridisierungs- und -Waschbedingungen sind wie folgt:
    Hybridisierung in 5 × SSPE, 5 × Denhardts Lösung, 50% Formamid, bei 42°C,
    gefolgt von Waschen in 0,2 × SSPE, 0,1% SDS, bei 65°C.
  • B. Nikotin-Bindungs-Assay
  • Zellinien, welche durch Transfektion mit DNA, die für humane neuronale nikotinerge AChR-α- oder -α- und -β-Untereinheiten kodierte, erzeugt wurden, können hinsichtlich ihres Vermögens zur Bindung von Nikotin analysiert werden, beispielsweise im Vergleich zu Kontrollzellinien: die Zellinien neuronalen Ursprungs PC12 (Boulter et al. (1986), oben; ATCC #CRL 1721) und IMR32 (Clementi et al. (1986), Int. J. Neurochem. 47: 291–297; ATCC #CCL127), und die aus dem Muskel stammende Zellinie BC3H1 (Patrick et al. (1977), J. Biol. Chem. 252: 2143–2153). Negative Kontrollzellen (d.h. Wirtszellen, aus denen die Transfektanten hergestellt wurden) sind ebenfalls in dem Assay eingeschlossen. Der Assay wird wie folgt durchgeführt:
    Unmittelbar vor dem Assay werden transfizierte Zellen durch Abschaben von Platten entnommen. Positive Kontrollzellen, welche eingesetzt wurden, sind PC12, BC3H1 und IMR32 (welche 7 Tage lang kein frisches Medium erhalten hatten). Kontrollzellinien werden entnommen durch Spülen in Assay-Puffer (50 mM Tris/HCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 120 mM NaCl, 3 mM EDTA, 2 mg/ml BSA und 0,1% Aprotinin bei pH 7,4) von 37°C. Die Zellen werden gewaschen und auf eine Konzentration von 1 × 106/250 μl resuspendiert. Zu jedem Kunststoff-Assay-Röhrchen werden 250 μl der Zellösung, 15 nM 3H-Nikotin, mit oder ohne 1 mM unmarkiertem Nikotin, und Assay-Puffer, um ein Endvolumen von 500 μlzu ergeben, zugegeben. Die Assays für die transfizierten Zellinien werden 30 Min. lang bei Raumtemperatur inkubiert; die Assays der positiven Kontrollzellen werden 2 Minuten bei 1°C inkubiert. Nach der entsprechenden Inkubationszeit werden 450-μl-Aliquots Assay-Volumen durch Whatman GF/C-Glasfaserfilter filtriert, welche durch Inkubation in 0,05% Poly ethylenimin 24 Stunden lang bei 4°C vorbehandelt wurden. Die Filter werden dann zweimal mit jeweils 4 ml Waschlösung mit eiskaltem Assay-Puffer gewaschen. Nach dem Waschen werden die Filter getrocknet, Gefäßen zugegeben, die 5 ml Szintillationsflüssigkeit enthalten, und die Radioaktivität wird gemessen.
  • C. 86Rb-Ionenfluß-Assay
  • Das Vermögen von Nikotin oder Nikotin-Agonisten und -Antagonisten zur Vermittlung des Einstroms von 86Rb in transfizierte Zellen und Kontrollzellen wurde befunden, einen Hinweis auf die Anwesenheit funktioneller AChRs auf der Zelloberfläche zu geben. Der 86Rb-Ionenfluß-Assay wird wie folgt durchgeführt:
    • 1. In der Nacht vor dem Experiment werden die Zellen mit 2 × 106 pro Mulde (d.h., 2 ml pro Mulde) in einer polylysin-beschichteten 6-Mulden-Platte ausplattiert.
    • 2. Das Kulturmedium wird dekantiert und die Platte mit 2 ml Assay-Puffer (50 mM HEPES, 260 mM Sucrose, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgSO4, 5,5 mM Glucose) bei Raumtemperatur gewaschen.
    • 3. Der Assay-Puffer wird dekantiert und 1 ml Assay-Puffer, enthaltend 3 μCi/ml 86Rb, mit 5 mM Ouabain und Agonist oder Antagonist in einer Konzentration, um eine maximale Reaktion zu bewirken, wird zugegeben.
    • 4. Die Platte wird auf Eis bei 1°C für 4 Min. inkubiert.
    • 5. Der Puffer wird in einen Abfallbehälter dekantiert und jede Mulde wird mit 3 ml Assay-Puffer, gefolgt von zwei Waschungen mit jeweils 2 ml, gewaschen.
    • 6. Die Zellen werden mit 2 × 0,5 ml 0,2%igem SDS pro Mulde lysiert und in ein Szintillationsgefäß überführt, das 5 ml Szintillationsflüssigkeit enthält.
    • 7. Die in jedem Gefäß enthaltene Radioaktivität wird gemessen und die Daten berechnet.
  • Positive Kontrollzellen ergaben die folgenden Daten in diesem Assay:
  • Figure 00440001
  • D. Elektrophysiologische Analyse von Säugerzellen, welche mit DNA, die für eine humane neuronale nikotinerge AChR-Untereinheit kodiert, transfiziert wurden
  • Elektrophysiologische Messungen können angewandt werden, um die Aktivität von rekombinanten Rezeptoren zu ermitteln oder um das Vermögen einer Testverbindung zur Potenzierung, Antagonisierung oder anderweitigen Modulierung der Größe und Dauer des Stroms von Kationen durch die liganden-gesteuerten rekombinanten AChR zu ermitteln. Die Funktion des exprimierten neuronalen AChR kann mit einer Vielfalt elektrophysiologischer Techniken, einschließlich Zweielektroden-Spannungsklemmen- und "Patch-clamp"-Verfahren, ermittelt werden. Der kationenleitende Kanal, der den AChR zu eigen ist, öffnet sich in Reaktion auf Acetylcholin (ACh) oder andere nikotinerge cholinerge Agonisten, was den Fluss eines Transmembranstroms, der unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich von Natrium- und Kaliumionen getragen wird, erlaubt. Dieser Strom kann direkt durch Spannungsklemmen-Techniken überwacht werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden transfizierte Säugerzellen oder injizierte Oozyten elektrophysiologisch hinsichtlich der Anwesenheit von AChR-Agonist-abhängigen Strömen analysiert.
  • Obwohl die Erfindung detailliert unter Bezugnahme auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben wurde, versteht sich, dass Modifizierungen und Variationen davon vom Geiste und Umfang des Beschriebenen und Beanspruchten umfaßt werden.
  • Zusammenfassung von Sequenzen
  • Sequenz-ID-Nr. 1 ist eine Nukleotidsequenz, welche für eine α2-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 2 ist die Aminosäuresequenz, welche von der in Sequenz-ID-Nr. 1 angegebenen Nukleotidsequenz abgeleitet ist, die für eine α2-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 3 ist eine Nukleotidsequenz, welche für eine α3-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 4 ist die Aminosäuresequenz, welche von der in Sequenz-ID-Nr. 3 angegebenen Nukleotidsequenz abgeleitet ist, die für eine α3-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 5 ist eine Nukleotidsequenz, welche für eine α4-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 6 ist die Aminosäuresequenz, welche von der in Sequenz-ID-Nr. 5 angegebenen Nukleotidsequenz abgeleitet ist, die für eine α4-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 7 ist eine Nukleotidsequenz, welche für eine α7-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 8 ist die Aminosäuresequenz, welche von der in Sequenz-ID-Nr. 7 angegebenen Nukleotidsequenz abgeleitet ist, die für eine α7-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 9 ist eine Nukleotidsequenz, welche für eine β2-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 10 ist die Aminosäuresequenz, welche von der in Sequenz-ID-Nr. 9 angegebenen Nukleotidsequenz abgeleitet ist, die für eine β2-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 11 ist eine Nukleotidsequenz, welche für eine β4-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • Sequenz-ID-Nr. 12 ist die Aminosäuresequenz, welche von der in Sequenz-ID-Nr. 11 angegebenen Nukleotidsequenz abgeleitet ist, die für eine β4-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  • SEQUENZVERZEICHNIS
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  • Figure 00700001

Claims (18)

  1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche für eine α7-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert, wobei die Nukleotidsequenz die Nukleotide 73–1581 wie in SEQ-ID-NR. 7 angegeben umfasst.
  2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz eine Sequenz von Nukleotiden wie in SEQ-ID-NR. 7 angegeben ist.
  3. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche für eine α7-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert, wobei die Nukleotidsequenz infolge des genetischen Codes eine Degenerationsvariante der Nukleotidsequenz von Anspruch 1 oder Anspruch 2 ist.
  4. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Nukleinsäuremolekül DNA ist.
  5. Zellen, transformiert mit mindestens einer DNA nach Anspruch 4, wobei die Zellen Bakterienzellen, eukaryotische Zellen oder Amphibien-Oozyten sind.
  6. Zellen nach Anspruch 5, ferner transformiert mit mindestens einer DNA, die für eine β-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  7. Zellen nach Anspruch 6, ferner gekennzeichnet durch das Vermögen zur Expression von spannungsabhängigen Calciumkanälen.
  8. Zellen nach Anspruch 6, wobei die β-Untereinheit aus β2 oder β4 ausgewählt ist.
  9. Zellen nach Anspruch 6, wobei die β-Untereinheit β4 ist.
  10. Zellen nach Anspruch 5, wobei die Zellen funktionelle neuronale nikotinerge Acetylcholin-Rezeptoren exprimieren, welche eine oder mehrere Untereinheit(en) enthalten, die von der DNA kodiert wird/werden.
  11. Verfahren zum Screening von Verbindungen, um Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität von humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren modulieren, welches Verfahren umfasst die Feststellung der Wirkung einer Verbindung auf die Aktivität von neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren in Testzellen nach Anspruch 6 im Vergleich zur Wirkung auf Kontrollzellen oder auf die Aktivität von neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren der Zellen in Abwesenheit der Verbindung, wobei die Kontrollzellen mit den Testzellen identisch sind, die Kontrollzellen jedoch keine nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren exprimieren.
  12. Rekombinante α7-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors mit der in SEQ-ID-NR. 8 angegebenen Aminosäuresequenz.
  13. Humaner neuronaler nikotinerger Acetylcholin-Rezeptor, umfassend die α7-Untereinheit nach Anspruch 12 und mindestens eine β-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors.
  14. Verfahren zur Identifizierung von funktionellen Untereinheiten eines neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors und von Kombinationen davon, wobei das Verfahren umfasst: a) Einführung von DNA nach Anspruch 4 oder dazu komplementärer RNA und gegebenenfalls von DNA, die für mindestens eine β-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert, oder dazu komplementärer RNA in eukaryotische Zellen, und b) Durchführung eines Assays hinsichtlich Aktivität von neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren in Zellen von Schritt a), wobei die Aktivität durch einen Rezeptor vermittelt wird, der eine oder mehrere der Untereinheiten, die von der eingeführten DNA kodiert werden, enthält.
  15. Isolierte mRNA, kodiert von der DNA nach Anspruch 4.
  16. Zellen, transformiert mit mRNA nach Anspruch 15.
  17. Zellen nach Anspruch 16, ferner transformiert mit mRNA, die für eine β-Untereinheit eines humanen neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors kodiert.
  18. Antikörper, gebildet gegen das Protein von Anspruch 12 oder einen immunogen Teil davon.
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