DE69433970T2

DE69433970T2 - Zelleinkapselungsvorrichtung

Info

Publication number: DE69433970T2
Application number: DE69433970T
Authority: DE
Inventors: Mark D. Butler; Stanley L. Mish
Original assignee: WL Gore and Associates Inc
Current assignee: WL Gore and Associates Inc
Priority date: 1993-08-10
Filing date: 1994-06-24
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2014-06-25
Also published as: CA2147626C; DE69433970D1; AU678843B2; EP0663817A1; CA2147626A1; EP0938893B1; EP0938893A1; US5980889A; DE938893T1; ATE274340T1; DE69420024T2; WO1995004521A1; US6426214B1; DE69420024D1; EP0663817B1; ES2138665T3; AU7356394A; ATE183078T1; DK0663817T3

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Vorrichtungen, die zur Erhaltung von Zellen in einem abgeschlossenen Raum brauchbar sind, während sie das Durchlassen von Zell-Nährstoffen und -Abfallprodukten in die Vorrichtung hinein und aus ihr heraus erlauben. Die Vorrichtungen dieser Erfindung sind zum Implantieren in ein Individuum, das davon profitieren würde, von den Zellen hergestellten Produkten, die aus der Vorrichtung heraus diffundieren, ausgesetzt zu werden, geeignet.
Hintergrund der Erfindung
Transplantierte Zellen schaffen wegen ihrer Fähigkeit, physiologisch wichtige Substanzen im Wirt festzustellen und auf sie zu reagieren, das Potential zur Behandlung verschiedener Krankheiten. Zellimplantationstherapie ist insbesondere wünschenswert, weil die Zellen Substanzen bereitstellen können, um natürliche Substanzen zu ersetzen oder zu ergänzen, die wegen ihres Mangels oder ihres Fehlens eine Krankheit verursachen können. Die Freisetzung therapeutischer Substanzen aus den transplantierten Zellen kann auch passend reguliert werden, vorausgesetzt, dass die transplantierten Zellen die nötigen Rezeptoren und die Fähigkeit, auf endogene Regulatoren zu reagieren, besitzen.
Patienten, die eine Krankheit als ein Ergebnis des Verlusts oder des Mangels an Hormonen, Neurotransmittern, Wachstumsfaktoren oder anderen physiologischen Substanzen haben, werden neben anderen als diejenigen betrachtet, die aus der Transplantationstherapie beträchtliche Vorteile ziehen würden. Bei spielsweise könnte die Implantation von Pankreasinselzellen einem Diabetiker Insulin nach Bedarf liefern. Chromaffine Nebennierenzellen oder PC12-Zellen, ins Gehirn implantiert, können Dopamin zur Behandlung von Patienten mit Parkinson-Krankheit liefern. Mehrere andere Hormone. Wachstumsfaktoren und andere Substanzen wurden als potentielle Therapeutika, die einem Individuum unter Verwendung transplantierter Zellen verabreicht werden können, identifiziert und sind in der PCT-Anmeldung WO 92/19195 diskutiert.
Weil Zellen, die implantiert werden, für den Wirt fremd sein können, ist es erforderlich, das Immunsystem des Wirts daran zu hindern, die implantierten Zellen anzugreifen und dadurch ihren Tod zu bewirken. Außerdem können Zellen, die derartige therapeutische Substanzen ausscheiden, von transformierten Zellen abgeleitet sein oder mit Viren infiziert worden sein, und daher können sie für den Wirt eine potentielle Bedrohung in der Form darstellen, als sie die Wahrscheinlichkeit einer Tumorbildung erhöhen. Mindestens vier Verfahren sind möglich, zum Zwecke des Schutzes der Lebensfähigkeit transplantierter Zellen die Immunantwort des Wirts zu vermindern. Ein Verfahren beinhaltet die Immunsuppression, um eine Transplantatabstoßung zu verhindern. Eine Immunsuppression kann durch eine Vielfalt von Verfahren erreicht werden, einschließlich der Verwendung von immunsuppressiven Arzneimitteln wie Cyclosporinen. Bei einem anderen Verfahren, der Immunmodulation, wird die Antigenität der implantierten Zellen verändert. Dies könnte das Anheften von Antikörper-Fragmenten an die implantierten Zellen beinhalten. Das dritte Verfahren beinhaltet ein Modulieren des Immunsystems des Wirts, um Toleranz für die implantierten Zellen zu erreichen. Bei einem vierten Verfahren sind die zu implantierenden Zellen in einer Vorrichtung enthalten, die die implantierten Zellen wirksam von dem Immunsystem isoliert. Die Fähigkeit eingeschlossener Zellen, Substanzen von therapeutischem Wert herzustellen und auszuscheiden, führte zu der Entwicklung implantierbarer Vorrichtungen zur Erhaltung von Zellen in einem Individuum, das der Behandlung bedarf.
Ein gemeinsames Merkmal von Isolierungsvorrichtungen ist eine Kolonie lebender Zellen, die von einer permeablen Membran umgeben sind. Der Transport von Nährstoffen, Abfallstoffen und anderen Produkten durch die Membran wird durch Druckgradienten und/oder Diffusionsgradienten angetrieben. Diese Bewegung von Substanzen durch die Membran wird durch die Permeabilität der Membran und durch die Strecke, über die diese Substanzen wandern müssen, begrenzt. Wenn ein unzureichender Transport dieser Substanzen entweder für die Anzahl oder das Volumen an Zellen bereitgestellt wird, kann die Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen verringert werden.
Dionne hat berichtet, dass eine dichte metabolisch aktive Zellmasse bestimmte Maximalabmessungen nicht überschreiten darf, wenn die Lebensfähigkeit der gesamten Zellmasse aufrecht erhalten werden soll. "Effect of Hypoxia on Insulin Secretion by Isolated Rat and Canine Islets of Langerhans", Diabetes, Vol. 42, 12: 20, (Januar 1993). Wenn große kugelförmige Zell-Agglomerate ihre Ernährung von einer äußeren Quelle erhalten, können Zellen im Zentrum der Zellmasse nicht ausreichend ernährt werden und absterben.
Die meisten Einkapselungsvorrichtungen zeichnen sich durch größere Zellräume aus als die, die Diffusion eines ausreichenden Nährstoffflusses zur Unterstützung einer lebensfähigen Volldichte-Zellmasse erlauben würden. Eine Volldichte-Zellmasse ist die maximale Anzahl an Zellen, die in einem festgesetzten Volumen erhalten werden kann, wenn der gesamte für Zellen verfügbare Raum von den Zellen eingenommen wird, um ein Minimum an zellfreiem Raum zu erreichen. Diese Anzahl wird angenähert durch Dividieren des gesamten zur Aufnahme von Zellen verfügbaren Volumens durch das Volumen einer einzigen Zelle.
In den zylindrischen Vorrichtungen, auf die sich Aebischer in WO 92/19595 bezieht, ist der Durchmesser größer als der maximale Durchmesser, der eine lebensfähige Volldichte-Zellmasse unterstützen würde. Dementsprechend müssen sich die Zellen der in WO 92/19595 beschriebenen Vorrichtung in einer verdünnten Suspension bei einer geringeren Zelldichte befinden. Die verdünnte Zellsuspension hat geringere Gesamtnährstofferfordernisse pro Einheitsvolumen und erhält daher mit der verfügbaren Ernährung, die durch die permeable Membran transportiert wird, im wesentlichen eine vollständige Lebensfähigkeit aufrecht. Der Zellbehälter, der größer ist als optimal, erlaubt eine einfachere Herstellung und nachfolgende Handhabung als möglich wäre, wenn diese Vorrichtung klein genug hergestellt würde, um eine optimale Volldichte-Zellpackung zu unterstützen. Aebischer verweist auch auf die Verwendung einer gelbildenden Substanz in der Zellsuspension zur Immobilisierung der Zellen in einer einheitlichen Dispersion, um ein Aggregieren von Zellen zu Klumpen zu verhindern. Derartige Klumpen könnten ansonsten wegen örtlicher Verarmung an Nährstoffen innerhalb dieser Klumpen nekrotisch werden.
Mehrere immunisolierende Vorrichtungen zur Implantation von Zellen in einen Wirt wurden entwickelt. Das US-Patent Nr. 5,158,881 betrifft eine Vorrichtung, von der behauptet wird, dass Zellen darin in einer semipermeablen polymeren Membran eingekapselt werden, indem eine wässerige Zellsuspension einer polymeren Lösung durch eine gemeinsame Mündung co-extrudiert wird, um ein röhrenförmiges Extrudat mit einer polymeren Außenumhüllung, die die Zellsuspension einkapselt, zu bilden. In einer Ausführungsform, die in dem Patent Nr. 5,158,881 beschrieben wird, werden die Zellsuspension und die Polymerlösung durch eine gemeinsame Extrusionsmündung mit mindestens zwei konzentrischen Öffnungen so extrudiert, dass die Zellsuspension durch die innere Öffnung und die Polymerlösung durch die äußere Öffnung extrudiert wird. Von der Polymerlösung wird behauptet, dass sie unter Bildung einer Außenumhüllung koaguliert. In einer anderen Ausführungsform des Patents Nr. 5,158,881 wird das röhrenförmige Extrudat in Intervallen abgedichtet, um getrennte Zellkammern, die durch polymere Verbindungen verbunden sind, zu definieren.
Ein unterschiedlicher Weg, einer Isolierungsvorrichtung Nährstoffe zuzuführen, ist, eine fließende Blutversorgung oder eine andere physiologische Flüssigkeit durch eine oder mehrere Leitungen in der Zellmasse zu führen. Diese verinnerlichte Nährstoffquelle ahmt die Struktur des Kreislaufsystems nahezu aller komplexen Organismen nach, indem sie dem Zentrum einer Zellmasse oder eines Gewebes Nahrung zuführt. Diese Nährstoffe diffundieren dann radial nach Außen. In einer derartigen intern gespeisten Vorrichtung, die in WO 91/02498 beschrieben wird, sind die transplantierten Zellen zwischen zwei konzentrischen Röhren enthalten. Ein Ende der inneren Röhre ist an eine Arterie gepflanzt, während das andere Ende an eine Vene gepflanzt ist. Ein gemeinsames Problem bei intern gespeisten Vorrichtungen ist das Potential für Thrombosebildung oder Gerinnen von Blut in den künstlichen Leitungen, was in relativ kurzen Zeiträumen auftritt. Die Bildung solcher verstopfender Massen schneidet den Fluß von Nährstoffen zu intern gespeisten Vorrichtungen ab.
In einer anderen Vorrichtung, die beschrieben wird von Goosen, US-Patente Nr. 4,673,566, Nr. 4,689,293 und Nr. 4,806,355, sind die Zellen in einer halbfesten Matrix enthalten, die in eine biologisch verträgliche, semipermeable elektrisch geladene Membran eingekapselt ist. Von der Membran wird behauptet, dass sie den Durchtritt von Nährstoffen und Faktoren erlaubt, während sie Viren, Antikörper und andere in der äußeren Umgebung vorhandene schädigenden Mittel ausschließt.
WO 84/01287 betrifft Vorrichtungen zur Einkapselung genetisch programmierter lebender Organismen. Eine der Vorrichtungen, die auf verwiesen wird, weist ein Nährstoffmaterial auf, das von einer inneren Membranwand umgeben wird, die von einer Schicht Organismen umgeben wird, die von einer äußeren Membranwand umgeben werden. Von den Organismen wird behauptet, dass sie therapeutische Substanzen liefern. Diese Organismen erhalten Nährstoffe von der inneren Schicht. Die Einbeziehung einer Nährstoffschicht ins Zentrum der Vorrichtung macht die Herstellung derartiger Vorrichtungen schwierig und teuer.
Damit implantierte Vorrichtungen therapeutisch sind, müssen in der Vorrichtung genügend Zellen vorhanden und lebensfähig sein, um therapeutisch wirksame Mengen einer therapeutischen Substanz herzustellen und auszuscheiden. Wenn in der Vorrichtung zu viele Zellen Nährstoffe verbrauchen, sinkt die örtliche Konzentration an diesen gelösten Stoffen unter den Minimalgehalt, der für die Lebensfähigkeit der Zellen erforderlich ist. Zellen, die sich nahe der Außenoberfläche der Zellmasse befinden, werden typischerweise reichlich Nahrung erhalten, während Zellen, die sich im Inneren befinden, die ersten sein werden, die absterben oder in anderer Weise deaktiviert werden. Faktoren, die eine negative Auswirkung auf die Lebensfähigkeit von in einer Vorrichtung enthaltenen Zellen haben können, sind: Vorrichtungsabmessungen, die Zellen fern von Nährstoffen anordnen; Zellen mit hohen Stoffwechselanforderungen; und jeglicher Widerstand gegen Diffusionstransport, der sich aus dicken oder undurchlässigen Membranen oder unbewegten Fluidschichten ergibt. Zellmassen, die zu groß werden, können die Diffusion von Nährstoffen oder Gasen in die Tiefen der Zellmasse hemmen, was zum Tod derartiger Zellen und zu einer entsprechend verringerten Ausgabe an Substanzen führt. Dieses Phänomen wird berichtet von Schrezenmeir et al. in "The Role of Oxygen Supply in Islet Transplantation", Transplantation Proceedings, Vol. 24, Nr. 6, Seiten 2925: 2929, (1992), worin von einem mittigen Nekrosekern in Inselchen von über etwa 150 μm Durchmesser nach Kultur der Inselchen in einer Einkapselungsvorrichtung berichtet wird. Zusätzlich kann die Ausscheidung anderer Faktoren im Zusammenhang mit der Lyse toter Zellen schädlich für den Wirt oder benachbarte Zellen sein.
Ein anderes Verfahren zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit von Zellen in einer Einkapselungsvorrichtung ist, die Vorrichtung ausreichend eng zu machen, um die Zellen genügend nahe an der permeablen Membran in Kontakt mit der Umgebung zu halten. Eine Verringerung des Vorrichtungsdurchmessers führt jedoch zu einem feineren, zerbrechlicheren Aufbau, der zunehmend schwierig herzustellen und zu verwenden ist.
Eine andere Anforderung an Einkapselungsvorrichtungen ist, dass die Vorrichtung eine ausreichende mechanische Festigkeit und eine Geometrie haben muß, die dazu geeignet ist zu erlauben, dass die Vorrichtung während der Implantation von einem Chirurgen gehandhabt wird. Mechanischer Zusammenhalt erlaubt, dass immunisolierende Vorrichtungen als eine Einheit gehandhabt werden. Die Festigkeitsanforderungen variieren mit der Größe, dem Gewicht und der Form der Vorrichtung, aber im allgemeinen wird die Vorrichtung um so fester sein müssen, je länger, schwerer oder größer sie ist. Wenn die Anzahl an Zellen, die erforderlich ist, um einen therapeutischen Nutzen zu schaffen, steigt, muß die Größe der Vorrichtung und die Menge an Baumaterial ebenfalls größer werden. Das zur Herstellung einer größeren Vorrichtung erforderliche zusätzliche Baumaterial kann die Funktion der Vorrichtung stören, wenn es die Le bensfähigkeit der Zellen oder den Transport therapeutischer Substanzen verringert. Geeignete Geometrien zur Implantation könnten eine Größe und Form, die mit behandschuhten Händen und chirurgischen Instrumenten aseptisch gehandhabt werden kann, und die in die geplanten Implantationsstellen in dem Wirt passen, umfassen.
Verschiedene Verfahren zum Füllen von Vorrichtungen mit lebenden Zellen wurden beschrieben. Manche Vorrichtungen werden nach der Bildung der permeablen Membran durch Spülen einer Zellsuspension in die Vorrichtung gefüllt, während andere Vorrichtungen durch Ausbilden einer Membran um die Zellmasse unter Verwendung eines chemischen Prozesses, der bewirkt, dass sich die Membran ohne Abtötung von Zellen bildet, hergestellt werden. Im ersten Fall ist die Vorrichtung leichter mit lebensfähigen Zellen zu beladen, wenn die Abmessungen der Vorrichtung groß genug sind, um ein scherungsarmes Strömen der Zellsuspension zu erlauben. In dem letzteren Beispiel verbessern größere Vorrichtungsabmessungen auch die Herstellbarkeit, da ein größerer Anteil an Zellen lebensfähig bleibt, weil sie durch die Anwesenheit einer unbewegten Fluidschicht vor dem Membranbildungsprozeß geschützt sind und weiter von der Stelle der Membranbildung entfernt sind. Ein Nachteil größerer Vorrichtungsabmessungen tritt auf, wenn Zellen nahe der Oberfläche getriggert werden, auf einen Reiz anzusprechen, der Zellen, die mehr im Inneren liegen, vielleicht nicht erreicht, wodurch die Freisetzung der therapeutischen Substanzen von den im Inneren gelegenen Zellen verringert wird.
Es ist daher erforderlich, eine Vorrichtung geeigneter Geometrie und Festigkeit zu entwickeln, die eine passende Anzahl lebensfähiger Zellen bereitstellen kann und die in ein Individuum eingeführt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt eine implantierbare Vorrichtung zur Versorgung eines behandlungsbedürftigen Individuums mit therapeutischen Substanzen bereit. Die Erfindung maximiert den Anteil an Zellen in nächster Nähe zu einer Mem bran in Kontakt mit der Umgebung, während sie eine Geometrie beibehält, die für eine Implantation in das Individuum praktisch ist. Dies wird erreicht durch Bereitstellung einer Vorrichtung, die einen Kern aufweist, der von einer permeablen Membran umgeben wird, wobei die Außenoberfläche des Kerns und die Innenoberfläche der permeablen Membran eine Begrenzung für eine Zone, in der Zellen enthalten sein können, definieren. Der maximale Abstand zwischen der Kern-Außenoberfläche und der permeablen Membran ist ausreichend knapp, um Bedingungen zu schaffen, die zum Überleben und für die Funktion der enthaltenen Zellen geeignet sind, wodurch die Lebensfähigkeit eines großen Anteils der enthaltenen Zellmasse unterstützt wird. Bevorzugt ist der Kern im wesentlichen zellfrei.
Erfindungsgemäß enthält eine Vorrichtung zum Bereitstellen von Substanzen, die von in der Vorrichtung enthaltenen Zellen stammen, einen Kern mit einem Innenbereich und einer den Innenbereich umgebenden äußeren Begrenzung. Eine Zone zur Aufnahme von Zellen umgibt den Kern im wesentlichen und erstreckt sich von der äußeren Begrenzung des Kerns zu einer innenseitigen Oberfläche einer permeablen Membran. Die permeable Membran hat eine innenseitige und eine außenseitige Oberfläche. Der Abstand von der äußeren Begrenzung des Kerns zu der innenseitigen Oberfläche der permeablen Membran ist bevorzugt ausreichend dünn, um die Lebensfähigkeit von Zellen in einer Zelkschicht, die sich am nächsten an der äußeren Begrenzung des Kerns und am weitesten entfernt von der inneren Oberfläche der permeablen Membran befindet, zu unterstützen.
In einer Ausführungsform wird der Abstand von der äußeren Begrenzung des Kerns zur innenseitigen Oberfläche der permeablen Membran durch einen Diffusionslängenparameter von weniger als etwa 500 μm definiert.
In einer anderen Ausführungsform sind der Kern und die permeable Membran so proportioniert, dass ein Diffusionslängenparameter (DLP), der an einem Querschnitt der Vorrichtung, der senkrecht zu einer Längsachse des Kerns vorgenommen wird und durch den Kern, die Zellenzone und die permeable Membran an einem Punkt an der Längsachse des Kerns, an dem die Zellenzone ausreichend dick ist, um mindestens eine Zellenlage zu enthalten, hindurchgeht, gemessen wird, weniger als etwa 500 μm beträgt. Der DLP ist definiert als das Verhältnis der Gesamtfläche der Zellenzone des Querschnitts, dividiert durch den Umfang der Zellenzone. Der Umfang der Zellenzone ist definiert als die Länge der permeablen Membran des Querschnitts.
Die Vorrichtungen können direkt in einen Wirt implantiert werden, um Substanzen, die von den in der Vorrichtung enthaltenen Zellen produziert werden, bereitzustellen.
Gemäß dieser Erfindung wird der innere Kern in der Vorrichtung vorgesehen, um zu erlauben, dass eine größere Anzahl lebensfähiger Zellen in der Vorrichtung erhalten wird als es möglich wäre, wenn der Kern in der Vorrichtung fehlen würde.
Die Vorrichtung dieser Erfindung sorgt auch für einen schnelleren Anstieg freigesetzter Substanzen auf ein Plateauniveau durch Verringerung der Transportverzögerung von Umgebungsreizen zu den Zellen und durch Verringerung der entsprechenden Verzögerung in Verbindung mit der Diffusion therapeutischer Substanzen aus der Vorrichtung heraus.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung stellt eine Oberfläche innerhalb der Zone zur Aufnahme von Zellen bereit, die die Anzahl von Anhaftstellen zur Unterstützung von Verankerung benötigenden Zellen erhöht.
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, eine implantierbare Vorrichtung, die Zellen in einem lebensfähigen Zustand erhält, bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist es, Vorrichtungen bereitzustellen, die einen raumfüllenden Kern haben, der es ermöglicht, dass eine größere Anzahl lebensfähiger Zellen in dem von einer Zelleinkapselungsvorrichtung eingenommenen Gesamtvolumen aufgenommen wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1A und 1B. Darstellung einer zylindrischen Vorrichtung mit einem Kern im Querschnitt (1A) und im Längsschnitt (1B), die die permeable Membran (1), die Zone zur Unterhaltung von Zellen (2), Zellen (3), den Kern (4) und einschnürende Dichtungen (5) veranschaulicht.
2. Darstellung zylindrischer Vorrichtungen mit Windungen (6), Längsrippen (7) und Höckern (8), die dahingehend wirken, den Kern innerhalb der permeablen Membran zu zentrieren.
3. Darstellung einer zylindrischen Vorrichtung mit den folgenden, den Kern umgebenden Oberflächen, um eine Erhöhung der Anzahl der Oberflächenstellen, die zur Anhaftung von Verankerung benötigenden Zellen zur Verfügung stehen, zu schaffen: einem mikroporösen expandierten Polytetrafluorethylen (PTFE) (9), einer Ansammlung von Zellkultur-Mikrokügelchen (10) und einer Fasermatte (11).
4. Darstellung einer zylindrischen Vorrichtung, in der Kernmaterial (12) in dem gesamten von der permeablen Membran (1) eingeschlossenen Volumen verteilt ist, und in der Zellen (3) die mehr am Rand gelegenen Räume, die in dem Kernmaterial vorgesehen sind, bevölkern.
5. Graphische Darstellung des Anwachsens der Zellpopulation im Laufe der Zeit für vier Vorrichtungen (beschriftet mit +, *, ❑ bzw. x), die mit CGT-6-Zellen beimpft sind. Die Zellenanzahl basiert auf Messungen des Glucoseverbrauchs. Daten von einer ersten Vorrichtung wurden weggelassen, weil jene Vorrichtung nicht unter Standardbedingungen kultiviert wurde.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Vorrichtungen dieser Erfindung bestehen aus einem Kern, der von einer permeablen Membran umgeben wird, und einem Raum, der von der Außenoberfläche des Kerns und der Innenoberfläche der permeablen Membran begrenzt wird. Der Raum zwischen dem Kern und der permeablen Membran ist eine Zone, die zur Erhaltung von Zellen in der Lage ist. Die Vorrichtung kann irgendeine Geometrie haben, die die Aufrechterhaltung der Beziehung Kern – Raum – permeable Membran erlaubt. Diese Geometrie kann Kugeln, Zylinder oder Flachmaterialien umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein. Zylinder und Kugeln sind bevorzugt. Am meisten bevorzugt sind Vorrichtungen, bei denen die permeable Membran und der Kern beide zylindrisch sind, wobei sie Längsachsen haben, die im wesentlichen parallel zueinander sind. Die 1A und 1B veranschaulichen eine zylindrische Vorrichtung der Erfindung und zeigen die permeable Membran (1), die die Vorrichtung umgibt, die Zone (2) zur Aufnahme von Zellen (3) und den Kern (4).
In den Vorrichtungen dieser Erfindung enthaltene Zellen erhalten Nährstoffe aus der Umgebung außerhalb der Vorrichtung. Die Vorrichtungen dieser Erfindung schaffen einen größeren Austausch von Nährstoffen und Abfallstoffen zwischen den Zellen innerhalb der Vorrichtung und der äußeren Umgebung, indem sie die Zellmasse ganz nahe an der permeablen Membran in Kontakt mit der äußeren Umgebung anordnen. Diese enge Nähe von Zellen zu der permeablen Membran wird erreicht durch Verdrängen von Zellen aus den inneren Bereichen der Vorrichtung durch die Anwesenheit des Kerns.
Der Kern der Vorrichtung ist insofern inert, als er nicht in erster Linie dazu gedacht ist oder dazu benötigt wird, diffundierbare Nährstoffe, die von den Zellen in der Vorrichtung zu verwenden sind, bereitzustellen. Wenn der Kern auch nicht in erster Linie dazu ausgelegt ist, Nährstoffe zuzuführen, kann er doch behandelt werden, um eine Oberfläche zu schaffen, die eine Anhaftung fördert oder Substanzen bereitstellt, die das Überleben, das Wachstum oder die Funktion der Zellen, die therapeutische Zellprodukte liefern, fördern. Bevorzugt werden solche zellfördernden Substanzen an der Außenoberfläche des Kerns adsorbiert. Collagen, Poly-L-Lysin, Laminin, Fibronectin und poröses PTFE sind unter den Substanzen, die an dem Kern adsorbiert werden können, um das Zellenwachstum und/oder Zellenfunktionen zu fördern. Zusätzlich kann der Kern eine äußere poröse Schicht haben, die als eine Matrix zur Anhaftung und Erhaltung von Verankerung benötigenden Zellen dient.
Man kann es so sehen, dass die Kerne der Vorrichtung der Erfindung einen inneren Bereich und eine äußere Begrenzung, die den inneren Bereich umgibt, aufweisen. Unterschiedliche Bereiche des Kerns können dieselbe Porosität oder verschiedene Porositäten haben, und können porös oder nicht porös sein. Die Porosität des Kerns sollte jedoch die Wanderung von Zellen in den inneren Bereich des Kerns, der im wesentlichen frei von Zellen sein sollte, verhindern.
Neben der Verdrängung von Zellen aus dem Inneren der Vorrichtung dient der Kern auch dazu, der Vorrichtung Steifheit zu verleihen, was die Handhabung während der Herstellung und der Implantation und der Rückgewinnung durch den Bereitsteller medizinischer Versorgung erleichtert. Der Kern kann irgendeine Gestalt haben. In einer Ausführungsform ist die Gestalt des Kerns im wesentlichen dieselbe wie diejenige der permeablen Membran. In einer anderen Ausführungsform kann der Kern kugelförmig oder zylindrisch mit Vorsprüngen, die aus der Oberfläche des Kerns herausstehen, sein. Diese Vorsprünge können beispielsweise, und wie in 2 veranschaulicht, Windungen (6), Rippen (7) oder Höcker (8) sein. Die Höhe jedes Vorsprungs kann dazu ausgelegt sein, den minimalen Raum zwischen der Oberfläche des Kerns und der inneren Oberfläche der permeablen Membran zu definieren, und kann dabei behilflich sein, den Kern innerhalb der Vorrichtung zu zentrieren.
Der von dem Kern und der permeablen Membran begrenzte Raum kann gewünschtenfalls Substanzen zur Förderung des Zellwachstums enthalten. Solche Substanzen können Material zur Schaffung eines Trägers, an dem Verankerung benötigende Zellen anhaften können, umfassen. Bevorzugt ist in dem gesamten, zum Zellenwachstum vorgesehenen Raum zwischen dem Kern und der permeablen Membran ein poröses Netzwerk vorgesehen. Geeignetes Material für den Träger sind Feststoffe einschließlich, aber nicht beschränkt auf, expan diertes oder poröses PTFE, Dextran, Collagen, Polyester, Polystyrol und andere natürliche oder synthetische Polymere, die eine Zellenanhaftung fördern. Der Träger kann in der Zellenzone in verschiedenen Formen einschließlich, unter anderem, regellosen Netzwerken oder Balkennetzwerken, Mikrokügelchen und Fasermatten, vorliegen. 3 veranschaulicht Beispiele fester Träger wie mikroporöses expandiertes PTFE (9), eine Ansammlung von Zellkultur-Mikrokügelchen (10) und eine Fasermatte (11). Der feste Träger in der Zellenzone kann auch zur Festigkeit der Vorrichtung beitragen und bei der Aufrechterhaltung der Gestalt der Vorrichtung helfen.
In einer bevorzugten Ausführungsform erhält die Geometrie der Vorrichtung die Lebensfähigkeit von Zellen in Kontakt mit oder in enger Nähe zu dem Kern aufrecht. Die Lebensfähigkeit der Zellen kann unter Verwendung verschiedener Indikatoren der Zellenfunktion untersucht werden. Beispielsweise kann die Fähigkeit von Zellen, bestimmte Farbstoffe wie Trypanblau, die sich in toten Zellen ansammeln, auszuschließen, zur Untersuchung der Lebensfähigkeit von Zellen verwendet werden. Ein Nachweis der Lebensfähigkeit von Zellen kann auch auf Untersuchungen des Grundstoffwechsels oder der Zellproliferation basieren. Der Beweis einer Synthese von Zellprodukten zeigt auch die Lebensfähigkeit von Zellen an. Eine Schlußfolgerung zur Lebensfähigkeit von Zellen kann auf dem Nachweis irgendeines Indikators der Zellen-Lebensfähigkeit basieren.
Die Lebensfähigkeit der Zellen kann vor oder nach der Implantation untersucht werden. Wegen der Möglichkeit von Wechselwirkungen zwischen der Vorrichtung und der Umgebung, die die Lebensfähigkeit der Zellen in einer Weise, die nicht in Beziehung zur Geometrie der Vorrichtung steht, gefährden, ist es jedoch bevorzugt, die Lebensfähigkeit vor der Implantation zu untersuchen.
In einem bevorzugten Verfahren zur Untersuchung der Zellen-Lebensfähigkeit wird die Zellen enthaltende Vorrichtung in vitro für eine Zeitdauer kultiviert, die ausreichend ist, um es der Population von Zellen zu ermöglichen, ein Plateau oder einen stationären Zustand zu erreichen. Das Medium zum Kultivieren der Vorrichtung sollte ausreichende Konzentrationen an Nährstoffen enthalten, um die Lebensfähigkeit der Anzahl von Zellen auf dem Plateauniveau zu erhalten, wenn solche Zellen ohne die Vorrichtung in Kultur gezüchtet würden. Außerdem sollte das Medium ausreichend ergänzt werden, um einen Zelltod aufgrund einer Verarmung an Nährstoffen aus dem Medium außerhalb der Vorrichtung zu vermeiden. Ein Anzeichen, dass ein Plateau erreicht worden ist, kann auf einer stabilen Stoffwechselrate basieren.
Zur Untersuchung der Zellen-Lebensfähigkeit in der Vorrichtung wird die Anzahl an lebensfähigen Zellen, die von der permeablen Membran am weitesten entfernt sind und einen Umkreis, der den im Wesentlichen zellfreien Kern umgibt, bilden, bestimmt. Der Umkreis der Zellen, die hinsichtlich Lebensfähigkeit untersucht werden, wird im wesentlichen die erste Zellenlage sein, die den im wesentlichen zellfreien Bereich des Kerns umgibt. Bevorzugt sind mindestens etwa 10% der Zellen in der ersten Zellenlage lebensfähig. Bevorzugter sind mindestens etwa 50% der Zellen in der ersten Zellenlage lebensfähig. Am bevorzugtesten sind mindestens 80% der Zellen in der ersten Zellenlage lebensfähig.
Wenn ein Vitalfarbstoff zur Untersuchung der Lebensfähigkeit verwendet werden soll, so wird der Farbstoff zu dem Kulturmedium zugegeben oder direkt in den Zellenraum der Vorrichtung injiziert, wenn die Anzahl an Zellen ein Plateau erreicht hat. Zur Untersuchung der Lebensfähigkeit der Zellen wird die Vorrichtung nach einer ausreichenden Zeit, um es dem Farbstoff zu ermöglichen, in die Vorrichtung zu diffundieren, aus dem Medium entfernt, die Vorrichtung wird durchgeschnitten und die Anzahl an lebensfähigen Zellen in der ersten Zellenlage, die den Kern umgibt, wird wie oben beschrieben bestimmt.
Ein anderes Verfahren zur Untersuchung der Lebensfähigkeit kann darin bestehen, die Zellen in der Plateauphase impulsweise mit einem radioaktiven Vorläufer für ein Stoffwechselprodukt zu versehen und den Prozentsatz an Zellen in der ersten Zellenlage, die den Vorläufer in ein Produkt einbauen, zu bestimmen. Autoradiographie kann verwendet werden, um das radioaktive Produkt zu orten. Weil der radioaktive Vorläufer und das Produkt in derselben Umgebung vorhanden sein können, kann die Analyse in Verbindung mit einer Immunmarkierung der neu synthetisierten Zellenprodukte durchgeführt werden.
Die erste Zellenschicht, die dem Kern am nächsten ist, kann wegen der Kerngeometrie oder der als das Kernmaterial verwendeten Substanz unregelmäßig in der Form sein. Außerdem, und wie in 4 veranschaulicht, kann das Kernmaterial aus demselben Material bestehen, das zur Bereitstellung eines Trägers für Zellen in der Zellenzone verwendet wird. Wenn das Kernmaterial dasselbe Material ist, wie es in der Zellenzone vorliegt, sollte die Porosität des den Kern aufweisenden Materials bevorzugt so sein, dass sie Zellen daran hindert, zu einem Abstand von der permeablen Membran zu wandern, wo sie nicht ausreichend Nahrung erhalten, um lebensfähig zu bleiben.
Ein weiterer Parameter zur Bestimmung der Abmessungen der bevorzugten Vorrichtungen der Erfindung ist der Diffusionslängenparameter (hierin im folgenden "DLP"), der zur Dicke der Zone zur Erhaltung von Zellen proportional ist. Der DLP wird bestimmt durch Vornehmen eines flächigen Schnitts durch die Vorrichtung, wobei ein solcher Schnitt senkrecht zu einer längsten Achse der Vorrichtung vorgenommen wird und durch den Kern, die permeable Membran und die Zellenzone an einem Punkt hindurchgeht, der genügend dick ist, um mindestens eine einzige Lage an Zellen zu enthalten. Die zwischen dem im wesentlichen zellfreien Bereich des Kerns und dem inneren Umfang der permeablen Membran für Zellen verfügbare Gesamtfläche wird durch direkte oder mikroskopische Beobachtungen bestimmt. Der DLP wird dann durch Dividieren der für Zellen verfügbare Gesamtfläche durch die Länge des inneren Umfangs der permeablen Membran berechnet. Bei der Berechnung des DLP für Vorrichtungen, die in der Zellenzone zellenverdrängende Substanzen wie einen festen Träger enthalten, wird zur Berechnung des DLP die Gesamtfläche der Zellenzone verwendet, ohne die von dem Träger eingenommene Fläche abzuziehen.
Zur Bestimmung der Fläche zwischen dem Kern und der permeablen Membran, die für Zellen zur Verfügung steht, können Standardverfahren verwendet werden. Bei einem Verfahren wird der ebene Querschnitt der Vorrichtung fotografiert. Die Fläche für das Zellenwachstum wird dann ausgeschnitten und gewogen. Zur Bestimmung der Fläche wird das sich ergebende Gewicht dann durch das durchschnittliche Gewicht pro Flächeneinheit des fotografischen Papiers dividiert und durch den passenden Vergrößerungsfaktor des Mikroskops und der Kamera maßstabsgerecht gemacht.
DLP-Werte sind bevorzugt kleiner als etwa 500 μm. Bevorzugter liegen DLP-Werte im Bereich von etwa 25 bis 250 μm, und am meisten bevorzugt von etwa 50 bis 100 μm.
Bevorzugt sind die Dicke der Zellenzone und der entsprechende DLP-Wert umgekehrt proportional zur Quadratwurzel der Stoffwechselaktivität der in die Vorrichtung aufzunehmenden Zellen. Außerdem sind die Dicke und die DLP-Werte direkt proportional zur Quadratwurzel des Konzentrationsunterschieds zwischen verfügbaren Nährstoffen und den Konzentrationen an Nährstoffen, die zum Überleben erforderlich sind. Dementsprechend können diese Beziehungen verwendet werden, um Vorrichtungen verschiedener Geometrien zu entwerfen, die zur Verwendung mit einem bestimmten Zelltyp besonders gut geeignet sind.
Durch Bestimmung einer bevorzugten Geometrie für einen Zelltyp können andere Vorrichtungen für andere Zelltypen durch Vergleichen der Stoffwechselaktivitäten der Zellen und durch Modifizieren des Entwurfs entsprechend den oben beschriebenen Beziehungen konstruiert werden. Für Zellen mit einer Stoffwechselrate von etwa 1 mg Glucose/(ml Zellen × min) in einem Medium, das 5 mg/100 ml Glucose enthält, liegt der am meisten bevorzugte DLP-Wert im Bereich von etwa 50 bis 100 μm. Bevorzugt würde der Sauerstoff-Verbrauch verwendet werden, um Vorrichtungen mit bevorzugten Geometrien zu entwerfen. Beispielsweise ist der bevorzugte DLP-Bereich für Zellen, die Sauerstoff mit einer Rate von etwa 4,6 × 10^–3 mol Sauerstoff/(ml Zellen × s) verwenden, ebenfalls etwa 50 bis 100 μm. (Die Werte für den Glucose- und Sauerstoff-Verbrauch basieren auf einem Zellenvolumen von 2000 Femtolitern/Zelle.) Dieser Wert geht davon aus, dass der Diffusionskoeffizient von Sauerstoff in Kulturmedium dem von Wasser ähnlich ist, der Partialdruck von Sauerstoff 120 mm Quecksilber beträgt, und dass die permeable Membran zu der Diffusion von Nährstoffen einen vernachlässigbaren Widerstand beiträgt.
Obwohl die Anwesenheit irgendeines Kerns den Vorteil schafft, den Anteil an Zellen nahe der permeablen Membran zu erhöhen, haben die bevorzugten Vorrichtungen Kerne, die die Anzahl an Zellen, die in ein gegebenes Volumen gepackt werden können, im Vergleich zu Vorrichtungen ohne Kerne erhöhen. In Vorrichtungen ohne Kerne führen größere Diffusionsstrecken zu niedrigeren Konzentrationsgradienten, was wiederum zu einem niedrigeren Netto-Nährstofffluß und zu einer niedrigeren Kapazität für lebensfähige Zellen führt.
Außerdem können Zellen im Inneren der Vorrichtung, die nicht genug Nährstoffe erhalten, absterben und Substanzen freisetzen, die für die Zellen in nächster Nähe zu der permeablen Membran toxisch sind, wodurch sie den Tod einer noch größeren Anzahl an Zellen verursachen. Dementsprechend kann in dem ringförmigen Raum oder der ringförmigen Zone, die zwischen der äußeren Oberfläche des Kerns und der inneren Oberfläche der permeablen Membran geschaffen wird, eine größere Anzahl an Zellen lebensfähig sein als ansonsten lebensfähig wäre, wenn der Kern nicht vorhanden wäre. Eine Grenze ist erreicht, wenn eine Erhöhung der Kerngröße die Lebensfähigkeit nicht länger verbessert und einfach lebensfähige Zellen verdrängt.
Ein Kern irgendeiner Größe, der Zellen aus dem mittigen Bereich der Vorrichtung verdrängt, ist zur Verwendung in den Vorrichtungen dieser Erfindung geeignet. Bevorzugt nimmt der Kern genügend Volumen ein, um den Diffusionslängenparameter (DLP) der Vorrichtung auf einen Wert zu begrenzen, der kleiner als oder gleich der maximalen Dicke ist, bis zu der eine gegebene Zellmasse durch Diffusion durch eine gegebene permeable Membran unterhalten werden kann. Die maximale Dicke hängt von mehreren Faktoren ab, wozu die Stoffwechselrate der Zellen, die Packungseffizienz der Zellen, die Permeabilitätseigenschaften der permeablen Membran und der Zellmasse, der Nährstoffgehalt des umgebenden Mediums und irgendwelches durch ein poröses Zellenwachstumssubtrat verdrängtes Volumen gehören. Bevorzugte Werte der maximalen Dicke für eine dichte Zellmasse, in der das Volumen der für Zellen verfügbaren Zone maximal mit Zellen gepackt ist, auf der Basis des Zellvolumens, liegen im Bereich von etwa 50 bis 100 μm für Pankreaszellen und Zellen mit ähnlichen Stoffwechselraten und daher ähnlichen Nährstofferfordernissen, bis etwa 500 μm für Zellen, die in verdünnter Suspension vorliegen oder die einen geringen Stoffwechselbedarf haben. Die Werte der maximalen Dicke sind relativ klein, weniger als etwa 10 μm, in dem Fall, in dem der Stoffwechselbedarf der Zelle hoch ist oder wenn Nährstoffe wegen ungünstiger Umgebungsbedingungen oder einer schlechten Membranpermeabilität knapp sind.
Wie oben diskutiert, kann es zur Bestimmung der bevorzugten Abmessungen der Vorrichtung notwendig sein, zuerst die Verbrauchserfordernisse für bestimmte kritische Nährstoffe, beispielsweise Sauerstoff oder Glucose, zu bestimmen. Verfahren zur Bestimmung der Sauerstoff- und Glucose-Verbrauchsraten sind Fachleuten wohl bekannt und sind im Handel erhältlich. Ausgehend von den Bestimmungen der Minimalbedingungen, die zur Erhaltung der Zellen in einem adäquaten Ernährungszustand notwendig sind, kann die Geometrie der Vorrichtung optimiert werden.
Das zweite Fick'sche Diffusionsgesetz kann auf den Entwurf der Vorrichtungen der Erfindung angewendet werden. Unter Verwendung einer zylindrischen Vorrichtung als ein Beispiel kann gezeigt werden, dass das Einführen eines Kerns, der 90% der Radialabmessung der permeablen Membran hat, die lineare Tragekapazität einer kernlosen Vorrichtung bemerkenswerterweise 10-fach erhöht. Diese Vorrichtungen der Erfindung haben gegenüber kernlosen Vorrichtungen mehrere Vorteile. Durch Erhöhen der Größe der Vorrichtung wird der Durchmesser der Vorrichtung größer und leichter zu handhaben. Für eine gegebene Zellenkapazität kann die geschätzte Länge kleiner werden, was die Handhabung weiter erleichtert. Die Einfachheit der Handhabung wird während aller Vorrichtungs-Handhabungsschritte, wozu Herstellung, Lagerung, Implantation und schließlich Rückgewinnung gehören, verbessert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine zylindrische Vorrichtung mit einer ringförmigen Zellenzone, die als der Raum zwischen der inneren Oberfläche der permeablen Membran und der äußeren Oberfläche des Kernmaterials definiert ist, dergestalt ausgestattet, dass der durchschnittliche Abstand zwischen den zwei Oberflächen weniger als etwa 500 μm beträgt. Bevorzugter be trägt der Raum zwischen dem Kern und der inneren Oberfläche der permeablen Membran im Mittel etwa 25 bis 250 μm. Am meisten bevorzugt beträgt der Raum zwischen dem Kern und der permeablen Membran im Mittel etwa 50 bis 100 μm.
Ein empirisches Verfahren zur Optimierung der Kerngröße für eine gegebene Vorrichtung ist, mehrere Vorrichtungen variierender Kernabmessung zu bauen, die Vorrichtungen in ihrer beabsichtigten Umgebung oder einem analogen Medium zu kultivieren, und die Vorrichtung zu wählen, die im stationären Zustand die größte Masse an lebensfähigen Zellen liefert. Alternativ kann die Vorrichtung durch Wählen eines Kerns, der zur größten Produktion an therapeutischer Substanz führt, optimiert werden. Zusätzlich können Vorrichtungen eines gewünschten Durchmessers ohne einen Kern konstruiert werden, mit Zellen gefüllt und kultiviert werden, um eine konstante Zellmasse zu erhalten. Wenn bei der Inspektion der Vorrichtung, nachdem sie für eine ausreichende Zeitdauer kultiviert wurde, eine nekrotische Zellmasse beobachtet wird, kann dann eine Vorrichtung, die einen Kern enthält, hergestellt werden. Bevorzugt ist der Kerndurchmesser etwa gleich dem Durchmesser oder kleiner als der Durchmesser der nekrotischen Zellmasse.
Ein weiterer Vorteil der Vorrichtungen dieser Erfindung ist die verbesserte Festigkeit der Vorrichtung. Vorrichtungen ohne einen Kern beziehen ihre gesamte Festigkeit von der einkapselnden Membran. Lange kernlose Vorrichtungen, die dünn sein müssen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, erfordern dickere Membranen, um eine ausreichende Festigkeit zu schaffen. Ein Erhöhen der Membrandicke erhöht auch den Widerstand gegen Diffusion und verringert daher die Anzahl an lebensfähigen Zellen, die in der Vorrichtung enthalten sein kann. Die Anwesenheit eines Kerns in den Vorrichtungen dieser Erfindung schafft die Fähigkeit, beträchtlich zur Festigkeit der Vorrichtung beizutragen ohne die Membrandicke zu erhöhen.
Ein anderer durch die Anwesenheit des Kerns geschaffener Vorteil ist ein schnelleres Ansprechen auf Umgebungsreize durch die in der Vorrichtung enthaltenen Zellen. Weil der Kern erfordert, dass sich die Zellen nahe an der ein kapselnden Membran befinden, wird der Abstand und daher die Zeit, die erforderlich ist, dass Diffusionsübertragung zu den Zellen auftritt, verringert. Diese Geschwindigkeitserhöhung ist in dem Fall wertvoll, wenn die therapeutischen Zellen durch Reagieren auf ein chemisches Signal, wie eine sich verändernde Konzentration einer physiologischen Substanz, funktionieren. Je schneller die Signalsubstanz zu den Zellen diffundieren kann, und je schneller das therapeutische Produkt aus der Vorrichtung heraus diffundieren kann, desto besser arbeitet die Vorrichtung.
Irgendein Material, das dahingehend wirkt, Zellen aus dem durch den Umfang der permeablen Membran definierten Raum zu verdrängen, ist zur Verwendung als das Kernmaterial geeignet. Zu geeigneten Kernmaterialien gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, poröses oder expandiertes Polytetrafluorethylen, Polydimethylsiloxan, Polyurethan, Polyester, Polyamid oder von Polysacchariden stammende Hydrogele, Alginat oder hydrophiles Polyacrylnitril wie Hypan^®. Der Kern ist bevorzugt ein flexibles Polymer oder Elastomer. Bevorzugter kann der Kern aus Polysacchariden, hydrophilen Copolymeren von Polyacrylnitril oder anderen Polymer-Komponenten hergestellt werden. Am bevorzugtesten weisen Kernzusammensetzungen wie Hypan^® ein Copolymer von Polyacrylnitril und Acrylamid auf. Wenn ein Hydrogel wie Hypan^® verwendet wird, sollte der Wassergehalt des hydratisierten Gels ausreichend sein, um für Flexibilität zu sorgen, während ein Wassergehalt, der Zellen den Eintritt in den Kern erlaubt, nicht überschritten werden sollte. Bevorzugt ist das die Kerne aufweisende Gel zu zwischen 35 und 95% hydratisiert. Am meisten bevorzugt beträgt der Wassergehalt etwa 68%. Weitere Einzelheiten der bevorzugten Kernzusammensetzung und des Verfahrens zur Herstellung der Kernmaterialien sind in der Technik, wie den US-Patenten Nr. 4 379 874, Nr. 4 420 589 und Nr. 4 943 618, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird, offenbart. Es werden Reaktionsbedingungen gewählt, die für eine 38%-ige Umwandlung von Acrylnitril-Gruppen in Acrylamid sorgen.
Die Herstellung des Kerns kann nach irgendeinem Verfahren, das Fachleuten auf dem Gebiet der Herstellung von Polymerstrukturen bekannt ist, erfolgen. Der Kern wird bevorzugt durch Extrudieren des Polymers durch ein rundes Mundstück als ein zylindrischer Stab geformt. Bevorzugt beträgt der Kerndurchmesser, wenn er ein Zylinder ist, zwischen etwa 0,2 bis 10 mm. Bevorzugter beträgt der Kerndurchmesser etwa 1,5 mm.
Die permeable Membran kann aus irgendeinem biologisch verträglichen Material, das die passenden Permeabilitätseigenschaften hat, hergestellt werden. Die permeable Membran sollte den Durchgang von Zell-Nährstoffen, Abfallprodukten und therapeutischen Substanzen, die von in der Vorrichtung enthaltenen Zellen ausgeschieden werden, durch sie hindurch erlauben. Die permeable Membran sollte den Durchgang von Zellen und Viren nicht erlauben. Bevorzugt sollte die permeable Membran dazu dienen, die in der Vorrichtung enthaltenen Zellen von Erkennung und Angriff durch Zellkomponenten des Immunsystems des Wirts zu isolieren. Bevorzugter sollte die permeable Membran dazu dienen, die in der Vorrichtung enthaltenen Zellen vom Kontakt mit Molekülen des Immunsystems des Wirts, die dahingehend wirken, fremde Zellen zu erkennen, einen Angriff gegen solche fremden Zellen zu führen oder unmittelbar toxische Wirkungen gegen fremde Zellen auszuüben, zu isolieren.
Beispiele von Polymeren, die geeignete selektive Permeabilitätseigenschaften haben und die als die permeable Membran verwendet werden können, können ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Natriumalginat-polyhydrat, Celluloseacetat, Panvinyl-Copolymeren, Chitosanalginat, Polyacrylaten wie Eudragit RL^®, hergestellt von Rohm & Haas GmbH, Agarose, Acrylnitril, Natriummethylyl-sulfonat, Polyvinylacrylaten wie denjenigen, die von W. R. Grace und Co. als XM50 erhältlich sind, und porösem PTFE besteht.
Am bevorzugtesten wird die permeable Membran aus einem Polyacrylnitril-Copolymer des Typs, der in den US-Patenten Nr. 4 379 874, Nr. 4 420 589 und Nr. 4 943 618 beschrieben ist, hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die permeable Membran ein Hydrogel wie dasjenige, das von Kingston Technolgies Inc. erhältlich ist und unter dem Handelsnamen Hypan^® verkauft wird. Bevorzugt hat das für die permeable Membran geeignete Hydrogel einen Wassergehalt von zwischen etwa 35 und 95. Am meisten bevorzugt beträgt der Wassergehalt des Hydrogels etwa 68%.
Die Herstellung der permeablen Membranen wird ebenfalls bevorzugt durch Extrudieren des Polymers durch ein Mundstück, in dem eine Hohlröhre mit den geeigneten Abmessungen gebildet wird, durchgeführt. Das extrudierte Polymer, das als die permeable Membran dient, sollte von ausreichendem Durchmesser sein, um das Einsetzen des Kerns in die permeable Membran zu erlauben.
Die Extrusion des Polymermaterials zur Herstellung der permeablen Membran wird unter Verwendung von Standard-Extrusionstechniken durchgeführt. Zur Herstellung der permeablen Membran zur Fertigung der Vorrichtungen dieser Erfindung wird Polymermaterial in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, um zu einer Lösung von genügend geringer Viskosität zu führen, um zu erlauben, dass die Lösung durch eine dünnwandige ringförmige Düsenmündung extrudiert wird. Bevorzugt wird die ringförmige Düse von einem Mundstück mit einem Außendurchmesser von 0,105 Inch und einem Innendurchmesser von 0,095 Inch gebildet, um eine Röhre aus permeabler Membran mit einem Lumen der gewünschten Größe herzustellen. Die Polymerlösung kann unter Verwendung einer Spritzenpumpe mit einer kontrollierten Strömungsrate durch das Mundstück gespeist werden. Die Koagulierung der Polymerlösung kann erreicht werden, indem das Mundstück in ein Koagulationsbad von entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur eingetaucht wird. Die Koagulierung der Polymerlösung tritt beim Kontakt mit dem Wasser am Austritt des Mundstücks auf. Die sich ergebende verfestigte Röhre kann von geschwindigkeitsgeregelten Treibrollen und einer Vorratsspule aufgenommen werden. Von dem Röhrenmaterial wird dann restliches Lösungsmittel abgespült, und es wird in Wasser eingetaucht gelagert.
Bevorzugt wird sehr dünnwandiges Röhrenmaterial erhalten. Dies kann erreicht werden durch Wählen einer Aufnahmegeschwindigkeit, die die Geschwindigkeit, mit der das Röhrenmaterial aus dem Mundstück austritt, überschreitet, um eine Dehnung der Röhre zu bewirken. Die Mundstück-Austrittsgeschwindigkeit wird berechnet durch Dividieren der Polymer-Zuführrate durch die Querschnittsfläche des Mundstückrings.
Die Wanddicke der permeablen Membran ist von einer Dicke, die den Durchgang von Nährstoffen und Abfallprodukten erlaubt und die Lebensfähigkeit der in der Vorrichtung enthaltenen Zellen erlaubt. Bevorzugt liegt die Dicke der permeablen Membran zwischen 2 und 100 μm. Bevorzugter ist die Dicke zwischen etwa 5 und 50 μm. Am meisten bevorzugt ist die Dicke zwischen 15 und 25 μm.
Die permeable Membran sollte einen Molekulargewicht-Ausschlußbereich (MWCO-Bereich, MWCO range) haben, der ausreicht, um Zellen daran zu hindern, sich in die Vorrichtung hinein oder aus ihr heraus zu bewegen, aber groß genug sein, um den Durchgang von Nährstoffen, Abfallstoffen und therapeutischen Substanzen, die von in der Vorrichtung enthaltenen Zellen ausgeschieden werden, zu erlauben. Der genaue MWCO-Bereich hängt ab von dem Membranmaterial, der Art von Zellen, die in der Vorrichtung enthalten sind, und der Größe des therapeutischen Zellprodukts, das in die Umgebung freigesetzt werden soll. Dementsprechend können permeable Membranen mit einem MWCO von zwischen 10 kD und 2000 kD zur Verwendung mit den Vorrichtungen dieser Erfindung geeignet sein. Ein MWCO-Bereich von zwischen 30 kD und 150 kD ist besonders bevorzugt bei Anwendungen, bei denen es gewünscht ist, die enthaltenen Zellen von einem Kontakt mit Molekülen des Immunsystems, die in der Lage sind, die enthaltenen Zellen zu erkennen oder zu zerstören, zu isolieren.
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung dieser Erfindung werden ein Kern und eine permeable Membran getrennt hergestellt, und das Lumen der permeablen Membran wird mit Flüssigkeit oder Gas expandiert, um das Einsetzen des Kern-Bestandteils zu erlauben. Wenn der Kern in das Lumen der permeablen Membran eingesetzt ist, können verschiedene Verfahren zum Verschließen der Vorrichtung verwendet werden.
Der Kern kann in die permeable Membran eingesetzt werden bevor oder nachdem die Vorrichtung mit Zellen beimpft wird (wurde). Die Kerne können unvollständig hydratisiert oder gequollen in die permeablen Membranen eingebracht werden. Bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Vorrichtung wird ein im wesentlichen trockener oder unvollständig hydratisierter Kern in das Lumen der permeablen Membran eingesetzt. Die Zellen können vor, mit oder nach dem Einsetzen des Kerns zugegeben werden. Nach dem Verschließen der Vorrichtung wird die Vorrichtung in einer Umgebung untergebracht, die ermöglicht, dass der Kern auf die passende Größe quillt. Bei einem anderen Verfahren zur Herstellung der Vorrichtungen der Erfindung werden Zellen in einer Aufschlämmung, die Zellen, Medien und einen hydratisierten Hypan^®-Kern aufweist, vorbereitet. Diese Aufschlämmung wird dann in die permeable Membran, die vorher mit einer Kanüle aus einer Röhre aus rostfreiem Stahl versehen wurde und sterilisiert wurde, injiziert. Wenn der Kern im Inneren der Röhre angeordnet ist, wird die Röhre aus rostfreiem Stahl entfernt, und die Enden werden verschlossen. Die Enden können mit chirurgischen Unterbindungsklemmen oder durch andere geeignete Mittel verschlossen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein kurzes Stück einer biologisch verträglichen Röhre über den Enden der Vorrichtung angebracht, um einen zusammenschnürenden Verschluß zu schaffen. 1B veranschaulicht zusammenschnürende Verschlüsse (5), die die permeable Membran an dem Kern abdichten. Derartige Verschlüsse können aus Substanzen wie Silikonkautschuk oder PTFE hergestellt werden. Das Verschließen der Enden kann auch erreicht werden, indem man den Kern in eine begrenzende Einfassung hineinquellen läßt.
Die Vorrichtungen dieser Erfindung schaffen dank der Fähigkeit der Zellen im Inneren der Einkapselungsvorrichtung, therapeutische Substanzen herzustellen und auszuscheiden, eine Quelle für derartige therapeutische Substanzen. Dementsprechend sollte die Vorrichtung eine ausreichende Anzahl an Zellen enthalten, um eine therapeutisch wirksame Substanzmenge bereitzustellen. Der Vorteil der Geometrie der Vorrichtungen dieser Erfindung ist, dass die Anwesenheit des Kernmaterials den Anteil an Zellen nahe an der permeablen Membran erhöht. Diese gesteigerte Nähe verringert den Anteil an Zellen, die wegen ihres Abstands von der permeablen Membran nicht genügend Nährstoffe erhalten.
Ein weiterer Vorteil der Vorrichtungen dieser Erfindung ist, dass Zellen in einer handhabbaren Vorrichtung dergestalt eingekapselt werden können, dass die Zellen in einer ausreichenden Menge vorhanden sind, um therapeutische Mengen an Zellprodukten zu liefern, und ausreichend nahe an der permeablen Membran sind, um die zerstörerischen Wirkungen der Zellnekrose zu vermeiden, die auftreten kann, wenn der Durchmesser der permeablen Membran so groß ist, dass die Zellen in den inneren Bereichen der Vorrichtung nicht in der Lage sind, Nährstoffe und Abfallstoffe auszutauschen. Diese Erfindung vermeidet solche Wirkungen durch die Anwesenheit eines innerhalb der permeablen Membran enthaltenen, volumenverdrängenden Kerns, der Zellen wirkungsvoll daran hindert, sich zu weit von der Oberfläche der permeablen Membran zu entfernen. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Gestaltung ist, dass die Vorrichtung ausreichend groß gehalten wird, um während der Implantation und der Entfernung leicht gehandhabt zu werden.
Verschiedene Arten prokaryotischer und eukaryotischer Zellen können zusammen mit den Vorrichtungen dieser Erfindung verwendet werden. Bevorzugt scheiden die Zellen eine therapeutisch brauchbare Substanz aus. Solche Substanzen können Hormone, Wachstumsfaktoren, trophische Faktoren, Neurotransmitter, Lymphokine, Antikörper oder andere Zellprodukte sein, die dem Empfänger der Vorrichtung einen therapeutischen Nutzen verschaffen. Beispiele für solche therapeutischen Zellprodukte sind, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Insulin, Nervenwachstumsfaktor, Interleukine, Nebenschilddrüsenhormon, Erythropoietin, Albumin, Transferrin und Faktor VIII.
Die Vorrichtungen dieser Erfindung können verwendet werden, um trophische Substanzen zur Behandlung verschiedener neurodegenerativer Störungen bereitzustellen. Solche Faktoren sind, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Nervenwachstumsfaktor (NGF, nerve growth factor) und andere Mitglieder der NGF-Genfamilie einschließlich dem aus dem Hirn stammenden neurotropen Faktor, Neurotrophin-3 und Neurotrophin-4; dem ciliaren neurotropen Faktor; und dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor.
Zellen wie Phäochromozytom-Zellen PC12 können in die Vorrichtungen der Erfindung implantiert werden, um Neurotransmitter wie Dopamin zu liefern, um eine Therapie für Parkinson's Krankheit zu schaffen. Zellen, die andere Neurotransmitter liefern, können ebenfalls verwendet werden.
Fachleute werden die breite Vielfalt an Zellprodukten, die zur Behandlung verschiedener Störungen brauchbar sind, die von den zum Beimpfen der Vorrichtungen dieser Erfindung verwendeten Zellen hergestellt werden können, erkennen. Die PCT-Anmeldung WO 92/19195 von Dionne, veröffentlicht am 12. November 1992, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird, beschreibt verschiedene Zelltypen, die zur Verwendung mit immunisolierenden Vorrichtungen brauchbar sind, und ihre Anwendung.
Zellen, die genetisch verändert wurden, dass sie mindestens eine zusätzliche Nucleinsäure-Sequenz enthalten, was mit der Expression einer therapeutischen Substanz verbunden ist, können besonders brauchbar zur Aufnahme in die Zellenzone der Vorrichtung dieser Erfindung sein. Diese genetisch veränderten Zellen sind von natürlich vorkommenden Zellen, die die zusätzliche Nucleinsäure-Sequenz nicht enthalten, unterscheidbar. Die zusätzlichen Nucleinsäure-Sequenzen können zu den die therapeutische Substanz exprimierenden Zellen heterolog oder homolog sein. Außerdem können die zusätzlichen Nucleinsäure-Sequenzen für die therapeutische Substanz selbst codieren und/oder nicht-codierende Sequenzen, z. B. regulatorische oder Antisense-Sequenzen, die die Expression endogener Gene modifizieren, aufweisen. Unter den Formen von Nucleinsäure-Sequenzen, die zur Einführung in die genetisch veränderten Zellen brauchbar sein können, sind intronlose codierende Sequenzen (d. h. cDNA), Kopien genomischer Gene und regulatorische Sequenzen. Die zusätzlichen Nucleinsäure-Sequenzen können aus Sequenzen, die von anderen Zellen, Viren oder synthetischen Sequenzen erhalten wurden, bestehen.
Die Größe der zu implantierenden Vorrichtung variiert in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen, die notwendig ist, um ausreichende Mengen an therapeutischen Substanzen zu liefern, und dem Ort der Vorrichtung. Bevorzugt würde die in einen Menschen zu implantierende Vorrichtung zylindrisch sein und eine Gesamtlänge von zwischen etwa 0,5 cm bis etwa 3 m haben. In ein einzelnes Individuum können mehrere Vorrichtungen implantiert werden.
Die Vorrichtungen können an irgendeiner Stelle in den Empfänger implantiert werden, die es ermöglicht, dass die Vorrichtung die erforderlichen Umgebungsreize empfängt, um durch Freisetzung therapeutischer Substanzen zu reagieren, und die die erforderlichen Nährstoffe bereitstellt, um die Lebensfähigkeit der Zellen im Inneren der Vorrichtung zu erhalten. Zu geeigneten Stellen für die Implantation von Vorrichtungen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, die Peritonealhöhle, die Hirnkammern oder die inneren Blutgefäße. Die Vorrichtungen können auch subkutan oder intramuskulär angebracht werden.
Zur Behandlung behandlungsbedürftiger Individuen wird mindestens eine Vorrichtung der Erfindung mit Zellen, die die erforderliche therapeutische Substanz liefern werden, beimpft. Nachdem in der Vorrichtung eine Kultur eingerichtet worden ist, wird die Vorrichtung in das behandlungsbedürftige Individuum übertragen. Wie oben diskutiert wurde, können die Vorrichtungen durch Mittel wie intravaskuläre Suspension, subkutanes oder intraperitoniales Einsetzen, durch jetzt bekannte oder später entwickelte Vorgehensweisen, an verschiedenen Stellen überall im Körper eingesetzt werden.
In ein Individuum werden ausreichende Anzahlen an Zellen eingesetzt, um therapeutisch wirksame Mengen der therapeutischen Substanz herzustellen. Zur Erzielung der erforderlichen Anzahl an Zellen kann eine oder mehrere Vorrichtungen verwendet werden. Die Menge an therapeutischer Substanz, die von der Zellen enthaltenden Vorrichtung hergestellt wird, kann auf der Basis der Herstellung der therapeutischen Substanz durch die Vorrichtung in Gewebekultur außerhalb des Individuums geschätzt werden. Auf der Basis solcher in vitro-Messungen kann die richtige Größe und Anzahl von Vorrichtungen, die die geeignete Anzahl an Zellen enthalten, bestimmt werden.
Die Vorrichtungen dieser Erfindung können auch verwendet werden, um Zellprodukte wie therapeutische Substanzen herzustellen. Für derartige Anwendungen werden die Vorrichtungen der Erfindung mit Zellen beimpft und in vitro für eine ausreichende Zeit kultiviert, um es den Zellprodukten zu ermöglichen, aus der Vorrichtung heraus und in das die Vorrichtung umgebende Zellenmedium hinein zu diffundieren. Die therapeutischen Substanzen können dann aus dem Kulturmedium isoliert werden, ohne mit Zellen verunreinigt zu sein. Wenn die Zellen in einer leicht entfernbaren Vorrichtung enthalten sind, erleichtert das die Substanzreinigung durch Beseitigung der Belastung durch Vorgehensweisen, die zur Entfernung zellulärer Bestandteile aus dem Kulturmedium notwendig sind.
Beispiel 1
Vorrichtungen wurden hergestellt und mit Zellen in vitro getestet, um zu belegen, dass eine stabile lebensfähige Zellenpopulation erzielt werden konnte.
A. Extrusion einer röhrenförmigen Membran
Eine Hypan^®-Röhre (HN-68, erhalten von Kingston Technologies, Inc.) zur Verwendung als die permeable Membran wurde hergestellt durch Auflösen von Polymer (10% w/w (Gewicht/Gewicht)) in einem Lösungsmittel, das aus einer wässerigen Lösung von 55% NaSCN bestand, was zur einer Polymer-Lösung von ausreichend niedriger Viskosität führte, um durch eine dünnwandige ringförmige Düsenmündung extrudiert zu werden. Unter Verwendung einer Spritzenpumpe wurde die Polymer-Lösung mit einer kontrollierten Strömungsrate von 10 ml pro Stunde durch ein Mundstück gespeist. Das zur Herstellung der permeablen Membran verwendete Mundstück bestand aus einer ringförmigen Öffnung mit 0,105 Inch Außendurchmesser, 0,095 Inch Innendurchmesser, und es war in ein Koagulationsbad eingetaucht, das aus entionisiertem Wasser von Raumtemperatur bestand. Das Koagulieren der Polymer-Lösung tritt beim Kontakt des Polymers mit dem Wasser am Ausgang des Mundstücks auf. Die sich ergebende verfestigte Röhre wurde mit einer geregelten Geschwindigkeit von 3,5 Fuß pro Minute von Treibrollen aufgenommen, und irgendwelches restliches Lösungsmittel wurde von der Röhre abgespült. Die sich ergebende Röhre wurde in Wasser eingetaucht gelagert. Dehnen der Röhre bei ihrer Koagulierung durch die obige Aufnahmegeschwindigkeit führte zu einer sehr dünnwandigen Röhre. Es wurde gemessen, dass die sich ergebende permeable Membran einen Außendurchmesser von 1,95 mm und eine Wanddicke von 15 μm hatte.
Ein Hypan^®-Kern aus HN68 wurde mit einem sich ergebenden Durchmesser von 1,5 mm extrudiert.
B. Beimpfen der Vorrichtung mit Zellen
CGT-6-Zellen, eine genetisch manipulierte Mäuse-Zelllinie, die beschrieben ist in Hughes SD et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA; 89: 688–692 (1992), in T75-Kolben zur Konfluenz gezüchtet, wurden zum Beimpfen in die Vorrichtung vorbereitet. Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt, zentrifugiert und wieder in 5 ml Medium (DMEM; 450 mg/dl Glucose enthaltend) suspendiert. Eine aus Zellen, Medien und hydratisiertem Hypan^®-Kern bestehende Aufschlämmung wurde in fünf Stücke Hypan^®-Röhre, von denen jedes vorher mit einem Stück Röhre aus rostfreiem Stahl als Kanüle versehen und dampfsterilisiert worden war, injiziert. Als der Kern im Inneren der Röhre angeordnet war, wurden die Enden der Röhren mit chirurgischen Unterbindungsklemmen, gepolstert durch ein kleines Quadrat aus Silikonkautschuk, verschlossen. Die fünf Vorrichtungen wurden jede in einer separaten Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit sechs Vertiefungen untergebracht. Nicht eingebrachte Zellen wurden in der sechsten Vertiefung untergebracht, um die Lebensfähigkeit dieser Population von Zellen nach dem Einbringungsvorgang zu bestimmen. Alle Vertiefungen wurden mit 4 ml Wachstumsmedium mit 450 mg/dl Glucose gefüllt. Das Medium wurde jeden Tag durch frisches Medium ersetzt. Das erschöpfte Medium aus jeder Vertiefung wurde zurückbehalten und zur nachfolgenden Analyse eingefroren. Eine Schätzung der Population der Vorrichtungen wurde durch Messen des Glucoseverbrauchs bestimmt. Vorhergehende Experimente ergaben, dass eine Million CGT-6-Zellen Glucose mit einer Geschwindigkeit von 3 mg/Tag verbrauchten.
Die Vorrichtungen wurden am Tag Null mit Zellen beimpft, und der Glucoseverbrauch wurde bis zum Tag 83 kontinuierlich überwacht. Zwischen dem Tag 83 und dem Tag 114 wurde das Medium weiterhin gewechselt, wenn auch weniger häufig, und der Glucoseverbrauch wurde nicht gemessen. Am Tag 114 wurden die Vorrichtungen aus dem Medium entfernt, geprüft, gemessen, und die Zellen geerntet. Die geernteten Zellen wurden mit Trypsin behandelt und unter Verwendung eines Coulter-Zählers gezählt.
Unmittelbar nach dem Beimpfen der Vorrichtungen mit Zellen hatten die Vorrichtungen ein gleichmäßig milchiges Aussehen. Innerhalb eines Tages und für näherungsweise drei Wochen danach kolonisierten die Zellen den tiefsten Teil der Vorrichtung, wobei sie parallel zur Länge der Vorrichtung eine Linie aus agglomerierten Zellen bildeten. Im Verlauf der Zeit stieg die Anzahl an Zellen an bis die Zellen konfluent waren, und die Zellen schienen um den Kern herum gewachsen zu sein, wobei sie den zwischen dem Kern und der permeablen Membran gebildeten ringförmigen Raum vollständig einnahmen. In den letzten Monaten der Kultur erschienen die Vorrichtungen vollständig gepackt, wobei sie ein superkonfluentes Aussehen hatten. Obwohl der Kern Blicken verborgen war, konnte sein Umriß im Zentrum der Zellmasse angenähert werden.
Wegen der Anwesenheit von Zellen außerhalb der Vorrichtung, von denen manche an den Silikonkautschuk-Kissen anhafteten, wurden die Vorrichtungen täglich gespült, um nicht in der Vorrichtung enthaltene Zellen zu entfernen. Nach den Spülungen enthielten die Vorrichtungen eine große superkonfluente Zellmasse mit Spuren von Zellklumpen, die auf den Silikonkissen beobachtet wurden.
Messungen der Vorrichtungsabmessungen wurden aus mikrophotographischen Aufnahmen, die unmittelbar vor dem Ernten von den Vorrichtungen ge macht wurden, bestimmt. Tabelle 1 zeigt die Abmessungen der fünf Vorrichtungen. Für Vorrichtung Nr. 5, die nicht mit ausreichender Deutlichkeit photographiert wurde, um Längenbestimmungen zu erlauben, wurden keine präzisen Messungen erhalten.
Tabelle 1
5 zeigt die Beziehung zwischen Tagen in Kultur und Glucoseverbrauch. Die Daten zwischen dem Tag 1 und dem Tag 43 wurden weggelassen, weil gefunden wurde, dass Zellen in dem Medium außerhalb der Vorrichtungen vorhanden waren und signifikant zum Glucoseverbrauch beitrugen. Bei allen getesteten Vorrichtungen wurde eine Erhöhung des Glucoseverbrauchs im Laufe der Zeit bis zu einem Plateauniveau beobachtet.
Die Lebensfähigkeit und die Anzahl an Zellen bei Beendigung des Experiments (114 Tage in Kultur) ist für die fünf Vorrichtungen in Tabelle 2 gezeigt. Die Lebensfähigkeit für die fünf Vorrichtungen lag im Mittel bei etwa 85%, wobei die Anzahl an Zellen im Bereich von 5,4 × 10⁵ bis 1,6 × 10⁶ Zellen pro Vorrichtung lag.
Tabelle 2
Beispiel 2
Eine andere zum Beleg der Lebensfähigkeit hergestellte Einkapselungsvorrichtung wurde unter Verwendung einer dünnwandigen (15 μm) röhrenförmigen permeablen Membran mit einem Außendurchmesser von 1,95 mm, die aus einem Polyacrylnitril-Acrylat-Copolymer aufgebaut war, wie es beschrieben ist in den US-Patenten Nr. 4 943 618, Nr. 4 379 874 und Nr. 4 420 589, konstruiert. Diese Vorrichtung wurde hergestellt durch Injizieren einer flüssigen Aufschlämmung, die eine suspendierte Menge an lebensfähigen CGT-6-Zellen und einen raumfüllenden Kern aus porösem PTFE von 2,5 cm Länge und 1,75 mm Durchmesser aufwies, in die permeable Membran. Die Enden der Vorrichtung wurden unter Verwendung chirurgischer Standard-Unterbindungsklemmen verschlossen, wobei ein kleines (5 mm × 5 mm) Quadrat aus Silikonkautschuk zur Steigerung der Klemmenwirkung durch Begrenzen der Belastung auf die Röhrenmembran verwendet wurde.
Die CGT-6-Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin, gefolgt von Zentrifugieren und erneutem Suspendieren in Zellen-Kulturmedien zur Aufschlämmungs-Injektion vorbereitet.
Unmittelbar nach dem Zusammensetzen wurde die Vorrichtung in einer Gewebekultur-Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen untergebracht, in 4 ml Medium eingetaucht und unter Standardbedingungen, die für die Zellen in freier Kultur geeignet sind, inkubiert. Das anfängliche Aussehen der Vorrichtung war durchscheinend. Suspendierte Zellen waren durch die klare permeable Membran betrachtbar.
Innerhalb eines Tages hatte sich die Zellen-Aufschlämmung abgesetzt, um ein krummliniges Agglomerat zu bilden, das näherungsweise durch den tiefsten Bereich der Vorrichtung, wie sie in der Zellkulturvertiefung lag, definiert wurde.
Im Laufe der nächsten drei Wochen veränderte sich diese Anordnung, als sich die Zellenkolonie vervielfachte und größere Flächen des ringförmigen Raums einnahm, wobei sie eine durchscheinende amorphe Masse bildete.
Die Glucose-Aufnahme wurde als ein Anzeichen für die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferation von Zellen in der Vorrichtung gemessen, wobei derselbe Umrechnungsfaktor, der in Beispiel 1 beschrieben ist, verwendet wurde. Die Glucose-Aufnahme wurde gemessen als der Unterschied zwischen den Glucose-Konzentrationen, die in dem die Vorrichtung über einen Zeitraum von 24 Stunden umgebenden Medium gemessen wurden, und der Glucose-Konzentration in einer Kontrollvertiefung. Die Glucose-Aufnahme der Vorrichtung war zu Beginn niedrig und erhöhte sich über die Dauer der Vorrichtung, bis sie sich auf einem Niveau stabilisierte, das der Anwesenheit von 2 × 10⁶ Zellen in freier Kultur entspricht. Die Insulin-Erzeugung der Vorrichtung während der Zeitdauer, als die Population der Vorrichtung stabil war, befand sich mit einer Population von 2 × 10⁶ Zellen in Übereinstimmung.
Viele Male während der Kultur dieser Vorrichtung war es notwendig, die Vorrichtung mit chirurgischen Instrumenten in aseptischer Weise zu handhaben. Diese Handhabung bestand im Ergreifen der Vorrichtung mit einer Zange, im Baden der Vorrichtung mit einer Strömung von Medium, und im Unterbringen der Vorrichtung in einem anderen Behälter.
Eine abschließende Beurteilung dieser Vorrichtung wurde nach einer Dauer von 56 Tagen durchgeführt. Die intakte Vorrichtung wurde mit einem Lebensfähigkeits-Farbstoff, der lebende Zellen mit grüner Farbe färbt und tote Zellen mit roter Farbe färbt ("Live/Dead^TM Viability/cytotoxicity assay, Molecular Probes Inc.), behandelt. Eine nachfolgende grobe Untersuchung der gefärbten Vorrichtung offenbarte einen hohen Grad an Lebensfähigkeit, wie durch einen im wesentlichen grünen Farbton angezeigt wurde. Nach Beurteilung der intakten Vorrichtung wurde die Vorrichtung aufgeschnitten und die Zellen wurden durch Behandlung mit Trypsin für die Coulter-Zählung vorbereitet. Die Lebensfähigkeit wurde ebenfalls geprüft. Zellen-Zählungen von 1,8 × 10⁶ Zellen, die von dem Coulter-Zähler erhalten wurden, stimmten im wesentlichen mit den 2 × 10⁶ Zellen überein, die aus den Glucoseaufnahme-Bestimmungen bestimmt wurden. Es wurde festgestellt, dass die Lebensfähigkeit der Zellen 82% betrug.
Beispiel 3
Eine weitere Vorrichtung mit den folgenden Abmessungen wurde im wesentlichen so, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, aufgebaut:

innerer Radius der permeablen Membran: 800 μm

äußerer Radius des Kerns: 725 μm

Dicke der permeablen Membran: 25 μm
Diese Vorrichtung wurde mit näherungsweise 1,4 × 10⁶ Zellen beimpft und 51 Tage lang mit täglichem Wechsel des Mediums kultiviert. Die in der Vorrichtung nach 51 Tagen vorhandene Anzahl an Zellen wurde auf der Basis des in dem Medium gemessenen, täglichen Glucoseverbrauchs zu 1,6 × 10⁶ Zellen bestimmt.
Beispiel 4
Vier Vorrichtungen, die den in Beispiel 3 beschriebenen ähnlich waren, wurden zur Implantation in Hunde vorbereitet.
Zur speziellen Anpassung der Vorrichtungen an eine Implantation in das Gefäßsystem wurde an einem Ende jeder Vorrichtung ein kleines geschoßförmiges Teil aus rostfreiem Stahl befestigt, wobei ein elastomeres Silikonröhrchen verwendet wurde, um bei der fluoroskopischen und radiographischen Ortung der Vorrichtungen zu helfen. Es wurde auch eine durchgehende Schlinge aus Nahtmaterial durch das entgegengesetzte Ende jeder Vorrichtung hindurchgeführt, um als ein Haltefaden zu wirken.
Eine Vorrichtung wurde jeweils bei vier erwachsenen Windhunden chirurgisch in die äußere Jugularvene eingeführt. Das Halterungs-Nahtmaterial wurde verwendet, um die Vorrichtung an der Wand der Vene zu befestigen. Sieben Tage nach der Implantation wurden die Vorrichtungen wieder entnommen.
Eine der den Tieren entnommenen Vorrichtungen ergab die folgenden Lebensfähigkeits-Bestimmungen nach drei verschiedenen Untersuchungsverfahren: 56% durch Glucose-Verbrauch, 62% durch Live/Dead^TM Viability/Cytotoxicity Assay, und 58% durch Insulin-Erzeugung. Insgesamt zeigte diese spezielle Vorrichtung nach sieben Tagen in vivo eine lebensfähige Population von Zellen, die 50–60% der Größe ihres Werts vor der Implantation hatte.
Irgendeine Lebensfähigkeit, die nach sieben Tagen Implantation in vivo nachgewiesen wird, zeigt ein richtiges Funktionieren der Vorrichtung, wie es durch den Transport von Nährstoffen zu der Zellenmasse definiert wird, an. Es wurde vorher festgestellt, dass die lebensfähige Population, die im Inneren einer Vorrichtung unterhalten werden kann, von den Konzentrationen an Nährstoffen in der Umgebung außerhalb der Vorrichtung abhängt. Dies kann die Verringerung der lebensfähigen Population, die beobachtet wurde, als die Vorrichtung aus dem Gewebekulturmedium entfernt und in das Tier implantiert wurde, erklären. Alternativ kann diese Lebensfähigkeits-Bestimmung fälschlicherweise niedrig sein, da die Vorrichtung während der Entnahme aus dem Tier ungünstigen Be dingungen ausgesetzt war. Die Untersuchung der Lebensfähigkeit in den anderen drei Vorrichtungen wurde durch experimentelle Schwierigkeiten beeinträchtigt, und die Ergebnisse sind nicht in einer sinnvollen Weise interpretierbar.

Claims

Zelleneinkapselvorrichtung zum Bereitstellen von Substanzen, die von in der Vorrichtung enthaltenen Zellen stammen, wobei die Vorrichtung aufweist: – einen Kern mit einer Innenzone und einer die Innenzone umgebenden äußeren Begrenzung; – eine Zellenzone zur Aufnahme von Zellen, wobei die Zellenzone den Kern im wesentlichen umgibt und zwischen der äußeren Begrenzung des Kerns zu einer Innenfläche einer permeablen Membran hin verläuft, welche eine Innen- und eine Außenfläche aufweist und die Zellenzone sowie den Kern umgibt, wobei der Kern vorgesehen ist, um die Zellen aus dem Mittelbereich der Vorrichtung herauszuverlagern und der Vorrichtung zusätzliche Festigkeit zu verleihen, die das Aufrechterhalten der Beziehung Kern-Raum-permeable Membran ermöglicht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Kern ein Hydrogelkern ist, der auf geeignete Größe anschwellen kann.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der das Hydrogel ein Copolymer aus Polyacrylnitril und Acrylamid aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der der Kern eine zylindrische Form mit einem Kerndurchmesser aufweist, der größer ist als die Dicke der Zellenzone.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Membran eine poröse PTFE-Membran ist, die den Durchgang von zellularen Nährstoffen, Abfallprodukten und therapeutischen Substanzen ermöglicht, die von den Zellen abgesondert werden, einschließlich gelöste Gase wie z. B. Sauerstoff.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei der ein poröses Netzwerk die Zellenzone ausfüllt.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der das poröse Netzwerk aus Synthetik-Polymeren besteht, die die Zellenanhaftung fördern.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der das poröse Netzwerk aus einem porösen PTFE-Material, einem Dextran-Material, einem Collagen-Material, einem Polyester-Material oder einem Polystyrol-Material besteht.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, bei der das poröse Netzwerk ein regelloses Netzwerk oder ein Balkennetzwerk ist oder die Form von Mikrokügelchen und Fasermatten aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, mit Zellen in der Zellenzone.
Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der die Zellen Insulin absondernde Zellen aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, bei der der Kern einen Durchmesser aufweist, der zu der stärksten Produktion einer therapeutischen Substanz führt.
Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, bei der der Kern einen Durchmesser besitzt, der die größte Dauerzustandsmasse lebensfähiger Zellen ermöglicht.
Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, bei der der Kern und die permeable Membran derart proportioniert sind, dass ein Diffusionslängenparameter (DLP), der gemessen wird an einem flächigen Querschnitt der Vorrichtung, der rechtwinklig zur Längsachse des Kerns vorgenommen wird und durch den Kern, die Zellenzone und die permeable Membran an einem Punkt entlang der Längsachse des Kerns, wo die Zellenzone ausreichend dick ist, um mindestens eine Zellenlage aufzunehmen, hindurchgeht, und bei der der DLP definiert ist als das Verhältnis einer Fläche der Zellenzone, wobei die Fläche die Gesamtfläche der Zellenzone des Querschnitts ist, dividiert durch den Umfang der Zellenzone des Querschnitts, wobei der Umfang definiert ist als die Länge der Innenfläche der permeablen Membran an dem Querschnitt, weniger als 500 μm beträgt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei der die Zellenzone eine Dicke von weniger als 500 μm aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei der der Kern kugelförmig oder zylindrisch mit Vorsprüngen ausgebildet ist, die sich von der Außenbegrenzung des Kerns ausgehend nach außen erstrecken.
Vorrichtung nach Anspruch 16, bei der die Vorsprünge Windungen (6), Rippen (7) oder Höcker (8) sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei der die Außenbegrenzung des Kerns porös und die Innenzone des Kerns im wesentlichen frei von Zellen ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei der der Kern ein inertes, zellenfreies Material aus Polytetrafluorethylen (PTFE), Polydimethylsiloxan, Polyurethan, Polyester, Polyamid oder Hydrogel aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, bei der die Außenbegrenzung des Kerns aus einem Material besteht, welches die Zellenanhaftung fördert.
Vorrichtung nach Anspruch 20, bei der das Material zum Fördern des Zellenanhaftens Collagen, Poly-L-Lysin, Laminin, Fibronectin oder poröses PTFE ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, bei der die permeable Membran ein Hydrogel mit einer durchschnittlichen Dicke von etwa 15 bis etwa 25 μm aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, bei der der Kern und die permeable Membran im wesentlichen kugelförmig sind.