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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberDE69433723 T3
Publication typeGrant
Application numberDE1994633723
PCT numberPCT/US1994/001985
Publication date30 Oct 2008
Filing date22 Feb 1994
Priority date22 Feb 1993
Also published asCA2155947A1, CA2155947C, CN1118136A, CN1245156C, DE69433723D1, DE69433723T2, EP0693924A1, EP0693924A4, EP0693924B1, EP0693924B2, US5498421, US5635207, US5639473, US20090048331, WO1994018954A1
Publication number1994633723, 94633723, DE 69433723 T3, DE 69433723T3, DE-T3-69433723, DE1994633723, DE69433723 T3, DE69433723T3, DE94633723, PCT/1994/1985, PCT/US/1994/001985, PCT/US/1994/01985, PCT/US/94/001985, PCT/US/94/01985, PCT/US1994/001985, PCT/US1994/01985, PCT/US1994001985, PCT/US199401985, PCT/US94/001985, PCT/US94/01985, PCT/US94001985, PCT/US9401985
InventorsNeil P. Desai, Mark W. Grinstaff, Paul A. Sandford, Patrick Soon-Shiong, Kenneth S. Suslick, Michael Wong
ApplicantAbraxis Bioscience, Inc., Los Angeles
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: DPMA, Espacenet
Verfahren für die in-vivo-verabreichung von biologischen substanzen und hierfür verwendbare zusammensetzungen A method for the in vivo administration of biological substances and compositions useful for this purpose translated from German
DE 69433723 T3
Abstract  available in
Claims(20)  translated from German
  1. Zusammensetzung zur In-vivo-Verabreichung einer biologischen Substanz durch intravenöse oder intraarterielle Injektion, wobei die biologische Substanz ausgewählt ist aus: – einem Feststoff, dispergiert in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel, das im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist, – einer Flüssigkeit, dispergiert in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel, das im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist, oder – Kombinationen der beiden, – wobei die größte Querschnittsabmessung der Hülle nicht größer als 10 μm ist, – wobei die polymere Hülle ein biokompatibles Material umfasst, das im Wesentlichen durch Disulfidbindungen vernetzt ist, – wobei die polymere Hülle wahlweise durch ein geeignetes Mittel modifiziert ist, wobei das Mittel wahlweise mit der polymeren Hülle durch eine optionale kovalente Bindung verbunden ist, und – wobei die biologische Substanz ein pharmazeutisch aktives Mittel ist, ausgewählt aus analgetischen Mitteln, Betäubungsmitteln, Antiasthmatika, Antibiotika, Antidepressiva, Antidiabetika, Antimykotika, Blutdruck senkenden Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, antineoplastischen Mitteln, anxiolytischen Mitteln, enzymatisch aktiven Mitteln, Nukleinsäurekonstrukten, immunstimulierenden Mitteln, immunsuppressiven Mitteln oder Vakzinen. A composition for in vivo administration of a biological substance by intravenous or intraarterial injection, wherein the biological substance is selected from: - a solid, dispersed in a non-aqueous biocompatible dispersing agent, which is completely contained within a polymeric shell, in essence, - a liquid, dispersed in a non-aqueous biocompatible dispersing agent, which is completely contained within a polymeric shell, in essence, or - combinations of the two, - wherein the greatest cross-sectional dimension of said shell is no greater than 10 micrometers, - wherein the polymeric shell comprises a biocompatible material which is is substantially crosslinked by disulfide bonds, - wherein the polymeric shell is optionally modified by a suitable agent, wherein the agent is selectively connected with the polymeric shell through an optional covalent bond, and - wherein the biological substance is a pharmaceutically active agent selected from analgesic agents, drugs, antiasthmatics, antibiotics, antidepressants, antidiabetics, antifungal agents, antihypertensive agents, antiinflammatory agents, anti-neoplastic agents, anxiolytic agents, enzymatically active agents, nucleic acid constructs, immunostimulating agents, immunosuppressive agents, or vaccines.
  2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die antineoplastischen Mittel Paclitaxel, Paclitaxel-Analoga, Taxane oder Taxotere sind. The composition of claim 1, wherein the antineoplastic agent is paclitaxel, paclitaxel analogs, taxanes or Taxotere is.
  3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das pharmazeutisch aktive Mittel ein Nukleinsäurekonstrukt ist. The composition of claim 1, wherein the pharmaceutically active agent is a nucleic acid construct.
  4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das biokompatible Dispergierungsmittel ausgewählt ist aus Sojaöl, Kokosöl, Olivenöl, Safloröl, Baumwollsamenöl, aliphatischen, zykloaliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen mit 4–30 Kohlenstoffatomen, aliphatischen oder aromatischen Alkoholen mit 2–30 Kohlenstoffatomen, aliphatischen oder aromatischen Estern mit 2–30 Kohlenstoffatomen, Alkyl, Aryl oder zyklischen Ethern mit 2–30 Kohlenstoffatomen, Alkyl- oder Aryl halogeniden mit 1–30 Kohlenstoffatomen, wahlweise mit mehr als einem Halogen-Substituenten, Ketonen mit 3–30 Kohlenstoffatomen, Polyalkylenglykol oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon. The composition of claim 1, wherein said biocompatible dispersing agent is selected from soybean oil, coconut oil, olive oil, safflower oil, cotton seed oil, aliphatic, cycloaliphatic or aromatic hydrocarbons having 4-30 carbon atoms, aliphatic or aromatic alcohols having 2-30 carbon atoms, aliphatic or aromatic esters having 2 -30 carbon atoms, alkyl, aryl, or cyclic ethers having 2-30 carbon atoms, alkyl or aryl halides having 1-30 carbon atoms, optionally with more than one halogen substituents, ketones having 3-30 carbon atoms, polyalkylene glycol or combinations of any two or more of it.
  5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das vernetzte Polymer ein natürlich vorkommendes Polymer, ein synthetisches Polymer oder eine Kombination davon ist, wobei das Polymer vor der Vernetzung kovalent daran gebundene Sulfhydrylgruppen oder Disulfid-Verbindungen aufweist. The composition of claim 1, wherein the crosslinked polymer is a naturally occurring polymer, a synthetic polymer or a combination thereof, wherein said polymer has covalently bonded thereto prior to the crosslinking sulfhydryl groups or disulfide linkages.
  6. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei das natürlich vorkommende Polymer ausgewählt ist aus Proteinen, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten, aus Polypeptiden, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten, aus Lipiden, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten, aus Polynukleinsäuren, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten, oder aus Polysacchariden, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten. The composition of claim 5, wherein the naturally occurring polymer is selected from proteins containing sulfhydryl groups and / or disulfide groups, polypeptides containing sulfhydryl groups and / or disulfide groups, lipids containing sulfhydryl groups and / or disulfide groups, polynucleic acids containing sulfhydryl groups contain disulfide groups, or polysaccharides containing sulfhydryl groups and / or disulfide groups and / or.
  7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei das Protein aus Hämoglobin, Albumin, Insulin, Lysozym, Immunglobulinen, α-2-Makroglobulin, Fibronektin, Vitronektin, Fibrinogen oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon ausgewählt ist. The composition of claim 6, wherein the protein is selected from hemoglobin, albumin, insulin, lysozyme, immunoglobulins, α-2-macroglobulin, fibronectin, vitronectin, fibrinogen, or combinations of any two or more thereof.
  8. Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das Protein Albumin ist. A composition according to claim 7, wherein the protein is albumin.
  9. Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das Protein Hämoglobin ist. The composition of claim 7, wherein the protein is hemoglobin.
  10. Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das Protein eine Kombination aus Albumin und Hämoglobin ist. The composition of claim 7, wherein the protein is a combination of albumin and hemoglobin.
  11. Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei die Polysaccharide ausgewählt sind aus Alginat, Alginaten mit hohem M-Anteil, Polymannuronsäure, Polymannuronaten, Hyaluronsäure, Hyaluronat, Heparin, Dextran, Chitosan, Chitin, Cellulose, Stärke, Glykogen, Guarmehl, Johannisbrotgummi, Dextran, Levan, Inulin, Cyklodextran, Agarose, Xanthanlösung, Karageenen, Heparin, Pektin, Gellangummi, Skleroglukan oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon. The composition of claim 6, wherein the polysaccharides are selected from alginate, alginates having a high M content, polymannuronic acid, Polymannuronaten, hyaluronic acid, hyaluronate, heparin, dextran, chitosan, chitin, cellulose, starch, glycogen, guar gum, locust bean gum, dextran, levan, inulin, Cyklodextran, agarose, xanthan gum, Karageenen, heparin, pectin, gellan gum, scleroglucan, or combinations of any two or more of them.
  12. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei das synthetische Polymer ausgewählt ist aus synthetischen Polyaminosäuren, die Cystein-Reste und/oder Disulfidgruppen enthalten, aus synthetischen Polypeptiden, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten, aus Polyvinylalkohol, der modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyhydroxyethylmethacrylat, das modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyacrylsäure, die modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyethyloxazolin, das modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyacrylamid, das modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyvinylpyrrolidinon, das modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyalkylenglykolen, die modifiziert wurden, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, wie auch aus Mischungen von beliebigen zwei oder mehr davon. A composition according to claim 5, wherein the synthetic polymer is selected from synthetic polyamino acids containing cysteine residues and / or disulfide groups, synthetic polypeptides containing sulfhydryl groups and / or disulfide groups, polyvinyl alcohol modified to contain free sulfhydryl groups and / or to contain disulfide groups, to contain from polyhydroxyethylmethacrylate, modified free sulfhydryl groups and / or disulfide groups, polyacrylic acid modified to contain free sulfhydryl groups and / or disulfide groups, polyethyloxazoline, which has been modified to contain free sulfhydryl groups and / to or disulfide groups, to contain from polyacrylamide, modified free sulfhydryl groups and / or disulfide groups, polyvinyl pyrrolidinone which has been modified to contain free sulfhydryl groups and / or disulfide groups, polyalkylene glycols which have been modified to contain free sulfhydryl groups and to contain / or disulfide groups, as well as mixtures of any two or more thereof.
  13. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Disulfidbindungen in dem vernetzten Polymer durch Ultraschallbeschallung gebildet sind. The composition of claim 1, wherein said disulfide bonds are formed in the crosslinked polymer by ultrasonic irradiation.
  14. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerhülle, die eine biologische Substanz enthält, in einem biokompatiblen Medium suspendiert ist, und wobei das biokompatible Medium ausgewählt ist aus Wasser, gepufferten wässrigen Medien, Salzlösung, gepufferter Salzlösung, Lösungen aus Aminosäuren, Proteinlösungen, Zuckerlösungen, Vitaminlösungen, Kohlenhydratlösungen, Lösungen aus synthetischen Polymeren, lipidhaltigen Emulsionen oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon. The composition of claim 1, wherein the polymer shell containing a biological substance, is suspended in a biocompatible medium, and wherein said biocompatible medium is selected from water, buffered aqueous media, saline, buffered saline, solutions of amino acids, protein solutions, sugar solutions, vitamin solutions , carbohydrate solutions, solutions of synthetic polymers, lipid-containing emulsions, or combinations of any two or more of them.
  15. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerhülle durch ein geeignetes Mittel modifiziert ist, wobei das geeignete Mittel ausgewählt ist aus einem synthetischen Polymer, Phospholipid, einem Protein, einem Polysaccharid, einem oberflächenwirksamen Mittel, einem chemischen Modifikationsmittel oder einer Kombination daraus, wobei das Mittel mit der Polymerhülle durch eine optionale kovalente Verbindung verbunden ist. The composition of claim 1, wherein the polymeric shell is modified by a suitable agent, wherein said suitable agent is selected from a synthetic polymer, phospholipid, a protein, a polysaccharide, a surface active agent, a chemical modifying agent, or a combination thereof, wherein the means the polymer shell is connected through an optional covalent linkage.
  16. Verfahren zur Zubereitung einer biologischen Substanz zur In-vivo-Verabreichung durch intravenöse oder intraarterielle Injektion, wobei das Verfahren umfasst, dass ein wässriges Medium, das biokompatibles Material, das durch Disulfidbindungen vernetzt werden kann, und eine biologische Substanz gemäß Anspruch 1 enthält, Ultraschall-Bedingungen hoher Intensität für eine Zeit ausgesetzt wird, die ausreicht, das biokompatible Material durch im Wesentlichen Disulfidbindungen zu vernetzen; A process for the preparation of a biologic for in vivo administration by intravenous or intraarterial injection, wherein the method comprises that an aqueous medium containing biocompatible material capable of being crosslinked by disulfide bonds and contains a biological substance according to claim 1, ultrasonic conditions of high intensity is exposed for a time sufficient to crosslink said biocompatible material by substantially disulfide bonds; – wobei die biologische Substanz im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist, – wobei die größte Querschnittsabmessung der Hülle nicht größer als 10 μm ist, und – wobei die biologische Substanz ein Feststoff oder eine Flüssigkeit ist, die in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel dispergiert sind. - Wherein the biological substance is substantially completely contained within a polymeric shell, - wherein the greatest cross-sectional dimension of said shell is no greater than 10 microns, and - wherein the biological substance is a solid or a liquid dispersed in a non-aqueous biocompatible dispersing agent ,
  17. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung der biologischen Substanz an einen Patienten, wobei das Medikament eine wirksame Menge der Zusammensetzung enthält. Use of a composition according to claim 1 for preparing a medicament for administration of the biological substance to a patient, wherein the medicament containing an effective amount of the composition.
  18. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 15 zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung der biologischen Substanz an einen Patienten, wobei das Medikament eine wirksame Menge der Zusammensetzung enthält. Use of a composition according to claim 15 for the manufacture of a medicament for administration of the biological substance to a patient, wherein the medicament containing an effective amount of the composition.
  19. Zusammensetzung zur In-vivo-Verabreichung von Paclitaxel, wobei ein wasserunlösliches Paclitaxel in einer biokompatiblen Flüssigkeit suspendiert ist, und wobei die entstehende Suspension Partikel von Paclitaxel enthält, die eine Querschnittsabmessung von nicht größer als 10 μm aufweisen, wobei das Paclitaxel im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist und wobei die polymere Hülle ein biokompatibles Material umfasst, das im Wesentlichen durch Disulfidbindungen vernetzt ist. A composition for in vivo administration of paclitaxel, wherein a water-insoluble paclitaxel is suspended in a biocompatible liquid, and wherein the resulting suspension particles of paclitaxel having a cross-sectional dimension of no greater than 10 microns, wherein the paclitaxel substantially completely in a polymeric shell is included and wherein the polymeric shell comprises a biocompatible material which is cross-linked by disulfide bonds substantially.
  20. Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, wobei Paclitaxel und geeignetes Medium Ultraschallbeschallung für eine Zeit ausgesetzt wird, die ausreicht, Partikel mit einer maximalen Querschnittsabmessung von nicht größer als 10 μm herzustellen. A composition according to claim 19, wherein paclitaxel and suitable medium is subjected to ultrasonic irradiation for a time sufficient to produce particles having a maximum cross-sectional dimension of no greater than 10 microns.
Description  translated from German
  • GEBIET DER ERFINDUNG FIELD OF THE INVENTION
  • [0001] [0001]
    Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die In-vivo-Verabreichung von biologischen Substanzen. The present invention relates to the in vivo administration of biological substances. Gemäß einem Aspekt ist die biologische Substanz mit einer polymeren Hülle verbunden, die aus einem biokompatiblen Material zubereitet ist. According to one aspect, the biologic is associated with a polymeric shell, which is made from a biocompatible material. Die biologische Substanz kann mit der polymeren Hülle selbst verbunden sein, und/oder die in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel suspendierte/dispergierte biologische Substanz kann von der polymeren Hülle umschlossen sein. The biological substance may be associated with the polymeric shell itself, and / or suspended in a non-aqueous biocompatible dispersing agent / dispersed biological substance may be enclosed by the polymeric shell. Gemäß einem anderen Aspekt wird die mit der polymeren Hülle verbundene biologische Substanz einem Patienten verabreicht, wahlweise in einer geeigneten biokompatiblen Flüssigkeit dispergiert. According to another aspect, the biologic associated with polymeric shell is administered to a patient, optionally dispersed in a suitable biocompatible liquid.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG BACKGROUND OF THE INVENTION
  • [0002] [0002]
    Im Blut vorhandene Mikropartikel und Fremdkörper werden im Allgemeinen von den "Blut-Filtrierorganen", nämlich der Milz, den Lungen und der Leber, aus dem Kreislauf entfernt. Present in the blood Microparticles and foreign bodies are generally of the "blood-Filtrierorganen", namely the spleen, lungs and liver, are removed from the circuit. Das im normalen Vollblut enthaltene partikuläre Material umfasst rote Blutzellen (typischerweise mit einem Durchmesser von 8 μm), weiße Blutzellen (typischerweise mit einem Durchmesser von 6–8 μm) und Plättchen (typischerweise mit einem Durchmesser von 1–3 μm). The particulate material contained in normal whole blood comprises red blood cells (typically having a diameter of 8 microns), white blood cells (typically 6-8 microns in diameter), and platelets (typically 1-3 microns in diameter). Die Mikrozirkulation in den meisten Organen und Geweben erlaubt die freie Passage dieser Blutzellen. The microcirculation in most organs and tissues allows the free passage of these blood cells. Wenn Mikrothromben (Blutgerinsel) von Abmessungen größer als 10–15 μm im Kreislauf vorhanden sind, hat dies das Risiko von Infarkt oder Verstopfung der Kapillargefäße zur Folge, was zu Ischämie oder Sauerstoffentzug und möglichem Absterben von Gewebe führt. If microthromboses (blood clots) are greater than 10-15 microns in the circulation of sizes available, this has the risk of infarction or blockage of capillaries result, leading to ischemia or oxygen deprivation and possible tissue death. Daher muss die Injektion von Partikeln mit einem Durchmesser von mehr als 10–15 μm in den Kreislauf verhindert werden. Therefore, the injection of particles to be of a diameter of more than 10-15 microns prevented in the circulation. Eine Suspension von Partikeln mit weniger als 7–8 μm ist jedoch verhältnismäßig sicher und wurde zur Zuführung von pharmakologisch wirksamen Mitteln in Form von Liposomen und Emulsionen, Nahrungsmitteln und Kontrastmitteln für bildgebende Anwendungen verwendet. A suspension of particles less than 7-8 microns, however, relatively safe and has been for the supply of pharmacologically active agents in the form of liposomes and emulsions, foods and contrast agents used for imaging applications.
  • [0003] [0003]
    Die Größe von Partikeln und ihre Art der Zuführung bestimmt ihr biologisches Verhalten. The size of particles and their mode of delivery determines their biological behavior. Strand et al. Beach et al. [in Microspheres-Biomedical Applications, Hrsg. A. Rembaum, S. 193–227, CRC Press (1988)] haben das Schicksal von Partikeln als von ihrer Größe abhängig beschrieben. [In Microspheres-Biomedical Applications, ed. A. Rembaum, pp 193-227, CRC Press (1988)] have described the fate of particles as a function of their size. Partikel im Größenordnungsbereich von wenigen Nanometern (nm) bis 100 nm dringen nach interstitieller Injektion in die lymphatischen Kapillaren ein, und eine Phagozytose kann innerhalb der Lymphknoten stattfinden. Particles in the size range of a few nanometers (nm) to 100 nm penetrate after interstitial injection into the lymphatic capillaries, and phagocytosis may occur within the lymph nodes. Nach intravenöser/intraarterieller Injektion werden Partikel, die kleiner als ungefähr 2 μm sind, durch das retikuloendotheliale System (RES), auch bekannt als mononukleäres Phagozyten-System (MPS), schnell aus dem Blutstrom entfernt. After intravenous / intra-arterial injection, particles that are smaller than about 2 microns, by the reticuloendothelial system (RES), also known as the mononuclear phagocyte system (MPS), rapidly cleared from the blood stream. Partikel, die größer als ungefähr 7 μm sind, werden nach intravenöser Injektion in den Lungen-Kapillaren eingeschlossen. Particles that are larger than about 7 microns will, after intravenous injection included in the lung capillaries. Nach intraarterieller Injektion werden Partikel in dem ersten Kapillarbett eingeschlossen, das sie erreichen. After intra-arterial injection particles are trapped in the first capillary bed, which they achieve. Inhalierte Partikel werden von den Alveolarmakrophagen eingeschlossen. Inhaled particles are trapped by the alveolar macrophages.
  • [0004] [0004]
    Wasserunlösliche oder schlecht wasserlösliche und auf die sauren Umgebungen im Magen empfindlich reagierende Pharmazeutika können nicht konventionell (z. B. durch intravenöse Injektion oder orale Eingabe) verabreicht werden. Water-insoluble or poorly water-soluble and the acid environments in the stomach that sensitive pharmaceuticals may not conventional (eg., By intravenous injection or oral input) are administered. Die parenterale Verabreichung solcher Pharmazeutika wurde erreicht durch Emulgierten von in Öl löslich gemachtem Arzneimittel mit einer wässrigen Flüssigkeit (wie normale Salzlösung) bei Vorhandensein von oberflächenaktiven Substanzen oder Emulsions-Stabilisatoren, um stabile Mikro-Emulsionen herzustellen. The parenteral administration of such pharmaceuticals has been achieved by means of emulsified in oil solubilized drug with an aqueous liquid (such as normal saline) in the presence of surfactants or emulsion stabilizers to produce stable microemulsions. Diese Emulsionen können intravenös injiziert werden, vorausgesetzt, die Komponenten der Emulsion sind pharmakologisch wirkungslos. These emulsions may be injected intravenously, provided the components of the emulsion are pharmacologically ineffective. Zum Beispiel beschreibt das For example, describes the US-Patent Nr. 4,073,943 US Pat. No. 4,073,943 die Verabreichung von wasserunlöslichen, pharmakologisch wirksamen, in Ölen gelösten und mit Wasser emulgierten Mitteln bei Vorhandensein von oberflächenaktiven Substanzen, wie Ei-Phosphatiden, Pluronics (Copolymere von Polypropylenglykol und Polyethylenglykol), Polyglycerololeat usw. Die internationale PCT-Veröffentlichung administration of water-insoluble pharmacologically active, dissolved in oils and emulsified with water in the presence of means of surfactants such as egg phosphatides, pluronics (copolymers of polypropylene glycol and polyethylene glycol), polyglycerol oleate, etc. PCT International Publication WO 85/00011 WO 85/00011 beschreibt pharmazeutische Mikrotröpfchen eines mit einem Phospholipid wie Dimyristoyl-Phosphatidylcholin überzogenen Anästhetikums, das geeignete Abmessungen zur intradermalen oder intravenösen Injektion hat. describes pharmaceutical microdroplets coated with a phospholipid such as dimyristoyl phosphatidylcholine anesthetic, the suitable dimensions for intradermal or intravenous injection has.
  • [0005] [0005]
    Über Protein-Mikrokugeln ist in der Literatur als Träger von pharmakologischen oder diagnostischen Mitteln berichtet worden. Via Protein microspheres have been reported in the literature as carriers of pharmacological or diagnostic agents. Mikrokugeln aus Albumin sind sowohl durch Denaturation mittels Hitze als auch durch chemische Vernetzung hergestellt worden. Microspheres of albumin have been prepared by both denaturation by heat and by chemical crosslinking. Mittels Hitze denaturierte Mikrokugeln werden aus einer emulgierten Mischung (z. B. Albumin, das einzuschließende Mittel, und ein geeignetes Öl) bei Temperaturen zwischen 100°C und 150°C hergestellt. By means of heat denatured microspheres are produced at temperatures between 100 ° C and 150 ° C from an emulsified mixture (z. B. albumin, the agent to be included, and a suitable oil). Die Mikrokugeln werden dann mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen und gelagert. The microspheres are then washed with a suitable solvent and stored. Leucuta et al. Leucuta et al. [International Journal of Pharmaceutics Bd. 41: 213–217 (1988)] beschreiben das Verfahren der Herstellung von mittels Hitze denaturierten Mikrokugeln. [International Journal of Pharmaceutics Vol. 41: 213-217 (1988)] describe the method of preparation of heat denatured microspheres means.
  • [0006] [0006]
    Das Verfahren zur Herstellung chemisch vernetzter Mikrokugeln schließt die Behandlung der Emulsion mit Glutaraldehyd ein, um das Protein zu vernetzen, gefolgt von Waschen und Lagern. The process for preparing chemically crosslinked microspheres involves treating the emulsion with glutaraldehyde to crosslink the protein, followed by washing and storage. Lee et al. Lee et al. [Science Bd. 213: 233–235 (1981)] und das [Science Vol 213:. 233-235 (1981)] and the US-Patent Nr. 4,671,954 US Pat. No. 4,671,954 lehren dieses Herstellungsverfahren. teach this manufacturing process.
  • [0007] [0007]
    Die obigen Arbeitsverfahren zur Herstellung von Protein-Mikrokugeln als Träger von pharmakologisch aktiven Mitteln sind ungeeignet für den Einschluss von wasserunlöslichen Mitteln, obwohl sie zur Zufuhr von wasserlöslichen Mitteln geeignet sind. The above working process for the preparation of protein microspheres as carriers of pharmacologically active agents are unsuitable for the encapsulation of water-insoluble agents, although suitable for the delivery of water-soluble agents. Diese Einschränkung wohnt dem Herstellungsverfahren inne, das auf der Vernetzung oder Hitze-Denaturation der Proteinkomponente in der wässrigen Phase einer Wasser-in-Öl-Emulsion beruht. This limitation is inherent in the manufacturing process that is based on the cross-linking or heat denaturation of the protein component in the aqueous phase of a water-in-oil emulsion. Jedes wasserlösliche Mittel, das in der Protein enthaltenden wässrigen Phase gelöst ist, kann in der entstehenden vernetzten oder mittels Hitze denaturierten Proteinmatrix eingeschlossen sein, aber ein kaum wasserlösliches oder kaum öllösliches Mittel kann nicht in eine mittels dieser Verfahren hergestellte Proteinmatrix eingeschlossen werden. Any water-soluble agent dissolved in the protein-containing aqueous phase may be included in the resulting crosslinked or by means of heat-denatured protein matrix, but a hardly water-soluble or hardly oil-soluble agent can not be included in one produced by these methods protein matrix.
  • [0008] [0008]
    Somit stellt die mangelhafte Wasserlöslichkeit vieler biologischer Substanzen ein Problem für die Verabreichung an Menschen dar. Tatsächlich kann die Zufuhr von schon an sich unlöslichen oder kaum in wässrigem Medium löslichen pharmakologisch wirksamen Mitteln stark beeinträchtigt werden, falls die orale Zufuhr nicht wirksam ist. Thus, the poor water solubility of many biological substances is a problem for human administration. In fact, the supply of already insoluble or sparingly soluble per se in aqueous medium pharmacologically active agents can be greatly affected if oral delivery is not effective. Dementsprechend bedürfen derzeit angewandte Rezepturen zur Zufuhr von pharmakologisch wirksamen Mitteln, die schon an sich unlöslich oder kaum in wässrigem Medium löslich sind, der Zugabe von Mitteln, um die pharmakologisch wirksamen Mittel löslich zu machen. Accordingly currently require formulations applied to the supply of pharmacologically active agents which are soluble in itself insoluble or sparingly in an aqueous medium to make the addition of agents, the pharmacologically active agent soluble. Häufig werden allerdings schwerwiegende allergische Reaktionen von den Mitteln (z. B. Emulgatoren) verursacht, die verwendet werden, um die pharmakologisch wirksamen Mittel löslich zu machen. However, serious allergic reactions of the resources (eg. As emulsifiers) caused often used to make the pharmacologically active agent soluble. Somit erfordert ein übliches Applikationsregime die Behandlung des Patienten mit Antihistaminika und Steroiden, bevor das pharmakologisch wirksame Mittel injiziert wird, um die allergischen Nebenwirkungen der angewandten Mittel zu vermindern und die Arzneimittelzufuhr zu unterstützen. Thus, a usual application regime requires treatment of the patient with antihistamines and steroids prior to the pharmacologically active agent is injected in order to reduce the allergic side effects of the means employed to support and drug delivery.
  • [0009] [0009]
    In dem Bemühen, die Wasserlöslichkeit von Arzneimitteln zu verbessern, die in wässrigem Medium an sich unlöslich oder kaum löslich sind, haben etliche Forscher die Struktur von Arzneimitteln mit funktionellen Gruppen, die eine verbesserte Wasserlöslichkeit verleihen, chemisch verändert. In an effort to improve the water solubility of drugs that are insoluble or sparingly soluble in aqueous medium itself, several researchers have chemically modified the structure of drugs with functional groups that impart improved water solubility. Unter den im Stand der Technik beschriebenen chemischen Modifikationen befinden sich die Herstellung von sulfurierten Derivaten [Kingston et al., Among the chemical modifications described in the art are the preparation of sulfurized derivatives [Kingston et al., US-Patent 5,059,699 US Patent 5,059,699 (1991)] und Aminosäureestern [Mathew et al., J. Med. Chem. Bd. 35: 145–151 (1992)], die eine signifikante biologische Wirksamkeit zeigen. (1991)] and amino acid esters [Mathew et al, J. Med Chem vol 35:.... 145-151 (1992)] which show significant biological activity. Modifikationen, um wasserlösliche Derivate zu erzeugen, erleichtern die intravenöse Gabe von Arzneimitteln, die an sich unlöslich oder kaum löslich sind, in wässrigem Medium (gelöst in einem unschädlichen Träger, wie normale Salzlösung). Modifications to produce water-soluble derivatives facilitate the intravenous administration of drugs that are insoluble or sparingly soluble in itself, in an aqueous medium (dissolved in an innocuous carrier such as normal saline). Solche Modifikationen kommen jedoch zu den Herstellungskosten der Arzneimittel hinzu, können unerwünschte Nebenwirkungen und/oder allergische Reaktionen hervorrufen und/oder können die Wirksamkeit des Arzneimittels herabsetzen. Such modifications are in addition to the cost of the drug, adverse effects and / or may cause allergic reactions and / or reduce the effectiveness of the drug.
  • [0010] [0010]
    Zusätzliche biologische Substanzen, die meist in einem wässrigen Medium an sich unlöslich oder kaum löslich sind und für die es wünschenswert ist, sie in einem unschädlichen Träger, wie normaler Salzlösung, gelöst zu verabreichen, während sie einem Minimum an unerwünschten Nebenwirkungen und/oder allergischen Reaktionen Vorschub leisten, sind Diagnosemittel, wie z. B. Kontrastmittel. Additional biological substances in an aqueous medium in themselves are generally insoluble or sparingly soluble, and for which it is desirable, it dissolved to be administered in an innocuous carrier such as normal saline, while a minimum of unwanted side effects and / or allergic reactions abet, are diagnostic agents such. as contrast agents. Kontrastmittel sind bei radiologischer Bildgebung erwünscht, da sie die Sichtbarmachung von Organen (dh ihre Lage, Größe und räumliche Anordnung) und anderen Zellstrukturen vor dem umgebenden Medium verbessern. Contrast agents in radiological imaging desirable because they (ie their location, size and spatial arrangement) improve the visualization of organs and other cell structures from the surrounding medium. Die Weichteile zum Beispiel haben eine ähnliche Zellzusammensetzung (dh sie bestehen vorwiegend aus Wasser), wenn sie auch bemerkenswert unterschiedliche biologische Funktionen haben (z. B. Leber und Bauchspeicheldrüse). The soft tissues, for example, a similar cell composition (ie, they are mainly water) when they have remarkably different biological functions (eg. As the liver and pancreas).
  • [0011] [0011]
    Das Verfahren der Magnet-Resonanz-Darstellung (MRI) oder Kernspinresonanz-(NMR-)Darstellung beruht auf dem Nachweis bestimmter Atomkerne bei einer angelegten Magnetfeldstärke unter Anwendung von Radiofrequenzstrahlung. The method of magnetic resonance imaging (MRI) or nuclear magnetic resonance (NMR) representation based on the detection of certain atomic nuclei at an applied magnetic field strength using radio frequency radiation. In mancher Hinsicht ist es der Röntgen-Computertomographie (CT) ähnlich, dahingehend, dass es (in manchen Fällen) Querschnittsabbildungen von Organen mit einer möglicherweise ausgezeichneten Weichteilauflösung liefern kann. In some ways, it is the X-ray computed tomography (CT) is similar, in that it (in some cases) cross-sectional images of organs can deliver with a potentially excellent soft tissue resolution. In seiner gegenwärtigen Nutzung erstellen die Bilder eine Verteilungskarte von Protonen in Organen und Geweben. In its current use to create the images, a distribution map of protons in organs and tissues. Jedoch verwendet MRI, anders als eine Röntgen-Computertomographie, keine ionisierende Strahlung. However, MRI is used, unlike an X-ray computed tomography, no ionizing radiation. MRI ist daher ein sicheres, nichtinvasives Verfahren zur medizinischen Bildgebung. MRI is, therefore, a safe non-invasive method for medical imaging.
  • [0012] [0012]
    Obwohl das NMR-Phänomen im Jahr 1954 entdeckt wurde, hat es in der medizinischen Diagnostik dennoch erst kürzlich als Mittel zur Kartierung innerer Strukturen Verwendung gefunden. Although the NMR phenomenon was discovered in 1954, it has nevertheless been recently found in medical diagnostics as a means of mapping internal structures use. Das Verfahren wurde zuerst von Lauterbur entwickelt [Nature 242: 190–191 (1973)]. The method was first developed by Lauterbur [Nature 242: 190-191 (1973)].
  • [0013] [0013]
    Es ist wohl bekannt, dass sich Kerne mit dem passenden Kernspin in Richtung des angelegten Magnetfeldes ausrichten. It is well known that align nuclei with the appropriate nuclear spin in the direction of the applied magnetic field. Der Kernspin kann in jeder von zwei verschiedenen Arten ausgerichtet werden: mit oder gegen das äußere Magnetfeld. The nuclear spin may be aligned in each of two different ways: with or against the external magnetic field. Die Ausrichtung mit dem Feld ist stabiler; The alignment with the field is more stable; wohingegen Energie absorbiert werden muss, um sich im weniger stabilen Zustand auszurichten (dh gegen das angelegte Feld). whereas energy must be absorbed to align in the less stable state (ie against the applied field). Falls es sich um Protonen handelt, präzedieren oder resonieren diese Kerne bei einer Frequenz von 42,6 MHz bei Vorhandensein eines Magnetfeldes von 1 Tesla (1 Tesla = 10 4 Gauß). If there are protons, these nuclei precess or resonate at a frequency of 42.6 MHz in the presence of a magnetic field of 1 tesla (1 tesla = 10 4 gauss). Bei dieser Frequenz erregt ein Hochfrequenz-(HF-)Strahlungsimpuls die Kerne und ändert ihre Spin-Orientierung, damit sie sich gegen das angelegte Magnetfeld ausrichten. At this frequency, a radio frequency (RF) radiation pulse excite the nuclei and change their spin orientation so that they line up against the applied magnetic field. Nach dem HF-Impuls "entspannen" die erregten Kerne oder kehren zum Äquilibrium oder der Ausrichtung mit dem Magnetfeld zurück. After the RF pulse "relax" the excited nuclei or return to equilibrium or alignment with the magnetic back. Die Abnahme des Relaxationssignals kann unter Verwendung von zwei Relaxationstermen beschrieben werden. The decrease of the relaxation can be described using two Relaxationstermen. T 1 , die Spin-Gitter-Relaxationszeit oder Longitudinalrelaxationszeit, ist die Zeit, die von den Kernen benötigt wird, um zum Äquilibrium entlang der Richtung des von außen angelegten Magnetfeldes zurückzukehren. T 1, the spin-lattice relaxation time or longitudinal relaxation time, is the time required by the nuclei to return to equilibrium along the direction of the externally applied magnetic field. Die zweite, T 2 oder Spin-Spin-Relaxationszeit, ist mit dem Verschieben der anfänglich kohärenten Präzession einzelner Protonen-Spins verbunden. The second, T 2, or spin-spin relaxation time, is associated with the displacement of the initially coherent precession of individual proton spins. Die Relaxationszeiten für verschiedene Flüssigkeiten, Organe und Gewebe in unterschiedlichen Arten von Säugetieren sind sehr gut dokumentiert. The relaxation times for various fluids, organs and tissues in different species of mammals are very well documented.
  • [0014] [0014]
    Ein Vorteil von MRI ist, dass unterschiedliche Abtastebenen und Schnittdicken ohne Verluste bei der Auflösung ausgewählt werden können. An advantage of MRI is that different scanning planes and slice thicknesses can be selected without loss of resolution. Dies erlaubt, dass qualitativ hochwertige transversale, koronale und sagittale Bilder direkt gewonnen werden. This permits high quality transverse, coronal and sagittal images to be obtained directly. Das Fehlen jeglicher mechanischer beweglicher Teile in der MRI-Ausrüstung fördert einen hohen Zuverlässigkeitsgrad. The absence of any mechanical moving parts in the MRI equipment promotes a high degree of reliability. Es wird allgemein angenommen, dass die MRI bei der selektiven Untersuchung von Geweben ein höheres Potential hat als die Röntgen-Computertomographie (CT). It is generally believed that MRI for the selective examination of tissues at a higher potential than that of the X-ray computed tomography (CT). In der CT bestimmen allein die Koeffizienten der Röntgenstrahlenabschwächung die Bildschärfe, während mindestens drei separate Variablen (T 1 , T 2 und die Kernspin-Dichte) am Magnetresonanzbild mitwirken. In the CT alone determine the coefficients of the X-ray attenuation image sharpness while at least three separate variables (T 1, T 2 and the nuclear spin density) involved in the magnetic resonance image.
  • [0015] [0015]
    Aufgrund feiner physio-chemischer Unterschiede zwischen Organen und Geweben kann die MRI Gewebetypen unterscheiden und Erkrankungen wahrnehmen, die möglicherweise von Röntgenstrahlen oder CT nicht wahrgenommen werden können. Due fine physio-chemical differences between organs and tissues can distinguish the MRI tissue types and perceive diseases that might not be perceived by X-rays or CT. Im Vergleich reagieren CT und Röntgenstrahlen nur empfindlich auf Unterschiede der Elektronendichte in Geweben und Organen. Compared with CT and X-rays react sensitively to differences in the electron density in tissues and organs. Die mittels MRI-Verfahren erhältlichen Bilder können einen Arzt auch in die Lage versetzen, wegen ihrer besseren räumlichen Auflösung Strukturen wahrzunehmen, die kleiner sind als die mittels CT wahrgenommenen. The images obtainable by MRI techniques can enable to perceive structures because of their better spatial resolution, which are smaller than the perceived means of CT a doctor in the situation. Zusätzlich kann jede Bildabtastebene, einschließlich transversal, koronal und sagittal, unter Verwendung von MRI-Verfahren leicht erhalten werden. In addition, each image sensing plane, including transverse, coronal, and sagittal be readily obtained using MRI methods.
  • [0016] [0016]
    Derzeit wird MRI verbreitet zur Unterstützung bei der Diagnose vieler medizinischer Störungen genutzt. Currently, MRI is widely used to aid in the diagnosis of many medical disorders used. Beispiele schließen ein: Gelenkschäden, Knochenmarksstörungen, Tumoren der Weichteile, Mediastinalinvasion, Lymphadenopathie, kavernöses Hämangiom, Hämochromatose, Zirrhose, Nierenzellkarzinom, uterines Leiomyom, Adenomyose, Endometriose, Mammakarzinome, Stenose, koronare Arterienerkrankung, Aortendissektion, lipomatöse Hypertrophie, Vorhofseptum, konstriktive Perikarditis und dergleichen [siehe z. B. Edelman & Warach, Medical Progress 328: 708–716 (1993); Examples include joint injuries, bone marrow disorders, tumors of the soft tissues, Mediastinalinvasion, lymphadenopathy, cavernous hemangioma, hemochromatosis, cirrhosis, renal cell carcinoma, uterine leiomyoma, adenomyosis, endometriosis, breast cancer, stenosis, coronary artery disease, aortic dissection, lipomatous hypertrophy, atrial septum, constrictive pericarditis, and the like [see, for example, Edelman & Warach, Medical Progress 328: 708-716 (1993);. Edelman & Warach, New England J. of Medicine 328: 785–791 (1993)]. Edelman & Warach, New England J. of Medicine 328: 785-791 (1993)].
  • [0017] [0017]
    Routinemäßig angewandte Magnet-Resonanz-Bilder basieren derzeit auf Protonen-Signalen, die aus den Wassermolekülen innerhalb der Zellen hervorgehen. Routinely used magnetic resonance images are currently based on proton signals arising from the water molecules within the cells. Folglich ist es oft schwierig, die Bilder zu entziffern und einzelne Organe und Zellstrukturen zu unterscheiden. Consequently, it is often difficult to decipher the images and distinguish individual organs and cell structures. Es gibt zwei mögliche Mittel, um Protonensignale besser zu unterscheiden. There are two possible means to better differentiate proton signals. Das erste schließt die Verwendung eines Kontrastmittels ein, das T 1 oder T 2 der Wassermoleküle in einem Bereich im Vergleich zu einem anderen verändert. The first involves using a contrast agent, the T 1 or T 2 changes of water molecules in one region as compared to another. Zum Beispiel verkürzt Gadolinium-Diethylentriaminpenta-Essigsäure (Gd-DTPA) die Protonen-T 1 -Relaxationszeit der sich in der Nähe dazu befindlichen Wassermoleküle, wodurch die gewonnenen Bilder verbessert werden. For example, gadolinium diethylenetriamine penta-acetic acid proton T shortened (Gd-DTPA) 1 relaxation time which nearby to water molecules, so that the images obtained are improved.
  • [0018] [0018]
    Der zweite Weg zur Unterscheidung einzelner Organe und zellulärer Strukturen ist, einen anderen Kern für die Bildgebung einzuführen (dh ein bildgebendes Mittel). The second way to distinguish individual organs and cellular structures is to introduce another nucleus for imaging (ie, an imaging agent). Bei der Anwendung dieser zweiten Vorgehensweise kann die Bildgebung nur dort stattfinden, wo das Kontrastmittel hingebracht wurde. In applying this second approach, imaging can take place only where the contrast agent was taken to. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist die Tatsache, dass die Bildgebung ohne Beeinträchtigung durch das umgebende Wasser erreicht wird. An advantage of this method is the fact that imaging is achieved without being affected by the surrounding water. Geeignete Kontrastmittel müssen biokompatibel (dh nicht toxisch, chemisch stabil, nicht mit Geweben reagierend) und vor Ausscheidung aus dem Körper von begrenzter Lebensdauer sein. Suitable contrast agents must be biocompatible (ie, non-toxic, chemically stable, non-reactive tissues) and before his elimination from the body by a limited lifetime.
  • [0019] [0019]
    Obwohl Wasserstoff typischerweise als Grundlage für die MRI-Abtastung ausgewählt worden ist (wegen seiner Häufigkeit im Körper), kann dies wegen fehlendem Kontrast schwach dargestellte Bereiche zur Folge haben. Although hydrogen has typically been selected as the basis for MRI scanning (because of its frequency in the body), this may have weak areas shown due to lack of contrast. Folglich kann daher die Verwendung anderer aktiver MRI-Nuklei (wie z. B. Fluor) vorteilhaft sein. Consequently, hence the use of other active MRI nuclei (such. As fluorine) may be advantageous. Die Verwendung bestimmter Perfluorkohlenstoffe in verschiedenen diagnostischen Bildgebungstechnologien wie Ultraschall, Magnet-Resonanz, Radiographie und Computertomografie ist in einem Artikel von Mattery [siehe SPIE, 626, XIV/PACS IV, 18–23 (1986)] beschrieben worden. The use of certain perfluorocarbons in various diagnostic imaging technologies such as ultrasound, magnetic resonance, radiography and computed tomography in an article by mattery [see SPIE, 626, XIV / PACS IV, 18-23 (1986)] have been described. Die Verwendung von Fluor ist vorteilhaft, da Fluor nicht natürlicherweise im Körper gefunden wird. The use of fluorine is advantageous since fluorine is not naturally found in the body.
  • [0020] [0020]
    Vorschläge des Standes der Technik von Fluor enthaltenden Verbindungen, die für die Magnet-Resonanz-Bildgebung für medizinische Diagnosezwecke nützlich sind, sind begrenzt auf eine ausgewählte Gruppe von Fluor enthaltenden Molekülen, die wasserlöslich sind oder Emulsionen bilden können. Suggestions of the prior art fluorine-containing compounds that are useful for magnetic resonance imaging for medical diagnostic purposes are limited to a select group of fluorine-containing molecules that are water soluble or can form emulsions. Dementsprechend leidet die Verwendung von Fluorkohlenstoff-Emulsionen wasserlöslicher Fluorkohlenstoffe des Standes der Technik unter zahlreichen Nachteilen, z. B.: Accordingly, the use of fluorocarbon emulsions of water-soluble fluorocarbons of the prior art suffers from numerous drawbacks, for B. .:
    • 1) Verwendung instabiler Emulsionen, 1) use of unstable emulsions,
    • 2) Fehlen von Organspezifität und Ausrichtung auf das Organ, 2) lack of organ specificity and focus on the institution,
    • 3) Potential zur Induktion allergischer Reaktionen aufgrund der Verwendung von Emulgatoren und oberflächenaktiven Substanzen (z. B. Ei-Phosphatide und Eidotter-Lecithin), 3) potential for inducing allergic reactions due to the use of emulsifiers and surfactants (eg. As egg phosphatides, and egg yolk lecithin),
    • 4) begrenzte Lieferkapazitäten, und 4) limited delivery capabilities, and
    • 5) wasserlösliche Fluorkohlenstoffe werden nach der intravenösen Injektion schnell in Blut verdünnt. 5) water-soluble fluorocarbons are quickly diluted in blood after intravenous injection.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • [0021] [0021]
    In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen, die bei der In-vivo-Verabreichung von biologischen Substanzen nützlich sind, in Form von Mikropartikeln zur Verfügung gestellt, die zur parenteralen Applikation in wässriger Suspension geeignet sind. In accordance with the present invention provides compositions which are useful for the in vivo administration of biological substances, in the form of microparticles are provided which are suitable for parenteral administration in aqueous suspension. Zusammensetzungen der Erfindung umfassen biologische Substanzen (als Feststoff oder Flüssigkeit) in Verbindung mit einer polymeren Hülle. Compositions of the invention include biological agents (as a solid or liquid) associated with a polymeric shell. Die polymere Hülle ist ein biokompatibles Material, vernetzt durch das Vorhandensein von Disulfidbindungen. The polymeric shell is a biocompatible material, crosslinked by the presence of disulfide bonds. Die Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung zur Verabreichung von biologischen Substanzen beseitigt die Notwendigkeit der Anwendung biologischer Substanzen in einer Emulsion, die z. B. Ethanol und polyethoxyliertes Rizinusöl, verdünnt in normaler Salzlösung, enthält (siehe zum Beispiel Norton et al., in Abstracts of the 2nd National Cancer Institute Workshop an Taxol & Taxus, 23–24. September 1992). The use of the compositions of the invention for administration of biological substances eliminates the need for the application of biological agents in an emulsion, for. Example, ethanol and polyethoxylated castor oil, diluted in normal saline containing (see, for example, Norton et al., In Abstracts of the 2nd National Cancer Institute Workshop. taxol & Taxus, 23-24 September 1992). Ein Nachteil solcher bekannter Zusammensetzungen ist ihre Neigung, allergische Nebenwirkungen hervorzurufen. A disadvantage of such known compositions is their propensity to cause allergic side effects.
  • [0022] [0022]
    Entsprechend einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Einschluss von biologischen Substanzen in eine polymere Hülle zur Verfügung gestellt. According to a still further aspect of the present invention, methods are provided for the inclusion of biological substances in a polymeric shell available.
  • [0023] [0023]
    Die Verabreichung von biologischen Substanzen in Form einer Mikropartikel-Suspension erlaubt einen gewissen Grad der erzielten Wirkstofffreisetzung an Organen wie Leber, Lungen, Milz, Lymphkreislauf und dergleichen durch die Verwendung von Partikeln verschiedener Größe und durch Verabreichung auf unterschiedlichen Wegen. The administration of biological substances in the form of a microparticulate suspension allows some degree of release of organs such as liver, lungs, spleen, lymphatic circulation, and the like obtained by the use of particles of varying size and by administration in various ways. Das Verfahren der Erfindung zur Verabreichung erlaubt ferner die Verabreichung von biologischen Substanzen, wie im Wesentlichen wasserunlösliche pharmakologisch wirksame Mittel, die ein viel geringeres Flüssigkeitsvolumen verwenden und eine beträchtlich verminderte Verabreichungszeit benötigen, verglichen mit den Verabreichungsvolumina und -zeiten, die von Verabreichungssystemen im Stand der Technik benötigt werden (z. B. werden intravenöse Infusionen von ungefähr ein bis zwei Litern Flüssigkeit über einen Zeitraum von 24 Stunden benötigt, um eine typische Human-Dosis von 200–400 mg Taxol zu verabreichen). The method of the invention for administration further allows the administration of biologics, such as substantially water insoluble pharmacologically active agents, employing a much smaller volume of liquid and require a considerably reduced time of administration, compared with the administration volumes and times of delivery systems in the prior art are needed (for. example, be intravenous infusion of approximately one to two liters of liquid required over a period of 24 hours to deliver a typical human dose of 200-400 mg of taxol).
  • [0024] [0024]
    Die vorliegende Erfindung überwindet die Nachteile des Standes der Technik, indem sie zur Verfügung stellt: The present invention overcomes the disadvantages of the prior art in that it provides:
    • 1) injizierbare Suspensionen von biologische Substanzen enthaltenden polymeren Hüllen, 1) injectable suspensions of biological substances containing polymeric shells,
    • 2) biologische Substanzen in einer Form mit verbesserter Stabilität im Vergleich zu einfachen Emulsionen, 2) biologics in a form having enhanced stability compared to simple emulsions,
    • 3) Organ-Zielspezifität (z. B. Leber, Milz, Lunge und dergleichen) aufgrund der Aufnahme der polymeren Hüllen der Erfindung durch das RES oder MNP-System, 3) organ targeting specificity (eg. As liver, spleen, lung, and the like) due to the recording of the polymeric shells of the invention by the RES or MNP system,
    • 4) ein emulgatorfreies System, wodurch Mittel vermieden werden, die möglicherweise allergische Reaktionen verursachen können, und 4) emulsifier-free system, thereby avoiding agents that may potentially cause allergic reactions, and
    • 5) die Fähigkeit, relativ geringe Dosen von biologischen Substanzen zu injizieren und immer noch eine gute Reaktion zu erzielen, da die biologische Substanzen enthaltenden polymeren Hüllen der Erfindung auf ein bestimmtes Organ gerichtet werden können. 5) the ability to inject relatively small doses of biological substances and still achieve good response because the biological substances containing polymeric shells of the invention can be directed to a specific organ.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
  • [0025] [0025]
    1 1 zeigt eine schematische Darstellung einer polymeren Hülle, hergestellt entsprechend der vorliegenden Erfindung. shows a schematic representation of a polymeric shell prepared in accordance with the present invention. In der Zeichnung bezieht sich A auf die unlösliche, über Disulfidbrücken vernetzte polymere Hülle, B bezieht sich auf das Innere der polymeren Hülle, das gelösten Sauerstoff enthaltenden Fluorkohlenstoff, ein biokompatibles Öl mit darin gelöster biologischer Substanz, eine in einem wässrigen Medium gelöste biologische Substanz enthaltende Wasser-in-Öl-Emulsion, eine Suspension aus in einer Flüssigkeit dispergierten Feststoffteilchen und dergleichen enthalten kann, C bezeichnet die Dicke der polymeren Hülle, typischerweise ungefähr 5–50 Nanometer, und D bezieht sich auf den Durchmesser der polymeren Hülle, typischerweise in einem Bereich von ungefähr 0,1 bis zu 20 μm. In the drawing, A refers to the insoluble, cross-linked by disulfide bonds polymeric shell, B refers to the interior of the polymeric shell, fluorocarbon containing the dissolved oxygen, a biocompatible oil having dissolved therein a biological substance, a dissolved in an aqueous medium biological substance containing water-in-oil emulsion, a suspension of solid particles dispersed in a liquid and the like can contain, C denotes the thickness of the polymeric shell, typically about 5-50 nanometers, and D refers to the diameter of the polymeric shell, typically in a range of about 0.1 to about 20 microns.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • [0026] [0026]
    Entsprechend der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen zur In-vivo-Verabreichung einer biologischen Substanz durch intravenöse oder intraarterielle Injektion zur Verfügung gestellt, According to the present invention provides compositions for in vivo administration of a biological substance by intravenous or intra-arterial injection are provided,
    wobei die biologische Substanz ausgewählt ist aus: wherein the biological substance is selected from:
    • – einem Feststoff, dispergiert in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel, das im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist, - A solid, dispersed in a non-aqueous biocompatible dispersing agent, which is substantially completely contained within a polymeric shell,
    • – einer Flüssigkeit, dispergiert in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel, das im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist, oder Mischungen von beiden - A liquid, dispersed in a non-aqueous biocompatible dispersing agent, which is substantially completely contained within a polymeric shell, or mixtures of both
    • – wobei die größte Querschnittsabmessung der Hülle nicht größer als 10 μm ist, - Wherein the largest cross-sectional dimension of said shell is no greater than 10 microns,
    • – wobei die polymere Hülle ein biokompatibles Material umfasst, das im Wesentlichen durch Disulfidbindungen vernetzt ist, und - Wherein the polymeric shell comprises a biocompatible material which is cross-linked by disulfide bonds substantially, and
    • – wobei das Äußere der polymeren Hülle wahlweise durch ein geeignetes Mittel modifiziert ist, wobei das Mittel mit der polymeren Hülle durch eine optionale kovalente Bindung verbunden ist. - Wherein the exterior of the polymeric shell is optionally modified by a suitable agent, wherein said agent is associated with the polymeric shell through an optional covalent bond.
  • [0027] [0027]
    Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen zur In-vivo-Verabreichung von Paclitaxel bereit, wobei ein wasserlösliches Paclitaxel in einer biokompatiblen Flüssigkeit suspendiert ist und wobei die resultierende Suspension Paclitaxel-Partikel mit einer Querschnittsabmessung von nicht mehr als 10 μm aufweist, wobei das Paclitaxel im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist und wobei die polymere Hülle ein biokompatibles Material umfasst, das im Wesentlichen mittels Disulfidbindungen vernetzt ist. The invention also provides compositions for in vivo administration of paclitaxel prepared wherein a water-soluble paclitaxel is suspended in a biocompatible liquid, and wherein the resulting suspension having paclitaxel-particles having a cross-sectional dimension of not more than 10 microns, wherein the paclitaxel is essentially completely is contained in a polymeric shell and wherein the polymeric shell comprises a biocompatible material which is substantially crosslinked by disulfide bonds.
  • [0028] [0028]
    Der Begriff "In-vivo-Verabreichung" bezieht sich auf die Verabreichung auf solchen Verabreichungswegen wie oral, intravenös, subkutan, intraperitoneal, intrathekal, intramuskulär, intrakraniell, durch Inhalation, topisch, transdermal, mittels Suppositorium (rektal), mittels Pessar (vaginal) und dergleichen. The term "in vivo delivery" refers to administration by such routes of administration such as orally, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, intrathecally, intramuscularly, intracranially, by inhalation, topically, transdermally, by suppository (rectal), by pessary (vaginal) and the like.
  • [0029] [0029]
    Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "biologische Substanz" auf pharmazeutisch wirksame Mittel, ausgewählt aus analgetischen Mitteln, Betäubungsmitteln, Antiasthmatika, Antibiotika, Antidepressiva, Antidiabetika, Antimykotika, Blutdruck senkenden Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, antineoplastischen Mitteln, anxiolytischen Mitteln, enzymatisch aktiven Mitteln, Nukleinsäurekonstrukten, immunstimulierenden Mitteln, immunsuppressiven Mitteln oder Vakzinen. As used herein, the term "biological substance" refers to pharmaceutically active agent selected from analgesic agents, narcotics, anti-asthmatic drugs, antibiotics, antidepressants, antidiabetics, antifungal, antihypertensive agents, anti-inflammatory agents, antineoplastic agents, anxiolytic agents, enzymatically active agents , nucleic acid constructs, immunostimulating agents, immunosuppressive agents or vaccines.
  • [0030] [0030]
    Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "μm" auf eine Maßeinheit von einem Tausendstel eines Millimeters. As used herein, the term "micron" refers to a unit of one thousandth of a millimeter.
  • [0031] [0031]
    Eine Anzahl von biokompatiblen Materialien kann in der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung zur Bildung einer polymeren Hülle verwendet werden. A number of biocompatible materials can be used in the practice of the present invention to form a polymeric shell. Wie hier verwendet, beschreibt der Begriff "biokompatibel" eine Substanz, die das biologische System, in das sie eingeführt wird, nicht nennenswert verändert oder in irgendwie nachteiliger Weise beeinträchtigt. As used herein, the term "biocompatible" a substance that does not change the biological system into which it is introduced or significantly impaired in any adverse way. Es kann im Wesentlichen jedes Material, ob natürlich oder synthetisch, das Sulfhydrylgruppen oder Disulfidbindungen in seiner Struktur enthält, zur Herstellung einer mit Disulfid vernetzten Hülle verwendet werden. It can be essentially any material, whether natural or synthetic, containing sulfhydryl or disulfide bonds in its structure, be used to produce a cross-linked with disulfide envelope. Die Sulfhydrylgruppen oder Disulfidbindungen können bereits vorher innerhalb der Struktur des biokompatiblen Materials vorhanden sein, oder sie können durch eine geeignete chemische Modifikation eingeführt werden. The sulfhydryl groups or disulfide bonds can previously be present within the structure of the biocompatible material, or they may be introduced by a suitable chemical modification. Zum Beispiel sind natürlich vorkommende biokompatible Materialien, wie Proteine, Polypeptide, Oligopeptide, Polynukleotide, Polysaccharide (z. B. Stärke, Cellulose, Dextrane, Alginate, Chitosan, Pektin, Hyaluronsäure und dergleichen), Lipide usw., Kandidaten für solch eine Modifikation. For example, naturally occurring biocompatible materials such as proteins, polypeptides, oligopeptides, polynucleotides, polysaccharides (e.g., starch, cellulose, dextrans, alginates, chitosan, pectin, hyaluronic acid and the like), lipids, etc., candidates for such modification. Andere Bindungen, wie Ester, Amide, Ether und dergleichen, können ebenfalls während des Ultraschall-Beschallungsschrittes gebildet werden (solange die notwendigen funktionellen Gruppen auf dem Ausgangsmaterial vorhanden sind). Other linkages, such as esters, amides, ethers and the like, may also be formed during the ultrasonic irradiation step (so long as the required functional groups are present on the starting material).
  • [0032] [0032]
    Als Beispiele für geeignete biokompatible Materialien können natürlich vorkommende oder synthetische Proteine verwendet werden, solange solche Proteine genügend Sulfhydryl- oder Disulfidgruppen haben, so dass Vernetzung (durch Disulfidbindungsbildung zum Beispiel, als Oxidationsergebnis während Ultraschall-Beschallung) stattfinden kann. Of course, examples of suitable biocompatible materials occurring or synthetic proteins can be used as long as such proteins have sufficient sulfhydryl or disulfide groups so that crosslinking can occur (through disulfide bond formation, for example, as a result of oxidation during ultrasonic irradiation). Beispiele geeigneter Proteine schließen Albumin (das 35 Cystein-Reste enthält), Insulin (das 6 Cysteine enthält), Hämoglobin (das 6 Cystein-Reste je α 2 β 2 -Einheit enthält), Lysozym (das 8 Cystein-Reste enthält), Immunglobuline, α-2-Makroglobulin, Fibronektin, Vitronektin, Fibrinogen und dergleichen sowie Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon ein. Examples of suitable proteins include albumin (which contains 35 cysteine residues), insulin (which contains 6 cysteines), hemoglobin (the 6 cysteine residues per α 2 β 2 unit contains), lysozyme (which contains 8 cysteine residues), immunoglobulins , α-2-macroglobulin, fibronectin, vitronectin, fibrinogen, and the like as well as combinations of any two or more thereof.
  • [0033] [0033]
    Ein derzeit bevorzugtes Protein zur Verwendung bei der Bildung einer polymeren Hülle ist Albumin. A presently preferred protein for use in the formation of a polymeric shell is albumin. Ein weiteres derzeit bevorzugtes Protein zur Verwendung bei der Bildung einer polymeren Hülle ist Hämoglobin. Another presently preferred protein for use in the formation of a polymeric shell is hemoglobin. Noch ein weiteres derzeit bevorzugtes Protein zur Verwendung bei der Bildung einer polymeren Hülle ist eine Kombination von Albumin und Hämoglobin. Yet another presently preferred protein for use in the formation of a polymeric shell is a combination of albumin and hemoglobin. Wahlweise könnten Proteine wie α-2-Makroglobulin, ein bekanntes Opsonin, verwendet werden, um die Aufnahme der durch die Hülle eingeschlossenen Partikel einer biologischen Substanz durch makrophagenähnliche Zellen zu verbessern oder um die Aufnahme der durch die Hülle eingeschlossenen Partikel in Leber und Milz zu verbessern. Optionally could proteins such as α-2-macroglobulin, a known opsonin, be used to improve the uptake of the area enclosed by the shell particles of a biological substance by macrophage-like cells, or to improve the absorption of the area enclosed by the envelope particles in the liver and spleen , Andere funktionelle Proteine, wie Antikörper oder Enzyme, die das Richten der biologischen Substanz auf eine gewünschte Stelle erleichtern könnten, können ebenfalls bei der Bildung der polymeren Hülle verwendet werden. Other functional proteins, such as antibodies or enzymes, which could facilitate the straightening of the biological substance to a desired location, may also be used in the formation of the polymeric shell.
  • [0034] [0034]
    Ähnlich sind synthetische Polypeptide, die Sulfhydryl- oder Disulfidgruppen enthalten, ebenfalls gute Kandidaten zur Bildung von Partikeln, die eine polymere Hülle haben. Similarly, synthetic polypeptides containing sulfhydryl or disulfide groups are also good candidates for formation of particles having a polymeric shell. Zusätzlich sind Polyalkylenglykole (z. B. lineare oder verzweigte Kette), Polyvinylalkohol, Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyacrylsäure, Polyethyloxazolin, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidinon und dergleichen gute Kandidaten für die chemische Modifikation (um Sulfhydryl- und/oder Disulfidbindungen einzuführen) und Hüllenbildung (indem sie deren Vernetzung verursachen). In addition, polyalkylene glycols (e.g., B. linear or branched chain), polyvinyl alcohol, polyhydroxyethyl methacrylate, polyacrylic acid, polyethyloxazoline, polyacrylamide, polyvinyl pyrrolidinone, and the like are good candidates for chemical modification (to sulfhydryl and / or to introduce disulfide linkages) and shell formation (by cross-linking the cause).
  • [0035] [0035]
    Bei der Zubereitung der Zusammensetzungen der Erfindung verwendet man ein nichtwässriges Dispergierungsmittel, um eine biologische Substanz zu suspendieren oder zu lösen. In preparing the compositions of the invention is used a non-aqueous dispersing agent to suspend or dissolve a biological substance. Dispergierungsmittel, die zur Verwendung in der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung gedacht sind, schließen jede beliebige Flüssigkeit ein, die eine biologische Substanz suspendieren oder lösen kann, jedoch weder mit dem zur Herstellung der Hülle verwendeten Polymer noch mit der biologischen Substanz selbst chemisch reagiert. Dispersing agents which are intended for use in the practice of the present invention include any liquid, which can dissolve or suspend a biological substance, but even chemically reacts with neither the used to prepare the shell polymer still having the biological substance. Beispiele schließen pflanzliche Öle (z. B. Sojaöl, Mineralöl, Maiskeimöl, Rapssamenöl, Kokosöl, Olivenöl, Safloröl, Baumwollsamenöl und dergleichen), aliphatische, cykloaliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe, die 4–30 Kohlenstoffatome haben (z. B. n-Dodekan, n-Dekan, n-Hexan, Cyklohexan, Toluen, Benzol und dergleichen), aliphatische oder aromatische Alkohole mit 1–30 Kohlenstoffatomen (z. B. Oktanol und dergleichen), aliphatische oder aromatische Ester mit 2–30 Kohlenstoffatomen (z. B Ethylcaprylat (Oktanoat) und dergleichen), Alkyl, Aryl oder cyklische Ether mit 2–30 Kohlenstoffatomen (z. B. Diethylether, Tetrahydrofuran und dergleichen), Alkyl- oder Arylhalide mit 1–30 Kohlenstoffatomen (und wahlweise mehr als einem Halogensubstituenten, z. B. CH 3 Cl, CH 2 Cl 2 , CH 2 Cl-CH 2 Cl und dergleichen), Ketone mit 3–30 Kohlenstoffatomen (z. B. Aceton, Methylethylketon und dergleichen), Polyalkylenglykole (z. B. Polyethylenglykol und dergleichen) oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon ein. Examples include vegetable oils (eg. For example, soybean oil, mineral oil, corn oil, rapeseed oil, coconut oil, olive oil, safflower oil, cottonseed oil, and the like), aliphatic, cycloaliphatic or aromatic hydrocarbons 4-30 carbon atoms have (eg., N-dodecane, n-decane, n-hexane, cyclohexane, toluene, benzene and the like), aliphatic or aromatic alcohols having 1-30 carbon atoms (eg. as octanol and the like), aliphatic or aromatic esters having 2-30 carbon atoms (e.g., ethyl caprylate B (octanoate), and the like), alkyl, aryl, or cyclic ethers having 2-30 carbon atoms (eg. diethyl ether, tetrahydrofuran and the like), alkyl or aryl halides having 1-30 carbon atoms (and optionally more than one halogen substituent, for example. B . CH 3 Cl, CH 2 Cl 2, CH 2 Cl-CH 2 Cl and the like), ketones having 3-30 carbon atoms (e.g., acetone, methyl ethyl ketone and the like), polyalkylene glycols (eg., polyethylene glycol and the like) or combinations of any two or more thereof.
  • [0036] [0036]
    Besonders bevorzugte Kombinationen von Dispergierungsmitteln enthalten flüchtige Flüssigkeiten wie Dichlormethan, Ethylacetat, Benzen und dergleichen (dh Lösungsmittel, die einen hohen Grad an Löslichkeit für das pharmakologisch wirksame Mittel haben und die in dem anderen verwendeten Dispergierungsmittel löslich sind) zusammen mit einem weniger flüchtigen Dispergierungsmittel. Particularly preferred combinations of dispersing agents include volatile liquids such as dichloromethane, ethyl acetate, benzene and the like (ie, solvents that have a high degree of solubility for the pharmacologically active agent and the dispersing agent are used in the other soluble) together with a less volatile dispersing agent. Wenn sie zu dem anderen Dispergierungsmittel hinzugefügt werden, helfen diese flüchtigen Additive, die Löslichkeit des pharmakologisch wirksamen Mittels in dem Dispergierungsmittel voranzutreiben. When added to the other dispersing agents, these volatile additives help to drive the solubility of the pharmacologically active agent in the dispersing agent. Dies ist wünschenswert, da dieser Schritt üblicherweise zeitraubend ist. This is desirable since this step is usually time consuming. Nach der Auflösung kann die flüchtige Komponente durch Verdampfung (wahlweise unter Vakuum) entfernt werden. After dissolution, the volatile component may be removed by evaporation (vacuum optional).
  • [0037] [0037]
    Partikel von biologischen Substanzen, die im Wesentlichen vollkommen in einer polymeren Hülle enthalten oder mit ihr verbunden sind, die wie hier beschrieben zubereitet wurden, werden als Suspension in einem biokompatiblen Medium verabreicht. Particles of biological substances, which are essentially contained completely within a polymeric shell or connected to, prepared as described herein are administered as a suspension in a biocompatible medium. Dieses Medium kann ausgewählt werden aus Wasser, gepufferten wässrigen Medien, Salzlösung, gepufferter Salzlösung, wahlweise gepufferten Lösungen aus Aminosäuren, wahlweise gepufferten Lösungen aus Proteinen, wahlweise gepufferten Lösungen aus Zuckern, wahlweise gepufferten Lösungen aus Kohlenhydraten, wahlweise gepufferten Lösungen aus Vitaminen, wahlweise gepufferten Lösungen aus synthetischen Polymeren, Lipid enthaltenden Emulsionen und dergleichen. This media can be selected from water, buffered aqueous media, saline, buffered saline, optionally buffered solutions of amino acids, optionally buffered solutions of proteins, optionally buffered solutions of sugars, optionally buffered solutions of carbohydrates, optionally buffered solutions of vitamins, optionally buffered solutions containing from synthetic polymers, lipid emulsions and the like.
  • [0038] [0038]
    Entsprechend einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Zubereitung einer biologischen Substanz zur In-vivo-Verabreichung durch intravenöse oder intraarterielle Injektion zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass Medium, das biokompatibles Material, das durch Disulfidbindungen vernetzt werden kann, und eine biologische Substanz enthält, Ultraschall-Bedingungen hoher Intensität für eine Zeit ausgesetzt wird, die ausreicht, das biokompatible Material durch im Wesentlichen Disulfidbindungen zu vernetzen; According to another embodiment of the present invention, a method for preparing a biological substance for the in vivo administration is made by intravenous or intra-arterial injection is available, the method comprising that medium, the biocompatible material that can be cross-linked by disulfide bonds, and containing a biological substance, a high intensity ultrasound conditions for a time is exposed, sufficient to crosslink said biocompatible material by substantially disulfide bonds;
    • – wobei die biologische Substanz im Wesentlichen vollkommen in einer polymeren Hülle enthalten ist, - Wherein the biological substance is substantially completely contained within a polymeric shell,
    • – wobei die größte Querschnittsabmessung der Hülle nicht größer als 10 μm ist, und - Wherein the largest cross-sectional dimension of said shell is no greater than 10 microns, and
    • – wobei die biologische Substanz ein Feststoff oder eine Flüssigkeit ist, die in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel dispergiert sind. - Wherein the biological substance is a solid or a liquid dispersed in non-aqueous biocompatible dispersing agent.
  • [0039] [0039]
    Somit werden entsprechend der vorliegenden Erfindung in polymeren Hüllen enthaltene biologische Substanzen synthetisiert, indem hochintensiver Ultraschall angewandt wird. Thus, biological substances contained in polymeric shells are synthesized according to the present invention by high-intensity ultrasound is applied. Zwei nicht lineare akustische Prozesse werden in die Bildung stabiler polymerer Hüllen (dh akustische Emulgierung und Kavitation) einbezogen. Two non-linear acoustic processes are involved in the formation of stable polymeric shells (ie, acoustic emulsification and cavitation). Zunächst dispergiert die akustische Emulgierung die biologische Substanz in die wässrige Proteinlösung. First, the acoustic emulsification disperses the biologic into the aqueous protein solution. Die gebildete Dispersion wird dann chemisch vernetzt und stabilisiert durch die Bildung von Disulfidbindungen. The dispersion formed is then chemically crosslinked and stabilized by the formation of disulfide bonds. Die Disulfidbindungen werden von den Cystein-Resten (in dem Falle, wo das Polymer ein Protein wie Albumin ist) gebildet, die durch Superoxid oxidiert werden, das durch akustische Kavitation erzeugt wird. The disulfide bonds of the cysteine residues (in the case where the polymer is a protein such as albumin) are formed that are oxidized by superoxide which is produced via acoustic cavitation.
  • [0040] [0040]
    Die sich ergebende Suspension wird wahlweise durch Centriconfilter gefiltert (100 kDa Rückhaltevermögen), und die gefilterten Konstrukte oder Mikroblasen werden erneut in normaler Salzlösung oder geeignetem Puffer suspendiert. The resulting suspension is optionally filtered by filter cents Rico (100 kDa retention), and the filtered constructs or microbubbles are resuspended in normal saline or suitable buffer. 1 1 zeigt ein Schema solch eines Konstruktes. shows a schematic of such a construct. Der durchschnittliche Durchmesser dieser Konstrukte ist ungefähr 2 μm. The average diameter of these constructs is approximately 2 microns. Von der Partikelgrößenverteilung, wie mit einem Elzone-Partikelzähler festgestellt, wird gesehen, dass sie recht eng ist (eine Gauß-Verteilung mit einem mittleren Durchmesser von ungefähr 3 μm wird typischerweise beobachtet). Of the particle size distribution as determined with a Elzone particle counter, is seen to be quite narrow (a Gaussian distribution with a mean diameter of about 3 microns is typically observed). Der Größenbereich von mittels dieser Technik erhaltenen Partikeln liegt zwischen 0,1 μm bis 20 μm. The size range of particles obtained by this technique is between 0.1 .mu.m to 20 .mu.m. Ein bevorzugter Größenbereich ist 0,5 bis 10 μm, und der bevorzugteste Bereich ist 1 bis 5 μm. A preferred size range is 0.5 to 10 microns, and the most preferred range is from 1 to 5 microns. Diese Größe ist ideal geeignet für medizinische Anwendungen, da intravenöse oder intraarterielle Injektionen ohne das Risiko der Blockierung kleiner Blutgefäße und nachfolgender Gewebeschädigung (Ischämie infolge von Sauerstoffentzug) durchgeführt werden können. This size is ideal for medical applications, since intravenous or intra-arterial injections without the risk of blockage of small blood vessels and subsequent tissue injury (ischemia due to oxygen deprivation) can be performed. Zum Vergleich: normale rote Blutzellen haben einen Durchmesser von ungefähr 8 μm. For comparison, normal red blood cells have a diameter of about 8 microns.
  • [0041] [0041]
    Ein nicht naheliegendes Merkmal des oben beschriebenen Prozesses liegt in der Wahl des Dispergierungsmittels, insbesondere hinsichtlich der Polarität des Dispergierungsmittels. A non-obvious feature of the process described above lies in the choice of the dispersing agent, in particular with regard to the polarity of the dispersing agent. Die Bildung einer Hülle um die Partikel der biologischen Substanz ist verbunden mit einer Neuorientierung des biokompatiblen Materials an der Grenzfläche zwischen der wässrigen und der nichtwässrigen Phase, dergestalt dass die hydrophilen Bereiche in dem biokompatiblen Material der wässrigen Phase ausgesetzt werden, während die hydrophoben Bereiche in dem biokompatiblen Material in Richtung der nichtwässrigen Phase orientiert werden. The formation of a shell about the particles of the biological substance is connected to a reorientation of the biocompatible material at the interface between the aqueous and the non-aqueous phase, in such a way that the hydrophilic portions are exposed in the biocompatible material of the aqueous phase while the hydrophobic regions of the in biocompatible material are oriented towards the non-aqueous phase. Falls das biokompatible Material ein Protein ist, muss dem Polymer zur Durchführung der Entfaltung oder Änderung der Konformation Energie zugeführt werden. If the biocompatible material is a protein, the polymer for carrying out the unfolding, or change the conformation of the energy has to be supplied. Die freie Energie der Grenzfläche (Grenzflächen-Spannung) zwischen den beiden flüssigen Phasen (dh wässrig und nichtwässrig) trägt zu Änderungen der Proteinkonformation an dieser Grenzfläche bei. The free energy of the interface (interfacial tension) between the two liquid phases (ie, aqueous and non-aqueous) contributes to changes in protein conformation at that interface. Thermische Energie trägt ebenfalls zu dem Energie-Pool bei, der zur Entfaltung und/oder Änderung der Proteinkonformation benötigt wird. Thermal energy also contributes to the energy pool, which is required for the development and / or modification of protein.
  • [0042] [0042]
    Die Zufuhr thermischer Energie ist eine Funktion solcher Variablen wie die Schallleistung, die beim Ultraschallbeschallungsvorgang hoher Intensität angewandt wird, die Zeit der Ultraschallbeschallung hoher Intensität, die Art des der Ultraschallbeschallung mit hoher Intensität ausgesetzten Materials, das Volumen des Materials, das der Ultraschallbeschallung mit hoher Intensität ausgesetzt wird und dergleichen. The supply of thermal energy is a function of such variables as the acoustic power that is applied during the ultrasonic irradiation process high intensity, the time of ultrasonic irradiation of high intensity, the type of the ultrasonic irradiation with a high intensity-exposed material, the volume of the material that the ultrasonic irradiation with high intensity is exposed and the like. Die Schallleistung von Ultraschallbeschallungsvorgängen hoher Intensität kann stark variieren; The sound power of ultrasonic irradiation processes high intensity can vary greatly; typischerweise fällt sie in den Bereich von ungefähr 1 bis zu 1000 Watt/cm 2 , wobei eine Schallleistung im Bereich von ungefähr 50 bis zu 200 Watt/cm 2 derzeit ein bevorzugter Bereich ist. Typically, it falls within the range of about 1 up to 1000 watts / cm 2, wherein a noise power in the range of about 50 up to 200 watts / cm 2 is currently a preferred range. Ähnlich kann die Zeit der Aussetzung an Ultraschallbeschallung hoher Intensität stark variieren; Similarly, the time of exposure to high intensity ultrasonic irradiation vary greatly; typischerweise fällt sie in den Bereich von wenigen Sekunden bis zu ungefähr 5 Minuten. Typically, it falls within the range of a few seconds to about 5 minutes. Vorzugsweise wird die Zeit des Aussetzens an Ultraschallbeschallung hoher Intensität in den Bereich von ungefähr 15 bis zu 60 Sekunden fallen. Preferably, the time of exposure to high intensity ultrasonic irradiation in the range of about 15 up to 60 seconds will fall. Fachleute erkennen, dass je höher die angewandte Schallleistung ist, umso weniger Zeit des Aussetzens an Ultraschallbeschallung hoher Intensität benötigt wird, und umgekehrt. Those skilled, that the higher the acoustic power applied, the less exposure time is required to ultrasonic irradiation of high intensity, and vice versa.
  • [0043] [0043]
    Die freie Energie an der Grenzfläche ist direkt proportional zur Polaritätsdifferenz zwischen den zwei Flüssigkeiten. The free energy at the interface is directly proportional to the polarity difference between the two fluids. Somit ist bei einer gegebenen Arbeitstemperatur eine minimale freie Energie an der Grenzfläche zwischen den zwei Flüssigkeiten notwendig, um die gewünschte polymere Hülle zu bilden. Thus at a given operating temperature a minimum free energy at the interface between the two liquids is essential to form the desired polymer shell. Somit sind, falls eine homologe Serie von Dispergierungsmitteln mit gradueller Änderung der Polarität genommen wird, zum Beispiel Ethylester von Alkansäuren, höhere Homologa zunehmend apolar, dh, die Grenzflächenspannung zwischen diesen Dispergierungsmitteln und Wasser steigt, wie die Anzahl der Kohlenstoffatome im Ester ansteigt. Thus, if a homologous series of dispersing agents is taken with a gradual change in polarity, for instance ethyl esters of alkanoic acids, higher homologues are increasingly nonpolar, that is, the interfacial tension between these dispersing agents and water increases as the number of carbon atoms is increased in the ester. Somit ward gefunden, dass, obwohl Ethylacetat wasserunmischbar ist (dh ein Ester einer Säure mit 2 Kohlenstoffen), dieses Dispergierungsmittel allein bei Raumtemperatur (~20°C) keine signifikante Ausbeute an mit polymeren Hüllen überzogenen Partikeln ergeben wird. Thus was found that, although ethyl acetate is water-immiscible (ie, an ester of an acid having 2 carbons), this dispersant alone at room temperature (~ 20 ° C) no significant yield is found with polymeric shells coated particles. Im Gegensatz dazu ergibt ein höherer Ester wie Ethyloctanoat (Ester einer Säure mit 8 Kohlenstoffen) mit polymeren Hüllen beschichtete Partikel in hoher Ausbeute. In contrast, a higher ester such as ethyl octanoate results (ester of an acid having 8 carbon atoms) with polymeric shells coated particles in high yield. Tatsächlich ergibt Ethylheptanoat (Ester einer 7-Carbonsäure) eine mäßige Ausbeute, während die niedrigeren Ester (Ester von Säuren mit 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffen) eine geringe Ausbeute ergeben. In fact, ethyl heptanoate gives (ester of a 7 carbon acid) has a moderate yield while the lower esters (esters of acids having 3, 4, 5 or 6 carbons) will give a low yield. Somit kann man bei einer gegebenen Temperatur einen Zustand einer Minimum-Grenzflächenspannung zwischen wässrigem und Dispergierungsmittel festlegen, die zur Bildung großer Ausbeuten von mit polymeren Hüllen überzogenen Partikeln benötigt wird. Thus, one can specify a state of a minimum interfacial tension between the aqueous and dispersing agent, which is required for formation of high yields of coated particles with polymeric shells at a given temperature.
  • [0044] [0044]
    Die Temperatur ist eine andere Variable, die manipuliert werden kann, um die Ausbeute von mit polymeren Hüllen überzogenen Partikeln zu beeinflussen. Temperature is another variable that can be manipulated to affect the yield of coated particles with polymeric shells. Im Allgemeinen nimmt die Oberflächenspannung einer Flüssigkeit mit zunehmender Temperatur ab. In general, the surface tension of a liquid decreases with increasing temperature. Die Rate der Veränderung der Oberflächenspannung mit der Temperatur ist bei verschiedenen Flüssigkeiten oft unterschiedlich. The rate of change of surface tension with temperature is often different for different liquids. Somit kann zum Beispiel die Grenzflächenspannung (Δγ) zwischen zwei Flüssigkeiten Δγ 1 bei Temperatur T 1 sein und Δγ 2 bei Temperatur T 2 . Thus, for example, the interfacial tension (Δγ) between two liquids Δγ 1 at temperature T 1 and be Δγ 2 at temperature T2. Falls Δγ 1 bei T 1 nahe dem zur Bildung von polymeren Hüllen der vorliegenden Erfindung benötigten Minimum ist, und falls Δγ 2 (bei Temp. T 2 ) größer ist als Δγ 1 , dann wird eine Temperaturänderung von T 1 zu T 2 die Ausbeute von polymeren Hüllen erhöhen. If Δγ 1 at T 1 is close to the to form required of polymeric shells of the present invention, minimum, and if Δγ 2 is greater (at temp. T 2) than Δγ 1, then a change of temperature from T 1 to T 2, the yield of increase polymeric shells. Dies wird tatsächlich im Falle von Ethylheptanoat beobachtet, das eine mäßige Ausbeute bei 20°C ergibt, jedoch eine hohe Ausbeute bei 10°C. This is indeed observed in the case of ethyl heptanoate, which gives a moderate yield at 20 ° C, however, a high yield at 10 ° C.
  • [0045] [0045]
    Die Temperatur beeinflusst auch den Dampfdruck der verwendeten Flüssigkeiten. The temperature also affects the vapor pressure of the liquids used. Je niedriger die Temperatur, umso niedriger ist der Gesamtdampfdruck. The lower the temperature, the lower the total vapor pressure. Je niedriger der Gesamtdampfdruck, umso besser funktioniert das Zusammenbrechen der Kavitationsblase. The lower the total vapor pressure, the better does the collapse of the cavitation bubble. Ein besser funktionierendes Zusammenbrechen der Ultraschallbeschallungsblase korreliert mit einer erhöhten Rate der Peroxid-(HO 2 )-Bildung. A better functioning collapse of the ultrasonic irradiation bubble correlates with an increased rate of peroxide (HO 2 -) formation. Eine erhöhte Rate der Peroxid-Bildung führt zu erhöhten Ausbeuten an polymeren Hüllen bei niedrigeren Temperaturen. An increased rate of peroxide formation leads to increased yields of polymeric shells at lower temperatures. Als eine gegengleiche Betrachtung erhöht sich jedoch die Reaktionsrate für die Oxidation der Sulfhydrylgruppen (dh um Disulfidbindungen zu bilden) durch Peroxid-Ionen mit ansteigender Temperatur. As a countermeasure same consideration, however, the reaction rate for oxidation of sulfhydryl groups increases (ie, to form disulfide linkages) by peroxide ions with increasing temperature. Somit besteht für eine gegebene Flüssigkeit, die Ultraschallbeschallungs-Bedingungen ausgesetzt wird, ein ziemlich enger Bereich von optimalen Betriebstemperaturen, innerhalb derer eine hohe Ausbeute an polymeren Hüllen erzielt wird. Thus, there is, for a given liquid, the ultrasound sonication conditions is exposed to a fairly narrow range of optimum operating temperatures within which a high yield of polymeric shells is obtained.
  • [0046] [0046]
    Somit diktiert eine Kombination von zwei Effekten, dh die Änderung der Oberflächenspannung mit der Temperatur (die die Entfaltung und/oder Konformationsänderungen des Polymers direkt beeinflusst) und die Änderung in der Reaktionsausbeute (wobei die Reaktion die Vernetzung des Polymers über die Bildung von Disulfidbindungen ist) mit der Temperatur, die Gesamtumsetzung oder -ausbeute von mit polymeren Hüllen überzogenen Partikeln. Thus dictates a combination of two effects, that is, the change in surface tension with temperature (which is the deployment and / or conformational changes of the polymer directly affected) (the reaction being crosslinking of the polymer via formation of disulfide bonds), and the change in reaction yield with temperature, the total conversion or yield of coated particles with polymeric shells. Geeignete Temperaturen für die Herstellung von polymeren Hüllen der Erfindung fallen in den Bereich von ungefähr 0–80°C. Suitable temperatures for the preparation of polymeric shells of the invention fall within the range of about 0-80 ° C.
  • [0047] [0047]
    Der oben beschriebene Ultraschallbeschallungsprozess kann beeinflusst werden, um mit polymeren Hüllen überzogene Partikel herzustellen, die eine biologische Substanz enthalten und einen Bereich an Größen haben. The ultrasonic irradiation process described above can be manipulated to produce polymeric shells coated with particles containing a biological substance and have a range of sizes. Derzeit bevorzugte Partikelradien fallen in den Bereich von ungefähr 0,1 bis zu ungefähr 5 μm. Presently preferred particle radii fall in the range of about 0.1 up to about 5 microns. Eine enge Größenverteilung in diesem Bereich ist besonders geeignet zur intravenösen Verabreichung der biologischen Substanz. A narrow size distribution in this range is particularly suitable for intravenous administration of the biological substance. Die mit der polymeren Hülle überzogenen Partikel werden dann vorzugsweise in biokompatiblem Medium suspendiert (wie hier beschrieben), bevor sie mit geeigneten Mitteln verabreicht werden. The coated with the polymeric shell particles are then preferably suspended in biocompatible medium (as described herein) before they are administered by appropriate means.
  • [0048] [0048]
    Zusätzlich kann die polymere Hülle wahlweise durch ein geeignetes Mittel modifiziert werden, wobei das Mittel durch eine optionale kovalente Bindung mit der polymeren Hülle verbunden ist. In addition, the polymeric shell can optionally be modified by a suitable agent, wherein the agent is connected through an optional covalent bond with the polymeric shell. Für solche Verbindungen in Betracht kommende kovalente Bindungen schließen Ester, Ether, Urethan, Diester, Amid, sekundäres oder tertiäres Amin, Phosphatester, Sulfatester und ähnliche Bindungen ein. For those compounds coming covalent bonds include ester, ether, urethane, diester, amide, secondary or tertiary amine, phosphate ester, sulfate ester, and the like bonds. Geeignete Mittel, die für diese optionale Modifikation der polymeren Hülle ins Auge gefasst werden, schließen synthetische Polymere (Polyalkylenglykole (z. B. lineares oder verzweigtes Polyethylenglykol), Polyvinylalkohol, Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyacrylsäure, Polyethyloxazolin, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidinon und dergleichen), Phospholipide (wie Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylinositol (P1), Sphingomyelin und dergleichen), Proteine (wie Enzyme, Antikörper und dergleichen), Polysaccharide (wie Stärke, Cellulose, Dextrane, Alginate, Chitosan, Pektin, Hyaluronsäure und dergleichen), chemische Modifikationsmittel (wie Pyridoxal-5'-phosphat, Derivate von Pyridoxal, Dialdehyde, Diaspirinester und dergleichen) oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon ein. Suitable means, which will be taken for this optional modification of the polymeric shell in the eye, include synthetic polymers (polyalkylene glycols (eg. B. linear or branched polyethylene glycol), polyvinyl alcohol, polyhydroxyethyl methacrylate, polyacrylic acid, polyethyloxazoline, polyacrylamide, polyvinyl pyrrolidinone, and the like), phospholipids (such as phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylinositol (P1), sphingomyelin and the like), proteins (such as enzymes, antibodies and the like), polysaccharides (such as starch, cellulose, dextrans, alginates, chitosan, pectin, hyaluronic acid and the like), chemical modification agents (such as pyridoxal-5'-phosphate, derivatives of pyridoxal, dialdehydes, Diaspirinester and the like), or combinations of any two or more thereof.
  • [0049] [0049]
    Variationen des Hauptthemas von gelöster biologischer Substanz, die in einer polymeren Hülle eingeschlossen ist, sind möglich. Variations of the main theme of dissolved organic substance, which is enclosed in a polymeric shell are possible. Eine Suspension von feinen Partikeln biologischer Substanz in einem biokompatiblen Dispergierungsmittel könnte verwendet werden (anstelle eines biokompatiblen Dispergierungsmittels, das die gelöste biologische Substanz enthält), um eine polymere Hülle herzustellen, die in einem Dispergierungsmittel suspendierte Partikel der biologischen Substanz enthält. A suspension of fine particles of biological substance in a biocompatible dispersing agent could be used (in place of a biocompatible dispersing agent containing dissolved biologic) to produce a polymeric shell containing dispersing agent-suspended particles of a biological substance. Mit anderen Worten, die polymere Hülle könnte eine gesättigte Lösung einer biologischen Substanz in einem Dispergierungsmittel enthalten. In other words, the polymeric shell could be a saturated solution of a biological substance contained in a dispersing agent. Eine andere Variante ist eine polymere Hülle, die einen festen Kern einer biologischen Substanz enthält, der hergestellt wird durch anfängliches Lösen der biologischen Substanz in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel (z. B. Benzol), Bilden der polymeren Hülle und Verdampfen des flüchtigen Lösungsmittels unter Vakuum, z. B. in einem Rotationsverdampfer, oder Gefriertrocknen der gesamten Suspension. Another variation is a polymeric shell containing a solid core of a biological substance that is produced by initially dissolving the biologic in a volatile organic solvent (eg. Benzene), forming the polymeric shell and evaporating the volatile solvent under vacuum , z. B. on a rotary evaporator, or freeze-drying the entire suspension. Dies mündet in eine Struktur, die einen festen Kern der biologischen Substanz hat, die umgeben wird von einem Polymermantel. This leads to a structure which has a solid core of biologic surrounded by a polymer coat. Dieses letztere Verfahren ist besonders vorteilhaft, um hohe Dosen einer biologischen Substanz in einem verhältnismäßig kleinen Volumen zuzuführen. This latter method is particularly advantageous for delivering high doses of biologic in a relatively small volume. In einigen Fällen könnte das biokompatible Material, das die Hülle um den Kern bildet, selbst ein Therapeutikum oder Diagnosemittel sein, z. B. im Falle von Insulin, das als Teil einer polymeren Hülle verabreicht werden kann, die im oben beschriebenen Ultraschallbeschallungsvorgang gebildet wurde. In some cases could the biocompatible material forming the shell about the core, have a therapeutic or diagnostic agent itself, for. Example, in the case of insulin, which can be administered as part of a polymeric shell that has been formed in the above-described ultrasonic irradiation process. In anderen Fällen könnte das die Hülle bildende Polymer an der Verabreichung einer biologischen Substanz teilhaben, z. B. im Falle von Hämoglobin, das als Teil einer polymeren Hülle zugeführt werden kann, die im oben beschriebenen Ultraschallbeschallungsvorgang gebildet wurde, wodurch ein Blutersatz zur Verfügung gestellt wird, der eine hohe Sauerstoffbindungskapazität hat. In other cases, it could participate in the sheath-forming polymer to the administration of a biological substance, for. Example, in the case of hemoglobin, which may be supplied as part of a polymeric shell that has been formed in the above-described ultrasonic irradiation process, thereby providing a blood substitute provided is who has a high oxygen binding capacity.
  • [0050] [0050]
    Variationen der polymeren Hülle sind ebenfalls möglich. Variations of the polymeric shell are also possible. Zum Beispiel könnte eine kleine Menge von PEG, das Sulfhydrylgruppen enthält, in dem Polymer eingeschlossen werden. For example, a small amount of PEG containing sulfhydryl groups be included in the polymer. Das PEG wird, wenn es der Ultraschallbeschallung ausgesetzt wird, in dem Polymer vernetzt und bildet einen Bestandteil der polymeren Hülle. The PEG will, when subjected to the ultrasonic irradiation, crosslinked in the polymer and forms a component of the polymeric shell. Wahlweise kann das PEG nach der Bereitung der Hülle an die polymere Hülle gekoppelt werden (anstatt als Teil in das Medium integriert zu werden, aus dem die Hülle hergestellt wird). Optionally, the PEG after the preparation of the shell are linked to the polymeric shell (rather than being integrated as part of in the medium is produced from the envelope).
  • [0051] [0051]
    PEG ist bekannt für sein nichtadhäsives Wesen und wurde an Proteine und Enzyme angeheftet, um deren Zirkulationszeit in vivo zu erhöhen [Abuchowski et al., J. Biol. Chem. Bd. 252: 3578 (1977)]. PEG is known for its nichtadhäsives nature and was attached to proteins and enzymes in vivo to increase their circulation time [Abuchowski et al, J. Biol Chem Vol 252:.... 3578 (1977)]. PEG wurde ebenfalls an Phospholipide angeheftet, welche die Lipiddoppelschicht in Liposomen bilden, um ihre Aufnahme zu vermindern und die Lebensdauer in vivo zu verlängern [Klibanov et al., FEBS Letters Bd. 268: 235 (1990)]. PEG has also been attached to phospholipids forming the lipid bilayer in liposomes to reduce their uptake and prolong the service life in vivo [Klibanov et al, FEBS Letters vol 268:.. 235 (1990)]. Somit verändert der Einbau des PEG in die Wände von vernetzten Proteinhüllen deren Zirkulationszeit im Blut. Thus the incorporation of PEG into the walls of crosslinked protein shells whose circulation time changes in the blood. Diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, um höhere Spiegel der biologischen Substanz im Blut und längere Freisetzungszeiten für die biologische Substanz zu erreichen. This property can be exploited to achieve higher levels of the biological substance in the blood and prolonged release times for the biologic.
  • [0052] [0052]
    Nützlich für die Modifikation der polymeren Hülle sind elektrophile PEG-Derivate, einschließlich PEG-Imidazole, Succinimidylsuccinate, Nitrophenylcarbonate, Tresylate und dergleichen; Useful for the modification of the polymeric shell are electrophilic PEG derivatives including PEG-imidazoles, Succinimidylsuccinate, nitrophenylcarbonates, tresylates, and the like; nukleophile PEG-Derivate, einschließlich PEG-Amine, Aminosäureester, Hydrazide, Thiole und dergleichen. nucleophilic PEG derivatives including PEG-amines, amino acid esters, hydrazides, thiols, and the like. Es wird erwartet, dass die PEG-modifizierte polymere Hülle längere Zeit im Kreislauf erhalten bleibt als ihre nicht modifizierten Gegenstücke. It is expected that the PEG-modified polymeric shell obtain longer life in circulation remains as their unmodified counterparts. Die Modifikation der polymeren Hülle mit PEG kann vor der Bildung der Hülle vorgenommen werden oder nach deren Bildung. The modification of polymeric shell with PEG may be performed before formation of the shell or after its formation. Die derzeit bevorzugte Technik ist, die polymere Hülle nach deren Bildung zu modifizieren. The currently preferred technique is to modify the polymeric shell after formation thereof. Andere Polymere, einschließlich Dextran, Alginate, Hydroxyethyl-Stärke und dergleichen, können bei der Modifikation der polymeren Hülle verwendet werden. Other polymers including dextran, alginates, hydroxyethyl starch and the like, can be used in the modification of the polymeric shell.
  • [0053] [0053]
    Weiterhin sind etliche Variationen möglich. Furthermore, several variations are possible. Zum Beispiel kann das Dispergierungsmittel innerhalb der polymeren Hülle variiert werden, eine große Vielfalt von biologischen Substanzen kann verwendet werden, und ein weiterer Bereich an Proteinen, wie auch andere natürliche und synthetische Polymere, kann bei der Bildung der Wände der polymeren Hülle verwendet werden. For example, the dispersing agent can be varied within the polymeric shell, a wide variety of biological substances may be used and another portion of proteins, as well as other natural and synthetic polymers may be used in forming the walls of the polymeric shell. Anwendungen können auch ziemlich breit variieren. Applications can also vary quite widely.
  • [0054] [0054]
    Entsprechend einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung werden polymere Hüllen, zubereitet wie oben beschrieben, für die In-vivo-Verabreichung von biologischen Substanzen verwendet. According to one embodiment of the present invention, polymeric shells prepared as described above, used for the in vivo administration of biological substances. Beispiele von pharmakologisch wirksamen Mitteln, für die praktische Verwendung der vorliegenden Erfindung vorgesehen, sind ua analgetische Mittel (z. B. Acetominophen, Aspirin, Ibuprofen, Morphin und deren Derivate und dergleichen), Antiasthmatika (z. B. Azelastin, Ketotifen, Traxanox und dergleichen), Antibiotika (z. B. Neomycin, Streptomycin, Chloramphenicol, Cephalosporin, Ampicillin, Penicillin, Tetracyclin und dergleichen), Antidepressiva (z. B. Nefopam, Oxypertin, Imipramin, Trazadon und dergleichen), Antidiabetika (z. B. Biguanidine, Hormone, Sulfonylurea-Derivate und dergleichen), Antimykotika (z. B. Amphotericin B, Nystatin, Candicidin und dergleichen), Blutdruck senkende Mittel (z. B. Propanolol, Propafenon, Oxyprenolol, Nifedipin, Reserpin und dergleichen), steroidale entzündungshemmende Mittel (z. B. Cortison, Hydrocortison, Dexamethason, Prednisolon, Prednison, Fluazacort und dergleichen), nichtsteroidale entzündungshemmende Mittel (z. B. Indomethacin, Ibuprofen, Ramifenizon, Piroxicam und dergleichen), antineoplastische Mittel (z. Examples of pharmacologically active agents, provided for the practical use of the present invention include analgesic agents (eg. As acetominophen, aspirin, ibuprofen, morphine and derivatives thereof, and the like), anti-asthmatics (such. As azelastine, ketotifen, Traxanox and the like), antibiotics (eg., neomycin, streptomycin, chloramphenicol, cephalosporin, ampicillin, penicillin, tetracycline and the like), antidepressants (eg. as nefopam, oxypertine, imipramine, trazadone and the like), antidiabetics (e.g., biguanides B. , hormones, sulfonylurea derivatives, and the like), antifungal agents (eg. as amphotericin B, nystatin, candicidin, and the like), blood pressure-lowering agents (eg. as propanolol, propafenone, oxyprenolol, nifedipine, reserpine and the like), steroidal anti-inflammatory agents (z. B. cortisone, hydrocortisone, dexamethasone, prednisolone, prednisone, fluazacort, and the like), non-steroidal anti-inflammatory agents (eg. as indomethacin, ibuprofen, Ramifenizon, piroxicam and the like), antineoplastic agents (eg. B. Adriamycin, Cyclophosphamid, Actinomycin, Bleomycin, Duanorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Mitomycin, Methotrexat, Fluorouracil, Carboplatin, Carmustin (BCNU), Cisplatin, Etoposid, Interferone, Phenesterin, Paclitaxel (wie hier angewandt, soll der Begriff "Paclitaxel" Paclitaxel-Analoga und Wirkstoffpräkursoren, Taxane und andere Paclitaxel-ähnliche Arzneimittel einschließen, z. B. Taxoter und dergleichen), Camptothecin und dessen Derivate (deren Bestandteile vielversprechend in der Behandlung von Dickdarmkrebs sind), Vinblastin, Vincristin, wie auch hormonelle antineoplastische Mittel wie Östrogene, Progestogene, Tamoxifen und dergleichen), anxiolytische Mittel (z. B. Dantrolen, Diazepam und dergleichen), enzymatisch wirksame Mittel (z. B. DNase, Ribozyme und dergleichen), Nukleinsäure-Konstrukte (z. B. die codierende Sequenz von IGF-1, die codierende Sequenz von Faktor VIII, die codierende Sequenz von Faktor IX, Antisense-Nukleotidsequenzen und dergleichen), immunstimulierende Mittel (dh Interleukine, Interferone, Vakzine und dergleichen), immunsuppressive Mittel (z. As adriamycin, cyclophosphamide, actinomycin, bleomycin, Duanorubicin, doxorubicin, epirubicin, mitomycin, methotrexate, fluorouracil, carboplatin, carmustine (BCNU), cisplatin, etoposide, interferons, phenesterine, paclitaxel (as used herein, the term "paclitaxel" Paclitaxel which include analogs and prodrugs taxanes paclitaxel and other similar medicines such. as taxotere and the like), camptothecin and its derivatives (whose components are promising in the treatment of colon cancer), vinblastine, vincristine, as well as hormonal antineoplastic agents such as estrogens , progestogens, tamoxifen, and the like), anxiolytic agents (eg. as dantrolene, diazepam and the like), enzymatically active agents (eg. B. DNase, ribozymes and the like), nucleic acid constructs (eg. as the coding sequence of IGF -1, the coding sequence of factor VIII, the coding sequence of Factor IX, antisense nucleotide sequences, and the like), immunostimulating agents (ie, interleukins, interferons, vaccines, and the like), immunosuppressive agents (eg. B. Cyclosporin (CsA), Azathioprin, Mizorobin, FK506, Prednison und dergleichen), wie auch andere pharmakologisch aktive Mittel, wie Cimetidin, Mitotan, Visadin, Halonitrosoharnstoffe, Anthracycline, Ellipticin, Benzocain, Barbiturate und dergleichen. , Cyclosporine (CsA), azathioprine, Mizorobin, FK506, prednisone and the like), as well as other pharmacologically active agents such as cimetidine, mitotane, Visadin, Halonitrosoharnstoffe, anthracyclines, ellipticine, benzocaine, barbiturates, and the like.
  • [0055] [0055]
    Schlüsselunterschiede zwischen der biologische Substanzen enthaltenden polymeren Hülle der Erfindung und Protein-Mikrokugeln des Standes der Technik liegen in der Art der Bildung und dem Endzustand des Proteins nach der Bildung der polymeren Hülle und in seiner Fähigkeit, kaum wasserlösliche oder im Wesentlichen wasserunlösliche Mittel zu tragen. Key differences between the biological substances containing polymeric shell of the invention and protein microspheres of the prior art are the kind of education and the final state of the protein after the formation of the polymeric shell and its ability to carry hardly water-soluble or substantially water-insoluble agents. Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist das Polymer (z. B. ein Protein) selektiv chemisch vernetzt durch die Bildung von Disulfidbindungen, z. B. durch die Aminosäure Cystein, die in der natürlichen Struktur einer Anzahl von Proteinen vorkommt. According to the present invention, the polymer (eg., A protein) is selectively chemically crosslinked through the formation of disulfide bonds, for. Example, by the amino acid cysteine that occurs in the natural structure of a number of proteins. Ein Ultraschallbeschallungsvorgang wird angewandt, um ein Dispergierungsmittel, das eine gelöste oder suspendierte biologische Substanz enthält, in einer wässrigen Lösung eines biokompatiblen Materials, das Sulfhydryl- oder Disulfidgruppen (z. B. Albumin) trägt, zu dispergieren, wobei eine Hülle aus vernetztem Polymer um winzige Tröpfchen eines nichtwässrigen Mediums herum gebildet wird. An ultrasonic irradiation process is used in order, transmits a dispersing agent that contains a dissolved or suspended biologic into an aqueous solution of a biocompatible material, the sulfhydryl or disulfide groups (eg. As albumin) to be dispersed, whereby a shell of crosslinked polymer is tiny droplets of a non-aqueous medium is formed around. Der Ultraschallbeschallungsvorgang ruft eine Kavitation in der Flüssigkeit hervor, die eine enorme lokale Erhitzung verursacht, und mündet in der Bildung von Peroxid-Ionen, die das Polymer durch Oxidation der Sulfhydryl-Reste vernetzen (und/oder durch Unterbrechen von bestehenden Disulfidbindungen), um neue vernetzte Disulfidbindungen zu bilden. The ultrasonic irradiation process produces a cavitation in the liquid out, which causes a tremendous local heating, and flows into the formation of peroxide ions that crosslink the polymer by oxidizing the sulfhydryl residues (and / or existing by breaking of disulfide bonds), new crosslinked to form disulfide bonds.
  • [0056] [0056]
    Im Gegensatz zum Verfahren der Erfindung ist das Verfahren der Glutaraldehyd-Vernetzung im Stand der Technik nicht spezifisch und eigentlich wirksam mit jeder beliebigen nukleophilen Gruppe, die in der Proteinstruktur vorhanden ist (z. B. Amine, Sulfhydryle und Hydroxyle). In contrast to the method of the invention, the process of glutaraldehyde-cross-linking in the prior art is not specific and actually effective with any nucleophilic group present in the protein structure (eg. Amines, sulfhydryls and hydroxyls). Hitze-Denaturierung, wie durch den Stand der Technik gelehrt, verändert die Proteinstruktur signifikant und irreversibel. Heat denaturation as taught by the prior art, the protein structure changed significantly and irreversibly. Im Gegensatz dazu ist die Disulfid-Bildung, die mit der vorliegenden Erfindung erwogen wird, sehr spezifisch und verändert das Protein nicht wesentlich. In contrast, disulfide formation, which is contemplated by the present invention, very specific and the protein is not significantly changed. Ferner unterscheiden sich Partikel und Tröpfchen einer biologischen Substanz, die innerhalb einer polymeren Hülle enthalten sind, von vernetzten oder durch Hitze denaturierten Protein-Mikrokugeln des Standes der Technik, weil die mit dem Verfahren der Erfindung erzeugte polymere Hülle verhältnismäßig dünn ist im Vergleich zu dem Durchmesser des überzogenen Partikels. Furthermore, particles and droplets of a biological substance that are contained within a polymeric shell differ from crosslinked or heat denatured protein microspheres of the prior art because the polymeric shell produced by the process of the invention is relatively thin compared to the diameter of the coated particle. Es wurde festgestellt (durch Transmissions-Elektronenmikroskopie), dass die "Hüllendicke" des Polymerüberzuges für ein überzogenes Partikel mit einem Durchmesser von 1 μm (1000 Nanometer) ungefähr 25 nm beträgt. It has been determined (by transmission electron microscopy) that the "shell thickness" of the polymeric coating for a coated particle having a diameter of 1 micron (1000 nanometers) is about 25 nm. Im Gegensatz dazu haben Mikrokugeln des Standes der Technik keine Proteinhüllen, sondern haben eher Protein, das durch das Volumen der Mikrokugel dispergiert ist. In contrast, microspheres of the prior art do not have protein shells, but rather have protein dispersed throughout the volume of the microsphere.
  • [0057] [0057]
    Die polymere Hülle, die feste oder flüssige Kerne von biologischer Substanz enthält, erlaubt die Verabreichung hoher Dosen der biologischen Substanz in verhältnismäßig geringen Volumina. The polymeric shell containing solid or liquid cores of biological substance allows the administration of high doses of biologic in relatively small volumes. Dies minimiert die Belastung des Patienten beim Erhalten großer Mengen von Flüssigkeit und minimiert den Krankenhausaufenthalt. This minimizes the exposure of the patient in obtaining large amounts of fluid and minimizes hospital stay. Zusätzlich sind die Wände der polymeren Hülle im Allgemeinen in vivo durch proteolytische Enzyme vollständig abbaubar (z. B. wenn das Polymer ein Protein ist), was in dem Fehlen von Nebenwirkungen seitens des Zufuhrsystems resultiert, wie es bei derzeitigen Formulierungen häufig der Fall ist. In addition, the walls of the polymeric shell are generally in vivo by proteolytic enzymes completely degradable (eg. As when the polymer is a protein), which is part of the delivery system results in the absence of side effects, as is often the case with current formulations.
  • [0058] [0058]
    Entsprechend diesem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sind Tröpfchen oder Partikel einer biologischen Substanz innerhalb einer Hülle mit einem Querschnittsdurchmesser von nicht mehr als ungefähr 10 μm enthalten. According to this embodiment of the present invention, droplets or particles of biologic contained within a shell having a cross-sectional diameter of not more than about 10 microns. Ein Querschnittsdurchmesser von weniger als 5 μm ist bevorzugter, während ein Querschnittsdurchmesser von ungefähr 2 μm derzeit der bevorzugteste für den intravenösen Applikationsweg ist. A cross-sectional diameter of less than 5 microns is more preferred, while a cross-sectional diameter of about 2 microns is currently the most preferred for the intravenous route of administration is.
  • [0059] [0059]
    Entsprechend einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, dass polymere Hüllen, wie hier beschrieben, wenn sie aus Hämoglobin hergestellt sind, eine überraschend hohe Sauerstoffbindungsfähigkeit haben und daher als Blutersatz nützlich sind. According to another embodiment of the present invention it has been discovered that polymeric shells as described herein, when they are prepared from hemoglobin, have surprisingly high oxygen-binding capability, and therefore are useful as blood substitutes. Hämoglobin (Lehninger, in Biochemistry, Worth Publishers, Inc., New York, S. 145–149, 1975) ist ein Protein mit einem MW von 64.500, das aus einem Tetramer besteht (zwei α- und zwei β-Ketten). Hemoglobin (Lehninger, in Biochemistry, Worth Publishers, Inc., New York, pp 145-149, 1975) is a protein with a MW of 64,500, consisting of a tetramer (two α- and two β-chains). Jede α- und β-Kette bindet einen Häm-Rest in einer nicht kovalenten Bindung. Each α- and β-chain binds a heme residue in a non-covalent bond. Die α- und β-Ketten werden auch von nichtkovalenten Bindungen zusammengehalten, die aus Wasserstoff-Bindungen und van-der-Waals-Kräften resultieren. The α- and β-chains are held together by noncovalent bonds resulting from hydrogen bonds and van der Waals forces. Die vier Häm-Gruppen, eine in jeder Untereinheit, sind fähig, vier Sauerstoff-Moleküle zu binden. The four heme groups, one in each subunit, are capable of binding four molecules of oxygen. Diese flachen Häm-Gruppen enthalten ein Eisenatom, das sich in einer rechtwinklig planaren Koordination befindet. These flat heme groups contain an iron atom that is in a perpendicular planar coordination. Die vier Häme sind im intakten Molekül verhältnismäßig weit voneinander entfernt. The four Häme are relatively far away in the intact molecule from one another.
  • [0060] [0060]
    Die Wechselwirkung oder Kooperation von Häm-Einheiten beim Binden von Sauerstoff erhöht die Sauerstoffbindungskapazität jeder Häm-Einheit innerhalb des tetrameren Hämoglobin-Moleküls erheblich. The interaction or cooperation of heme units in binding of oxygen increases the oxygen binding capacity of each heme unit within the tetrameric hemoglobin significantly molecule. Im Allgemeinen würde erwartet werden, dass eine einzelne isolierte Häm-Einheit nur ein einziges Sauerstoff-Molekül bindet. In general, it would be expected that a single isolated heme binds only a single oxygen molecule. Jedoch kooperieren benachbarte Häm-Einheiten innerhalb des Hämoglobin-Moleküls, um den gebundenen Sauerstoff je Häm-Einheit zu erhöhen. However, neighboring heme units within the hemoglobin molecule cooperate to increase the bound oxygen per heme unit. Diese Kooperationsfähigkeit wird in Form eines "Hill-Koeffizienten" beschrieben, dessen Wert die Anzahl interagierender Sauerstoffbindungsstellen widerspiegelt. This ability to cooperate will be described in the form of a "Hill coefficients" whose value reflects the number of interacting oxygen binding sites. Im Falle von natürlichem Hämoglobin beträgt der Hill-Koeffizient ungefähr 2,8. In the case of natural hemoglobin of the Hill coefficient is approximately 2.8.
  • [0061] [0061]
    Lösliches Hämoglobin macht ungefähr 90% des gesamten Proteins in roten Blutzellen aus. Soluble hemoglobin constitutes about 90% of the total protein in red blood cells from. 100 ml Vollblut sind aufgrund der Bindungsfähigkeit von Hämoglobin fähig, annähernd 21 ml gasförmigen Sauerstoff zu absorbieren. 100 ml of whole blood is capable of absorbing approximately 21 ml of gaseous oxygen due to the binding ability of hemoglobin. Ähnlich wichtig für die Bindung von Sauerstoff ist die Tatsache, dass Hämoglobin bei der Freigabe des gebundenen Sauerstoffs an Gewebe ebenso wirkungsvoll ist. Equally important for the binding of oxygen is the fact that hemoglobin at the release of the bound oxygen is also effective to tissue. Die Fähigkeit von Hämoglobin, Sauerstoff zu binden und abzugeben, wird oft quantitativ als P 50 (oder P 1/2 ) ausgedrückt. The ability of hemoglobin to bind oxygen and deliver is often expressed quantitatively as 50 P (or P 1/2). Zum Beispiel ist der P 50 -Wert für Vollblut, dh der Partialdruck des Sauerstoffs, der in einer Hämoglobinsättigung von fünfzig Prozent mündet, ungefähr 28 mm Hg. For example, the P 50 value for whole blood, that is, the partial pressure of oxygen, which flows in a hemoglobin saturation of fifty percent, about 28 mm Hg.
  • [0062] [0062]
    Das Verhältnis zwischen Sauerstoffpartialdruck und prozentualer Sättigung von Hämoglobin kann als eine S-Kurve dargestellt werden, deren Lage durch den pH-Wert beeinflusst wird (der Bohr-Effekt). The relationship between partial pressure of oxygen and percent saturation of hemoglobin may be represented as an S-curve, the position of which is affected by pH (the Bohr effect). Je höher der pH-Wert der Hämoglobin-Lösung bei einem gegebenen Sauerstoffpartialdruck ist, umso höher ist die prozentuale Sättigung mit Sauerstoff und umso niedriger der P 50 ; The higher the pH of the hemoglobin solution at a given partial pressure of oxygen, the greater the percent saturation with oxygen, and the lower the P 50; die Sauerstoff-Sättigungskurve wird zur linken Seite auf der Abszisse verschoben. the oxygen saturation curve is shifted to the left on the abscissa. Umgekehrt, je niedriger der pH-Wert der Hämoglobin-Lösung ist, umso niedriger ist die prozentuale Sättigung mit Sauerstoff und umso höher ist der P 50 ; Conversely, the lower the pH of the hemoglobin solution, the lower the percent saturation with oxygen, and the higher the P 50; die Sauerstoff-Sättigungskurve wird zur rechten Seite auf der Abszisse verschoben. the oxygen saturation curve is shifted to the right on the abscissa. Wenn sich Hämoglobin vom verhältnismäßig alkalischen pH-Wert der Lungen zum relativ sauren pH-Wert sauerstoffarmer Gewebe bewegt (wobei durch anaerobe Atmung Milchsäure erzeugt wird), werden die Hämoglobin-Moleküle demzufolge eine Neigung haben, ihre Sauerstoff-Ladung abzugeben. (Which is produced by anaerobic respiration lactic acid) when hemoglobin moves from the relatively alkaline pH of the lungs to the relatively acidic pH of oxygen-poor tissues, the hemoglobin molecules will therefore have a tendency to cast their oxygen charge. Somit ändert sich im Allgemeinen die Affinität des Hämoglobins zu Sauerstoff in der entgegensetzten Richtung wie der P 50 des Hämoglobins. Thus, the affinity of hemoglobin for oxygen changes generally in the opposite direction as the P 50 of hemoglobin.
  • [0063] [0063]
    Modifikationen des Hämoglobin-Moleküls oder seiner Konformation können mit Änderungen der Sauerstoffbindungsaffinität verbunden sein. Modifications of the hemoglobin molecule or its conformation may be associated with changes in oxygen binding affinity. Zum Beispiel lockert die Assoziation mit 2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG, wie es innerhalb des RBC vorkommt) die Assoziation zwischen Sauerstoff und Hämoglobin, was die Abgabe von Sauerstoff an Gewebe erleichtert; For example loosens the association with 2,3-diphosphoglycerate (2,3-DPG, as occurs within the RBC), the association between oxygen and hemoglobin, facilitating release of oxygen to tissues; Serumspiegel von 2,3-DPG steigen unter physiologischen Bedingungen, in denen eine erhöhte Zufuhr von Sauerstoff wünschenswert ist, zum Beispiel in großen Höhen und während der Schwangerschaft. Serum levels of 2,3-DPG rise under physiological conditions in which an increased supply of oxygen is desirable, for example, at high altitudes and during pregnancy. Die Oxidation des Eisen-Ions in der prosthetischen Gruppe des Häm von Fe(II) zu Fe(III) resultiert in der Bildung von Methämoglobin (met-Hb), das Wasser so fest bindet, dass es die Sauerstoffübertragung ausschließt. The oxidation of the iron ion in the heme prosthetic group from Fe (II) to Fe (III) results in the formation of methemoglobin (met-Hb), the water so tightly bound that it excludes the oxygen transfer. Diese Oxidation oder 'Autooxidation' ist ein fortwährender Vorgang in vivo, welcher mittels eines Systems aus Redoxenzymen innerhalb der roten Blutzelle in Schach gehalten wird. This oxidation or 'auto-oxidation' is an ongoing process in vivo which is maintained by a system of redox enzymes within the red blood cell in check.
  • [0064] [0064]
    Hämoglobin, das Protein für Sauerstoff-Transport und -Zufuhr, kann von den Membranen der Wand roter Blutzellen oder dem Stroms (das Stroms enthält die spezifischen Antigene, die die Blutgruppe festlegen) sowie von anderen Zell- und Plasmakomponenten getrennt werden. Hemoglobin, the protein for oxygen transport and feed method can, of the wall membranes of the red blood cells or the stream (the stream containing the specific antigens that determine blood type) and be separated from other cell and plasma components. Falls eine solche Trennung und Isolation durchgeführt wird, enthält das resultierende stromafreie Hämoglobin keine Antigen-Materialien; If such separation and isolation is performed, the resulting stroma-free hemoglobin contains no antigenic materials; somit sind Blutgruppenbestimmung und -anpassung nicht mehr notwendig. thus are blood group determination and adjustment no longer necessary.
  • [0065] [0065]
    Von stromafreiem Hämoglobin (SFH), das aus der Mikroumgebung der roten Blutzellen gewonnen wurde, wurde gefunden, dass es eine Neigung hat, Sauerstoff zu fest (ein niedriger P 50 ) zu binden und auch, dass es eine kurze Zirkulationshalbwertszeit nach der Transfusion hat. Of stroma-free hemoglobin (SFH), which was obtained from the micro-environment of the red blood cells, it was found that it has a propensity to bind oxygen too tightly (a low P 50) and also that it has a short circulating half-life after transfusion. Der niedrige P 50 , der die Linksverschiebung in der Hämoglobin-Sauerstoff-Bindungskurve widerspiegelt, war teilweise eine Folge des Aussetzens von stromafreiem Hämoglobin an einen höheren pH-Wert im Plasma (7,4) als jener, der im Erythrozyt erfahrungsgemäß vorhanden ist (7,2); The low P 50, which reflects the leftward shift in the hemoglobin-oxygen binding curve was partly a consequence of exposure of stroma-free hemoglobin to a higher pH in plasma (7.4) than that which experience has shown that present in the erythrocyte (7 , 2); ferner wurde die natürliche Assoziation zwischen Hämoglobin und 2,3-Diphosphoglycerat zerstört, als Hämoglobin aus der roten Zelle entfernt wurde, was eine weitere Reduzierung des P 50 zur Folge hatte. Further, the natural association between hemoglobin and 2,3-diphosphoglycerate was destroyed when hemoglobin was removed from the red cell, resulting in a further reduction in the P 50 meant. Hinsichtlich der Clearance aus der Zirkulation wird beobachtet, dass stromafreies Hämoglobin durch die Nieren schnell ausgeschieden wird, mit einer Tranfusionshalbwertszeit von (t 1/2 ) von lediglich ungefähr 100 Minuten. With regard to the clearance from the circulation is observed that stroma-free hemoglobin is rapidly excreted by the kidneys, with a Tranfusionshalbwertszeit of (t 1/2) of only about 100 minutes. Der Hill-Koeffizient für SFH liegt im Bereich von 2,3–2,8. The Hill coefficient for SFH is in the range of 2.3-2.8.
  • [0066] [0066]
    Chemisch veränderte Hämoglobine, die einige der Mängel von stromafreiem Hämoglobin angehen, wurden erforscht. Chemically modified hemoglobins that address some of the shortcomings of stroma-free hemoglobin were investigated. Im Stand der Technik beschriebene Modifikationen umfassen verschiedene Mittel zur intramolekularen Vernetzung von stromafreiem Hämoglobin; Modifications described in the prior art include various means for intramolecular crosslinking of stroma-free hemoglobin; Mittel zur intermolekularen Vernetzung von stromafreiem Hämoglobin mit Mitteln niedrigen Molekulargewichts; Means for intermolecular crosslinking of stroma-free hemoglobin with low molecular weight agents; Mittel zur intra- und intermolekularen Vernetzung von stromafreiem Hämoglobin mit Mitteln niedrigen Molekulargewichts; Means of intra- and intermolecular crosslinking of stroma-free hemoglobin with low molecular weight agents; und Mittel zur Kopplung stromafreien Hämoglobins an andere Polymere. and means for coupling stroma-free hemoglobin to other polymers.
  • [0067] [0067]
    Verfahren zur intramolekularen Vernetzung von stromafreiem Hämoglobin sind im Stand der Technik bekannt; A process for intramolecular crosslinking of stroma-free hemoglobin are known in the art; siehe zum Beispiel see for example US-Patente 4,584,130 U.S. Patents 4,584,130 , . 4,598,064 4,598,064 und and 4,600,531 4,600,531 . , Diese Behandlung modifiziert stromafreies Hämoglobin durch kovalentes Verbinden der Lysin-99-Reste auf den Alpha-Ketten des Proteins über eine Fumarat-Brücke. This treatment modifies stroma-free hemoglobin by covalently linking the lysine-99 residues on the alpha chains of the protein through a fumarate bridge. Als eine Folge dieser intramolekularen Vernetzung hat mit Diaspirin vernetztes Hämoglobin eine Sauerstoff-Affinität, die mit jener von Blut äquivalent ist. As a consequence of this intramolecular cross-linking with diaspirin crosslinked hemoglobin has an oxygen affinity that is equivalent to that of blood. Ferner kann mit Diaspirin vernetztes Hämoglobin (Molekulargewicht 64.500) nicht mehr in Dimere zerfallen (Molekulargewicht 32.250). Furthermore, diaspirin crosslinked hemoglobin (molecular weight 64,500) not disintegrate into dimers (molecular weight 32,250). Infolgedessen beträgt die Retentionszeit von mit Diaspirin alpha-alpha-vernetztem Hämoglobin vier bis acht Stunden (was das Zwei- bis Vierfache der von stromafreiem Hämoglobin ist). Consequently, is the retention time of diaspirin alpha-alpha crosslinked hemoglobin four to eight hours (which is two to four times that of stroma-free hemoglobin). Jedoch ist dies keine ausreichend lange Zeit zur Nutzung bei der Behandlung akuter Hämorrhagie, da ein Sauerstoffträger benötigt wird, der Sauerstoff einige Tage lang tragen kann, wenn der Patient eine beträchtliche Menge Blut verloren hat. However, this is not a long enough time for use in the treatment of acute hemorrhage, as an oxygen carrier is needed that can carry oxygen for several days when the patient has lost a significant amount of blood. Der P 50 von mit Diaspirin vernetztem Hämoglobin befindet sich im physiologischen Bereich (24–28 mm Hg), ebenso wie der Hill-Koeffizient (2,5–2,8). The P 50 of diaspirin crosslinked with hemoglobin is in the physiological range (24-28 mm Hg), as is the Hill coefficient (2.5-2.8).
  • [0068] [0068]
    Unter Verwendung von Vernetzungsmitteln mit niedrigen Molekulargewichten wurden Hämoglobin-Moleküle auch intermolekular miteinander vernetzt. By using crosslinking agents having low molecular weights hemoglobin molecules have also been intermolecularly crosslinked to each other. Zum Beispiel ist im For example, in US-Patent Nr. 4,336,248 US Pat. No. 4,336,248 die Kopplung von Hämoglobin-Molekülen aneinander und/oder an Serum-Proteine und Gelatine-Derivate unter Verwendung von Dialdehyden, am besten gefolgt von der Zugabe von Pyridoxalphosphat, beschrieben. the coupling of hemoglobin molecules to each other and / or to serum proteins and gelatin derivatives using dialdehydes, best followed by the addition of pyridoxal phosphate, as described. Die Vernetzung mit einem bifunktionalen oder polyfunktionalen Vernetzungsmittel mit niedrigem Molekulargewicht wurde in den The crosslinking with a bifunctional or polyfunctional crosslinking agent having low molecular weight was in the US-Patenten 4,001,401 U.S. Patents 4,001,401 , . 4,001,200 4,001,200 , . 4,053,590 4,053,590 und and 4,061,736 4,061,736 beschrieben. described. Die Produkte der intermolekularen Hämoglobin-Vernetzung sind oft nicht einzeln lösliche Tetramere, sondern vielfache Tetramere aus kovalent verbundenem Hämoglobin, um lösliche Oligomere zu bilden. The products of intermolecular hemoglobin crosslinking are often not single soluble tetramers, but multiple tetramers of hemoglobin covalently bandaged to form soluble oligomers. Typischerweise haben Produkte solcher intermolekularen Vernetzung sauerstofftragende und -zuführende Eigenschaften, die nicht mit Blut äquivalent sind (ein P 50 von 18–23 für mit Glutaraldehyd polymerisiertem Hämoglobin, im Vergleich zu einem P 50 von 28 für Vollblut und Hill-Koeffizienten im Bereich von 1,8–2,8). Typically, products of such intermolecular crosslinking oxygen-carrying and -zuführende properties that are not equivalent to blood have (a P 50 of 18-23 for glutaraldehyde-polymerized hemoglobin as compared to a P 50 of 28 for whole blood and Hill coefficients in the range of 1 , 8-2.8). Ferner sind Produkte aus intermolekularer Vernetzung durch Glutaraldehyd im Stand der Technik bekannt dafür, dass sie antigen sind [siehe DH Marks et al., in Military Med. 152: 473 (1987)]. Further products of intermolecular cross-linking by glutaraldehyde in the prior art are known to be antigenic [see DH Marks et al, in Military Med 152:.. 473 (1987)].
  • [0069] [0069]
    Im Allgemeinen vermindert die intramolekulare und intermolekulare Vernetzung von Hämoglobin einige der Nierengifitigkeitsprobleme, die sich aus der Dissoziation unmodifizierten Hämoglobins in αβ-Dimere ergeben. In general, the intramolecular and intermolecular crosslinking of hemoglobin reduces some of the Nierengifitigkeitsprobleme arising from the dissociation unmodified hemoglobin into αβ-dimers. Jedoch wird der kolloidale osmotische Druck (COP), der von löslichem Hämoglobin ausgeübt wird, durch intramolekulare Vernetzung nicht signifikant vermindert. However, the colloidal osmotic pressure (COP) exerted by soluble hemoglobin is not significantly reduced by intramolecular crosslinking. Dies begrenzt daher den Dosierungsspiegel von für die Applikation geeignetem löslichem Hämoglobin-Blutersatz. This therefore limits the dosage level of suitable for the application of soluble hemoglobin blood substitute. Im Allgemeinen bewirkt ein Anstieg des COP eine Abnahme des hydrostatischen Drucks und eine begleitende Abnahme der glomerulären Filtrationsrate, was zu Oligurie und, in schwerwiegenden Fällen, zu Anurie führt. In general, an increase in COP results in a decrease in hydrostatic pressure and a concomitant decrease in glomerular filtration rate, leading to oliguria and, in severe cases, to anuria. Die im Stand der Technik beschriebene Applikation von löslichen Hämoglobinen mündete in Bradykardie, einem Ansteigen des Blutdrucks und einem Abfallen der Kreatininclearance. The application of soluble hemoglobins described in the prior art has resulted in bradycardia, a rise in blood pressure and a decrease of creatinine clearance. Vasokonstriktion und Tubulusverstopfung wurden als Grund für die renale Wirkung vermutet, die alle mit der Verwendung von löslichen Hämoglobinen als Blutersatz im Zusammenhang stehen. Vasoconstriction and Tubulusverstopfung were suspected as the cause of the renal effects, all of which are related to the use of soluble hemoglobin as a blood substitute in context. Eine hoch polymerisierte Form von Hämoglobin, wie sie gemäß der Beschreibung hier hergestellt werden kann, kann diese Probleme mildern, wenn sie als Blutersatz verwendet wird. A highly polymerized form of hemoglobin, such as can be prepared as described herein can alleviate these problems when it is used as a blood substitute.
  • [0070] [0070]
    Hoch fluorierte Verbindungen, und insbesondere Perfluorkohlenstoff-Verbindungen, wurden ebenfalls aufgrund ihrer hohen Löslichkeiten für Sauerstoff als Ersatz für rote Blutzellen in Erwägung gezogen. Highly fluorinated compounds, and particularly perfluorocarbon compounds, have also been considered because of their high solubilities for oxygen as a substitute for red blood cells. Unter den hoch fluorierten Verbindungen, die für solche Anwendungen nützlich sind, befinden sich die Perfluorkohlenstoffe, z. B. Perfluordecalin, Perfluorindan, Perfluormethyladamantan, Perfluortripropylamin, Perfluortributylamin, Perfluoroctylbromid und dergleichen. Among the highly fluorinated compounds useful for such applications are the perfluorocarbons, z. B. Perfluorodecalin, perfluoroindane, perfluoromethyladamantane, perfluorotripropylamine perfluorotributylamines perfluorooctylbromide and the like. Zur intravenösen Verwendung müssen diese Fluorkohlenstoffe, da sie wasserunvermischbar sind, als injizierbare Emulsionen dispergiert werden. For intravenous use, these fluorocarbons must, as they are wasserunvermischbar be dispersed as injectable emulsions. Typischerweise in diesen Anwendungen verwendete Emulgatoren sind Eigelb-Lecithin und Ei-Phosphatide, welche beide das Potential haben, allergische Reaktionen herbeizuführen; Emulsifiers typically used in these applications are egg yolk lecithin and egg phosphatides, both of which have the potential to cause allergic reactions; siehe zum Beispiel PCT 92/06517, die eine Emulsion beschreibt, die eine Fluorchemikalie und Phospholipide wie Lysophosphatidylcholin und Lyophosphatidylethanolamin als oberflächenaktive Substanzen enthält, oder PCT 93/11868, die eine Emulsion mit Eigelb-Lecithin als Emulgator beschreibt, der hoch fluorierte, mit Chlor substituierte, azyklische organische Verbindungen als Sauerstoffträger enthält. see for example, PCT 92/06517, which describes an emulsion that contains a fluorochemical and phospholipids, such as lysophosphatidylcholine and Lyophosphatidylethanolamin as surfactants, or PCT 93/11868, which describes an emulsion with egg yolk lecithin as emulsifier, the fluorinated high, with chlorine substituted containing acyclic organic compounds as oxygen carriers.
  • [0071] [0071]
    Fluosol-DA (Alpha-Therapeutika), eine Emulsion aus Perfluordecalin und Perfluortripropylamin, ist das einzige von der US-Bundesbehörde FDA zugelassene Produkt zur Verwendung bei der Prävention von vorübergehender Ischämie bei der Ballon-Koronar-Angioplastie. Fluosol-DA (Alpha Therapeutics), an emulsion of perfluorodecalin and perfluorotripropylamine, is the only one by the US Federal Drug Administration approved product for use in the prevention of transient ischemia in balloon coronary angioplasty. Ein weiteres Fluorkohlenstoff-Produkt, Oxygent (Alliance Pharmaceuticals) oder Perfluoroctylbromid, hat die Zulassung als ein orales Bildgebungsmittel. Another fluorocarbon product, Oxygent (Alliance Pharmaceuticals) or perfluorooctylbromide, was admitted as an oral imaging agent. Zur Übersicht über Perfluorverbindungen als Blutersatzstoffe, siehe Riess et al. For a summary of perfluorinated compounds as blood substitutes, see Riess et al. in Angew. in Angew. Chem. Int. Chem. Int. Ed. Ed. Engl. 17: 621–634 (1978). Engl. 17: 621-634 (1978).
  • [0072] [0072]
    Im Gegensatz dazu sind aus Hämoglobin hergestellte polymere Hüllen, wie hier beschrieben, "riesige" makroskopische Moleküle (aufgrund extensiver Polymerisation oder Vernetzung einer großen Anzahl von Hämoglobin-Tetramer-Molekülen), die aufgrund ihrer großen Größe in wässrigem Medium unlöslich sind. In contrast, polymeric shells prepared from hemoglobin, as described herein, "large" macroscopic molecules (due to extensive polymerization or crosslinking of large numbers of hemoglobin tetramer molecules) which are insoluble because of their large size in an aqueous medium. Die Polymerisation geschieht als Ergebnis der Vernetzung der Sulfhydrylgruppen an den Cysteinresten des Proteins während des Ultraschallbeschallungsvorganges. The polymerization occurs as a result of crosslinking of the sulfhydryl groups of cysteine residues of the protein during the sonication process. Eine polymere Hülle, die entsprechend der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, umfasst typischerweise mindestens 10 4 vernetzte Polymer-Moleküle und kann so viele wie 10 12 Hämoglobintetramere haben, die in einem einzigen makroskopischen Hämoglobin-"Megamer" vernetzt sind. A polymeric shell, prepared according to the present invention typically comprises at least 10 4 crosslinked polymer molecules, and may have as many as 10 12 hemoglobin tetramers crosslinked into a single macroscopic hemoglobin "Megamer". Es wurde unerwarteterweise herausgefunden, dass Sauerstoff reversibel an diese unlöslichen Konstrukte binden kann, mit Affinitäten, die sich in einem nützlichen Bereich für einen Ersatz von roten Blutzellen (RBC) befinden, dh ein P 50 zwischen ungefähr 10 mm Hg bis ungefähr 50 mm Hg. It has been unexpectedly found that oxygen can bind reversibly to these insoluble constructs with affinities in a useful range for a replacement of red blood cells (RBC), ie a P 50 is between about 10 mm Hg to about 50 mm Hg.
  • [0073] [0073]
    Aufgrund ihrer vernetzten Eigenschaft und Größe ist es wahrscheinlich, dass die unlöslichen Hämoglobin-Konstrukte der vorliegenden Erfindung eine In-vivo-Zirkulationszeit haben, die beträchtlich länger ist als Ersatzstoffe für rote Blutzellen (RBC) des Standes der Technik. Due to their crosslinked property and size, it is likely that the insoluble hemoglobin constructs of the present invention have an in vivo circulation time, which is considerably longer as substitutes for red blood cells (RBC) of the prior art. Ferner ist es nicht wahrscheinlich, dass sie wegen ihrer großen molekularen (makroskopischen) Größe die Nierengiftigkeitsprobleme hervorrufen, die mit den konventionellen tetrameren oder oligomeren löslichen Formen von Hämoglobin üblich sind, die im Stand der Technik beschrieben sind. Further, it is not likely that they produce because of their large molecular (macroscopic) size, the renal toxicity problems that are common with conventional tetrameric or oligomeric soluble forms of hemoglobin described in the prior art.
  • [0074] [0074]
    Die verborgene "zelluläre" Natur der unlöslichen Hämoglobin-Konstrukte der vorliegenden Erfindung macht sie geeignet, Sauerstoff auf eine physiologische Weise zu transportieren, nicht unähnlich roten Blutzellen in vivo. The hidden "cellular" nature of insoluble hemoglobin constructs of the present invention makes them suitable to carry oxygen in a physiologic manner, not unlike red blood cells in vivo. Wegen der "megameren" Natur der unlöslichen Hämoglobin-Konstrukte dieser Erfindung werden sie einen kolloidosmotischen Druck oder onkotischen Druck haben, der vernachlässigbar ist, verglichen mit einer äquivalenten Menge (hinsichtlich der Sauerstoff-Transport-Kapazität) an löslichem Hämoglobin jedes Standes der Technik. Because of the "megameren" nature of insoluble hemoglobin constructs of this invention, they will have a colloidal osmotic pressure or oncotic pressure have, which is negligible compared with an equivalent amount (in terms of oxygen carrying capacity) of soluble hemoglobin of each prior art. Dies würde die intravenöse Infusion hoher Konzentrationen von Hämoglobin-Konstrukten der Erfindung erlauben, während lösliches Hämoglobin des Standes der Technik mit einer maximalen Konzentration von lediglich 6–8 g/dl infundiert werden darf, wegen der Sorge um schwerwiegenden Wasserverlust aus Geweben, die den vaskulären Raum umgeben, aufgrund der osmotischen Gradienten. This would allow the intravenous infusion of high concentrations of hemoglobin constructs of the invention, while soluble hemoglobin of the prior art may be infused with a maximum concentration of only 6-8 g / dl, because of the concern for serious water loss from tissues, the vascular to surrounded space, due to the osmotic gradient.
  • [0075] [0075]
    Die Zusammensetzung der Erfindung hat einen entscheidenden Vorteil gegenüber verkapselten Hämoglobin-Zusammensetzungen des Standes der Technik. The composition of the invention has a significant advantage over encapsulated hemoglobin compositions of the prior art. Liposomale Hämoglobin-Formulierungen des Standes der Technik umfassen lösliches Hämoglobin innerhalb einer äußeren Lipidschicht. Liposomal hemoglobin formulations of the prior art comprise soluble hemoglobin within an external lipid layer. In Liposomen verkapselte Hämoglobin-Zusammensetzungen des Standes der Technik leiden unter etlichen Nachteilen, die durch die vorliegende Erfindung beseitigt werden. Liposome encapsulated hemoglobin compositions of the prior art suffer from several drawbacks that are overcome by the present invention. Die Leckage löslichen Hämoglobins aus liposomalen Zusammensetzungen kann möglicherweise Nephrotoxizität verursachen. The leak soluble hemoglobin from liposomal compositions can potentially cause nephrotoxicity. Die unlöslichen Konstrukte der vorliegenden Erfindung werden aufgrund ihrer extensiv vernetzten Natur kein lösliches Hämoglobin verlieren. The insoluble constructs of the present invention will lose no soluble hemoglobin due to their extensively crosslinked nature. Die Aggregation von Liposomen ist bekannt dafür, dass sie das Komplementprotein C3a aktiviert. The aggregation of liposomes is known to activate the complement C3a. Diese Aggregation ist unwahrscheinlich im Falle von unlöslichen Konstrukten wegen ihrer Größe, die erheblich größer ist als der liposomale Größenbereich. This aggregation is unlikely in the case of insoluble constructs due to their size, which is considerably larger than the liposomal size range.
  • [0076] [0076]
    Die Zusammensetzung von unlöslichem vernetztem Hämoglobin gemäß der Erfindung verhindert mit löslichen Hämoglobin-Zusammensetzungen des Standes der Technik verbundene Toxizität. The composition of insoluble crosslinked hemoglobin according to the invention avoids toxicity associated with soluble hemoglobin compositions of the prior art. Die Nephrotoxizität oder Nierengiftigkeit von Hämoglobin hängt hauptsächlich mit der Clearance von löslichem dimerem, tetramerem oder oligomerem Hämoglobin aus dem Kreislauf zusammen. Nephrotoxicity or renal toxicity of hemoglobin is mainly related to the clearance of soluble dimeric, tetrameric or oligomeric hemoglobin from the circulation. Das Hämoglobin der vorliegenden Erfindung, das extensiv vernetzt oder 'megamer' ist, kann nicht von der Niere ausgeschieden werden, und es ist unwahrscheinlich, das es nephrotoxisch ist. The hemoglobin of the present invention, which is extensively crosslinked or 'megamer', can not be excreted by the kidney, and it is unlikely that it is nephrotoxic. Die unlöslichen Konstrukte der vorliegenden Erfindung können nicht von den Nieren ausgeschieden werden und umgehen daher dieses Problem. The insoluble constructs of the present invention can not be excreted by the kidneys and therefore circumvent this problem. Ein weiterer Vorteil der extensiv vernetzten Hämoglobin-Konstrukte der vorliegenden Erfindung gegenüber dem Stand der Technik ist das erhöhte intravaskuläre Fortbestehen aufgrund der unlöslichen Form. Another advantage of the extensively crosslinked hemoglobin constructs of the present invention over the prior art is the increased intravascular persistence due to the insoluble form.
  • [0077] [0077]
    Die Morphologie des unlöslichen Hämoglobin-Konstruktes (IHC) wurde unter Verwendung von Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestimmt. The morphology of the insoluble hemoglobin construct (IHC) was determined using transmission electron microscopy (TEM). Um die mikroskopische TEM-Aufnahme eines Querschnitts eines Rinder-IHC zu erhalten, wurde das IHC mit Glutaraldehyd fixiert, mit Osmiumtetroxid und Kalium-Eisencyanat gefärbt (um Kontrast in Bereichen mit hoher Protein-Konzentration bereitzustellen), in ein Harz mit niedriger Viskosität eingebettet und Ultramikrotomschnitte hergestellt (Schnittdicke ~75 nm). In order to obtain the microscopic TEM image of a cross section of a bovine IHC, the IHC was fixed with glutaraldehyde, with osmium tetroxide and potassium Eisencyanat colored (to provide contrast in regions of high protein concentration), embedded in a resin with low viscosity and ultramicrotome made (section thickness ~ 75 nm). Da eine gewisse Schrumpfung im Gesamtdurchmesser und ein gewisses Verwinden der Form des IHC während dieses Vorgehens erwartet wurden, wird der wahre Durchmesser des IHC am besten durch die Partikelgrößenverteilung (3 μm; Standardabweichung 1) der Lösung dargestellt, eher als durch direkte Messungen an der mikroskopischen TEM-Aufnahme. (Standard deviation 1 3 microns) of the solution presented, rather than by direct measurements microscopic to the Da some shrinkage in the overall diameter and a certain distortion of the shape of the IHC during this procedure have been expected, the true diameter of the IHC is best described by the particle size distribution TEM image. Ein näherer Blick auf die mikroskopische TEM-Aufnahme zeigt drei unterscheidbare Regionen: eine helle Zentralregion; A closer look at the microscopic TEM image shows three distinct regions: a bright central region; eine dunkle, dünne Schicht um das Partikel; a dark, thin layer around the particles; und eine lose angefügte, diffuse, fleckig-graue Region, verbunden mit der äußeren Oberfläche des Partikels. and a loosely attached, diffuse, speckled gray region associated with the outer surface of the particle. Die dunkle, dünne Schicht ist die IHC-Hülle. The dark, thin layer is the IHC shell. Sie enthält eine hohe Proteindichte und entwickelt während des Färbungsverfahrens den stärksten Kontrast. It contains a high protein density and developed during the dying process the strongest contrast. Das lose angefügte, graue Material scheint natürliches Protein zu sein, das während des Fixierungsschrittes bei der Probenpräparation an der IHC-Hülle haftet. The loosely attached, gray material appears to be natural protein that adheres during the fixation step in the sample preparation of the IHC shell. Anfängliche Messungen von dieser und vielen anderen mikroskopischen Aufnahmen zeigen, dass die Hüllendicke des Rinder-Hämoglobin-IHC ungefähr 25–35 nm ist. Initial measurements from this and many other micrographs indicate that the shell thickness of the bovine hemoglobin IHC is approximately 25-35 nm. Hämoglobin ist ein grobkugelförmiges Protein (L. Stryer, Biochemistry, WH Freeman, New York, 1988) mit einem Durchmesser von 5,5 nm. Folglich ist die Proteinhülle des IHC annähernd 4 bis 20 Hämoglobin-Moleküle (Tetramere) dick. Hemoglobin is a roughly spherical protein (L. Stryer, Biochemistry, WH Freeman, New York, 1988) with a diameter of 5.5 nm. Therefore, the protein shell of the IHC is approximately 4 to 20 hemoglobin molecules (tetramers) thick. Somit würde eine Blase mit einem Durchmesser von 3,0 μm ungefähr 10 4 bis 10 12 Hämoglobin-Moleküle enthalten. Thus, a bubble having a diameter of 3.0 microns would contain about 10 4 to 10 12 hemoglobin molecules.
  • [0078] [0078]
    Die Untersuchung von unlöslichen Hämoglobin-Konstrukten (IHC) der vorliegenden Erfindung (Mikroblasen oder Mikrokugeln) durch Zirkulardichroismus zeigte, dass der Gehalt an Alpha-Helices und Beta-Faltblättern in dem IHC sich nicht signifikant von dem des gereinigten stromafreien Hämoglobins (SFH) unterschied. The investigation of insoluble hemoglobin constructs (IHC) of the present invention (microbubbles or microspheres) showed by circular dichroism that the content of alpha-helices and beta-sheets in the IHC was not significantly different from that of purified stroma hemoglobin (SFH) differed. Diese Beobachtung ist von Bedeutung, da sie zeigt, dass das Vernetzungsverfahren und die Bildung von unlöslichem Hämoglobin keine Denaturierung (dh die Veränderung der Tertiär- und Quartärstruktur) des Proteins verursacht. This observation is significant because it indicates that the crosslinking procedure and formation of insoluble hemoglobin does not denature (ie, the change in the tertiary and quaternary structure) of the protein caused. Diese Beobachtung wird selbstverständlich durch funktionelle Daten erhärtet, die die Beibehaltung der reversiblen Sauerstoffbindung und das Zusammenwirken zwischen sauerstoffbindenden Hämeeinheiten nach dem synthetischen Schritt zeigen. This observation is of course supported by functional data showing the retention of reversible oxygen binding and the interaction between oxygen scavenging Hämeeinheiten after the synthetic step.
  • [0079] [0079]
    Ein Rinder- und ein menschliches Hämoglobin-IHC wurden synthetisiert, wie im Beispiel 14 beschrieben. A bovine and a human-hemoglobin IHC were synthesized as described in Example 14. Wie von Fachkundigen anerkannt wird, kann das verwendete Hämoglobin aus jeder Wirbeltier-, Wirbellosen- oder eukaryotischen Quelle gewonnen werden oder kann das Produkt genetischer Manipulation von Wirbeltier- Wirbellosen- oder eukaryotischen Zellen sein. As will be appreciated by those skilled in the hemoglobin used from any vertebrate, invertebrate or eukaryotic source can be won or may be the product of genetic manipulation of vertebrate invertebrate or eukaryotic cells. Tabelle 1 gibt eine Zusammenfassung der derzeitigen Ergebnisse. Table 1 gives a summary of the current results. Tabelle 1 Zusammenfassung von n max - und P 50 -Werten von beschallten Hb-Mikroblasen und unbeschalltem BHb bei unterschiedlichen Phosphatkonzentrationen Table 1 Summary of n max - and P 50 values of Hb sonicated microbubbles and unbeschalltem BHb at different phosphate concentrations
    Effektorkonzentr. Effektorkonzentr. (mM) (MM) Beschallte Hb-Mikroblasen Hb sonicated microbubbles Unbeschallte Hb-Lösung Blank echoed Hb solution
    IHP IHP 2,3-BPG 2,3-BPG IHP IHP 2,3-BPG 2,3-BPG
    n max n max P 1/2 P 1/2 n max n max P 1/2 P 1/2 n max n max P 1/2 P 1/2 n max n max P 1/2 P 1/2
    0 0 9,5 9.5 21,2 21.2 9,5 9.5 21,2 21.2 2,7 2.7 22,3 22.3 2,7 2.7 22,3 22.3
    0,25 0.25 12,1 12.1 22,2 22.2 11,5 11.5 22,0 22.0 2,7 2.7 24,7 24.7 2,7 2.7 22,5 22.5
    0,5 0.5 15,2 15.2 28,3 28.3 13,0 13.0 25,1 25.1 2,8 2.8 28,2 28.2 2,8 2.8 23,2 23.2
    1,0 1.0 15,1 15.1 32,1 32.1 13,4 13.4 28,7 28.7 2,8 2.8 30,2 30.2 2,8 2.8 24,9 24.9
    1,7 1.7 17,6 17.6 39,5 39.5 14,0 14.0 32,6 32.6 2,8 2.8 34,1 34.1 2,8 2.8 28,0 28.0
    • Anmerkung: Die Hill-Koeffizienten (n) für BHb-Mikroblasen sind berechnet aus der Formel: Note: The Hill coefficient (n) for BHb microbubbles are calculated from the formula: wobei Y die mit Sauerstoff angereicherte Fraktion ist und wherein Y is the oxygen-enriched fraction, and der Sauerstoffdruck ist. the oxygen pressure. Für die Mikroblasen ist jeder Δlog(Y/1 – Y)-Term über fünf aufeinanderfolgende Punkte gemittelt. For the microbubbles any Δlog (Y / 1 - Y) -term averaged over five consecutive points.
  • [0080] [0080]
    Alle Bindungsversuche wurden bei 25°C in Tris-Puffer (pH 7,4) durchgeführt. All binding experiments were carried out at 25 ° C in Tris-buffer (pH 7.4). Die IHC behalten ihre Fähigkeit bei, Sauerstoff reversibel zu binden, wie durch UV-Sichtbar-Spektren des IHC dargestellt, was das Vorhandensein von Met-Fe(III)-, Oxy-Fe(II)- und Desoxy-Fe(II)-Formen anzeigt. The IHC retain their ability to bind oxygen reversibly, as indicated by UV-visible spectra of the IHC, which the presence of Met-Fe (III) -, oxy-Fe (II) - and deoxy-Fe (II) - forms displays. Das IHC kann ohne nennenswerten Abbau in mehr als zehn Zyklen zwischen den Desoxy- und Oxy-Zuständen im Kreislauf geführt werden. The IHC can be performed without significant degradation in more than ten cycles between the deoxy and oxy-states in the circuit. Dies ist wichtig, weil es zeigt, dass die Umgebung, die die aktive Häm-Stelle umgibt, während des Vorgangs der Herstellung des IHC-rote-Blutzellen-Ersatzes nicht nennenswert verändert wurde. This is important because it indicates that the environment surrounding the active heme site has not changed significantly during the process of preparation of the IHC red blood cell substitute.
  • [0081] [0081]
    Diese Sauerstoffbindungsdaten lassen den Schluss zu, dass das IHC im Wesentlichen nicht denaturiertes Hämoglobin umfasst. These oxygen binding data suggest that the IHC comprises substantially non-denatured hemoglobin. Falls es denaturiert worden wäre, würde keine physiologische (oder eine geringere) Reaktivität beobachtet werden. If it had been denatured, no physiological (or less) reactivity would be observed.
  • [0082] [0082]
    Von allosterischen Effektoren von natürlichem Hämoglobin wie Inositolhexaphosphat (IHP) und 2,3-Biphosphoglycerat (2,3-BPG) wurde gezeigt, dass sie sowohl den P 50 erhöhten (dh niedrigere Sauerstoffaffinität) als auch die Kooperativität verbesserten. Of allosteric effectors of native hemoglobin such as inositol hexaphosphate (IHP) and 2,3-biphosphoglycerate (2,3-BPG) have been shown that they improved both the P 50 increased (ie lower oxygen affinity) and the cooperativity. Dieselben Auswirkungen sind im IHC zu sehen. The same effect can be seen in the IHC. Obwohl die P 50 -Werte um denselben Betrag erhöht sind, zeigt sich ein dramatischerer Effekt in der Kooperativität des IHC. Although the P 50 values are increased by the same amount, a more dramatic effect in the cooperativity of the IHC shows. Der n max stieg dramatisch über den von natürlichem Hämoglobin bei Vorhandensein von 1,7 mM IHP (17,6 vs. 2,8) und 2,3-BPG (14 vs. 2,8) (siehe Tabelle 1). The n max increased dramatically over the of native hemoglobin in the presence of 1.7 mM IHP (17.6 vs. 2.8) and 2,3-BPG (14 vs. 2.8) (see Table 1).
  • [0083] [0083]
    Diese unerwartet hohe Zunahme der Kooperativität ist offensichtlich auf die kovalente Bindung zwischen Hämoglobin-Tetrameren innerhalb der IHC-Hülle zurückzuführen. The unexpectedly high increase in cooperativity is apparently due to the covalent bond between hemoglobin tetramers within the IHC shell. Der Hill-Koeffizient kann nicht höher sein als die Anzahl von wechselseitig wirkenden Bindungsstellen. The Hill coefficient can not be greater than the number of mutually co-acting binding sites. Die Werte von ungefähr 2,8 in natürlichem Hämoglobin spiegeln die Kooperativität in einem Tetramer wider. The values of about 2.8 in native hemoglobin reflects the cooperativity reflected in a tetramer. Jedoch findet in der IHC-Hülle eine Kommunikation zwischen etlichen der vernetzten Tetramere (aus der Bildung von Disulfidbindungen) nach der Bindung des Sauerstoffs statt. However, in the IHC shell is communication between several of the cross-linked tetramers (from the formation of disulfide bonds) upon binding oxygen instead. Die Wechselwirkungen mit den nächsten Nachbar-Tetrameren scheinen die stärksten zu sein; The interactions with nearest-neighbor tetramers appear to be the strongest; jedoch können zusätzliche schwächere Wechselwirkungen zwischen weiter entfernten Tetrameren bestehen. however, additional weaker interactions between tetramers further away may exist. Im Wesentlichen ist der hohe n max ein Anzeichen dafür, dass multiple Tetramere nach dem Binden von Sauerstoff innerhalb der IHC-Hülle beim Übergang vom Desoxy-T- zum Oxy-R-Zustand zusammenarbeiten. In essence, the high n max is an indication that multiple tetramers cooperate after bonding of oxygen within the IHC shell during the transition from deoxy-T to the oxy-R state. Wiederum offenbaren mikroskopische TEM-Aufnahmen von Hämoglobin-IHC eine Hüllendicke von ungefähr sechs Hämoglobin-Tetrameren. Again reveal microscopic TEM micrographs of hemoglobin IHC a shell thickness of about six hemoglobin tetramers. Eine Blase mit einem Durchmesser von 3,0 μm würde ungefähr 10 4 bis 10 12 Hämoglobin-Moleküle enthalten. A bubble having a diameter of 3.0 microns would contain about 10 4 to 10 12 hemoglobin molecules.
  • [0084] [0084]
    Die Stabilität nach der Lagerung des IHC wurde durch Partikelzählungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zubereitung gezählt. The stability upon storage of the IHC was counted by particle counts at various times after preparation. Die IHC wurden in steriler Salzlösung bei 4°C für bis zu 6 Monate gelagert. The IHC were stored in sterile saline at 4 ° C for up to 6 months. Nach 3 Monaten hatte die Konzentration des IHC um ungefähr 10% abgenommen, während die Konzentration nach 6 Monaten um ungefähr 25–30% gefallen war. After 3 months, the concentration of the IHC had decreased by about 10%, while at 6 months the concentration had dropped by about 25-30%.
  • [0085] [0085]
    Die Auto-Oxidationsrate des IHC (von Oxy-Fe(II) zu Met-Fe(III)) wurde als höher denn 60 Stunden, 96 Stunden und 25 Tage bei 37°C, 25°C bzw. 4°C bestimmt. The auto-oxidation rate of the IHC (from oxy-Fe (II) to Met-Fe (III)) was determined to be higher than 60 hours, 96 hours, 25 days at 37 ° C, 25 ° C or 4 ° C. Keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen wurden getroffen, um eine Inertatmosphäre aufrechtzuerhalten, als diese Ergebnisse gewonnen wurden. No special precautions were taken to maintain an inert atmosphere, was recovered as these results. Der Stand der Technik zeigt klar den Nutzen, eine Inertatmosphäre wie Stickstoff aufrechtzuerhalten, um die Auto-Oxidationsrate von Hämoglobin zu reduzieren. The prior art clearly demonstrates the benefit of maintaining an inert atmosphere such as nitrogen, to reduce the rate of auto-oxidation of hemoglobin. Eine Lagerung unter solchen Bedingungen ließe erwarten, dass der Anteil von über einen längeren Zeitraum beibehaltenem Fe(II)-Hämoglobin stark ansteigen würde. Storage under such conditions would be expected that the proportion of over a longer period Preserved Fe (II) hemoglobin would rise sharply.
  • [0086] [0086]
    Zusätzlich kann die Auto-Oxidation durch Lagerung der IHC-Suspension mit dem oben beschriebenen Reduktionssystem von Hyashi et al. In addition, the auto-oxidation by storage of the IHC suspension with the reduction system of Hyashi described above et al. verhindert werden. be prevented.
  • [0087] [0087]
    Die Pasteurisierung wurde untersucht als ein Verfahren der Sterilisation der IHC-Suspensionen im Endstadium. Pasteurization was investigated as a method of sterilization of the IHC suspensions in the final stage. Zahlreiche unterschiedliche Pasteurisierungsbedingungen wurden angewandt. Many different pasteurization conditions were applied. Partikelzählungen wurden nach jeder Bedingung angewandt, um jegliche schädlichen Auswirkungen der Temperatur auf das IHC festzustellen. Particle counts were applied after each condition to determine any adverse effects of temperature on the IHC.
    Bedingung 1: Condition 1: Die Temperatur der IHC-Suspension wurde in 8 Minuten von 25–62,8°C aufgestockt und 30 Minuten lang bei dieser Temperatur gehalten. The temperature of the IHC suspension was increased in 8 minutes from 25 to 62.8 ° C and held for 30 minutes at this temperature. Partikelzählungen zeigten einen Abbau von weniger als 20%. Particle counts showed a degradation of less than 20%.
    Bedingung 2: Condition 2: Die Temperatur der IHC-Suspension wurde in 10 Minuten von 25–71,7°C aufgestockt und 15 Sekunden lang bei dieser Temperatur gehalten. The temperature of the IHC suspension was increased to 10 minutes from 25 to 71.7 ° C and held for 15 seconds at this temperature. Partikelzählungen zeigten einen Abbau von weniger als 20%. Particle counts showed a degradation of less than 20%.
    Bedingung 3: Condition 3: Die Temperatur der IHC-Suspension wurde in 12 Minuten von 25–89,5°C aufgestockt und 2 Sekunden lang bei dieser Temperatur gehalten. The temperature of the IHC suspension was increased to 12 minutes from 25 to 89.5 ° C and held for 2 seconds at this temperature. Partikelzählungen zeigten einen schwerwiegenden Abbau von mehr als 70%. Particle counts showed a severe degradation of greater than 70%.
  • [0088] [0088]
    Somit wurden die Bedingungen 1 und 2 als für Pasteurisierungsmethoden geeignet befunden. Thus, the conditions 1 and 2 were found to be suitable for Pasteurisierungsmethoden. Gamma-Strahlung als eine Sterilisationsmodalität im letzten Stadium ist ebenfalls geeignet. Gamma radiation as an Sterilisationsmodalität in the last stage is also suitable.
  • [0089] [0089]
    Die Sauerstoff-Affinität (oder P 50 ) des IHC kann durch chemische Modifizierung des Hämoglobins mit bekannten allosterischen Effektoren verändert werden. The oxygen affinity (or P 50) of the IHC may altered by chemical modification of the hemoglobin with known allosteric effectors. Im Allgemeinen begrenzt die Modifizierung des Hämoglobins den Übergang zwischen den zwei Oxy- und Desoxy-Konformationen; In general, the modification of hemoglobin restricts the transition between the two oxy and deoxy conformations; somit wird die Oxidationsfunktion fast immer auf irgendeine Weise verändert. Thus, the oxidation function is almost always altered in some way. Falls Hämoglobin zum Beispiel in der Oxy-Form modifiziert wird, wird üblicherweise eine hohe Sauerstoff-Affinität bevorzugt, während das Umgekehrte der Fall ist, wenn die Modifizierung im Desoxy-Zustand durchgeführt wird. If hemoglobin is modified, for example, in the oxy form, high oxygen affinity is usually preferred, while the reverse is the case when the modification is carried out in the deoxy condition. Derivate von Pyridoxal sind nützliche Modifikatoren, da dieses Molekül den natürlichen allosterischen Effektor 2,3-Diphosphoglycerat (DPG) nachahmt. Derivatives of pyridoxal are useful modifiers since this molecule mimics the natural allosteric effector 2,3-diphosphoglycerate (DPG). Sie binden an die endständigen Aminoguppen des Hämoglobins. They bind to the terminal Aminoguppen of hemoglobin. Zum Beispiel kann das Hämoglobin mit Pyridoxal-5'-Phosphat (PLP) zur Reaktion gebracht werden, das die natürliche Interaktion von 2,3-DPG nachahmt, um den P 50 zu erhöhen. For example, the hemoglobin with pyridoxal-5'-phosphate (PLP) may be reacted, which mimics the natural interaction of 2,3-DPG to increase the P 50. Andere Pyridoxal-Derivate wie 2-Nor-2-formyl-PLP, ein bifunktionales Mittel, das die Hämoglobin-β-Ketten koppelt, oder Bispyridoxaltetraphosphat sind nützliche Modifikatoren. Other derivatives of pyridoxal such as 2-nor-2-formyl PLP, a bifunctional agent that links the hemoglobin β chains, or Bispyridoxaltetraphosphat are useful modifiers. Andere Vernetzer, wie Acyl-tris(natriummethylphosphate), können ebenfalls verwendet werden, um die β-Ketten zu vernetzen. Other crosslinkers such as acyl tris (sodium methyl phosphates) may also be used to crosslink the β chains.
  • [0090] [0090]
    Aldehyd-Modifikatoren können ebenfalls verwendet werden. Aldehyde modifiers may also be used. Zum Beispiel ist Glutaraldehyd nützlich bei der Polymerisation von Hämoglobin und kann in Verbindung mit PLP verwendet werden. For example glutaraldehyde is useful in polymerization of hemoglobin and can be used in conjunction with PLP.
  • [0091] [0091]
    Diaspirinester wie 3,5-Bis(dibromsalicyl)fumarat und das entsprechende Monoaspirin sind nützliche allosterische Modifikatoren. Diaspirinester such as 3,5-bis (dibromosalicyl) fumarate and the corresponding mono aspirin are useful allosteric modifiers. Das Aspirin bindet zwischen den α-Ketten des Hämoglobins und dem monofunktionellen Reagens an ein inneres Lysin. The aspirin binds between the α-chain of hemoglobin and the monofunctional reagent to an internal lysine. Beide erhöhen den P 50 von Hämoglobin. Both increase the P 50 of hemoglobin.
  • [0092] [0092]
    Somit können Konstrukte mit 'niedriger Affinität' oder 'hoher Affinität' hergestellt werden zur Applizierung in anderen Situationen als bei Traumata und akutem Blutverlust, wie in Situationen, in denen lokale Zufuhr von Sauerstoff notwendig und wohltuend ist. Thus constructs can be with 'low affinity' or 'high affinity' manufactured for application in other situations than for trauma and acute blood loss, such as in situations where local supply of oxygen is necessary and beneficial.
  • [0093] [0093]
    Ein Konstrukt mit 'niedriger Affinität', dh eines mit einem hohen P 50 (≥ 28 mm Hg), das mittels des obigen Verfahrens hergestellt wurde, bringt Nutzen bei der Verwendung von Sauerstoff als ein Adjuvans bei der Behandlung von Tumoren durch Strahlung oder Chemotherapie. A construct with 'low affinity', ie one with a high P 50 (≥ 28 mm Hg), which was prepared by the above method, brings benefits in the use of oxygen as an adjuvant in the treatment of tumors by radiation or chemotherapy. Solche Konstrukte werden außerhalb des Körpers bis zur maximalen Sauerstoffkapazität beladen und dann in den Kreislauf des Tumors verabreicht. Such constructs are loaded outside the body to maximum oxygen capacity and then administered into the circulation of the tumor. Dies erlaubt, dass eine große Menge Sauerstoff an den Tumor abgegeben wird. This allows a large amount of oxygen is delivered to the tumor. Aktivierter Sauerstoff, der unter Strahlung oder Chemotherapie hergestellt wird, resultiert in einer höheren zytotoxischen Aktivität im Tumorbereich. Activated oxygen is produced by radiation or chemotherapy results in greater cytotoxic activity in the tumor area.
  • [0094] [0094]
    Ein Konstrukt mit 'hoher Affinität' (P 50 < 28 mm Hg) hat Nutzen bei der 'ischämischen Sauerstoffzufuhr'. A construct with 'high affinity' (P 50 <28 mm Hg) has utility in the 'ischemic oxygen supply'. Ischämie oder Sauerstoffmangel von Gewebe kann in einer Anzahl von pathologischen Bedingungen vorkommen, z. B. Schlaganfall, Myokardinfarkt und dergleichen. Ischemia or oxygen deprivation of tissue may occur in a number of pathological conditions, eg. As stroke, myocardial infarction, and the like. Die bevorzugte Freisetzung von Sauerstoff in solchen Bereichen würde helfen, dauerhafte Gewebeschäden zu minimieren. The preferred release of oxygen in such areas would help minimize permanent tissue damage. Ein Sauerstoffträger oder RBC-Ersatz mit einer Sauerstoff-Affinität ähnlich der von Vollblut wird Sauerstoff nicht bevorzugt in einem solchen Bereich freisetzen. An oxygen carrier or RBC substitute with oxygen affinity similar to that of whole blood is not preferred release oxygen in such an area. Jedoch wird einer mit einer hohen Sauerstoff-Affinität (dh ein niedriger P 50 , verglichen mit Vollblut) seinen Sauerstoff bevorzugt an einer solchen ischämischen Stelle freisetzen, aufgrund des hohen Sauerstoff-Gradienten zwischen dem Blut und dem Gewebe, während er den größten Teil seines Sauerstoffs unter Bedingungen von normal anzutreffenden Sauerstoff-Gradienten zurückhält. However, one with a high oxygen affinity (ie, a low P 50, compared with whole blood) is preferred release its oxygen at such ischemic place, due to the high oxygen gradient between the blood and the tissue, while most of its oxygen retains under conditions of normal encountered oxygen gradients. Die Affinitäten von unlöslichen Hämoglobin-Konstrukten der vorliegenden Erfindung können für solche Anwendungen einfach durch Änderung der Vernetzungsnatur auf einen geeigneten (P 50 )-Wert manipuliert werden, indem ein geeignetes natürliches Hämoglobin mit der gewünschten Affinität verwendet wird, oder durch Verwendung eines gentechnisch hergestellten Hämoglobins mit geeigneter Affinität. The affinities of insoluble hemoglobin constructs of the present invention can be manipulated by changing the nature of crosslinking to a suitable (P 50) value by using a suitable natural hemoglobin with the desired affinity is used, or by using a genetically engineered hemoglobin of such applications simply with appropriate affinity.
  • [0095] [0095]
    Etliche Arzneimittel sind Kandidaten zur Einkapselung in Hämoglobin-Mikrokugeln der vorliegenden Erfindung. Several drugs are candidates for encapsulation in hemoglobin microspheres of the present invention. Etliche chemotherapeutische Mittel erfordern das Vorhandensein von Sauerstoff zur maximalen Tumorzytotoxizität. Several chemotherapeutic agents require the presence of oxygen for maximal tumor cytotoxicity. Die Verabreichung solcher Arzneimittel innerhalb Konstrukten eines Sauerstoffträgers wie Hämoglobin verbindet wirkungsvoll die wesentlichen Komponenten der Zytotoxizität in einer einzigen Verpackung. The administration of such drugs within constructs of an oxygen carrier such as hemoglobin effectively combines the essential components of cytotoxicity in a single package. Etliche nützliche zytotoxische Arzneimittel sind öllöslich. Several useful cytotoxic drugs are oil-soluble. Diese Arzneimittel können in einem Fluorkohlenstoff oder anderem biokompatiblen Öl wie Sojaöl, Safloröl, Kokosöl, Olivenöl, Baumwollsamenöl und dergleichen gelöst werden. These drugs may be dissolved in a fluorocarbon or other biocompatible oil such as soybean oil, safflower oil, coconut oil, olive oil, cotton seed oil and the like. Die Öl/Arzneimittel-Lösung wird einer Ultraschallbeschallung mit einer Hämoglobinlösung ausgesetzt, um Mikrokugeln von Öl/Arzneimittel innerhalb einer Hülle von vernetztem unlöslichem Hämoglobin herzustellen. The oil / drug solution is subjected to ultrasonic irradiation with a hemoglobin solution exposed to produce microspheres of oil / drug within a shell of crosslinked insoluble hemoglobin. Die Suspension kann vor der intravaskulären Verabreichung mit Sauerstoff angereichert werden. The suspension can be enriched prior to intravascular administration with oxygen. Öllösliche zytotoxische Arzneimittel sind Cyclophosphamid, BCNU, Melphalan, Mitomycine, Taxol und Derivate, Taxoter und Derivate, Camptothecin, Adriamycin, Etoposid, Tamoxifen, Vinblastin, Vincristin und dergleichen; Oil-soluble cytotoxic drugs are cyclophosphamide, BCNU, melphalan, mitomycins, taxol and derivatives, taxotere and derivatives, camptothecin, adriamycin, etoposide, tamoxifen, vinblastine, vincristine and the like; nichtsteroidale Entzündungshemmer wie Ibuprofen, Aspirin, Piroxicam, Cimetidin und dergleichen; nonsteroidal anti-inflammatory drugs such as ibuprofen, aspirin, piroxicam, cimetidine, and the like; Steroide wie Östrogen, Prednisolon, Cortison, Hydrocortison, Diflorason und dergleichen; Steroids such as estrogen, prednisolone, cortisone, hydrocortisone, diflorasone, and the like; Arzneimittel wie Phenesterin, Mitotan, Visadin, Halonitrosoharnstoffe, Anthrocycline, Ellipticin, Diazepam und dergleichen; Medicines like phenesterine, mitotane, Visadin, Halonitrosoharnstoffe, Anthrocycline, ellipticine, diazepam, and the like; immunsuppressive Mittel wie Cyclosporin, Azathioprin, FK506 und dergleichen. immunosuppressive agents such as cyclosporine, azathioprine, FK506, and the like.
  • [0096] [0096]
    Wasserlösliche Arzneimittel können auch durch ein Verfahren der Doppel-Emulsion innerhalb der IHC-Hülle eingekapselt werden. Water-soluble drugs may also be encapsulated by a method of double emulsion within the IHC shell. Zunächst wird eine wässrige Arzneimittel-Lösung mit einem biokompatiblen Öl emulgiert, um eine Wasser-in-Öl-(W/O-)Emulsion zu erhalten. First, an aqueous drug solution is emulsified with a biocompatible oil to obtain a water-in-oil (W / O) emulsion. Die W/O-Emulsion wird als eine Öl-Phase behandelt und, wie oben, einer Ultraschallbeschallung mit einer wässrigen Hämoglobin-Lösung unterzogen, um IHC herzustellen, das innerhalb ihrer Hülle eine Mikro-Emulsion des gewünschten wasserlöslichen Arzneimittels enthält. The W / O emulsion is treated as an oil phase and, as above, an ultrasonic irradiation with an aqueous hemoglobin solution subject to produce IHC containing a microemulsion of the desired water-soluble drug within its case. Emulgatoren, die zur Verwendung in diesem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, enthalten die Pluronics (Blockcopolymere aus Polyethylenoxid und Polypropylenoxid), Phospholipide, aus Eigelb gewonnen (z. B. Ei-Phosphatide, Eigelblecithin und dergleichen); Emulsifiers contemplated for use in this embodiment of the present invention which contain Pluronics (block copolymers of polyethylene oxide and polypropylene oxide), phospholipids derived from egg yolk (e.g., egg phosphatides, egg yolk lecithin and the like.); Fettsäureester (z. B. Glycerolmono- und -distearat, Glycerolmono- und -dipalmitat und dergleichen). Fatty acid esters (eg. As glycerol mono- and distearate, glycerol mono- and dipalmitate, and the like). Wasserlösliche Arzneimittel, die zur Verwendung in diesem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, schließen antineoplastische Arzneimittel wie Actinomycin, Bleomycin, Cyclophosphamid, Duanorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Fluorouracil, Carboplatin, Cisplatin, Interferone, Interleukine, Methotrexat, Mitomycine, Tamoxifen, Östrogene, Progestogene und dergleichen ein. Water-soluble drugs that are intended for use in this embodiment of the present invention include antineoplastic drugs such as actinomycin, bleomycin, cyclophosphamide, Duanorubicin, doxorubicin, epirubicin, fluorouracil, carboplatin, cisplatin, interferons, interleukins, methotrexate, mitomycins, tamoxifen, estrogens, progestogens and the like.
  • [0097] [0097]
    Um das IHC den roten Blutzellen ähnlicher zu machen, kann eine Phospholipid-Doppelschicht um die vernetzten Hämoglobin-Mikroblasen gebildet werden. To make the IHC red blood cells Similarly, a phospholipid bilayer can be formed around the crosslinked hemoglobin microbubbles. Solch eine Doppelschicht resultiert in der Bildung eines echten "Erythrozyten-Analogons" und kann in einem zweistufigen Vorgang geschaffen werden. Such a bilayer results in the formation of a true 'red cell analog' and may be created in a two step process. Beladene Phospholipide oder Lipide, die bei der Bildung dieser Doppelschicht verwendet werden, schließen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, Sphingomyelin, Dimyristoylphosphatidsäure, Dipalmitoylphosphatidsäure, Sarcosinate (Sarcosinamide), Betaine, monomere und dimere Alkyde und dergleichen ein. Charged phospholipids or lipids which are used in the formation of this bilayer include phosphatidyl choline, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, sphingomyelin, dimyristoylphosphatidic acid, dipalmitoyl phosphatidic acid, sarcosinates (Sarcosinamide), betaines, monomeric and dimeric alkyds, and the like. Nichtionische Lipide können ebenfalls in dieser Erfindung verwendet werden, einschließlich Polyethylenfettsäureester, Polyethylenfettsäureether, Diethanolamide, langkettige Acylhexosamide, langkettige Acylaminosäureamide, langkettige Aminosäureamine, Polyoxyethylensorbitanester, Polyoxyglycerol-mono- und -diester, Glycerol-mono- und -distearat, Glycerol-mono- und -dioleat, Glycerol-mono- und -dipalmitat und dergleichen. Nonionic lipids may also be used in this invention, including polyethylene fatty acid esters, Polyethylenfettsäureether, diethanolamides, long chain Acylhexosamide, long chain acyl amino acid amides, long chain amino acid amines, polyoxyethylene sorbitan esters, Polyoxyglycerol-mono- and diesters, glyceryl mono- and di-stearate, glycerol mono- and - dioleate, glycerol mono-and dipalmitate, and the like.
  • [0098] [0098]
    Eine weitere Variation dieses Verfahrens besteht darin, photopolymerisierbare Lipide oder Lipide zu verwenden, die leicht durch eine chemische Reaktion vernetzt werden können, um einen stabileren Lipid-"Membran"-Mantel zur Verfügung zu stellen. A further variation of this method is to utilize photopolymerizable lipids or lipids that may be readily crosslinked via a chemical reaction to provide a more stable lipid 'membrane' Coats available. Photopolymerisierbare Lipide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen mit Acrylat oder Methacrylat substituierte Lipide (wie Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Dimyristoylphosphatidsäure, Dipalmitoylphosphatidsäure und dergleichen); Photopolymerizable lipids that may be used in the present invention include acrylate or methacrylate substituted lipids (such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, dimyristoyl phosphatidic acid, dipalmitoylphosphatidic acid, and the like); Lipide mit natürlicher polymerisierbarer Ungesättigtheit (wie ungesättigte Phosphatidylcholine mit Diacetylengruppen oder konjugierten Diengruppen und dergleichen) usw. ein. Lipids with natural polymerizable unsaturation (such as unsaturated phosphatidyl cholines with diacetylene groups or conjugated diene groups, and the like) and so on. Lipide, die leicht mittels eines Thiol-Disulfid-Austausches eine Vernetzung durchmachen können, sind ebenfalls gute Kandidaten zur Bildung eines stabilen Lipid-Mantels für das IHC. Lipids, which can easily undergo crosslinking by means of a thiol-disulfide exchange, are also good candidates for the formation of a stable lipid coat for the IHC. Beispiele solcher Lipide schließen Derivate von Phosphatidylcholinen ein, die mit Liponsäure und ähnlichen verestert sind. Examples of such lipids include derivatives of phosphatidyl cholines esterified with lipoic acid, and the like.
  • [0099] [0099]
    Durch Ultraschallbeschallung synthetisierte IHC können als eine Suspension in einem biokompatiblen Medium verabreicht werden, wie oben beschrieben, wie auch andere Mittel mit Ernähungswert. IHC synthesized by ultrasonic irradiation can be used as a suspension in a biocompatible medium can be administered as described above, as well as other agents having Ernähungswert.
  • [0100] [0100]
    Bevorzugte Wege zur In-vivo-Verabreichung sind: intravenös, intraarteriell, intramuskulär, subkutan, intraperitoneal, oral, durch Inhalation, topisch, transdermal, als Suppositorium, als Pessar und dergleichen. Preferred routes for in vivo administration include intravenous, intraarterial, intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally, orally, by inhalation, topical, transdermal, suppository, pessary and the like.
  • [0101] [0101]
    Zusammenfassend haben die unlöslichen Hämoglobin-Konstrukte der vorliegenden Erfindung zahlreiche Vorteile gegenüber dem löslichen Hämoglobin des Standes der Technik, dem eingekapselten löslichen Hämoglobin des Standes der Technik sowie den Fluorkohlenstoff-Blutersatzstoffen oder Sauerstoffträgern des Standes der Technik. In summary, the insoluble hemoglobin constructs of the present invention has numerous advantages over the soluble hemoglobin of the prior art, the encapsulated soluble hemoglobin of the prior art, as well as fluorocarbon blood substitutes or oxygen carriers of the prior art. Diese Vorteile schließen ein: These advantages include:
    • – höhere Sauerstoff-Kapazität; - Higher oxygen capacity;
    • – variable Sauerstoff-Affinität; - Variable oxygen affinity;
    • – unlösliches 'megameres' Hämoglobin, von dem erwartet wird, länger im Kreislauf zu überdauern als tetrameres oder oligomeres lösliches Hämoglobin des Standes der Technik; - Insoluble 'megameres' hemoglobin, which is expected to last longer in the circulation than tetrameric or oligomeric soluble hemoglobin of the prior art;
    • – niedrigere Möglichkeit der Nierengiftigkeit aufgrund der großen Molekülgröße; - Lower possibility of renal toxicity due to the large molecular size;
    • – geringere Wahrscheinlichkeit, dass Hämoglobin leckt, als im Falle von in Liposom eingekapseltem Hämoglobin; - Less likely to hemoglobin licks, as in the case of encapsulated in liposome hemoglobin;
    • – infolge der viel größeren Größe als Liposomen ist die Bildung von Aggregaten, die Komplementproteine stimulieren, unwahrscheinlich; - Due to the much larger size than liposomes, formation of aggregates that stimulate complement proteins is unlikely;
    • – verhält sich mehr wie RBC aufgrund der verborgenen "Zell"-Natur, verglichen mit löslichem Hämoglobin des Standes der Technik; - Behaves more like RBC due to the Hidden "cell" nature compared to soluble hemoglobin of prior art;
    • – kann einen Vorrat ungebundenen Sauerstoffs neben Sauerstoff, der an Hämoglobin gebunden ist, tragen; - Can a stock unbound oxygen in addition to oxygen bound to hemoglobin wear;
    • – kann als Fluorkohlenstoff-(FC-)Träger verwendet werden, ohne möglicherweise allergische und toxische Emulgatoren; - Can be used as fluorocarbon (FC) support can be used without potentially allergic and toxic emulsifiers;
    • – vernetztes Hämoglobin in Hb/FC-Konstrukten sorgt für verbesserte Stabilität gegenüber emulgierten Systemen des Standes der Technik, die Ei-Phosphatide und/oder andere synthetische oberflächenaktive Substanzen verwenden; - Crosslinked hemoglobin in Hb / FC constructs provides for enhanced stability relative to prior art emulsified systems that use egg phosphatides and / or other synthetic surfactants;
    • – Sauerstoff-Freisetzungsprofile aus dem Hb/FC sind eine Kombination von S-förmig und linear im Verhältnis zum Gewebe-pO 2 ; - Oxygen release profiles from the Hb / FC are a combination of S-shaped and linear in relation to tissue pO 2;
    • – Hb/FC-Konstrukte können in vivo nachgewiesen und überwacht werden durch 19 F-MRI; - Hb / FC constructs can be detected and monitored in vivo by 19 F MRI;
    • – Hämoglobin- oder Hb/FC-Konstrukte können zusätzlich zum Befördern von Sauerstoff als Arzneimittel-Träger verwendet werden; - Hemoglobin or Hb / FC constructs can be additionally used for the transport of oxygen as a drug carrier;
    • – eine Lipid-Doppelschicht-Membran kann bei dem Hämoglobin-Konstrukt Anwendung finden, um es physiologischer erscheinen zu lassen; - A lipid bilayer membrane can be found in the hemoglobin construct application to make it seem physiological;
    • – das Hämoglobin-Konstrukt kann mit Polymeren, wie PEG, modifiziert werden, um die intravaskuläre Verweildauer weiter zu erhöhen. - The hemoglobin construct may be of polymers such as PEG, modified to increase intravascular dwell time on.
  • [0102] [0102]
    Die Partikelgröße von polymeren Hüllen, die entsprechend der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, haben einen durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 2 μm, was ideal für medizinische Anwendungen ist, da intravenöse oder intraarterielle Injektionen ohne die Gefahr der Blockierung kleiner Blutgefäße und nachfolgender Gewebeschädigung (z. B. verursacht durch Ischämie infolge von Sauerstoff-Verlust) ausgeführt werden können. The particle size of polymeric shells that are produced according to the present invention have an average diameter of about 2 microns, which is ideal for medical applications, since intravenous or intra-arterial injections without the risk of blockage of small blood vessels and subsequent tissue damage (eg. As can be caused by ischemia executed due to oxygen loss). Zum Vergleich: rote Blutzellen haben einen Durchmesser von ungefähr 8 μm (somit sollte injizierbares Biomaterial kleiner als 8–10 μm im Durchmesser sein, um Blockierungen der Blutgefäße vorzubeugen). By comparison, red blood cells have a diameter of about 8 microns (thus should be less than 8-10 microns in diameter injectable biomaterial to blockages of blood vessels to prevent).
  • [0103] [0103]
    Entsprechend einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein Ansatz für das Problem der Verabreichung von im Wesentlichen wasserunlöslichen Arzneimitteln wie Paclitaxel bereitgestellt, der in der Literatur nicht beschrieben ist. According to another embodiment of the present invention, an approach to the problem of administration of substantially water insoluble drugs such as paclitaxel, is provided, which is not described in the literature. Dieser Ansatz würde die Zufuhr solcher Arzneimittel in verhältnismäßig hohen Konzentrationen erleichtern und dadurch die Anwendung von Emulgatoren mit ihren begleitenden toxischen Nebenwirkungen erübrigen. This approach would facilitate the delivery of such drugs in relatively high concentrations and thereby obviate the use of emulsifiers and their accompanying toxic side effects.
  • [0104] [0104]
    Die oben beschriebene Darreichungsform wird durch neue arzneimittelhaltige Zusammensetzungen erleichtert, wie beansprucht, wobei im Wesentlichen wasserunlösliches Paclitaxel in einer biokompatiblen Flüssigkeit suspendiert ist, und worin die resultierende Suspension Paclitaxel-Partikel mit einer Querschnittsabmessung von nicht größer als ungefähr 10 μm enthält. The dosage form described above is facilitated by new drug-containing compositions, as claimed, being substantially water-insoluble paclitaxel is suspended in a biocompatible liquid, and wherein the resulting suspension contains particles of paclitaxel having a cross-sectional dimension of no greater than about 10 microns. Die angestrebte Partikelgröße von weniger als ungefähr 10 μm kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, z. B. Ultraschallbeschallung und dergleichen. The desired particle size of less than about 10 microns can be achieved in various ways, eg. As ultrasonic irradiation and the like.
  • [0105] [0105]
    Aufgrund der Kristallgröße der konventionell hergestellten, im Wesentlichen wasserunlöslichen Arzneimittel wie Paclitaxel, das größer als 20 μm ist, wurden feste Partikel solcher Arzneimittel (z. B. Paclitaxel) nicht in Form einer Suspension in einem Vehikel wie normale Salzlösung zugeführt. Due to the crystal size of conventionally produced, essentially water-insoluble drugs such as paclitaxel, which is larger than 20 microns, solid particles of such drugs (eg., Paclitaxel) were not supplied in the form of a suspension in a vehicle such as normal saline.
  • [0106] [0106]
    Aufgrund der mikropartikulären Natur des zugeführten Arzneimittels wird der größte Teil davon durch Organe mit retikuloendothelialen Systemen, wie die Milz, Leber und Lungen, aus dem Kreislauf entfernt. Due to the nature of the microparticulate drug supplied the largest part of it is removed by the reticuloendothelial system organs such as the spleen, liver and lungs from the circulation. Dies ermöglicht es, pharmakologisch wirksame Mittel in partikulärer Form, auf solche Bereiche im Körper zu richten. This makes it possible to judge pharmacologically active agent in particulate form to those areas of the body.
  • [0107] [0107]
    Die biokompatiblen Flüssigkeiten, vorgesehen zur Anwendung in diesem Ausführungsbeispiel, sind die gleichen wie die oben beschriebenen. The biocompatible fluids, is provided for use in this embodiment are the same as those described above. Zusätzlich können parenterale Nahrungsmittel wie Intralipid (Handelsname für eine im Handel erhältliche Fett- Emulsion, angewendet als ein parenterales Nahrungsmittel; erhältlich von Kabi Vitrum, Inc., Clayton, North Carolina), Nutralipid (Handelsname für eine im Handel erhältliche Fett-Emulsion, angewendet als ein parenterales Nahrungsmittel; erhältlich von McGaw, Irvine, Kalifornien), Liposyn III (Handelsname für eine im Handel erhältliche Fett-Emulsion, angewendet als ein parenterales Nahrungsmittel (enthält 20% Sojaöl, 1,2% Ei-Phosphatide und 2,5% Glycerin); erhältlich von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) und dergleichen als Träger der Arzneimittelpartikel verwendet werden. In addition, parenteral foods such as Intralipid can (trade name for a commercially available fat emulsion used as a parenteral foods; available from Kabi Vitrum, Inc., Clayton, North Carolina), Nutralipid (trade name for a commercially available fat emulsion used, as a parenteral foods; available from McGaw, Irvine, California), Liposyn III (trade name for a commercially available fat emulsion used as a parenteral foods (containing 20% soybean oil, 1.2% egg phosphatides and 2.5% glycerin); available from Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) and the like can be used as the carrier of the drug particles. Alternativ kann, falls die biokompatible Flüssigkeit ein Arzneimittel lösendes Material enthält, wie Sojaöl (z. B. wie im Fall von Intralipid), das Arzneimittel teilweise oder vollständig innerhalb der Trägerflüssigkeit gelöst werden, was seine Verabreichung unterstützt. Alternatively, if the biocompatible liquid contains a drug-dissolving material such as soybean oil (z. B. as in the case of Intralipid), the drug dissolved partly or completely within the carrier liquid, which supports its administration. Derzeit bevorzugte biokompatible Flüssigkeiten zur Anwendung in diesem Ausführungsbeispiel sind parenterale Nahrungsmittel, wie jene oben beschriebenen. Currently preferred biocompatible liquids for use in this embodiment are parenteral foods, such as those described above.
  • [0108] [0108]
    Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden nicht begrenzenden Beispiele detaillierter beschrieben. The invention will now be described with reference to the following non-limiting Examples.
  • Beispiel 1 Example 1
  • Herstellung der Öl enthaltenden Proteinhülle Manufacture of oil-containing protein shell
  • [0109] [0109]
    Drei Milliliter einer 5%igen USP-(United States Pharmacopoeia)-Humanserumalbumin-Lösung (Alpha Therapeutic Corporation) wurden in ein zylindrisches Gefäß gegeben, das an eine Beschallungssonde (Heat Systems, Modell XL2020) angeschlossen werden konnte. Three milliliters of 5% USP (United States Pharmacopoeia) -Humanserumalbumin solution (Alpha Therapeutic Corporation) were placed in a cylindrical vessel to a PA probe (Heat Systems Model XL2020) could be connected. Die Albuminlösung wurde mit 6,5 ml Sojabohnenöl mit USP-Qualität (Sojaöl) überschichtet. The albumin solution was overlayered with 6.5 ml of USP grade soybean oil (soya oil). Die Spitze der Beschallungssonde wurde an die Grenzfläche zwischen den beiden Lösungen angelegt, und die Anordnung wurde auf 20°C in einem Kühlungsbad gehalten. The tip of the sonicator probe was applied to the interface between the two solutions and the assembly was maintained at 20 ° C in a cooling bath. Dem System wurde ermöglicht zu äquilibrieren, und das Beschallungsgerät wurde für 30 Sekunden eingeschaltet. The system was allowed to equilibrate, and the sound device was switched on for 30 seconds. Es fand ein kräftiges Mischen statt, und eine weiße, milchige Suspension wurde gewonnen. There was a vigorous mixing, and a white, milky suspension was obtained. Die Suspension wurde im Verhältnis 1:5 mit normaler Salzlösung verdünnt. The suspension was diluted 1: 5 with normal saline. Ein Partikelzählgerät (Particle Data Systems, Elzone, Modell 280 PC) wurde verwendet, um die Größenverteilung und Konzentration von Öl enthaltenden Proteinhüllen zu bestimmen. A particle counter (Particle Data Systems, Elzone, Model 280 PC) was used to determine the size distribution and concentration of oil-containing protein shells. Die resultierenden Proteinhüllen wurden auf eine maximale Querschnittsabmessung von ungefähr 1,35 ± 0,73 μm bestimmt, und die Gesamtkonzentration wurde bestimmt auf ~10 9 Hüllen/ml in der Originalsuspension. The resulting protein shells were determined on a maximum cross-sectional dimension of about 1.35 ± 0.73 microns, and the total concentration was determined to be ~ 10 9 sheets / ml in the original suspension.
  • [0110] [0110]
    Zur Kontrolle: die obigen Bestandteile ohne Protein bildeten keine stabile Mikro-Emulsion, als sie der Ultraschallbeschallung unterzogen wurden. For control: the above ingredients without protein did not form a stable micro-emulsion when they were subjected to ultrasonic irradiation. Dieses Ergebnis legt den Schluss nahe, dass das Protein zur Bildung von Mikrokugeln notwendig ist. This result suggests that the protein for the formation of microspheres is necessary. Dies wird durch Rasterelektronenmikroskop- und Elektronenbeugungsaufnahmestudien bestätigt, wie unten beschrieben. This is confirmed by scanning electron microscope and electron diffraction uptake studies, as described below.
  • Beispiel 2 Example 2
  • Parameter, die die Bildung der polymeren Hülle beeinflussen Parameters that influence the formation of the polymeric shell
  • [0111] [0111]
    Etliche Variable wie Protein-Konzentration, Temperatur, Beschallungszeit, Konzentration des pharmakologisch wirksamen Mittels und akustische Intensität wurden getestet, um die Bildung der polymeren Hülle zu optimieren. Several variables such as protein concentration, temperature, sonication time, concentration of pharmacologically active agent, and acoustic intensity were tested to optimize formation of polymeric shell. Diese Parameter wurden für vernetzte Rinderserumalbuminhüllen bestimmt, die Toluol enthielten. These parameters were determined for cross-linked bovine serum albumin shells containing toluene.
  • [0112] [0112]
    Polymere Hüllen, die aus Lösungen hergestellt wurden, die Proteinkonzentrationen von 1%, 2,5%, 5% und 10% enthielten, wurden mit dem Partikelzählgerät gezählt, um eine Veränderung in der Größe und Anzahl der hergestellten polymeren Hüllen zu bestimmen. Polymeric shells prepared from solutions containing protein concentrations of 1%, 2.5%, 5% and 10% contained, were counted with the particle counter to determine a change in the size and number of polymeric shells produced. Es wurde festgestellt, dass die Größe der polymeren Hüllen nicht stark in Abhängigkeit zur Proteinkonzentration schwankte, jedoch nahm die Anzahl der polymeren Hüllen je Milliliter der gebildeten "milchigen Suspension" mit der Zunahme der Proteinkonzentration bis zu 5% zu. It was found that the size of the polymeric shells not fluctuated depending on the protein concentration, but with the increase in protein concentration, the number of polymeric shells per milliliter of educated "milky suspension" up to 5%. Oberhalb dieser Konzentration wurde keine signifikante Änderung der Anzahl der polymeren Hüllen beobachtet. Above this concentration, no significant change in the number of polymeric shells was observed.
  • [0113] [0113]
    Es wurde festgestellt, dass die Anfangstemperaturen der Gefäße wichtig für die optimale Herstellung von polymeren Hüllen war. It was found that the initial temperatures of the vessels was important for optimal preparation of polymeric shells. Typischerweise wurden die Eingangsgefäßtemperaturen zwischen 0°C und 45°C gehalten. Typically, the input vessel temperatures between 0 ° C and 45 ° C were kept. Die Wasser-Öl-Grenzflächenspannung der für die Bildung der polymeren Hülle verwendeten Öle war ein wichtiger Parameter, der ebenfalls als eine Funktion der Temperatur schwankte. The water-oil interfacial tension of the oils used for formation of the polymeric shell was an important parameter, which also varied as a function of temperature. Es wurde festgestellt, dass die Konzentration des pharmakologisch wirksamen Mittels den Ertrag an Proteinhüllen nicht entscheidend beeinflusst. It has been found that the concentration of the pharmacologically active agent does not affect the yield of protein shells critical. Es ist verhältnismäßig unwichtig, ob das pharmakologisch wirksame Mittel im gelösten Zustand oder im Dispergierungsmittel suspendiert eingebaut wird. It is relatively unimportant if the pharmacologically active agent is incorporated in the dissolved state, or suspended in the dispersing agent.
  • [0114] [0114]
    Die Beschallungszeit war ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der Anzahl an hergestellten polymeren Hüllen je Milliliter. Sonication time was an important factor in determining the number of polymeric shells produced per ml. Es wurde festgestellt, dass eine längere Beschallungszeit als drei Minuten eine Abnahme der Gesamtzahl der polymeren Hüllen bewirkte, was eine mögliche Zerstörung von polymeren Hüllen wegen übermäßiger Beschallung anzeigt. It was found that a longer sonication time than three minutes produced a decrease in the total number of polymeric shells, indicating possible destruction of polymeric shells due to excessive sonication. Es wurde festgestellt, dass Beschallungszeiten von weniger als drei Minuten angemessene Mengen an polymeren Hüllen herstellen. It was found that sonication times of less than three minutes to produce adequate amounts of polymeric shells.
  • [0115] [0115]
    Entsprechend dem Nomogramm, das vom Hersteller des Beschallungsgerätes zur Verfügung gestellt wurde, ist die Nennschallleistung des hier verwendeten Beschallungsgerätes ungefähr 150 Watt/cm 2 . According to the nomogram was provided by the manufacturer of the sonicator, the nominal sound power of the sonicator used here is about 150 watts / cm 2. Drei Leistungseinstellungen in der Reihenfolge steigender Leistung wurden angewandt, und es wurde festgestellt, dass die größte Anzahl an polymeren Hüllen bei der höchsten Leistungseinstellung hergestellt wurde. Three power settings in order of increasing power were applied, and it was found that the largest number of polymeric shells produced at the highest power setting.
  • Beispiel 3 Example 3
  • Herstellung von polymeren Hüllen, die gelöstes Taxol enthalten Include the preparation of polymeric shells containing dissolved taxol
  • [0116] [0116]
    Taxol wurde in Sojaöl mit USP-Qualität auf eine Konzentration von 2 mg/ml gelöst. Taxol was dissolved in USP grade soybean oil at a concentration of 2 mg / ml. 3 ml einer 5%igen USP-Humanserumalbuminlösung wurden in ein zylindrisches Gefäß gegeben, das an eine Beschallungssonde angeschlossen werden konnte. 3 ml of a USP 5% human serum albumin solution were placed in a cylindrical vessel that could be connected to a sonicator probe. Die Albuminlösung wurde mit 6,5 ml der Sojaöl/Taxol-Lösung überschichtet. The albumin solution was overlayered with 6.5 ml of soybean oil / taxol solution. Die Spitze der Sonde des Beschallungsgerätes wurde an die Grenzfläche zwischen den zwei Lösungen angelegt, und die Anordnung wurde im Äquilibrium gehalten und das Beschallungsgerät für 30 Sekunden eingeschaltet. The tip of the probe of the sonicator was applied to the interface between the two solutions and the assembly was maintained in equilibrium and the sonicator turned on for 30 seconds. Starkes Mischen fand statt, und eine stabile, weiße, milchige Suspension wurde erhalten, die polymere Hüllen mit Proteinwänden enthielt, die die Öl/Taxol-Lösung einschlossen. Strong mixing took place, and a stable, white, milky suspension was obtained, the polymeric shells with walls containing protein, which included the oil / taxol solution.
  • [0117] [0117]
    Um eine höhere Beladung mit Arzneimittel in die vernetzte Proteinhülle zu erhalten, kann ein wechselseitiges Lösungsmittel für das Öl und das Arzneimittel (in dem das Arzneimittel eine beträchtlich höhere Löslichkeit hat) mit dem Öl gemischt werden. In order to obtain a higher loading of drug into the crosslinked protein shell, a mutual solvent for the oil and the drug may (in which the drug has a considerably higher solubility) can be mixed with the oil. Vorausgesetzt, dass dieses Lösungsmittel verhältnismäßig ungiftig ist (z. B. Ethylacetat), kann es gemeinsam mit dem ursprünglichen Träger injiziert werden. Provided that this solvent is relatively non-toxic (eg., Ethyl acetate), it can be injected together with the original carrier. Andernfalls kann es durch Verdampfen der Flüssigkeit unter Vakuum im Anschluss an die Herstellung der polymeren Hüllen entfernt werden. Otherwise, it can be removed by evaporating the liquid under vacuum following preparation of the polymeric shells.
  • Beispiel 4 Example 4
  • Stabilität der polymeren Hüllen Stability of the polymeric shells
  • [0118] [0118]
    Suspensionen von polymeren Hüllen mit einer bekannten Konzentration wurden bei drei verschiedenen Temperaturen (dh 4°C, 25°C und 38°C) auf Stabilität untersucht. Suspensions of polymeric shells at a known concentration were at three different temperatures (ie, 4 ° C, 25 ° C and 38 ° C) were examined for stability. Die Stabilität wurde durch Änderung der Partikelzählungen über die Zeit gemessen. The stability was measured by change in particle counts over time. Vernetzte Protein-(Albumin-)Hüllen, die Sojabohnenöl (SBO) enthielten, wurden wie oben beschrieben hergestellt (siehe Beispiel 1), in Salzlösung auf eine Ölendkonzentration von 20% verdünnt und bei den obigen Temperaturen gelagert. Crosslinked protein (albumin) shells containing soybean oil (SBO) were prepared as described above (see Example 1), diluted in saline to a Ölendkonzentration of 20% and stored at the above temperatures. Partikelzählungen (Elzone), die für jede der Proben als eine Funktion der Zeit gewonnen wurden, sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Particle counts (Elzone) obtained for each of the samples as a function of time are summarized in Table 2. Tabelle 2 Table 2
    Tag Day Proteinhüllen (#/ml·10 10 ) in Salzlösung Protein shells (# / ml × 10 10) in saline
    4°C 4 ° C 25°C 25 ° C 38°C 38 ° C
    0 0 7,9 7.9 8,9 8.9 8,1 8.1
    1 1 7,4 7.4 6,9 6.9 6,8 6.8
    7 7 7,3 7.3 8,3 8.3 5,0 5.0
    9 9 7,8 7.8 8,1 8.1 5,8 5.8
    17 17 7,8 7.8 8,3 8.3 6,1 6.1
    23 23 6,9 6.9 7,8 7.8 7,4 7.4
    27 27 7,2 7.2 8,8 8.8 7,1 7.1
  • [0119] [0119]
    Wie durch die obigen Daten gezeigt, bleibt die Konzentration der gezählten Partikel (dh polymeren Hüllen) über die Dauer des Experiments ziemlich konstant. As shown by the above data, the concentration of counted particles (ie, polymeric shells) over the duration of the experiment remains fairly constant. Der Bereich ist ziemlich konstant und verbleibt zwischen ungefähr 7–9·10 10 /ml, was eine gute Stabilität der polymeren Hülle unter einer Vielfalt von Temperaturbedingungen über beinahe vier Wochen anzeigt. The range is fairly constant and remains between about 7-9 · 10 10 / ml, indicating good polymeric shell stability under a variety of temperature conditions over almost four weeks.
  • Beispiel 5 Example 5
  • In-vivo-Bioverteilung – Vernetzte Proteinhüllen, die ein Fluorophor enthalten In vivo biodistribution - Crosslinked protein shells containing a fluorophore
  • [0120] [0120]
    Um die Aufnahme und Bioverteilung einer Flüssigkeit, die in Protein-Polymerhüllen eingeschlossen ist, nach der intravenösen Injektion zu bestimmen, wurde ein Fluoreszenzfarbstoff (Rubren, erhältlich bei Aldrich) innerhalb einer Humanserumalbumin-(HSA)-Protein-Polymerhülle eingeschlossen und als Marker verwendet. To determine the uptake and biodistribution of liquid entrapped in protein polymeric shells after intravenous injection, a fluorescent dye (rubrene, available from Aldrich) within a human serum albumin (HSA) protein polymeric shell was sealed and used as a marker. Somit wurde Rubren in Toluol gelöst, und vernetzte Albuminhüllen, die Toluol/Rubren enthielten, wurden wie oben beschrieben durch Ultraschallbeschallung hergestellt. Thus, rubrene was dissolved in toluene, and crosslinked albumin shells containing toluene / rubrene were prepared as described above by ultrasonic irradiation. Die entstandene milchige Suspension wurde fünfmal in normaler Salzlösung verdünnt. The resulting milky suspension was diluted five times in normal saline. Zwei Milliliter der verdünnten Suspension wurden dann während einer Zeitspanne von 10 Minuten in die Schwanzvene einer Ratte injiziert. Two milliliters of the diluted suspension was then injected over a period of 10 minutes in the tail vein of a rat. Ein Tier wurde eine Stunde nach der Injektion und ein anderes 24 Stunden nach der Injektion geopfert. One animal was sacrificed an hour after injection and another 24 hours after injection.
  • [0121] [0121]
    100 μm-Gefrierschnitte von Lunge, Leber, Niere, Milz und Knochenmark wurden unter einem Fluoresenzmikroskop auf das Vorhandensein von in der Polymerhülle eingeschlossenem Fluoreszenzfarbstoff oder freigesetztem Farbstoff untersucht. 100 micron frozen sections of lung, liver, kidney, spleen, and bone marrow were examined entrapped fluorescent dye or dye released under a Fluoresenzmikroskop for the presence of the polymer shell. Nach einer Stunde schien die Mehrzahl der polymeren Hüllen intakt zu sein (dh sie erschienen als hell fluoreszierende Partikel von ungefähr 1 μm Durchmesser) und befand sich in den Lungen und der Leber. After one hour, the majority of the polymeric shells appeared to be intact (ie, they appeared as brightly fluorescent particles of about 1 micron in diameter) and was located in the lungs and liver. Nach 24 Stunden wurde der Farbstoff in Leber, Lungen, Milz und Knochenmark beobachtet. After 24 hours, the dye was observed in liver, lungs, spleen and bone marrow. Eine allgemeine Färbung des Gewebes wurde ebenfalls beobachtet, was anzeigte, dass die Hüllenwand der Polymerhüllen sich aufgelöst hatte und der Farbstoff aus dem Inneren freigesetzt worden war. A general staining of the tissue was also observed, indicating that the shell wall of the polymeric shells had dissolved and the dye from the inside had been released. Dieses Ergebnis entsprach den Erwartungen und zeigt die mögliche Verwendung der Verbindungen der Erfindung für eine verzögerte oder kontrollierte Freisetzung eines eingeschlossen pharmazeutischen Mittels wie Taxol. This finding was in line with expectations and shows the possible use of the compounds of the invention for sustained or controlled release of an incorporated pharmaceutical agent such as taxol.
  • Beispiel 6 Example 6
  • Toxizität von polymeren Hüllen, die Sojabohnenöl (SBO) enthalten Included toxicity of polymeric shells containing soybean oil (SBO)
  • [0122] [0122]
    Polymere Hüllen, die Sojaöl enthalten, wurden zubereitet wie in Beispiel 1 beschrieben. Polymeric shells containing soybean oil were prepared as described in Example 1 is prepared. Die entstandene Suspension wurde in normaler Salzlösung verdünnt, um zwei unterschiedliche Lösungen herzustellen, eine mit 20% SBO und die andere mit 30% SBO. The resulting suspension was diluted in normal saline to produce two different solutions, one containing 20% SBO and the other containing 30% SBO.
  • [0123] [0123]
    Intralipid, ein im Handel erhältliches TPN-Mittel, enthält 20% SBO. Intralipid, a commercially available TPN agent, contains 20% SBO. Die LD 50 von Intralipid in Mäusen beträgt 120 ml/kg oder ungefähr 4 ml für eine Maus mit 30 g, wenn sie mit 1 cm 3 /min injiziert wird. The LD 50 of Intralipid in mice is 120 ml / kg, or about 4 ml for a 30 g mouse, when injected at 1 cm 3 / min.
  • [0124] [0124]
    Zwei Gruppen von Mäusen (drei Mäuse in jeder Gruppe; jede Maus mit einem Gewicht von ungefähr 30 g) wurden mit der SBO enthaltenden Zusammensetzung der Erfindung wie folgt behandelt. Two groups of mice (three mice in each group; each mouse weighing about 30 g) were treated with the SBO-containing composition of the invention as follows. Jeder Maus wurden 4 ml der vorbereiteten Suspension SBO enthaltender polymerer Hüllen injiziert. Each mouse was 4 ml of the prepared suspension injected SBO-containing polymeric shells. Jedes Mitglied der einen Gruppe erhielt die 20% SBO enthaltende Suspension, während jedes Mitglied der anderen Gruppe die 30% SBO enthaltende Suspension erhielt. Each member of one group received containing 20% SBO suspension, while each member of the other group received the suspension containing 30% SBO.
  • [0125] [0125]
    Alle drei Mäuse in der Gruppe, die die 20% SBO enthaltende Suspension erhielt, überlebten eine solche Behandlung und zeigten bei Beobachtung eine Woche nach der SBO-Behandlung keine starke Toxizität in irgendeinem Gewebe oder Organ. All three mice in the group receiving the suspension containing 20% SBO survived such treatment, and showed when observed one week after SBO treatment no gross toxicity in any tissues or organs. Lediglich eine der drei Mäuse der Gruppe, die die 30% SBO enthaltende Suspension erhielt, starb nach der Injektion. Only one of the three mice in the group receiving the suspension containing 30% SBO died after injection. Diese Ergebnisse belegen klar, dass Öl, das in polymeren Hüllen entsprechend der vorliegenden Erfindung enthalten ist, verglichen mit einer im Handel erhältlichen SBO-Zubereitung (Intralipid) bei seiner LD 50 -Dosis nicht toxisch ist. These results clearly demonstrate that oil contained within polymeric shells according to the present invention compared to a commercially available SBO formulation (Intralipid) 50 dose is not toxic at its LD. Diese Wirkung kann der langsamen Freisetzung (dh kontrollierte Rate bei der Bioverfügbarwerdung) des Öls aus dem Inneren der polymeren Hülle zugerechnet werden. This effect may be slow release (ie, controlled rate in Bioverfügbarwerdung) of the oil are allocated from the interior of the polymeric shell. Solch eine langsame Freisetzung verhindert das Erreichen einer tödlichen Dosis Öl, im Gegensatz zu den hohen Öl- Dosierungen, die mit handelsüblichen Emulsionen erzielt werden. Such slow release prevents the attainment of a lethal dose of oil, in contrast to the high oil dosages attained with commercially available emulsions.
  • Beispiel 7 Example 7
  • In-vivo-Bioverfügbarkeit von Sojaöl, das aus polymeren Hüllen freigesetzt wurde In vivo Bioavailability of Soybean oil, which was released from polymeric shells
  • [0126] [0126]
    Ein Versuch wurde durchgeführt, um die langsame oder verzögerte Freisetzung von in einer polymeren Hülle eingeschlossenem Material nach der Injektion einer Suspension von polymeren Hüllen in den Blutkreislauf von Ratten zu bestimmen. An experiment was performed to determine the slow or sustained release of entrapped in a polymeric shell material after the injection of a suspension of polymeric shells into the blood stream of rats. Vernetzte Protein-(Albumin)-ummantelte polymere Hüllen, die Sojabohnenöl (SBO) enthielten, wurden durch Beschallung, wie oben beschrieben, zubereitet. Crosslinked protein (albumin) -ummantelte polymeric shells containing soybean oil (SBO) were prepared by sonication as described above, prepared. Die sich ergebende Suspension aus Öl enthaltenden polymeren Hüllen wurde in Salzlösung auf eine Endsuspension verdünnt, die 20% Öl enthielt. The resulting suspension of oil-containing polymeric shells was diluted in saline to a final suspension containing 20% oil. Fünf Milliliter dieser Suspension wurden über einen Zeitraum von 10 Minuten in die kanülierte äußere Drosselvene von Ratten injiziert. Five milliliters of this suspension was injected over a period of 10 minutes into the cannulated external jugular vein of rats. Diesen Ratten wurde zu etlichen Zeitpunkten im Anschluss an die Injektion Blut entnommen und der Spiegel von Triglyceriden (Sojaöl ist überwiegend Triglycerid) im Blut durch Routine-Analysen bestimmt. These rats were collected at several time points following the injection and the blood levels of triglycerides (soybean oil is predominantly triglyceride) in the blood determined by routine analysis.
  • [0127] [0127]
    Fünf Milliliter einer im Handel erhältlichen Fett-Emulsion (Intralipid, ein wässriges parenterales Nahrungsmittel, das 20% Sojaöl, 1,2% Eigelb-Phospholipide und 2,25% Glycerin enthält) wurden als Kontrolle verwendet. (Contains Intralipid, an aqueous parenteral foods containing 20% soybean oil, 1.2% egg yolk phospholipids, and 2.25% glycerin) five milliliters of a commercially available fat emulsion used as a control. Die Kontrolle verwendet Ei-Phosphatid als Emulgator zur Stabilisierung der Emulsion. The control used egg phosphatide as an emulsifier to stabilize the emulsion. Ein Vergleich von Serumspiegeln der Triglyceride in den zwei Fällen würde einen direkten Vergleich der Bioverfügbarkeit des Öls als eine Funktion der Zeit geben. A comparison of serum levels of triglycerides in the two cases would give a direct comparison of the bioavailability of the oil as a function of time. Zusätzlich zur Suspension von 20% Öl enthaltenden Polymerhüllen wurden auch 5 ml einer Probe von Öl enthaltenden polymeren Hüllen in Salzlösung mit einer Endkonzentration von 30% Öl injiziert. In addition to the suspension of polymeric shells containing oil 20% were injected with a final concentration of 30% oil and 5 ml of a sample of oil-containing polymeric shells in saline. In jeder der drei Gruppen wurden zwei Ratten verwendet. In each of the three groups of two rats were used. Die Blutspiegel an Triglyceriden jedes Falles sind in Tabelle 3 aufgezeigt, angegeben in Einheiten von mg/dl. The blood levels of triglycerides of each case are shown in Table 3, given in units of mg / dl. Tabelle 3 Table 3
    GRUPPE GROUP SERUMTRIGLYCERIDE (mg/dl) Serum triglycerides (mg / dl)
    Vorher Before 1 Std. 1 hr. 4 Std. 4 hours. 24 Std. 24 hrs. 48 Std. 48 hrs. 72 Std. 72 hrs.
    Intralipid-Kontrolle (20% SBO) Intralipid control (20% SBO) 11,4 11.4 941,9 941.9 382,9 382.9 15,0 15.0 8,8 8.8 23,8 23.8
    Polymerhüllen (20% SBO) Polymer shells (20% SBO) 24,8 24.8 46,7 46.7 43,8 43.8 29,3 29.3 24,2 24.2 43,8 43.8
    Polymerhüllen (30% SBO) Polymer shells (30% SBO) 33,4 33.4 56,1 56.1 134,5 134.5 83,2 83.2 34,3 34.3 33,9 33.9
  • [0128] [0128]
    Blutspiegel vor Injektion werden in der mit "Vorher" bezeichneten Spalte angegeben. Blood levels before injection are shown in the column labeled "before". Es ist deutlich, dass sehr hohe Triglycerid-Spiegel im Anschluss an die Injektion bei der Intralipid-Kontrolle zu sehen sind. It is clear that very high triglyceride levels are seen following the injection in the Intralipid control. Es ist dann ersichtlich, dass die Triglycerid-Spiegel ungefähr 24 Stunden benötigen, um bis auf den Spiegel vor der Injektion abzufallen. It is then seen that the triglyceride levels require about 24 hours to decay down to the level before the injection. Somit ist ersichtlich, dass das Öl unverzüglich im Anschluss an die Injektion für den Stoffwechsel zur Verfügung steht. Thus it is seen that the oil is immediately after the injection for the metabolism available.
  • [0129] [0129]
    Die Suspension von Öl enthaltenden polymeren Hüllen, die die gleiche Menge an Gesamtöl wie Intralipid (20%) enthält, zeigt eine dramatisch andere Verfügbarkeit von nachweisbarem Triglycerid im Serum. The suspension of oil-containing polymeric shells containing the same amount of total oil as Intralipid (20%), shows a dramatically different availability of detectable triglyceride in the serum. Der Spiegel steigt auf ungefähr das Zweifache seines Normalwertes an und wird bei diesem Spiegel für viele Stunden gehalten, was eine langsame oder verzögerte Freisetzung von Triglycerid in das Blut bei recht nahe an die Norm reichenden Spiegeln zeigt. The level rises to about twice its normal value and is maintained at this level for many hours indicating a slow or delayed release of triglyceride in the blood at very close to reaching the standard mirrors. Die Gruppe, die Öl enthaltende Polymerhüllen mit 30% Öl erhielt, zeigt einen höheren Triglycerid-Spiegel (einhergehend mit der höheren verabreichten Dosis), der innerhalb von 48 Stunden auf den Normalstand fällt. The group receiving oil-containing polymeric shells having 30% oil shows a higher triglyceride levels (along with the higher dose) that falls on the normal level within 48 hours. Wiederum steigen die Blutspiegel an Triglycerid in dieser Gruppe nicht astronomisch, verglichen mit der Kontrollgruppe, die Intralipid erhielt. Turn increase the blood levels of triglyceride in this group are not astronomical, compared with the control group receiving Intralipid. Dies wiederum zeigt die langsame und anhaltende Verfügbarkeit des Öls der Zusammensetzung gemäß der Erfindung, was die Vorteile hat, gefährlich hohe Blutspiegel von Material, das in den polymeren Hüllen enthalten ist, zu vermeiden, sowie die Verfügbarkeit über einen ausgedehnten Zeitraum bei annehmbaren Spiegeln. This again shows the slow and sustained availability of the oil of the composition according to the invention, what are the benefits, dangerous to prevent high blood levels of material contained in the polymeric shells and availability over an extended period at acceptable levels. Klar ist, dass in polymeren Hüllen der vorliegenden Erfindung zugeführte Arzneimittel diese gleichen Vorteile erreichen würden. It is clear that these same benefits would reach in polymeric shells of the present invention administered drugs.
  • Beispiel 8 Example 8
  • Zubereitung vernetzter proteinummantelter Polymerhüllen, die einen festen Kern eines pharmazeutisch wirksamen Mittels enthalten Preparation of crosslinked protein coated polymeric shells containing a solid core of a pharmaceutically active agent
  • [0130] [0130]
    Ein weiteres Verfahren zur Verabreichung eines kaum wasserlöslichen Arzneimittels wie Taxol innerhalb einer polymeren Hülle ist die Herstellung einer Hülle aus polymerem Material um einen festen Arzneimittelkern. Another method for administration of a hardly water-soluble drug such as taxol within a polymeric shell is to produce a shell of polymeric material around a solid drug core. Solch ein "proteinummanteltes" Arzneimittel-Partikel kann wie folgt gewonnen werden. Such a "protein-coated" drug particles can be obtained as follows. Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wird unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wiederholt, um Taxol in einer verhältnismäßig hohen Konzentration zu lösen. The procedure described in Example 3 is repeated using an organic solvent to dissolve taxol at a relatively high concentration. Üblicherweise verwendete Lösungsmittel sind organische Verbindungen wie Benzol, Toluol, Hexan, Ethylether und dergleichen. Commonly used solvents are organic compounds such as benzene, toluene, hexane, ethyl ether and the like. Polymere Hüllen werden wie in Beispiel 3 hergestellt. Polymeric shells prepared as described in Example 3. Fünf Milliliter der milchigen Polymerhüllen-Suspension, die gelöstes Taxol enthalten, werden auf 10 ml in normaler Salzlösung verdünnt. Five milliliters of the milky suspension of polymeric shells containing dissolved taxol are diluted to 10 ml in normal saline. Diese Suspension wird in einen Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur gegeben, und die flüchtige organische Verbindung wird durch Vakuum entfernt. This suspension is placed in a rotary evaporator at room temperature, and the volatile organic compound is removed by vacuum. Nach ungefähr 2 Stunden im Rotationsverdampfer werden diese Polymerhüllen unter einem Mikroskop geprüft, um undurchsichtige Kerne zu zeigen, was die Entfernung von im Wesentlichen dem gesamten organischen Lösungsmittel und das Vorhandensein festen Taxols innerhalb einer Proteinhülle anzeigt. After about 2 hours in the rotary evaporator, these polymeric shells are examined under a microscope to reveal opaque cores, which makes the removal of substantially fixed throughout the organic solvent and the presence of taxol displays within a protein sheath.
  • [0131] [0131]
    Alternativ werden die Polymerhüllen mit Kernen aus organisches Lösungsmittel enthaltendem gelöstem Arzneimittel gefriergetrocknet, um ein trockenes, krümeliges Pulver zu erhalten, das in Salzlösung (oder anderer geeigneter Flüssigkeit) zum Zeitpunkt des Gebrauchs resuspendiert werden kann. Alternatively, the polymer shells are freeze-dried with cores of organic solvent containing dissolved drug in order to obtain a dry, crumbly powder in saline (or other suitable liquid) can be resuspended at time of use. Im Falle anderer Arzneimittel, die bei Raumtemperatur nicht im festen Zustand sein könnten, wird eine Polymerhülle mit einem flüssigen Kern gewonnen. In the case of other drugs that may not be in the solid state at room temperature, a polymer shell is recovered with a liquid core. Dieses Verfahren ermöglicht die Herstellung einer vernetzten proteinummantelten Hülle, die ein unverdünntes Arzneimittel enthält. This method enables the preparation of a crosslinked protein-coated envelope containing an undiluted drug. Die Analyse der Partikelgröße zeigt, dass diese polymeren Hüllen kleiner sind als jene, die Öl enthalten. The particle size analysis shows these polymeric shells that are smaller than those containing oil. Obwohl das derzeit bevorzugte Protein für die Verwendung in der Herstellung der polymeren Hülle Albumin ist, können andere Proteine wie α-2-Makroglobulin, ein bekanntes Opsonin, verwendet werden, um die Aufnahme der polymeren Hüllen durch makrophagenähnliche Zellen zu verbessern. Although the presently preferred protein for use in the production of the polymeric shell is albumin, other proteins such as α-2-macroglobulin, a known opsonin, be used to improve the uptake of the polymeric shells by macrophage-like cells. Alternativ dazu könnte ein PEG-Sulfhydryl (unten beschrieben) während der Bildung der polymeren Hülle hinzugefügt werden, um eine polymere Hülle mit erhöhter Zirkulationszeit in vivo herzustellen. Alternatively, a PEG-sulfhydryl (described below) can be added during the formation of the polymeric shell to produce a polymeric shell with increased circulation time in vivo.
  • Beispiel 9 Example 9
  • In-vivo-Zirkulation und Freisetzungskinetik der Polymerhüllen In vivo circulation and release kinetics of the polymer shells
  • [0132] [0132]
    Polymerhüllen mit festem Kern, die Taxol enthalten, wurden wie oben beschrieben bereitet (siehe z. B. Beispiel 3) und in normaler Salzlösung suspendiert. Polymer shells solid core containing taxol were prepared as described above (see, for. Example, Example 3) and suspended in normal saline. Die Taxol-Konzentration in der Suspension wurde wie folgt mittels HPLC gemessen. The taxol concentration in the suspension was measured by HPLC as follows. Zunächst wurde das Taxol in der Polymerhülle durch Zugabe von 0,1 M Mercaptoethanol freigesetzt (was den Austausch von Protein-Disulfid-Vernetzungen sowie das Zusammenbrechen der Vernetzung der Polymerhülle zur Folge hatte), dann wurde das freigesetzte Taxol mit Acetonitril aus der Suspension extrahiert. First, the taxol is released in the polymer shell by the addition of 0.1M mercaptoethanol (which is the exchange of protein disulfide crosslinkages, and the breakdown of the crosslinking of the polymer sheath a result had), then the liberated taxol was extracted with acetonitrile from the suspension. Die sich ergebende Mischung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde gefriergetrocknet. The resulting mixture was centrifuged, and the supernatant was freeze-dried. Das Lyophilisat wurde in Methanol gelöst und auf eine HPLC-Säule injiziert, um die Konzentration von Taxol in der Suspension zu bestimmen. The lyophilisate was dissolved in methanol and injected onto a HPLC column to determine the concentration of taxol in the suspension. Die Taxol-Konzentration wurde als ungefähr 1,6 mg/ml festgestellt. The taxol concentration was found to be about 1.6 mg / ml.
  • [0133] [0133]
    Ratten wurden durch einen Jugularkatheter 2 ml dieser Suspension injiziert. Rats were injected through a jugular catheter 2 ml of this suspension. Das Tier wurde nach zwei Stunden geopfert und die Menge an in der Leber vorhandenem Taxol durch HPLC bestimmt. The animal was sacrificed after two hours and the amount of taxol present in the liver by HPLC. Dies erforderte die Homogenisation der Leber, gefolgt von der Extraktion mit Acetonitril und Lyophilisierung des Überstandes im Anschluss an die Zentrifugierung. This required homogenization of the liver, followed by extraction with acetonitrile and lyophilization of the supernatant following the centrifugation. Das Lyophilisat wurde in Methanol gelöst und auf eine HPLC-Säule injiziert. The lyophilisate was dissolved in methanol and injected onto an HPLC column. Ungefähr 15% der verabreichten Taxol-Dosis wurden nach zwei Stunden von der Leber wiedergewonnen, was eine signifikante Dosierung an die Leber zeigt. Approximately 15% of the administered dose of taxol was recovered from the liver after two hours, indicating a significant dosage to the liver. Dieses Ergebnis stimmt mit der bekannten Funktion des retikuloendothelialen Systems der Leber hinsichtlich der Entfernung kleiner Partikel aus dem Blut überein. This result is consistent with the known function of the reticuloendothelial system of the liver with respect to the removal of small particles from the blood.
  • Beispiel 10 Example 10
  • Herstellung von vernetzten PEG-ummantelten polymeren Hüllen Preparation of Crosslinked PEG-coated polymeric shells
  • [0134] [0134]
    Als eine Alternative zur Verwendung von Thiol (Sulfhydryl) enthaltenden Proteinen bei der Bildung von oder als Additiv zu polymeren Hüllen der Erfindung wurde ein Thiol enthaltendes PEG hergestellt. As an alternative to the use of thiol (sulfhydryl) containing proteins in the formation of, or as an additive to polymeric shells of the invention, a thiol-containing PEG was prepared. PEG ist bekannt als nicht toxisch, nichtentflammbar, nichthaftend an Zellen und im Allgemeinen biologisch inert. PEG is known as a non-toxic, non-flammable, non-adhesive to cells and in general biologically inert. Es wurde an Proteine gebunden, um deren Antigenität zu reduzieren, und an Liposom bildende Lipide, um deren Zirkulationszeit in vivo zu erhöhen. It has been bound to proteins to reduce their antigenicity and to liposome forming lipids to increase their circulation time in vivo. Somit würde erwartet, dass der Einbau von PEG in eine vorwiegend aus Proteinen bestehende Hülle sowohl die Zirkulationszeit als auch die Stabilität der polymeren Hülle erhöht. Thus, it would be expected that the incorporation of PEG increased in a predominantly consisting of envelope proteins, both the circulation time and the stability of the polymeric shell. Durch Variieren der Konzentration von PEG-Thiol, das der 5%igen Albuminlösung hinzugefügt wurde, war es möglich, polymere Hüllen mit variierenden Stabilitäten in vivo zu gewinnen. By varying the concentration of PEG-thiol, which was added to the 5% albumin solution, it was possible to obtain polymeric shells with varying stabilities in vivo. PEG-Thiol wurde durch Arbeitsverfahren hergestellt, die in der Literatur zugänglich sind (wie das Verfahren von Harris und Herati, wie beschrieben in Polymer Preprints Vol. 32: 154–155 (1991)). PEG-thiol was prepared by working procedures, which are available in the literature (such as the method of Harris and Herati, as described in Polymer Preprints Vol. 32: 154-155 (1991)).
  • [0135] [0135]
    PEG-Thiol mit einem Molekulargewicht von 2000 g/mol wurde auf eine Konzentration von 1% (0,1 g wurden 10 ml hinzugefügt) in einer 5%igen Albuminlösung gelöst. PEG-thiol of molecular weight 2000 g / mol was adjusted to a concentration of 1% (0.1 g added to 10 ml) in a 5% albumin solution dissolved. Diese Protein/PEG-Lösung wurde mit Öl überschichtet, wie in Beispiel 1 beschrieben, und beschallt, um Öl enthaltende polymere Hüllen mit Wänden, die vernetztes Protein und PEG enthalten, herzustellen. This protein / PEG solution was overlayered with oil as described in Example 1 and sonicated to oil-containing polymeric shells with walls comprising crosslinked protein and PEG to manufacture. Diese polymeren Hüllen wurden auf Stabilität geprüft, wie in Beispiel 4 beschrieben. These polymeric shells were tested for stability as described in Example 4.
  • [0136] [0136]
    Andere synthetische wasserlösliche Polymere, die mit Thiol-Gruppen modifiziert werden können und anstelle von PEG verwendet werden könnten, schließen zum Beispiel Polyvinylalkohol, Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyacrylsäure, Polyethyloxazolin, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidinon, Polysaccharide (wie Chitosan, Alginate, Hyaluronsäure, Dextrane, Stärke, Pektin und dergleichen) und dergleichen ein. Other synthetic water-soluble polymers which may be modified with thiol groups and may be used in place of PEG include, for example polyvinyl alcohol, polyhydroxyethyl methacrylate, polyacrylic acid, polyethyloxazoline, polyacrylamide, polyvinyl pyrrolidinone, polysaccharides (such as chitosan, alginates, hyaluronic acid, dextrans, starch, pectin and the like) and the like.
  • [0137] [0137]
    Zum Beispiel wurden Fluorkohlenstoff enthaltende Proteinhüllen, die verlängerte Zirkulationszeiten in vivo haben, als besonders vorteilhaft zur Bildgebung des Gefäßsystems erkannt. For example, fluorocarbon-containing protein shells were having prolonged circulation times in vivo, recognized as particularly advantageous for imaging of the vascular system. Diese Hüllen verblieben für verlängerte Zeiträume innerhalb der Zirkulation, im Verhältnis zu Hüllen, die kein PEG in den Hüllenwänden enthielten. These shells remained within the circulation for extended periods, relative to shells not containing PEG in the shell walls. Dies erlaubte zum Beispiel die Sichtbarmachung der kardialen Zirkulation und stellte ein nicht invasives Mittel zur Beurteilung der Coronar-Zirkulation zur Verfügung, anstatt konventionelle invasive Verfahren, wie Angiographie, zu verwenden. This allowed, for example, the visualization of the cardiac circulation, and provided a non-invasive means of evaluating the coronary circulation is available, instead of using conventional invasive techniques such as angiography.
  • Beispiel 11 Example 11
  • Ausrichten immunsuppressiver Mittel auf transplantierte Organe unter Verwendung der intravenösen Zufuhr von polymeren Hüllen, die solche Mittel enthalten Aligning immunosuppressive agent on transplanted organs using the intravenous supply of polymeric shells containing such agents
  • [0138] [0138]
    Immunsuppressive Mittel werden ausgedehnt verwendet nach Organtransplantationen zur Vorbeugung von Abstoßungsvorfällen. Immunosuppressive agents are used extended after organ transplants to prevent rejection incidents. Insbesondere verlängert Cyclosporin, ein hochwirksames immunsuppressives Mittel, das Überleben von allogenen Transplantaten, einbegriffen Haut, Herz, Niere, Bauchspeicheldrüse, Knochenmark, Dünndarm und Lunge, in Tieren. In particular, extended Cyclosporine is a potent immunosuppressive agent, the survival of allogeneic transplants included skin, heart, kidney, pancreas, bone marrow, small intestine and lung in animals. Von Cyclosporin wurde gezeigt, dass es eine gewisse humorale Immunität und in noch größerem Maße zellvermittelte Reaktionen, wie die Abstoßung allogener Transplantate, verzögerte Überempfindlichkeit, experimentelle allergische Encephalomyelitis, Freund-Adjuvans-Arthritis und Graft-versus-Host-Reaktion bei vielen Tierarten hinsichtlich einer Vielzahl von Organen unterdrückt. Of cyclosporine has been shown that there is a certain humoral immunity and cell-mediated to a greater extent reactions such as allograft rejection, delayed hypersensitivity, experimental allergic encephalomyelitis, Freund's adjuvant arthritis, graft-versus-host disease in many animal species with respect to a Multiple organs suppressed. Erfolgreiche allogene Nieren-, Leber- und Herz- Transplantate wurden unter Verwendung von Cyclosporin an Menschen durchgeführt. Successful allogeneic kidney, liver and heart transplants were performed using cyclosporine in humans.
  • [0139] [0139]
    Cyclosporin wird derzeit oral verabreicht, entweder als Kapseln, die eine Lösung von Cyclosporin in Alkohol und Öle wie Maisöl, polyoxyethylierte Glyceride und dergleichen enthalten, oder als eine Lösung in Olivenöl, polyoxyethylierten Glyceriden und dergleichen. Cyclosporine is currently administered orally, either as capsules containing a solution of cyclosporine in alcohol, and oils such as corn oil, polyoxyethylated glycerides and the like, or as a solution in olive oil, polyoxyethylated glycerides and the like. Es wird auch durch intravenöse Injektion verabreicht, wobei es in einer Lösung aus Ethanol (ungefähr 30%) und Cremaphor (polyoxyethyliertes Rizinusöl) gelöst ist, die vor der Injektion in normaler Salzlösung oder 5% Dextrose im Verhältnis 1:20 bis 1:100 verdünnt werden muss. It is also administered by intravenous injection, wherein it is dissolved in a solution of ethanol (approximately 30%) and cremaphor (polyoxyethylated castor oil) which prior to injection in normal saline or 5% dextrose in a ratio of 1:20 to 1: 100 diluted must be. Verglichen mit einer intravenösen (iv) Infusion beträgt die absolute Bioverfügbarkeit der oralen Lösung ungefähr 30% (Sandoz Pharmaceutical Corporation, Publikation SDI-Z10 (A4), 1990). Compared to an intravenous (IV) infusion, the absolute bioavailability of the oral solution is approximately 30% (Sandoz Pharmaceutical Corporation, Publication SDI-Z10 (A4), 1990). Im Allgemeinen leidet die iv-Verabreichung von Cyclosporin unter ähnlichen Schwierigkeiten wie die derzeit praktizierte iv-Verabreichung von Taxol, dh anaphylaktischen und allergischen Reaktionen, von denen angenommen wird, dass sie auf das Cremaphor, das Transportmittel, das für die iv-Formulierung verwendet wird, zurückzuführen sind. In general, intravenous administration of cyclosporin under similar problems as the currently practiced suffers iv administration of taxol, ie, anaphylactic and allergic reactions, which are believed to point to the cremaphor, the means of transport, which is used for the iv formulation are due. Ferner verhindert die intravenöse Zufuhr von Arzneimitteln (z. B. Cyclosporik), eingekapselt wie hierin beschrieben, gefährliche Spitzen-Blutspiegel unmittelbar nach der Arzneimittelgabe. In addition, the intravenous delivery of drugs (such. As Cyclosporik) prevents encapsulated as described herein, dangerous peak blood levels immediately after drug administration. Zum Beispiel zeigte ein Vergleich von derzeit erhältlichen Formulierungen für Cyclosporin mit der oben beschriebenen eingekapselten Form von Cyclosporin eine fünffache Abnahme der Spitzen-Blutspiegel von Cyclosporin unmittelbar nach der Injektion. For example, a comparison of currently available formulations for cyclosporine with the above described encapsulated form of cyclosporine a five-fold decrease in peak blood levels of cyclosporine immediately after injection.
  • [0140] [0140]
    Um Schwierigkeiten im Zusammenhang mit Cremaphor zu vermeiden, kann Cyclosporin, das in Polymerhüllen, wie oben beschrieben, enthalten ist, durch iv-Injektion verabreicht werden. To avoid difficulties associated with Cremaphor, cyclosporine, which is contained in polymer shells, as described above, can be administered by iv injection. Es kann in einem biokompatiblen Öl oder einer Reihe anderer Lösungsmittel gelöst werden, woraufhin es durch Beschallung in polymere Hüllen dispergiert werden kann, wie oben beschrieben. It can be dissolved in a biocompatible oil or a number of other solvents, whereupon it may be dispersed into polymeric shells by sonication as described above. Zusätzlich hat die Verabreichung von Cyclosporin (oder anderer immunsuppressiver Mittel) in polymeren Hüllen den Vorteil des lokalen Targetings wegen der Aufnahme des injizierten Materials in die Leber durch das RES-System. In addition, the administration of cyclosporine (or other immunosuppressive agent) in polymeric shells has the advantage of local targeting due to the absorption of the injected material in the liver by the RES system. Dies kann bis zu einem gewissen Ausmaß systemische Toxizität verhindern und wirkungsvolle Dosierungen aufgrund des lokalen Targetings reduzieren. This can to some extent prevent systemic toxicity and reduce effective dosages due to the local targeting. Die Wirksamkeit der Verabreichung und des Targetings des in Polymerhüllen enthaltenen Taxols an die Leber nach der intravenösen Injektion ist in Beispiel 9 gezeigt. The efficacy of administration, and the targeting of taxol contained in polymeric shells to the liver following intravenous injection is demonstrated in Example 9. Ein ähnliches Ergebnis würde erwartet hinsichtlich der Verabreichung von Cyclosporin (oder anderer mutmaßlich immunsuppressiver Mittel) entsprechend der vorliegenden Erfindung. A similar result would be expected with regard to the administration of cyclosporine (or other putative immunosuppressive agent) in accordance with the present invention.
  • Beispiel 12 Example 12
  • Antikörper-Targeting von polymeren Hüllen Antibody targeting of polymeric shells
  • [0141] [0141]
    Die Natur der polymeren Hüllen der Erfindung erlaubt das Anheften monoklonaler oder polyklonaler Antikörper an die polymere Hülle oder den Einbau von Antikörpern in die Polymerhülle. The nature of the polymeric shells of the invention allows the attachment of monoclonal or polyclonal antibodies to the polymeric shell, or the incorporation of antibodies into the polymeric shell. Antikörper können in die polymere Hülle eingebaut werden, wenn die polymere Mikrokapsel-Hülle gebildet wird, oder Antikörper können an die polymere Mikrokapsel-Hülle nach deren Herstellung angeheftet werden. Antibodies can be incorporated into the polymeric shell as the polymeric microcapsule shell is formed, or antibodies can be attached to the polymeric microcapsule shell after preparation thereof. Standard-Protein-Immobilisierungsverfahren können für diesen Zweck angewandt werden. Standard protein immobilization may be used for this purpose. Zum Beispiel steht mit Protein-Mikrokapseln, die aus einem Protein, wie Albumin, hergestellt werden, eine große Zahl von Aminogruppen auf den Albumin-Lysin-Resten für das Anhängen von geeignet modifizierten Antikörpern zur Verfügung. For example, stands with protein microcapsules, which are prepared from a protein such as albumin, a large number of amino groups on the albumin lysine residues for the attachment of suitably modified antibodies are available. Als ein Beispiel können Anti-Tumormittel einem Tumor zugeführt werden durch Einschluss von Antikörpern gegen den Tumor in die polymere Hülle, während sie gebildet wird, oder es können Antikörper gegen den Tumor an die polymere Mikrokapselhülle nach deren Herstellung angehängt werden. As an example, antitumor agents can be delivered to a tumor by incorporating antibodies against the tumor into the polymeric shell as it is being formed, or antibodies against the tumor to the polymeric microcapsule shell after preparation thereof are appended. Als ein weiteres Beispiel können Genprodukte speziellen Zellen zugeführt werden (z. B. Hepatozyten oder bestimmten Stammzellen im Knochenmark) durch Einbau von Antikörpern gegen Rezeptoren auf den Zielzellen in die Polymerhülle, während sie gebildet wird, oder Antikörper gegen Rezeptoren auf den Zielzellen können an die polymere Mikrokapselhülle nach deren Herstellung angehängt werden. As another example, gene products can special cells are fed (eg., Hepatocytes or certain stem cells in the bone marrow) by incorporating antibodies against receptors on the target cells in the polymer shell as it is formed, or antibodies to receptors on the target cells to the polymeric microcapsule shell is appended after the connection. Zusätzlich können monoklonale Antikörper gegen Kernrezeptoren verwendet werden, um das eingekapselte Produkt zielgenau auf den Nukleus bestimmter Zelltypen zu richten. In addition, monoclonal antibodies against nuclear receptors can be used to judge the encapsulated product precisely to the nucleus of certain cell types.
  • Beispiel 13 Example 13
  • Polymere Hüllen als Träger für Polynukleotidkonstrukte, Enzyme und Vakzine Cases polymers as carriers for polynucleotide, enzymes and vaccines
  • [0142] [0142]
    Mit zunehmender Akzeptanz der Gentherapie als eine durchführbare therapeutische Option (derzeit wurden mehr als 40 Vorschläge zum menschlichen Gen-Transfer von NIH- und/oder FDA-Prüfungsausschüssen angenommen) ist eine der zu überwindenden Barrieren bei der Einführung dieses therapeutischen Ansatzes die Abneigung, virale Vektoren für den Einbau genetischen Materials in das Genom einer menschlichen Zelle zu verwenden. With the increasing acceptance of gene therapy as a viable therapeutic option (currently more than 40 proposals for human gene transfer from NIH and / or FDA audit committees were adopted) is one of the to be overcome barriers to the introduction of this therapeutic approach aversion, viral vectors to be used for the incorporation of genetic material into the genome of a human cell. Viren sind schon an sich toxisch. Viruses are toxic in itself. Somit sind die Risiken, die die Verwendung viraler Vektoren in der Gentherapie mit sich bringt, insbesondere für die Behandlung von nicht lebensbedrohlichen, nicht erblich bedingten Krankheiten inakzeptabel. Thus, the risks associated with the use of viral vectors in gene therapy with, in particular for the treatment of non-life threatening, non-hereditary diseases are unacceptable. Leider werden Plasmide, die ohne Verwendung eines viralen Vektors übertragen werden, üblicherweise nicht in das Genom der Zielzelle eingebaut. Unfortunately, plasmids transferred without the use of a viral vector, usually not incorporated into the genome of the target cell. Ferner haben solche Plasmide, wie konventionelle Arzneimittel, eine begrenzte Halbwertszeit im Körper. Also have such plasmids, as conventional drug, a limited half-life in the body. Somit war eine generelle Begrenzung der Einführung einer Gentherapie (wie auch Antisense-Therapie, die eine Umkehrform der Gentherapie ist, bei der eine Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid eingeführt wird, um eine Genexpression zu hemmen) die Unmöglichkeit, Nukleinsäuren oder Oligonukleotide wirksam zuzuführen, die zu groß sind, um die Zellmembran zu durchdringen. Thus, it was a general limitation to the introduction of a gene therapy (as well as antisense therapy, which is a reverse form of gene therapy, wherein a nucleic acid or oligonucleotide is introduced to inhibit gene expression) the impossibility of nucleic acids or oligonucleotides supply effective to are large to permeate the cell membrane.
  • [0143] [0143]
    Die Einkapselung von DNA, RNA, Plasmiden, Oligonukleotiden, Enzymen und dergleichen in Protein-Mikrokapselhüllen, wie hierin beschrieben, kann ihre gezielte Zufuhr an die Leber, die Lunge, die Milz, die Lymphe und das Knochenmark erleichtern. The encapsulation of DNA, RNA, plasmids, oligonucleotides, enzymes and the like into protein microcapsule shells as described herein can facilitate their targeted delivery to the liver, lungs, spleen, lymph and bone marrow. Somit können solche biologischen Mittel entsprechend der vorliegenden Erfindung intrazellulären Orten zugeführt werden, ohne die begleitende Gefahr, die mit der Verwendung viraler Vektoren verbunden ist. Thus, such biological agents according to the present invention, intracellular locations, can be fed, without the attendant risk associated with the use of viral vectors. Diese Art der Formulierung erleichtert die nicht-spezifische Aufnahme oder Endozytose der polymeren Hüllen direkt aus dem Blutstrom in die Zellen des RES, in Muskelzellen durch intramuskuläre Injektion, oder durch direkte Injektion in Tumoren. This type of formulation facilitates the non-specific uptake or endocytosis of the polymeric shells directly from the blood stream into the cells of the RES in muscle by intramuscular injection or by direct injection into tumors. Ferner können monoklonale Antikörper gegen Kernrezeptoren verwendet werden, um das eingekapselte Produkt auf den Nukleus bestimmter Zelltypen zu richten. Furthermore, monoclonal antibodies against nuclear receptors can be used to judge the encapsulated product to the nucleus of certain cell types.
  • [0144] [0144]
    Krankheiten, die von solchen Konstrukten zum Ziel genommen werden können, schließen Diabetes, Hepatitis, Hämophilie, zystische Fibrose, multiple Sklerose, Krebserkrankungen im Allgemeinen, Grippe, AIDS und dergleichen ein. Diseases that can be taken by such constructs to target include diabetes, hepatitis, hemophilia, cystic fibrosis, multiple sclerosis, cancers in general, flu, AIDS and the like. Zum Beispiel kann das Gen des insulinähnlichen Wachstumsfaktors (IGF I) in Protein-Mikrokapselhüllen eingekapselt werden zur Verabreichung bei der Behandlung von diabetischer peripherer Neuropathie und Kachexie. For example, the gene of insulin-like growth factor (IGF I) can be encapsulated into protein microcapsule shells for administration in the treatment of diabetic peripheral neuropathy and cachexia. Die Gene, die Faktor IX und Faktor VIII kodieren (nützlich für die Behandlung von Hämophilie), können auf die Leber gerichtet werden durch Einkapselung in Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung. The genes encoding Factor IX and Factor VIII (useful for the treatment of hemophilia) can be directed to the liver by encapsulation into protein microcapsule shells of the present invention. Ähnlich kann das Gen für den Low-Density-Lipoprotein-(LDL-)Rezeptor auf die Leber gerichtet werden zur Behandlung der Atherosklerose durch Einkapselung in Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung. Similarly, the gene for the low density lipoprotein (LDL) receptor can be targeted to the liver for treatment of atherosclerosis by encapsulation into protein microcapsule shells of the present invention.
  • [0145] [0145]
    Andere Gene, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind Gene, die die Immunantwort des Körpers gegen Kebszellen restimulieren. Other genes useful in the practice of the present invention, genes restimulate the immune response of the body against Kebszellen are. Zum Beispiel können Antigene, wie HLA-B7, kodiert durch eine in einem Plasmid enthaltene DNA, in eine Protein-Mikrokapselhülle der vorliegenden Erfindung eingebaut werden zur Injektion direkt in einen Tumor (wie einen Hautkrebs). For example, antigens such as HLA-B7, encoded by DNA contained in a plasmid, can be incorporated into a protein microcapsule shell of the present invention for injection directly into a tumor (such as a skin cancer). Einmal im Tumor, wird das Antigen für den Tumor spezifische Zellen rekrutieren, die den Spiegel von Zytokinen (z. B. IL-2) anheben, die den Tumor zum Ziel für einen Angriff des Immunsystems machen. Once a tumor antigen for tumor specific cells will recruit, raise the levels of cytokines (eg., IL-2), which make the tumor a target for an attack by the immune system.
  • [0146] [0146]
    Als ein weiteres Beispiel sind Plasmide, die Teile des adeno-assoziierten Virusgenoms enthalten, zur Einkapselung in Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung vorgesehen. As another example, plasmids containing portions of the adeno-associated virus genome, provided for encapsulation into protein microcapsule shells of the present invention. Zusätzlich können Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um therapeutische Gene zu CD8+ T-Zellen zu bringen für eine ergriffene Immuntherapie gegen eine Vielzahl von Tumoren und Infektionskrankheiten. In addition, protein microcapsule shells of the present invention can be used to bring therapeutic genes to CD8 + T-cells for a taken immunotherapy against a variety of tumors and infectious diseases.
  • [0147] [0147]
    Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung können ebenso verwendet werden als ein Verabreichungssystem im Kampf gegen Infektionskrankheiten über die gezielte Zufuhr eines Antisense-Nukleotids, zum Beispiel gegen das Hepatitis-B-Virus. Protein microcapsule shells of the present invention can also be used as a delivery system in the fight against infectious diseases via the targeted delivery of an antisense nucleotide, for example, against the hepatitis B virus. Ein Beispiel solch eines Antisense-Oligonukleotids ist ein 21-mer Phosphorothioat gegen das Polyadenylierungssignal des Hepatitis-B-Virus. An example of such an antisense oligonucleotide is a 21-mer phosphorothioate against the polyadenylation signal of the hepatitis B virus.
  • [0148] [0148]
    Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung können auch zur Verabreichung des Zystische-Fibrose-Transmembran-Regulator-(CFTR-)Gens verwendet werden. Protein microcapsule shells of the present invention can also be used for administration of the cystic fibrosis transmembrane Regulator (CFTR) gene. Menschen, denen dieses Gen fehlt, entwickeln zystische Fibrose, die durch Zerstäuben von Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung, die das CFTR-Gen enthalten, und direkte Inhalation in die Lungen behandelt werden kann. People lacking this gene develop cystic fibrosis, which can be treated by spraying protein microcapsule shells of the present invention containing the CFTR gene, and inhaling directly into the lungs.
  • [0149] [0149]
    Enzyme können unter Verwendung der Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung ebenfalls verabreicht werden. Enzymes can be administered using the protein microcapsule shells of the present invention also. Zum Beispiel kann das Enzym DNase eingekapselt und der Lunge zugeführt werden. For example, the enzyme may be encapsulated DNase and the lungs are supplied. Ähnlich können Ribozyme eingekapselt werden und auf Virus-Hüllproteine oder virusinfizierte Zellen gerichtet werden, indem geeignete Antikörper an das Äußere der polymeren Hülle angeheftet werden. Similarly, ribozymes can be encapsulated and will be directed to virus envelope proteins or virus-infected cells by applying appropriate antibodies are attached to the exterior of the polymeric shell. Impfstoffe können ebenso in polymere Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung eingekapselt werden und zur subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Verabreichung verwendet werden. Vaccines can also be encapsulated into polymeric microcapsules of the present invention and used for subcutaneous, intramuscular or intravenous administration.
  • Beispiel 14 (Vergleichsbeispiel) Example 14 (Comparative Example)
  • Herstellung von unlöslichen Hämoglobin-Konstrukten (IHC) zur Verwendung als Ersatzstoff für rote Blutzellen Preparation of insoluble hemoglobin constructs (IHC) for use as a substitute for red blood cells
  • [0150] [0150]
    Eine 20-ml-Glas-Reaktionszelle, Titanhorn und Kragen wurden vor der Synthese mit Alkohol und steriler Salzlösung gewaschen, wie auch die gesamte verwendete Ausrüstung. A 20 ml glass reaction cell, titanium horn and collar were washed with alcohol before the synthesis and sterile saline, as well as all equipment used. In einer typischen Reaktion wurden 3,5 ml Hämoglobin (menschliches oder vom Rind) mit 5 Gew.-% pro Volumeneinheit zu einer Reaktionszelle hinzugefügt, die an das Ultraschallhorn angeschlossen war (Heat Systems XL2020, 20 kHz, 400 W Maximalleistung). In a typical reaction, 3.5 ml of hemoglobin (human or bovine) was added with 5 wt .-% per unit volume to a reaction cell which was attached to the ultrasonic horn (Heat Systems XL2020, 20 KHz, 400 W maximum power). Das Horn und die Zelle wurden dann in ein temperaturkontrolliertes Bad getaucht, dessen Temperatur auf 55°C eingestellt war. The horn and cell were then submerged in a temperature controlled bath, whose temperature was set at 55 ° C. Reaktionen, die bei 55°C durchgeführt wurden, schienen optimal, jedoch kann das Produkt in einem breiten Temperaturbereich (0 bis 80°C) synthetisiert werden. Reactions were performed at 55 ° C seemed optimal, however, the product can be used in a wide temperature range are synthesized (from 0 to 80 ° C). Der pH-Wert betrug 6,8. The pH was 6.8. Die Temperaturkontrolle ist entscheidend für hohe Materialerträge, und die optimale Temperatur hängt von der spezifischen Konfiguration des Experiments ab. The temperature control is critical to high material yield, and the optimum temperature depends on the specific configuration of the experiment. Die Ultraschallquelle schaltete sich bei einer Leistungseinstellung von 7 ein. The ultrasonic source chimed in at a power setting of 7. Das Nomogramm des Herstellers empfahl eine Ausgangsleistung von ungefähr 150 W/cm 2 . The manufacturer's nomogram recommended an output power of about 150 W / cm 2. Die Reaktion ist nach ungefähr 30 Sekunden abgeschlossen. The reaction is finished after about 30 seconds. Erträge bei kürzeren oder längeren Reaktionszeiten scheinen geringer zu sein. Yields in shorter or longer reaction times appear to be lower. Für das Rinder-Hämoglobin wurde die Lösung mit 2,5 Gew.-% pro Volumeneinheit durch eine Sephadex-G-25-Gel-Permeationssäule geschleust, um sämtliche Anionen, wie Phosphate, zu entfernen. For bovine hemoglobin, the solution was wt .-% per unit volume of 2.5 funneled through a Sephadex G-25 gel-permeation column to remove any anions such as phosphates. In einer typischen Synthese von menschlichem Hämoglobin-IHC wurde das Ultraschallhorn an der Luft/Wasser-Grenzfläche positioniert. In a typical synthesis of human hemoglobin IHC, the ultrasonic horn was positioned at the air / water interface. Die hergestellte homogene Suspension enthält proteinöse rote Blutzellen. The homogeneous suspension produced contains proteinaceous red blood cells. Die wässrige Suspension kann dann in einem sterilen Behälter bei 4°C gelagert werden. The aqueous suspension may then be stored in a sterile container at 4 ° C.
  • [0151] [0151]
    Eine typische Reaktion ergibt eine Lösung, die ungefähr 3 × 10 8 IHC-Hüllen je Milliliter enthält mit einem durchschnittlichen Hüllendurchmesser von 3 μm und einer Standardabweichung von 1 μm. A typical reaction yields a solution that contains approximately 3 X 10 8 IHC shells per ml with an average shell diameter of 3 microns and a standard deviation of 1 micron. Dieses synthetische Verfahren ergibt hohe Konzentrationen von Biomaterial in Mikrometergrößen mit engen Größenverteilungen. This synthetic procedure yields high concentrations of biomaterial micron sizes with narrow size distributions.
  • [0152] [0152]
    Nach der Synthese verbleiben die IHC als eine Suspension in der natürlichen Proteinlösung. After synthesis, the IHC remain as a suspension in the native protein solution. Um das IHC von dem nicht umgesetzten Protein zu trennen, wurden etliche Verfahren angewandt: Filtration, Zentrifugieren und Dialyse. To separate the IHC from the unreacted protein, several methods were used: filtration, centrifugation and dialysis. Das erste Verfahren schloss das Filtern der Mischung durch einen Anotop-Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm im Durchmesser (Whatman, Inc.) ein. The first method castle filtering the mixture through a Anotop syringe filter with a pore size of 0.2 microns in diameter (Whatman, Inc.). Der Filter wurde mit etlichen Volumen Wasser gewaschen, bis das Filtrat sehr wenig oder kein Protein enthielt (wie mittels UV-VIS-Spektroskopie festgestellt). The filter was washed with several volumes of water until the filtrate contained very little or no protein (as determined by UV-VIS spectroscopy). Die IHC wurden aus dem Filter "rückgewaschen" und in einem äquivalenten Volumen Salzlösung resuspendiert. The IHC were prepared from the filter "backwashed" and resuspended in an equivalent volume of saline. Das zweite Reinigungsverfahren bezog die Verwendung eines Centricon-Zentrifugenfilters mit einem Molekulargewichtsrückhaltevermögen von 100 Kilodalton (kD) ein. The second purification procedure involved the use of a Centricon centrifugal filter with a molecular weight cut-off of 100 kilodaltons (kD). Der Zentrifugenfilter ist ein Zentrifugenröhrchen, das durch eine Filtermembran in der Mitte abgetrennt ist. The centrifuge filter is a centrifuge tube separated by a filtration membrane in the middle. Das Zentrifugieren der IHC-Lösung bei 1000 G für die Dauer von 5 Minuten ermöglichte, dass das meiste des nicht umgesetzten Hämoglobins (64,5 kD) die Membran passieren konnte. Centrifugation of the IHC solution at 1000 G for a period of 5 minutes allowed that most of the unreacted hemoglobin (64.5 kD) could pass through the membrane. Schließlich wurde auch Dialyse mit einer Membran für hohes Molekulargewicht (300 kD) verwendet, um das IHC zu reinigen. Finally, dialysis with a membrane of high molecular weight (300 kD) was used to purify the IHC. Jedoch benötigte dieses Verfahren ungefähr zwei Dialyse-Tage. However, this process took approximately two dialysis days. Das bevorzugte Verfahren zur Reinigung des IHC ist das der Centricon-Zentrifugation. The preferred method of purification of the IHC is the Centricon centrifugation.
  • Beispiel 15 (Vergleichsbeispiel) Example 15 (Comparative Example)
  • Herstellung eines unlöslichen Hämoglobin/Albumin-Konstrukts (IHAC) als Ersatz für rote Blutzellen Preparation of an insoluble hemoglobin / albumin construct (IHAC) as a substitute for red blood cells
  • [0153] [0153]
    Eine 20-ml-Glas-Reaktionszelle, Titanhorn und Kragen wurden vor der Synthese mit Alkohol und steriler Salzlösung gewaschen, wie auch die gesamte verwendete Ausrüstung. A 20 ml glass reaction cell, titanium horn and collar were washed with alcohol before the synthesis and sterile saline, as well as all equipment used. In einer typischen Reaktion wurden 3,5 ml Hämoglobin und Albumin (menschliches oder vom Rind; das Hämoglobin/Albumin-Verhältnis schwankte von 0,5 bis 2) mit 5 Gew.-% pro Volumeneinheit in eine Reagenzzelle gegeben, die an ein Ultraschallhorn angeschlossen war (Heat Systems XL2020, 20 KHz, 400 W Maximalleistung). In a typical reaction, 3.5 ml of hemoglobin and albumin (human or bovine, hemoglobin / albumin ratio varied from 0.5 to 2) was added with 5 wt .-% per unit volume in a reagent cell, which is connected to an ultrasonic horn was (Heat Systems XL2020, 20 KHz, 400 W maximum power). Das Horn und die Zelle wurden dann in ein temperaturkontrolliertes Bad mit einer auf 55°C eingestellten Temperatur getaucht. The horn and cell were then immersed in a temperature-controlled bath at a temperature set at 55 ° C. Reaktionen, die bei 55°C durchgeführt wurden, erschienen optimal, jedoch kann das Produkt in einem breiten Temperaturbereich synthetisiert werden (0 bis 80°C). Reactions were performed at 55 ° C appeared optimal, however, the product can be synthesized over a wide temperature range (0 to 80 ° C). Der pH-Wert betrug 6,8. The pH was 6.8. Die Temperaturkontrolle ist entscheidend für hohe Materialerträge, und die optimale Temperatur hängt von der spezifischen Konfiguration des Experiments ab. The temperature control is critical to high material yield, and the optimum temperature depends on the specific configuration of the experiment. Die Ultraschallquelle schaltete sich bei einer Leistungseinstellung von 7 ein. The ultrasonic source chimed in at a power setting of 7. Das Nomogramm des Herstellers empfahl eine Ausgangsleistung von ungefähr 150 W/cm 2 . The manufacturer's nomogram recommended an output power of about 150 W / cm 2. Die Reaktion ist nach ungefähr 30 Sekunden abgeschlossen. The reaction is finished after about 30 seconds. Erträge bei kürzeren und längeren Reaktionszeiten scheinen geringer zu sein. Income at shorter and longer reaction times appear to be lower. Die hergestellte homogene Suspension enthält den proteinösen Ersatzstoff für rote Blutzellen. The homogeneous suspension produced contains the proteinaceous red blood cell substitute. Die wässrige Suspension wurde gefiltert, gewaschen, in steriler gepufferter Salzlösung resuspendiert und in einem sterilen Behälter bei 4°C gelagert. The aqueous suspension was filtered, washed, resuspended in sterile buffered saline and stored in a sterile container at 4 ° C.
  • [0154] [0154]
    Wiederum, wie oben beschrieben, ergibt eine typische Reaktion eine Lösung, die grob geschätzt 10 8 Hüllen je Milliliter enthält mit einem durchschnittlichen Hüllendurchmesser von 3 μm und einer Standardabweichung von 1 μm. Again, as described above, a typical reaction yields a solution roughly 10 8 shells per milliliter contains an average shell diameter of 3 microns and a standard deviation of 1 micron. Dieses synthetische Verfahren ergibt hohe Konzentrationen von Biomaterial in Mikrometergrößen mit engen Größenverteilungen. This synthetic procedure yields high concentrations of biomaterial micron sizes with narrow size distributions.
  • [0155] [0155]
    Als Alternative kann ein Durchfluss-System verwendet werden, das die kontinuierliche Bearbeitung des IHC ermöglicht. Alternatively, a flow-through system may be used which allows for the continuous processing of the IHC. Solch ein System besteht aus peristaltisch arbeitenden Pumpen, die kontinuierlich Ströme aus Hämoglobin und wahlweise einem biokompatiblen Öl oder Fluorkohlenstoff in ein Reagenzgefäß mit einer Beschallungssonde pumpen. Such a system consists of peristaltic working pumps that continuously flows from hemoglobin and optionally a biocompatible oil or fluorocarbon into a reagent vessel with a sonicator probe. Eine geeignete Verweildauer wird im Gefäß beibehalten und das IHC durch Überlauf vom Gefäß in einen Rückgewinnungstank wiedergewonnen. A suitable residence time is maintained in the vessel and the IHC recovered by overflow from the vessel into a recovery tank. Die nicht umgesetzte Hämoglobinlösung wird in das Reagenzgefäß zurückgeführt. The unreacted hemoglobin solution is recycled into the reagent vessel.
  • Beispiel 16 (Vergleichsbeispiel) Example 16 (Comparative Example)
  • Herstellung unlöslicher Hämoglobin-Konstrukte, die eingekapselte Fluorkohlenstoffe enthalten Include the preparation of insoluble hemoglobin constructs containing encapsulated fluorocarbons
  • [0156] [0156]
    Eine 20-ml-Glas-Reaktionszelle, Titanhorn und Kragen wurden vor der Synthese mit Alkohol und steriler Salzlösung gewaschen, wie auch die gesamte verwendete Ausrüstung. A 20 ml glass reaction cell, titanium horn and collar were washed with alcohol before the synthesis and sterile saline, as well as all equipment used. In einer typischen Reaktion wurden 3,5 ml eines Hämoglobins (menschliches oder vom Rind) mit 5 Gew.-% pro Volumeneinheit in eine Reagenzzelle gegeben, die an das Ultraschallhorn (Heat Systems XL2020, 20 kHz, 400 W Maximalleistung) angeschlossen wurde. In a typical reaction, 3.5 ml of hemoglobin was added (human or bovine) with 5 wt .-% per unit volume of a reagent cell in which to the ultrasonic horn (Heat Systems XL2020, 20 KHz, 400 W maximum power) has been connected. 3,5 ml eines Fluorkohlenstoffes, Perfluordecalin, wurden in das Reagenzgefäß gegeben. 3.5 ml of a fluorocarbon, perfluorodecalin were placed in the reagent vessel. Das Horn und die Zelle wurden dann in ein temperaturkontrolliertes Bad mit einer auf 20°C eingestellten Temperatur getaucht. The horn and cell were then immersed in a temperature-controlled bath at a temperature set at 20 ° C. Der pH-Wert der wässrigen Phase betrug 6,8. The pH of the aqueous phase was 6.8. Die Ultraschallquelle schaltete sich bei einer Leistungseinstellung von 7 ein. The ultrasonic source chimed in at a power setting of 7. Das Nomogramm des Herstellers empfahl eine Ausgangsleistung von ungefähr 150 W/cm 2 . The manufacturer's nomogram recommended an output power of about 150 W / cm 2. Die Reaktion ist nach ungefähr 30 Sekunden abgeschlossen. The reaction is finished after about 30 seconds. Die hergestellte homogene Suspension enthält die Mikrokapseln oder Mikrokugeln von vernetzten unlöslichen Hämoglobinhüllen mit eingekapseltem Perfluordecalin im Innern. The homogeneous suspension produced contains the microcapsules or microspheres of crosslinked insoluble hemoglobin shells with encapsulated perfluorodecalin in the interior. Die milchige Suspension wird, wie oben, gefiltert, gewaschen, in steriler gepufferter Salzlösung resuspendiert und in einem sterilen Behälter bei 4°C gelagert. The milky suspension is, as above, filtered, washed, resuspended in sterile buffered saline and stored in a sterile container at 4 ° C.
  • [0157] [0157]
    Wiederum, wie oben beschrieben, ergibt eine typische Reaktion eine Lösung, die grob 10 8 Hüllen je Milliliter enthält mit einem durchschnittlichen Hüllendurchmesser von 3 μm und einer Standardabweichung von 1 μm. Again, as described above, typical reaction yields a solution that contains roughly 10 8 shells per ml with an average shell diameter of 3 microns and a standard deviation of 1 micron. Dieses Syntheseverfahren ergibt hohe Konzentrationen von Biomaterial in Mikrometergrößen mit engen Größenverteilungen. This synthesis method results in high concentrations of biomaterial micron sizes with narrow size distributions.
  • Beispiel 17 (Vergleichsbeispiel) Example 17 (Comparative Example)
  • Herstellung von unlöslichen Albumin-Konstrukten, die eingekapselte Fluorkohlenstoffe enthalten Include the preparation of insoluble Albumin constructs, the encapsulated fluorocarbons
  • [0158] [0158]
    Eine 20-ml-Glas-Reaktionszelle, Titanhorn und Kragen wurden vor der Synthese mit Alkohol und steriler Salzlösung gewaschen, wie auch die gesamte verwendete Ausrüstung. A 20 ml glass reaction cell, titanium horn and collar were washed with alcohol before the synthesis and sterile saline, as well as all equipment used. In einer typischen Reaktion wurden 3,5 ml Albumin (menschliches oder vom Rind) mit 5 Gew.-% pro Volumeneinheit in eine Reaktionszelle gegeben, die an das Ultraschallhorn angeschlossen war (Heat Systems XL2020, 20 kHz, 400 W Maximalleistung). In a typical reaction, 3.5 ml of albumin was added (human or bovine) with 5 wt .-% per unit volume in a reaction cell which was attached to the ultrasonic horn (Heat Systems XL2020, 20 KHz, 400 W maximum power). 3,5 ml eines Fluorkohlenstoffes, Perfluordecalin (oder Perfluortripropylamin), wurden in das Reagenzgefäß gegeben. 3.5 ml of a fluorocarbon, perfluorodecalin (or perfluorotripropyl) were placed in the reagent vessel. Das Horn und die Zelle wurden dann in ein temperaturkontrolliertes Bad mit einer auf 20°C eingestellten Temperatur getaucht. The horn and cell were then immersed in a temperature-controlled bath at a temperature set at 20 ° C. Der pH-Wert der wässrigen Phase betrug 6,8. The pH of the aqueous phase was 6.8. Die Ultraschallquelle schaltete sich bei einer Leistungseinstellung von 7 ein. The ultrasonic source chimed in at a power setting of 7. Das Nomogramm des Herstellers empfahl eine Ausgangsleistung von ungefähr 150 W/cm 2 . The manufacturer's nomogram recommended an output power of about 150 W / cm 2. Die Reaktion ist nach ungefähr 30 Sekunden abgeschlossen. The reaction is finished after about 30 seconds. Die hergestellte homogene Suspension enthält die Mikrokapseln oder Mikrokugeln von vernetzten unlöslichen Albuminhüllen mit eingekapseltem Perfluordecalin (oder Perfluortripropylamin) im Innern. The homogeneous suspension produced contains the microcapsules or microspheres of crosslinked insoluble Albumin shells with encapsulated perfluorodecalin (or perfluorotripropyl) inside. Die milchige Suspension wird, wie oben, gefiltert, gewaschen, in steriler gepufferter Salzlösung resuspendiert und in einem sterilen Behälter bei 4°C gelagert. The milky suspension is, as above, filtered, washed, resuspended in sterile buffered saline and stored in a sterile container at 4 ° C.
  • [0159] [0159]
    Wiederum, wie oben beschrieben, ergibt die typische Reaktion eine Lösung, die grob 10 8 Hüllen je Milliliter enthält mit einem durchschnittlichen Hüllendurchmesser von 3 μm und einer Standardabweichung von 1 μm. Again, as described above, typical reaction yields a solution that contains roughly 10 8 shells per ml with an average shell diameter of 3 microns and a standard deviation of 1 micron. Dieses Syntheseverfahren ergibt hohe Konzentrationen von Biomaterial in Mikrometergrößen mit engen Größenverteilungen. This synthesis method results in high concentrations of biomaterial micron sizes with narrow size distributions.
  • Beispiel 18 Example 18
  • Unlösliche Hämoglobin-Konstrukte, zusätzlich mit allosterischen Modifikatoren modifiziert, wie Pyridoxal-5'-phosphat (PLP) Insoluble hemoglobin constructs additionally modified with allosteric modifiers, such as pyridoxal-5'-phosphate (PLP)
  • [0160] [0160]
    Um Hämoglobin-Konstrukte mit variablen Affinitäten zu Sauerstoff (dh variable P 50 ) zu erhalten, wurden die IHC weiter mit PLP zur Reaktion gebracht, einem bekannten allosterischen Modulator. In order to obtain hemoglobin constructs with variable affinities to oxygen (ie, variable P 50), the IHC were further reacted with PLP for the reaction, a known allosteric modulator. Einer Suspension von IHC (gewonnen wie in Beispiel 14) in Trispuffer wurde bei 10°C unter Stickstoff der Sauerstoff entzogen. A suspension of IHC (obtained as in Example 14) in tris buffer was removed from the oxygen at 10 ° C under nitrogen. 10 ml der reduzierten IHC-Suspension wurden in jedes von sechs getrennten Reagenzgefäßen gegeben. 10 ml of the reduced IHC suspension was placed in each of six separate reagent vessels. Unterschiedliche molare PLP/Hb-Verhältnisse wurden in jedes der Gefäße hinzugefügt. Different molar PLP / Hb ratios were added in each of the vessels. Sie betrugen 0,1/3,0, 0,75/3,0, 1,5/3,0, 3,0/3,0, 4,2/3,0, 6,0/3,0. They were 0.1 / 3.0, 0.75 / 3.0, 1.5 / 3.0, 3.0 / 3.0, 4.2 / 3.0, 6.0 / 3.0. Nach 30 Minuten wurde ein zehnfacher Natriumborhydrid-Überschuss hinzugefügt und es wurde ermöglicht, die Schiffsche Base für die Dauer von weiteren 30 Minuten zu reduzieren. After 30 minutes, a tenfold excess of sodium borohydride was added and allowed to reduce the Schiff's base for a period of another 30 minutes. Die Suspension wurde dann durch Zentrifugieren gefiltert, dreimal mit gepufferter Salzlösung rückgespült, in gepufferter Salzlösung resuspendiert und bei 4°C gelagert. The suspension was then filtered by centrifugation, backwashed three times with buffered saline, resuspended in buffered saline and stored at 4 ° C. Diese Modifizierung hat die endständigen Aminogruppen der b-Globinkette in Desoxy-Hämoglobin zum Ziel. This modification has the terminal amino groups of the b-globin chain in deoxy-hemoglobin to the destination. In dieser Hinsicht ahmt die Modifizierung stark die Wirkung von 2,3-DPG (der am Lysin-EF6(82)b bindet) bei der Stabilisierung der Desoxykonformation nach. In this respect the modification strongly mimics the action of 2,3-DPG (which at lysine EF6 (82) b binds) in stabilizing the deoxy conformation after.
  • [0161] [0161]
    Die sechs verschiedenen Grade der Modifizierung werden zu IHC mit ansteigenden P 50 -Werten führen (abnehmende Sauerstoff-Affinitäten) mit steigendem Grad der PLP-Substitution. The six different degrees of modification are to IHC with increasing P 50 values lead (decreasing oxygen affinities) with increasing degree of PLP substitution.
  • Beispiel 19 Example 19
  • Unlösliche Konstrukte mit vernetzten Hüllen aus Hämoglobin und Polyethylenglykol Insoluble constructs with networked cases of hemoglobin and polyethylene glycol
  • [0162] [0162]
    Polyethylenglykol (PEG) ist bekannt als nicht toxisch, nichtentflammbar, nichthaftend an Zellen und im Allgemeinen biologisch inert. Polyethylene glycol (PEG) is known as a non-toxic, non-flammable, non-adhesive to cells and in general biologically inert. Proteine, die an PEG angehängt worden sind, wurden als weniger antigen befunden. Proteins that have been attached to PEG, were found to be less antigenic. Es wurde beobachtet, dass bei Liposomen die Zirkulation nach Bindung/Einschluss von PEG erhöht war. It has been observed that in the liposomes of the circulation upon binding / incorporation of PEG was increased. Somit wird damit gerechnet, dass der Einbau von PEG in die RBC die Zirkulationszeit erhöht. Thus, it is expected that the incorporation of PEG into the RBC increased the circulation time. Durch Variieren der Konzentration von PEG-Thiol, das dem Protein (z. B. Hämoglobin) hinzugefügt wurde, war es möglich, PEG-Hämoglobin-RBC herzustellen, das variierende Stabilitäten aufwies. By varying the concentration of PEG-thiol, which the protein (eg. As hemoglobin) was added, it was possible to prepare PEG-hemoglobin RBC that had varying stabilities. Das PEG-Thiol wurde durch Verfahren, wie in der Literatur beschrieben (wie Harris and Heart, Polymer Preprints 32: 154 (1991), hergestellt. The PEG-thiol was prepared by procedure as described in the literature (such as Harris and Heart Polymer Preprints 32: manufactured 154 (1991).
  • [0163] [0163]
    PEG-Thiol mit einem Molekulargewicht von 2000 g/mol wurde auf eine Konzentration von 1% (0,1 g auf 10 ml) in einer 5%igen Hämoglobin-Lösung gelöst. PEG-thiol of molecular weight 2000 g / mol was dissolved at a concentration of 1% (0.1 g in 10 ml) in a 5% hemoglobin solution. Die Protein-PEG-Lösung wurde beschallt, um den proteinhaltigen Ersatz für rote Blutzellen, wie in Beispiel 14 beschrieben, zu bilden. The protein-PEG-solution was sonicated to form the proteinaceous red blood cell substitute as described in Example 14.
  • Beispiel 20 Example 20
  • Unlösliche Hämoglobin-Konstrukte mit Polyethylenglykol, kovalent an das Hüllenäußere angeheftet Insoluble hemoglobin constructs with polyethylene glycol, covalently attached to the exterior shell
  • [0164] [0164]
    Die IHC wurden, wie in Beispiel 14 beschrieben, hergestellt. The IHC were prepared as described in Example 14 were prepared. Polyethylenglykol mit einem MW von 10.000 (PEG 10k) wurde mit 1,1'-Carbonyldiimidazol CDI entsprechend Verfahren, die in der Literatur zugänglich sind (Beauchamp et al. Analytical Biochemistry 131: 25–33, 1983), zur Reaktion gebracht. Polyethylene glycol having a MW of 10,000 (PEG 10k) was reacted with 1,1'-carbonyl diimidazole CDI according to methods which are available in the literature (Beauchamp et al Analytical Biochemistry 131:. 25-33, 1983), reacted. Die IHC wurden in 50 mM Borat-Puffer pH 8,0 suspendiert und PEG-CDI (2facher molarer Überschuss, bezogen auf Gesamt-Hämoglobinlysine) wurde hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für die Dauer von 6 Stunden gerührt. The IHC were suspended in 50 mM borate buffer pH 8.0 and PEG-CDI (2-fold molar excess relative to total hemoglobin lysines) was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for a period of 6 hours. Die entstandenen PEG-IHC wurden dann durch Filtration getrennt, in Salzlösung gewaschen und in steriler gepufferter Salzlösung resuspendiert. The resulting PEG-IHC were then separated by filtration, washed in saline and resuspended in sterile buffered saline.
  • Beispiel 21 Example 21
  • Parameter, die die Bildung von unlöslichen Hämoglobin-Konstrukten beeinflussen Parameters affecting the formation of insoluble hemoglobin constructs
  • [0165] [0165]
    Etliche Variable, wie Proteinkonzentration, Temperatur, Beschallungszeit, akustische Stärke, pH-Wert, wurden untersucht, um die Bildung der IHC zu optimieren. Several variables such as protein concentration, temperature, sonication time, acoustic intensity, pH were tested to optimize formation of the IHC.
  • [0166] [0166]
    Diese Materialien wurden aus 1%-, 2,5%-, 5%- und 10%-Hämoglobin-Lösungen hergestellt. These materials were prepared from 1% - 2.5% -, 5% - and 10% hemoglobin solutions prepared.
  • [0167] [0167]
    Sie wurden ebenfalls aus gemischter Protein-Lösung hergestellt, wie Hämoglobin und Humanserumalbumin, mit Konzentrationen, die wiederum zwischen 1 bis 10% lagen. They were also prepared from mixed protein solution such as hemoglobin and human serum albumin, with concentrations which were in turn between 1 and 10%. Die Größe und Konzentrationen wurden mittels eines Partikelzählgeräts bestimmt. The size and concentrations were determined using a Partikelzählgeräts. Es wurde festgestellt, dass die Größe nicht signifikant mit der Anfangs-Proteinkonzentration variierte. It has been found that the size is not significantly varied with the initial protein concentration. Die zubereitete Anzahl stieg mit steigender Anfangs-Proteinkonzentration bis zu ungefähr 5%. The number prepared increased with increasing initial protein concentration up to about 5%. Keine signifikante Veränderung der Anzahl wurde oberhalb dieser Konzentration beobachtet. No significant change was observed in the number above this concentration.
  • [0168] [0168]
    Die anfängliche Gefäßtemperatur wurde als wichtig für die optimale Herstellung der IHC festgestellt. The initial vessel temperature was found to be important for optimal preparation of the IHC. Typischerweise wurden die anfänglichen Reaktionstemperaturen zwischen 0 und 80°C gehalten. Typically the initial reaction temperatures between 0 and 80 ° C were maintained. Die optimale Starttemperatur war grob 70°C. The optimal starting temperature was roughly 70 ° C.
  • [0169] [0169]
    Die Beschallungsdauer war ebenfalls ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der Anzahl der je Milliliter hergestellten IHC. The sonication time was also an important factor in determining the number of IHC produced per ml. Es wurde festgestellt, dass eine Beschallungsdauer von grob 30 Sekunden gut war, um eine hohe Konzentration der IHC zu synthetisieren. It was found that a sonication time of roughly 30 seconds was good to synthesize a high concentration of the IHC. Längere oder kürzere Beschallungszeiten ergaben weniger, aber immer noch eine angemessene Anzahl an IHC. Longer or shorter sonication times were less, but still a reasonable number of IHC.
  • [0170] [0170]
    Entsprechend dem Nomogramm, bereitgestellt vom Hersteller des Beschallungsgerätes, ist die Nennschallleistung des Beschallungsgerätes, das bei diesen Experimenten verwendet wurde, ungefähr 150 Watt/cm 2 . According to the nomogram provided by the manufacturer of the sound device is the nominal sound power of the sound device that was used in these experiments, about 150 watts / cm 2. Bei anderen Leistungseinstellungen wurde ebenfalls festgestellt, dass eine große Anzahl an IHC hergestellt wurde. For other power settings was also found that a large number of IHC was prepared.
  • Beispiel 22 Example 22
  • Unlösliche Hämoglobin-Konstrukte als Arzneimittelträger von öllöslichen Arzneimitteln Insoluble hemoglobin constructs as a drug carrier for oil soluble drugs
  • [0171] [0171]
    Die zytotoxischen Wirkungen etlicher antineoplastischer Arzneimittel sind bei Vorhandensein von Sauerstoff stark verbessert. The cytotoxic effects of several antineoplastic drugs are greatly enhanced in the presence of oxygen. Es ist daher erstrebenswert, ein Arzneimittel einer Tumorstelle zuzuführen, während die Sauerstoff-Konzentration in diesem Bereich erhöht wird. It is therefore desirable to deliver a drug to a tumor site, while the oxygen concentration is increased in this area. Die Hämoglobin-Mikrokugeln der vorliegenden Erfindung sorgen für diese Fähigkeit. The hemoglobin microspheres of the present invention provide this capability. Das obige Beispiel 16 beschreibt die Einkapselung einer Fluorkohlenstoff-Flüssigkeit in eine Hülle aus unlöslichem Hämoglobin. The above example 16 describes the encapsulation of a fluorocarbon liquid in a shell of insoluble hemoglobin. Zytotoxische Arzneimittel, wie Cyclophosphamid, BCNU, Melphalan, Taxol, Camptothecin, Adriamycin, Etoposid und dergleichen, können im Fluorkohlenstoff oder einem anderen geeigneten Öl, wie Sojaöl, gelöst und in das Hämoglobin-Konstrukt eingekapselt werden. Cytotoxic drugs such as cyclophosphamide, BCNU, Melphalan, taxol, camptothecin, adriamycin, etoposide and the like can be in the fluorocarbon or other suitable oil such as soybean oil, dissolved and encapsulated in the hemoglobin construct.
  • [0172] [0172]
    Taxol wurde in Sojabohnenöl (SBO) auf eine Konzentration von 5 mg/ml gelöst. Taxol was dissolved in soybean oil (SBO) at a concentration of 5 mg / ml dissolved. 3,5 ml einer 5%igen Hämoglobin-Lösung wurden in ein Reagenzgefäß gegeben, und 3,5 ml des SBO/Taxol wurde zu dem Gefäß hinzugefügt. 3.5 ml of a 5% hemoglobin solution was placed in a reagent vessel, and 3.5 ml of the SBO / taxol was added to the vessel. Die Zwei-Phasen-Mischung wurde beschallt, wie in Beispiel 16 beschrieben, um vernetzte unlösliche Hämoglobinhüllen, die SBO/Taxol enthielten, zu gewinnen. The two-phase mixture was sonicated as described in Example 16 to obtain crosslinked insoluble hemoglobin shells containing SBO / Taxol.
  • Beispiel 23 Example 23
  • Polymerhüllen als Arzneimittelträger von wasserlöslichen Arzneimitteln Polymer shells as drug carriers by water-soluble drugs
  • [0173] [0173]
    Etliche wasserlösliche Arzneimittel sind Kandidaten zur Einkapselung in Polymerhüllen. Several water-soluble drugs are candidates for encapsulation in polymer shells. Als ein Beispiel wurde Methotrexat in Wasser auf eine Konzentration von 5 mg/ml gelöst. As an example methotrexate was dissolved in water to a concentration of 5 mg / ml. Ein Milliliter dieser wässrigen Lösung wurde mit 4 ml Sojaöl emulgiert unter Verwendung von Pluronic-65 (Block-Copolymer aus Polyethylenoxid und Polypropylenoxid), um eine stabile Wasser-in-Öl-(W/O-)Mikro-Emulsion zu bilden. One milliliter of this aqueous solution was emulsified with 4 ml of soybean oil using Pluronic-65 (block copolymer of polyethylene oxide and polypropylene oxide) to form a stable water-in-oil (W / O) microemulsion. 3,5 ml einer 5%igen Hämoglobin-Lösung wurden mit 3,5 ml dieser W/O-Mikro-Emulsion überschichtet und für die Dauer von 30 Sekunden beschallt, um unlösliche Hämoglobin-Konstrukte zu erhalten, die eine eingekapselte Mikro-Emulsion mit Methotrexat enthalten. 3.5 ml of a 5% hemoglobin solution was overlayered with 3.5 ml of this W / O microemulsion and sonicated for 30 seconds to obtain insoluble hemoglobin constructs containing an encapsulated microemulsion with methotrexate included.
  • Beispiel 24 Example 24
  • Polymerhüllen als Proteinträger Polymer shells as a protein carrier
  • [0174] [0174]
    Etliche Proteine sind Kandidaten zur Einkapselung in Polymerhüllen, z. B. Hämoglobin, Albumin und dergleichen. Several proteins are candidates for encapsulation in polymer shells, z. B. hemoglobin, albumin, and the like. Zum Beispiel könnte als ein Verfahren zur Erhöhung des Hämoglobingehalts der IHC das Hämoglobin in das IHC eingekapselt werden, anstatt des wasserlöslichen Arzneimittels in Beispiel 23. Hämoglobin wurde auf eine Konzentration von 10% in Wasser gelöst. For example, could be encapsulated into the IHC as a method of increasing the hemoglobin content of the IHC, hemoglobin, instead of the water-soluble drug in Example 23. hemoglobin was dissolved to a concentration of 10% in water. Ein Milliliter dieser wässrigen Lösung wurde mit 4 ml Sojaöl emulgiert unter Verwendung von Pluronic-65 (Block-Copolymer aus Polyethylenoxid und Polypropylenoxid), um eine stabile Wasser-in-Öl-(W/O-)Mikro-Emulsion zu bilden. One milliliter of this aqueous solution was emulsified with 4 ml of soybean oil using Pluronic-65 (block copolymer of polyethylene oxide and polypropylene oxide) to form a stable water-in-oil (W / O) microemulsion. 3,5 ml einer 5%igen Hämoglobin-Lösung wurden mit 3,5 ml dieser W/O-Mikro-Emulsion überschichtet, die Hämoglobin enthielt. 3.5 ml of a 5% hemoglobin solution was overlayered with 3.5 ml of this W / O micro-emulsion that contained hemoglobin. Die Zweiphasen-Mischung wurde für die Dauer von 30 Sekunden beschallt, um unlösliche Hämoglobin-Konstrukte zu erhalten, die eine eingekapselte Mikro-Emulsion enthielten, welche ebenfalls Hämoglobin enthielt. The two phase mixture was sonicated for 30 seconds to obtain insoluble hemoglobin constructs containing an encapsulated microemulsion that also contained hemoglobin. Dieses Verfahren diente dazu, die Gesamtmenge an Hämoglobin je Mikrokugel des IHC zu erhöhen und erhöhte darum die Sauerstofftransportfähigkeit für gebundenen Sauerstoff. This method was used to increase the total amount of hemoglobin per microsphere of the IHC and therefore increased the oxygen carrying capacity for bound oxygen.
  • Beispiel 25 Example 25
  • In-vivo-Verabreichung von Konstrukten, die Arzneimittel befördern In vivo administration of constructs carrying the drug
  • [0175] [0175]
    Unlösliche Hämoglobin-Konstrukte, die eingekapseltes Taxol (in SBO) enthalten, wurden gemäß Beispiel 22 hergestellt. Insoluble hemoglobin constructs containing encapsulated Taxol (in SBO) were prepared according to Example 22. Die Endsuspension wurde bereitet, um 20 Volumen-% SBO in steriler Salzlösung zu enthalten. The final suspension was prepared to contain 20% by volume of the SBO in sterile saline. 2 ml dieser Suspension wurden über die Schwanzvene einer mit Ketamin betäubten Sprague-Dawley-Ratte injiziert. 2 ml of this suspension was injected via the tail vein of anesthetized with ketamine Sprague-Dawley rat.
  • [0176] [0176]
    Die Ratte wurde 2 Stunden nach der Injektion geopfert und die Leber entnommen. The rat was sacrificed 2 hours after injection, and the livers are removed. Die Leber wurde mit einer kleinen Menge Salzlösung homogenisiert und mit Ethylacetat extrahiert. The liver was homogenized with a small amount of brine and extracted with ethyl acetate. Der Extrakt wurde lyophilisiert, in Methanol gelöst und in eine HPLC-Säule injiziert. The extract was lyophilized, dissolved in methanol and injected into an HPLC column. Ungefähr 15% der Anfangsdosis an unmetabolisiertem Taxol wurden aus der Leber zurückgewonnen. Approximately 15% of the initial dose of unmetabolized taxol was recovered from the liver. Dies bestimmte die Durchführbarkeit des Targetings von antineoplastischen Arzneimitteln auf die Leber in Verbindung mit der Zufuhr von Sauerstoff an diese Stellen. This determined the feasibility of targeting of antineoplastic drugs to the liver in conjunction with the supply of oxygen to these sites.
Classifications
International ClassificationA23L33/00, A61K49/00, A61K9/51, A61K47/30, A61K49/04, A61K51/00, A61K49/18, A61K9/00, A61K9/48, A61K9/50, A61K47/48, A61K49/22
Cooperative ClassificationA61K47/6925, A61K47/6927, A61K49/1818, A61K49/1863, A61K49/222, A61K49/223, A61K9/0026, A61K49/226, A61K49/126, A61K9/5052, A61K49/18, A61K9/5146, A23L33/40, A61K9/5161, A61K9/5169, A61K9/5138, B82Y5/00
European ClassificationB82Y5/00, A61K49/12P, A61K49/18R, A61K49/18R2N2K8, A61K49/22P4, A61K49/22P, A61K9/50H6H, A61K9/00M5F, A23L1/29F, A61K49/18, A61K49/22P12, A61K47/48W8D, A61K47/48W8, A61K9/51H6H, A61K9/51H6B, A61K9/51H6F, A61K9/51H6D