DE69432706T2

DE69432706T2 - Verfahren zur reinigung von "basic" fibroblasten wachstumsfaktor

Info

Publication number: DE69432706T2
Application number: DE69432706T
Authority: DE
Inventors: Paula J. Shadle; Kate B. Silverness; Robert S. King
Original assignee: Scios LLC
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 1994-07-18
Filing date: 1994-07-18
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2014-07-19
Also published as: CA2170885C; JPH08510762A; CA2170885A1; WO1996002562A1; DE69432706D1; US5331095A; EP0720618A1; JP3509104B2; EP0720618A4; EP0720618B1; ATE240969T1

Description

Fachgebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Proteinen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Basic Fibroblast Growth Factor) unter Anwendung von starker und schwacher Kationenaustausch-Chromatographie als auch der Hydrophoben Interaktions-Chromatographie.
Hintergrund der Erfindung
Vom Basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) wurde gezeigt, dass er über eine potente mitogene Wirkung verfügt, was seine Nutzung zur Geweberegeneration oder -reparatur nahelegt.
Eine Reihe von Verfahren zum Reinigen des nativen bFGFs wurden beschrieben. Da beim nativen bFGF eine Affinität für Heparin nachgewiesen wurde, wurde die Affinitätschromatographie unter Verwendung von Heparin als eine wirksame Methode zur Reinigung von bFGF befunden. Burgess et al., Annu. Rev. Biochem. 58: 575–606 (1989). Allerdings besteht der Nachteil dieses Ansatzes darin, dass die völlige Abwesenheit von Heparin im gereinigten bFGF-Endprodukt nur schwer gewährleistbar ist. Da Heparin ein biologisch aktives Material mit gerinnungshemmender Wirksamkeit ist, sind selbst Spurenmengen des kontaminierenden Heparins in hohem Maße unerwünscht.
Shing et al., J. Biol. Chem. 263: 9059–9062 (1988) beschreiben die Trennung zweier Arten von FGF, nämlich des basischen und des sauren, auf der Grundlage ihrer jeweiligen Affinitäten für Heparin und ihrer isoelektrischen Punkte (pl). Die Heparin-Chromatographie wurde zur Reinigung von nativem FGF angewendet, das entweder von Lysaten unbehandelter Zellkulturen oder von Geweben wie Hirnanhangsdrüse, Nebennierenmark und Hirngewebe stammte. Gospodarowicz und Mescher (1981) Advances in Neurology: Neurofibromatosis, Riccardi V. M. und Mulvihill J. J., Hg., Bd. 29, S. 149 Raven Press, New York. Rekombinanter bFGF wurde ebenfalls unter Anwendung der Heparinaffinitäts-HPLC erzeugt und gereinigt. Masaharu et al., Biochem. Bioghys. Res. Commun. 151: 701-708 (1988). Masaharu et al. wandten die positionsgerichtete Mutagenese an zum Austausch vierer Cystein-Reste des reifen bFGF-Proteins gegen Serin-Reste bei dem Versuch der Stabilisierung des Proteins und der Verminderung der Heterogenität der bFGF-Elution aus der Heparinaffinitäts-HPLC bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität einiger der modifizierten Proteine.
Scheuermann et al., US-Patent Nr. 5.136.025 (im folgenden "das '025-Patent") beschrieb ein Verfahren zum Gewinnen von in Escherichia coli exprimierten rekombinanten humanen bFGF-Multimeren und Reinigen des bFGFs unter Anwendung der Metallchelat-Affinitätschromatographie in Abwesenheit von Heparin. Im '025-Patent wurde angemerkt, dass Heparin, wie bei den bekannten bFGF-Reinigungsmethoden verwendet, die Affinität, Aufnahmerate und Pharmakokinetik von bFGF in vivo beeinträchtigen kann. Das im '025-Patent beschriebene Verfahren ergibt ein Protein, das zu 98% frei von Kontaminanten ist. Kurz gesagt besteht das Verfahren in folgendem: Unbehandelte Extrakte, die rekombinanten bFGF enthalten, werden einem ersten Chromatographie-Schritt unterzogen, welcher einen Kationenaustauscher enthält, an den bFGF aufgrund seines basischen pl bindet. Aus dieser ersten Säule rückgewonnenes Protein besteht zu etwa 80% in bFGF. Dieses teilgereinigte bFGF wird auf eine Metallchelat-Affinitätsmatrix aufgebracht, was zu einem Präparat führt, das multimere Formen des bFGF und eine verminderte Menge an Kontaminanten enthält. Sind niedermolekulare (MG) Kontaminanten vorhanden, so wird ein zusätzlicher Chromatographie-Schritt wie die Gelfiltration angewendet. Das Größenauschlussharz der Gelfiltration trennt die höhermolekularen Spezies, einschließlich der bFGF-Aggregate, von den niedermolekularen Kontaminanten. bFGF enthaltende Fraktionen werden zum Dissoziieren der bFGF-Multimere chemisch reduziert. Die vollständig dissoziierten und reduzierten bFGF-Monomere können dann von jeglichen höhermolekularen Kontaminanten isoliert werden. Eine derartige Isolierung kann mittels einer Gelfiltrations-Säule erfolgen, die das monomere bFGF von höhermolekularen Kontaminanten trennt. Ein Nachteil des Metallchelat-Affinitätschromatographie-Prozesses besteht darin, dass das Metall zu Oxidation, Aggregation und Hydrolyse der Peptidbindung des Produkts bei daraus folgender Verminderung der Ausbeute an monomerem Produkt beitragen kann. Daher sind zusätzliche Bearbeitungsschritte zur Beseitigung von Aggregraten erforderlich.
Beschreibung der Erfindung
Es wurde nun festgestellt, dass der bFGF unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung im wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt werden kann, wie mittels Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie-("RP-HPLC")-Analyse ohne Anwendung der Heparin- oder der Metallchelat-Affinitätschromatographie beurteilt. In dieser Weise wird eine hohe Ausbeute an bFGF in einem schnelleren Prozess erhalten. Weiterhin sind die Bearbeitungsbedingungen, denen das bFGF unterzogen wird, viel milder als bei den bisherigen Verfahren.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein verbessertes Verfahren zum Gewinnen von gereinigtem bFGF aus einer Probe bereitgestellt, die nativen oder rekombinanten bFGF, einschließlich von Fragmenten oder Analoga davon, enthält. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Zusammenbringen einer bFGF enthaltenden Lösung mit einer starken Kationenaustauscher-Matrix, welche über einen pH-Bereich von 5 bis 7,5 vollständig ionisiert ist;
(b) Eluieren aus der starken Kationenaustauscher-Matrix eine Vielzahl von Fraktionen, von denen mindestens eine bFGF enthält;
(c) Zusammenbringen der bFGF enthaltenden Fraktionen der starken Kationenaustauscher-Matrix mit einer Hydrophoben Interaktions-Matrix;
(d) Eluieren aus der Hydrophoben Interaktions-Matrix eine Vielzahl von Fraktionen, von denen mindestens eine bFGF enthält;
(e) Zusammenbringen der bFGF enthaltenden Fraktionen der Hydrophoben Interaktions-Matrix mit einer schwachen Kationenaustauscher-Matrix, welche über einen pH-Bereich von 5 bis 7,5 nicht vollständig ionisiert ist und welche über einen pH-Bereich von 6 bis 7 wirkt;
(f) Eluieren aus der schwachen Kationenaustauscher-Matrix eine Vielzahl von Fraktionen, von denen mindestens eine bFGF enthält;
(g) Gewinnen des gereinigten bFGF aus den bFGF enthaltenden Fraktionen der schwachen Kationenaustauscher-Matrix.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In 1 ist ein Flussdiagramm dargestellt, das ein Beispiel eines Reinigungsschemas zeigt.
In 2A und 2B sind analytische Diagramme der Umkehrphasen- (2A) und Ionenaustausch-Elutionsmuster (2B) des bFGF-Produkts gezeigt.
Ausführungsformen der Erfindung
A. Definitionen
"bFGF" bezieht sich auf den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, der entweder ein natürlich vorkommender oder ein rekombinant erzeugter ist. Der bFGF ist entweder homolog oder im wesentlichen homolog der in 1 des '025-Patents gezeigten Sequenz. Alternativ weist der bFGF eine biologische Aktivität auf, wie in den hierin beschriebenen Assays oder einem anderen, den Fachleuten des Gebiets bekannten Assay gezeigt. "bFGF" kann auch analoge Proteine und Fragmente des bFGF umfassen, die eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen, doch zufällig oder absichtlich induzierte Veränderungen enthalten wie Deletionen, Additionen, Extensionen oder Austäusche von Aminosäure-Resten. Zu Beispielen solcher Analoga zählen z. B. Proteine, in denen ein oder mehrere Cystein-Reste durch einen anderen Aminosäure-Rest ersetzt wurden, um Stellen für eine intermolekulare Vernetzung oder inkorrekte intramolekulare Bildung von Disulfidbindungen zu eliminieren. Die Umwandlung von Cystein zu neutralen Aminosäuren wie Glycin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Serin, Tyrosin oder Methionin stellt einen bevorzugten Ansatz dar. Serin und Alanin stellen aufgrund der chemischen Homologie mit Cystein die bevorzugteren Substitute dar. Bei einer mutanten Form mit biologischer Aktivität sind die Cystein-Reste an Positionen 78 und 96 gegen Serine ausgetauscht. Weitere bFGF-Analoga, einschließlich eines N-terminalen Deletions-Analogons, sind beschrieben in der PCT-Veröffentlichung WO89/00198. Ferner kann das bFGF durch jegliche im Fachgebiet bekannte Methode chemisch modifiziert sein. Wie hierin verwendet, umfasst "bFGF" die oben erörterten Formen und alle natürlich vorkommenden oder rekombinanten Formen, das gesamte Protein und biologisch aktive Analoga und Fragmente davon.
Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "Säuger" jegliche Säuger-Spezies, doch vorzugsweise den Menschen.
"Gereinigt" oder "rein" bezieht sich auf ein Material, das frei von Substanzen ist, die es normalerweise in seinem rekombinanten oder nativen Zustand begleiten. So bezieht sich z. B. "reiner" bFGF auf einen bFGF, der keine DNA, Wirtszell-Proteine oder Lipide enthält, die normalerweise mit ihm in seiner in situ-Umgebung assoziiert sind. Natürlich kann "reiner" bFGF kovalent assoziierte Materialien umfassen. "Reiner" bFGF bezieht sich auf einen Grad der Reinheit, der mindestens etwa 75%, bevorzugter mindestens etwa 90% und am bevorzugtesten mindestens etwa 98 beträgt.
"Kationenaustausch-Chromatographie" oder "Kationenaustauscher" bezieht sich auf ein Reinigungsverfahren, bei dem ein Chromatographieharz, das geladene Gruppen trägt, zur selektiven Bindung und Freisetzung geladener Komponenten in das zu reinigende Gemisch eingesetzt wird. Ein Kationenaustauscher bindet Kationen (positiv geladene Spezies) und weist daher negativ geladene Liganden als der aktiven oder gebundenen Phase auf. Die "Starke Kationenaustausch-Chromato graphie" verwendet ein Harz, das über einen breiten pH-Bereich (zwischen 5 und 7,5) vollständig ionisiert ist; d. h., dass sich die Eigenschaften der Medien mit dem pH-Wert nicht stark verändern. Zu Beispielen starker Kationenaustauscher zählen Sulfonat, Sulfopropyl (SP), Trisacryl und ähnliche. Die "Schwache Kationenaustausch-Chromatographie" verwendet ein Harz, bei dem der Grad an Dissoziation und daher die Austauschkapazität mit dem pH-Wert stark variiert. Typischerweise ist ein schwacher Kationenaustauscher lediglich bei einem pH-Wert oberhalb seiner Dissoziationskonstante ionisiert. Ein schwacher Kationenaustauscher wirkt daher nur in einem engen pH-Bereich (zwischen etwa 6 und 7). Zu Beispielen der schwachen Kationenaustauscher zählen Carboxymethyl (CM), Phosphin- und Polyasparaginsäure und ähnliche.
"Hydrophobe Interaktions-Chromatographie" (HIC) bezieht sich auf eine Chromatographieform, die in wässrigen Puffern vorgenommen wird. Eine Komponente, z. B. ein Protein, bindet an eine HIC-Säule über eine hydrophobe Wechselwirkung. Bei HIC können dieselben Chromatographieharze verwendet werden wie bei der Umkehrphasen-(RP)-Chromatographie. HIC kann bei niedrigen oder hohen Drücken vorgenommen werden. Anders als bei der RP-Chromatographie allerdings wird die Säule in Gegenwart von wässrigen Puffern unter Verwendung hoher Salzkonzentrationen äquilibriert und in Gegenwart der wässrigen Puffer unter Verwendung niedriger Salzkonzentrationen eluiert. Zu typischen HIC-Harzen für Niederdruck-Anwendungen zählen Phenyl-Sepharose von Pharmacia und Butyl-, Phenyl- und Etherharze der Toyopearl 650-Reihe von Tosohaas.
B. Allgemeines Verfahren
Bei allen beschriebenen Verfahren handelt es sich um herkömmliche und von den Fachleuten des Gebiets angewandte Verfahren; diese sind zu finden bei Yost et al., Practical Liquid Chromatography, Perkin-Eimer Corporation (1980).
1. Ausgangsquelle des bFGF: Rekombinant erzeugtes Protein
Durch Ausnutzung rekombinanter DNA-Techniken lässt sich heutzutage ein ausreichender Vorrat an bFGF zur Reparatur traumatisierten Gewebes infolge von Verwundungen, Operationen, Verbrennungen, Frakturen oder neurologischen Degenerationen herstellen.
bFGF kann mittels rekombinanter Methoden erzeugt werden, wie beschrieben in der PCT-Veröffentlichung WO87/01728. Siehe außerdem Abraham et al., Science, 233: 545 (1986) und Abraham et al., The EMBO Journal 5: 2523 (1986). Das rekombinant erzeugte Protein kann in bakteriellen Wirtsystemen exprimiert werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf E. coli.
Die Herstellung des Zelllysats kann durch Lysiseren der Wirtszellen bei einer Temperatur von etwa 2 bis 10°C in einem Zelllyse-Puffer aus etwa 0,01 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), etwa 0,1 bis etwa 0,2 M NaCl; etwa 0,02 bis etwa 0,05 M Phosphatbuffer; und etwa 0,005 M DTT (Dithiothreitol) bei einem pH-Wert von etwa 7,5 erfolgen. Das Zelllysat wird dann mittels einer geeigneten Methode homogenisiert, einschließlich, doch nicht beschränkt auf ein 30-CD-System (Manton-Gaulin, Inc., Everett, Mass.). Das 30-CD-System wird bei etwa 12.000 bis etwa 15.000 psig bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 bis 3 l/Min. angewendet, was eine 80- bis 90%-ige Lyse ergibt. Alternativ kann das Protein durch die Wirtszellen in das umgebende Medium sekretiert werden, womit das Zelllyse-Verfahren umgangen wird.
2. Ausgangsquelle für bFGF: Isolierung aus Gewebequellen
Der bFGF zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung kann auch durch Extraktion und anschließende Konzentrationstechniken aus der Hypophyse verschiedener Tiere gewonnen werden. Viele Endothelzell-Mitogene mit MG, 13.000 bis 18.000 und einer starken Affinität für Heparin und basischem pl wurden aus Säugerquellen isoliert (siehe Fox et al., J. Biol. Chemistry 263: 18452–18458 (1988) für eine Zusammenfassung dieser Mitogene). Es ist bekannt, dass alle diese Faktoren Formen des bFGF sind, die lediglich hinsichtlich des Grads des N-terminalen Processing voneinander abweichen. Wie aus dem Hypophysengewebe isoliert, handelt es sich bei bFGF um ein einkettiges, unglycosyliertes Protein mit MG 16.500.
3. Reinigung des bFGF
Nachdem die unbehandelten Isolate des bFGF durch die oben beschriebenen Verfahren oder unter Anwendung einer anderen geeigneten Methode gewonnen wurden, können dann die Reinigungsvorgänge der vorliegenden Erfindung angewendet werden. 1 zeigt ein Flussdiagramm eines Beispiels einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Bei der bevorzugten Methode werden drei Chromatographie-Schritte angewendet.
Ein erster Schritt umfasst einen starken Kationenaustauscher, an den bFGF aufgrund seines basischen pl bindet. Ein Reduktionsmittel kann in den Zellextraktions-Puffer aufgenommen werden, um die Bildung intermolekularer Disulfidbindungen zwischen bFGF-Molekülen oder dem bFGF und Wirtszell-Proteinen zu zerstören oder zu verhindern und um die Bindungsleistung des bFGF an das Harz zu erhöhen. Zu Beispielen geeigneter Reduktionsmittel zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, DTT, β-Mercaptoethanol und Cystein. Die starke Kationenaustausch-Chromatographie wird bei einer Temperatur von etwa 2°C bis etwa 25°C, bevorzugt etwa 4°C, in einem Puffer bei pH-Wert etwa 6 bis 8, bevorzugt etwa 7,5, vorgenommen. Zu Beispielen solcher Puffer zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Natriumphosphat- und Imidazol-HCL-Puffer. Die Elution kann schrittweise oder als Gradient erfolgen, vorzugsweise schrittweise. Die Säulenmatrix kann sich aus Kationenaustauscherharzen zusammensetzen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Sulfopropyl-Agarose-, Dextran- und Acrylamid-Matrices wie Sulfopropyl-Sepharose* Fast Flow, Sulfopropyl-Sephadex*, Trisacryl* (*eingetragenes Warenzeichen in ein oder mehreren bezeichneten Staaten) oder ähnliches, vorzugsweise Sulphopropyl-Sepharose* Fast Flow. bFGF wird bei niedriger Salzkonzentration (0,1 M NaCl, 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,5, vorzugsweise mit 10 mM EDTA und 5 mM DTT) gebunden und bei hoher Salzkonzentration (0,5 M NaCl, 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,5, vorzugsweise mit 1,0 mM EDTA) eluiert. Weitere geeignete Salze, einschließlich, doch nicht beschränkt auf KCl, Na₂SO₄ oder ähnliche, können anstelle von NaCl zur Bindung und Elution verwendet werden. Mit diesem Schritt wird der bFGF 7- bis 8-fach gereinigt und außerdem werden die Endotoxin- und Nukleinsäuremengen wesentlich vermindert, so dass der bFGF zu etwa 70 bis 85% rein ist. Dieser Schritt kann chargenweise als auch in einer Säule vorgenommen werden.
Ein zweiter Schritt umfasst die Anwendung der Hydrophoben Interaktions-Chromatographie zur weiteren Reinigung des bFGF. Das Ionenaustauscher-Eluat des oben beschriebenen starken chromatographischen Kationenaustausch-Prozesses wird mit einem Puffer behandelt, um seine Leitfähigkeit einzustellen, woraufhin die Chromatographie auf einem Butyl-HIC-Harz vorzugsweise bei Raumtemperatur, doch auch bei 4°C, durchgeführt wird. Der Puffer enthält 0 bis 5 mM EDTA; ist vorzugsweise ein Ammoniumsulfat/Kaliumphosphat-Puffer mit 1,4 bis 1,5 M Ammoniumsulfat und 0,01 bis 0,1 M Kaliumphosphat, doch kann auch Natriumsulfat, KCl, hohe NaCl- oder andere starke Salzkonzentrationen enthalten. Auch alternative Puffer sind möglich, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Natriumphosphat, Imidazol-HCl, Natriumcitrat und Natriumacetat. Die HIC kann bei einem pH-Wert von zwischen 5 und 7,2, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6 bis 7, vorgenommen werden. Die Abtrennung des bFGF von anderen Kontaminanten wird mittels abnehmender Salzgradienten erreicht. Es kann entweder eine stufenweise oder eine Gradientenelution vorgenommen werden. Die Säulenmatrix umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, Agarose, Kieselgel oder Polymerharze. Die Säulenmatrix ist an funktionelle Gruppen gekoppelt, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Butyl, Octyl, Phenyl, Acetyl oder andere niedere C_1-8-Alkyle.
Mit dem oben beschriebenen HIC-Gradientenschritt wird der bFGF zu etwa 85 bis 95% Homogenität mittels RP-HPLC gereinigt, wodurch ein zu mehr als 90% reiner bFGF erhalten wird. Die Reinheit wird mittels RP-HPLC analysiert, welche auf einer Vydac-C4-Säule unter Anwendung eines Acetonitril/0,1% TFA-Gradienten von 30– 45% über 30 Minuten hinweg vorgenommen wird. Die Peak-Detektion erfolgt bei 215 nm.
Eine Alternative zur Gradientenelution durch HIC ist die isokratische HIC, bei der nicht der bFGF an das HIC-Harz bindet, die Unreinheiten jedoch schon. Die Methode ergibt ein bFGF, das zu etwa 80 bis 90% homogen gemäß RP-HPLC ist und daher einen zu etwa 90 bis 95% reinen bFGF ergibt.
Ein dritter Schritt umfasst die Anwendung einer schwachen Kationenaustausch-Chromatographie zur weiteren Reinigung des bFGF von FGF-Aggregaten und Abbauprodukten als auch Wirtszell-Proteinen. Das HIC-Eluat, das den gereinigten bFGF enthält, wird unter Anwendung einer geeigneten Methode konzentriert, z. B. der Ultrafiltration, und dann der Puffer gegen einen Puffer mit niedriger Salzkonzentration ausgetauscht und auf eine Ionenaustauscher-Säule aufgebracht. Der Puffer mit niedriger Salzkonzentration kann 0,1 M Ammioniumsulfat, 0,02 M Kaliumphosphat, pH 6,0, mit 1 mM EDTA sein. Weitere Salze, einschließlich, doch nicht beschränkt auf NaCl und Na₂SO₄, können verwendet werden. Weitere Puffer, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Acetat, Citrat und Imidazol, können ebenfalls verwendet werden.
Die schwache Kationenaustausch-Chromatographie wird bei einer Temperatur von etwa 2°C bis etwa 25°C, vorzugsweise etwa 15 bis 20°C, in einem Puffer mit einem pH-Wert von etwa 5 bis 7,5, bevorzugt etwa 6, vorgenommen. Schwache Kationenaustauscher auf der Basis einer Carboxyl-(COO^–)-austauschenden Gruppe und einer Polyasparaginsäure-Bindung an Kieselgel (z. B. PolyCAT A von PolyLC Inc., Columbia, MD und Bakerbond Schwacher Kationenaustauscher von J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.) haben sich für diese Anwendung als nützlich erwiesen. Ein Bereich von Säulenmatrix-Partikelgrößen (5 bis 25 μm) und Porengrößen (300 oder 100010 haben alle annehmbare Trenneigenschaften ergeben. bFGF wird unter Verwendung von kationenaustauschenden Salzen (z. B. Natrium oder Ammonium) in einem isokratischen oder flachen Gradientenelutions-Modus (d. h. 0,5 mM/Min.) bei einem konstanten pH-Wert (im Bereich von 6,0 bis 7,5) und einer linearen Geschwindigkeit von etwa 4 cm/Min. bis zu etwa 10 cm/Min. eluiert.
Das bFGF-Produkt eluiert in einem kleineren und einem Haupt-Peak, genannt A und B. Peak A enthält oxidierte FGF-Kontaminanten, wohingegen Peak B mehr als etwa 95% ist, vorzugsweise etwa 97–98% Einzelpeak-bFGF bei Analyse mittels RP-HPLC enthält, wie oben beschrieben (siehe 2). FGF-Aggregate, sofern vorhanden, eluieren später als Peak B.
4. Kontaminationstests
Die Aktivität des bFGF nach der Reinigung kann mittels einer Vielfalt von Assays bestimmt werden, wie etwa dem adrenokortikalen Endothelzell-Assay (ACE-Assay) oder dem Hamsterbaby-Nieren-21-((BHK)-21)-Mikrotiter-Zellproliferations-Assay. Außerdem soll mit den Kontaminationstests des Endprodukts die Reinheit überwacht werden, z. B. mit dem Limulus-Amoebozyten-Lysat-(LAL)-Assay, den Kontaminationsbereich durch Nukleinsäure-Reste, den E. coli-Wirtszell-Protein-Assays und der Kaninchen-Assay auf Pyrogene.
C. Beispiele
Die folgenden Beispiele sollen der Veranschaulichung, jedoch nicht einer Beschränkung der Erfindung dienen.
Beispiel 1
Rekombinanter humaner bFGF wurde in E. coli B exprimiert, wie im gemeinsamen US-Patent Nr. 5.136.025 beschrieben, welches hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist. Die Zellen wurden abgeerntet und mittels Tangentialstromfiltration auf einem Prostak-Gerät (Millipore, Bedford, MA) gewaschen. Die gefrorene Zellmasse von etwa 2 kg wurde aufgetaut und in 3 Volumina an 0,05 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, und 0,1 M NaCl bei 4°C suspendiert. EDTA (0,5 M) und DTT (1 M) wurden zu Endkonzentrationen von 10 mM bzw. 5 mM zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde durch Homogenisierung unter Verwendung eines Manton-Gaulin CD30-Homogenisators lysiert.
Schritt 1 - Starke Kationenaustausch-Chromatographie
Das Zelllysat wurde direkt mit SP-Sepharose Fast Flow-Harz (Pharmacia) zusammengebracht, welches mit 0,05 M Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, bei 4°C in einem gerührten Chargenmodus äquilibriert wurde. Die Inkubation wurde für 60 Minuten bei 4°C (gerührt) zum Binden des bFGF an das Harz vorgenommen. Das Harz durfte sich dann absetzen und wurde zur Entfernung von ungebundenen Komponenten, Zelltrümmern und Puffer abgeschöpft. Zwei Waschgänge mit Puffer wurden in derselben Weise vorgenommen. Das Harz wurde dann in eine Säule (18 × 90 cm, IBF/Sepracor Inc.) gepackt und mit 0,22 M NaCl in 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,5, 1 mM EDTA, weiter gewaschen. Dieser Schritt eluierte bestimmte Wirtszell-Proteinkontaminanten. Der bFGF wurde dann mit 0,5 M NaCl im Ausgangspuffer eluiert.
Von der Ausgangs-Zellmasse von 1,9 kg, die 210 Gramm Gesamtprotein enthielt (Bradford-Assay), wurden 14,7 g oder etwa 7% des Proteins und nahezu der gesamte bFGF in der gebundenen und eluierten Fraktion gewonnen. Dieses Material bestand zu etwa 80% in bFGF, ausgehend von einem immunologischen Assay unter Verwendung einer Molecular Devices Threshold Machine. Die wirksame Entfernung der Zelltrümmer wurde daher ohne Ausführung eines separaten Filtrationsschritts vorgenommen.
Schritt 2 - Hydrophobe Interaktions-Chromatographie
Beim nächsten Schritt wird die Hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC) angewendet. Das oben beschriebene 0,5 M-Eluat wurde 1 : 1 mit 3 M Ammoniumsulfat in "Puffer A" (Puffer A besteht aus 0,1 M Kaliumphosphat und 1 mM EDTA, pH 6,5) verdünnt. Nach der Filtration durch einen teilchenentfernten Filter wurden etwa 15 mg Protein in 100 ml Sulfopropyl-0,5M-Elutionspool auf eine 10 ml-(1,6 cm × 5 cm) Butyl-650M-ToSoHaas-(Philadelphia, PA)-Säule geladen, die in 1,5 M Ammoniumsulfat in Puffer A äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 1,5 M Ammoniumsulfat in Puffer A nach der Proteinbeladung gewaschen. Die Säule und alle Puffer befanden sich bei Raumtemperatur. Die Elution des gebundenen Proteins wurde in einem schittweisen Verfahren unter Verwendung von 1,4 M und 1,3 M Ammoniumsulfat in Puffer A, Wasser und Natriumhydroxid vorgenommen. Die Fraktionen wurden auf die bFGF-Homogenität mittels RP-HPLC untersucht und für die Reinheit gepoolt. Ausbeuten von 50 bis 70% wurden bei einem HauptpeakbFGF von mehr als 85% erzielt.
Schritt 3 - Schwache Kationenaustausch-Chromatographie
Beim nächsten Schritt wurde eine schwache Ionenaustausch-Chromatographie angewendet. Das Eluat aus dem HIC-Schritt wurde entsalzt und mittels eines Ultrafiltrationssystems - Minitan (Millipore, Bedford, MA) - konzentriert. Die zur Reinigung von bFGF aus dem Eluat der HIC-Säule verwendete Säule bestand in einer 4,6 × 200 mm schwachen Kationenaustauscher-Säule, bezeichnet als polyCAT A, bestehend in 5 μm an einer 1000 Å-Kieselgelpackung, beschichtet mit Polyasparaginsäure (PolyLC, Columbia, MD). Die Elution des gebundenen Proteins wurde mit einem linearen Gradienten von Ammoniumsulfat in 20 mM Kaliumphosphat und 1 mM EDTA bei pH 6 vorgenommen. Der duale Gradient bestand in einem anfänglichen langsamen Gradienten von 1,6 mM Ammoniumsulfat/Min. und dann 120 mM Ammoniumsulfat min zu einer Endkonzentration von 400 mM Ammoniumsulfat. Das Elutionsmuster des Produkts ist in 2 gezeigt. Eine Ausbeute von etwa 60% wurde bei einem Hauptpeak-bFGF von mehr als 95% erzielt.
Beispiel 2
2 kg des Zelllysats aus Beispiel 1 wurden direkt mit SP-Sepharose Fast Flow-Harz (Pharmacia) zusammengebracht, welches mit 0,05 M Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,5, 1 mM EDTA bei 4°C in einem Rührchargen-Modus äquilibriert wurde. Die Inkubation wurde 60 Minuten lang bei 4°C (gerührt) vorgenommen. Das Harz enthaltende Lysat wurde dann in eine Säule (18 × 90 cm, IBF/Sepracor Inc.) bei einer langsamen Fließgeschwindigkeit gepackt, bis ein stabiles Packbett mit einem darüberliegenden Pufferraum erhalten war. Das Harzbett wurde dann mit 0,05 M Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,5, und 1 mM EDTA unter Aufwärtsströmung im Wechsel mit Abwärtsströmung gewaschen, bis die meisten Zelltrümmer mit dem Auge erkennbar aus der Säule entfernt waren und der Ablauf klar war. Dies erforderte vier Richtungsänderungen des Stroms. Die Säule wurde dann mit 0,22 M NaCl in 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,5, 1 mM EDTA gewaschen. Der bFGF wurde dann mit 0,5 M NaCl im Ausgangspuffer eluiert.
Aus der Ausgangs-Zellmasse von 2,0 kg wurde etwa 6,5% des Proteins und nahezu der gesamte bFGF in der gebundenen und eluierten Fraktion erhalten. Dieses Material bestand zu etwa 80% in bFGF, ausgehend von einem immunologischen Assay unter Verwendung der Molecular Devices Threshold Machine. Eine wirksame Entfernung der Zelltrümmer wurde daher ohne Anwendung eines separaten Filtrationsschritts erreicht.
Beispiel 3
HIC-Reinigung - Stufenweise Gradientenmethode
Die Reinigung des bFGF wurde wie in Beispiel 1 vorgenommen, doch wurden die Bearbeitungsschritte aus Schritt 2 wie unten beschrieben variiert.
Das Eluat aus dem starken Kationenaustauscher wurde 1 : 1 mit 3 M Ammoniumsulfat in Puffer A verdünnt. Dieses Material wurde durch einen teilchenentfernten Filter passiert. Nach der Äquilibration mit 1,5 M Ammoniumsulfat in Puffer A wurde die in Beispiel 2 beschriebene Säule mit 30 mg Protein in 200 ml beladen. Die Säule wurde dann mit Äquilibrationspufter gewaschen, gefolgt von der Elution des gebundenen Proteins in einem schrittweisen Verfahren unter Verwendung von 1,25 M, 0,9 M und 0,5 M Ammoniumsulfat in Puffer A, Wasser und Natriumhydroxid. Eine Ausbeute von 53% wurde bei einem Hauptpeak-bFGF von 85% erzielt, wie mittels RP-HPLC bestimmt.
Beispiel 4
Die Reinigung des bFGF wurde wie in Beispiel 1 vorgenommen, doch wurden die Bearbeitungsbedingungen aus Schritt 2 wie unten beschrieben variiert.
Das Eluat aus dem starken Kationenaustauscher wurde 1 : 1 mit 3 M Ammoniumsulfat in Puffer A verdünnt. Nach der Filtration durch einen teilchenentfernenden Filter wurden 960 mg Protein in 100 ml Sulfopropyl-0,5M-NaCl-Puffer-Elutionspool (absteigende Seite) auf eine 159-ml-(4,5 cm × 10 cm)-Butyl 650S ToSoHaas (Philadelphia, PA)-Säule gepackt, welche in 1,5 Ammoniumsulfat in Puffer A äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 1,5 M Ammoniumsulfat in Puffer A nach der Proteinbeladung gewaschen. Die Säule und alle Puffer befanden sich bei Raumtemperatur. Die Elution des gebundenen Proteins wurde in einem stufenweisen Verfahren wie folgt vorgenommen: 1,5 M; 1,3 M; 1,25 M; 1,1 M; 0,9 M; 0,7 M; 0,45 M und 0,0 M Ammoniumsulfat, alle in Puffer A, 0,5 M Natriumhydroxid, 20% Ethanol und 30% Propylenglycol. Die Ausbeute betrug zwischen 62% und 81%, was davon abhing, welche Fraktionen bei 85% Hauptpeak-bFGF, wie mittels RP-HPLC bestimmt, gepoolt wurden.
Beispiel 5
Die Reinigung des bFGF wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, doch wurden die Bearbeitungsbedingungen aus Schritt 2 wie unten beschrieben variiert.
Das Eluat aus dem starken Kationenaustauscher wurde 1 : 1 mit 3 M Ammoniumsulfat in Puffer A verdünnt. Nach der Filtration durch einen teilchenentfernenden Filter wurden 85 mg Protein in 85 ml Sulfopropyl-0,5M-NaCl-Puffer-Elutionspool (aufsteigende Seite) auf eine 159-ml-(4,5 cm × 10 cm)-Butyl 650S ToSoHaas (Philadelphia, PA)-Säule gepackt, welche in 1,5 M Ammoniumsulfat in Puffer A äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 1,5 M Ammoniumsulfat in Puffer A nach der Proteinbeladung gewaschen. Die Säule und alle Puffer befanden sich bei Raumtemperatur. Die Elution des gebundenen Proteins wurde in einem schrittweisen Verfahren wie folgt vorgenommen: 1,5 M; 1,3 M; 1,25 M; 0,9 M; 0,7 M; 0,45 M und 0,0 M Ammoniumsulfat, alle in Puffer A; 0,5 M Natriumhydroxid; und 30 % Propylenglycol. Die Ausbeute betrug 15% bei 85% Hauptpeak-bFGF, wie mittels RP-HPLC bestimmt. Die Ausbeute war gering, da ein niedriger Prozentsatz an Produkt im Beladungsmaterial vorlag.
Beispiel 6
Die Reinigung des bFGF wurde wie in Beispiel 1 vorgenommen, doch wurden die Bearbeitungsbedingungen aus Schritt 2 wie unten beschrieben variiert.
Das Eluat aus dem starken Kationenaustauscher wurde 1 : 1 mit 3 M Ammoniumsulfat in Puffer A verdünnt. Nach der Filtration durch einen teilchenentfernenden Filter wurden 1026 mg Protein in 1000 ml Sulfopropyl-0,5M-NaCl-Puffer-Elutionspool auf eine 159-ml-(4,5 cm × 10 cm)-Butyl 650S ToSoHaas (Philadelphia, PA)-Säule gepackt, die in 1,5 Ammoniumsulfat in Puffer A äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 1,5 M Ammoniumsulfat in Puffer A nach der Proteinbeladung gewaschen. Die Säule und alle Puffer befanden sich bei Raumtemperatur. Die Elution von gebundenem Protein wurde in einem schrittweisen Verfahren wie folgt vorgenommen: 1,5 M; 1,3 M; 1,25 M; 1,1 M; 0,9 M; 0,45 M; und 0,0 M Ammoniumsulfat, alle in Puffer A. Eine Ausbeute von 92% wurde bei einem Hauptpeak-bFGF von mehr als 85%, wie mittels RP-HPLC bestimmt, erzielt.
Beispiel 7
HIC-Reinigung - Isokratische Methode
Die Reinigung des bFGF wurde wie in Beispiel 1 vorgenommen, doch wurden die Bearbeitungsbedingungen aus Schritt 2 wie unten beschrieben variiert.
Das Eluat aus dem starken Kationenaustauscher wurde 3 : 5 mit 100 mM KPi, 1,5 M Ammoniumsulfat, 1 mM EDTA, pH 6,5, verdünnt, wodurch die Ammoniumsulfat-Konzentration auf 0,9 M gebracht wurde. Unter Verwendung von Butyl-650M ToSoHaas-Harz (Philadelphia, PA) wurde eine 5 ml-(1,0 cm × 6,5 cm)-Säule befällt und mit 100 mM KPi, 0,9 M Ammoniumsulfat, 1 mM EDTA, pH 6,5, äquilibriert. Diese Säule wurde dann an einem Pharmacia-FPLC-System befestigt. Nach weiteren 10 Minuten der Äquilibration wurden 20 ml (37 mg Protein) des oben erwähnten Beladungsmaterials auf die Säule aufgebracht. Das System wurde dann weitere 30 Minuten lang bei isokratischen Bedingungen (100 mM KPi, 0,9 M Ammoniumsulfat, 1 mM EDTA, pH 6,5) gewaschen, was die UV-überwachte chromatographische Spur zurück zur Ausgangslinie brachte. Über die nächsten 10 Minuten hinweg wurde die Ammoniumsulfat-Konzentration unter Verwendung eines kontinuierlichen Gradienten auf Null reduziert, was die Freisetzung der an das HIC-Harz gebundenen kontaminierenden Proteine erleichterte.
2 ml-Fraktionen wurden über den gesamten Verlauf der chromatographischen Spur entnommen und jede dritte Fraktion auf ihre Proteinkonzentration mittels der Bradford-Methode ((Biorad, Richmond, CA) mit BSA als Standard untersucht. Diese Fraktionen wurden dann mit SDS-PAGE analysiert. Gemäß der visuellen Analyse des Gels wurden Fraktionen für die Reinheit gepoolt und dann nochmals mittels Bradford-Methode für Massenbilanz-Zwecke untersucht. Dies ergab eine Proteingewinnung von der Säule von 96% und eine Ausbeute von 92% bei 80 Hauptpeak-bFGF.
Eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ergab geringfügig höhere Mengen der Wirtszell-Kontamination (visuelle Beobachtung) bei bFGF enthaltenden Fraktionen als zuvor bei den oben beschriebenen schrittweisen Elutionsverfahren erkennbar. Dies ist mit größter Wahrscheinlichkeit auf die Tatsache rückführbar, dass bei der hierin beschriebenen isokratischen Methode der Ammoniumsulfat-Waschschritt, wie bei der schrittweisen Methode angewendet, weggelassen wird, der nachweislich eine beträchtliche Menge an Kontaminanten entfernt.
Beispiel 8
Schwache Kationenaustausch-Chromatographie
Die Reinigung des bFGF wurde wie in Beispiel 1 vorgenommen, doch wurden die Bearbeitungsbedingungen aus Schritten 2 und 3 wie unten beschrieben variiert.
Das Eluat aus der Hydrophoben Interaktions-Matrix (siehe Beispiel 3) wurde auf eine IE-HPLC-Säule (4,6 × 200 mm) im analytischen Maßstab, bestehend aus 5 μM an 1000 A-Kieselgelpackung, beschichtet mit Polyasparaginsäure (PolyCAT A von PolyLC, Inc., Columbia, MD), aufgebracht. Die Probe wurde unter Verwendung eines dualen Gradienten aus Ammoniumsulfat in 20 mM Kaliumphosphat und 1 mM EDTA bei pH 6,0 eluiert. Der duale Gradient bestand in einem anfänglichen langsamen Gradienten von 1,6 mM (NHa)₂SO₄/Min. bis 120 mM (NHa)₂SO₄/Min. bis zu einer Endkonzentration von 400 mM (NH₄)₂SO₄. Die Peak-Fraktionen wurden für die größten Peaks manuell entnommen, indem die Entnahme an der aufsteigenden Seite begonnen und an der absteigenden Seite beendet wurde. Die Ausbeute betrug etwa 60% bei einem Hauptpeak-bFGF von mehr als 95%.
Beispiel 9
Studien zur Maßstabsvergrößerung der schwachen Kationenaustausch-Chromatographie
Um die Auftrennung für Scale-up-Betrachtungen zu maximieren, wurden Studien unter Anwendung der isokratischen Elution wie oben beschrieben an einer 21 mm I. D. schwachen Kationenaustauschersäule im präparativen Maßstab zum Testen der optimalen Elutionsbedingungen zum Abtrennen des Hauptpeak-bFGF von anderen Unreinheiten durchgeführt. Basierend auf diesen Studien betrug die Differenz bei der Auftrennung (Hauptpeak-bFGF zur nächsten Unreinheit) zwischen einem 300 Å, 12 μm-Partikel und einem 1000 Å, 15–25 μm-Partikel bei Beladungen von <5 mg/ml des Säulenvolumens vernachlässigbar. Als optimalere Elutionsbedingungen, um die bei der isokratischen Elution feststellbaren Schwanzbildungswirkungen zu vermindern, erwies sich ein flacher Gradient von <0,5 mM (NH₄)₂SO₄/Min., ausgehend von 110 mM bis 125 mM (NHa)₂SO₄.
Modifikationen der oben beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung, die für Fachleute der verwandten Gebiete bei üblicher Sachkenntnis erkennbar sind, werden als in den Rahmen der folgenden Ansprüche fallend betrachtet.

Claims

Verfahren zum Gewinnen von gereinigtem bFGF aus einer Probe, die bFGF enthält, welches Verfahren umfasst: (a) Zusammenbringen einer bFGF enthaltenden Lösung mit einer starken Kationenaustauscher-Matrix, welche über einen pH-Bereich von 5 bis 7,5 vollständig ionisiert ist; (b) Eluieren aus der starken Kationenaustauscher-Matrix einer Vielzahl von Fraktionen, von denen mindestens eine bFGF enthält; (c) Zusammenbringen der bFGF enthaltenden Fraktionen der starken Kationenaustauscher-Matrix mit einer Hydrophoben Interaktions-Matrix; (d) Eluieren aus der Hydrophoben Interaktions-Matrix einer Vielzahl von Fraktionen, von denen mindestens eine bFGF enthält; (e) Zusammenbringen der bFGF enthaltenden Fraktionen der Hydrophoben Interaktions-Matrix mit einer schwachen Kationenaustauscher-Matrix, welche über einen pH-Bereich von 5 bis 7,5 nicht vollständig ionisiert ist und weiche über einen pH-Bereich von 6 bis 7 wirkt; (f) Eluieren aus der schwachen Kationenaustauscher-Matrix eine Vielzahl von Fraktionen, von denen mindestens eine bFGF enthält; (g) Gewinnen des gereinigten bFGF aus den bFGF enthaltenden Fraktionen der schwachen Kationenaustauscher-Matrix.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die starke Kationenaustauscher-Matrix gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Sulfopropyl-Agarose-, Dextran- und Acrylamid-Matrices.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Hydrophobe Interaktions-Matrix einen Träger umfasst, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Agarose, Kieselgel und polymeren Harzen, gekoppelt mit einer funktionellen Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phenyl, Acetyl und C_1-8-Alkylen.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die schwache Kationenaustauscher-Matrix einen Kieselgel-Träger in Koppelung an eine funktionelle Carboxylgruppe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die funktionelle Gruppe Polyasparaginsäure ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei jeder Eluierschritt bei einer Temperatur von 2°C bis 25°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Kontaktierschritte a, c und e und die Eluierschritte b, d und f bei einem ph-Wert von 6 bis 8 durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der gereinigte bFGF ein Protein-Analogon umfasst, bei dem ein oder mehrere Cystein-Reste durch einen neutralen Aminosäure-Rest ersetzt sind und wobei das Protein-Analogon die biologische Aktivität des nativen bFGF zeigt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der gereinigte bFGF ein Amino-terminales Deletions-Analogon des nativen bFGF umfasst.