DE69426804T4

DE69426804T4 - Cyclisch gmp bindende cyclisch gmp spezifische phosphodiesterase materialien und verfahren.

Info

Publication number: DE69426804T4
Application number: DE69426804T
Authority: DE
Inventors: A. Joseph BEAVO; D. Jackie CORBIN; M. Kenneth FERGUSON; H. Sharron FRANCIS; Ann Kadlecek; Kate Loughney; M. Linda McALLISTER-LUCAS; K. William SONNENBURG; K. Melissa THOMAS
Original assignee: University of Washington; Icos Corp
Current assignee: University of Washington; Icos Corp
Priority date: 1993-05-27
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2014-05-28
Also published as: JP2010042035A; CA2363537A1; WO1994028144A1; LV12814B; CA2141060C; LV12814A; EP1038963B1; US20060216809A1; US5955583A; JP4450767B2; EP0652960B1; ATE199569T1; ES2156898T3; US5702936A; US20050196833A1; DK1038963T3; ES2333691T3; US20030054992A1; PT1038963E; DE69435227D1

Description

Die hierin beschriebene experimentelle Arbeit wurde teilweise von den Forschungsgeldmitteln GM15731, DK21723, DK40029 und GM41269 und dem Medical Scientist Training Program Grant GM07347, der von den National Institutes of Health vergeben wird, unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten hat gewisse Rechte an der Erfindung.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine zyklisches Guanosinmonophosphat-bindende, für zyklisches Guanosinmonophosphat spezifische Phosphodiesterase, bezeichnet als cGB-PDE, und insbesondere neue aufgereinigte und isolierte Polynukleotide, die für cGB-PDE-Polypeptide kodieren, Verfahren und Materialien zur rekombinanten Herstellung von cGB-PDE-Polypeptiden und Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren der cGB-PDE-Aktivität.
Hintergrund
Zyklische Nukleotid-Phosphodiesterasen (PDEs), die die Hydrolyse von 3'5'-zyklischen Nukleotiden, wie zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), zu den entsprechenden Nukleosid-5'-Monophosphaten katalysieren, stellen eine komplexe Enzymfamilie dar. Durch Vermittlung der intrazellulären Konzentration der zyklischen Nukleotide funktionieren die PDE-Isoenzyme auf Signaltransduktionswegen, die zyklische Nukleotid-second-messengers einbeziehen.
Eine Vielzahl PDEs sind aus unterschiedlichen Gewebequellen isoliert worden, und viele der bis heute charakterisierten PDEs weisen Unterschiede hinsichtlich der biologischen Eigenschaften, einschließlich physikochemischer Eigenschaften, Substratspezifität, Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren, immunologische Reaktivität und Regulationsmodus auf. [Siehe Beavo et al., Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, John Wiley & Sons, Chichester, U.K. (1990)]. Ein Vergleich der bekannten Aminosäuresequenzen von verschiedenen PDEs zeigt an, daß die meisten PDEs chimäre Multidomän-Proteine sind, die unterschiedliche katalytische und regulatorische Domänen haben. [Siehe Charbonneau, S. 267–296 in Beavo et al., supra]. Alle bis heute charakterisierten Säugetier-PDEs haben eine Sequenz in der Länge von näherungsweise 250 Aminosäureresten gemeinsam, die das katalytische Zentrum zu umfassen scheint und sich in der carboxy-terminalen Region des Enzyms befindet. Es wird davon ausgegangen, daß PDE-Domänen, die mit allosterischen oder regulatorischen Molekülen wechselwirken, sich innerhalb der amino-terminalen Regionen der Isoenzyme befinden. Auf der Grundlage ihrer biologischen Eigenschaften können die PDEs in sechs allgemeine Familien klassifiziert werden: Die Ca²⁺/Calmodulin-stimulierten PDEs (Typ I), die cGMP-stimulierten PDEs (Typ II), die cGMP-inhibierten PDEs (Typ III), die cAMP-spezifischen PDEs (Typ IV), die cGMP-spezifische Phosphodiesterase cGB-PDE (Typ V), die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, und die cGMP-spezifischen Photorezeptor-PDEs (Typ VI).
Die cGMP-bindenden PDEs (Typ II, Typ V und Typ VI-PDEs) haben, zusätzlich zu einer homologen katalytischen Domäne nahe ihrem Carboxyterminus, eine zweite konservierte Sequenz, die sich näher an ihrem Aminoterminus befindet, und die eine allosterische cGMP-bindende Domäne umfassen kann. Siehe Charbonneau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 288–292 (1990).
Die Typ II cGMP-stimulierien PDEs (cGs-PDEs) sind in verschiedenen Gewebetypen weit verbreitet, und es wird davon ausgegangen, daß sie als Homodimere von Untereinheiten mit 100–105 kDa existieren. Die cGs-PDEs zeigen unter physiologischen Bedingungen eine Reaktion gegenüber erhöhten cGMP-Konzentrationen durch Erhöhen der cAMP-Hydrolyserate. Über die Aminosäuresequenz einer Rinderherz-cGs-PDE und eine partielle cDNA-Sequenz einer bovinen Nebennierenrinden-cGs-PDE wird in LeTrong et al., Biochemistry, 29: 10280–10288 (1990) berichtet, und bovine Nebennieren- und menschliche fötale Hirn-cGs-PDE-cDNA-Sequenzen voller Länge sind in Patent Cooperation Treaty Internationale Veröffentlichungsnr. WO 92/18541, veröffentlicht am 29. Oktober 1992, beschrieben. Die bovine Nebennieren-cDNA-Sequenz voller Länge wird ebenso in Sonnenburg et al., J. Biol. Chem., 266: 17655–17661 (1991) beschrieben.
Die Photorezeptor-PDEs und die cGB-PDE sind als cGMP-spezifische PDEs beschrieben worden, weil sie eine 50-fache oder größere Selektivität für die Hydrolyse von cGMP gegenüber cAMP aufweisen.
Die Photorezeptor-PDEs sind die Stäbchen-äußeres-Segment-PDE (ROS-PDE) und die Zäpfchen-PDE (COS-PDE). Die Holoenzymstruktur der ROS-PDE umfaßt zwei große Untereinheiten α (88 kDa) und β (84 kDa), die beide katalytisch aktiv sind, und zwei kleinere γ-regulatorische Untereinheiten (beide 11 kDa). Eine lösliche Form der ROS-PDE ist ebenso identifiziert worden, die α-, β- und γ-Untereinheiten und eine δ-Untereinheit (15 kDa) einschließt, die mit der COS-PDE-15-kDa-Untereinheit identisch zu sein scheint. Eine cDNA voller Länge, die der membranassoziierten bovinen ROS-PDE-α-Untereinheit entspricht, wird in Ovchinnikov et al., FEBS Lett., 223: 169–173 (1987) beschrieben, und eine cDNA voller Länge, die der bovinen Stäbchen-äußeres-Segment-PDE-β-Untereinheit entspricht, wird in Lipkin et al., J. Biol. Chem., 265: 12955–12959 (1990) beschrieben. Ovchinnikov et al., FEBS Lett., 204: 169–173 (1986) stellt eine cDNA voller Länge dar, die der bovinen ROS-PDE-γ-Untereinheit entspricht, und die Aminosäuresequenz der δ-Untereinheit. Über die Expression der ROS-PDE im Gehirn ist in Collins et al., Genomics, 13: 698–704 (1992) berichtet worden. Die COS-PDE ist aus zwei identischen α' (94 kDa) Untereinheiten und drei kleineren Untereinheiten von 11 kDa, 13 kDa und 15 kDa zusammengesetzt. Über eine cDNA voller Länge, die der bovinen COS-PDE-α'-Untereinheit entspricht, ist in Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 293–297 (1990) berichtet worden.
cGB-PDE ist bis zur Homogenität aus Ratte [Francis et al., Methods Enzymol., 159: 722–729 (1988)] und bovinem Lungengewebe [Thomas et al., J. Biol. Chem. 265: 14964–14970 (1990), hiernach „Thomas I"] aufgereinigt worden. Über die Anwesenheit dieses oder ähnlicher Enzyme ist in einer Vielzahl von Geweben und Arten berichtet worden, einschließlich Ratten- und menschlichen Blutplättchen [Hamet et al., Adv. Cyclic Nucleotide Protein Phosphorylation Res., 16: 119–136 (1984)], Rattenmilz [Coquil et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 127: 226–231 (1985)], Meerschweinchenlunge [Davis et al., J. Biol. Chem, 252: 4078–4084 (1977)], glatter Gefäßmuskel [Coquil et al., Biochim. Biophys. Acta, 631: 148–165 (1980)] und Seeigelsamen [Francis et al., J. Biol. Chem, 255: 620–626 (1979)] berichtet worden. cGB-PDE kann ein Homodimer sein, zusammengesetzt aus zwei 93 kDa-Untereinheiten. [Siehe Thomas I, oben]. Es ist gezeigt worden, daß cGB-PDE eine einzelne Stelle enthält, die in den anderen bekannten cGMP-bindenden PDEs nicht gefunden wird, die durch cGMP- abhängige Proteinkinase (cGK) und, mit einer geringeren Affinität, durch cAMP-abhängige Proteinkinase (cAK) phosphoryliert wird. [Siehe Thomas et al., J. Biol. Chem., 265: 14971–14978 (1990), hiernach „Thomas II"]. Die primäre Aminosäuresequenz der Phosphorylierungsstelle und des aminoterminalen Ende eine Fragments, das durch chymotryptischen Verdau von cGB-PDE erzeugt wird, sind in Thomas II, oben, bzw. Thomas I, oben, beschrieben. Jedoch ist der Hauptteil der Aminosäuresequenz von cGB-PDE nicht zuvor beschrieben worden.
Verschiedene Inhibitoren verschiedener Typen von PDEs sind in der Literatur beschrieben worden. Zwei Inhibitoren, die eine gewisse Spezifität für Typ V-PDEs aufweisen, sind Zaprinast und Dipyridamol. Siehe Francis et al., S. 117–140 in Beavo et al., oben.
Eine Aufkärung der DNA- und Aminosäuresequenzen, die für die cGB-PDE kodieren, und die Herstellung von cGB-PDE-Polypeptid mittels rekombinanter Methoden würde Information und, Material zur Verfügung stellen, um die Identifizierung von neuen Mitteln zu ermöglichen, die selektiv die Aktivität der cGB-PDEs modulieren. Die Erkenntnis, daß es verschiedene Typen oder Familien von PDE-Isoenzymen gibt und daß verschiedene Gewebe verschiedene Komplemente von PDEs exprimieren, hat zu einem Interesse an der Entwicklung von PDE-Modulatoren geführt, die therapeutische Indikationen für Krankheitszustände haben können, die Signaltransduktionswege einbeziehen, welche zyklische Nukleotide als second messengers verwenden. Verschiedene selektive und nicht-selektive Inhibitoren der PDE-Aktivität sind in Murray et al., Biochem. Soc. Trans., 20 (2): 460–464 (1992) diskutiert. Die Entwicklung von PDE-Modulatoren ohne die Fähigkeit, eine spezifische PDE mittels rekombinanter DNA-Techniken zu produzieren, ist schwierig, weil alle PDEs dieselbe Grundreaktion katalysieren, überlappende Substratspezifitäten haben und nur in Spuren vorkommen. Infolgedessen ist die Aufreinigung bis zur Homogenität vieler PDEs ein mühsamer und schwieriger Prozeß.
Es gibt somit auf dem Gebiet weiterhin einen Bedarf für DNA- und Aminosäuresequenz-Information für die cGB-PDE, für Verfahren und Materialien zur rekombinanten Herstellung von cGB-PDE-Polypeptiden und für Verfahren zum Identifizieren spezifischer Modulatoren der cGB-PDE-Aktivität.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue aufgereinigte und isolierte Polynukleotide (z. B. DNA-Sequenzen und RNA-Transkripte, sowohl Sense- als auch Antisense-Stränge, einschließlich Splice-Varianten davon) bereit, die für das humane, cGMP-bindende, cGMP-spezifische PDE (cGB-PDE)-Polypeptid kodieren, das in SEQ ID NO: 23 dargestellt ist. Ebenso wird von der vorliegenden Erfindung ein aufgereinigtes und isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das für eine humane, allelische Variante des in SEQ ID NO: 23 dargestellten cGB-PDE-Polypeptids kodiert, wobei besagtes Polynukleotid bei ungefähr 65°C in 3 × SSC, 20 mM Natriumphosphat pH 6,8, unter Waschen bei ungefähr 65°C in 2 × SSC, an den nicht-kodierenden Strang der in SEQ ID NO: 22 dargestellten DNA hybridisiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiter ein aufgereinigtes und isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, das die in SEQ ID NO: 22 dargestellte DNA-Sequenz umfaßt. Bevorzugte DNA-Sequenzen der Erfindung schließen genomische und cDNA-Sequenzen sowie vollständig oder partiell chemisch synthetisierte DNA-Sequenzen ein. Die für cGB-PDE kodierenden DNA-Sequenzen, die in SEQ ID NO: 9 oder 20 dargestellt sind, und DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen daran hybridisieren, oder DNA-Sequenzen, die ohne die Redundanz des genetischen Codes daran hybridisieren würden, werden hierin offenbart. Ebenso werden biologische Replicas (d. h. Kopien von isolierten DNA-Sequenzen, die in vivo oder in vitro gemacht worden sind) von DNA-Sequenzen der Erfindung erwogen. Autonom replizierende rekombinante Konstruktionen, wie etwa Plasmid- und virale DNA-Vektoren, die die cGB-PDE-Sequenzen der Erfindung einbeziehen, und insbesondere Vektoren, bei denen die DNA, die für die cGB-PDE der Erfindung kodiert, operativ an eine endogene oder exogene Expressionskontroll-DNA-Sequenz und einen Transkriptionsterminator geknüpft sind, werden ebenso bereitgestellt. Die Expressionsplasmide der Erfindung illustriert insbesondere das Plasmid hcgbmet156-2 6n in E. coli Stanmm JM 109, der bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, am 4. Mai 1993 als Hinterlegungsnr. 69296 hinterlegt wurde.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden Wirtszellen, einschließlich prokaryotischer und eukaryotischer Zellen, mit den DNA-Sequenzen der Erfindung auf eine Weise stabil transformiert, die es ermöglicht, die erwünschten Polypeptide darin zu exprimieren. Wirtszellen, die die cGB-PDE-Produkte exprimieren, können einer Vielzahl nützlicher Zwecke dienen. Solche Zellen stellen eine wertvolle Immunogen-Quelle für die Entwicklung von An tikörpersubstanzen dar, die mit cGB-PDE spezifisch immunreaktiv sind. Wirtszellen der Erfindung sind bei Verfahren in großem Maßstab zur Herstellung von cGB-PDE-Polypeptiden bemerkenswert nützlich, bei denen die Zellen in einem geeigneten Kulturmedium wachsen gelassen werden und die gewünschten Polypeptidprodukte aus den Zellen oder aus dem Medium, in dem die Zellen wachsen gelassen werden, z. B. durch Immunaffinitätsaufreinigung isoliert werden.
cGB-PDE-Produkte können als Isolate aus natürlichen Zell-Quellen erhalten werden oder können chemisch synthetisiert werden, werden aber bevorzugt durch rekombinante Prozeduren hergestellt, die die Wirtszellen der Erfindung einbeziehen. Es wird erwartet, daß die Verwendung von Säugetierwirtszellen solche posttranslationalen Modifizierungen bereitstellt (z. B. Glycosylierung, Verkürzung, Anhängen von Lipiden, und Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Phosphorylierung), die benötigt werden können, um den rekombinanten Expressionsprodukten der Erfindung optimale biologische Aktivität zu verleihen. cGB-PDE-Produkte der Erfindung können Polypeptide voller Länge, Fragmente oder Varianten sein. Die Varianten können cGB-PDE-Polypeptid-Analoge umfassen, bei denen eine oder mehrere der spezifizierten (d. h. natürlich kodierten) Aminosäuren deletiert oder ersetzt ist, oder bei denen eine oder mehrere nicht-spezifizierte Aminosäuren zugefügt sind: (1) ohne Verlust von einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten oder immunologischer Eigenschaften, die für cGB-PDE spezifisch sind; oder (2) mit spezifischer Behinderung einer besonderen biologischen Aktivität von cGB-PDE.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiter ein Fragment humaner cGB-PDE, das aus den Aminosäuren 516–875 von SEQ ID NO: 23 besteht, ein Fragment humaner cGB-PDE, das aus den Aminosäuren 1–494 von SEQ ID NO: 23 besteht, ein Fragment der humanen cGB-PDE, das aus den Aminosäuren 1–549 von SEQ ID NO: 23 besteht, und ein Fragment der humanen cGB-PDE bereitgestellt, das aus den Aminosäuren 515–819 von SEQ ID NO: 23 besteht.
Ebenso werden von der vorliegenden Erfindung Antikörpersubstanzen bereitgestellt (z. B. monoklonale und polyklonale Antikörper, Einzelketten-Antikörper, chimäre Antikörper, CDR-grafted Antikörper und ähnliche), die spezifisch immunreaktiv sind mit der cGB-PDE, wie dargestellt in SEQ ID NO: 23. Andere Bindungsproteine, die für cGB-PDE spezifisch sind, werden ebenso offenbart. Spezifische Bindungsproteine können unter Verwendung isolierter oder rekombinanter cGB-PDE oder cGB-PDE-Varianten oder Zellen, die solche Pro dukte exprimieren, entwickelt werden. Bindungsproteine sind wiederum bei Zusammensetzungen zur Immunisierung sowie zum Aufreinigen von cGB-PDE-Polypeptiden und dem Nachweis oder der Quantifizierung von cGB-PDE-Polypeptiden in Flüssig- und Gewebeproben mittels bekannter immunologischer Prozeduren nützlich. Sie sind ebenso deutlich nützlich beim Modulieren (d. h. Blockieren, Inhibieren oder Stimulieren) von biochemischen Aktivitäten von cGB-PDE, insbesondere denjenigen Aktivitäten, die bei der Signaltransduktion beteiligt sind. Anti-idiotypische Antikörper, die für anti-cGB-PDE-Antikörpersubstanzen spezifisch sind, werden ebenso in Erwägung gezogen.
Der wissenschaftliche Wert der durch die Offenbarungen der DNA- und Aminosäuressequenzen der vorliegenden Erfindung beigetragenen Information ist offensichtlich. Als eine Beispielsserie macht die Kenntnis der Sequenz einer cDNA für cGB-PDE die Isolierung mittels DNA/DNA-Hybridisierung von genomischen DNA-Sequenzen möglich, die für cGB-PDE kodieren und cGB-PDE-Expression-regulatorische Kontrollsequenzen, wie etwa Promotoren, Operatoren und ähnliche spezifizieren. Ebenso wird erwartet, daß DNA/DNA-Hybridisierungsprozeduren, die mit DNA-Sequenzen der Erfindung unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden, die Isolierung von DNAs ermöglichen, die für allelische Varianten von cGB-PDE, andere strukturell verwandte Proteine, die eine oder mehrere der biochemischen und/oder immunologischen Eigenschaften, die für cGB-PDE spezifisch sind, gemeinsam haben, und für Proteine von nicht-humanen Spezies kodieren, die zu cGB-PDE homolog sind. Die Polynukleotide der Erfindung sind, wenn sie auf geeignete Weise markiert sind, in Hybridisierungsassays nützlich, um die Fähigkeit von Zellen, cGB-PDE zu synthetisieren, nachzuweisen. Die Polynukleotide der Erfindung können ebenso die Grundlage für diagnostische Methoden sein, die zum Identifizieren einer genetischen Alterationen) am cGB-PDE-Lokus nützlich sind, die einem Krankheitszustand oder -zuständen zugrunde liegt. Ebenso werden von der Erfindung Antisense-Polynukleotide verfügbar gemacht, die zum Regulieren der Expression von cGB-PDE durch diejenigen Zellen, die dieselbe normalerweise exprimieren, relevant sind.
Die DNA- und Aminosäuresequenz-Information, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, macht ebenso die systematische Analyse der Struktur und Funktion von cGB-PDE und die Definition der Moleküle möglich, mit denen sie wechselwirken wird. Mittel, die die cGB-PDE-Aktivität modulieren, können durch Inkubieren eines vermeintlichen Modulators mit dem Lysat aus eukaryotischen Zellen, die rekombinante cGB-PDE exprimieren, und durch Bestimmen der Wirkung des vermeintlichen Modulators auf die cGB-PDE-Phosphodiesteraseaktivität identifiziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform fehlt der eukaryotischen Zelle eine endogene zyklische Nukleotid-Phosphodiesteraseaktivität. Eine solche eukaryotische Zelle illustriert insbesondere der Hefestamm YKS45, der bei der ATCC am 19. Mai 1993 als Hinterlegungsnr. 74225 hinterlegt wurde. Die Selektivität einer Verbindung, die die Aktivität der cGB-PDE moduliert, kann durch Vergleich ihrer Aktivität auf die cGB-PDE mit ihrer Aktivität auf andere PDE-Isozyme bewertet werden. Die Kombination der rekombinanten cGB-PDE-Produkte der Erfindung mit anderen rekombinanten PDE-Produkten in einer Reihe von unabhängigen Assays stellt ein System zum Entwickeln von selektiven Modulatoren von cGB-PDE bereit.
Selektive Modulatoren können z. B. Antikörper und andere Proteine oder Peptide einschließen, die spezifisch an die cGB-PDE oder cGB-PDE-Nukleinsäure binden, Oligonukleotide, die spezifisch an die cGB-PDE oder cGB-PDE-Nukleinsäure binden, und andere nicht-Peptid-Verbindungen (z. B. isolierte oder synthetische organische Moleküle), die spezifisch mit cGB-PDE oder cGB-PDE-Nukleinsäure reagieren. Mutante Formen von cGB-PDE, die die enzymatische Aktivität oder zelluläre Lokalisierung der Wildtyp-cGB-PDE beeinflussen, werden ebenso in Erwägung gezogen. Gegenwärtig bevorzugte Targets zur Entwicklung von selektiven Modulatoren schließen z. B. ein: (1) Die Regionen der cGB-PDE, die mit anderen Proteinen in Kontakt kommen und/oder die cGB-PDE innerhalb einer Zelle lokalisieren, (2) die Regionen der cGB-PDE, die Substrat binden, (3) die allosterische(n) cGMP-bindende(n) Stelle(n) von cGB-PDE, (4) die Phosphorylierungsstelle(n) von cGB-PDE und (5) die Regionen der cGB-PDE, die bei der Dimerisierung der cGB-PDE-Untereinheiten beteiligt sind. Die Modulatoren der cGB-PDE-Aktivität können bei der Behandlung eines breiten Bereichs an Krankheiten und physiologischen Zuständen therapeutisch nützlich sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Zahlreiche andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung davon offensichtlich sein, wobei Bezug auf die Zeichnungen genommen wird, wobei:
1A bis 1C ein Alignment der konservierten katalytischen Domänen von mehreren PDE-Isoenzymen ist, wobei Reste, die bei allen aufgelisteten PDEs identisch sind, durch ihre Ein-Buchstaben-Aminosäure-Abkürzung auf der „konserviert"-Zeile angezeigt sind, Reste, die bei der cGB-PDE und den Photorezeptor-PDEs identisch sind, nur durch einen Stern auf der „konserviert"-Zeile angezeigt sind, und Lücken, die für ein optimales Alignment eingeführt wurden, durch Leerzeichen angezeigt sind;
2A bis 2C ein Alignment der cGMP-bindenden Domänen mehrerer PDE-Isoenzyme ist, wobei Reste, die in allen aufgelisteten PDEs identisch sind, durch ihre Ein-Buchstaben-Aminosäure-Abkürzung auf der „konserviert"-Zeile angezeigt sind und Lücken, die für ein optimales Alignment eingeführt wurden, durch Leerstellen angezeigt sind;
3 ein Alignment von intern homologen Repeats aus mehreren PDE-Isoenzymen ist, wobei identische Reste in jedem Repeat A und B aus allen aufgelisteten cGMP-bindenden PDEs durch ihre Ein-Buchstaben-Aminosäure-Abkürzung auf der „konserviert"-Zeile angezeigt sind und Sterne auf der „konserviert"-Zeile Positionen repräsentieren, an denen alle Reste chemisch konserviert sind;
4 schematisch die Domänenorganisation von cGB-PDE darstellt;
5 ein Balkendiagramm ist, das die Resultate von Experimenten repräsentiert, bei denen Extrakte von COS-Zellen, die mit bovinen cGB-PDE-Sequenzen transfiziert worden sind, oder Extrakte von nicht-transfizierten COS-Zellen auf Phosphodiesteraseaktivität getestet wurden unter Verwendung von entweder 20 μM cGMP oder 20 μM cAMP als das Substrat;
6 ein Diagramm ist, das die Resultate von Assays von Extrakten aus Zellen darstellt, die mit bovinen cGB-PDE-Sequenzen transfiziert worden sind, auf cGMP-Phosphodiesteraseaktivität in der Anwesenheit einer Konzentrationsreihe von Phosphodiesterase-Inhibitoren, einschließlich Dipyridamol (ausgefüllte Quadrate), Zaprinast (ausgefüllte Kreise), Methoxymethylxanthin (ausgefüllte Dreiecke) und Rolipram (nicht-ausgefüllte Kreise);
7 ein Balkendiagramm ist, das Resultate von Experimenten präsentiert, bei denen Zellextrakte von COS-Zellen, die mit bovinen cGB-PDE-Sequenzen transfiziert worden sind, oder nicht-transfizierten Kontroll-COS-Zellen auf [³H]cGMP-bindende Aktivität in der Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) von 0,2 mM IBMX getestet wurden; und
8 ein Diagramm der Resultate von Assays ist, bei denen Extrakte aus Zellen, die mit bovinen cGB-PDE-Sequenzen transfiziert worden sind, auf [³H]cGMP-bindende Aktivität in der Anwesenheit von überschüssigem nicht-markiertem cAMP (nicht-ausgefüllte Kreise) oder cGMP (ausgefüllte Kreise) in den angezeigten Konzentrationen getestet wurden.
Detaillierte Beschreibung
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung. Beispiel 1 beschreibt die Isolierung eines bovinen cGB-PDE-cDNA-Fragments mittels PCR und die darauffolgende Isolierung einer cGB-PDE-cDNA voller Länge unter Verwendung des PCR-Fragments als eine Sonde. Beispiel 2 stellt eine Analyse der Beziehung der bovinen cGB-PDE-Aminosäuresequenz mit Sequenzen dar, die für verschiedene andere PDEs berichtet worden sind. Eine Northern-Blot-Analyse von cGB-PDE-mRNA in verschiedenen bovinen Geweben wird in Beispiel 3 präsentiert. Die Expression der bovinen cGB-PDE-cDNA in COS-Zellen wird in Beispiel 4 beschrieben. Beispiel 5 präsentiert Assay-Resultate des cGB-PDE-COS-Zellexpressionsprodukts auf Phosphodiesteraseaktivität, cGMP-bindende Aktivität und Zn²⁺-Hydrolaseaktivität. Beispiel 6 beschreibt die Isolierung von humanen cDNAs, die mit der bovinen cGB-PDE-cDNA homolog sind. Die Expression einer humanen cGB-PDE-cDNA in Hefezellen wird in Beispiel 7 präsentiert. RNase-Protection-Assays zum Nachweis von cGB-PDE in menschlichen Geweben werden in Beispiel 8 beschrieben. Beispiel 9 beschreibt die bakterielle Expression humaner cGB-PDE-cDNA und die Entwicklung von Antikörpern, die mit dem bakteriellen cGB-PDE-Expressionsprodukt reaktiv sind. Beispiel 10 beschreibt cGB-PDE-Analoge und -Fragmente. Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, die cGB-PDE erkennen, wird in Beispiel 11 beschrieben. Beispiel 12 betrifft die Verwendung rekombinanter cGB-PDE-Produkte der Erfindung zur Entwicklung von Mitteln, die selektiv die biologischen Aktivitäten von cGB-PDE modulieren.
Beispiel 1
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um ein cDNA-Fragment zu isolieren, das für einen Teil von cGB-PDE kodiert, aus Erststrang-cDNA aus Rinderlunge. Voll degenerierte Sense- und Antisense-PCR-Primer wurden auf der Grundlage der partiellen cGB-PDE-Aminosäuresequenz entworfen, die in Thomas I, oben, beschrieben ist, und neuer partieller Aminosäuresequenz-Infomation.
A. Aufreinigung von cGB-PDE-Protein
cGB-PDE wurde, wie in Thomas I, oben, beschrieben, aufgereinigt, oder mittels einer Modifizierung des unten beschriebenen Verfahrens.
Frische Rinderlungen (5–10 kg) wurden von einem Schlachthof erhalten und sofort auf Eis gelegt. Das Gewebe wurde zermahlen und mit kaltem PEM-Puffer kombiniert (20 nM Natriumphosphat, pH 6.8, enthaltend 2 mM EDTA und 25 mM β-Mercaptoethanol). Nach Homogenisierung und Zentrifugation wurde der resultierende Überstand mit 4–7 Litern DEAE-Zellulose (Whatman, UK) für 3–4 Stunden inkubiert. Der DEAE-Schlamm wurde dann unter Vakuum gefiltert und mit mehreren Volumina kaltem PEM gespült. Das Harz wurde in eine Glassäule gegossen und mit drei bis vier Volumina PEM gewaschen. Das Protein wurde mit 100 mM NaCl in PEM eluiert und zwölf 1-Liter-Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden auf IBMX-stimulierte cGMP-bindende und cGMP-Phosphodiesterase-Aktivitäten mit Standardprozeduren, beschrieben in Thomas et al., oben, getestet. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, 2-fach mit kaltem, entionisiertem Wasser verdünnt und einer Blue Sepharose^® CL-6B-Chromatographie (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) unterzogen. Eine Zinkchelat-Affinität-adsorbierende Chromatographie wurde dann unter Verwendung von entweder einer Agarose- oder Sepharose-basierenden Gelmatrix durchgeführt. Der resultierende Protein-Pool aus dem Zink-Chelierungsschritt wurde behandelt, wie in Thomas I, oben, beschrieben, oder wurde einer modifizierten Aufreinigungsprozedur unterzogen.
Wie in Thomas I, oben, beschrieben, wurde der Protein-Pool in vielfachen Ladungen auf eine HPLC Bio-Sil TSK-545 DEAE-Säule (150 × 21.5 mm) (BioRad Laboratories, Hercules, CA) aufgetragen, die in PEM bei 4°C äquilibriert worden war. Nach einer Äquilibrierungsperiode wurde eine 120-ml-Waschung mit 50 mM NaCl in PEM von einer 120 ml-Lineargradienten-Elution (50–200 mM NaCl in PEM) bei einer Durchflußrate von 2 ml/Minute gefolgt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und im Dialyseschlauch gegen Sephadex G-200 (Boehringer Mannheim Biochemicals, UK) auf ein Endvolumen von 1,5 ml konzentriert. Der konzentrierte cGB-PDE-Pool wurde auf eine HPLC-Gelfiltrationssäule (Bio-Sil TSK-250, 500 × 21,5 mm) aufgetragen, die in 100 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 mM EDTA, 25 mM β-Mercaptoethanol äquilibriert worden war, und bei einer Durchflußrate von 2 ml/Minute bei 4°C eluiert.
Wenn die modifizierte, weniger beschwerliche Prozedur durchgeführt wurde, wurde der Protein-Pool gegen PEM für 2 Stunden dialysiert und auf eine präparative 10 ml DEAE-Sephacel-Säule (Pharmacia) geladen, die in PEM-Puffer äquilibriert worden war. Das Protein wurde chargenweise mit 0,5 M NaCl in PEM eluiert, was zu einer näherungsweise 10–15-fachen Aufkonzentrierung des Proteins führte. Die konzentrierte Proteinprobe wurde auf eine 800 ml (2,5 cm × 154 cm) Sephacryl S400 Gelfiltrationssäule (Boehringer) geladen, die in 0,1 M NaCl in PEM äquilibriert worden war, und bei einer Durchflußrate von 1,7 ml/Minute eluiert.
Die Reinheit des Proteins wurde mittels Coomassie-Färbung nach einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) beurteilt. Näherungsweise 0,5–3,0 mg reine cGB-PDE wurden pro 10 kg Rinderlunge erhalten.
Polyklonale Kaninchen-Antikörper, die für die aufgereinigte Rinder-cGB-PDE spezifisch waren, wurden mittels Standardprozeduren erzeugt.
B. Aminosäure-Sequenzierung von cGB-PDE
Die cGB-PDE wurde mit [³²P]ATP phosphoryliert und wurde dann mit Protease verdaut, um ³²P-markerte Phosphopeptide zu ergeben. Näherungsweise 100 μg aufgereinigte cGB-PDE wurde in einer Reaktionsmischung, enthaltend 9 mM MgCl₂, 9 μM [³²P]ATP, 10 μM cGMP und 4,2 μg aufgereinigte bovine katalytische Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase (cAK) in einem Endvolumen von 900 μl, phosphoryliert. Die katalytische Untereinheit von cAK wurde gemäß dem Verfahren von Flockhart et al., Seiten 209–215 in Marangos et al., Brain Receptor Methodologies, Teil A, Academic Press, Orlando, Florida (1984) hergestellt. Die Reaktion wurde für 30 Minuten bei 30°C inkubiert und durch Zugabe von 60 μl 200 mM EDTA abgebrochen.
Um eine erste Peptidsequenz von cGB-PDE zu erhalten, wurden 3,7 μl einer 1 mg/ml-Lösung von α-Chymotrypsin in KPE-Puffer (10 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, mit 2 mM EDTA) zu 100 μg aufgereinigter, phosphorylierter cGB-PDE zugegeben, und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 30°C inkubiert. Die Proteolyse wurde durch Zugabe von 50 μl 10% SDS und 25 μl β-Mercaptoethanol abgebrochen. Die Probe wurde gekocht, bis das Volumen auf weniger als 400 μl reduziert war, und wurde auf ein 8% präparatives SDS-Polyacrylamidgel geladen und einer Elektrophorese bei 50 mAmps unterzogen. Die aufgetrennten Verdauungsprodukte wurden auf Immobilon-Polyvinylidendifluorid elektro-geblottet (Millipore, Bedford, MA), gemäß dem Verfahren von Matsudaira, J. Biol. Chem, 262: 10035–10038 (1987). Das übertragene Protein wurde mittels Coomassie-Blau-Färbung identifiziert, und eine 50 kDa Bande wurde aus der Membran ausgeschnitten für eine automatisierte Gasphasen-Aminosäure-Sequenzierung. Die Sequenz des Peptids, das durch die α-chymotryptische Verdauungsprozedur erhalten wurde, wird unten als SEQ ID NO: 1 dargestellt.
Eine zweite Sequenz wurde von einem cGB-PDE-Peptidfragment erhalten, das durch V8-Proteolyse erzeugt worden war. Näherungsweise 200 μg aufgereinigte cGB-PDE wurden zu 10 mM MgCl₂, 10 μM [³²P]ATP, 100 μM cGMP und 1 μg/ml aufgereinigte katalalytische Untereinheit von cAK in einem Endvolumen von 1,4 ml zugegeben. Die Reaktion wurde für 30 Minuten bei 30°C inkubiert und wurde durch die Zugabe von 160 μl 0,2 M EDTA beendet. Als nächstes wurden 9 μl von 1 mg/ml Staphylococcal aureus V8-Protease (International Chemical Nuclear Biomedicals, Costa Mesa, CA), verdünnt in KPE, zugegeben, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation bei 30°C. Die Proteolyse wurde durch Zugabe von 88 μl 10% SDS und 45 μl β-Mercaptoethanol abgebrochen. Die Verdauungsprodukte wurden mittels Elektrophorese auf einem präparativen 10% SDS-Polyacrylamidgel getrennt, das bei 25 mAmps für 4,5 Stunden laufen gelassen wurde. Die Proteine wurden elektro-geblottet und wie oben beschrieben gefärbt. Eine 28 kDa-Proteinbande wurde aus der Membran ausgeschnitten und einer automatisierten Gasphasen-Aminosäure-Sequenzierung unterzogen. Die erhaltene Sequenz ist unten als SEQ ID NO: 2 dargestellt.
C. PCR-Amplifizierung von boviner cDNA
Die partiellen Aminosäuresequenzen, die verwendet wurden, um Primer zu konstruieren (SEQ ID NO: 3, unten, und Aminosäuren 9–20 von SEQ ID NO: 1) und die Sequenzen der entsprechenden PCR-Primer (in der IUPAC-Nomenklatur) sind unten dargestellt, wobei SEQ ID NO: 3 die in Thomas I, oben, berichtete Sequenz ist.
Die Sense- und Antisense-Primer, die unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 380A DNA Synthesizer (Foster City, CA) synthetisiert wurden, wurden in allen möglichen Kombinationen verwendet, um die cGB-PDE-spezifischen Sequenzen aus Erststrang-cDNA aus Rinderlunge zu amplifizieren, wie unten beschrieben.
Nach einer Ethanolfällung wurden Paare von Oligonukleotiden (SEQ ID NO: 4 oder 5, kombiniert mit SEQ ID NO: 6, 7 oder 8) bei jeweils 400 nM in einer PCR-Reaktion kombiniert. Die Reaktion wurde unter Verwendung von 50 ng Erststrang-cDNA aus Rinderlunge (erzeugt unter Verwendung von AMV-reverser-Transkriptase und Random-Primern auf Oligo-dT-ausgewählter mRNA aus Rinderlunge), 200 μM dNTPs und 2 Einheiten Taq-Polymerase durchgeführt. Der anfängliche Denaturierungsschritt wurde bei 94°C für 5 Minuten durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen eines 1-minütigen Denaturierungsschritt bei 94°C, einem 2-minütigen Annealingschritt bei 50°C und einem 2-minütigen Extensionsschritt bei 7°C. Die PCR wurde unter Verwendung eines Hybaid Thermal Reactor (ENK Scientific Products, Saratoga, CA) durchgeführt, und die Produkte wurden mittels Gelelektrophorese auf einem 1%-Niedrig-Schmelzpunkt-Agarosegel getrennt, das in 40 mM Tris-acetat, 2 mM EDTA laufen gelassen wurde. Eine schwache Bande von ungefähr 800–840 bp wurde bei den Primern, dargestellt in SEQ ID NO: 4 und 7, und bei den Primern, dargestellt in SEQ ID NO: 4 und 8, gesehen. Keines der anderen Primer-Paare ergab sichtbare Banden. Das PCR-Produkt, das durch die Amplifizierung mit den Primern, dargestellt in SEQ ID NO: 4 und 7, erzeugt worden war, wurde unter Verwendung des Gene Clean^® (Bio101, La Jolla, CA) DNA-Aufreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Das PCR-Produkt (20 ng) wurde in 200 ng linearisiertem pBluescript KS(+) (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert, und das resultierende Plasmidkonstrukt wurde verwendet, um E. coli XL1 Blue-Zellen zu transformieren (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Vermeintliche Transformationspositive wurden mittels Sequenzierung gescreent. Die erhaltenen Sequenzen waren zu keiner bekannten PDE-Sequenz oder zu den bekannten partiellen cGB-PDE-Sequenzen homolog.
Die PCR wurde wieder an Erststrang-cDNA aus Rinderlunge unter Verwendung der in SEQ ID NO: 4 und 7 dargestellten Primer durchgeführt. Ein Klon, der ein 0,8 kb-Insert mit einem einzelnen großen offenen Leserahmen enthielt, wurde identifiziert. Der offene Leserahmen kodierte für ein Polypeptid, das die Aminosäuren KNTM einschloß (Aminosäuren 17–20 aus SEQ ID NO: 1, die nicht verwendet wurden, um die Primersequenz zu konstruieren, die in SEQ ID NO: 7 dargestellt ist), und das einen hohen Homologiegrad zu den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der cGs-, ROS- und COS-PDEs besaß. Der identifizierte Klon entspricht Nukleotiden 489–1312 aus SEQ ID NO: 9.
D. Konstruktion und Hybridisierungsscreening einer bovinen cDNA-Bibliothek
Um eine cDNA zu erhalten, die für eine cGB-PDE voller Länge kodiert, wurde eine cDNA-Bibliothek aus Rinderlunge gescreent unter Verwendung des ³²P-markierten, PCR-erzeugten cDNA-Insert als eine Sonde.
Polyadenylierte RNA wurde aus Rinderlunge hergestellt, wie beschrieben von Sonnenburg et al., J. Biol. Chem. 266: 17655–17661 (1991). Erststrang-cDNA wurde synthetisiert unter Verwendung von AMV reverser Transkriptase (Life Sciences, St. Petersburg, FL) mit Random-Hexanukleotid-Primern, wie beschrieben in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1987). Zweitstrang-cDNA wurde synthetisiert unter Verwendung von E. coli DNA-Polymerase-I in der Anwesenheit von E. coli DNA-Ligase und E. coli RNAse H. Eine Auswahl von cDNAs, die größer als 500 bp waren, wurde mittels Sepharose^® CL-4B (Millipore)-Chromatography getroffen. EcoRI-Adaptoren (Promega, Madison, WI) wurden an die cDNA unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Nach einer Hitzeinaktivierung der Ligase wurde die cDNA unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert. Nicht-ligierte Adaptoren wurden mittels Sepharose^® CL-4B-Chromatographie entfernt (Pharmacia, Piscataway, NJ). Die cDNA wurde in EcoRI-verdaute, dephosphorylierte Lambda-Zap^®II-Arme (Stratagene) ligiert und mit Gigapack^® Gold (Strategene)-Extrakten gemäß dem Herstellerprotokoll verpackt. Der Titer der nicht-amplifizierten Bibliothek war 9,9 × 10⁵ mit 18% Nicht-rekombinanten. Die Bibliothek wurde durch Ausplattieren von 50.000 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) auf zwanzig 150 mm-Platten amplifiziert, was zu einem Endtiter von 5,95 × 10⁶ pfu/ml mit 21% Nicht-rekombinanten führte.
Die Bibliothek wurde auf vierundzwanzig 150 mm-Platten in 50.000 pfu/Platte ausplattiert und mit dem ³²P-markierten cDNA-Klon gescreent. Die Sonde wurde unter Verwendung des Verfahrens von Feinberg et al., Anal. Biochem. 137: 266–267 (1984) hergestellt, und die ³²P-markierte DNA wurde unter Verwendung von Elutip-D^®-Säulen aufgereinigt (Schleicher and Schuell Inc., Keene, NH) unter Verwendung des Herstellerprotokolls. Das Abnehmen von Plaques wurde unter Verwendung von 15-cm Nitrocellulosefiltern durchgeführt. Nach einer Denaturierung und Neutralisation wurde die DNA auf die Filter fixiert durch Backen bei 80°C für 2 Stunden. Die Hybridisierung wurde bei 42°C über Nacht in einer Lösung, enthaltend 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,75 M Natriumzitrat, pH 7), 25 mM Natriumphosphat (pH 7,0), 2 × Denhardtsche Lösung, 10% Dextransulfat, 90 μg/ml Hefe-tRNA und näherungsweise 10⁶ cpm/ml ³²P-markierte Sonde (5 × 10⁸ cpm/μg), durchgeführt. Die Filter wurden zweimal in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei Zimmertemperatur für 15 Minuten pro Waschung gewaschen, gefolgt von einer einzelnen 20-minütigen Waschung in 0,1 × SSC, 1% SDS bei 45°C. Die Filter wurden dann einem Röntgenfilm bei –70°C für mehrere Tage ausgesetzt.
Die Plaques, die mit der markierten Sonde hybridisierten, wurden über mehrere Runden erneutes Ausplattieren und Screening aufgereinigt. Insert-cDNAs wurden in den pBluescript SK(–)-Vektor (Statagene) mit der in vivo-Ausschneide-Methode subkloniert, die im Herstellerprotokoll beschrieben ist. Southern-Blots wurden durchgeführt, um zu verifizieren, daß die gewonnene cDNA an die PCR-Sonde hybridisiert. Vermeintliche cGB-PDE-cDNAs wurden unter Verwendung von Sequenase^® Version 2.0 (United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio) oder TagTrack^®-Kits (Promega) sequenziert.
Drei verschiedene cDNA-Klone, bezeichnet als cGB-2, cGB-8 und cGB-10, wurden isoliert. Die DNA- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Klon cGB-8 sind in SEQ ID NO: 9 und 10 dargestellt. Die DNA-Sequenz stromab von Nukleotid 2686 kann ein Klonierungsartefakt repräsentieren. Die DNA-Sequenz von cGB-10 ist mit der Sequenz von cGB-8 identisch mit der Ausnahme eines Nukleotids. Die DNA-Sequenz von Klon cGB-2 unterscheidet sich von der von Klon cGB-8 5' zu Nukleotid 219 von Klon cGB-8 (siehe SEQ ID NO: 9) und könnte für ein Protein mit einem unterschiedlichen Aminoterminus kodieren.
Der cGB-8-cDNA-Klon ist 4474 bp lang und enthält einen großen offenen Leserahmen von 2625 bp. Es wird vorhergesagt, daß das Triplett ATG an Position 99–101 der Nukleotidsequenz die Translationsinitationsstelle des cGB-PDE-Gens ist, weil ihm ein Stopp-Kodon im Leserahmen vorangeht und die umgebenden Basen mit der Kozak-Consensus-Initiationsstelle für eukaryotische mRNAs kompatibel sind. Das Stopp-Kodon TAG befindet sich an Positionen 2724–2726 und wird von 1748 bp von 3'-nicht-translatierter Sequenz gefolgt. Die Sequenz von cGB-8 enthält keine Transkriptions-Terminations-Consensus-Sequenz, deshalb kann es sein, daß der Klon nicht die gesamte 3' nicht-translatierte Region der entsprechenden mRNA repräsentiert.
Der offene Leserahmen der cGB-8-cDNA kodiert für ein 875-Aminosäure-Polypeptid mit einem berechneten Molekulargewicht von 99,5 kD. Dieses berechnete Molekulargewicht ist nur geringfügig größer als das berichtete Molekulargewicht von aufgereinigter cGB-PDE, das mittels SDS-PAGE-Analyse auf näherungsweise 93 kDa geschätzt worden ist. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von cGB-8 entsprach exakt allen Peptidsequenzen, die aus aufgereinigter cGB-PDE aus Rinderlunge erhalten wurde, was ein starkes Anzeichen dafür ist, daß cGB-8 für cGB-PDE kodiert.
Beispiel 2
Eine Suche der SWISS-PROT und GenEmbl-Datenbanken (Ausgabe vom Februar 1992), die unter Verwendung des FASTA-Programms durchgeführt wurde, das mit dem Genetics Computer Group (GCG) Software-Paket (Madison, Wisconsin) geliefert wurde, offenbarte, daß nur DNA- und Aminosäuresequenzen, die für andere PDEs berichtet worden waren, eine signifikante Ähnlichkeit zu der DNA und abgeleiteten Aminosäure von Klon cGB-8 hatten.
Paarweise Vergleiche der cGB-PDE-abgeleiteten Aminosäuresequenz mit den Sequenzen von acht anderen PDEs wurden durchgeführt unter Verwendung der ALIGN [Dayhoff et al., Methods Enzymol., 92: 524–545 (1983)]- und BESTFIT [Wilbur et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 726–730 (1983)]-Programme durchgeführt. Wie alle bis heute sequenzierten Säugetier-Phosphodiesterasen enthält cGB-PDE eine konservierte katalytische Domänensequenz von näherungsweise 250 Aminosäuren in der carboxy-terminalen Hälfte des Proteins, von der gedacht wird, daß sie für die katalytische Aktivität essentiell ist. Dieses Segment umfaßt Aminosäuren 578–812 von SEQ ID NO: 9 und weist eine Sequenz-Konservierung mit den entsprechenden Regionen anderer PDEs auf. Tabelle 1 unten stellt die spezifischen Identitätswerte dar, die bei paarweisen Vergleichen anderer PDEs mit Aminosäuren 578–812 von cGB-PDE erhalten werden, wobei „ratdunce" die cAMP-spezifische PDE aus Ratte ist; „61 kCaM" die bovine 61 kDa Calcium/Calmodulin-abhängige PDE ist; „63 kCaM" die bovine 63 kDa Calcium/Calmodulin-abhängige PDE ist; „drosdunce" die cAMP-spezifische Dunce-PDE aus Drosophila ist; „ROS-α" die bovine ROS-PDE-α-Untereinheit ist; „ROS-β" die bovine ROS-PDE-β-Untereinheit ist; „COS-α'" die bovine COS-PDE-α'-Untereinheit ist; und „cGs" die bovine cGs-PDE (612–844) ist.
Tabelle 1
Vielfache Sequenz-Alignments wurden unter Verwendung des Progressive Alignment Algorithm [Feng et al., Methods Enzymol., 183: 375–387 (1990)] durchgeführt, der in dem PILEUP-Programm (GCG-Software) implementiert ist. 1A bis 1C zeigt ein vielfaches Sequenz-Alignment der vorgeschlagenen katalytischen Domäne von cGB-PDE mit allen entsprechenden Regionen der PDEs aus Tabelle 1. Achtundzwanzig Reste (siehe die Reste, die durch Ein-Buchstaben-Aminosäure-Abkürzungen in der „konserviert" Zeile in 1A bis 1C angezeigt sind) sind unter den Isoenzymen unverändert, einschließlich mehrerer konservierter Histidinreste, von denen vorhergesagt wird, daß sie eine funktionelle Rolle bei der Katalyse spielen. Siehe Charbonneau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, oben. Die katalytische Domäne von cGB-PDE ähnelt den katalytischen Domänen der ROS-PDEs und COS- PDEs mehr als den entsprechenden Regionen anderer PDE-Isoenzyme. Es gibt mehrere konservierte Regionen zwischen den Photorezeptor-PDEs und cGB-PDE, die mit anderen PDEs nicht gemeinsam sind. Aminosäurepositionen in diesen Regionen, die bei den Photorezeptor-PDE- und cGB-PDE-Sequenzen unverändert sind, werden durch Sterne in der „konserviert" Zeile von 1A bis 1C angezeigt. Homologieregionen zwischen cGB-PDE und den ROS- und COS-PDEs können wichtigen Rollen beim Verleih von Spezifität für cGMP-Hydrolyse relativ zur cAMP-Hydrolyse oder zur Empfindlichkeit gegenüber pharmakologischen Mitteln spielen.
Die Sequenzähnlichkeit zwischen cGB-PDE, cGs-PDE und den Photorezeptor-PDEs ist nicht auf die konservierte katalytische Domäne beschränkt, sondern schließt ebenso die nicht-katalytische cGMP-bindende Domäne in der amino-terminalen Hälfte des Proteins ein. Eine Optimierung des Alignment zwischen cGB-PDE, cGs-PDE und den Photorezeptor-PDEs zeigt an, daß ein amino-terminales konserviertes Segment existieren kann, einschließlich Aminosäuren 142–526 von SEQ ID NO: 9. Eine paarweise Analyse der Sequenz der vorgeschlagenen cGMP-bindenden Domäne von cGB-PDE mit den entsprechenden Regionen der Photorezeptor-PDEs und cGs-PDE offenbarte 26–28% Sequenzidentität. Ein vielfaches Sequenzalignment der vorgeschlagenen cGMP-bindenden Domänen mit den cGMP-bindenden PDEs wird in 2A bis 2C gezeigt, wobei die Abkürzungen dieselben sind, wie für Tabelle 1 angezeigt. Achtunddreißig Positionen in dieser nicht-katalytischen Domäne scheinen zwischen allen cGMP-bindenden PDEs unverändert zu sein (siehe die Positionen, die durch die Ein-Buchstaben-Aminosäure-Abkürzungen auf der „konserviert" Zeile von 2A bis 2C angezeigt sind).
Die cGMP-bindende Domäne der cGMP-bindenden PDEs enthält intern homologe Repeats, die zwei ähnliche, aber verschiedene inter- oder intra-Untereinheit-cGMP-bindenden Stellen bilden kann. 3 zeigt ein vielfaches Sequenzalignment der Repeats a (entsprechend Aminosäuren 228–311 von cGB-PDE) und b (entsprechend Aminosäuren 410–500 von cGB-PDE) der cGMP-bindenden PDEs. Sieben Reste sind in jeder A- und B-Region unverändert (siehe die Reste, die durch Ein-Buchstaben-Aminosäure-Abkürzungen auf der „konserviert" Zeile von 3 angezeigt sind). Reste, die chemisch in den A- und B-Regionen konserviert sind, werden durch Sterne auf der „konserviert" Zeile von 3 angezeigt. cGMP-Analog-Studien von cGB-PDE unterstützen die Existenz einer Wasserstoffbindung zwischen der zyklischen-Nukleotid-Bindungsstelle auf cGB-PDE und dem 2' OH von cGMP.
Drei Regionen von cGB-PDE haben keine signifikante Sequenzähnlichkeit mit anderen PDE-Isoenzymen. Diese Regionen schließen die Sequenz ein, die das carboxy-terminale Ende der katalytischen Domäne flankiert (Aminosäuren 812–875), die Sequenz, die die cGMP-bindende und katalytische Domäne trennt (Aminosäuren 527–577) und die amino-terminale Sequenz, die Aminosäuren 1–141 überspannt. Die Stelle (das Serin an Position 92 von SEQ ID NO: 10) der Phosphorylierung von cGB-PDE durch cGK befindet sich an dieser aminoterminalen Region der Sequenz. Die Bindung von cGMP an das allosterische Zentrum auf cGB-PDE ist für ihre Phosphorylierung erforderlich.
Eine vorgeschlagene Domänenstruktur von cGB-PDE, basierend auf den vorhergehenden Vergleichen mit anderen PDE-Isoenzymen, wird in 4 präsentiert. Diese Domänenstruktur wird durch die biochemischen Studien von cGB-PDE die aus Rinderlunge aufgereinigt worden ist, unterstützt.
Beispiel 3
Die Anwesenheit von cGB-PDE-mRNA in verschiedenen bovinen Geweben wurde mittels Northern-Blot-Hybridisierung untersucht.
Polyadenylierte RNA wurde aus Gesamt-RNA-Präparationen unter Verwendung des Poly(A) Quick^® mRNA Aufreinigungskit (Stategene) gemäß dem Herstellerprotokoll aufgereinigt. RNA-Proben (5 μg) wurden auf ein 1,2% Agarose, 6,7% Formaldehyd-Gel geladen. Die Elektrophorese und der RNA-Transfer wurden wie zuvor beschrieben in Sonnenburg et al., oben, durchgeführt. Eine Prä-Hybridisierung des RNA-Blot wurde für 4 Stunden bei 45°C in einer Lösung durchgeführt, die 50% Formamid, 5 × SSC, 25 mM Natriumphosphat, pH 7, 2 × Denhardtsche Lösung, 10% Dextransulfat und 0,1 mg/ml Hefe-tRNA enthielt. Eine mit Random-Hexanukleotid-Primer markierte Sonde (5 × 10⁸ cpm/μg) wurde hergestellt, wie beschrieben in Feinberg et al., oben, unter Verwendung des 4,7 kb cGB-8 cDNA-Klons aus Beispiel 2, ausgeschnitten durch Verdau mit AccI und SacII. Die Sonde wurde hitzedenaturiert und einer Blot-Tasche (6 × 10⁵ cpm/ml) nach einer Prä-Hybridisierung injiziert. Der Northern-Blot wurde über Nacht bei 45°C hybridisiert, gefolgt von einer 15-minütigen Waschung mit 2 × SSC, 0,1% SDS bei Zimmertemperatur, und drei 20-minütigen Waschungen mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 45°C. Der Blot wurde einem Röntgenfilm für 24 Stunden bei –70°C exponiert. Die Größe der RNA, die mit der cGB-PDE-Sonde hybridisierte, wurde unter Ver wendung einer 0,24–9,5 kb-RNA-Leiter abgeschätzt, die mit Ethidiumbromid gefärbt und mittels UV-Licht sichtbar gemacht wurde.
Die ³²P-markierte cGB-PDE-cDNA hybridisierte an eine einzelne 6,8 kb RNA-Spezies aus Rinderlunge. Eine mRNA-Bande identische Größe wurde ebenso in polyadenylierter RNA nachgewiesen, die aus boviner Luftröhre, Aorta, Niere und Milz isoliert worden war.
Beispiel 4
Die cGB-PDE-cDNA in Klon cGB-8 aus Beispiel 2 wurde in COS-7-Zellen exprimiert (ATCC CRL 1651).
Ein Teil der cGB-8-cDNA wurde isoliert nach einem Verdau mit dem Restriktionsenzym XbaI. XbaI schneidet an einer Position in der pBluescript-Polylinkersequenz, die sich 30 bp stromauf vom 5'-Ende des cGB-8-Insert befindet, und an der Position 3359 innerhalb des cGB-8-Insert. Das resultierende 3389 bp-Fragment, das die gesamte kodierende Region von cGB-8 enthält, wurde dann in die einzige XbaI-Klonierstelle des Expressionsvektors pCDM8 ligiert (Invitrogen, San Diego, CA). Das pCDM8-Plasmid ist ein 4,5 kb eukaryotischer Expressionsvektor, der einen Zytomegalovirus-Promoter und Enhancer, einen aus SV40 stammenden Replikationsursprung, ein Polyadenylierungssignal, einen prokaryotischen Replikationsursprung (aus pBR322 stammend) und einen prokaryotischen genetischen Marker (supF) enthält. E. coli MC1061/P3-Zellen (Invitrogen) wurden mit den resultierenden Ligationsprodukten transformiert, und Transformations-positive Kolonien wurden auf die richtige Orientierung des cGB-8-Insert unter Verwendung von PCR und Restriktionsenzymanalyse gescreent. Das resultierende Expressionskonstrukt, das das cGB-8-Insert in der richtigen Orientierung enthält, wird als pCDM8-cGB-PDE bezeichnet.
Die pCDM8-cGB-PDE-DNA wurde aus Plasmid-Präparationen auf großem Maßstab unter Verwendung von Qiagen Pack-500-Säulen (Chatsworth, CA) gemäß dem Herstellerprotokoll aufgereinigt. COS-7-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% fetales bovines Serum, 50 μg/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin enthielt, bei 37°C in einer befeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre kultiviert. Näherungsweise 24 Stunden vor der Transfektion wurden die konfluenten 100-mm-Zellschalen auf ein Viertel oder ein Fünftel der ursprünglichen Dichte erneut ausplattiert. Bei einem typischen Transfektionsexperiment wurden die Zellen mit Puffer gewaschen, der 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,1 mM Kaliumphosphat und 8,1 mM Natriumphosphat, pH 7,2 (PBS) enthielt. Dann wurden 4–5 ml DMEM, das 10% NuSerum (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) enthielt, jeder Platte zugegeben. Transfektion mit 10 μg pCDM8-cGB-PDE-DNA oder pCDM8-Vektor-DNA, vermischt mit 400 μg DEAE-Dextran (Pharmacia) in 60 μl TBS [Tris-gepufferte Salzlösung: 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,6 mM Na₂HPO₄, 0,7 mM CaCl₂ und 0,5 mM MgCl₂], wurde durch tropfenweises Zugeben der Mischung zu jeder Platte durchgeführt. Die Zellen wurden bei 37°C, 5% CO₂ für 4 Stunden inkubiert und dann mit 10% Dimethylsulfoxid in PBS für 1 Minute behandelt. Nach 2 Minuten wurde das Dimethylsulfoxid entfernt, die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in vollständigem Medium inkubiert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen in 0,5–1 ml kaltem Homogenisierungspuffer pro Zellplatte suspendiert [40 mM Tris-HCl (pH 7,5) 15 mM Benzamidin, 15 mM β-Mercaptoethanol, 0,7 μg/ml Pepstatin A, 0,5 μg/ml Leupeptin und 5 μM EDTA] und unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators aufgebrochen. Die resultierenden Ganzzell-Extrakte wurden auf Phosphodiesteraseaktivität, cGMP-bindende Aktivität und Gesamtproteinkonzentration getestet, wie unten in Beispiel 5 beschrieben.
Beispiel 5
Die Phosphodiesteraseaktivität in Extrakten der transfizierten COS-Zellen aus Beispiel 4 oder in Extrakten aus schein-transfizierten COS-Zellen wurde unter Verwendung von einer Modifizierung der Assay-Prozedur gemessen, die für die cGs-PDE in Martins et al., J. Biol. Chem., 257: 1973–1979 (1982) beschrieben ist. Die Zellen wurden geerntet und die Extrakte 48 Stunden nach der Transfektion präpariert. Die Inkubationsmischungen enthielten 40 mM MOPS-Puffer (pH 7), 0,8 mM EDTA, 15 mM Magnesiumacetat, 2 mg/ml bovines Serumalbumin, 22 μM [³H]cGMP oder [³H]cAMP (100.000–200.000 cpm/Assay) und COS-7-Zellextrakt in einem Gesamtvolumen von 250 μl. Die Reaktionsmischung wurde für 10 Minuten bei 30°C inkubiert und dann durch Kochen abgestoppt. Als nächstes wurden 10 μl von 10 mg/ml Crotalus atrox Gift (Sigma) zugegeben, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 30°C. Die Nukleosid-Produkte wurden von den nicht-umgesetzten Nukleotiden, wie beschrieben in Martins et al., oben, getrennt. Bei allen Studien wurden weniger als 15% des gesamten [³H]zyklischen Nukleotids während der Reaktion hydrolysiert.
Die Resultate der Assays werden in 5 präsentiert, wobei die gezeigten Resultate die Mittelwerte von drei getrennten Transfektionen sind. Eine Transfektion von COS-7-Zellen mit pCDM8-cGB-PDE-DNA führt zur Expression von näherungsweise 15-fach höheren Konzentrationen an cGMP-Phosphodiesteraseaktivität als in schein-transfizierten Zellen oder in Zellen, die mit pCDM8-Vektor alleine transfiziert worden waren. Keine Erhöhung hinsichtlich der cAMP-Phosphodiesteraseaktivität gegenüber schein- oder nur-Vektor-transfizierten Zellen wurde bei Extrakten aus Zellen nachgewiesen, die mit pCDM8-cGB-PDE-DNA transfiziert worden waren. Diese Resultate bestätigen, daß die bovine cGB-PDE-cDNA für eine cGMP-spezifische Phosphodiesterase kodiert.
Die Extrakte aus den transfizierten COS-Zellen von Beispiel 4 wurden ebenso auf cGMP-PDE-Aktivität in der Anwesenheit einer Konzentrationsreihe der PDE-Inhibitoren Zaprinast, Dipyridamol (Sigma), Isobutyl-1-methyl-8-methoxymethylxanthin (MeOxMeMIX) und Rolipram getestet.
Die Resultate der Assays werden in 6 präsentiert, wobei die PDE-Aktivität in der Abwesenheit von Inhibitor als 100% genommen wird und jeder Datenpunkt den Mittelwert zweier getrennter Bestimmungen repräsentiert. Die relativen Stärken der PDE-Inhibitoren bezüglich der Inhibition von cGMP-Hydrolyse durch das exprimierte cGB-BPDE-cDNA-Proteinprodukt waren identisch mit den relativen Stärken, die für native cGB-PDE berichtet worden ist, welche aus Rinderlunge (Thomas I, oben) aufgereinigt worden ist. Die IC₅₀-Werte, errechnet aus den Kurven in 6, sind wie folgt: Zaprinast (ausgefüllte Kreise), 2 μM; Dipyridamole (ausgefüllte Quadrate), 3,5 μM; MeOxMeMIX (ausgefüllte Dreiecke), 30 μM; und Rolipram (nicht-ausgefüllte Kreise), > 300 μM. Der IC₅₀-Wert von Zaprinast, einem relativ spezifischen Inhibitor von cGMP-spezifischen Phosphodiesterasen, war wenigstens zwei Größenordnungen geringer als der, der für die Inhibition der Phosphodiesteraseaktivität der cGs-PDE oder der cGMP-inhibierten Phosphodiesterase (cGi-PDEs) (Reeves et al., S. 300–316 von Beavo et al., oben) berichtet worden ist. Dipyridamol, ein effektiver Inhibitor von ausgewählten cAMP- und cGMP-spezifischen Phosphodiesterasen, war ebenso ein potenter Inhibitor der exprimierten cGB-PDE. Der relativ selektive Inhibitor der Calcium/Calmodulin-stimulierten Phosphodiesterase (CaM-PDEs), MeOxMeMIX, war näherungsweise 10-fach weniger potent als Zaprinast und Dipyridamol, in Übereinstimmung mit den Resultaten unter Verwendung von cGB-PDE-Aktivität, die aus Rinderlunge aufgereinigt worden war. Rolipram, ein potenter Inhibitor von cAMP Phosphodieserasen mit niedriger K_m, war ein schlechter Inhibitor des exprimierten cGB-PDE-cDNA-Proteinprodukts. Diese Resultate zeigen, daß die cGB-PDE-cDNA für eine Phosphodiesterase kodiert, die katalytische Aktivität besitzt, die für eine cGB-PDE charakteristisch ist, die aus Rindergewebe isoliert worden war, was somit die Identität des cGB-8-cDNA-Klons als eine cGB-PDE verifiziert.
Es ist interessant, zu bemerken, daß, obwohl die relativen Stärken der PDE-Inhibitoren zur Inhibition von cGMP-Hydrolyse für die rekombinante und Rinderisolat-cGB-PDE identisch waren, die absoluten IC₅₀-Werte für alle getesteten Inhibitoren 2–7-fach höher für die rekombinante cGB-PDE waren. Dieser Unterschied konnte nicht den Wirkungen irgendwelcher Faktoren, die in COS-7-Zellextrakten vorhanden waren, auf cGMP-hydrolytische Aktivität zugeschrieben werden, da die cGB-PDE, die aus Rindergewebe isoliert worden war, identische Inhibitionskinetiken als ein reines Enzym oder nach erneuter Zugabe zu Extrakten von schein-transfizierten-COS-7-Zellen aufwies. Der offensichtliche Unterschied hinsichtlich der pharmakologischen Empfindlichkeit mag auf einem subtilen Unterschied in der Struktur des rekombinanten cGB-PDE-cDNA-Proteinprodukts und cGB-PDE aus Rinderlunge beruhen, wie etwa einem Unterschied in der posttranslationalen Modifizierung an oder nahe dem katalytischem Zentrum. Alternativ kann dieser Unterschied auf einer Veränderung der katalytischen Aktivität von cGB-PDE aus Rinderlunge über mehrere Aufreinigungsschritte beruhen.
Die Zellextrakte wurden auf [³H]cGMP-bindende Aktivität in der Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,2 mM 3-Isobutyl-1-methylaxanthin (IBMX) (Sigma), einem kompetitiven Inhibitor der cGMP-Hydrolyse, getestet. Der cGMP-Bindungsassay, modifiziert von dem in Thomas I, oben, beschriebenen Assay, wurde in einem Gesamtvolumen von 80 μl durchgeführt. 60 μl Zellextrakt wurden mit 20 μl eines Bindungscocktails kombiniert, so daß die Endkonzentration der Mischungsbestandteile 1 μM [³H]cGMP, 5 μM cAMP und 10 μM 8-Brom-cGMP waren. Das cAMP und 8-Brom-cGMP wurden zugegeben, um eine [³H]cGMP-Bindung an cAK bzw. cGK zu blockieren. Die Assays wurden in der Abwesenheit und Anwesenheit von 0,2 mM IBMX durchgeführt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Zellextrakts initiiert und wurde für 60 Minuten bei 0°C inkubiert. Eine Filtration der Reaktionsmischungen wurde durchgeführt, wie in Thomas I, oben, beschrieben. Die Nullproben wurden durch parallele Inkubationen mit Homogenisierungspuffer, der die Zellextrakte ersetzt, oder mit einem 100-fachen Überschuß von nicht-markiertem cGMP bestimmt. Ähnliche Resultate wurden mit beiden Verfahren erhalten. Die Gesamtproteinkonzentration der Zellex trakte wurde mittels des Verfahrens von Bradford, Anal. Biochem., 72: 248–254 (1976) unter Verwendung von bovinem Serumalbumin als dem Standard durchgeführt.
Die Resultate des Assay werden in 7 dargestellt. Wenn bei 1 μM [³H]cGMP in der Anwesenheit von 0,2 mM IBMX gemessen, wiesen die Extrakte aus COS-7-Zellen, die mit pCDM8-cGB-PDE transfiziert worden waren, eine 8-fach höhere cGMP-bindende Aktivität als Extrakte aus schein-transfizierten Zellen auf. Keine IBMX-Stimulierung der Hintergrund-cGMP-Bindung wurde beobachtet, was nahelegt, daß wenig oder keine cGB-PDE in den COS-7-Zellextrakten vorhanden war. In Extrakten von pCDM8-cGB-PDE-transfizierten Zellen wurde die cGMP-spezifische Aktivität näherungsweise 1,8-fach durch die Zugabe von 0,2 mM IBMX stimuliert. Die Fähigkeit von IBMX, die cGMP-Bindung 2–5-fach zu stimulieren ist eine kennzeichnende Eigenschaft der cGMP-bindenden Phosphodiesterasen.
Die Zellextrakte, wurden wie oben beschrieben, auf [³H]cGMP-Bindungsaktivität (wobei die Konzentration von [³H]cGMP 2,5 μM war) in der Anwesenheit eines Überschusses an nicht-markierten cAMP oder cGMP getestet. Die Resultate sind in 8 präsentiert, wobei die cGMP-Bindung in der Abwesenheit von nicht-markiertem Competitor als 100% genommen wurde und jeder Datenpunkt den Durchschnitt von drei getrennten Bestimmungen repräsentiert. Die Bindungsaktivität des Proteinprodukts, das durch die cGB-PDE-cDNA kodiert wird, war für cGMP relativ zu cAMP spezifisch. Weniger als 10-fach höhere Konzentrationen nicht-markiertem cGMP waren erforderlich, um die [³H]cGMP-Bindungsaktivität um 50% zu inhibieren, während näherungsweise 100-fach höhere Konzentrationen von cAMP für denselben Inhibitionsgrad erforderlich waren.
Die in diesem Beispiel präsentierten Resultate zeigen, daß die cGB-PDE-cDNA für eine Phosphodiesterase kodiert, die biochemische Aktivität besitzt, die für native cGB-PDE charakteristisch sind.
Die katalytischen Domänen von Säugetier-PDEs und einer Drosophila-PDE enthalten zwei konservierte Tandem-Sequenzen (HX₃HX₂₄-₂₆E), die typische Zn²⁺-bindende Motive in Zn²⁺-Hydrolasen, wie Thermolysin [Vallee and Auld, Biochem., 29: 5647–5659 (1990)] sind. cGB-PDE bindet Zn²⁺ in der Anwesenheit eines großen Überschusses von Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Ca²⁺ oder Cd²⁺. In der Abwesenheit von zugegebenen Metall hat cGB-PDE eine PDE-Aktivität, die näherungsweise 20% der maximalen Aktivität ist, die in der Anwesenheit von 40 mM Mg²⁺ stattfindet, und diese Grundaktivität wird durch 1, 10-Phenanthrolin oder EDTA inhibiert. Dies legt nahe, daß ein in Spuren vorkommendes Metalle) für die Grund-PDE-Aktivität verantwortlich ist, trotz erschöpfender Behandlungen, um die Metalle zu entfernen. Die PDE-Aktivität wird durch Zugabe von Zn²⁺ (0,02–1 μM) oder Co²⁺ (1–20 μM), aber nicht durch Fe²⁺, Fe³⁺, Ca²⁺, Cd²⁺, oder Cu²⁺ stimuliert. Zn²⁺ erhöht die Grund-PDE-Aktivität auf bis zu 70% der maximalen Stimulierung, die durch 40 mM Mg²⁺ erzeugt wird. Der stimulatorische Effekt von Zn²⁺ in diesen Assays kann durch einen inhibitorischen Effekt beeinträchtigt werden, der durch Zn²⁺-Konzentrationen > 1 μM verursacht wird. Die Zn²⁺-unterstützte PDE-Aktivität und die Zn²⁺-Bindung von cGB-PDE finden bei ähnlichen Zn²⁺-Konzentrationen statt. Somit scheint cGB-PDE eine Zn²⁺-Hydrolase zu sein, und Zn²⁺ scheint eine kritische Rolle bei der Aktivität des Enzyms zu spielen. Siehe Colbran et al., The FASEB J., 8: Zusammenfassung 2148 (15. März 1994).
Beispiel 6
Mehrere menschliche cDNA-Klone, homolog mit dem bovinen cDNA-Klon, der für cGB-PDE kodiert, wurden mittels Hybridisierung unter stringenten Bedingungen unter Verwendung einer Nukleinsäurensonde isoliert, die einem Teil des bovinen cGB-8-Klons entspricht (Nukleotide 489–1312 von SEQ ID NO: 9).
Isolierung von cDNA Fragmenten, die für menschliche cGB-PDE kodieren
Drei menschliche cDNA-Bibliotheken (zwei Glioblastom und eine Lunge) im Vektor Lambda Zap wurden mit der bovinen cGB-PDE-Sequenz sondiert. Der PCR-erzeugte Klon, entsprechend Nukleotiden 484–1312 von SEQ ID NO: 9, der in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde mit EcoRI und SalI verdaut, und das resultierende 0,8 kb-cDNA-Insert wurde isoliert und mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt. Das Fragment wurde mit radioaktiven Nukleotiden unter Verwendung eines zufallsgeprimten DNA-Markierungskit markiert (Boehringer).
Die cDNA-Bibliotheken wurden auf 150 mm Petrischalen in einer Dichte von näherungsweise 50.000 Plaques pro Platte ausplattiert. Doppelte Nitrozellulose-Filter-Replikas wurden hergestellt. Der Prähybridisierungspuffer war 3 × SSC, 0,1% Sarkosyl, 10 × Denhardtsche Lösung, 20 mM Natriumphosphat (pH 6,8) und 50 μg/ml Testes-DNA aus Lachs. Die Prähybridisierung wurde bei 65°C für ein Minimum von 30 Minuten ausgeführt. Die Hybridisierung wurde bei 65°C über Nacht in einem Puffer derselben Zusammensetzung mit der Zugabe von 1–5 × 10⁵ cpm/ml Sonde durchgeführt. Die Filter wurden bei 65°C in 2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen. Hybridisierende Plaques wurden mittels Autoradiographie nachgewiesen. Die Anzahl an cDNAs, die an die bovine Sonde hybridisierten, und die Anzahl an cDNAs, die gescreent wurden, werden in Tabelle 2 unten angezeigt.
Tabelle 2
Die als cgbS2.1, cgbS3.1, cgbL23.1, cgbL27.1 und cgbS27.1 bezeichneten Plasmide wurden in vivo aus den Lambda-Zap-Klonen ausgeschnitten und sequenziert.
Der Klon cgbS3.1 enthält 2060 bp eines offenen PDE-Leserahmens, gefolgt von einem vermutlichen Intron. Die Analyse von Klon cgbS2.1 offenbart, daß er Klon cgbS3.1 an den Positionen 664 bis 2060 entspricht und den offenen PDE-Leserahmen um zusätzliche 585 bp erweitert, bevor er in ein vermutliches Intron liest. Die Sequenzen der vermutlichen 5'-nicht-translatierten Region und des Proteins, das für Teile der cgbS2.1- und cgbS3.1-Klone kodiert, sind in SEQ ID NO: 11 bzw. 12 dargestellt. Eine Kombination der beiden cDNAs ergibt eine Sequenz, die näherungsweise 2,7 kb eines offenen Leserahmens enthält, der für eine PDE kodiert. Die drei anderen cDNAs erstreckten sich 5' oder 3' nicht weiter als die cDNA cgbS3.1 oder cDNA cgbS2.1.
Um zusätzliche cDNAs zu isolieren, wurden Sonden, die für das 5'-Ende von Klon cgbS3.1 und das 3'-Ende von Klon cgbS2.1 spezifisch waren, hergestellt und verwendet, um eine SW1088-Glioblastom-cDNA-Bibliothek und eine menschliche Aorta-cDNA-Bibliothek zu screenen. Eine 5'-Sonde wurde aus Klon cgbS3.1 mittels PCR unter Verwendung der Primer cgbS3.1S311 und cgbL23.1A1286 gewonnen, deren Sequenzen in SEQ ID NO: 8 bzw. 9 und unten dargestellt sind.
Die PCR-Reaktion wurde in einem 50 μl Reaktionsvolumen durchgeführt, das 50 pg cgbS3.1-cDNA, 0,2 mM dNTP, 10 μg/ml jedes Primers, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,2, 1,5 mM MgCl₂ und Taq-Polymerase enthält. Nach einer anfänglichen vierminütigen Denaturierung bei 94°C wurden 30 Zyklen von einer Minute bei 94°C, zwei Minuten bei 50°C und vier Minuten bei 72°C durchgeführt. Ein näherungsweise 0,2 kb-Fragment wurde mittels der PCR-Reaktion erzeugt, das den Nukleotiden 300–496 von Klon cgbS3.1 entsprach.
Eine 3'-Sonde wurde aus cDNA cgbS2.1 mittels PCR unter Verwendung der Oligos cgbL23.1S1190 und cgbS2.1A231 gewonnen, deren Sequenzen unten dargestellt sind.
Die PCR-Reaktion wurde ähnlich zu der oben beschriebenen zum Erzeugen der 5'-Sonde durchgeführt und ergab ein Fragment von näherungsweise 0,8 kb, was den Nukleotiden 1358–2139 der cDNA cgbS2.1 entspricht. Die 157 3'-Nukleotide des PCR-Fragments (in SEQ ID NO: 12 nicht gezeigt) sind innerhalb des vermutlichen Introns.
Die zwei PCR-Fragmente wurden aufgereinigt und mittels einer Agarose-Gelelektrophorese isoliert und wurden mit radioaktiven Nukleotiden mittels Zufallspriming markiert. Eine zufallsgeprimte SW1088-Glioblastom-cDNA-Bibliothek (1,5 × 10⁶ Plaques) wurde mit den markierten Fragmenten gescreent, wie oben beschrieben, und 19 hybridisierende Plaques wurden isoliert. Zusätzliche 50 hybridisierende Plaques wurde aus einer menschlichen Aorta-cDNA-Bibliothek isoliert (dT- und zufallsgeprimt, Clontech, Palo Alto, CA).
Die Plasmide wurden in vivo aus einigen der positiven Lambda-Zap-Klone ausgeschnitten und sequenziert. Ein als cgbS53.2 bezeichneter Klon, dessen Sequenz in SEQ ID NO: 17 dargestellt ist, enthält ein näherungsweise 1,1 kb-Insert, dessen Sequenz mit den letzten 61 bp von cgbS3.1 überlappt und den offenen Leserahmen um zusätzliche 135 bp über den in cgbS2.1 gefundenen hinaus erweitert. Der Klon enthält ein Terminationskodon und näherungsweise 0,3 kB einer vermutlichen 3'-nicht-translatierten Sequenz.
Erzeugung einer zusammengesetzten cDNA, die für menschliche cGB-PDE kodiert
Die Klone cgbS3.1, cgbS2.1 und cgbS53.2 wurden verwendet, wie in den folgenden Paragraphen beschrieben, um eine zusammengesetzte cDNA zu bauen, die einen vollständigen menschlichen offenen cGB-PDE-Leserahmen enthielt. Die zusammengesetzte cDNA wird als cgbmet156-2 bezeichnet und wurde in den Hefe-ADHI-Expressionsvektor pBNY6N eingesetzt.
Als erstes wurde ein als cgb stop-2 bezeichnetes Plasmid erzeugt, das das 3'-Ende des offenen cGB-PDE-Leserahmens enthielt. Ein Teil des Insert des Plasmid wurde mittels PCR unter Verwendung von Klon cgbS53.2 als eine Matrize erzeugt. Die verwendeten PCR-Primer waren cgbS2.1 S 1700 und cgbstop-2.
Die PCR-Reaktion wurde in 50 μl durchgeführt, die 50 pg Matrizen-DNA, 0,2 mM dNTPs, 20 mM Tris-HCl pH 8,2, 10 mM KCl, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 1,5 mM MgCl₂, 0,1% Triton-X-100, 500 ng jeden Primers und 0,5 Einheiten Pfu-Polymerase (Stategene) enthielt. Die Reaktion wurde auf 94°C für 4 Minuten erhitzt, und dann wurden 30 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 2 Minuten bei 50°C und vier Minuten bei 72°C durchgeführt. Die Polymerase wurde während des ersten Zyklus bei 50°C zugegeben. Das resultierende PCR-Produkt wurde Phenol/Chloroform-extrahiert, Chloroform-extrahiert, Ethanol-gefällt und mit den Restriktionsenzymen BclI und XhoI geschnitten. Das Restriktionsfragment wurde auf einem Agarosegel aufgereinigt und eluiert.
Dieses Fragment wurde an die cDNA cgbS2.1 ligiert, die in dam^– E. coli wachsen gelassen worden war, mit den Restriktionsenzymen BclI und XhoI geschnitten und unter Verwendung des Promega magic PCR-Kit Gel-aufgereinigt. Das resultierende Plasmid wurde sequenziert, um zu verifizieren, daß cgbstop-2 den 3'-Teil des offenen cGB-PDE-Leserahmens enthält.
Als zweites wurde ein Plasmid, das das 5'-Ende des menschlichen offenen cGB-PDE-Leserahmens trägt, erzeugt. Sein Insert wurde mittels PCR unter Verwendung von Klon cgbS3.1 als eine Matrize erzeugt. Die PCR wurde, wie oben beschrieben, durchgeführt unter Verwendung von Primern cgbmet156 und cgbS2.1A2150.
Das resultierende PCR-Fragment wurde Phenol/Chloroform-extrahiert, Chloroform-extrahiert, Ethanol-gefällt und auf einer Sepharose CL-6B-Säule aufgereinigt. Das Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRV und EcoRI geschnitten, auf einem Agarosegel laufengelassen und durch Zentrifugieren durch Glaswolle aufgereinigt. Nach einer Phenol/Chloroform-Extraktion, einer Chloroform-Extraktion und einer Ethanol-Fällung wurde das Fragment in EcoRI/EcoRV-verdauten BluescriptII SK(+) ligiert, um Plasmid cgbmet156 zu erzeugen. Die DNA-Sequenz des Insert und der Junctions wurde bestimmt. Das Insert enthält eine neue EcoRI-Stelle und zusätzliche 5 Nukleotide, die zusammen die ursprünglichen 155 Nukleotide 5' vom Initiationskodon ersetzen. Das Insert erstreckt sich auf eine EcoRV-Stelle, wobei es 531 Nukleotide von dem Initiationskodon beginnt.
Die 5'- und 3'-Teile des offenen cGB-PDE-Leserahmens wurden dann in einem Vektor pBNY6a zusammengesetzt. Der Vektor pBNY6a wurde mit EcoRI und XhoI geschnitten, aus einem Gel isoliert und mit dem Agarosegel-aufgereinigten EcoRI/EcoRV-Fragment von cgbmet156 und dem Agarosegel-aufgereinigten EcoRV/XhoI-Fragment von cgbstop-2 kombiniert. Die Junctions des Insert wurden sequenziert, und das Konstrukt wurde hcbgmet156-2 6a genannt.
Das cGB-PDE-Insert von hcbgmet156-2 6a wurde dann in den Expressionsvektor pBNY6n gebracht. Die Expression der in diesen Vektor eingefügten DNA wird von dem Hefe-ADH1-Promotor und -Terminator gesteuert. Der Vektor enthält den 2-Micron-Replikationsursprung von Hefe, den pUC19-Replikationswsprung und ein Ampicillan-Resistenzgen. Der Vektor pBNY6n wurde mit EcoRI und XhoI geschnitten und Gel-aufgereinigt. Das EcoRUXhoI-Insert von hcgbmet156-2 6a wurde Gel-aufgereinigt unter Verwendung von Promega-Magic-PCR-Säulen und in den geschnittenen pBNY6n ligiert. Alle neuen Junctions in dem resultierenden Konstrukt, hcgbmet156-2 6n, wurden sequenziert. Die DNA- und abgeleiteten Ami nosäuresequenzen des Insert von hcgbmet156-2 6n, das für eine zusammengesetzte menschliche cGB-PDE kodiert, ist in SEQ ID NO: 22 und 23 dargestellt. Das Insert erstreckt sich vom ersten Methionin in Klon cgbS3.1 (Nukleotid 156) zu dem Stopp-Kodon (Nukleotid 2781) in der zusammengesetzten cDNA. Weil das Methionin das am meisten 5'-befindliche Methionin in Klon cgbS3.1 ist und weil es keine Stopp-Kodons im Rahmen mit dem Methionin und stromaufwärts davon gibt, kann das Insert im pBNY6n eine trunkierte Form des offenen Leserahmens repräsentieren.
Variante cDNAs
Vier menschliche cGB-PDE-cDNAs, die von der hcgbmet156-2 6n, zusammengesetzten cDNA unterschiedlich sind, sind isoliert worden. Einer cDNA, cgbL23.1, fehlt eine interne Region von hcgbmet156-2 6n (Nukleotide 997–1000 bis 1444–1447). Die exakten Endpunkte der Deletion können nicht aus der cDNA-Sequenz an diesen Positionen bestimmt werden. Drei der vier Varianten cDNAs haben 5'-Endsequenzen, die von der hcgbmet156-2 6n-Sequenz stromaufwärts von Nukleotid 151 divergieren (cDNAs cgbA7f, cgbA5C, cgbI2). Diese cDNAs repräsentieren vermutlich alternativ gespleißte oder ungespleißte mRNAs.
Beispiel 7
Das zusammengesetzte menschliche cGB-PDE-cDNA-Konstrukt, hcgbmet156-2 6n, wurde in den Hefestamm YKS45 (ATCC 74225) (MATα his3 trp1 ura3 leu3 pde1::HIS3 pde2::TRP1) transformiert, in dem zwei endogene PDE-Gene deletiert sind. Es wurden Transformanten, die die leu^–-Defizienz des YKS45-Stammes komplementieren, ausgewählt und auf cGB-PDE-Aktivität getestet. Es wurde bestimmt, daß Extrakte von Zellen, die das Plasmid hcgbmet156-2 6n tragen, eine für zyklisches GMP-spezifische Phosphodiesteraseaktivität aufweisen, mit dem unten beschriebenen Assay.
Ein Liter YKS45-Zellen, die mit dem Plasmid cgbmet156-2 6n transformiert und in SC-leu-Medium auf eine Dichte von 1–2 × 10⁷ Zellen/ml wachsen gelassen worden waren, wurde mittels Zentrifugation geerntet, einmal mit entionisiertem Wasser gewaschen, in Trockeneis/Ethanol gefroren und bei –70°C gelagert. Die Zellpellets (1–1,5 ml) wurden auf Eis in der Anwesenheit eines gleichen Volumens 25 mM Tris-Cl (pH 8,0)/5 mM EDTA/5 mM EGTA/1 mM o-Phenanthrolin/0,5 mM AEBSF (Calbiochem)/0,1% β-Mercaptoethanol und 10 μg/ml jeweils von Aprotinin, Leupeptin und Pepstatin A aufgetaut. Die aufgetauten Zellen wurden zu 2 ml säuregewaschenen Glasperlen (425–600 μM, Sigma) in 15 ml Corex-Röhrchen zugegeben. Die Zellen wurden mit 4 Zyklen, bestehend aus einem 30-Sekunden-Vortexen bei Einstellung 1 aufgebrochen, gefolgt von einer 60-Sekunden-Inkubation auf Eis. Das Zell-Lysat wurde bei 12.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde durch einen 0,8 μ-Filter laufengelassen. Der Überstand wurde auf cGMP-PDE-Aktivität wie folgt getestet. Die Proben wurden für 20 Minuten bei 30°C in der Anwesenheit von 45 mM Tris-Cl (pH 8,0), 2 mM EGTA, 1 mM EDTA, 0,2 mg/ml BSA, 5 mM MgCl₂, 0,2 mM o-Phenanthrolin, 2 μg/ml jeweils von Pepstatin A, Leupeptin und Aprotinin, 0,1 mM AEBSF, 0,02% β-Mercaptoethanol und 0,1 mM [³H]cGMP als ein Substrat inkubiert. [¹⁴C]-AMP (0,5 nCi/Assay) wurden als ein Recovery-Standard zugegeben. Die Reaktion wurde mit Stopp-Puffer beendet (0,1 M Ethanolamin pH 9,0, 0,5 M Ammoniumsulfat, 10 mM EDTA, 0,05% SDS Endkonzentration). Das Produkt wurde von dem zyklischen Nukleotid-Substrat mittels Chromatographie auf einem BioRad Affi-Gel 601 getrennt. Die Probe wurde auf eine Säule aufgebracht, die näherungsweise 0,25 ml Affi-Gel 601 enthielt, äquilibriert in Säulenpuffer (0,1 M Ethanolamin pH 9,0, enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat). Die Säule wurde fünfmal mit 0,5 ml Säulenpuffer gewaschen. Das Produkt wurde mit vier 0,5 ml Aliquots von 0,25 Essigsäure eluiert und mit 5 ml Ecolume vermischt (ICN Biochemicals). Das radioaktive Produkt wurde mittels Szintillationszählung vermessen.
Beispiel 8
Die Analyse der Expression von cGB-PDE-mRNA in menschlichen Geweben wurde mittels eines RNase-Protection-Assay durchgeführt.
Eine Sonde, die einem Teil der vermuteten cGMP-Bindungsdomäne von cGB-PDE entsprach (402 bp entsprechend Nukleotiden 1450 bis 1851 von SEQ ID NO: 13), wurde mittels PCR erzeugt. Das PCR-Fragment wurde in die EcoRI-Stelle des Plasmids pBSII SK(-) eingesetzt, um das Plasmid RP3 zu erzeugen. Die RP3-Plasmid-DNA wurde mit XbaI linearisiert, und Antisense-Sonden wurden mittels einer Modifikation des Strategene T7-RNA-Polymerase-Kit erzeugt. Fünfundzwanzig ng linearisiertes Plasmid wurden mit 20 Microcuries alpha-³²P-rUTP (800 Ci/mmol, 10 mCi/ml), 1 × Transkriptionspuffer (40 mM TrisCl, pH 8, 8 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin, 50 mM NaCl), je 0,25 mM von rATP, rGTP und rCTP, 0,1 Einheiten RNase Block II, 5 mM DTT, 8 μM rUTP und 5 Einheiten T7 RNA-Polymerase in einem Ge samtvolumen von 5 μl kombiniert. Die Reaktion ließ man für 1 Stunde bei Zimmertemperatur fortschreiten, und dann wurde die DNA-Matrize mittels Verdau mit RNase-freier DNase entfernt. Die Reaktion wurde in 100 μl 40 mM TrisCl, pH 8, 6 mM MgCl₂ und 10 mM NaCl verdünnt. Fünf Einheiten RNase-freier DNase wurden zugegeben, und man ließ die Reaktion für weitere 15 Minuten bei 37°C fortlaufen. Die Reaktion wurde mittels einer Phenol-Extraktion unterbrochen, gefolgt von einer Phenol-Chloroform-Extraktion. Ein halbes Volumen 7,5 M NH₄OAc wurden zugegeben, und die Sonde wurde Ethanol-gefällt.
Die RNase-Protection-Assays wurden unter Verwendung des Ambion RNase Protection kit (Austin, TX) durchgeführt und 10 μg RNA aus menschlichen Geweben mittels einer sauren Guanidin-Extraktionsmethode isoliert. Die Expression von cGB-PDE-mRNA wurde leicht in RNA nachgewiesen, die aus Skelettmuskel, Uterus, Bronchus, Haut, rechter Vena saphena, Aorta und SW1088-Glioblastom-Zellen extrahiert worden war. Eine kaum nachweisbare Expression wurde in RNA gefunden, die aus dem rechten Atrium, dem rechten Ventrike, der Nierenrinde und dem Nierenmark extrahiert worden war. Nur ein vollständiger Schutz der RP3-Sonde wurde gesehen. Der Mangel an partiellem Schutz spricht dagegen, daß die cDNA cgbL23.1 (eine Variante cDNA beschrieben in Beispiel 7) ein Haupttranskript repräsentiert, wenigstens bei diesen RNA-Proben.
Beispiel 9
Polyklonale Antiseren wurden gegen E. coli-produzierte Fragmente der menschlichen cGB-PDE gezogen.
Ein Teil der menschlichen cGB-PDE-cDNA (Nukleotide 1668–2612 von SEQ ID NO: 22, Aminosäuren 515–819 von SEQ ID NO: 23) wurden mittels PCR amplifiziert und in den E. coli Expressionsvektor pGEX2T (Pharmacia) als ein BamHI/EcoRI-Fragment eingesetzt. Das pGEX2T-Plasmid trägt ein Ampicillin-Resistenzgen, ein E. coli laq I^q-Gen und einen Teil des Glutathion-S-Transferase(GST)-Gens von Schistosoma japonicum. Die in das Plasmid eingesetzte DNA kann als ein Fusionsprotein mit GST exprimiert werden und kann dann von dem GST-Teil des Proteins mit Thrombin abgespalten werden. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als cgbPE3, wurde in E. coli-Stamm LE392 (Strategene) transformiert. Die transformierten Zellen ließ man bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6 wachsen. IPTG (Isopropylthioalactopyranosid) wurde auf 0,1 mM zugegeben, und die Zellen ließ man bei 37°C zusätzlich 2 Stunden wachsen. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt und durch Beschallung lysiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde mittels SDS-PAGE fraktioniert. Das Gel wurde mit kaltem 0,4 M KCl gefärbt, und die GST-cgb-Fusionsprotein-Bande wurde ausgeschnitten und elektro-eluiert. Der PDE-Teil des Proteins wurde von dem GST-Teil mittels Verdau mit Thrombin abgetrennt. Der Verdau wurde mittels SDS-PAGE fraktioniert, das PDE-Protein wurde elektro-eluiert und subkutan in ein Kaninchen injiziert. Das resultierende Antiserum erkennt sowohl das humane cGB-PDE-Fragment, das als ein Antigen verwendet wurde, als auch das menschliche cGB-PDE-Protein voller Länge, das in Hefe exprimiert wird (siehe Beispiel 8).
Beispiel 10
Polynukleotide, die für verschiedene cGB-PDE-Analoge kodieren und cGB-PDE-Fragmente wurden mittels Standardverfahren erzeugt.
A. cGB-PDE-Analoge
Alle bekannten cGMP-bindenden PDEs enthalten zwei intern homologe Tandem-Repeats innerhalb ihrer vermutlichen cGMP-Bindungsdomänen. In der bovinen cGB-PDE der Erfindung überspannen die Repeats wenigstens Reste 228–311 (Repeat A) und 410–500 (Repeat B) von SEQ ID NO: 10. Eine ortsgerichtete Mutagenese einer Asparaginsäure, die in den Repeats A und B aller bekannten cGMP-bindenden PDEs konserviert ist, wurde verwendet, um Analoge von cGB-PDE mit entweder Asp-289 ersetzt durch Ala (D289A) oder Asp-478 ersetzt durch Ala (D478A) zu erzeugen. Die rekombinanten Wildtyp (WT) bovinen und mutanten bovinen cGB-PDEs wurden in COS-7-Zellen exprimiert. Die cGB-PDE, aufgereinigt aus Rinderlunge (native cGB-PDE) und WT-cGB-PDE wiesen identische cGMP-Bindungskinetiken mit einer K_d von näherungsweise 2 μM und einem kurvilinearen Dissoziationsprofil (t_½ = 1,3 Stunden bei 4°C) auf. Diese Kurvilinearität mag auf der Anwesenheit von bestimmten Hochaffinitäts- (langsamen) und Niederaffinitäts-(schnellen)Stellen der cGMP-Bindung beruht haben. Die D289A-Mutante hatte eine signifikant verringerte Affinität für cGMP (K_d > 20 μM) und eine einfache Rate der cGMP-Assoziation (t_½ = 0,5 Stunden), die ähnlich derjenigen war, die für die schnelle Stelle von WT- und nativer cGB-PDE berechnet worden war. Dies legte den Verlust einer langsamen cGMP-Bindungsstelle im Repeat A dieser Mutante nahe. Umgekehrt zeigte die D478A-Mutante eine höhere Affinität für cGMP (K_d von näherungsweise 0,5 μM) und eine einfache cGMP-Dissoziationsrate (t_½ = 2,8 Stunden), die ähnlich der für die langsame Stelle von WT- und nativer cGB-PDE berechneten Rate war. Dies legte den Verlust einer schnellen Stelle nahe, wenn Repeat B modifiziert wurde. Diese Resultate zeigen an, daß dimere cGB-PDE zwei homologe, aber kinetisch unterschiedliche cGMP-Bindungsstellen besitzt, wobei die konservierte Asparaginsäure für die Wechselwirkung mit cGMP an jeder Stelle wesentlich ist. Siehe Colbran et al., FASEB J., 8: Zusammenfassung 2149 (15. Mai 1994).
B. Amino-terminal frankierte cGB-PDE-Polypeptide
Ein frankiertes menschliches cGB-PDE-Polypeptid, das Aminosäuren 516–875 von SEQ ID NO: 23 einschloß, wurde in Hefe exprimiert. Ein cDNA-Insert, das sich von der NcoI-Stelle am Nukleotid 1555 von SEQ ID NO: 22 bis zur XhoI-Stelle am 3'-Ende von SEQ ID NO: 22 erstreckte, wurde in den ADH2-Hefe-Expressionsvektor YEpC-PADH2d eingesetzt [Price et al., Meth. Enzymol., 185: 308–318 (1990)], der mit NcoI und SalI verdaut worden war, um Plasmid YEpC-PADH2d HcGB zu erzeugen. Das Plasmid wurde in Sphäroplasten des Hefestamms yBJ2-54 transformiert (prc1-407 prb1-1122 pep4-3 leu2 trp1 ura3-52 Δpdel::URA3, HIS3 Δpde2::TRP1 cir^•). Die endogenen PDE-Gene sind in diesem Stamm deletiert. Die Zellen ließ man in SC-Ieu-Medium mit 2% Glukose auf 10⁷ Zellen/ml wachsen, sie wurden mittels Filtration gesammelt und 24 Stunden in YEP-Medium wachsen gelassen, das 3% Glycerol enthält. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation pelletiert und gefroren gelagert. Die Zellen wurden mit Glasperlchen aufgebrochen, und das Zell-Homogenat wurde auf Phosphodiesterase-Aktivität im wesenentlichen getestet, wie in Prpic et al., Anal. Biochem., 208: 155–160 (1993) beschrieben. Das frankierte menschliche cGB-PDE-Polypeptid wies Phosphodiesterase-Aktivität auf.
C. Carboxy-terminal trunkierte cGB-PDE-Polypeptide
Zwei verschiedene Plasmide, die für carboxy-terminal frankierte menschliche cGB-PDE-Polypeptide kodierten, wurden konstruiert.
Plasmid pBJ6-84Hin enhält eine cDNA, die für Aminosäuren 1–494 von SEQ ID NO: 23 kodiert, eingesetzt in die NcoI und SalI-Stellen von Vektor YEpC-PADH2d. Das cDNA-Insert erstreckt sich von der NeoI-Stelle an Nukleotid-Position 10 von SEQ ID NO: 22 durch die HindIII-Stelle an Nukleotid-Position 1494 von SEQ ID NO: 22, gefolgt von einem Linker und der SalI-Stelle von YEpC-PADH2d.
Das Plasmid pBJ6-84Ban enthält eine cDNA, die für Aminosäuren 1–549 von SEQ ID NO: 23 kodiert, eingesetzt in die NcoI- und SalI-Stellen von Vektor YEpC-PADJ2d. Das cDNA-Insert erstreckt sich von der NcoI-Stelle an Nukleotid-Position 10 von SEQ ID NO: 22 durch die BanI-Stelle an Nukleotid-Position 1657 von SEQ ID NO: 22, gefolgt von einem Linker und der SalI-Stelle von YEpC-PADH2d.
Die trunkierten cGB-PDE-Polypeptide sind zum Screenen auf Modulatoren der cGB-PDE-Aktivität nützlich.
Beispiel 11
Monoklonale Antikörper, die mit menschlicher cGB-PDE reaktiv sind, wurden erzeugt.
Hefe yBJ2-54, das Plasmid YEpADH2 HcGB (Beispiel 10B) enthaltend, wurde in einem New Brunswick Scientific 10 Liter Microferm fermentiert. Das cGB-PDE-cDNA-Insert in Plasmid YEpADH2 HcGB erstreckt sich von der NcoI-Stelle an Nukleotid 12 von SEQ ID NO: 22 bis zu der XhoI-Stelle am 3 3'-Ende von SEQ ID NO: 22. Ein Inoculum von 4 × 10⁹ Zellen wurde zu 8 Liter Medien, enthaltend SC-leu, 5% Glukose, metallische Spurenelemente und Vitamin-Spurenelemente zugegeben. Die Fermentation wurde bei 26°C gehalten, es wurde bei 600 rpm mit dem Standard-mikrobiellem Rührer gerührt und mittels Druckluft bei 10 Volumina pro Minute belüftet. Wenn die Glukose auf 0,3% 24 Stunden nach der Beimpfung abgesunken war, wurde die Kultur mit 2 Litern 5 × YEP-Medien, enthaltend 15% Glyzerin, infundiert. 66 Stunden nach der Beimpfung wurde die Hefe aus dem Fermenter mittels Zentrifugation bei 4.000 × g für 30 Minuten bei 4°C geerntet. Die gesamte Biomassenausbeute aus dieser Fermentation näherte sich 350 g Naßgewicht.
Menschliches cGB-PDE-Enzym wurde aus dem Hefe-Zellpellet aufgereinigt. Es wurden Assays für die PDE-Aktivität unter Verwendung von 1 mM cGMP als Substrat verwendet, um die Chromatographie des Enzyms zu verfolgen. Alle chromatographischen Handhabungen wurden bei 4°C durchgeführt.
Hefe (29 g Naßgewicht) wurde im 70 ml Puffer A resuspendiert (25 mM Tris pH 8,0, 0,25 mM DTT, 5 mM MgCl₂, 10 μM ZnSO₄, 1 mM Benzamidin) und durch Passieren durch einen Microfluidizer bei 22–24.000 psi lysiert. Das Lysat wurde bei 10.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde auf eine 2,6 × 28 cm Säule aufgebracht, enthaltend Pharmacia Fast Flow Q Anionenaustauschharz, äquilibriert mit Puffer B, enthaltend 20 mM BisTris-Propan pH 6,8, 0,25 mM DTT, 1 mM MgCl₂ und 10 μM ZnSO₄. Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina Puffer B gewaschen, enthaltend 0,125 M NaCl, und dann mit einem linearen Gradienten von 0,125 bis 1,0 M NaCl entwickelt. Fraktionen, die das Enzym enthielten, wurden vereinigt und direkt auf eine 5 μ 20 cm Säule keramischen Hydroxylapatit (BioRad) aufgebracht, äquilibriert in Puffer C, enthaltend 20 mM BisTris-Propan pH 6,8, 0,25 mM DTT, 0,25 MKCl, 1 mM MgCl₂ und 10 μM ZnSO₄. Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina Puffer C gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 250 mM Kaliumphosphat in Puffer C eluiert. Das vereinigte Enzym wurde 8-fach mittels Ultrafiltration (YM30 Membran, Amicon). Das konzentrierte Enzym wurde auf eine 2,6 × 90 cm Säule von Pharmacia Sephacryl S300 (Piscataway, NJ) chromatographiert, äquilibriert in 25 mM BisTris-Propan pH 6,8, 0,25 mM DTT, 0,25 M NaCl, 1 mM MgCl₂ und 20 μM ZnSO₄. Näherungsweise 4 mg Protein wurden enthalten. Das rekombinante menschliche cGB-PDE-Enzym machte näherungsweise 90% des erhaltenen Proteins aus, beurteilt mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefolgt von Färbung mit Coomassie-Blau.
Das aufgereinigte Protein wurde als ein Antigen verwendet, um monoklonale Antikörper zu ziehen. Von 19-Wochen-alten Balb/c-Mäusen (Charles River Biotechnical Services, Inc., Wilmington, Mass) wurde jede subkutan mit 50 μg aufgereinigtem menschlichen cGB-PDE-Enzym in einer 200 μl-Emulsion, bestehend aus 50% Freundschem vollständigen Adjuvans (Sigma Chemical Co.), immunisiert. Darauffolgende Boosts am Tag 20 und am Tag 43 wurden in unvollständigem Freundschem Adjuvans verabreicht. Ein Prä-Fusions-Boost wurde am Tag 86 unter Verwendung von 50 μg Enzym in PBS durchgeführt. Die Fusion wurde am Tag 90 durchgeführt.
Die Milz von Maus #1817 wurde steril entfernt und in 10 ml Serum-freies RPMI 1640 gebracht. Eine Einzelzeli-Suspension wurde gebildet und durch ein steriles 70-mesh Nitex Zell-Sieb (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) gefiltert und zweimal durch Zentrifugieren bei 200 g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 20 ml Serum-freien RPMI gewa schen. Es wurden Thymocyten, die 3 naiven Balb/c Mäusen entnommen worden waren, auf eine ähnliche Weise hergestellt.
NS-1-Myelom-Zellen, die in der log-Phase im RPMI mit 11% Fetalclone (FGS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) für 3 Tage vor der Fusion gehalten worden waren, wurden bei 200 g für 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet wurde zweimal, wie im vorhergehenden Paragraph beschrieben, gewaschen. Nach dem Waschen wurde jede Zellsuspension auf ein Endvolumen von 10 ml in Serum-freies RPMI gebracht, und 20 μl wurden 1 : 50 in 1 ml Serum-freiem RPMI verdünnt. 20 μl jeder Verdünnung wurden entfernt, gemischt mit 20 μl 0,4% Trypanblaufärbung in 0,85% Kochsalzlösung (Gibco), auf einen Hämozytometer geladen (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, Illinois) und gezählt.
Zwei × 10⁸ Milzzellen wurden kombiniert mit 4,0 × 10⁷ NS-1-Zellen, zentrifugiert, und der Überstand wurde aspiriert. Das Zellpellet wurde losgelöst durch Anstoßen des Röhrchens, und 2 ml 37°C PEG 1500 (50% in 75 mM Hepes, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) wurden unter Rühren im Verlauf von 1 Minute zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 14 ml Serum-freiem RPMI über 7 Minuten. Zusätzliche 16 ml RPMI wurden zugegeben, und die Zellen wurden bei 200 g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstands wurde das Pellet in 20 ml RPMI, enthaltend 15% FBS, 100 μM Natriumhypoxanthin, 0,4 μM Aminopterin, 16 μM Thymidin (HAT) (Gibco), 25 Einheiten/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) und 1,5 × 10⁶ Thymozyten/ml, resuspendiert. Die Suspension wurde zuerst in einen T225-Kolben (Corning, Vereinigtes Königreich) bei 37°C für 2 Stunden gebracht, bevor sie in zehn 96-Napf-Gewebekulturplatten mit flachem Boden (Corning, Vereinigtes Königreich) in 200 μl/Napf verteilt wurde. Die Zellen in den Platten wurden an den Tagen 3, 4, 5 nach dem Fusionstag gefüttert durch Aspirieren von näherungsweise 100 μl von jedem Napf mit einer 20-G-Nadel (Becton Dickinson) und durch Zugabe von 100 μl/Napf Plattiermedium, das oben beschreiben ist, außer daß es 10 Einheiten/ml IL-6 enthält und Thymozyten fehlen.
Die Fusion wurde anfänglich mittels ELISA gescreent. Immulon-4-Platten (Dynatech) wurden bei 4°C über Nacht mit aufgereinigtem menschlichen cGB-PDE-Enzym beschichtet (100 ng/Napf in 50 mM Carbonatpuffer pH 9,6). Die Platten wurden 3 × mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 (PBST), gewaschen. Die Überstände der einzelnen Hybridoma-Näpfe wurden zu den Enzym-beschichteten Näpfen (50 μl/Napf) zugegeben. Nach einer Inkubation bei 37°C für 30 Minuten und Waschen wie oben wurden 50 μl Meerrettich-Peroxidase- konjugierter Ziege-anti-Maus IgG(fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania), verdünnt 1 : 3500 in PBST, zugegeben. Die Platten wurden wie oben inkubiert, 4 × mit PBST gewaschen und 100 μl Substrat, bestehend aus 1 mg/ml o-Phenylen Diamin (Sigma) und 0,1 μl/ml 30% H₂O₂ in 100 mM Citrat, pH 4,5, wurden zugegeben. Die Farbreaktion wurde in 5 Minuten durch die Zugabe von 50 μl 15% H₂SO₄ abgestoppt. A₄₉₀ wurde auf einem Platten-Lesegerät (Dynatech) gelesen.
Die Näpfe C5G, E4D, F1G, F9H, F11G, J4A und J5D wurden genommen und umbenannt in 102A, 102B, 102C, 102D, 102E, 102F bzw. 102G, zwei- oder dreimal aufeinanderfolgend kloniert durch verdoppelnde Verdünnung in RPMI, 15% FBS, 100 μM Natriumhypoxanthin, 16 μM Thymidin und 10 Einheiten/ml IL-6. Die Näpfe der Klonplatten wurden visuell nach 4 Tagen bewertet, und die Anzahl an Kolonien in den am wenigsten dichten Näpfen wurden aufgezeichnet. Ausgewählte Näpfe jeder Klonierung wurden mittels ELISA getestet.
Die monoklonalen Antikörper, produziert durch obige Hybridome, wurden in einem ELISA-Assay isotypisiert. Die Resultate zeigten, daß die monoklonalen Antikörper 102A bis 102E IgG1 waren, 102F war IgG2b und 102G war IgG2a.
Alle sieben monoklonalen Antikörper reagierten mit menschlicher cGB-PDE, bestimmt mittels Western-Analyse.
Beispiel 12
Das Entwickeln von Modulatoren der biologischen Aktivitäten spezifischer PDEs erfordert das Differenzieren von PDE-Isozymen, die in einer einzelnen Assay-Präparation vorhanden sind. Der klassische enzymologische Ansatz, PDEs aus natürlichen Gewebequellen zu isolieren und jedes neue Isozym zu studieren, wird durch die Einschränkungen der Aufreinigungstechniken und die Unfähigkeit beeinträchtigt, definitiv festzustellen, ob eine vollständige Auflösung eines Isozyms erreicht worden ist. Ein anderer Ansatz ist es gewesen, Assay-Bedingungen zu identifizieren, die den Beitrag eines Isozyms favorisieren und den Beitrag anderer in einer Zubereitung minimieren könnten. Noch ein anderer Ansatz ist die Auftrennung von PDEs durch immunologische Mittel gewesen. Jeder der vorhergehenden Ansätze zum Differenzieren von PDE-Isozymen ist zeitraubend und technisch schwierig. Als ein Resultat sind viele Versuche, um selektive PDE-Modulatoren zu entwickeln, mit Präparationen durchgeführt worden, die mehr als ein Isozym enthielten. Darüber hinaus unterliegen PDE-Präparationen aus natürlichen Gewebequellen limitierter Proteolyse und können Mischungen von aktiven proteolytischen Produkten enthalten, die unterschiedliche kinetische, regulatorische und physiologische Eigenschaften als die PDEs voller Länge haben.
Die rekombinanten cGB-PDE-Polypeptid-Produkte der Erfindung erleichtern die Entwicklung neuer und spezifischer cGB-PDE-Modulatoren stark. Die Verwendung von menschlichen rekombinanten Enzymen zum Screenen auf Modulatoren hat viele inhärente Vorteile. Der Bedarf zur Aufreinigung eines Isozyms kann vermieden werden durch sein rekombinantes Exprimieren in einer Wirtszelle, der eine endogene Phosphodiesterase-Aktivität fehlt (z. B. Hefestamm YKS45, hinterlegt als ATCC 74225). Das Screenen von Verbindungen gegen menschliches Protein vermeidet die Komplikationen, die oft aus dem Screenen gegen nicht-menschliches Protein entstehen, bei denen es sein kann, daß eine Verbindung, die auf ein nicht-menschliches Protein optimiert ist, für das menschliche Protein nicht spezifisch ist oder damit nicht reagiert. Z. B. ist ein Unterschied in einer einzelnen Aminosäure zwischen den menschlichen und Nagetier 5HT_1B-Serotoninrezeptoren für den Unterschied hinsichtlich der Bindung einer Verbindung an die Rezeptoren verantwortlich. [Siehe Oskenberg et al., Nature, 360: 161–163 (1992)]. Wenn eine Verbindung, die die Aktivität der cGB-PDE moduliert, entdeckt wird, kann ihre Selektivität durch Vergleich ihrer Aktivität auf die cGB-PDE mit ihrer Aktivität auf andere PDE-Isozyme bewertet werden. Somit stellt die Kombination der rekombinanten cGB-PDE-Produkte der Erfindung mit anderen rekombinanten PDE-Produkten in einer Reihe unabhängiger Assays ein System zum Entwickeln von selektiven Modulatoren von cGB-PDE bereit. Selektive Modulatoren können z. B. Antikörper und andere Proteine oder Peptide einschließen, die spezifisch an die cGB-PDE oder cGB-PDE Nukleinsäure binden, Oligonukleotide, die spezifisch an die cGB-PDE (siehe Patentzusammenarbeitsvertrag Internationale Veröffentlichungsnr. WO 93/05182, veröffentlicht am 18. März 1993, die Verfahren zum Auswählen von Oligonukleotiden beschreibt, die selektiv an Target-Biomoleküle binden), oder cGB-PDE-Nukleinsäure (z. B. Antisense-Oligonukleotide) binden und andere natürliche oder synthetische Nicht-Peptid-Verbindungen, die spezifisch an die cGB-PDE oder cGB-PDE-Nukleinsäure binden. Mutante Formen der cGB-PDE, die die enzymatische Aktivität der cGB-PDE oder ihre Lokalisierung in einer Zelle verändern, werden ebenso in Erwägung gezogen. Die Kristallisierung von rekombinanter cGB-PDE alleine und gebunden an einen Modulator, die Analyse der atomaren Struktur mittels Röntgen-Kristallographie und die Computermodellierung dieser Strukturen sind Verfahren, die zum Entwerfen und Optimieren von selektiven Nicht-Peptid-Modulatoren nützlich sind. Siehe z. B. Erickson et al., Ann. Rep. Med. Chem., 27: 271–289 (1992) für einen allgemeinen Überblick von Wirkstoff-Design auf Strukturbasis.
Die Targets für die Entwicklung von selektiven Modulatoren schließen z. B. ein: (1) die Regionen der cGB-PDE, die mit anderen Proteinen in Kontakt kommen und/oder die cGB-PDE innerhalb einer Zelle lokalisieren, (2) die Regionen der cGB-PDE, die Substrat binden, (3) die allosterische(n) cGMP-Bindungsstelle(n) von cGB-PDE, (4) die Metall-Bindungsregionen der cGB-PDE, (5) die Phosphorylierungsstelle(n) von cGB-PDE und (6) die Regionen der cGB-PDE, die bei der Dimerisierung von cGB-PDE-Untereinheiten beteiligt sind.
Sequenzprotokoll

Claims

Ein aufgereinigtes und isoliertes Polynukleotid, das für das humane, zyklisches GMP-bindende, für zyklisches GMP spezifische Phosphodiesterase(cGB-PDE)-Polypeptid kodiert, das in SEQ ID NO: 23 dargestellt ist.
Ein aufgereinigtes und isoliertes Polynukleotid, das für eine humane, allelische Variante des in SEQ ID NO: 23 dargestellten cGB-PDE-Polypeptids kodiert, wobei besagtes Polynukleotid bei ungefähr 65°C in 3 × SSC, 20 mM Natriumphosphat pH 6,8, unter Waschen bei ungefähr 65°C in 2 × SSC, an den nicht-kodierenden Strang der in SEQ ID NO: 22 dargestellten DNA hybridisiert.
Ein Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, das eine DNA ist.
Eine DNA nach Anspruch 3, die eine cDNA ist.
Eine DNA nach Anspruch 3, die eine genomische DNA ist.
Ein RNA-Transkript einer DNA nach Anspruch 5.
Eine DNA nach Anspruch 5, die weiter eine endogene Expressionskontroll-DNA-Sequenz umfaßt.
Ein Vektor, der eine DNA nach Anspruch 3 umfaßt.
Ein Vektor nach Anspruch 8, wobei die DNA an eine Expressionskontroll-Sequenz operativ geknüpft ist.
Eine Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 3 auf eine Weise stabil transformiert oder transfiziert ist, die die Expression in besagter Wirtszelle der cGB-PDE von SEQ ID NO: 23 ermöglicht.
Ein Verfahren zum Herstellen eines cGB-PDE-Polypeptids, wobei das Verfahren umfaßt: Wachsenlassen einer Wirtszelle nach Anspruch 10 in einem geeigneten Nährmedium und Isolieren von cGB-PDE-Polypeptid aus der Zelle oder dem Medium seines Wachstums.
Ein cGB-PDE-Polypeptid, erzeugt durch das Verfahren von Anspruch 11.
Ein aufgereinigtes und isoliertes Polynukleotid, das die in SEQ ID NO: 22 dargestellte DNA-Sequenz umfaßt.
Ein Fragment humaner cGB-PDE, das aus den Aminosäuren 516 bis 875 von SEQ ID NO: 23 besteht.
Ein Fragment humaner cGB-PDE, das aus den Aminosäuren 1–494 von SEQ ID NO: 23 besteht.
Ein Fragment der humanen cGB-PDE, das aus den Aminosäuren 1–549 von SEQ ID NO: 23 besteht.
Ein Fragment der humanen cGB-PDE, das aus den Aminosäuren 515–819 von SEQ ID NO: 23 besteht.
Ein Antikörper, der spezifisch immunreaktiv ist mit der cGB-PDE, wie dargestellt in SEQ ID NO: 23.
Ein Antikörper nach Anspruch 18, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Eine Hybridom-Zellinie, die einen Antikörper nach Anspruch 19 produziert.
Ein Antikörper nach Anspruch 18, der ein humanisierter Antikörper ist.