DE69333785T2

DE69333785T2 - Anordnung zum Aufbau eines Proben- und Reagenzien-Aufnahmesystems für in situ PCR auf einer Lamelle

Info

Publication number: DE69333785T2
Application number: DE69333785T
Authority: DE
Inventors: John G. Atwood; Larry Haff
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1993-02-16
Filing date: 1993-09-30
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2013-10-01
Also published as: IL107131A0; NZ248835A; EP0611598A2; JPH06245771A; IL107131A; AU5505494A; KR940019868A; IL120847A0; CN1095759A; AU6219496A; AU673397B2; EP0884394A2; AU705036B2; DE69323720D1; US5675700A; IL120847A; ATE291635T1; EP0884394B1; US5527510A; DE69333785D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Erfindungsfeld
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein System zum Durchführen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction) und insbesondere eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Durchführen einer PCR auf einer DNS- oder RNS-Probe, ohne diese aus ihrer ursprünglichen Zellenstruktur zu entfernen.
Beschreibung des Standes der Technik
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Prozeß zum Herstellen einer sehr großen Anzahl von genauen Kopien eines Abschnitts einer doppelstrangigen DNS (Amplifikation) durch thermisches Wechselbehandeln von einem oder mehreren Molekülen der DNS (der Matrizen-DNS) in Anwesenheit eines thermisch stabilen DNS-Polymerase-Enzyms (typischerweise Taq-Polymerase), der vier DNS-Nukleotidenbasen und zwei oder mehreren einstrangigen DNS-Primern. Diese Primer sind kurze Abschnitte in der Größenordnung von 20 Basen, die den 5'-Enden der zwei komplementären DNS-Einsträngen der doppelstrangigen Matrize komplementär sind.
PCR ist eine immens wertvolle Technik, die weit verbreitet ist und das Gebiet der Molekularbiologie revolutioniert hat. Die Technik ist ausführlich in den US-Patenten 4,683,195, 4,683,202 und 4,965,188 beschrieben. Die Reaktion wurde bis vor kurzem in Lösung in kleinen Reaktionsgefäßen ausgeführt, in der die zu amplifizierende DNS in Suspension ist. Vorrichtungen für diesen Prozeß werden in dem US-Patent 5,038,852 sowie in der US-Patentanmeldung Nr. 07/871,274, eingereicht am 20. April 1992, offenbart.
Das Dokument US 4,814,279 offenbart einen Brutschrank für chemische-analytische Objektträger. Der Brutschrank hat eine Zelle, in die ein Objektträger eingeführt und eingelegt wird, eine Öffnung für Photometrie, ein Dichtungselement, das angedrückt wird, um die Öffnung zum Beobachten des Objektträgers abzudichten, eine Drückeinrichtung, die das Dichtelement an das Loch für Photometrie drückt, sowie eine Heizeinrichtung, die den Objektträger erhitzt. Das Dichtelement umfasst einen Dichtteil, der aus Kunststoff besteht und die Öffnung zum Beobachten abdeckt, sowie einen Drückteil, der verschleißfest ist.
In letzter Zeit wurde herausgefunden, dass es möglich ist, PCR für die Amplifikation besonderer DNS-Abschnitte innerhalb von Zellen anzuwenden, ohne dass die DNS aus den Zellen extrahiert werden muß. Diese Technik wird als in-situ-PCR bezeichnet. Die Zellen können einzelne Zellen oder ein Teil einer Gewebeprobe sein. Meistens wird die in-situ-PCR bei Zellen oder dünnen Gewebeschnitten durchgeführt, die auf Mikroskop-Objektträgern positioniert sind. Die Zellen oder das Gewebe werden gewöhnlich durch eine Behandlung mit Formalin oder einem anderen Reagens fixiert, so dass ihre Morphologie erhalten und nach der Behandlung erkennbar ist.
Wenn der ausgewählte DNS-Abschnitt derart amplifiziert wird, dass die amplifizierte Produkt-DNS selektiv gefärbt werden kann, dann kann eine mikroskopische Untersuchung der PCR-behandelten Zellen identifizieren, welche Zellen in einer Gewebeprobe, wenn vorhanden, den besonderen DNS-Abschnitt enthalten und sogar, wo in der Zelle er lokalisiert ist. Eine Sichtbarmachung der amplifizierten DNS innerhalb der Zellen kann durch eines von zwei Verfahren erreicht werden. Ein Verfahren verwendet eine komplementäre einstrangige DNS-Probe, an die ein Indikatormolekül angefügt wurde. Diese Probe wird mit den besonderen DNS-Sequenzen in der amplifizierten Probe hybridisiert, wenn vorhanden, und die überschüssige Probe und der Indikator werden weggewaschen. Dann werden die Positionen der verbleibenden Indikatormoleküle durch die Behandlung mit Entwicklungsreagenzien sichtbar gemacht. Diese Technik zum Sichtbarmachen wird als „in-situ-Hybridisierung" oder „indirekte Feststellung" der in situ amplifizierten DNS bezeichnet.
Das andere Verfahren zum Sichtbarmachen besteht darin, während des PCR-Prozesses ein PCR-Reagens zu verwenden, das modifizierte DNS-Nukleotidbasen enthält, an die ein Indikatormolekül angefügt wurde. Viele modifizierte Basen mit Indikatormolekülen werden durch die DNS-Polymerase direkt in das amplifizierte Produkt eingebaut. Die Position der amplifizierten DNS kann dann wie zuvor durch das Behandeln des Objektträgers mit Entwicklungsreagenzien sichtbar gemacht werden. Die ses Verfahren wird als „direkte Integrationsfeststellung" der in situ amplifizierten DNS bezeichnet.
Die Entwicklungsreagenzien in beiden Verfahren umfassen typischerweise Enzyme wie Alkaliphosphatase in Verbindung mit einem Molekül, das sich stark und spezifisch mit dem Indikatormolekül auf der amplifizierten DNS oder auf der hybridisierten Probe verbindet, sowie ein Substrat, das durch das Enzym typischerweise in einen nicht lösbaren, stark absorbierenden Farbstoff umgewandelt wird. Wenn das Indikatormolekül auf der amplifizierten DNS Biotin ist, dann ist das mit dem Enzym verbundene Bindungsmolekül typischerweise Avidin. Wenn das Indikatormolekül Digoxigenin, dann ist das Verbindungsmolekül ein Antidigoxigenin-Antikörper. Beide Arten von Entwicklungsreagenzien wurden sowohl in der indirekten Feststellung durch die in-situ-Hybridisierung und in der direkten Integrationsfeststellung verwendet. Die Indikatoren der Indikatormoleküle können gefärbt, fluoreszierend oder radioaktiv sein.
Beide Verfahren der Feststellung der in situ amplifizierten DNS können sehr empfindlich sein und von zehn zu einigen hundert Kopien des amplifizierten DNS-Segments in jeder Zelle feststellen. Beide Verfahren erfordern eine gewissen Nach-PCR-Verarbeitung des Objektträgers nachdem die in-situ-Thermowechselbehandlung abgeschlossen ist.
Verfahren zum Wechselbehandeln für die in-situ-PCR von ganzen Zellen unterscheiden sich je nach der Zellenquelle. Zellen, die kein Gewebe bilden, wie Leukozyten und viele Kulturzellen (wie He-La-Zellen), erfordern nicht notwendigerweise eine spezielle Instrumentation für das in-situ-PCR-Thermowechselbehandeln. Hasse et al. berichten in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 4971–4975 (1990), dass Suspensionen derartig fixierter Zellen in denselben Reagenzgläsern thermisch wechselbehandelt werden können, die normalerweise für die Lösungsphasen-PCR verwendet werden, und dass die Zellen danach auf einem Objektträger für die Feststellung des amplifizierten Produkts verteilt werden.
Häufig werden derartige Zellen jedoch auf einem Objektträger thermisch wechselbehandelt. Sie werden durch Zentrifugieren auf dem Objektträger verteilt, wobei ein sogenanntes „Zytospin"-Präparat erzeugt wird. Das Verteilen derartiger Zellen erleichtert die Fixierverfahren und anderen Behandlungen der Probe vor der PCR. Dies erfordert keinen zusätzlichen Aufwand, da der Zytospin-Schritt sowieso später für die Sichtbarmachung des amplifizierten Produktes auf dem Objektträger erforderlich ist. Zytospins werden genauso wie auf Objektträgern aufgebrachte Gewebe amplifiziert.
Wenn Zellen in Gewebeschnitten untersucht werden sollen, müssen sie direkt auf einer Oberfläche amplifiziert werden, da die dünnen Schnitte ansonsten nicht die Morphologie des Gewebes wiedergeben können. Beim thermischen Wechselbehandeln der Gewebe ist es problematisch, die Gewebemorphologie und die Zellenmorphologie beizubehalten, die Verdampfung der PCR-Rekationsmixtur über der Probe zu verhindern und einheitliche, wiederholbare Ergebnisse zu erhalten.
Um die in-situ-PCR auf fixierten Zellen oder Gewebeproben auf einem Mikroskop-Objektträger aus Glas durchzuführen, muß man erstens einen Objektträger verwenden, der derart behandelt wurde, dass die Zellen oder das Gewebe auf dem Objektträger haften und nicht durch die wäßrigen Behandlungen für die Sichtbarmachung der amplifizierten DNS weggewaschen oder weggeschwemmt werden. Typischerweise ist ein mit Silan behandelter Objektträger geeignet, der an seiner Oberfläche kovalente Bindungen mit 3-Aminopropyl-Triethoxysilan-Molekülen eingeht. Alternativ dazu können Beschichtungen aus Poly (Lysin) oder Gelatine/Chromalaun verwendet werden.
Als nächstes wird die Fläche des Objektträgers mit der zu amplifizierenden Probe großzügig mit dem PCR-Reagens bedeckt, das DNS-Polymerase-Enzyme, Nukleotiden, Primer und andere Komponenten in den richtigen Konzentrationen enthält. Dann müssen der Objektträger und das Reagens typischerweise 10 bis 30 Mal mit Temperaturen von typischerweise ungefähr 95°C und 68°C, manchmal jedoch nur 37°C wechselbehandelt werden, wobei während jedes Zyklus wenigstens eine Minute oder länger bei jeweils jeder der zwei oder drei ausgewählten Temperaturen verblieben wird.
Es gibt einige wichtige Anforderungen, die während der thermischen Wechselbehandlung erfüllt werden müssen, damit die in-situ-PCR erfolgreich ist. Eine Anforderung besteht darin, dass die Verdampfung von Wasser aus dem Reagens beinahe vollständig verhindert werden muß. Es kann keine Änderung von mehr als 5% der optimalen Reagenskonzentrationen toleriert werden, ohne dass niedrigere Amplifikationsergebnisse oder eine schlechtere spezifische Wirkung resultieren. Eine andere Anforderung besteht darin, dass kein der PCR-Reaktion entgegenwirkendes Material während des Prozesses in Kontakt mit dem Reagens kommen darf. Eine weitere Anforderung be steht darin, dass Luftblasen oder gelöstes Gas, die bei der Erwärmung durch das Reagens gelöst werden, nicht den Zugriff des flüssigen Reagens auf die gesamte zu verarbeitende Fläche stören dürfen.
Veröffentlichungen über die in-situ-PCR zeigen, dass es für die Beibehaltung einer sehr spezifischen Amplifikation häufig wichtig ist, die Reaktion so vorzusehen, dass ein „heißer Start" oder sein chemisches Äquivalent erreicht wird. Bei einem physikalisch heißen Start wird das ganze Reagens weder zusammengestellt, noch kontaktiert es die Probe-DNS, bis alle für die Reaktion erforderlichen Komponenten auf eine hohe Temperatur erwärmt sind. Die Temperatur muß hoch genug sein, so dass keine Teilhybridisierung der Primer an anderen Positionen als der vorgeschriebenen Matrizenposition auftreten kann, obwohl das gesamte Genom der Zelle für die nichtspezifische Teilhybridisierung der Primer verfügbar ist. Die Temperatur muß auch hoch genug sein, um zu verhindern, dass sich Primermoleküle verbinden, um ein amplifizierbares Produkt zu bilden, das als „Primer-Dimer" bezeichnet wird. Diese sichere Starttemperatur liegt typischerweise im Bereich von 68°C bis 75°C und ist typischerweise um 10°C wärmer als die in der PCR verwendete Abkühltemperatur.
Eine Möglichkeit zum Erreichen eines „chemisch heißen Starts" in einer PCR besteht darin, in dem Reagens eine wärmeempfindliche Komponente wie ein einstrangiges Bindungsprotein (SSB = Single Strand Binding) vorzusehen, das eine Erweiterung durch das Polymeraseenzym verhindert, bis die Reaktionsmischung im ersten PCR-Zyklus auf eine Temperatur erwärmt wird, die hoch genug ist, um eine nichtspezifische Hybridisierung zu verhindern und die wärmeempfindlichen SSB-Komponenten zu zerstören. Eine andere Möglichkeit zum Implementieren eines chemisch heißen Starts besteht darin, das dUTB durch Urazil zu ersetzen und zu dem Reagens das wärmeempfindliche Enzym UNG (Urazil-N-Glykosylase) hinzuzufügen, das alle PCR-Produkte zerstört, die bei der Inkubationszeit mit niedriger Temperatur vor dem ersten PCR-Zyklus erzeugt werden.
Eine weitere Möglichkeit zum Implementieren eines chemisch heißen Starts besteht darin, das Taq-Polymeraseenzym mit einem Taq-Antikörper zu kombinieren, bevor es zu dem Reagens hinzugefügt wird. Ein derartiger monoklonaler Antikörper wurde vor kurzem von Dr. John Findlay der Kodak Clinical Products Division in einer Veröffentlichung mit dem Titel „Development of PCR for In Vitro Diagnostics" der 1992 San Die go Conference: Genetic Recoginition, November 18–20, 1992 vorgestellt. Der Taq-Antikörper bindet sich mit dem Taq-Polymeraseenzym und verhindert dessen Funktion bei normalen Temperaturen. Beim Erwärmen der verhinderten Taq-Polymerase auf beinahe 95°C wird der Taq-Antikörper, der ein normales Protein ist, denaturiert, wodurch das Taq-Polymeraseenzym entbunden wird und normal im PCR-Prozeß funktionieren kann.
Diese Typen von chemisch heißen Starts erfordern das Aufnehmen einer häufig teueren Komponente (z. B. UNG oder eines Taq-Antikörpers) in das Reagens und können der Leistung der PCR unvorteilhafte Beschränkungen auferlegen, wie etwa ein relativ kurzes Zeitlimit zwischen der Vorbereitung eines Reagens und der Zeit, zu der es benutzt werden muß, oder eine geringere Effektivität der Amplifikation. Es ist deshalb vorzuziehen, physikalisch heiße Starts bei der in-situ-PCR durchzuführen, wenn dies möglich ist.
Laborarbeiter erfüllen die oben genannten Anforderungen bei der in-situ-PCR durch verschiedene Möglichkeiten, die sie häufig in ihren eigenen Labors entwickelt haben. Die unter Verwendung der in-situ-PCR erhaltene Information kann häufig nicht in anderer Weise erhalten werden und ist derart wertvoll, dass der ungewöhnlich hohe Aufwand und die ungewöhnlich hohe Investition von Wissen toleriert wird, um diese Information zu erhalten.
Eine verbreitete Strategie besteht darin, einen Deckel über eine zu amplifizierende Probe zu legen und diesen mit Nagellack oder einem ähnliches Kleber zu dichten, wie durch Kommnoth et al. in Diagnostic Molecular Biology 1. #2, 85–97 (1992) gelehrt. Es ist nicht ungewöhnlich, dass derartige Anordnungen lecken, da der Nagellack nicht stark an den Gewebeproben haftet. Da alle das Reagens enthaltenden Komponenten starr sind, werden hohe Drücke bei der Denaturisierungstemperatur (typischerweise 94°C) erzeugt, die den Nagellack wegdrücken können. Der harte Deckel kann auch die Morphologie der empfindlichen Zellen zerstören, wenn er diese berührt. Dieses Verfahren erlaubt keine praktischen heißen Starts. Ein anderer Nachteil besteht in der Anforderung einer Chloroformbehandlung der Anordnung, um den Nagellack nach der Wechselbehandlung zu entfernen.
Derartige Objektträger werden typischerweise auf den Probenblock von Thermozyk luseinrichtungen gelegt, die nicht eigens für Objektträger ausgebildet sind. Um einen guten Wärmekontakt zu erhalten, verwenden Komminoth et al. einen Abstandhalter zwischen dem Probenraumdeckel der Thermozykluseinrichtung und dem Objektträger, um den Objektträger gegen den Probenblock zu drücken. Weiterhin sehen bestehende Thermozykluseinrichtungen mit Löchern im Thermoblock zum Aufnehmen von Reagenzgläsern keinen gleichmäßigen Wärmekontakt und damit keinen gleichmäßige Temperatur für Objektträger vor.
Eine verwandte Technik wird von Chiu et al. J. Histochemistry and Cytochemistry 40. #3, 333–341 (1992) demonstriert, der zu untersuchende Zellen auf Objektträgern mit Kammern züchtet und eine in-situ-PCR der Zellen auf denselben Objektträgern durchführt. Nach dem Züchten werden die Kammerwände entfernt, wobei aber die Dichtung zwischen dem Objektträger und den Kammern auf dem Objektträger gelassen wird. Um eine in-situ-PCR durchzuführen, werden die Zellen zuerst mit einer PCR-Reaktionsmischung bedeckt, die 2,5% Agarose enthält, und werden die Objektträger eng mit einem Saranband umwickelt. Dieses Verfahren sieht eine flexible Bedeckung der Zellen vor, die auf den Dichtungen aufliegt, so dass eine Beschädigung der Zellen vermieden wird. Das Saranband ermöglicht eine Kontrolle der Verdunstung. Die gesamte Anordnung wird auf eine Perkin-Elmer-Cetus-DNA-Thermozykluseinrichtung gelegt, wobei Wasser in die langen Schlitze zwischen den Proben gegeben wird. Die Anordnung wird vor der Wechselbehandlung mit einem Kunststofffilm und einem Kunststoffdeckel bedeckt.
Nuovo et al. in American Journal of Pathology. #6, 1239–1244 (1992) bedecken die Proben mit einem Deckel aus einem flexiblen, temperaturbeständigen Polypropylen. Der Deckel wird typischerweise über dem gewünschten Gewebe mit einem Tropfen Nagellack an einer Ecke fixiert. Der Objektträger wird typischerweise in einem Aluminium-„Boof plaziert, das auf dem Probenblock einer Perkin-Elmer-Cetus-DNA-Thermozykluseinrichtung positioniert wird. Dieses „Boot" dient vor allem dazu, das Mineralöl zu halten, das später zu der Objektträger-Anordnung hinzugefügt wird, um eine Verdampfung der Reagenzien zu verhindern. Nach dem Bedecken der Probe mit der PCR-Reaktionsmischung ohne Taq-DNS-Polymerase, wird die Temperatur der Probe typischerweise auf ungefähr 65°C erhöht und der Deckel teilweise gehoben, um die Taq-Polymerase in die Reaktionsmischung einzuführen und die PCR-Reaktion einzuleiten.
Die Möglichkeit zum Heben des Deckels erlaubt einen heißen Start, was eine beträchtliche Verbesserung der spezifischen Wirkung und des Ertrags des spezifischen PCR-Produkts in der in-situ-PCR-Amplifikation ermöglicht. Nach dem Einführen des Enzyms wird zuvor erwärmtes Mineralöl auf die Oberseite und die Seiten des Deckels gegeben. Etwas Öl wird aufgrund der Kapillarwirkung auch unter den Deckel gezogen. Das Öl reduziert den Durchmesser des Tröpfchens des PCR-Reagens unter dem Deckel sowie die Kontrolle über die exakte Positionierung des Tröpfchens des PCR-Reagens. Das Verfahren ermöglicht exzellente Ergebnisse, erfordert jedoch sehr geschickte Bediener, ist umständlich und ist nicht für eine große Anzahl von Objektträgern geeignet.
Ein anderes verwendetes Verfahren zum thermischen Wechselbehandeln und zum Reduzieren der mit der Verdampfung und der Kondensation verbundenen Probleme besteht darin, die Objektträger in Kunststoffbeuteln zu plazieren und diese in einer Luftofen-Thermozykluseinrichtung wechselzubehandeln. Zum Beispiel bedecken Staskus et al. in Microbial Pathogenesis 1991. 11, 67–76 (1991) und Emberto et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 357–361 (1993) Objektträger mit einem Deckel und dann mit Mineralöl, bevor sie die Objektträger in einen gegenüber Hitze dichtbaren Kunststoffbeutel plazieren, der in einer Luftofen-Thermozykluseinrichtung wechselbehandelt wird. Mit dem Luftofen wird das Problem des Verdampfens des Wassers aus der Probe und des Kondensierens desselben auf dem Deckel vermieden, weil die gesamte Anordnung während der thermischen Wechselbehandlung im Wesentlichen isothermisch ist.
Der Hauptnachteil bei der Verwendung eines Luftofens besteht darin, dass die schlechten Übertragungseigenschaften des Systems sehr langsame Zykluszeiten bedingen. Derartige Systeme weisen häufig auch eine schlechte Gleichmäßigkeit der Temperatur bei aufeinanderfolgenden Proben auf.
Alles in allem bietet keines der bestehenden Verfahren jeweils die vorteilhaften Aspekte einer guten thermischen Gleichmäßigkeit, einer Kontrolle der Verdampfung ohne Mineralöl, eines kleinen Reagensvolumens, der Erhaltung der Zellenmorphologie, der Fähigkeit eines heißen Starts und der praktischen Anordnung einer großen Anzahl von Objektträgern für eine thermische Wechselbehandlung in einer anderen Anordnung als der horizontalen. Beinahe jeder verwendet heutzutage das Eintauchen des vorbereiteten Objektträgers in Mineralöl, um das Verdampfen von Wasser aus dem Reagens während der thermischen Wechselbehandlung zu vermeiden.
Die Ölbeschichtung ist extrem unpraktisch, weil sie gewöhnlich in zusätzlichen Schritten nach dem thermischen Wechselbehandeln und vor der weiteren Verarbeitung mit Feststellungsreagenzien sorgfältig und vollständig entfernt werden muß. Öl ist manchmal auch Träger von Verunreinigungen, die die PCR zunichte machen können.
Wir haben durch Experimente herausgefunden, dass wenn ein auf Wasser basierender Reagens auf der Probe vorgesehen ist und ein Deckel aus Kunststoff auf der Probe angebracht und mit Hilfe von Klebstoff an den Ecken oder Kanten an dem Objektträger befestigt wird, die Oberflächenspannung und die Elution von Gas den flüssigen Reagens während der Wechselbehandlung bewegen. Deshalb sind diese Verfahren nicht immer völlig verläßlich. Dabei ist es allgemein erforderlich, dass der Objektträger horizontal angeordnet wird, wodurch die Möglichkeiten der Anordnung in einer Thermozykluseinrichtung beschränkt werden. Bemühungen, das Reagens unter einem Deckel zu dichten, indem sein Durchmesser vollständig mit einem dichtenden Klebstoff umgeben wird, sind häufig nicht erfolgreich, weil eine Gasdichtung mit Klebstoff alleine schwierig oder unmöglich aufrechtzuerhalten ist. Außerdem ist die Oberfläche des Objektträgers gewöhnlich mit einer dünnen Schicht der Probe unter wenigstens einem Teil des Deckelumfangs bedeckt, wodurch eine schlechte Haftung auf dem Objektträger verursacht wird.
Dementsprechend besteht ein Bedarf für ein neues und verbessertes vollständiges Probenhaltesystem zum Durchführen einer in-situ-PCR. Es besteht ein Bedarf für ein System, das ein praktisches physikalisches Halten des Reagens auf einer Probe vorsieht und das das Verdampfen des Reagens und der Probe während der thermischen Wechselbehandlung verhindert. Es besteht weiterhin ein Bedarf für ein System, das die Verwendung von Öl überflüssig macht, keinen Klebstoff verwendet und keine horizontale Anordnung des Objektträgers während der thermischen Wechselbehandlung erfordert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen zum Montieren eines Proben-und- Reagenzfluid-Halte- bzw. Aufnahmesystems für in situ-PCR an einem Objektglas, wobei das Haltesystem ein Abdeckelement und eine Halte- bzw. Rückhalteanordnung umfasst.
Gemäß einer veranschaulichenden Ausführung der vorliegenden Erfindung umfasst eine Vorrichtung zum Montieren einer in-situ-PCR-Probe die in Anspruch 1 definierten Merkmale.
Gemäß einer weiteren veranschaulichenden Ausführung der vorliegenden Erfindung umfasst eine Vorrichtung zum Montieren einer in-situ-PCR-Probe die in Anspruch 5 definierten Merkmale.
Diese und andere Merkmale, Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung verdeutlicht, die auf die beigefügten Zeichnungen Bezug nimmt.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine perspektivische Ansicht eines Probenhaltesystems in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine Explosionsansicht der Systemanordnung von 1, die hier auf den Kopf gestellt, d. h. in der beim Anordnen verwendeten Lage gezeigt ist.
3 ist eine vergrößerte Teilansicht der Anordnung von 1, die hier auf den Kopf gestellt gezeigt ist, von oben.
4 ist eine Querschnittansicht der Anordnung entlang der Linie 4-4 von 3.
5 ist eine Querschnittansicht der Anordnung entlang der Linie 5-5 von 3.
7 ist eine Ansicht von oben auf die in 6 gezeigte Federklemme.
6 ist eine Endansicht einer der Federklemmen.
8 ist eine Ansicht eines bevorzugten Querträgers, der in der Anordnung verwendet wird, von unten.
9 ist eine Seitenansicht des in 8 gezeigten Querträgers.
10 ist eine Querschnittansicht des Querträgers von 8 entlang der Linie 10-10
11 ist eine perspektivische Ansicht einer Vorrichtung für die manuelle Anordnung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
12 ist eine perspektivische Ansicht einer mechanischen Anordnungseinrichtung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
13 ist eine perspektivische Ansicht der von der Vorrichtung von 12 getrennten Zangenanordnung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
1 zeigt ein Beispiel eines Haltesystems 10 zum Halten einer Probe 12, die eine Ziel-Nukleinsäure enthält, und eines auf der Probe aufgebrachten Reagens 13 auf einem Objektträger 14 aus Glas. Das System 10 umfasst den Objektträger 14 aus Glas, ein im Wesentlichen flexibles Deckelglied 16 über der Probe 12 sowie eine Halteeinrichtung 18, die den Deckel 16 auf dem Objektträger 14 befestigt.
Diese Systemanordnung 10 ist perspektivisch in 1 gezeigt. 2 zeigt eine Explosionsansicht der einzelnen Teile, und 3 zeigt eine vergrößerte Ansicht des in 1 gezeigten angeordneten Systems von oben. 4 und 5 zeigen Querschnittansichten des Systems 10 von 3.
Das Reagens 13, ungefähr ein Tropfen, ist durch eine flexibles Dichtungsglied oder eine Dichtung entlang des Umfangs dicht in dem Volumen zwischen dem Deckel 16 und dem Objektträger 14 eingeschlossen. Das Dichtungsglied kann ein separates Teil oder ein einstückig mit dem Deckel 16 ausgebildeter Teil sein. Die Dichtung ist vorzugsweise als flexibler Randteil 19 des Deckelgliedes 16 vorgesehen, das aus einem Elastomer hergestellt ist, das chemisch mit den PCR-Reagenzien kompatibel ist. Vor zugsweise ist das Deckelglied 16 aus Silikonkautschuk hergestellt. Die Dichtung ist breit genug und wird durch einen starren Dichtungsring 20 mit ausreichender Kraft pro Fläche gegen den Objektträger 14 gedrückt, so dass auch dann nur wenig Wasser, Flüssigkeit oder Dampf während der thermischen Wechselbehandlung aus dem Raum unter dem Deckel 16 entweichen kann, wenn die Oberfläche des Objektträgers unter dem Dichtungsring mit einer dünnen Schicht von Zellen oder Gewebe der Probe 12 bedeckt ist. Die Dichtung soll auch bei Kochtemperaturen aufrechterhalten werden.
Der flexible Deckel ist derart geformt, dass er im entspannten Zustand auf der das Reagens berührenden Seite leicht konkav ist. Der gewählte Grad der Höhlung definiert das Volumen 13, das zwischen dem Deckel 16 und dem Objektträger vorgesehen ist, wenn der Dichtungsring 20 den Randteil 19 des Deckels 16 gegen den Objektträger 14 drückt. Typischerweise beträgt das Volumen bei einem kreisförmigen Deckel mit einem Durchmesser von 12 mm ungefähr 10 Mikroliter. Das Volumen wird wie folgt gewählt. Wenn das Volumen zu groß gewählt wird, ist die erforderliche Menge des Reagens unnötig teuer und braucht länger, um sich zu erwärmen oder abzukühlen. Wenn das Volumen zu klein ist, ist das Verhältnis zwischen Oberfläche und Volumen unter dem Deckel unvorteilhaft groß, was das Risiko einer schlechten Amplifikation wegen der Adsorption der Enzyme auf den Oberflächen oder einer Vergiftung des Reagens 13 durch Spuren von hindernden Verunreinigungen auf den Teilen oder auf der Probe 12 erhöht.
Typischerweise ist der Durchmesser des interessanten Bereichs der zu untersuchenden Probe 12 nicht größer als 10 mm. Der freie Bereich des Objektträgers ist ungefähr 25 mm mal 57 mm groß, weil ein Ende gewöhnlich für die Etikettierung reserviert ist. Da es ziemlich schwierig ist, einen Gewebeschnitt mit einer Dicke von nur wenigen Mikrometern präzise auf einer vorbestimmten Position auf dem Objektträger zu plazieren, ist es vorzuziehen, den Deckel 16 so auszubilden, dass er an einer beliebigen Position auf dem freien Bereich angeordnet werden kann. Es können auch mehr als ein interessanter Bereich auf einem Objektträger vorhanden sein, so dass es von Vorteil ist, wenn wie in 1 gezeigt mehr als eine Probe und mehr als ein System 10 auf einem Objektträger angeordnet werden können.
Die neuartige Halteanordnung 18 zum Klemmen des Deckels 16 auf den Objektträger 14 erlaubt eine stark variable Position des Deckels 16. An einer beliebigen Positi on innerhalb eines wenige Millimeter breiten Randes an den Kanten des freien Bereichs auf dem Objektträger positionierte Proben können gehalten und amplifiziert werden. Der wenige Millimeter breite Rand wird für den Dichtungsring 20 benötigt. Der Randteil 19 des Deckels 16 wird durch den starren Dichtungsring 20 um seinen Umfang herum verstärkt, so dass wenn der Dichtungsring 20 an zwei gegenüberliegenden Kanten des Deckels gegen den Objektträger 14 gedrückt wird, um dieselben adäquat zu dichten, dann auch allen anderen Teile entlang des Umfangs des Deckel adäquat gedichtet sind. Der starre Dichtungsring 20 erlegt also die Beschränkung auf, dass der Umfang des Deckels in einer Ebene liegt.
Der Deckel 16 ist vorzugsweise eine kreisförmige Scheibe aus einem dünnen Gummifolienmaterial. Der starre Dichtungsring 20 aus nichtrostendem Stahl ist mit dem Rand 19 des Gummideckels 16 verbunden. Der Ring 20 kann einen rechteckigen, trapezförmigen, dreieckigen oder anderen vieleckigen Querschnitt aufweisen, so dass wenigstens eine flache Seite für die Verbindung mit dem Deckel 16 vorgesehen ist. Vorzugsweise weist der Ring 20 eine rechteckigen oder trapezförmigen Querschnitt auf. Auch ein „D"-förmiger Querschnit ist möglich. Außerdem muß der Ring nicht rund sein. Er kann rechteckig sein oder eine andere kontinuierliche Form aufweisen, solange der Deckel 16 eine dichte Verbindung mit der Oberfläche des Objektträgers herstellen kann. Der mit dem Stahlring 20 verbundene Rand 19 des Gummischeiben-Deckels 16 bildet auf diese Weise eine mit dem Rest der Scheibe kontinuierliche Dichtung. Dieses Beispiel erfordert, dass der dünne Gummideckel 16 undurchlässig für die Diffusion von Wasserdampf und gleichzeitig gegenüber den PCR-Reagenzien nicht feindlich ist. Silikonkautschuk ist zwar der PCR gegenüber nicht feindlich, ist jedoch für Wasserdampf zu durchlässig. Dementsprechend ist wie in 4 und 5 gezeigt entweder eine Sandwich-Schichtung oder ein Kompositmaterial aus einem nicht feindlichen Elastomer wie Silikonkautschuk und einem nicht durchlässigen Elastomer wie Polypropylen oder eine nicht feindliche Beschichtung 21 wie Paryien D von Union Carbide auf wenigstens einem Teil der Unterseite einer nicht durchlässigen Elastomerschicht als Material für den Deckel vorzuziehen.
Die erforderliche konkave Form des Deckels 16 kann entweder während des Gießens, durch das Verformen des flachen Deckels 16 während des Verbindens mit dem starren Ring 20 oder durch das Verbinden der Außenoberfläche des Deckels 16 mit einem am Ring 20 vorgesehenen Querstück (nicht gezeigt) erreicht werden, der das Zentrum der Scheibe leicht aus der Ebene des Rings 20 hält.
Der Deckel 16 wird durch einen starren Querträger 22 mit parallelen Schienen 24, die nur gegenüberliegende Teile des Dichtungsrings 20 berühren, gegen den Objektträger 14 gehalten. Die Schienen 24 des Querträgers 22 erstrecken sich von einer Kante zur anderen über den Objektträger. Der Deckel 16 kann also wie in 3 gezeigt an einer beliebigen Position auf dem Querträger 22 angeordnet werden. Weiterhin kann der Querträger 22 an einer beliebigen Position entlang der Länge des Objektträgers festgeklemmt werden. Deshalb kann der Deckel 16 an einer beliebigen Position innerhalb des freien Bereichs auf dem Objektträger angeordnet werden.
Die Schienen 24 des Querträgers 22 weisen vorzugsweise wie in 5 gezeigt einen L-förmigen Querschnitt auf, um die Starrheit zu verbessern. Die Schienen 24 werden über flache Enden 26 verbunden, die wie in 1, 3 und 4 gezeigt, mit Hilfe von zwei Klemmen 28 auf dem Objektträger 14 festgeklemmt werden. Diese Klemmen 28 erstrecken sich jeweils über die langen Kanten zur Rückseite 30 des Objektträgers 14, d. h. zu der Oberfläche gegenüber der die Probe 12 tragenden Oberfläche. Jedes Ende 26 des Querträgers 22 ist leicht gebogen, um eine geneigte Ebene zu bilden. Wenn die Klemmen 28 in Position geschoben werden, gleiten sie auf diesen Enden 26 mit den geneigten Ebenen und üben eine wesentliche Druckkraft auf den Querträger 22 und den Dichtungsring 20 aus, so dass der Randteil 19 des Deckels 16 gegen den Objektträger 14 gedrückt wird.
Obwohl die Klemmen 28 und der Querträger 22 aus einem relativ dünnen Material hergestellt werden können, etwa aus nichtrostendem Stahl, müssen sie ausreichend starr sein, so dass sie sich während des Anordnens lediglich geringfügig biegen. Die gespeicherte Energie für die Klemmkraft stammt vorzugsweise größtenteils aus dem Zusammendrücken der Gummidichtung (des Randes 19 des Deckels unter dem Dichtungsring 20) und nicht aus dem Biegen des Querträgers 22 oder der Klemmen 28. Die vorteilhafte Folge davon ist, dass die Schienen 24 des Querträgers 22 unabhängig davon, wo der Deckel 16 auf dem Objektträger positioniert ist, immer parallel zu dem Objektträger angeordnet sind, so dass der Rand 19 entlang seines gesamten Umfangs gleichmäßig mit derselben Kraft zusammengedrückt wird. Der Querträger 22 und die Klemmen 28, die den Deckel 16 auf dem Objektträger 14 festklemmen, sind ausreichend starr, um dem durch das Erwärmen des Reagens 13 auf beinahe Kochtempera tur erzeugten Druckanstieg standzuhalten. Die Flexibilität des Deckels reduziert erheblich den maximalen Druck, der unter dem Deckel auftreten kann. Außerdem wirkt der flexible Deckel 16 der Fluidexpansion während des Erwärmens entgegen, ohne dass der Objektträger 14 gebrochen wird, der das eingeschlossene Volumen effektiv unter Druck setzt. Dadurch kann eine Blasenbildung im Reagens 13 während der thermischen Wechselbehandlung verhindert oder wenigstens minimiert werden.
In 6 und 7 sind jeweils eine Draufsicht und eine Endansicht einer der Klemmen 28 vergrößert gezeigt. Die Klemme 28 ist ein Stück Metallblech aus nichtrostendem Stahl, das in eine „J"-Form gebogen ist, um eine lange Seite 32, eine kurze Seite 34 sowie eine verbindende senkrechte Seite 36 vorzusehen. Die Seite 32 kann ein Paar von Dellen 38 aufweisen, die zu der kurzen Seite 34 hin vorstehen. Diese Dellen sind derart zueinander beabstandet, dass sie die Innenkante des Endes 26 mit der geneigten Ebene des Querträgers 22 kontaktieren und über dieselbe schnappen, um die Klemme 28, den Querträger 22 und den Objektträger 14 wie in 1 und 4 gezeigt zusammenzuhalten. Alternativ dazu kann die Funktion der Dellen 38 durch einen erhobenen Grat oder einen anderen Sperrmechanismus zwischen den ineinandergreifenden Anordnungsteilen 18 erfüllt werden.
Ein alternatives Beispiel des Querträgers 22 ist in 8, 9 und 10 gezeigt. Der Querträger 22a ist im Wesentlichen ein gestanzter rechteckiger Metallblechkörper, der zwei parallele Schienen 24a bildet, die durch Querenden 26a verbunden werden. Die Schienen 24a des Querträgers 22a weisen, wie in 10 gezeigt, einen L-förmigen Querschnitt auf. Bei der Anordnung werden die Schienen 24a zusammen mit den flachen Enden 26a wie oben beschrieben auf dem Objektträger 14 festgeklemmt. Der grundsätzliche Unterschied zu dem ersten in 3 gezeigten Querträger besteht darin, dass die Enden 26a in einer doppelten Biegung 27a mit den Schienen 24a verbunden werden. Die doppelte Biegung 27a erlaubt es, dass das lange Bein der Klemme 28 unter Reibung mit der Oberfläche des Endes 26a verbunden wird. Die doppelte Biegung 27a erzeugt auch beinahe eine Stufe, so dass die Gesamtdicke der Anordnung des Objektträgers und des Deckels minimiert ist, wenn die Klemme 28 angebracht ist.
Eine Neigung von ungefähr 3° an den Enden 26a reicht aus, um die notwendige Greifkraft zwischen den Trägerenden 26a, dem Objektträger 14 und der Klemme 28 vorzu sehen und um einen ausreichenden Druck auf den starren Ring 20 auszuüben. Wenn der in den 8 bis 10 gezeigte alternative Träger verwendet wird, dann sind keine Dellen 38 auf den Klemmen 28 erforderlich.
Da der Deckel 16 nicht größer ist als erforderlich, ist das Volumen des Reagens nicht größer als erforderlich, so dass die zum Herstellen einer leckgeschützten Dichtung erforderliche Kraft minimiert ist. Alle diese Eigenschaften sind vorteilhaft. Es ist vorteilhaft, dass keine große Dichtkraft erforderlich ist, weil es das Anordnen einfacher macht. Außerdem würde ein zum starren Aushalten einer größeren Kraft erforderlicher Mechanismus die Anordnung unnötig dick und massiv machen. Dadurch würde wiederum die Anzahl der gleichzeitig in einer Zykluseinrichtung unterzubringenden Objektträger beschränkt werden, wenn diese Kante an Kante angeordnet werden. Weiterhin würde auch die thermische Zeitkonstante der Anordnung erhöht werden und dadurch der Zyklusprozeß verlangsamt werden.
Das Anordnen eines Objektträgers für die in-situ-PCR
Das Anordnen des vollständigen Haltesystems 10 auf einem Objektträger 14 mit einem unter einem Deckel 16 plazierten Reagens 13 wird durch eine einzigartige Prozedur bewerkstelligt, die auch Teil der vorliegenden Erfindung ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vorrichtung 40 für das manuelle Anordnen verwendet. Diese Vorrichtung 40 ist in 11 gezeigt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine mechanisch unterstützte Anordnungsvorrichtung bzw. ein mechanisch unterstütztes Anordnungswerkzeug verwendet. Ein derartiges Werkzeug ist in 12 gezeigt.
Die in 11 gezeigte Vorrichtung 40 für das manuelle Anordnen gemäß einer Ausführung der vorliegenden Erfindung besteht aus einem auf einer Grundplatte 45 befestigten Anordnungspfosten 42 und einer beweglich auf der Grundplatte 45 befestigten Objektträgerführung 44. Die Objektträgerführung 44 ist nach oben federvorgespannt, um sich vertikal um den Pfosten 42 zu bewegen. Die Oberseite des Pfostens 42 weist Vertiefungsbereiche 46 und 48 auf, die derart geformt sind, dass sie die Klemmen 28 und den Querträger 22 lose aufnehmen, um diese für das Anordnen auf dem Objektträger 14 in Position zu halten. Der Pfosten 42 weist auch einen zentralen Luftdurchgang 43 auf.
Die Objektträgerführung 44 ist ein U-förmiger Körper, der zwei im Wesentlichen flache Plattenteile 50 aufweist, die neben gegenüberliegenden Seiten des Pfosten 42 angeordnet sind. Diese Plattenteile 50 weisen einen Kanal auf, der zum Aufnehmen eines dem Standard entsprechenden Mikroskop-Objektträgers dimensioniert ist. Die zwei Plattenteile 50 sind durch ein einstückig damit ausgebildetes U-förmiges Joch 52 miteinander verbunden. Jeder Plattenteil 50 weist eine Muffe 54 auf, die an seiner Unterseite befestigt ist und über einen entsprechenden auf der Grundplatte 45 befestigten Stift 56 gleitet. Um die Stifte 56 sind Federn 58 befestigt, die die Führung nach oben zu einer Position vorspannen, in der der durch die Plattenteile 44 gehaltene Objektträger 14 über den Vertiefungsbereichen 46 und 48 in der Oberseite des Pfostens 42 positioniert ist.
Das Anordnen des Haltesystems 10 wird wie folgt vorgenommen. Zuerst werden zwei Klemmen 28 in die Vertiefungsbereiche 46 auf der Oberseite des Pfostens 42 mit ihren langen Seiten 32 nach unten gegen den Pfosten 42 gelegt. Dann werden sie derart positioniert, dass der Raum zwischen ihren gegenüberliegenden kurzen Seiten 34 gerade etwas breiter ist als die Breite eines Standard-Mikroskop-Objekträgers 1. Als nächstes wird der Querträger 22 auf den Anordnungspfosten zwischen die Vertiefungen 46 wie in 2 gezeigt mit den Schienenkanten nach oben und den Schienen 24 in den Vertiefungsbereichen 48 plaziert. Die Dimensionen der verschiedenen Teile sind derart, dass jeweils ein Teil der geneigten Ebenen der Enden 26 des Querträgers 22 auf der Oberseite der langen Seiten 32 der Klemmen 28 liegt. Auf diese Weise wird die anfängliche Verbindung der Klemmen 28 mit dem Querträger 22 hergestellt.
Alternativ dazu kann eine zuvor angeordnete Kombination aus dem Querträger 22 und den zwei Klemmen 28, die durch einen schwachen Klebstoff verbunden und in der richtig beabstandeten Anfangsbeziehung gehalten werden, vorgesehen werden, um den Aufwand bei der Vorbereitung der Anordnung 18 zu reduzieren. Wenn die Klemmen 28 aus einem magnetischen nichtrostenden Stahl hergestellt sind, können weiterhin im Anordnungspfosten eingebettete kleine Dauermagneten die Klemmen mit minimalem Aufwand automatisch richtig positionieren.
Als nächstes wird der Deckel 16 mit dem am Randteil 19 angebrachten Dichtungsring 20 auf und zwischen die Schienen 24 des Querträgers 22 plaziert, wobei die konkave Dichtungsseite des Deckels 16 nach oben angeordnet ist und der Dichtungsring 20 auf den Schienen 24 des Querträgers 22 ruht. Der Deckel 16 wird dann derart positioniert, dass er unter dem interessanten Bereich (mit der Probe) auf dem Objektträger 14 zentriert ist. Der Deckel ist derart dimensioniert, dass sein Rand 19 (d. h. die Dichtoberfläche) weiter über die Schienen des Querträgers 22 vorsteht als die Dichtung bei der Anordnung zusammengedrückt wird, so dass der Querträger 22 vorzugsweise auch nach dem Zusammendrücken des Randes 19 den Objektträger 14 aus Glas nicht tatsächlich berührt, wie in 4 und 5 gezeigt.
Ein Tröpfchen des Reagens 13 wird dann auf den Deckel 16 gegeben. Eine zum Ausgeben des gewünschten Reagensvolumens eingestellte Pipette wird vorzugsweise manuell verwendet, um das Reagens als Tröpfchen nahe dem Zentrum der konkaven Oberfläche auszugeben. Da die Oberfläche des Deckels nur zum Teil benetzbar ist, breitet sich das Tröpfchen nicht wesentlich aus. Es steht deutlich nach oben über den Rand 19 des Deckels 16 vor.
Der Objektträger 14 mit wenigstens einer zuvor auf demselben angebrachten Probe 12 wird dann auf die Objektträgerführung 44 der Anordnungsvorrichtung 40 mit der Probenseite nach unten direkt über dem Reagenströpfchen 13 plaziert. Die Objektträgerführung ist zu Beginn derart positioniert, dass der Boden des Objektträgers durch die Federn 58 immer wenigstens einige Millimeter über der Oberseite des Reagenströpfchens 13 gehalten wird. Der Objektträger 14 wird positioniert, indem er in seiner Längsrichtung verschoben wird, um den zu verarbeitenden Probenbereich über dem Tröpfchen auf dem Deckel 16 zu zentrieren. Dies kann vorgenommen werden, indem durch die Rückseite des (auf dem Kopf stehenden) Objektträgers 14 geblickt wird, was dadurch erleichtert werden kann, dass der interessante Bereich durch eine Markierung auf der Rückseite 30 des Objektträgers 14 angegeben wird.
Als nächstes legt der Benutzer einen Finger (im Handschuh) direkt über dem Anordnungspfosten 42 auf die Rückseite 30 des Objektträgers 14 und übt einen direkt nach unten gerichteten Druck aus, der ausreicht, um die nach oben drückende Kraft der Federn 58 zu überwinden und die Objektträgerführung 44 nach unten zu bewegen. Dadurch wird die Probenseite des Objektträgers 14 in Kontakt mit dem Reagenströpfchen 13 gebracht und wird das Tröpfchen 13 über den Objektträger 14 und die Deckeloberfläche innerhalb des Randes 19 verteilt. Das Volumen des Reagenströpfchens wird so gewählt, dass es etwas größer als das Volumen zwischen der konkaven Ober fläche des Deckels 16 und der Ebene seines Randes 19 (der Oberfläche des Objektträgers) ist. Deshalb erreicht das Tröpfchen 13 die Kante des Randes 19 und überschreitet dieselbe kurz bevor die Objektträgeroberfläche den Rand 19 kontaktiert. Dadurch wird alle oder beinahe alle Luft aus dem Raum unterhalb des Deckels 16 verdrängt, bevor der Objektträger 14 und der Deckelrand 19 eine Dichtung bilden. Es ist akzeptabel, dass ein kleines überschüssiges Volumen des Reagens über den Rand 19 des Deckels 16 gedrängt wird, da dieses während des weiteren Prozesses trocknet. Die nach unten auf den Objektträger 14 gerichtete Kraft beginnt nun den Rand 19 zusammenzudrücken.
Wenn der Rand 19 teilweise zusammengedrückt wurde, sollte die Rückseite 30 des Objektträgers 14 gerade bei oder gerade unterhalb der Bodenkante der kurzen Seite 34 jeder der Klemmen 28 sein. Zu diesem Zeitpunkt verwendet der Bediener die (durch einen Handschuh bedeckten) Daumen und Finger seiner anderen Hand, um die zwei Klemmen 28 zueinander über die Kanten des Objektträgers 14 und über die Enden 26 des Querträgers 22 zu schieben, bis die Klemmen 28 mit ihren vertikalen Verbindungsseiten 36 gegen die Kanten des Objektträgers 14 stoßen. Durch diese Tätigkeit wird der Rand 19 des Deckels weiter zusammengedrückt. Wegen der kleinen Rasteinrichtungen 38, die in die Enden 26 des Querträgers 22 greifen, und/oder weil die Tangente des Winkels der geneigten Ebenen der Querträgerenden 26 kleiner ist als der Reibungsfaktor zwischen der Klemme 28 und dem Querträgerende 26, bleibt die Klemme 28 in dieser Position, bis sie absichtlich wieder entfernt wird.
Bei dem angeordneten System 10 ist das zwischen dem Objektträger 14 und dem Deckel 16 eingeschlossene Volumen vollständig mit der nicht komprimierbaren Reagensflüssigkeit 13 gefüllt. Wenn also der Randteil 19 des Deckels 16 vollständig zusammengedrückt wird, ist der Deckel selbst vorzugsweise flexibel, so dass er sich dem festen Reagensvolumen ohne einen wesentlichen Druckanstieg anpassen kann, der die Anordnung schwierig machen würde. Ein anderer Grund dafür, dass der Deckel flexibel sein sollte, besteht darin, dass das Reagens 13 auf eine Temperatur erwärmt wird, die sich dem Kochpunkt annähert oder denselben überschreitet, und dabei expandiert, so dass der Dampfdruck steigt und im Reagens gelöste Gase aus der Lösung austreten. Wenn der Deckel überhaupt nicht flexibel wäre, könnte der Druck in seinem Inneren so hoch steigen, dass er den Objektträger oder den Deckel brechen und einen Verlust des Reagens verursachen könnte. Bereits eine geringe Flexibilität reicht aus, um sich dem Volumen von sich bildenden Gasblasen anzupassen und einen zu hohen Druckanstieg zu verhindern. Der Druck steigt dabei allgemein nur etwas mehr als der Reagens-Dampfüberdruck gegenüber dem externen Atmosphärendruck. Dadurch wird sichergestellt, dass das System auch bei hohen absoluten Höhen gut arbeitet, bei denen der Kochpunkt des freien Reagens niedriger ist als die PCR-Denaturierungstemperatur.
Eine mechanisch unterstützte Vorrichtung bzw. ein mechanisch unterstütztes Werkzeug 80 für das Anordnen gemäß einer Ausführung der vorliegenden Erfindung ist in 12 gezeigt. Dieses Werkzeug ist dem in 11 gezeigten Werkzeug ähnlich, wobei jedoch die Handhabung der Anordnung mit den Fingern praktisch überflüssig gemacht wurde. Das Werkzeug 80 ist vorzuziehen, insbesondere wenn physikalisch heiße Starts (weiter unten ausführlich beschrieben) vorgenommen werden. Das in 12 gezeigte Werkzeug 80 weist wie in 11 eine Grundplatte 45 und einen auf derselben befestigen Pfosten 42 auf und verwendet eine Objektträgerführung 82, die der in 11 gezeigten Führung 44 ähnlich ist. Außerdem weist das Werkzeug 80 einen Kompressionsarm 84 und einen Klemmeninstallationsmechanismus 86 auf, so dass der Benutzer während des Anordnens keine physikalisch heißen Komponenten der Halteanordnung 18 berühren muß.
Die Objektträgerführung 82 weist ein Paar von beabstandeten flachen Plattenteilen 88 auf, die für das Aufnehmen eines Objektträgers 14 dimensioniert sind. Die Plattenteile werden durch ein einstückig damit ausgebildetes U-förmiges Joch 90 miteinander verbunden, das sich um einen horizontalen Drehzapfen 92 dreht. Der Drehzapfen 92 wird horizontal über der Grundplatte 45 durch zwei fixierte Stützen 94 ungefähr auf der Höhe der Oberseite des Pfostens 42 gehalten.
Ein Ende des Kompressionsarms 84 wird ebenfalls schwenkbar innerhalb des Jochs 90 auf dem Zapfen 92 gehalten. Der Arm 84 ist ein flaches und längliches Glied mit einer im Wesentlichen rechteckigen Öffnung 96, die über der Oberseite des Pfostens 42 angeordnet ist, der den Querträger 22 und die Klemmen 28 aufnimmt und hält. Die Öffnung 42 erlaubt das Betrachten des Deckelglieds 16, des Querträgers 22 und der Probe 12 auf dem Objektträger 14, wenn der Arm über dem Pfosten 42 auf den Objektträger 14 gesenkt wird. Ein die Öffnung 96 umgebendes Polsterkissen 98 aus Gummi wird verwendet, um das Brechen des Objektträgers 14 zu verhindern, wenn der Arm 94 gegen denselben gedrückt wird. Der Arm ist vorzugsweise nach oben federvorgespannt, um ihn aus dem Weg zu halten, bis er benötigt wird. Die Objektträgerführung 82 ist entsprechend nach oben federvorgespannt, um den Objektträger 14 über dem Querträger 22, den Klemmen 28, dem Deckelglied 16 und dem Reagenströpfchen 13 zu halten, bis der Arm 94 für die Endinstallation der Halteanordnung 18 auf den Objektträger 14 gesenkt wird. Der Arm 84 und die Objektträgerführung 82 können herkömmliche Federn (nicht gezeigt) umfassen, die auf dem Zapfen 90 befestigt sind oder sich von der Grundplatte 45 erstrecken, um die gewünschte nach oben gerichtete Vorspannung vorzusehen.
Der Klemmeninstallationsmechanismus 86 ist vorzugsweise eine federbelastete Zange 100, die auf dem Posten 42 befestigt ist und zwei gegenüberliegende Finger 102, die sich zu einem Vertiefungsbereich 46 biegen, um jeweils eine Klemme 28 an der Kante des auf der Führung 82 befestigten Objektträgers 14 zu positionieren, sowie einstückig damit ausgebildete gegenüberliegende Griffteile 104 umfasst. Die gegenüberliegenden Griffteile 104 der Zange 100 werden manuell zusammengedrückt, um die Klemmen 28 auf die Seiten des Objektträgers, über die Kanten des Objektträgers und die Enden 26 des Querträgers 22 zum Abschließen der Anordnung des Haltesystems 10 zu schieben. Die Zangenarme 100 sind schwenkbar auf einem stationären Schwenkzapfen 106 befestigt, der direkt unter dem Kontakt zwischen den Fingern 102 und den Klemmen 28 von den Seiten des Pfostens 42 vorsteht.
Der Klemmeninstallationsmechanismus 84 ist separat in der perspektivischen Ansicht von 13 gezeigt. Jeder L-förmige Finger 102 weist ein kurzes Bein auf, das in einen der Vertiefungsbereiche 46 an der Oberseite des Pfostens 42 passt. Jeder flache Griffteil 104 fügt sich um zwei benachbarte Seiten des Pfostens 42. Zwischen den Griffteilen 104 und dem Posten 42 (nicht gezeigt) positionierte Federn (nicht gezeigt) spannen die Griffteile 104 und damit die Fingerteile 102 der Zange 100 nach außen vor, um das Einsetzen der Halteklemmen 28 in die Vertiefungen 46 zu gestatten. Wenn die gegenüberliegenden Griffteile 104 zusammengedrückt werden, bewegen sich die Spitzen 102 zueinander und schieben die Klemmen 28 auf den Objektträger.
Das Werkzeug 80 wird wie folgt betätigt. Zwei Klemmen 28 werden wie zuvor beschrieben in den Vertiefungen 46 eingesetzt. Der Querträger 22, der Dichtungsring 20, der Deckel 16 und das Reagens 13 werden nacheinander auf dem Pfosten plaziert, wobei dann ein Objektträger 14 mit einer darauf angebrachten Probe 12 auf den Plattenteil 88 der Führung 82 mit der Probenseite nach unten gelegt wird und die Probe vertikal über dem Reagens 13 im Deckel 16 positioniert wird. Der Kompressionsarm 84 wird dann nach unten gegen den Objektträger geschwenkt, um den Objektträger 14 auf den Deckel zu senken und um das Reagens und das Enzym über die Probe auf dem Objektträger 14 zu verteilen. Wenn der Arm 94 vollständig gesenkt ist, wird die Zange 100 zusammengedrückt, werden die Finger 102 zueinander bewegt und werden die Halteklemmen 28 auf den Objektträger 14 und über die Trägerenden 26 geschoben. Die vollständige Objektträgeranordnung 10 wird dann aus dem Werkzeug 80 genommen und wie weiter oben beschrieben thermisch wechselbehandelt.
Anwendungen mit heißem Start
Um mit der vorliegenden Erfindung heiße Starts zu implementieren, ist es lediglich erforderlich, ein Heizsystem zu der manuellen Anordnungsvorrichtung 40 oder zu dem mechanisch unterstützen Werkzeug 80 hinzuzufügen, wobei erwärmte Behälter zum Halten der Systemkomponenten verwendet werden. Außerdem können wie weiter oben genannt einige der Komponenten des Objektträger-Haltesystems vorübergehend miteinander verbunden und erwärmt werden, bevor sie in die Vorrichtung gegeben und mit den restlichen Komponenten des Haltesystems verbunden werden.
Die folgende Beschreibung bezieht sich auf die in 11 gezeigte manuelle Anordnungsvorrichtung 40 und entsprechend auf das in 12 gezeigte mechanisch unterstütze Werkzeug 80. Der Anordnungspfosten 42 ist mit einer vertikalen Bohrung bzw. einem Luftdurchlaß 43 durch denselben ausgebildet, der am Boden mit der Umgebungsluft kommuniziert. Eine interne, durch einen Thermostaten gesteuerte Heizeinrichtung hält den Körper des Pfostens 42 nach dem Einschalten auf ungefähr 75°C, was wärmer als die Heißstarttemperatur von ungefähr 70°C ist. Diese Heizeinrichtung kann eine Widerstandsspule sein, die um die zentrale Bohrung 43 gewickelt oder einfach in der Grundplatte 45 oder im Pfosten 42 eingebettet ist. In der Bohrung 43 können Lamellen vorgesehen sein, um beim Erwärmen der durch den Luftdurchgang aufsteigenden Luft hilfreich zu sein. Durch Konvektion wird wie in einem Kamin eine aufsteigende Säule von Heißluft aufrechterhalten, die den Querträger 22 und den Deckel 16 umströmt, die vor der Endanordnung auf der Oberseite des Pfostens 42 ange bracht sind. Der Querbalken 22 und die Klemmen 28 werden ebenfalls durch den Kontakt mit dem Anordnungspfosten 42 aus Metall erwärmt.
Die zu verarbeitenden Objekttträger werden in einem erwärmten Träger aufbewahrt, der sie auf ungefähr 75°C hält. Die Klemmen 28, der Deckel 16 und der Querträger 22 können in kleinen erwärmten Behältern am Arbeitsplatz aufbewahrt und mit Pinzetten gehandhabt werden. Die zum Anbringen von zwei vorgewärmten Klemmen, einem Querträger und einem Deckel auf dem erwärmten Anordnungspfosten 42 erforderliche Zeitdauer beträgt typischerweise 10 bis 15 Sekunden. Die zum Übertragen des vorgewärmten Reagens 13 unter Verwendung einer vorgewärmten positiven Übertragungs-Pipettenspitze erforderliche Zeitdauer beträgt weniger als 10 Sekunden. Das erwärmte Reagens 13 wird nicht länger als weitere 10 Sekunden der Umgebung ausgesetzt, bevor der vorgewärmte Objektträger dichtend nach unten geschoben wird und die Komponenten der Halteanordnung 18 fest miteinander verbunden werden. Wenige Sekunden später kann die Objektträgeranordnung zurück in den erwärmten Träger gegeben werden, wobei sie sich nicht auf unter 70°C abgekühlt hat. Die durch Verdampfung verursachte Konzentration des Reagens sollte also minimal sein, da die Zeitdauer der Aussetzung an die Umgebungsbedingungen zu kurz ist.
Eine wirklicher physikalisch heißer Start kann erreicht werden, indem einfach das Anordnungswerkzeug erwärmt wird und die Objektträger, die Halteteile, das Reagens und die Pipettenspitze am Arbeitsplatz in erwärmten Trägern aufbewahrt werden. Es sind keine weiteren Änderungen der Prozedur erforderlich. Die Prozedur wird durch die Verwendung des in 12 gezeigten Anordnungswerkzeugs vereinfacht, da hier das Aufbewahren der erwärmten Komponenten und der Kontakt mit den erwärmten Komponenten und der Führung 82 überflüssig gemacht wird. Es können auch zuvor verbundene Anordnungen von Klemmen 28 und Querträgern 22 für Heißstarts verwendet werden, wenn die Komponenten durch einen Klebstoff miteinander verbunden werden, der bei Umgebungstemperaturen hart ist, um die Verpackung und den Transport zu erleichtern, der aber bei heißen Starttemperaturen weich ist, um die Endanordnung zu erleichtern.

Claims

Vorrichtung (80) zum Montieren eines Proben-und-Reagenzfluid-Aufnahmesystems für in-situ-PCR an einem Objektglas (14), wobei das Aufnahmesystem ein Abdeckelement (16) und eine Halteanordnung (20, 22, 28) umfasst und die Vorrichtung umfasst: einen Untersatz (45); eine Tragestütze (42), die auf dem Untersatz angebracht ist, wobei die Tragestütze eine im Allgemeinen horizontale obere Fläche aufweist, die Bauteile der Halteanordnung und das Objektglas in einer vorgegebenen beabstandeten Beziehung aufnimmt und trägt; eine vertikal bewegliche Objektglasführung (82), die zwei im Allgemeinen plane Ablageabschnitte zum Aufnehmen des Objektglases (14) aufweist, wobei die Objektglasführung (82) um einen horizontalen Schwenkbolzen (92) herum schwenkbar gelagert ist und durch eine Vielzahl von Federn nach oben gespannt wird; einen länglichen Drückarm (84), der von dem Untersatz beweglich an einer Position getragen wird, die von der Stütze beabstandet ist, wobei der Arm in Funktion das Objektglas und die Halteanordnung in engem Kontakt zusammendrückt; und einen Halteanordnungs-Installationsmechanismus (86), der so positioniert ist, dass er die Halteanordnung an dem Objektglas (14) installiert, während der Drückarm (84) das Objektglas (14) und die Halteanordnung zusammendrückt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Mechanismus paarige Zangenteile (100) umfasst, die Fingerabschnitte (102), die an einander gegenüberliegende Kanten der horizontalen Oberseite der Trageplattform (42) angrenzend positioniert sind, und bewegliche Abschnitte aufweisen, die in Funktion die Fingerabschnitte aufeinander zu bewegen.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei jedes der Zangenteile einen Griffabschnitt (104) aufweist, der mit einem der Fingerabschnitte (102) gekoppelt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die des Weiteren eine Erwärmungseinrichtung umfasst, die funktionell mit der Vorrichtung verbunden ist, um Bauteile der Halteanordnung und das Objektglas zu erwärmen.
Vorrichtung (40) zum Montieren eines Proben-und-Reagenzfluid-Aufnahmesystems für in-situ-PCR an einem Objektglas (14), wobei das Aufnahmesystem ein Abdeckelement (16) und eine Halteanordnung (20, 22, 28) umfasst und die Vorrichtung umfasst: einen Untersatz (45); eine Tragestütze (42), die an dem Untersatz angebracht ist, wobei die Tragestütze eine im Allgemeinen horizontale obere Fläche aufweist, die Bauteile der Halteanordnung und das Objektglas in einer vorgegebenen beabstandeten Beziehung aufnimmt und trägt; und eine vertikal bewegliche Objektglasführung (44), die zwei im Allgemeinen plane Ablageabschnitte zum Aufnehmen des Objektglases (14) aufweist, wobei die Objektglasführung (44) verschiebbar von einer Vielzahl von Bolzen (56) getragen wird und durch eine Vielzahl von Federn (58) nach oben gespannt wird.