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Die
vorliegende Erfindung betrifft Gegenstände (im Folgenden „Gegenstände mit
Blutkontakt" genannt),
welche bei Verwendung mit Blut oder Blutprodukten in Berührung kommen,
und insbesondere solche Gegenstände
mit einer polymeren Angriffsfläche
(Angriffsfläche).
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Seit über vierzig
Jahren sind eine Reihe von medizintechnischen Geräten, die
mit dem Blut oder Blutprodukten von lebenden Menschen oder Tieren
in Kontakt kommen, entwickelt, hergestellt und klinisch eingesetzt
worden. Beispiele solcher Gegenstände sind Schrittmacher, Arterienimplantate,
Herzklappen, künstliche Herzen,
Herzpumpen, Hüftprothesen,
Herz-Lungen-Maschinen, Katheter und Ausrüstung für die Nierendialyse.
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Ein
Hauptproblem bei solchen Gegenständen
ist, dass ihre Angriffsflächen
(Oberflächen
mit Blutkontakt, das heißt
Oberflächen,
die mit Blut oder Blutprodukten wie beispielsweise Serum, Plasma
und anderen aus Blut gewonnenen Flüssigkeiten und Feststoffen
in Kontakt kommen) Blut und Blutprodukten fremd sind und dazu neigen,
unter anderem die Zerstörung
roter Blutkörperchen
und die Blutkoagulation bis zur Bildung von Blutgerinnseln (Thrombogenese)
einzuleiten.
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Normales
intaktes Endothel ist nicht thrombogen, was teilweise auf die Synthese
von Heparansulfat zurückzuführen ist.
Heparansulfat neigt dazu, an der Oberfläche von Endothelzellen gebunden
zu bleiben, wobei die Deaktivierung von Thrombin, dem für die Polymerisation
von Fibrinogen zu Fibrin bei der Bildung von Blutgerinnseln verantwortlichen
Enzym, durch Antithrombin III (ATIII) beschleunigt wird. Heparansulfat
ist ein sehr starkes Antikoagulanz in den natürlichen Blutgefäßen. Folglich
ist es für Ärzte und
die Pharmaindustrie von großem
Interesse gewesen, mit Blut in Kontakt kommende polymere Oberflächen zu
entwickeln, die Charakteristika von Heparansulfat besitzen, insbesondere
durch das Beschichten von Oberflächen
mit Heparin. Beispielsweise werden in US-A-3826678 (Hoffman et al.) biologisch
aktive Moleküle
chemisch an Polymere und Copolymere, die zuvor auf polymere Trägermaterialien
wie Polyurethan und Polyethylen durch Strahlung gepfropft wurden,
gebunden. Das Pfropfpolymer ist vorzugsweise ein hydrophiles Hydrogel
(zum Beispiel ein Hydroxyethylmethacrylat-(HEMA)Polymer) und kann
an das Hydrogel gebundenes Heparin beinhalten.
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Ein
weiteres Hauptproblem bei solchen Gegenständen ist ihre Anfälligkeit
für Post-Implantations-Infektionen.
Staph. epidermis, die auf der menschlichen Haut leben, und Staph.
aureus, die manchmal in Krankenhausumgebungen zu finden sind, sind
die beiden häufigsten
pathogenen Erreger, denen man beim Implantieren und in ähnlichen
Situationen ausgesetzt ist. Sie haben beide die Fähigkeit,
durch die Operationsöffnung
in den Körper
einzudringen und das Implantat anzugreifen. Dieses Problem ist beispielsweise
in US-A-4442133 (Greco et al.) angesprochen worden, in dem ein PTFE-
oder Dracon-Implantat mit in Ethanol gelöstem TDMAC (Tridodecylmethylammoniumchlorid)
getränkt
wird. Das TDMAC wird adsorbiert, so dass es eine Beschichtung bildet,
und wird dann mit einer Lösung
eines Antibiotikums, zum Beispiel Penicillin oder Cefoxitin, inkubiert.
Auch wird beispielsweise in US-A-4612337 (Fox, Jr., et al.) ein
polymeres Material wie PTFE in Lösungen
von Antibiotika in einem organischen Lösungsmittel getränkt, dann
in einem organischen Lösungsmittel
mit einem Metallsalz getränkt
und anschließend
wieder mit der Lösung
aus Antibiotikum und organischem Lösungsmittel getränkt.
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Es
besteht daher ein offensichtlicher Bedarf an neuen und verbesserten
thromboresistenten und infektionsresistenten Gegenständen.
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Es
wurde nunmehr herausgefunden, dass Gegenstände, die bei Verwendung mit
Blut oder Blutprodukten in Berührung
kommen, in dieser Hinsicht verbesserte Eigenschaften aufweisen,
wenn sie eine Angriffsfläche
aufweisen, die eine polymere Oberfläche mit einem speziellen, darauf
gepfropften Vinyl-Pfropfpolymer, an
das ein Biowirkstoff gekoppelt ist, umfasst.
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Demnach
ist ein Aspekt der Erfindung die Bereitstellung eines Gegenstandes
zur Verwendung im Kontakt mit Blut oder Blutprodukten, wobei dieser
Gegenstand wenigstens eine exponierte Oberfläche aufweist, die von einem
polymeren Substrat ausgebildet ist, woran ein von einem hydrophilen
Vinylmonomer abgeleitetes Pfropfpolymer kovalent gepfropft ist,
und wobei an das Pfropfpolymer ein Biowirkstoff gekoppelt ist, dadurch
gekennzeichnet, dass das Pfropfpolymer gebundene Gruppen mit ionischer
Ladung umfasst und das bioaktive Agens eine ionische Ladung mit
einer zu den gebundenen Gruppen des Pfropfpolymers entgegengesetzten
Polarität,
so dass das bioaktive Agens auf dem Pfropfpolymer durch ionische
Wechselwirkung gebunden ist. Vorzugsweise ist das Pfropfpolymer
ein Polymer oder Copolymer eines unter Acrylsäure (AA), Acrylamid (AAm),
N-(3-Aminopropyl)methacrylamid (APMA), 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS)
und Salzen davon ausgewählten
Vinylmonomers.
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In
den erfindungsgemäßen Gegenständen ist
der Biowirkstoff ionisch an das Pfropfpolymer gekoppelt und kann
ein antibiotischer oder antimikrobieller Wirkstoff, beispielsweise
Silber oder Gentamycin, oder ein anderer konventioneller Infektionen
bekämpfender
Wirkstoff, oder ein Antikoagulanz oder ein anderer Thrombogenese
bekämpfender
Biowirkstoff sein. Die polymere Substrat-Oberfläche des Gegenstandes, auf die
das Pfropfpolymer gepfropft ist, ist geeigneterweise ein Polyurethan,
wie beispielsweise ein Polyetherurethan. Die Vorteile, die solch
ein Gegenstand bietet, schließen
Eigenschaften von sowohl hydrophilen Beschichtungen als auch Biowirkstoffen
ein. Beispielsweise sind antimikrobielle Wirkstoffe in der Lage,
Post-Implantations-Infektionen zu bekämpfen, während hydrophile Beschichtungen
wie beispielsweise eine AMPS-haltige
Beschichtung Thrombose reduzieren können und glatte Oberflächen bereitstellen.
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In
dem erfindungsgemäßen Gegenstand
mit Blutkontakt umfasst das Pfropfpolymer Seitengruppen mit ionischer
Ladung, und der Biowirkstoff ist ionisch dadurch daran gekoppelt,
dass er eine ionische Ladung entgegengesetzter Polarität zu der
der Seitengruppen des Pfropfpolymers hat. Beispielsweise kann das Pfropfpolymer
AMPS oder APMA sein, und der Biowirkstoff kann Gentamycin oder basischer
Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) sein. Der Biowirkstoff ist auf
diese Weise durch ionische Anziehungskräfte an den Gegenstand gekoppelt
und wird auf diesem festgehalten.
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In
dem erfindungsgemäßen Gegenstand
mit Blutkontakt kann ein Albuminbindender Farbstoff wie beispielsweise
Blaudextran als Biowirkstoff eingesetzt werden und kann ionisch
an das Pfropfpolymer, zum Beispiel an ein APMA/AAm-Copolymer, gebunden
werden. Die Oberfläche
zieht dann Albumin aus dem mit der Oberfläche des Gegenstandes in Kontakt
stehenden Blut an.
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In
dem erfindungsgemäßen Gegenstand
mit Blutkontakt kann das Pfropfpolymer benutzt werden, um eine Einstellung
der Hydrophilie und das Koppeln des Biowirkstoffes durch geeignete
Auswahl der Monomere für
das Pfropfpolymer aus AAm, AA, AMPS, HEMA und APMA in den vorgegebenen
Mengenverhältnissen
zu gewährleisten.
Beispielsweise kann ein Copolymer aus APMA und AAm auf eine Polyurethan-Oberfläche gepfropft
werden, und Heparin kann an das Pfropfpolymer gekoppelt werden.
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Die
Erfindung ermöglicht
das gleichzeitige Lösen
einer Reihe von Problemen, mit denen man bei implantierbaren Gegenständen konfrontiert
wird. Die Erfindung bezieht Eigenschaften von hydrophilen Beschichtungen
und Biowirkstoffen, beispielsweise antimikrobiellen Wirkstoffen,
die in der Lage sind, sowohl Post-Implantations-Infektionen als
auch Thrombose zu bekämpfen,
solange sie glatte Oberflächen
bereitstellen, ein. Andere Biowirkstoffe werden ebenfalls in Betracht
gezogen.
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So
wird die Erfindung dem Bedürfnis
nach neuen und verbesserten thromboresistenten/infektionsresistenten
Gegenständen
mit Blutkontakt gerecht, zum Beispiel durch Bereitstellen dieser
Gegenstände
mit antimikrobiellen Wirkstoffen, was eine bakterizide Wirksamkeit
dieses Polymers zur Folge haben kann, oder mit antikoagulierenden
Wirkstoffen, um ihm Thromboresistenz zu verleihen.
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Wie
oben jedoch angedeutet, ist es manchmal ebenfalls wünschenswert,
Biowirkstoffe, die von antimikrobiellen und antikoagulierenden Wirkstoffen
verschieden sind, in diesen Gegenständen mit einzubeziehen.
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Das
Substrat einer Angriffsfläche
eines für
den Kontakt mit Blut oder Blutprodukten vorgesehenen Gegenstandes
umfasst im Allgemeinen ein biologisch inertes polymeres Material.
Ein hydrophiles Pfropfpolymer mit einer durch anionische oder kationische
Seitengruppen darauf verursachten Nettoladung ist permanent kovalent
durch Pfropfpolymerisation an das polymere Substrat gebunden. Diese
Pfropfpolymere können
so ausgewählt
werden, dass man thromboresistente Gleitbeschichtungen erhält, die
sich für
ionisches Koppeln (sofern sie so ausgewählt werden, dass eine entsprechende
Ladung verschieden von der des Biowirkstoffes zur Verfügung steht)
mit verschiedenen ionischen Biowirkstoffen eignen. Ionisches Koppeln
des Biowirkstoffes an das Pfropfpolymer kann man durch einfaches
Eintauchen des oberflächengepfropften
Polymers in eine Lösung
des gewünschten
Biowirkstoffes erzielen.
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Die
verschiedenen, von dieser Erfindung umfassten Gegenstände können beispielsweise
polymere Substrate mit fester Phase haben, die aus der unten in
Tabelle 1 gezeigten Gruppe von Materialien ausgewählt sind.
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Tabelle 1
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- Polyamide
- Polycarbonate
- Polyether
- Polyester
- Polyolefine
- Polystyrol
- Polyurethan
- Polyvinylchloride
- Silikone
- Polyethylene
- Polypropylene
- Polyisoprene
- Polytetrafluorethylene
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Derzeit
nimmt man an, dass Polyurethan das bevorzugte polymere Substrat
für die
vorliegende Erfindung ist.
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Das
geeigneterweise verwendete Pfropfpolymer geht von einem pfropfenden,
hydrophilen Monomer aus. Solche Monomere bilden eine hydrophile
Polymerbeschichtung auf der Substratoberfläche. Eine hydrophile Beschichtung
minimiert Protein-Wechselwirkungen und stattet zudem die Oberfläche mit
Gleiteigenschaften aus. Das Monomer muss mindestens eine Vinyl-Gruppe
umfassen. Die Vinyl-Gruppe ist für
das Eintreten der radikalischen Polymerisation notwendig. Das Monomer
kann neutral, anionisch oder kationisch sein. Nach dem Pfropfen
(und gegebenenfalls notwendigen chemischen Modifikationen) sollte
das erhaltene Pfropfpolymer eine positive Nettoladung oder eine
negative Nettoladung aufweisen. Die Ladung erlaubt die ionische Bindung
entgegengesetzt geladener bioaktiver Moleküle. Neutrale Monomere können nach
dem Pfropfen chemisch modifiziert werden, um anionische oder kationische
Oberflächen hervorzubringen.
Beispielsweise kann gepfropftes Acrylamid zu Acrylsäure hydrolisiert
werden, so dass sich eine anionische Oberfläche bildet.
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Insbesondere
wurden eine Anzahl von gepfropften Gleitbeschichtungen erfindungsgemäß eingesetzt. Am
meisten bevorzugt sind diejenigen, die aus auf die Substratoberflächen mittels
Kettenstart durch Cer-Ionen gepfropften Monomeren bestehen. Sowohl
Monomere mit kationischen als auch Monomere mit anionischen Gruppen
wurden gepfropft. Ein Beispiel für
Erstere sind N-(3-Aminopropyl-)methacrylat (APMA) und dessen Copolymere,
während
ein wichtiges Beispiel für
Letztere 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS) ist.
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Diese
geladenen Oberflächen
eignen sich für
das ionische Koppeln geladener Biowirkstoffe. Das ionische Koppeln
der Biowirkstoffe bietet den Vorteil, dass diese Wirkstoffe unter
geeigneten Bedingungen nur langsam freigesetzt werden. Beispiele
antimikrobieller Biowirkstoffe sind Gentamycinsulfat und Silber-Ionen. Allgemein
können
unter den in Tabelle 2 gezeigten Typen ausgewählte Biowirkstoffe erfindungsgemäß für ionisches
Koppeln eingesetzt werden.
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Tabelle 2
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- Antibakterielle Wirkstoffe oder antimikrobielle Wirkstoffe
- Antikoagulantien
- Enzyme
- Katalysatoren
- Hormone
- Wachstumsfaktoren
- Lecithin-Wikrkstoffe
- Vitamine
- Antikörper
- Antigene
- Nukleinsäuren
- Farbstoffe, die als biologische Liganden fungieren
- DNA- und RNA-Segmente
- Proteine
- Peptide
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So
aus einem weiteren Blickwinkel betrachtet, stellt die Erfindung
ein Verfahren zur Bereitstellung eines implantierbaren Gegenstandes
mit einer bioaktiven Oberfläche
zur Verfügung,
wobei dieser Prozess die folgenden Schritte umfasst:
Pfropfpolymerisation
eines hydrophilen Vinylmonomers mit Seitengruppen, die gegebenenfalls
eine ionische Ladung tragen, auf einer exponierten Polymeroberfläche dieses
Gegenstandes,
gegebenenfalls chemisches Modifizieren der Oberfläche des
resultierenden Pfropfpolymers, um eine ionisch geladene oder ionisierbare
Oberfläche
zu erhalten, und
ionisches Koppeln eines Biowirkstoffes an
die Oberfläche
dieses Pfropfpolymers.
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Gemäßeiner bevorzugten
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird ein implantierbarer Gegenstand mit einer bioaktiven Oberfläche bereitgestellt,
in dem man:
einen implantierbaren, eine exponierte Polymeroberfläche aufweisenden
Gegenstand mit einer wässerigen Lösung von
Ce(IV)-Ionen und einem Vinylmonomer in Kontakt bringt, wobei man
eine Pfropfpolymer-Oberfläche
auf dieser polymeren Oberfläche
erzeugt, und einen Biowirkstoff an diese Pfropfpolymer-Oberfläche anbindet.
Die wässerige
Monomer-Lösung
kann ein oder mehrere Vinylmonomere enthalten, und der implantierbare
Gegenstand kann nacheinander mit verschiedenen Lösungen in Kontakt gebracht
werden, wodurch geschichtete oder copolymere Propfpolymer-Oberflächen gebildet
werden, falls dies so gewünscht
ist.
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Daher
umfasst eine Ausführungsform
des Verfahrens folgende Schritte:
- a) Zubereiten
einer wässerigen
Lösung
aus AMPS und Ce(IV)-Ionen;
- b) In Kontakt bringen einer polymeren Oberfläche eines implantierbaren Gegenstandes
mit dieser wässerigen
Lösung
für eine
Zeitdauer, die ausreicht, um ein an die Oberfläche gepfropftes Polymer von
AMPS zu erhalten; und
- c) Binden eines Biowirkstoffes an die gepfropfte Oberfläche.
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Bei
dieser Ausführungsform
findet die Bindung des Biowirkstoffes beispielsweise durch ionische
Bindung statt, zum Beispiel einer kationischen antimikrobiellen
Verbindung wie Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Silber-Ionen, Chlorhexidin,
Vancomycin, Streptomycin oder Erythromycin, oder eines Wirkstoffes
wie ein basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, oder eines kationischen
Farbstoffes wie Toluidin-Blau.
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Eine
weitere Ausführungsform
des Verfahrens umfasst folgende Schritte:
- (a)
Zubereiten einer wässerigen
Lösung
aus AAm, APMA und Ce(IV)-Ionen;
- (b) In Kontakt bringen einer polymeren Oberfläche eines
implantierbaren Gegenstandes mit dieser wässerigen Lösung für eine effektive Zeitdauer,
um ein an die Oberfläche
gepfropftes Polymer des AAm und APMA zu erhalten; und
- (c) Binden eines Biowirkstoffes an die gepfropfte Oberfläche.
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Bei
dieser Ausführungsform
findet die Bindung des Biowirkstoffes auch beispielsweise durch
ionische Bindung statt, zum Beispiel einer anionischen antimikrobiellen
Verbindung wie Ampicillin, Oxacillin, Cefazolin, Bacitracin, Cephalosporin,
Cephalothin, Cefuroxin, Cefoxitin, Norfloxacin, Perfloxacin oder
Sulfadiazin, oder eines anionischen Farbstoffes wie Ponceau S.
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Während der
Initiierung durch Cer-Ionen (Ce(IV)), die derzeit bevorzugteste
Technik ist, die zum Pfropfen von Monomeren auf Oberflächen eingesetzt
wird, sind andere Pfropftechniken ebenfalls bekannt und können in
geeigneten Situationen angewendet werden. Beispielsweise sind Corona-Entladung,
UV-Bestrahlung und
ionisierende Strahlung (60Co, Röntgenstrahlung,
Hochenergieelektronenstrahlung, Plasma-Gasentladung) bekannt. Diese
Techniken sind Beispiele dafür,
wie man freie Radikale auf einer Angriffsfläche eines polymeren Substrats
erzeugt. Die darauf erzeugten freien Radikale initiieren die Pfropfung
der Vinylmonomere (CH2=CH-R).
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Das
ionische Koppeln eines Biowirkstoffes wird einfach durch Eintauchen
des oberflächengepfropften Polymers
in eine Lösung
des gewünschten
Biowirkstoffes erreicht. Beispielsweise wurden im Fall der antimikrobiellen
Wirkstoffe bakterizide Prüfungen
(Hemmhofmethode) auf AMPS/AgNO3- und AMPS/Gentamycin-Sulfat-Oberflächen durchgeführt. Signifikante
antibakterielle Wirksamkeit wurde erreicht. Im Fall der AMPS/Gentamycin-Sulfat-Oberfläche wurde
die volle Wirksamkeit selbst nach 24-stündigem Spülen mit entionisiertem Wasser
erhalten.
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Obwohl
die folgende, detaillierte Erörterung
Beispiele erwähnt,
in denen Filme wie die Polymersubstrat-Oberflächen behandelt werden, ist
es nicht beabsichtigt, die Erfindung darauf zu beschränken. Gepfropfte hydrophile,
mit Biowirkstoffen ionisch gekoppelte Oberflächen können entsprechend an andere
Substratoberflächen
gebunden werden, beispielsweise Oberflächen von für den Kontakt mit Blut oder
Blutprodukten bestimmten Gegenständen,
von Gegenständen
jeglicher Form oder Gestaltung einschließlich rohr-, blatt-, oder stabförmiger Gestaltung
und Gegenstände
in einer für
den Einsatz in künstlichen
Organen geeigneten Form, in Ausrüstung
zur Blutbehandlung oder in Körperimplantaten
jeglicher Art und für
jegliches einkapselndes Mittel hierfür.
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Die
Bereitstellung von Gegenständen
für den
Körperkontakt
mit einer ionisch geladenen Pfropfpolymer-Oberfläche wie in den erfindungsgemäßen Gegenständen mit
Blutkontakt kann auch genutzt werden, um eine Wechselwirkung zwischen
ionischen Biowirkstoffen, die dem Körper durch die Auswahl eines
Pfropfpolymers mit einer Oberflächenladung
gegensätzlicher
Polarität
zu der des aktiven Ions des Biowirkstoffes eingegeben werden, zu
verhindern.
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Wie
bereits erläutert,
ist gesundes intaktes Endothel nicht thrombogen, teilweise aufgrund
der Synthese von Heparansulfat. Das Heparansulfat neigt dazu, auf
der Oberfläche
der Endothelzellen gebunden zu bleiben und beschleunigt die Inaktivierung
von Thrombin, dem für
die Polymerisation von Fibrinogen zu Fibrin bei der Gerinsel-Bildung
durch ATIII verantwortlichen Enzym. Heparansulfat ist ein sehr wirksames
Antikoagulans in den natürlichen
Geweben.
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Heparin
ist ein stark saures Aminoglycan. Es weist einen hohen Gehalt an
N- und O-Sulfatgruppen auf. Heparin ist dem Heparan strukturell ähnlich,
obwohl es stärker
sulfatiert ist. Die antikoagulierende Wirkung von Heparin hängt direkt
ab von seinen molekularen Größen und
elektrischer Ladung, und somit führt
eine Erhöhung
des Molekulargewichts und/oder des Sulfonierungsgrades zu einer
Erhöhung
der antikoagulierenden Wirkung. Daher stimuliert ein hochgradig
sulfoniertes Polymer die Inaktivierung von Thrombin durch ATIII,
vergleichbar dem Heparin.
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Die
2-Acrylamidosulfonsäure(AMPS)-Beschichtung
zieht auf die Herstellung einer Oberfläche ab, die aufgrund ihrer
Hydrophilie zu einer Verringerung der nichtspezifischen Absorption
verschiedener Proteine führt und
eine hochgradig sulfonierte Oberfläche bereitstellt, die bevorzugt
ATIII adsorbiert.
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Im
Bezug auf die AMPS-Arbeit dieser Erfindung wurde ein hoher Aufwand
in die Entwicklung einer allgemeinen Technik zur Oberflächenmodifizierung
von Polyurethan mit AMPS gesteckt, jedoch kann diese Technik mit
geringfügigen
Modifikationen für
Oberflächen
anderer Materialien verwendet werden. Die im Folgenden detailliert
beschriebene Technik basiert auf der Erzeugung freier Radikale auf
einer Polyurethan-Oberfläche mit
Ce(IV)-Ionen und der Pfropfpolymerisation von AMPS-Monomeren direkt
auf dieser Oberfläche.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
und die erfindungsgemäßen Gegenstände werden
nun näher
an Hand von Illustrationen mit Bezug auf die folgenden, nicht einschränkenden
Beispiele und die dazugehörigen Zeichnungen
beschrieben:
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1 zeigt ein Diagramm, das
die Menge des Farbstoffes Toluidin-Blau zeigt, die von den mit AMPS gepfropften
Oberflächen
von Pellethan 55D Polyurethan und von Pellethan 55D Polyurethan
abgegeben wird;
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2 zeigt ein Diagramm, das
einen Vergleich von ATIII-Wirksamkeit von unbeschichtetem Pellethan 55D
Polyurethan, mit Heparin beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan
und mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan zeigt (die
Ergebnisse sind als Menge an durch die Probenobertläche deaktiviertem Thrombin/cm2 ausgedrückt);
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3 zeigt ein Diagramm, das
den Hemmhof von Pellethan 55D Polyurethan, mit AMPS beschichtetem
Pellethan 55D Polyurethan und mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D
Polyurethan, das adsorbiertes Gentamycin enthält, (die eingesetzten Bakterien
waren S. epidermis) zeigt;
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4 zeigt ein Diagramm, das
die Elutionsrate von Gentamycin aus Proben von mit AMPS gepfropften
Pellethan 55D Polyurethan-Proben in entionisiertem Wasser, 0,9%iger
NaCl-Lösung
und 10%iger NaCl-Lösung
zeigt, wie durch die Hemmhofmethode gemessen;
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5 zeigt ein Diagramm, das
die ATIII-Wirksamkeit von mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan,
das Gentamycin enthält,
und von mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan nach 24-stündiger Elution
von Gentamycin zeigt;
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6 zeigt ein Diagramm, das
die Menge des Fibroblastenwachstumsfaktors zeigt, der an Polyurethan
(PU) und an mit Acrylamid (AAm), N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid
(APMA) und Acrylamid(AAm)-Copolymeren oder 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS)
gepfropftes Polyurethan bindet;
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7 zeigt ein Diagramm, das
die Adsorption des Farbstoffes Toluidin-Blau für die gleichen Substrate wie
in 6 zeigt (d. h. PU,
AAm, APMA/AAm und AMPS);
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8 zeigt ein Diagramm, das
die Adsorption des Farbstoffes Ponceau S. für die gleichen Substrate wie
in 6 und 7 zeigt (d. h. PU, AAm,
APMA/AAm und AMPS);
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9a zeigt einen postulierten
Reaktionsmechanismus für
den Kettenstart mit Ce(IV)-Ionen als Radikalbildner auf einer Polyurethan-Oberfläche;
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9b zeigt eine Pfropfpolymerisation
von AAm und APMA auf einer durch Ce(IV)-Ionen aktivierten Polyurethan-Oberfläche;
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10 zeigt die Oxidation von
Dextran mit Periodat;
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11 zeigt die reduktive Aminierung
(Schiff'sche Base-Reaktion)
von oxidiertem Dextran und gepfropften APMA;
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12 zeigt die Stabilisation
von Imin-Verbindungen mit Natriumcyanborhydrid;
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13 zeigt kovalent an oberflächengebundenes
Dextran gekoppelten Farbstoff Cibracon-Blau;
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14 zeigt ein Diagramm, das
die Adsorption von 125I-Albumin an Pellethan
55D Polyurethan, mit Blaudextran vollständig derivatisiertem Pellethan
55D Polyurethan (55D/BD) und mit Blaudextran oberflächenderivatisiertem
Pellethan 55D Polyurethan (Blaudextran) zeigt;
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15 zeigt ein Diagramm, das
die Adsorption von 125I-Albumin an unbeschichtetes
Pellethan 55D Polyurethan, an mit APMA/AAm oberflächenbeschichtetes
Pellethan 55D Polyurethan, an mit Dextran oberflächenbeschichtetes Pellethan
55D Polyurethan und an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetes Pellethan 55D
Polyurethan zeigt;
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16 zeigt ein Diagramm, das
den Immunogold-Assay von Albumin zeigt, das an Proben von mit APMA/AAm
oberflächenbeschichtetem
Pellethan 55D Polyurethan, mit Dextran oberflächenbeschichtetem Pellethan
55D Polyurethan und mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Pellethan
55D Polyurethan aus frischem menschlichen Blutplasma adsorbiert
wird (die Ergebnisse sind ausgedrückt als Goldpartikel/cm2);
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17 zeigt ein Diagramm, das
die Adsorption von 125I-Albumin an mit Blaudextran
oberflächenbeschichtetes
Pellethan 55D Polyurethan zeigt, wobei die Proben getrocknet und
1 Stunde in PBS rehydratisiert wurden (die Ergebnisse sind ausgedrückt als
% der ursprünglichen
Albumin-Adsorption);
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18 zeigt ein Diagramm, das
die selektive Adsorption von Albumin in Gegenwart von Fibrinogen an
Proben von Pellethan 55D Polyurethan und von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Pellethan 55D Polyurethan zeigt (die Ergebnisse sind ausgedrückt in %
des an der Oberfläche
adsorbierten Gesamtproteins (wobei es sich um Albumin handelt);
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19 zeigt ein Diagramm, das
den Anteil in % des adsorbierten Albumins zeigt, das von Proben
von Pellethan 55D Polyurethan und von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Pellethan 55D Polyurethan während
eines Waschens mit einprozentiger SDS-Lösung entfernt wurde;
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20 zeigt ein Diagramm, das
die konkurrierende Verdrängung
von 125I-Albumin
auf Proben von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Pellethan
55D Polyurethan und von unbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan
zeigt, die in entweder PBS oder PBS-haltigem Blaudextran gewaschen
wurden (die Ergebnisse sind ausgedrückt in % des während des
Waschens mit Blaudextrans aus den Proben entfernten Albumins);
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21 zeigt ein Diagramm, das
einen Vergleich der ATIII-Wirksamkeit von Proben von unbeschichtetem
Pellethan 55D Polyurethan, von mit CBAS (Heparin) beschichtetem
Pellethan 55D Polyurethan und von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Pellethan 55D Polyurethan zeigt (die Ergebnisse sind ausgedrückt als
die Menge an durch die Probenoberflächen deaktivierten Thrombins/cm2);
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22 zeigt ein Diagramm, das
die prozentuale Abnahme der bakteriellen Adhäsion an Proben von mit Blaudextran
oberflächenderivatisiertem
Pellethan 55D im Vergleich zu nicht derivatisiertem Pellethan 55D ohne
Albumin und mit Pre-Albumin-Adsorption zeigt;
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23 zeigt eine schematische
Formel, die verschiedene, ein Polymer bildende Monomere zeigt; und
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24 zeigt ein Diagramm, das
die Menge an auf der Oberfläche
von mit CBAS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan und von mit
Heparin beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan deaktiviertem Thrombin
in IU/cm2 zeigt.
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Beispiel 1
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Extrudiertes
Pellethan 55D Polyurethan wurde als ein Polyurethan-Material verwendet.
Es ist erhältlich bei
der DOW Chemical Company of Midland, Michigan 48640, USA. Filme
des Pellethan 55D Polyurethans wurden über 72 Stunden in Azeton und
in Ethanol für
weitere 72 Stunden vor dem Pfropfen mit Ce(IV)-Ionen extrahiert.
Das Verfahren der Lösungsmittel-Extraktion
entfernt jegliche Prozesshilfsmittel, die den Pfropfprozess beeinträchtigen
könnten.
Es wurde eine 50%ige AMPS-Monomer-Lösung in entionisiertem Wasser
zubereitet, und 20 ml der Ce(IV)-Ionen-Lösung wurde auf 100 ml der Monomer-Lösung gegeben.
Die Ce(IV)-Ionen-Lösung
bestand aus 2,74 g Cerammoniumnitrat und 3,15 g Salpetersäure in 50
ml entionisiertem Wasser. Die Ce(IV)-Monomer-Lösung wurde dann vor dem Pfropfen
entgast und von Stickstoff befreit. Proben von Pellethan 55D Polyurethan
wurden dann in die entgaste Monomer-Lösung gegeben und diese wurden
gerührt. Das
Pfropfen fand über
einen Zeitraum von 2 Stunden statt. Gepfropfte Proben wurden dann
entfernt und gründlich
in entionisiertem Wasser gewaschen.
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Die
Anwesenheit von Sulfonsäuregruppen
auf mit AMPS gepfropftem Material wurde unter Verwendung des Farbstoffes
Toluidin-Blau bestimmt. Durch seine positive Ladung lagert sich
der Farbstoff Toluidin-Blau an negativ geladenen Oberflächen an.
Daher weist die Anlagerung von Toluidin-Blau an die AMPS-Oberflächen auf
die Anwesenheit von negativen Ladungen auf Grund der Sulfonsäuregruppen
in AMPS hin. Mit AMPS gepfropfte Proben wurden 1 Minute in eine
1%ige Lösung
des Farbstoffes Toluidin-Blau in entionisiertem Wasser gegeben und
anschließend
in entionisiertem Wasser gespült.
Der gebundene Farbstoff wurde dann von der Oberfläche mit
einer 1%igen Lösung
aus Natriumdodecylsulfat (SDS) in entionisiertem Wasser entfernt.
Die Menge an eluiertem Farbstoff wurde durch Spektralfotometrie
bei 640 nm bestimmt. Die Menge an Farbstoff, die aus Proben von
Pellethan 55D Polyurethan und von mit AMPS gepfropftem Pellethan 55D
Polyurethan abgegeben wurden, sind in 1 dargestellt.
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Wie
die Ergebnisse zeigen, adsorbierte Pellethan 55D Polyurethan, das
kein AMPS enthält,
keinen Toluidin-Blau-Farbstoff. Das ist darauf zurückzuführen, dass
Pellethan 55D Polyurethan keine negativ geladenen Gruppen enthält. Die
AMPS-Beschichtung adsorbierte jedoch eine große Menge des Farbstoffes Toluidin-Blau,
was auf die Anwesenheit von Sulfonsäuregruppen auf der Oberfläche hinweist.
Weil die AMPS-Oberfläche
eine große
Anzahl an Sulfonsäuregruppen
enthielt, wurde seine Fähigkeit,
ATIII zu binden, als nächstes näher untersucht.
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Beispiel 2
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Da
das Koagulieren auf Materialien, deren Oberflächen mit AMPS beschichtet sind,
auf Grund der Aktivierung von ATIII durch die Sulfonsäuregruppen,
die auf der modifizierten Oberfläche
des Polymersubstrats anwesend sind, verzögert werden kann, wurde die
oberflächenvermittelte
Aktivierung von ATIII durch mit AMPS beschichteten Proben bewertet.
Proben wurden erst in phosphatgepufferter salzhaltiger Lösung (PBS) 15
Minuten gespült,
bevor sie ATIII ausgesetzt wurden. Im Anschluss an das Spülen wurden
die Proben 15 Minuten einem Überschuss
an gereinigtem ATIII (50 IU/ml) ausgesetzt. Nicht adsorbiertes ATIII
wurde durch rasches Spülen
in Tris-gepufferter Salzlösung
mit einem pH-Wert von 7,4 bei 25°C
(100 mM NaCl und 50 mM Tris) entfernt. Die Menge des an der Oberfläche gebundenen
und aktivierten ATIII wurde dann ermittelt, indem die Proben mit
einem Überschuss
an Thrombin inkubiert wurden. Nach einer Inkubationszeit von 10
Minuten unter konstantem Mischen bei 25°C wurde das überschüssige Thrombin über die
Reaktion mit einem chromogenen Substrat (H-D-Phenylanalyl-L-pipecolyl-arginin-p-nitroaniliddichlorid)
in einem Spektralfotometer gemessen. Die Veränderung in der Absorption bei
405 nm wurde gemessen.
-
Die
Ergebnisse werden in 2 dargestellt.
Wie die Ergebnisse zeigen, scheint die Oberflächenderivatisierung mit AMPS
eine Heparin-artige Wirksamkeit aufzuweisen. Tatsächlich stellt
sich heraus, dass die mit AMPS beschichteten Proben eine höhere ATIII-Wirksamkeit
als die mit CBAS® (Carmeda® Bioactive
Surface) beschichteten Polyurethan-Proben besitzen. CBAS® ist
eine Heparin-Beschichtung,
erhältlich
bei Carmeda AB, einer schwedischen Firma. Dieser Heparin-artige
Effekt ist zurückzuführen auf
die in der AMPS-Beschichtung vorhandenen Sulfonsäuregruppen. Daher erwartet
man, dass die AMPS-Beschichtung
nicht-thrombogene Eigenschaften, die üblicherweise mit Heparin beschichteten
Materialien zugesprochen werden, besitzt.
-
INFEKTIONSRESISTENTE BESCHICHTUNG
MIT AMPS/GENTAMYCIN
-
Ein
großes
Problem bei implantierbaren polymeren Gegenständen ist ihre Anfälligkeit
für Post-Implantations-Infektion.
Stagh. epidermis, die auf der menschlichen Haut leben, und Staph.
aureus, die man manchmal in Krankenhausumgebungen findet, sind die
beiden häufigsten
pathogenen Erreger. Beide besitzen die Fähigkeit, durch die Operationsöffnung in
den Körper
einzudringen und das Implantat anzugreifen. Obwohl ein solches Risiko
durch gute Operationstechniken und eine saubere Umgebung des Operationsraumes
minimiert werden kann, kann man es nicht vollständig ausräumen. Darüber hinaus sind die Folgen
einer Post-Implantations-Infektion fast immer schwerwiegend. Bis
zu 5% der Implantate (abhängig
von dem implantierten Gerät) werden
infiziert; Krankheit/Tod ist in den meisten Fällen die Folge.
-
Die
meisten Arbeiten mit Prototypen zum Erfassen von Daten bei antimikrobiellen
Additionen an AMPS wurden mit Gentamycin durchgeführt. Es
wurde festgestellt, dass es die Fähigkeit hat, ionisch an die AMPS-Beschichtung
zu binden. Kommerziell ist Gentamycin meist als ein Sulfat-Salz
erhältlich.
Da AMPS eine Sulfonsäure
als funktionale Gruppe enthält,
hat man festgestellt, dass die Immersion eines mit AMPS beschichteten
Polymers in eine Gentamycin-Sulfat-Lösung eine
Adsorption von Gentamycin an die Oberfläche zur Folge hat. Darüber hinaus,
eluierte das adsorbierte Gentamycin in vitro von der Oberfläche, was
der AMPS-Oberfläche
eine bakterizide Wirksamkeit verleiht. Als Folge führte die
geeignete Zugabe von antibakteriellen Wirkstoffen zu den AMPS-Beschichtungen zu
einer sowohl infektionsresistenten als auch nicht-thrombogenen Beschichtung.
-
Beispiel 3
-
Das
Verfahren, zur Beladung der AMPS-Oberflächen mit Gentamycin wurde wie
folgt durchgeführt. Eine
AMPS-Oberfläche
wurde auf einem Polymersubstrat wie oben beschrieben hergestellt.
Die mit AMPS beschichteten Polymere wurden dann in eine wässerige
(üblicherweise
5% w/w) Lösung
aus Gentamycin-Sulfat getaucht; diese Immersion benötigt nur
3 Minuten. Bei Beendigung der Immersion wurden die Proben entnommen,
10 bis 15 Sekunden in entionisiertem Wasser gespült, luftgetrocknet und dann
gelagert.
-
Proben
wurden in Hinblick auf antibakterielle Wirksamkeit mit Hilfe der „Hemmhofmethode" (ring of inhibition)
analysiert. Die Hemmhofmethode wird in der Literatur als In-vitro-Test
für die
antibakterielle Wirksamkeit eines Medikamentes oder eines medikamentenbeladenen
Systems beschrieben. Sie wird wie folgt durchgeführt. Auf einer Agar-Platte
mit Blut wird mit dem zu testenden bakteriellen Organismus eine
Kultur angelegt und über
Nacht inkubiert. Eine oder zwei Kolonien von dieser Platte werden
dann abgetupft und in eine Trisgepufferte salzhaltige (TBS) Lösung bis
zu einer Standard-Trübung
(1,5*109/ml nach Macfarland Standards) eingerührt. Diese
bakterielle Lösung
wird dann auf einer Mueller-Hinton Agar-Platte als Strichkultur
angelegt. Die zu testenden Proben werden dann gemeinsam mit einer
positiven und einer negativen Kontrolle auf das Agar gepresst oder
darin eingebettet. Die positive Kontrolle sollte eine medikamentenbeladene
Probe mit genau definierten antibakteriellen Eigenschaften sein;
die negative Kontrolle sollte eine Probe ohne Medikament sein. Ein
oder zwei Proben (abhängig
von ihrer Größe) können dann
auf der gleichen Platte ausgetestet werden. Wenn das Agar einmal
mit Proben beladen ist, wird es auf den Kopf gestellt und über Nacht
bei 37°C inkubiert.
Am nächsten
Tag kann die Platte aus der Inkubation entnommen werden und der
von Bakterien unbewachsene Hemmhof kann um jede Probe herum gemessen
werden. Die Bereiche bakteriellen Wachstums und Hemmung sind deutlich
sichtbar. Das normale trübe
Erscheinungsbild von Bakterien auf Agar fehlt in den Bereichen gehemmten
Wachstums völlig.
Der Hemmhof wird einfach mit einem Lineal gemessen (ist der „Hof" länglich,
wird ein ungefährer
durchschnittlicher Radius bestimmt). Die Hemmhofmethode ist ein
gutes Maß für die relative
Wirksamkeit verschiedener mit Medikamenten beladener Materialien.
-
S.
epidermis war der Test-Organismus für alle Tests nach der Hemmhofmethode,
die im Zusammenhang mit mit AMPS beschichteten Polymeren, wie hierin
beschrieben, durchgeführt
wurden.
-
Das
Diagramm in 3 veranschaulicht
die bakteriziden Eigenschaften von adsorbiertes Gentamycin enthaltenden
AMPS-Beschichtungen. 3 zeigt
im Vergleich die Wirksamkeit gegen S. epidermis von Pellethan 55D
Polyurethan, von Pellethan 55D Polyurethan mit mit AMPS gepfropfter
Beschichtung und von mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan
mit adsorbiertem Gentamycin.
-
Wie
die Ergebnisse in 3 erkennen
lassen, gab es keine bakteriziden Eigenschaften im Zusammenhang
mit einfachem Pellethan 55D Polyurethan oder mit dem mit AMPS gepfropften
Pellethan 55D Polyurethan. Allerdings wies das mit AMPS gepfropfte,
adsorbiertes Gentamycin enthaltende Pellethan 55D Polyurethan eine
signifikante bakterizide Wirksamkeit auf. Die Fähigkeit des Gentamycins, von
den mit AMPS gepfropften Oberflächen
unter verschiedenen ionischen Gegebenheiten zu eluieren, wurde als
nächstes
untersucht.
-
4 zeigt die Ergebnisse eines
Elutionstests, der durchgeführt
wurde, um zu bestimmen, wie die Ionenstärke die Elutionsrate des Gentamycins
von der AMPS-Beschichtung beeinflusst. Man erkennt, dass je größer die
Ionenstärke
der Vorratslösung
ist, desto schneller der Hemmhof abnimmt, und desto größer deshalb die
Elutionsrate des Gentamycins von der Oberfläche ist. Dies zeigt nicht nur,
dass ionische Bindung von Wirkstoffen an Beschichtungen stattgefunden
hat, sondern auch, dass bei einer physiologischen Ionenstärke (Konzentration
von 0,9%) die Desorptionsrate förderlich
für eine
langzeitliche, langsame Abgabe von Wirkstoffen ist. Diese Kinetik
ist auffallend ähnlich
der der Diffusion von Wirkstoffen aus einer durchgängig beladenen
Matrix, woran man erkennt, dass therapeutische Mengen an Wirkstoffen über eine
relativ lange Zeitspanne freigesetzt werden.
-
Beispiel 4
-
Das
folgende Beispiel wurde ausgearbeitet, um zu bestimmen, ob die Adsorption
von Gentamycin die Wirksamkeit von ATIII auf einer mit AMPS beschichteten
Oberfläche
herabsetzt. Es besteht aus der Beladung von mit AMPS gepfropften
Oberflächen
mit Gentamycin durch Immersion in einer wässerigen (üblicherweise 5% w/w) Lösung aus
Gentamycin-Sulfat über
5 Minuten. Nach Fertigstellung der Immersion in Gentamycin wurden
die Proben entfernt, 10 bis 15 Sekunden in entionisiertem Wasser
gespült
und entweder getrocknet oder 24 Stunden in eine 10%ige NaCl-Lösung gegeben.
Die Proben wurden dann auf ATIII-Wirksamkeit untersucht.
-
Die
Proben wurden zuerst 15 Minuten in phosphatgepufferter salzhaltiger
Lösung
(PBS) gespült,
bevor sie ATIII ausgesetzt wurden. Im Anschluss an das Spülen wurden
die Proben 15 Minuten einem Überschuss
an gereinigtem ATIII (50 IU/ml) ausgesetzt. Nicht adsorbiertes ATIII
wurde durch schnelles Spülen
in Trisgepufferter salzhaltiger Lösung, pH-Wert von 7,4 bei 25°C (100 mM
NaCl und 50 mM Tris), entfernt. Die Menge der an der Oberfläche gebundene
und aktivierten ATIII wurde dann ermittelt, indem die Proben mit
einem Überschuss
an Thrombin inkubiert wurden. Nach einer Inkubationszeit von 10
Minuten unter konstantem Mischen bei 25°C wurde das überschüssige Thrombin über die
Reaktion mit einem chromogenen Substrat (N-D-Phenylanalyl-L-pipecolyl-L-arginin-p-nitroaniliddichlorid)
in einem Spektralfotometer gemessen. Die Veränderung in der Absorption bei
405 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Wie die Ergebnisse veranschaulichen,
behält
die AMPS-Oberfläche,
die adsorbiertes Gentamycin enthält,
einen großen
Prozentsatz (74%) ihrer ursprünglichen
ATIII-Wirksamkeit. Die ATIII-Wirksamkeit, die die AMPS-Oberfläche auf
Grund des adsorbierten Gentamycins verliert, kehrt mit der Elution
des Gentamycins wieder. Daraus lässt
sich schließen,
dass die AMPS-Beschichtung
einen Großteil
ihrer antithrombogenen Eigenschaften besitzt, während sie mit Gentamycin beladen
ist, und alle ihre antithrombogenen Eigenschaften mit der Elution von
Gentamycin wiedererlangt. Daher ist eine solche Beschichtung nicht-thrombogen
und bakterienresistent.
-
Die
Idee, die sich hinter der Beschichtung mit AMPS verbirgt, ist die
Bereitstellung einer Heparin-artigen Oberfläche, um Thrombogenität zu vermeiden,
mit dem Nebeneffekt, implantierbare Geräte mit Gleiteigenschaften zu
versehen. Die oben erörterten
Daten veranschaulichen, dass die Beschichtung tatsächlich eine
Heparin-artige Oberfläche
auf Grund seiner selektiven Adsorption von ATIII schafft. Zusätzlich zu
diesen antithrombogenen Eigenschaften wurde festgestellt, dass die
anionische AMPS-Beschichtung die Fähigkeit besitzt, kationische
antimikrobielle Wirkstoffe ionisch zu binden und langsam freizusetzen, so
dass sie der Oberfläche
zusätzlich
langfristige bioaktive Eigenschaften verleiht. Es stellte sich heraus,
dass sich diese Zugabe von Biowirkstoffen nicht nachteilig auf die
Fähigkeit
der AMPS-Oberfläche,
ATIII selektiv zu adsorbieren, auswirkte. Diese Ergebnisse lassen
erkennen, dass die AMPS-Beschichtung eine wirkungsvolle sowohl nicht-thrombogene
als auch infektionsresistente Oberflächenmodifikation ist, die die
Biokompatibilität
von implantierbaren, polymeren Medizingeräten signifikant erhöht.
-
Andere
Beispiele kationischer antimikrobieller Wirkstoffe (gebunden durch
negativ geladene Oberflächen)
werden in untenstehender Tabelle 3 aufgezeigt.
-
Tabelle 3
-
- Gentamycin
- Kanamycin
- Neomycin
- Silber-Ionen
- Chlorhexidin
- Vancomycin
- Streptomycin
- Erythromycin
-
Spezielle
Beispiele anionischer antimikrobieller Wirkstoffe (gebunden durch
positiv geladene Oberflächen)
werden in untenstehender Tabelle 4 aufgezeigt.
-
Tabelle 4
-
- Ampicillin
- Oxacillin
- Cefazolin
- Bacitracin
- Cephalosporin
- Cefuroxin
- Cefoxitin
- Norfloxacin
- Perfloxacin
- Sulfadiazin
-
AN IONISCH GELADENE OBERFLÄCHEN BINDENDER
BASISCHER FIBROBLASTENWACHSTUMSFAKTOR (PFROPFPOLYMER)
-
Basischer
Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) wurde aus vielen Ausgangsgeweben
isoliert und ist ein Einzelketten-Protein mit einem ungefähren Molekulargewicht
von 18.000. Es ist ein kationisches Protein mit einem isoelektrischen
Punkt von 9. Das Binden von bFGF an ionisch geladene Oberflächen wird
im Folgenden veranschaulicht.
-
Dabei
verwendete Polyurethan-Proben wiesen entweder negativ geladene,
positiv geladene oder neutrale hydrophile Pfropfpolymer-Oberflächen auf.
Die modifizierten Polyurethan-Oberflächen wurden über ein Pfropfen
mit Cer-Ionen hergestellt. Nicht beschichtete Polyurethan-Proben
(PU) wurden ebenfalls verwendet.
-
Beispiel 5
-
Ungeladene Proben (AAm)
-
Ungeladene
Polyurethan-Proben (1 cm2) wurden hergestellt,
indem die Proben 45 Minuten bei Umgebungstemperatur in die folgenden
entgasten Pfropflösungen
gegeben wurden.
50 g Acrylamid (AAm)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3
g Salpetersäure
70
ml entionisiertes Wasser
-
Im
Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser
gespült.
-
Beispiel 6
-
Positiv geladene Proben
(APMA/AAm)
-
Positiv
geladene Polyurethan-Proben (1 cm2) wurden
hergestellt, indem die Proben 45 Minuten bei Umgebungstemperatur
in die folgenden entgasten Pfropflösungen gegeben wurden.
40
g Acrylamid (AAm)
10 g N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid
(APMA)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3 g Salpetersäure
70
ml entionisiertes Wasser
-
Im
Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser
gespült.
-
Beispiel 7
-
Negativ geladene Proben
(AMPS)
-
Negativ
geladene Polyurethan-Proben (1 cm2) wurden
hergestellt, indem die Proben 2 Stunden bei Umgebungstemperatur
in die folgenden entgasten Pfropflösungen gegeben wurden.
50
g 2-Acrylamid-2-methylpropansulfonsäure (AMPS)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3
g Salpetersäure
70
ml entionisiertes Wasser
-
Im
Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser
gespült.
-
Ergebnisse – Beispiele
5 bis 7
-
Die
gepfropften Proben (1 cm2) wurden dann in
24 Well-Gewebeplatten aus Polystyren-Gewebe gegeben und mit Silikon-Gummiringen
fixiert. Die Proben wurden bis zur Untersuchung zur Befeuchtung
in Wasser bei Umgebungstemperatur gelagert.
-
Verdünnte bFGF
wurde in phosphatgepufferte salzhaltige Lösung (PBS) mit 1 mg/ml Albumin
aus Rinderserum (BSA) gegeben. Die Proben wurden über Nacht
bei 25°C
inkubiert. Drei Konzentrationen von bFGF wurden untersucht: 0,5
ng/ml, 5 ng/ml und 50 ng/ml. Man gab 0,1 mg 125I-markierte
bFGF zu jedem Well bis zu einem Gesamtvolumen von 0,5 ml pro Well.
Die Proben wurden mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Proben wurden
in einem Beckmann-Gamma-Zähler ausgezählt.
-
-
Wie
man aus den Daten der Tabelle 5 und der 6 ersieht, ist die Menge an Fibroblastenwachstumsfaktor,
der an die unterschiedlichen Oberflächen bindet, dargestellt. Wie
die Ergebnisse zeigen, adsorbierten die negativ geladenen Proben
(AMPS) erheblich mehr bFGF als die anderen Proben.
-
Wollte
man andererseits den gegenteiligen Effekt erzielen, d. h. Abstoßung anstelle
von Anziehung, würde
man ein Pfropfpolymer bzw. einen Biowirkstoff mit gleichartigen
Ladungen (+,+) oder (–,–) wählen. Das kann
in solchen Fällen
gemacht werden, wenn man jegliche Wechselwirkung zwischen diesen
zu minimieren wünscht.
So kann es beispielsweise wünschenswert
sein, Peptid-Wechselwirkungen
in Bezug auf eine implantierte Oberfläche zu minimieren. Um dies
zu erreichen, kann man hydrophile Polymere auf die zu implantierende
Oberfläche
pfropfen, die gleichartige Ladungen aufweist wie das Peptid von
Interesse, so dass das Fehlen von Wechselwirkungen durch die Ladungsabstoßung unterstützt wird.
Als Beispiel ist 6 zu
sehen, woraus man eine APMA/AAm-Beschichtung wählen könnte, um bFGF abzustoßen. Man
betrachte 7, woraus
man eine APMA/AAm-Beschichtung wählen
könnte,
um Toluidin-Blau abzustoßen.
Zuletzt betrachte man 8,
woraus man eine AMPS-Beschichtung
wählen
könnte,
um Ponceau S. abzustoßen.
-
IONISCHE BINDUNG VON FARBSTOFFEN
AN GELADENE OBERFLÄCHEN
(PFROPFPOLYMER)
-
Die
Fähigkeit
eines kationischen und eines anionischen Farbstoffes, an geladene
Oberflächen
zu binden, wurde ebenfalls untersucht. Das ist auf Grund des Konzeptes,
verschiedene Farbstoffe als biologische Liganden zu verwenden, von
Interesse. Der in dieser Studie verwendete kationische Farbstoff
war Toluidin-Blau,
und der verwendete anionische Farbstoff war Ponceau S.
-
Hierbei
verwendete Polyurethan-Substratproben wiesen entweder negativ geladene,
positiv geladene oder ungeladene hydrophile Oberflächen auf.
Die Polyurethan-Oberflächen
wurden mittels Pfropfen mit Cer-Ionen hergestellt. Unbeschichtete
Polyurethan-Proben (PU) wurden ebenfalls verwendet.
-
Beispiel 8
-
Ungeladene Proben (AAm)
-
Ungeladene
Polyurethan-Proben (1 cm2) wurden hergestellt,
indem die Proben 45 Minuten bei Umgebungstemperatur in die folgenden
entgasten Pfropflösungen
gegeben wurden.
50 g Acrylamid (AAm)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3
g Salpetersäure
70
ml entionisiertes Wasser
-
Im
Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser
gespült.
-
Beispiel 9
-
Positiv geladene Proben
(APMA/AAm)
-
Positiv
geladene Polyurethan-Proben (1 cm2) wurden
hergestellt, indem die Proben 45 Minuten bei Umgebungstemperatur
in die folgenden entgasten Pfropflösungen gegeben wurden.
40
g Acrylamid (AAm)
10 g N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid
(APMA)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3 g Salpetersäure
70
ml entionisiertes Wasser
-
Im
Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser
gespült.
-
Beispiel 10
-
Negativ geladene Proben
(AMPS)
-
Negativ
geladene Polyurethan-Proben (1 cm2) wurden
hergestellt, indem die Proben 2 Stunden bei Umgebungstemperatur
in die folgenden entgasten Pfropflösungen gegeben wurden.
50
g 2-Acrylamid-2-methylpropansulfonsäure (AMPS)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3
g Salpetersäure
70
ml entionisiertes Wasser
-
Im
Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser
gespült.
-
Ergebnisse – Beispiele
8 bis 10
-
Die
gepfropften Proben aus den Beispielen 8 bis 10 (1 cm2)
wurden 1 Minute entweder in eine Lösung aus 1% des Farbstoffes
Toluidin-Blau in entionisiertem Wasser (12a–14a) oder in eine Lösung aus
1% des Farbstoffes Ponceau S. in entionisiertem Wasser (12b–14b) gegeben.
Im Anschluss an das Färben
wurden die Proben gründlich
mit 500 ml entionisiertem Wasser gespült. Gefärbte Proben wurden in einer
Lösung
aus 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in entionisiertem Wasser 24 Stunden
bewegt.
-
Die
Extinktion jeder eluierten Farbstoff enthaltenden SDS-Probe-Lösung wurde
dann in einem Beckmann DU 64 Spektralfotometer bei einer Wellenlänge von
640 nm für
den Farbstoff Toluidin-Blau und bei 520 nm für den Farbstoff Ponceau S.
gemessen.
-
Die
Menge des an jeder Probe adsorbierten Farbstoffs wird dann errechnet,
indem die Extinktion der Probe mit einer standardisierten Extinktionskurve
verglichen wird, bei der bekannte Mengen des Farbstoffes verwendet
wurden. Die Ergebnisse für
die Extinktion des Farbstoffes Toluidin-Blau werden sowohl in Tabelle
6 als auch in 7 dargestellt.
-
-
Ähnliche
Ergebnisse werden in Tabelle 7 und 8 für die Extinktion
des Farbstoffes Ponceau S. dargestellt.
-
-
Wie
die Ergebnisse erkennen lassen, adsorbierten die negativ geladenen
Proben (AMPS) erheblich mehr kationischen Farbstoff (Toluidin-Blau)
als die anderen Proben. Dahingegen adsorbierten die positiv geladenen
Proben (APMA/AAm) erheblich mehr des anionischen Farbstoffes (Ponceau
S.) als die anderen Proben.
-
KOVALENTES BINDEN VON
BIOWIRKSTOFFEN
-
Das
Konzept, Biowirkstoffe wie beispielsweise Farbstoffe kovalent auf
implantierbare Materialien, beispielsweise aus Polyurethan, zu binden,
die gepfropfte Gleitbeschichtungen aufweisen, ist ein weiterer Gegenstand
der vorliegenden Erfindung. Materialien mit Oberflächen, die
bevorzugt Albumin binden, werden weniger thrombogen, weniger entzündungsfördernd und
weniger anfällig
dafür sein,
pathogene Bakterien zu beherbergen.
-
Die
vorliegende Erfindung beschreibt hierin Verfahren, um Blaudextran,
Dextran oder den Farbstoff Cibacron-Blau kovalent an eine gepfropfte
Polymeroberfläche
zu binden. Das Binden dieser Wirkstoffe basiert auf der Erzeugung
freier Radikale auf der Oberfläche
eines basischen Materials und der Copolymerisation von Vinylmonomeren
direkt an diese Oberfläche,
gefolgt von dem kovalenten Binden von Biowirkstoffen, d. h. Blaudextran,
Dextran oder des Farbstoffes Cibacron-Blau. Im Bereich der Pfropf-Copolymerisation
auf Materialien wurde von einer Anzahl von Verfahren berichtet.
Pfropf-Copolymerisation stellt ein Verfahren zur Verfügung, um
die Zusammensetzung des gepfropften Polymers durch das Variieren
der Monomere und das Variieren ihrer Konzentrationen zu steuern.
Es ist möglich,
gepfropfte Oberflächen
mit folgenden Eigenschaften zu schaffen:
- 1.
Hydrophilie.
- 2. Keine nicht-spezifischen Wechselwirkungen mit Proteinen im
allgemeinen.
- 3. Eine ausreichende Anzahl aktiver Gruppen, die für die chemische
Funktionalisierung und Modifikation zugänglich sind, die für das kovalente
Binden von Biowirkstoffen, wie beispielsweise Blaudextran, Dextran oder
des Farbstoffes Cibacron-Blau, erforderlich ist.
- 4. Mechanische, chemische und enzymatische Stabilität.
-
Um
Oberflächen
mit dem gewünschten
Maß an
Hydrophilie und der gewünschten
Menge funktionaler Gruppen, die für das Koppeln der Biowirkstoffe
gebraucht werden, zu erzeugen, kann das Pfropfen stöchiometrisch
in die Wege geleitet werden. Hydrophile Spacer-Monomere (neutral,
anionisch und kationisch) können ausgewählt werden,
um entsprechend geladene hydrophile Spacer zu erzeugen. Kopplungsmonomere
können
auf der Grundlage ihrer funktionalen Seitengruppen, beispielsweise
-OH, -NH2, -CHO, -NCO, die für das Immobilisieren
eines Biowirkstoffes, beispielsweise Blaudextran, Dextran oder des
Farbstoffes Cibacron-Blau benötigt
werden, ausgewählt
werden.
-
Pfropf-Copolymerisation
auf Poly(etherurethan) mit Ce(IV)-Ionen war die angewendete Methode.
Die verwendeten Monomere sind Acrylamid (AAm) und N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid
(APMA). Diese Monomere wurden teilweise auf Grund ihrer Reaktivitäts- und
Wasserlöslichkeits-Charakteristika
ausgewählt.
Das AAm-Monomer wird als hydrophiles Spacer-Monomer eingesetzt.
-
Das
APMA-Monomer wird als Kopplungsmonomereingesetzt. AAm wurde extensiv
als Matrix für
die Affinitäts-Chromatografie
eingesetzt. AAm ist ein neutrales hydrophiles Monomer; daher zeigten
Polymere von AAm wenig Protein-Assoziation.
APMA ist ein Aminogruppen enthaltendes Monomer, das die Bindung
von Blaudextran, Dextran oder des Farbstoffes Cibacron-Blau erlaubt.
-
Der
Farbstoff Cibacron-Blau kann direkt mit der funktionalen Aminogruppe
des APMA-Monomers durch sein reaktives Chlor im Triazin-Ring reagieren.
Dextran und Blaudextran können
an die Aminogruppe des APMA über
eine stabilisierte Schiff'sche
Base-Reaktion kovalent gebunden werden. Das Dextran oder Blaudextran
wird erst mit Hilfe von Natriumperiodat oxidiert. Die Oxidation
bildet reaktive Aldehydgruppen, die mit den primären Aminen auf dem APMA reagieren,
wobei sie Imine bilden. Die Imine werden mit Hilfe von Natriumcyanborhydrid
stabilisiert.
-
Der
Farbstoff Cibacron-Blau kann mit dem kovalent gebundenen Dextran
zu Blaudextran auf der Oberfläche
des Materials reagieren. Dies ermöglicht, so viel Farbstoff wie
gewünscht
auf der Oberfläche
zu binden. Darüber
hinaus kann das gebundene Dextran in gewünschter Weise im Molekulargewicht
verändert
werden.
-
VERFAHREN ZUR OBERFLÄCHENBESCHICHTUNG
MIT BLAUDEXTRAN
-
Das
Verfahren zur Oberflächenderivatisierung
mit Blaudextran beginnt mit der Pfropf-Copolymerisation von AAm-
und APMA-Monomeren auf eine saubere Polyurethan-Oberfläche mit
Ce(IV)-Ionen. Das Ce(IV)-Ion bildet ein freies Radikal auf der Polyurethan-Oberfläche, das
die Pfropf-Copolymerisation der Acrylamide (9a und b)
startet. Das APMA-Monomer enthält
eine primäre
Aminogruppe, die dann für
das Koppeln von Dextran, das später
mit dem Farbstoff Cibacron-Blau gefärbt wird, verwendet wird. Das
Anbinden von Dextran umfasst zunächst
das Oxidieren des Kohlenwasserstoffes mit Natriumperiodat, wobei
Aldehydgruppen (10)
gebildet werden. Diese Aldehydgruppen werden dann kovalent an die
primären
Aminogruppen auf dem gepfropften APMA-Monomer durch reduktive Aminierung
(Schiff'sche Base-Reaktion)
gebunden (11). Natriumcyanborhydrid
(NaCNBH3) wird verwendet, um die Imin-Verbindung
zu stabilisieren (12). Schließlich wird
der Farbstoff Cibacron-Blau kovalent an das oberflächengebundene
Dextran gekoppelt (13).
-
Der
Umfang der Oberflächenaminierung
(der Pfropf-Copolymerisation von APMA und AAm), die auf der Polyurethan-Oberfläche stattfindet,
kann durch Monomerkonzentrationen, Katalysatorkonzentrationen und die
Pfropfzeit beeinflusst werden. Daher wurde eine Untersuchung zur
Bestimmung der optimalen Pfropfbedingungen für eine hoch aminierte Polyurethan-Oberfläche durchgeführt. Den
Umfang der erhaltenen Oberflächenaminierung
bestimmt man über
das Einfärben
der Oberfläche
mit dem Farbstoff Ponceau S., einem negativ geladenen Farbstoff-Molekül. Der Farbstoff
geht eine ionische Bindung mit primären Aminen auf der aminierten
Oberfläche
ein. Nach dem Einfärben
wird der Farbstoff von der Oberfläche mit Hilfe von SDS gelöst und durch
Spektralfotometrie bei 520 nm quantifiziert.
-
Beispiel 11
-
Verfahren zum APMA/AAm-Pfropfen
-
Extrudierte
Pellethan 55D Filme wurden vor dem Pfropfen mit Ce(IV)-Ionen in
Azeton und Ethanol extrahiert. Das Verfahren der Lösungsmittel-Extraktion
entfernt jegliche Prozesshilfsmittel, die den Pfropfprozess beeinträchtigen
könnten.
Es wurden Monomer-Lösungen
in entionisiertem Wasser zubereitet, und verschiedene Konzentrationen
der Ce(IV)-Ionen-Lösung
wurden zugegeben. Die Ce(IV)-Ionen-Lösung bestand aus 2,74 g Cerammoniumnitrat
und 3,15 g Salpetersäure
in 50 ml entionisiertem Wasser. Die Ce(IV)-Monomer-Lösung wurde
vor dem Pfropfen entgast und von Stickstoff befreit. Proben von
Pellethan 55D wurden in die entgaste Monomer-Lösung gegeben und gerührt. Das
Pfropfen konnte über
verschiedene Zeiträume
stattfinden. Die Proben wurden dann entfernt und gründlich in
entionisiertem Wasser gewaschen.
-
Der
Umfang der Oberflächenaminierung,
die auf Grund der Pfropf-Copolymerisation
der Proben stattfand, wurde mit Hilfe des Farbstoffes Ponceau S.
bestimmt. Gepfropfte Proben wurden 1 Minute in eine 1%ige Lösung des
Farbstoffes Ponceau S. in entionisiertem Wasser gegeben und dann
in entionisiertem Wasser gespült.
Der gebundene Farbstoff wurde dann von der Oberfläche unter
Verwendung von 1%iger SDS-Lösung gelöst. Die
Menge an eluiertem Farbstoff wurde anschließend durch Spektralfotometrie
bei 520 nm bestimmt.
-
Tabelle
8 beschreibt die verschiedenen, verwendeten Pfropf-Bedingungen und
den Umfang der erreichten Oberflächenaminierung,
die durch die Einfärbe-Methode mit Ponceau
S. bestimmt wurde. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden Proben
unter Verwendung einer absoluten Monomerkonzentration von 50%, einer
Reaktionszeit von 30 Minuten, einer Katalysatorkonzentration von
20 und einem AMPA/AAm-Monomer-Verhältnis von 0,10 (10%/90%) gepfropft.
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Beispiel 12
-
Bindung von Dextran an
aminierte Polyurethan-Oberflächen
-
Dextran
wurde zuerst oxidiert, indem 1,0 g davon in 18 g entionisiertes
Wasser, das 1,0 g NaIO4 enthielt, gegeben
wurde. Die Mischung wurde 2 Stunden im Dunkeln inkubiert. Die oxidierte
Mischung wurde dann 24 Stunden gegen entionisiertes Wasser dialysiert,
um jegliches überschüssiges Periodat
zu entfernen. Mit APMA/AAm gepfropfte Proben von Pellethan 55D wurden
dann 1 Stunde bei Umgebungstemperatur in die oxidierte Dextran-Lösung gegeben,
gefolgt von der Zugabe von NaCNBH3 (3 mg/ml).
Die erhaltene Mischung ließ man
2 Stunden bei Umgebungstemperatur reagieren. Die Proben wurden dann
entfernt und gründlich
in entionisiertem Wasser gespült.
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Beispiel 13
-
Kovalent
gekoppeltes Dextran enthaltende Proben wurden anschließend mit
dem Farbstoff Cibacron-Blau gefärbt.
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Die
Proben wurden über
Nacht in eine Färbelösung aus
1,0 g Farbstoff Cibacron-Blau, 4,0 g NaCl und 12,0 g NaHCO3 in 200 ml entionisiertem Wasser gegeben.
Dann wurden die Blaudextran-Proben gründlich in entionisiertem Wasser
gespült.
-
REM-Analyse von mit Blaudextran
oberflächenbeschichtetem
Material (Beispiel 13)
-
Es
wurde eine Raster-Elektronenmikroskopie (REM) an Oberflächen von
mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Pellethan 55D durchgeführt.
Die Oberflächen
wurden bei einer 6000-fachen Vergrößerung untersucht. REM-Bilder
der Oberfläche
zeigen, dass sich die Blaudextran/APMA/AAm-Beschichtung ungefähr 2 μm dick und
einheitlich über
die Oberfläche
verteilt zeigt.
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Tabelle
8 Oberflächenaminierung
von Pellethan 55D-Filmen
-
ESCA-Analyse von mit Blaudextran
oberflächenbeschichtetem
Material
-
ESCA
wurde durchgeführt
auf unbeschichteten Pellethan 55D Proben (Kontrolle), mit APMA/AAm oberflächenbeschichteten
Pellethan 55D Proben, mit Dextran oberflächenbeschichteten Pellethan
55D Proben und mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Pellethan
55D Proben (Tabelle 9). Wie die Ergebnisse zeigen, ist Blaudextran
auf der Oberfläche
des mit Blaudextran oberflächenbeschichteten
Materials vorhanden. Das wird durch eine Abnahme des Kohlenstoffanteiles,
eine Zunahme des Sauerstoffanteiles und eine Zunahme des Schwefelanteiles
deutlich.
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-
Dehnungseigenschaften
von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Material
-
Dehnungseigenschaften
von mit Blaudextran oberflächenbeschichteten
Pellethan 55D Filmen, von mit Dextran oberflächenderivatisierten Pellethan
55D Filmen, von mit APMA/AAm oberflächenderivatisierten Pellethan
55D Filmen und Pellethan 55D Filmen wurden unter Verwendung einer
mechanischen Instron-Prüfvorrichtung
gemessen. Wie in Tabelle 10 gezeigt wird, verändern der Schritt der Pfropf-Copolymerisation
und weitere Derivatisierungsschritte der Methode zur Oberflächenderivatisierung
mit Blaudextran die physikalischen Eigenschaften von Polyurethan
nicht wesentlich.
-
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BEISPIEL 14
-
Die Adsorption von Albumin
auf oberflächenbeschichtetem
Material
-
Das
Ausmaß der
Bindung von mit radioaktiven Isotopen markiertem Albumin an mit
Blaudextran oberflächenbeschichteten
Proben, mit Blaudextran vollständig
beladenen Proben (55D/BD) und Proben von Pellethan 55D (Kontrolle)
wurden untersucht. Die Proben wurden jeweils 15 Minuten in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) gespült
und danach 15 Minuten in 125I-Albumin (0,08
mg/ml) inkubiert. Die Proben wurden entnommen und erneut in PBS
gewaschen und in einem Szintillationszähler ausgezählt. Die Ergebnisse (14) zeigen, dass die mit
Blaudextran oberflächenbeschichteten
Proben mehr Albumin adsorbierten als die 55D-Kontroll-Proben und
mehr als die vollständig
beladenen 55D/BD-Proben.
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BEISPIEL 15
-
Die Adsorption von Albumin
auf oberflächenbeschichtetem
Blaudextran
-
Das
Ausmaß der
Bindung von mit radioaktiven Isotopen markiertem Albumin an mit
Blaudextran oberflächenbeschichteten
Proben, mit Dextran oberflächenbeschichteten
Proben, mit APMA/AAm oberflächenbeschichteten
Proben und unbeschichteten 55D-Proben wurde untersucht. Diese Untersuchung
wurde durchgeführt,
um zu bestimmen, ob die Bindung von Albumin auf die Anwesenheit
des Farbstoffes Cibacron-Blau in der Blaudextran-Beschichtung oder
statt dessen auf die darunter liegenden Dextran- oder APMA/AAm-Beschichtungen zurückzuführen ist.
Die Proben wurden jeweils 15 Minuten in PBS gespült und anschließend 15 Minuten
in 125I-Albumin (0,08 mg/ml) inkubiert.
Die Proben wurden dann entnommen und erneut in PBS gewaschen und
in einem Szintillationszähler
ausgezählt.
Die Ergebnisse (15)
zeigen, dass die mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Proben wesentlich
mehr Albumin adsorbierten als die anderen Proben. Die Zunahme in
der Adsorption von Albumin ist daher auf die Anwesenheit des Farbstoffes
Cibacron-Blau in der Blaudextran-Beschichtung
zurückzuführen.
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BEISPIEL 16
-
Immunogold-Assay von an
oberflächenbeschichtetem
Material adsorbiertem Albumin
-
Eine
andere Untersuchung wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die
Bindung von Albumin wieder auf die Anwesenheit von Cibacron-Blau
Farbstoff in der Blaudextran-Beschichtung oder auf die darunter
liegenden Dextran- oder APMA/AAm-Beschichtungen zurückzuführen ist.
In dieser Untersuchung wurden die Proben jeweils 15 Minuten in PBS
gespült
und danach 45 Minuten bei 37°C
in frischem menschlichen Plasma inkubiert. Die Proben wurden dann
5 Minuten in PBS gespült.
Im Anschluss an das Spülen
wurden die Proben 7 Minuten in eine 1,0%ige Glutaraldehyd-Lösung gegeben
und dann 10 Minuten in PBS gespült.
Die Proben wurden dann 7 Minuten in 1 ml einer 50 mM Glyzin-Lösung gegeben.
Die Proben wurden dann wieder 10 Minuten in PBS gespült. Im Anschluss
an das Spülen
wurden die Proben eine Stunde bei 37°C in 1 ml einer 15%igen Milch-Lösung, die 10 μg einer Protein
A-Lösung
enthielt, inkubiert. Die Proben wurden dann 10 Minuten in PBS gespült. Im Anschluss
an das Spülen
wurden die Proben in 0,5 ml Hasen-Antihuman-Albumin gegeben und
1 Stunde bei 37°C
inkubiert. Die Proben wurden dann 10 Minuten in PBS gespült. Im Anschluss an
das Spülen
wurden die Proben über
Nacht bei 4°C
in 1 ml einer 2,5%igen Glutaraldehyd-Lösung
inkubiert. Nach dem Inkubieren in der Glutaraldehyd-Lösung wurden
die Proben 10 Minuten in PBS gespült. Die Proben wurden dann
25 Minuten in 1 ml einer 50 mM Glyzin-Lösung gegeben, gefolgt von einer
einstündigen
Inkubation in 0,5 ml einer Gold-markierten Protein A-Lösung bei
37°C. Die
Proben wurden dann 10 Minuten in PBS und 10 Minuten in entionisiertem
Wasser gespült.
Eine Lösung
zur Silber-Anreicherung (0,5 ml) wurde dann 15 Minuten zu den Proben
gegeben. Die Proben wurden entnommen, und ihre Oberflächen wurden
mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) aufgenommen. Die Anzahl
der Partikeln auf den REM-Aufnahmen der Oberflächen von mit APMA/AAm oberflächenderivatisiertem
55D, mit Dextran oberflächenderivatisiertem
55D und mit Blaudextran oberflächenderivatisiertem
55D wurden ausgezählt
und in 16 dargestellt.
-
Wie
die Ergebnisse zeigen, gibt es keine signifikante Differenz zwischen
Dextran- und APMA/AAm-Oberflächen;
allerdings gibt es signifikant mehr Albumin auf Blaudextran-Oberflächen.
-
BEISPIEL 17
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Trocknungs- und Rehydratisations-Effekte
auf Albumin-Bindungen
-
Es
gab einige Bedenken, dass die Blaudextran-Oberfläche, wenn sie austrocknet,
einen Teil ihrer Albumin-bindenden Wirksamkeit verlieren könnte, da
die Oberfläche
extrem hydrophil ist. Daher wurden Untersuchungen zur Dehydratation/Rehydratation
durchgeführt.
Mit Blaudextran oberflächenbeschichtete
Proben von Pellethan 55D wurden im Ofen bei 50°C getrocknet und dann auf Albumin-Adsorption
getestet. Einige der getrockneten Proben wurden eine Stunde in PBS
rehydratisiert und dann auf Albumin-Adsorption getestet. Um die Albumin-Adsorption
zu testen, wurden die Proben 15 Minuten in 125I-Albumin
(0,08 mg/ml) inkubiert, anschließend in PBS gespült und in
einem Szintillationszähler
ausgezählt.
Wie die Ergebnisse in 17 erkennen
lassen, verringert das Austrocknen der Oberfläche seine Albumin-Wirksamkeit,
allerdings scheint die Rehydratation der getrockneten Proben diese
wiederherzustellen.
-
Beispiel 18
-
Die selektive Bindung
von Albumin an oberflächenbeschichtetes
Material
-
Die
selektive Bindung von Albumin an mit Blaudextran gepfropfte Oberflächen in
Anwesenheit von Fibrinogen wurde als nächstes bestimmt, indem eine
50/50-Mischung aus Albumin/125I-Fibrinogen
und 125I-Albumin/Fibrinogen eingesetzt wurde.
Fibrinogen war anwesend, um die nicht spezifische Bindung von Proteinen an
die Oberfläche
zu bestimmen und weil Oberflächen,
die bereitwillig Fibrinogen adsorbieren, hochgradig thrombogen sein
können.
Daher wurden die Proben 15 Minuten einer Mischung entweder aus Albumin/125I-Fibrinogen oder aus 125I-Albumin/Fibrinogen
ausgesetzt und anschließend
mit PBS gespült.
Im Anschluss an das Spülen
mit PBS wurden die Proben in einem Szintillationszähler ausgezählt. Wie
in 18 gezeigt, wiesen
die mit Blaudextran oberflächenbeschichteten
Proben trotz der Anwesenheit von Fibrinogen eine höhere Fähigkeit auf,
Albumin selektiv zu adsorbieren. Die Reversibilität der Albumin-Adsorption
an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Material wurde als nächstes
untersucht.
-
Beispiel 19
-
Die reversible Bindung
von Albumin an oberflächenbeschichtetem
Material
-
Die
reversible Bindung von Albumin wurde bestimmt, indem seine Elutionsfähigkeit
durch das Waschen mit 1%iger SDS untersucht wurde. Protein, das
im Anschluss an ein Waschen mit SDS an einer Oberfläche haften
bleibt, wird als denaturiert und irreversibel gebunden betrachtet
(vergleiche Rapoza et al. J. Biomedical Materials Research 24: 1263–1287 (1990)).
-
Die
Proben wurden deshalb fünf
Stunden in 125I-Albumin inkubiert, dann
entnommen und eine Stunde in einer 1%igen SDS-Lösung gewaschen. Wie 19 zeigt, wurden ungefähr 95% des
ursprünglich
an die mit Blaudextran gepfropfte Oberfläche adsorbierten Albumins während des
Waschens mit SDS entfernt. Diese Ergebnisse zeigen, dass adsorbiertes
Albumin nicht denaturiert und reversibel an die mit Blaudextran
oberflächenbeschichteten
Proben gebunden ist. Die Bindungsstelle von Albumin an mit Blaudextran
oberflächenbeschichteten
Proben wurde als nächstes
untersucht.
-
Beispiel 20
-
Die Bindungsstelle von
Albumin an oberflächenbeschichtetem
Material
-
Die
Bindungsstelle von Albumin an mit Blaudextran oberflächenbeschichteten
Pellethan 55D wurde untersucht, indem Blaudextran in der festen
Phase eingesetzt wird, um konkurrierend die Bindung des Albumins
an das auf die Oberfläche
des Polyurethans gepfropfte Blaudextran zu unterbinden. Proben von
mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
und unbeschichtetem Pellethan 55D wurden je 15 Minuten in PBS gespült, bevor
sie 15 Minuten in 125I-Albumin (0,08 mg/ml) inkubiert wurden.
Die Proben wurden dann entweder in PBS oder in gelöstes Blaudextran
enthaltender PBS gewaschen und in einem Szintillationszähler ausgezählt. Die Ergebnisse
sind in 20 dargestellt.
Wie aus 20 zu ersehen
ist, entfernte die Aufnahme von Blaudextran in die Pufferwaschlösung selektiv
ungefähr
95% des am oberflächenbeschichteten
Materials anhaftenden Albumins. Daher wird an oberflächenbeschichtetes
Material gebundenes Albumin mit dem Blaudextran auf der Oberfläche in Zusammenhang
gebracht.
-
Beispiel 21
-
Blut-Schlaufen-Versuch
von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Material
-
Pellethan
55D (mit einem Durchmesser von 2 mm und einer Länge von 30 cm) wurde mit Blaudextran oberflächenbeschichtet.
Eine Venenpunktion wurde ohne Antikoagulans in eine Kunststoffspritze
an einem menschlichen Wesen vorgenommen. Aliquoten von einem Milliliter
des Vollblutes wurden dann sofort in ein 12*75 mm Reagenzglas und
einen Probeschlauch aus unbeschichtetem Pellethan 55D gegeben. Ein
Ende jedes Polyurethan-Schlauches wurde um das andere Ende geschlungen
und über
ein Verbindungsteil aus Silikon damit verbunden. Eine Stoppuhr wurde
gestartet, sobald das Blut in die Proben eintrat. Die Polyurethan-Schläuche wurden
dann mit 9 U/min rotiert bis das Blut koagulierte. Das Reagenzglas
wurde vorsichtig alle 30 Sekunden gekippt, bis ein Klumpen zu sehen
war; die Stoppuhr wurde an diesem Punkt gestoppt und die Zeit wurde
protokolliert. Die Zeitdauer, in der 1 ml des frischen Vollblutes
in den Polyurethan-Schläuchen koagulierte,
wurde mit der Zeitdauer des Koagulierens im Reagenzglas verglichen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt.
-
-
Die
Ergebnisse in Tabelle 11 zeigen, dass sowohl mit Blaudextran oberflächenbeschichtete
als auch unbeschichtete Oberflächen
der Schlauchsysteme einen hemmenden Effekt auf die Koagulation von
Vollblut hatten. Das Blaudextran enthaltende Schlauchsystem hatte
einen genügend
großen
Effekt, um eine vollständige
Koagulation über
16 Stunden, in denen es rotiert wurde, zu verhindern. Daher vermindert
eine Oberflächenbeschichtung
mit Blaudextran offensichtlich die Thrombogenität von Pellethan 55D.
-
Beispiel 22
-
Im
Anschluss an die Koagulations-Untersuchungen wurde eine Gel-Elektrophorese mit
Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid (SDS-PAGE) an den Polyurethan-Schläuchen durchgeführt, um
zu bestimmen, ob eine Albumin-Beschichtung
auf der Oberfläche
des mit Blaudextran oberflächenbeschichteten
Materials vorlag. Beide Polyurethan-Oberflächen wurden intensiv mit PBS
gespült.
Die Schläuche
wurden dann in zwei Stücke geschnitten.
Ein Stück
jeden Schlauches wurde in SDS-PAGE-Pufferlösung gelegt und über Nacht
inkubiert, um das anhaftende Protein zu entfernen. Die Pufferlösung bestand
aus 62,5 mM Tris-HCl, 5% β-Mercaptoethanol,
10% Glycerol und 2,3% SDS in entionisiertem Wasser. Dann wurde mit
100 μl der
die eluierten Proteine enthaltenden Pufferlösung SDS-PAGE durchgeführt. Im
Anschluss an die Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brilliant
Blau eingefärbt,
und die Identität
des eluierten Proteins wurde durch Referenz zu den auf dem Gel enthaltenen
Molekuargewicht-Standards
bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experiments weisen darauf hin, dass
das hauptsächlich
an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Material adsorbierende Protein Albumin ist. Dagegen hatte unbeschichtetes
Material viel weniger adsorbiertes Albumin und proportional mehr von
Albumin verschiedene Proteine.
-
Beispiel 23
-
Das
jeweils andere Stück
der Polyurethan-Schlauchsysteme wurde über Nacht in 2,5%ige Glutaraldehyd-Lösung gegeben.
Mittels Raster-Elektronenmikroskopie
wurde dann die Oberfläche
jedes Schlauchsystems untersucht. Die REM-Aufnahmen zeigten eine
Anhäufung
von Thromben auf der Oberfläche
des unbeschichteten Materials. Dagegen gab es keine Thrombenbildung
auf der mit Blaudextran beschichteten Oberfläche. Tatsächlich gab es keinerlei offensichtliche
Zelladhäsion.
Die Methode der Oberflächenbeschichtung mit
Blaudextran vermindert also die Thrombogenität der Polyurethan-Oberfläche. Als
nächstes
wurde die Oberflächenbeschichtung
mit Blaudextran untersucht, um zu sehen, ob irgendeine Heparin-artige
Wirksamkeit vorlag.
-
Beispiel 24
-
ATIII-Wirksamkeit von
mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Material
-
Koagulation
kann auf mit Blaudextran oberflächenbeschichteten
Materialien aufgrund der Aktivierung von ATIII durch die drei Sulfonsäuregruppen
pro Farbstoffmolekül
verzögert
werden. Diese Wechselwirkung kann eine Heparinartige Aktivierung
von ATIII bewirken.
-
Daher
wurde die oberflächenvermittelte
Aktivierung von ATIII durch beschichtete Proben bewertet. Die Proben
wurden erst 15 Minuten in PBS gespült, bevor sie ATIII ausgesetzt
wurden. Im Anschluss an das Spülen
wurden die Proben 15 Minuten einem Überschuss an gereinigtem ATIII
(50 IU/ml) ausgesetzt. Nicht adsorbiertes ATIII wurde durch schnelles
Spülen
in Trisgepufferter salzhaltiger Lösung, pH-Wert von 7,4 bei 25°C (100 mM
NaCl und 50 mM Tris) entfernt. Die Menge von an der Oberfläche gebundenen
und aktivierten ATIII wurde dann ermittelt, indem die Proben mit
einem Überschuss
an Thrombin inkubiert wurden. Nach einer Inkubationszeit von 10
Minuten unter konstantem Mischen bei 25°C wurde das restliche Thrombin über die
Reaktion mit einem chromogenen Substrat (H-D-Phenylanalyl-L-pipecolyl-L-arginin-p-nitroaniliddichlorid)
in einem Spektralfotometer bestimmt. Die Veränderung in der Absorption bei
405 nm wurde dann bestimmt. Die Ergebnisse sind in 21 dargestellt. Wie die Ergebnisse veranschaulichen,
scheint die Oberflächenbeschichtung
mit Blaudextran einen gewissen Heparin-artigen Effekt aufzuweisen.
Dieser Heparin-artige Effekt ist vermutlich auf den Farbstoff Cibacron-Blau
in der Blaudextran-Beschichtung zurückzuführen.
-
Beispiel 25
-
Bakterielle Adhäsion an
mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Material
-
Die
Adhäsion
pathogener Bakterien an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem und an unbeschichtetem
Pellethan 55D wurde untersucht, um die Effektivität der Methode
der Oberflächenbeschichtung mit
Blaudextran in Hinblick auf das Vermeiden bakterieller Adhäsion zu
bestimmen. Staphylococcus epidermidis wurden für die Untersuchung zur bakteriellen
Adhäsion
ausgewählt,
da sie die häufigste
Ursache für
die durch medizintechnische Geräte
verursachten Infektionen sind.
-
Staph.
epidermidis wurden über
Nacht in Gehirn-Herz-Infusionslösung
vermehrt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren konzentriert
und drei Mal in isotonischer salzhaltiger Lösung gewaschen. Die Bakterien
wurden bis zu einer Konzentration von 7 × 106 cfu/ml
resuspendiert, und Proben von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
und unbeschichtetem Pellethan 55D wurden entweder in die Lösung unter
vorsichtigem Mischen bei 25°C über 2 Stunden
eingetaucht oder 15 Minuten in einer Albumin-Lösung vorinkubiert und anschließend zwei
Stunden in der Bakterienlösung
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben in steriler isotonischer
Kochsalzlösung
gespült
und dann in 5 ml einer sterilen Kochsalzlösung gegeben. Die Proben wurden
dann eine Minute mit Ultraschall bei 20 Watt behandelt. Nach der
Ultraschall-Behandlung wurden 50 μl der
Lösung,
die jetzt abgelöste
Bakterien enthielt, auf Platten gegeben, inkubiert und ausgezählt. Die
Ergebnisse sind in 22 dargestellt.
-
Die
Proben wurden eingefärbt
und unter einem Lichtmikroskop nach Ultraschall-Behandlung betrachtet.
Man konnte in der Untersuchung im Lichtmikroskop keine anhaftenden
Bakterien auf den Proben mehr erkennen, was darauf hinweist, dass
die Ultraschall-Behandlung die anhaftenden Bakterien abgelöst hat.
-
Wie
die Ergebnisse in 22 zeigen,
haften an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Material ungefähr
50% weniger Bakterien als an unbeschichtetem Material, wenn kein
Albumin anwesend ist. Diese Verringerung ist vermutlich auf die
hydrophile Oberfläche
des beschichteten Materials zurückzuführen. In
Anwesenheit von Albumin war das mit Blaudextran oberflächenbeschichtete
Material sogar in der Lage, die bakterielle Adhäsion um fast 100% zu senken.
-
Zusammenfassung der Methode
zur Oberflächenbeschichtung
mit Blaudextran
-
Die
Methode zur Oberflächenbeschichtung
mit Blaudextran umfasst die Pfropf-Copolymerisation von APMA/AAm
an Polyurethan-Oberflächen,
wobei Ce(IV)-Ionen verwendet werden. Dextran wird dann an diese hydrophile
Beschichtung mittels einer Schiff'schen-Base-Reaktion kovalent gebunden.
Der Farbstoff Cibacron-Blau wird dann an das gebundene Dextran kovalent
gebunden, so dass man das mit Blaudextran oberflächenbeschichtete Polyurethan
erhält.
-
Es
wurde gezeigt, dass das Binden von Albumin an oberflächenbeschichtetes
Material zu 95% spezifisch ist und sogar in Anwesenheit von Fibrinogen
stattfindet. Zweitens erscheint Albumin, das von unbeschichtetem
Material adsorbiert wird, denaturiert zu sein und kann nicht konkurrierend
verdrängt
werden. Im Gegensatz dazu werden 95% des an oberflächenbeschichtetes
Material gebundenes Albumin leicht durch eine 1%ige SDS-Lösung verdrängt. Drittens
wird die Bindung von Albumin an 95% der Oberfläche des oberflächenbeschichteten
Materials offensichtlich primär
durch das ortspezifische Binden des Proteins an das Blaudextran vermittelt.
Dies wird gestützt
durch die Beobachtung, dass zugefügtes (freies) Blaudextran konkurrierend
ungefähr
95% des bereits am oberflächenbeschichteten
Material vor-adsorbierten Albumins freisetzt.
-
Es
wurde gezeigt, dass das Binden von Albumin an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem
Material die Oberflächenaktivierung
der Koagulation hemmt, was sich aus der gemessenen Koagulationszeit
von Vollblut ergibt, die Adhäsion
von Blutplättchen
vermindert und die Bildung von Fibrin auf der Oberfläche verhindert.
Ebenfalls wurde gezeigt, dass mit der Methode zur Oberflächenbeschichtung
mit Blaudextran signifikant weniger Bakterien anhaften.
-
Thrombose
und Infektionen sind wahrscheinlich die beiden größten Hindernisse
bei der Verwendung künstlicher,
implantierbarer medizintechnischer Vorrichtungen. Die Materialien
dieser Vorrichtungen neigen dazu, die Bildung von Thromben zu verursachen
und sind Infektionsherd im Körper
für eine
Reihe von Bakterienarten. Durch Gerätschaften verursachte Infektionen
werden durch die Neigung dieser Organismen, an der Oberfläche der
Vorrichtung anzuhaften und zu siedeln, gefördert. Thrombenbildung kann
durch die Adsorption großer
Mengen zelladhäsiver
Proteine, beispielsweise Fibrinogen, an der Oberfläche der
Vorrichtung gefördert werden.
Dieses adsorbierte adhäsive
Protein tritt dann in Wechselwirkung mit den Plättchen-Membran-Rezeptoren GPIIB-IIIa
und möglicherweise
GPIb, was zu einer Ablagerung und Aktivierung von Blutplättchen führt. Die
Ablagerung und Aktivierung von Blutplättchen verursacht eine Anhäufung der
Blutplättchen
und letztlich Thrombenbildung. Um Thrombenbildung und Infektionen
zu vermeiden, wurde festgelegt, dass ein implantierbares Material
eine „aktive" Oberfläche besitzen
soll, die selektiv und reversibel Albumin mit einer hohen Affinität bindet,
ohne es zu denaturieren. Daher wurde ein Verfahren zur Modifizierung
bereitgestellt, das dem Zweck dient, die Fähigkeit eines implantierbaren
Polyurethans, Albumin zu binden, zu erhöhen.
-
Dieses
Verfahren schafft eine Oberfläche
eines Biomaterials mit einem Albumin-bindenden Farbstoff von hoher
Affinität,
der Albumin selektiv und reversibel bindet, indem eine erneuerbare,
endogene Albumin-Beschichtung auf der Oberfläche geschaffen wird, sobald
das Material mit einer physiologischen, Albumin enthaltenden Flüssigkeit
in Kontakt kommt. Es wurde gezeigt, dass die Bildung dieser Albumin-Beschichtung
die Tendenz des Materials, Thrombose auf der Materialoberfläche zu unterstützen, dadurch
verringert, dass die zelladhäsiven
Proteine und die koagulationsfördernden
Proteine davon abgehalten werden, an der Materialoberfläche zu adsorbieren.
Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die Beschichtung die Tendenz des
Materials, bakterielle Infektionen zu unterstützen, verringert, indem die
Adhäsion
pathogener Bakterien an der Materialoberfläche und Besiedlung mit diesen
darauf gemindert wird.
-
Die
Modifikationsmethode bietet ein Verfahren, nach dem ungefähr 95% der
Oberfläche
des Materials selektiv und reversibel Albumin binden.
-
HEPARIN-BESCHICHTUNG
-
Pfropfen
kann in stöchiometrischer
Weise in die Wege geleitet werden, um Oberflächen mit dem gewünschten
Maß an
Hydrophilie und der gewünschten
Menge an biowirksamen Kopplern zu erzeugen. Hydrophile Spacer-Monomere
(neutral, anionisch oder kationisch) können so ausgewählt werden,
dass man entsprechend geladene hydrophile Spacer erhält. Kopplungsmonomere
für Bioagenzien
können
auf der Grundlage ihrer funktionellen Seitengruppen, beispielsweise
-OH, -NH2, -CHO, -COOH, -NCO, ausgewählt werden,
die von den Acryl-artigen Monomeren benötigt oder hierfür gewünscht werden,
was durch 23 veranschaulicht wird.
-
Pfropf-Copolymerisation
auf Poly(etherurethan) mit Ce(IV)-Ionen ist das bevorzugte Mittel.
Die für
diesen Einsatz ausgesuchten Monomere sind Acrylamid (AAm), Acrylsäure (AA),
2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS), 2-Hydroxyethylmethacrylat
(HEMA) und N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid (APMA).
Diese Monomere wurden teilweise auf Grund ihrer Reaktivitäts- und
Wasserlöslichkeits-Charakteristika
ausgewählt.
AAm-, AA- und AMPS-Monomere wurden als biokompatible, hydrophile
Spacer-Monomere verwendet. HEMA und APMA wurden als biowirksame
Kopplungsmonomere für
Bioagenzien verwendet. AAm wurde extensiv als eine Matrix für die Affinitätschromatographie
verwendet. AAm ist ein neutrales hydrophiles Monomer; daher haben
Polymere von AAm wenig Proteinassoziation gezeigt. AMPS und AA sind
anionische hydrophile Monomere. Polymere von AMPS und Copolymere
von AMPS und AA haben, wie gezeigt wurde, Heparin-artige Wirksamkeit.
HEMA ist ein Hydroxylgruppen enthaltendes Monomer, und APMA ist
ein Aminogruppen enthaltendes Monomer.
-
Pfropfen
kann stöchiometrisch
in die Wege geleitet werden, um Oberflächen bereitzustellen, die das gewünschte Maß an Hydrophilie
und die gewünschten
Menge an Kopplern aufweisen. Hydrophile Spacer-Monomere (neutral,
anionisch oder kationisch) können
so ausgewählt
werden, dass man entsprechend geladene hydrophile Spacer erhält. Kopplungsmonomere
können
auf der Grundlage ihrer funktionellen Seitengruppen, beispielsweise
-OH, -NH2, -CHO, -NCO, ausgewählt werden,
die für
das Immobilisieren von Heparin benötigt oder gewünscht werden.
-
Entweder
wird das AAm- oder das AMPS-Monomer als hydrophiles Spacer-Monomer verwendet.
Das APMA-Monomer wird als Kopplungsmonomer verwendet. AAm wurde
extensiv als eine Matrix für
die Affinitätschromatographie
verwendet. AAm ist ein neutrales hydrophiles Monomer; daher haben
Polymere von AAm wenig Proteinassoziation gezeigt. APMA ist ein
Aminogruppen enthaltendes Monomer, das daher das Anbinden von Heparin
ermöglicht.
-
Heparin
wird kovalent durch eine stabilisierte Schiff'sche Base-Reaktion (reduktive Aminierung)
an die Aminogruppen des APMA gebunden. Das Heparin wird unter Verwendung
von entweder Natriumperiodat oder Salpetersäure oxidiert. Beide Oxidationsmethoden
erzeugen reaktive Aldehydgruppen. Diese Aldehydgruppen reagieren
mit den primären
Aminen auf APMA zu Iminen. Die Imine werden unter Verwendung von
Natriumcyanborhydrid stabilisiert.
-
Das
folgende Beispiel 26 veranschaulicht eine Methode zur Heparinisierung
einer Polyurethan-Oberfläche.
Gegenwärtig
liefert diese Methode Polyurethan-Oberflächen mit ungefähr fünffacher
Heparin-Wirksamkeit im Vergleich zu Carmeda®-beschichteter
Polyurethan-Oberflächen.
Mit der beschriebenen heparinisierten Oberfläche ausgerüstete Chandler-Schleifen haben
gezeigt, dass diese Beschichtung Blutkoagulation während einer
zweistündigen
Untersuchung unterband.
-
Beispiel 26
-
Die
Methode zur Oberflächenbeschichtung
mit Heparin beginnt mit der Pfropf-Copolymerisation von Monomeren
von Acrylamid (AAm) und N-(3-Aminopropyl)methacrylamid
(APMA) auf sauberen Polyurethan-Oberflächen mittels Ce(IV)-Ionen.
Das Ce(IV)-Ion bildet ein freies Radikal auf der Polyurethan-Oberfläche, das
die Pfropf-Copolymerisation der Acrylamide (9a und 9b)
startet. Das Ausmaß der
Oberflächenaminierung
(die Pfropf-Copolymerisation von APMA und AAm), die auf der Polyurethan-Oberfläche stattfindet, kann
durch Einfärben
der Oberfläche
mit dem Farbstoff Ponceau S., einem negativ geladenen Farbstoffmolekül, bestimmt
werden. Dieser Farbstoff bindet ionisch an primäre Amine auf der aminierten
Oberfläche.
Nach dem Einfärben
wird der Farbstoff mit SDS von der Oberfläche entfernt und durch Spektralphotometrie
bei 520 nm quantifiziert.
-
Diese
aminierte Oberfläche
wird dann verwendet, um Heparin zu koppeln. Das Binden von Heparin umfasst
zunächst
die Oxidation mit Natrium-m-Periodat (NaIO4),
so dass Aldehydgruppen (10)
entstehen. Diese Aldehydgruppen werden dann kovalent an primäre Aminogruppen
in dem gepfropften APMA/AAm durch reduktive Aminierung (Schiff'sche-Base-Reaktion)
gebunden (11). Natriumcyanborhydrid
(NaCNBH3) wird verwendet, um die Imin-Verbindungen
zu stabilisieren (12).
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Die
Menge an gebundenem Heparin kann über das Einfärben der
Oberfläche
mit dem Farbstoff Toluidin-Blau, einem positiv geladenen Farbstoff,
der ionisch an das negativ geladene Heparin bindet, bestimmt werden.
Toluidin-Blau wird
ebenfalls durch SDS von der Oberfläche entfernt und durch Spektralphotometrie bei
640 nm quantifiziert. Die Heparin-Wirksamkeit der Oberfläche wird
durch eine Thrombin-ATIII-Wirksamkeitsprüfung bestimmt. Die Prüfung beginnt
damit, die mit Heparin derivatisierten Proben einem Überschuss an
ATIII auszusetzen. Nicht adsorbiertes ATIII wird dann durch rasches
Spülen
in Tris-gepufferter salzhaltiger Lösung entfernt. Die Menge an
oberflächengebundenem
und aktiviertem ATIII wird dann durch Inkubieren der Proben mit
einem Überschuss
an Thrombin bestimmt. Nach der Inkubation wird das überschüssige Thrombin durch
die Reaktion mit einem chromogenen Substrat in einem Spektralfotometer
gemessen. Die Veränderung in
der Extinktion bei 405 nm wird gemessen. Die Ergebnisse sind in 24 zu sehen.
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Beispiel 27
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Die
Methode zur Oberflächenderivatisierung
mit dem Farbstoff Cibacron-Blau
beginnt mit der Pfropfpolymerisation von AMPS- und HEMA-Monomeren
auf die Polyurethan-Oberfläche
mit Ce(IV)-Ionen. Das Ce(IV)-Ion bildet ein freies Radikal auf der
Polyurethan-Oberfläche,
das die Pfropf-Copolymerisation der Monomere startet. Das HEMA-Monomer
enthält
eine Hydroxylgruppe, die dann für
das Koppeln des Farbstoffes Cibacron-Blau gebraucht wird.
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Kovalent
gebundenen Farbstoff Cibacron-Blau enthaltende Polyurethan-Oberflächen wurden
hergestellt, indem die Polyurethan-Proben zunächst 2 Stunden bei Umgebungstemperatur
in die folgende entgaste Pfropflösung
gegeben wurden:
40 g 2-Acrylamid-2-methylpropansulfonsäure (AMPS)
10
g 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3
g Salpetersäure
70
ml entionisiertes Wasser
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Im
Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser
gespült.
Die mit AMPS/HEMA gepfropften Proben wurden dann über Nacht
in eine Lösung
des Farbstoffes Cibacron-Blau gegeben, die aus 1,0 g des Farbstoffes
Cibacron-Blau, 4,0 g NaCl und 12,0 g NaHCO3 in
200 ml entionisiertem Wasser bestand. Die eingefärbten Proben wurden dann gründlich in
entionisiertem Wasser gespült.