DE69333050T2

DE69333050T2 - Anordnung zur probenbestimmung

Info

Publication number: DE69333050T2
Application number: DE69333050T
Authority: DE
Inventors: J. Steve LACKIE
Original assignee: Sapidyne Inc Woburn; Sapidyne Inc
Current assignee: Sapiddyne Instruments Inc(ndgesdstaates Delaw
Priority date: 1992-08-03
Filing date: 1993-07-23
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2013-07-24
Also published as: EP0606460A1; US6120734A; DE69333050D1; JP2006258824A; EP0606460B1; US5554340A; JP2005321416A; ATE242996T1; WO1994003104A1; CA2518356A1; CA2518356C; JP2004069716A; US5372783A; DK0606460T3; JP4102837B2; EP0606460A4; CA2120481C; CA2120481A1; JPH07500191A; JP3534756B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf chemische und biochemische Gehaltsbestimmungen und insbesondere auf ein verbessertes optisches Gerät und Verfahren für Fluoreszenzbestimmungen.
Analysen, bei denen Teilmengen einer im Test begriffenen Probe und ein Reagens oder mehrere Reagenzien in verschiedener Weise in hochgradig spezifischen Reaktionen zur Reaktion gebracht werden, um Ligand/Verbindungskomplexe wie etwa Antigen/Antikörper oder ähnliche Komplexe zu bilden, die dann beobachtet werden können, um die Probe auf einen Titer eines vorbestimmten Anteils der Probe bestimmen zu können, sind allgemein bekannt. Typischerweise wird ein Antikörper verwendet, um das Vorhandensein eines Antigens zu untersuchen, für das der Antikörper spezifisch ist, jedoch sind derartige Untersuchungen ausgedehnt worden auf quantitative Bestimmungen von Haptenen, wie etwa Hormonen, Alkaloiden, Steroiden, Antigenen, Antikörpern, Nukleinsäuren und deren Fragmenten, und der Begriff "Ligand/Verbindung", wie er hier verwendet wird, sollte in diesem weitgefaßten Sinn verstanden werden.
Sensitive Immunitätsprüfungen verwenden typischerweise Indikatortechniken, bei denen ein markierter Bestandteil des Komplexes eingebaut wird, z. B. in das Reagens, wobei dann das nicht in einem Komplex gebundene markierte Reagens von dem im Komplex gebundenen Reagens getrennt wird. Der Komplex kann danach durch Beobachten eines Signals von der Markierung quantitativ bestimmt werden. Radioisotope, fluoreszierende und chemilumineszente Moleküle, colorimetrische Markierungen und andere Indikatoren sind zum Markieren von Bestandteilen bzw. Anteilen des Komplexes verwendet worden, wobei geeignete Vorrichtungen zum Einsatz kommen, um die Strahlung von der Markierung festzustellen und zu messen.
Bei solchen Untersuchungen, bei denen zumindest eine Komponente des Verbindungskomplexes anfangs an ein Feststoffsubstrat in Vorbereitung der Bildung des Komplexes gebunden ist, entsteht ein grundsätzliches Problem aufgrund der bezeichnenderweise langen Zeit, die erforderlich ist, um diese Komponente an das Substrat zu binden. Zum Beispiel benötigen Fluoreszenzuntersuchungen, wie solche, die in der üblichen 96-Mulden-Mikrotiter-Platte durchgeführt werden, Zeiten in der Größenordnung von Stunden, bis die Bindung einer Komponente an die Feststoffphase auftrat, und dies ungeachtet solcher Hilfsmittel wie Erwärmen, Schütteln und dgl.. Es ist verständlich, daß durch Vergrößerung des Oberflächeninhalts der Feststoffphase, der für die Verbindung bzw. Beschichtung mit einem Ligand zur Verfügung gestellt wird, der Verbindungsverzug erheblich reduziert werden kann. Demgemäß lehrt der Stand der Technik bezüglich derartiger Feststoffphasenbestimmungen (wie Mikrotiter-Mulden-Untersuchungen, Eintauchstab-Untersuchungen und dergleichen) auch die Verwendung kleiner Partikel bzw. Kügelchen als Feststoffphase.
Der Durchfluß der Probe durch eine Partikelbettpackung beschleunigt die Reaktionen zwischen dem Probenligand, der untersucht wird, und einer Verbindung, die auf der Oberfläche der Partikel immobilisiert ist. Zu dieser verstärkten Reaktionsbereitschaft tragen wahrscheinlich mehrere Faktoren bei: Die reduzierte Diffusionsdistanz, das konstante Schütteln der Probe aufgrund der turbulenten Strömung und die hohe Dichte von Verbindungsplätzen im Reaktionsvolumen aufgrund der dargebotenen großen Oberfläche.
Bekannte Partikeluntersuchungen umfassen den allgemein bekannten Kügelchenagglutinationstest einschließlich quantitativer oder semiquantitativer Gleitagglutination und Techniken, bei denen die zusammengebackenen Kügelchen von den nicht zusammengebackenen Kügelchen durch Hindurchleiten durch einen mechanischen Filter getrennt werden. Eine andere bekannte Partikeluntersuchung ist diejenige, die im US-Patent Nr. 4.780.423 beschrieben ist, bei der Partikel mit kontrollierter Porosität, die einen auf ihnen immobilisierten Ligand aufweisen, in Suspension inkubiert und gewaschen werden. Das Waschen kann eine Sedimentierung und erneute Suspension der Partikel beinhalten. Die resultierende Fluoreszenz kann entweder von den konzentrierten oder den suspendierten Partikeln gelesen werden. Bei noch einer anderen Untersuchung sind die Partikel an eine Membran bzw. einen Filter gebunden, wodurch die Probe dann hindurchgegossen wird. Diese Technik ist angenommenermaßen auf enzymcolorimetrische Erkennungen beschränkt. Wo Partikel in einer Wassersuspension inkubiert werden, sind die durchschnittlichen Diffusionsdistanzen, die der freie Ligand in der Probe durchqueren muß, und die Zeit, die erforderlich ist, um die Komplexbildung zur Vollendung zu bringen, tendenziell sehr groß.
US-A-4.425.438 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Prüfung einer Testsubstanz unter Verwendung einer primären Absorptionssubstanz, um es selektiv nur einem Quantum eines analytischen Reagens proportional der Menge der Testsubstanz zu ermöglichen, hindurch zu strömen, wenn Testsubstanz und analytisches Reagens mit dem ersten Absorbens in Kontakt gebracht werden. Ein analytisches Absorbens ist in einer Reihe von Zonen zum sequentiellen Absorbieren des analytischen Reagens untergebracht, das durch das primäre Absorbens hindurchfließt, so daß die Erfassung der letzten Zone des absorbierten analytischen Reagens die Menge der Testsubstanz anzeigt. Das Verfahren beinhaltet das Hindurchleiten der Testsubstanz und des analytischen Reagens durch das primäre Absorbens und dann das analytische Absorbens, gefolgt von der Erfassung der letzten Zone, in der das analytische Reagens absorbiert ist. Die Vorrichtung umfaßt einen Trichter mit dem primären Absorbens in diesem zum Hinleiten der Testsubstanz und des analytischen Reagens zu einer das analytische Absorbens enthaltenden engen Röhre.
Die vorliegende Erfindung liegt in dem, was in den Ansprüchen beansprucht ist.
Es ist somit eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes optisches Untersuchungssystem zu schaffen, bei dem die Kinetik und Sensitivität verbessert sind durch Vergrößerung der Oberfläche der Feststoffphase, Verringerung der Diffusionsdistanzen und Verbesserung der optischen Kopplung unter der Feststoffphase mit der Erregungslichtquelle und der Kopplung der Feststoffphase mit dem Detektor. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine neuartige Fließzelle zu schaffen, die die gewünschte Verbesserung zwischen der Probe und einem Detektor herbeiführt. Noch weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung bestehen darin, ein solches Untersuchungssystem zu schaffen, das ein kleines Probenvolumen erfordert und besonders geeignet ist für eine Untersuchung des ganzen Blutes; ein Untersuchungssystem zu schalten, bei dem die Ligand/Verbindungsreaktion auf einen Einwegposten beschränkt ist, der ohne weiteres in das optische System der Fließzelle einsetzbar und aus diesem herausnehmbar ist; und ein solches Un tersuchungssystem zu schaffen, bei dem sämtliche der Komponenten des gewünschten Komplexes außer dem zu untersuchenden Probenanteil im vorhinein vorausgesetzt sind.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind zum Teil offensichtlich und werden sich zum Teil im Nachfolgenden ergeben. Im allgemeinen werden die vorstehenden und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung durch ein System zur Untersuchung einer Flüssigprobe erreicht, das typischerweise eine Identifizierungskennzeichnung bzw. Markierung verwendet, mit der Aufgabe, bei Erregung eine elektromagnetische Strahlung zu emitieren, wobei das System eine Fließzelle mit einer hohlen, lichtdurchlässigen Leitung für einen Flüssigkeitsdurchfluß durch diese und eine oder mehrere getrennte poröse Massen aus lichtdurchlässigem Material in der Leitung umfaßt, die Porosität der Masse aus durchlässigem Material so gewählt ist, daß ein Flüssigkeitsdurchfluß der Probe durch diese hindurch möglich ist und zumindest ein Anteil eines jeweiligen Ligand/Verbindungskomplexes, z. B. ein spezifisch bindender Ligand, etwa durch Vorbeschichtung auf den Oberflächen jeder Masse immobilisiert ist.
Bei einer Ausführungsform umfaßt die Masse eine Mehrzahl von vorzugsweise im wesentlichen lichtdurchlässigen Partikeln, die, insbesondere wenn der gebildete Komplex eine fluoreszierende Markierung aufweißt, sowohl für die erforderliche Strahlung zur Erregung der Fluoreszenz als auch für die erregte Fluoreszenz durchlässig sind. Die Partikel sind typischerweise Kügelchen mit Abmessungen innerhalb eines spezifischen Durchmesserbereichs und können, etwa durch Sintern oder dergleichen, vorgeformt sein. Statt dessen kann die Masse durch Ansetzen an einer flüssigkeitsdurchlässigen Sperreinrichtung in der Leitung gebildet sein. Im letzteren Fall ist die Sperreinrichtung in der Leitung so angeordnet, daß zumindest eine Wand einer Kammer gebildet ist, wobei die Durchlässigkeit der Sperreinrichtung ausreichend kleiner ist als der genannte Bereich, so daß in einer Flüssigkeitsströmung durch die Leitung mitgeführte Partikel von der Sperreinrichtung aufgefangen werden und sich zur Bildung der porösen Masse in der Kammer ansetzen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine Linseneinrichtung zur Lichtbündelung, durch die hindurch die Leitung einen hohlen rohrförmigen Kanal bildet, der sich quer zur optischen Achse der und durch die Fokuszone der Linseneinrichtung erstreckt. Typischerweise umfaßt die Linseneinrichtung eine Mehrzahl von Linsen, und die Leitung erstreckt sich durch eine dieser Linsen. Soll das System mit einer Identifizierungskennzeichnung bzw. Markierung mit der Aufgabe, bei Erregung elektromagnetische Strahlung zu emitieren, verwendet werden, muß die Linseneinrichtung in der Lage sein, sowohl die Erregung als auch die Emissionsstrahlung zu bündeln.
Die Erfindung umfaßt demgemäß die Vorrichtung mit der Konstruktion, Kombination von Elementen und Anordnung von Teilen und das Verfahren mit den einzelnen Schritten und dem Bezug eines oder mehrerer solcher Schritte in Bezug auf jeden der anderen, wie es sämtlich in der nachfolgenden detaillierten Beschreibung beispielhaft ausgeführt ist, wobei der Umfang der Anmeldung in den Ansprüchen angegeben ist.
Für ein volleres Verständnis der Art und Aufgaben der vorliegenden Erfindung ist auf die folgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen zu verweisen, in denen gleiche Bezugszahlen in den einzelnen Zeichnungen zur Bezeichnung gleicher Teile verwendet werden; es zeigt:
1 eine schematische Darstellung einer Untersuchungsvorrichtung im Querschnitt, die die Prinzipien der vorliegenden Erfindung verkörpert,
2 einen schematischen Querschnitt einer Ausführungsform der Fließzelle der vorliegenden Erfindung,
3 ein Querschnitt der Fließzelle nach 2 quer dazu,
4 einen schematischen Querschnitt einer Abwandlung der Fließzelle nach 2,
5 einen schematischen Querschnitt einer weiteren Abwandlung der Fließzelle nach der vorliegenden Erfindung,
6 einen schematischen Querschnitt einer Abwandlung der Fließzelle nach 5,
7 einen schematischen Querschnitt einer weiteren Abwandlung der Fließzelle nach 5, und
8 einen schematischen Querschnitt noch einer weiteren Ausführungsform der Fließzelle nach der vorliegenden Erfindung.
In 1 ist eine beispielhafte Vorrichtung 20 zur Untersuchung einer Flüssigprobe gezeigt, die typischerweise ein optisches System mit einer Lichtquelle 22 zur Lieferung einer Erregungsstrahlung, einen Lichtdetektor 24 zur Erfassung von durch die Erregungsstrahlung angeregtem Licht, einen Strahlteiler wie etwa einen dichroitischen bzw. halbdurchlässigen Spiegel 26 und einen Kollimator 28 verwenden kann. Die Ausführungsform nach den 1, 2 und 3 wird, im Interesse einer einfachen Darlegung, bei einer Verwendung insbesondere im Zusammenhang mit einer Fluoreszenz-Immununtersuchung beschrieben, wobei sich jedoch versteht, daß sie nicht in dieser Weise beschränkt ist. Der Ausdruck "Licht", wie er hier verwendet wird, ist so zu verstehen, daß Wellenlängen im sichtbaren Spektrum wie auch solche im nahen Infrarot- und Ultraviolettbereich ebenso umfaßt werden. In gleicher Weise ist der Ausdruck "Erregung" so zu verstehen, daß eine Erregung von Fluoreszenz, polarisiert oder nicht, etwa durch Strahlung, die Erregung von Chemolumineszenz durch chemische Mittel, die Emission durch Reflexion von Licht von Chromogenen und dergleichen umfaßt werden.
Die vorstehenden Elemente des optischen Systems sind typischerweise in einem Rahmen (nicht gezeigt) in einem festen optischen Verhältnis zueinander angeordnet, wie es im folgenden ausführlicher beschrieben wird. Die Erfindung umfaßt ferner eine Fließzelle 30, die insbesondere in vergrößerter Form in den 2 und 3 gezeigt ist und bei dieser Ausführungsform von einer Linseneinrichtung 32 zur Lichtbündelung gebildet ist, die als ein Linsenverbundsystem mit einer Bündelungslinse 33, typischerweise aus Glas, einem Polymer mit hohem Molekulargewicht oder dergleichen gezeigt ist. Die Linse 33 zeichnet sich dadurch aus, daß sie einen langgestreckten hohlen Kanal bzw. eine flüssigkeitsführende Leitung 34 enthält, in einer Ausrichtung quer zur optischen Achse der Linse 32 und mit einem Durchgang, typischerweise mit kreisförmigem Querschnitt, durch die Linse 33. Zumindest ein Bereich dieser zylindrischen Leitung, die Reaktionskammer 36, ist in der Fokuszone der Linseneinrichtung 32 angeordnet.
Es sei somit zum Beispiel angenommen, daß eine Flüssigkeit, die einen Ligand enthält, der als solcher oder über eine geeignete Markierung zu einer Emission wie etwa Fluoreszenz angeregt werden kann, die Kammer 34 durchquert und entsprechend dort zu einer Emission durch Erregungsstrahlung angeregt wird, die auf die Kammer 34 durch die Linseneinrichtung 32 gebündelt wird. Diese Fluoreszenzemission wird dann durch die Linseneinrichtung zu einem Detektor 24 geleitet, wo, unter der Annahme, daß der Detektor zum Beispiel eine elektrische Ausführung hat, entsprechende elektrische Signale erzeugt und beurteilt werden können, um die Fluoreszenz zu bewerten.
Um ein besseres Signal-Ligand-Verhältnis zu schaffen, weist die in 4 gezeigte Ausführungsform eine mechanische flüssigkeitsdurchlässige Sperr- bzw. Siebeinrichtung 38 auf, bei entsprechender Abmessung in der Leitung 34 angrenzend an die Fokuszone der Linseneinrichtung 32 angeordnet, um so den Transport von Partikeln bzw. Kügelchen 40 von vorbestimmter Größe in einem Durchflußstrom durch die Leitung aufzuhalten. Derartige Kügelchen sind im wesentlichen durchlässig sowohl für die Erregungsstrahlung als auch für die angeregte Fluoreszenz und sind zu diesem Zweck typischerweise von Polymethylmethacrylat, einem Styrol-Divinylbenzol-Copolymer oder dergleichen gebildet. Die Kügelchen 40 sind mit zumindest einem Anteil des Antikörper/Antigen-Komplexes, z. B. einem spezifischen Bindeligand, zum Beispiel einem Antigen und einem Antikörper dazu, auf zumindest einem Bereich der Oberfläche des Kügelchens beschichtet.
Die Sieböffnung oder Durchlässigkeit des Siebes 38 ist so gewählt, daß ein freier Durchfluß von Probenflüssigkeit und deren Bestandteilen ermöglicht ist, während der Durchfluß der beschichteten Kügelchen aufgehalten und dadurch eine Masse von Kügelchen 40 am Sieb und in der Fokuszone der Linseneinrichtung 32 angesetzt wird. Die Partikelgröße der Kügelchen ist so gewählt, daß sie ein Minimum beträgt, jedoch unter der Voraussetzung, daß, wenn sich eine Masse von Kügelchen am Sieb 38 ansetzt, die Probenbestandteile noch frei durch die angesetzte Masse hindurch gelangen können. Typischerweise liegt eine Kügelchengröße, bei der gut mit vollständigem Blut als Probe gearbeitet werden kann, im Bereich von 50 μm bis 250 μm, vorzugsweise etwa 98 μm. Die Kügelchengröße hängt natürlich in gewissem Maß von der Natur der Probe ab (z. B. Blut, Nahrungsmittel, Urin, Prozeßstrom und dergleichen). Die Öffnungsgröße ist natürlich abhängig von dem Durchmesserbereich der im System zu verwendenden Kügelchen, aber üblicherweise ist für Kügelchen von etwa 98 μm Durchmesser eine Sieböffnung von etwa 50 μm angebracht. Somit muß die Probenflüssigkeit, wenn sie durch die Leitung 34 hindurchfließt, durch die Zwischenräume der angehäuften Masse beschichteter Kügelchen 40 hindurchgelangen, was eine sehr kleine Diffusionsdistanz zur Folge hat, über die die untersuchte Komponente laufen muß, um mit der Beschichtung auf den Kügelchen einen Komplex zu bilden. Diese kleine Diffusionsdistanz, verbunden mit dem langen, gewundenen Weg der Probe durch die angehäufte Masse und das hohe Oberflächen/Volumen-Verhältnis der Kügelchen ermöglicht ein sehr effizientes Auslösen der untersuchten Komponente aus der Probe. Dieses Merkmal der vorliegenden Erfindung ist bedeutsam, insoweit als die Diffusionszeit um das Quadrat der Diffusionsdistanz reduziert wird. Es ist ferner zu bemerken, daß die gesamte Feststoffphase in der angehäuften Masse enthalten ist, ein sehr kleines Volumen (z. B. etwa 0,02 cm³ für eine typische Leitung von 0,18 cm Durchmesser) und in die Linseneinrichtung 32 "versenkt" ist, wodurch eine hohe numerische Apertur-Lichtkopplung zwischen dem Erregungs- und Detektorsystem geschaffen wird. Da das Fluoreszenzsignal um die vierte Potenz der numerischen Apertur erhöht wird, ist die hohe numerische Apertur-Lichtkopplung sehr bedeutsam.
In Ausführung der Erfindung, gezeigt in 4, wird eine Menge von Kügelchen 40 vorzugsweise mit einem geeigneten Ligand vorbehandelt, der auf den Oberflächen der Kügelchen durch Adsorption oder andere bekannte Immobilisierungstechniken immobilisiert wird, und in einer Suspensionsflüssigkeit suspendiert. In Fällen, in denen die Kügelchen nicht für gewöhnlich ohne weiteren eine stabile Suspension in der Suspensionsflüssigkeit bilden, können sie in einen Wirbelmischer (nicht gezeigt) oder dergleichen Mischer eingegeben werden, der die Kügelchen in einer Suspension, typischerweise einer wässrigen, durch Bewegung hält. Eine gewünschte Teilmenge der Kügelchensuspension wird aus dem Wirbelmischer etwa von einer Pumpe (nicht gezeigt) abgesaugt und in die Leitung 34 eingebracht, in der der Fluß der Kügelchen durch das Sieb 38 aufgehalten wird, was eine Anhäufung oder Masse von Kügelchen 40 in der Reaktionskammer 36 herbeiführt. Man läßt dann eine Teilmenge der zu untersuchenden Probenlösung durch die Leitung 34 und die Masse von Kügelchen 40 in der Reaktionskammer 36 fließen, mit der Wirkung der Bildung eines Ligand/Verbindungskomplexes auf der Oberfläche der Kügelchen. Wie allgemein bekannt ist, wird bei kompetitiven Untersuchungen, bevor man die Probenlösung durch die Fließzelle fließen läßt, die Probenlösung zunächst mit einem Markierungsreagens behandelt und der Inkubation überlassen. Handelt es sich bei der Untersuchung um eine Sandwichuntersuchung, wird die Probenlösung durch die Fließzelle geleitet, dann wird ein markierter Antikörper durch die Zelle geleitet, und die Kügelchenmasse wird einer Waschstufe unterzogen. Wie dem Fachmann allgemein bekannt ist, kann eine markierte, typischerweise fluoreszierende Komponente entweder das Komplement oder die konjugierte Verbindung zu dem oder ein Analogon des immobilisierten Ligands sein, je nach dem, ob eine kompetitive oder Sandwichuntersuchung durchzuführen ist. Die Identifizierungskennzeichnung bzw. Markierung ist üblicherweise ein fluoreszierender Farbstoff, wie etwa ein Fluoresceinfarbstoff, Acridinfarbstoff oder dergleichen, wie es insgesamt dem Fachmann allgemein bekannt ist. In jedem Fall muß der resultierende Ligand/Verbindungskomplex die gewünschten an den Komplex gebundenen Farbstoffanteile enthalten. Läßt man eine Waschpuffersubstanz durch die Masse der Kügelchen fließen, werden sodann sämtliche nicht zur Reaktion gekommenen Materialien und insbesondere irgendwelche freie Farbstoffkomponenten ausgewaschen, wobei lediglich diejenigen gefärbten Anteile, wie sie auf den Kügelchen immobilisiert sind, zurück bleiben. Sodann wird die Lichtquelle 22 aktiviert, um den Erregungslichtstrahl 23 (in gestrichelten Linien gezeigt) zu erzeugen, der seinerseits zum Spiegel 26 durch die Kollimatorlinse 28 geleitet wird, so daß der kollimierte Strahl auf die Linseneinrichtung 32 reflektiert wird. Letztere bündelt den Erregungsstrahl auf eine Fokuszone, in der die Masse der Kügelchen 40 in der Reaktionskammer 36 angeordnet ist, und die Erregungsstrahlung regt die Fluorophore auf den Kügelchen 40 zur Fluoreszenz an. Diese Fluoreszenz wird durch die Linse 32 übertragen und durch den Strahlteilerspiegel 26 zum Detektor 24 geleitet. Nachdem die Messungen vorgenommen worden sind, kann die Masse der Kügelchen 40 ohne weiteres aus der Reaktionskammer 36 entnommen werden, indem sie einfach durch die Leitung 34 zurückgespült werden.
Wie insoweit beschrieben, ist die Technik des Füllens der Reaktionskammer aus einer Suspension bzw. einem Pool vorbehandelter Kügelchen offensichtlich der Automation zugänglich, wobei die Komponenten für spezifische Untersuchungen, wie etwa die Art der vorbehandelten Kügelchen, die Probenlösung, das Markierungsreagens und dergleichen durch geeignete Ventile auswählbar sind, die den Fluß der Materialien aus jeweiligen Vorratsbehältern steuern. Jedoch ist die vorliegende Erfindung auch ohne weiteres für eher tragbare Systeme adaptierbar, bei denen die Masse der Kügelchen und die Reagenzien Wegwerfartikel sind.
Während zum Beispiel die Leitung 34 in 3 einfach als Kanal durch die Fokuszone der Linseneinrichtung 32 quer zur optischen Achse der Linse gezeigt ist, ist bei der in 5 gezeigten Ausführungsform die Leitung 34 von einem langgestreckten Hohlraum 34A mit gleichförmigem Durchmesser in gleicher Weise durch die Linse 33 und einer langgestreckten lichtdurchlässigen Röhre 42 mit einem gleichförmigen Durchmesser gebildet, der etwas kleiner ist als derjenige des Hohlraums 34A, so daß die Röhre 42 in den Hohlraum eingesetzt und aus diesem herausgenommen werden kann. Das Sieb 38 ist so in der Röhre 42 angeordnet, daß letzteres im Hohlraum 34A angrenzend an die Fokuszone der Linse positioniert werden kann.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der Fließzelle nach der vorliegenden Erfindung, wie sie in 6 gezeigt ist, ist die Leitung 34 in gleicher Weise von einem langgestrecktem Hohlraum 34A von gleichförmigem Durchmesser durch die Linse 33 und einer langgestreckten lichtdurchlässigen Röhre 42A mit einem gleichförmigen Durchmesser gebildet, der geringfügig kleiner ist als derjenige des Hohlraums 34A, so daß die Röhre 42 in den Hohlraum eingesetzt und aus diesem herausgenommen werden kann. Siebe 38A und 38B sind so in der Röhre 42 in einem gegenseitigen Abstandsverhältnis angeordnet, daß eine Reaktionskammer 44 in der Röhre gebildet ist. Wie bei der Ausführungsform nach 5 kann die Reaktionskammer 44 im Hohlraum 34A angrenzend an die Fokuszone der Linse positioniert werden. In der Kammer 44 ist eine Mehrzahl von Kügelchen 40 mit Abmessungen in einem spezifischen Durchmesserbereich enthalten, wobei die Sieböffnung der Siebe ausreichend kleiner ist als der Bereich der Durchmesser der Kügelchen, so daß die letzteren von den Sieben in der Kammer 44 aufgefangen werden, um eine poröse Masse zu bilden, die im wesentlichen in der Fokuszone der Linse positionierbar ist. Die Kügelchen in der Ausführungsform nach 6 sind vorzugsweise mit dem gewünschten spezifischen Bindeligand vor Einbringung in die Kammer 44 vorbeschichtet.
Bei den beiden Ausführungsformen nach 5 und 6 versteht sich, daß die Röhren 42 vorzugsweise ohne weiteres in den Hohlraum 34 bzw. 34A jeweils einsetzbar und aus diesem herausnehmbar sind und somit als "Wegwerfartikel" gelten können. Insbesondere bietet sich der in 6 gezeigte "Wegwerfartikel" für eine Vorbehandlung im Labor und Verpackung in hermetisch verschlossenen Behältern für einen bequemen Vertrieb und Gebrauch an. Bei den beiden Ausführungsformen nach den 5 und 6 sind die sowohl die Linse 32 als auch die Röhre 42A bildenden Materialien so ausgewählt, daß ihre jeweiligen Brechungszahlen im wesentlichen zusammen passen. Um die optimale Lichtkopplung zwischen der Röhre 42A und der Linse 32 zu schaffen, wird eine mit der Brechungszahl zusammenpassende Flüssigkeit vorzugsweise um die Röhre in dem Zwischenraum zwischen der Röhre und der Innenwand des Hohlraums 34A angeordnet.
Es versteht sich, daß die Masse der Kügelchen 40 bei der Ausführungsform nach 6 zum Beispiel durch die gleiche Technik gebildet werden kann, wie sie zur Schaffung der Kügelchenmasse nach 5 verwendet wurde, d. h. indem man eine Suspension von Kügelchen durch die Leitung 42 fließen läßt, damit sie sich an einem Sieb wie dem Sieb 38B ansetzen, wobei das andere Sieb dann eingesetzt wird, um die Kügelchenmasse einzuschließen. Statt dessen kann die poröse Kügelchenmasse auch dadurch gebildet werden, daß eine Mehrzahl von Kügelchen leicht etwa durch Sintern oder Klebstoffe aneinander geklebt werden. Zum Beispiel kann die Kügelchenmasse gebildet werden, indem eine dicke Schicht von Kügelchen vorgesehen wird, die freistehend sein kann, oder durch Beschichten eines porösen Substrats oder Formung eines Sandwiches zwischen einem Paar von porösen Substraten mit der dicken Schicht von Kügelchen, welche Kügelchenschichten einen geringfügigen Betrag an Klebstoff enthalten, der die Durchlässigkeit der resultierenden Masse praktisch nicht verringert. Nach dem Aushärten kann der Überzug mit einem geeigneten spezifisch reaktiven Ligand vorbeschichtet und ein kleiner Zylinder des Überzugs ausgestanzt und in entsprechend bemessene Röhren 42 eingesetzt werden. Alternativ sind Lagen aus Polymermaterial hohen Molekulargewichts mit der gewünschten Durchlässigkeit im Handel erhältlich und können nach Behandlung zur Immobilisierung des erforderlichen Ligands in der porösen Struktur zur Erzeugung der gewünschten Zylinder zur Einsetzung in die Röhren 42 gestanzt werden. Somit kann man eine Mehrzahl von Kügelchenmassen zur Verfügung stellen, die jeweils mit einem unterschiedlichen Ligand überzogen sind. Die resultierende Mehrzahl von Kügelchenmassen kann in eine einzige Röhre 42 eingesetzt werden, wie in 7 gezeigt, so daß man eine durch die Röhre fließende Probe auf mehrere verschiedene Liganden getrennt, jedoch im wesentlichen gleichzeitig untersuchen kann.
Wie in 8 gezeigt, kann die Leitung 34 zum Teil als ein muldenförmiger langgestreckter Kanal 34B bzw. ein halbröhrenförmiger Teil mit zum Beispiel halbkreisförmigem Querschnitt ausgebildet sein, der in eine ebene Oberfläche 48 der Linse 33 eingeschnitten oder eingeformt wird und sich senkrecht zur optischen Achse der Linse und durch die Fokuszone der Linseneinrichtung 32 erstreckt. Der übrige Teil der Leitung 34 ist von einem weiteren halbröhrenförmigen langgestreckten Kanal 34C gebildet, der, in gleicher Weise mit halbkreisförmigem Querschnitt, in einer Platte 50 vorgesehen ist. Die letztere ist an der Linse 32 angrenzend an die Oberfläche 48 typischerweise durch eine Gelenkverbindung 52 angebracht, so daß die Platte 50 gedreht werden kann, damit die Kanäle 34C und 34B in coaxialem Verhältnis paarweise zusammengebracht werden können, um eine Leitungskombination mit im wesentlichen kreisförmigem Querschnitt zu bilden. In der bevorzugten Ausführungsform ist die innere Oberfläche des Kanals 34C mit einer hochgradig reflektiven Beschichtung 54 versehen.
Da an dem obigen Verfahren und der obigen Vorrichtung gewisse Änderungen vorgenommen werden können, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen, soll die gesamte Materie, die in der obigen Beschreibung enthalten bzw. in der beigefügten Zeichnung gezeigt ist, im Sinne einer Veranschaulichung und nicht im beschränkenden Sinn ausgelegt werden.

Claims

Vorrichtung, in Kombination bestehend aus einer lichtdurchlässigen Leitung (34) zur Ermöglichung eines Flüssigkeitsdurchflusses einer Flüssigprobe durch diese und einer porösen Masse lichtdurchlässigen Materials (40), die in der Leitung (34) angeordnet ist, wobei die Porosität der Masse so gewählt ist, daß ein Flüssigkeitsdurchfluß der Flüssigprobe durch diese ermöglich ist, und auf der Masse zumindest ein Anteil eines Ligand/Verbindungskomplexes immobilisiert ist, gekennzeichnet durch eine Meßeinrichtung (24) in einer Position in Bezug auf die poröse Masse (40) und Anordnung zur quantitativen Messung eines Betrags von dieser ausgehender elektromagnetischer Strahlung.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die poröse Masse eine Mehrzahl von Partikeln (40) mit Abmessungen in einem spezifizierten Durchmesserbereich umfaßt und die Vorrichtung ferner eine flüssigkeitsdurchlässige Sperreinrichtung (38) aufweist, die in der Leitung (34) angeordnet ist, wobei die Durchlässigkeit und Anordnung der Sperreinrichtung (38) so gewählt ist, daß die Partikel (40) von der Sperreinrichtung (38) zur Bildung der porösen Masse aufgefangen werden.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der (a) die Sperreinrichtung zumindest ein Paar von Sieben (38) umfaßt, die zur Bildung einer Reaktionskammer in der Leitung voneinander beabstandet sind, wobei die Sieböffnung der Siebe (38) ausreichend kleiner ist als der genannte Durchmesserbereich, so daß Partikel zwischen den Sieben in der Kammer zur Bildung der porösen Masse aufgefangen werden, und auf den Partikeln zumindest ein Anteil eines Ligand/Verbindungskomplexes immobilisiert ist, oder (b) in Kombination die Sperreinrichtung eine Mehrzahl von Paaren von Sieben (38) umfaßt, die Siebe (38) eines jeden Paares zur Bildung einer Reaktionskammer in der Leitung (34) voneinander beabstandet sind, so daß die Mehrzahl von Paaren (38) eine Mehrzahl von Reaktionskammern in der Leitung (42) bildet, jede Reaktionskammer eine Mehrzahl von Partikeln (40) mit Abmessungen in einem spezifizierten Durchmesserbereich aufweist, die Sieböffnung der Siebe (38) ausreichend kleiner ist als der genannte Durchmesserbereich, so daß die Partikel von den Sieben (38) in jeder Reaktionskammer zur Bildung einer porösen Masse in jeder Reaktionskammer aufgefangen werden, und die Partikel einer jeden porösen Masse zumindest einen Anteil eines Ligand/Verbindungskomplexes imobilisiert auf ihren Oberflächen aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der jeder Anteil eines Ligand/Verbindungskomplexes eine Mehrzahl getrennter Segmente aufweist und jedes Segment in einer unterschiedlichen Zone der Leitung (42) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Linseneinrichtung (32) zur Lichtbündelung, wobei die Leitung (34) mit gleichförmiger Querschnittsabmessung in der Linseneinrichtung (32) angeordnet ist und sich quer zu einer optischen Achse der Linseneinrichtung 32 durch eine Fokuszone der Linseneinrichtung (32) erstreckt, die die Lichtstrahlen durch Brechung bündelt, und die Linseneinrichtung (32) so angeordnet ist, daß Strahlen, die vom Inneren der Leitung (34) ausgehen, zu der Meßeinrichtung (24) geleitet werden.
Vorrichtung nach Anspruch 5, bei der die Linseneinrichtung (34) eine Mehrzahl von Linsen und die Leitung (34) einen zylindrischen Kanal umfaßt, der sich durch eine der Linsen hindurcherstreckt.
Vorrichtung nach Anspruch 5, mit einer mechanischen, flüssigkeitsdurchlässigen Sperreinrichtung (38), die so bemessen und angrenzend an die Fokuszone angeordnet ist, daß der Durchfluß von Partikeln mit oder oberhalb einer vorbestimmten Größe durch die Leitung (34) blockiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 5, mit einem ersten langgestreckten halbröhrenförmigen Kanal (34B) in der Linseneinrichtung (33) und einem zweiten langgestreckten halbröhrenförmigen Kanal (34C), wobei die Kanäle miteinander zur Bildung der Leitung (34) verbindbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 8, bei der (a) der zweite halbröhrenförmige Kanal (34C) eine lichtbrechende Oberfläche (54) umfaßt, (b) wobei ein Rand des ersten Kanals (34B) gelenkig mit einem Rand des zweiten Kanals (34C) verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 7, bei der die Leitung einen zylindrischen Kanal (34A) mit einer in diesem angeordneten lichtdurchlässigen Röhre (42) umfaßt und die Sperreinrichtung (38) in der Röhre (42) angeordnet ist, und wobei (a) die Sperreinrichtung ein Paar von Sieben (38) umfaßt, die zur Bildung einer Reaktionskammer in der Röhre (42) voneinander beabstandet sind, und eine Mehrzahl von Partikeln (40) mit Abmessungen innerhalb eines spezifizierten Durchmesserbereichs aufweist, wobei die Sieböffnung der Siebe (38) ausreichend kleiner ist als der genannte Durchmesserbereich, so daß die Partikel (40) von den Sieben (38) in der Reaktionskammer zur Bildung einer durchlässigen Masse aufgefangen werden, die im wesentlichen in der Fokuszone positionierbar ist, oder (b) die Linseneinrichtung (33) und die Röhre (42) Brechungszahlen aufweisen, die im wesentlichen zusammenpassend sind, und die Vorrichtung eine brechungszahlangepaßte Flüssigkeit umfaßt, die um die Röhre (42) und zwischen der Röhre (42) und dem Kanal (34A) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der ein Bereich des Kanals (34A) als ein langgestreckter halbröhrenförmiger erster Kanal (34B) in der Linseneinrichtung (33) und der verbleibende Bereichs des Kanals (34A) als ein langgestreckter halbröhrenförmiger zweiter Kanal (34C) ausgebildet ist, der mit dem ersten Kanal (34B) zusammenpaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 7, mit einer Mehrzahl von Partikeln (40) mit Abmessungen innerhalb eines spezifischen Durchmesserbereichs, wobei die flüssigkeitsdurchlässige Sperreinrichtung (38) Poren von kleinerem Durchmesser als der genannte Durchmesserbereich aufweist, so daß die Partikel (40) in der Leitung (34) gegen die flüssigkeitsdurchlässige Sperreinrichtung (38) zur Bildung einer im wesentlichen in der Fokuszone angeordneten porösen Masse angesetzt werden.
Vorrichtung nach Anspruch 5 und geeignet zur Bestimmung einer Flüssigprobe mit einer erregten Markierung, die elektromagnetische Strahlung beim Durchfluß durch die Leitung (34) aussendet, wobei die Vorrichtung ferner eine flüssigkeitsdurchlässige Sperreinrichtung (38) angrenzend an die Fokuszone in der Leitung (34) für einen begrenzten Durchgang von Partikeln (40) durch die flüssigkeitsdurchlässige Sperreinrichtung (38) in Abhängigkeit von der Partikelgröße umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 13, mit einer Einrichtung (22) zum Erregen der Emission der elektromagnetischen Strahlung (23).
Vorrichtung nach Anspruch 14, bei der die Einrichtung zur Emmisionserregung eine Erregungsstrahlungsquelle (22) und eine Einrichtung zur Weiterleitung der Erregungsstrahlung (22) in der Leitung (34) zur Fokuszone umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 15, bei der die Ausstrahlung eine fluoreszierende Strahlung ist.
Vorrichtung nach Anspruch 15, mit einer Mehrzahl von Partikeln (40) mit Abmessungen innerhalb eines spezifizierten Durchmesserbereichs, wobei die flüssigkeitsdurchlässige Sperreinrichtung (38) Poren mit kleinerem Durchmesser als der genannte Durchmesserbereich aufweist, so daß die Partikel (40) in der Leitung (34) gegen die flüssigkeitsdurchlässige Sperreinrichtung (38) zur Bildung einer im wesentlichen in der Fokuszone angeordneten porösen Masse angesetzt werden.
Vorrichtung nach Anspruch 17, bei der die Partikel (40) im wesentlichen sowohl für die Erregungsstrahlung (23) als auch für die fluoreszierende Strah lung durchlässig und zumindest teilweise mit einem immobilisierten spezifischen Bindeligand überzogen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 18, bei der der Ligand einen Komplex in einer Ligand/Verbindungsreaktion gebildet hat und der Komplex mit Molekülen markiert ist, die bei Erregung durch geeignete Erregungsstrahlung (23) fluoreszieren.
Verfahren zur Bestimmung einer Flüssigprobe durch Messung von Strahlung, die von einem Ligand/Verbindungskomplex ausgesendet wird, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, daß die Vorrichtung gemäß Anspruch 2 bereitgestellt wird, die poröse Masse (40), einschließlich des Durchflusses von zumindest der Flüssigprobe durch diese, so behandelt wird, daß der Ligand/Verbindungskomplex auf Oberflächen der Partikel (40) erzeugt wird, der Komplex derart angeregt wird, daß eine charakteristische Strahlung von diesem ausgeht, die charakteristische Strahlung durch eine Linseneinrichtung zur Lichtbündelung mit einer Fokuszone gebündelt wird, und der Betrag der charakteristischen Strahlung, die ausgesendet wird, gemessen wird.
Verfahren zur Bestimmung nach Anspruch 20, wobei (a) die Behandlung das Überziehen der Partikel (40) auf einem Bereich ihrer Oberfläche mit zumindest einem Anteil des Komplexes umfaßt, der Komplex mit einer fluoreszierenden Markierung markiert wird und die Leitung (34) und die poröse Masse (40) von einer Waschflüssigkeit durchströmt wird, um nichtreagierte Verbindung und fluoreszierende Markierung von dem markierten Komplex zu trennen, oder (b) die Erregung das Leiten von Erregungsstrahlung (23) auf den markierten Komplex umfaßt und die charakteristische Strahlung aus Fluoreszenz besteht, die von dem angeregten markierten Komplex ausgeht und durch die Linseneinrichtung zur Lichtbündelung hindurchgeht.
Verfahren zur Bestimmung nach Anspruch 20, wobei die lichtdurchlässige Leitung aus einer Röhre (42) besteht und die flüssigkeitsdurchlässige Sperreinrichtung ein Paar von beabstandeten Sieben (38) umfaßt, die eine Reaktionskammer in der Röhre (42) bilden, welche die poröse Masse aus der Mehrzahl von Partikeln (40) enthält, und wobei die Röhre in einen zylindrischen Kanal (34A) quer durch die Linseneinrichtung (33) eingesetzt wird, derart, daß die Reaktionskammer innerhalb der Fokuszone liegt.