DE69233459T2

DE69233459T2 - Herstellung von gamma-linolensäure durch eine delta-6 desaturase

Info

Publication number: DE69233459T2
Application number: DE69233459T
Authority: DE
Inventors: Terry Thomas; S. Avutu Reddy; Michael Nuccio; Georges Freyssinet
Original assignee: Bayer CropScience SA
Current assignee: Bayer SAS
Priority date: 1991-10-10
Filing date: 1992-10-13
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2012-10-14
Also published as: CZ285471B6; BG61791B1; HU217328B; US5663068A; WO1993006712A1; CA2120629A1; IL103407A0; MX9205820A; EP0666918B1; JP3537434B2; AU667848B2; HU9401007D0; IL103407A; ES2231767T3; RU2152996C2; UA43314C2; EP0666918A4; US5552306A; CN1072722A; KR100316068B1

Description

Linolsäure (18:2) (LA) wird durch das Enzym Δ6-Desaturase in gamma-Linolensäure (18:3) (GLA) umgewandelt. Wenn dieses Enzym, oder die dafür codierende Nukleinsäure, in LA-produzierende Zellen überführt wird, wird GLA hergestellt. Die vorliegende Erfindung sieht eine Nukleinsäure vor, umfassend das Δ6-Desaturase-Gen. Genauer gesagt, umfaßt die Nukleinsäure den Promotor, die codierende Region und die Terminations-Regionen des Δ6-Desaturase-Gens. Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf rekombinante Konstruktionen, umfassend eine Δ6-Desaturase codierende Region in funktioneller Kombination mit heterologen regulatorischen Sequenzen. Die Nukleinsäuren und rekombinanten Konstruktionen der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei der Herstellung von GLA in transgenen Organismen.
Ungesättigte Fettsäuren, wie Linol(C₁₈Δ^9,12)- und α-Linolen(C₁₈Δ^9,12,15)-Säuren sind essentielle Nahrungsbestandteile, welche von Wirbeltieren nicht synthetisiert werden können, da Wirbeltierzellen Doppelbindungen an der Δ⁹-Position von Fettsäuren einführen können, aber nicht weitere Doppelbindungen zwischen der Δ⁹-Doppelbindung und dem Methyl-Terminus der Fettsäurekette einführen können. Da sie Vorläufer von anderen Produkten sind, sind Linol- und α-Linolen-Säuren essentielle Fettsäuren und werden gewöhnlicherweise aus pflanzlichen Quellen erhalten. Linolsäure kann von Säugetieren zu γ-Linolensäure (GLA, C₁₈Δ^6,9,12) umgewandelt werden, welche ihrerseits zu Arachidonsäure (20:4) umgewandelt werden kann, einer Fettsäure von kritischer Bedeutung, da sie ein wesentlicher Vorläufer der meisten Prostaglandine ist.
Die Bereitstellung von Linolsäure in der Nahrung erfüllt, dank ihrer resultierenden Umwandlung in GLA und Arachidonsäure, die nahrungsmäßigen Bedürfnisse für GLA und Arachidonsäure. Allerdings ist eine Beziehung zwischen dem Verzehr gesättigter Fettsäuren und Gesundheitsrisiken, wie Hypercholesterolämie, Arteriosklerose und anderen chemischen Störungen, welche mit einer Anfälligkeit gegenüber Coronar-Erkrankung zusammenhängen, aufgezeigt worden, wohingegen der Verzehr ungesättigter Fette mit einer verringerten Blutcholesterin-Konzentration und einem gesenkten Risiko für Arteriosklerose in Zusammenhang gebracht worden ist. Die therapeutischen Vorteile von GLA in der Nahrung können daraus resultieren, daß GLA ein Vorläufer für Arachidonsäure ist und somit anschließend zur Prostaglandin-Synthese beiträgt. Folglich besitzt der Verzehr von mehr ungesättigtem GLA anstatt von Linolsäure potenzielle Vorteile für die Gesundheit. Allerdings ist GLA nicht in praktisch jeder kommerziell gezüchteten Nutzpflanze vorhanden.
Linolsäure wird durch das Enzym Δ6-Desaturase in GLA umgewandelt. Δ6-Desaturase, ein Enzym von etwa 359 Aminosäuren, besitzt eine membrangebundene Domäne und eine aktive Stelle für die Desaturierung von Fettsäuren. Wenn dieses Enzym in Zellen transferiert wird, welche Linolsäure aber nicht GLA endogen herstellen, wird GLA produziert. Die vorliegende Erfindung gestattet, durch Vorsehen des für Δ6-Desaturase codierenden Gens, die Erzeugung von transgenen Organismen, welche funktionelle Δ6-Desaturase enthalten und welche GLA produzieren. Zusätzlich zum Gestatten der Produktion großer Mengen an GLA stellt die vorliegende Erfindung neue Nahrungs-Quellen von GLA bereit.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein isoliertes Δ6-Desaturase-Gen. Spezifisch gesagt, umfaßt das isolierte Gen den Promotor, die codierende Region und die Terminations-Region von Δ6-Desaturase.
Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf Expressionsvektoren, umfassend den Promotor, die codierende Region und die Terminationsregion von Δ6-Desaturase.
Die vorliegende Erfindung richtet sich ebenfalls auf Expressionsvektoren, umfassend eine für Δ6-Desaturase codierende Region in funktioneller Kombination mit heterologen regulatorischen Regionen, d. h. Elementen, welche nicht von dem Δ6-Desaturase-Gen abgeleitet sind.
Zellen und Organismen, welche die Vektoren der Erfindung umfassen, und die Nachkommenschaft derartiger Organismen, werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner isolierte bakterielle Δ6-Desaturase vor, und richtet sich weiterhin noch auf eine isolierte Nukleinsäure, welche für bakterielle Δ6-Desaturase codiert.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit einem erhöhten Gehalt an gamma-Linolensäure (GLA) vor, welches das Transformieren einer Pflanzenzelle mit einer isolierten Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung und das Regenerieren einer Pflanze mit erhöhtem GLA-Gehalt aus der Pflanzenzelle umfaßt.
Ein Verfahren zur Herstellung von kühlungstoleranten Pflanzen wird von der vorliegenden Erfindung ebenfalls vorgesehen.
Die 1 zeigt die Hydropathie-Profile der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Synechocystis-Δ6-Desaturase (Tafel A) und Δ12-Desaturase (Tafel B). Vermeintliche membrandurchspannende Regionen sind durch ausgefüllte Kästen angezeigt. Der Hydrophobie-Index wurde für eine Fenstergröße von 19 Aminosäureresten berechnet [Kyte et al. (1982) J. Molec. Biol. 157].
Die 2 sieht Gas-Flüssig-Chromatographie-Profile von Wildtyp- (Tafel A) und transgenen (Tafel B) Anabaena vor.
Die 3 ist ein Diagramm von Karten von Cosmid cSy75, cSy13 und cSy7 mit überlappenden Regionen und Subklonen. Die Ursprünge der Subklone von cSy75, cSy75-3.5 und cSy7 sind durch die gestrichelten diagonalen Linien angegeben. Restriktionsstellen, welche inaktiviert worden sind, stehen in Klammern.
Die 4 stellt Gas-Flüssig-Chromatographie-Profile von Wildtyp- (Tafel A) und transgenem (Tafel B) Tabak bereit.
Die vorliegende Erfindung sieht eine isolierte Nukleinsäure, welche Δ6-Desaturase codiert, vor. Um eine Δ6-Desaturase codierende Nukleinsäure zu identifizieren, wird DNA aus einem Organismus isoliert, welcher GLA produziert. Bei dem Organismus kann es sich beispielsweise um eine Tierzelle, bestimmte Pilze (z. B. Mortierella), bestimmte Bakterien (z. B. Synechocystis) oder bestimmte Pflanzen (Borettsch, Oenothera, Johannisbeeren) handeln. Die Isolierung genomischer DNA kann durch eine Vielzahl von dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gut bekannten Verfahren bewerkstelligt werden, wie beispielhaft aufgeführt von Sambrook et al. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. Die isolierte DNA wird durch physikalische Verfahren oder enzymatischen Verdau fragmentiert und in einen geeigneten Vektor kloniert, z. B. einen Bakteriophagen- oder Cosmid-Vektor, und zwar durch jedes einer Vielzahl von gut bekannten Verfahren, welche in Bezugsstellen, wie Sambrook et al. (1989) zu finden sind. Expressionsvektoren, welche die DNA der vorliegenden Erfindung enthalten, werden hierin spezifisch in Betracht gezogen. Für Δ6-Desaturase codierende DNA kann durch eine Funktions-Zugewinn-Analyse identifiziert werden. Der Vektor, welcher fragementierte DNA enthält, wird beispielsweise durch Infektion, Transkonjugation, Transfektion in einen Wirtsorganismus überführt, welcher Linolsäure aber nicht GLA herstellt. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Transformation" allgemein auf die Einbringung von Fremd-DNA in eine Wirtszelle. Verfahren zum Einbringen von rekombinanter DNA in einen Wirtsorganismus sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und können beispielsweise in Sambrook et al. (1989) gefunden werden. Die Herstellung von GLA durch diese Organismen (z. B. Funktionszugewinn) wird geassayt, beispielsweise durch Gaschromatographie oder andere Verfahren, welche dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Organismen, welche zur Erzeugung von GLA induziert worden sind, d. h. eine Funktion durch die Einbringung des Vektors hinzugewonnen haben, werden als Δ6-Desaturase codierende DNA exprimierend identifiziert, und die DNA wird aus den Organismen zurückgewonnen. Die zurückgewonnene DNA kann erneut fragmentiert, mit Expressionsvektoren kloniert und mittels der obenstehenden Vorgehensweisen funktionell überprüft werden, um die für Δ6-Desaturase codierende DNA mit größerer Genauigkeit einzugrenzen.
Als ein Beispiel der vorliegenden Erfindung wird statistische DNA aus dem Cyanobacterium Synechocystis, Pasteur Culture Collection (PCC) 6803, American Type Culture Collection (ATCC) 27184, isoliert, in einen Cosmidvektor kloniert und mittels Transkonjugation in den GLA-defizienten Cyanobacterium-Stamm Anabaena PCC 7120, ATCC 27893, eingeführt. Die Herstellung von GLA aus Anabaena-Linolsäure wird durch Gaschromatographie überwacht, und das entsprechende DNA-Fragment wird isoliert.
Die isolierte DNA wird durch Verfahren sequenziert, welche dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, wie beispielsweise in Sambrook et al. (1989) zu finden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, umfassend ein Δ6-Desaturase-Gen, isoliert worden. Genauer gesagt, ist eine 3,588 Kilobasen (kb) große DNA, umfassend ein Δ6-Desaturase-Gen, aus dem Cyanobacterium Synechocystis isoliert worden. Die Nukleotidsequenz der 3,588-kb-DNA wurde bestimmt und ist in der SEQ ID NO: 1 gezeigt. Offene Leseraster, welche potenziell codierende Regionen definieren, sind von Nukleotid 317 bis 1507 und von Nukleotid 2002 bis 3081 vorhanden. Um die für das Codieren von Δ6-Desaturase verantwortlichen Nukleotide zu definieren, wird das 3,588 kb große Fragment, welches Δ6-Desaturase-Aktivität vermittelt, in zwei Subfragmente gespalten, von denen jedes nur ein offenes Leseraster enthält. Das Fragment ORF1 enthält die Nukleotide 1 bis 1704, wohingegen das Fragment ORF2 die Nukleotide 1705 bis 3588 enthält. Jedes Fragment wird sowohl in der Vorwärts- als auch der Rückwärts-Orientierung in einen konjugalen Expressionsvektor (AM542, Wolk et al. [1984] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561) subkloniert, welcher einen cyanobakteriellen Carboxylase-Promotor enthält. Die resultierenden Konstrukte (d. h. ORF1(F), ORF1(R), ORF2(F) und ORF2(R)] werden durch Standardverfahren mit Wildtyp-Anabaena PCC 7120 konjugiert (siehe zum Beispiel Wolk et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1561). Konjugierte Zellen von Anabaena werden als grüne Neo^R-Kolonien auf einem braunen Hintergrund von sterbenden nicht-konjugierten Zellen nach zweiwöchigem Wachstum auf Selektivmedium (Standard-Mineralmedium BG11N+ enthaltend 30 μg/ml Neomycin, gemäß Rippka et al., (1979) J. Gen Microbiol. 111, 1) identifiziert. Die grünen Kolonien werden selektiert und in selektivem Flüssigmedium (BG11N+ mit 15 μg/ml Neomycin) herangezogen. Lipide werden durch Standardverfahren (z. B. Dahmer et al., (1989) Journal of American Oil Chemical Society 66, 543) aus den resultierenden Transkonjuganten, enthaltend die vorwärts und rückwärts orientierten ORF1- und ORF2-Konstrukte, extrahiert.
Zum Vergleich werden Lipide auch aus Wildtypkulturen von Anabaena und Synechocystis extrahiert. Die Fettsäuremethylester werden durch Gas-Flüssig-Chromatographie (GLC) analysiert, beispielsweise mit einem Gas-Flüssigkeit-Chromatograph Tracor-560, ausgerüstet mit einem Wasserstoffflammen-Ionisationsdetektor und einer Kapillarsäule. Die Ergebnisse der GLC-Analyse sind in der Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: Vorkommen von C18-Fettsäuren in Wildtyp- und transgenen Cyanobakterien
Wie mittels GLC-Analyse überprüft, gewinnen GLA-defiziente Anabaena die Funktion der GLA-Herstellung hinzu, wenn das Konstrukt, welches ORF2 in der Vorwärtsorientierung enthält, durch Transkonjugation eingeführt wird. Transkonjuganten, welche Konstrukte mit ORF2 in Rückwärtsorientierung zum Carboxylase-Promotor oder ORF1 in jedweder Orientierung enthalten, zeigen keine GLA-Produktion. Diese Analyse verdeutlicht, daß das einzelne offene Leseraster (ORF2) innerhalb des 1884-bp-Fragmentes Δ6-Desaturase codiert. Das 1884 bp große Fragment ist als SEQ ID NO: 3 gezeigt. Dies wird durch die Gesamt-Ähnlichkeit der Hydropathie-Profile zwischen Δ6-Desaturase und Δ12-Desaturase untermauert [Wada et al. (1990) Nature 347], wie in der 1 als (A) bzw. (B) gezeigt.
Isolierte Nukleinsäuren, codierend Δ6-Desaturase, können aus anderen GLA-erzeugenden Organismen durch die obenstehend beschriebene Funktionszugewinn-Analyse oder durch Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken unter Verwendung der isolierten Nukleinsäure, welche Anabaena-Δ6-Desaturase codiert, als Hybridisierungssonde, identifiziert werden. Sowohl genomische als auch cDNA-Klonierungs-Verfahren sind dem Fachmann bekannt und werden von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Die Hybridisierungssonde kann die gesamte DNA-Sequenz, offenbart als SEQ ID NO: 1, oder ein Restriktionsfragment oder sonstiges DNA-Fragment davon, einschließlich einer Oligonukleotid-Sonde, umfassen. Verfahren zur Klonierung homologer Gene durch Kreuzhybridisierung sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und können beispielsweise gefunden werden in Sambrook (1989) und Beltz et al. (1983) Methods in Enzymology 100, 266.
Transgene Organismen, welche die Funktion der GLA-Herstellung durch Einführung von für Δ-Desaturase codierende DNA hinzugewinnen, gewinnen ebenfalls die Funktion der Produktion von Octadecatetraensäure (18:4 Δ^6,9,12,15) hinzu. Octadecatetraensäure ist normalerweise in Fischölen und manchen Pflanzenarten der Boraginaceae-Familie vorhanden (Craig et al. [1964] J. Amer. Oil Chem. Soc. 41, 209–211; Gross et al. [1976] Can. J. Plant Sci. 56, 659–664). In den transgenen Organismen der vorliegenden Erfindung resultiert Octadecatetraensäure aus der weiteren Desaturierung von α-Linolensäure durch Δ6-Desaturase oder Desaturierung von GLA durch Δ15-Desaturase.
Die von ORF2 codierten 359 Aminosäuren, d. h. das offene Leseraster, codierend Δ6-Desaturase, sind als SEQ ID NO: 2 gezeigt. Die vorliegende Erfindung zieht ferner andere Nukleotidsequenzen in Betracht, welche die Aminosäuren von SEQ ID NO: 2 codieren. Es liegt innerhalb des Kenntnisstands des Durchschnittsfachmanns, derartige Sequenzen zu identifizieren, welche beispielsweise aus der Degenerierung des genetischen Codes resultieren. Darüber hinaus kann der Durchschnittsfachmann durch die hierin obenstehend beschriebene Funktionszugewinn-Analyse kleinere Subfragmente des 1884-bp-Fragments, enthaltend ORF2, bestimmen, welche für Δ6-Desaturase codieren.
Die vorliegende Erfindung zieht jegliches derartige Polypeptidfragment von Δ6-Desaturase und die Nukleinsäuren dafür, welche Aktivität für die Umwandlung von LA in GLA beibehalten, in Betracht.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor, enthaltend das 1884-bp-Fragment oder ein kleineres Fragment, enthaltend den Promotor, die codierende Sequenz und die Terminationsregion des Δ6-Desaturase-Gens, in einen Organismus, zum Beispiel Cyanobakterien, überführt, in welchem der Promotor und die Terminationsregionen von Δ6-Desaturase funktional sind. Folglich werden von dieser Erfindung Organismen vorgesehen, die rekombinante Δ6-Desaturase herstellen. Noch ein anderer Aspekt dieser Erfindung sieht isolierte Δ6-Desaturase vor, welche aus den rekombinanten Organismen durch Standardverfahren der Proteinreinigung gereinigt werden kann. (Siehe zum Beispiel Ausubel et al. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, New York).
Vektoren, welche Δ6-Desaturase codierende DNA enthalten, werden von der vorliegenden Erfindung ebenfalls vorgesehen. Dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird es offensichtlich sein, daß passende Vektoren konstruiert werden können, um die Expression der Δ6-Desaturase codierenden Sequenz in einer Vielzahl von Organismen zu steuern. Replizierbare Expressionsvektoren werden besonders bevorzugt. Replizierbare Expressionsvektoren, wie hierin beschrieben, sind DNA- oder RNA-Moleküle, konstruiert für die gesteuerte Expression eines gewünschten Gens, d. h. des Δ6-Desaturase-Gens. Vorzugsweise sind die Vektoren Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide oder Viren. Shuttle-Vektoren, z. B. wie beschrieben von Wolk et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1561–1565, und Bustos et al. (1991) J. Bacteriol. 174, 7525–7533, werden gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen. Sambrook et al. (1989), Goeddel, Hrsg. (1990) Methods in Enzymology 185, Academic Press, und Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, Inc., sehen ausführliche Übersichtsartikel über Vektoren vor, in welche eine Nukleinsäure, codierend für die vorliegende Δ6-Desaturase, inseriert und exprimiert werden kann. Derartige Vektoren enthalten auch Nukleinsäuresequenzen, welche eine Expression von Δ6-Desaturase codierenden Nukleinsäuren bewirken können. Sequenzelemente, fähig zur Bewirkung der Expression eines Genprodukts, schließen Promotoren, Enhancer-Elemente, stromaufwärts gelegene aktivierende Sequenzen, Transkriptionsterminationssignale und Polyadenylierungsstellen ein. Sowie konstitutive als auch gewebespezifische Promotoren werden in Betracht gezogen. Für die Transformation von Pflanzenzellen sind der Blumenkohl-Mosaik-Virus(CaMV)-35S-Promotor und Promotoren, welche während der Pflanzensamenreifung reguliert werden, von besonderem Interesse. Alle derartigen Promotor- und Transkriptionsregulator-Elemente, einzeln oder in Kombination, werden zur Verwendung in den vorliegenden replizierbaren Expressionsvektoren in Betracht gezogen und sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt. Der CaMV-355-Promotor wird beispielsweise beschrieben von Restrepo et al. (1990) Plant Cell 2, 987. Gentechnisch veränderte und mutierte regulatorische Sequenzen werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Der Durchschnittsfachmann kann Vektoren und regulatorische Elemente bestimmen, welche für die Expression in einer jeweiligen Wirtszelle geeignet sind. Zum Beispiel ist ein Vektor, umfassend den Promotor aus dem Gen, codierend für die Carboxylase von Anabaena, funktionstüchtig verknüpft an die codierende Region von Δ6-Desaturase und ferner funktionstüchtig verknüpft an ein Terminationssignal aus Synechocystis, für die Expression von Δ6-Desaturase in Cyanobakterien geeignet. "Funktionstüchtig verknüpft" in diesem Kontext bedeutet, daß die Promotor- und Terminator-Sequenzen wirksam zur Regulierung der Transkription fungieren. Als weiteres Beispiel kann ein Vektor, geeignet für die Expression von Δ6-Desaturase in transgenen Pflanzen, eine samenspezifische Promotorsequenz, abgeleitet aus Helianthinin, Napin oder Glycin, funktionstüchtig verknüpft an die für Δ6-Desaturase codierende Region und fernerhin funktionstüchtig verknüpft an ein Samen-Terminationssignal oder das Nopalin-Synthase-Terminationssignal, umfassen.
Insbesondere werden die Helianthinin-Regulatorelemente, offenbart in der gleichzeitig anhängigen U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 682 354 der vorliegenden Anmelder, eingereicht am 8. April 1991 und hierin durch Bezug darauf einbezogen, als Promotorelemente in Betracht gezogen, um die Expression der Δ6-Desaturase der vorliegenden Erfindung zu steuern.
Modifikationen der hierin offenbarten Nukleotidsequenzen oder regulatorischen Elemente, bei denen die hierin betrachteten Funktionen erhalten bleiben, liegen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Solche Modifikationen schließen Insertionen, Substitutionen und Deletionen und spezifischerweise Substitutionen, welche die Degeneration des genetischen Codes reflektieren, ein.
Standardtechniken für die Konstruktion solcher Hybridvektoren sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gut bekannt und können in Bezugsstellen, wie Sambrook et al. (1989) oder jedwedem der großen Menge an Laborhandbüchern über rekombinante DNA-Technologie, welche weithin verfügbar sind, gefunden werden. Eine Vielzahl von Strategien steht zur Ligation von DNA-Fragmenten zur Verfügung, deren Auswahl von der Natur der Termini der DNA-Fragmente abhängt. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird es fernerhin in Betracht gezogen, andere Nukleotidsequenzelemente in den Hybridvektoren einzuschließen, welche Klonierung, Expression oder Prozessierung erleichtern, beispielsweise Sequenzen, codierend für Signalpeptide, eine Sequenz, codierend für KDEL, welches für die Zurückhaltung von Proteinen im endoplasmatischen Reticulum erforderlich ist, oder Sequenzen, codierend für Transitpeptide, welche Δ6-Desaturase zum Chloroplasten lenken. Solche Sequenzen sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt. Ein optimiertes Transitpeptid wird beispielsweise beschrieben von Van den Broeck et al. (1985) Nature 313, 358. Prokaryotische und eukaryotische Signalsequenzen werden beispielsweise von Michaelis et al. (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36, 425, offenbart.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht von Cyanobakterien verschiedene Organismen vor, welche die DNA enthalten, die für die Δ6-Desaturase der vorliegenden Erfindung codiert. Die gemäß der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen transgenen Organismen schließen Bakterien, Cyanobakterien, Pilze und Pflanzen und Tiere ein. Die isolierte DNA der vorliegenden Erfindung kann durch im Fachgebiet bekannte Verfahren in den Wirt eingebracht werden, zum Beispiel Infektion, Transfektion, Transformation oder Transkonjugation. Techniken zum Überführen der DNA der vorliegenden Erfindung in derartige Organismen sind weithin bekannt und werden in Bezugsstellen, wie Sambrook et al. (1989) angegeben.
Eine Vielzahl von Pflanzentransformationsverfahren ist bekannt. Das Δ6-Desaturase-Gen kann mittels eines Blattscheibchen-Transformations-Regenerations-Vorgehens, wie beschrieben von Horsch et al. (1985) Science 227, 1229, in Pflanzen eingeführt werden. Andere Transformationsverfahren, wie Protoplasten-Kultur (Horsch et al. (1984) Science 223, 496; DeBlock et al. (1984) EMBO J. 2, 2143; Barton et al. (1983) Cell 32, 1033), können ebenfalls angewandt werden und liegen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Pflanzen mit Agrobacterium-abgeleiteten Vektoren transformiert. Allerdings sind andere Verfahren verfügbar, um das Δ6-Desaturase-Gen der vorliegenden Erfindung in Pflanzenzellen einzuführen. Derartige alternative Verfahren schließen biolistische Vorgehensweisen (Klein et al. (1987) Nature 327, 70), Elektroporation, chemisch induzierte DNA-Aufnahme und die Verwendung von Viren oder Pollen als Vektoren ein.
Wenn für das Transformationsverfahren notwendig, kann das Δ6-Desaturase-Gen der vorliegenden Erfindung in einen Pflanzentransformationsvektor inseriert werden, z. B. den binären Vektor, beschrieben von Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8111. Pflanzentransformationsvektoren können durch Modifizieren des natürlichen Gentransfersystems von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet werden. Das natürliche System umfaßt große Ti(Tumor-induzierende)-Plasmide, enthaltend ein großes Segment, bekannt als T-DNA, welches in transformierte Pflanzen überführt wird. Ein anderes Segment des Ti-Plasmids, die vir-Region, ist verantwortlich für den T-DNA-Transfer. Die T-DNA-Region wird von terminalen Wiederholungen begrenzt. In den modifizierten binären Vektoren sind die Tumor-induzierenden Gene deletiert worden, und die Funktionen der vir-Region werden benutzt, um Fremd-DNA begrenzt von den T-DNA-Border-Sequenzen zu transferieren. Die T-Region enthält auch einen selektierbaren Marker für Antibiotikumresistenz, und eine Mehrfachklonierungsstelle zum Inserieren von Sequenzen für den Transfer. Derartige manipulierte Stämme sind als "entschärfte" A. tumefaciens-Stämme bekannt und gestatten die effiziente Transformation von Sequenzen, welche von der T-Region begrenzt werden, in die Zellkern-Genome von Pflanzen.
Oberflächen-sterilisierte Blattscheibchen werden mit dem "entschärften", Fremd-DNA enthaltenden A. tumefaciens inokuliert, zwei Tage lang kultiviert und dann auf Antibiotikum enthaltendes Medium transferiert. Transformierte Triebe werden nach dem Auswurzeln in Medium mit dem passenden Antibiotikum selektiert, in Erdboden überführt und regeneriert.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht transgene Pflanzen oder Nachkommen dieser Pflanzen vor, enthaltend die isolierte DNA der Erfindung. Sowohl monokotyledone als auch dikotyledone Pflanzen werden in Betracht gezogen. Pflanzenzellen werden mit der isolierten DNA, codierend für Δ6-Desaturase, durch jedwedes der obenstehend beschriebenen Pflanzentransformationsverfahren transformiert. Die transformierte Pflanzenzelle, üblicherweise in einer Callus-Kultur oder Blattscheibe, wird durch dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gut bekannte Verfahren zu einer vollständigen transgenen Pflanze regeneriert (z. B. Horsch et al. (1985) Science 227, 1129). In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der transgenen Pflanze um Sonnenblume, Raps, Mais, Tabak, Erdnuß oder Sojabohne. Da die Nachkommenschaft von transformierten Pflanzen die Δ6-Desaturase codierende DNA erbt, werden Samen oder Stecklinge von transformierten Pflanzen verwendet, um die transgene Pflanzenlinie aufrechtzuerhalten.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner ein Verfahren zur Bereitstellung transgener Pflanzen mit einem erhöhten Gehalt an GLA vor. Dieses Verfahren schließt das Einführen von Δ6-Desaturase codierender DNA in Pflanzenzellen, welchen GLA fehlt oder in welchen es bei niedrigen Spiegeln vorliegt, welche aber LA enthalten, und das Regenerieren von Pflanzen mit erhöhtem GLA-Gehalt aus den transgenen Zellen ein. Insbesondere werden kommerziell gezüchtete Nutzpflanzen als der transgene Organismus in Betracht gezogen, einschließlich, jedoch ohne Einschränkung darauf, Sonnenblume, Sojabohne, Raps, Mais, Erdnuß und Tabak.
Die vorliegende Erfindung sieht fernerhin ein Verfahren zur Bereitstellung transgener Organismen vor, welche GLA enthalten. Dieses Verfahren umfaßt das Einführen von Δ6-Desaturase codierender DNA in einen Organismus, bei welchem GLA fehlt oder in niedrigen Spiegeln vorliegt, der jedoch LA enthält. In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Verfahren das Einführen von einem oder mehreren Expressionsvektoren, welche für Δ12-Desaturase und Δ6-Desaturase codierende DNA umfassen, in Organismen, welche sowohl hinsichtlich GLA als auch LA defizient sind. Folglich werden sowohl hinsichtlich LA als auch GLA defiziente Organismen induziert, um LA durch die Expression von Δ12-Desaturase herzustellen, und dann wird GLA aufgrund der Expression von Δ6-Desaturase erzeugt. Expressionsvektoren, umfassend DNA, welche Δ12-Desaturase oder Δ12-Desaturase und Δ6-Desaturase codiert, können durch dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannte Verfahren der rekombinanten Technologie (Sambrook et al., 1989) und die veröffentlichte Sequenz von Δ12-Desaturase (Wada et al. [1990] Nature (London) 347, 200–203) konstruiert werden. Darüber hinaus ist in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung festgestellt worden, daß die Nukleotide 2002–3081 von SEQ. ID NO: 1 für cyanobakterielle Δ12-Desaturase codieren. Folglich kann diese Sequenz verwendet werden, um die vorliegenden Expressionsvektoren zu konstruieren. Im besonderen werden kommerziell gezüchtete Nutzpflanzen als der transgene Organismus in Betracht gezogen, einschließlich, jedoch ohne darauf eingeschränkt zu sein, Sonnenblume, Sojabohne, Raps, Mais, Erdnuß und Tabak.
Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf ein Verfahren zum Herbeiführen von Kühlungstoleranz bei Pflanzen. Kühlungsempfindlichkeit kann auf dem Phasenübergang von Lipiden in Zellmembranen beruhen. Die Phasenübergangstemperatur hängt vom Grad der Ungesättigtheit von Fettsäuren in Membranlipiden ab, und somit kann eine Erhöhung des Grads der Ungesättigtheit, beispielsweise durch Einbringung von Δ6-Desaturase zur Umwandlung von LA in GLA, Kühlungsbeständigkeit herbeiführen oder verbessern. Folglich umfaßt das vorliegende Verfahren das Einführen von Δ6-Desaturase codierender DNA in eine Pflanzenzelle und das Regenerieren einer Pflanze mit verbesserter Kühlungsbeständigkeit aus der transformierten Pflanzenzelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pflanze eine Sonnenblumen-, Sojabohnen-, Raps-, Mais-, Erdnuß- oder Tabakpflanze.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1
Stämme und Kulturbedingungen
Synechocystis (PCC 6803, ATCC 27184), Anabaena (PCC 7120, ATCC 27893) und Synechococcus (PCC 7942, ATCC 33912) wurden photoautotroph bei 30°C in BG11N+-Medium (Rippka et al. [1979], J. Gen. Microbiol. 111, 1–61) unter Beleuchtung mit Glühlampen (60 μE·m^–2·S^–1) herangezogen. Cosmide und Plasmide wurden im Escherichia coli-Stamm DH5α auf LB-Medium, supplementiert mit Antibiotika bei Standardkonzentrationen, wie beschrieben von Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York, selektiert und propagiert.
Beispiel 2
Konstruktion einer genomischen Synechocystis-Cosmidbibliothek
Genomische Gesamt-DNA aus Synechocystis (PCC 6803) wurde mit Sau3A partiell verdaut und auf einem Saccharose-Gradienten fraktioniert (Ausubel et al. [1987] Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Fraktionen, enthaltend die 30 bis 40 kb großen DNA-Fragmente, wurden selektiert und in die dephosphorylierte BamHI-Stelle des Cosmidvektors pDUCA7 (Buikema et al. [1991] J. Bacteriol. 173, 1879–1885) ligiert. Die ligierte DNA wurde in vitro verpackt, wie beschrieben von Ausubel et al. (1987), und verpackter Phage wurde in E. coli DH5α, enthaltend das AvaI- und Eco4711-Methylase-Helferplasmid pRL528, wie beschrieben von Buikema et al. (1991), propagiert. Insgesamt 1152 Kolonien wurden statistisch isoliert und individuell in zwölf 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatten gehalten.
Beispiel 3
Funktionszugewinn-Expression von GLA in Anabaena
Anabaena (PCC 7120), ein filamentöses Cyanobacterium, ist hinsichtlich GLA defizient, enthält aber bedeutende Mengen an Linolsäure, dem Vorläufer für GLA (2; Tabelle 2). Die in Beispiel 2 beschriebene Synechocystis-Cosmidbibliothek wurde in Anabaena (PCC 7120) konjugiert, um Transkonjugate zu identifizieren, welche GLA herstellen. Anabaena-Zellen wurden in BG11N+-Flüssigmedium bis zur mittleren Log-Phase herangezogen und im selben Medium zu einer Endkonzentration von ungefähr 2 × 10⁸ Zellen pro ml resuspendiert. Eine Kultur der mittleren Log-Phase von E. coli RP4 (Burkhardt et al. [1979] J. Gen. Microbiol. 114, 341–348), herangezogen in LB mit Ampicillin, wurde gewaschen und in frischem LB-Medium resuspendiert. Anabaena und RP4 wurden dann vermischt und gleichmäßig auf BG11N+-Platten, enthaltend 5% LB, verteilt. Die genomische Cosmidbibliothek wurde auf LB-Platten, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin und 17,5 μg/ml Chloramphenicol, replika-plattiert und wurde anschließend auf BG11N+-Platten, enthaltend Anabaena und RP4, pflasterartig ausgebracht. Nach 24 Stunden Inkubation bei 30°C wurden 30 μg/ml Neomycin unterschichtet; und die Inkubation bei 30°C wurde fortgesetzt, bis Transkonjuganten erschienen.
Individuelle Transkonjuganten wurden nach der Konjugation isoliert und in 2 ml BG11N+-Flüssigmedium mit 15 μg/ml Neomycin herangezogen. Fettsäuremethylester wurden aus Wildtypkulturen und Kulturen, enthaltend Pools von zehn Transkonjuganten, wie folgend hergestellt. Wildtyp und transgene cyanobakterielle Kulturen wurden durch Zentrifugation abgeerntet und zweimalig mit destilliertem Wasser gewaschen. Fettsäuremethylester wurden aus diesen Kulturen extrahiert, wie beschrieben von Dahmer et al. (1989) J. Amer. Oil. Chem. Soc. 66, 543–548, und wurden mittels Gas-Flüssig-Chromatographie (GLC) unter Anwendung eines Tracor-560, ausgestattet mit einem Wasserstoffflammen-Ionisierungs-Detektor und Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm gebundenes FSOT Superox II, Alltech Associates Inc., IL) analysiert. Die Retentionszeiten und Co-Chromatographie von Standards (erhalten von Sigma Chemical Co.) wurden zur Identifikation von Fettsäuren herangezogen. Die durchschnittliche Fettsäurezusammensetzung wurde als das Verhältnis der Peak-Fläche von jeder C18-Fettsäure bestimmt, wobei eine Normierung an einen internen Standard erfolgte.
Repräsentative GLC-Profile sind in der 2 gezeigt. Es sind C18-Fettsäuremethylester gezeigt. Peaks wurden durch Vergleichen der Elutionszeiten mit bekannten Standards von Fettsäuremethylestern identifiziert und wurden durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie bestätigt. Die Tafel A zeigt die GLC-Analyse von Fettsäuren von Wildtyp-Anabaena. Der Pfeil gibt die Wanderungszeit von GLA an. Die Tafel B ist ein GLC-Profil von Fettsäuren von Transkonjuganten von Anabaena mit pAM542 + 1.8F. Zwei GLA-produzierende Pools (von 25 Pools, die 250 Transkonjuganten repräsentieren), welche GLA herstellten, wurden identifiziert. Individuelle Transkonjuganten aus jedem GLA-positiven Pool wurden hinsichtlich der GLA-Produktion analysiert; zwei unabhängige Transkonjuganten, AS13 und AS75, eine aus jedem Pool, wurden identifiziert, welche signifikante Spiegel an GLA exprimierten und welche die Cosmide cSy13 bzw. cSy75 enthielten (3). Die Cosmide überlappen in einer Region mit einer Länge von ungefähr 7,5 kb. Ein 3,5 kb großes NheI-Fragment von cSy75 wurde in den Vektor pDUCA7 umkloniert und in Anabaena überführt, was zu einer Funktionszugewinn-Expression von GLA führte (Tabelle 2).
Zwei NheI/Hind III-Subfragmente (1,8 und 1,7 kb) des 3,5 kb großen NheI-Fragments von cSy75-3.5 wurden für eine Sequenzierung in "pBLUESCRIPT" (Stratagene) subkloniert (3). Standardmäßige molekularbiologische Techniken wurden durchgeführt, wie beschrieben von Maniatis et al. (1982) und Ausubel et al. (1987). Eine Didesoxy-Sequenzierung (Sanger et al. [1977] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467) von pBS1.8 wurde mit "SEQUENASE" (United States Biochemical) auf beiden Strängen unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer durchgeführt, welche vom Advanced DNA Technologies Laboratory (Biology Department, Texas A & M University) synthetisiert wurden. Eine DNA-Sequenzanalyse erfolgte mit der Software GCG (Madison, WI), wie beschrieben von Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387–395.
Beide NheI/HindIII-Subfragmente wurden in einen konjugalen Expressionsvektor, AM542, sowohl in der Vorwärts- als auch Rückwärtsorientierung in Bezug auf einen cyanobakteriellen Carboxylase-Promotor, überführt und wurden mittels Konjugation in Anabaena eingeführt. Transkonjuganten, welche das 1,8-kb-Fragment in der Vorwärts-Orientierung enthielten (AM542 – 1.8F), erzeugten bedeutende Mengen an GLA und Octadecatetraensäure (2; Tabelle 2). Transkonjuganten, welche andere Konstrukte, entweder rückwärts orientiertes 1,8-kb-Fragment oder vorwärts und rückwärts orientiertes 1,7-kb-Fragment, enthielten, stellten keine nachweisbaren Spiegel an GLA her (Tabelle 2).
Die 2 vergleicht das C18-Fettsäureprofil eines Extraktes aus Wildtyp-Anabaena (2A) mit demjenigen von transgenem Anabaena, enthaltend das 1,8-kb-Fragment von cSy75-3.5 in der Vorwärtsorientierung (2B). Die GLC-Analyse der Fettsäuremethylester aus AM542 – 1.8F zeigte einen Peak mit einer Retentionszeit, identisch zu derjenigen eines authentischen GLA-Standards. Die Analyse dieses Peaks durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) bestätigte, daß er dasselbe Massen-Fragmentationsmuster wie eine GLA-Referenzprobe aufwies. Transgene Anabaena mit veränderten Spiegeln an mehrfach ungesättigten Fettsäuren waren hinsichtlich Wachstumsrate und Morphologie ähnlich zum Wildtyp. Tabelle 2 Zusammensetzung von C18-Fettsäuren in Wildtyp- und transgenen Cyanobakterien

18:0: Stearinsäure;
18.1: Oleinsäure;
18:2: Linolsäure;
18:3(α): α-Linolensäure;
18:3(γ): γ-Linolensäure;
18:4: Octadecatetraensäure

Beispiel 4
Transformation von Synechococcus mit Δ6- und Δ12-Desaturase-Genen
Ein drittes Cosmid cSy7, welches ein Δ12-Desaturase-Gen enthält, wurde durch Screening der genomischen Synechocystis-Bibliothek mit einem Oligonukleotid isoliert, welches aus der veröffentlichten Δ12-Desaturase-Gensequenz von Synechocystis synthetisiert worden war (Wada et al. [1990] Nature (London) 347, 200–203). Ein 1,7 kb großes AvaI-Fragment aus diesem Cosmid, enthaltend das Δ12-Desaturase-Gen, wurde identifiziert und als Sonde verwendet, um zu zeigen, daß cSy13 nicht nur ein Δ6-Desaturase-Gen, sondern auch ein Δ12-Desaturase-Gen enthält (3). Eine genomische Southern-Blot-Analyse zeigte ferner, daß beide, die Δ6- und Δ12-Desaturase-Gene, im Synechocystis-Genom einmalig vorhanden sind, so daß beide funktionellen Gene, beteiligt an der C18-Fettsäure-Desaturierung, im Synechocystis-Genom eng verknüpft sind.
Das einzellige Cyanobacterium Synechococcus (PCC 7942) ist sowohl hinsichtlich Linolsäure als auch GLA (3) defizient. Die Δ12- und Δ6-Desaturase-Gene wurden individuell und gemeinsam in pAM854 (Bustos et al. [1991] J. Bacteriol. 174, 7525–7533) kloniert, einen Shuttle-Vektor, welcher notwendige Sequenzen für die Integration von Fremd-DNA in das Genom von Synechococcus (Golden et al. [1987] Methods in Enzymol. 153, 215–231) enthält. Synechococcus wurde mit diesen Genkonstrukten transformiert, und Kolonien wurden selektiert. Fettsäuremethylester wurden aus transgenem Synechococcus extrahiert und mittels GLC analysiert.
Die Tabelle 2 zeigt, daß die hauptsächlichen Fettsäuren von Wildtyp-Synechococcus Stearinsäure (18:0) und Oleinsäure (18:1) sind. Mit pAM854-Δ12 transformierter Synechococcus exprimierte Linolsäure (18:2) zusätzlich zu den hauptsächlichen Fettsäuren. Transformanten mit pAM854-Δ6 und Δ12 erzeugten sowohl Linoleat als auch GLA (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigten, daß Synechococcus, enthaltend sowohl Δ12- als auch Δ6-Desaturase-Gene, die Fähigkeit zur Einführung einer zweiten Doppelbindung an der Δ12-Position und einer dritten Doppelbindung an der Δ6-Position von C18-Fettsäuren hinzugewonnen hat. Allerdings wurden keine Änderungen in der Fettsäurezusammensetzung in der Transformante beobachtet, welche pAM854-Δ6 enthielt, was anzeigt, daß die Δ6-Desaturase in Abwesenheit von durch die Δ12-Desaturase synthetisiertem Substrat inaktiv ist. Dieses Experiment bestätigt ferner, daß das 1,8 kb große NheI/HindIII-Fragment (3) sowohl codierende als auch Promotor-Regionen des Synechocystis-Δ6-Desaturase-Gens enthält. Transgene Synechococcus mit veränderten Spiegeln an mehrfach ungesättigten Fettsäuren waren hinsichtlich Wachstumsrate und Morphologie ähnlich zum Wildtyp.
Beispiel 5
Nukleotidsequenz von Δ6-Desaturase
Die Nukleotidsequenz des 1,8 kb großen Fragments von cSy75-3.5, einschließlich des funktionellen Δ6-Desaturase-Gens, wurde bestimmt. Ein offenes Leseraster, codierend ein Polypeptid von 359 Aminosäuren, wurde identifiziert (4). Eine Kyte-Doolittle-Hydropathie-Analyse (Kyte et al. [1982] J. Mol. Biol. 157, 105–132) identifizierte zwei Regionen von hydrophoben Aminosäuren, welche Transmembrandomänen repräsentieren könnten (1A); darüber hinaus ist das Hydropathie-Profil der Δ6-Desaturase ähnlich zu demjenigen des Δ12-Desaturase-Gens (1B; Wada et al.) und von Δ9-Desaturasen (Thiede et al. [1986] J. Biol. Chem. 261, 13230–13235). Allerdings ist die Sequenzähnlichkeit zwischen der Δ6- und Δ12-Desaturase von Synechocystis auf der Nukleotid-Ebene geringer als 40% und beträgt ungefähr 18% auf der Aminosäure-Ebene.
Beispiel 6
Transfer von cyanobakterieller Δ6-Desaturase in Tabak
Das cyanobakterielle Δ⁶-Desaturase-Gen wurde in einen Pflanzenexpressionsvektor mobilisiert und unter Anwendung von agrobacterium-vermittelten Gentransfertechniken in Tabak übertragen. Um zu gewährleisten, daß die transferierte Desaturase angemessen in Blättern und sich entwickelnden Samen exprimiert wird, und daß das Desaturase-Genprodukt in das endoplasmatische Reticulum oder den Chloroplasten gelenkt wird, wurden verschiedene Expressionskassetten mit dem offenen Leseraster (ORF) für Synechocystis-Δ-Desaturase konstruiert. Die Komponenten dieser Kassetten schließen folgendes ein: (i) einen 35S-Promotor oder samenspezifischen Promotor, abgeleitet aus dem Sonnenblumen-Helianthinin-Gen, um jeweils die Δ⁶-Desaturase-Genexpression in allen Pflanzengeweben oder lediglich in sich entwickelnden Samen anzutreiben, (ii) ein vermutliches Signalpeptid, entweder aus dem Karotten-Extensin-Gen oder dem Sonnenblumen-Helianthinin-Gen, um neu synthetisierte Δ⁶-Desaturase in das ER zu lenken, (iii) eine ER-Lumen-Retentions-Signalsequenz (KDEL) am COOH-Terminus des Δ⁶-Desaturase-ORF, und (iv) ein optimiertes Transitpeptid, um Δ⁶-Desaturase in den Chloroplasten zu lenken. Der 35S-Promotor ist ein Derivat von pRTL2, beschrieben von Restrepo et al. (1990). Die optimierte Transitpeptid-Sequenz wird von Van de Broeck et al. (1985) beschrieben. Das Karotten-Extensin-Signalpeptid wird von Chen et al. (1985) EMBO J. 9, 2145, beschrieben.
Transgene Tabakpflanzen wurden hergestellt, welche ein chimäres cyanobakterielles Desaturase-Gen enthielten, aufgebaut aus dem Synechocystis-Δ⁶-Desaturase-Gen, fusioniert an eine Retentionssequenz für das endoplasmatische Reticulum (KDEL) und ein Extensin-Signalpeptid, gesteuert von dem CaMV-35S-Promotor. PCR-Amplifikationen von genomischer DNA von transgenem Tabak zeigen, daß das Δ⁶-Desaturase-Gen in das Tabak-Genom eingebaut wurde. Fettsäuremethylester von Blättern dieser transgenen Tabakpflanzen wurden extrahiert und durch Gas-Flüssig-Chromatographie (GLC) analysiert. Dieser transgene Tabak akkumulierte signifikante Mengen von GLA (4). Die 4 zeigt Fettsäuremethylester, wie bestimmt mittels GLC. Die Peaks wurden durch Vergleichen der Elutionszeiten mit bekannten Fettsäuremethylester-Standards identifiziert. Folglich können am Fettsäure-Stoffwechsel beteiligte cyanobakterielle Gene verwendet werden, um transgene Pflanzen mit veränderten Fettsäure-Zusammensetzungen zu erzeugen.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Nukleinsäure, die für eine delta-6-Desaturase codiert, wobei diese Nukleinsäure aus der Reihe (a) Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eines ihrer Fragmente codiert, (b) die Nukleinsäure, die durch SEQ ID NO: 3 oder eines ihrer Fragmente wiedergegeben wird, (c) Nukleinsäure, die zu einer beliebigen Nukleinsäure (a) oder (b) hybridisiert, stammt.
Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 enthält.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, wobei die für eine delta-6-Desaturase codierende Nukleinsäure operativ mit einem Promoter und/oder einem Terminationssignal, das fähig ist, die Expression des Genprodukts dieser Nukleinsäure zu bewirken, operativ verbunden ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem Promoter um einen delta-6-Desaturase-Promoter, einen Anabaena-Carboxylase-Promoter, einen Helianthinin-Promoter, einen Glycin-Promoter, einen Napin-Promoter, den CaMV-35S-Promoter oder einen gewebespezifischen Helianthinin-Promoter handelt.
Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem Terminationssignal um ein Synechocystis-Terminationssignal, ein Nopalinsynthase- Terminationssignal oder ein Samen-Terminationssignal handelt.
Genetisch transformierte isolierte Einzelzelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder einen Vektor nach den Ansprüchen 2 bis 5 enthält.
Genetisch transformierte Zelle nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Zelle um eine tierische Zelle, eine Bakterienzelle, eine Pflanzenzelle oder eine pilzliche Zelle handelt.
Genetisch transformierter nichtmenschlicher Organismus, der eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder einen Vektor nach den Ansprüchen 2 bis 5 enthält.
Genetisch transformierter nichtmenschlicher Organismus nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Organismus um ein Bakterium, einen Pilz, eine Pflanze oder ein Tier handelt.
Pflanze nach Anspruch 9 oder deren transgene Nachkommenschaft, wobei es sich um eine Sonnenblumen-, Sojabohnen-, Mais-, Tabak-, Erdnuß- oder Rapspflanze handelt.
Verfahren zur Bereitstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem gamma-Linolensäure-(GLA)-Gehalt, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) eine Pflanzenzelle mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 5 transformiert und (b) aus dieser Pflanzenzelle eine Pflanze mit erhöhtem GLA-Gehalt regeneriert.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Pflanze um eine Sonnenblumen-, Sojabohnen-, Mais-, Tabak-, Erdnuß- oder Rapspflanze handelt.
Verfahren für die Bereitstellung eines transgenen nichtmenschlichen Organismus, der gamma-Linolensäure (GLA) enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Organismus ohne oder mit nur niedrigem GLA-Gehalt, der jedoch Linolsäure (LA) enthält, mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 5 transformiert.
Verfahren zur Bereitstellung eines transgenen nichtmenschlichen Organismus, der gamma-Linolensäure (GLA) enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Organismus, der sowohl GLA- als auch Linolsäure-(LA-)defizient ist, mit einem Vektor aus der Gruppe (a) Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 5, der außerdem eine isolierte Nukleinsäure, die für eine delta-12-Desaturase codiert, enthält, (b) Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 5 sowie ein Vektor, der eine isolierte Nukleinsäure, die für eine delta-12-Desaturase codiert, enthält, transformiert.
Verfahren zur Bereitstellung eines transgenen nichtmenschlichen Organismus, der Octadecatetraensäure enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Organismus, der gamma-Linolensäure-defizient ist bzw. dem diese fehlt, mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 5 transformiert.
Verfahren nach den Ansprüchen 13 bis 15, wobei es sich bei dem Organismus um ein Bakterium, einen Pilz oder eine Pflanze handelt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei es sich bei der Pflanze um eine Sonnenblumen-, Sojabohnen-, Mais-, Tabak-, Erdnuß- oder Rapspflanze handelt.
Nichtmenschlicher Organismus nach Anspruch 8 oder 9 oder Pflanze nach Anspruch 10 oder deren transgene Nachkommenschaft, der bzw. die weiterhin eine Nukleinsäure, die für eine delta-12-Desaturase codiert, enthält.
Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit verbesserter Kälteresistenz, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) eine Pflanzenzelle mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 5 transformiert und (b) aus dieser transformierten Pflanzenzelle die Pflanze mit verbesserter Kälteresistenz regeneriert.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei der Pflanze um eine Sonnenblumen-, Sojabohnen-, Mais-, Tabak-, Erdnuß- oder Rapspflanze handelt.
Isolierte bakterielle delta-6-Desaturase mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder einem ihrer Fragmente.