DE69233353T2

DE69233353T2 - Transitpeptid-dna sequenz

Info

Publication number: DE69233353T2
Application number: DE69233353T
Authority: DE
Inventors: Michel Lebrun; Bernard Leroux; Alain Sailland
Original assignee: Bayer CropScience SA
Current assignee: Bayer SAS
Priority date: 1991-03-05
Filing date: 1992-03-04
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2012-03-05
Also published as: DK0508909T3; EP0508909A1; DK0924299T3; ES2217446T3; AU1144292A; US5633448A; DE69233353D1; KR100233191B1; USRE37287E1; CA2061636A1; EP0508909B1; ZA921645B; ES2118802T3; FR2673643A1; IE990458A1; BR9200790A; EP0924299B1; MX9200915A; FR2673643B1; ATE267261T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Transitpeptid-DNA-Sequenzen, neue Hybridgene und ihre Verwendung bei Pflanzen, um ihnen eine erhöhte Toleranz gegenüber Herbiziden der Phosphonomethylglycin-Familie zu verleihen. Sie betrifft weiterhin mit Hilfe dieser Gene transformierte Pflanzenzellen, aus diesen Zellen regenerierte transformierte Pflanzen sowie Pflanzen, die aus Kreuzungen, bei denen diese transformierten Pflanzen verwendet werden, hervorgegangen sind.
Bei Glyphosate, Sulfosate oder Fosametine handelt es sich um systemische Herbizide aus der Phosphonomethylglycin-Familie mit einem breiten Wirkungsspektrum. Sie wirken im wesentlichen als kompetitive Hemmer der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (EC 2.5.1.19), oder EPSPS, gegenüber PEP (Phosphoenolpyruvat). Nach ihrer Ausbringung auf die Pflanze werden sie in die Pflanze transportiert, wo sie sich in Regionen mit intensivem Wachstum, insbesondere der Sproß- und Wurzelspitze, anhäufen, wobei sie eine Veränderung oder sogar Abtötung von empfindlichen Pflanzen hervorrufen.
Bei der plastidären EPSPS, dem Hauptangriffspunkt dieser Produkte, handelt es sich um ein Enzym des aromatischen Aminosäurebiosynthesewegs, das von einem oder mehreren nukleären Genen codiert und in Form eines cytoplasmatischen Vorläufers synthetisiert und anschließend in die Plastiden importiert wird, wo es sich in seiner reifen Form anhäuft.
Die Toleranz der Pflanzen gegenüber Glyphosate und Produkte dieser Familie wird dadurch erzielt, daß man ein in bezug auf die Hemmung des Produkts dieses Gens durch Glyphosate mutiertes oder nichtmutiertes EPSPS-Gen pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs stabil in das Genom der Pflanzen einbaut. Angesichts der Wirkungsweise von Glyphosate und dem Grad der Glyphosate-Toleranz des Produkts der verwendeten Gene ist es interessant, das Produkt der Translation dieses Gens so exprimieren zu können, daß es stark in den Plastiden angehäuft werden kann.
Zum Beispiel aus dem amerikanischen Patent 4 535 060 ist es bekannt, einer Pflanze eine Toleranz gegenüber ein Herbizid des obengenannten Typs, insbesondere N-Phosphonomethylglycin oder Glyphosate, zu verleihen, und zwar dadurch, daß man in das Genom von Pflanzen ein für eine EPSPS codierendes Gen mit mindestens einer Mutation, die dieses Enzym nach der Lokalisation des Enzyms in das plastidäre Kompartiment resistenter gegen seinen kompetitiven Hemmer (Glyphosate) macht, einbringt (siehe EP 0189707 , EP 0218571 oder WO 88/02402). Um eine höhere Verläßlichkeit bei der Verwendung dieser Pflanzen unter landwirtschaftlichen Bedingungen zu erzielen, müssen diese Techniken jedoch noch verbessert werden.
In der vorliegenden Beschreibung versteht man unter „Pflanze" jeglichen mehrzelligen differenzierten Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist, und unter „Pflanzenzelle" jegliche Zelle, die von einer Pflanze stammt und undifferenzierte Gewebe wie Kalli oder differenzierte Gewebe wie Embryonen oder Teile von Pflanzen oder Samen darstellen kann.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von transformierten Pflanzen mit einer verbesserten Toleranz gegenüber Herbiziden der Phosphonomethylglycin-Familie durch die Regeneration von Zellen, die mit Hilfe von neuen Hybridgenen die ein Gen für Toleranz gegenüber diesen Herbiziden enthalten, transformiert werden. Die Erfindung betrifft ebenfalls diese neuen Hybridgene, die neuen Transitpeptide, die sie enthalten, sowie die sie enthaltenden Pflanzen, die durch eine Anhäufung des mutierten reifen Enzyms in den Pflanzen stärker tolerant gemacht worden sind.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Hybridgen, das Pflanzen eine erhöhte Toleranz gegenüber einem Herbizid, das die EPSPS angreift, verleiht und das in Transkriptionsrichtung eine Promoterregion, eine Transitpeptidregion, eine Sequenz eines Gens, das für ein Glyphosatetoleranzenzym codiert und eine 3'-nichttranslatierte Polyadenylierungssignalregion umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Transitpeptidregion in Transkriptionsrichtung ein Transitpeptid eines für ein im Plastiden lokalisiertes Enzym codierenden pflanzlichen Gens, eine Teilsequenz des reifen N-terminalen Abschnitts eines für ein im Plastiden lokalisiertes Enzym codierenden pflanzlichen Gens und schließlich ein zweites Transitpeptid eines für ein im Plastiden lokalisiertes Enzym codierendes pflanzliches Gen umfaßt.
Die Erfindung betrifft ebenfalls jegliche DNA-Sequenz der oben definierten Transitpeptidregion.
Die Transitpeptide, die in der Transitpeptidregion verwendet werden können, können als solche bekannt sein und pflanzlichen Ursprungs sein, z. B. aus Mais, Sonnenblume, Erbse, Tabak oder anderen stammen. Das erste und zweite Transitpeptid können identisch, analog oder unterschiedlich sein. Sie können weiterhin jeweils eine oder mehrere Transitpeptideinheiten enthalten. Vorzugsweise verwendet man eine Sequenz, die aus der kleinen Unterheit des Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/oxygenase (RuBisCO)-Gens stammt.
Die Teilsequenz des reifen N-terminalen Teils stammt aus einem pflanzlichen Gen, die für ein Enzym mit Lokalisierung im Plastiden codiert, z. B. einem Gen aus Mais, Sonnenblume, Erbse oder anderen, wobei die Ausgangspflanzenart mit der Pflanzenart, aus der das erste bzw. das zweite Transitpeptid stammen, identisch oder analog bzw. davon unterschiedlich sein kann. Außerdem kann der Sequenzabschnitt des reifen Abschnitts eine unterschiedliche Anzahl, im allgemeinen 10 bis 40, vorzugsweise 18 bis 33, Aminosäure umfassen. Vorzugsweise verwendet man eine Sequenz, die aus der kleinen Untereinheit des Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/oxygenase(RuBisCO)-Gens stammt.
Die gesamte Transitregion kann auf eine Art und Weise, die als solche bekannt ist, insbesondere durch Fusion oder auf eine beliebige andere Weise konstruiert werden. Die Aufgabe dieser charakteristischen Region besteht darin, ein reifes und natives Protein höchstwirksam freizusetzen.
Die für die Herbizidtoleranz codierende Sequenz, die in dem erfindungsgemäßen Hybridgen verwendet werden kann, codiert für eine mutierte EPSPS mit einer gewissen Glyphosatetoleranz. Diese Sequenz, die insbesondere durch Mutation des EPSPS-Gens erhalten wird, kann bakteriellen Ursprungs sein und z. B. aus Salmonella typhimurium stammen (im folgenden Text als „AroA-Gen" bezeichnet) oder pflanzlichen Ursprungs sein und z. B. aus der Petunie oder der Tomate stammen. Diese Sequenz kann eine oder mehrere Mutationen umfassen, z. B. die Pro-101-Mutation zu Ser oder die Mutation Gly-96 zu Ala.
Die Promoterregion des erfindungsgemäßen Hybridgens kann vorteilhaft aus mindestens einem Promoter eines natürlich in Pflanzen exprimierten Gens, also Promotern, die von Viren stammen, wie dem der Blumenkohlmosaikvirus-35S-RNA (CaMV35S) oder pflanzlichen Ursprungs sein, wie die kleine Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/oxygenase(RuBisCO)-Gen Untereinheit einer Kultur wie Mais oder Sonnenblume bestehen.
Die 3'-nichttranslatierte Polyadenylierungssignalregion des erfindungsgemäßen Hybridgens kann beliebigen Ursprungs sein, z. B. bakteriellen Ursprungs, wie die des Nopalinsynthasegens, oder pflanzlichen Ursprungs, wie die der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais oder Sonnenblume, sein.
Das erfindungsgemäße Hybridgen kann außer den wesentlichen obengenannten Abschnitten eine nichttranslatierte Zwischenregion (Linker) zwischen der Promoterregion und der Codiersequenz umfassen, die beliebigen Ursprungs, also bakteriellen, viralen oder pflanzlichen Ursprungs, sein kann.
BEISPIEL 1: KONSTRUKTION EINES HYBRIDGENS
Das erfindungsgemäße Hybridgen wird aus den folgenden Elementen konstruiert:
1) „Doppel-CaMV"-Promoter (bei dem also ein Abschnitt verdoppelt ist)
Der CaMV-35S-Promoter wurde von Odell et al. (1985) isoliert. Ein Klon, nämlich pJO 5-2, der ungefähr 850 bp stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt enthält, wurde mit EcoRI-HindIII geschnitten, die Enden dieses isolierten Fragments wurden mit Klenow-Polymerase geglättet und das Fragment wurde in die HincII-Stelle des Vektors pUC19 (Yannish-Perron et al., 1985) insertiert. Dieser Promoter wurde mit ClaI verdaut, die Enden wurden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und anschließend wurde mit HindIII verdaut. Ein aus dem gleichen Ausgangspromoter isoliertes HindIII-EcoRV-Fragment wurde zwischen diese beiden Stellen eingefügt. Der so erhaltene Promoter enthält stromaufwärts der Regulationselemente des CaMV-35S-Promoters eine doppelte Amplifizierungsregion. Er wurde in Form eines HindIII-EcoRI-Fragments in den Vektor pRPA-BL 150 A alpha 2, der in der französischen Patentanmeldung 88/04130 beschrieben ist und mit HindIII und EcoRI geschnitten wurde, eingefügt.
2) Transitregion
Die beiden Transitpeptide sowie die verwendeten reifen Proteinelemente stammen aus cDNA, die von der kleinen RuBisCO-Untereinheit des Maisgens kloniert wurde, deren Gen von Lebrun et al. (1987) beschrieben wurde, und aus cDNA, die aus der kleinen RuBisCO-Untereinheit des Sonnenblumengens kloniert wurde, die von Waksman et al. (1987) isoliert wurde. Genauer gesagt umfaßt die Transitregion, die als optimiertes Transitpeptid bezeichnet wird, in Translationsrichtung

– ein Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Sonnenblume,
– eine 22 Aminosäure lange N-terminale Sequenz des reifen Abschnitts der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais,
– ein Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais.

Das Konstrukt, bei dem dieses optimierte Transferpeptid verwendet wird, wird als pRBA-BL 410 bezeichnet.
Es können auch andere analoge Sequenzen verwendet werden, die jeweils Sequenzen mit 10 bis 40, vorzugsweise 18 bis 33, Aminosäuren enthalten.
Um ein Vergleichselement bereitzustellen, wurde ein weiteres Konstrukt mit einem ersten Transitpeptid und dem gleichen Abschnitt der reifen Maissequenz ohne das zweite Transitpeptid dem Stand der Technik entsprechend (pRPA-BL 294) hergestellt.
3) Strukturgen
Dieses stammt aus dem an der Pro-101-Position zu Ser mutierten Salmonella-typhimurium-EPSPS-Gen, das von Stalker et al. (1985) isoliert worden war. Der (von Calgene bereitgestellte) Klon pMG34-2 wurde mit SmaI linearisiert und anschließend mit Vigna-radiata-Nuklease behandelt. Nach erneutem Schneiden mit SmaI wurden die beiden glatten Enden ligiert. Der erhaltene Klon weist auf dem Start-ATG eine NcoI-Stelle sowie 17 bp stromabwärts des Stopp-Codons eine SalI-Stelle auf. Dieser Klon wurde pRPA-BL 104 genannt.
4) Polyadenylierungssignalregion
Das Fragment stammt aus dem Nopalinsynthasegen von pTi37 (Bevan et al., 1983). Diese Stelle liegt auf einem 260 bP langen MboI-Fragment (Fraley et al., 1983; PCT-Patentanmeldung 84/02913), das mit Klenow-Polymerase behandelt und in die SmaI-Stelle von M13 mp 18 geklont wurde, um die BamHI- und EcoRI-Stellen am 5'- bzw. 3'-Ende einzuführen.
Nach dem Schneiden mit BamHI und Behandeln mit Vigna-radiata-Nuklease und anschließendem Schneiden mit EcoRI und Behandlung mit Klenow-Polymerase wurde das erhaltene Fragment in den Vektor p-BL 20 (siehe französische Patentanmeldung 88/04130) eingeführt, mit XbaI und BamHI geschnitten und mit Klenow-Polymerase behandelt. Nach erneutem Schneiden mit SalI und SstI erhält man ein ungefähr 0,4 kb langes Fragment, das die 3'-nos-Sequenz neben der SalI-Schnittstelle und die „right border" der T-DNA neben der SstI-Schnittstelle enthält.
Die unterschiedlichen Elemente wurden folgendermaßen assembliert:
„Mais-RuBisCO-KSU-Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais/AroA-Gen"-Fusion
Das Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit des Maisgens stammt von einem 192 bP großen EcoRI-SphI-Fragment, das von der cDNA stammt, die dem Gen für die kleine RuBisCO-Untereinheit des Maisgens entspricht (beschrieben von Lebrun et al. (1987)), und das eine NcoI-Spaltstelle über dem Translationsstartcodon und eine SphI-Spaltstelle, die der Spaltstelle des Transitpeptids entspricht, aufweist.
Durch Behandlung des SphI-Endes mit der Polymerase des Bakteriophagen T4 und durch ihre Ligation mit dem mit Klenow-Polymerase behandelten NcoI-Ende des AroA-Gens des nochmals mit EcoRI geschnittenen pRPA-BL 104 gelangt man zu der Translationsfusion zwischen dem Mais-Transitpeptid und dem Gen der bakteriellen EPSPS.
Transitpeptid der Mais-RuBisCO-KUU/22 Aminosäuren lange Sequenz des reifen Abschnitts der Mais-RuBisCO-KUU/AroA-Gen-Fusion
Auf ähnliche Weise wird ein 228 bP langes EcoRI-HindII-Fragment der cDNA der kleinen RuBisCO-Untereinheit des Maisgens mit dem mit Klenow-Polymerase behandelten NcoI-Ende des AroA-Gens von mit EcoRI erneut geschnittenem pRPA-BL-104 ligiert. Man gelangt zu einer Translationsfusion zwischen dem Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais, den 22 Aminosäuren des reifen Abschnitts der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais und dem Gen der bakteriellen EPSPS.
Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Sonnenblume
Das Fragment stammt aus der von Waksman und Freyssinet (1987) isolierten cDNA. Nach der Methode von Zoller und Smith (1984) wurde an der Spaltstelle des Transitpeptids eine SphI-Spaltstelle geschaffen. Bei dem so erhaltenen Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Sonnenblume handelt es sich um ein 171 bP langes EcoRI-SphI-Fragment.
Transitpeptid der Sonnenblumen-RuBisCO-KUU/22 Aminosäuren lange Sequenz des reifen Abschnitts der Mais-RuBisCO-KUU/AroA-Gen-Fusion
Aus dem Konstrukt, das die Fusion Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Mais-RuBisCO/22 Aminosäuren lange Sequenz der kleinen Untereinheit der Mais-RuBisCO des reifen Abschnitts des Maisgens enthält, wurden mit EcoRI-SphI die 171 bP, die dem Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus diesem Sonnenblumengen entsprachen, herausgeschnitten. Ein entstandenes Konstrukt weist eine Substituion der EcoRI-SphI-Fragmente auf und stellt eine „Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Sonnenblume/22 Aminosäuren lange Sequenz des reifen Teils der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais/AroA-Gen-Translationsfusion" dar.
Das EcoRI-SalI-Fragment wurde mit dem SalI-SstI-Fragment, das die 3'-nos-Sequenz und die „right border" der T-DNA enthält, ligiert. Das entstandene EcoRI-SstI-Fragment, das „Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Sonnenblume/22 Aminosäuren lange Sequenz des reifen Abschnitts der kleinen Untereinheit der Mais-RuBisCO/AroA-Gen/3'-nos/T-DNA „right border"" enthält wird durch das EcoRI-SstI-Fragment, das die „right border" der T-DNA des Plasmids 150 A alpha 2 enthält, das den „doppelten CaMV"-Promoter enthält, ersetzt. Die Transkriptionsfusion „Doppel-CaMV/Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Sonnenblumen/22 Aminosäuren lange Sequenz des reifen Abschnitts der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais/AroA-Gen/3'-nos" in dem Vektor 150 A alpha 2 wurde pRPA-BL 294 genannt.
„Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Sonnenblume/22 Aminosäuren lange Sequenz der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais/Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais/AroA-Gen"-Fusion
Das obergenannte Konstrukt wird mit NcoI-HindIII geschnitten, wodurch das AroA-Gen freigesetzt wird. Dann wird es mit einem 1,5 kb langen NcoI-HindIII- Fragment, das die „Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais/AroA-Gen"-Fusion enthält, ligiert. Ein erhaltenes Konstrukt weist eine Substitution des NcoI-HindIII-Fragments auf und ist eine „Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Sonnenblume/22 Aminosäuren lange Sequenz der kleinen Untereinheit der RuBisCO des reifen Abschnitts des Maisgens/Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais/AroA-Gen"-Translationsfusion.
Das EcoRI-SalI-Fragment wurde mit dem Fragment SalI-SstI, das die 3'-nos-Sequenz und die „right border" der T-DNA enthält, ligiert. Das so erhaltene EcoRI-SstI-Fragment, das „Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Sonnenblume/22 Aminosäuren lange Sequenz der kleinen Untereinheit der RuBisCO des reifen Abschnitts des Maisgens/Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais/AroA-Gen/3'-nos/T-DNA "right border"" enthält, wird durch das EcoRI-SstI-Fragment, das die T-DNA-„right border" des Plasmids 150 A alpha 2 enthält, das den doppelten CaMV-Promoter enthält, ersetzt. Die „Doppel-CaMV/Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Sonnenblume/22 Aminosäuren lange Sequenz der kleinen RuBisCO-Untereinheit des reifen Abschnitts des Gens aus Mais/Transitpeptid der kleinen RuBisCO-Untereinheit aus Mais/AroA-Gen/3'-nos"-Transkriptionsfusion in dem Vektor 150 A alpha 2 wurde pRPA-BL 410 genannt.
BEISPIEL 2: RESISTENZ VON TRANSFORMIERTEN PFLANZEN
1. Transformation
Der Vektor wird in den nichtonkogenen Agrobakterium-Stamm EHA 101 (Hood et al., 1987), der das Kosmid pTVK 291 (Komari et al., 1986) birgt, eingeführt. Die Transformationstechnik beruht auf dem Verfahren von Horsh et al. (1985).
2. Regeneration
Die Regeneration von Tabak PBD6 (Herkunft SEITA, Frankreich) wird ausgehend von Blattexplantaten auf Murashige-Skoog(MS)-Grundmedium mit 30 g/l Saccharose sowie 200 μg/ml Kanamycin durchgeführt. Die Blattexplantate werden von Gewächshaus- oder in-vitro-Pflanzen entnommen und nach der Blattscheibchentechnik (Science 1985, Bd. 227, S. 1229–1231) in drei aufeinanderfolgenden Schritten transformiert. Der erste Schritt umfaßt die Induktion von Sprossen auf einem MS-Medium mit einem Zusatz von 30 g/l Saccharose, das 0,05 mg/l Naphthylessigsäure (NAE) und 2 mg/l Benzylaminopurin (BAP) enthält, während 15 Tagen. Die während dieses Abschnitts gebildeten Sprosse werden anschließend durch 10tägige Kultivierung auf einem MS-Medium mit Zusatz von 30 g/l Saccharose, jedoch ohne Hormone, weiter entwickeln gelassen. Dann entfernt man die entwickelten Sprosse und kultiviert sie auf einem MS-Bewurzelungsmedium mit halbem Salz-, Vitamin- und Zuckergehalt, das keine Hormone enthält. Nach ungefähr 15 Tagen werden die bewurzelten Sprosse in Erde umgesetzt.
3. Bestimmung der Glyphosatetoleranz
a) in vitro
Die Toleranz wird dadurch bestimmt, daß man die extrapolierte Kallusmasse von 100 Blattscheibchen mit einem Durchmesser von 0,5 cm nach 30tägigem Wachstum auf einem MS-Medium mit einem Zusatz von 30 g/l Saccharose, 0,05 mg/l Naphthylessigsäure und 2 mg/l BAP, das 35 Polyesterpolymeren Glyphosate und 200 Mikrogramm/ml Kanamycin enthält, wiegt. Unter diesen Bedingungen beobachtet man, daß bei den mit dem erfindungsgemäßen pRPA-BL-410-Hybridgen modifizierten Tabakpflanzen die Kallusmasse 34 g beträgt, während die Masse bei den mit dem Hybridgen ohne zweites Transitpeptid modifizierten Pflanzen nur 12 g beträgt.
b) in vivo
30 Pflanzen, die aus der Regeneration von mit pRPA-BL 294 bzw. pRPA-BL 410 transformierten Tabakpflanzen stammen, werden ins Glashaus umgesetzt und im 5-Blatt-Stadium durch Besprühen mit einer wäßrigen Suspension mit einer Dosis, die 0,6 kg/ha Glyphosate (Round-Up) entspricht, behandelt. Nach 21 Tagen wird eine phänotypische Beobachtung der Pflanzen im Vergleich zu nichttransformierten Kontrollpflanzen durchgeführt. Unter diesen Bedingungen findet man, daß bei den mit pRPA-BL 410 transformierten Pflanzen eine vernachlässigbar kleine Phytotoxizität beobachtet wird, während die Kontrollpflanzen völlig abgetötet sind; außerdem wird bei denjenigen Pflanzen, die mit einem Hybridgen, das sich von dem vorgenannten durch die Abwesenheit des zweiten Transitpeptids unterscheidet, transformiert worden waren, eine Phytotoxizität, die mindestens 30% Abtötung entspricht, beobachtet.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Verbesserung, die durch Verwendung eines erfindungsgemäßen Hybridgens bei einem gleichen Gen, das für Glyphosatetoleranz codiert, erzielt wird.
Die erfindungsgemäßen transformierten Pflanzen können als Kreuzungspartner zur Gewinnung von Linien und von Hybriden mit einer erhöhten Glyphosatetoleranz verwendet werden.

Claims

Transitpeptid-DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Transkriptionsrichtung eine Sequenz, die für ein erstes Transitpeptid eines für ein im Plastiden lokalisiertes Enzym codierenden pflanzlichen Gens codiert, eine Teilsequenz des reifen N-terminalen Abschnitts eines für ein im Plastiden lokalisiertes Enzym codierenden pflanzlichen Gens und schließlich eine Sequenz, die für ein zweites Transitpeptid eines für ein im Plastiden lokalisiertes Enzym codierenden pflanzlichen Gens codiert, umfaßt.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das zweite Transit codierende Sequenz von der gleichen Pflanze wie die für das erste Transitpeptid codierende Sequenz stammt.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das zweite Transit codierende Sequenz von einer anderen Pflanze als der des ersten Transitpeptids stammt.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Sequenz, die für eines der Transitpeptide codiert, von der kleinen Untereinheit des Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO)-Gens stammt.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz des reifen N-terminalen Abschnitts von der kleinen Untereinheit des RuBisCO-Gens stammt.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Sequenz, die für eines der Transitpeptide codiert, vom gleichen Gen wie dem Ausgangsgen der Sequenz des reifen Abschnitts stammt.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Sequenz, die für eines der Transitpeptide codiert, von einem Maisgen stammt.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Sequenz, die für eines der Transitpeptide codiert, von einem Sonnenblumengen stammt.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz des reifen Abschnitts von einem Maisgen stammt.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz des reifen Abschnitts von einem Sonnenblumengen stammt.
DNA-Sequenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz des reifen Abschnitts 10 bis 40 Aminosäuren umfaßt.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz des reifen Abschnitts 18 bis 33 Aminosäuren umfaßt.
Hybridgen, das Pflanzen eine erhöhte Toleranz gegenüber einem Herbizid, das das Enzym 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) angreift, verleiht und das in Transkriptionsrichtung eine Promoterregion, eine Transitpeptidregion, eine Sequenz, die für Glyphosatetoleranz codiert und eine 3'-nichttranslatierte Polyadenylierungssignalregion umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Transitpeptidregion eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfaßt.
Hybridgen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz, die für Glyphosatetoleranz codiert, bakteriellen Ursprungs ist.
Hybridgen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz, die für Glyphosatetoleranz codiert, pflanzlichen Ursprungs ist.
Verfahren für die Konstruktion eines Hybridgens nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils mindestens zwei Transitpeptidregionen und mindestens eine Sequenz des reifen Abschnitts von entsprechenden pflanzlichen plastidären Genen sowie mindestens eine Sequenz, die für Glyphosatetoleranz codiert, und eine entsprechende Polyadenylierungssignalregion isoliert und diese dann in der Transkriptionsrichtung des Toleranzgens zusammenfügt.
Vektor für die Transformation von Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß dieser ein Hybridgen nach einem der Ansprüche 13 bis 15 umfaßt.
Transformierte Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß diese ein Hybridgen nach einem der Ansprüche 13 bis 15 enthält.
Mit verbesserter Toleranz gegenüber einem Herbizid, das die EPSPS angreift, transformierte Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß diese ausgehend von einer Zelle nach Anspruch 18 erhalten wurde.
Pflanze nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um eine zweikeimblättrige Pflanze handelt.
Pflanze nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um eine einkeimblättrige Pflanze handelt.
Mit verbesserter Toleranz gegenüber einem Herbizid, das die EPSPS angreift, transformierte Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß diese aus Kreuzungen, bei denen die Pflanzen nach Anspruch 19 und 20 verwendet wurden, hervorgeht.
Verfahren zur Gewinnung von Linien und Hybriden mit einer erhöhten Glyphosatetoleranz, dadurch gekennzeichnet, daß man als Eltern die Pflanzen nach einem der Ansprüche 19 bis 21 verwendet.
Verfahren zur Behandlung von Pflanzen nach einem der Ansprüche 19 bis 22 oder von Pflanzen, die mit dem Verfahren nach Anspruch 23 erhalten wurden, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Pflanzen mit einem Herbizid, das die EPSPS angreift, behandelt.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Herbizid um ein systemisches Breitbandherbizid der Phosphonomethylglycin-Familie handelt.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Herbizid um Glyphosate handelt.