DE69233109T2

DE69233109T2 - Transgene tiermodelle fur alzheimer-krankheit

Info

Publication number: DE69233109T2
Application number: DE69233109T
Authority: DE
Inventors: Samuel Wadsworth; Benjamin Snyder; B. Vermuri REDDY; Cha-Mer Wei; Paul Leibowitz
Original assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1992-01-07
Filing date: 1992-12-29
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2012-12-30
Also published as: JP2007267742A; EP0620849B1; DK0620849T3; EP0620849A1; US5811633A; PT620849E; AU3336093A; ES2204899T3; IL104304A0; CA2127450A1; IL104304A; DE69233109D1; WO1993014200A1; AU671093B2; CA2127450C; JPH07506720A; ATE243746T1; US5720936A; JP2004089187A

Description

Hintergrund der Erfindung
Es wird eine Technologie zur Erzeugung transgener Tiere beschrieben, die aufgrund der Expression des Alzheimer-Vorläuferproteins oder einer modifizierten Version von diesem Symptome der menschlichen Alzheimer-Krankheit zeigen.
Die Alzheimer-Krankheit (AK) ist eine degenerative Erkrankung des Gehirns, die erstmals 1907 von Alois Alzheimer beschrieben wurde, nachdem er einen seiner Patienten untersucht hatte, der an einer drastischen Verminderung seiner kognitiven Fähigkeiten litt und eine generalisierte Demenz zeigte („The early story of Alzheimer's Disease", herausgegeben von Bick K., Amaducci L. und Pepeu G. (Raven Press, New York, 1987). Sie stellt den wichtigsten Grund für eine Demenz bei älteren Personen dar. AK-Patienten haben starke Probleme bezüglich eines Gedächtnisverlustes und intellektueller Fähigkeiten, und diese Probleme nehmen bis zu dem Punkt zu, an dem sich die Patienten nicht mehr wie normale Individuen verhalten können. Mit dem Verlust der intellektuellen Fähigkeiten weisen die Patienten Veränderungen ihrer Persönlichkeit auf, zeigen ein gestörtes Sozialverhalten und werden schizophren („A guide to the understanding of Alzheimer's Disease and related disorders", herausgegeben von Jorm A. F. (New York University Press, New York, 1987). Die AK ist sowohl für die Opfer als auch für deren Familien verheerend, da es keine wirksame Behandlung zur Linderung oder Verhinderung der unvermeidlichen Neurodegeneration gibt. Die häufigsten Probleme bei Alzheimer-Patienten sind die Unfähigkeit, sich ohne fremde Hilfe anzuziehen, die den ganzen Tag anhaltende Ruhelosigkeit, die Inkontinenz sowie Schlafstörungen. Die Familienangehörigen berichten über Verlegenheit, Angst, Depressionen und ein gestörtes Sozialleben.
Die Auswirkungen der AK auf die Gesellschaft und die nationalen Ökonomien sind enorm. Es wird erwartet, dass die geistig beeinträchtige Gruppe älterer Menschen in den Vereinigten Staaten von Amerika bis zum Jahr 2000 um 41% zunehmen wird. Sie kostet die Systeme des Gesundheitswesen, die eine institutionelle und begleitende Betreuung der Patienten bereit stellen müssen, mit jährlichen Kosten von 40 Milliarden Dollar große Summen (Jorm, 1987; Fisher, LM: New York Times, 23. August 1989 D1, "Alzheimer's Disease", herausgegeben von Reisberg, B. (The Free Press, New York & London, 1983). Diese Faktoren implizieren, dass Vorbeugungsmaßnahmen getroffen werden müssen, um die Häufigkeit der AK durch die Bereitstellung von Fördermitteln für die AK-Forschung zu senken.
Auf makroskopischer Ebene sind die Gehirne von AK-Patienten gewöhnlich kleiner, wobei sie manchmal weniger als 1 000 Gramm wiegen. Auf mikroskopischer Ebene gehören zu den histopathologischen Symptomen der AK Bündel von Neurofibrillen (neurofibrillary tangles, NFT), neuritische Plaques und die Degeneration von Neuronen. AK-Patienten weisen eine Degeneration von Nervenzellen im frontalen und temporalen Cortex der Großhirnrinde auf, der pyramidalen Neuronen des Hippocampus, der Neuronen der medialen, medial-zentralen und kortikalen Nuclei der Mandelkerne, der noradrenergen Neuronen im Locus coeruleus und der Neuronen des basalen cholinergen Systems des Vorderhirns. Der Verlust von Neuronen im cholinergen System führt zu einem konsistenten Mangel an cholinergen präsynaptischen Markern bei der AK (Reisberg, 1983; „Alzheimer's Diseaese and related disorders, research and development", herausgegeben von Kelly W. E. (Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1984).
Die AK ist mit neuritischen Plaques assoziiert, die einen Durchmesser von bis zu 200 μm im Cortex, Hippocampus, Subiculum, Hippocampus-Gyrus und in den Mandelkernen haben. Einer der Hauptbestandteile der neuritischen Plaques ist Amyloid, das durch Kongorot anfärbbar ist (Reisberg, 1983; Kelly, 1984). Die Amyloid-Plaques liegen extrazellulär, sind im Hellfeld pink oder rostfarben und in polarisiertem Licht doppelbrechend. Die Plaques bestehen aus Polypeptidfibrillen und kommen oft um Blutgefäße herum vor, wodurch sie die Blutversorgung verschiedener Neuronen im Gehirn vermindern.
Es wurden verschiedene Faktoren, wie eine genetische Veranlagung, infektiöse Agenzien, Toxine, Metalle und Kopfverletzungen, als mögliche Mechanismen der AK-Neuropathie vorgeschlagen. Die verfügbaren Informationen deuten jedoch stark auf zwei verschiedene Typen einer genetischen Veranlagung für die AK hin. Erstens haben molekulare Analysen Hinweise auf Mutationen im Gen des Amyloid-Vorläuferproteins (amyloid precursor protein, APP) bei bestimmten, mit der AK geschlagenen Familien geliefert (Goate et al., Nature 349, 704–706 (1991); Murrell, J. et al., Science 254, 97–99 (1991); Chartier-Harlin, M.-C. et al., Nature 353, 844–846 (1991)). Zweitens liegt bei bestimmten anderen Familien mit einer klaren genetischen Veranlagung für die AK die Mutation auf dem Chromosom 21 vor, ist aber vom APP-Locus verschieden (Tanzi, R. E. et al., Nature 331, 528–530 (1988)).
Amyloid-Plaques kommen in großer Häufigkeit bei AK-Patienten und bei Personen mit Down Syndrom, die das Alter von 40 Jahren erreichen, vor. Die Plaques kommen auch im normalen alternden Gehirn vor, allerdings in geringerer Zahl. Diese Plaques bestehen aus dem Amyloid-β-Peptid (β-Peptid) (Glenner und Wong et al., Biochem. Biophvs. Res. Comm. 120, 885–890 (1984)), das auch den Haupt-Proteinbestandteil in zerebrovaskuären Ablagerungen und den neurofibrillären Bündeln ausmacht. Das β-Peptid ist ein filamentäres Material, dass in Beta-Faltblattstruktur vorliegt und ein Molekulargewicht von 4,2–4,5 Kilodalton hat. Es ist ein hydrophobes Peptid aus 39–42 Aminosäuren. Die Bestimmung seiner Aminosäuresequenz führte zur Klonierung der APP-cDNA (Kang et al., Nature 325, 733–735 (1987); Goldgaber et al., Science 235, 877–880 (1987); Robakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 4190–4194 (1987); Tanzi et al., Nature 331, 528–530 (1988)) und der genomischen APP-DNA (Lemaire et al., Nucl. Acids Res. 17, 517–522 (1989); Yoshikai et al., Gene 87, 257–263 (1990). Es wurden drei Formen von APP-cDNAs isoliert (APP695, APP751 und APP770), und sie entstehen aus einer einzigen Vorläufer-RNA durch alternatives Splicing. Das Gen erstreckt sich über mehr als 175 kb und hat 18 Exons (Yoshikai et al., 1990). Das APP enthält drei extrazelluläre Domänen, einen Transmembran-Bereich und eine zytoplasmatische Domäne. Das β-Peptid besteht aus 28 Aminosäuren gerade außerhalb der Membran und 14 Resten der hydrophoben Transmembran-Domäne. Somit ist das β-Peptid ein Spaltprodukt des APP, das natürlichennreise im Gehirn und in anderen Geweben, wie dem Herzen, den Nieren und der Milz, vorkommt. Ablagerungen des β-Peptids finden sich üblicherweise jedoch nur im Gehirn, obwohl Joachim et al., Nature 341, 226–228 (1989) über Ablagerungen von β-Peptid außerhalb des Gehirns, in der Haut, dem Darm und subcutanen Geweben, bei den meisten AK-Patienten berichteten.
Die größeren alternativen Formen des APP (APP751, APP770) bestehen aus dem gesamten APP695 plus einer oder zwei zusätzlichen Domäne(n). Das APP751 besteht aus dem gesamten APP695 plus zusätzlichen 56 Aminosäuren, die eine Homologie zur Kunitz-Familie von Serinprotease-Inhibitoren (KP1) zeigen (Tanzi et al., 1988; Weidemann et al., Cell 57, 115–126 (1989); Kitaguchi et al., Nature 331, 530–532 (1988); Tanzi et al., Nature 329, 156 (1987)). Das APP770 enthält APP751 und eine weitere Domäne von 19 Aminosäuren, die homolog zum Zelloberflächenantigen OX-2 von Neuronen ist (Weidemann et al., Cell 57, 115-126 (1989); Kitaguchi et al., 1988). Das APP wird posttranslational durch die Entfernung der Leadersequenz und durch die Anfügung von Sulfat- und Zuckergruppen modifiziert.
Van Broeckhaven et al., Science 248, 1120–1122 (1990) haben gezeigt, dass das APP-Gen in zwei niederländischen Familien eng mit der erblichen Hirnblutung mit Amyloidose (hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis, HCHWA-D) verknüpft ist. Das wurde durch die Identifizierung einer Punktmutation im codierenden Bereich des APP bei zwei niederländischen Patienten bestätigt (Levy et al., Science 248, 1124–1128 (1990). Die Mutation bewirkte einen Ersatz einer Glutaminsäure durch ein Glutamin in der Position 22 des β-Peptids (Position 618 des APP695). Außerdem sind bestimmte Familien bezüglich der Alzheimer-Krankheit genetisch prädisponiert, ein Leiden, das als familiäre Alzheimer-Krankheit (FAK) bezeichnet wird, und zwar über Mutationen, die zu einem Austausch der Aminosäure in der Position 717 des Proteins der vollen Länge führen (Goate et al., 1991; Murrell et al., 1991; Chartier-Harlin et al., 1991). Diese Mutationen co-segregieren mit der Krankheit innerhalb der Familien, und sie fehlen in Familien mit spät eintretender AK.
Es gibt keine anerkannten Tiermodelle zur Untersuchung der AK, obwohl alternde nichthumane Primaten anscheinend Amyloid-Plaques aus β-Peptid im Gehirnparenchym und in den Wänden einiger Hirnhaut- und Hirnrindengefäße entwickeln. Zwar können ältere Primaten und Hunde als Tiermodelle dienen, aber sie sind teuer im Unterhalt und erfordern eine lange Studiendauer. Es gibt bei Tieren keine Spontanmutationen, die der AK so ähnlich sind, dass sie als experimentelle Modelle nützlich wären. Es sind verschiedene Modelle vorgeschlagen worden, bei denen einige AK-artige Symptome durch eine Elektrolyse, eine Transplantation von AK-Gehirnproben, Aluminumchlorid, Kainsäure oder Cholinanaloge induziert werden können (Kisner et al., Neurobiol. Aginq 7, 287–292 (1986); Mistry, J. S. et al., J. Med. Chem. 29, 337–343 (1986)). Flood et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 3363–3366 (1986) berichteten über amnestische Wirkungen vier synthetischer Peptidhomologe des β-Peptids bei Mäusen. Da keines von ihnen entweder irgendwelche Symptome, die Biochemie oder die Pathogenese mit der AK gemeinsam hat, ist es unwahrscheinlich, dass sie viele nützliche Informationen bezüglich der Ätiologie oder der Behandlung liefern werden.
Es sind transgene Mäuse mit dem mit der β-Galactosidase von E. coli verknüpften humanen APP-Promotor (Wirak, D. O. et al., The EMBO J. 10, 289–296 (1991)) sowie transgene Mäuse, die die humane APP751-cDNA (Quon, D. et al., Nature 352, 239–241 (1991)) oder ein Subfragment der cDNA einschließlich des β-Peptids exprimieren (Wirak, D. O. et al., Science 253, 323–325 (1991); Sandhu, F. A. et al., J. Biol. Chem. 266, 21331–21334 (1991); Kawabata, S., Nature 354, 476–478 (1991)) erzeugt worden. Die in den verschiedenen Studien erhaltenen Ergebnisse hängen offenbar von der verwendeten Quelle des Promotors und der für das Protein codierenden Sequenz ab. Zum Beispiel fanden Wirak et al. (1991), dass bei transgenen Mäusen, die eine Form des β-Peptids exprimieren, intrazelluläre Ablagerungen von „amyloidartigem" Material, das mit Antikörpern reagierte, die gegen APP hergestellt worden waren, beobachtet wurden, aber sie fanden keine anderen histopathologischen Krankheitssymptome. Die intrazelluläre Natur des mit dem Antikörper reagierenden Materials und das Fehlen anderer Symptome legen nahe, dass das betreffende transgene Tier kein richtiges Modellsystem für die Alzheimer-Krankheit ist. Kawabata et al. (1991) berichten von der Erzeugung von Amyloid-Plaques, neurofibrillären Bündeln und dem Tod neuronaler Zellen in ihren transgenen Tieren. In allen diesen Studien wurde das gleiche Peptidfragment, das β-Peptid plus die 56 verbleibenden C-terminalen Aminosäuren des APP, exprimiert. Wirak et al. (1991) verwendeten den humanen APP-Promotor, während Kawabata et al. (1991) den humanen thy-1-Promotor verwendeten. Bei den transgenen Mäusen, die die APP751-cDNA vom Neuronen-spezifischen Enolase-Promotor exprimieren, von Quon, D. et al., Nature 352, 239–241 (1991), wurden extrazelluläre Ablagerungen eines Materials, dass mit einem Antikörper reagierte, der gegen APP hergestellt worden war, beobachtet. Was nicht gezeigt wurde war, ob die Ablagerungen das APP751 der vollen Länge oder das β-Peptid oder beide enthielten, wodurch eine Korrelation der Ablagerungen mit den bei der Alzheimer-Krankheit vorliegenden ausgeschlossen wurde. Quon et al. (1991) stellen auch fest, dass das von der APP695-cDNA codierte Protein, das vom Neuronen-spezifischen Enolase-Promotor exprimiert wurde, keine extrazellulären, immunreaktiven Ablagerungen bildet. Diese Ergebnisse lassen es möglich erscheinen, dass, obwohl das β-Peptid im APP695-Vorläufer enthalten ist, die Verwendung des Neuronen-spezifischen Enolase-Promotors in Verbindung mit der APP695-cDNA möglicherweise kein effektives Modell der Alzheimer-Krankheit darstellt. Weiterhin ist das Vorkommen von APP-immunreaktiven Ablagerungen in diesem speziellen transgenen Modell nicht mit dem Alter oder der Gendosis korreliert.
Die Alzheimer-Krankheit ist ein komplexes Syndrom, das pathologische Aspekte und Verhaltensaspekte beinhaltet. Ein nützliches Krankheitsmodell sollte diese Komplexizität berücksichtigen. Es werden multiple Proteine von dem Gen exprimiert, wobei bestimmte Formen in einem gegebenen Gewebe dominieren. Im Gehirn herrscht die 695-Form vor, aber die mRNAs anderer Formen kommen ebenfalls vor (Golde et al., Neuron 4, 253–267 (1990)). Es ist nicht bekannt, ob sich das Verhältnis der verschiedenen Formen mit dem Alter des Individuums ändert. Die verschiedenen Proteinformen resultieren aus einem alternativen Splicing, so dass die Kl-Domäne und/oder die OX-2-Domäne im reifen Protein vorliegen kann bzw. können oder auch nicht. Außerdem resultiert das β-Peptid aus der posttranslationalen Prozessierung des Vorläuferproteins. Dieser Prozess kann sich mit der Zeit beim Älterwerden des Individuums verändern, und er kann durch Mutationen beeinflusst werden, die die Struktur des β-Peptids nicht direkt beeinflussen, zum Beispiel bei der familiären Alzheimer-Krankheit (FAK) durch die Mutationen in der Aminosäureposition 717 des Protein der vollen Länge (Groate et al., 1991; Murrell et al., 1991; Chartier-Harlin et al., 1991). Auf der Basis dieser Überlegungen erfordert die Erzeugung universeller Tiermodelle für die Alzheimer-Krankheit die Konstruktion von Tiermodellen, die die Wirkungen bekannter Mutationen auf den Phänotyp berücksichtigen, der aus der Expression dieser Formen resultiert, sowie die Möglichkeit, dass sich das Verhältnis der verschiedenen Formen über die Lebenszeit des Tiers ändert.
WO 92/06187 betrifft einen transgenen Nager, der für das Studium der Alzheimer-Krankheit nützlich ist, und der ein Transgen aufweist, das einen Säugetier-Metallothionein-1-Promotor umfasst, der funktionsfähig mit einer für das APP codierenden Nucleotidsequenz verknüpft ist, die funktionsfähig mit einem 3'-untranslatierten Bereich des Säugetier-Wachstumshormons verknüpft ist.
WO 92/13069 betrifft eine für das APP codierende DNA, die eine Aminosäuresubstitution beim Rest 717 des APP770 aufweist.
EP 0 451 700 betrifft transgene Mäuse, die ein APP-Minigenkonstrukt tragen.
Es ist somit ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Nager-Modell für die Alzheimer-Krankheit bereit zu stellen, das mittels einer Transgen-Technologie konstruiert wurde.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, transgene Nager bereit zu stellen, die akkurat die Expression verschiedener Formen des Amyloid-Vorläuferproteins wiederspiegeln.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, transgene Nager bereit zu stellen, die durch bestimmte genetische Abnormalitäten bezüglich der Expression des Amyloid-Vorläuferproteins charakterisiert sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird die Konstruktion von Modellen mit transgenen Nagern zur Testung potenzieller Behandlungen der Alzheimer-Krankheit beschrieben. Die Modelle sind durch eine größere Ähnlichkeit mit den Bedingungen charakterisiert, die bei der natürlich auftretenden Alzheimer-Krankheit vorliegen, basierend auf der Fähigkeit zur Steuerung der Expression einer oder mehrerer der drei Formen des β-Amyloid-Vorläuferproteins (APP) APP695, APP751 und APP770 oder von Subfragmenten von diesen sowie verschiedener Punktmutationen, die auf natürlich vorkommenden Mutationen basieren, wie den FAK-Mutationen der Aminosäure 717, sowie vorhergesagten Mutationen im APP-Gen. Die APP-Genkonstrukte werden hergestellt unter Verwendung des natürlich vorkommenden APP-Promotors des Menschen, der Maus oder der Ratte sowie induzierbarer Promotoren, wie des Metallothionein-Promotors der Maus, der durch den Zusatz von Schwermetallen wie Zink zum Wasser oder zur Nahrung des Tiers reguliert werden kann. Eine Neuronen-spezifische Expression von Konstrukten wird über die Verwendung des Neuronen-spezifischen Enolase-Promotors der Ratte erreicht.
Die Konstrukte werden in die Nager-Embryonen mittels Standard-Techniken, wie einer Mikroinjektion oder Techniken der Verwendung embryonaler Stammzellen von Nagern, eingeführt. Es können auch Modelle, die auf Zellkulturen basieren, mittels zweier Methoden hergestellt werden. Es können Zellkulturen aus den transgenen Nagern isoliert werden, oder sie können aus etablierten Zellkulturen unter Verwendung der gleichen Konstrukte mittels Standardtechniken der Zelltransfektion präpariert werden.
Die erfindungsgemäßen Konstrujkte sind diejenigen gemäß Anspruch 11.
Die Promotoren können aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus dem Promotor des humanen APP-Gens, dem Promotor des APP-Gens der Maus, dem Promotor des APP-Gens der Ratte, dem Promotor des Metallothionein-Gens, dem Neuronen-spezifischen Promotor des Enolase-Gens der Ratte, dem Promotor des humanen β-Actin-Gens, dem Promotor des Gens der B-Kette des humanen platelet derived growth factor (PDGF-B), dem Promotor des Gens des Natriumkanals der Ratte, dem Promotor des Gens des basischen Myelin-Proteins der Maus, dem Promotor des Gens der humanen Kupfer-Zink-Superoxiddismutase und dem Promotor des regulatorischen Gens der Säugetier-POU-Domäne.
Die erfindungsgemäßen transgenen Nager oder Säugetierzellen sind diejenigen gemäß Anspruch 1.
Diese Konstrukte können in die transgenen Nager eingeführt und dann durch das Verpaaren der Tiere, die die verschiedenen Konstrukte exprimieren, kombiniert werden.
Die transgenen Nager oder die transgenen Säugetierzellen werden für das Screening von Verbindungen eingesetzt, die den pathologischen Verlauf der Alzheimer-Krankheit verändern, wie er anhand ihrer Wirkung auf die Menge und die Histopathologie des APP und des β-Peptids in den Tieren sowie anhand von Verhaltensänderungen bestimmt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die als Kästen dargestellten Abschnitte in den Zeichnungen geben die für Aminosäuren codierenden Bereiche der Konstrukte an. Ausgefüllte Abschnitte bezeichnen die verschiedenen Domänen des Proteins, wie es in der Legende der Figur angegeben ist. Linien bezeichnen Sequenzen in den Klonen, die 5'- oder 3'-untranslatierte Sequenzen, flankierende genomische Sequenzen oder Introns sind. Die Unterbrechung in the Linie links von den Konstrukten in den 7 und 8 zeigt das Vorliegen einer langen DNA-Sequenz an.
1a ist eine schematische Darstellung der für die APP770-cDNA codierenden Sequenz.
1b ist eine schematische Darstellung der für die APP770-cDNA codierenden Sequenz, die eine Mutation in der Position 717 enthält.
2a ist eine schematische Darstellung der für die APP751-cDNA codierenden Sequenz.
2b ist eine schematische Darstellung der für die APP751-cDNA codierenden Sequenz, die eine Mutation in der Position 717 enthält.
3a ist eine schematische Darstellung der für APP695 codierenden Sequenz.
3b ist eine schematische Darstellung der für die APP695-cDNA codierenden Sequenz, die eine Mutation in der Position 717 enthält.
4a ist eine schematische Darstellung einer für den carboxyterminalen Teil des APP codierenden Sequenz.
4b ist eine schematische Darstellung einer für den carboxyterminalen Teil des APP codierenden Sequenz, die eine Mutation in der Position 717 enthält.
5 ist eine schematische Darstellung einer für den β-Peptid-Teil des APP codierenden Sequenz.
6a ist eine schematische Darstellung einer codierenden Sequenz aus einer Kombination aus genomischer DNA und cDNA, die ein alternatives Splicing der KI- und OX2-Exons ermöglicht.
6b ist eine schematische Darstellung einer codierenden Sequenz aus einer Kombination aus genomischer DNA und cDNA, die eine Mutation in der Position 717 enthält und ein alternatives Splicing der KI- und OX2-Exons ermöglicht.
7a ist eine schematische Darstellung einer für das humane APP YAC codierenden Sequenz.
7b ist eine schematische Darstellung einer für das humane APP YAC codierenden Sequenz, die eine Mutation in der Position 717 enthält.
8 ist eine schematische Darstellung einer genetischen Veränderung des APP-Gens der Maus durch eine homologe Rekombination, die in den Exon-9-Teil des Gens dirigiert wurde, zwischen dem APP-Gen der Maus in einer ES-Zelle der Maus und einem Vektor, der die humane APP-cDNA (entweder der Wildtyp- oder der mutierten FAK-Form) trägt. Als Ergebnis dieses Rekombinationsereignisses sind die Sequenzen des von Haus aus vorliegenden chromosomalen APP-Gens der Maus jenseits des Rekombinationspunkts im Exon 9 durch die analogen humanen Sequenzen ersetzt.
Die 1 bis 5 sowie 7 und 8 dienen lediglich einer Veranschaulichung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Konstrukte und die transgenen Nager und Säugetierzellen werden mittels der unten beschriebenen Methoden und Materialien erzeugt.
Herkunft der Materialien
Restriktionsendonucleasen werden von herkömmlichen kommerziellen Quellen, wie New England Biolabs (Beverly, Massachusetts), Promega Biological Research Products (Madison, Wisconsin) und Stratagene (La Jolla, Kalifornien) etc. bezogen. Radioaktive Materialien werden von herkömmlichen kommerziellen Quellen, wie Dupont/NEN oder Amersham, bezogen. Speziell konstruierte Oligonukleotide für die ortsspezifische Mutagenese können von einem beliebigen der verschiedenen kommerziellen Anbieter derartiger Materialien bezogen werden, beispielsweise von Bio-Synthesis Inc., Lewisville, Texas. Kits zur Durchführung der ortsspezifischen Mutagenese können von kommerziellen Vertreibern, wie Promega Biological Research Products, Stratagene etc., bezogen werden. cDNA-Klone der, einschließlich der APP695-, APP751- und APP770-Formen der APP-mRNA, wurden direkt von Dr. Dmitry Goldgaber, NIH, bezogen. DNA-Bibliotheken können von kommerziellen Vertreibern, wie Stratagene, La Jolla, Kalifornien, oder Clontech, Palo Alto, Kalifornien, bezogen werden. PC12- und 3T3-Zellen wurden von der ATCC (Nr. CRL1721 bzw. Nr. CCL92) bezogen. Eine weitere PC12-Zellline wurde von Dr. Charles Marotta der Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital und McLean Hospital, bezogen. Für die jeweiligen Zelllinien geeignete Standard-Zellkulturmedien wurden von den üblichen kommerziellen Quellen, wie Gibco/BRL, bezogen. Maus-Stammzellen, Stamm D3, wurden von Dr. Rolf Kemler (Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morphol. 87, 27 (1985)) bezogen. Lipofectin für die Transfektion von DNA und das Mittel G418 für die Selektion stabiler Transformanten können von Gibco/BRL bezogen werden.
Isolierung des humanen APP-Promotors
Es wurde eine Cosmid-Bibliothek, die aus humaner plazentarer DNA im pWE15-Cosmidvektor konstruiert worden war, durch die Hybridisierung mit einer ³²P-markierten Sonde gescreent, die durch Nicktranslation (Maniatis et al., Molecular Cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989)) des APP770-cDNA-Klons hergestellt worden war. Klone, die mit der Sonde hybridisierten, wurden gepickt, gereinigt und durch Restriktionskartierung, Hybridisierung und DNA-Sequenzierung charakterisiert. Aus einem derartigen Klon, der einen langen 5'-flankierenden Bereich enthielt, wurde ein DNA-Restriktionsfragment von Notl bis Nrul von ungefähr 25 kb isoliert. Dieses Fragment hört 2 Nucleotide vor dem Initiator-Methionincodon des für das Alzheimer-Protein codierenden Bereichs auf. Dieses Fragment, oder ein Subfragment davon, ist die Quelle des humanen APP-Promotors für die hier beschriebenen Konstrukte. Analoge DNA-Fragmente, die mittels der gleichen Methoden aus genomischen Bibliotheken der Maus oder der Ratte isoliert wurden, sind die Quelle der Promotoren der Maus oder der Ratte.
Definition der APP-cDNA-Klone
Der cDNA-Klon APP-695 hat die durch Kang et al., Nature 325, 733–735 ((1987), beschriebene Form der cDNA und repäsentiert die häufigste Form des Alzheimer-Proteins im Gehirn. Der cDNA-Klon APP-751 hat die durch Ponte, P., Nature 331, 525–527 (1988) beschriebene Form. Der cDNA-Klon APP-770 hat die durch Kitaguchi et al., Nature 331, 530-532 (1988) beschriebene Form. Diese Form enthält gegenüber der 695-Form ein Insert von 225 Nucleotiden. Das Insert von 225 Nucleotiden codiert für die Kl-Domäne und für die OX-Domäne.
Definition des genomischen APP-Locus
Die Charakterisierung von Phagen- und Cosmid-Klonen der humanen genomischen DNA-Klone, die in der Tabelle unten aufgeführt sind, etablierte ursprünglich eine minimale Größe von wenigstens 100 kb für das Alzheimer-Gen. Es liegen insgesamt 18 Exons im APP-Gen vor (Lemaire et al., Nucl. Acid Res. 17, 517–522 (1989); Yoshikai et al., 1990). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die minimale Größe des Alzheimer-Gens bei 175 kb liegt.
1. Tabelle der Alzheimer-Cosmid-und-Lambda Klone
Konstruktion von Transgenen
Die Klone, die verschiedene Teile der humanen APP-Gensequenz tragen und in den 1–5 gezeigt sind, wurden auf analoge Weise konstruiert. Zuerst wird das Signal des SV40-Virus für die polyA-Anfügung als ein Fragment von 253 Basenpaaren von BclI bis BamHI (Reddy et al., Science 200, 494–502 (1978)) in einen modifizierten Vektor aus der pUC-Reihe kloniert. Als nächstes werden die für die cDNA codierenden Sequenzen (770, 751 oder 695) eingefügt. Die Korrektheit der Orientierung und des Inhalts der insertierten Fragmente wird mittels einer Kartierung mit Restriktionsendonukleasen und einer limitierten Sequenzierung bestimmt.
Die Klone, die verschiedene carboxyterminale Teile der humanen APP-Gensequenz tragen und in den 4 und 5 gezeigt sind, werden über mehrere Schritte zusätzlich zu den oben angegebenen konstruiert. Zuerst wir ein APP770-cDNA Klon mit Asp718 verdaut, die nach der Position 56 spaltet (Zählweise von Kang et al., 1987). Die resultierende 5'-Verlängerung wird mittels des Klenow-Enzyms aufgefüllt (Maniatis et al., 1989) und an ein Hexanucleotid mit der Sequenz AGATCT, der Erkennungsstelle für BglII, ligiert. Nach der Spaltung mit BglII, die auch nach der Position 1769 spaltet, und der erneuten Ligation bleibt der Leserahmen des Proteins für die Translation erhalten. Das auf diese Weise codierte, verkürzte Protein enthält die Leader-Sequenz, gefolgt von ungefähr 6 Aminosäuren, die dem β-Peptid vorangehen, und gefolgt vom β-Peptid und den 56 terminalen Aminosäuren des APP. Der Klon in der 5 wird über die Einführung des Nucleotids 1913 im Klon der 4a in Form eines T (Zählweise von Kang et al., 1987) durch ortsspezifische Mutagenese erzeugt, wodurch ein Terminationscodon direkt nach dem letzten Aminosäurecodon des β-Peptids erzeugt wird. Alle in den 1–5 gezeigten Klone der APP-cDNA-Sequenz enthalten ein einzige Nrul-Stelle 2 Nucleotide stromaufwärts des Initiator-Methionincodons, die für die Anbringung der verschiedenen verwendeten Promotoren verwendet wird, um jedes Konstrukt zu vervollständigen. Das Obige, was sich auf die 1 bis 5 bezieht, dient lediglich der Veranschaulichung.
Es werden auch Expressionsklone, die mit diesen identisch sind, aber Mutationen bei der Aminosäure 717 des Proteins der vollen Länge, dem Ort der FAK-Mutation, tragen, konstruiert. Die Mutationen bei der Aminosäure 717 werden durch ortsspezifische Mutagenese (Vincent et al., Genes & Devel. 3, 334–347 (1989)) erzeugt, und sie schließen Mutationen des Wildtyp-Val-Codons zu einem der Codons Ile, Phe, Gly, Tyr, Leu, Ala, Pro, Trp, Met, Ser, Thr, Asn und Gln ein.
Die bevorzugte Methode zur Konstruktion der Expressionsklone aus der Kombination aus cDNA/genomischer DNA in der 6 sieht folgendermaßen aus. Die Tagl-Stelle in der Position 860 (Zählweise von Kang et al., 1987) in einem APP770-cDNA Klon wird durch ortsspezifische Mutagenese in eine Xhol-Stelle umgewandelt. Die Spaltung des resultierenden Plasmids mit Xhol schneidet an der neuen Xhol-Stelle und einer bereits existierenden Stelle bei 930 und setzt die für KI und OX-2 codierende Sequenz frei.
Das so erzeugte Plasmid dient als der Akzeptor für die Kassette für das alternative Splicing von KI und OX-2. Die Kassette für das alternative Splicing wird durch eine Reihe von Klonierungsschritten erzeugt. Zuerst wird die Tagl-Stelle in der Position 860 (Zählweise von Kang et al., 1987) im genomischen Klon, der das Exon 6 und das angrenzende stromabwärts liegende Intron enthält, durch ortsspezifische Mutagenese in eine Xhol-Stelle überführt. Die Spaltung des resultierenden Plasmids mit Xhol schneidet an der neuen Xhol-Stelle und an der Xhol-Stelle innerhalb des angrenzenden Introns. Dieses Fragment wird in die Xhol-Stelle eines Plasmid-Vektors kloniert. Als zweites wird der genomische Klon, der das Exon 9 und das angrenzende stromaufwärts liegende Intron enthält, mit Xhol (Position 930) gespalten und in die Xhol-Stelle eines Plasmidvektors kloniert. Diese zwei Fragmente mit dem Exon/Intron-Übergang werden durch Spaltung mit Xhol und entweder BamHI oder BglII aus ihrem jeweiligen Plasmid- Rückgrat frei gesetzt und in die Xhol-Stelle eines Plasmidvektors kloniert. Das resultierende Xhol-Fragment wird entweder mit BamHI oder BglII gespalten, und das genomische BamHI-Segment von 6,6 kb (Kitaguchi et al., 1988), das den für KI und OX-2 codierenden Bereich zusammen mit den flankierenden Intron-Sequenzen enthält, wird eingefügt. Nach der Spaltung mit Xhol wird dieses DNA-Segment in die Xhol-Stelle der oben konstruierten modifizierten APP770-cDNA eingefügt. Diese Klonierungsschritte erzeugen einen Expressionklon aus einer Kombination aus cDNA/genomischer DNA, der es Zellen in einem transgenen Nager ermöglicht, den Einschluss der KI- und OX-2-Domänen über einen natürlichen Mechanismus des alternativen Splicing zu regulieren. Ein analoges Gen, das eine Mutation bei der Aminosäure 717 trägt, wird über die Verwendung der oben beschriebenen mutierten Form der APP770-cDNA konstruiert.
Aktivität von Genpromotoren
Es werden verschiedene Promotorsequenzen zur Steuerung der Expression der für APP codierenden Sequenzen verwendet. Es wird angenommen, dass die Fähigkeit zur Steuerung der Expression des APP-Gens in transgenen Nagern nützlich für die Untersuchung der Rolle der verschiedenen APP-Genprodukte für die AK ist. Es wird angenommen, dass die Fähigkeit zur Steuerung der Expression des APP-Gens in kultivierten Zellen nützlich für die Untersuchung der Expression und der Prozessierung der verschiedenen APP-Genprodukte ist und möglicherweise die Basis für Arzneimittel-Screeningverfahren auf der Basis von Zellkulturen bereit stellt.
Der Metallothionein-Promotor (MT-Promotor) ist gut charakterisiert, wurde in transgenen Nagern eingesetzt, und seine Expression kann über die Modulation der Spiegel von Zink und Glucocorticoidhormonen reguliert werden (Palmiter et al., Nature 300, 611–615 (1982)).
Der humane APP-Promotor ist auch bezüglich der Expression im ZNS charakterisiert (Wirak et al., 1991). Es wird angenommen, dass dieser Promotor nützlich für für die akkurate Reproduktion der zeitlichen und räumlichen Expression von humanen APP-Sequenzen im ZNS transgener Nager ist. Zusätzlich zum humanen APP-Promotor wird der APP-Promotor von Maus und Ratte zusammen mit den verschiedenen, für das APP codierenden Wildtyp-Sequenzen und mutierten Sequenzen verwendet. Es wurde zwar gezeigt, dass der humane APP-Promotor Aktivität in den richtigen Bereichen des Gehirns transgener Mäuse zeigt (Wirak et al., 1991), aber es wird angenommen, dass die Verwendung eines APP-Promotors der Maus in einer transgenen Maus oder eines APP-Promotors der Ratte in einer transgene Ratte ein noch genaueres Muster der Expression im ZNS transgener Tiere liefert.
Als eine Alternative für die Steuerung der Expression des humanen APP in Neuronen wird der für Rattenneuronen spezifische Promotor des Enolase-Gens verwendet. Von diesem Promotor wurde gezeigt, dass er die Expression codierender Sequenzen in Neuronen steuert (Forss-Petter et al., Neuron 5, 197–197 (1990)).
Zu weiteren Alternativen für die Verwendung bei der Steuerung der Expression des humanen APP in Neuronen gehören der Promotor des humanen β-Actin-Gens (Ray et al., Genes and Development 5, 2265–2273 (1991)), der Promotor des Gens der B-Kette des humanen plafelet derived growth factor (PDGF-B) (Sasahara et al., Cell 64, 217–227 (1991)), der Promotor des Gens des Natriumkanals der Ratte (Maue et al., Neuron 4, 223–231 (1990)), der Promotor des Gens der humanen Kupfer-Zink-Superoxiddismutase (Ceballos-Picot et al., Brain Res. 552, 198–214 (1991)) sowie Promotoren für Mitglieder der Genfamilie der regulatorischen Säugetier-POU-Domäne (Xi et al., Nature 340, 35–42 (1989)). Die POU-Domäne ist der Bereich einer Ähnlichkeit der vier Säugetier-Transkriptionsfaktoren Pit-1, Oct-1, Oct-2 und unc-86, und sie repräsentiert einen Teil der DNA-bindenden Domäne. Für diese Promotoren ist bekannt oder wird angenommen, dass sie zu einer Expression spezifisch in den Neuronen transgenerTiere führen.
Die Expression des humanen APP in nicht-neuronalen Gehirnzellen kann durch den Promotor des basischen Myelinproteins der Maus (Readhead et al., Cell 48, 703–712 (1987)) gesteuert werden.
Künstliche Hefe-Chromosomen (lediglich zu illustrativen Zwecken)
Die in der 7 gezeigten Konstrukte werden wie folgt konstruiert. Große Abschnitte humaner genomischer DNA können, wenn sie in bestimmte Vektoren kloniert werden, als autonom replizierende Einheiten in der Hefezelle vermehrt werden. Derartige Vektor-getragene Abschnitte werden als künstliche Hefe-Chromosomen bezeichnet (yeast artificial chromosomes, YAC; Burke et al., Science 236, 806 (1987)). Eine humane YAC-Bibliothek mit einer durchschnittlichen Insert-Größe von 250 000 Basenpaaren (Bereich von 180 000 bis 500 000 Basenpaare) ist im Handel erhältlich (Clontech, Palo Alto, Kalifornien). Ein YAC-Klon des Alzheimer-Gens kann direkt durch das Screenen der Bibliothek mit der humanen APP770-cDNA isoliert werden. Die Anwesenheit aller essentiellen Genbereiche im Klon kann durch PCR-Analyse bestätigt werden.
Der YAC-APP-Klon, der in der 7a gezeigt ist, wird in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) von Nagern über eine Selektion für eine Neomycin-Resistenz, die durch den YAC-Vektor codiert wird, etabliert. ES-Zellen, die den YAC-APP-Klon enthalten, werden zur Erzeugung transgener Mäuse mittels der unten unter „Transgene Mäuse" und „Verfahren unter Verwendung embryonaler Stammzellen von Nagern" beschriebenen etablierten Methoden verwendet. Das YAC-APP-Gen, das eine Mutation bei der Aminosäure 717 (7b) trägt, wird über die Erzeugung einer YAC-Bibliothek unter Verwendung der genomischen DNA ein Person, die von der Mutation der Aminosäure 717 betroffen ist, erzeugt. Der Klon wird in ES-Zellen von Nagern wie oben beschrieben identifiziert und etabliert.
Genetische Veränderung des APP-Gens der Maus (lediglich zu illustrativen Zwecken
Die Homologie der Nucleotidsequenz des humanen Alzheimer-Proteins und desjenigen der Maus beträgt ungefähr 85%. Innerhalb des für das β-Peptid codierenden Bereichs gibt es drei Aminosäuren, die sich bei den beiden Sequenzen unterscheiden. Der Val-Rest, der bei der Aminosäure 717 mutiert ist, ist bei Maus, Ratte und Mensch konserviert. Wildtyp-Nager entwickeln keine Alzheimer-Krankheit, und sie entwickeln im ZNS auch keine Ablagerungen oder Plaques, die denjenigen analog sind, die bei menschlichen Alzheimer-Patienten vorliegen. Deshalb ist es möglich, dass die humane Form, aber nicht die Nager-Form des β-Peptids imstande ist, die Krankheit zu verursachen. Eine homologe Rekombination (Capecchi, M. R., Science 244, 1288–1292 (1989)) kann dazu verwendet werden, das Alzheimer-Gen der Maus in situ in ein Gen umzuwandeln, das für das humane β-Peptid codiert. Diese Rekombination wird zu einer Stelle stromabwärts der KI- und OX-2-Domänen dirigiert, beispielsweise innerhalb des Exons 9, so dass die nätürlichen Mechanismen des alternativen Splicing, die in allen Zellen des transgenen Tiers vorhanden sind, zur Expression des letztendlichen Genprodukts eingesetzt werden können.
Es wird sowohl die Wildtyp-Form (8, Schema „a") als auch die mutierte Form (8, Schema „b") der humanen cDNA zur Erzeugung transgener Modelle verwendet, die entweder die Wildtyp-Form oder die mutierte Form des APP exprimieren. Der Rekombinationsvektor wird aus einer humanen APP-cDNA (695- oder 770-Form) konstruiert, die bezüglich der Aminosäure 717 entweder den Wildtyp oder die Mutante repräsentiert. Die Spaltung des Rekombinationsvektors, beispielsweise an der Xhol-Stelle im Exon 9, fördert eine homologe Rekombination innerhalb der direkt angrenzenden Sequenzen (Capecchi, 1989). Das endogene APP-Gen, das aus diesem Ereignis resultiert, ist bis zum Punkte der Rekombination, in diesem Beispiel in Exon 9, normal und besteht danach aus der humanen cDNA-Sequenz.
Mutierte Formen des APP Proteins
Es werden auch Expressionsklone konstruiert, die mit diesen identisch sind, aber Mutationen der Aminosäure 717 des Proteins der vollen Länge, dem Ort der FAK-Mutationen, tragen. Mutationen der Aminosäure 717 werden durch ortsspezifische Mutagenese erzeugt (Vincent et al., 1989), und sie schließen Mutationen des Wildtyp-Val-Codons zu einem der folgenden Codons Ile, Phe, Gly, Tyr, Leu, Ala, Pro, Trp, Met, Ser, Thr, Asn und Gln ein. Mutationen des Val-717 zu Ile, Phe und Gly wurden beschrieben (Goate et al., 1991; Murrell et aI., 1991; Chartier-Harlin et al., 1991). Keine dieser natürlich vorkommenden Mutationen beinhaltet eine geladene oder großräumige Aminosäure. Deshalb wird angenommen, dass der Ersatz des Val-717 durch die anderen aufgeführten Aminosäuren auch das FAK-Syndrom fördern und Eigenschaften haben könnte, die für Tiermodelle der AK sind nützlich.
Präparation von Konstrukten für Transfektionen und Mikroinjektionen
DNA-Klone für die Mikroinjektion werden mit geeigneten Enzymen, wie SalI, Notl etc., gespalten, und die DNA-Fragmente werden einer Elektrophorese in 1%-igen Agarosegelen in TBE-Puffer (Maniatis et al., 1989) unterzogen. Die DNA-Banden werden durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht, ausgeschnitten und in Dialysetaschen, die 0,3 M Natriumacetat, pH 7,0, enthalten, gegeben. Die DNA wird in die Dialysetaschen elektroeluiert, mit Phenol-Chloroform (1 : 1) extrahiert und mit zwei Volumina Ethanol gefällt. Die DNA wird wieder in 1 ml Puffer mit niedriger Salzkonzentration (0,2 M NaCl, 20 mM Tris^TM, pH 7,4, und 1 mM EDTA) gelöst und über eine Elutip-D^TM-Säule gereinigt. Die Säule wird zuerst mit 3 ml Puffer mit hoher Salzkonzentration (1 M NaCl, 20 mM TrisTM, pH 7,4, und 1 mM EDTA) vorbehandelt, gefolgt von einer Waschung mit 5 ml Puffer mit niedriger Salzkonzentration. Die DNA-Lösungen werden dreimal durch die Säule geschickt, um die DNA an die Säulenmatrix zu binden. Nach einer Waschung mit 3 ml Puffer mit niedriger Salzkonzentration wird die DNA mit 0,4 ml Puffer mit hoher Salzkonzentration eluiert und mit zwei Volumina Ethanol gefällt. Die DNA-Konzentrationen werden anhand der Absorption bei 260 nm mittels eines UV-Spektralphotometers gemessen. Für die Mikroinjektion werden die DNA-Konzentrationen mit 5 mM Tris^TM, pH 7,4, und 0,1 mM EDTA auf 3 μg/ml eingestellt. Weitere Methoden zur Reinigung von DNA für eine Mikroinjektion werden auch beschrieben bei Hogan et al., Manipulating the mouse embryo (Cold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, New York (1986), bei Palmiter et al., Nature 300, 611 (1982), in „The Qiagenologist, Application Protocols", 3. Auflage, veröffentlicht von Qiagen, Inc., Chatsworth, Kalifornien, und bei Maniatis et al., Molecular Cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989).
Konstruktion transgener Nager
Herkunft der Nager
Nager, die für Experimente unter Einsatz transgener Techniken geeignet sind, können von kommerziellen Standard-Quellen, wie Charles River (Wilmington, Massachusetts), Taconic (Germantown, New York), Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Indiana) etc. bezogen werden. Es werden weibliche Swiss-Webster-Mäuse für die Gewinnung von Embyonen und den Embryotransfer bevorzugt. B6D2F₁-Männchen können für die Verpaarung eingesetzt werden, und vasektomierte Swiss-Webster-Männchen können zur Stimulation einer Pseudoträchtigkeit eingesetzt werden. Vasektomierte Mäuse und Ratten können von den Lieferfirmen bezogen werden.
Verfahren der Mikroinjektion
Die Verfahren zur Manipulation der Nager-Embryonen und zur Mikroinjektion von DNA werden detailliert bei Hogan et al., Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1986) beschrieben.
Transgene Mäuse
Bei weiblichen, sechs Wochen alten Mäusen wird eine Superovulation ausgelöst, indem ihnen eine Injektion von 5 IU (0,1 ml, i.p.) Gonadotropin aus dem Serum trächtiger Stuten (pregnant mare serum gonadotropin, PMSG; Sigma) verabreicht wird, an die sich 48 Stunden später eine Injektion von 5 IU (0,1 ml, i.p.) humanem Choriongonadotropin (hCG; Sigma) anschließt. Die Weibchen werden unmittelbar nach der hCG-Injektion mit den Männchen zusammengesetzt. Einundzwanzig Stunden nach dem hCG werden die verpaarten Weibchen durch CO₂-Asphyxie oder durch Genickbruch getötet, und aus den ausgeschnitten Eileitern werden Embryonen gewonnen und in Dulbeccos Phosphate-gepufferte Saline mit 0,5% Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA; Sigma) gegeben Umgebende Kumufuszellen werden mit Hyaluronidase (1 mg/ml) entfernt. Pronukleäre Embryonen werden dann gewaschen und bis zum Zeitpunkt der Injektion in Earle's Balanced Salt Solution mit 0,5% BSA (EBSS) in einen Inkubator mit einer Temperatur von 37,5°C und einer feuchten Atmosphäre aus 5% CO₂ und 95% Luft gegeben.
Weibliche adulte Mäuse, die sicht nicht in einer bestimmten Zyklusphase befinden, werden mit vasektomierten Männchen verpaart. Es können Swiss-Webster-Mäuse oder andere vergleichbare Stämme für diesen Zweck verwendet werden. Die Empfänger-Weibchen werden zum gleichen Zeitpunkt wie die Donor-Weibchen verpaart. Zum Zeitpunkt des Embryotransfers werden die Empfänger-Weibchen durch eine intraperitoneale Injektion von 0,015 ml einer 2,5%-igen Lösung von Avertin pro Gramm Körpergewicht anästhesiert. Die Eileiter werden durch einen dorsalen Schnitt längs der Mittellinie frei gelegt. Dann wird ein Schnitt direkt über dem Eileiter durch die Körperwand gelegt. Die Eileiter-Bursa wird dann mit einer Uhrmacher-Pinzette zerrissen. Die Embryonen, die transferiert werden sollen, werden in DPBS gegeben und in die Spitze einer Transferpipette verbracht (ungefähr 10–12 Embryonen). Die Pipettenspitze wird in das Infundibulum eingeführt, und die Embryonen werden transferiert. Nach dem Transfer wird der Schnitt mit zwei Nähten geschlossen.
Transgene Ratten
Das Verfahren zur Erzeugung transgener Ratten ist demjenigen für Mäuse ähnlich (Hammer et al., Cell 63, 1099–1112 (1990)). Dreißig Tage alte weibliche Ratten erhalten eine subkutane Injektion von 20 IU PMSG (0,1 ml), und 48 Stunden später wird jedes Weibchen mit einem Männchen, das seine Männlichkeit bereits unter Beweis gestellt hat, zusammengesetzt. Zur gleichen Zeit werden 40–80 Tage alte Weibchen in Käfigen mit vasektomierten Männchen.
zusammengesetzt. Diese Weibchen werden die Ziehmütter für den Embryotransfer sein. Am nächsten Morgen werden die Weibchen auf Vaginalpröpfe untersucht. Weibchen, die sich mit vasektomierten Männchen gepaart haben, werden bis zum Zeitpunkt des Transfers aufbewahrt. Donor-Weibchen, die sich gepaart haben, werden getötet (CO₂-Asphyxie), und ihre Eileiter werden entnommen, in DPBS (Dulbeccos Phosphat-gepufferte Saline) mit 0,5% BSA gegeben, und die Embryonen werden gesammelt. Die Embryonen umgebende Kumuluszellen werden mit Hyaluronidase (1 mg/ml) entfernt. Die Embryonen werden dann gewaschen und bis zum Zeitpunkt der Mikroinjektion in EBSS (Earle's Balanced Salt Solution) mit 0,5% BSA in einen Inkubator mit einer Temperatur von 37,5°C gegeben.
Wenn die Embryonen injiziert werden sollen werden die lebenden Embryonen für den Transfer in die Ziehmütter in DPBS gegeben. Die Ziehmütter werden mit Ketamin (40 mg/kg, i.p.) und Xylazin (5 mg/kg, i.p.) anästhesiert. Es wird ein dorsaler Schnitt längs der Mittellinie durch die Haut und das Ovar geführt, und der Eileiter wird durch einen Schnitt durch die Muskelschicht direkt über dem Ovar frei gelegt. Die Ovar-Bursa wird zerrissen, die Embryonen werden in die Transferpipette aufgenommen, und die Spitze der Transferpipette wird in das Infundibulum eingeführt. Es werden ungefähr 10–12 Embryonen durch das Infundibulum in jeden Eileiter der Ratte transferiert. Der Schnitt wird dann mit Nähten geschlossen, und die Ziehmütter werden einzeln weiter gehalten.
Verfahren unter Verwendung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) von Nagern
Einführung von cDNA in ES-Zellen von Nagern:
Methoden zur Kultivierung von ES-Zellen und die anschließende Erzeugung von transgenen Nagern sowie zur Einführung von DNA in Nager-ES-Zellen durch eine Vielzahl von Methoden, wie eine Elektroporation, eine Calciumphosphat/DNA-Fällung und eine direkte Injektion, werden detailliert in Teratocarcinomas and embryonic stem cells a practical approach, Hrsg. E. J. Robertson (IRL Press 1987) beschrieben. Die Selektion des gewünschten Klons der das Transgen enthaltenden ES-Zellen wird über eines von verschiedenen Verfahren erreicht. In Fällen, die eine zufällige Integration des Gens beinhalten, wird ein APP-Klon mit einem Gen copräzipitiert, das für die Neomycin-Resistenz codiert. Die Transfektion wird mittels eines von verschiedenen Verfahren durchgeführt, die detailliert bei Lovell-Badge in Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, Hrsg. E. J. Robertson (IRL Press 1987) oder bei Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 7161 (1984) beschrieben wurden. Die Calciumphosphat/DNA-Fällung, die direkte Injektion und die Elektroporation sind die bevorzugten Methoden. Bei diesen Verfahren werden 0,5 × 10⁶ ES-Zellen in Gewebekulturplatten ausplattiert und in einem letztendlichen Volumen von 100 μl mit einer Mischung des linearisierten APP-Klons und 1 mg pSV2neo-DNA transfiziert (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1, 327–341 (1982)), die in Gegenwart von 50 mg Lipofectin gefällt werden. Die Zellen werden mit Selektionsmedium gefüttert, das 10% fötales Kälberserum in DMEM enthält, das mit G418 (zwischen 200 und 500 μg/ml) supplementiert ist. Kolonien G418-resistenter Zellen werden mittels Klonierungsringen isoliert und dann vermehrt. Die DNA G418-resistenter Klone wird extrahiert, und Southern-Blot-Experimente unter Verwendung einer APP770-cDNA Sonde werden eingesetzt, um diejenigen Klone zu identifizieren, die die APP-Sequenzen tragen. Bei einigen Experimenten werden PCR-Verfahren zur Identifizierung interessanter Klone verwendet.
DNA-Moleküle, die in Nager-ES-Zellen eingeführt wurden, können auch über den Prozess der homologen Rekombination, wie es von Capecchi (1989) beschrieben wurde, in das Chromosom integriert werden. Die direkte Injektion führt zu einer sehr effizienten Integration. Die gewünschten Klone werden über eine PCR der DNA identifiziert, die aus Pools der injizierten ES-Zellen präpariert wurde. Positive Zellen in den Pools werden durch PCR nach der Zellklonierung identifiziert (Zimmer und Gruss, Nature 338, 150–153 (1989)). Die Einführung von DNA durch Elektroporation ist weniger effizient und erfordert einen Selektionsschritt. Methoden zur positiven Selektion des Rekombinationsereignisses (d. h. der neo-Resistenz) und eine duale Positiv-Negativ-Selektion (d. h. der neo-Resistenz und der Gancyclovir-Resistenz) und die anschließende Identifizierung der gewünschten Klone durch PCR wurden von Joyner et al., Nature 338, 153–156 (1989) und von Capecchi (1989) beschrieben.
Gewinnung der Nager-Embryonen und Injektion von Nager-ES-Zellen
Weibliche Mäuse im natürlichen Zyklus oder im superovulierten Zustand, die mit Männchen verpaart wurden, werden zur Gewinnung von Embryonen für die Implantation von Nager-ES-Zellen verwendet. Es ist wünschenswert, den C57B-Stamm für diesen Zweck einzusetzen, wenn Mäuse verwendet werden. Mausembryonen des geeigneten Alters werden ungefähr 3,5 Tage nach der erfolgreichen Verpaarung gewonnen. Die verpaarten Weibchen werden durch CO₂-Asphyxie oder Genickbruch getötet, und die Embryonen werden aus den herausgeschnittenen Uterushörnern gespült und in Dulbecco's modified essentiell medium plus 10% Kälberserum für die Injektion der ES-Zellen gegeben. Ungefähr 10–20 ES-Zellen werden mittels einer Mikronadel aus Glas mit einem Innendurchmesser von ungefähr 20 μm in Blastocysten injiziert.
Transfer von Nager-Embryonen in pseudoträchtige weibliche Mäuse
Weibliche adulte Mäuse im natürlichen Zyklus werden mit vasektomierten Männchen verpaart. Es können Mäuse-Stämme wie Swiss-Webster, ICR oder andere für diesen Zweck verwendet werden.
Die Empfänger-Weibchen werden so verpaart, dass die Verpaarung 2,3 bis 3,5 Tage zurück liegt, wenn sie für die Implantation der Blastocysten, die Nager-ES-Zellen enthalten, benötigt werden. Zum Zeitpunkt des Embryotransfers werden die Empfänger-Weibchen durch eine intraperitoneale Injektion von 0,015 ml einer 2,5%-igen Lösung von Avertin pro Gramm Körpergewicht anästhesiert. Die Ovarien werden durch einen Schnitt in die Körperwand direkt über dem Eileiter frei gelegt, und das Ovar und der Uterus werden nach außen geholt. Es wid mit einer 25-Gauge-Nadel in ein Uterushorn ein Loch gestochen, durch das die Blastocysten transferiert werden. Nach dem Transfer werden das Ovar und der Uterus in den Körper zurück gedrückt, und der Schnitt wird mit zwei Nähten geschlossen. Diese Prozedur wird auf der gegenüber liegenden Seite wiederholt, wenn weitere Transfers vorgenommen werden sollen.
Identifizierung transgener Mäuse und Ratten
Schwanzproben(1–2 cm) werden drei Wochen alten Tiere entnommen. Die DNA wird präpariert und sowohl mittels Southern Blots als auch PCR analysiert, um die transgenen Ausgangstiere (F₀) und ihre Nachkommen (F₁ und F₂) zu identifizien.
Pathologie-Studien
Die verschiedenen F₀-, F₁- und F₂-Tiere, die das mikroinjizierte Transgen tragen, werden durch CO₂-Asphyxie getötet und immunhistologisch bezüglich neuritischer Plaques und neurofibrillärer Bündel (NFTs) im Gehirn analysiert. Die Gehirne von Mäusen und Ratten jeder transgenen Linie werden in 4% Paraformaldehyd fixiert und mit einem Kryostaten geschnitten. Die Schnitte werden mit Antikörpern gegen das APP und/oder das β-Peptid gefärbt. Sekundäre, mit Fluorescein, Rhodamin, Meerrettich-Peroxidase oder alkalischer Phosphatase konjugierte Antikörper werden zum Nachweis der primären Antikörper verwendet. Diese Experimente ermöglichen die Identifizierung von Amyloid-Plaques und die Lokalisierung dieser Plaques in spezifischen Bereichen des Gehirns. Plaques im Größenbereich von 9 bis 50 μm kommen charakteristischerweise in den Gehirnen von AK-Patienten in der Großhirnrinde vor, aber sie können auch in der tieferen grauen Substanz, einschlielich des Mandelkerns, des Corpus striatum und des Diencephalon beobachtet werden. Schnitte werden auch mit anderen Antikörpern gefärbt, die Alzheimer-Plaques anzeigen, indem sie Antigene wie Alz-50, tau, A2B5, Neurofilamente, die Neuronen-spezifische Enolase sowie andere erkennen, die charakteristisch für Alzheimer-Plaques sind (Wolozin et al., Science 232, 648 (1986); Hardy und Allsop, Trends in Pharm. Sci. 12, 383–388 (1991); Selkoe, Ann. Rev. Neurosci. 12, 463–490 (1989); Arai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 2249–2253 (1990); Majocha et al., Amer. Assoc. Neuropathology Abs. 99, 22 (1988); Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 4245–4249; Majocha et al., Can. J. Biochem. Cell Biol. 63, 577–584 (1985)). Die Färbung mit Thioflavinen und Kongorot wird ebenfalls durchgeführt, um die Kolokalisation der β-Peptid-Ablagerungen in neuritischen Plaques und der NFTs zu analysieren.
Analyse der APP-und β-Peptid-Expression
mRNA: Die mRNA wird mittels der Methode der Extraktion mit saurem Guanidinium-Thiocyanat-Phenol : Chloroform (Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156–159 (1987)) aus Zelllinien und Geweben transgenerTiere isoliert, um die Expressionsspiegel mittels Northern-Blots zu bestimmen.
Protein: Das APP und das β-Peptid werden über die Verwendung polyklonaler und monoklonaler Antikörper nachgewiesen, die für die extrazytoplasmatische Domäne, den β-Peptid-Bereich und den C-Terminus spezifisch sind.
Western-Blot-Analyse: Es werden Proteinfraktionen aus Gewebehomogenaten und Zelllysaten isoliert und einer Western-Blot-Analyse unterzogen, wie es von Harlow et al., Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor, New York, 1988), Brown et al., J. Neurochem. 40, 299–308 (1983) und von Tate-Ostroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 745–749 (1989) beschrieben wurde. Im Folgenden wird nur eine kurze Beschreibung gegeben.
Die Proteinfraktionen werden in Laemmli-Probenpuffer denaturiert und einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Die Proteine werden dann durch Elektroblotting auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Filter werden geblockt, mit primären Antikörpern inkubiert und zuletzt mit Enzym-konjugierten sekundären Antikörpern inkubiert. Die nachfolgende Inkubation mit dem geeigneten chromogenen Substrat zeigt die Position der APP-Proteine an.
Pathologie- und Verhaltensstudien
Pathologiestudien
Die Immunhistologie und die Thioflavin-S-Färbung werden wie hier an anderer Stelle beschrieben durchgeführt.
In-situ-Hybridisierungen: Radioaktiv oder enzymatisch markierte Sonden werden zum Nachweis von mRNA in situ verwendet. Die Sonden werden für ein besseres Eindringen in die Zellen auf eine Länge von ungefähr 100 Nukleotiden abgebaut. Die Prozedur von Chou et al., J. Psych. Res. 24, 27–50 (1990) für fixierte und paraffineingebettete Sonden wird im Folgenden kurz beschrieben, aber es können ähnliche Verfahren mit Proben, die als gefrorenes Material geschnitten wurden, durchgeführt werden. Paraffin-Objektträger für die In-situ-Hybridisierung werden mit Xylol entwachst, in einer abgestuften Ethanol-Reihe rehydratisiert und zuletzt in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) gespült. Die Schnitte werden in frischem 4%-igem Paraformaldehyd nachfixiert. Die Objektträger werden zweimal für 5 Minuten mit PBS gewaschen, um den Paraformaldehyd zu entfernen. Dann werden die Schnitte durch die Behandlung mit einer Proteinase-K-Lösung von 20 μg/ml permeabilisiert. Die Schnitte werden erneut in 4%-igem Paraformaldehyd fixiert, und basische Moleküle, die zu einer Hintergrund-Bindung der Sonde führen könnten, werden in einer Lösung von 0,1 M Triethanolamin und 0,3 M Essigsäureanhydrid 10 Minuten acetyliert. Die Objektträger werden in PBS gewaschen, dann in einer abgestuften Ethanolreihe dehydriert und luftgetrocknet. Die Schnitte werden mit einer Antisense-Sonde hybridisiert, wobei eine Sense-Sonde als Kontrolle dient. Nach einer geeigneten Waschung werden gebundene radioaktive Sonden durch Autoradiographie oder durch enzymatisch markierte Sonden über eine Reaktion mit den geeigneten chromogenen Substraten nachgewiesen.
Verhaltensstudien
Es werden Verhaltensstudien eingesetzt, die so angelegt sind, dass sie Lern- und Gedächntnisdefizite erfassen. Ein Beispiel für einen derartigen Test ist der Wasserlabyrinth-Test nach Morris (Morris, Learn Motivat. 12, 239–260 (1981)). Bei diesem Verfahren wird der Nager in ein rundes, mit Wasser gefülltes Becken mit einer Rettungsplattform, die knapp unter der Oberfläche des Wassers liegt, gesetzt. Die Plattform trägt eine sichtbare Markierung, so dass der Nager sie über die Navigation in Richtung eines proximalen sichtbaren Hinweiszeichens finden kann. Alternativ wird eine komplexere Form des Tests, bei der keine formalen Hinweiszeichen zur Markierung der Lage der Plattform gegeben werden, mit den Nagern durchgeführt. Bei dieser Form muss der Nager die Lage der Plattform bezüglicher distaler sichtbarer Hinweiszeichen lernen.
Die Verfahren, die zur Testung transgener Mäuse eingesetzt werden, sind denjenigen für transgene Ratten ähnlich.
Screening von Verbindung bezüglich einer Behandlung der Alzheimer-Krankheit
Die transgenen Nager und Säugetierzellen werden für das Screening von Verbindungen bezüglich einer potenziellen Wirkung bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit mittels Standard-Verfahren eingesetzt. Die Verbindung wird den Nagern verabreicht oder dem Kulturmedium zugesetzt, und zwar für einen gewissen Zeitraum und in verschiedenen Dosierungen, und dann werden die Nager oder Säugerzellen bezüglich Veränderungen der APP-Expression, der Histopathologie und/oder des Verhaltens unter Einsatz der oben beschriebenen Verfahren untersucht.
Beispiel 1: Expression des pMTAPP-1 in NIH3T3- und PC12-Zellen
Der Klon pMTAPP-1 ist ein Beispiel für den in der 1 a gezeigten Expressionsvektor, wobei der verwendete Promotor der Metallothionein-Promotor ist. Stabille Zelllinien wurden durch das Transfizieren der NIH3T3- und PC12-Zelllinien (ATCC-Nr. CCL92 und CRL1721) gewonnen. 0,5 × 10⁶ NIH3T3- oder PC12-Zellen wurden in 100-mm-Kulturschalen ausgesät und in einem letztendlichen Volumen von 100 μl mit einer Mischung von 5 mg des Sall-Fragments und 1 mg pSV2neo-DNA (46), die in Gegenwart von 50 mg Lipofectin (Gibco-BRL) gefällt wurden, transfiziert. Polylysin-beschichtete Platten wurden für die PC12-Zellen verwendet, die normalerweise nicht gut an Gewebekulturplatten anhaften. Die Zellen wurden mit Selektionsmedium gefüttert, das 10% fötales Kälberserum in DMEM oder RPMI enthielt und mit G418 supplementiert war. Es wurden fünfhundert mg/ml (biologisches Gewicht) und 250 mg/ml G418 zur Selektion von Kolonien der NIH3T3- bzw. PC12-Zellen eingesetzt. Fünfzehn Tage nach der Transfektion wurden die gegen G418 resistenten Zellkolonien mittels Klonierringen isoliert und in T-Flaschen vermehrt. Die Gegenwart von APP-cDNA in den Zellen wurde durch PCR mittels des Verfahrens von Mullis und Faloona, Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987) nachgewiesen.
Die Expression des APP in 25 Kolonien jeder Zelllinie wurde mittels Immunfärbung analysiert (Majocha et al., 1988). Man ließ die Zellen bis zum subkonfluenten Zustand wachsen, und dann wurden sie in einer Lösung fixiert, die 4% Paraformaldehyd, 0,12 M NaCl und 20 mM Na₃PO₄, pH 7,0, enthielt. Sie wurden über Nacht mit einem primären monoklonalen Antikörper gegen eine synthetische β-Peptid-Sequenz (Masters et al., 1985), der von Dr. Ronald Majocha, Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, bereit gestellt worden war, inkubiert, gefolgt von einem generellen, mit Biotin konjugierten Anti-Maus-Antikörper (Jackson ImmunoResearch Labs, Pennsylvania). Dann wurde die Immunfärbung durch Zugabe von Avidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) (Vector Labs, Burlingame, Kalifornien) und Diaminobenzidin als Chromogen (Majocha et al., 1985) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass der pMTAPP-1-Vektor sowohl in den NIH3T3- als auch in den PC12-Zellen APP exprimierte.
Beispeel 2: Expression von pEAPP-1 in PC12-Zellen
pEAPP-1 ist ein Beispiel für den humanen, 25 kb langen Promotor des APP-Gens, der mit einer humanen APP770-cDNA verknüpft ist und deren Expression steuert, wie das Konstrukt in der 1A. Die DNA dieses Konstrukts wurde wie oben beschrieben in PC12-Zellen transfiziert. Bestimmte Klone der mit pEAPP-1 transfizierten Zellen zeigten einen Differenzierungsphänotyp, der morphologisch demjenigen ähnlich war, den mit mit nerve growth factor (NGF) behandelte PC12-Zellen zeigen. PC12-Zellen sind normalerweise ziemlich runde und flache Zellen. Die mit pEAPP-1 transfizierten haben zytoplasmatische Fortsätze, die Neuriten ähneln. Mit NGF behandelte PC12-Zellen entwickeln sehr lange neuritische Fortsätze. Dreizehn mit pEAPP-1 transfizierte PC12-Zellklone wurden selektiert und vermehrt. Acht dieser Zellklone zeigten den Phänotyp der spontanen Differenzierung, wobei die Klone 1-8, 1-1 und 1-4 diesen Phänotyp am stärksten ausprägten. Die Färbung pEAPP-1-transfizierter PC12-Zellen mit einem Antikörper gegen das β-Peptid wie oben beschrieben ergab, dass diejenigen Zellen, die die Differenzierung zeigten, auch APP exprimierten. Da mit dem pMTAPP1-Klon transfizierte PC12-Zellen diesen Phänotyp nicht zeigen, auch wenn die APP770-cDNA exprimiert wird, legen diese Ergebnisse nahe, dass die Expression von APP770 vom humanen Promotor neuartige Eigenschaften bezüglich der Physiologie der Zelle zur Folge hat.
Beispiel 3: Expression von pMTA4 in PC12-Zellen
pMTA4 ist ein Beispiel für den in der 4A gezeigten Konstrukttyp, wobei der verwendete Promotor der Metallothionein-Promotor ist. Das von diesem Konstrukt codierte Protein unterscheidet sich leicht von dem in der 4 dargestellten. Ein APP770-cDNA-Klon wurde mit Asp718 verdaut, die nach der Position 56 spaltet (Zählweise nach Kang et al., 1987). Die resultierende 5'-Verlängerung wurde mittels des Klenow-Enzyms gefüllt (Maniatis). Die gleiche DNA-Präparation wurde auch mit EcoRI gespalten, die auch nach der Position 1795 schneidet, und die resultierende 5'-Verlängerung wurde mittels des Klenow-Enzyms gefüllt (Maniatis). Die Selbstligation dieses Moleküls ergibt einen Expressionsklon, bei dem das codierte verkürzte Protein die Leadersequenz enthält, gefolgt von einer verkürzten Version des β-Peptids, die mit der Sequenz Phe-Arg-Val-Gly-Ser des β-Peptids beginnt, gefolgt von den 56 terminalen Aminosäuren des APP. Die DNA dieses Konstrukts wurde wie oben beschrieben in PC12-Zellen transfiziert.
Beispiel 4: Erzeugung von transgenen Mäusen, die das APP unter der Kontrolle des MT-1-Promotors exprimieren
Transgene Mäuse wurden durch die Mikroinjektion der DNA des pMTAPP1-Vektors in pronukleäre Mausembryonen hergestellt. pMTAPP1 ist ein Beispiel für den in der 1a gezeigten Konstrukttyp, der funktionsfähig mit dem Metallothionein-Promotor verknüpft ist. Die Verfahren zur Mikroinjektion in Mausembryonen werden in „Manipulating the mouse embryo" von B. Hogan et al. (1986) beschrieben. Im Folgenden wird nur eine kurze Beschreibung des Verfahrens gegeben.
Mäuse wurden von Taconic Laboratories (German Town, New York) bezogen. Weibliche Swiss-Webster-Mäuse wurden für die Gewinnung und Implantation von Mausembryonen verwendet. Es wurden B6D2F-Männchen für die Verpaarung eingesetzt, und vasektomierte Swiss-Webster-Männchen wurden zur Stimulation der Pseudoträchtigkeit verwendet.
Gewinnung von Mausembryonen: Bei weiblichen, 4 bis 8 Wochen alten Mäusen wurde eine Superovulation ausgelöst, indem ihnen eine Injektion von 5 IU (0,1 ml, i.p.) von Gonadotropin aus dem Serum trächtiger Stuten (pregnant mare serum gonadotropin, PMSG; Sigma) verabreicht wurde, an die sich 48 Stunden später eine Injektion von 5 IU (0,1 ml, i.p.) von humanem Choriongonadotropin (hCG; Sigma) anschloss. Die Weibchen wurden unmittelbar nach der hCG-Injektion mit den Männchen zusammengesetzt. Mausembryonen wurden aus den ausgeschnittenen Eileitern verpaarter Weibchen 21 Stunden nach der Applikation von hCG gewonnen und in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Saline mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA; Sigma) gegeben Umgebende Kumuluszellen wurden mit Hyaluronidase (1 mg/ml) entfernt. Pronukleäre Mausembryonen wurden dann gewaschen und bis zum Zeitpunkt der Injektion in Earle's Balanced Salt Solution mit 0,4% BSA (EBSS) in einen Inkubator mit einer Temperatur von 37,5°C und einen feuchten Atmosphäre aus 7 CO₂, 5% CO₂ und 88% N₂ gegeben.
Mikroinjektion: Über Elutip-D^TM gereinigte SalI-DNA wurde für die Mikroinjektion in einer Konzentration von 3 mg/ml in 5 mM Tris (pH 7,4) und 0,1 mM EDTA gelöst. Die Mikronadeln und Haltepipetten wurden aus Fisher-Koagulationsröhrchen (Fisher) mittels eines Pipettenpullers (DKl, Modell 720) ausgezogen. Die Haltepipetten wurden dann bei ungefähr 70 μm (Außendurchmesser) gebrochen und mittels einer Narishige-Mikroschmiede (Modell MF-83) auf einen Innendurchmesser von ungefähr 30 μm feuerpoliert. Die Pipetten wurden an Narishige-Mikromanipulatoren befestigt, die an einem Nikon-Diaphot-Mikroskop angeschlossen waren. Die luftgefüllte Injektionspipette wurde durch die Spitze mit DNA-Lösung gefüllt, nachdem die Spitze an der Haltepipette abgebrochen wurde. Die Mausembryonen wurden in Gruppen von 30 bis 40 Stück für die Mikromanipulation in Tropfen von 100 μl EBBS unter Paraffinöl gegeben. Ein Mausembryo wurde ausgerichtet und mit der Haltepipette gehalten. Die Injektionspipette wurde dann in den männlichen Pronucleus (üblicherweise den größeren) eingeführt. Wenn die Pipette die Membran nicht sofort durchbrach wurde der Tisch angetippt, um die Penetration zu unterstützen. Der Kern wurde dann injiziert, und die Injektion wurde über die Schwellung des Kerns verfolgt. Nach der Injektion wurde die Gruppe der Mausembryonen bis zum Transfer in Empfänger-Weibchen in EBSS gegeben.
Transfer: Weibliche adulte Mäuse, die sich nicht in einer bestimmten Zyklusphase befanden, wurden mit vasektomierten Swiss-Webster-Männchen verpaart. Die Empfänger-Weibchen wurden zum gleichen Zeitpunkt wie die Donor-Weibchen verpaart. Zum Zeitpunkt des Embryotransfers wurden die Weibchen mit Avertin anästhesiert. Die Eileiter wurden durch einen dorsalen Schnitt längs der Mittellinie freigelegt. Dann wurde ein Schnitt direkt über dem Eileiter durch die Körperwand gelegt. Die Eileiter-Bursa wurde dann mit einer Uhrmacher-Pinzette zerrissen. Die Mausembryonen, die transferiert werden sollen, wurden in DPBS gegeben und in die Spitze einer Transferpipette gebracht (ungefähr 10–12 Embryonen). Die Pipettenspitze wurde in das Infundibulum eingeführt, und die Mausembryonen wurden transferiert. Nach dem Transfer wurde der Schnitt mit zwei Nähten geschlossen.
Analyse der Mäuse bezüglich einer Integration des Transgens: Im Alter von drei Wochen wurden Schwanzproben von ungefähr 1 cm Länge für die DNA-Analyse abgeschnitten. Die Schwanzproben wurden durch eine Schüttelinkubation über Nacht bei 55°C in Gegenwart von 0,7 ml 5 mM Tris, pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5% SDS und 350 μg Proteinase K verdaut. Das verdaute Material wurde einmal mit dem gleichen Volumen Phenol und einmal mit dem gleichen Volumen Phenol : Chloroform (1 : 1-Mischung) extrahiert. Die Überstände wurden mit 70 μl 3 M Natriumacetat (pH 6,0) gemischt, und die DNAs wurden durch die Zugabe des gleichen Volumens an 100%-igem Ethanol gefällt. Die DNAs wurden in einer Microfuge abzentrifugiert, einmal mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 100 μl TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, und 1 mM EDTA) gelöst.
10–20 μl der DNAs wurden mit BamHI restriktionsverdaut, einer Elektrophorese auf 1%-igen Agarosegelen unterzogen, auf Nitrocellulosepapier geblotted und mit einem ³²Pmarkierten APP-cDNA-Fragment hybridisiert. Transgene Tiere wurden über eine Autoradiographie der hybridisierten Nitrocellulosefilter identifiziert. Die DNAs wurden auch durch PCR analysiert, die unter Verwendung synthetischer Primer zur Erzeugung eines Fragments von 800 Basenpaaren durchgeführt wurde.
Insgesamt wurden 671 pronucleäre Mausembryonen mikroinjiziert, die zu 73 lebenden und 6 toten Nachkommen führten. Über die DNA-Analyse wurden 9 transgene Mäuse (5 Weibchen und 4 Männchen) identifiziert, die zur Erzeugung von transgenen F₁- und F₂-Tieren weiter gezüchtet wurden. Diese Tiere können bezüglich der Expression von APP-mRNA und -Protein in verschiedenen Geweben und bezüglich Abnormalitäten hinsichtlich des Verhaltens und der Pathologie wie oben beschrieben analysiert werden.

Claims

Transgenes Nagetier oder transgene Säugetierzelle, das bzw. die ein genetisches Konstrukt enthält, das einen Promotor aufweist, der funktionsfähig mit einem Expressionsklon aus einer Kombination von cDNA/genomischer DNA verknüpft ist, wobei der genannte Expressionsklon eine cDNA-Sequenz enthält, die für APP770 codiert, oder eine cDNA-Sequenz, die für APP770 mit einer natürlich vorkommenden Mutation codiert, wobei eine genomische APP-DNA-Sequenz, die besteht aus dem Exon 6 und einem Teil des angrenzenden, stromabwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, den für KI und OX-2 codierenden Bereichen und jeweils einem Teil ihrer stromaufwärts und stromabwärs liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, und dem Exon 9 und einem Teil des angrenzenden, stromaufwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, den entsprechenden Bereich der cDNA-Sequenz ersetzt, die für APP770 codiert, oder der cDNA, die für APP770 mit einer natürlich vorkommenden Mutation codiert, und wobei das Konstrukt in Säugetierzellen transkribiert und alternativ gespleißt wird, so dass mRNA-Moleküle gebildet werden, die für APP695, APP751 und APP770 codieren und in diese translatiert werden.
Transgenes Nagetier oder transgene Säugetierzellen nach Anspruch 1, wobei der Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus dem humanen APP-Promotor, dem APP-Promotor der Maus, dem APP-Promotor der Ratte, dem Metallothionein-Promotor, dem Neuronen-spezifischen Enolase-Promotor der Ratte, dem Promotor des humanen p-Actin-Gens, dem Promotor des Gens des humanen plafelet derived growth factor 8 (PDGF-B), dem Promotor des Gens des Natriumkanals der Ratte, dem Promotor des Gens des basischen Myelin-Proteins der Maus, dem Promotor des Gens der humanen Kupfer-Zink-Superoxiddismutase und dem Promotor des regulatorischen Gens der Säugetier-POU-Domäne.
Transgenes Nagetier oder transgene Säugetierzellen nach Anspruch 1, wobei das Konstrukt in das Chromosom des Nagetiers oder der Säugetierzelle integriert ist.
Kultivierte Zellen des transgenen Nagetiers nach Anspruch 3.
Nagetier nach Anspruch 1, wobei das Codon, das für den Valinrest in der Position 717 des Wildtyp-APP770-Proteins codiert, so mutiert ist, dass es für eine Aminosäure codiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ile, Phe, Gly, Tyr, Leu, Ala, Pro, Trp, Met, Ser, Thr, Asn und Gln besteht.
Nagetier nach Anspruch 1, wobei der Promotor der APP-Promotor dieser Nagetier-Spezies ist.
Verfahren zur Erstellung eines transgenen Modells der Alzheimer-Krankheit, das das Einführen eines genetischen Konstrukts in Nagetierzellen oder Nagetierembryonen umfasst, wobei das Konstrukt einen Promotor aufweist, der funktionsfähig mit einem Expressionsklon aus einer Kombination von cDNA/genomischer DNA verknüpft ist, wobei der genannte Expressionsklon eine cDNA-Sequenz enthält, die für APP770 codiert, oder eine cDNA-Sequenz, die für APP770 mit einer natürlich vorkommenden Mutation codiert, wobei eine genomische APP-DNA-Sequenz, die besteht aus dem Exon 6 und einem Teil des angrenzenden, stromabwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, den für KI und OX-2 codierenden Bereichen und jeweils einem Teil ihrer stromaufwärts und stromabwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, und dem Exon 9 und einem Teil des angrenzenden, stromaufwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, den entsprechenden Bereich der cDNA-Sequenz ersetzt, die für APP770 codiert, oder der cDNA, die für APP770 mit einer natürlich vorkommenden Mutation codiert, und wobei das Konstrukt in Säugetierzellen transkribiert und alternativ gespleißt wird, so dass mRNA-Moleküle gebildet werden, die für APP695, APP751 und APP770 codieren und in diese translatiert werden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das transgene Modell ein Nagetier mit Veränderungen im Verhalten ist.
Verfahren zur Testung, ob eine Verbindung für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit nützlich sein könnte, das umfasst das Bestimmen in einem transgenen Nagetier oder einer transgenen Säugetierzelle, das bzw. die einer Verbindung ausgesetzt wurde, die getestet werden soll, und das bzw. die ein genetisches Konstrukt in das Chromosom integriert enthält, wobei das Konstrukt einen Promotor aufweist, der funktionsfähig mit einem Expressionsklon aus einer Kombination von cDNA/genomischer DNA verknüpft ist, wobei der genannte Expressionsklon eine cDNA-Sequenz enthält, die für APP770 codiert, oder eine cDNA-Sequenz, die für APP770 mit einer natürlich vorkommenden Mutation codiert, wobei eine genomische APP-DNA-Sequenz, die besteht aus dem Exon 6 und einem Teil des angrenzenden, stromabwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, den für KI und OX-2 codierenden Bereichen und jeweils einem Teil ihrer stromaufwärts und stromabwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, und dem Exon 9 und einem Teil des angrenzenden, stromaufwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, den entsprechenden Bereich der cDNA-Sequenz ersetzt, die für APP770 codiert, oder der cDNA-Sequenz, die für APP770 mit einer natürlich vorkommenden Mutation codiert, und wobei das Konstrukt im transgenen Nagetier oder der transgenen Säugetierzelle transkribiert und alternativ gespleißt wird, so dass mRNA gebildet wird, die in APP695, APP751 und APP770 translatiert wird, ob eine veränderte Expression oder Prozessierung von APP vorliegt, wobei das Vorliegen einer veränderten Expression oder Prozessierung des APP eine Wirkung der Verbindung auf die Alzheimer-Krankheit anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 9 unter Verwendung transgener Nagetiere, das außerdem die Bestimmung umfasst, ob die Histopathologie oder das Verhalten der transgenen Nagetiere nach der Verabreichung der Verbindung verändert ist.
Genetisches Konstrukt, das einen Promotor aufweist, der funktionsfähig mit einem Expressionsklon aus einer Kombination aus cDNA/genomischer DNA verknüpft ist, wobei der Expressionsklon eine cDNA-Sequenz enthält, die für APP770 oder für APP770 mit einer natürlich vorkommenden Mutation codiert, wobei eine genomische APP-DNA-Sequenz, die besteht aus dem Exon 6 und einem Teil des angrenzenden, stromabwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, den für KI und OX-2 codierenden Bereichen und jeweils einem Teil ihrer stromaufwärts und stromabwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, und dem Exon 9 sowie einem Teil des angrenzenden, stromaufwärts liegenden Introns, der für ein Spleißen ausreicht, den Bereich der cDNA-Sequenz ersetzt, der für APP770 oder für APP770 mit einer natürlich vorkommenden Mutation codiert, und wobei das Konstrukt in Säugetierzellen transkribiert und alternativ gespleißt wird, so dass mRNA-Moleküle gebildet werden, die für APP695, APP751 und APP770 codieren und in diese translatiert werden.
Genetisches Konstrukt nach Anspruch 11, wobei der Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus dem humanen APP-Promotor, dem APP-Promotor der Maus, dem APP-Promotor der Ratte, dem Metallothionein-Promotor, dem Neuronen-spezifischen Enolase-Promotor der Ratte, dem Promotor des humanen β-Actin-Gens, dem Promotor des Gens des humanen platelet derived growth factor B (PDGF-B), dem Promotor des Gens des Natriumkanals der Ratte, dem Promotor des Gens des basischen Myelin-Proteins der Maus, dem Promotor des Gens der humanen Kupfer-Zink-Superoxiddismutase und dem Promotor des regulatorischen Gens der Säugetier-POU-Domäne.
Genetisches Konstrukt nach Anspruch 11, wobei das Konstrukt zur Integration in das Chromosom einer Säugetierzelle fähig ist.