DE69233022T2

DE69233022T2 - Rekombinante knochenmorphogenetische protein heterodimere, zusammensetzungen und verfahren zur verwendung

Info

Publication number: DE69233022T2
Application number: DE69233022T
Authority: DE
Inventors: David Israel; M. Neil WOLFMAN
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1991-11-04
Filing date: 1992-11-02
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2012-11-03
Also published as: ATE238417T1; US7678885B2; EP0612348B1; KR940703914A; US20030235888A1; US6593109B1; JP2003125789A; AU3062292A; AU674500B2; US5866364A; DE69233022D1; JPH07500968A; US6190880B1; JP3504263B2; EP0612348A1; KR100259827B1; WO1993009229A1; MX9206315A; US20090105137A1

Description

Die vorliegenden Erfindung betrifft eine Serie von neuen rekombinanten heterodimeren Proteinen, die auf dem Gebiet der Behandlung von Knochenschäden, bei der Heilung von Verletzungen des Knochens und im allgemeinen bei der Wundheilung von Nutzen sind. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Gewinnung dieser Heterodimeren, Verfahren zu ihrer Herstellung mittels Verfahren der rekombinanten Gentechnik und Zusammensetzungen, die sie enthalten.
In den vergangenen Jahren wurden Proteinfaktoren isoliert und identifiziert, die durch Wachstum-induzierende Eigenschaften auf Knochen und Knorpel charakterisiert sind. Vgl. z.B. U.S.-Patent Nr. 5,013,649 , veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 90/11366; veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 91/05802 und die Vielzahl der dort zitierten Referenzen. Vgl. auch PCT/LTS90/05903, die eine Proteinsequenz offenbart, die als OP-1 bezeichnet wird, die im wesentlichen ähnlich menschlichem BMP-7 ist und von der berichtet wird, dass sie osteogene Aktivität hat.
Eine Familie von einzelnen knochenmorphogenetischen Proteinen (BMPs), die als BMP-2 bis BMP-9 bezeichnet werden, wurden isoliert und identifiziert. Referenz zum Zwecke der Bereitstellung einer Offenbarung für diese Proteine und Verfahren für ihre Herstellung wird zu dem im Co-Eigentum befindlichen U.S.-Patent Nr. 6,150,328 und die verwandten Anmeldungen, die in dessen Präambel zitiert werden, gemacht. Von besonderem Interesse sind die Proteine, die als BMP-2 und BMP-4 bezeichnet werden, die in dem vorstehend zitierten Patent offenbart sind; BMP-7, offenbart in US 5,141,905 ; BMP-5, offenbart in US 5,106,748 und BMP-6, offenbart in US 5,187,076 . BMP-8 ist offenbart in US 5,688,678 . Weitere Mitglieder der BMP-Familie umfassen BMP-1; BMP-9, offenbart in US 5,116,738 ; und BMP-3, offenbart in US 5,116,738 und der PCT-Publikation 89/01464.
Es besteht Bedarf auf dem Fachgebiet an anderen Proteinen und Zusammensetzungen, die auf dem Gebiet der Knochen- und Wundheilung von Nutzen sind.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterodimeren Proteins bereit, das knochenstimulierende Aktivität hat, umfassend Züchten einer ausgewählten Wirtszelle, die eine Nucleotidsequenz enthält, die ein erstes ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, und eine Nucleotidsequenz, die ein zweites ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, wobei die Nucleotidsequenzen jeweils unter der Kontrolle einer geeigneten regulatorischen Sequenz sind, die imstande ist, die Co-Expression der Proteine zu regeln, und Isolieren des heterodimeren Proteins aus dem Kulturmedium, wobei das heterodimere Protein ein menschlichem BMP-2/5-, BMP-2/6-, BMP-4/5-, BMP-4/6- oder BMP-4/7-Heterodimer ist.
Gemäß einer Ausführungsform dieser Erfindung kann die Wirtszelle mit einem oder mehrere Vektoren, die codierende Sequenzen für einen oder mehrere BMPs enthalten, co-transfiziert sein. Jede BMP-Polynucleotidsequenz kann auf demselben Vektor oder verschiedenen Vektoren vorhanden sein, die in die Zelle transfiziert werden. In einer anderen Ausführungsform können die BMPs oder ihre Fragmente in das Chromosom der Wirtszelle eingebaut sein. Außerdem kann eine einzelne Transkriptionseinheit eine einzelne Kopie von zwei Genen codieren, die einen verschiedenen BMP codieren.
Gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung ist die ausgewählte Wirtszelle, die die beiden Polypeptide codierenden Sequenzen enthält, eine hybride Zelllinie, die durch Fusion von zwei ausgewählten, stabilen Wirtszelle erhalten wird, wobei jede Wirtszelle mit einer Polynucleotidsequenz transfiziert ist, die eine ausgewählten ersten oder zweiten BMP oder ein Fragment davon codiert, und in der Lage ist, diese stabil zu exprimieren.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden daher rekombinante heterodimere Proteine bereitgestellt, die ein Protein oder ein Fragment eines ersten BMP umfassen in Assoziation mit einem Protein oder einem Fragment eines zweiten BMP. Das Heterodimer kann durch seine knochenstimulierende Aktivität charakterisiert sein. Die Heterodimeren umfassen ein Protein oder Fragment von BMP-2 assoziiert mit einem Protein oder Fragment von entweder BMP-5 oder BMP-6; oder ein Protein oder Fragment von BMP-4 assoziiert mit einem Protein oder Fragment von entweder BMP-5, BMP-6 oder BMP-7. Diese Heterodimeren können mittels Co-Expression jedes Proteins in einer ausgewählten Wirtszelle und Isolierung des Heterodimeren aus dem Kulturmedium hergestellt werden.
In einem weiteren Aspekt dieser Endung wird eine Zelllinie bereitgestellt, die eine erste Polynucleotidsequenz enthält, die ein erstes ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, und eine zweite Polynucleotidsequenz, die ein zweites ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, wobei die Sequenzen jeweils unter der Kontrolle eines oder mehrerer geeigneter regulatorischer Systeme für die Expression sind, die imstande sind, die Co-Expression der BMPs als ein Heterodimer zu regeln, worin das besagte rekombinante heterodimere Protein menschliches BMP-2/5-, BMP-2/6-, BMP-4/5-, BMP-4/6- oder BMP-4/7-Heterodimer ist. Die Zelllinie kann mit einem oder mehr als einem Polynucleotidmolekül transfiziert sein. In einer anderen Ausführungsform kann die Zelllinie ein hybride Zelllinie sein, die wie vorstehend beschrieben mittels Zellfusion erzeugt wurde.
Ein andere Aspekt der Erfindung ist ein Polynucleotidmolekül oder Plasmidvektor, das/der eine erste Polynucleotidsequenz enthält, die ein erstes ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, und eine Polynucleotidsequenz, die ein zweites ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, worin das besagte erste ausgewählte BMP BMP-2 oder BMP-4 ist und das besagte zweite ausgewählte BMP BMP-5 oder BMP-6 ist, oder worin das besagte erste ausgewählte BMP BMP-4 ist und das besagte zweite ausgewählte BMP BMP-7 ist. Die Sequenzen sind unter der Kontrolle von mindestens einer geeigneten regulatorischen Sequenz, die imstande sind, die Co-Expression von jedem Protein oder Fragment zu regeln. Das Molekül kann eine einzelne Transkriptionseinheit enthalten, die eine Kopie beider Gene enthält, oder mehr als eine Transkriptionseinheit, von denen jede eine Kopie eines einzelnen Gens enthält.
In noch einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten heterodimeren Proteins, das knochenstimulierende Aktivität hat, in einer prokaryontischen Zelle bereitgestellt, umfassend die Züchtung einer ausgewählten Wirtszelle, die eine Polynucleotidsequenz enthält, die ein erstes ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert; die Züchtung einer zweiten ausgewählten Wirtszelle, die eine Polynucleotidsequenz enthält, die ein zweites ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert; die Isolierung der monomeren Formen von jedem BMP-Protein aus dem Kulturmedium und Co-Zusammenbau eines Monomeren des ersten Proteins mit einem Monomeren des zweiten Proteins, worin das besagte heterodimere Protein ein menschliches BMP-2/5-, BMP-2/6-, BMP-4/5-, BMP-4/6- oder BMP-4/7-Heterodimer ist. Das erste Protein und das zweite Protein sind verschiedene BMPs. Das resultierende biologisch aktive Heterodimer wird danach aus dem Gemisch isoliert. Bevorzugte Zellen sind E. coli.
Somit werden in einem weiteren Aspekt dieser Erfindung rekombinante BMP-Heterodimere, die in einer eukaryontischen Zelle hergestellt werden, bereitgestellt, ebenso wie geeignete Vektoren oder Plasmide, und ausgewählte transformierte Zellen, die bei einem solchen Herstellungsverfahren von Nutzen sind.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind in der folgenden detaillierten Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weiter beschrieben.
1 stellt die DNA- und Aminosäuresequenzen von menschlichem BMP-2 bereit (SEQ ID NRs: 1 und 2).
2 stellt die DNA- und Aminosäuresequenzen von menschlichem BMP-4 bereit (SEQ ID NRs: 3 und 4).
3 stellt die DNA- und Aminosäuresequenzen von menschlichem BMP-7 bereit (SEQ ID NRs: 5 und 6).
4 stellt die DNA- und Aminosäuresequenzen von menschlichem BMP-6 bereit (SEQ ID NRs: 7 und 8).
5 stellt die DNA- und Aminosäuresequenzen von menschlichem BMP-5 bereit (SEQ ID NRs: 9 und 10).
6 stellt die DNA- und Aminosäuresequenzen von menschlichem BMP-8 bereit (SEQ ID NRs: 11 und 12).
7 stellt die DNA-Sequenz von Vektor pALB2-781 bereit, der den reifen Teil des BMP-2-Gens enthält (SEQ ID NRs: 13 und 14).
8 vergleicht die Aktivität von CHO BMP-2 und CHO BMP-2/7 in dem W20 alkalische Phosphatase-Test.
9 vergleicht die Aktivität von CHO BMP-2 und CHO BMP-2/7 in dem BGP (Osteocalcin)-Test.
10 stellt einen Vergleich der W-20-Aktivität von in E. coli hergestelltem BMP-2- und BMP-2/7-Heterodimer bereit.
11 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen von BMP-3.
12 stellt einen Vergleich von BMP-2 und BMP-2/6 in dem W20-Test bereit.
13 stellt einen Vergleich der in vivo-Aktivität von BMP-2/6 und BMP-2 bereit.
14 stellt einen Vergleich der in vivo-Aktivität von BMP-2 und BMP-6 und BMP2/6 bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten heterodimeren Proteins, das knochenstimulierende Aktivität hat, bereit, ebenso wie die rekombinanten Heterodimeren selbst, und Zusammensetzungen, die sie zur therapeutischen Verwendung bei der Knochenstimulation und -reparatur enthalten.
Wie im Verlauf dieses Dokuments verwendet, ist der Ausdruck "Heterodimer" definiert als ein biologisch aktives Proteinkonstrukt, umfassend die Assoziation zweier verschiedener BMP-Proteinmonomere oder ihrer aktiven Fragmente, die durch mindestens eine kovalente Disulfidbindung verknüpft sind. Ein "Heterodimer" dieser Erfindung kann durch die Anwesenheit von zwischen einer und sieben Disulfidbindungen zwischen zwei Strängen von BMP-Komponenten charakterisiert werden.
Gemäß der vorliegenden Endung umfaßt daher ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten BMP-Heterodimeren gemäß der Erfindung die Züchtung einer ausgewählten Wirtszelle, die eine Polynucleotidsequenz enthält, die ein erstes ausgewähltes BMP oder ein biologisch aktives Fragment davon codiert und eine Polynucleotidsequenz, die ein zweites ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert. Das resultierende, co-exprimierte, biologisch aktive Heterodimer bildet sich innerhalb der Wirtszelle, wird daraus sezerniert und aus dem Kulturmedium isoliert. Bevorzugte Ausführungsformen der Verfahren zur Herstellung heterodimerer Proteine dieser Erfindung werden im Detail nachstehend und in den folgenden Beispielen beschrieben. Bevorzugte Verfahren der Erfindung umfassen bekannte Techniken der rekombinanten Gentechnik [vgl. z.B. Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2te Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] Es können jedoch auch andere Verfahren wie die herkömmliche chemische Synthese bei der Herstellung der Heterodimeren dieser Erfindung von Nutzen sein.
BMP-Heterodimere, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, werden in einem Gemisch aus Homodimeren und Heterodimeren hergestellt. Dieses Gemisch aus Heterodimeren und Homodimeren kann durch Rückgriff auf im wesentlichen herkömmliche Verfahren, wie die klassische Proteinbiochemie oder Affinitäts-Antikörpersäulen, die spezifisch für eines der BMPs sind, aus denen das Heterodimer aufgebaut ist, von Verunreinigungen im Kulturmedium getrennt werden. Zusätzlich können nach Wunsch die Heterodimeren von den Homodimeren in dem Gemisch getrennt werden. Solche Trenntechniken erlauben die eindeutige Bestimmung der Aktivität der heterodimeren Arten. Das Beispiel 4 stellt ein gegenwärtig verwendetes Reinigungsschema für diesen Zweck bereit.
Die rekombinanten Heterodimeren dieser Erfindung, die gemäß dieser Verfahren hergestellt werden, umfassen die BMPs, die als menschliches BMP-2, menschliches BMP-4, menschliches BMP-5, menschliches BMP-6 und menschliches BMP-7 bezeichnet werden und sind menschliches BMP-2/5-, BMP-2/6-, BMP-4/5-, BMP-4/6-, oder BMP-4/7-Heterodimere.
Vorstehend spezifisch identifizierte BMPs können auch in Heterodimeren verwendet werden, die für tierärztliche, diagnostische oder Forschungszwecke von Nutzen sind.
Menschliches BMP-2 ist dadurch charakterisiert, dass es im wesentlichen die gesamte Sequenz, oder Fragmente, der Aminosäuresequenz und der DNA-Sequenz enthält, die in 1 offenbart ist. Menschliche BMP-2-Proteine sind weiterhin als Disulfid-verknüpfte Dimere und Homodimere von reifen BMP-2-Untereinheiten charakterisiert. Rekombinant exprimierte BMP-2-Untereinheiten umfassen Proteinarten, die heterogene Aminoenden haben. Eine BMP-2-Untereinheit ist dadurch charakterisiert, dass sie Aminosäure #249 (Ser) – #396 (Arg) von 1 (SEQ ID NRs 1 und 2) umfaßt. Eine andere BMP-2-Untereinheit ist dadurch charakterisiert, dass sie Aminosäure #266 (Thr) – #396 (Arg) von 1 umfaßt. Eine andere BMP-2-Untereinheit ist dadurch charakterisiert, dass sie Aminosäure #296 (Cys) – #396 (Arg) von 1 umfaßt. Eine reife BMP-2-Untereinheit ist dadurch charakterisiert, dass sie Aminosäure #283 (Gln) – #396 (Arg) von 1 umfaßt. Diese letztere Untereinheit ist die gegenwärtig häufigste Proteinart, das von der rekombinanten Expression von BMP-2 resultiert (1).
Die Anteile von gewissen Arten an hergestelltem BMP-2 können jedoch durch Manipulation der Kulturbedingungen geändert werden. BMP-2 kann auch Modifikationen der Sequenzen von 1 umfassen, z.B. Deletion der Aminosäuren #241–280 und die Änderung der Aminosäure #245 Arg zu Ile, unter anderen Änderungen.
Wie im Detail in dem United States Patent Nr. 6,150,328 beschrieben, kann menschliches BMP-2 durch Züchtung einer Zelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die codierende Nucleotidsequenz von Nucleotid #356 bis #1543 in 1 umfaßt, und durch Gewinnung und Reinigung von einer oder mehrerer der vorstehend identifizierten Proteinarten aus dem, im wesentlichen von anderen Proteinmaterialien, mit denen es gemeinsam hergestellt wird, freien Kulturmedium, hergestellt werden. Menschliches BMP-2 hat auch in vitro-Aktivität im W20-Biotest. Menschliche BMP-2-Proteine sind durch ihre Fähigkeit zur Induktion der Knochenbildung charakterisiert. Menschliches BMP-2 ist weiterhin durch seine Fähigkeit zur Induktion der Knorpelbildung charakterisiert. Menschliches BMP-2 ist weiterhin durch seine Fähigkeit charakterisiert, Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität in dem Ratten-Knochenbildungstest zu zeigen, der in der vorstehend zitierten Anmeldung beschrieben ist.
Menschliches BMP-4 ist dadurch charakterisiert, dass es im wesentlichen die gesamte Sequenz, oder Fragmente, der Aminosäuresequenz und der DNA-Sequenz enthält, die in 2 offenbart ist (SEQ ID NRs 3 und 4). Menschliche BMP-4-Proteine sind weiterhin als Disulfid-verknüpfte Dimere und Homodimere von reifen BMP-4-Untereinheiten charakterisiert. Rekombinant exprimierte BMP-4-Untereinheiten können Proteinarten umfassen, die heterogene Aminoenden haben. Eine reife Untereinheit von menschlichem BMP-4 ist durch eine Aminosäuresequenz charakterisiert, die Aminosäuren #293 (Ser) – #408 (Arg) von 2 umfaßt. Andere Aminoenden von BMP-4 können aus der Sequenz von 2 ausgewählt werden. Modifizierte Versionen von BMP-4, einschließlich Proteine, die am Amino- oder Carboxy-Ende weiter verkürzt sind, können auch durch Rückgriff auf herkömmliche Mutagenese-Techniken konstruiert werden.
Wie in dem US-Patent Nr. 6,150,328 offenbart, kann BMP-4 durch Züchtung einer Zelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die codierende Nucleotidsequenz von Nucleotid #403 bis #1626 in 2 umfaßt, und durch Gewinnung und Reinigung eines Proteins, das die Aminosäuresequenz von Aminosäure #293 bis #408, wie in 2 gezeigt, enthält, aus dem, im wesentlichen von anderen Proteinmaterialien, mit denen es gemeinsam hergestellt wird, freien Kulturmedium, hergestellt werden. BMP-4-Proteine sind zur Induktion der Knochenbildung in der Lage. BMP-4-Proteine sind zur Induktion der Knorpelbildung in der Lage. BMP-4-Proteine sind weiterhin durch ihre Fähigkeit charakterisiert, Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität in dem Ratten-Knochenbildungstest zu zeigen.
Menschliches BMP-7 ist dadurch charakterisiert, dass es im wesentlichen die gesamte Sequenz, oder Fragmente, der Aminosäuresequenz und der DNA-Sequenz enthält, die in 3 offenbart ist. Menschliche BMP-7-Proteine sind weiterhin als Disulfid-verknüpfte Dimere und Homodimere von reifen BMP-7-Untereinheiten charakterisiert. Rekombinant exprimierte BMP-7-Untereinheiten umfassen Proteinarten, die heterogene Aminoenden haben. Eine reife BMP-7-Untereinheit ist dadurch charakterisiert, dass sie Aminosäure #293 (Ser) – #431 (His) von 3 enthält (SEQ ID NRs: 5 und 6). Diese Untereinheit ist das am meisten gebildete Protein, das bei der rekombinanten Expression der BMP-7-Sequenz hergestellt wird. Eine andere BMP-7-Untereinheit ist dadurch charakterisiert, dass sie Aminosäure #300 (Ser) – #431 (His) von 3 umfaßt. Noch eine andere BMP-7-Untereinheit ist dadurch charakterisiert, dass sie Aminosäure #316 (Ala) – #431 (His) von 3 umfaßt. Andere Amino-Enden von BMP-7 können von der Sequenz von 3 ausgewählt werden. In ähnlicher Weise können modifizierte Versionen von BMP-7, einschließlich Proteine, die am Amino- oder Carboxy-Ende weiter verkürzt sind, auch durch Rückgriff auf herkömmliche Mutagenese-Techniken konstruiert werden.
Wie in dem US-Patent Nr. 5,141,905 offenbart, kann BMP-7 durch Züchtung einer Zelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die codierende Nucleotidsequenz von Nucleotid #97 bis Nucleotid #1389 in 3 umfaßt, und durch Gewinnung und Reinigung eines Proteins, das die Aminosäuresequenz von Aminosäure #293 bis #431, wie in 3 gezeigt, enthält, aus dem, im wesentlichen von anderen Proteinmaterialien oder verunreinigendem Material, mit denen es gemeinsam hergestellt wird, freien Kulturmedium, hergestellt werden. Diese Proteine sind in der Lage, die Knorpel- und/oder Knochenbildung zu stimulieren, zu fördern oder anders zu induzieren.
Menschliches BMP-6 ist dadurch charakterisiert, dass es im wesentlichen die gesamte Sequenz, oder Fragmente, der Aminosäuresequenz und der DNA-Sequenz enthält, die in 4 offenbart ist. Menschliche BMP-6-Proteine sind weiterhin als Disulfid-verknüpfte Dimere von reifen BMP-6-Untereinheiten charakterisiert. Rekombinant exprimierte BMP-6-Untereinheiten können Proteinarten umfassen, die heterogene Aminoenden haben. Eine BMP-6-Untereinheit ist dadurch charakterisiert, dass sie Aminosäure #375 (Ser) – #513 (His) von 4 enthält (SEQ ID NRs: 7 und 8). Andere Amino-Enden von BMP-6 können von der Sequenz von 4 ausgewählt werden. Modifizierte Versionen von BMP-6, einschließlich Proteine, die am Amino- oder Carboxy-Ende weiter verkürzt sind, können auch durch Rückgriff auf herkömmliche Mutagenese-Techniken konstruiert werden.
Wie in dem United States-Patent Nr. 5,187,076 im Detail beschrieben, kann menschliches BMP-6 durch Züchtung einer Zelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die codierende Nucleotidsequenz von Nucleotid #160 bis Nucleotid #1698 in 4 umfaßt, und durch Gewinnung und Reinigung eines Proteins, das die Aminosäure #375 bis #513, wie in 4 gezeigt, enthält, aus dem, im wesentlichen von anderen Proteinmaterialien oder anderen verunreinigenden Materialien, mit denen es gemeinsam hergestellt wird, freien Kulturmedium, hergestellt werden. Menschliches BMP-6 kann weiterhin durch seine Fähigkeit charakterisiert werden, Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität in dem Ratten-Knochenbildungstest zu zeigen.
Menschliches BMP-5 ist dadurch charakterisiert, dass es im wesentlichen die gesamte Sequenz, oder Fragmente, der Aminosäuresequenz und der DNA-Sequenz enthält, die in 5 offenbart ist (SEQ ID NRs: 9 und 10). Menschliche BMP-5-Proteine sind weiterhin als Disulfid-verknüpfte Dimere von reifen BMP-5-Untereinheiten charakterisiert. Rekombinant exprimierte BMP-5-Untereinheiten können Proteinarten umfassen, die heterogene Aminoenden haben. Eine BMP-5-Untereinheit ist dadurch charakterisiert, dass sie Aminosäuren #329 (Ser) – #454 (His) von 5 umfaßt. Andere Amino-Enden von BMP-5 können von der Sequenz von 5 ausgewählt werden. Modifizierte Versionen von BMP-5, einschließlich Proteine, die am Amino- oder Carboxy-Ende weiter verkürzt sind, können auch durch Rückgriff auf herkömmliche Mutagenese-Techniken konstruiert werden.
Wie in dem United States-Patent Nr. 5,543,394 im Detail beschrieben, kann menschliches BMP-5 durch Züchtung einer Zelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die codierende Nucleotidsequenz von Nucleotid #701 bis #2060 in 5 umfaßt, und durch Gewinnung und Reinigung eines Proteins, das die Aminosäure #329 bis #454 von 5 enthält, aus dem, im wesentlichen von anderen Proteinmaterialien oder anderen verunreinigenden Materialien, mit denen es gemeinsam hergestellt wird, freien Kulturmedium, hergestellt werden. Menschliches BMP-5 kann weiterhin durch seine Fähigkeit charakterisiert werden, Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität in dem Ratten-Knochenbildungstest zu zeigen, der in der vorstehend zitierten Anmeldung beschrieben ist.
Jedes vorstehend beschriebene BMP-Protein in seiner reifen, nicht reduzierten Form kann weiterhin durch ein offensichtliches Molekulargewicht charakterisiert werden, das auf einem 12%-igen Laemmli-Gel von etwa 28 kD bis etwa 40 kD reicht. Analoge oder modifizierte Versionen der hier beschriebenen DNA- und Aminosäuresequenzen, die Proteine oder aktive Fragmente bereitstellen, die in dem Knochenbildungstest der Ratte, der nachstehend in Beispiel 9 beschrieben ist, knochenstimulierende oder Knochenreparatur-Aktivität zeigen, werden auch als geeignete BMPs zur Verwendung in dieser Erfindung eingestuft, unter der weiteren Voraussetzung, dass die Proteine oder Fragmente einen oder mehr Cys-Reste zur Teilnahme an Disulfidbindungen enthalten. Nützliche Modifikationen dieser Sequenzen können vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet unter Rückgriff auf bekannte Verfahren der Gentechnik gemacht werden. Die Herstellung dieser BMP-Sequenzen in Säugerzellen hergestellt Homodimere, im allgemeinen Gemische von Homodimeren, die heterologe N-Enden haben. Die Herstellung dieser BMP-Sequenzen in E. coli hergestellt monomere Proteinarten.
Somit umfaßt gemäß dieser Erfindung ein rekombinantes Heterodimer der vorliegenden Erfindung die Assoziation von menschlichem BMP-2, einschließlich z.B. einem monomeren Strang einer reifen BMP-2-Untereinheit, wie vorstehend beschrieben, oder eines aktiven Fragmentes davon, durch eine oder bis zu sieben kovalente Disulfidbindungen an menschliches BMP-5 gebunden, einschließlich z.B. einen monomeren Strang einer reifen BMP-5-Untereinheit, wie vorstehend beschrieben, oder eines aktiven Fragmentes davon. Ein anderes rekombinantes Heterodimer der vorliegenden Erfindung umfaßt die Assoziation von menschlichem BMP-2, wie vorstehend beschrieben, durch eine oder bis zu sieben kovalente Disulfidbindungen an menschliches BMP-6 gebunden, einschließlich z.B. einen monomeren Strang von einer BMP-6-Untereinheit, wie vorstehend beschrieben, oder ein aktives Fragment davon.
Noch ein anderes rekombinantes Heterodimer der vorliegenden Erfindung umfaßt die Assoziation von menschlichem BMP-4, z.B. einem monomeren Strang einer BMP-4-Untereinheit, wie vorstehend beschrieben, oder eines aktiven Fragmentes davon, durch eine oder bis zu sieben kovalente Disulfidbindungen an menschliches BMP-5 gebunden, wie vorstehend beschrieben. Ein anderes rekombinantes Heterodimer der vorliegenden Erfindung umfaßt die Assoziation von menschlichem BMP-4, wie vorstehend beschrieben, durch eine oder mehr kovalente Disulfidbindungen an menschliches BMP-6 gebunden, wie vorstehend beschrieben. Ein anderes rekombinantes Heterodimer der vorliegenden Erfindung umfaßt die Assoziation von menschlichem BMP-4, wie vorstehend beschrieben, durch eine oder mehr kovalente Disulfidbindungen an menschliches BMP-7 gebunden, wie vorstehend beschrieben.
Die Disulfidbindungen, die zwischen den monomeren Strängen der BMPs ausgebildet werden, können zwischen einem Cys auf jedem Strang auftreten. Disulfidbindungen können zwischen zwei Cys auf jedem BMP ausgebildet werden. Disulfidbindungen können zwischen drei Cys auf jedem BMP ausgebildet werden. Disulfidbindungen können zwischen vier Cys auf jedem BMP ausgebildet werden. Disulfidbindungen können zwischen fünf Cys auf jedem BMP ausgebildet werden. Disulfidbindungen können zwischen sechs Cys auf jedem BMP ausgebildet werden. Disulfidbindungen können zwischen sieben Cys auf jedem BMP ausgebildet werden. Diese Disulfidbindungen können zwischen benachbarten Cys auf jedem BMP oder nur zwischen ausgewählten Cys, die in die entsprechende Proteinsequenz eingestreut sind, ausgebildet werden. Es können sich verschiedene Heterodimere mit unterschiedlicher Zahl an Disulfidbindungen bilden, die dieselben BMP-Komponentenstränge haben. Es können sich verschiedene Heterodimere mit Disulfidbindungen an verschiedenen Cys-Stellen bilden, die dieselben BMP-Komponentenstränge haben. Verschiedene Heterodimere, die von dieser Erfindung umfaßt werden, die dieselben BMP-Komponenten haben, können auf Grund ihrer rekombinanten Herstellung in Säugerzellen, Bakterienzellen, Insekten- oder Hefezellen unterschiedlich sein.
Diese rekombinanten Heterodimere können, im Vergleich mit den einzelnen BMP-Homodimeren, von denen ein Strang jedes Heterodimer bildet, durch eine erhöhte alkalische Phosphatase-Aktivität im W20 Stromazelllinie-Biotest der Maus (Beispiel 8) charakterisiert werden. Darüber hinaus sind die Heterodimeren durch größere Aktivität im W20 Biotest als jene, die durch einfaches Mischen der einzelnen BMP-Dimere bereitgestellt wird, charakterisiert. Die vorläufige Charakterisierung der Heterodimeren, gemessen im W20 Biotest, haben gezeigt, dass die Heterodimeren von BMP-2 mit BMP-5, BMP-6 oder BMP-7 sehr aktiv sind. In ähnlicher Weise sind die Heterodimeren von BMP-4 mit BMP-5, BMP-6 oder BMP-7 sehr aktiv im W20 Biotest.
Die Heterodimeren dieser Erfindung können auch durch ihre Aktivität in Knochenwachstums- und Knochenstimulierungstests charakterisiert werden. Zum Beispiel ist ein Heterodimer dieser Endung auch aktiv im Knochenbildungstest der Ratte, der nachstehend in Beispiel 9 beschrieben ist. Die Heterodimeren sind auch aktiv im Osteocalcin-Biotest, der in Beispiel 8 beschrieben ist. Andere Charakteristika eines Heterodimeren dieser Erfindung umfassen die Co-Präzipitation mit anti-BMP-Antikörpern gegen die verschiedenen beteiligten BMPs, ebenso wie charakteristische Resultate bei Western Blots, Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) und auf zweidimensionalen Gelen, mit oder ohne reduzierenden Bedingungen.
Eine Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von rekombinanten BMP-Heterodimeren umfaßt die Züchtung einer geeigneten Zelllinie, die mit einer DNA-Sequenz, die die Expression eines ersten BMP oder eines Fragments davon codiert, und einer DNA-Sequenz, die die Expression eines zweiten BMP oder eines Fragments davon, unter der Kontrolle bekannter regulatorischer Sequenzen, codiert, co-transfiziert wurde. Die transformierten Wirtszellen werden kultiviert und das heterodimere Protein aus dem Kulturmedium gewonnen und gereinigt.
Bei einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens, welches das gegenwärtig bevorzugte Verfahren der Expression der Heterodimeren dieser Erfindung ist, wird eine einzelne Wirtszelle, z.B. eine CHO DUKX-Zelle mit einem ersten DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein BMP codiert, und einem zweite DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein zweites, ausgewähltes BMP codiert, co-transfiziert. Eines oder beide Plasmide enthalten einen selektierbaren Marker, der verwendet werden kann, um stabile Zelllinien zu etablieren, die BMPs exprimieren. Diese getrennten Plasmide, die verschiedene BMP-Gene auf getrennten Transkriptionseinheiten enthalten, werden gemischt und unter Verwendung herkömmlicher Protokolle in CHO-Zellen transfiziert. Ein Verhältnis der Plasmide, das eine maximale Expressions der Aktivität im W20-Test ergibt, im allgemeinen 1:1, wird bestimmt.
Wie zum Beispiel im Detail in Beispiel 3 beschrieben, können gleiche Verhältnisse eines Plasmids, das das erste BMP und ein Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-Markergen enthält und eines anderen Plasmids, das ein zweites BMP und ein DHFR-Markergen enthält, in DHFR-defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII, mittels Calciumphosphat-Co-Präzipitation und Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Protoplastenfusion oder Lipofektion co-eingebracht werden. Einzelne, DHFR exprimierende Transformanten werden zur Züchtung in alpha-Medien mittels herkömmlicher Mittel mit dialysiertem fötalem Kälberserum ausgewählt. DHFR+-Zellen, die erhöhte Genkopien enthalten, können für die Vermehrung in wachsenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) ausgewählt werden (z.B. sequentielle Schritte mit 0,02, 0,1, 0,5 und 2,0 uM MTX) gemäß dem Verfahren von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol., 159:601-629 (1982); und Kaufman et al., Mol. Cell Biol., 5:1750 (1983). Die Expression des Heterodimeren oder mindestens eines mit DHFR verknüpften BMPs sollte mit steigendem Maß an MTX-Resistenz zunehmen. Zellen, die eines oder beide der BMP/DHFR-Gene stabil exprimieren, werden überleben. Mit großer Häufigkeit inkorporieren und exprimieren Zelllinien jedoch stabil beide Plasmide, die während der ursprünglichen Transfektion anwesend sind. Das konditionierte Medium wird danach geerntet und das Heterodimer mittels herkömmlicher Verfahren isoliert und auf Aktivität getestet. Dieser Ansatz kann mit DHFR-defizienten Zellen angewendet werden.
Als eine alternative Ausführungsform dieses Verfahrens kann ein DNA-Molekül, das ein ausgewähltes BMP-Gen enthält, in eine stabile Zelllinie transfiziert werden, die bereits ein anderes ausgewähltes BMP-Gen exprimiert. Wie zum Beispiel nachstehend in Beispiel 3 im Detail beschrieben, wird eine stabile CHO-Zelllinie, die BMP-7 mit dem DHFR-Marker exprimiert (als 7MB9 bezeichnet) [Genetics Institute, Inc] mit einem Plasmid, das BMP-2 enthält und ein zweites selektierbares Markergen, z.B. Neomycin-Resistenz (Neo) transfiziert. Nach der Transfektion wird die Zelle gezüchtet und geeignete Zellen werden durch Behandlung mit MTX und dem Antibiotikum G-418 selektiert. Überlebende Zellen werden dann auf die Expression des Heterodimeren durchmustert. Dieses Expressionssytem hat den Vorteil, dass es einen einzigen Selektionsschritt erlaubt.
Alternative duale Selektionsstrategien unter Verwendung von verschiedenen Zelllinien oder von verschiedenen Markern können ebenfalls verwendet werden. Zum Beispiel kann man die Verwendung des Adenosin-Desaminase (ADA)-Markers für die Amplifikation des zweiten BMP-Gens in einer stabilen CHO-Zelllinie, die ein anderes BMP mit dem DHFR-Marker exprimiert, vorzuziehen sein, da das Niveau an Expression unter Verwendung von Desoxyformycin (DCF)-vermittelter Genamplifikation erhöht werden kann. (Vgl. das ADA enthaltende Plasmid, das in Beispiel 1 beschrieben ist). Als andere Möglichkeit kann jede BMP-Zelle, die zunächst unter Verwendung dieses Markers gemacht wurde, dann der Empfänger eines zweiten BMP-Expressionsvektors sein, der einen verschiedenen Marker enthält und auf duale Resistenz und BMP-Co-Expression selektiert werden.
Noch eine andere Ausführungsform eines Verfahrens der Expression der Heterodimeren dieser Erfindung umfaßt die Transfektion der Wirtszelle mit einem einzelnen DNA-Molekül, das vielfache Gene für die Expression entweder auf einer einzelnen Transkriptionseinheit oder auf getrennten Transkriptionseinheiten codiert. Die multicistronische Expression umfaßt vielfache Polypeptide, die innerhalb eines einzelnen Transkript codiert werden, das effizient unter Verwendung einer Leader-Sequenz z.B. von dem EMC-Virus, von Poliovirus oder von anderen herkömmlichen Quellen von Leader-Sequenzen, von Vektoren translatiert werden kann. Zwei BMP-Gene und ein selektierbarer Marker können innerhalb einer einzelnen Transkriptionseinheit exprimiert werden. Zum Beispiel können Vektoren, die die Konfiguration BMPx-EMC-BMPy-DHFR oder BMPx-EMC-BMPy-EMC-DHFR enthalten, unter Verwendung des DHFR-Markers in CHO-Zellen transfiziert und selektiert und amplifiziert werden. Es kann ein Plasmid konstruiert werden, das DNA-Sequenzen enthält, die zwei verschiedene BMPs, ein oder mehrere Markergene und eine geeignete Leader- oder regulatorische Sequenz auf einer einzelnen Transkriptionseinheit codieren.
In ähnlicher Weise können Wirtszellen mit einem einzelnen Plasmid transfiziert werden, das getrennte Transkriptionseinheiten für jedes BMP enthält. Ein selektierbarer Marker, z.B. DHFR, kann auf einer anderen Transkriptionseinheit, oder, alternativ, als das zweite Cistron auf einem oder beiden BMP-Genen, enthalten sein. Die Plasmide können zur Expression des Heterodimeren in eine ausgewählte Wirtszelle transfiziert werden und das Heterodimer wie vorstehend beschrieben aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden.
Eine andere Ausführungsform dieses Expressionsverfahrens umfaßt die Zellfusion. Zwei stabile Zelllinien, die ausgewählte BMPs exprimieren, wie eine Zelllinie, die BMP-2 exprimiert (z.B. 2EG5) und eine Zelllinie, die BMP-7 exprimiert (z.B. 7MB9), die unter Verwendung des DHFR/MTX-Genamplifikationssystems entwickelt wurden und die BMP auf hohem Niveau exprimieren, wie in Beispiel 1 und den vorstehend eingeschlossenen U.S.-Anmeldungen beschrieben, können mit einem von mehreren dominanten Markergenen (z.B. Neo^r, Hygromycin^r, GPT) transfiziert werden. Nach ausreichender Zeit in Co-Kultur (ungefähr einem Tag) kann eine resultierende Zelllinie, die ein BMP und einen dominanten Marker exprimiert, mit einer Zelllinie, die ein anderes BMP und vorzugsweise einen anderen Marker exprimiert, unter Verwendung eines fusionierenden Reagens, wie Polyethylenglycol, Sendai-Virus oder anderer bekannter Mittel fusioniert werden.
Die resultierenden Zellhybride, die die dominanten Marker und DHFR exprimieren, können unter Verwendung der geeigneten Kulturbedingungen selektiert und auf die Co-Expression der BMPs oder ihrer Fragmente durchmustert werden. Die selektierte Hybridzelle enthält Sequenzen, die die beiden selektierten BMPs codiert, und das Heterodimer bildet sich in der Zelle und wird dann sezerniert. Das Heterodimer wird aus dem konditionierten Medium erhalten und mittels herkömmlicher Verfahren daraus isoliert und gereinigt (vgl. z.B. Beispiel 4). Das resultierenden Heterodimer kann durch hier beschriebene Verfahren charakterisiert werden.
Auf den vorstehend beschriebenen Wegen erzeugte Zelllinien können verwendet werden, um co-exprimierte, heterodimere BMP-Polypeptide zu produzieren. Die heterodimeren Proteine werden mittels herkömmlicher Reinigungsverfahren aus dem Zellmedium in einer Form isoliert, dass sie im wesentlichen frei sind von anderen Proteinen, mit denen sie gemeinsam hergestellt werden, ebenso wie von anderen Verunreinigungen, die in der Wirtszelle gefunden werden. Das gegenwärtig bevorzugte Herstellungsverfahren ist die Co-Transfektion verschiedener Vektoren in CHO-Zellen und Methotrexat-vermittelte Genamplifikation. Stabile Zelllinien können verwendet werden, um konditionierte Medien zu erzeugen, die rekombinantes BMP enthalten, das gereinigt und auf in vitro- und in vivo-Aktivitäten getestet werden kann. Zum Beispiel können die resultierenden, Heterodimer produzierenden Zelllinien, die mittels jedes der hier beschriebenen Verfahren erhalten wurden, mit den in den Beispielen 8 und 9 beschrieben Tests auf Aktivität, auf RNA-Expression und mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) auf Proteinexpression durchmustert werden.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren der Co-Expression der Heterodimeren dieser Erfindung verwenden geeignete Wirtszellen oder Zelllinien. Geeignete Zellen umfassen vorzugsweise Säugerzellen, wie Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO). Die Auswahl geeigneter Wirtszellen und Verfahren für die Transformation, Kultur, Amplifikation, Durchmusterung und Herstellung und Reinigung des Produkts sind im Fachgebiet bekannt. Vgl. z.B. Gething und Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981) oder alternativ Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 (1985) oder Howley et al., U. S.-Patent 4,419,446 . Andere geeignete Säugerzelllinien sind die CV-1-Zelllinie, die BHK-Zelllinien und die 293-Zelllinie. Man nimmt zur Zeit an, dass die COS-1-Zelllinie des Affen bei der Herstellung von BMP-Heterodimer ineffizient ist.
Viele Stämme an Hefezellen, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, können ebenfalls als Wirtszellen für die Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung verfügbar sein, z. B. Saccharomyces cerevisiae. Außerdem können, wo erwünscht, Insektenzellen als Wirtszellen bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vgl. z.B. Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) und die dort zitierten Referenzen.
Ein anderes Verfahren für die Herstellung eines biologisch aktiven heterodimeren Proteins dieser Erfindung kann verwendet werden, wenn die Wirtszellen mikrobielle, vorzugsweise bakterielle Zellen, insbesondere E. coli, sind. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z.B. HB101, MC1061) auf dem Gebiet der Biotechnologie als Wirtszellen bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas, anderen Bazillen und dergleichen können bei diesem Verfahren ebenfalls verwendet werden.
Dieses Verfahren, das angewendet werden kann, um Monomere und Dimere (Homodimere und Heterodimere) zu produzieren, ist beschreiben in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 433,225 . Kurz gesagt umfaßt dieses Verfahren die Züchtung eines mikrobiellen Wirts, der eine Nucleotidsequenz umfaßt, die das gewünschte BMP-Protein codiert, die im geeigneten Leserahmen mit einer Expressionkontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression des Proteins und die Gewinnung des monomeren, löslichen Proteins erlaubt. Wenn das Protein in der Wirtszelle unlöslich ist, wird die Wasser-unlösliche Proteinfraktion aus der Wirtszelle isoliert und das Protein wird solubilisiert. Nach der Chromatographiereinigung wird das solubilisierte Protein ausgewählten Bedingungen unterworfen, um die biologisch aktive dimere Konfiguration des Proteins zu erhalten. Dieses Verfahren, das angewendet werden kann, um die Heterodimeren dieser Endung zu produzieren, ist spezifisch in Beispiel 7 für die Herstellung eines BMP-2-Homodimeren beschrieben.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt DNA-Moleküle oder Plasmidvektoren zur Verwendung bei der Expression dieser rekombinanten Heterodimeren bereit. Diese Plasmidvektoren können unter Rückgriff auf bekannte Verfahren und verfügbare Komponenten, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, konstruiert werden. Im allgemeinen wird, um einen Vektor zu erzeugen, der bei den Verfahren dieser Erfindung von Nutzen ist, die DNA, die das gewünschte BMP-Protein codiert, in einen oder mehrere geeignete Expressionsvektoren transferiert, die für die ausgewählte Wirtszelle geeignet sind.
Es wird gegenwärtig angenommen, dass jeder Expressionsvektor, der für die effiziente Expression in Säugerzellen geeignet ist, verwendet werden kann, um die rekombinanten Heterodimeren dieser Erfindung in Säugerwirtszellen herzustellen. Vorzugsweise enthalten die Vektoren die ausgewählten BMP-DNA-Sequenzen, die vorstehend und in den Figuren beschreiben sind, die ausgewählte BMP-Komponenten des Heterodimeren codieren. Alternativ sind Vektoren, die modifizierte Sequenzen beinhalten, wie beschrieben in den Patentanmeldungen, auf die vorstehend Bezug genommen wird, auch Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und bei der Herstellung der Vektoren von Nutzen.
Zusätzlich zu den spezifischen Vektoren, die in Beispiel 1 beschrieben sind, kann ein Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet Säugerexpressionsvektoren konstruieren, indem er die Sequenz der 1-6 oder andere DNA-Sequenzen verwendet, die die codierenden Sequenzen der 1-6 (SEQ ID NRs: 1, 3, 5, 7, 9 und 11) enthalten, oder andere modifizierte Sequenzen und bekannte Vektoren wie pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)] und pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)]. Die BMP DNA-Sequenzen können durch Entfernen der nicht codierenden Nucleotide an den 5'- und 3'-Enden der codierenden Region modifiziert werden. Die deletierten nicht codierenden Nucleotide können oder können nicht durch andere Sequenzen ersetzt werden, von denen bekannt ist, dass sie für die Expression von Nutzen sind. Die Transformation dieser Vektoren in geeignete Wirtszellen, wie vorstehend beschrieben, kann die gewünschten Heterodimeren produzieren.
Ein Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet könnte die Sequenzen der 1-6 manipulieren, indem er die regulatorischen Säugersequenzen, die die codierende Sequenz flankieren, eliminiert oder durch z.B. regulatorische Hefe- oder Insektensequenzen ersetzt, um Vektoren für die intrazelluläre oder extrazelluläre Expression durch Hefe- oder Insektenzellen zu schaffen. [Vgl. z.B. Verfahren, die in der publizierten Europäischen Patentanmeldung 155,476 für die Expression in Insektenzellen beschrieben sind; und Verfahren, die in der publizierten PCT-Anmeldung WO 86/00639 und der Europäischen Patentanmeldung EPA 123,289 für die Expression in Hefezellen beschrieben sind].
In ähnlicher Weise können auch bakterielle Sequenzen und Präferenz-Codons Sequenzen in den beschriebenen und beispielhaft dargestellten Säugervektoren ersetzen, um geeignete Expressionssysteme zur Verwendung bei der Herstellung der BMP-Monomeren bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren zu schaffen. Zum Beispiel könnten die codierenden Sequenzen weiter manipuliert werden (z.B. Ligierung mit anderen bekannten Linkern oder Modifikation durch Deletion von nicht codierenden Sequenzen daraus oder Änderung von Nucleotiden durch andere bekannte Verfahren). Die modifizierten, BMP codierenden Sequenzen könnten dann unter Verwendung von Verfahren, wie beschrieben bei Z. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230-5233 (1980), in einen bekannten bakteriellen Vektor insertiert werden. Der exemplarische bakterielle Vektor könnte dann in eine bakterielle Wirtszelle transfiziert werden und dadurch BMP-Heterodimere exprimiert werden. Ein exemplarischer Vektor für die mikrobielle, z.B. bakterielle, Expression ist nachstehend in Beispiel 7 beschrieben.
Andere Vektoren, die bei den Verfahren dieser Erfindung von Nutzen sind, können vielfache Gene in einer einzigen Transkriptionseinheit enthalten. Zum Beispiel enthält ein vorgeschlagenes Plasmid p7E2D das BMP-7-Gen, gefolgt von der EMC-Leadersequenz, gefolgt von dem BMP-2-Gen, gefolgt von dem DHFR-Markergen. Ein anderes Beispiel ist das Plasmid p7E2ED, welches das BMP-7-Gen enthält, den EMC-Leader, das BMP-2-Gen, eine andere EMC-Leadeursequenz und das DHFR-Markergen. Alternativ kann der Vektor mehr als eine Transkriptionseinheit enthalten. Als ein Beispiel enthält das Plasmid p2ED7ED eine Transkriptionseinheit für BMP-2 und eine separate Transkriptionseinheit für BMP-7, d.h. BMP-2-EMC-DHFR und BMP-7-EMC-DHFR. Alternativ kann jede Transkriptionseinheit auf dem Plasmid ein unterschiedliches Markergen enthalten. Zum Beispiel enthält das p2EN7ED-Plasmid BMP-2-EMC-Neo und BMP-7-EMC-DHFR.
Außerdem enthalten die Vektoren auch geeignete Expressionskontrollsequenzen die in der Lage sind, die Replikation und Expression des BMP in den ausgewählten Wirtszellen zu steuern. Nützliche regulatorische Sequenzen für solche Vektoren sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt und können in Abhängigkeit von der ausgewählten Wirtszelle ausgewählt werden. Eine solche Auswahl ist Routine und ist kein Teil der vorliegenden Erfindung. In ähnlicher Weise können die Vektoren einen oder mehrere Selektionsmarker enthalten, wie das Antibiotika-Resistenzgen Neo oder selektierbare Marker wie DHFR und ADA. Das gegenwärtig bevorzugte Markergen ist DHFR. Diese Markergene können ebenfalls vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet ausgewählt werden.
Sobald sie gemäß einem der vorstehend beschriebenen Verfahren exprimiert werden, können die Heterodimeren dieser Erfindung durch Anwendung einer Reihe von Tests und Verfahren identifiziert und charakterisiert werden. Ein Co-Präzipitations (Immunpräzipitations)-Test kann mit Antikörpern gegen jedes der BMPs, die das Heterodimeren bilden, durchgeführt werden. Im allgemeinen können Antikörper für diese Verwendung mit herkömmlichen Mitteln entwickelt werden, d.h. unter Verwendung des ausgewählten BMP, Fragmenten davon oder synthetische BMP-Peptide als Antigen. Bei den Tests verwendete Antikörper sind im allgemeinen polyclonale Antikörper, die von einzelnen BMP-Peptiden oder -Proteinen gemacht werden, die gemäß klassischer Verfahren in Kaninchen injiziert werden. Dieser Test wird in herkömmlicher Weise durchgeführt und erlaubt die Identifikation des Heterodimeren, welches durch Antikörper gegen beide BMP-Komponenten des Heterodimeren präzipitiert wird. Im Gegensatz dazu verursacht nur einer der beiden Antikörper die Präzipitation der homodimeren Form, die bei dem Verfahren der Herstellung des Heterodimeren hergestellt werden kann.
Ein anderer charakteristischer Test ist ein Western-Test unter Verwendung eines präzipitierenden Antikörpers, eines Sonden-Antikörpers und eines Nachweis-Antikörpers. Dieser Test kann auch herkömmlich durchgeführt werden, unter Verwendung eines Antikörpers gegen eines der BMPs, um die Dimeren zu präzipitieren, die für die Western-Analyse auf einem reduzierenden SDS-PAGE laufen gelassen werden. Ein Antikörper gegen das zweite BMP wird als Sonde für die Präzipitate auf dem Western-uGel für das Heterodimer verwendet. Ein Nachweis-Antikörper, wie ein Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiert ist, wird dann angewendet, was die Anwesenheit einer der Untereinheitskomponenten des Heterodimeren offenbart.
Letztlich kann die spezifische Aktivität des Heterodimeren, wie im Detail in Beispiel 6 beschrieben, quantifiziert werden. Kurz gesagt wird die Menge an jedem BMP unter Verwendung der Western Blot-Analyse oder der Pulsmarkierung und SDS-PAGE-Analyse in Proben von jedem BMP-Homodimeren und dem Heterodimeren quantifiziert. Die W20-Aktivität wird ebenfalls bestimmt, wie spezifisch in Beispiel 8 beschrieben. Die relativen spezifischen Aktivitäten können mittels der Formel: W20 alkalische Phosphatase-Aktivität/Menge an BMP beim Western Blot oder mittels Fluorographie berechnet werden. Als ein Beispiel wurde diese Formel auf das BMP-2/7-Heterodimer angewendet und gezeigt, dass das Heterodimer eine schätzungsweise 5- bis 50-fach höhere spezifische Aktivität als das BMP-2-Homodimer.
Die Heterodimeren der vorliegenden Endung können eine Reihe von therapeutischen und pharmazeutischen Verwendungen haben, z.B. in Zusammensetzungen für die Wundheilung, Gewebereparatur, und in ähnlichen Zusammensetzungen, die die Verwendung von einzelnen BMPs als Indikation haben. Die erhöhte Wirksamkeit der Heterodimeren gegenüber den einzelnen BMPs kann niedrigere Dosierungen der Zusammensetzungen, in denen sie enthalten sind, zur Verabreichung an den Patienten erlauben im Vergleich zu Dosierungen bei Zusammensetzungen, die nur ein einziges BMP enthalten. Ein heterodimeres Protein der vorliegenden Erfindung, das Knorpel- und/oder Knochenwachstum unter Umständen induziert, unter denen sich normalerweise kein Knochen bildet, findet Anwendung bei der Heilung von Knochenbrüchen und Knorpelschäden beim Menschen und anderen Tieren. Solch eine Präparation, die ein heterodimeres Protein der Erfindung verwendet, kann prophylaktische Verwendung bei der Reduktion von geschlossenen und offenen Brüchen haben und ebenso bei der verbesserten Fixierung von künstlichen Gelenken. De novo-Knochenbildung, die von einem osteogenen Mittel induziert wird, trägt zur Reparatur von angeborenen, von Trauma induzierten oder von onkologischer Resektion induzierten Schädel/Gesichtschäden bei, und ist auch bei kosmetischer plastischer Chirurgie von Nutzen.
Ein heterodimeres Protein dieser Erfindung kann zur Behandlung der periodontalen Krankheit und bei anderen Zahnreparaturvorgängen verwendet werden. Solche Mittel können eine Umgebung bereitstellen, die knochenbildende Zellen anlockt, das Wachstum von knochenbildenden Zellen stimuliert oder die Differenzierung von Vorläufern von knochenbildenden Zellen induziert. Heterodimere Polypeptide der Erfindung können auch bei der Behandlung der Osteoporose von Nutzen sein. Eine Reihe von osteogenen, Knorpel induzierenden und Knochen induzierenden Faktoren wurden beschrieben. Für eine Diskussion davon vgl. z. B. die Europäischen Patentanmeldungen 148,155 und 169,016 .
Die Proteine der Erfindung können auch bei der Wundheilung und der verwandten Gewebereparatur verwendet werden. Die Arten an Wunden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Verbrennungen, Schnitte und Geschwüre. (Für eine Diskussion der Wundheilung und der verwandten Gewebereparatur vgl. z. B. die PCT-Veröffentlichung WO 84/01106).
Außerdem können die Proteine der Erfindung das neuronale Überleben verbessern und können daher bei der Transplantation und bei der Behandlung von Zuständen von Nutzen sein, die eine Verschlechterung des neuronalen Überlebens zeigen.
Angesichts des Nutzens der Heterodimeren ist daher ein weitere Aspekt der Endung eine therapeutische Zusammensetzung zur Reparatur von Brüchen und anderen Zuständen, die ' mit Knorpel- und/oder Knochendefekten oder periodontalen Krankheiten einhergehen. Zusätzlich umfaßt die Endung therapeutische Zusammensetzungen für die Wundheilung und Gewebereparatur. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines heterodimeren Proteins der Erfindung unter Zumischung eines pharmazeutisch verträglichen Vehikels, Trägers oder einer Matrix. Die Präparationen und Formulierungen solcher physiologisch verträglichen Proteinzusammensetzungen hinsichtlich des pH, der Isotonizität, der Stabilität und dergleichen ist Stand der Technik.
Es wird erwartet, dass die Proteine der Erfindung im Zusammenwirken mit anderen verwandten Proteinen und Wachstumsfaktoren wirken. Therapeutische Zusammensetzungen der Erfindung umfassen daher eine therapeutische Menge eines heterodimeren Proteins der Erfindung mit einer therapeutischen Menge von mindestens einem der anderen BMP-Proteine, die in der im selben Besitz befindlichen und parallel angemeldeten, vorstehend beschriebenen U. S.-Anmeldung offenbart sind. Solche Kombinationen können separate Moleküle der BMP-Proteine oder anderen Heteromoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen.
In weiteren Zusammensetzungen können die heterodimeren Proteine der Erfindung mit anderen Mitteln kombiniert werden, die bei der Behandlung des fraglichen Knochen- und/oder Knorpeldefekts, der Wunde oder des Gewebes von Nutzen sind. Diese Mittel umfassen verschiedene Wachstumsfaktoren wie epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF).
Wegen des Fehlens der Arien-Spezifität bei den BMP-Proteinen sind die therapeutischen Zusammensetzungen gegenwärtig auch beim Einsatz in der Veterinärmedizin von Nutzen. Insbesondere Haustiere und Vollblutpferde sind außer Menschen erwünschte Patienten für eine solche Behandlung mit heterodimeren Proteinen der vorliegenden Erfindung.
Die Zusammensetzung kann topisch, systemisch oder lokal als Implantat oder Vorrichtung verabreicht werden. Wenn sie verabreicht wird, ist die therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei dieser Erfindung natürlich in einer pyrogenfreien, physiologisch verträglichen Form. Weiterhin kann die Zusammensetzung zur Verabreichung an der Stelle des Knochen- Knorpel- oder Gewebeschadens wünschenswerterweise verkapselt sein oder in viskoser Form injiziert werden. Die topische Verabreichung kann für die Wundheilung und Gewebereparatur geeignet sein. Bei den Verfahren der Erfindung können andere therapeutische nützliche Mittel als die heterodimeren Proteinen der Erfindung, die gegebenenfalls, wie vorstehend beschrieben, in die Zusammensetzung eingeschlossen sein können, alternativ oder zusätzlich simultan oder schrittweise mit der heterodimeren BMP-Zusammensetzung verabreicht werden. Für die Knochen- und/oder Knorpelbildung würde die Zusammensetzung vorzugsweise eine Matrix umfassen, die in der Lage ist, die heterodimeres Protein enthaltende Zusammensetzung an die Stelle des Knochen- und/oder Knorpelschadens zu verabreichen und eine Struktur für sich entwickelnden Knochen oder Knorpel bereitstellt und optimal in der Lage ist, vom Körper resorbiert zu werden. Solche Matrices können aus Materialien gebildet werden, die gegenwärtig für andere Anwendungen bei der Implantationsmedizin in Verwendung sind.
Die Auswahl des Matrixmaterials basiert auf der biologischen Verträglichkeit, der biologischen Abbaubarkeit, den mechanischen Eigenschaften, dem kosmetischen Aussehen und den Wechselwirkungseigenschaften. Die spezielle Anwendung der heterodimeren BMP-Zusammensetzung wird die geeignete Formulierung definieren. Potentielle Matrices für die Zusammensetzungen können biologisch abbaubares und chemisch definiertes Calciumsulfat sein, Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit, Polymilchsäure, Polyglycolsäure und Polyanhydride. Andere potentielle Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch gut definiert, wie Knochen- oder Hautkollagen. Weitere Matrices bestehen aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrixkomponenten. Andere potentielle Matrices sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert, wie gesinterter Hydroxylapatit, Bioglas, Aluminate oder andere keramische Materialien. Matrices können aus Kombinationen aller vorstehend erwähnten Arten an Materialien zusammengesetzt sein, wie Polymilchsäure und Hydroxylapatit oder Kollagen und Tricalciumphosphat. Die biokeramischen Materialien können bei der Zusammensetzung verändert sein, wie Calcium-Aluminium-Phosphat, und bei der Verarbeitung, um die Porengröße, die Teilchengröße, die Teilchenform und die biologische Abbaubarkeit zu verändern.
Gegenwärtig bevorzugt ist ein 50:50 (Molgewicht) Copolymer von Milchsäure und Glycolsäure in der Form von porösen Teilchen, die Durchmesser haben, die von 150 bis 800 Mikron reichen. Bei einigen Anwendungen wird es von Nutzen sein, ein sequestrierendes Mittel zu verwenden, wie Carboxymethylcellulose oder autologe Blutklumpen, um zu verhindern, dass die BMP-Zusammensetzungen von der Matrix disassoziieren.
Das Dosierungsschema einer heterodimeres Protein enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung wird durch den behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren bestimmt, die die Wirkung der heterodimeren Proteine modifizieren, z. B. der Menge an Knochengewicht, das sich wünschenswerierweise bilden soll, der Stelle des Knochenschadens, dem Zustand des beschädigten Knochens, der Größe der Wunde, der Art des Gewebeschadens, dem Alter, dem Geschlecht und der Ernährung des Patienten, der Schwere einer Infektion, dem Zeitpunkt der Verabreichung und anderer klinischer Faktoren. Die Dosierung kann mit der Art der bei der Wiederherstellung verwendeten Matrix und der BMP-Proteine in dem Heterodimer und jedem anderen BMP- oder anderen Proteinen in der pharmazeutischen Zusammensetzung variieren. Zum Beispiel kann auch die Zugabe anderer bekannter Wachstumsfaktoren wie IGF I (Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I) zu der endgültigen Zusammensetzung die Dosierung beeinflussen. Der Fortschritt kann durch eine periodische Bewertung des Knochenwachstums und/oder der -reparatur beobachtet werden, zum Beispiel Röntgenaufnahme, histomorphometrische Bestimmung und Tetracyclinmarkierung.
Die folgenden Beispiele sind illustrativ für die vorliegende Erfindung und beschränken ihren Umfang nicht. Sie umfassen BMP-Monomere und -Heterodimere, die nicht im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind, die jedoch zum Zwecke der Illustration und der Nacharbeitbarkeit enthalten sind.
BEISPIEL 1 – BMP-Vektor-Konstrukte und Zelllinien
A. BMP-2-Vektoren
Der Säugerexpressionsvektor pMT2 CXM ist ein Derivat von p91023 (b) [Wong et al., Science, 228:810-815 (1985)], und unterscheidet sich von letzterem dadurch, dass es das Ampicillin-Resistenzgen (Amp) anstelle des Tetracyclin-Resistenzgens (Tet) enthält und außerdem eine XhoI-Stelle für die Inserierung von cDNA-Clonen enthält. Die funktionellen Elemente von pMT2 CXM sind beschrieben worden [R. J. Kaufmann, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:689-693 (1985)] und umfassen die VA-Gene des Adenovirus, den SV40- Replikationsursprung einschließlich des Enhancers von 72 bp, den späten Hauptpromotor des Adenovirus einschließlich einer 5'-Splice-Stelle und den Hauptteil der Tripartit-Leadersequenz des Adenovirus, die auf den späten mRNAs des Adenovirus vorhanden ist, eine 3'-Splice-Akzeptor-Stelle, eine DHFR-Insertion, die frühe Polyadenylierungsstelle von SV40 (SV40) und pBR322-Sequenzen, die für die Vermehrung in E. coli erforderlich sind.
Der Verdau von pMT2-VWF, das bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) unter der Zugangsnummer ATCC 67122 hinterlegt wurde, mit EcoRI schneidet die in pMT2-VWF vorhandene cDNA aus, was pMT2 in linearer Form ergibt. Das Plasmid pMT2 kann ligiert und verwendet werden, um E. coli HB 101 oder DH-5 zu Ampicillin-Resistenz zu transformieren. Die pMT2 Plasmid-DNA kann mittels herkömmlicher Verfahren präpariert werden, Das Plasmid pMT2 CXM wird dann unter Verwendung der Loopout/in-Mutagenese [Morinaga et al., Biotechnology, 84:636 (1984)] konstruiert werden. Dies entfernt die Basen 1075 bis 1145 relativ zu der HindIII-Stelle in der Nähe des SV40-Replikationsursprung und der Enhancersequenzen von pMT2. Außerdem inseriert dies die folgende Sequenz:
bei Nucleotid 1145. Diese Sequenz enthält die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease XhoI.
Ein Derivat von pMT2 CXM, genannt Plasmid pMT23, enthält Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen PstI, EcoRI, SalI und XhoI.
BMP-2-cDNA voller Länge (1) (SEQ ID NR: 1) wird durch Verdau mit EcoRI von dem Vektor λGT10 freigesetzt und in pSP65 [Promega Biotec, Madison, Wisconsin; vgl. z. B. Melton et al., Nucl. Acids Res., 12:7035-7056 (1984)] in beiden Orientierungen subcloniert, was pBMP-2 #39-3 oder pBMP-2 #39-4 ergibt.
Die Mehrzahl der nicht translatierten Regionen der BMP-2-cDNA werden auf die folgende Weise entfernt. Die 5'-Sequenzen werden zwischen der SalI-Stelle in dem Adapter (anwesend von der ursprünglichen cDNA-Clonierung) und der SalI-Stelle 7 Basen stromaufwärts des Initiations-ATG durch Verdau des Plasmids pSP65, das die BMP-2-cDNA enthält, mit SalI und Religierung entfernt. Die 3' nicht translatierte Region wird unter Verwendung der Heteroduplex-Mutagenese unter Verwendung des Oligonucleotids
entfernt. Die Sequenz enthält die terminale 3' codierende Region der BMP-2-cDNA, unmittelbar gefolgt von der Erkennungsstelle für SalI. Die Sequenz führt eine dem Terminationscodon (TAG) folgende SalI-Stelle ein.
Das SalI-Fragment dieses Clons wurde in den Expressionsvektor pMT23 subcloniert, was den Vektor pMT23-BMP2ΔUT ergab. Restriktionsenzymstellen flankieren die BMP-2 codierende Region in der Sequenz PstI-EcoRI-SalI-BMP-2-cDNA-SalI-EcoRI-XhoI.
Das Expressionsplasmid pED4 [Kaufman et al., Nucl. Acids Res., 19:4485-4490 (1991)] wurde durch Verdau mit EcoRI linearisiert und mit Phosphatase aus dem Kalbsdarm behandelt. Das BMP-2-cDNA-Gen wurde durch Verdau mit EcoRI aus pMT23-BMP2ΔUT ausgeschnitten und das Fragment von 1,2 kb durch Elektrophorese durch ein 1%-iges Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gewonnen. Der linearisierte pED4-Vektor und das EcoRI-Fragment von BMP-2 wurden ligiert, was das BMP-2-Expressionsplamid pBMT2Δ-EMC ergab.
Ein anderer Vektor pBMP-2Δ-EN enthält dieselben Sequenzen, die im Vektor pBMT2Δ-EMC enthalten sind, außer dass das DHFR-Gen mittels herkömmlicher Mittel durch das Neomycin-Resistenzgen von dem transposablen Element Tn5 ersetzt wurde.
B. BMP-4-Vektoren
Eine BMP-4-cDNA-Sequenz, die in 2 (SEQ ID NR: 3) dargestellt ist, bei der die 3' nicht translatierte Region entfernt ist, wird mittels Heteroduplex-Mutagenese unter Verwendung des mutagenen Oligonucleotids:
hergestellt. Dies deletiert alle Sequenzen 3' vom Translationsterminatorcodon der BMP-4-cDNA und stellt dieses Terminatorcodon und die Polylinkersequenzen des Vektors nebeneinander. Dieser Schritt wird in einem SP65-Vektor [Promega Biotech] durchgeführt und kann auch einfach in pMT2-Derivaten durchgeführt werden, die die BMP-4-cDNA enthalten, ähnlich den vorstehend beschriebenen BMP-2-Vektoren. Die 5' nicht translatierte Region wird unter Verwendung der Restriktionsendonuclease BsmI entfernt, die innerhalb des achten Codons der BMP-4-cDNA spaltet.
Die Rekonstruktion der ersten acht Codons wird durch Ligierung mit den Oligonucleotiden
erreicht. Diese Oligonucleotide bilden einen Duplex, der ein BsmI komplementäres kohäsives Ende hat, das in der Lage ist, mit der mit BsmI geschnittenen BMP-4-cDNA zu ligieren, und er hat ein EcoRI komplementäres kohäsives Ende hat, das in der Lage ist, mit dem mit EcoRI geschnittenen Vektor pMT2 zu ligieren. Somit wird die cDNA für BMP-4 mit den 5' und 3' nicht translatierten Regionen deletiert und die gesamte codierende Sequenz wird erhalten und ist innerhalb eines EcoRI-Restriktionsfragments von etwa 1,2 kb enthalten.
Das pMT2 CXM-Plasmid, das diese BMP-4-Sequenz enthält, wird als pXMBMP-4ΔUT bezeichnet. Es wird mit EcoRI verdaut, um die die BMP-4-cDNA enthaltende Inseriion von dem Vektor freizusetzen. Diese Inseriion wird in die EcoRI-Stelle des Säugerexpressionsvektors pED4 subcloniert, was in pBMP4Δ-EMC resultiert.
C. BMP-5-Vektoren
Eine BMP-5-cDNA-Sequenz, die die Nucleotidsequenz von Nucleotid #699 bis #2070 von 5 (SEQ ID NR: 9) enthält, wird wie folgt spezifisch amplifiziert. Die Oligonucleotide CGACCTGCAGCCACCATGCATCTGACTGTA (SEQ ID NR: 20) und TGCCTGCAGTTTAATATTAGTGGCAGC (SEQ ID NR: 21) werden als Primer verwendet, um die Amplifikation der Nucleotidsequenz #699 bis #2070 von 5 von der BMP-5-Insertion des λ-ZAP-Clons U2-16 (ATCC #68109) zu erlauben. Dieser Vorgang führt die Nucleotidsequenz CGACCTGCAGCCACC (SEQ ID NR: 22) unmittelbar vor Nucleotid #699 und die Nucleotidsequenz CTGCAGGCA unmittelbar nach Nucleotid #2070 ein. Das Hinzufügen dieser Sequenzen resultiert in der Schaffung von PstI-Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen an beiden Enden des amplifizierten DNA-Fragments. Das resultierende amplifizierte DNA-Produkt dieses Verfahrens wird mit der Restriktionsendonuclease PstI verdaut und in die PstI-Stelle des pMT2-Derivats pMT21 subcloniert [Kaufman, Nucl. Acids Res., 19:4485-4490 (1991)]. Der resultierende Clon wird als H5/5/pMT bezeichnet.
Die Inseriion in H5/5/pMT wird durch Verdau mit PstI ausgeschnitten und an der PstI-Stelle in den Plasmidvektor pSP65 [Promega Biotech] an der PstI-Stelle subcloniert, was in dem Plasmid BMP5/SP6 resultiert. BMP5/SP6 und U2-16 werden mit den Restriktionsendonucleasen NsiI und NdeI verdaut, um den Teil ihrer Insertionen auszuschneiden, der den Nucleotiden #704 bis #1876 von 5 entspricht. Das resultierende NsiI-NdeI-Fragment von 1173 Nucleotiden von Clon U2-16 wird in die NsiI-NdeI-Stelle von BMP5/SP6 ligiert, aus dem das entsprechende NsiI-NdeI-Fragment von 1173 Nucleotiden entfernt worden war. Der resultierende Clon wird als BMP5mix/SP65 bezeichnet.
Von BMP5mix/SP65 wird eine direkte DNA-Sequenzanalyse durchgeführt, um die Identität der durch Amplifikation produzierten Nucleotidsequenzen mit den in 5 dargestellten zu bestätigen. Der Clon BMP5mix/SP65 wird mit der Restriktionsendonuclease PstI verdaut, was in dem Ausschneiden einer Insertion resultiert, die die Nucleotide #699 bis #2070 von 5 und die zusätzliche Sequenzen umfaßt, die die PstI-Erkennungsstellen enthalten, wie vorstehend beschrieben. Das resultierende PstI-Fragment von 1382 Nucleotiden wird in die PstI-Stelle des pMT2-Derivats pMT21 subcloniert. Dieser Clon wird als BMP5mix/pMT21#2 bezeichnet.
Dasselbe Fragment wird auch in die PstI-Stelle von pED4 subcloniert, was den Vektor ergibt, der als BMP5mix-EMC-11 bezeichnet wird.
D. BMP-6-Vektoren
Eine BMP-6-cDNA-Sequenz, die die Nucleotidsequenz von Nucleotid #160 bis 1706 von 4 (SEQ ID NR: 7) wird durch eine Reihe von Techniken produziert, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind. Der Clon BMP6C35 (ATCC 68245) wird mit den Restriktionsendonucleasen ApaI und TagI verdaut, was in der Ausschneidung einer Portion von 1476 Nucleotiden der Insertion resultiert, die die Nucleotide #231 bis #1703 von 4 umfaßt. Synthetische Oligonucleotide mit Konvertierern der Restriktionsendonucleasestelle SalI werden geplant, um diejenigen Nucleotide zu ersetzen, die #160 bis #230 und #1704 bis #1706 entsprechen, die nicht in dem 1476 ApaI-TagI-Fragment der BMP-6-cDNA-Sequenz enthalten sind.
Sequenzen zu ersetzen, werden unabhängig mit jedem anderen verknüpft. Die verknüpften 5' und 3'-Konvertierer werden dann mit dem vorstehend beschriebenen ApaI-TagI von 1476 Nucleotiden ligiert, was ein Fragment von 1563 Nucleotiden schafft, welches die Nucleotidsequenz von #160 bis #1706 von 4 und die zusätzlichen Sequenzen umfaßt, die geplant wurden, um SalI-Restriktionsendonucleasestellen an beiden Enden zu erzeugen. Das resultierende Fragment von 1563 Nucleotiden wird in die SalI-Stelle von pSP64 [Promega Biotech, Madison, WI] subcloniert. Der Clon wird als BMP6/SP64#15 bezeichnet.
Von BMP6/SP64#15 wird eine direkte DNA-Sequenzanalyse durchgeführt, um die Identität der 5'- und 3'-Sequenzen, die durch die Konvertierer ersetzt wurden, mit der in 4 dargestellten Sequenz zu bestätigen. Die Insertion von BMP6/SP64#15 wird durch Verdau mit der Restriktionsendonuclease SalI ausgeschnitten. Das resultierende SalI-Fragment von 1563 Nucleotiden wird in die XhoI-Restriktionsendonucleasestelle von pMT21 subcloniert und hier als BMP6/pMT21 bezeichnet.
Die PstI-Stelle von pED4 wird durch Verdau des Plasmids mit PstI und Ligierung mit den Konverter-Oligonucleotiden:
in eine SalI-Stelle umgewandelt. Das vorstehende SalI-Fragment von 1563 Nucleotiden wird auch in die SAlI-Stelle dieses pED4-Vektors subcloniert, was den Expressionsvektor BMP6/EMC ergibt.
E. BMP-7-Vektoren
Eine BMP-7-Sequenz, die die Nucleotidsequenz von Nucleotid #97 bis #1402 von 3 (SEQ ID NR: 5) umfaßt, wird wie folgt spezifisch amplifiziert. Die Oligonucleotide CAGGTCGACCCACCATGCACGTGCGCTCA (SEQ ID NR: 29) und TCTGTCGACCTCGGAGGAGCTAGTGGC (SEQ ID NR: 30) werden als Primer verwendet, um die Amplifikation der Nucleotidsequenz #97 bis #1402 von 3 von der Insertion von Clon PEH-7 [ATCC #68182] zu erlauben. Dieser Vorgang erzeugt die Inserierung der Nucleotidsequenz CAGGTCGACCCACC unmittelbar vor Nucleotid #97 und die Inserierung der Nucleotidsequenz GTCGACAGA unmittelbar nach Nucleotid #1402 ein. Das Hinzufügen dieser Sequenzen resultiert in der Schaffung einer SAlI-Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen an jedem Ende des amplifizierten DNA-Fragments. Das aus diesem Verfahren resultierende amplifizierten DNA-Produkt wird mit der Restriktionsendonuclease SAlI verdaut und in die SAlI-Stelle des Plasmidvektors pSP64 [Promega Biotech, Madison, WI] subcloniert, was in BMP7/SP6#2 resultiert.
Die Clone BMP7/SP6#2 und PEH7-9 werden mit den Restriktionsendonucleasen NcoI und StuI verdaut, um die Portion ihrer Insertionen auszuschneiden, die den Nucleotiden #363 bis #1081 von 3 entsprechen. Das resultierende NcoI-StuI-Fragment von 719 Nucleotiden von Clon PEH7-9 wird in die NcoI-StuI-Stelle von BMP7/SP6#2 ligiert, aus dem das entsprechende Fragment von 719 Nucleotiden entfernt worden war. Der resultierende Clon wird als BMP7mix/SP6 bezeichnet.
Die direkte DNA-Sequenzanalyse von BMP7mix/SP6 bestätigte die Identität der 3'-Region mit der Nucleotidsequenz von #1082 bis #1402 von 3, die 5'-Region enthielt jedoch einen Nucleotid-Fehleinbau.
Die Amplifikation der Nucleotidsequenz (#97 bis #1402 von 3) unter Verwendung von PEH7-9 als Matrize wird wie vorstehend beschrieben wiederholt. Das von diesem Vorgang resultierende amplifizierte DNA-Fragment wird mit den Restriktionsendonucleasen SAlI und PstI verdaut. Dieser Verdau resultiert im Ausschneiden eines Fragments von 747 Nucleotiden, das die Fragmente #97 bis #833 von 3 enthält plus der zusätzlichen Sequenzen des 5' primenden Oligonucleotids, das verwendet wurde, um die vorstehend beschriebene SAlI-Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle zu schaffen. Dieses 747 SAlI-PstI-Fragment wird in einen mit SAlI-PstI verdauten pSP65 [Promega Biotech, Madison, WI]-Vektor subcloniert, was in 5 BMP7/SP65 resultiert. Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, dass die Insertion von 5 BMP7/SP65#1 eine Sequenz umfaßt, die zu Nucleotid #97 bis #362 von 3 identisch ist.
Die Clone BMP7mix/SP6 und 5 BMP7/SP65 werden mit den Restriktionsendonucleasen SAlI und NcoI verdaut. Das resultierende 3' NcoI-SAlI-Fragment von BMP7mix/SP6, das die Nucleotide #363 bis #1402 von 3 umfaßt, und das 5' SAlI-NcoI-Fragment von 5'BMP7/SP65, das die Nucleotide #97 bis #362 von 3 umfaßt, werden an den NcoI-Restriktionsstellen aneinanderligiert, um ein Fragment von 1317 Nucleotiden zu produzieren, das die Nucleotide #97 bis #1402 von 3 umfaßt plus die zusätzlichen Sequenzen, die von den 5'- und 3'-Oligonucleotidprimern abgeleitet sind, was die Schaffung von SAlI-Restriktionsstellen an beiden Seiten dieses Fragments erlaubt.
Dieses SAlI-Fragment von 1317 Nucleotiden wird in die SAlI-Stelle des pMT2-Derivats pMT2Cla-2 ligiert. pMT2Cla-2 wird durch Verdau von pMT21 mit EcoRV und XhoI, Behandlung der verdauten DNA mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I und Ligierung des ClaI-Linkers (NEBio Labs, CATCGATG) konstruiert. Dies entfernt die Basen 2171 bis 2420, startend von der HindIII-Stelle in der Nähe des SV40-Replikationsursprungs und die Enhancer-Sequenzen von pMT2 und führt eine einzelne ClaI-Stelle ein, läßt aber das VAI-Gen des Adenovirus intakt, was in pMT2Cla-2 resultiert. Dieser Clon wird als BMP-7-pMT2 bezeichnet.
Die Insertion von BMP-7-pMT2 wird durch Verdau mit der Restriktionsendonuclease SAlI ausgeschnitten. Das resultierende SAlI-Fragment von 1317 Nucleotiden wird in die XhoI-Restriktionsendonucleasestelle von pMT21 subcloniert, was den Clon BMP-7/pMT21 ergibt. Dieses SAlI-Fragment wird auch in die SAlI-Stelle des Vektors pED4 subcloniert, bei dem die PstI-Stelle wie vorstehend beschrieben in eine SAlI-Stelle umgewandelt worden war, was in dem Vektor pBMP7/EMC#4 resultierte.
F. BMP-8-Vektoren
Gegenwärtig wurden keine Säuger-BMP-8-Vektoren konstruiert. Unter Verwendung der Sequenz von 6 (SEQ ID NR: 11) ist jedoch anzunehmen, dass Vektoren, die den vorstehend für die anderen BMPs beschriebenen ähnlich sind, einfach konstruiert werden können. Ein bakterieller Expressionsvektor, ähnlich dem in Beispiel 7 im Detail beschriebenen BMP-2-Vektor, kann auch für BMP-8 durch Einfügen eines Met vor der Aminosäure #284 Ala von 6 konstruiert werden. Diese Sequenz von BMP-8 wird in den Vektor pALBP2-781 anstelle der BMP-2-Sequenz insertiert. Siehe Beispiel 7.
G. BMP-Vektoren, die den Adenosin-Desaminase (Ada)-Marker enthalten
BMP-Gene wurden in den Vektor pMT3SV2Ada [R. J. Kaufman, Meth. Enzym., 185:537-566 (1990)] insertiert, um Expressionsplasmide zu ergeben, die getrennte Transkriptionseinheiten für das BMP-cDNA-Gen und den selektierbaren Marker Ada enthalten. pMT3SV2Ada enthält einen Polylinker mit Erkennungsstellen für die Enzyme PstI, EcoRI, SAlI und XbaI, die für die Inserierung und Expression von Genen (z. B. BMP) in Säugerzellen verwendet werden können. Zusätzlich enthält der Vektor eine zweite Transkriptionseinheit, die Ada codiert, was als dominanter und amplifizierbarer Marker in Säugerzellen dient.
Um die Expressionsvektoren für BMP-5, BMP-6 und BMP-7 individuell zu konstruieren, wurde dasselbe generelle Verfahren verwendet. Das Gen für BMP-5 (5), 6 (4) oder 7 (3) wurde, wie im wesentlichen vorstehend für den pED4-Vektor beschrieben, in den Polylinker insertiert. Diese Vektoren können für die Transfektion in CHO DUKX-Zellen und anschließende Selektion und Amplifikation unter Verwendung des Ada- Markers verwendet werden, wie zuvor beschrieben [Kaufman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3136-3140 (1986)]. Da jeder solche Vektor kein DHFR-Gen enthält, bleiben die resultierenden transformierten DHFR-negativ und können anschließend mit einem zweiten Vektor transfiziert werden, der ein verschiedenes BMP in Verbindung mit DHFR enthält und mit Methotrexat amplifiziert werden.
Alternativ können die pMT3SV2Ada/BMP-Vektoren verwendet werden, um CHO-Zellen stabil zu transfizieren, die zuvor mit einem verschiedenen BMP-Gen transfiziert wurden, und unter Verwendung des DHFR/Methotrexat-Systems amplifiziert werden. Die resultierenden Transfektanten können anschließend unter Verwendung des Ada-Systems amplifiziert werden, was zu Zelllinien führt, die zwei verschiedene BMP-Gene coexprimieren, und sie werden unter Verwendung sowohl der DHFR- wie der Ada-Marker amplifiziert.
H. BMP exprimierende Säugerzelllinien
Gegenwärtig sind die folgenden Zelllinien die wünschenswertesten zur Verwendung bei der Herstellung der rekombinanten Homodimeren und Heterodimeren der Erfindung. Diese Zelllinien wurden mittels herkömmlicher Transformation von CHO-Zellen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren hergestellt.
Die BMP-2 exprimierende Zelllinie 2EG5 ist eine mit dem Vektor pBMP2delta-EMC stabil transformierte CHO-Zelle.
Die BMP-4 exprimierende Zelllinie 4E9 ist eine mit dem Vektor pBMP4delta-EMCstabil transformierte CHO-Zelle.
Die BMP-5 exprimierende Zelllinie 5E10 ist eine mit dem Vektor BMP5mix-EMC-11 stabil transformierte CHO-Zelle (mit einem Amplifikationsniveau von 2 mikromolar MTX).
Die BMP-6 exprimierende Zelllinie 6HG8 ist eine mit dem Vektor BMP6/EMC stabil transformierte CHO-Zelle.
Die BMP-7 exprimierende Zelllinie 7MB9 ist eine mit dem Vektor BMP7/pMT21 stabil transformierte CHO-Zelle.
BEISPIEL 2 – TRANSIENTE EXPRESSION VON BMP-HETERODIMEREN
sDie Heterodimeren der vorliegenden Erfindung können durch Co-Expression in einem transienten Expressionssytem wie folgt mittels zwei verschiedener Techniken zur Durchmusterung in den Tests von Beispiel 8 hergestellt werden.
Beim ersten Verfahren wurden die von pMT2 abgeleiteten und von EMC abgeleiteten Expressionsplasmide, die in Beispiel 1 beschrieben werden, und andere, auf ähnliche Weise abgeleitete Vektoren konstruiert, die jeweils BMP-2 bis BMP-7 und transformierenden Wachstumsfaktor Beta (TGFβ1) codierten. Alle Kombinationen an Paaren an Plasmiden wurde zu gleichen Teilen gemischt und verwendet, unter Verwendung des DEAE-Dextran-Verfahrens [Sompayrac und Danna, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7575-7578 (1981); Luthman und Magnusson, Nucl. Acids Res., 11:1295-1308 (1983)] CHO-Zellen zu co-transfizieren. Die Zellen werden in alpha Minimalem Essentiellem Medium (αMEM) gezüchtet, das mit 10% fötalem Kälberserum, Adenosin, Desoxyadenosin, Thymidin (jeweils 100 μg/ml) Pen/Strep und Glutamin (1 mM) ergänzt war.
Die Zugabe von Substanzen wie Heparin, Suramin und Dextransulfat sind in dem Wachstumsmedium erwünscht, um die Mengen an BMP-2 zu steigern, die in dem konditionierten Medium der CHO-Zellen anwesend sind. Ähnlich reagiert BMP-5 auf solche Substanzen. Es wird daher erwartet, dass diese Substanzen zum Wachstumsmedium für jedes Heterodimer zugegeben werden, das diese BMP-Komponenten enthält. Andere BMPs können auch auf die Wirkungen dieser Substanzen reagieren, von denen man annimmt, dass sie die Wechselwirkung der reifen BMP-Moleküle mit der Zelloberfläche inhibieren.
Am folgenden Tag wurde frisches Wachstumsmedium, mit oder ohne 100 μg/ml Heparin, zugegeben. Vierundzwanzig Stunden später wurde das konditionierte Medium geerntet.
Bei einigen Experimenten wurde das konditionierte Medium ohne Heparin für den Zeitraum 24–48 Stunden nach der Transfektion gesammelt, und dieselben Platten wurden dann verwendet, um konditioniertes Medium in der Gegenwart von Heparin 48–72 Stunden nach der Transfektion zu erzeugen. Die Kontrollen umfaßten die Transfektion von Zellen mit Expressionsplasmiden, denen jegliche BMP-Sequenzen fehlten, die Transfektion von Zellen mit Plasmiden, die nur Sequenzen für ein einziges BMP enthielten, oder das Mischen von konditioniertem Medium von Zellen, die mit einem einzigen BMP transfiziert waren mit konditioniertem Medium von Zellen, die mit einem anderen BMP transfiziert waren.
Die Charakterisierung der co-exprimierten, heterodimeren BMPs in rohen konditionierten Medien, das ansonsten nicht gereinigt war, ergab die folgenden Ergebnisse. Transient co-exprimiertes BMP wurde auf die Induktion der Aktivität der alkalischen Phosphatase bei W20-Stromazellen getestet, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Die Co-Expression von BMP-2 mit BMP-5, BMP-6 und BMP-7, und BMP-4 mit BMP-5, BMP-6 und BMP-7 ergab mehr Aktivität der Induktion der alkalischen Phosphatase in dem W20-Test als sowohl die einzelnen BMP-Homodimeren allein oder Gemische von Homodimeren, wie nachstehend gezeigt wird. Die maximale Aktivität in vitro wurde erhalten, wenn BMP-2 mit BMP-7 co-exprimiert wurde. Eine erhöhte Aktivität wurde auch für die Heterodimeren BMP-2/5; BMP-2/6; BMP-4/5; BMP-4/6; und BMP-4/7 gefunden.
Konditioniertes Medium
Konditioniertes Medium + Heparin

Einheiten: 1 Einheit an Aktivität ist äquivalent der von 1 ng/ml von rhBMP-2.
-: zeigt Aktivität unterhalb der Nachweisgrenze des Tests

Diese BMP-Kombinationen wurden anschließend unter Verwendung verschiedener Verhältnisse an Expressionsplasmiden (9:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:9) während der transienten Transfektion von CHO-Zellen exprimiert. Die Durchführung dieses Verfahrens unter Verwendung der Plasmide, die BMP-2 enthielten, und der Plasmide, die BMP-7 enthielten, mit Plasmidzahlenverhältnissen, die von 9:1 bis 1:9 reichten, zeigte, dass die höchste Aktivität in dem W20-Test dann erhalten wurde, wenn etwa die gleiche Zahl an Plasmiden von jedem BMP in die Wirtszelle transfiziert wurde. Verhältnisse an BMP-2- zu BMP-7-Plasmiden von 3:1 bzw. 1:3 resultierten ebenfalls in einer erhöhten Aktivität in dem W20-Test im Vergleich mit Wirtszellen, die mit Plasmiden transfiziert waren, die nur ein einziges BMP enthielten. Diese letzteren Verhältnisse erzeugten jedoch weniger Aktivität als das 1:1 Verhältnis.
Ähnliche Verhältnisse können vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet für Heterodimere bestimmt werden, die aus anderen als BMP-2 und BMP-7 bestehen. Zum Beispiel haben vorläufige Arbeiten mit dem Heterodimer, das sich zwischen BMP-2 und BMP-6 bildet, gezeigt, dass ein bevorzugtes Plasmidverhältnis für die Co-Transfektion 3:1 ist. Die Bestimmung von bevorzugten Verhältnissen für dieses Verfahren ist Stand der Technik.
Als ein alternativer Weg zur transienten Erzeugung co-exprimierter BMPs werden die stabilen CHO-Zelllinien, die in Beispiel 1 identifiziert wurden und die jeweils BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7 exprimieren, für einen Tag co-kultiviert und werden dann mit 56,7% Polyethylenglycol (PEG) fusioniert. Einen Tag nach der Fusionierung wird frisches Medium zugegeben und die Heterodimeren werden 24 Stunden später für den W20-Test geerntet, der in Beispiel 8 beschrieben wird. Die Testergebnisse waren im wesentlichen ähnlich zu den unmittelbar vorstehend beschriebenen.
Daher ergaben alle Kombinationen von BMP-2 oder 4, die entweder mit BMP-5, 6 oder 7 co-exprimiert wurden, höhere Aktivität als jedes der BMP-Homodimeren allein. In Kontrollexperimenten, in denen jedes BMP-Homodimer allein exprimiert wurde und die konditionierten Medien nach der Ernte gemischt wurden, war die Aktivität immer in der Mitte zwischen den einzelnen BMPs, was anzeigt, dass die co-exprimierten BMP-Heterodimeren eine höhere Aktivität ergaben als Kombinationen der einzeln exprimierten BMP-Homodimeren.
BEISPIEL 3 – STABILE EXPRESSION VON BMP-HETERODIMEREN
A. BMP2/7
Basierend auf den Resultaten der transienten Tests in Beispiel 2 wurden stabile Zelllinien gemacht, die BMP-2 und BMP-7 co-exprimieren.
Eine bevorzugte stabile Zelllinie, 2E7E-10, wurde wie folgt erhalten: Plasmid-DNA (ein 1:1-Gemisch von pBMP-7-EMC und pBMP-2-EMC, beschrieben in Beispiel 1) wird mittels Elektroporation [Neuman et al., EMBO J., 1:841-845) (1982)] in CHO-Zellen transfiziert.
Zwei Tage später werden die Zellen zu dem selektiven Medium gewechselt, das 10% dialysiertes fötales Kälberserum enthält und dem Nucleoside fehlen. Kolonien, die DHFR exprimieren, werden 10–14 Tage später gezählt. Einzelne Kolonien oder Pools von Kolonien werden expandiert und unter Verwendung von Standardverfahren auf die Expression von RNA und Protein von jeder heterodimeren BMP-Komponente analysiert und anschließend durch Wachstum in wachsenden Konzentrationen von MTX auf Amplifikation selektiert. Die stufenweise Selektion des bevorzugten Clons, als 2E7E bezeichnet, wird bei einer Konzentration von bis zu 0,5 μM MTX durchgeführt. Die Zelllinie wird dann subcloniert und auf die Expression des Heterodimeren 2/7 getestet.
Die Verfahren für einen solchen Test umfassen die Western Blot-Analyse, um die Anwesenheit der DNA der Komponente nachzuweisen, die Protein-Analyse und die SDS-PAGE-Analyse von metabolisch markiertem Protein, den W20-Test und die Analyse auf Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität unter Verwendung des ectopischen Rattenknochenbildungstests von Beispiel 9. Die gegenwäriig bevorzugte, clonal abgeleitete Zelllinie wird als 2E7E-10 identifiziert. Diese Zelllinie sezerniert heterodimere BMP-2/7-Proteine in Medien, die 0,5 μM MTX enthalten.
Die CHO-Zelllinie 2E7E-10 wird in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM)/Ham's Nährstoffgemisch F-12, 1:1 (Vol./Vol.) gezüchtet, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum. Wenn die Zellen zu 80 bis 100% konfluent sind, wird das Medium durch serumfreies DMEM/F-12 ersetzt. Das Medium wird 4 Tage lang alle 24 Stunden geerntet. Für die ProteinHerstellung und -reinigung werden die Zellen serumfrei gezüchtet.
Während die co-exprimierende Zelllinie 2E7E-10 vorläufig niedrigere Mengen an BMP-Protein zu machen scheint als die BMP-2 exprimierende Zelllinie 2EG5, die in Beispiel 2 beschrieben ist, legen vorläufige Ergebnisse nahe, dass die spezifische Aktivität des mutmaßlichen Heterodimeren mindestens 5-fach höher ist als die des BMP-2-Homodimeren (vgl. Beispiel 6).
Um eine andere, Heterodimer produzierende Zelllinie zu konstruieren, wird die stabile CHO-Zelllinie 7MB9, die zuvor mit pBMP-7-pMT2 transfiziert worden war und die BMP-7 exprimiert, verwendet. 7MB9 kann amplifiziert werden und unter Verwendung des DHFR/MTX-Systems auf Resistenz gegen 2 μm Methotrexat selektiert werden. Um eine stabile, co-exprimierende Zelllinie zu schaffen, wird die Zelllinie 7MB9 mit dem Expressionsvektor pBMP-2Δ-EN (EMC-Neo) transfiziert, der BMP-2 und das Neomycin-Resistenzgen von dem Tn5 transposablen Element enthält. Die resultierende transfizierte stabile Zelllinie wurde auf Resistenz gegen G-418 und MTX selektiert. Einzelne Clone wurden entnommen und auf BMP-Expression analysiert, wie vorstehend beschrieben.
Es ist anzunehmen, dass stabile Zelllinien, die andere Kombinationen von BMPs co-exprimieren, die bei der transienten Co-Expression eine erhöhte Aktivität zeigen, bei stabiler Expression in ähnlicher Weise eine höhere Aktivität ergeben werden.
B. BMP-2/6
Basierend auf den Resultaten der transienten Tests in Beispiel 2 wurden stabile Zelllinien gemacht, die BMP-2 und BMP-6 co-exprimieren.
Eine bevorzugte stabile Zelllinie, 12C07, wurde wie folgt erhalten: Plasmid-DNA (ein 1:3 Gemisch von pMBP-6-EMC und pMBP-2-EMC), in Beispiel 1 beschrieben) wird mittels Elektroporation [Neuman et al., EMBO J., 1:841-845) (1982)] in CHO-Zellen transfiziert.
Zwei Tage später werden die Zellen zu dem selektiven Medium gewechselt, das 10% dialysiertes fötales Kälberserum enthält und dem Nucleoside fehlen. Kolonien, die DHFR exprimieren, werden 10–14 Tage später gezählt. Einzelne Kolonien oder Pools von Kolonien werden expandiert und unter Verwendung von Standardverfahren auf die Expression von RNA und Protein von jeder heterodimeren BMP-Komponente analysiert und anschließend durch Wachstum in wachsenden Konzentrationen von MTX auf Amplifikation selektiert. Die stufenweise Selektion des bevorzugten Clons, als 12-C bezeichnet, wird bei einer Konzentration von bis zu 2,0 μM MTX durchgeführt. Die Zelllinie wird dann subcloniert und auf die Expression des Heterodimeren 2/6 getestet.
Die Verfahren für einen solchen Test umfassen die Western Blot-Analyse, um die Anwesenheit der DNA der Komponente nachzuweisen, die Protein-Analyse und die SDS-PAGE-Analyse von metabolisch markiertem Protein, den W20-Test und die Analyse auf Knorpel- und/oder Knochenbildungsaktivität unter Verwendung des ectopischen Rattenknochenbildungstests von Beispiel 9. Die gegenwärtig bevorzugte, clonal abgeleitete Zelllinie wird als 12C07 identifiziert. Diese Zelllinie sezerniert heterodimere BMP-2/6-Proteine in Medien, die 2,0 μM MTX enthalten.
Die CHO-Zelllinie 12C07 wird in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM)/Ham's Nährstoffgemisch F-12, 1:1 (Vol./Vol.) gezüchtet, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum. Wenn die Zellen zu 80 bis 100% konfluent sind, wird das Medium durch serumfreies DMEM/F-12 ersetzt. Das Medium wird 4 Tage lang alle 24 Stunden geerntet. Für die ProteinHerstellung und -reinigung werden die Zellen serumfrei gezüchtet.
Während die co-exprimierende Zelllinie 12C07 vorläufig niedrigere Mengen an BMP-Protein zu machen scheint als die BMP-2 exprimierende Zelllinie 2EG5, die in Beispiel 2 beschrieben ist, legen vorläufige Ergebnisse nahe, dass die spezifische Aktivität des mutmaßlichen Heterodimeren mindestens 3–5-fach höher ist als die des BMP-2-Homodimeren (vgl. Beispiel 6).
Um eine andere, Heterodimer produzierende Zelllinie zu konstruieren, wird die stabile CHO-Zelllinie 2EG5, die zuvor mit pBMP-2-EMC transfiziert worden war und die BMP-2 exprimiert, verwendet. 2EG5 kann amplifiziert werden und unter Verwendung des DHFR/MTX-Systems auf Resistenz gegen 2 μm Methotrexat selektiert werden. Um eine stabile, co-exprimierende Zelllinie zu schaffen, wird die Zelllinie 2EG5 mit dem Expressionsvektor pBMP-6-ada (ada-Desaminase) transfiziert, die BMP-6 und das ADA-Resistenzgen enthält. Die resultierende transfizierte stabile Zelllinie wurde auf Resistenz gegen DCF und MTX selektiert. Einzelne Clone wurden entnommen und auf BMP-Expression analysiert, wie vorstehend beschrieben.
Es ist anzunehmen, dass stabile Zelllinien, die andere Kombinationen von BMPs co-exprimieren, die bei der transienten Co-Expression eine erhöhte Aktivität zeigen, bei stabiler Expression in ähnlicher Weise eine höhere Aktivität ergeben werden.
BEISPIEL 4 – REINIGUNG VON BMP-2/7- UND BMP-2/6-HETERODIMER
Dasselbe Reinigungsverfahren wird für das BMP-2/6-Heterodimer und das BMP-2/7-Heterodimer verwendet. Konditionierte Medien von Kulturen der Zelllinie 2E7E-10 oder 12C07, die rekombinant hergestelltes BMP-Heterodimer 2/7V oder 2/6 enthielten, können entweder von adhärenten oder Suspensionskulturen gewonnen werden. Zur Erzeugung von co-exprimiertem BMP in kleinem oder mittlerem Maßstab wurden adhärente Kulturen in Rollerflaschen gesät und in alpha-Minimalem Eagles Medium [α-MEM, Gibco, Grand Island, NY], das 10% dialysiertes hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum [Hazleton, Denver, PA] enthielt, zur Influenz wachsen gelassen. Das Medium wird dann gewechselt zu serumfreiem, Albumin-freiem Medium mit wenig Protein, basierend auf einem 50:50 Gemisch von Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium und Hams F-12 Medium, gegebenenfalls ergänzt mit 100 Mikrogramm/ml Dextransulfat. Die tägliche Ernte von vier oder fünf Tagen wird vereint und verwendet, um das rekombinante Protein zu reinigen.
Konditioniertes Medium von Rollerflaschenkulturen, das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, wurde langsam bei Raumtemperatur aufgetaut und vereint. Der pH des vereinten Mediums wurde unter Verwendung von 1 M Tris, pH 8,0, auf pH 8,0 eingestellt. Eine Säule, die Matrex Cellufin Sulfat [Amicon] enthielt, wurde gefüllt und mit 50 mM Tris, pH 8,0, äquilibriert.
Nach erfolgter Beladung des Mediums wurde die Säule mit Puffer gewaschen, der 50 mM Tris, 0,4 M NaCl, pH 8,0, enthielt, bis die Absorption bei 280 nm die Grundlinie erreichte. Die Säule wurde dann mit 50 mM Tris, pH 8,0, gewaschen, um NaCl aus dem Puffer zu entfernen. Das Harz wurde dann mit 50 mM Tris, 0,2 M NaCl, 4 M Harnstoff, pH 8,0, gewaschen, bis ein Peak eluierte. Die Säule wurde dann mit 50 mM Tris, pH 8,0, gewaschen, um den Harnstoff zu entfernen.
Das gebundene BMP-2/7 oder BMP-2/6 wurde dann unter Verwendung von 50 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,5 M Arginin, pH 8,0, eluiert. Das Eluat wurde als ein einziger Pool gesammelt und kann ggf. vor der weiteren Reinigung gefroren aufbewahrt werden. Das Cellufin Sulfat-Eluat wurde mit 14 Volumen 6 M Harnstoff verdünnt und die Probe wurde auf pH 6,0 eingestellt. Eine Hydroxyapatit-Ultrogel [IBF]-Säule wurde gefüllt und mit 80 mM Kaliumphosphat, 6 M Harnstoff, pH 6,0, äquilibriert.
Nach vollständiger Beladung mit der Probe wurde die Säule mit 10 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer gewaschen. Die gebundenen BMP-2/7- oder BMP-2/6-Heterodimeren wurden mit 5 Säulenvolumen 100 mM Kaliumphosphat, 6 M Harnstoff, pH 7,4 eluiert. Dieses Eluat wurde direkt auf eine Vydac C₄ Umkehrphasen-HPLC-Säule geladen, die mit Wasser – 0,1% TFA äquilibriert war. BMP-2/7- oder BMP-2/6-Heterodimere wurden mit einem Gradienten von 30–50% Acetonitril in Wasser – 0,1% Trifluoressigsäure eluiert.
Die Fraktionen, die BMPs enthalten, werden mittels SDS-PAGE in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Reduktionsmittel identifiziert. Die Identität der BMPs hinsichtlich von Heterodimeren gegenüber Homodimeren wird mittels 2D-PAGE (+/– Reduktionsmittel) bestimmt. Fraktionen mit Heterodimeren gaben Banden, die sich auf zwei Flecken reduzierten. Banden von Fraktionen von Homodimeren reduzieren sich auf einen einzelnen Fleck für jede BMP-Art.
Die Untereinheiten des BMP-2/6-Heterodimeren wurden auf einem Protein-Sequenzer analysiert. Es sind BMP-2/6-Heterodimere der folgenden Arten anwesend: Eine BMP-6-Untereinheit beginnend mit Aminosäure #375 Ser-Ala-Ser-Ser in Assoziation mit der BMP-2-Untereinheit beginnend mit Aminosäure #283 Gin-Ala-Lys oder #249 Ser-Lev-His, obwohl auch andere weniger häufige Arten anwesend sein können.
Es ist anzunehmen, dass dieselben oder im wesentlichen ähnlichen Reinigungsverfahren für jedes rekombinante BMP- Heterodimer dieser Erfindung verwendet werden kann. Die Hydroxyapatit-Ultrogel-Säule kann überflüssig sein und das Reinigungsschema kann durch Laden des Cellufin Sulfat-Eluats direkt auf die C₄ Umkehrphasen-HPLC-Säule ohne Verwendung der früheren Säule für BMP-2/7 oder BMP-2/6 oder die anderen Heterodimeren dieser Erfindung modifiziert werden.
BEISPIEL 5 – PROTEINCHARAKTERISIERUNG
Das gesamte Protein, das von den co-exprimierenden Zelllinien sezerniert wurde, wurde nach Markierung mit ³⁵S-Methionin oder mittels Western Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die gegen beide BMPs des Heterodimeren, d.h. BMP-2 und BMP-7, erzeugt wurden, analysiert. Zusammen mit den alkalische Phophatase-Tests zeigen die Ergebnisse die Anwesenheit des Heterodimeren und die spezifische Aktivität an. Die folgenden spezifischen Details sind auf Ergebnisse gerichtet, die für die BMP-2/7- und BMP-2/6-Heterodimeren gewonnen wurden; bei der Anwendung ähnlicher Verfahren für die anderen hier beschriebenen Heterodimeren werden ähnliche Ergebnisse erwartet.
A. Markierung mit ³⁵S-Met
Zelllinien, die von der Co-Transfektion von BMP2Δ-EMC- und BMP7Δ-EMC-Expressionsvektoren abgeleitet abgeleitet waren, wurden 15 Minuten mit ³⁵S-Methionin markiert und 6 Stunden in serumfreiem Medium in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Heparin gezüchtet. Das sezernierte Gesamtprotein wurde unter reduzierenden Bedingungen Mittels PAGE und Fluorographie analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass mehrere Zelllinien BMP-2- und BMP-7-Protein sezernieren. Es gibt eine gute Korrelation zwischen der Höhe der Aktivität der alkalischen Phosphatase und der Menge an co-exprimiertem Protein.
Mehrere Zelllinien sezernieren weniger gesamt BMP-2 und -7 als die nur BMP-2 exprimierende Zelllinie 2EG5, die 10 μg/ml BMP-2 hergestellt. Die Zelllinie 2E7E-10 (bei einem Niveau von 0,5 mM MTX amplifiziert) sezerniert gleiche Mengen an BMP-2 und BMP-7 bei etwa gleichem Gesamtniveau an Expression wie die Zelllinie 2EG5. Die Zelllinie 2E7E-10 hergestellt das Äquivalent von 600 Mikrogramm/ml an BMP-2-Homodimer-Aktivität in einem Test.
Markiertes Gesamtprotein wurde ebenfalls auf einem zweidimensionalen, nicht reduzierenden/reduzierenden Gelsystem analysiert, um sicherzustellen, ob ein Heterodimer gemacht wurde. Vorläufige Ergebnisse zeigen die Anwesenheit eines einzigen Flecks in diesem Gelsystem, der weder in der Zelllinie mit nur BMP-2 noch mit nur BMP-7 gefunden wurde, was die Anwesenheit des 2/7-Heterodimeren nahelegt. Dasselbe Gel mit gereinigtem Material hergestellte dieselben Ergebnisse (d.h. zwei einzelne Flecken auf dem Gel), was die Anwesenheit des 2/7-Heterodimeren nahelegt. Das BMP-2-Homodimer hergestellte unterschiedliche Arten in diesem Gelsystem.
Im Gegensatz zu der Reinigung von rekombinantem BMP-2/7 werden BMP-2-Homodimere während der Herstellung von BMP-2/6 nicht nachgewiesen; es werden jedoch signifikante Mengen an BMP-6-Homodimeren gefunden. Zusätzlich wird eine signifikante Menge einer um –20 Aminosäuren N-terminal verkürzten Form von BMP-6 gefunden; dies konnte durch Verwendung eines Protease-Inhibitors während der Zellkultur eliminiert werden. Bei BMP-2/6 wurde gefunden, dass es zwei bis drei Fraktionen später von der C₄ RP-HPLC eluierte als BMP-2/7.
Die Aminosäuresequenzierung zeigt, dass die vorherrschende Art an BMP-2/7-Heterodimer eine reife BMP-2-Untereinheit [Aminosäure #283 (Gln) – #396 (Arg)] enthält und eine reife BMP-7-Untereinheit [#293 (Ser) – #431 (His)]. Das BMP-2/6-Heterodimer umfaßt die reife BMP-2-Untereinheit [#283 – #396] und die reife BMP-6-Untereinheit [#375 (Ser) – #513 (His)].
B. Immunpräzipitation gekoppelt mit der Western Blot-Analyse
Konditionierte Medien von einer nur BMP-2 (2EG5), nur BMP-7 (7MB9) oder der 3E7E-10 co-exprimierenden Zelllinie wurden einer Immunpräzipitation mit entweder einem BMP-2- oder BMP-7-Antikörper (beides herkömmlich in Kaninchen erzeugte polyclonale Antikörper) unterworfen, und dann auf Western Blots analysiert, wobei entweder mit einem anti-BMP-2- oder einem anti-BMP-7-Antikörper hybridisiert wurde. Das 2/7-Heterodimer fällt aus und reagiert in Western Blots sowohl mit BMP-2- als auch BMP-7-Antikörpern, während jedes BMP selbst nur mit seinem spezifischen Antikörper reagiert, aber nicht mit dem reziproken Antikörper.
Es wurde unter Verwendung dieser Strategie gezeigt, dass ein Protein in der co-exprimierenden Zelllinie, das mit dem anti-BMP-7-Antikörper W33 [Genetics Institute, Inc, Cambridge, Massachusetts] ausgefällt wurde und im Western Blot mit dem anti-BMP-2-Antikörper W12 oder W10 [Genetics Institute, Inc.] reagiert, in den nur BMP-2 oder nur -7 exprimierenden Zelllinien nicht anwesend ist. Diese Experiment zeigt an, dass diese Proteinart das heterodimere Protein ist. Umgekehrt ergibt die Ausfällung mit W12 und die Hybridisierung mit W33 ähnliche Ergebnisse.
BEISPIEL 6 – SPEZIFISCHE AKTIVITÄT VON HETERODIMEREN
A. in vitro-Tests
Die spezifische Aktivität des BMP-2/7- oder BMP-2/6-Heterodimeren und des BMP-2-Homodimeren, die von den stabilen Zelllinien 2E7E-10 und 2EG55, und 12C07 und 2EG5 in das Wachstumsmedium sezerniert wurden, wurde wie folgt abgeschätzt.
Die Menge an BMP-Protein in konditionierten Medium wurde entweder mit der Western Blot-Analyse oder durch Analyse von Protein von mit ³⁵S-Methionin markierten Zellen mittels PAGE oder Fluorographie gemessen. Die Menge an Aktivität, die von denselben Zelllinien hergestellt wurde, auf W20-Zellen unter Verwendung entweder des alkalischen Phosphatase-Test oder des Osteocalcin-Induktions-Tests wurde dann geschätzt. Die spezifische Aktivität des BMP wurde aus dem Verhältnis von Aktivität zu in das Wachstumsmedium sezerniertem Protein berechnet.
Bei einem Experiment sezernierten 2E7E-10 und 2EG5 ähnliche Mengen an Gesamt-BMP-Proteinen, wie bestimmt mittels PAGE und Fluorographie. 2E7E-10 hergestellte etwa 50-fach mehr alkalische Phosphatase induzierende Aktivität als 2EG5, was nahelegt, dass die spezifische Aktivität des Heterodimeren etwa 50-fach höher ist als die des Homodimeren.
In einem anderen Experiment war die Menge an BMP-2, die von 2EG5 sezerniert wurde, etwa 50% höher als das BMP-2/7, das von 2E7E-10 sezerniert wurde, 2E7E-10 hergestellte jedoch eine etwa 10-fach höhere, Osteocalcin induzierende Aktivität als 2EG5. Von mehreren verschiedenen Experimenten dieser Art wird die spezifische Aktivität des BMP-2/7-Heterodimeren auf etwa 5- bis 50-fach höher als die des BMP-2-Homodimeren geschätzt.
Die 8 und 9 vergleichen die Aktivität von BMP-2 und BMP-2/7 in dem W20 alkalische Phosphatase- und BPG (Gla-Protein des Knochens, Osteocalcin)-Test. BMP-2/7 hat eine stark erhöhte spezifische Aktivität im Vergleich mit BMP-2 (8). In 8 waren etwa 1,3 ng/ml BMP-2/7 ausreichend, um 50% der maximalen Antwort der alkalischen Phosphatase in W20-Zellen zu induzieren. Ein vergleichbarer Wert für BMP-2 ist schwer zu berechnen, da die Antwort der alkalischen Phosphatase das Maximum nicht erreichte, sondern es waren mehr als 30 ng/ml für eine halb-maximale Antwort erforderlich. Im W20-Test hat BMP-2/7 somit eine 20- bis 30-fach höhere spezifische Aktivität als BMP-2.
Wie man in 9 sieht, war BMP-2/7 in diesem Experiment auch für die BPG (Gla-Protein des Knochens, Osteocalcin)-Herstellung ein wirksamerer Stimulator als BMP-2. Vier Tage Behandlung von W-20-17-Zellen mit BMP-2/7 resultierte bei 62 ng/ml in einer maximalen BGP-Antwort und 11 ng/ml bewirken 50% der maximalen BGP-Antwort. Im Gegensatz war mit Dosen von bis zu 468 ng/ml an Protein eine maximale Stimulation der BPG-Synthese durch BMP-2 nicht zu sehen. Die minimale Dosis an BMP-2/7, die erforderlich war, um eine BGP-Antwort bei W-20-17-Zellen hervorzurufen, war 3,9 ng/ml, etwa 7-fach weniger als die 29 ng/ml, die bei BMP-2 erforderlich waren. Diese Resultate waren konsistent mit den Ergebnissen, die in dem alkalischen Phosphatase-Test für BMP-2 und BMP-2/7 erhalten worden waren.
Eine vorläufige Analyse zeigt, dass BMP-2/6 in vitro eine spezifische Aktivität hat, die der von BMP-2/7 ähnlich ist. Die Wirksamkeiten von BMP-2 und BMP-2/6 bei der Induktion der Herstellung von alkalischer Phosphatase in W20 wird verglichen, und wie in 12 gezeigt hat BMP-2/6 bei diesem Testsystem eine höhere spezifische Aktivität als BMP-2. Dieses Ergebnis ist in guter Übereinstimmung mit dem Ergebnis, das in dem in vivo-Test mit BMP-2 und BMP-2/6 erhalten wurde.
B. In Vivo-Test
(i) BMP-2/7
Gereinigtes BMP-2/7 und BMP-2 wurde in dem ectopischen Knochenbildungstest der Ratte getestet. Eine Reihe von verschiedenen Mengen an BMP-2/7 oder BMP-2 wurden dreifach in Ratten implantiert. Nach 5 und 10 Tagen wurden die Implantate entfernt und histologisch auf die Anwesenheit von Knochen und Knorpel untersucht. Die histologischen Befunde für die Mengen an neu gebildetem Knorpel und Knochen sind in Tabelle A zusammengefaßt.
Tabelle A
Die Menge an BMP-2/7, die erforderlich ist, um Knorpel und Knochen im ectopischen Knochenbildungstest der Ratte zu induzieren, ist niedriger als die an BMP-2. Histologisch ist das Aussehen von Knorpel und Knochen, induziert von BMP-2/7 und BMP-2, identisch.
(ii) BMP-2/6
Die in vivo-Aktivität von BMP-2/6 wurde mit der von BMP-2 durch zehn Tage Implantation verschiedener Mengen von jedem BMP im ectopischen Knochenbildungstest der Ratte verglichen. Die Resultate dieser Studie (Tabelle B, 13) zeigen, dass BMP-2/6, ähnlich wie BMP-2/7, eine gegenüber BMP-2 erhöhte in vivo-Aktivität hat. Die spezifischen Aktivitäten von BMP-2, BMP-6 und BMP-2/6 werden zehn Tage nach Implantation der Proteine in dem ectopischen Knochenbildungstest verglichen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle C und 14 gezeigt. BMP-2/6 ist ein wirksamerer Induzierer der Knochenbildung als BMP-2 oder BMP-6. Die Menge an Knochenbildung, die mit BMP-2/6 beobachtet wurde, war vergleichbar mit der, die mit äquivalenten Dosen an BMP-2/7 beobachtet wurde. Das Aussehen von BMP-2/6-Implantaten ist ganz ähnlich dem von Implantaten, die BMP-2 oder BMP-2/7 enthalten.
Tabelle B Histologische Befunde von Implantaten von BMP-2/6 und BMP-2 im ectopischen Test der Ratte (10 Tage-Implantate)
Tabelle C Histologische Befunde von Implantaten von BMP-2, BMP-6 und BMP-2/6 im ectopischen Test der Ratte (10 Tage-Implantate)
BEISPIEL 7 – EXPRESSION VON BMP-DIMER IN E. COLI
Ein biologisch aktives, homodimeres BMP-2 wurde unter Verwendung von Techniken, wie sie in der Europäischen Patentanmeldung 433,255 beschrieben sind, mit kleineren Modifikationen in E. coli exprimiert. Andere Verfahren, die in der vorstehend zitierten Europäischen Patentanmeldung offenbart sind, können auch verwendet werden, um die Heterodimeren der vorliegenden Erfindung in E. coli zu produzieren. Bei der Anwendung dieser Verfahren auf die Heterodimeren dieser Erfindung wird erwartet, dass in E. coli aktive heterodimere Proteine hergestellt werden.
A. BMP-2-Expressionsvektor
Ein Expressionsplasmid pALBP2-781 (7) (SEQ ID NR: 13) wurde konstruiert, das den reifen Teil des BMP-2 (SEQ ID NR: 14)-Gens enthielt und andere Sequenzen, die im Detail nachstehend beschrieben sind. Dieses Plasmid steuerte die Akkumulation von 5–10% des gesamten Zellproteins als BMP-2 in einem E. coli-Wirtsstamm, GI724, wie nachstehend beschrieben.
Das Plasmid pALBP2-781 enthält die folgenden prinzipiellen Eigenschaften. Die Nucleotide 1-2060 enthalten DNA-Sequenzen, die von dem Plasmid pUC-18 [Norrander et al., Gene, 26:101-106 (1983)] stammen, einschließlich Sequenzen, die das Gen für β-Lactamase enthalten, das auf E. coli-Stämme Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin überträgt, und einen von co1E1 abgeleiteten Replikationsursprung. Die Nucleotide 2061-2221 enthalten DNA-Sequenzen für den wichtigen linkswärts-Promotor (pL) des Bakteriophagen λ [Sanger et al., J. Mol. Biol., 162:729-773 (1982)], einschließlich von drei Operatorsequenzen O_L1, O_L2 und O_L3. Diese Operatoren sind die Bindungsstellen für das λc1 Repressorprotein, dessen intrazelluläre Niveaus die Menge an Transkriptionsinitiation von pL kontrollieren. Die Nucleotide 2222-2723 enthalten eine starke Ribosomenbindungssequenz, die von den Nucleotiden 35566 bis 35472 und 38137 bis 38361 vom Bakteriophagen lambda abgeleitet ist, wie von Sanger et sl., J. Mol. Biol., 162:729-773 (1982) beschrieben. Die Nucleotide 2724-3133 enthalten eine DNA-Sequenz, die das reife BMP-2-Protein codiert mit zusätzlich 62 Nucleotiden 3' nicht translatierter Sequenz.
Die Nucleotide 3134-3149 stellen eine "Linker"-DNA-Sequenz bereit, die Restriktionsendonucleasestellen bereitstellt. Die Nucleotide 3150-3218 stellen eine Transkriptionsterminationssequenz bereit, die auf der des aspA-Gens von E. coli [Takagi et. sl., Nucl. Acids Res., 13:2063-2074 (1985)] basieren. Die Nucleotide 3219-3623 sind DNA-Sequenzen, die von pUC-18 abgeleitet sind.
Wie nachstehend beschrieben kann pALBP2-781, wenn es unter den geeigneten Bedingungen in einem geeigneten E. coli-Wirtsstamm gezüchtet wird, die Herstellung von hohen Niveaus (etwa 10% des gesamten zellulären Proteins) an BMP-2-Protein steuern.
pALBP2-781 wurde mit dem Verfahren von Dagert und Ehrlich, Gene, 6:23 (1979) in den E. coli-Wirtsstamm GI724 (F, lacI^q, lacP^Lg, ampC::λcI⁺) transformiert. [Der nicht transformierte Wirtsstamm E. coli GI724 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland am 31. Januar 1991 under ATCC Nr. 55151 für Patentzwecke gemäß geltender Gesetze und Regulierungen hinterlegt]. Transformanten wurden auf 1,5%-igen Gew./Vol. Agarplatten selektiert, die IMC Medium enthielten, das aus M9 Medium [Miller, „Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)] zusammengesetzt ist, ergänzt mit 0,5% Gew./Vol. Glucose, 0,2% Gew./Vol. Casaminosäuren und 100 μg/ml Ampicillin.
GI724 enthält eine Kopie des Wildtyp-λcI-Repressorgens, das ampC-Lokus stabil in das Chromosom integriert ist, wo es unter die transkriptionelle Kontrolle von Promotor/Operatorsequenzen von Salmonella typhimurium trp gestellt wurde. In GI724 wird das λcI-Protein nur während der Züchtung in Tryptophan-freien Medien gemacht, so wie minimale Medien oder ein minimales Medium, ergänzt mit Casaminosäuren, wie IMC, vorstehend beschrieben. Die Zugabe von Tryptophan zu einer Kultur von GI724 wird den trp-Promotor unterdrücken und die Synthese von λcI ausschalten und damit nach und nach die Induktion der Transkription von pL-Promotoren verursachen, wenn sie in der Zelle anwesend sind.
Mit pALBP2-781 transformiertes GI724 wurde in IMC-Medium bei 37°C bis zu einer A₅₅₀ von 0,5 (Absorption bei 550 nm) gezüchtet. Tryptophan wurde mit einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben und die Kultur weitere 4 Stunden inkubiert. Während dieser Zeit akkumulierte das BMP-2-Protein zu etwa 10% des gesamten Zellproteins, alles in der Fraktion der "Einschlußkörper".
BMP-2 wird wie folgt als unlösliche, monomere Form gewonnen. Der Zellaufbruch und die Gewinnung wird bei 4°C durchgeführt. Etwa 9 g der nassen, fermentierten E. coli GI724/pALBP2-781-Zellen werden in 30 ml 0,1 M Tris/HCl, 10 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulphonylfluorid (PMSF), pH 8,3 (Aufbrechpuffer) suspendiert. Die Zellen werden viermal durch einen Zellaufbrecher gegeben und das Volumen wird mit dem Aufbrechpuffer auf 100 ml gebracht. Die Suspension wird 20 Min. zentrifuguiert (15.000 × g). Das erhaltene Pellet wird in 50 ml Aufbrechpuffer suspendiert, der 1 M NaCl enthält und wie vorstehend 10 Min. zentrifugiert. Das Pellet wird in 50 ml Aufbrechpuffer suspendiert, der 1% Triton X-100 (Pierce) enthält und erneut wie vorstehend 10 Min. zentrifugiert. Das gewaschene Pellet wird dann in 25 ml 20 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% DDT, pH 8,3 suspendiert und in einem Glashomogenisator homogenisiert. Die resultierende Suspension enthält rohes monomeres BMP-2 in einer unlöslichen Form.
Zehn ml der BMNP-2-Suspension, die wie vorstehend beschrieben erhalten worden war, werden mit 10%-iger Essigsäure auf pH 2,5 angesäuert und in einer Eppendorf-Zentrifuge 10 Min. bei Raumtemperatur zentrifuguert. Der Überstand wird chromatographiert. Die Chromatographie wird auf einer Sephacryl S-100 HR-Säule (Pharmacia, 2,6 × 83 cm) in 1%-iger Essigsäure bei einer Flußrate von 1,4 ml/Minute durchgeführt. Die Fraktionen, die monomeres BMP-2 enthalten, werden vereint. Dieses Material wird verwendet, um biologisch aktives homodimeres BMP-2 zu erzeugen.
Biologisch aktives homodimeres BMP-2 kann aus dem monomeren BMP-2 nach Solubilisierung und Reinigung, vorstehend beschrieben, wie folgt erzeugt werden.
0,1, 0,5 oder 2,5 mg an BMP-2 werden mit einer Konzentration von 20, 100 oder 500 μg/ml in 50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM reduziertem Glutathion, 1 mM oxidiertem Glutathion und 33 mM CHAPS [Calbiochem] aufgelöst. Nach 4 Tagen bei 4°C oder 23°C wird das Gemisch mit 0,1%-iger TFA 5- bis 10-fach verdünnt.
Die Reinigung des biologisch aktiven BMP-2 wird durch Unterwerfung des verdünnten Gemischs unter die Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C4 214TP54-Säule (25 × 0,46 cm) [The NEST Group, USA] mit einer Flußrate von 1 ml/Min erreicht. Der Puffer A ist 0,1% TFA. Puffer B ist 90% Acetonitril und 0,1% TFA. Der lineare Gradient war 0 bis 5 Minuten bei 20% Puffer B; 5 bis 10 Minuten bei 20 bis 30% Puffer B; 10 bis 40 Minuten bei 30 bis 60% Puffer B; und 40 bis 50 Minuten bei 60 bis 100% Puffer B. Homodimeres BMP-2 wird eluiert und von der HPLC-Säule gesammelt.
Die HPLC-Fraktionen werden bis zur Trockenheit lyophilisiert, in Probenpuffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,45, 12% Glycerin, 4% SDS, 0,0075 Serva Blau G, 0,0025% Phenolrot, mit oder ohne 100 mM Dithiothreitol) wieder aufgelöst und fünf Minuten auf 95°C erhitzt. Der Laufpuffer ist 100 mM Tris, 100 mM Tricin (16% Tricingelb) [Novex], 0,1% SDS bei pH 8,3. Das SDS-PAGE-Gel wird 2,5 Stunden bei 125 Volt laufen gelassen.
Das Gel wird eine Stunde mit 200 ml 0,5% Coomassie Brilliantblau R-250, 25% Isopropanol, 10% Essigsäure, auf 60°C erhitzt, gefärbt. Das Gel wird dann mit 10% Essigsäure, 10% Isopropanol entfärbt, bis der Hintergrund klar ist.
Das reduzierte Material lief zu etwa 13 kD; das nicht reduzierte Material lief zu etwa 30 kD, was ein Hinweis auf das BMP-Dimer ist. Dieses Material war später aktiv in dem W20-Test von Beispiel B.
B. BMP-7-Expressionsvektor
Für die Expression von BMP-7 auf hohem Niveau wird ein Plasmid pALBMP7-981 konstruiert. pALBMP7-981 ist bis auf zwei Ausnahmen identisch mit Plasmid pALBP2-781: das BMP-2-Gen (die Reste 2724-3133 von pALBP2-781) ist ersetzt durch den reifen Teil des BMP-7-Gens, deletiert für die Sequenz, die die ersten 7 Reste der reifen BMP-7-Proteinsequenz codiert:
und die Ribosomenbindungsstelle, die zwischen den Resten 2707 und 2723 in pALBP2-781 gefunden wird, ist durch eine andere Ribosomenbindungsstelle ersetzt, die auf derjenigen basiert, die vor dem Gen 10 des Phagen T7 gefunden wird, mit der Sequenz 5'-CAAGAAGGAGATATACAT-3'. Der Wirtsstamm und die Wachstumsbedingungen, die für die Produktion von BMP-7 verwendet wurden, waren wie für BMP-2 beschrieben.
C. BMP-3-Expressionsvektor
Für die Expression von BMP-3 auf hohem Niveau wird ein Plasmid pALB3-782 konstruiert. Dieses Plasmid ist dem Plasmid pALBP2-781 identisch, außer dass das BMP-2-Gen (Reste 2724-3133 von pALBP2-781) ersetzt ist durch ein Gen, das eine Form von reifem BMP-3 codiert. Die Sequenz dieses BMP-3-Gens ist:
Der Wirtsstamm und die Wachstumsbedingungen, die für die Herstellung von BMP-3 verwendet wurden, waren wie für BMP-2 beschrieben.
D. Expression eines BMP-2/7-Heterodimeren in E coli
Denaturierte und gereinigte BMP-2- und BMP-7-Homodimere aus E. coli wurde aus E. coli-Einschlußkörperpellets durch Ansäuerung und Gelfiltration isoliert, wie zuvor vorstehend beschrieben. 125 μg von jedem BMP in 1 %-iger Essigsäure wurden gemischt und in einer Speed Vac zur Trockenheit gebracht. Das Material wurde in 2,5 ml 50 mM Tris, 1,0 NaCl, 5 mM EDTA, 33 mM CHAPS, 2 mM Glutathion (reduziert), 1 mM Glutathion (oxidiert), pH 8,0, resuspendiert. Die Probe wurde bei 23°C eine Woche inkubiert.
Das BMP-2/7-Heterodimer wurde mittels HPLC auf einer 25 × 0,46 cm Vydac C4 Säule isoliert. Die Probe wurde 5 Minuten in einer Microfuge zentrifugiert und der Überstand wurde mit 22,5 ml 0,1 %-iger TFA verdünnt.

A Puffer: 0,1% TFA

B Puffer: 0,1% TFA, 95% Acetonitril

1,0 ml/Minute

0–5' 20% B

5–10' 20–30% B

10–90' 30–50% B

90–100' 50–100% B
Bei der SDS-PAGE-Analyse eluierten die BMP-2/7-Heterodimeren nach etwa 23'.
Die 10 ist ein Vergleich der W-20-Aktivität der von BMP-2 und BMP-2/7-Heterodimer von E. coli, der eine höhere Aktivität des Heterodimeren zeigt.
F. Expression eines BMP-2/3-Heterodimeren in E. coli
BMP-2- und BMP-3-Monomere wurde wie folgt isoliert: zu 1,0 g an gefrorenen geernteten Zellen, die entweder BMP-2 oder BMP-3 exprimierten, wurde 3,3 ml 100 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,3, zugegeben. Die Zellen wurden durch intensive Behandlung in einer Vortex resuspendiert. 33 μ1 an 100 mM PMSF in Isopropanol wurden zugegeben und die Zellen wurden durch Durchgang durch eine French-Press-Zelle lysiert. Das Lysat wurde in einer Microfuge 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Einschlußkörperpellet wurde in 8,0 M Guanidinhydrochlorid, 0,25 M OTT, 0,5 M Tris, 5 mM EDTA, pH 8,5 aufgenommen und eine Stunde auf 37°C erhitzt.
Die reduzierten und denaturierten BMP-Monomeren wurden wie folgt mittels HPLC auf einer Supelco C4 Guard-Säule isoliert:

A Puffer: 0,1 % TFA

B Puffer: 0,1% TFA, 95 % Acetonitril

1,0 ml/Minute

0–5' 1% B

5–40' 1–70% B

40–45' 70–100% B
Das monomere BMP eluierte nach 28-30'. Die Proteinkonzentration wurde bei A280 und den entsprechenden Extinktionskoeffizienten abgeschätzt.
10 μg an BMP-2 und BMP-3 wurden kombiniert und in einer Speed Vac zur Trockenheit gebracht. Dazu wurden 50 μl an 50 mM Tris, 1,0 NaCl, 5 mM EDTA, 33 mM CHAPS, 2 mM reduziertes Glutathion und 1 mM oxidiertes Glutathion pH 8,5 zugegeben. Die Probe wurde bei 3 Tage bei 23°C inkubiert. Die Probe wurde mittels SDS-PAGE auf einem 16%-igen Tricin-Gel unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen analysiert. Das BMP-2/3-Heterodimer wanderte nicht reduziert zu etwa 35 kd und reduziert und zum BMP-2-Monomer bei etwa 13 kd und zum BMP-3-Monomer bei etwa 21 kd.
Das in E. coli hergestellte BMP-2/3-Heterodimer wird auf in vivo-Aktivität getestet. (20 μg) nach (10 Tagen) wird verwendet um die in vivo-Aktivität von BMP-2/3 mit der von BMP-2 zu vergleichen. Die BMP-2/3-Implantate zeigten keine Aktivität der Knorpel- oder Knochenbildung, während die BMP-Kontrollimplantate die vorrausgesagten Mengen an Knochen- und Knorpelbildung zeigten. Die mit BMP-2/3 erhaltenen in vivo-Ergebnisse sind konsistent mit den in vitro-Ergebnissen von dem W-20-Test.
BEISPIEL 8 – W-20-Biotest
A. Beschreibung der W-20-Zellen
Die Verwendung von stromales W-20-Knochenmarkszellen als einer Indikatorzelllinie basiert auf der Umwandlung dieser Zellen in Osteoblasten-ähnliche Zellen nach der Behandlung mit BMP-2 [R. S. Thies et al., "Bone Morphogenetic Protein alters W-20 stromal cell differentation in vitro", Journal of Bone and Mineral Research, 5(2):305 (1990); und R. S. Thies et al., "Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein 2 Induces Osteoblastic Differentation in W-20-17 Stromal Cells", Endocrinology, im Druck (1992)]. Spezifisch sind W-20-Zellen clonale stromales Knochenmarkszellen, die von Forschern in dem Labor con Dr. D. Nathan, Children's Hospital, Boston, MA, von einer erwachsenen Maus abgeleitet wurden. Die Behandlung von W-20-Zellen mit BMP-2 resultiert in (1) erhöhter Herstellung von alkalischer Phosphatase, (2) Induktion des von PTH stimulierten cAMP, und (3) Induktion der Osteocalcin-Synthese durch die Zellen. Während (1) und (2) Charakteristika darstellen, die mit dem Phänotyp des Osteoblasten assoziiert sind, ist die Fähigkeit, Osteocalcin zu synthetisieren eine phänotypische Eigenschaft, die nur von reifen Osteoblasten gezeigt wird. Darüber hinaus haben wir bisher die Umwandlung von stromalen W-20 Zellen in Osteoblasten-ähnliche Zellen nur bei Behandlung mit BMPs beobachtet. Auf diese Weise korrelieren die in vitro-Aktivitäten, die von mit BMP behandelten W-20-Zellen gezeigt werden, mit der knochenbildenden Aktivität in vivo, die bei den BMPs bekannt ist.
Nachstehend werden zwei in vitro-Test beschrieben, die beim Vergleich der BMP-Aktivitäten von neuen osteoinduktiven Molekülen von Nutzen sind.
B. Protokoll des W-20 alkalische Phosphatase-Tests
W-20-Zellen werden in Gewebekulturplatten mit 96 Mulden mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Mulde in 200 μl Medium (DME mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 100 U/ml + 100 μg/ml Streptomycin) ausplattiert. Die Zellen können sich übernacht in einem Inkubator mit 95% Luft, 5% CO₂ bei 37°C anheften.
Die 200 μl Medium werden mit einer Vielkanal-Pipette von jeder Mulde entfernt und durch ein gleiches Volumen Testprobe ersetzt, die in DME mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin zugeführt wurde. Die Testsubstanzen werden dreifach getestet.
Die Testproben und Standards erhalten eine Inkubationszeit von 24 Stunden mit den W-20-Indikatorzellen. Nach den 24 Stunden werden die Platten von dem Inkubator mit 37°C entnommen und das Testmedium wird von den Zellen entfernt.
Die W-20-Zellschichten werden 3 mal mit 200 μl pro Mulde an Calcium/Magnesium-freier phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und die Waschlösungen werden verworfen.
50 μl Glas-destilliertes Wasser werden zu jeder Mulde zugegeben und die Testplatten werden dann zum schnellen Einfrieren in ein Trockeneis/Ethanol-Bad platziert.
Nachdem sie eingefroren sind, werden die Platten von dem Trockeneis/Ethanol-Bad entfernt und bei 37°C aufgetaut. Dieser Schritt wird noch 2 mal für insgesamt 3 Einfrier-/Auftau-Verfahren wiederholt. Nach Abschluß ist die membrangebundene alkalische Phosphatase für Messungen verfügbar.
50 μl Testmix (50 mM Glycin, 0,05% Triton X-100, 4 mM MgCl₂, 5 mM p-Nitrophenolphosphat, pH = 10,3) werden zu jeder Testmulde zugegeben und die Testplatten werden dann 30 Minuten bei 37°C in einem in einem Schüttelwasserbad mit 60 Schwingungen pro Minute inkubiert.
Am Ende der 30 Minuten Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe von 100 μl 0,2 N NaOH zu jeder Mulde und Platzierung der Platten auf Eis gestoppt.
Die spektrophotometrische Absorption wird bei einer Wellenlänge von 405 Nanometer für jede Mulde ausgelesen. Diese Werte werden dann mit bekannten Standards verglichen, um eine Abschätzung der Aktivität der alkalischen Phosphatase in jeder Probe zu ergeben. Zum Beispiel werden unter Verwendung bekannter Mengen von p-Nitrophenolphosphat Absorptionwerte erzeugt. Dies ist in Tabelle I gezeigt. Tabelle I Absorptionwerte Für Bekannte Standards von p-Nitrophenolphosphat

μMol Nitrophenolphosphat Mittlere Absorption (405 nm)

0,000 0

0,006 0,261 +/– 0,024

0,012 0,521 +/– 0,031

0,018 0,797 +/– 0,063

0,024 1,074 +/– 0,061

0,030 1,305 +/– 0,083
Die Absorptionwerte für bekannte Mengen an BMP-2 können bestimmt werden und in gespaltene μMol Nitrophenolphosphat per Zeiteinheit umgewandelt werden, wie in Tabelle II gezeigt.
Tabelle 2 Werte der alkalischen Phosphatase bei der Behandlung von W-20-Zellen mit BMP-2
Diese Werte werden dann verwendet, um die Aktivitäten bekannter Mengen an BMP-Heterodimeren mit BMP-2-Homodimerem zu vergleichen.
C. RIA-Protokoll für Osteocalcin
W-20-Zellen werden mit 10⁶ Zellen pro Mulde in Vielfachmulden-Gewebekulturgefäße mit 24 Mulden in 2 ml DME, das 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum und 2 mM Glutamin enthält, ausplattiert. Die Zellen können sich übernacht in einer Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO₂ bei 37°C anheften.
Am nächsten Tag wird das Medium zu DME gewechselt, das 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und die Testsubstanz in einem Gesamtvolumen von 2 ml enthält. Jede Testsubstanz wird zu drei Mulden zugegeben. Die Testsubstanzen werden mit den W-20-Zellen insgesamt 96 Stunden inkubiert, wobei nach 48 Stunden durch dieselben Testmedien ersetzt wird.
Am Ende der 96 Stunden werden 50 μl des Testmediums von jeder Mulde entfernt und unter Verwendung eines Radioimmunassays für Osteocalcin der Maus auf die Herstellung von Osteocalcin getestet. Die Details des Tests sind in dem Kit beschrieben, der von Biomedical Technologies Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072, hergestellt wird.
Die Reagentien für den Test werden als die Produktnummern BT-431 (Standard-Osteocalcin der Maus), BT-432 (Ziege-anti-Maus-Osteocalcin), BT-431R (jodiertes Osteocalcin der Maus), BT 415 (normales Ziegenserum) und BT-414 (Esel-anti-Ziege IgG) gefunden. Der RIA auf Osteocalcin, das von W-20-Zellen als Antwort auf die Behandlung mit BMP synthetisiert wird, wird so durchgeführt, wie in dem Protokoll beschrieben ist, das von dem Hersteller zur Verfügung gestellt wird.
Die für die Testproben erhaltenen Werte werden mit Werten für bekannte Standards für Osteocalcin der Maus verglichen und mit der Menge an Osteocalcin, das von W-20-Zellen als Antwort auf Herausforderung mit bekannten Mengen an BMP-2 hergestellt wird.
Die Werte für von BMP-2 induzierte Osteocalcin-Synthese durch W-20-Zellen werden in Tabelle III gezeigt. Tabelle III Osteocalcin-Synthese durch W-20-Zellen

BMP-2-Konzentration ng/ml Osteocalcin-Synthese ng/Mulde

0 0,8

2 0,9

4 0,8

8 2,2

16 2,7

31 3,2

62 5,1

125 6,5

250 8,2

500 9,4

1000 10,0
BEISPIEL 9 – ROSEN-MODIFIZIERTER SAMPATH-REDDI-TEST
Eine modifizierte Version des Knochenbildungstests der Ratte, beschrieben in Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:6591-6595 (1983) wird verwendet, um die Knochen- und/oder Knorpelaktivität von BMP-Proteinen zu bewerten. Dieser modifizierte Test wird hier als der Rosen-modifizierte Sampath-Reddi-Test bezeichnet. Der Schritt der Etanol-Fällung des Sampath-Reddi-Verfahrens wird durch Dialyse (wenn die Zusammensetzung eine Lösung ist) oder Diafiltration (wenn die Zusammensetzung eine Suspension ist) der zu testenden Fraktion gegen Wasser ersetzt. Die Lösung oder Suspension wird dann in 0,1% TFA wiederaufgelöst und die resultierende Lösung zu 20 mg Rattenmatrix zugegeben. Eine Ersatzmatrixprobe der Ratte, die nicht mit dem Protein behandelt wurde, dient als Kontrolle. Dieses Material wird eingefroren und lyophilisiert und das resultierende Puder in #5 Gelatinekapseln eingeschlossen. Die Kapseln subkutan in den abdominalen Thoraxbereich von männlichen Long Evans-Ratten implantiert, die 21–49 Tage alt sind. Die Implantate werden nach 7–14 Tagen entfernt. Die Hälfte von jedem Implantat wird für die alkalische Phosphatase-Analyse verwendet [vgl. A. H. Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 69:1601 (1972)].
Die andere Hälfte von jedem Implantat wird fixiert und für die histologische Analyse verarbeitet. Glycolmethacrylat-Schnitte von 1 μm werden mit Von Kossa und saurem Fuschin gefärbt, um die Menge an induzierter Knochen- und Knorpelbildung, die bei jedem Implantat vorhanden ist, zu bewerten. Die Werte +1 bis +5 stellen die Fläche von jedem histologischen Schnitt von einem Implantat dar, die von neuen Knochen- und/oder Knorpelzellen besetzt ist. Ein Wert von +5 zeigt an, dass mehr als 50% des Implantats neuer Knochen und/oder Knorpel ist, der als direktes Ergebnis von Protein in dem Implantat hergestellt wurde. Ein Wert von +4, +3, +2 und +1 würde anzeigen, dass mehr als 40%, 30%, 20% und 10% des Implantats neuen Knochen und/oder Knorpel enthalten.
Die heterodimeren BMP-Proteine dieser Erfindung können mit diesem Test auf Aktivität bewertet werden.
Es ist zu erwarten, dass dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet zahlreiche Modifikationen und Variationen bei der Durchführung der Erfindung offensichtlich werden. Solche Modifikationen und Variationen werden von den folgenden Ansprüchen umfaßt.
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:

Claims

Verfahren zur Herstellung eines heterodimeren Proteins, das knochenstimulierende Aktivität hat, umfassend Züchten einer ausgewählten Wirtszelle, die eine Nucleotidsequenz enthält, die ein erstes ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, und eine Nucleotidsequenz, die ein zweites ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, wobei die Nucleotidsequenzen jeweils unter der Kontrolle einer geeigneten regulatorischen Sequenz sind, die imstande ist, die Co-Expression der Proteine zu regeln, und Isolieren des heterodimeren Proteins aus dem Kulturmedium, wobei das heterodimere Protein ein menschliches BMP-2/5-, BMP-2/6-, BMP-4/5-, BMP-4/6- oder BMP-4/7-Heterodimer ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenzen auf einzelnen in die Wirtszelle transfizierten Vektoren vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei mehr als eine einzelne Kopie des Gens, das jeweils das BMP oder ein Fragment davon codiert, auf jedem Vektor vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei beide Nucleotidsequenzen auf einem einzelnen Vektor vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei beide Nucleotidsequenzen in ein Chromosom der Wirtszelle eingebaut werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Wirtszelle eine Hybridzelle ist, hergestellt durch Züchten von zwei fusionierten, ausgewählten, stabilen Wirtszellen, wobei jede Wirtszelle mit einer Nucleotidsequenz transfiziert ist, die ein ausgewähltes erstes oder zweites BMP oder ein Fragment davon codiert, wobei die Nucleotidsequenzen unter der Kontrolle einer geeigneten regulatorischen Sequenz sind, die imstande ist, die Expression von jedem Protein oder Fragment zu regeln.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle, eine Insektenzelle oder eine Hefezelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines heterodimeren Proteins, das knochenstimulierende Aktivität hat, in einer Bakterienzelle, umfassend Züchten einer ausgewählten Wirtszelle, die eine Nucleotidsequenz enthält, die ein erstes ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, unter der Kontrolle einer geeigneten regulatorischen Sequenz, die imstande ist, die Expression des Proteins oder des Proteinfragmentes unter Bedingungen zu regeln, die für die Bildung eines löslichen, monomeren Proteins geeignet sind; Züchten einer ausgewählten Wirtszelle, die eine Nucleotidsequenz enthält, die ein zweites BMP oder ein Fragment davon codiert, unter der Kontrolle einer geeigneten regulatorischen Sequenz, die imstande ist, die Expression des Proteins oder des Proteinfragmentes unter den Bedingungen zu regeln, um ein zweites lösliches, monomeres Protein zu bilden; und Mischen der löslichen, monomeren Proteine unter Bedingungen, die die Bildung von dimeren Proteinen erlauben, die durch mindestens eine kovalente Disulfidbindung verbunden sind; und Isolieren eines heterodimeren Proteins aus dem Gemisch, wobei das heterodimere Protein ein menschliches BMP-2/5-, BMP-2/6-, BMP-4/5-, BMP-4/6- oder BMP-4/7-Heterodimer ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Wirtszelle E. coli ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Bedingungen das Behandeln des Proteins mit einem Solubilisierungsmittel umfassen.
Zellinie, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein erstes BMP oder ein Fragment davon codiert, unter der Kontrolle eines geeigneten expressions-regulatorischen Systems, und eine Nucleotidsequenz, die ein zweites BMP oder ein Fragment davon codiert, unter der Kontrolle eines geeigneten expressions-regulatorischen Systems, wobei das regulatorische System imstande ist, die Co-Expression der BMPs oder der Fragmente davon und die Bildung von heterodimerem Protein zu regeln, wobei das rekombinante, heterodimere Protein ein menschliches BMP-2/5-, BMP-2/6-, BMP-4/5-, BMP-4/6- oder BMP-4/7-Heterodimer ist.
Zellinie nach Anspruch 11, wobei die Nucleotidsequenzen in einem einzelnen DNA-Molekül vorhanden sind.
Zellinie nach Anspruch 11, wobei die Nucleotidsequenzen auf unterschiedlichen DNA-Molekülen vorhanden sind.
Zellinie nach Anspruch 12, wobei das einzelne DNA-Molekül eine erste Transkriptionseinheit umfasst, enthaltend ein Gen, das ein erstes BMP oder ein Fragment davon codiert, und eine zweite Transkriptionseinheit, enthaltend ein Gen, das ein zweites BMP oder ein Fragment davon codiert.
Zellinie nach Anspruch 12, wobei das einzelne DNA-Molekül eine einzelne Transkriptionseinheit umfasst, enthaltend mehrere Kopien des Gens, das das erste BMP oder Fragmente davon codiert, und mehrere Kopien des Gens, das das zweite BMP oder Fragmente davon codiert.
DNA-Molekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein erstes ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, und eine Nucleotidsequenz, die ein zweites, unterschiedliches, ausgewähltes BMP oder ein Fragment davon codiert, wobei die Nucleotidsequenzen unter der Kontrolle von mindestens einer geeigneten reguluatorischen Sequenz sind, die imstande ist, die Co-Expression von jedem BMP oder Fragment davon zu regeln, wobei das erste ausgewählte BMP BMP-2 oder BMP-4 ist, und das zweite ausgewählte BMP BMP-5 oder BMP-6 ist, oder wobei das erste ausgewählte BMP BMP-4 ist und das zweite ausgewählte BMP BMP-7 ist.
Molekül nach Anspruch 16, umfassend eine erste Transkriptionseinheit, die ein Gen enthält, das ein erstes BMP oder ein Fragment davon codiert, und eine zweite Transkriptionseinheit, die ein Gen enthält, das ein zweites BMP oder ein Fragment davon codiert.
Molekül nach Anspruch 16, umfassend eine einzelne Transkriptionseinheit, die mehrfache Kopien des Gens enthält, das das erste BMP oder Fragmente davon codiert, und mehrfache Kopien des Gens, das das zweite BMP oder Fragmente davon codiert.
Rekombinantes, heterodimeres Protein mit knochenstimulierender Aktivität, umfassend ein Protein oder ein Fragment eines ersten BMP in Verbindung mit einem zweiten Protein oder Fragment eines zweiten BMP, hergestellt durch Co-Exprimieren der Proteine in einer ausgewählten Wirtszelle, wobei das rekombinante, heterodimere Protein ein menschliches BMP-2/5-, BMP-2/6-, BMP-4/5-, BMP-4/6- oder BMP-4/7-Heterodimer ist.
Arzneimittel, umfassend ein Protein nach Anspruch 19.
Verwendung eines rekombinanten, heterodimeren Proteins nach Anspruch 19 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Knochendefekten, Periodontalerkrankungen, Heilung von Knochenverletzung, Wundheilung oder Steigerung neuronalen Überlebens oder zur Chirurgie.