DE69133329T2

DE69133329T2 - Markierte Oligonukleotide

Info

Publication number: DE69133329T2
Application number: DE69133329T
Authority: DE
Inventors: David H. Gelfand; M. Pamela Holland; K. Randall Saiki; M. Robert Watson
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1990-08-06
Filing date: 1991-08-06
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2011-08-07
Also published as: WO1992002638A1; DE69133574T2; EP1302549B1; DK0543942T3; EP1302549A3; JP2825976B2; DE69133574D1; EP0919565B1; EP0543942B2; ES2209033T5; DK0919565T3; EP0543942B1; EP0919565A2; AU8651091A; EP0919565B2; CA2088683A1; JPH06500021A; US7141377B2; US5210015A; ATE252110T1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Nucleinsäurechemie. Genauer betrifft sie die Verwendung der 5' zu 3' Nuclease-Aktivität einer Nucleinsäurepolymerase zum Abbau eines markierten Oligonucleotids in einem hybridisierten Doppelstrang, bestehend aus dem markierten Oligonucleotid und einer Oligonucleotid-Zielsequenz, und zur Bildung nachweisbarer markierter Fragmente.
Neue mikrobiologische Techniken werden routinemäßig in diagnostischen Untersuchungen angewendet. Zum Beispiel offenbart das US-Patent Nr. 4.358.535 ein Verfahren zum Nachweis von Pathogenen durch Aufbringen einer Probe (z. B. Blut, Zellen, Speichel etc.) auf einen Filter (z. B. Nitrozellulose), Lysierung der Zellen und Fixierung der DNA durch chemische Denaturierung und Erhitzung. Dann werden markierte DNA-Sonden hinzu gegeben, und man lässt sie mit der fixierten DNA der Probe hybridisieren, Hybridisierung zeigt die Anwesenheit von Pathogen-DNA an. Die Proben-DNA kann in diesem Fall durch Kultivierung der Zellen oder Organismen vor Ort auf dem Filter amplifiziert werden.
Als erhebliche Verbesserung der DNA-Amplifikation wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Technik in den US-Patenten Nr. 4.683.202; 4.683.195; 4.800.159 und 4.965.188 offenbart. In ihrer einfachsten Form ist die PCR ein in vitro-Verfahren für die enzymatische Synthese spezieller DNA-Sequenzen mit der Verwendung zweier Oligonucleotid-Primer, die mit komplementären Strängen hybridisieren und die interessierende Region in der Ziel-DNA flankieren. Eine wiederholte Serie von Reaktionsschritten, die Matrizen-Denaturierung, Primer-Anheftung und die Extension der angehefteten Primer umfasst, führt zu der exponentiellen Anhäufung eines bestimmten Fragments, dessen Enden durch die 5'-Enden der Primer definiert sind. Die PCR ist in der Lage, eine selektive Anreicherung einer spezifischen DNA-Sequenz um den Faktor 10⁹ zu erzeugen. Das PCR-Verfahren wird auch von Saiki et al., 1985, Science 230: 1350 beschrieben. Nachweisverfahren, die allgemein bei Standard-PCR-Techniken eingesetzt werden, verwenden eine markierte Sonde mit der amplifizierten DNA in einem Hybridisierungstest. Z. B. offenbaren EP-Veröffentlichung Nr. 237.362 und PCT-Veröffentlichung Nr. 89/11548 Testverfahren, worin die PCR-amplifizierte DNA zunächst auf einem Filter fixiert wird und dann eine spezifische Oligonucleotid-Sonde zugegeben und eine Hybridisierung zugelassen wird. Bevorzugt ist die Sonde markiert, z. B. mit ³²P, Biotin, Meerrettich-Peroxidase (HRP), etc., um den Nachweis der Hybridisierung zu ermöglichen. Es wurde auch der umgekehrte Fall vorgeschlagen, das heißt, dass die Sonde stattdessen an die Membran gebunden ist und die PCR-amplifizierte Proben-DNA zugegeben wird.
Die Patente US-A-4876395, EP-A-0 252 683, EP-A-0 334 694 und US-A-4780405 beschreiben markierte Nucleinsäuren, die zu einer Ziel-Nucleinsäure komplementär sind und die an ihrem 3'-Ende blockiert sind. Keine dieser Referenzen jedoch beschreiben Oligonucleotide, die zwei Markierungen enthalten, wobei die Markierungen durch eine für eine Nuclease empfindliche Spaltstelle voneinander getrennt sind.
Andere Nachweismethoden schließen die Verwendung von Fragmentlängen-Polymorphismus (PCR-FLP), Hybridisierung mit Allel-spezifischen Oligonucleotid (ASO)-Sonden (Saiki et al., 1986, Nature 324: 163) oder direkte Sequenzierung mittels des Dideoxy-Verfahrens unter Verwendung von amplifizierter DNA anstatt von clonierter DNA ein. Bei der Standard-PCR-Technik wird grundsätzlich mit der Replikation einer DNA-Sequenz, die zwischen zwei Primern liegt, gearbeitet, woraus man als Hauptprodukt der Reaktion eine DNA-Sequenz mit diskreter Länge, begrenzt von dem Primer am 5'-Ende jedes Stranges, erhält. Auf diese Weise ergeben Insertionen und Deletionen zwischen den Primern Produktsequenzen verschiedenener Längen, die durch eine Größenbestimmung des Produktes mittels PCR-FLP nachgewiesen werden können. In einem Beispiel einer ASO-Hybridisierung wird die amplifizierte DNA auf einem Nylonfilter in einer Reihe von „Dot Blots" fixiert (z. B. durch UV-Bestrahlung), dann wird Hybridisierung mit einer Oligonucleotidsonde, die unter stringenten Bedingungen mit HRP markiert ist, ermöglicht. Nach dem Waschen werden Tetramethylbenzidin (TMB) und Hydrogenperoxid zugegeben: HRP katalysiert die Hydrogenperoxid-Oxidation von TMB zu einem löslichen blauen Farbstoff, der ausgefällt werden kann und die hybridisierte Sonde anzeigt.
Während die zur Zeit praktizierte PCR-Technik ein außerordentlich wirkungsvolles Verfahren zur Amplifizierung von Nucleinsäuresequenzen darstellt, erfordert der Nachweis des amplifizierten Materials zusätzliche Manipulation und nachträgliche Behandlung der PCR-Produkte um festzustellen, ob die Ziel-DNA vorhanden ist. Es wäre zu wünschen, die Anzahl der zur Zeit notwendigen nachträglichen Behandlungsschritte zum Nachweis des amplifizierten Materials zu senken. Ein „homogenes" Testsystem, das heißt, eines, das ein Signal sendet, während die Ziel-DNA amplifiziert wird, und damit minimale Behandlung nach der Amplfizierung erfordert, wäre ideal.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe, bestehend aus:

(a) Zusammenführung einer einsträngige Nucleinsäuren enthaltenden Probe mit einem Oligonucleotid, das eine Sequenz, die komplementär zu einer Region der Ziel-Nucleinsäure ist, enthält und einem markierten Oligonucleotid, das eine Sequenz, die komplementär zu einer zweiten Region des selben Ziel-Nucleinsäurestranges enthält, die die durch das erste Oligonucleotid definierte Nucleinsäuresequenz aber nicht mit einschließt, um während der Hybridisierungsbedingungen ein Gemisch aus Doppelsträngen zu bilden, wobei die Doppelstränge aus der Ziel-Nucleinsäure bestehen, die so an das erste Oligonucleotid und das markierte Oligonucleotid angeheftet ist, dass das 3'-Ende des ersten Oligonucleotids dem 5'-Ende des markierten Oligonucleotids benachbart ist;
(b) Haltung des Gemisches aus Schritt (a) mit einer Matrizen-abhängigen Nucleinsäure-Polymerase mit einer 5' zu 3' Nuclease-Aktivität unter Bedingungen, die es der 5' zu 3' Nuclease-Aktivität der Polymerase erlauben, das angeheftete, markierte Oligonucleotid abzuspalten und die markierten Fragmente frei zu setzen; und
(c) Nachweis und/oder Messung der Freisetzung der markierten Fragmente.

Dieser Vorgang ist besonders für die Analyse von Nucleinsäure, die mit PCR amplifiziert wurde, geeignet. Dieser Vorgang ist eine Verbesserung von bekannten PCR-Nachweisverfahren, weil es sowohl die Amplifizierung eines Zieles, als auch die Freisetzung einer Markierung zum Nachweis in einem Reaktionssystem zusammen führt, ohne auf zahlreiche Behandlungsschritte des amplifizierten Produktes zurückgreifen zu müssen. So wird in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ein Amplifizierungsverfahren mit der Polymerase-Kettenreaktion, in dem gleichzeitig Amplifizierung und Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe ablaufen, bereit gestellt. Dieses Verfahren besteht aus:

(a) Bereitstellung von mindestens einem markierten Oligonucleotid, das eine zu einer Region in der Ziel-Nucleinsäure komplementäre Sequenz enthält, für den PCR-Test mit besagter Probe, wobei sich das markierte Oligonucleotid innerhalb der Ziel-Nucleinsäuresequenz, die von den oligonucleotiden Primern aus Schritt (b) gebunden ist, anheftet;
(b) Bereitstellung eines Sets von oligonucleotiden Primern, wobei ein erster Primer eine Sequenz enthält, die komplementär zu einer Region in einem Strang der Ziel-Nucleinsäuresequenz ist und die Synthese eines komplementären DNA-Stranges auslöst, und ein zweiter Primer eine Sequenz enthält, die komplementär zu einer Region in einem zweiten Strang der Ziel-Nucleinsäuresequenz ist und die Synthese eines komplementären DNA-Stranges auslöst; und wobei jeder oligonucleotide Primer so ausgewählt ist, dass er sich stromaufwärts von jedem markierten Oligonucleotid, das an dem gleichen Nucleinsäurestrang angeheftet ist, an seine komplementäre Matrize anheftet;
(c) Amlifizierung der Ziel-Nucleinsäuresequenz mit Hilfe einer Nucleinsäure-Polymerase mit einer 5' zu 3'-Nuclease-Aktivität als ein Matrizen-abhängiges Agens unter Bedingungen, die PCR-Wiederholungszyklen von (i) Anheftung von Primern und markierten Oligonucleotiden an eine Matrizen-Nucleinsäuresequenz innerhalb der Zielregion und (ii) Extension des Primers erlauben, wobei besagte Nucleinsäure-Polymerase ein Primer-Extensionsprodukt synthetisiert, während die 5' zu 3'-Nuclease-Aktivität der Nucleinsäure-Polymerase gleichzeitig markierte Fragmente von den angehefteten Doppelsträngen freisetzt, die aus dem markierten Oligonucleotid und seinen komplementären Matrizen-Nucleinsäuresequenzen bestehen, wodurch nachweisbare, markierte Fragmente erzeugt werden, und
(d) Nachweis und/oder Messung der Freisetzung von markierten Fragmenten, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielsequenz in der Probe zu bestimmen.

1 ist eine Autoradiographie einer DEAE-Zellulose-Dünnschichtchromatographie (TLC)-Platte, die die Freisetzung markierter Fragmente von der gespaltenen Sonde zeigt.
2 ist eine Autoradiographie einer DEAE-Zellulose-TLC-Platte, die die Thermostabilität der markierten Sonde zeigt.
3A und 3B sind Autoradiographien von DEAE-Zellulose-TLC-Platten, die zeigen, dass die Menge des freigesetzten markierten Sondenfragments mit dem Ansteigen der PCR-Zyklen korrelliert und Konzentration von Matrizen-DNA beginnt.
4 zeigt die polymerisationsunabhängige 5' zu 3'-Nuclease-Aktivität von Taq-DNA-Polymerase, die in der Autoradiographie gezeigt wird, unter Verwendung von Primern, die sich 0 bis 20 Nucleotide stromaufwärts der Sonde anheften.
5 ist eine Autoradiographie, die die Freisetzung von markierten Sondenfragmenten unter ansteigenden Inkubationstemperaturen und -zeiten zeigt, wobei die Zusammensetzung am 5'-Ende GC-reich ist.
6 ist eine Autoradiographie, die die Freisetzung von markierten Sondenfragmenten unter ansteigenden Inkubationstemperaturen und -zeiten zeigt, wobei die Zusammensetzung am 5'-Ende AT-reich ist.
7 zeigt eine Gel-elektrophoretische Analyse mit 5% Acrylamid eines 142 Basenpaare umfassenden HIV-Produktes, das in Anwesenheit oder Abwesenheit einer markierten Sonde amplifiziert wurde.
8 ist eine Zusammenstellung zweier Autoradiographien von TLC-Analysen von Aliquots von PCR-Amplifizierungsprodukten, die zeigt, dass radiomarkierte Freisetzung auftritt und in der Menge sowohl mit Erhöhung der Start-Matrize, als auch mit längeren Thermozyklen zunimmt.
9 ist ein Schema für eine Reaktion, in der ein NHS-aktives Esterderivat von Biotin zu dem 3'-Amin einer Oligonucleotid-Sonde gegeben wird.
10 ist ein Schema für eine Reaktion, in der ein Biotin-Hydrazid verwendet wird, um eine Oligonucleotidsonde, die ein 3'-Ribonucleotid aufweist, zu markieren.
11 ist ein Schema zur Markierung einer Oligonucleotidsonde mit Biotin unter Verwendung eines Biotin-Phosphoramidits.
12 zeigt ein Reagenz zur Markierung von Oligonucleotidsonden mit Biotin.
13 zeigt eine Oligonucleotidsonde, die mit Rhodamin-X-590 und Kristallviolett markiert ist.
14 zeigt ein Schema für eine Reaktion, um ein aktives Acylazid von Kristallviolett zu erzeugen.
15 zeigt ein Schema für eine Reaktion zur Addierung eines Amins an ein Thymidin zur Verwendung bei der Bindung einer Markierung an eine Oligonucleotidsonde.
16 zeigt typische Ergebnisse und die Beziehung von Signal zu Anzahl der anfänglichen Zielsequenzen für das vorliegende Verfahren unter Verwendung von Bakerbond^TM PEI-Festphasen-Extraktant.
Der hierin verwendete Ausdruck „Probe" bezieht sich auf jede Substanz, die Nucleinsäure enthält oder vermutlich enthält, und umschließt eine Probe von Gewebe oder Flüssigkeit eines Individuums oder von Individuen einschließlich, aber nicht begrenzt auf zum Beispiel Haut, Plasma, Serum, Hirnflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, Urin, Tränen, Blutzellen, Organe, Tumoren und auch Proben von in vitro-Zellkulturbestandteilen (einschließlich, aber nicht begrenzt auf ein bestimmtes Medium, erhalten durch das Wachstum von Zellen in Zellkulturmedium, von rekombinanten Zellen und Zellbestandteilen).
Die hierin verwendeten Ausdrücke „Nucleinsäure", „Polynucleotid" und „Oligonucleotid" beziehen sich auf Primer, Sonden, oligomere Fragmente, die nachzuweisen sind, oligomere Kontrollen und unmarkierte blockierende Oligomere und sollen allgemein für Polydesoxyribonucleotide (enthalten 2-Desoxy-D-Ribose), für Polyribonucleotide (enthalten D-Ribose) und für jeden anderen Typ von Polynucleotid, das ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase oder von modifizierten Purin- oder Pyrimidinbasen ist, gelten. Es ist keine Unterscheidung nach der Länge zwischen dem Ausdruck „Nucleinsäure", „Polynucleotid" und „Oligonucleotid" beabsichtigt, und diese Ausdrücke werden untereinander austauschbar benutzt. Diese Ausdrücke beziehen sich nur auf die Primärstruktur der Moleküle. Daher umschließen diese Ausdrücke sowohl doppel- und einsträngige DNA, als auch doppel- und einsträngige RNA. Das Oligonucleotid besteht aus einer Sequenz von etwa mindestens 6 Nucleotiden, bevorzugt aus mindestens etwa 10–12 Nucleotiden und mehr bevorzugt aus mindestens etwa 15–20 Nucleotiden, die mit einer Region der ausgewählten Nucleotidsequenz korrespondieren. „Korrespondieren" bedeutet identisch oder komplementär zu der ausgewählten Sequenz.
Das Oligonucleotid stammt nicht notwendigerweise physisch von einer existierenden oder natürlichen Sequenz ab, sondern kann in jeder Weise erzeugt werden, einschließlich durch chemische Synthese, DNA-Replikation, reverse Transkription oder eine Kombination hieraus. Mit den Ausdrücken „Oligonucleotid" oder „Nucleinsäure" ist ein Polynucleotid einer genomischen DNA oder RNA, cDNA semisynthetischen oder synthetischen Ursprungs gemeint, das aufgrund seiner Herkunft oder durch Manipulation (1) nicht mit dem ganzen oder einem Teil des Polynucleotides, mit dem es natürlicherweise verbunden ist, verbunden ist; und/oder (2) an ein Polynucleotid gebunden ist, das ein anderes ist, als das, an das es natürlicherweise gebunden ist; und das (3) nicht in der Natur gefunden wird.
Weil Mononucleotide bei der Bildung von Oligonucleotiden in der Weise reagieren, dass das 5'-Phosphat des Pentoseringes des einen Mononucleotides mit dem 3'-Sauerstoff seines Nachbarn in einer Richtung über eine Phosphodiester-Bindung verbunden wird, wird ein Ende eines Oligonucleotids als das „5'-Ende" bezeichnet, wenn sein 5'-Phosphat nicht mit einem 3'-Sauerstoff eines Pentoserings eines Mononucleotids verbunden ist und als „3'-Ende", wenn sein 3'-Sauerstoff nicht mit einem 5'-Phosphat des Pentoseringes des folgenden Mononucleotids verbunden ist. Es gilt hierin, dass die Enden einer Nucleinsäuresequenz, selbst wenn sie innerhalb eines größeren Oligonucleotids liegt, ebenfalls als 3'- und 5'-Enden bezeichnet werden können.
Wenn sich zwei verschiedene, nicht überlappende Oligonucleotide an verschiedene Regionen der selben linearen, komplementären Nucleotidsequenz anheften, und das 3'-Ende eines Oligonucleotids weist in Richtung auf das 5'-Ende des anderen, kann das erste als das „stromaufwärts" gerichtete Oligonucleotid und das folgende das „stromabwärts" gerichtete Oligonucleotid bezeichnet werden.
Der Ausdruck „Primer" kann sich auf mehr als einen Primer beziehen und bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das natürlich vorkommt, wie in einem gereinigten Restriktionsenzym, oder synthetisch hergestellt wird, und das in der Lage ist, als Initiationspunkt für die Synthese entlang eines komplementären Stranges zu wirken, wenn es Bedingungen ausgesetzt ist, unter denen die Synthese eines Primer-Extensionsproduktes, das komplementär zu einem Nucleinsäurestrang ist, katalysiert wird. Solche Bedingungen umschließen die Anwesenheit von vier verschiedenen Desoxyribonucleosidtriphosphaten und einem die Polymerisation induzierenden Agens wie etwa DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase in einer geeigneten Pufferlösung („Pufferlösung" umschließt Substituenten, die Cofaktoren sind, oder die auf den pH-Wert, Ionenstärke etc. wirken), und eine geeignete Temperatur. Der Primer ist bevorzugt einsträngig zur maximalen Wirksamkeit bei der Amplifizierung.
Der hierin verwendete Begriff Komplement einer Nucleinsäuresequenz bezieht sich auf ein Oligonucleotid, dass sich in „antiparalleler Assoziation" befindet, wenn es in der Weise mit der Nucleinsäuresequenz verbunden ist, dass das 5'-Ende der einen Sequenz mit dem 3'-Ende der anderen gepaart ist. Bestimmte Basen, die normalerweise nicht in natürlichen Nucleinsäuren gefunden werden, können in die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden und umschließen zum Beispiel Inosin und 7-Deazaguanin. Die Komplementarität muss nicht perfekt sein; stabile Doppelstränge können falsche Basenpaarungen oder ungepaarte Basen enthalten. Fachleute der Nucleinsäure-Technologie können Doppelstrang-Stabilität unter Berücksichtigung einer Reihe von Variablen, zum Beispiel der Länge des Oligonucleotids, der Basenzusammensetzung und der Sequenz des Oligonucleotids, der Ionenstärke und dem Vorkommen von falsch gepaarten Basenpaaren, bestimmen.
Stabilität eines Nucleinsäure-Doppelstrangs wird durch die Schmelztemperatur, oder „T_M", gemessen. Die T_M eines bestimmten Nucleinsäure-Doppelstrangs unter spezifischen Bedingungen ist die Temperatur, bei der sich die Hälfte der Basenpaare getrennt haben.
Der hierin verwendete Ausdruck „Zielsequenz" oder „Ziel-Nucleinsäuresequenz" bezieht sich auf eine Region des Oligonucleotids, die entweder amplifiziert oder nachgewiesen werden soll oder beides. Die Zielsequenz liegt zwischen den beiden Primersequenzen, die für die Amplifizierung verwendet werden.
Der hierin verwendete Ausdruck „Sonde" bezieht sich auf ein markiertes Oligonucleotid, das mit einer Sequenz in der Ziel-Nucleinsäure eine Doppelstrangstruktur bildet, entsprechend der Komplementarität von mindestens einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz in der Zielregion. Die Sonde enthält vorzugsweise keine Sequenz, die komplementär zu Sequenzen) ist, die als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden. Im allgemeinen wird das 3'-Ende der Sonde „blockiert" sein, um die Aufnahme der Sonde in ein Primer-Extensionsprodukt zu verhindern. „Blockierung" kann durch die Verwendung von nicht komplementären Basen oder durch Zugabe einer chemischen Einheit wie etwa Biotin oder einer Phosphatgruppe zum 3'-Hydroxyl des letzten Nucleotids erreicht werden, was, abhängig von der verwendeten Einheit, einen doppelten Zweck erfüllen kann, indem es als Markierung für den anschließenden Nachweis oder die Auslese der an die Markierung gebundene Nucleinsäuren dient. Blockierung kann auch durch das Entfernen der 3'-OH-Gruppe oder durch Verwendung eines Oligonucleotids, dem eine 3'-OH-Gruppe fehlt, wie etwa eines Didesoxynucleotids, erreicht werden.
Der hierin verwendete Ausdruck „Markierung" bezieht sich auf jedes Atom oder Molekül, das verwendet werden kann, ein nachweisbares (bevorzugt quantifizierbares) Signal zu erzeugen, und das an eine Nucleinsäure oder ein Protein gebunden werden kann. Markierungen können nachweisbare Signale durch Fluoreszenz, Radioaktivität, Colorimetrie, Gravimetrie, Röntgenstrahl-Diffraktion oder -Absorption, Magnetismus, enzymatische Aktivität und dergleichen liefern.
Die hierin verwendeten Ausdrücke „5'→3'-Nuclease-Aktivität" oder „5' zu 3'-Nuclease-Aktivität" bezieht sich auf die Aktivität einer Matrizen-spezifischen Nucleinsäure-Polymerase, einschließlich entweder eine 5'→3'-Exonuclease-Aktivität, traditionell verbunden mit einigen DNA-Polymerasen, wobei Nucleotide in sequenzieller Art vom 5'-Ende eines Oligonucleotids entfernt werden, (z. B. hat E. coli-DNA-Polymerase I diese Aktivität, während das Klenow-Fragment sie nicht hat), oder eine 5'→3'-Aktivität, wobei Spaltung bei mehr als einer Phosphodiesterbindung (Nucleotid) vom 5'-Ende auftritt, oder beides.
Der hierin verwendete Ausdruck „benachbart" bezieht sich auf die Positionierung des Primers unter Berücksichtigung der Sonde auf ihrem komplementären Strang auf der Matrizen-Nucleinsäure. Der Primer und die Sonde können durch 1 bis etwa 20 Nucleinsäuren, mehr bevorzugt durch etwa 1 bis 10 Nucleotide, getrennt sein oder können direkt aneinander stoßen, wie es für einen Nachweis mit einem polymerisationsunabhängigen Prozess wünschenswert sein kann. Alternativ, zur Anwendung in dem polymerisationsabhängigen Prozess, wenn das vorliegende Verfahren in der PCR-Amplifizierung und den hierin beschriebenen Nachweisverfahren angewendet werden, kann die „Nachbarschaft" irgendwo innerhalb der zu amplifizierenden Sequenz liegen, irgendwo stromabwärts eines Primers, so dass Primer-Extension die Polymerase so positioniert, dass eine Abspaltung der Sonde eintritt.
Der hierin verwendete Ausdruck „thermostabile Nucleinsäure-Polymerase" bezieht sich auf ein Enzym, das im Vergleich zu zum Beispiel Nucleotid-Polymerasen von E. coli relativ stabil gegenüber Hitze ist, und das die Polymerisation von Nucleosidtriphosphaten katalysiert. Allgemein wird das Enzym die Synthese am 3'-Ende des an die Zielsequenz angehefteten Primers initiieren und wird in der 5'-Richtung entlang der Matrize fortfahren, und wenn es eine 5' zu 3'-Nuclease-Aktivität besitzt, hydrolysiert es eine eingeschobene, angeheftete Sonde, um sowohl markierte als auch unmarkierte Sondenfragmente frei zu setzten, bis die Synthese endet. Ein repräsentative thermostabiles Enzym, das aus Thermus aquaticus (Taq) isoliert wird, ist im US-Patent Nr. 4.889.818 beschrieben, und ein Verfahren zu seiner Anwendung in herkömmlicher PCR ist von Saiki et al., 1988, Science 239: 487 beschrieben.
Taq-DNA-Polymerase hat eine DNA-Synthese abhängige, Strang ersetzende 5'-3'-Exonuclease-Aktivität (vgl. Gelfand, „Tag DNA Polymerase" in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich, Hrsg. Stockton Press, N.Y. (1989), Kapitel 2). In Lösung findet, wenn überhaupt, geringer Abbau von markierten Oligonucleotiden statt.
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, soweit nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinante DNA-Techniken eingesetzt, die in der Fachwelt verwendet werden. Diese Techniken sind vollständig in der Literatur beschrieben. Vgl. z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hrsg. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg. 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984); und eine Reihe, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.). Alle hierin sowohl vorstehend als auch nachstehend erwähnten Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen liegen hiermit innerhalb der Referenzen.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung beruhen auf einer speziellen Fähigkeit der Nucleinsäure-Polymerasen. Nucleinsäure-Polymerasen können mehrere Aktivitäten besitzen, darunter eine 5' zu 3'-Nuclease-Aktivität, wobei die Nucleinsäure-Polymerase Mononucleotide oder kleine Oligonucleotide von einem Oligonucleotid, das an sein größeres, komplementäres Polynucleotid angeheftet ist, abspalten kann. Soll die Abspaltung wirksam verlaufen, muss ein stromaufwärts gelegenes Oligonucleotid ebenfalls an das selbe, größere Polynucleotid angeheftet sein.
Das 3'-Ende dieses stromaufwärts gerichteten Oligonucleotids liefert die Initationsbindungsstelle für die Nucleinsäure-Polymerase. Sobald die gebundene Polymerase auf das 5'-Ende des stromabwärts gelegenen Oligonucleotids trifft, kann die Polymerase Mononucleotide oder kleine Oligonucleotide davon abspalten.
Die beiden Oligonucleotide können so hergestellt werden, dass sie sich in enger Nachbarschaft auf der komplementären Ziel-Nucleinsäure anheften, so dass die Bindung der Nucleinsäure-Polymerase am 3'-Ende des stromaufwärts gerichteten Oligonucleotids sie automatisch mit dem 5'-Ende des stromabwärts gerichteten Oligonucleotids in Kontakt bringt. Weil Polymerisation nicht erforderlich ist, um die Nucleinsäure-Polymerase zur Durchführung der Abspaltung in Position zu bringen, wird dieser Prozess „polymerisationsunabhängige Abspaltung" genannt.
Alternativ, wenn sich die beiden Oligonucleotide an weiter auseinander liegenden Regionen auf der Matrize der Ziel-Nucleinsäure anheften, muss eine Polymerisation erfolgen, bevor die Nucleinsäure-Polymerase das 5'-Ende des stromabwärts gerichteten Oligonucleotids erreicht. Wenn die Polymerisation läuft, spaltet die Polymerase fortlaufend Mononucleotide oder kleine Oligonucleotide vom 5'-Ende des stromabwärts gerichteten Oligonucleotids ab. Diese Spaltung setzt sich so lange fort, bis der Rest des stromabwärts gerichteten Oligonucleotids in solchem Ausmaß destabilisiert worden ist, dass es vom Matrizenmolekül dissoziiert. Dieser Prozess wird „polymerisationsabhängige Spaltung" genannt.
In der vorliegenden Erfindung ist an dem stromabwärts gerichteten Oligonucleotid eine Markierung angebracht. Auf diese Weise können die abgespaltenen Mononucleotide oder kleinen Oligonucleotide, die von der 5' zu 3'-Nuclease-Aktivität der Polymerase abgespalten werden, nachgewiesen werden.
Darauf folgend kann jede der zahlreichen Strategien eingesetzt werden, um die nicht abgespaltenen markierten Oligonucleotide von den abgespaltenen Fragmenten derselben zu unterscheiden. Auf diese Weise erlaubt die vorliegende Erfindung die Identifizierung jener Nucleinsäureproben, die Sequenzen enthalten, die zu den stromaufwärts und stromabwärts gerichteten Nucleotiden komplementär sind.
Die vorliegende Erfindung nutzt diese 5' zu 3'-Nuclease-Aktivität der Polymerase, wenn sie in Verbindung mit der PCR verwendet wird. Dies unterscheidet sich von zuvor beschriebenen PCR-Amplifizierung, worin die post-PCR amplifizierten Ziel-Oligonucleotide nachgewiesen werden, zum Beispiel durch Hybridisierung mit einer Sonde, die bei stringenten bis moderat stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen einen stabilen Doppelstrang mit jenem der Zielsequenz bilden. Im Gegensatz zu jenen bekannten Nachweisverfahren, die nach PCR-Amplifizierungen verwendet werden, erlaubt die vorliegende Erfindung den Nachweis von Ziel-Nucleinsäuresequenzen während der Amplifizierung dieser Zielnucleinsäure. In der vorliegenden Erfindung wird ein markiertes Oligonucleotid zusammen mit dem Primer zu Beginn der PCR zugegeben, und das Signal, das von der Hydrolyse der markierten Nucleotide (des markierten Nucleotids) der Sonde erzeugt wird, liefert ein Mittel zum Nachweis der Zielsequenz während der Amplifizierung.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch kompatibel mit anderen Amplifizierungssystemen, etwa dem Transkriptions-Amplifizierungssystem, in dem einer der Primer einen Promotor codiert, der dazu benutzt wird, RNA-Kopien der Zielsequenz zu erstellen. In ähnlicher Weise kann die vorliegende Erfindung in einem selbstunterstützenden Sequenzreplikations-(3SR)System verwendet werden, in dem eine Reihe von Enzymen eingesetzt werden, um RNA-Transkriptionen herzustellen, die dann zur Erstellung von DNA-Kopien verwendet werden, alles bei einer einzigen Temperatur. Durch die Inkorporation einer Polymerase mit 5'→3'-Exonuclease-Aktivität in ein Ligase-Kettenreaktions-(LCR-)System zusammen mit geeigneten Oligonucleotiden kann man die vorliegende Erfindung auch zum Nachweis von LCR-Produkten einsetzen.
Natürlich kann die vorliegende Erfindung auch bei Systemen, die keine Amplifizierung beinhalten, eingesetzt werden. Tatsächlich erfordert die vorliegende Erfindung nicht einmal das Vorkommen einer Polymerisation. Ein Vorteil des polymerisationsunabhängigen Prozesses liegt in der Eliminierung der Notwendigkeit einer Amplifizierung der Zielsequenz. In Abwesenheit von Primer-Extension ist die Zielnucleinsäure hauptsächlich einsträngig. Vorausgesetzt, der Primer und das markierte Oligonucleotid sind benachbart an die Zielnucleinsäure gebunden, können sequenzielle Runden von Oligonucleotid-Anheftung und Abspaltung von markierten Fragmenten auftreten. Auf diese Weise kann eine ausreichende Menge von markierten Fragmenten erzeugt werden, die den Nachweis ohne Polmerisation möglich macht. Das während der PCR-Amplifizierung erzeugte Signal könnte, was von Fachleuten geschätzt würde, mit Hilfe dieser polymerisationsunabhängigen Aktivität verstärkt werden.
In jedem hier beschriebenen Prozess wird eine Probe verwendet, bei der die Vermutung besteht, dass sie die bestimmte, interessierende Oligonucleotidsequenz, die „Zielnucleinsäure" enthält. Die in der Probe enthaltene Zielnucleinsäure kann zunächst, wenn nötig, durch reverse Transkription in cDNA transkribiert werden, und dann unter Verwendung eines geeigneten Denaturierungsverfahrens, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel, die Fachleuten dieses Gebietes bekannt sind, denaturiert werden. Ein bevorzugtes physikalisches Mittel zu Strangtrennung stellt die Erhitzung der Nucleinsäure, bis sie vollständig (> 99%) denaturiert ist, dar. Typische Denaturierung durch Hitze erfordert Temperaturen im Bereich von etwa 80°C bis etwa 105°C in einem Zeitraum, der von einigen Sekunden bis zu Minuten reicht. Als eine Alternative zur Denaturierung kann die Zielnucleinsäure in einsträngiger Form in der Probe vorliegen, wie etwa zum Beispiel bei RNA oder DNA-Viren.
Die denaturierten Nucleinsäurestränge werden dann mit zuvor ausgewählten Oligonucleotid-Primern und markiertem Oligonucleotid (hierin auch als „Sonde" bezeichnet) unter Hybridisierungsbedingungen, Bedingungen, die die Bindung von Primern und Sonden an die einfachen Nucleinsäurestränge erlauben, inkubiert. Wie in der Fachwelt bekannt, werden die Primer so ausgewählt, dass ihre relativen Positionen entlang des Doppelstrangs derart sind, dass ein von dem einen Primer synthetisiertes Extensionsprodukt nach Trennung des Extensionsproduktes von seiner Matrize (Komplement) als eine Matrize für die Extension des anderen Primers dient, um eine Replikationskette von definierter Länge zu erhalten.
Weil die komplementären Stränge länger als entweder die Sonde oder Primer sind, haben die Stränge zahlreichere Kontaktpunkte und auf diese Weise innerhalb jedes gegebenen Zeitraums eine größere Chance, einander zu finden. Ein hoher molarer Überschuss von Sonde plus dem Primer hilft, die Balance zugunsten der Anheftung von Sonde und Primer anstatt der Matrizen-Wiedervereinigung zu verschieben.
Der Primer muss von ausreichender Länge sein, um die Synthese von Extensionsprodukten in der Anwesenheit von dem Agens für Polymerisation in Gang zu setzen. Die genaue Länge und Zusammensetzung des Primers wird von zahlreichen Faktoren abhängen, einschließlich der Temperatur der Anheftungsreaktion, Herkunft und Zusammensetzung des Primers, Nähe der Sonden-Anheftungsstelle zu der Primer-Anheftungsstelle und das Verhältnis der Konzentration Primer : Sonde. Zum Beispiel enthält das Primer-Oligonucleotid, abhängig von der Komplexität der Zielsequenz, in typischer Weise etwa 15–30 Nucleotide, obwohl ein Primer auch aus mehr oder weniger Nucleotiden bestehen kann. Die Primer müssen ausreichend komplementär sein, um sich selektiv an ihre entsprechenden Stränge anzuheften und stabile Doppelstränge zu bilden.
Die hierin verwendeten Primer sind so ausgewählt, dass sie „wesentlich" komplementär zu den verschiedenen Strängen jeder spezifischen, zu amplifizierenden Sequenz sind. Die Primer müssen nicht die exakte Sequenz der Matrize widerspiegeln, sie müssen aber ausreichend komplementär sein, um selektiv mit ihren entsprechenden Strängen zu hybridisieren. Nicht komplementäre Basen oder längere Sequenzen können innerhalb des Primers verteilt oder an den Enden des Primers lokalisiet sein, vorausgesetzt, der Primer behält ausreichende Komplementarität mit einem Matrizenstrang, um mit ihm einen stabilen Doppelstrang zu bilden. Die nicht komplemantären Nucleotidsequenzen der Primer können Restriktionsenzym-Stellen enthalten.
Bei der Durchführung der Erfindung muss das markierte Sonden-Oligonucleotid zuerst an eine komplementäre Nucleinsäure angeheftet werden, bevor die Nucleinsäure-Polymerase diese Doppelstrangregion erreicht und damit der 5' zu 3'-Nuclease-Aktivität erlaubt, markierte Oligonucleotid-Fragmente abzuspalten und frei zu setzen.
Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass das markierte Oligonucleotid sich an eine komplementäre Nucleinsäure angeheftet hat, bevor die Primer-Extensionspolymerisation diese Doppelstrangregion erreicht hat, oder bevor sich die Polymerase an das stromaufwärts gerichtete Oligonucleotid in dem polymerisationsunabhängigen Prozess gebunden hat, können eine Reihe von Techniken angewendet werden. Bei dem polymerisationsabhängigen Prozess kann man die Sonde so positionieren, dass das 5'-Ende der Sonde relativ weit vom 3'-Ende des Primers entfernt liegt, womit der Sonde mehr Zeit gegeben wird, sich anzuheften, bevor die Primer-Extension die Sonden-Bindungsstelle blockiert. Kurze Primer-Moleküle erfordern allgemein niedrigere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridkomplexe mit der Zielnucleinsäure zu bilden. Daher kann das markierte Oligonucleotid so ausgewählt werden, dass es länger als der Primer ist, sodass das markierte Oligonucleotid sich bevorzugt bei relativ zur Primer-Anheftung höheren Temperaturen an die Zielsequenz anheftet.
Man kann auch Primer und markierte Oligonucleotide verwenden, die eine unterschiedliche thermale Stabilität aufweisen. Zum Beispiel kann die Nucleotidzusammensetzung des markierten Oligonucleotids so gewählt werden, dass sie einen höheren C/G-Gehalt, und damit folglich eine größere thermische Stabilität als der Primer aufweist. In ähnlicher Weise kann man modifizierte Nucleotide in die Sonde einbringen, diese modifizierten Nucleotide enthalten Basenanaloge, die stabilere Basenpaare bilden, als die Basen, die typischer Weise in natürlich vorkommenden Nucleinsäuren vorkommen.
Modifizierungen der Sonde, die Sondenbindung vor Primerbindung erleichtern sollen, um die Wirksamkeit des vorliegenden Tests zu maximieren, umschließen den Einbau von positiv geladenen oder neutralen Phosphodiesterbindungen in die Sonde, um die Abstoßung des polyanionischen Rückrats von Probe und Ziel zu vermindern (vgl. Letsinger et al., 1988, J. Amer. Chem. Soc. 110: 4470); den Einbau von alkylierten oder halogenierten Basen wie etwa 5-Bromuridin in die Sonde, um Basenpaarung zu erhöhen; den Einbau von Ribonucleotiden in die Sonde, um den Sonde : Zieldoppelstrang in eine „A"-Struktur zu zwingen, die erhöhte Basenpaarung aufweist; und die Substitution einiger oder aller Adenosine der Sonde durch 2,6-Diaminopurin (Aminoadenosin). Bei der Herstellung solcher modifizierter Sonden der Erfindung sollte man zur Kenntnis nehmen, dass der die Rate limitierende Schritt der Doppelstrangbildung die „Nucleation" ist, die Bildung eines einzelnen Basenpaares, und daher kann die Veränderung der biophysikalischen Eigenschaften eines Abschnitts der Sonde, zum Beispiel nur des 3'- oder 5'-Endabschnitts, ausreichen, das gewünschte Ergebnis zu erlangen. Weil der 3'-Endabschnitt der Sonde (die 3'-endständigen 8 bis 12 Nucleotide) nach der Exonuclease-Degradierung des 5'-Endes durch die Polymerase dissoziiert, können zusätzlich Modifikationen des 3'-Endes ohne Beachtung einer Wechselwirkung mit Polymerase/Nuclease-Aktivität vorgenommen werden.
Die Bedingungen der Thermozyklen können gleichfalls so verändert werden, dass die unterschiedliche Thermostabilität von dem markierten Oligonucleotid und Primer genutzt werden können. Zum Beispiel kann nach dem Denaturierungsschritt im Thermozyklus eine intermediäre Temperatur eingeführt werden, die die Bindung von markiertem Oligonucleotid, nicht aber des Primers erlaubt, und dann wird die Temperatur weiter gesenkt, um Primer-Anheftung und -Extension zu ermöglichen. Man sollte jedoch beachten, dass für befriedigende Ergebnisse Sondenspaltung nur in späteren Zyklen des PCR-Prozesses erforderlich ist. Daher kann man das Reaktionsgemisch in der Weise ansetzen, dass, selbst wenn sich Primer anfangs vor Sonden binden, die Primer-Konzentration durch die Primer-Extension so reduziert wird, dass sich in späteren Zyklen Sonden vor Primern binden.
Um Bindung des markierten Oligonucleotids vor dem Primer zu begünstigen, kann auch ein hoher molarer Überschuss von markiertem Oligonucleotid gegenüber Primer-Konzentration verwendet werden. In dieser Ausführungsform sind die Konzentrationen markierter Oligonucleotide in typischer Weise im Bereich von etwa 2 bis 20 Mal höher als die entsprechende Primer-Konzentration, die allgemein 0,5–5 × 10^–7 M beträgt. Fachleute beachten, dass Oligonucleotid-Konzentration, Länge und Basenzusammensetzung alles wichtige Faktoren sind, die die Tm jedes einzelnen Oligonucleotids in einem Reaktionsgemisch beeinflussen. Jeder einzelne dieser Faktoren kann verändert werden, um eine thermodynamische Richtung zur Begünstigung von Sonden-Anheftung gegenüber Primer-Anheftung zu erzeugen.
Die Primer-Oligonucleotide und markierten Oligonucleotide können durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden mit bestimmter Sequenz sind in der Fachwelt bekannt und umschließen zum Beispiel Clonierung und Restriktion von geeigneten Sequenzen und direkte chemische Synthese. Verfahren chemischer Synthese können zum Beispiel das Phosphotriester-Verfahren, beschrieben von Narang et al., 1979, Methods in Enzymology 68: 90, das Phosphodiester-Verfahren, veröffentlicht von Brown et al., 1979, Methods in Enzymology 68: 109, das Diethylphosphoramidat-Verfahren, veröffentlicht von Beaucage et al., 1981, Tetrahedon Letters 22: 1859, und das Solid Support-Verfahren, offengelegt im US-Patent Nr. 4.458.066, einschließen.
Die Zusammensetzung des markierten Oligonucleotids kann so gewählt werden, dass Nuclease-Aktivität vor Strangabspaltung (Mono- und Dinucleotid-Fragmente vor Oligonucleotiden) mit Hilfe der Auswahl von Sequenzen, die GC-reich sind, oder die sequenzielle As und Ts vermeiden und durch die Wahl der Position der Markierung in der Sonde begünstigt wird. Bei der Anwesenheit von AT-reichen Sequenzen in der 5'-komplementären Sondenregion tritt Spaltung etwa nach dem vierten, fünften oder sechsten Nucleotid auf. In einer GC.reichen 5'-komplementären Sondenregion tritt die Spaltung jedoch im Allgemeinen nach dem ersten oder zweiten Nucleotid auf. Alternativ kann der Einbau von modifizierten Phosphodiester-Bindungen (z. B. Phosphorothioat oder Methylphosphonate) in die markierte Sonde während der chemischen Synthese (Noble et al., 1984, Nuc Acids Res 12: 3387–3403; Iyer et al., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112: 1253–1254) verwendet werden, um Spaltung an einer bestimmten Stelle zu verhindern. Abhängig von der Länge der Sonde und der Position der Markierung, kann man eine Sonde herstellen, um bevorzugt die Erzeugung von kurzen oder langen markierten Sondenfragmenten zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung zu begünstigen.
Wie nachfolgend beschrieben, ist das Oligonucleotid durch den Einbau von Einheiten markiert, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Methoden nachweisbar sind. Das Verfahren zur Bindung oder Konjugation der Markierung an das Sonden-Oligonucleotid hängt natürlich von der Art der/des verwendeten Markierung/en und der Position der Markierung in der Sonde ab.
Es sind eine Vielzahl von Markierungen, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, sowie Verfahren zu ihrem Einbau in der Fachwelt bekannt und umschließen, sind aber nicht auf diese beschränkt, Enzyme (z. B. alkaline Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase) und Enzymsubstrate, radioaktive Atome, fluoreszierende Farbstoffe, Chromophoren, chemoluminestzierende Markierungen, elektrochemolumineszierende Markierungen, wie etwa Origen^TM (Igen), Liganden, die spezifische Bindungspartner haben, oder alle anderen Markierungen, die miteinander agieren können, um ein Signal zu verstärken, zu ändern oder auszulöschen. Natürlich sollte die PCR in einem Thermocycler durchgeführt werden, die Markierung muss daher in der Lage sein, die für diesen automatisierten Prozess erforderlichen Temperaturzyklen zu überstehen.
Unter den radioaktiven Atomen wird ³²P bevorzugt. Verfahren zum Einbau von ³²P in Nucleinsäuren sind in der Fachwelt bekannt und umschließen zum Beispiel 5'-Markierung mit einer Kinase oder Zufallsinsertion durch Nick-Translation. Enzyme werden typischer Weise durch ihre Aktivität nachgewiesen. „Spezifischer Bindungspartner" bezieht sich auf ein Protein, das ein Ligandenmolekül mit hoher Spezifität binden kann, wie zum Beispiel in dem Fall eines Antigens und eines dafür spezifischen monoclonalen Antikörpers. Andere spezifische Bindungspartner umschließen Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A und die zahlreichen in der Fachwelt bekannten Rezeptor-Ligand Paare. Die vorstehende Beschreibung soll nicht dazu dienen, die verschiedenen Markierungen in bestimmte Klassen einzuordnen, denn die selbe Markierung kann auf mehrere unterschiedliche Weisen eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ¹²⁵Jod als radioaktive Markierung oder als elektronendichtes Reagenz dienen. HRP kann als Enzym oder als Antigen für monoclonale Antikörper dienen. Darüber hinaus kann man verschiedene Markierungen für den gewünschten Effekt kombinieren. Zum Beispiel könnte man eine Sonde mit Biotin markieren und die Anwesenheit der Sonde durch mit ¹²⁵I markiertes Avidin nachweisen oder mit einem anti-Biotin monoclonalen Antikörper, der mit HRP markiert ist. Andere Permutationen und Möglichkeiten werden Fachleuten auf diesem Gebiet sofort offensichtlich sein und werden als Äquivalente innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung angesehen.
Fluorophore zum Gebrauch als Markierungen bei der Konstruktion markierter Sonden der Erfindung umschließen Rhodamin und Derivate wie etwa Texas Red, Fluorescein und Derivate, wie etwa 5-Bromomethylfluorescein, Lucifer Yellow, IAEDANS, 7-Me₂N-Cumarin-4-Acetat, 7-OH-4-CH₃-Cumarin-3-Acetat, 7-NH₂-4-CH₃-Cumarin-3-Acetat (AMCA), Monobromobiman, Pyrentrisulfonate wie etwa Cascade Blue und Monobromtrimethyl-Ammoniobiman. Im Allgemeinen werden Fluorophore mit breiten Stokes-Shifts bevorzugt, um sowohl den Einsatz von Fluorimetern mit Filtern, als auch eines Monochromometers zu erlauben, und um die Wirksamkeit des Nachweises zu steigern.
In einigen Situationen kann man zwei interaktive Markierungen auf einem einzelnen Oligonucleotid in der Absicht verwenden, einen geeigneten Abstand zwischen den Markierungen auf dem Oligonucleotid zu behalten, um die Trennung der Markierungen während der Hydrolyse des Oligonucleotids zu gestatten. Rhodamin und Kristallviolett sind bevorzugte interaktive Markierungen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann der Nachweis der hydrolisierten, markierten Sonde durchgeführt werden, indem man zum Beispiel Fluoreszenzpolarisierung verwendet, ein auf molekularer Schleudertechnik beruhendes Verfahren, um zwischen großen und kleinen Molekülen zu unterscheiden. Große Moleküle (z. B. intakte markierte Sonden) werden in Lösung weit langsamer geschleudert als kleine Moleküle. Auf Grund der Bindung einer fluoreszierenden Einheit an das interessierende Molekül (z. B. das 5'-Ende einer markierten Sonde) kann diese fluoreszierende Einheit, basierend auf der molekularen Schleudertechnik, gemessen (und unterschieden) werden, womit zwischen intakter und gespaltener Sonde unterschieden wird. Der Nachweis kann direkt während der PCR gemessen werden, oder er kann nach der PCR durchgeführt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform werden zwei markierte Oligonucleotide verwendet, jedes komplementär zu unterschiedlichen Regionen auf unterschiedlichen Strängen einer doppelsträngigen Zielregion, aber nicht zu einander, so dass ein Oligonucleotid sich stromabwärts jedes Primers anheftet. Zum Beispiel kann die Anwesenheit von zwei Sonden potentiell die Intensität des von einer einzelnen Markierung erzeugten Signals verdoppeln und kann ausserdem dazu dienen, die Wiederanheftung des Produktstrangs, die oft während der PCR-Amplifizierung auftritt, zu reduzieren. Die Sonden werden so ausgewählt, dass die Sonden an Positionen binden, die jenen Positionen benachbart (stromabwärts) sind, an denen Primer binden.
Man kann die multiplen Sonden der vorliegenden Erfindung auch zum Erreichen anderer Vorteile einsetzen. Zum Beispiel könnte man eine Probe auf jede beliebige Anzahl von Pathogenen einfach dadurch untersuchen, dass man so viele Sonden wie gewünscht zu dem Reaktionsgemisch gibt: jede der Sonden könnte eine andere Markierung tragen, um den Nachweis zu erleichtern.
Man kann auch allelspezifische oder artspezifische (z. B. spezifisch für die verschiedenen Arten von Borrelia, dem die Lyme-Krankheit (Borreliose) verursachenden Agens) Unterscheidung mit der Verwendung multipler Sonden der vorliegenden Erfindung erreichen, zum Beispiel durch Verwendung von Sonden, die unterschiedlicher T_ms haben und die Anheftungs/Spaltungsreaktion bei einer Temperatur durchführen, die nur für eine Sonde/Allel Doppelstrang-spezifisch ist. Zum Beispiel kann man ein Primer-Paar auswählen, das sowohl HTLVI, als auch HTLVII amplifiziert, und zwei Sonden verwenden, jede eindeutig markiert und entweder für HTLVI oder für HTLVII spezifisch. Man kann allelspezifische Unterscheidung auch dadurch erhalten, dass man nur eine einzige Sonde verwendet und die Arten der erzeugten Spaltungsprodukte untersucht. In dieser Ausführung der Erfindung wird die Sonde so hergestellt, dass sie zumindestens in der 5'-terminalen Region exakt komplementär zu einem Allel, nicht aber zu dem/den anderen Allel/en ist. Für die anderen Allele gilt, dass die Sonde sich nicht mit der 5'-terminalen Region der Sonde paaren wird, so dass, verglichen mit dem Spaltungsprodukt, das erzeugt wird, wenn die Sonde an das exakt komplementäre Allel hybridisiert ist, ein unterschiedliches Spaltungsprodukt erzeugt wird.
Obwohl die Sondensequenz so gewählt werden kann, dass man wichtige Eigenschaften erhält, kann man auch durch die Auswahl der Sondenmarkierung(en) wichtige Vorteile bekommen. Die Markierungen können durch eine Reihe von Techniken direkt oder indirekt mit dem Oligonucleotid verbunden werden. Abhängig von dem genauen Typ der verwendeten Markierung, kann die Markierung an das 5'- oder 3'-Ende der Sonde gelegen sein, kann im Innern der Sonde gelegen sein oder an Seitenarme von verschiedenen Größen und Zusammensetzungen gebunden sein, um Signal-Interaktionen zu vereinfachen. Mit der Verwendung von käuflich erwerbbaren Phosphoramidit-Reagenzien kann man Oligomere herstellen, die funktionelle Gruppen (z. B. Thiole oder primäre Amine) entweder am 5'- oder am 3'-Terminus über ein angemessen geschütztes Phosphoamidit enthalten, und man kann sie durch Befolgung von Anleitungen, die zum Beispiel in PCR Protokols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Hrsg. Academic Press, Inc. 1990) beschrieben werden, markieren.
Verfahren zur Einführung von Reagenzien, die das Oligonucleotid funktionalisieren, um eine oder mehrere Sulfhydryl-, Amino- oder Hydroxyl-Einheiten in die Sequenz des Sonden-Oligonucleotids, typischer Weise am 5'-Terminus, einzuführen, werden im US-Patent Nr. 4.914.210 beschrieben. Eine 5'-Phosphatgruppe kann als ein Radioisotop eingeführt werden, indem man Polynucleotid-Kinase und Gamma-³²P-ATP verwendet, um eine nachzuweisende Gruppe zu erhalten. Biotin kann an das 5'-Ende angefügt werden, indem man einen Aminothymidin-Rest oder einen 6-Aminohexyl-Rest, die während der Synthese eingefügt wurden, mit einem N-Hydroxysuccinimid-Ester des Biotins reagieren lässt. Für Markierungen am 3'-Terminus kann man Polynucleotid-Terminal-Transferase zum Anfügen der gewünschten Einheit verwenden, wie etwa zum Beispiel Cordycepin ³⁵S-dATP und biotinyliertes dUTP.
Oligonucleotid-Derivate sind gleichfalls verfügbare Markierungen. Zum Beispiel sind Etheno-dA und Etheno-A bekannte fluoreszierende Adenin-Nucleotide, die in ein Sonden-Oligonucleotid eingefügt werden können. In ähnlicher Weise sind Etheno-dC oder 2-Aminopurin-Deoxyribosid andere Analoge, die bei der Sondensynthese verwendet werden können. Die Sonden, die solche Nucleotid-Derivate enthalten, können bei der Hydrolyse durch die 5' zu 3-Nuclease-Aktivität viel stärker fluoreszierende Mononucleotide freisetzen, wenn DNA-Polymerase während der PCR einen Primer extendiert.
Matrizenabhängige Extension des (der) Primer-Oligonucleotid(e) wird durch ein polymerisierendes Agens in der Anwesenheit adäquater Mengen der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) oder Analoga, wie vorstehend diskutiert, in einem Reaktionsmedium, bestehend aus den geeigneten Salzen, Metall-Kationen und pH-Pufferlösungsystem, katalysiert. Geeignete polymerisierende Agenzien sind Enzyme, die dafür bekannt sind, Primer- und matrizenabhängige DNA-Synthese zu katalysieren und die 5'- zu 3'-Nuclease-Aktivität besitzen. Bekannte DNA-Polymerasen umschließen zum Beispiel E. coli DNA-Polymerase I, Thermus thermophilus (Tth) DNA-Polymerase, Bacillus stearothermophilus DNA-Polymerase, Thermococcus litoralis DNA-Polymerase und Thermus aquaticus (Taq) DNA-Polymerase. Die Reaktionsbedingungen für die Katalyse von DNA-Synthese mit diesen DNA-Polymerasen sind in der Fachwelt gut bekannt. Um in der vorliegenden Erfindung von Nutzen zu sein, muss das polymerisierende Agens das Oligonucleotid wirksam abspalten und markierte Fragmente freisetzen, so dass das Signal direkt oder indirekt erzeugt wird.
Die Produkte der Synthese sind Doppelstrangmoleküle, die aus den Matrizensträngen und den Primer-Extensionssträngen bestehen, die die Zielsequenz einschließen. Nebenprodukte dieser Synthese sind markierte Oligonucleotid-Fragmente, die aus einem Gemisch aus Mono-, Di- und größeren Nucleotidfragmenten bestehen. Wiederholte Denaturierungszyklen, Anheftung von markiertem Oligonucleotid und Primer und Primer-Extension und Abspaltung des markierten Oligonucleotids münden in der exponentiellen Akkumulation der Zielregion, die durch die Primer und die exponentielle Erzeugung von markierten Fragmenten definiert ist. Es werden genügend Zyklen durchgeführt, um eine nachweisbare Art von Markierung zu erhalten, die mehrere Größenordnungen größer sein kann als das Hintergrundsignal, obwohl in der allgemeinen Praxis solche hohen Verhältnisse von Signal zu Rauschen nicht immer erreicht werden oder erwünscht sind.
In einem bevorzugten Verfahren wird der PCR-Prozess als ein automatisierter Prozess durchgeführt, der ein thermostabiles Enzym verwendet. In diesem Prozess durchläuft das Reaktionsgemisch in Zyklen einen Denaturierungsschritt, einen Sonden- und Primer-Anheftungsschritt und einen Syntheseschritt, wobei Spaltung und Entfernung gleichzeitig mit Primer-abhängiger Matrizenextension auftritt. Es kann ein DNA-Thermozykler, wie etwa das käuflich zu erwerbende Gerät von Perkin-Elmer Cetus Instruments, das speziell zur Nutzung mit einem thermostabilen Enzym entworfen wurde, verwendet werden.
Temperaturstabile Polymerasen werden in diesem automatisierten Prozess bevorzugt, weil die bevorzugte Art, die doppelsträngigen Extensionsprodukte zu denaturieren, darin besteht, sie während des PCR-Zyklus einer hohen Temperatur (etwa 95°C) auszusetzen. Zum Beispiel wird in dem US-Patent Nr. 4.889.818 ein repräsentatives thermostabiles Enzym, das aus Thermus aquaticus isoliert wurde, offengelegt. Weitere repräsentative temperaturstabile Polymerasen umschließen z. B. Polymerasen, die aus den thermostabilen Bakterien Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus (das ein etwas tieferes Temperaturoptimum als die anderen angeführten aufweist), Thermus lacteus, Thermus rubens, Thermotoga maritima, Thermococcus litoralis und Methanothermus fervidus extrahiert wurden.
Nachweis oder Verifikation der markierten Oligonucleotid-Fragmente kann mit einer Reihe von Verfahren durchgeführt werden und kann von der Herkunft der verwendeten Markierung oder Markierungen abhängig sein. Eine vorteilhafte Ausführung der Erfindung ist, die Reaktionsprodukte, einschließlich der abgespaltenen markierten Fragmente, einer Größenanalyse zu unterziehen. Verfahren zur Größenbestimmung von markierten Nucleinsäurefragmenten sind in der Fachwelt bekannt und umschließen zum Beispiel Gel-Elektrophorese, Gradientensedimentation, Gel-Ausschlusschromatographie und Homochromatographie.
Während oder nach der Amplifizierung kann die Trennung der markierten Fragmente aus dem PCR-Gemisch durchgeführt werden, zum Beispiel dadurch, dass man das PCR-Gemisch mit einem Festphasen-Extraktant (SPE) in Kontakt bringt. Zum Beispiel können Materialien mit einer Fähigkeit, Oligonucleotide aufgrund von Größe, Ladung oder Wechselwirkung mit der Oligonucleotid-Basis zu binden, dem PCR-Gemisch unter Bedingungen zugegeben werden, bei denen markierte, ungespaltene Oligonucleotide gebunden und kurze, markierte Fragmente nicht gebunden sind. Solche SPE-Materialien umschließen Ionenaustauschharze oder -perlen, wie etwa die käuflich zu erwerbenden Bindungspartikel Nensorb (DuPont Chemical Co.), Nucleogen (The Nest Group), PEI, BakerBond^TM PEI, Amicon PAE 1,000, Selectacel^TM PEI, Boronat SPE mit einer 3'-Ribose Sonde, SPE, der dem 3'-Ende der Sonde komplementäre Sequenzen enthält, und Hydroxylapatit. In einer speziellen Ausführung, wenn ein zweifach markiertes Oligonucleotid, das eine durch eine auf Nuclease ansprechende Spaltungsstelle von einer 5'-Markierung getrennte 3'-Biotin-Markierung enthält, als ein Signal verwendet wird, kann das PCR-amplifizierte Gemisch mit Materialien in Kontakt gebracht werden, die die einen spezifischen Bindungspartner wie etwa Avidin oder Streptavidin oder einen Antikörper oder monoclonalen Antikörper für Biotin enthalten. Solche Materialien können mit speziellen Bindungspartnern überzogene Perlen und Partikel einschließen und können auch magnetische Partikel einschleissen.
Anschließend an den Schritt, bei dem das PCR-Gemisch mit einem SPE in Kontakt gebracht wurde, kann das SPE-Material durch Filtration, Sedimentation oder magnetische Anziehungskraft entfernt werden, die markierten Fragmente, frei von ungespaltenen markierten Oligonucleotiden und einem Nachweisverfahren zugänglich, zurücklassend.
Reagenzien, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können in Diagnose-Kits zusammengestellt werden. Diagnose-Kits umfassen die markierten Oligonucleotide und die Primer in getrennten Behältern. Falls das Oligonucleotid nicht markiert ist, können die spezifischen Markierungsreagenzien ebenfalls in dem Kit enthalten sein. Der Kit kann ebenfalls andere geeignet zusammengestellte, für Amplifizierung notwendige Reagenzien und Materialien enthalten, zum Beispiel Pufferlösung, dNTPs und/oder polymerisierende Mittel und zum Beispiel Enzyme und Festphasen-Extraktante für die Nachweisanalyse, sowie Anleitungen zur Durchführung der Untersuchung.
Die nachstehend angeführten Beispiele sind gedacht, die zahlreichen Verfahren und Bestandteile der Erfindung zu illustrieren.
Beispiel 1
PCR-Freisetzung der Sondenmarkierung
Eine PCR-Amplifizierung wurde durchgeführt, die das 5'-³²P-markierte Ende einer komplementären Sonde freisetzte, wenn ein speziell beabsichtigtes Produkt synthetisiert wurde.
A. Markierung der Sonde mit gamma-³²P-ATP und Polynucleotid-Kinase.
Zehn pmol jeder Sonde (BW31 BW33, BW35, Sequenzen nachstehend gezeigt) wurden einzeln mit 15 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase (New England Biolabs) und 15,3 pmol gamma-³²P-ATP (New England Nuclear, 3000 Ci/mmol) in einem 50 μl Reaktionsvolumen, bestehend aus 50 mM Tris-HCL, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 0,1 mM Spermidin und 0,1 mM EDTA, für 60 Minuten bei 37°C gemischt. Das Gesamtvolumen wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, wie von Sambrook et al., Molecular Cloning, Zweite Auflage (1989) beschrieben. Die Sonden wurden in 100 μl TE-Pufferlösung resuspendiert und durchliefen eine Sephadex G-50 Spin Dialysesäule, um das nicht inkorporierte ³²P-ATP zu entfernen, wie von Sambrook et al., vorstehend, gelehrt. Die TCA-Fällung der Reaktonsprodukte zeigte die folgenden spezifischen Aktivitäten:
BW31: 1,98 × 10⁶ cpm/pmol
BW33: 2,54 × 10⁶ cpm/pmol
BW35: 1,77 × 10⁶ cpm/pmol
Die Endkonzentration von allen drei Sonden betrug 0,10 pmol/μl.
B. Amplifizierung
Die amplifizierte Region war ein Produkt mit 350 Basenpaaren des Bakteriophagen M13mp10w, dirigiert von den Primern BW36 und BW42. Die Region jeder nummerierten Primersequenz, die hierin erwähnt wird, folgt dem standartisierten M13 Nucleotidsequenz-Gebrauch.
Es wurden drei verschiedene Sonden verwendet; alle enthielten die zu M13mp10w exakt komplementäre 30-Basen Sequenz, unterschieden sich aber in der in der Länge der nicht komplementären 5'-Regionen. Die Sonden wurden synthetisiert, um ein 3'-PO₄ anstatt eines 3'-OH zu erhalten, um jegliche Extension durch Taq-Polymerase zu blockieren.

X = 3'-Phosphat
a, t, g, c = Basen nicht komplementär zum Matrizenstrang
* = gamma ³²P-ATP Markierung
Zur Amplifizierung des 350-bp-Fragments wurden 10^–3 pmol der M13mp10w-Zielsequenz zu einem 50 μl Reaktionsvolumen zugegeben, das aus 50 mM KCL, 10 mM Tris-HCL, pH 8,3, 3 mM MgCl₂, je 10 pmol der Primer BW36 und BW42, 200 μM von jeder der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate, 1,25 Einheiten Taq DNA-Polymerase und entweder 1, 10 oder 20 pmol der Isotopen-verdünnten Sonde BW31. BW33 oder BW35 bestand. Die Menge der radiomarkierten Sonde wurde konstant auf 0,4 pmol pro Reaktion gehalten und auf 1, 10 oder 20 pmol mit nicht radioaktiver Sonde verdünnt. Taq-Polymerase wurde mit 4 μl pro Reaktion mit 0,3125 U/μl zugegeben und in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5% Tween 20 und 500 μg/ml Gelatine verdünnt.
Es wurde ein General-Reaktionsgemisch angesetzt, das ausreichende Mengen Reaktionspufferlösung, Nucleosidtriphosphate, beide Primer und Enzym enthielt. Aus diesem General-Gemisch wurden Aliquots entnommen, und zu diesen wurde Matrize und verschiedene Konzentrationen jeder Sonde gegeben. Kontrollreaktionen bestanden aus der Zugabe aller Reaktionsbestandteile ausgenommen Matrize und aller Reaktionsbestandteile ausgenommen Sonde. Jedes Reaktionsgemisch wurde mit 50 μl Mineralöl überschichtet, um Verdunstung zu verhindern, für 45 Sekunden mikrozentrifugiert und dann in einen Thermozykler gestellt. Die Reaktionsgemische wurden dem folgenden Reaktionsschema unterworfen:
15 Zyklen: 96°C Denaturierung, 1 min
60°C Anheftung/Extension, 1,5 min
Ein Zyklus: 96°C Denaturierung, 1 min
60°C Anheftung/Extension, 5,5 min
Nach Durchlauf der Zyklen wurde das Mineralöl mit 50 μl Chloroform extrahiert, die Gemische wurden bei 4°C gelagert, und die folgenden Untersuchungen wurden durchgeführt.
C. Analyse
Für die Acrylamidgel-Analyse wurden 4 μl von jeder Amplifizierungsreaktion mit 3 μl von 5X Gel-Ladungsgemisch (0,125% Bromophenol Blue, 12,5% Ficoll 400 in H₂O) gemischt und auf ein 4% Acrylamidgel (10 ml 10X TBE-Pufferlösung, 1 ml 10% Ammoniumpersulfat, 10 ml 40% Bis Acrylamid 19 : 1, 50 μl TEMED, und 79 ml H₂O) in 1X TBE Pufferlösung (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure und 2 mM EDTA) gegeben und der Elektrophorese für 90 Minuten bei 200 Volt ausgesetzt. Nach Anfärbung mit Ethidiumbromid wurde die DNA durch UV-Fluoreszenz sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwesenheit keiner dieser drei Sonden in den verschiedenen Konzentrationen einen Einfluss auf die Menge des erzeugten amplifizierten Produkts hatte. Probenreihen, die keine Sonde enthielten, zeigten diskrete 350-Basenpaar-Banden mit hoher Intensität, übereinstimmend mit der gewünschten Sequenz. Alle Reihen, die Sonde enthielten, zeigten das Gleiche und zusätzlich ein paar blasse Banden bei leicht höherem Molekulargewicht. Kontrollreihen ohne Matrizenzugabe zeigten, wenn überhaupt, kein Banden bei 350 Basen, und nur Banden mit geringerer Intensität, die die Primer bei 30–40 Basen repräsentierten.
Nach fotografischen Aufnahmen wurde das Gel auf Whatman-Papier übertragen, mit Saran Wrap bedeckt und einer Autoradiographie unterworfen. Eine Aufnahme über Nacht zeigte, dass sich 90–95% der Radiomarkierung nahe des Gelbodens befand, wohin Sondenmaterial oder teilweise degradiertes Sondenmaterial wandern würde.
Für die denaturierende Gelanalyse wurden 2 μl von jeder Amplifizierungsreaktion mit 2 μl Formamid-Ladungspufferlösung (0,2 ml 0,5 M EDTA pH 8, 10 mg Bromophenol Blau, 10 mg Xylencyanol und 10 ml Formamid) gemischt, dann für 3–5 min auf 96°C erhitzt und auf Eis gelegt. Die Proben wurden auf ein Polyacrylamid-Gel mit einem Denaturierungsgradienten von 6,2% (7 M Harnstoff mit einem Sucrose- als auch einem Pufferlösunggradienten) nach dem Verfahren von Sambrook et al., vorstehend, gegeben. Das Gel wurde für 90 Minuten bei 2000 V, 45 W der Elektrophorese ausgesetzt, dann auf Whatman-Papier übertragen und eine Autoradiographie aufgenommen.
Ergebnisse aus dem denaturierenden Gel zeigten, dass etwa 50% von jeder Sonde in kleinere markierte Fragmente zerlegt waren. Annähernd 50%–60% der Counts liegen in dem 30–40 Basen-Bereich, unzerlegtes Sondenmaterial repräsentierend. Eine sehr schwache Bande ist bei 300 Basen für alle Amplifikationsreaktionen sichtbar, was nahelegt, dass ein sehr kleiner Prozentsatz der Sonden eine 3'-PO₄-Gruppe verloren oder nie besessen hat und der Extension unterworfen war. Die restlichen Counts liegen in dem Bereich zwischen null und 15 Basen. Die Auflösung auf solch einem Gel gibt nicht die exakte Größe von Produkten wieder, die besser mit einer homochromatographischen Analyse bestimmt werden kann.
Für eine homochromatische Analyse wurden 1 μl-Punkte von jeder Probe in 1,2 cm Entfernung auf eine Polygram-CEL 300 DEAE 20 × 20 cm Zellulose-Dünnschichtplatte aufgebracht, auf der zuvor 5 μl-Punkte von gescherter Heringssperma-DNA (150 μg/ml) aufgebracht worden waren, die man trocknen ließ. Nachdem die Probe getrocknet war, wurde die Platte in ein Gefäß mit destilliertem Wasser gestellt und dem Wasser gestattet, gerade eben über die Proben-Ladezone zu wandern. Die Platte wurde dann in einen gläsernen Entwicklungstank, der gefiltertes Homo-Mix III (Jay et al., 1979, Nuc. Acid Res. 1 (3): 331–353) enthielt, eine Lösung von zum Teil hydrolysierter RNA mit 7 M Harnstoff bei 70°C in einen Ofen gegeben. Man ließ den Homo-Mix durch Kappillarkraft zum oberen Rand der Platte wandern, zu welchem Zeitpunkt die Platte entfernt, getrocknet, mit Saran Wrap bedeckt wurde und dann eine Autoradiographie aufgenommen wurde.
Eine Aufnahme der Homochromatographie-Platte über Nacht zeigte ebenfalls, dass etwa 40% der Proben in kleinere Fragmente degradiert waren. Diese Fragmente waren von sehr spezifischer Größe, abhängig von der Länge des nicht komplementären 5'-Schwanzes jeder Sonde. 1 zeigt eine Autoradiographie der TCL-Platte. Sonde BW31 (Reihen 1–3), die vollständig komplementär zu der M13mp10w-Matrize war, erzeugte markierte Fragmente von vorwiegend ein bis zwei Basen Länge. Sonde BW33 (Reihen 4–6), die eine nicht komplementäre 5'-Region von 3 Basen enthielt, setzte Produkte von vorwiegend vier bis sechs Basen Länge frei. BW35 (Reihen 7–9) hatte einen nicht komplementären 5'-Schwanz von 10 Basen und setzte vorwiegend Produkte mit einer Länge von 12 bis 13 Basen frei. Die Reihen 10–12 sind Kontrollreaktionen nach 15 Zyklen, die entweder BW31, BW33 oder BW35 und alle PCR-Bestandteile ausgenommen Matrizenmaterial enthielten. Während der DNA-Synthese löste das Enzym die ersten ein oder zwei gepaarten Basen, auf die es traf, und spaltete dann an jener Stelle, Indikativ für eine Endonuclease-ähnliche Aktivität. Die Ergebnisse zeigen spezifische Sonden-Freisetzung, koordiniert mit Produktakkumulation während der PCR.
Beispiel 2
Spezifität der Freisetzung von Sondenmarkierung
Die Spezifität der Freisetzung markierten Sondenmaterials wurde mit Hilfe der Durchführung einer PCR-Amplifizierung unter Verwendung von Lambda-Bakteriophagen-DNA und Primern und einer Reihe von nicht komplementären, Kinase-behandelten Sonden untersucht.
Die zu amplifizierende Region war eine 500 Nucleodide umfassende Region auf der Lambda-Bakteriophagen-DNA aus dem GeneAmp^® DNA-Amplifizierungsreagenzien-Kit (Perkin-Elmer Cetus), flankiert von den Primern PCRO1 und PCRO2, ebenfalls aus dem GeneAmp^® DNA-Kit.
Aliquots der selben drei Sonden BW31, BW33 und BW35, die in Beispiel 1 identifiziert worden waren, wurden verwendet, alle waren vollständig nicht komplementär zur Zielsequenz.
Zur Amplifizierung der 500 bp-Region wurden 0,5 ng der Lambda-DNA Zielsequenz (Kontrollmatrize Lot #3269, 1 μg/ml, Verdünnung 1 : 10 in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und 10 mM NaCl als Grundlage) zu einem 50 μl Reaktionsvolumen gegeben, das aus 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl₂, je 1 μM von den Primern PCRO1 (Lot #3355) und PCRO2 (Lot #3268), je 200 μM der vier Desoxynucleosidtriphosphate, 1,25 Einheiten Taq DNA-Polymerase und entweder 2, 10 oder 20 pmol der mit Isotopen verdünnten Sonden BW31, BW33 oder BW35 bestand. Die Menge der radiomarkierten Sonde wurde konstant auf 0,4 pmol pro Reaktion gehalten und auf 1, 10 oder 20 pmol mit nicht radioaktivem Sondenmaterial verdünnt. Tag DNA-Polymerase wurde mit 4 μl pro Reaktion zu 0,3125 Einheiten/μl zugegeben und in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5% Tween 20 und 500 μg/ml Gelatine verdünnt.
Das General-Reaktionsgemisch wurde, wie vorstehend beschrieben, zusammen mit den Kontrollreaktionsgemischen minus Sonde oder minus Enzym angesetzt Die Reaktionsgemische wurden nach den Zyklusbedingungen, die in Beispiel 1B festgesetzt wurden, amplifiziert und dann wie folgt analysiert. Für Acrylamidgel-Analysen wurden 4 μl von jeder Amplifizierungsreaktion, gemischt mit 3 μl 5X-Ladungsgemisch, auf ein 4% Acrylamidgel in 1X TBE-Pufferlösung gegeben und für 90 Minuten bei 200 Volt der Elektrophorese ausgesetzt. Nach Anfärbung mit Ethidiumbromid wurde die DNA durch UV-Fluoreszenz sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwesenheit keiner dieser Sonden in keiner Konzentration einen Einfluss auf die Menge des erzeugten amplifizierten Produkts hatte. Kontrollreihen der Proben, die keine Sonde enthielten, und alle Reihen, die Sondenmaterial enthielten, zeigten eine diskrete 500-Basenpaar-Bande mit hoher Intensität, übereinstimmend mit der gewünschten Sequenz. Kontrollreihen ohne Enzymzugabe zeigten keinerlei Produkt-Banden, sondern nur Banden mit geringerer Intensität, die Primer und Sonde von annähernd 30–40 Nucleotiden repräsentierten.
Die homochromatographische Analyse, dargestellt in 2, zeigt eine Aufnahme der Platte über Nacht, in der kein Abbau der Sonden beobachtet wurde. Alle Counts lagen an der Ausgangsstelle, keine Freisetzung von markierten Fragmenten zeigend. Reihen 1–3 zeigen Reaktionen mit der Sonde BW31; Reihen 4–6 umschließen Sonde BW33; Reihen 7–9 umschließen Sonde BW35; und Reihen 10–12 sind Kontrollreaktionen ohne Matrize. Die Ergebnisse zeigen, dass die Sonde nicht abgebaut wird, solange sie nicht spezifisch an die Zielsequenz gebunden ist und ist imstande, den Bedingungen der PCR-Zyklen zu widerstehen.
In der denaturierenden Gel-Analyse wurden 2 μl jeder Amplifizierungsreaktion mit 2 μl Formamid-Ladungspufferlösung (in Beispiel 1 beschrieben) gemischt und für 3–5 min auf einen Heizblock bei 96°C gestellt. Die Proben wurden sofort auf Eis gelegt und auf ein Acrylamidgel mit 6,2% Denaturierungsgradient gegeben und für 90 Minuten bei 2000 Volt der Elektrophorese ausgesetzt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf Whatman-Papier übertragen, mit Saran Wrap überdeckt und eine Autoradiographie aufgenommen.
Eine Aufnahme über Nacht zeigte, dass alle Counts im Bereich der 30–40 Basenpaare lagen, entsprechend den Größen der Sonden. Wiederum war kein Sonden-Abbau zu erkennen, was weiterhin bestätigt, dass eine Sonde spezifisch an die Matrize gebunden sein muss, bevor irgendein Abbau einsetzen kann.
Beispiel 3
Spezifität der Freisetzung von Sondenmarkierung in der Anwesenheit genomischer DNA
In diesem Beispiel wurde die Spezifität der Freisetzung von Sondenmarkierung mittels der Durchführung einer PCR-Amplifizierung in der Anwesenheit von degradierter oder nicht degradierter menschlicher genomischer DNA untersucht.
Die in diesem Experiment verwendete, mit Kinase behandelte Sonde BW33 hatte eine spezifische Aktivität von 5,28 × 10⁶ cpm/pmol, bestimmt durch TCA-Fällung nach der Kinase-Reaktion. Die amplifizierte Region war die aus 350 Basenpaaren bestehende Region von M13mp10w, flankiert von den Primern BW36 und BW42. Primer-Sequenzen und Positionen sind in Beispiel 1 aufgelistet. Die genomische DNA vom Menschen stammte aus der Zelllinie HL60 und wurde nicht degradiert oder durch Scheren in einer French Press auf eine durchschnittliche Größe von 800 Basenpaaren degradiert verwendet.
Jedes 50 μl Amplifizierungsreaktionsgemisch bestand aus 10^–2 oder 10^–3 pmol M13mp10w Zielsequenz, 1 μg von entweder degradierter oder nicht degradierter HL60 genomischer DNA, die zu einem aus 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl₂, je 10 pmol der Primer BW36 und BW42, je 200 μM der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate, 1,25 Einheiten Taq DNA-Polymerase und 10 pmol der Isotopen-verdünnten Sonde BW33 bestehenden Reaktionsgemisch hinzugegeben wurden.
Ein General-Reaktionsgemisch wurde angesetzt, das ausreichende Mengen an Reaktionspufferlösung, Nucleosidtriphosphaten, Primern, Sondenmaterial und Enzym enthielt. Aliquots wurden entnommen und zu diesen wurde M13mp10w-Matrize und/oder genomische DNA gegeben. Kontrollreaktionen umschlossen alle Reaktionsbestandteile ausgenommen M13mp10w Ziel-DNA oder alle Reaktionsbestandteile ausgenommen genomischer DNA.
Jedes Reaktionsgemisch wurde mit 50 μl Mineralöl überschichtet, mikrozentrifugiert und in einen Thermozykler gestellt. Die Reaktionsgemische wurden dem folgenden Reaktionsschema unterworfen:
Für 10, 15 oder 20 Zyklen: 96°C Denaturierung, 1 min
60°C Anheftung/Extension, 1,5 min
letzter Zyklus: 96°C Denaturierung, 1 min
60°C Anheftung/Extension, 5,5 min
Nach Durchlauf der Zyklen wurde das Mineralöl mit 50 μl Chloroform extrahiert, und die Proben wurden bei 4°C gelagert. Die Proben wurden anschließend mit einer 4% Acrylamidgel-Elektrophorese und einer homochromatischen Analyse analysiert.
Für die Acrylamidgel-Analyse wurden 4 μl jedes Reaktionsgemisches mit 3 μl von 5X Gel-Ladungsgemisch vermischt, auf ein 4% Acrylamidgel in 1X TBE Pufferlösung gegeben und der Elektrophorese für 90 Minuten bei 220 Volt ausgesetzt. Die DNA wurde nach Anfärbung mit Ethidiumbromid durch UV-Fluoreszenz sichtbar gemacht.
In den zu den Kontrollproben gehörenden Reihen, die keine M13mp10w Ziel-DNA enthielten, gab es keine sichtbaren Produkt-Banden, was die Abwesenheit aller Crossover-Verunreinigung von M13mp10w anzeigt. Alle folgenden Reihen zeigten eine Bande bei 350 Basen, entsprechend der erwarteten Sequenz. Die Intensität der Bande war größer, wenn 10^–2 pmol der M13mp10w Ziel-DNA vor 10^–3 pmol in Abwesenheit oder Anwesenheit von genomischer DNA (degradiert oder nicht degradiert) anwesend war. Die Intensität der Produkt-Bande wuchs mit steigender Anzahl der Amplifizierungszyklen. 20 Zyklen erzeugten eine Bande mit einer Intensität, die doppelt so stark wie nach 10 Zyklen zu sehen ist, und 15 Zyklen erzeugten eine Bande mit intermediärer Intensität. Die Menge der anwesenden PCR-Produkte variierte mit der Menge der Ziel-Matrize zu Beginn und der Anzahl der Zyklen, und die Anwesenheit von 1 μg menschlicher genomischer DNA, gleich ob degradiert oder nicht degradiert, zeigte keinerlei Auswirkung auf diese Produktbildung.
In der homochromatographischen Analyse wurden 1 μl von jedem Reaktionsgemisch punktförmig auf eine DEAE-Dünnschichtplatte aufgetragen und in eine Entwicklungskammer mit Homo-Mix III bei 70°C gestellt. Nach 90 Minuten wurde die Platte herausgenommen, getrocknet, mit Saran Wrap bedeckt und eine Autoradiographie durchgeführt. Eine Aufnahme über Nacht wird in 3 gezeigt; in 3A zeigen die Reihen 1 bis 6 PCR-Zyklen in Abwesenheit von M13mp10w DNA, die entweder degradierte oder nicht degradierte HL60-DNA nach 10, 15 und 20 Zyklen enthält; und die Reihen 7–12 sind doppelte Ladungskontrollreaktionen, die M13mp10w-Matrizen-DNA ohne menschliche genomische DNA nach 10, 15 und 20 Zyklen enthalten. In 3B werden die Reaktionsgemische über 5 zunehmende Zyklusanstiege, startend bei 10 Zyklen, amplifiziert. Die in den Reihen 1, 2, 5, 6, 9 und 10 gezeigte DNA-Konzentration der M13mp10w-Matrize in den Reaktionsgemischen ist 10^–2 pmol, während sie in den Reihen 3, 4, 7, 8, 11 und 12 10^–3 beträgt. Die in den Reihen mit ungeraden Nummerierungen von 1 bis 11 gezeigten Reaktionsgemische enthalten degradierte menschliche genomische DNA, und die gerade nummerierten Reihen enthalten nicht degradierte menschliche genomische DNA. Markierte Sondenfragmente waren als zwei gut definierte Punkte zu erkennen, die etwa über eine Länge von 4 und 5 Basen auf der Dünnschichtplatte gewandert waren. Wenn die Startkonzentration der Matrize erhöht wurde und/oder wenn die Anzahl der Zyklen erhöht wurde, stieg die Menge der freigesetzten markierten Sondenfragmente ebenfalls. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von degradierter oder nicht degradierter menschlicher genomischer DNA führte zu keiner Wechselwirkung mit oder Verstärkung von Hybridisierung und Abbau der Sonde.
Die Ergebnisse zeigen, dass ansteigende Mengen von freigesetzten, kleinen Sondenfragmenten koordiniert und gleichzeitig mit spezifischer Produktakkumulation während des Durchlaufens einer PRC-Untersuchung auftreten. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von entweder einer großen Menge hochkomplexer menschlicher genomischer DNA oder einer großen Anzahl von zufälligen DNA-"Enden" hat keinen Einfluss auf die spezifische Produktakkumulation oder den Grad der Sondenfreisetzung. Und schließlich führt die Anwesenheit einer großen Menge hochkomplexer menschlicher genomischer DNA zu keiner nachweisbaren Sondenfreisetzung in Abwesenheit von spezifischer Produktakkumulation.
Beispiel 4
PCR mit 3'-markierter Sonde
Es wurde eine PCR-Amplifizierung durchgeführt, die eine hybridisierte 3'-radiomarkierte Sonde in kleinere Fragmente freisetzte, wenn die Sonde an die Matrize angeheftet war. Die Sequenzen dieser Sonden waren wie folgt:
A. Markierung von Sonden mit 32P-Cordycepin und terminaler Transferase
Fünf pmol von jeder Sonde (DG46, BW32 und BW34) wurden einzeln mit 17,4 Einheiten terminaler Transferase (Stratagene) und 10 pmol [α-³²P]-Cordycepin (Cordycepin: 3'-Deoxyadenosin-5'-Triphosphat, New England Nuclear, 5000 Ci/mmol, 3X verdünnt mit ddATP [Pharmacia]) in einem 17,5 μl Reaktionsvolumen, dass 100 mM Kaliumcacodylat, 25 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM CoCl₂ und 0,2 mM Dithiothreitol bestand, für 60 Minuten bei 37°C gemischt. Das gesamte Volumen wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die Sonden wurden in 50 μl TE-Pufferlösung resuspendiert und man ließ sie nach dem Verfahren von Sambrook et al., Molecular Cloning, vorstehend, über eine Sephadex G-50 spin-Dialysesäule laufen. Die Endkonzentration der Sonden betrug 0,1 pmol/μl. TCA-Fällung der Reaktionsprodukte zeigte die folgenden spezifischen Aktivitäten:
DG46: 2,13 × 10⁶ cpm/pmol
BW32: 1,78 × 10⁶ cpm/pmol
BW34: 5,02 × 10⁶ cpm/pmol
Ein Vergleich der Denaturierungsgradienten-Gel-Analyse der 3'-radiomarkierten Sonden mit den Kinase-behandelten 5'-Sonden BW31, BW33 und BW35 zeigt, dass die 3'-radiomarkierten Sonden in ähnlicher Weise laufen wie die 5'-radiomarkierten Sonden.
Wiederum war die amplifizierte Region die 350-Basen-Region auf M13mp10w, definiert durch die Primer BW36 und BW42. Primer-Sequenzen und Lokalisierungen sind in Beispiel 1 aufgelistet. Jedes Amplifikationsgemisch wurde durch die Zugabe von 10³ pmol der M13mp10w-Ziel-DNA zu einem 50 μl-Reaktionsvolumen, bestehend aus 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl₂, je 10 pmol der Primer BW36 und BW42, je 200 μM der vier Desoxynucleosidtriphosphate, 1,25 Einheiten Taq DNA-Polymerase und entweder 2, 10 oder 20 pmol der Isotopen-verdünnten Sonden DG46, BW32, oder BW34, hergestellt.
Ein General-Reaktionsgemisch, das ausreichende Mengen an Reaktionspufferlösung, Nucleosidtriphosphaten Matrize und Enzym enthielt, wurde angesetzt. Aliquots wurden entnommen und zu ihnen wurden die geeigneten Mengen an Primern und Sonden hinzu gegeben. Kontrollreaktionsgemische beinhalteten alle Reaktionsbestandteile ausgenommen den Primern und alle Reaktionsbestandteile ausgenommen dem Sondenmaterial.
Die Reaktionsgemische wurde mit 50 μl Mineralöl überschichtet, mikrozentrifugiert und in einen Thermozykler gestellt. Das Amplifizierungsschema war wie folgt:
15 Zyklen: 96°C Denaturierung, 1 min
60°C Anheftung/Extension, 1,5 min
letzter Zyklus: 96°C Denaturierung, 1 min
60°C Anheftung/Extension, 5,5 min
Nach Durchlauf der Zyklen wurde das Mineralöl mit 50 μl Chloroform extrahiert, und die Proben wurden bei 4°C gelagert.
Die Proben wurden mit einem 4%igen Acrylamidgel, einem 8%igen Denaturierungsgradienten-Acrylamidgel und durch homochromatische Analyse analysiert. Bei allen drei Analysen war die Handhabung der Reaktionsgemische wie vorstehend beschrieben.
In der 4% Acrylamidgel-Analyse war eine scharfe Bande, zu dem gewünschten Produkt bei 350 Basen gehörend, in allen Reaktionsgemischen ausser den Kontrollreaktionsgemischen minus Primer sichtbar. In allen Reaktionsgemischen, die sowohl Primer als auch Sonde enthielten, war eine zweite Bande bei etwa 300 Basen sichtbar. Diese zweite Bande gewann mit steigender Sondenkonzentration an Intensität und gehört vermutlich zu Sondenmaterial, das entweder nicht wirksam am 3'-Ende radiomarkiert war oder die Radiomarkierung verloren hatte, was Sondenextension und Bildung eines Produktes zulässt.
Eine Aufnahme des 8% Denaturierungsgradienten-Acrylamidgels über Nacht zeigte eine Verteilung des Produkts, die von der vollständigen Sonde bis hinab zu weniger als 15 Basen nach dem Durchlauf aller drei Sonden reichte. Wie erwartet, degradierte die 5'-3'-Nuclease-Aktivität von Taq DNA-Polymerase die Sonde bis u einem Punkt, an dem die degradierte Sonde von der Matrize dissoziierte.
Die weite Größenverteilung von Produkten war kennzeichnend für die beständig wechselnden Konzentrationen von Reaktanten und Temperaturwechsel während der PCR-Zyklen. Solche Variationen würden zu Änderungen in der Anheftungskinetik von Sonde und Enzym führen, was der Sonde erlaubt, in einer Vielzahl von Größen zu unterschiedlichen Zeitpunkten in den Zyklusdurchläufen zu dissoziieren.
Die Homochromatographie-Platte zeigte, das das kleinste Produkt bei allen untersuchten Sonden eine Länge von etwa 10 bis 12 Basen hat. Da alle drei Sonden bis auf die 5'-Region eine identische Sequenz hatten, zeigt dieses Ergebnis, dass bei dieser bestimmten Sondensequenz bei einer Anheftungs/Extensions-Temperatur von 60°C die Sonde auf etwa 10 Basen degradiert wurde und dann von der Matrize dissoziierte.
Beispiel 5
Polymerisationsunabhängige 5'-3'-Nuclease-Aktivität von Taq DNA-Polymerase
Taq DNA-Polymerase war in der Lage, das 5'-³²P-markierte Ende einer hybridisierten Sonde frei zu setzen, wenn sie durch einen stromaufwärts gerichteten Primer in der Nachbarschaft zu dieser Sonde positioniert wurde. Eine Reihe von Primern wurde entworfen, um 0 bis 20 Basen stromaufwärts der hybridisierten, mit Kinase behandelten Sonde BW33 zu liegen. Diese Primer werden nachstehend gezeigt.
Etwa 0,5 pmol der Sonde BW33 und 0,5 pmol von je einem der Primer wurden in einem 10,5 μl Reaktionsvolumen, bestehend aus 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, und 3 mM MgCl₂, an 0,5 pmol M12mp10w angeheftet. Kontrollreaktionsgemische enthielten entweder 20 μM oder 200 μM von jedem der vier Desoxynucleosidtriphosphate. Es wurde ein zusätzlicher Primer, DG47, 530 Basen stromaufwärts der Sonde gelegen, verwendet.
Die Reaktionsgemische wurden für 1 min auf 98°C erhitzt und bei 60°c für 30 min angeheftet. Die Tubes wurden dann mikrozentrifugiert und in ein Wasserbad bei 70°C gestellt. Nach ausreichender Zeit, in der die Reaktionsgemische sich an die Temperatur anpassen konnten wurden 10, 5, 2,5, 1,25 oder 0,3125 Einheiten Tag DNA-Polymerase zugegeben und 4 μl-Aliquots wurden nach 2, 5 und 10 Minuten entnommen. Das Enzym wurde durch die Zugabe von 4 μl von 10 mM EDTA zu jedem Aliquot und Lagerung bei 4°C inaktiviert. Die Reaktionsgemische wurden mittels homochromatischer Analyse untersucht.
In der homochromatischen Analyse wurden 1 μl jeder Probe punktförmig auf DEAE-Zellulose-Dünnschichtplatten aufgetragen und in eine Homo-Mix III enthaltende Entwicklungskammer bei 70°C gestellt. Man ließ Homo-Mix zum oberen Rand jeder Platte wandern, worauf die Platten entfernt, getrocknet mit Saran Wrap bedeckt und einer Autoradiographie unterzogen wurden. 4 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments.
In 4 enthalten die Reihen 1 bis 3 radiomarkierte Markierungen für Oligonucleotid-Molekulargrößen von 6, 8, 9, 10, 11, 12 und 13 Nucleotide. Reihen 4–10 zeigen Reaktionen für die Primer BW37, BW38, BW39, BW40, BW41, BW42 beziehungsweise DG47 bei Abwesenheit von dNTPs. Reihen 11–24 zeigen Kontrollreaktionen für alle Primer in Anwesenheit von 20 mM oder 200 mM dNTP.
Bei Abwesenheit von dNTPs erzeugte die Taq DNA-Polymerase markierte Sondenfragmente aller Primer, wobei mit steigender Entfernung Primer-Sonde merklich weniger Markierung frei gesetzt wurde. Diese Wirkung wurde bei allen untersuchten Enzymkonzentrationen (0,3125 U bis 10 U/Reaktion) und allen Zeitpunkten beobachtet. Die Größe der Fragmente war die gleiche, etwa zwei und drei Basen Länge; die primäre Art variierte jedoch, abhängig davon, welcher Primer zugegeben wurde. Die hauptsächliche Art, die von den Delta-null- und Delta-zwei-Primern frei gesetzt wurde, war um eine Base kleiner als die von den Delta-eins-, Delta-fünf-, zehn- und 20-Primern freigesetzt wurden. Diese Nuclease-Aktivität war polymerisationsunabhängig und nachbarschaftsabhängig.
In Anwesenheit von Nucleosidtriphosphaten waren die Größe der freigesetzten Sondenfragmente und die relativen Proportionen der einzelnen identisch für alle untersuchten Primer. Auch war die Größe der Produkte um eine oder zwei Basen größer, wenn dNTPs anwesend waren. Es kann sein, dass das Enzym, während es polymerisiert wurde, einen „laufenden Start" hatte, und als es die hybridisierte Sonde erreichte, gleichzeitig eine oder zwei Basen ersetzte und dann schnitt, wodurch ein größeres Fragment erzeugt wurde.
Es gab keinen nachweisbaren Unterschied in der Menge frei gesetzter Produkte, wenn dNTPs mit je 20 μM oder 200 μM vorlagen, und es wurden keine signifikanten Unterschiede aufgrund von Extensionszeiten oder Enzymkonzentrationen bei der Anwesenheit von dNTPs beobachtet.
Beispiel 6
Beispiel zur Veranschaulichung der Natur von freigesetztem Produkt, basierend auf Sondensequenz am 5'-Ende
Der Einfluss von starker oder schwacher Basenpaarung an der 5'-komplementären Region einer Sonde auf die Größe des freigesetzten Produkts wurde untersucht. Zwei Sonden, BW50 und BW51 wurden so entworfen, dass sie entweder eine CG-reiche oder eine AT-reiche 5'-komplementäre Region trugen. BW50 und BW51 wurden mit der in Beispiel V verwendeten Sonde BW33 verglichen.
a, t, g, c = Basen, die nicht komplementär zum Matrizenstrang sind
BW50, BW51 und BW33 wurden mit ³²P-ATP unter Verwendung von Polynucleotid-Kinase markiert und hatten die folgenden Aktivitäten:
BW50: 1,70 × 10⁶ cpm/pmol
BW51: 2,22 × 10⁶ cpm/pmol
BW33: 1,44 × 10⁶ cpm/pmol
Die Endkonzentration von allen drei Sonden betrug 0.10 pmol/μl.
Je 0,5 pmol von den Sonden BW50, BW15 oder BW33 und 0,5 pmol des Primers BW42 wurden in einem Reaktionsvolumen von 10,5 μl, bestehend aus bestehend aus 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl₂ und je 200 μM der vier Desoxynucleosidtriphosphaten, an 0,5 pmol M13mp10w angeheftet. Kontrollproben enthielten alle Reaktionsbestandteile ausgenommen Matrize. Für den Anheftungsschritt wurden die Reaktionsgemische für 1 Minute auf 98°C erhitzt und bei 60°C für 30 Minuten angeheftet. Die Tubes wurden dann mikrozentrifugiert und in ein Wasserbad bei 50°C, 60°C oder 70°C gestellt. Nach ausreichender Zeit, in der die Reaktionsgemische sich an die Temperatur anpassen konnten, wurden 0,3125 Einheiten Taq DNA-Polymerase zugegeben. Vier-μl-Aliquots wurden nach 1, 2 und 5 Minuten entnommen. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 4 μl von 10 mM EDTA zu jedem Aliquot und Lagerung bei 4°C inaktiviert. Die Proben wurden mittels homochromatischer Analyse untersucht, und die Ergebnisse sind in den 5 und 6 gezeigt.
5 zeigt die Reaktionsgemische mit der CG-reiche Sonde BW50. Reihen 1–3 enthalten oligonucleotide Molekulargrößen-Markierungen aus 6, 8, 9, 10, 11, 12 und 13 Nucleotiden. Reihen 4–6 zeigen Extensionsreaktionen bei 60°C über 1, 2 und 5 Minuten. Reihen 10–12 zeigen Reaktionen bei 70°C über 1, 2 und 5 Minuten. Reihen 13–15 sind Kontrollreaktionen, die alle Bestandteile ausser Matrize enthielten, inkubiert bei 70°C über 1, 2 und 5 Minuten.
6 zeigt die Reaktionsgemische mit der AT-reichen Sonde BW51. Wie in 5 sind die Reihen 1–3 oligonucleotide Molekulargrößen-Markierungen aus 6, 8, 9, 10, 11, 12 und 13 Nucleotiden. Reihen 4–6 sind Extensionsreaktionen, durchgeführt bei 50°C über 1, 2 und 5 Minuten. Reihen 10–12 sind Reaktionen bei 70°C über 1, 2 und 5 Minuten. Reihen 13–15 sind Kontrollreaktionen, die alle Bestandteile ausser Matrize enthielten, inkubiert bei 70°C über 1, 2 und 5 Minuten.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Art der Freisetzung der Sondenmarkierung abhängig von der Temperatur und der Basenzusammensetzung am 5'-Ende war. Die stabilere GC-reiche Sonde BW50 zeigte geringe Freisetzung der Markierung bei 50°C (5, Reihen 4–6) und zunehmend mehr bei 60°C (5, Reihen 7–9) und 70°C (5, Reihen 10–12). Die meisten freigesetzten Produkte hatten eine Länge von etwa 3–5 Basen. BW51, das AT-reich am 5'-Ende war, zeigte bei 50°C (6, Reihen 4–6) genau so viel Freisetzung von Markierung, wie bei höheren Temperaturen beobachtet wurde. Zusätzlich erzeugte die AT-reiche Sonde größere Produkte als die GC-reiche Sonde. Die Basenzusammensetzung der AT-reichen Sonde kann die Möglichkeit für eine größere „Bewegungsfreiheit" geben, und auf diese Weise mehr Sondenablösung vor dem Schneiden zulassen, und bei niedrigeren Temperaturen als die GC-reiche Sonde.
Beispiel 7
HIV-Nachweisuntersuchung
Das Folgende ist ein Beispiel für die Verwendung einer doppelt markierten Sonde mit Biotin in einer PCR, um die Anwesenheit einer Zielsequenz nachzuweisen. Zwei Oligonucleotide, BW73 und BW74, jedes komplementär zu einem Abschnitt aus dem HIV-Genom, wurden mit einem Biotin-Molekül, das an dem 3'-Ende des Oligonucleotids befestigt war, synthetisiert. Das 5'-Ende jedes Oligonucleotids wurde zusätzlich mit ³²P unter Verwendung von Polynucleotid-Kinase und gamma-³²P-ATP markiert. Die beiden Oligonucleotide PH7 und PH8 sind ebenfalls komplementär zu dem HIV-Genom, flankieren die Region, die Homologie zu den beiden Sonden-Oligonucleotiden enthält und können als PCR-Primer, die ein 142 Basen-Produkt definieren, dienen. Die Sequenzen dieser Oligonucleotide sind nachstehend gezeigt.
In den Sequenzen ist „Y" ein Biotin, und kleine Buchstaben bezeichnen Basen, die nicht komplementär zu dem Matrizenstrang sind.
Es wurde ein Set von 50 μl Polymerase-Kettenreaktionen konsruiert, das entweder BW73 oder BW74, beide doppelt markiert, als Sondenoligonucleotide mit 2 nM enthielt. Zusätzlich wurde HIV-Matrize in Form eines Plasmid-Clons entweder mit 10² oder 10³ Kopien pro Reaktion zugegeben, und die Primer-Oligonucleotide PH7 und PH8 wurden mit je 0,4 μM zugegeben. Taq Polymerase wurde mit 1,25 Einheiten pro Reaktion zugegeben und dNTPs mit je 200 μl. Jedes Reaktionsgemisch wurde mit 50 μl Öl überschichtet, kurz in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um alle Flüssigkeiten am Boden des Tubes zu sammeln, und dann im Thermozykler zwischen 95°C und 60°C, mit Pausen von 60 Sekunden bei jeder Temperatur, über 30, 35 oder 40 Zyklen behandelt. Zum Abschluss der Thermozyklen wurde jedes Reaktionsgemisch mit 50 μl CHCl₃ extrahiert und die wässrige Phase behalten.
Jedes Reaktionsgemisch wurde auf Amplifizierung untersucht, indem 3 μl auf ein 5%iges Acrylamid-Elektrophoresegel gegeben und auf das erwartete 142 Basenpaare-Produkt untersucht wurde. Zusätzlich wurde 1 μl jedes Reaktionsgemisches mit TLC-Homochromatographie auf DEAE-Zelluloseplatten untersucht. Schließlich wurde jedes Reaktionsgemisch darüber hinaus analysiert, indem das verbleibende Volumen mit 25 μl einer 10 mg/ml Suspension von DYNABEADS M-280, Streptavidin-markierten, superparamagnetischen Polystyol-Perlen, in Kontakt gebracht wurde. Nach Reaktion mit den Perlen wurde das Gemisch durch Filtration durch einen Costar Spin X Zentrifugenfilter abgetrennt, das Filtrat gesammelt und die Anwesenheit von frei gesetzten Radiomarkierungen bestimmt.
7 enthält Abbildungen der beiden verwendeten Gels und zeigt, das das 142 Basenpaar-Produkt in allen Reaktionsgemischen, mit oder ohne Sonde, auftritt und in der Menge sowohl durch die Erhöhung der Startmatrize von 10² auf 10³ Kopien, als auch durch die Fortsetzung der Thermozyklen von 30 auf 35 und 40 Zyklen ansteigt.
8 ist eine Zusammenstellung von zwei Autoradiographien der TLC-Analyse von Aliquots der PCRs und zeigt, dass Freisetzung von Radiomarkierungen auftritt und sowohl durch Erhöhung der Startmatrize, als auch durch Verlängerung der Thermozyklen in ihrer Menge ansteigt. In der ersten TLC von PCRs mit Verwendung von BW73 enthalten die Reihen 1 und 3 radiomarkierte Oligonucleotide von 2 und 3 Basen Länge als Größenstandards. Die Reihen 4, 5 und 6 enthalten Proben von PCR mit 10² Startkopien der Matrize und die Reihen 7, 8 und 9 mit 10³ Startkopien. Die Proben in den Reihen 4 und 7 durchliefen 30 Zyklen im Thermozykler; in den Reihen 5 und 8 35 Zyklen; und in den Reihen 6 und 9 40 Zyklen. In der zweiten TLC von PCR mit Verwendung von BW74 sind die Reihen 1 und 2 die radiomarkierten 2mere und 3mere, die Reihen 4, 5 und 6 enthalten Proben von PCR mit 10² Startkopien der Matrize mit entsprechend 30, 35 und 40 Zyklen im Thermozykler, und die Reihen 7, 8 und 9 mit 10³ Kopien der Startmatrize mit entsprechend 30, 35 und 40 Zyklen im Thermozykler. Die Größe der frei gesetzten Markierung ist kleiner mit BW73, das keine 5'-nicht komplementären Basen hat, und größer mit BW74, das eine 5'- drei Basen nicht komplementäre Extension hat.
Jedes Chromatogramm wurde zusätzlich durch eine zweidimensionale Radioisotop-Abbildung mit einem Ambis-Counter analysiert. Die Ergebnisse der Ambis-Zählung und der Zählung der Perlenanlagerung werden in Tabelle 1 gezeigt. Die gute Übereinstimmung der beiden Verfahren bei der Messung der Freisetzung von Markierungen zeigt die einfache Durchführbarkeit der Verwendung von markierten, biotinylierten Sonden und avidinylierten Perlen in PCR, um die Produktbildung zu bestimmen.
Tabelle 1
Beispiel 8
Sondenmarkierung und Festphasen-Extraktant-Verfahren
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Trennschritt nach der Sondenabspaltung, aber vor der Bestimmung der Menge der abgespaltenen Sonde eingeführt, um abgespaltenen Sondenprodukte von ungespaltener Sonde zu trennen. Zwei verschiedene Trennverfahren werden bevorzugt: (1) die Verwendung von avidinylierten oder streptavidinylierten magnetischen Parikeln, um Sonden zu binden, die am 3'-Ende mit Biotin und am 5'-Ende mit einem Fluorophor markiert sind; die magnetischen Partikel binden sowohl die ungespaltene Sonde, als auch das 3'-Fragment, das das Produkt von Sondenabspaltung ist; und (2) die Verwendung von magnetischen Ionenaustauch-Partikeln, die Oligonucleotide binden, nicht aber Mono- oder Dinucleotide, die typischer Weise am 5'-Ende mit einem Fluorophor oder ³²P markiert sind. Verschiedene Aspekte dieser beiden Stategien werden nachstehend diskutiert.
A. Avidinylierte magnetische Partikel
Das Trennungssystem, das 3'-biotinylierte Sonden und magnetische, avidinylierte (oder streptavidinylierte) Perlen verwendet, wird vorzugsweise mit Perlen wie etwa Dynabeads^TM von Dynal durchgeführt; diese Perlen haben eine Biotin-Bindungskapazität von etwa 100 pmol pro 50 μl Perlen. Nicht spezifische Adsorption wird minimiert, indem die Perlen zuerst sowohl mit Denhardt-Lösung als auch mit Carrier-DNA behandelt werden.
Die Sonde für Trennverfahren mit Streptavidin-Biotin benötigt eine Biotin-Einheit am 3'-Terminus und einen Fluorophor am 5'-Terminus. Das 3'-Biotin dient sowohl als ein Ligand für die Trennung mit streptavidinylierten (oder avidinylierten) Perlen, als auch als eine Blockierung zur Verhinderung der Extension der Sonde während der Amplifizierung. Postsynthetische Modifikationen können vereinfacht werden, indem jedes Ende der Probe mit einem unterschiedlichen Nucleophil erweitert wird; zum Beispiel kann man ein Amin an das 3'-Ende zur Addition von Biotin und ein blockiertes Thiol an das 5'-Ende zur späteren Addition des Fluorophors anhängen. Die 3'-biotinylierten Sonden können auf eine Vielzahl von Arten hergestellt werden; von denen einige nachstehend erläutert werden.
Ein NHS-aktives Esterderivat von Biotin kann mit Hilfe des in 9 gezeigten Reaktionsmechanismus an das 3'-Amin der Sonde angefügt werden. Die resultierende Bindung erzeugt ein sekundäres Hydroxyl in gamma-Position zu dem Amidcarbonyl, was zu Instabilität während der wiederholten thermalen Zyklen in einer typischen PCR führen kann. Zum Beispiel können thermale Zyklen mit 40 Durchläufen bis zu 6% der anfänglich zugegebenen Sonde unfähig machen, an magnetische, avidinylierte Partikel zu binden. Wenn die Bindung zwischen der Sonde und dem angehängten Biotin infolge thermaler Zyklen zusammenbricht, kann die Sonde nicht mehr von den abgespaltenen Produkten unterschieden werden und trägt zum Hintergrund bei. Obwohl man dieses Problem zu überwinden helfen kann, indem man mehr als ein Biotin an die Sonde anfügt, können mehrere andere Verfahren zum Anfügen von Biotin an ein Oligonucleotid stabilere Produkte ergeben.
Man kann Biotinhydrazid mit Aldehyden, die von einer 3'-Ribose aus der Sonde erzeugt werden, reagieren lassen, um ein biotinyliertes Oligonucleotid zu erhalten. Für diese Strategie enthält das 3'-Nucleotid der Sonde einen Ribose-Zucker anstelle des Desoyxribose-Zuckers. Während der Synthese wird die 3'-Ribose entweder über ihr 2'- oder 3'-OH an den festen Träger gebunden. An die Synthese anschließend wird das ergänzte Oligonucleotid vom festen Träger frei gesetzt, und die benachbarten Diole der Ribose werden mit Natriumperjodat (NaIO₄) zu Aldehyden oxidiert, die dann mit dem Biotinhydrazid reagieren, wie in 10 gezeigt, und das Produkt wird mit Natriumborhydrid (NaBH₄) reduziert. Die resultierende biotinylierte Sonde bindet sich jedoch nicht wirksam an avidinylierte magnetische Partikel. Die Verwendung von Biotin-Langketten-Hydrazid, eine Verbindung, die ebenfalls in 10 gezeigt wird, kann dieses Problem lösen.
Man kann das Biotin während der Sondensynthese an die Sonde binden, indem man ein lösliches Biotin-Phosphoramidit verwendet, wie in 11 gezeigt. Die Synthese beginnt mit einer Base, die an kontrolliertes Porenglas (CPG) gebunden ist, welches vollständig ungeladen ist. Ein Phosphoramidit, das die Bildung eines 3'-Phospats unter Schutz von Ammoniumhydroxid des synthetischen Oligonucleotids ermöglicht, wird zugegeben. Das Biotin-Phosphoramidit wird dann zugegeben und das synthetisierte Oligonucleotid ist wie in 11 dargestellt, wo auch das Endprodukt gezeigt wird. Dieses Verfahren des Anfügens erlaubt die Verwendung von 5'-Amin-terminierten Oligonucleotiden zum Anfügen eines Fluorophors. Die Verwendung eines 3'-Amins zum Anfügen von Biotin begrenzt die Chemie des Anfügens eines Fluorophors auf 5'-Thiole. Benutzung eines Biotin-Phosphoamidits, in dem eines der Biotn-Stickstoffe blockiert ist, kann die Synthese der Biotin-markierten Sonde verbessern.
Man kann auch ein kommerzielles Reagenz verwenden, das aus direkt an Porenglas gebundenes Biotin enthält; Das Reagenz ist das Startsubstrat für die Sondensynthese und wird in 12 dargestellt. Dieses Anfügeverfahren erlaubt die Verwendung von 5'-Amin-terminierten Oligonucleotiden zum Anfügen eines Fluorophors. Die Verwendung eines 3'-Amins zum Anfügen von Biotin begrenzt die Chemie des Anfügens eines Fluorophors auf 5'-Thiole. Enzymatische Verfahren zur Anfügung modifizierter Nucleotide an die 5'-Enden von Oligonucleotiden sind ebenfalls verfügbar, jedoch in ihrer Generalität und Durchführbarkeit begrenzt.
B. Magnetische Ionenaustausch-Matrizes
Man kann käuflich zu erwerbende Polyethylenimin (PEI) Matrizes (Zellulose-, Silica- und Polyol-Polymer-basierende) Partikel verwenden, um abgespaltene von ungespaltener Sonde zu trennen. Zum Beispiel sind Hydrophase PEI, Selectacel^TM PEI, Bakerbond^TM PEI und Amicon PAE 300, 1000 und 1000L alles käuflich zu erwerbende PEI-Matrizes, die Trennung von ungespaltener Sonde von abgespaltenen Sondenprodukten ermöglichen.
Käuflich zu erwerbende aktivierte, magnetische Zellulosepartikel, wie etwa Cortex MagaCell^TM-Partikel, können mit PEIs verschiedener Länge, wie etwa PEI600, PEI1800 und PEI10.000, und mit unterschiedlichen molaren Verhältnissen von PEI pro Gramm Matrix derivatisiert werden. Alle Größen von Oligonucleotiden und Cumarin-markierte Oligonucleotide binden jedoch an magetische Zellulose- und Agarose-Perlen, gleich, ob sie mit PEI derivatisiert wurden oder nicht (die mit Oligonucleotiden auf käuflich zu erwerbenden PEI-Matrizes gefundene Spezifität geht verloren, wenn man die Oligonucleotide mit Cumarin markiert). Die Zugabe von hohen Konzentrationen von Salz (2,0 M NaCl) oder N-Methylpyrrolidon (10 bis 20%) erhöhen die Spezifität zum Teil, und andere Cosolvenzien, wie etwa SDS, Brij 35, Guanidin und Harnstoff können ebenfalls verwendet werden, die Spezifität der Bindung zu erhöhen. 8 M Harnstoff liefert jedoch eine wirkungsvolle Blockierung der nicht spezifischen Bindung von Cumarin-markierten Di- und Trinucleotiden sowohl an Bakerbond^TM PEI, als auch an magnetische Cortex^TM PEI derivatisierte Partikel, obwohl die Verwendung von N-substituierten Harnstoffen noch bevorzugter sein kann.
Wie vorstehend erwähnt, verkauft Cortex Biochem eine Reihe von aktivierten, mit Zellulose ummantelten magnetischen Partikeln, die an PEI gebunden werden können. Die Bekannteste von diesen ist die Periodat-aktivierte Matrix. Das vom Hersteller empfohlene Protokoll zur Bindung von Aminen an die Periodat-aktivierte Matrix birgt jedoch mehrere Probleme: die Reaktion eines Amins mit einem Aldehyd führt zu Iminen, die labil sind und hydrolysiert werden oder wiederum mit Aminen reagieren können; während des Schrittes zur Blockierung der verbleibenden Aldehyde durch die Zugabe von Ethanolamin im Überfluss, kann das PEI durch Ethanolamin ersetzt werden, wodurch das PEI von der Matrix entfernt wird; Während der Konjugationsreaktion unter Basisbedingungen kann Aldol-Kondensation zu einer Reaktion unter den Aldehydgruppen kommen, wobei es zu einer Aggregation der Partikel kommt; und die Reaktion von Aldehyden unter Basisbedingungen kann zu freien Radikalen führen, die die Zellulose angreifen können und an einer Vielzahl von Reaktionen teilnehmen können.
Um das Imin zu stabilisieren, kann ein Reduktionsschritt (mit NaBH₄ und NaBH₃CN) eingeschlossen werden; dieser Schritt kann jedoch zu der Produktion von Gas, ein Masseverlust für die Partikel, und Partikel-Agglutination führen. Diese unerwünschten Effekte können von der Produktion freier Radikale verursacht sein. Die Komplikationen durch die Bindung mit aktiven Aldehyden kann durch die Anwendung der Epoxid-Chemie vermieden werden. Die entstehenden Beta-Hydroxyamine sind stabil und erfordern keine Reduktion. Weil Sauerstoff bei der Erzeugung von freien Radikalen beteiligt sein kann, sollte das Entfernen von Sauerstoff aus dem System zusätzlich die Bildung von freien Radikalen minimieren, besonders während des Reduktionsschritts. Bei einer Synthese von PEI-derivatisierten, Zelllulose-ummantelten magnetischen Partikeln wurde der Blockierungsschritt mit Ethanolamin eliminiert, und das Erzeugnis wurde über Nacht vor und während der Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid mit Helium gereinigt. Es fand sich geringe Aggregation im fertigen Präparat.
Magnetische Polyacrolein-Partikel können sowohl mit PEI600, als auch mit Ethylendiamin derivatisiert werden, und die nicht spezifische Bindung von Cumarin-markierten Di- und Trinucleosiden kann durch hohe Konzentrationen von NMP verhindert werden. Die Verwendung von längerkettigen PEI-Polymeren kann nicht spezifische Rückrat-Interaktionen mit kleinen, Cumarin-markiereen Oligonucleotiden maskieren.
Ein wichtiger Faktor bei der Auswahl einer magnetischen Matrix zum Gebrauch in dem gegenwärtigen Verfahren ist die Höhe der von der Matrix stammende Hintergrundfluoreszenz. Eine Strategie zur Minimierung dieser Hintergrundfluoreszenz besteht darin, Fluorophoren mit Anregungs- und Emissionsmaxima auszuwählen, die sich möglichst gering mit dem Hintergrundfluoreszenzspektrum von Pufferlösunglösung, Matrix und klinischen Proben überschneiden. Zusätzlich kann der fluoreszierende Hintergrund von der Anwesenheit von Kontaminanten in der Matrix stammen, die durch gründliche Vorbehandlung vor der Bindung entfernt werden könnten.
C. Chemie der Bindung des Fluorophors an die Sonde
Wie vorstehend erwähnt, ist die bevorzugte Markierung für eine Sonde, ohne Berücksichtigung der Trennungsstrategie, ein Fluorophor. Es scheint eine Wechselwirkung zwischen dem Sonden-Oligonucleotid und dem angefügten Fluorophor zu geben. Diese Wechselwirkung könnte für das beobachtete Quenschen verantwortlich sein, das beobachtet wird, wenn Fluorophore an Oligonucleotide angefügt worden sind. Man sollte Flourophoren auswählen, die nur minimal mit der DNA in Wechselwirkung treten, wenn sie an den 5'-Terminus einer Nucleinsäure angefügt werden.
Drei bevorzugte Fluorophoren sind 7-Diethylamino-3-(4'-maleimidylphenyl)-4-methyl-Cumarin (CPM), 6-(Bromomethyl)Fluorescin (BMF), Luzifergelb-Iodoacetamid (LYIA) und 5-(und 6-)Carboxy-X-Rhodaminsuccinimidylester, wobei CPM aufgrund zahlreicher Eigenschaften bevorzugt wird: großer Extinktionskoeffizient, große Quantum-Ausbeute, geringes Ausbleichen und breite Stokes-Shift. Der Fluorophor kann durch ein Thiol angefügt werden, der an die 5'-Phosphatgruppe der Sonde gebunden ist, aber in dem Fall von CPM bildet dieser Prozess ein Arylmaleimid, das unter thermozyklischen Bedingungen instabil sein kann.
Eine Reihe von kommerziellen Instrumenten stehen für die Analyse von fluoroszenzmarkierten Materialien zu Verfügung. Zum Beispiel kann der ABI Gene Analyzer verwendet werden, um attomole Quantitäten von DNA, gekennzeichnet mit Flurophoren wie ROX (6-Carboxy-X-Rhodamin), Rhodamin-NHS, TAMRA (5/6-Carboxytetramethyl-Rhodamin-NHS) und FAM (5'-Carboxyfluorescein-NHS), zu analysieren. Diese Verbindungen werden über eine Amidbindung mit einem 5'-Alkylamin der Sonde an die Sonde gebunden. Andere nützliche Flurophoren umschließen CNHS (7-Amino-4-methyl-Cumarin-3-Essigsäure, Succinimidylester), der ebenfalls über eine Amidbindung angefügt werden kann.
Modifizierungen in dem Markierungsprozess können notwendig sein, um wirksame Bindung eines gegebenen Fluorophors an ein bestimmtes Sonden-Oligonucleotid zu erreichen. Zum Beispiel war die Anfangsreaktion zwischen einer 5'-Amin-terminierten Sonde und einem 7-Diethylaminocumarin-3-Carboxylat-NHS-Ester sehr ineffizient. Die Sonde, die am 3'-Ende phosphoryliert worden war, um Extension der Sonde während der Amplifizierung zu verhindern, hatte eine signifikante Sekundärstruktur, wobei eine dieser Konformationen das 5'-Amin und das 3'-Phosphat dicht genug zusammenbrachte, um eine Salzbrücke auszubilden. Diese Struktur könnte das 5'-Amin daran gehindert haben, für die Reaktion mit dem NHS-Ester zur Verfügung zu stehen, auf diese Weise die geringe Ausbeute an Produkten verursachend. Zugabe von 25% N-Methylpyrrolidinon (NMP) verbesserte den Wirkungsgrad der Reaktion wesentlich.
Man kann auch sowohl einen Fluorophor, als auch ein quenchendes Agens verwenden, um die Sonde zu markieren. Wenn die Sonde intakt ist, wird die Fluoreszenz des Fluorophors vom Quencher gequencht. Währende des vorliegenden Verfahrens wird die Sonde zwischen dem Fluorophor und dem Quencher gespalten, wodurch die volle Expression der Fluoreszenz des Fluorophors ermöglicht wird. Quenchen erfordert Transfer von Energie zwischen dem Fluorophor und dem Quencher, das Emissionsspektrum des Fluorophors und das Absorptionsspektrum des Quenschers müssen sich überschneiden. Eine bevorzugte Kombination für diesen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist der Fluorophor Rhodamin 590 und der Quencher Kristallviolett.
Eine solche Sonde wird in 13 dargestellt. Die Synthese dieser Konstruktion erfordert die Bindung eines Rhodaminderivats durch einen 5'-Thiol und die Bindung von Kristallviolett durch ein aus einem zwei Basen entfernten Thymidin hervorstehendes Amin. Die Trennung von den beiden Einheiten durch zwei Phosphodiester-Bindungen erhöht die Chancen für eine Spaltung durch die DNA-Polymerase zwischen ihnen.
Anfängliche Versuche, das Kristallviolett über eine Reaktion zwischen einem Lacton und einem Amin zu binden, waren nicht erfolgreich. Das Kristallviolett wurde modifiziert, um ein aktives Acylazid zu erzeugen, dargestellt in 14. Diese Form des Kristallviolett ließ man mit Amin-modifizierter DNA reagieren, und das gewünschte Produkt wurde mit einer Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
Versuche, die Rhodamin-X-Maleimid-Gruppe mit dem 5'-Thiol reagieren zu lassen, waren nicht erfolgreich. Dies war auch der Fall, wenn man das Rhodamin-X-Maleimid vor der Addition des Kristallviolett reagieren ließ. Dies kann so sein, weil der deblockierte 5'-Thiol mit der Acrylamid-Doppelbindung in dem Thymidin-Seitenarm (vgl. 13) reagiert. Ein anderes Verfahren zur Addition eines Amins an das Thymidin ist in 15 dargestellt.
Dieses Beispiel zeigt generelle Gültigkeit für die Anfügung eines Biotin an das 3'-Ende eines Sonden-Oligonucleotis und eines Fluorophors an das 5'-Ende eines Sonden-Oligonucleotis. Fachleute auf dem Gebiet werden zur Kenntnis nehmen, dass eine Reihe von Verfahren für solche Anfügungen in der Fachwelt bekannt sind, und dass die vorliegende Erfindung nicht auf das im Einzelnen gewählte Verfahren zur Markierung der Sonde beschränkt ist.
Beispiel 9
Protokoll für AmpliWax^TM-vermittelte PCR mit UNG und dUTP
Der PCR-Prozess kann im Hinblick auf die Spezifität der Amplifizierung durch Verfahren und Reagenzien, die ausführlicher in der PCT-Patentanmeldung, Seriennr. 481.501, eingereicht am 16. Februar 1991, PCT-Patentanmeldung, Seriennr. PCT/US 91/05210, eingereicht am 23. Juli 1991, und der US-Patentanmeldung, Seriennr. 557.517, eingereicht am 24. Juli 1990 beschrieben sind, verbessert werden. Die Veröffentlichungen dieser Patentanmeldungen sind durch Referenz hierin eingeschlossen, und das folgende Protokoll zeigt, wie diese verbesserten PCR-Verfahren in Verbindung mit dem vorliegenden Verfahren für hervorragende Ergebnisse eingesetzt werden können. Alle Reagenzien können von Perkin-Elmer Cetus Instruments (PECI, Norwalk, CT) bezogen werden.
Dieses Protokoll betrifft wesentlich drei Bestandteile: MikroAmp^TM-Tubes, die dNTPs, Primer, Magnesium und Tris mit Wachs abgedeckt enthalten; Premix B, zu dem AmpliTaq^® DNA-Polymerase und UNG zugegeben wird (und daher das Enzymgemisch genannt wird); und Premix C, zu dem die Testprobe und Sonde zugegeben wird. Das Enzymgemisch und die Testprobe mit Sonde werden hergestellt und über die Wachsschicht zugegeben. Die Tubes werden dann in einen TC9600 Thermozykler gestellt und durchlaufen die Thermozyklen. Das nachstehende Protokoll geht von einem 50 μl-Reaktionsvolumen mit Testproben von nicht mehr als 27 μl aus, und die Zielsequenz ist HIV.
Die Reagenzien werden vorzugsweise wie folgt hergestellt: MicroAmp^TM-Tubs mit 12,5 μl Premix A und einem 12 mg AmpliWax^TM PCR-Kügelchen pro Tube werden hergestellt. Premix A enthält 1 μM SK145-Primer und 1 μM SK431-Primer (keiner der Primer ist biotinyliert), 800 μM dATP, 800 μM dGTP, 800 μM dCTP, 800 μM dUTP, 15 mM MgCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Das AmpliWax^TM-Kügelchen besteht aus einem bei 55°C schmelzenden Paraffin (Aldrich Chemical Co.), das 0,15% Tween 65 enthält, und das Wachskügelchen und die Premix A-Bodenschicht werden in einen DNA-freien Raum zusammen gegeben. Das Wachskügelchen wird dann geschmolzen, um eine Verdunstungsbarriere am oberen Rand zu bilden. Diese Barriere wird seine Integrität behalten, wenn die Tubes bei 4 bis 25°C gelagert werden, und die PCR-Reagenzien unterhalb der Barriere sind bei 4°C für Monate lagerungsstabil. Es gibt keine Mischung mit Material, das oberhalb der Barriere zugegeben wird, bis das Wachs während der Anfangsstufen der thermalen Zyklen geschmolzen ist. Kontroll-Tubes sind identisch, enthalten aber keinen Primer.
Premix B-Pufferlösung enthält 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, und 50 mM KCl und wird für die Verdünnung der Enzyme AmpiTaq^® DNA-Polymerase und UNG verwendet. Etwa 2,6 μl Premix B Pufferlösung werden pro Reaktion gebraucht.
Premix C Pufferlösung wird als 10X-Konzentrat hergestellt, das 105 mM Tris-HCl, pH 8,3, und 715 mM KCl enthält, und wird zur Test-DNA-Probe gegeben, so dass die Endkonzentrationen von Tris und KCl in der letzten Reaktion entsprechend 10 mM und 50 mM betragen. Die Sonde wird ebenfalls in dieser Schicht zugegeben, wie auch die Carrier- DNA, falls vorhanden. Wenn Plasmidkontrollen durchgeführt werden, wird gewöhnlich 1 μg menschlicher Plazenta-DNA (1 μg/μl in 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA und 10 mM NaCl, die geschoren, Phenol/Chloroform-extrahiert, Chloroform-extrahiert und Ethanol-gefällt wurde) pro Reaktion als Carrier-DNA zugegeben.
Die Sonde wird als 5 μM-Ausgangslösung angesetzt und als LG101C bezeichnet. Sonde LG101C hat ein 3'-Phosphat, um die Extension einer Sonde zu verhindern, und ein 7-Diethylaminocumarin-3-Carboxylat über eine Amid-Bindung an eine 5'-Aminoaliphatische Gruppe auf dem Oligonucleotid gebunden. Die Nucleotidsequenz der Sode ist nachstehend angegeben:
Diese Sonde sollte bei –20°C im Dunkeln gelagert werden.
AmpliTaq^® DNA-Polymerase wird in einer Ausgangskonzentration von 5 U/μl von PECI geliefert, und UNG wird in einer Ausgangskonzentration von 1 U/μl vom selben Händler geliefert. Man kann auch Plasmid-Kalibrierungsproben bearbeiten, und für diesen Zweck ist die Herstellung von Ausgangsverdünnungen (Kopien/ml) von 300, 1000, 3000, 30.000, 100.000 und 1.000.000 mit GeneAmplimer^TM Positiv Controll DNA hilfreich. Diese DNA besteht aus dem HIVZ6-Genom, neu geordnet, um die pol-Region zu unterbrechen und so Infektivität zu blockieren, in das Plasmid pBR322 insertiert.
Jedes fertige Reaktionsgemisch wird aus 12,5 μl Premix A, 2,6 μl Premix B, 3,3 μl Premix C, 2 μl der Sonde LG101C, 27 μl der Testprobe, 0,4 μl AmpliTaq^® DNA-Polymerase und 2 μl UNG bestehen, was ein Endvolumen von 49,8 μl ergibt. Dieses Gemisch enthält 250 nM von jedem Primer, 200 μM von jedem dNTP, 3,75 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 200 nM Sonde, 2 Einheiten UNG und 2 Einheiten Polymerase.
Um die Reaktion ablaufen zu lassen, stellt man zunächst das Enzymgemisch unter einer DNA-freien Haube oder einem DNA-freien Raum her, indem man pro Reaktion 2,6 μl Premix B-Pufferlösung, 0,4 μl AmpliTaq^®-DNA-Polymerase und 2 μl UNG zusammen micht. Für alle 16 Reaktionen, die durchgeführt werden solen, sollte man genug Enzymgemisch für 18 Reaktionen herstellen, um ausreichend Material sicher zu stellen. Das Enzymgemisch wird dann zu jedem MicroAmp-Tube, der das mit Wachs verschlossene Premix A enthält, unter einer DNA-freien Haube oder in einem DNA-freien Raum über das Wachs gegeben. Eine einzelne Probennehmerspitze kann für alle Transfers ausreichen, und 5 μl Enzymgemisch werden zu jedem Tube zugegeben.
Im Bereich für die Probenherstellung wird das Probengemisch durch Vermischen von 3,3 μl von 10X Premix C Pufferlösung, 27 μl Probe (für Quantifizierungskontrollen 10 μl Ausgangsverdünnung und 17 μl Wasser zugeben) und 2 μl Sonde (Carrier-DNA, falls vorhanden, wird mit der Probe vermischt) pro Reaktion hergestellt. Dann werden mit einer neuen Probennehmerspitze für jeden Transfer 32,3 μl Probengemisch zu jedem Tube gegeben; die Volumenungleichheit zwischen Enzymgemisch und Probengemisch sichert vollständige Durchmischung. Man sollte auch zwei Kontroll-Tubes ohne Primer ansetzen, die als ein Maß für Sondenspaltung durch die Thermozyklen dienen. Diese Kontrolle enthält typischer Weise 1.000 Kopien der Kontrollmatrize. Zusätzlich sollte man eine Verdünnungsreihe vom Plasmid ansetzen, um die Untersuchung zu kalibrieren. Diese Kalibrierung liegt typischer Weise im Bereich von 3 bis 10.000 Kopien von HIV-Zielsequenz pro Probe. Wenn die vorstehenden Schritte abgeschlossen sind, werden die Tubes verschlossen und im TC9600-Gestell gesammelt.
Das Thermozykler-Profil ist wie folgt: 1 Zyklus bei 50°C für 2 Minuten; 5 Zyklen bei 95°C für 10 Sekunden; 55°C für 10 Sekunden und 72°C für 10 Sekunden; und 35 Zyklen bei 90°C für 10 Sekunden, 60°C für 10 Sekunden und 72°C für 10 Sekunden. Wenn die Thermozyklen durchgelaufen sind, werden die Tubes aus dem TC9600 heraus genommen und bei –20°C gelagert, wenn erforderlich. Längeres Einweichen der Tubes bei über 70°C ist nicht zu empfehlen, und alkaline Denaturierung sollte nicht angewendet werden.
Eine Reihe von Kontrollen ist hilfreich, einschließlich einer-Kontrolle ohne-Matrize, um die Verunreinigung der Reaktionsgemische, als auch die Amplifizierung von nicht spezifischen Produkten zu bestimmen, die aus der Sondenspaltung hervorgehen und nicht spezifische Signals geben können; einer ohne-Primer-Kontrolle als ein Maß für nicht-amplifizierungsabhängige Spaltung der Sonde, die zum Hintergrund beitragen könnte (man könnte auch einige klinische Proben in die Tests einschließen, um die Anwesenheit von Bestandteilen nachzuweisen, die aus der Sondenspaltung hervorgehen könnten); und Quantifizierungskontrollen.
Um das PCR-Produkt unter der sich nach der Amplifizierung nach dem vorstehenden Protokoll bildenden Wachsschicht hervor zu holen, kann man die Probe entnehmen, nachdem man eine Probennehmerspitze durch das Zentrum der Wachsschicht gestoßen hat, indem man die Spitze langsam und mit sanftem Druck einführt, um die Möglichkeit zu minimieren, dass das Reaktionsgemisch an der Spitze vorbei spritzt und das ganze Labor verunreinigt. Führen des Probennehmers mit einem Finger der Hand, die den Reaktions-Tube hält, steigert die Kontrolle wesentlich. Schlanke Probennehmerspitzen (zum Laden von Gel) durchstoßen das Wachs extrem gut. Eine schneidende Bewegung anstatt einer stechenden Bewegung erleichtert das Durchdringen ebenfalls und hilft sicher zu stellen, dass die Spitze nicht mit Wachs verstopft. Wenn die Spitze ein Stück Wachs aufspießt, kann das Wachs normaler Weise durch sanftes Reiben an dem verbliebenen Wachs entfernt werden.
Man kann die Reaktions-Tubes auch einfrieren, (z. B. in Trockeneis-Ethanol oder über Nacht in einer Tiefkühltruhe), sie auftauen und kurz in einer Mikrozentrifuge schleudern (Winkelrotor). Die Wachsschicht wird tief aufgebrochen sein, was Eindringen des Probennehmers ohne jede Gefahr einer Verstopfung gestattet. Wachsfragmente können von der Probennehmerspitze gegen die innere Wand des Tubes abgestreift werden. Dieses Verfahren ist besonders für Wechsel-probennehmer geeignet, die oft so dicke Spitzen haben, dass das direkte Durchstoßen der Wachsschicht nur schwer möglich ist. Keine der vorstehenden Methoden sollte das Wachs so vollständig von der entfernten Probe ausschließen, dass die Chloroform-Extraktion unnötig ist.
Obwohl die vorliegende Erfindung zum Zweck der Erläuterung in einiger Genauigkeit beschrieben wurde, wird es für Fachleute offensichtlich sein, dass mögliche praktizierte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Bereichs der anhängenden Ansprüche liegen.
Beispiel 110
Festphasen-Extraktion mit Bakerbond^TMPEI
Dieses Beispiel liefert ein Protokoll zur Untersuchung eines PCR-Gemisches, in dem die Amplifizierung in Gegenwart einer fluoreszent-markierten (ein Cumarin-Derivat) Sonde nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde.
Die Herstellung bestimmter Ausgangsreagenzien erleichtert die Anwendung dieses Protokolls. Ein solches Reagenz sind Eppendorf-Tubes, die 50 mg vorgewaschener Bakerbond PEI-Matrix enthalten. Die Bakerbond^TM PEI kann von J. T. Baker (Produkt Nr. 7264-00) bezogen werden und ist eine Silica-basierende, 40 μm Partikelgröße, 275 Angstrom Porengröße. Die Matrix wird vorbereitet, indem sie zuerst mit Wasser, dann Ethanol, dann Wasser und dann einem Gemisch aus 10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 2 M NaCl und 8 M Harnstoff gewaschen und dann mit 10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl und 8 M Harnstoff äquilibriert wird. Nach der Verteilung werden 15 μl Wasser zu jedem Tube zugegeben, um die Matrix feucht zu halten. Die Tubes sollten bei 4°C gelagert werden.
Die Bindungspufferlösung kann ebenfalls als Ausgangslösung hergestellt werden, und Zusammensetzung ist 10 mM Tris, pH 8, 500 mM NaCl, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, und 8 M Harnstoff. Die Bindungspufferlösung sollte bei 4°C gelagert werden, obwohl die Harnstoff bei dieser Temperatur ausfällen kann. Die Bindungspufferlösung kann vor Gebrauch kurz aufgewärmt werden, um die Harnstoff zu resuspendieren.
Bestimmtes Handwerkszeug ist nützlich bei der Durchführung dieses Protokolls. Während des Bindungsschrittes sollten die Tubes durchmischt werden, um die Matrix in der Suspension zu halten, und ein Vortex Genie 2 Schüttler (zu beziehen von Fischer Scientific, Kat. Nr. 12-812, mit Halterung für 60 Mikrotubes, Kat. Nr. 12-812-B) ist für diesen Zweck hilfreich. Zusätzlich sind auch eine Eppendorf-Mikrofuge, ein Hitachi-Spectrofluorometer, Modell 2000, und Mikrofluorimeter-Quarzküvetten mit 2 mm innerer Weite, und 2,5 mm Basis-Pfadlänge (zu beziehen von Starna Cells, Inc., Nr. 18F Q 10 mm 5) nützlich für die Durchführung dieses Protokolls.
Angemessene Kontrollen sollten ebenfalls durchgeführt werden, und der Bindungsschritt erfordert drei Kontrollen. Die Kontrolle der Hintergrundfluoreszenz bedingt die Herstellung einer Probe, die alle Bestandteile der PCR-Amplifizierung ausser Sonde enthält. Die Kontrollprobe sollte identisch mit den aktuellen Testproben behandelt werden, indem 20 μl zur Matrix gegeben werden und die auftretende Fluoreszenz im Überstand gemessen wird. Diese Kontrolle ermöglicht einen Weg, Hintergrundfluoreszenz zu messen, die in Matrix, Bindungspufferlösung, und bei einigen Bestandteilen in dem PCR-Amplifizierungsgemisch auftritt und liefert ebenso ein Maß für die Höhe der Fluoreszenz, die in klinischen Proben auftritt.
Die zweite Kontrolle liefert ein Maß für den unabwendbaren Sonden-Zusammenbruch und für die Bindungsreaktion und besteht aus einem Schein-PCR-Amplifizierungsgemisch, dass alle Bestandteile einschließlich Sonde enthält, aber nicht den thermalen Zyklen unterworfen wird. Die Kontrollprobe sollte identisch mit den aktuellen Testproben behandelt werden, indem 20 μl zur Matrix zugegeben werden und die Fluoreszenz im Überstand gemessen wird. Diese Kontrolle liefert einen Weg zur Messung der Anwesenheit von Sonden-Zusammenbruch während der Lagerung, als auch der Wirksamkeit der Bindungsreaktion. Wenn kein Zusammenbruch auftreten sollte, und wenn die Bindungsreaktion vollständig ist, sollte die Fluoreszenz des Überstandes nach der Bindung an Bakerbond^TM PEI ähnlich der des Hintergrundes sein, die in der ersten Kontrolle gemessen wurde.
Die dritte Kontrolle liefert einen Weg zur Messung der Ausgangsmenge der Sonde. Die Probe, die für die zweite Kontrolle hergestellt wurde, kann für diese Messung verwendet werden. In diesem Fall werden jedoch 20 μl zu einem Tube zugegeben, der 290 μl Bindungspufferlösung ohne Matrix enthält. Diese Kontrolle kann verwendet werden, die Ausgangsmenge der Sonde zu bestimmen.
Um mit dem Protokoll zu beginnen, bestimmt man zuerst die Anzahl der benötigten Bindungs-Tubes; diese Anzahl ist die Summe aus Testproben und Kontrollen. Die Kontrollen sind eine Kontrolle ohne Matrize. Eine Kontrolle ohne Primer, Kalibrierungskontrollen und die erste und zweite der vorstehend diskutierten Kontrollen. Die Kontrollen können in dreifacher Ausführung durchgeführt werden. Zu jedem Tube gibt man 235 μl Bindungspufferlösung.
Man stellt auch einen Tube zur Messung der Ausgangsmengen her, indem man in einen leeren Eppendorf-Tube zusammengibt: 290 μl Bindungspufferlösung, was dem Volumen in den Tubes mit Matrix äquivalent ist (235 μl Bindungspufferlösung, 15 μl Wasser und 40 μl durch das Matrix-Volumen). Die Bestimmung der Ausgangsmengen kann in dreifacher Ausführung durchgeführt werden.
Zu den Matrix enthaltenden Tubes (die Testproben und die ersten und zweiten Kontrollen) gibt man 20 μl der Probe. Zu den Pufferlösung enthaltenden Tubes (die dritte Kontrolle) gibt man 20 μl Schein-PCR-Amplifizierungsgemisch. Die Proben werden dann auf einem Vortex Genie 2 Schüttler auf Stufe 4 bei Raumtemperatur für 30 Minuten gemischt. Die Tubes werden dann in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge (16.000 × g) für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die oberen 200 μl des Überstands von jedem Tube werden entfernt, ohne das Pellet oder die Matrix, die sich an der Wand des Tubes befindet, zu zerstören, und in einen sauberen Eppendorf-Tube gegeben.
Die Fluoreszenz des Überstands wird mit einem Hitachi Modell 2000 in den vorstehend beschriebenen Küvetten gemessen. Für Sonden, die mit 7-Diethylamino-3-(4'-maleimidophenyl)-4-methyl-Cumarin markiert sind, wird das Spektrofluorometer wie folgt eingestellt: PM-Spannung beträgt 700 V; die Anregungswellenlänge ist 432 nm; die Emissionswellenlänge ist 480 nm; Die Schlitzweite für die Anregung beträgt 10 nm; und die Schlitzweite für die Emission beträgt 20 nm. Man sollte die Exposition der Probe in dem anregenden Licht minimieren; wenn die Probe für einen längeren Zeitraum im Spektrofluorometer bleiben soll, sollte der Verschluss geschlossen sein.
Die Anzahl der pMol der gespaltenen Sonde ist der gebräuchlichste Weg, die Höhe des Signals zu bewerten. Um die Hohe des Signals zu bewerten, muss man daher erst das Ausgangssignal von der dritten Kontrolle mit der folgenden Rechnung bestimmen:
In dieser Formel korrigiert die Subtraktion alle Hintergrundfluoreszenz in den Testproben; 310/20 ist der Verdünnungsfaktor; und 10 pmol ist die Menge der zu den PCR-Amplifikationen gegebenen Sonde.
Die Höhe des Testprobensignals wird durch die folgende Formel berechnet:
Das vorstehende Protokoll kann entsprechend des jeweiligen, zur Markierung der Sonde verwendeten Fluorophors modifiziert werden und dient hauptsächlich der Erläuterung der Erfindung.
16 zeigt typische Ergebnisse und das Verhältnis von Signal zu Menge der Ausgangs-Zielsequenz für das vorliegende Verfahren unter Verwendung von Bakerbond^TM PEI Festphaasen-Extraktant.
Sequenzprotokoll

Claims

Markiertes Oligonucleotid, welches eine Sequenz enthält, die komplementär zu einem Bereich einer Zielnucleinsäuresequenz ist, wobei das markierte Oligonucleotid am 3'-Ende blockiert ist, um den Einbau des markierten Oligonucleotids in ein Primerverlängerungsprodukt zu verhindern, und wobei das Oligonucleotid zwei Markierungen umfasst, wobei die Markierungen durch eine für eine Nuclease geeignete Spaltstelle getrennt sind.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei das Blockieren durch Hinzufügen einer chemischen Einheit an die 3'-Hydroxylgruppe des letzten Nucleotids erreicht wird.
Oligonucleotid nach Anspruch 2, wobei die chemische Einheit nicht auch als eine Markierung für den nachfolgenden Nachweis dient.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei das Blockieren durch Entfernen der 3'-OH-Gruppe des letzten Nucleotids oder durch Verwenden eines Nucleotids, bei welchem die 3'-OH-Gruppe fehlt, erreicht wird.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei die Markierung aus Fluoreszenzfarbstoffen ausgewählt ist.
Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Oligonucleotid ein Paar interaktiver, signalerzeugender Markierungen umfasst, welche so wirksam an dem Oligonucleotid positioniert sind, dass sie die Erzeugung eines nachweisbaren Signals quenchen.
Oligonucleotid nach Anspruch 6, wobei eine der Markierungen ein Fluorophor und die andere ein Quencher ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 7, wobei das Fluorophor Rhodamin oder ein Derivat davon enthält.