DE69132521T3 - Homogenes testsystem - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Nucleinsäurechemie. Genauer gesagt betrifft sie die Verwendung der 5'- zu 3'-Nuclesaseaktivität einer Nucleinsäurepolymerase zum Abbau markierter Oligonucleotide in einem hybridisierten Duplexmolekül, das aus dem markierten Oligonucleotid und einer Ziel-Oligonucleotidesequenz aufgebaut ist, und zur Bildung nachweisbarer, markierter Fragmente.
  • Mikrobiologische Techniken aus der Forschung werden routinemäßig bei diagnostischen Tests angewendet. Zum Beispiel offenbart das US-Patent Nr. 4,358,535 ein Verfahren zum Nachweis eines Pathogens mittels Aufbringung einer Probe (z.B. Blut, Zellen, Speichel, usw.) auf einem Filter (z.B. Nitrocellulose), Lyse der Zellen und Fixierung der DNA durch chemische Denaturierung und Erhitzen. Dann werden markierte DNA-Sonden zugegeben, und die Hybridisierung mit der fixierten Proben-DNA wird zugelassen, wobei die Hybridisierung die Anwesenheit der DNA des Pathogens anzeigt. Die Proben-DNA kann in diesem Fall durch Züchten der Zellen oder Organismen auf der Stelle auf dem Filter amplifiziert werden.
  • Eine deutliche Verbesserung bei der DNA-Amplifikation, das Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Verfahren, wird in den US-Patenten Nr. 4,683,202; 4,683,195; 4,800,159 und 4,965,188 offenbart. In seiner einfachsten Form ist die PCR ein in vitro-Verfahren zur enzymatischen Synthese von spezifischen DNA-Sequenzen unter Verwendung von zwei Oligonucleotidprimern, die an gegenläufige Stränge binden und den Bereich von Interesse in der Ziel-DNA flankieren. Eine wiederholte Serie von Reaktionsschritten, die die Denaturierung der Matrize, die Anlagerung der Primer und die Verlängerung der angelagerten Primer durch DNA-Polymerase umfassen, resultiert in einer exponentiellen Akkumulation eines spezifischen Fragments, dessen Enden durch die 5'-Enden der Primer bestimmt sind. PCR ist in der Lage, eine selektive Anreicherung einer spezifischen DNA-Sequenz um den Faktor 109 zu produzieren. Das PCR-Verfahren ist auch beschrieben in Saiki et al., 1985, Science 230:1350.
  • Nachweisverfahren, die bei Standard-PCR-Techniken im allgemeinen angewendet werden, verwenden eine markierte Sonde mit der amplifizierten DNA in einem Hybridisierungstest. Zum Beispiel offenbaren die EP-Veröffentlichung Nr. 237,362 und die PCT-Veröffentlichung Nr. 89/11548 Testverfahren, bei denen die PCR-amplifizierte DNA zunächst an einen Filter fixiert wird und dann eine spezifische Oligonucleotidsonde zur Hybridisierung zugegeben wird. Vorzugsweise ist die Sonde markiert, z.B. mit 32P, Biotin, Meerrettich-Peroxidase (HRP), usw., um den Nachweis der Hybridisierung zu erlauben. Das Umgekehrte wird auch vorgeschlagen, das heißt, statt dessen wird die Sonde an die Membran gebunden und die PCR-amplifizierte Proben-DNA wird zugegeben.
  • Andere Nachweisverfahren umfassen die Verwendung von Fragmentlängen-Polymorphismus (PCR-FLP), Hybridisierung an Allel-spezifische Oligonucleotid (ASO)-Sonden (ASO) (Sails et al., 1986, Nature 324:163) oder direkte Sequenzierung mittels des Didesoxy-Verfahrens unter Verwendung von amplifizierter DNA statt clonierter DNA. Die Standard-PCR-Technik arbeitet im Wesentlichen durch Replikation einer DNA-Sequenz, die zwischen zwei Primern liegt, und stellt als Hauptprodukt der Reaktion eine DNA-Sequenz spezieller Länge zur Verfügung, die mit dem Primer am 5'-Ende jedes Strangs endet. Somit resultieren Insertionen und Deletionen zwischen den Primern in Produktsequenzen verschiedener Längen, die durch Größenauftrennung mittels PCR-FLP nachgewiesen werden können. In einem Beispiel einer ASO-Hybridisierung wird die amplifizierte DNA in einer Reihe von „Dotblots" an einen Nylon-Filter fixiert (z.B. durch UV-Bestrahlung) und kann dann mit einer Oligonucleotidsonde, die mit HRP markiert ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Nach Waschen werden Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid zugegeben: HRP katalysiert die Oxidation von TMB durch Wasserstoffperoxid zu einem löslichen, blauen Farbstoff, der ausgefällt werden kann, was die hybridisierte Sonde anzeigt.
  • Während die PCR-Technik, wie sie gegenwärtig praktiziert wird, ein äußerst leistungsfähiges Verfahren zur Amplifizierung von Nucleinsäuresequenzen ist, erfordert der Nachweis des amplifizierten Materials eine zusätzliche Manipulation und eine anschließende Bearbeitung des PCR-Produkts, um zu bestimmen, ob Ziel-DNA anwesend ist. Es wäre wünschenswert, die Zahl an anschließenden Bearbeitungsschritten, die gegenwärtig zum Nachweis des amplifizierten Materials erforderlich sind, herabzusetzen. Ein „homogenes" Nachweisverfahren, das heißt, eines, das ein Signal erzeugt, während die Zielsequenz amplifiziert wird, und das minimale Bearbeitung nach der Amplifizierung erfordert, wäre ideal.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe zur Verfügung, wobei besagtes Verfahren umfasst:
    • (a) Inkontaktbringen einer einzelsträngige Nucleinsäuren umfassenden Probe mit einem Oligonucleotid, das eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einem Bereich der Ziel-Nucleinsäure, und einem markierten Oligonucleotid, das eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einem zweiten Bereich des gleichen Ziel-Nucleinsäuresequenzstranges, aber nicht die Nucleinsäuresequenz einschließt, die durch das erste Oligonucleotid definiert ist, um unter Hybridisierungsbedingungen ein Gemisch von Duplexmolekülen zu erzeugen, wobei die Duplexmoleküle die Ziel-Nucleinsäure, angelagert an das erste Oligonucleotid und an das markierte Oligonucleotid, umfassen, so dass das 3'-Ende des ersten Oligonucleotids an das 5'-Ende des markierten Oligonucleotids angrenzt;
    • (b) Beibehalten des Gemisches aus Schritt (a) mit einer matrizenabhängigen Nucleinsäurepolymerase, die eine 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität aufweist, unter Bedingungen, die ausreichen, um der 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität der Polymerase das Schneiden des angelagerten markierten Oligonucleotids und die Freisetzung von markierten Fragmenten zu erlauben; und
    • (c) Nachweisen und/oder Messen der Freisetzung der markierten Fragmente.
  • Dieses Verfahren ist insbesondere geeignet zur Analyse von Nucleinsäure, die mittels PCR amplifiziert wurde. Dieses Verfahren ist eine Verbesserung gegenüber bekannten PCR-Nachweisverfahren, denn es erlaubt sowohl die Amplifizierung eines Ziels und die Freisetzung einer Markierung zur Durchführung eines Nachweises in einem Reaktionssystem ohne die Notwendigkeit vieler Bearbeitungsschritte des amplifizierten Produkts. Deshalb wird in einer anderen Ausführungsform der Erfindung ein Amplifikationsverfahren mittels Polymerase-Kettenreaktion zur gleichzeitigen Amplifikation und zum gleichzeitigen Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst:
    • (a) Bereitstellen mindestens eines markierten Oligonucleotids, das eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einem Bereich der Zielnucleinsäure, für einen die Probe enthaltenden PCR-Test, wobei das markierte Oligonucleotid sich innerhalb der durch die Oligonucleotidprimer von Schritt (b) gebundenen Ziel-Nucleinsäuresequenz anlagert;
    • (b) Bereitstellen eines Satzes von Oligonucleotidprimern, wobei ein erster Primer eine Sequenz enthält, die komplementär zu einem Bereich in einem Strang der Ziel-Nucleinsäuresequenz ist und die Synthese eines komplementären DNA-Strangs in Gang setzt, und ein zweiter Primer eine Sequenz enthält, die komplementär zu einem Bereich in einem zweiten Strang der Ziel-Nucleinsäuresequenz ist und die Synthese eines komplementären DNA-Strangs in Gang setzt; und wobei jeder Oligonucleotidprimer so ausgewählt ist, dass er sich an seine komplementäre Matrize stromaufwärts von jedem markierten Oligonucleotid anlagert, das an den gleichen Nucleinsäurestrang angelagert ist;
    • (c) Amplifizieren der Ziel-Nucleinsäuresequenz unter Einsatz einer Nucleinsäurepolymerase mit 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität als ein matrizenabhängiges Polymerisationsmittel unter Bedingungen, die die PCR-Zyklusschritte (i) Anlagerung von Primern und markiertem Oligonucleotid an eine Matrizen-Nucleinsäuresequenz, die in einer Zielsequenz enthalten ist, und (ii) Verlängern der Primer erlauben, wobei die Nucleinsäurepolymerase ein Primerverlängerungsprodukt synthetisiert, während die 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität der Nucleinsäurepolymerase gleichzeitig markierte Fragmente von den angelagerten Duplexmolekülen freisetzt, die markiertes Oligonucleotid und seine komplementäre Matrizen-Nucleinsäuresequenz umfassen, wobei nachweisbare, markierte Fragmente erzeugt werden; und
    • (d) Nachweisen und/oder Messen der Freisetzung von markierten Fragmenten, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielsequenz in der Probe zu bestimmen.
  • 1 ist ein Autoradiogramm einer DEAE-Cellulose-Dünnschichtchromatographie (DC)-Platte, die die Freisetzung der markierten Fragmente aus der gespaltenen Sonde illustriert.
  • 2 ist ein Autoradiogramm einer DEAE-Cellulose-DC-Platte, die die Thermostabilität der markierten Sonde zeigt.
  • 3A und 3B sind Autoradiogramme von DEAE-Cellulose-DC-Platten, die zeigen, dass die Menge an markiertem, freigesetztem Sondenfragment mit der Zunahme der PCR-Zyklenzahl und der Anfangskonzentration der Matrizen-DNA korreliert.
  • 4 zeigt die polymerisationsunabhängige 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase in dem Autoradiogramm unter Verwendung einer Serie von Primern, die null bis 20 Nucleotide stromaufwärts der Sonde anlagern.
  • 5 ist ein Autoradiogramm, das die Freisetzung der markierten Sondenfragmente bei wachsender Inkubationstemperatur und -zeit zeigt, wobei die Zusammensetzung des 5'-Endes der Sonde GC-reich ist.
  • 6 ist ein Autoradiogramm, das die Freisetzung der markierten Sondenfragmente bei wachsender Inkubationstemperatur und -zeit zeigt, wobei die Zusammensetzung des 5'-Endes der Sonde AT-reich ist.
  • 7 zeigt die Analyse mittels 5% Acrylamid-Gelelektrophorese eines HIV-Produkts von 142 Basenpaaren, das in der Anwesenheit oder Abwesenheit der markierten Sonde amplifiziert wurde.
  • 8 ist eine Montage aus zwei Autoradiogrammen einer DC-Analyse von Aliquots eines PCR-Amplifizierungsprodukts, die zeigt, dass eine Freisetzung der Radiomarkierung eintritt, die mengenmäßig anwächst, wenn sowohl die Start-Matrize zunimmt als auch die Thermozyklen sich verlängern.
  • 9 ist ein Schema für die Reaktion, bei der ein NHS-aktives Esterderivat von Biotin an das 3'-Amin einer Oligonucleotidsonde angefügt wird.
  • 10 ist ein Schema für die Reaktion, bei der ein Biotinhydrazid verwendet wird, um eine Oligonucleotidsonde zu markieren, die ein 3'-Ribonucleotid hat.
  • 11 ist ein Schema für die Markierung einer Oligonucleotidsonde mit Biotin unter Verwendung eines Biotin-Phosphoramidits.
  • 12 zeigt ein Reagens zur Markierung von Oligonucleotidsonden mit Biotin.
  • 13 zeigt eine Oligonucleotidsonde, die mit Rhodamin-X-590 und Kristallviolett markiert ist.
  • 14 zeigt ein Schema für eine Reaktion, um ein aktives Acylazid von Kristallviolett zu bilden.
  • 15 zeigt ein Schema für eine Reaktion, um ein Amin an ein Thymidin zur Verwendung zur Konjugation einer Markierung mit einer Oligonucleotidsonde anzufügen.
  • 16 zeigt typische Ergebnisse und das Verhältnis von Signal zur eingesetzten Zahl an Zielmolekülen für das vorliegende Verfahren unter Verwendung von BakerbondTM PEI Festphasen-Extraktionsmittel.
  • Wie hier verwendet bezieht sich eine „Probe" auf jede Substanz, die eine Nucleinsäure enthält oder vermutlich enthält, und umfasst eine Probe von Gewebe oder Flüssigkeit, die von einem Individuum oder Individuen isoliert ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, zum Beispiel Haut, Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphe, Synovialflüssigkeit, Urin, Tränen, Blutzellen, Organe, Tumore, und auch auf Proben von Bestandteilen von in vitro-Zellkulturen (einschließlich, aber nicht beschränkt auf konditioniertes Medium vom Wachstum von Zellen in einem Zellkulturmedium, rekombinante Zellen und Zellbestandteile).
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck „Nucleinsäure", „Polynucleotid" und „Oligonucleotid" auf Primer, Sonden und Oligomerfragmente, die nachgewiesen werden sollen, Oligomerkontrollen und nicht markierte, blockierende Oligomere, und allgemein auf Polydesoxyribonucleotide (die 2-Desoxy-D-Ribose enthalten), Polyribonucleotide (die D-Ribose enthalten) und auf jede andere Art von Polynucleotid, das ein N-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase oder modifizierte Purin- oder Pyrimidinbasen ist. Es gibt keine vorsätzliche Längenunterscheidung zwischen den Begriffen „Nucleinsäure", „Polynucleotid" und „Oligonucleotid", und diese Begriffe werden austauschbar verwendet. Diese Begriffe beziehen sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Deshalb umfassen diese Begriffe doppel- und einzelsträngige DNA ebenso wie doppel- und einzelsträngige RNA. Das Oligonucleotid umfasst eine Sequenz von ungefähr mindestens 6 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens etwa 10–12 Nucleotiden, und noch mehr bevorzugt mindestens etwa 15–20 Nucleotiden, die einem Bereich der bezeichneten Nucleotidsequenz entspricht. „Entsprechend" bedeutet identisch mit oder komplementär zu der bezeichneten Sequenz.
  • Das Oligonucleotid ist nicht notwendigerweise physikalisch abgeleitet von irgendeiner existierenden oder natürlichen Sequenz, sondern kann in jeder Weise gewonnen werden, einschließlich chemische Synthese, DNA-Replikation, reverse Transkription oder eine Kombination davon. Die Begriffe „Oligonucleotid" oder „Nucleinsäure" bedeuten ein Polynucleotid von genomischer DNA oder RNA, cDNA, halbsynthetischem oder synthetischem Ursprung, das wegen seiner Herkunft oder wegen einer Manipulation: (1) nicht mit dem gesamten oder einem Teil des Polynucleotids assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist; und/oder (2) mit einem anderen Polynucleotid als in der Natur verknüpft ist; und (3) in der Natur nicht gefunden wird.
  • Da Mononucleotide bei der Bildung von Oligonucleotiden so zur Reaktion gebracht werden, dass das 5'-Phosphat eines Mononucleotid-Pentoserings mit dem 3'-Sauerstoff seines Nachbarn in einer Richtung mittels einer Phosphodiesterbindung verknüpft wird, wird ein Ende eines Oligonucleotids als das „5'-Ende" bezeichnet, wenn sein 5'-Phosphat nicht mit dem 3'-Sauerstoff eines Mononucleotid-Pentoserings verknüpft ist, und als das „3'-Ende", wenn sein 3'-Sauerstoff nicht mit dem 5'-Phosphat eines folgenden Mononucleotid-Pentoserings verknüpft ist. Wie hier verwendet, kann man auch von einer Nucleinsäuresequenz, selbst wenn im Innern eines größeren Oligonucleotids, sagen, dass sie 5'- und 3'-Enden hat.
  • Wenn zwei verschiedene, nicht überlappende Oligonucleotide an verschiedene Bereiche der selben linearen, komplementären Nucleinsäuresequenz anlagern und das 3'-Ende des einen Oligonucleotids zum 5'-Ende des anderen gerichtet ist, kann das erstere als das „Stromaufwärts"-Oligonucleotid und das letztere als das „Stromabwärts"-Oligonucleotid bezeichnet werden.
  • Der Begriff „Primer" kann mehr als einen Primer betreffen und betrifft ein Oligonucleotid, entweder natürlich vorkommend, wie in einem gereinigten Restriktionsverdau, oder synthetisch hergestellt, welches in der Lage ist, als Ausgangspunkt der Synthese entlang eines Komplementärstrangs zu fungieren, wenn es unter Bedingungen gestellt wird, bei denen die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das komplementär ist zu dem Nucleinsäurestrang, katalysiert wird. Solche Bedingungen umfassen die Anwesenheit von vier verschiedenen Desoxyribonucleosid-Triphosphaten und eines die Polymerisation induzierenden Agens, wie DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase, in einem geeigneten Puffer („Puffer" beinhaltet Bestandteile, die Kofaktoren sind, oder die den pH-Wert, die Ionenstärke, usw, beeinflussen) und bei geeigneter Temperatur. Der Primer ist für eine maximale Effizienz bei der Amplifizierung vorzugsweise einzelsträngig.
  • Das Komplementär einer Nucleinsäuresequenz, wie hier verwendet, betrifft ein Oligonucleotid, das, wenn es mit der Nucleinsäuresequenz so ausgerichtet ist, dass das 5'-Ende einer Sequenz gepaart ist mit dem 3'-Ende der anderen, in der „antiparallelen Assoziation" ist. Gewisse Basen, die üblicherweise nicht in natürlichen Nucleinsäuren vorkommen, können von den Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfasst werden, zum Beispiel Inosin und 7-Deazaguanin. Die Komplementarität muss nicht perfekt sein; stabile Duplexmoleküle können falsch gepaarte Basenpaare oder nicht gepaarte Basen enthalten. Die Fachleute in der Nucleinsäuretechnologie können die Duplexmolekülstabilität empirisch bestimmen unter Berücksichtigung einer Zahl von Variablen, zum Beispiel die Länge des Oligonucleotids, die Basenzusammensetzung und die Sequenz des Oligonucleotids, die Ionenstärke und das Vorkommen falsch gepaarter Basenpaare.
  • Die Stabilität eines Nucleinsäureduplexmoleküls wird durch die Schmelztemperatur oder „TM" gemessen. Die TM eines speziellen Nucleinsäureduplexmoleküls unter spezifischen Bedingungen ist die Temperatur, bei der die Hälfte der Basenpaare dissoziiert ist.
  • Wie hier verwendet betrifft der Begriff „Zielsequenz" oder „Zielnucleinsäuresequenz" den Bereich des Oligonucleotids, der entweder amplifiziert oder nachgewiesen werden soll, oder beides. Die Zielsequenz sitzt zwischen den beiden Primersequenzen, die für die Amplifikation verwendet werden.
  • Wie hier verwendet betrifft der Begriff „Sonde" ein markiertes Oligonucleotid, das mit einer Sequenz in der Zielnucleinsäure eine Duplexstruktur aufgrund der Komplementarität zumindest einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz in dem Zielbereich bildet. Die Sonde enthält vorzugsweise keine Sequenzkomplementarität mit (einer) Sequenz(en), die verwendet wird/werden, um die Polymerase-Kettenreaktion in Gang zu setzen. Generell wird das 3'-Ende der Sonde „blockiert" sein, um den Einbau der Sonde in das Primerverlängerungsprodukt zu verhindern. Die „Blockierung" kann erreicht werden durch Verwendung von nicht komplementären Basen oder durch Anfügen einer chemischen Gruppe, wie Biotin oder eine Phosphatgruppe, an das 3'-Hydroxyl des letzten Nucleotids, was in Abhängigkeit von der gewählten Gruppe, einem doppelten Zweck dienen kann, indem sie auch als Markierung für einen anschließenden Nachweis oder zum Einfangen der an die Markierung gebundenen Nucleinsäure fungiert. Die Blockierung kann auch erreicht werden durch die Entfernung des 3'-OH oder durch Verwendung eines Nucleotids ohne das 3'-OH, wie ein Didesoxynucleotid.
  • Wie hier verwendet betrifft der Begriff „Markierung" jedes Atom oder Molekül, das zur Erzeugung eines nachweisbaren (vorzugsweise quantifizierbaren) Signals verwendet werden kann und das an eine Nucleinsäure oder ein Protein gebunden werden kann. Markierungen können mittels Fluoreszenz, Radioaktivität, Kolorimetrie, Gravimetrie, Röntgenbeugung oder -absorption, Magnetismus, enzymatischer Aktivität und dergleichen nachweisbare Signale erzeugen.
  • Wie hier verwendet betrifft „5'→3'-Nuclesaseaktivität" oder „5' zu 3'-Nuclesaseaktivität" die Aktivität einer Matrizen-spezifischen Nucleinsäurepolymerase, die entweder die 5'→3'-Exonuclesaseaktivität umfasst, die üblicherweise mit einigen DNA-Polymerasen assoziiert ist, wobei vom 5'-Ende eines Oligonucleotids in sequentieller Weise Nucleotide entfernt werden (d.h. E. coli DNA-Polymerase I besitzt diese Aktivität, während das Klenow-Fragment sie nicht besitzt), oder eine 5'→3'-Endonuclesaseaktivität, wobei die Spaltungen mehr als eine Phosphodiesterbindung (Nucleotid) vom 5'-Ende entfernt stattfinden, oder beides.
  • Wie hier verwendet betrifft der Begriff „benachbart" die Positionierung des Primers in Bezug auf die Sonde auf seinem komplementären Strang der Matrizennucleinsäure. Der Primer und die Sonde können durch 1 bis etwa 20 Nucleotide voneinander entfernt sein, mehr bevorzugt etwa 1 bis 10 Nucleotide, oder können direkt aneinander stoßen, wie es bei einem Nachweis unter Verwendung eines polymerisationsunabhängigen Verfahrens wünschenswert sein kann. In einer anderen Ausführungsform kann die Nachbarschaft bei Verwendung in einem polymerisationsabhängigen Verfahren, wenn das vorliegende Verfahren bei den hier offenbarten PCR-Amplifikations- und Nachweisverfahren verwendet wird, an beliebiger Stelle innerhalb der zu amplifizierenden Sequenz, an beliebiger Stelle stromabwärts von einem Primer sein, sodass die Primerverlängerung die Polymerase so positioniert, dass eine Spaltung der Sonde auftritt.
  • Wie hier verwendet betrifft der Begriff „thermostabile Nucleinsäurepolymerase" ein Emzym, das gegenüber Hitze im Vergleich zum Beispiel mit Nucleotidpolymerasen von E. coli relativ stabil ist und das die Polymerisation von Nucleosidtriphosphaten katalysiert. Generell wird das Enzym die Synthese am 3'-Ende des an die Zielsequenz angelagerten Primers starten und wird in die 5'-Richtung an der Matrize entlang fortfahren, und, wenn es eine 5'- zu 3'-Nuclesaseaktivität hat, eine dazwischenliegende, angelagerte Sonde hydrolysieren und dabei sowohl markierte als auch nicht markierte Fragmente freisetzen, bis die Synthese beendet ist. Ein beispielhaftes thermostabiles Enzym, das von Thermus aquaticus (Taq) isoliert ist, ist beschrieben im US-Patent Nr. 4,889,818, und ein Verfahren zur Verwendung in der konventionellen PCR ist beschrieben in Saiki et al., 1988, Science 239:487.
  • Taq-DNA-Polymerase hat eine von der DNA-Synthese abhängige, Strang verdrängende 5'→3'-Exonuclesaseaktivität (siehe Gelfand, „Taq-DNA-Polymerase" in PCR Technology: Principles and Applications for DNA-Amplification, Erlich, Hrsg., Stockton Press, N.Y. (1989), Kapitel 2). In Lösung findet wenig Abbau von markierten Oligonucleotiden statt, sofern er überhaupt stattfindet.
  • Die Durchführung der vorliegenden Erfindung wird, außer anders angezeigt, herkömmliche Verfahren der Molekularbiologie, der Mikrobiologie und der rekombinanten DNA-Technik verwenden, die zum Stand der Technik gehören. Solche Verfahren sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe, z.B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Hrsg., (1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J. Higgins, Hrsg., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984), und eine Serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.). Alle hier erwähnten Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen sowohl vorstehend als auch nachstehend, werden hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
  • Die verschiedenen Aspekte der Erfindung basieren auf einer speziellen Eigenschaft von Nucleinsäurepolymerasen. Nucleinsäurepolymerasen können verschiedene Aktivitäten besitzen, unter ihnen eine 5'- zu 3'-Nuclesaseaktivität, womit die Nucleinsäurepolymerase von einem Oligonucleotid, das an ein größeres, komplementäres Polynucleotid angelagert ist, Mononucleotide oder kleine Oligonucleotide abspalten kann. Damit die Abspaltung effizient verläuft, muss auch ein stromaufwärts gelegenes Oligonucleotid an das selbe größere Polynucleotid angelagert sein.
  • Das 3'-Ende dieses stromaufwärts gelegenen Oligonucleotids stellt die anfängliche Bindungsstelle für die Nucleinsäurepolymerase bereit. Sobald die gebundene Polymerase das 5'-Ende des stromabwärts gelegenen Oligonucleotids erreicht, kann die Polymerase davon Mononucleotide oder kleine Oligonucleotide abspalten.
  • Die beiden Oligonucleotide können so geplant werden, dass sie sehr nahe an die komplementäre Zielnucleinsäure anlagern, sodass die Bindung der Nucleinsäurepolymerase an das 3'-Ende des stromaufwärts gelegenen Oligonucleotids sie automatisch mit dem 5'-Ende des stromabwärts gelegenen Oligonucleotids in Kontakt bringt. Dieses Verfahren wird „polymerisationsunabhängige Spaltung" genannt, da die Polymerisation nicht erforderlich ist, um die Nucleinsäurepolymerase in die Position zu bringen, in der sie die Spaltung vornehmen kann.
  • Wenn die beiden Oligonucleotide in einer anderen Ausführungsform an weiter voneinander entfernte Bereiche der Matrizen-Zielnucleinsäure anlagern, muss Polymerisation erfolgen, bevor die Nucleinsäurepolymerase mit dem 5'-Ende des stromabwärts gelegenen Oligonucleotids in Kontakt kommt. Bei fortschreitender Polymerisation, spaltet die Polymerase kontinuierlich Mononucleotide oder kleine Oligonucleotide vom 5'-Ende des stromabwärts gelegenen Oligonucleotids ab. Diese Abspaltung geht weiter, bis der Rest des stromabwärts gelegenen Oligonucleotids in dem Maße destabilisiert worden ist, dass er von dem Matrizenmolekül dissoziiert. Dieses Verfahren wird „polymerisationsabhängige Spaltung" genannt.
  • In der vorliegenden Erfindung ist eine Markierung an das stromabwärts gelegene Oligonucleotid gebunden. Deswegen können die abgespaltenen Mononucleotide oder kleinen Oligonucleotide, die durch die 5'→3'-Nuclesaseaktivität der Polymerase abgespalten werden, nachgewiesen werden.
  • Anschließend kann jede von mehreren Strategien angewendet werden, um die nicht gespaltenen, markierten Oligonucleotide von ihren gespaltenen Fragmenten zu unterscheiden. Auf diese Weise erlaubt die vorliegende Erfindung die Identifizierung der Nucleinsäureproben, die Sequenzen enthalten, die zu den stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Oligonucleotiden komplementär sind.
  • Die vorliegende Erfindung nutzt die 5'- zu 3'-Nuclesaseaktivität der Polymerase, wenn sie in Verbindung mit PCR verwendet wird. Dies unterscheidet sie von zuvor beschriebenen PCR-Amplifikationen, wobei die amplifizierten Ziel-Oligonucleotide nach der PCR zum Beispiel durch Hybridisierung mit einer Sonde nachgewiesen werden, die unter stringenten bis mäßig stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen ein stabiles Duplexmolekül mit der Zielsequenz bilden. Im Gegensatz zu diesen bekannten Nachweisverfahren, die nach den PCR-Amplifikationen verwendet werden, erlaubt die vorliegende Erfindung den Nachweis von Ziel-Nucleinsäuresequenzen während der Amplifikation dieser Ziel-Nucleinsäure. In der vorliegenden Erfindung wird zu Beginn der PCR ein markiertes Oligonucleotid gleichzeitig mit dem Primer zugegeben, und das Signal, das durch die Hydrolyse des/der markierten Nucleotids/Nucleotide gebildet wird, stellt ein Mittel zum Nachweis der Zielsequenz während seiner Amplifikation bereit.
  • Die vorliegende Erfindung ist jedoch kompatibel mit anderen Amplifikationssystemen, wie dem Transkription-Amplifikation-System, bei dem einer der PCR-Primer einen Promotor codiert, der verwendet wird, um RNA-Kopien der Zielsequenz herzustellen. In ähnlicher Weise kann die vorliegende Erfindung in einem sich selbst tragenden Sequenz-Replikationssystem (3SR) verwendet werden, bei dem eine Vielzahl von Enzymen verwendet wird, um RNA-Transkripte herzustellen, die dann verwendet werden, um DNA-Kopien zu machen, alles bei einer einzigen Temperatur. Durch Einbau einer Polymerase mit 5'→3'-Exonuclesaseaktivität in ein Ligase-Kettenreaktions (LCR)-System, zusammen mit geeigneten Oligonucleotiden, kann die vorliegende Erfindung auch zum Nachweis von LCR-Produkten verwendet werden.
  • Natürlich kann die vorliegende Erfindung bei Systemen angewendet werden, die keine Amplifikation umfassen. In der Tat ist es für die vorliegende Erfindung nicht einmal erforderlich, dass Polymerisiation erfolgt. Ein Vorteil des von der Polymerisiation unabhängigen Verfahrens liegt in der Beseitigung der Notwendigkeit der Amplifikation der Zielsequenz. In Abwesenheit von Primerverlängerung ist die Zielnucleinsäure im Wesentlichen einzelsträngig. Unter der Voraussetzung, dass der Primer und das markierte Oligonucleotid benachbart an die Zielnucleinsäure gebunden sind, können aufeinanderfolgende Runden von Oligonucleotidanlagerung und Spaltung von markierten Fragmenten erfolgen. Somit kann eine ausreichende Menge von markierten Fragmenten erzeugt werden, was den Nachweis in der Abwesenheit von Polymerisiation möglich macht. Das Signal, das während der PCR-Amplifikation erzeugt wird, könnte durch diese polymerisiationsunabhängige Aktivität erhöht werden, was die Fachleute schätzen würden.
  • Bei jedem hier beschriebenen Verfahren wird eine Probe bereitgestellt, von der man annimmt, dass sie die spezielle Oligonucleotidsequenz von Interesse enthält, die „Zielnucleinsäure". Die Zielnucleinsäure, die in der Probe enthalten ist, kann, falls erforderlich, erst in cDNA umgeschrieben und dann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Denaturierungsverfahrens denaturiert werden, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Mittel, die dem Fachmann bekannt sind. Ein bevorzugtes physikalisches Mittel zur Strangtrennung ist das Erhitzen der Nucleinsäure, bis sie vollständig (>99%) denaturiert ist. Die typische Hitzedenaturierung umfasst Temperaturen, die sich im Bereich von etwa 80°C bis etwa 105°C bewegen, für Zeitspannen, die von wenigen Sekunden bis Minuten reichen. Als eine Alternative zur Denaturierung kann die Zielnucleinsäure in der Probe als einzelsträngige Form vorliegen, wie zum Beispiel einzelsträngige RNA- oder DNA-Viren.
  • Die denaturierten Nucleinsäurestränge werden dann mit vorab ausgewählten Oligonucleotidprimern und markiertem Oligonucleotid (hier auch als „Sonde" bezeichnet) unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert, Bedingungen, die die Bindung der Primer und der Sonden an die einzelsträngigen Nucleinsäuren erlauben. Wie im Stand der Technik bekannt, werden die Primer so ausgewählt, dass ihre relativen Positionen entlang der Duplexsequenz so sind, dass das Verlängerungsprodukt, das von einem Primer synthetisiert wird, als Matrize für die Verlängerung des anderen Primers dient, um eine Replikationskette definierter Länge zu ergeben, wenn das Verlängerungsprodukt von seiner Matrize (Komplement) getrennt wird.
  • Da die komplementären Stränge länger sind als sowohl Sonden als auch Primer, haben die Stränge mehr Kontaktpunkte und deshalb eine größere Chance, sich gegenseitig innerhalb eines gegebenen Zeitraums zu finden. Ein hoher molarer Überschuss an Sonde plus Primer hilft dabei, das Gleichgewicht mehr in Richtung der Anlagerung von Primer und Sonde zu verschieben als in Richtung einer Wiederzusammenlagerung der Matrize.
  • Der Primer muss lang genug sein, um die Synthese des Verlängerungsprodukts in der Gegenwart des Polymerisiationsmittels in Gang zu setzen. Die genaue Länge und Zusammensetzung des Primers wird von vielen Faktoren abhängen, einschließlich Temperatur der Anlagerungsreaktion, Quelle und Zusammensetzung des Primers, Nähe der Anlagerungsstelle der Sonde zur Anlagerungsstelle des Primers und das Konzentrationsverhältnis Primer:Sonde. Zum Beispiel enthält der Oligonucleotidprimer in Abhängigkeit von der Komplexität der Zielsequenz typischerweise etwa 15–30 Nucleotide, obwohl ein Primer mehr oder weniger Nucleotide enthalten kann. Die Primer müssen ausreichend komplementär sein, um an ihre jeweiligen Stränge selektiv anzulagern und stabile Duplexmolkül zu bilden.
  • Die hier verwendeten Primer werden so ausgewählt, dass sie im Wesentlichen komplementär zu den verschiedenen Strängen jeder spezifischen Sequenz sind, die amplifiziert werden soll. Die Primer müssen nicht die exakte Sequenz der Matrize wiederspiegeln, aber müssen ausreichend komplementär sein, um selektiv mit ihren jeweiligen Strängen zu hybridisieren. Nicht komplementäre Basen oder längere Sequenzen können in den Primer eingestreut sein oder an den Enden der Primer gelegen sein, unter der Voraussetzung, dass der Primer ausreichend Komplementarität mit einem Matrizenstrang behält, um damit ein stabiles Duplexmolekül zu bilden. Die nicht komplementären Nucleotidsequenzen der Primer können Restriktionsenzymstellen enthalten.
  • Bei der Ausführung der Erfindung muss die markierte Oligonucleotidsonde erst an die komplementäre Nucleinsäure angelagert werden, bevor die Nucleinsäurepolymerase auf den Duplexbereich trifft und damit der 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität die Spaltung und Freisetzung der markierten Oligonucleotidfragmente erlaubt.
  • Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass das markierte Oligonucleotid an die komplementäre Nucleinsäure angelagert ist, bevor die Primerverlängerungs-Polymerisiation den Duplexbereich erreicht oder bevor sich die Polymerase beim polymerisiationunabhängigen Verfahren an das stromaufwärts liegende Oligonucleotid anlagert, können eine Reihe von Verfahren angewendet werden. Beim polymerisiationabhängigen Verfahren kann man die Sonde so positionieren, dass das 5'-Ende der Sonde relativ weit vom 3'-Ende des Primers entfernt ist, um damit der Sonde mehr Zeit zur Anlagerung zu geben, bevor die Primerverlängerung die Bindungsstelle der Sonde blockiert. Kurze Primermoleküle erfordern im allgemeinen niedrigere Temperaturen zur Bildung ausreichend stabiler Hybridkomplexe mit der Zielnucleinsäure. Deshalb können die markierten Oligonucleotide so geplant werden, dass sie länger sind als der Primer, sodass sich das markierte Oligonucleotid vorzugsweise bei höheren Temperaturen an das Ziel anlagert als der Primer.
  • Man kann auch Primer und markierte Oligonucleotide verwenden, die verschiedene thermische Stabilität haben. Zum Beispiel kann die Nucleotidzusammensetzung der markierten Oligonucleotide so ausgewählt werden, dass sie einen höheren G/C-Gehalt und folglich eine höhere thermische Stabilität haben als der Primer. In ähnlicher Weise kann man modifizierte Nucleotide in die Sonde einbauen, wobei die modifizierten Nucleotide Basenanaloga enthalten, die stabilere Basenpaare bilden als die Basen, die typischerweise in natürlich vorkommenden Nucleinsäuren anwesend sind.
  • Modifikationen der Sonde, die die Bindung der Sonde vor der Bindung der Primer erleichtern, um die Effizienz des vorliegenden Tests zu maximieren, umfassen den Einbau positiv geladener oder neutraler Phosphodiesterbindungen in die Sonde, um die Abstoßung der polyanionischen Rückgrate der Sonde und des Ziels zu vermindern (siehe Letsinger et al.,1988, J. Amer. Chem. Soc. 110:4470); den Einbau von alkylierten oder halogenierten Basen, wie 5-Bromuridin, in die Sonde, um die Basenstapelung zu erhöhen; den Einbau von Ribonucleotiden in die Sonde, um das Sonde:Ziel-Duplexmolekül in eine „A"-Struktur zu zwingen, die erhöhte Basenstapelung hat; und den Austausch einiger oder aller Adenosine in der Sonde durch 2,6-Diaminopurin (Aminoadenosin). Bei der Herstellung solcher modifizierter Sonden der Erfindung sollte man erkennen, dass der geschwindigkeitslimitierende Schritt der Duplexbildung die „Nucleation", – die Bildung eines einzigen Basenpaars – ist, und deshalb kann die Änderung der biophysikalischen Charakteristik eines Teils der Sonde, zum Beispiel nur des 3'- oder 5'-Endbereichs, ausreichen, um das gewünschte Ergebnis zu erreichen. Da zusätzlich der 3'-Endbereich der Sonde (die terminalen 8 bis 12 3'-Nucleotide) nach dem Exonucleoseabbau des 5'-Endes durch die Polymerase dissoziiert, können Veränderungen des 3'-Endes ohne Bedenken vorgenommen werden, sodass die Aktivität der Polymerase/Nuclease beeinträchtigt wird.
  • Die Thermozyklus-Parameter können ebenfalls variiert werden, um die verschiedene thermische Stabilität der markierten Oligonucleotide und Primer auszunutzen. Zum Beispiel kann nach dem Denaturierungsschritt im Thermozyklus eine intermediäre Temperatur eingeführt werden, die die Bindung der markierten Oligonucleotide zulässt, aber nicht die Bindung der Primer, und dann wird die Temperatur weiter abgesenkt, um das Anlagern der Primer und die Verlängerung zu erlauben. Man sollte jedoch beachten, dass die Abspaltung der Sonde für geeignete Ergebnisse nur in späteren Zyklen des PCR-Verfahrens auftreten darf. Daher könnte man die Reaktionsbedingungen so festlegen, dass, obwohl die Primer anfänglich bevorzugt an die Sonden binden, die Primerkonzentration durch die Primerverlängerung reduziert wird, sodass in späteren Zyklen die Sonden bevorzugt an Primer binden.
  • Um die Bindung des markierten Oligonucleotids vor dem Primer zu begünstigen, kann auch ein hoher molarer Überschuss an markiertem Oligonucleotid im Vergleich zum Primer verwendet werden. In dieser Ausführungsform bewegen sich die Konzentrationen an markiertem Oligonucleotid typischerweise in dem Bereich, der etwa 2- bis 20-fach höher als die entsprechende Primerkonzentration ist, welche üblicherweise 0,5 – 5 × 10–7 M ist. Die Fachleute erkennen, dass die Oligonucleotidkonzentration, -länge und die -Basenzusammensetzung alles wichtige Faktoren sind, die die Tm jedes einzelnen Oligonucleotids in dem Reaktionsgemisch beeinflussen. Jeder dieser Faktoren kann manipuliert werden, um eine thermodynamische Lage zu schaffen, die die Anlagerung der Sonde gegenüber der Anlagerung des Primers begünstigt.
  • Die Oligonucleotid-Primer und die markierten Oligonucleotide können mittels jedes beliebigen geeigneten Verfahrens hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden von spezifischer Sequenz sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel Clonierung und Restriktion geeigneter Sequenzen und direkte chemische Synthese. Chemische Syntheseverfahren sind zum Beispiel das Phosphotriesterverfahren, beschrieben von Narang et al., 1979, Methods in Enzymology 68:90, das Phosphodiesterverfahren, offenbart von Brown et al., 1979, Methods in Enzymology 68:109, das Diethylphosphoramidatverfahren, offenbart in Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Letters 22:1859, und das Festphasenverfahren, offenbart im US-Patent Nr. 4,458,066.
  • Die Zusammensetzung des markierten Oligonucleotids kann geplant werden, um die Nucleaseaktivität gegenüber der Strangverdrängung (Mono- und Dinucleotidfragmente gegenüber Oligonucleotiden) durch Auswahl von Sequenzen, die GC-reich sind oder die aufeinanderfolgende A's und T's vermeiden und durch Wahl der Position der Markierung in der Sonde zu begünstigen. In der Anwesenheit von AT-reichen Sequenzen im komplementären 5'-Bereich der Sonde erfolgt die Spaltung nach ungefähr dem vierten, fünften oder sechsten Nucleotid. In einem GC-reichen 5'-Bereich der komplementären Sonde jedoch erfolgt die Spaltung im allgemeinen nach dem ersten oder zweiten Nucleotid. In einer anderen Ausführungsform kann der Einbau von modifizierten Phosphodiesterbindungen (z.B. Phosphorothioat oder Methylphosphonate) in die markierte Sonde während der chemischen Synthese (Noble et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12:3387-3403; lyer et al., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254) verwendet werden, um die Spaltung an einer ausgewählten Stelle zu verhindern. In Abhängigkeit von der Länge der Sonde, der Zusammensetzung des komplementären 5'-Bereichs der Sonde und der Lage der Markierung kann man Sonden planen, um vorzugsweise die Bildung kurzer oder langer markierter Sondenfragmente zur Verwendung in der Durchführung der vorliegenden Erfindung begünstigen.
  • Das Oligonucleotid wird markiert, wie nachstehend beschrieben, durch Einbau von Gruppen, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische oder chemische Mittel nachweisbar sind. Das Verfahren der Bindung oder Konjugation der Markierung an die Oligonucleotidsonde hängt natürlich von der Art der verwendeten Markierungen und von der Lage der Markierung auf der Sonde ab.
  • Eine Vielzahl von Markierungen, die zur Verwendung bei der Erfindung geeignet wären, ebenso wie Verfahren für ihren Einbau in die Sonde, sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Enzyme (z.B. alkalische Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase) und Enzymsubstrate, radioaktive Atome, fluoreszierende Farbstoffe, Chromophore, chemilumineszierende Markierungen, elektrochemie-lumineszierende Markierungen, wie OrigenTM (Igen), Liganden, die spezifische Bindungspartner haben, oder andere beliebige Markierungen, die miteinander wechselwirken können, um ein Signal zu verstärken, ändern oder abzuschwächen. Wenn die PCR unter Verwendung eines Thermozyklus-Instruments durchgeführt wird, muss die Markierung natürlich in der Lage sein, die im Thermozyklus erforderlichen Temperaturen in diesem automatisierten Verfahren zu überleben.
  • Unter den radioaktiven Atomen wird 32P bevorzugt. Verfahren zum Einbau von 32P in Nucleinsäuren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel die 5'-Markierung mit einer Kinase oder die zufällige Insertion mittels der Nick-Translation. Enzyme werden typischerweise mittels ihrer Aktivität nachgewiesen. „Spezifischer Bindungspartner" betrifft ein Protein, das in der Lage ist, mit hoher Spezifität an ein Ligandenmolekül zu binden, wie zum Beispiel im Falle eines Antigens und des zugehörigen monoclonalen Antikörpers. Andere spezifische Bindungspartner umfassen Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, und die zahlreichen Rezeptor-Liganden-Paare, die im Stand der Technik bekannt sind. Die vorstehende Beschreibung soll, die verschiedenen Markierungen nicht in verschiedene Klassen kategorisieren, da die selbe Markierung in verschiedener Weise verwendet werden kann. Zum Beispiel kann 125I als radioaktive Markierung oder als Elektronendichte-Reagens dienen. HRP kann als Enzym oder als Antigen für einen monoclonalen Antikörper dienen. Darüber hinaus kann man für erwünschte Effekte verschiedene Markierungen kombinieren. Zum Beispiel könnte man eine Sonde mit Biotin markieren und die Anwesenheit der Sonde mit Avidin, das mit 125I markiert ist oder mit einem monoclonalen Anti-Biotin-Antikörper, der mit HRP markiert ist, nachweisen. Andere Veränderungen und Möglichkeiten sind für den Durchschnittsfachmann offensichtlich und werden innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung als Äquivalente betrachtet.
  • Fluorophore zur Verwendung als Markierungen bei der Herstellung von markierten Sonden der Erfindung umfassen Rhodamin und seine Derivate, wie Texasrot, Fluorescein und seine Derivate, wie 5-Brommethyl-Fluorescein, Lucifergelb, IAEDANS, 7-Me2N-Coumarin-4-Acetat, 7-OH-4-CH3-Coumarin-3-Acetat, 7-NH2-4-CH3-Coumarin-3-Acetat (AMCA), Monobrombiman, Pyrentrisulfonate, wie Kaskadenblau, und Monobromtrimethyl-ammoniobiman. Generell werden Fluorophore mit einer weiten Stokes-Verschiebung bevorzugt, um die Verwendung von Fluorimetern mit Filtern statt eines Monochromators zuzulassen und die Effizienz des Nachweises zu erhöhen.
  • In einigen Situationen kann man zwei interaktive Markierungen auf einem einzelnen Oligonucleotid verwenden, wobei man bedenken muss, dass man einen geeigneten Abstand der Markierungen auf dem Oligonucleotid einhält, um die Trennung der Markierungen während der Oligonucleotidhydrolyse zuzulassen. Rhodamin und Kristallviolett sind bevorzugte interaktive Markierungen.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann der Nachweis der hydrolysierten, markierten Sonde unter Verwendung von zum Beispiel der Fluoreszenzpolarisation erfolgen, einem Verfahren, das zwischen großen und kleinen Molekülen unterscheiden kann und auf dem molekularen Taumeln basiert. Große Moleküle (z.B. intakte markierte Sonde) taumeln („tumble") in Lösung viel langsamer als kleine Moleküle. Nach Bindung einer fluoreszierenden Gruppe an das Molekül von Interesse (z.B. das 5'-Ende der markierten Sonde) kann die fluoreszierende Gruppe auf dem molekularen Taumeln basierend gemessen (und unterschieden) werden, und so kann zwischen intakter und abgebauter Sonde unterschieden werden. Der Nachweis kann direkt während der PCR gemessen oder nach der PCR durchgeführt werden.
  • In noch einer anderen Ausführungsform werden zwei markierte Oligonucleotide verwendet, jedes komplementär zu getrennten Bereichen auf verschiedenen Strängen eines doppelsträngigen Zielbereichs, aber nicht zu dem anderen Oligonucleotid, sodass sich ein Oligonucleotid stromabwärts von jedem Primer anlagert. Zum Beispiel kann die Anwesenheit von zwei Sonden potentiell die Intensität des Signals verdoppeln, die von einer einzigen Markierung erzeugt wird und kann weiterhin dazu dienen, das Wiederzusammenlagern des Produktstrangs zu verhindern, was häufig während der PCR-Amplifikation vorkommt. Die Sonden werden so ausgewählt, dass die Sonden an Positionen binden, die benachbart (stromabwärts) zu den Positionen sind, an die die Primer binden.
  • Man kann bei der vorliegenden Erfindung auch mehrere Sonden verwenden, um andere Vorteile zu erhalten. Man könnte zum Beispiel auf jede Zahl von Pathogenen in einer Probe einfach dadurch testen, dass man so viele Sonden wie gewünscht in das Reaktionsgemisch gibt; jede Sonde könnte eine unterschiedliche Markierung tragen, um den Nachweis zu erleichtern.
  • Man kann auch eine Allel-spezifische oder Art-spezifische (d.h. spezifisch für die verschiedenen Arten von Borrelia, die Ursache der Lyme-Krankheit) Unterscheidung unter Verwendung von mehreren Sonden bei der vorliegenden Erfindung erreichen, zum Beispiel unter Verwendung von Sonden, die verschiedene Tm haben, und bei Durchführung der Anlagerungs-/Spaltungsreaktion bei einer Temperatur, die nur für ein Sonden/Allelduplexmolekül spezifisch ist. Zum Beispiel kann man ein Primerpaar auswählen, das sowohl HTLV I als auch HTLV II amplifiziert, und zwei Sonden verwenden, von denen jede einmalig und spezifisch für entweder HTLV I oder HTLV II markiert ist. Man kann auch eine Allel-spezifische Unterscheidung durch Verwendung einer einzigen Sonde und Untersuchung der erzeugten Spaltprodukte erreichen. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird die Sonde so geplant, dass sie zumindest im 5'-Endbereich genau zu einem Allel, aber nicht zu dem/den anderen Allel/en komplementär ist. In Bezug auf das andere Allel/die anderen Allele wird die Sonde im 5'-Endbereich der Sonde Fehlpaarungen aufweisen, sodass ein Spaltprodukt erzeugt wird, das im Vergleich zu dem Spaltprodukt, das erzeugt wird, wenn die Sonde an das exakt komplementäre Allel hybridisiert, unterschiedlich ist.
  • Außer durch die Auswahl der Sequenz der Sonde können auch durch die Auswahl der Markierungen) der Sonde wichtige Vorteile erzielt werden. Die Markierungen können mittels einer Vielzahl von Verfahren direkt oder indirekt an das Oligonucleotid gebunden werden. In Abhängigkeit vom genauen Typ der verwendeten Markierung kann die Markierung am 5'- oder 3'-Ende der Sonde lokalisiert sein, intern in der Sonde lokalisiert sein oder mittels Abstandshalter verschiedener Größen und Zusammensetzungen gebunden sein, um Signalwechselwirkungen zu erleichtern. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Phosphoramidit-Reagenzien kann man Oligomere herstellen, die funktionelle Gruppen (z.B. Thiole oder primäre Amine) an entweder dem 5'- oder 3'-Ende über ein geeignetes geschütztes Phosphoramidit enthalten, und man kann sie unter Verwendung von Protokollen markieren, die zum Beispiel in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Hrsg. Academic Press, Inc., 1990) beschrieben sind.
  • Verfahren zur Einführung von Oligonucleotid funktionalisierenden Reagenzien zur Einführung von einer oder mehrerer Sulfhydryl-, Amino- oder Hydroxylgruppen in die Oligonucleotidsondensequenz, typischerweise am 5'-Ende, werden im US-Patent Nr. 4,914,210 beschrieben. Eine 5'-Phosphatgruppe kann unter Verwendung einer Polynucleotid-Kinase und Gamma 32P-ATP als ein Radioisotop eingeführt werden, um eine Reportergruppe zu ergeben. Biotin kann an das 5'-Ende zugegeben werden durch Reaktion eines Aminothymidinrests oder eines 6-Aminohexylrests, der während der Synthese eingeführt wurde, mit einem N-Hydroxysuccinimidester von Biotin angefügt werden. Markierungen am 3'-Ende können terminale Polynucleotid-Transferasen zum Anfügen der gewünschten Gruppe verwenden, wie zum Beispiel Cordycepin-35S-dATP und biotinyliertes dUTP.
  • Oligonucleotidderivate sind ebenfalls verfügbare Markierungen. Zum Beispiel sind Etheno-dA und Etheno-A bekannt als fluoreszierende Adeninnucleotide, die in eine Oligonucleotidsonde eingebaut werden können. In ähnlicher Weise ist Etheno-dC oder 2-Aminopurin-Desoxyribosid ein anderes Analog, das bei der Sondensynthese verwendet werden könnte. Die Sonden, die solche Nucleotidderivate enthalten, können durch die 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität hydrolysiert werden, um, während die DNA-Polymerase während der PCR einen Primer verlängert, viel stärker fluoreszierende Mononucleotide freizusetzen.
  • Die matrizenabhängige Verlängerung des/der Oligonucleotidprimer(s) wird mittels eines polymerisierenden Mittels in der Gegenwart von geeigneten Mengen der vier Desoxyribonucleosid-Triphosphate (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) oder von Analoga, wie vorstehend diskutiert, in einem Reaktionsmedium katalysiert, das die geeigneten Salze, Metallkationen und pH-Puffersysteme enthält. Geeignete polymerisierende Mittel sind Enzyme, von denen bekannt ist, dass sie die Primer- und matrizenabhängige DNA-Synthese katalysieren und 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität besitzen. Bekannte DNA-Polymerasen umfassen zum Beispiel E. coli-DNA-Polymerase I, Thermus thermophilus (Tth)-DNA-Polymerase, Bacillus stearothermophilus-DNA-Polymerase, Thermococcus litoralis-DNA-Polymerase und Thermus aquaticus (Taq)-DNA-Polymerase. Die Reaktionsbedingungen zur Katalyse der DNA-Synthese mit diesen DNA-Polymerasen sind im Stand der Technik wohl bekannt. Um bei der vorliegenden Erfindung von Nutzen zu sein, muss das polymerisierende Mittel die Oligonucleotide effizient spalten und markierte Fragmente freisetzen, sodass direkt oder indirekt ein Signal erzeugt wird.
  • Die Produkte der Synthese sind Duplexmoleküle, die aus dem Matrizenstrang und dem Primerverlängerungsstrang bestehen und die Zielsequenz einschließen. Nebenprodukte dieser Synthese sind markierte Oligonucleotidfragmente, die aus einem Gemisch von Mono-, Di- und größeren Nucleotidfragmenten bestehen. Wiederholte Zyklen von Denaturierung, Anlagerung von markiertem Oligonucleotid und Primer und Primerverlängerung und Spaltung des markierten Oligonucleotids resultieren in einer exponentiellen Anhäufung des Zielbereichs, der durch die Primer definiert ist, und der exponentiellen Bildung von markierten Fragmenten. Eine ausreichende Anzahl an Zyklen wird durchgeführt, um eine nachweisbare Markierungsart zu erreichen, die um mehrere Größenordnungen größer sein kann als das Hintergrundsignal, obwohl bei der allgemeinen Praxis solch hohe Verhältnisse von Signalen zum Hintergrund möglicherweise nicht zu erreichen bzw. erwünscht sind.
  • In einem bevorzugten Verfahren wird der PCR-Prozess als automatisierter Prozess durchgeführt, der ein thermostabiles Enzym verwendet. Bei diesem Prozess durchläuft das Reaktionsgemisch zyklisch einen Denaturierungsschritt, einen Anlagerungsschritt von Sonde und Primer und einen Syntheseschritt, wobei Spaltung und Verdrängung sich simultan mit der Primer-abhängigen Matrizenverlängerung ereignen. Ein DNA-Thermocycler, wie das kommerziell erhältliche Gerät von Perkin-Elmer Cetus Instruments, das speziell für die Verwendung mit einem thermostabilen Enzym entwickelt ist, kann verwendet werden.
  • Temperaturstabile Polymerasen werden bei diesem automatisierten Verfahren bevorzugt, da der bevorzugte Weg der Denaturierung der doppelsträngigen Verlängerungsprodukte das Aussetzen gegen hohe Temperaturen (etwa 95°C) während des PCR-Zyklus ist. Zum Beispiel offenbart das US-Patent Nr. 4,889,818 ein repräsentatives thermostabiles Enzym, das aus Thermus aquaticus isoliert ist. Zusätzliche repräsentative temperaturstabile Polymerasen umfassen z.B. Polymerasen, die aus thermostabilen Bakterien, wie Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus (der ein etwas niedrigeres Temperaturoptimum hat als die anderen aufgelisteten), Thermus lacteus, Thermus rubens, Thermotoga maritima, Thermococcus litoralis und Methanothermus fervidus extrahiert sind.
  • Der Nachweis oder die Verifikation der markierten Oligonucleotidfragmente kann mittels einer Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden und kann vom Ursprung der verwendeten Markierung oder Markierungen abhängig sein. Eine bequeme Ausführungsform der Erfindung ist die Anwendung der Größenanalyse auf die Reaktionsprodukte, einschließlich der gespaltenen markierten Fragmente. Verfahren zur Bestimmung der Größe der markierten Nucleinsäurefragmente sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel Gelelektrophorese, Sedimentation in Gradienten, Gelausschlusschromatographie und Homochromatographie.
  • Während oder nach der Amplifikation kann die Abtrennung der markierten Fragmente von dem PCR-Gemisch zum Beispiel mittels Inkontaktbringen des PCR-Gemischs mit einem Festphasen-Extraktionsmittel (SPE) durchgeführt werden. Zum Beispiel können Materialien zugegeben werden, die die Fähigkeit haben, aufgrund ihrer Größe, Ladung oder ihrer Wechselwirkung mit den Oligonucleotidbasen Oligonucleotide zu binden, zu dem PCR-Gemisch unter Bedingungen, bei denen markierte, ungespaltene Oligonucleotide gebunden werden und kurze, markierte Fragmente nicht gebunden werden. Solche SPE-Materialien umfassen Ionenaustauscherharze oder -kügelchen, wie die kommerziell erhältlichen Bindungspartikel Nensorb (DuPont Chemical Co.), Nucleogen (The Nest Group), PEI, BakerBondTM PEI, Amicon PAE 1,000, SelectacelTM PEI, Boronat-SPE mit einer 3'-Ribose-Sonde, SPE, das Sequenzen enthält, die zum 3'-Ende der Sonde komplementär sind, und Hydroxylapatit. In einer speziellen Ausführungsform, wenn ein zweifach markiertes Oligonucleotid als Signalmittel verwendet wird, das eine 3'-Biotin-Markierung umfasst, die von einer 5'-Markierung durch eine für Nuclease zugängliche Spaltstelle getrennt ist, kann das mittels PCR amplifizierte Gemisch mit Materialien in Kontakt gebracht werden, die spezifische Bindungspartner, wie Avidin oder Streptavidin enthalten, oder einen Antikörper oder einen monoclonalen Antikörper gegen Biotin. Solche Materialien können Kügelchen und Partikel umfassen, die mit spezifischen Bindungspartnern beschichtet sind, und können auch magnetische Partikel umfassen.
  • Nach dem Schritt, in dem das PCR-Gemisch mit einem SPE in Kontakt gebracht worden ist, kann das SPE-Material durch Filtration, Sedimentation oder magnetische Anziehung entfernt werden, wodurch man die markierten Fragmente frei von nicht gespaltenen markierten Oligonucleotiden lässt, sodass sie für den Nachweis verfügbar sind.
  • Reagenzien, die bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden, können in diagnostische Kits verpackt werden. Diagnostische Kits umfassen die markierten Oligonucleotide und die Primer in getrennten Behältnissen. Das markierte Oligonucleotid ist an seinem 3'-Ende blockiert und umfasst erste und zweite Markierungen, wobei die erste Markierung von der zweiten Markierung durch eine für Nuclease zugängliche Spaltstelle getrennt ist. Der Kit kann auch andere, geeignet verpackte Reagenzien und Materialien, die zur Amplifikation erforderlich sind, zum Beispiel Puffer, dNTPs und/oder Polymerisationsmittel, und zur Nachweisanalyse zum Beispiel Enzyme und Festphasenextraktionsmittel ebenso wie Anweisungen zur Durchführung des Tests enthalten.
  • Die nachstehend aufgeführten Beispiele sind zur Erläuterung der verschiedenen Verfahren und Mittel der Erfindung gedacht.
  • Beispiel 1
  • Freisetzung der PCR-Sonden-Markierung
  • Es wurde eine PCR-Amplifikation durchgeführt, die das mit 32P markierte 5'-Ende einer komplementären Sonde freisetzte, wenn das spezifisch beabsichtigte Produkt synthetisiert wurde.
  • A. Markierung der Sonde mit Gamma-32P-ATP und Polynucleotidkinase
  • Zehn pmol von jeder Sonde (BW31, BW33, BW35, Sequenzen werden nachfolgend zur Verfügung gestellt) wurden einzeln mit 15 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (New England Biolabs) und 15,3 pmol Gamma-32P-ATP (New England Nuclear, 3000 Ci/mmol) in 50 μl Reaktionsvolumen, das 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreit, 0,1 mM Spermidin und 0,1 mM EDTA enthält für 60 Minuten bei 37°C gemischt. Das gesamte Volumen wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert, wie von Sambrook et al., Molecular Cloning, Zweite Ausgabe (1989) beschrieben. Die Sonden wurden in 100 μl TE-Puffer resuspendiert und über eine Sephadex G-50 Spin-Dialyse-Säule laufen gelassen, um nicht eingebautes Gamma 32P-ATP zu entfernen, wie von Sambrook et al., vorstehend gelehrt. Die TCA-Präzipitation der Reaktionsprodukte ergab die folgenden spezifischen Aktivitäten:
    BW31: 1,98 × 106 CpM/pmol
    BW33: 2,54 × 106 CpM/pmol
    BW35: 1,77 × 106 CpM/pmol
  • Die Endkonzentration aller drei Sonden war 0,10 pmol/μl.
  • B. Amplifikation
  • Der amplifizierte Bereich war ein 350 Basenpaar-Produkt vom Bacteriophagen M13mp10w, das von den Primern BW36 und BW42 erzeugt wurde. Der Bereich jeder nummerierten Primersequenz, die hier bezeichnet ist, folgt der Verwendung der Standard M13-Nucleotidsequenz.
    SEQ ID NR:1 BW36= 5'5241-5268 3'
    5'-CCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGC-3'
    SEQ ID NR:2 BW42= 5'5591-5562 3'
    5'-GAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGC-3'
  • Drei verschiedene Sonden wurden verwendet; jede enthielt über 30 Basen die exakt komplementäre Sequenz zu M13mp10w, war aber unterschiedlich in der Länge des nicht komplementären 5'-Schwanzbereichs. Sonden wurden so synthetisiert, dass sie 3'-PO4 hatten anstelle eines 3'-OH, um die Verlängerung mittels der Taq-Polymerase zu blockieren.
    SEQ ID NR:3 BW31= 5' 5541-5512 3'
    5'-*CGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCX-3'
    SEQ ID NR:4 BW33= 5' 5541-5512 3'
    5'-*gatCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCCGCGCX-3'
    SEQ ID NR:5 BW35= 5' 5541-5512 3'
    5' *cgtcaccgatCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCX-3'
    • X = 3'-Phosphat
    • a, t, g, c = zum Matrixstrang nicht komplementäre Basen
    • * = Gamma 32P-ATP-Markierung
  • Zur Amplifikation des 350 bp-Fragments wurden 10–3 pmol der M13mp10w-Zielsequenz zu 50 μl Reaktionsvolumen zugegeben, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl2, 10 pmol von jedem der Primer BW36 und BW42, 200 μM von jedem der vier Desoxyribonucleosid-Triphosphate, 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und entweder 1, 10 oder 20 pmol der isotopisch verdünnten Sonden BW31, BW33 oder BW35 enthielt. Die Menge an radiomarkierter Sonde wurde pro Reaktion konstant bei 0,4 pmol gehalten und mit nicht radioaktiver Sonde auf 1, 10 oder 20 pmol verdünnt. Die Taq-Polymerase wurde mit 4 μl pro Reaktion bei 0,3125 U/μl zugegeben und verdünnt in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5% Tween 20 und 500 μg/ml Gelatine.
  • Ein Stamm-Reaktionsgemisch wurde hergestellt, das geeignete Mengen an Reaktionspuffer, Nucleosid-Triphosphaten, beiden Primern und Enzym enthielt. Von diesem Stamm-Gemisch wurden Aliquots entnommen, und zu ihnen wurden Matrize und verschiedene Konzentrationen von jeder Sonde zugegeben. Kontrollreaktionen bestanden darin, dass alle Reaktionskomponenten außer der Matrize und alle Reaktionskomponenten außer der Sonde zugegeben wurden. Jedes Reaktionsgemisch wurde mit 50 μl Mineralöl überschichtet, um das Verdampfen zu verhindern, für 45 Sekunden mikrozentrifugiert und dann in einen Thermo-Cycler gebracht. Die Reaktionsgemische wurden dem folgenden Amplifikationsschema unterworfen:
    Figure 00250001
  • Nach den Zyklen wurde das Mineralöl mit 50 μl Chloroform extrahiert, die Gemische wurden bei 4°C gelagert, und die folgenden Tests wurden durchgeführt.
  • C. Analyse
  • Für die Acrylamid-Gelanalyse wurden 4 μl von jeder Amplifikationsreaktion mit 3 μl 5X Gel-Beladungs-Mix (0,125% Bromphenolblau, 12,5% Ficoll 400 in H2O) gemischt und auf ein 4% Acrylamid-Gel (10 ml 10X TBE-Puffer, 1 ml 10% Ammoniumpersulfat, 10 ml 40% Bis-Acrylamid 19:1, 50 μl TEMED und 79 ml H2O) in 1X TBE-Puffer (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure und 2 mM EDTA) aufgetragen und 90 Minuten mit 200 Volt der Elektrophorese unterworfen. Nach Anfärben mit Ethidiumbromid wurde die DNA mittels UV-Fluoreszenz sichtbar gemacht.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwesenheit von jeder der drei Sonden bei den verschiedenen Konzentrationen keine Auswirkung auf die Menge des gebildeten Amplifikationsprodukts hatte. Probespuren, die keine Sonde enthielten, zeigten getrennte Banden hoher Intensität von 350 Basenpaaren, die der erwünschten Sequenz entsprachen. Alle Spuren, die Sonde enthielten, zeigten die selben, ebenso wie wenige schwache Banden bei leicht höherem Molekulargewicht. Kontrollspuren ohne zugegebene Matrize zeigte keinerlei Banden bei 350 Basen, nur Banden niedriger Intensität, die die Primer bei 30–40 Basen darstellten.
  • Nach der Photographie wurde das Gel auf Whatman-Papier übertragen, mit Saran Wrap bedeckt und autoradiographiert. Eine Übernachtexposition zeigte, dass 90–95% der Radiomarkierung nahe dem unteren Ende des Gels waren, wo die Sonde oder teilweise abgebaute Sonde laufen würde.
  • Für die Analyse im denaturierenden Gel wurden 2 μl von jeder Amplifikationsreaktion mit 2 μl Formamid-Ladepuffer (0,2 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0, 10 mg Bromphenolblau, 10 mg Xylolcyanol und 10 ml Formamid) gemischt, dann für 3–5 Minuten auf 96°C erhitzt und auf Eis gestellt. Die Proben wurden auf ein 6,2% denaturierendes Gradienten-Polyacrylamidgel (7 M Harnstoff mit sowohl einem Sucrose- als auch einem Puffergradienten) aufgetragen, entsprechend den Vorschriften von Sambrook et al., vorstehend. Das Gel wurde 90 Minuten mit 2000 Volt, 45 W, der Elektrophorese unterworfen, dann auf Whatman-Papier übertragen und autoradiographiert.
  • Die Ergebnisse von dem denaturierenden Gel zeigten, dass etwa 50% von jeder Sonde abgebaut waren zu kleineren markierten Fragmenten. Ungefähr 50%–60% der Impulse liegen im Bereich von 30–40 Basen, was der nicht abgebauten Sonde entspricht. Eine sehr schwache Bande ist für alle Amplifikationsreaktionen bei 300 Basen sichtbar, was nahe legt, dass ein sehr kleiner Prozentsatz der Sonden eine 3'-PO4-Gruppe verloren oder nie besessen hat und verlängert worden ist. Der Rest der Impulse ist im Bereich von null bis 15 Basen. Die Auflösung auf solch einem Gel zeigt nicht die exakte Größe der Produkte, die mittels Homochromatographie-Analyse besser bestimmt werden kann.
  • Für die Homochromatographie-Analyse wurde 1 μl von jeder Probe im 1,2 cm-Abstand auf eine Polygram CEL 300 DEAE-Cellulosedünnschichtplatte von 20 × 20 cm aufgebracht, auf die vorher 5 μl gescherte Heringssamen-DNA (150 μg/ml) aufgebracht worden war, und trocknen gelassen. Nachdem die Probe trocken war, wurde die Platte in eine Wanne mit destilliertem H2O gebracht und das Wasser konnte gerade bis über die Probenauftragungsfläche laufen. Die Platte wurde dann in einem 70°C-Ofen in einen Glasentwicklungstank gebracht, der gefilterten Homo-Mix III (Jay et al., 1979, Nuc. Acid. Res. 1(3):331–353) enthielt, eine Lösung von teilweise hydrolysierter RNA, die 7 M Harnstoff enthält. Der Homo-Mix konnte mittels Kapillarwirkung bis zum oberen Ende der Platte laufen, zu welcher Zeit die Platte herausgenommen wurde, trocknen gelassen wurde, mit Saran Wrap bedeckt und dann autoradiographiert wurde.
  • Eine Übernachtexposition der Homochromatographieplatte zeigte auch, dass etwa 40% der Sonden zu kleineren Fragmenten abgebaut waren. Diese Fragmente waren sehr spezifisch in der Größe in Abhängigkeit von der Länge des nicht komplementären 5'-Schwanzes jeder Sonde. 1 zeigt eine Autoradiographie der DC-Platte. Die Sonde BW31 (Spuren 1-3), die vollständig komplementär zu der M13mp10w-Matrize war, erzeugte markierte Fragmente, die vorwiegend eine bis zwei Basen lang waren. Die Sonde BW33 (Spuren 4-6), die im 5'-Bereich einen nicht komplementären Bereich von 3 Basen enthielt, setzte Produkte frei, die vorwiegend vier bis sechs Basen lang waren. BW35 (Spuren 7-9) hatte im 5'-Bereich einen nicht komplementären Schwanz von 10 Basen und setzte Produkte frei, die vorwiegend 12 bis 13 Basen lang waren. Spuren 10-12 sind Kontrollreaktionen, die entweder BW31, BW33 oder BW35 und alle PCR-Komponenten außer der Matrize nach 15 Zyklen enthielten. Während der DNA-Synthese ersetzte das Enzym die ersten ein oder zwei betroffenen Basenpaare und schnitt dann an dieser Stelle, was eine Endonucleaseähnliche Aktivität anzeigte. Die Ergebnisse zeigen spezifische Sonden-Freisetzung in Übereinstimmung mit der Produktanhäufung bei der PCR.
  • Beispiel 2
  • Spezifität der Freisetzung von Sondenmarkierung
  • Die Spezifität der Freisetzung von markierter Sonde wurde mittels Durchführung einer PCR-Amplifikation unter Verwendung von DNA vom Bakteriophagen Lambda und Primern und einer Reihe von nicht komplementären Sonden nach Behandlung mit Kinase untersucht.
  • Der zu amplifizierende Bereich war ein Bereich von 500 Nucleotiden auf der DNA vom Bakteriophagen Lambda vom GeneAmp® DNA Amplification Reagent-Kit (Perkin-Elmer Cetus), flankiert von den Primern PCR01 und PCR02, ebenfalls vom GeneAmp® DNA-Kit.
    SEQ ID NR:6 PCR01 = 5'7131-7155 3'
    5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3'
    SEQ ID NR:7 PCR02 = 5'7630-7606 3'
    5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3'
  • Aliquots der selben drei markierten Sonden BW31, BW33 und BW35, die in Beispiel 1 identifiziert sind, wurden verwendet, von denen alle vollständig nicht komplementär zu der Zielsequenz waren.
  • Für die Amplifikation des 500 Basenpaarbereichs wurden 0,5 ng der Ziel-Lambda-DNA-Sequenz (Kontrollmatrize, Fabrikations-# 3269, 1 μg/ml, 1:10 verdünnt in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA und 10 mM NaCl als Stammlösung) zu 50 μl Reaktionsvolumen zugegeben, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl2, 1 μM von jedem der Primer PCR01 (Fabrikations-# 3355) und PCR02 (Fabrikations-# 3268), 200 μM von jedem der vier Desoxynucleosid-Triphosphate, 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und entweder 2, 10 oder 20 pmol der isotopisch verdünnten Sonden BW31, BW33 oder BW35 enthielt. Die Menge an radiomarkierter Sonde wurde pro Reaktion konstant bei 0,4 pmol gehalten und mit nicht radioaktiver Sonde auf 1, 10 oder 20 pmol verdünnt. Die Taq-DNA-Polymerase wurde mit 4 μl pro Reaktion bei 0,3125 Einheiten/μl zugegeben und verdünnt in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5% Tween 20 und 500 μg/ml Gelatine.
  • Der Stamm-Reaktionsmix wurde wie vorstehend gelehrt hergestellt, gleichzeitig mit den Kontrollreaktionen minus Sonde oder minus Enzym. Die Reaktionsgemische wurden gemäß den Zyklus-Bedingungen von Beispiel 1B amplifiziert und dann wie folgt analysiert. Für die Acrylamid-Gelanalyse wurden 4 μl von jeder Amplifikationsreaktion, gemischt mit 3 μl 5X Lademix, auf ein 4% Acrylamidgel in 1X TBE-Puffer aufgetragen und 90 Minuten mit 200 Volt der Elektrophorese unterworfen. Nach Anfärben mit Ethidiumbromid wurde die DNA mittels UV-Fluoreszenz sichtbar gemacht.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit von jeder Sonde bei jeder Konzentration keine Auswirkung hat auf die Menge des gebildeten Amplifikationsprodukts. Probenkontrollspuren, die keine Sonde enthielten, und alle Spuren, die eine Sonde enthielten, zeigten eine getrennte Bande hoher Intensität von 500 Basenpaaren, die der erwünschten Sequenz entsprachen. Kontrollspuren ohne zugegebenes Enzym zeigte keinerlei Produkt, sondern nur Banden niedriger Intensität, die die Primer und Sonden von etwa 30-40 Nucleotiden darstellten.
  • Die in 2 bereitgestellte Homochromatographie-Analyse zeigt eine Übernachtexposition der Platte, bei der kein Abbau der Sonden beobachtet wurde. Alle Impulse waren am Ursprungspunkt lokalisiert und zeigten keine Freisetzung von markierten Fragmenten. Spuren 1-3 sind Reaktionen, die die Sonde BW31 enthalten; Spuren 4-6 umfassen die Sonde BW33; Spuren 7-9 umfassen die Sonde BW35; und Spuren 10-12 sind Kontrollreaktionen ohne Matrize. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Sonde nicht abgebaut wird, außer sie ist spezifisch an das Ziel gebunden, und dass sie in der Lage ist, der PCR-Zyklus-Bedingungen zu widerstehen.
  • In der denaturierenden Gelanalyse wurden 2 μl von jeder Amplifikationsreaktion gemischt mit 2 μl Formamid-Ladepuffer (beschrieben in Beispiel 1) und bei 96°C für 3-5 Minuten auf einen Heizblock gestellt. Unmittelbar danach wurden die Proben auf Eis gestellt und auf ein denaturierendes 6,2% Gradienten-Acrylamidgel geladen und für 90 Minuten mit 2.000 Volt der Elektrophorese unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf Whatman-Papier übertragen, mit Saran Wrap bedeckt und autoradiographiert.
  • Eine Übernachtexposition zeigte alle Impulse im Bereich von 30-40 Basenpaaren, entsprechend der Größe der Sonden. Erneut war kein Sondenabbau ersichtlich, was weiterhin bestätigte, dass die Sonde spezifisch an die Matrize gebunden sein muss, bevor ein Abbau stattfinden kann.
  • Beispiel 3
  • Spezifität der Freisetzung von Sondenmarkierung in Gegenwart von genomischer DNA
  • In diesem Beispiel wurde die Spezifität der Freisetzung von Sondenmarkierung mittels der Durchführung einer PCR-Amplifikation in Gegenwart von abgebauter oder nicht abgebauter menschlicher genomischer DNA untersucht.
  • Nach Behandlung mit Kinase hatte die BW33-Sonde, die in diesem Experiment verwendet wurde, eine spezifische Aktivität von 5,28 × 106 CpM/pmol, die mittels TCA-Präzipitation nach der Kinase-Reaktion bestimmt wurde. Der amplifizierte Bereich war der 350 Basenpaar-Bereich von M13mp10w, flankiert von den Primern BW36 und BW42. Die Sequenzen und Lagen der Primer sind in Beispiel 1 aufgelistet. Menschliche genomische DNA war von der Zelllinie HL60 und wurde nicht abgebaut oder durch Scheren in einer French Presse zu einer Durchschnittsgröße von 800 Basenpaaren abgebaut verwendet.
  • Jede 50 μl-Amplifikationsreaktion bestand aus 10–2 oder 10–3 pmol M13mp10w-Zielsequenz, 1 μg entweder abgebauter oder nicht abgebauter genomischer HL60-DNA, die zugegeben war zu einem Gemisch, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl2, 10 pmol von jedem der Primer BW36 und BW 42, 200 μM von jedem der vier Desoxyribonucleosid-Triphosphate, 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und 10 pmol der isotopisch verdünnten Sonde BW33 enthielt.
  • Ein Stamm-Reaktionsmix wurde hergestellt, der geeignete Mengen an Reaktionspuffer, Nucleosid-Triphosphaten, Primern, Sonde und Enzym enthielt. Aliquots wurde hergestellt und zu ihnen wurde M13mp10w-Matrize und/oder genomische DNA zugegeben. Kontrollreaktionen umfassten alle Reaktionskomponenten außer M13mp10w-Ziel-DNA oder alle Reaktionskomponenten außer genomischer DNA.
  • Jedes Reaktionsgemisch wurde mit 50 μl Mineralöl überschichtet, mikrozentrifugiert, und in einen Thermo-Cycler gebracht. Die Reaktionsgemische wurden dem folgenden Amplifikationsschema unterworfen:
    Figure 00300001
  • Nach den Zyklen wurde das Mineralöl mit 50 μl Chloroform extrahiert, und die Proben wurden bei 4°C gelagert. Danach wurden die Proben mittels 4% Acrylamid-Gelelektrophorese und Homochromatographie-Analyse analysiert.
  • Für die Acrylamid-Gelanalyse wurden 4 μl von jedem Reaktionsgemisch mit 3 μl 5X Gel-Beladungs-Mix gemischt, auf ein 4% Acrylamid-Gel in 1X TBE-Puffer aufgetragen und 90 Minuten bei 220 Volt der Elektrophorese unterworfen. Nach Anfärben mit Ethidiumbromid wurde die DNA mittels UV-Fluoreszenz sichtbar gemacht.
  • In den Spuren, die den Kontrollproben entsprechen, die keine M13mp10w-Ziel-DNA enthielten, waren keine sichtbaren Produktbanden, was die Abwesenheit jeglicher Überkreuz-Verunreinigung mit M13mp10w anzeigte. Alle folgenden Spuren zeigten eine Bande bei 350 Basen, die der erwarteten Sequenz entspricht. Die Intensität der Bande war höher, wenn 10–2 pmol M13mp10w Ziel-DNA statt 10–3 pmol in der Abwesenheit oder Anwesenheit von genomischer DNA (abgebaut oder nicht abgebaut) anwesend waren. Die Intensität der Produktbande erhöhte sich mit steigender Zahl an Amplifikations-Zyklen. Zwanzig Zyklen produzierten eine Bande mit der doppelten Intensität der nach zehn Zyklen gesehenen, und 15 Zyklen erzeugten eine Bande mit dazwischenliegender Intensität. Die Menge an vorhandenem PCR-Produkt variierte mit der Menge an Ausgangs-Zielmatrize und der Zahl an Zyklen, und die Anwesenheit von 1 μg menschlicher genomischer DNA, ob abgebaut oder nicht abgebaut, zeigte keinerlei Effekt auf diese Produktbildung.
  • In der Homochromatographie-Analyse wurde 1 μl von jedem Reaktionsgemisch auf eine DEAE-Dünnschichtplatte aufgebracht und bei 70°C in eine Entwicklungskammer gebracht, die Homo-Mix III enthielt. Nach 90 Minuten wurde die Platte entfernt, trocknen gelassen, mit Saran Wrap bedeckt und autoradiographiert. Eine Übernachtexposition wird in 3 gezeigt; in 3A zeigen die Spuren 1 bis 6 PCR-Reaktionszyklen in der Abwesenheit von M13mp10w Matrizen-DNA, die abwechselnd abgebaute und nicht abgebaute HL60-DNA bei 10, 15 und 20 Zyklen enthielt; und die Spuren 7-12 sind Kontrollreaktionen in zweifacher Beladung, die M13mp10w-Matrizen-DNA ohne menschliche genomische DNA bei 10, 15 und 20 Zyklen enthielten. In 3B werden Reaktionen amplifiziert mit steigender Zyklenzahl in 5er Schritten, beginnend mit 10 Zyklen. Die M13mp10w-Matrizen-DNA-Konzentration bei den Reaktionen, die in den Spuren 1, 2, 5, 6, 9 und 10 gezeigt werden, ist 10–2 pmol, während sie in den Spuren 3, 4, 7, 8, 11 und 12 10–3 pmol ist. Die Reaktionen, die in den Spuren 1 bis 11 mit ungerader Zahl gezeigt werden, enthalten abgebaute menschliche genomische DNA, und die geraden Zahlen enthalten nicht abgebaute menschliche genomische DNA. Markierte Sondenfragmente wurde als zwei gut definierte Flecken gesehen, die mit einer Länge von etwa 4 und 5 Basen auf der Dünnschichtplatte wanderten. Wenn sich die Konzentration an Startmatrize und/oder die Zyklenzahl erhöhte, erhöhte sich auch die Menge an freigesetzten, markierten Sondenfragmenten. Die Anwesenheit oder Abwesenheit abgebauter oder nicht abgebauter menschlicher genomischer DNA störte oder erhöhte die Sonden-Hybridisierung und den Sonden-Abbau nicht.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass erhöhte Mengen von freigesetzten, kleinen Sondenfragmenten in Übereinstimmung und gleichzeitig mit der Anhäufung von spezifischem Produkt im Verlauf eines PCR-Tests auftreten. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von entweder großen Mengen menschlicher genomischer DNA hoher Komplexität oder einer hohen Zahl von zufälligen DNA-„Enden" hat keinen Effekt auf die spezifische Produktanhäufung oder das Ausmaß der Sondenfreisetzung. Letztlich führt die Anwesenheit von großen Mengen menschlicher genomischer DNA hoher Komplexität nicht zu irgendeiner nachweisbaren Freisetzung von Sonden in der Abwesenheit einer spezifischen Produktanhäufung.
  • Beispiel 4
  • PCR mit 3'-markierten Sonden
  • Eine PCR-Amplifikation wurde durchgeführt, die eine hybridisierte, 3'-radiomarkierte Sonde in kleineren Fragmenten freisetzte, wenn die Sonde an die Matrize angelagert war. Die Sequenzen der Sonden waren wie folgt:
    SEQ ID NR:8 DG46 = 5'5541-5512-3'
    5'-CGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGC-3'
    SEQ ID NR:9 BW32 = 5'5541-5512-3'
    5'-gatCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGC-3'
    SEQ ID NR:10 BW34 = 5'5541-5512-3'
    5'-cgtcaccgatCGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGC-3'
  • A. Markierung der Sonden mit 32P-Cordycepin und terminaler Transferase
  • Fünf pmol von jeder Sonde (DG46, BW32 und BW34) wurden einzeln mit 17,4 Einheiten terminaler Transferase (Stratagene) und 10 pmol [α-32P]-Cordycepin (Cordycepin: 3'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat, New England Nuclear, 5000 Ci/mmol, verdünnt 3X mit ddATP [Pharmacia]) in einem 17,5 μl-Reaktionsvolumen, das 100 mM Kaliumcacodylat, 25 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM CoCl2 und 0,2 mM Dithiothreit enthielt, für 60 Minuten bei 37°C gemischt. Das gesamte Volumen wurde dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die Sonden wurden in 50 μl TE-Puffer resuspendiert und über eine Sephadex G-50 Spindialysesäule laufen gelassen gemäß der Vorschrift von Sambrook et al., Molecular Cloning, vorstehend. Die Endkonzentration an Sonden war 0,1 pmol/μl. Die TCA-Präzipitation der Reaktionsprodukte ergab die folgenden spezifischen Aktivitäten:
    DG46: 2,13 × 106 CpM/pmol
    BW32: 1,78 × 106 CpM/pmol
    BW34: 5,02 × 106 CpM/pmol
  • Der Vergleich der Analyse mit denaturierendem Gradientengel der 3'-radiomarkierten Sonden mit den 5'-Kinase-behandelten Sonden BW31, BW33 und BW35 zeigt, dass die 3'-radiomarkierten Sonden in ähnlicher Weise laufen wie die 5'-radiomarkierten Sonden.
  • Wieder war der amplifizierte Bereich der 350 Basen-Bereich von M13mp10w, der durch die Primer BW36 und BW42 definiert wird. Die Sequenzen und Lagen der Primer sind in Beispiel 1 aufgelistet. Jedes Amplifikationsgemisch wurde hergestellt durch Zugabe von 10–3 pmol der M13mp10w-Ziel-DNA zu 50 μl Reaktionsvolumen, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl2, 10 pmol von jedem der Primer BW36 und BW42, 200 μM von jedem der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate, 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase und entweder 2, 10 oder 20 pmol der isotopisch verdünnten Sonde DG46, BW32 oder BW34 enthielt.
  • Ein Stamm-Reaktionsmix wurde hergestellt, der die geeigneten Mengen an Reaktionspuffer, Nucleosidtriphosphaten, Matrize und Enzym enthielt. Aliquots wurden hergestellt und zu ihnen wurden die geeigneten Mengen an Primer und Sonden zugegeben. Die Kontrollreaktionen umfassten alle Reaktionskomponenten außer Primer, und alle Reaktionskomponenten außer einer Sonde.
  • Die Reaktionsgemische wurden mit 50 μl Mineralöl überschichtet, mikrozentrifugiert und in einen Thermo-Cycler gebracht. Das Amplifikationsschema war wie folgt:
    Figure 00330001
  • Nach den Zyklen wurde das Mineralöl mit 50 μl Chloroform extrahiert, und die Proben wurden bei 4°C gelagert.
  • Die Proben wurden analysiert mittels eines 4% Acrylamidgels, eines denaturierenden 8% Gradienten-Acrylamidgels und Homochromatographie. Für alle drei Analysen war die Handhabung der Reaktionsgemische wie vorstehend beschrieben.
  • In der 4% Acrylamidgel-Analyse war in allen Reaktionsgemischen außer in den Kontrollreaktionen minus Primer eine scharfe Bande sichtbar, die dem gewünschten Produkt von 350 Basen entsprach. In allen Reaktionsgemischen, die sowohl Primer als auch Sonde enthielten, war eine zweite Bande bei etwa 300 Basen sichtbar. Diese zweite Bande wurde mit steigender Sondenkonzentration intensiver und entsprach vermutlich der Sonde, die entweder nicht effizient 3'-radiomarkiert war oder die die 3'-Markierung verloren hatte, was die Verlängerung der Sonde und die Erzeugung eines Produkts zuließ.
  • Eine Übernachtexposition des denaturierenden 8% Gradienten-Acrylamidgels zeigte eine Verteilung der Produkte, die von Sonden voller Größe bis zu weniger als 15 Basen bei allen drei Sonden, die mitgelaufen waren, reichte. Wie zu erwarten wäre, baute die 5'-3'-Nucleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase die Sonde bis zu einem Punkt ab, wo die abgebaute Sonde von der Matrize dissoziierte.
  • Die weite Größenverteilung der Produkte veranschaulichte für die kontinuierlich wechselnden Konzentrationen der Reaktanden und die Temperaturveränderungen während der PCR-Zyklen. Solche Variationen würden zu Veränderungen in den Anlagerungskinetiken von Sonde und Enzym führen, was dazu führt, dass die Sonde in einer Vielzahl von Größen zu verschiedenen Zeiten bei dem routinemäßigen Zyklenablauf dissoziiert.
  • Die Homochromatographieplatte zeigte, dass das kleinste Produkt bei allen untersuchten Sonden etwa 10 bis 12 Basen lang war. Da alle drei Sonden eine identische Sequenz außer am 5'-Schwanzbereich hatten, zeigt dieses Ergebnis, dass für diese spezifische Sondensequenz bei einer Anlagerungs-/Verlängerungstemperatur von 60°C die Sonde bis etwa 10 Basen abgebaut wurde und dann von der Matrize dissoziierte.
  • Beispiel 5
  • Von der Polymerisiation unabhängige 5'-3'-Nucleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase
  • Die Taq-DNA-Polymerase war in der Lage, das 32P-markierte 5'-Ende einer hybridisierten Sonde freizusetzen, wenn sie mittels eines stromaufwärts gelegenen Primers in der Nähe dieser Sonde positioniert war. Eine Reihe von Primern wurde geplant, die zwischen null und 20 Basen stromaufwärts von der hybridisierten Sonde BW33 nach der Kinasereaktion lagen. Diese Primer sind nachstehend gezeigt.
    BW37 SEQ ID NR:11 Delta-0 5'5571-5542 3'
    5'-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCA-3'
    BW38 SEQ ID NR:12 Delta-1 5'5572-5543 3'
    5'-GGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTC-3'
    BW39 SEQ ID NR:13 Delta-2 5'5573-5544 3'
    5'-GGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGT-3'
    BW40 SEQ ID NR:14 Delta-5 5'5576-5547 3'
    5'-AGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGC-3'
    BW41 SEQ ID NR:15 Delta-10 5'5581-5552 3'
    5'-AAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGT-3'
    BW42 SEQ ID NR:16 Delta-20 5'5591-5562 3'
    5'-GAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGC-3'
  • Etwa 0,5 pmol der Sonde BW33 und 0,5 pmol von jedem der Primer wurden an 0,5 pmol M13mp10w in 10,5 μl Reaktionsvolumen, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, und 3 mM MgCl2 enthielt, angelagert. Kontrollreaktionsgemische enthielten entweder 20 μM oder 200 μM von jedem der vier Desoxynucleosidtriphosphate. Ein zusätzlicher Primer, DG47, der 530 Basen stromaufwärts von der Sonde liegt, wurde verwendet.
    DG47 SEQ ID NR:17 Delta-530 5'6041-6012 3'
    5'-CGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCG-3'
  • Reaktionsgemische wurden für 1 Minute auf 98°C erhitzt und bei 60°C 30 Minuten angelagert. Die Röhrchen wurden dann mikrozentrifugiert und bei 70°C in ein Wasserbad gestellt. Nach ausreichender Zeit für die Einstellung der Temperatur der Reaktionsgemische wurden 10, 5, 2,5, 1,25 oder 0,3125 Einheiten Taq-DNA-Polymerase zugegeben, und 4 μl-Aliquots wurden nach 2, 5 und 10 Minuten entnommen. Das Enzym wurde durch Zugabe von 4 μl 10 mM EDTA zu jedem Aliquot und Stehenlassen bei 4°C inaktiviert. Die Reaktionsgemische wurden mittels Homochromatographieanalyse untersucht.
  • Bei der Homochromatographieanalyse wurde 1 μl von jeder Probe auf DEAE-Cellulose-Dünnschichtplatten aufgebracht und in eine Entwicklungskammer gebracht, die Homo-Mix III bei 70°C enthielt. Den Homo-Mix ließ man zum oberen Ende jeder Platte laufen; zu diesem Zeitpunkt wurden die Platten herausgenommen, getrocknet, mit Saran Wrap bedeckt und autoradiographiert. 4 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments.
  • In 4 enthalten die Spuren 1 bis 3 radiomarkierte Oligonucleotide als Molekulargrößenmarker mit 6, 8, 9, 10, 11, 12 und 13 Nucleotiden. Die Spuren 4-10 zeigen die Reaktionen für die Primer BW37, BW38, BW39, BW40, BW41, BW42 beziehungsweise DG47 in Abwesenheit von dNTPs. Die Spuren 11-24 zeigen die Kontrollreaktionen für alle Primer in Anwesenheit von 20 mM oder 200 mM dNTP.
  • In Abwesenheit von dNTPs erzeugte die Taq-DNA-Polymerase markierte Sondenfragmente unter Verwendung aller Primer, wobei beträchtlich weniger Markierung freigesetzt wurde, wenn sich der Abstand Primer-Sonde vergrößerte. Dieser Effekt wurde bei allen untersuchten Enzymkonzentration (0,3125 U bis 10 U/Reaktion) und zu allen Zeitpunkten gesehen. Die Größen der freigesetzten Fragmente waren gleich, etwa zwei und drei Basen lang; die Hauptart variierte jedoch in Abhängigkeit vom zugegebenen Primer. Die Hauptart, die durch die Primer Delta null und Delta zwei freigesetzt wurde, war eine Base kleiner als die von den Primern Delta eins, fünf, 10 und 20 freigesetzte. Die Nucleaseaktivität war polymerisationsunabhängig und -abhängig vom Abstand.
  • In Gegenwart von Nucleosidtriphosphaten waren die Größen der freigesetzten markierten Sondenfragmente und der relative Anteil von jedem für alle untersuchten Primer identisch. Auch die Größen der Produkte waren ein bis zwei Basen größer, wenn dNTPs anwesend waren. Es kann sein, dass das Enzym, während es die Polymerisierung durchführte, es einen „fliegenden Start" hatte und beim Auftreffen auf die hybridisierte Sonde gleichzeitig ein bis zwei Basen verdrängte und dann schnitt und damit ein größeres Fragment erzeugte.
  • Es gab keinen nachweisbaren Unterschied bei der Menge von freigesetztem Produkt, wenn die dNTPs jeweils zu 20 μM oder 200 μM vorhanden waren, und keine wesentlichen Unterschiede aufgrund von Verlängerungszeiten oder Enzymkonzentrationen in der Gegenwart von dNTPs waren ersichtlich.
  • Beispiel 6
  • Beispiel, um die Beschaffenheit des freigesetzten Produkts, basierend auf der Sondensequenz am 5'-Ende, zu veranschaulichen
  • Der Effekt starker oder schwacher Basenpaarung am komplementären 5'-Bereich einer Sonde auf die Größe des freigesetzten Produkts wurde untersucht. Die zwei Sonden BW50 und BW51 wurden so geplant, dass sie entweder eine GC-reichen oder AT-reichen komplementären 5'-Bereich hatten. BW50 und BW51 wurden mit der Sonde BW33 verglichen, die in Beispiel V verwendet wurde.
    SEQ ID NR:18 BW50 = 5'5521-5496 3'
    5'-tatCCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACA-3'
    SEQ ID NR:19 BW51 = 5'5511-5481 3'
    5'-gcaTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGG-3'
    a,t,g,c = Basen, die zum Matrizenstrang nicht komplementär sind
  • BW50, BW51 und BW33 wurden mit 32P-ATP unter Verwendung von Polynucleotidkinase markiert und hatten die folgenden spezifischen Aktivitäten:
    BW50: 1,70 × 106 CpM/pmol
    BW51: 2,22 × 106 CpM/pmol
    BW33: 1,44 × 106 CpM/pmol
  • Die Endkonzentration aller drei Sonden war 0,10 pmol/μl.
  • 0,5 pmol von entweder der Sonde BW50, BW51 oder BW33 und 0,5 pmol von Primer BW41 wurden einzeln an 0,5 pmol von M13mp10w in 10,5 μl Reaktionsvolumen angelagert, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 3 mM MgCl2 und 200 μM von jedem der vier Desoxynucleosidtriphosphate enthielt. Kontrollproben enthielten alle Reaktionskomponenten außer der Matrize. Für den Anlagerungsschritt wurden die Reaktionsgemische für 1 Minute auf 98°C erhitzt und dann für 30 Minuten bei 60°C angelagert. Die Röhrchen wurden dann mikrozentrifugiert und bei 50°C, 60°C oder 70°C in ein Wasserbad gestellt. Nach ausreichender Zeit für die Einstellung der Temperatur der Reaktionsgemische wurden 0,3125 Einheiten an Taq DNA-Polymerase zugegeben. Vier μl-Aliquots wurden nach 1, 2 und 5 Minuten entnommen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 4 μl 10 mM EDTA zu jedem Aliquot und Stehenlassen bei 4°C inaktiviert. Die Proben wurden mittels Homochromatographie-analyse untersucht, und die Ergebnisse werden in den 5 und 6 gezeigt.
  • 5 zeigt die Reaktionen, die die GC-reiche Sonde BW50 enthalten. Die Spuren 1 bis 3 enthalten Oligonucleotide als Molekulargrößenmarker mit 6, 8, 9, 10, 11, 12 und 13 Nucleotiden. Die Spuren 4-6 zeigen Verlängerungsreaktionen, die bei 50°C für 1, 2 und 5 Minuten durchgeführt wurden. Die Spuren 7-9 zeigen Verlängerungsreaktionen, die bei 60°C für 1, 2 und 5 Minuten durchgeführt wurden. Die Spuren 10-12 zeigen Reaktionen, die bei 70°C für 1, 2 und 5 Minuten durchgeführt wurden. Die Spuren 13-15 sind Kontrollreaktionen, die alle Komponenten außer der Matrize enthalten, inkubiert bei 70°C für 1, 2 und 5 Minuten.
  • 6 zeigt die Reaktionen, die die AT-reiche Sonde BW51 enthalten. Wie in 5 sind die Spuren 1 bis 3 Oligonucleotide als Molekulargrößenmarker mit 6, 8, 9, 10, 11, 12 und 13 Nucleotiden. Die Spuren 4-6 sind Verlängerungsreaktionen, die bei 50°C für 1, 2 und 5 Minuten durchgeführt wurden. Die Spuren 7-9 sind Reaktionen, die bei 60°C für 1, 2 und 5 Minuten durchgeführt wurden. Die Spuren 10-12 sind Reaktionen, die bei 70°C für 1, 2 und 5 Minuten durchgeführt wurden. Die Spuren 13-15 sind Kontrollreaktionen, die alle Komponenten außer der Matrize enthalten, inkubiert bei 70°C für 1, 2 und 5 Minuten.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Natur der Sondenmarkierungsfreisetzung abhängig war von der Temperatur und der Basenzusammensetzung am 5'-Ende. Die stabilere GC-reiche Sonde BW50 zeigte bei 50°C eine geringe Freisetzung der Markierung (5, Spuren 4-6) und zunehmend mehr bei 60°C (5, Spuren 7-9) und 70°C (5, Spuren 10-12). Die hauptsächlichen freigesetzten Produkte waren 3-5 Basen lang. BW51, das am 5'-Ende AT-reich war, zeigte bei 50°C (6, Spuren 4-6) ein solches Ausmaß an Freisetzung von Markierung, wie sie bei den höheren Temperaturen beobachtet wurde. Zusätzlich bildete die AT-reiche Sonde größere Produkte als die GC-reiche Sonde. Die Basenzusammensetzung der AT-reichen Sonde mag Gelegenheit geben zu einer größeren „Atmungs"-Kapazität und daher eine stärkere Sondenverdrängung vor dem Schneiden bei niedrigeren Temperaturen als die GC-reiche Sonde zulassen.
  • Beispiel 7
  • HIV-Einfang-Test
  • Das folgende ist ein Beispiel für die Verwendung einer zweifach markierten Sonde, die Biotin enthält, in einer PCR, um die Anwesenheit einer Zielsequenz nachzuweisen. Zwei Oligonucleotide, BW73 und BW74, jedes komplementär zu einem Bereich des HIV-Genoms, wurden mit einem an das 3'-Ende des Oligonucleotids gebundenen Biotinmolekül synthetisiert. Das 5'-Ende jedes Oligonucleotids wurde zusätzlich mit 32P unter Verwendung von Polynucleotidkinase und Gamma-32P-ATP markiert. Die beiden Oligonucleotide PH7 und PH8 sind ebenfalls komplementär zum HIV-Genom, flankieren den Bereich, der eine Homologie zu den beiden Sondenoligonucleotiden enthält und können als PCR-Primer dienen, wobei sie ein Produkt von 142 Basen definieren. Die Sequenzen dieser Oligonucleotide werden nachstehend gezeigt.
    SEQ ID NR:20 BW73 = 32P-GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT-Y
    SEQ ID NR:21 BW74 = 32P-gtgGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT-Y
    SEQ ID NR:22 PH7 = AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT
    SEQ ID NR:23 PH8 = TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT
  • In den Sequenzen steht „Y" für Biotin, und kleingeschriebene Buchstaben stehen für Basen, die zum Matrizenstrang nicht komplementär sind.
  • Eine Reihe von 50 μl Polymerasekettenreaktionen wurden konstruiert, die entweder BW73 oder BW74, jeweils doppelt markiert, als Sondenoligonucleotide mit 2 nM enthielten. Zusätzlich wurde die HIV-Matrize in der Form eines Plasmidclons mit entweder 102 oder 103 Kopien pro Reaktion zugegeben, und die Primeroligonucleotide PH7 und PH8 wurden mit jeweils 0,4 μM zugegeben. Taq-Polymerase wurde mit 1,25 U pro Reaktion und dNTPs mit jeweils 200 μM zugegeben. Jede Reaktion wurde mit 50 μl Öl überschichtet, kurz in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um sämtliche Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln, und die Thermozyklen wurden bei 95°C und 60°C mit 60 Sekunden Dauer bei jeder Temperatur für 30, 35 oder 40 Zyklen durchgeführt. Am Ende der Thermozyklen wurde jede Reaktion mit 50 μl CHCl3 extrahiert und die flüssige Phase gesammelt.
  • Jede Reaktion wurde auf Amplifikation durch Auftragen von 3 μl auf ein 5% Acrylamid-Elektrophoresegel untersucht und auf das erwartete 142 Basenpaarprodukt überprüft. Zusätzlich wurde 1 μl von jeder Reaktion mittels DC-Homochromatographie auf DEAE-Celluloseplatten untersucht. Letztlich wurde jede Reaktion weiterhin durch Inkontaktbringen des restlichen Volumens mit 25 μl einer Suspension von 10 mg/ml Streptavidin-markierten, superparamagnetischen DYNABEADS M-280-Polystyrol-Kügelchen untersucht. Nach der Reaktion mit den Kügelchen wurde das Gemisch durch Filtration durch einen Costar Spin X-Zentrifugenfilter getrennt, das Filtrat gesammelt und die Anwesenheit von freigesetzter Radiomarkierung bestimmt.
  • 7 enthält Bilder von den zwei verwendeten Gelen und zeigt, dass das 142 Basenpaarprodukt bei allen Reaktionen mit und ohne Sonde auftritt, und in der Menge ansteigt, wenn sowohl die Startmatrize von 102 auf 103 Kopien erhöht wurde als auch die Thermozyklen von 30 auf 35 und 40 Zyklen weitergeführt wurden.
  • 8 ist eine Zusammensetzung aus zwei Autoradiogrammen der DC-Analyse von Aliquots der PCRs, die zeigen, dass eine Freisetzung von Radiomarkierung in steigenden Mengen sowohl bei zunehmender Startmatrize als auch längerem Thermozyklus auftritt. In der ersten DC von PCRs mit BW73 enthalten die Spuren 1 uns 3 radiomarkierte Oligonucleotide von 2 und 3 Basen Länge als Größenstandards. Die Spuren 4, 5 und 6 enthalten Proben von PCRs mit 102 Startkopien an Matrize und die Spuren 7, 8 und 9 mit 103 Startkopien. Bei den Proben in den Spuren 4 und 7 wurden 30 Thermozyklen durchgeführt; 35 Thermozyklen in den Spuren 5 und 8; und in den Spuren 6 und 9 wurden 40 Thermozyklen durchgeführt. In der zweiten DC von PCRs mit BW74 sind die Spuren 1 und 2 das radiomarkierte Dimer und Trimer; die Spuren 4, 5 und 6 enthalten Proben von PCRs mit 102 Startkopien an Matrize, die 30, 35 beziehungsweise 40 Thermozyklen unterworfen wurden und die Spuren 7, 8 und 9 enthaltenen Proben von PCRs mit 103 Startkopien an Matrize, die 30, 35 beziehungsweise 40 Thermozyklen unterworfen wurden. Die Größe der freigesetzten Markierung ist mit BW73 kleiner, das keine nicht-komplementären 5'-Basen hat, und größer mit BW74, das 5' eine nicht-komplementäre Verlängerung von drei Basen hat. Jedes Chromatogramm wurde zusätzlich mittels zweidimensionaler Radioisotopen-Bildgebung unter Verwendung eines Ambis-Zählers analysiert. Die Ergebnisse der Ambis-Zählung und der Kügelchen-Einfangzählung werden in Tabelle 1 gezeigt. Die gute Übereinstimmung bei den beiden Messverfahren der Freisetzung von Sonde zeigt die Praktikabilität der Verwendung von markierten biotinylierten Sonden und avidinylierten Kügelchen in der PCR zur Bestimmung der Produktbildung.
  • Tabelle 1
    Figure 00410001
  • Beispiel 8
  • Sondenmarkierung und Methode mit Festphasenextraktionsmitteln
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nach der Spaltung der Sonde, aber vor der Bestimmung der Menge der gespaltenen Sonde ein Trennschritt eingeführt, um die Produkte der gespaltenen Sonde von der nicht gespaltenen Sonde abzutrennen. Zwei alternative Trennverfahren werden bevorzugt: (1) die Verwendung von avidinylierten oder streptavidinylierten magnetischen Partikeln zur Bindung von Sonden, die am 3'-Ende mit Biotin und am 5'-Ende mit einem Fluorophor markiert sind; die magnetischen Partikel binden sowohl die nicht gespaltene Sonde als auch das 3'-Fragment, das das Produkt der Spaltung der Sonde ist; und (2) die Verwendung von magnetischen Ionenaustauscherpartikeln, die Oligonucleotide binden, aber nicht Mono- oder Dinucleotide, die typischerweise am 5'-Ende mit einem Fluorophor oder 32P markiert sind. Verschiedene Aspekte dieser alternativen Strategien werden nachstehend diskutiert.
  • A. Avidinylierte magnetische Partikel
  • Das Trennsystem, das 3'-biotinylierte Sonden und magnetische avidinylierte (oder streptavidinylierte) Kügelchen umfasst, wird vorzugsweise mit Kügelchen wie DynabeadsTM von Dynal durchgeführt; diese Kügelchen haben eine Bindungskapazität für Biotin von etwa 100 pmol pro 50 μl Kügelchen. Die nicht spezifische Adsorption wird durch vorherige Behandlung der Kügelchen mit Denhardt's Lösung und Träger-DNA minimiert.
  • Die Sonde für die Streptavidin-Biotin-Trennverfahren erfordert eine Biotingruppe am 3'-Ende und ein Fluorophor am 5'-Ende. Das 3'-Biotin fungiert sowohl als Ligand für die Trennung mittels streptavidinylierter (oder avidinylierter) Kügelchen und als ein Block, um die Verlängerung der Sonde während der Amplifikation zu verhindern. Die Modifkationen nach der Synthese können durch Verlängerung jedes Endes der Sonde mit einem anderen Nucleophil vereinfacht werden; zum Beispiel kann man an das 3'-Ende ein Amin zur Anfügung von Biotin und an das 5'-Ende ein blockiertes Thiol für die spätere Anfügung des Fluorophors anfügen. Die 3'-biotinylierten Sonden können auf unterschiedliche Weisen hergestellt werden, von denen nachstehend einige beschrieben werden.
  • Ein NHS-aktives Esterderivat von Biotin kann mittels des in 9 gezeigten Reaktionsmechanismus an das 3'-Amin der Sonde angefügt werden. Die resultierende Bindung schafft eine sekundäre Hydroxylgruppe in Gamma-Stellung zu der Amid-Carbonylgruppe, was während der wiederholten Thermozyklen einer normalen PCR zu einer Instabilität führen kann. Zum Beispiel können Thermozyklen von 40 Zyklen sogar dazu führen, dass 6% der anfänglich zugegebenen Sonde nicht magnetische, avidinylierte Partikel binden. Wenn die Bindung zwischen der Sonde und dem gebundenen Biotin als Ergebnis der Thermozyklen zusammenbricht, kann die Sonde nicht mehr von den Spaltprodukten getrennt werden und trägt zum Hintergrund bei. Obwohl man dazu beitragen kann, dieses Problem zu überwinden, indem man mehr als ein Biotin an die Sonde bindet, können mehrere alternative Verfahren zur Bindung von Biotin an ein Oligonucleotid stabilere Produkte ergeben.
  • Man kann Biotin-Hydrazid mit Aldehyden zur Reaktion bringen, die von einer 3'-Ribose an der Sonde gebildet wurden, um biotinylierte Oligonucleotide zu erhalten. Für diese Strategie enthält das 3'-Nucleotid der Sonde einen Ribose-Zucker anstelle eines Desoxyribose-Zuckers. Während der Synthese wird die 3'-Ribose mit entweder ihrem 2'- oder ihrem 3'-OH an den festen Träger gebunden. Nach der Synthese wird das fertiggestellte Oligonucleotid von dem festen Träger freigesetzt, und die benachbarten Diolgruppen der Ribose werden mittels Natriumperjodat (NaIO4) zu Aldehyden oxidiert, die dann mit dem Biotin-Hydrazid zur Reaktion gebracht werden, wie in 10 gezeigt, und das Produkt wird mittels Natriumborhydrid (NaBH4) reduziert. Die resultierende biotinylierte Sonde bindet jedoch nicht effizient an die avidinylierten magnetischen Partikel. Die Verwendung von langkettigem Biotin-Hydrazid, einer auch in 10 gezeigten Verbindung, kann dieses Problem lösen.
  • Man kann das Biotin während der Synthese der Sonde an die Sonde unter Verwendung eines löslichen Biotin-Phosphoramidits binden, wie in 11 gezeigt. Die Synthese beginnt mit der Bindung einer Base an kontrolliert poröses Glas (CPG-controlled porous glass), die letztlich freigesetzt wird. Ein Phosphoramidit wird angefügt, welches bei der Ammoniumhydroxid-Schutzgruppenabspaltung von dem synthetischen Oligonucleotid die Bildung eines 3'-Phosphats erlaubt. Dann wird das Biotin-Phosphoramidit angefügt, und das synthetisierte Oligonucleotid ist so, wie in 11 – die auch das Endprodukt darstellt – gezeigt. Dieses Verfahren der Bindung erlaubt die Verwendung von Oligonucleotiden, die am 5'-Ende ein Amin haben, für die Bindung eines Fluorophors. Die Verwendung eines 3'-Amins für die Bindung von Biotin beschränkt die Chemie der Bindung eines Fluorophors auf 5'-Thiolgruppen. Die Verwendung von Biotin-Phosphoramiditen, bei denen einer der Biotin-Stickstoffe blockiert ist, kann die Synthese der Biotin-markierten Sonde verbessern.
  • Man kann auch ein kommerzielles Reagens verwenden, das aus Biotin besteht, das direkt an poröses Glas gebunden ist; das Reagens ist das Startsubstrat für die Synthese der Sonde und wird in 12 gezeigt. Dieses Verfahren der Bindung erlaubt die Verwendung von Oligonucleotiden mit einem Amin am 5'-Ende für die Bindung des Fluorophors. Die Verwendung eines 3'-Amins für die Bindung von Biotin beschränkt die Chemie der Bindung eines Fluorophors auf 5'-Thiolgruppen. Enzymatische Verfahren für die Bindung von modifizierten Nucleotiden an das 5'-Ende von Oligonucleotiden stehen auch zur Verfügung, sind aber limitiert in ihrer Allgemeinheit und Praktikabilität.
  • B. Magnetische Ionenaustauschermatrizen
  • Man kann kommerziell erhältliche Polyethylenimin (PEI)-Matrizen (auf der Basis von Cellulose-, Silica- und Polyol-Polymer)-Partikel verwenden, um gespaltene von nicht gespaltener Sonde zu trennen. Zum Beispiel sind Hydrophase PEI, SelectacelTM PEI, BakerbondTM PEI und Amicon PAE 300, 1000 und 1000L kommerziell erhältliche PEI-Matrizen, die eine Trennung von nicht gespaltener Sonde von gespaltenen Sondenprodukten ergeben.
  • Kommerziell erhältliche magnetische Partikel mit aktivierter Cellulose, wie Cortex MagaCellTM-Partikel, können mit PEIs von verschiedener Länge, wie PEI600, PEI1800 und PEI10000, und mit verschiedenen molaren Verhältnissen von PEI pro Gramm Matrix derivatisiert werden. Jedoch binden alle Größen von Oligonucleotiden und Cumarin-markierten Oligonucleotiden an magnetische Cellulose- und Agarose-Kügelchen, ob sie mit PEI derivatisiert worden sind oder nicht (die Spezifität, die man mit Oligonucleotiden auf kommerziell erhältlichen PEI-Matrizen sieht, geht verloren, wenn man die Oligonucleotide mit Cumarin markiert). Die Zugabe von hohen Konzentrationen an Salz (2,0 M NaCl) oder N-Methyl-Pyrrolidon (10-20%) erhöht zum Teil die Spezifität, und andere gleichzeitig verwendete Lösungsmittel wie SDS, Brij 35, Guanidin und Harnstoff, können ebenfalls verwendet werden, um die Spezifität der Bindung zu erhöhen. 8 M Harnstoff jedoch führt zu einem effektiven Blockieren der nicht spezifischen Bindung von Cumarin-markierten Di- und Trinucleotiden an sowohl BakerbondTM PEI als auch magnetische PEI-derivatisierte CortexTM-Partikel, obwohl die Verwendung von N-substituierten Harnstoffen stärker bevorzugt sein kann.
  • Wie vorstehend festgehalten, verkauft Cortex Biochem eine Vielzahl von aktivierten, Cellulose-beschichteten, magnetischen Partikeln, die an PEI gebunden werden können. Die geeignetste von diesen ist die durch Perjodat aktivierte Matrix. Das vom Hersteller empfohlene Protokoll zur Bindung von Aminen an die durch Perjodat aktivierte Matrix hat jedoch mehrere Probleme: die Reaktion eines Amins mit einem Aldehyd resultiert in Iminen, die labil sind und hydrolysiert werden können oder mit Aminen weiterreagieren können; während des Schrittes des Blockierens der restlichen Aldehydgruppen durch die Zugabe eines Überschusses an Ethanolamin kann PEI durch Ethanolamin ersetzt werden, wodurch PEI von der Matrix verdrängt wird; während der Konjugationsreaktion unter basischen Bedingungen kann die Aldol-Kondensation zur Reaktion unter den Aldehydgruppen führen, woraus eine Aggregation der Partikel resultiert; und die Reaktion von Aldehyden unter basischen Bedingungen kann in freien Radikalen resultieren, die Cellulose angreifen können und an einer Vielzahl von Reaktionen teilnehmen können.
  • Um das Imin zu stabilisieren, kann ein Reduktionsschritt (mit NaBH4 und NaBH3CN) eingebaut werden; dieser Schritt kann jedoch in einer Produktion von Gas resultieren, in einer Abnahme der Masse der Partikel und in einer Partikel-Agglutination. Diese unerwünschten Effekte können aus der Produktion von freien Radikalen resultieren. Die Komplikationen, die aus der Konjugation mit aktivem Aldehyd resultieren, können durch die Verwendung der Epoxid-Chemie vermieden werden. Die resultierenden Beta-Hydroxyamine sind stabil und erfordern keine Reduktion. Da zusätzlich Sauerstoff an der Bildung von freien Radikalen beteiligt sein kann, sollte die Entfernung von Sauerstoff aus dem System die Bildung von freien Radikalen minimieren, insbesondere während des Reduktionsschritts. In einer Synthese von PEI-derivatisierten, Cellulose-beschichteten, magnetischen Partikeln wurde der Blockierungsschritt mit Ethanolamin eliminiert und das Gemisch über Nacht mit Helium vor und während Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid gespült. In der endgültigen Herstellung war wenig Aggregation.
  • Magnetische Partikel aus Polyacrolein können sowohl mit PEI600 als auch mit Ethylendiamin derivatisiert werden, und die nicht spezifische Bindung von Cumarinmarkierten Di- und Trinucleotiden kann durch hohe Konzentrationen an NMP inhibiert werden. Die Verwendung von längerkettigen PEI-Polymeren kann die nicht spezifische Wechselwirkung des Gerüsts mit kleinen, Cumarin-markierten Oligonucleotiden maskieren.
  • Ein wichtiger Faktor bei der Auswahl einer magnetischen Matrix zur Verwendung bei dem vorliegenden Verfahren ist die Menge an Hintergrundfluoreszenz, die von der Matrix beigetragen wird. Eine Strategie zur Minimierung dieser Hintergrundfluoreszenz ist die Auswahl eines Fluorophors mit Anregungs- und Emissionsmaxima, die nur minimal mit den Spektren der Hintergrundfluoreszenz von Puffer, Matrix und klinischen Proben überlappen. Zusätzlich kann der fluoreszierende Hintergrund auch aus der Anwesenheit von Verunreinigungen in der Matrix resultieren, die durch intensive Vorbehandlung vor der Bindung entfernt werden könnten.
  • C. Chemie der Bindung des Fluorophors an die Sonde
  • Wie vorstehend festgehalten ist die bevorzugte Markierung für die Sonde, unabhängig von der Trennungsstrategie, ein Fluorophor. Es scheint eine Wechselwirkung zwischen der Oligonucleotidsonde und dem gebundenen Fluorophor zu geben. Diese Wechselwirkung kann verantwortlich sein für das belegte Quenching, das beobachtet wird, wenn Fluorophore an Oligonucleotide gebunden worden sind. Man sollte Fluorophore auswählen, die minimal mit DNA wechselwirken, wenn sie an das 5'-Ende der Nucleinsäure gebunden sind.
  • Drei bevorzugte Fluorophore sind 7-Diethylamino-3-(4'-maleimidylphenyl)-4-methylcumarin (CPM), 6-(Brommethyl)-fluorescein (BMF), Lucifergelb-jodacetamid (LYIA) und 5-(und 6-)Carboxy-X-rhodamin-succinimidyl-ester, wobei CPM wegen mehrerer Eigenschaften bevorzugt wird: großer Extinktionskoeffizient, große Quantenausbeute, geringe Ausbleichung und große Stokes-Verschiebung. Das Fluorophor kann durch eine Thiolgruppe gebunden werden, das an die 5'-Phosphatgruppe der Sonde gebunden ist, aber im Falle von CPM ergibt dieses Verfahren ein Arylmaleimid, das unter den Bedingungen des Thermozyklus instabil sein kann.
  • Eine Anzahl von kommerziellen Instrumenten sind für die Analyse von fluoreszierend markiertem Material verfügbar. Zum Beispiel kann das ABI-Gene-Analyzergerät verwendet werden, um attomolare Mengen von DNA zu analysieren, die mit Fluorophoren, wie ROX (6-Carboxy-X-rhodamin), Rhodamin-NHS, TAMRA (5/6-Carboxytetramethylrhodamin-NHS) und FAM (5'-Carboxyfluoreszein-NHS), markiert sind. Diese Verbindungen sind durch eine Amidbindung über ein 5'-Alkylamin auf der Sonde an die Sonde gebunden. Andere nützliche Fluorophore umfassen CNHS (7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure, Succinimidylester), das ebenfalls über eine Amidbindung gebunden werden kann.
  • Beim Markierungsverfahren können Modifikationen erforderlich sein, um die effiziente Bindung eines vorgegebenen Fluorophors an eine spezielle Oligonucleotidsonde zu erreichen. Zum Beispiel war die anfängliche Reaktion zwischen einer Sonde mit einem Amin am 5'-Ende und 7-Diethylaminocumarin-3-carboxylat-NHS-Ester sehr ineffizient. Die Sonde, die am 3'-Ende phosphoryliert worden war, um eine Verlängerung der Sonde während der Amplifikation zu verhindern, hatte eine signifikante Sekundärstruktur, von denen eine Konformation das 5'-Amin in ausreichende Nähe zum 3'-Phosphat brachte, um eine Salzbrücke zu bilden. Diese Struktur kann verhindert haben, dass das 5'-Amin für die Reaktion mit dem NHS-Ester zur Verfügung stand, was die niedrige Ausbeute an Produkt verursachte. Die Zugabe von 25% N-methylpyrrolidon (NMP) verbesserte die Effizienz der Reaktion beträchtlich.
  • Man kann auch sowohl ein Fluorophor als auch ein Quencher-Mittel verwenden, um die Sonde zu markieren. Wenn die Sonde intakt ist, wird die Fluoreszenz des Fluorophors durch den Quencher gequencht. Während des vorliegenden Verfahrens wird die Sonde zwischen dem Fluorophor und dem Quencher gespalten, was die volle Expression der Fluoreszenz des Fluorophors zulässt. Das Quenchen umfasst die Übertragung von Energie zwischen dem Fluorophor und dem Quencher; das Emissionsspektrum des Fluorophors und das Absorptionsspektrum des Quenchers müssen überlappen. Eine bevorzugte Kombination für diesen Aspekt der Erfindung ist das Fluorophor Rhodamin 590 und der Quencher Kristallviolett.
  • Eine solche Sonde ist in 13 gezeigt. Die Synthese dieses Konstrukts erfordert die Bindung eines Rhodaminderivats durch eine 5'-Thiolgruppe und die Bindung des Kristallvioletts durch ein Amin, das sich von einem Thymidin zwei Basen weiter erstreckt. Die Trennung dieser beiden Gruppen durch zwei Phosphodiesterbindungen erhöht die Chance einer Spaltung zwischen diesen durch die DNA-Polymerase.
  • Anfängliche Versuche, das Kristallviolett durch eine Reaktion zwischen einem Lacton und einem Amin zu binden, waren nicht erfolgreich. Das Kristallviolett wurde modifiziert, um ein aktives Acylazid zu bilden, gezeigt in 14. Diese Form von Kristallviolett wurde mit Amin-modifizierter DNA zur Reaktion gebracht, und das gewünschte Produkt wurde mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
  • Versuche, die Rhodamin-X-maleimid-Gruppe mit der 5'-Thiolgruppe zur Reaktion zu bringen, waren nicht erfolgreich. Dies war auch der Fall, wenn das Rhodamin-X-maleimid vor der Zugabe von Kristallviolett zur Reaktion gebracht wurde. Der Grund mag sein, dass die entblockierte 5'-Thiolgruppe mit der Acrylamid-Doppelbindung in dem Thymidin-Abstands-Arm reagiert (siehe 13). Ein alternatives Verfahren für die Anfügung eines Amins an das Thymidin ist in 15 gezeigt.
  • Dieses Beispiel stellt eine allgemeine Anleitung für die Bindung eines Biotin an das 3'-Ende einer Oligonucleotidsonde und eines Fluorophors an das 5'-Ende einer Oligonucleotidsonde bereit. Die Fachleute werden erkennen, dass eine Reihe von Verfahren für solche Bindungen im Stand der Technik bekannt sind und dass die vorliegende Erfindung nicht eingeschränkt ist auf die speziellen Verfahren, die ausgewählt wurden, um die Sonde zu markieren.
  • Beispiel 9
  • Protokoll für die durch AmpliWaxTM vermittelte PCR mit UNG und dUTP
  • Das PCR-Verfahren kann in Bezug auf die Spezifität seiner Amplifikation durch Verfahren und Reagenzien verbessert werden, die vollständiger beschrieben sind in der PCT-Patentanmeldung Seriennr. 91/01039, angemeldet am 15. Februar 1991; US-Patentanmeldung Seriennr. 481,501, angemeldet am 16. Februar 1991; PCT-Patentanmeldung Seriennr. PCT/US 91/05210, angemeldet am 23. Juli 1991; US-Patentanmeldung Seriennr. 609,157, angemeldet am 2. November 1990; und US-Patentanmeldung Seriennr. 557,517, angemeldet am 24. Juli 1990. Die Offenbarung dieser Patentanmeldungen wird durch Bezugnahme hier miteingeschlossen, und die folgenden Protokolle demonstrieren, wie diese verbesserten PCR-Verfahren in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um überlegene Resultate zu erhalten. Alle Reagenzien sind bei Perkin-Elmer Cetus Instruments (PECI, Norwalk, CT) erhältlich.
  • Dieses Protokoll umfasst im Wesentlichen drei Komponenten: MicroAmpTM-Röhrchen, die dNTPs, Primer, Magnesium und Tris enthalten und mit Wachs abgedeckt sind; Premix B, zu dem AmpliTaq®-DNA-Polymerase und UNG (und der deshalb Enzyme Mixture genannt wird) zugesetzt werden; und Premix C, zu dem die Testprobe und die Sonde zugesetzt werden. Enzyme Mixture und die Testprobe mit Sonde werden hergestellt und auf die Wachsschicht aufgetragen. Die Röhrchen werden dann in ein TC9600-Thermal-Cycler gebracht und dem Thermozyklus unterworfen. Das nachstehende Protokoll geht von einer 50 μl Reaktion aus, mit Testproben von nicht mehr als 27 μl, und das Ziel ist HIV.
  • Die Reagenzien werden vorzugsweise wie folgt bereitgestellt. MicroAmpTM-Röhrchen, die 12,5 μl Premix A und ein 12 mg AmpliWaxTM-PCR-Pellet pro Röhrchen enthalten, werden hergestellt. Premix A enthält 1 μM Primer SK145 und 1 μM Primer SK431 (keiner der Primer ist biotinyliert), 800 μM dATP, 800 μM dGTP, 800 μM dCTP, 800 μM dUTP, 15 mM MgCl2 und 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Das AmpliWaxTM-Pellet besteht aus Paraffin, das bei 55°C schmilzt (Aldrich Chemical Co.), und enthält 0,15% Tween 65, und das Wachspellet und die Premix A-Bodenschicht werden in einem DNA-freien Raum zusammengefügt. Das Wachspellet wird dann geschmolzen, um oberhalb eine Dampfbarriere zu bilden. Diese Barriere wird unversehrt bleiben, wenn die Röhrchen bei 4 bis 25°C aufbewahrt werden, und die PCR-Reagenzien unterhalb der Barriere sind bei 4°C für Monate lagerungsstabil. Es gibt keine Mischung des zugefügten Materials oberhalb der Barriere, bis das Wachs während der anfänglichen Stufen der Thermozyklen geschmolzen wird. Kontrollröhrchen sind identisch, enthalten aber keinen Primer.
  • Premix B-Puffer enthält 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, und 50 mM KCl und wird verwendet zur Verdünnung der Enzyme AmpliTaq®-DNA-Polymerase und UNG. Etwa 2,6 μl Premix B-Puffer werden pro Reaktion verwendet.
  • Premix C-Puffer wird als 10X Konzentrat hergestellt, das 105 mM Tris-HCl, pH 8,3, und 715 mM KCl enthält und wird zu der Test-DNA-Probe zugegeben, sodass die endgültigen Tris- und KCl-Konzentrationen in der Endlösung 10 mM beziehungsweise 50 mM sind. Die Sonde wird auch in dieser Schicht, ebenso wie gegebenenfalls Träger-DNA zugegeben. Wenn Plasmid-Kontrollen mitlaufen, wird etwa 1 μg an menschlicher Placenta-DNA (1 μg/μl in 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA und 10 mM NaCl, geschert, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt) normalerweise als Träger-DNA pro Reaktion zugegeben. Etwa 3,3 μl der 10X Stammlösung von Premix C werden pro Reaktion zugegeben.
  • Die Sonde wird als 5 μM Stammlösung hergestellt und als LG101C bezeichnet. Die Sonde LG101C hat ein 3'-Phosphat, um eine Verlängerung der Sonde zu verhindern, und ein 7-Diethylaminocumarin-3-carboxylat, das durch eine Amidbindung gebunden an eine aliphatische 5'-Amino-Gruppe an dem Oligonucleotidiat. Die Nucleotidsequenz der Sonde ist nachstehend gezeigt:
    SEQ ID NO: 24 LG101C: 5'-GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
  • Diese Sonde sollte bei –20°C im Dunkeln aufbewahrt werden.
  • AmpliTaq®-DNA-Polymerase wird von PECI als Stammlösung mit einer Konzentration von 5U/μl geliefert, und UNG wird von demselben Lieferanten als Stammlösung mit einer Konzentration von 1 U/μl geliefert. Man kann auch Plasmid-Eichproben laufen lassen, und zu diesem Zweck ist die Herstellung von Stammverdünnungen (Kopien/ml) von 300, 1.000, 3.000, 10.000, 30.000, 10.0000 und 100.0000 mit der GeneAmplimerTM Positive Control DNA hilfreich. Diese DNA besteht aus dem HIVZ6-Genom, das umgeordnet ist, um den pol-Bereich zu unterbrechen und die Infektivität zu blockieren, und ist in das Plasmid pBR322 insertiert.
  • Jeder endgültige Reaktionsansatz wird aus 12,5 μl Premix A; 2,6 μl Premix B; 3,3 μl Premix C; 2 μl der Sonde LG101C; 27 μl Testprobe; 0,4 μl AmpliTaq®-DNA-Polymerase; und 2 μl UNG bestehen, was ein Endvolumen von 49,8 μl ergibt. Dieses Gemisch enthält 250 nM von jedem Primer; 200 μM von jedem dNTP; 3,75 mM MgCl2; 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 200 nM Sonde; 2 Einheiten UNG; und 2 Einheiten Polymerase.
  • Um die Reaktion durchzuführen, stellt man zuerst Enzyme Mixture in einem DNA-freien Abzug oder Raum her, indem man pro Reaktion 2,6 μl Premix B-Puffer, 0,4 μl AmpliTaq®-DNA-Polymerase und 2 μl UNG mischt. Für jeweils 16 Reaktionen, die man durchführen will, sollte man ausreichend Enzyme Mixture für 18 Reaktionen herstellen, um ausreichend Material sicherzustellen. Enzyme Mixture wird dann zu jedem MicroAmpTM-Röhrchen, das mit Wachs abgedeckten Premix A über dem Wachs enthält, in einem DNA-freien Abzug oder Raum zugegeben. Eine einzige Probennehmer kann für alle Transfers ausreichen, und 5 μl Enzyme Mixture werden zu jedem Röhrchen zugegeben.
  • Im Bereich der Probenherstellung wird Sample Mixture (Probengemisch) pro Reaktion hergestellt, indem 3,3 μl 10X Premix C-Puffer, 27 μl Probe (für Quantifizierungskontrollen werden 10 μl Stammlösung und 17 μl Wasser zugegeben) und 2 μl Sonde gegebenenfalls wird (Träger-DNA mit der Probe gemischt) gemischt werden. Dann wird, unter Verwendung einer separaten Pipettenspitze für jeden Transfer, 32,3 μl Sample Mixture zu jedem Röhrchen zugegeben; das ungleiche Volumen zwischen dem Enzyme Mixture und dem Sample Mixture gewährleistet vollständige Mischung. Man sollte auch zwei Kontrollröhrchen ansetzen, bei denen die Primer fehlen, um als Maß für die Spaltung der Sonde durch die Thermozyklen zu dienen. Diese Kontrolle enthält typischerweise 1.000 Kopien an Kontrollmatrize. Zusätzlich sollte man eine Verdünnungsserie des Plasmids ansetzen, um den Test zu kalibrieren. Diese Kalibrierung ist typischerweise im Bereich von 3 bis 10.000 Kopien an HIV-Ziel pro Probe. Nachdem die vorstehenden Schritte abgeschlossen sind, werden die Röhrchen verschlossen und in der Schale des TC9600 zusammengestellt.
  • Das Profil der Thermozyklen ist wie folgt: ein Zyklus bei 50°C für 2 Minuten; 5 Zyklen bei 95°C für 10 Sekunden, 55°C für 10 Sekunden und 72°C für 10 Sekunden; und 35 Zyklen bei 90°C für 10 Sekunden, 60°C für 10 Sekunden und 72°C für 10 Sekunden. Wenn die Thermozyklen beendet sind, werden die Röhrchen aus dem TC9600 entfernt und gegebenenfalls bei –20°C aufbewahrt. Ein längeres Einwirken von mehr als 70°C auf die Röhrchen wird nicht empfohlen, und die alkalische Denaturierung sollte nicht angewendet werden.
  • Eine Anzahl von Kontrollen ist von Nutzen, einschließlich einer Kontrolle ohne Matrize, um die Verunreinigung des Reaktionsgemischs, ebenso wie die Amplifikation von unspezifischen Produkten, die in einer Spaltung der Sonde resultieren können und unspezifische Signale ergeben, zu bestimmen; eine Kontrolle ohne Primer, um ein Maß für die Spaltung der Sonde bereitzustellen, die nicht mit der Amplifikation zusammenhängt und die zum Untergrund beitragen könnte (man könnte auch einige klinische Proben in den Test mit einbauen, um die Anwesenheit von Komponenten zu entdecken, die in einer Spaltung der Sonde resultieren); und Quantifizierungskontrollen.
  • Um die PCR-Produkte von unterhalb der Wachsschicht zu entfernen, die sich nach der Amplifikation gemäß des vorstehenden Protokolls bilden wird, kann man die Probe mittels Durchstechen der Mitte des Wachsschicht mit einer Pipettenspitze entfernen, indem man die Spitze langsam mit sanftem Druck voranführt, um das Risiko zu minimieren, dass Reaktionsgemisch bis oberhalb der Spitze vordringt und das Labor verunreinigt. Sichern des Probennehmers mit einem Finger der Hand, die das Reaktionsröhrchen hält, erhöht die Kontrolle beträchtlich. Feine Propennehmer (zum Beladen von Gelen) durchdringen das Wachs besonders gut. Eine Schneidebewegung statt einer Stechbewegung erleichtert das Durchdringen ebenfalls und hilft bei der Sicherstellung, dass die Spitze nicht von dem Wachs verstopft wird. Wenn die Spitze ein Stück Wachs aufnimmt, kann das Wachs normalerweise durch leichtes Reiben am restlichen Wachs wieder entfernt werden.
  • Man kann die Reaktionsröhrchen auch einfrieren (z.B. in Trockeneis/Ethanol oder über Nacht in einer Tiefkühltruhe), auftauen und sie kurz in einer Mikrofuge (Winkelrotor) zentrifugieren. Die Wachsschicht wird stark durchbrochen sein, was die Einführung des Probennehmers Pipette ohne das Risiko der Verstopfung erlaubt. Wachsbruchstücke können von der Probennehmerspitze gegen die Innenwand des Röhrchen abgewischt werden. Dieses Verfahren ist besonders praktisch bei Verdrängungsprobennehmern, die oftmals so dicke Spitzen haben, dass das direkte Durchdringen der Wachsschicht schwierig ist. Jedes der vorstehenden Verfahren sollte Wachs in der entfernten Probe so vollständig ausschließen, dass eine Chloroformextraktion nicht erforderlich ist.
  • Obwohl die vorstehende Erfindung zum Zweck der Illustration detailliert beschrieben wurde, ist es offensichtlich, dass Abänderungen und Modifikationen innerhalb des Bereichs der beigefügten Ansprüche durch den Durchschnittsfachmann durchgeführt werden können.
  • Beispiel 10
  • Festphasenextraktion mit BakerbondTM-PEI
  • Dieses Beispiel stellt ein Protokoll zur Probenherstellung eines PCR-Gemisches bereit, bei dem die Amplifikation in Gegenwart einer Fluoreszenz-markierten Sonde (einem Cumarindervat) entsprechend dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde.
  • Die Herstellung gewisser Stammreagenzien erleichtert die Durchführung dieses Protokolls. Ein solches Reagens sind Eppendorf-Röhrchen, die 50 mg vorgewaschene BakerbondTM PEI-Matrix enthalten. Bakerbond PEI kann von J. T. Baker (Produkt-Nr. 7264-00) erhalten werden; es handelt sich um 40 μm Partikel mit 275 Angstrom Porengröße auf Silica-Basis. Die Matrix wird hergestellt zuerst durch zunächst Waschen mit Wasser; dann mit Ethanol; dann mit Wasser; und dann mit einem Gemisch von 10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 2 M NaCl und 8 M Harnstoff; und dann Äquilibrieren in 10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl und 8 M Harnstoff. Nach der Aufteilung werden 15 μl Wasser zu jedem Röhrchen zugegeben, um die Matrix hydratisiert zu halten. Die Röhrchen sollten bei 4°C aufbewahrt werden.
  • Auch Bindungspuffer kann als Stammlösung hergestellt werden, und die Zusammensetzung ist 10 mM Tris, pH 8, 500 mM NaCl, 50 mM KCl, 1 mM EDTA und 8 M Harnstoff. Der Bindungspuffer sollte bei 4°C aufbewahrt werden, obwohl Harnstoff bei dieser Temperatur ausfallen kann. Der Bindungspuffer kann kurz vor der Verwendung erwärmt werden, um den Harnstoff zu resuspendieren.
  • Eine gewisse Ausrüstung ist bei der Durchführung dieses Protokolls von Nutzen. Während der Bindungsschritte sollten die Röhrchen durchmischt werden, um die Matrix in Suspension zu halten, und ein Vortex Genie 2-Mixgerät (erhältlich bei Fischer Scientific, Kat. Nr. 12-812, mit dem 60 Mikroröhrchen-Halter, Kat. Nr. 12-812-B) ist für diesen Zweck von Nutzen. Zusätzlich sind eine Eppendorf-Microfuge, ein Hitachi Model 2000-Spectrofluorometer und Microfluorimeter-Quarzküvetten mit 2 mm innerer Weite und 2,5 mm Weglänge (erhältlich bei Starna Cells, Inc., Nr. 18F Q 10 mm 5) ebenfalls von Nutzen bei der Durchführung dieses Protokolls.
  • Geeignete Kontrollen sollten ebenfalls durchgeführt werden, und die Bindungsschritte erfordern drei Kontrollen. Die Kontrolle für die Hintergrundfluoreszenz umfasst die Herstellung einer Probe, die alle Komponenten der PCR-Amplifikation außer der Sonde enthält. Die Kontrollprobe sollte identisch wie die aktuellen Testproben behandelt werden, indem 20 μl zu der Matrix zugegeben werden und die im Überstand vorhandene Fluoreszenz gemessen wird. Diese Kontrolle stellt einen Weg bereit, um die in der Matrix, dem Bindungspuffer und in jeder Komponente des PCR-Amplifikationsgemisches vorhandene Hintergrundfluoreszenz zu messen und außerdem eine Messung der Menge an Fluoreszenz, die in klinischen Proben vorhanden ist.
  • Die zweite Kontrolle stellt eine Messung für ungewollten Sondenabbau und für die Bindungsreaktion bereit und besteht aus einem Schein-PCR-Amplifikationsgemisch, das alle Komponenten einschließlich der Sonde enthält, aber nicht den Thermozyklen unterworfen wird. Die Kontrollprobe sollte identisch wie die aktuellen Testproben behandelt werden, indem 20 μl zu der Matrix zugegeben werden und die im Überstand vorhandene Fluoreszenz gemessen wird. Diese Kontrolle ermöglicht die Messung eines vorliegenden Abbaus der Sonde bei Lagerung ebenso wie die Messung der Effizienz der Bindungsreaktion. Wenn kein Abbau auftritt und wenn die Bindungsreaktion vollständig ist, sollte die Fluoreszenz des Überstands nach der Bindung an BakerbondTM PEI ähnlich der des Hintergrunds sein, die in der ersten Kontrolle gemessen wurde.
  • Die dritte Kontrolle stellt ermöglicht die Messung der einzusetzenden Menge an Sonde bereit. Die für die zweite Kontrolle hergestellte Probe kann für diese Messung verwendet werden. In diesem Fall jedoch werden 20 μl zu einem Röhrchen zugegeben, das 290 μl Bindungspuffer ohne Matrix enthält. Diese Kontrolle kann verwendet werden, um die einzusetzenden Menge an Sonde zu bestimmen.
  • Um das Protokoll zu beginnen, bestimmt man zuerst die Zahl der benötigten Bindungsröhrchen; diese Zahl ist die Summe von Testproben und Kontrollen. Die Kontrollen sind eine Kontrolle ohne Matrize, eine Kontrolle ohne Primer, Kalibrierungskontrollen und die erste und zweite vorstehend diskutierte Kontrolle. Kontrollen können dreifach gemacht werden. Zu jedem Röhrchen werden 235 μl Bindungspuffer zugegeben.
  • Man bereitet auch ein Röhrchen zur Messung des Einsatzes vor, indem man in ein leeres Eppendorf-Röhrchen gibt: 290 μl Bindungspuffer, was äquivalent ist zum Volumen in den Röhrchen mit der Matrix (235 μl Bindungspuffer, 15 μl Wasser und 40 μl, die von der Matrix beigetragen werden). Die Bestimmung der Einsatzmenge kann dreifach gemacht werden.
  • Zu den Röhrchen, die Matrix enthalten (die Testproben und erste und zweite Kontrollen), fügt man 20 μl Probe hinzu. Zu den Röhrchen, die Puffer enthalten (die dritte Kontrolle) fügt man 20 μl Schein-PCR-Amplifikationsgemisch hinzu. Die Röhrchen werden dann auf einem Vortex Genie 2-Mixgerät mit einer Einstellung von 4 für 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Röhrchen werden dann in einer Eppendorf Microfuge (16000 × g) 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die oberen 200 μl des Überstands werden von jedem Röhrchen entfernt, ohne den Niederschlag oder die Matrix aufzuwirbeln, die an der Wand des Röhrchens anwesend sind, und in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen gegeben.
  • Die Fluoreszenz des Überstands wird auf einem Hitachi Model 2000 in den vorstehend angegebenen Küvetten gemessen. Für Sonden, die mit 7-Diethylamino-3 (4'-maleimidophenyl)-4-methyl-Cumarin markiert sind, ist die Einstellung des Spectrofluorometers wie folgt: PM-Spannung ist 700 V; die Anregungswellenlänge ist 432 nm; die Emissionswellenlänge ist 480 nm; die Anregungsspaltbreite ist 10 nm; die Emissionsspaltbreite ist 20 nm. Man sollte die Aussetzung der Sonde gegen das Anregungslicht minimieren; wenn die Sonde für längere Zeiträume in dem Spectrofluorometer verbleiben soll, sollte der Verschluss geschlossen werden.
  • Die Zahl an pmolen an gespaltener Sonde ist am besten geeignet, um die Menge an Signal einzuschätzen. Um die Menge an Signal einzuschätzen, bestimmt man dann zuerst das Einsatzsignal der dritten Kontrolle durch die folgende Berechnung: Fluoreszenz-Signal der dritten Kontrolle – Fluoreszenz-Signal der ersten Kontrolle) × (310/20)/ 10 pmole
  • In dieser Formel korrigiert die Subtraktion jede Hintergrundfluoreszenz in der Testprobe; 310/20 ist der Verdünnungsfaktor; und 10 pmol ist die Menge an Sonde, die den PCR-Amplifikationen zugegeben wurde.
  • Die Menge an Signal der Testprobe wird durch die folgende Formel berechnet: Fluoreszenz-Signal der Testprobe – Fluoreszenz-Signal der ersten Kontrolle) × 310/20/ Einsatzsignal
  • Das vorstehende Protokoll kann entsprechend dem für die Markierung der Sonde speziell verwendeten Fluorophor modifiziert werden und ist lediglich illustrativ für die Erfindung.
  • 16 zeigt typische Ergebnisse und ein typisches Verhältnis von Signal zu Zahl an eingesetztem Ziel für das vorliegende Verfahren mit BakerbondTM PEI-Festphasenextraktionsmittel.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
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  • Figure 00630001

Claims (55)

  1. Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkontaktbringen einer einzelsträngige Nucleinsäuren umfassenden Probe mit einem Oligonucleotid, das eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einem Bereich der Ziel-Nucleinsäure und einem markierten Oligonucleotid, das eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einem zweiten Bereich des gleichen Ziel-Nucleinsäuresequenzstranges, aber nicht die Nucleinsäuresequenz einschließt, die durch das erste Oligonucleotid definiert ist, um unter Hybridisierungsbedingungen ein Gemisch von Duplexen zu erzeugen, wobei die Duplexe die Ziel-Nucleinsäure angelagert an das erste Oligonucleotid und an das markierte Oligonucleotid umfassen, sodass das 3'-Ende des ersten Oligonucleotids an das 5'-Ende des markierten Oligonucleotids angrenzt; (b) Inkubieren des Gemischs aus Schritt (a) mit einer matrizenabhängigen Nucleinsäure-Polymerase, die eine 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität aufweist, unter Bedingungen, die ausreichen, um der 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität der Polymerase das Schneiden des angelagerten markierten Oligonucleotids und die Freisetzung von markierten Fragmenten zu erlauben; und (c) Nachweisen und/oder Messen des Signals, das durch die Hydrolyse des markierten Oligonucleotids erzeugt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das 3'-Ende des ersten Oligonucleotids in dem angelagerten Dupex aus Schritt (a) an das 5'-Ende eines angelagerten markierten Oligonucleotids angrenzt, mit einem Abstand, der wirksam ist, die Freisetzung markierter Fragmente in der Abwesenheit von Nucleinsäurepolymerisation zu erlauben.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oligonucleotide Desoxyribonucleotide umfassen.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäurepolymerase eine DNA-Polymerase mit einer 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Nucleotid in dem markierten Oligonucleotid modifiziert ist, um die Nucleasespaltungsspezifität zu steuern.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das markierte Oligonucleotid mindestens eine Markierung umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das markierte Oligonucleotid erste und zweite Markierungen umfasst, wobei die erste Markierung von der zweiten Markierung durch eine für Nuclease zugängliche Schnittstelle getrennt ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das markierte Oligonucleotid am 5'-Ende markiert ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das markierte Oligonucleotid außerdem einen Schwanz von Nicht-Nucleinsäuren oder eine Sequenz von Nucleotiden, die zu der Ziel-Nucleinsäuresequenz nicht-komplementär ist, umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Markierung an einem Nucleotid an der Schwanz- oder nicht-komplementären Sequenz angeheftet ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Markierung sich am 5'-Ende befindet und von der zu der Ziel-Nucleinsäuresequenz komplementären Sequenz durch die Schwanz- oder nicht-komplementäre Sequenz getrennt ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, durchgeführt unter Bedingungen, die ausreichen, um Nucleinsäurepolymerisation zu fördern, wobei die Freisetzung markierter Fragmente während der Verlängerung des ersten Oligonucleotids erfolgt.
  13. Polymerasen-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikationsverfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen mindestens eines markierten Oligonucleotids, das eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu einem Bereich der Zielnucleinsäure, für einen die Probe enthaltenden PCR-Test, wobei das markierte Oligonucleotid sich innerhalb der durch die Oligonucleotidprimer von Schritt (b) gebundenen Ziel-Nucleinsäuresequenz anlagert; (b) Bereitstellen eines Satzes von Oligonucleotidprimern, wobei ein erster Primer eine Sequenz enthält, die komplementär zu einem Bereich in einem Strang der Ziel-Nucleinsäuresequenz ist, und die Synthese eines Verlängerungsproduktes in Gang setzt und ein zweiter Primer eine Sequenz enthält, die komplementär zu einem Bereich in einem zweiten Strang der Ziel-Nucleinsäuresequenz oder komplementär zu einem Bereich in dem Verlängerungsprodukt des ersten Primers ist, und die Synthese eines komplementären DNA-Strangs in Gang setzt; und wobei jeder Oligonucleotidprimer so ausgewählt ist, dass er sich an seine komplementäre Matrize stromaufwärts von jedem markierten Oligonucleotid anlagert, das an den gleichen Nucleinsäurestrang angelagert ist; (c) Amplifizieren der Ziel-Nucleinsäuresequenz unter Einsatz einer Nucleinsäurepolymerase mit 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität als ein Matrizenabhängiges Polymerisationsmittel unter Bedingungen, die die PCR-Zyklusschritte (i) Anlagerungen von Primern und markiertem Olignucleotid an eine Matrizen-Nucleinsäuresequenz, die in einer Zielsequenz enthalten ist, und (ii) Verlängern der Primer erlauben, wobei die Nucleinsäurepolymerase ein Primer-verlängerungsprodukt synthetisiert, während die 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität der Nucleinsäurepolymerase gleichzeitig markierte Fragmente von den angelagerten Duplexen freisetzt, die markiertes Oligonucleotid und seine komplementäre Matrizen-Nucleinsäuresequenz umfassen, wobei nachweisbare markierte Fragmente erzeugt werden; und (d) Nachweisen und/oder Messen des Signals, das durch die Hydrolyse des markierten Oligonucleotids erzeugt wird, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielsequenz in der Probe zu bestimmen.
  14. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Nucleinsäurepolymerase ein thermostabiles Enzym ist.
  15. PCR-Verfahren nach Anspruch 14, wobei das thermostabile Enzym eine DNA-Polymerase einer Thermus-Art ist.
  16. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei das 3'-Ende eines angelagerten Oligonucleotidprimers an das 5'-Ende des markierten Olignucleotids, das an den gleichen Nucleinsäurestrang angelagert ist, angrenzt.
  17. PCR-Verfahren nach Anspruch 16, wobei das markierte Oligonucleotid ein blockiertes 3'-Ende hat, um die Verlängerung durch die Nucleinsäurepolymerase zu verhindern.
  18. PCR-Verfahren nach Anspruch 16, wobei das markierte Oligonucleotid zusätzlich eine Sequenz von einem bis etwa zehn Nucleotiden umfasst, wobei die Sequenz zu der Ziel-Nucleinsäuresequenz im Wesentlichen nicht-komplementär ist.
  19. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei das markierte Oligonucleotid erste und zweite Markierungen umfasst, wobei die erste Markierung von der zweiten Markierung durch eine für Nuclease zugängliche Schnittstelle getrennt ist.
  20. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei in Schritt (a) ein Paar markierte Oligonucleotidsonden bereitgestellt wird.
  21. PCR-Verfahren nach Anspruch 20, wobei sich das Paar markierter Sonden an unterschiedliche nicht überlappende Bereiche desselben komplementären Nucleinsäurestranges anlagert, wobei das 5'-Ende der zweiten markierten Sonde zu dem 3'-Ende der ersten markierten Sonde benachbart ist.
  22. PCR-Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Markierung an ein Nucleotid in der nicht-komplementären Sequenz angeheftet ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Markierung am 5'-Ende ist und von der komplementären Sondensequenz durch die nicht-komplementäre Sequenz getrennt ist.
  24. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Oligonucleotid am 5'-Ende markiert ist.
  25. PCR-Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Oligonucleotid am blockierten 3'-Ende markiert ist.
  26. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Markierung an eine interne Sequenz des Oligonucleotids angeheftet ist.
  27. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Markierung ein Signal proportional zur Anzahl der amplifizierten Ziel-Nucleinsäuresequenzen bereitstellt.
  28. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Markierung ein Desoxyribonucleosid-Analogon mit signalerzeugenden Eigenschaften ist.
  29. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei das markierte Oligonucleotid ein Paar interaktive signalerzeugende Markierungen umfasst, die auf dem Oligonucleotid wirksam lokalisiert sind, um die Erzeugung eines nachweisbaren Signals zu quenchen, und die Markierungen durch eine Stelle innerhalb des Oligonucleotids, die für Nucleasespaltung zugänglich ist, getrennt sind, sodass die 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität der Nucleinsäurepolymerase die Trennung der ersten interaktiven signalerzeugenden Markierung von der zweiten interaktiven signalerzeugenden Markierung während der Primer-Verlängerung durch Schneiden an der zugänglichen Stelle möglich macht, wodurch ein nachweisbares Signal erhalten wird.
  30. PCR-Verfahren nach Anspruch 29, wobei die erste Markierung ein chemilumineszentes Substrat und die zweite Markierung ein Fluorophor ist, welches damit interagiert.
  31. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Markierung des Oligonucleotids über einen Abstandsarm von ausreichender Länge angeheftet ist, um zu ermöglichen, dass die 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität der Nucleinsäurepolymerase die markierten Fragmente freisetzt.
  32. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei die zwischen dem markierten Oligonucleotid und seinem zugehörigen Stromaufwärts-Oligonucleotidprimer unterschiedliche Schmelztemperatur (Tm), zur Bereitstellung einer bevorzugten Bindung des markierten Oligonucleotids während der Anlagerungsschritte der PCR-Zyklen wirksam ist.
  33. PCR-Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Tm des markierten Oligonucleotids bis zu 40°C höher ist als die Tm des Stromaufwärts-Oligonucleotidprimers.
  34. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, wobei die markierten Oligonucleotid-Fragmente ein Gemisch aus Mono-, Di- und größeren Nucleotidfragmenten umfassen.
  35. PCR-Verfahren nach Anspruch 13, das ferner die Abtrennung markierter Oligonucleotidfragmente von anderen Bestandteilen in dem PCR-Gemisch vor dem Nachweis der markierten Fragmente umfasst.
  36. PCR-Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Trennungsschritt Größenausschlusschromatographie verwendet.
  37. PCR-Verfahren nach Anspruch 35, wobei die markierten Fragmente von dem PCR-Gemisch durch Festphasenextraktion getrennt werden.
  38. PCR-Verfahren nach Anspruch 37, wobei Avidin oder Streptavidin an die Festphase gebunden ist und das markierte Oligonucleotid zusätzlich ein gebundenes Biotinmolekül umfasst, das von der Markierung durch eine für Nuclease zugängliche Schnittstelle getrennt ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die erste Markierung ein Fluorophor ist und die zweite Markierung ein Quencher ist, der damit interagiert.
  40. Kit zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Probe, umfassend: a) mindestens ein markiertes Oligonucleotid , das eine Sequenz enthält, die komplementär zu einem Bereich der Ziel-Nucleinsäure ist, wobei das markierte Oligonucleotid sich innerhalb der Ziel-Nucleinsäuresequenz, die durch die Oligonucleotidprimer aus Teil (b) gebunden ist, anlagert und wobei das 3'-Ende des markierten Oligonucleotids blockiert ist, um die Verlängerung durch eine Nucleinsäure-Polymerase mit 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität zu verhindern, wobei durch die 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität markierte Fragmente von den angelagerten Duplexen, umfassend markierte Oligonucleotide und ihre komplementäre Matrizen-Nucleinsäuresequenz, während eines PCR-Amplifikationsvorganges freigesetzt werden; wobei das markierte Oligonucleotid erste und zweite Markierungen umfasst, wobei die erste Markierung von der zweiten Markierung durch eine für Nuclease zugängliche Schnittstelle getrennt ist und wobei die Markierungen in dem markierten Oligonucleotid ein Paar interaktiver, signalerzeugender Markierungen umfassen, die auf dem Oligonucleotid lokalisiert sind, um die Erzeugung eines nachweisbaren Signals zu quenchen; b) einen Satz von Oligonucleotidprimern, wobei ein erster Primer eine Sequenz komplementär zu einem Bereich in einem Strang der Ziel-Nucleinsäuresequenz enthält und die Synthese eines Verlängerungsproduktes in Gang setzt; und ein zweiter Primer eine Sequenz komplementär zu einem Bereich in einem zweiten Strang der Ziel-Nucleinsäuresequenz oder komplementär zu einem Bereich in dem Verlängerungsprodukt des ersten Primers enthält und die Synthese eines komplementären DNA-Stranges in Gang setzt; und wobei jeder Oligonucleotidprimer ausgewählt ist, um stromaufwärts von jeglichem an den gleichen Nucleinsäurestrang angelagerten markierten Oligonucleotid anzulagern.
  41. Kit nach Anspruch 40, zusätzlich umfassend eine Nucleinsäurepolymerase mit einer 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität.
  42. Kit nach Anspruch 41, wobei die Nucleinsäurepolymerase ein thermostabiles Enzym ist, bevorzugt eine DNA-Polymerase aus einer Thermus-Art.
  43. Kit nach einem der Ansprüche 40 bis 42, wobei die Oligonucleotide Desoxyribonucleotide umfassen.
  44. Kit nach einem der Ansprüche 40 bis 43, wobei das markierte Oligonucleotid am 5'-Ende markiert ist.
  45. Kit nach einem der Ansprüche 40 bis 43, wobei das markierte Oligonucleotid zusätzlich einen Schwanz von Nicht-Nucleinsäuren oder eine Sequenz von Nucleotiden, die zur Ziel-Nucleinsäuresequenz nicht-komplementär ist, umfasst.
  46. Kit nach Anspruch 45, wobei die Markierung in dem markierten Oligonucleotid an ein Nucleotid in der Schwanz- oder nicht-komplementären Sequenz angeheftet ist.
  47. Kit nach Anspruch 46, wobei die Markierung in dem markierten Oligonucleotid sich am 5'-Ende befindet und von der zur Ziel-Nucleinsäuresequenz komplementären Sequenz durch die Schwanz- oder nicht-komplementäre Sequenz getrennt ist.
  48. Kit nach Anspruch 40, wobei in dem markierten Oligonucleotid die erste Markierung ein Fluorophor und die zweite Markierung ein Quencher ist, der damit interagiert.
  49. Kit nach einem der Ansprüche 40 bis 48, der in Teil (a) ein Paar markierter Oligonucleotidsonden enthält.
  50. Reaktionsansatz zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuesequenz in einer Probe, wobei der Reaktionsansatz vor der Amplifikation eine Probe, eine Nucleinsäure-Polymerase mit einer 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität, ein Paar Oligonucleotidprimer und mindestens ein markiertes Oligonucleotid umfasst, wobei das Primerpaar und das markierte Oligonucleotid dadurch gekennzeichnet sind, dass: a) das markierte Oligonucleotid eine Sequenz enthält, die komplementär zu einem Bereich der Ziel-Nucleinsäure ist, und sich innerhalb der Ziel-Nucleinsäure, die an die Oligonucleotidprimer aus Teil (b) gebunden ist, anlagert, und von welchem Oligonucleotid durch die 5'- zu 3'-Nucleaseaktivität einer Polymerase markierte Fragmente von den angelagerten Duplexen, die ein markiertes Oligonucleotid und seine komplementäre Matrizen-Nucleinsäuresequenz umfassen, während eines PCR-Amplifikationsvorgangs freigesetzt werden; b) das Oligonucleotidprimer-Paar umfasst: einen ersten Primer, der eine Sequenz komplementär zu einem Strang der Ziel-Nucleinsäure enthält und der die Synthese eines Verlängerungsproduktes in Gang setzt, und einen zweiten Primer, der eine Sequenz komplementär zu einem Bereich in einem zweiten Strang der Ziel-Nucleinsäuesequenz oder komplementär zu einem Bereich in einem Verlängerungsprodukt des ersten Primers enthält und die Synthese eines komplementären DNA-Stranges in Gang setzt; und wobei jeder Oligonucleotidprimer so ausgewählt ist, dass er sich an seine komplementäre Matrize anlagert, stromaufwärts von jeglichen markierten Oligonucleotiden, die an den gleichen Nucleinstrang angelagert sind; wobei das markierte Oligonucleotid eine erste und zweite Markierung umfasst, wobei die erste Markierung von der zweiten Markierung durch eine für Nuclease zugängliche Schnittstelle getrennt ist und wobei die Markierungen in dem markierten Oligonucleotid ein Paar interaktiver, signalerzeugender Markierungen sind, die auf dem Oligonucleotid lokalisiert sind, um die Erzeugung eines nachweisbaren Signals zu quenchen.
  51. Reaktionsansatz nach Anspruch 50, wobei das markierte Oligonucleotid am 5'-Ende markiert ist.
  52. Reaktionsansatz nach einem der Ansprüche 50 oder 51, wobei das markierte Oligonucleotid zusätzlich einen Schwanz von Nicht-Nucleinsäuren oder eine Sequenz von Nucleotiden umfasst, welche zu der Ziel-Nucleinsäuresequenz nicht-komplementär ist.
  53. Reaktionsansatz nach Anspruch 52, wobei die Markierung in dem markierten Oligonucleotid am 5'-Ende ist und durch die Schwanz- oder nicht-komplementären Sequenzen von der Sequenz komplementär zu der Ziel-Nucleinsäuresequenz getrennt ist.
  54. Reaktionsansatz nach Anspruch 50, wobei in dem markierten Oligonucleotid die erste Markierung ein Fluorophor ist und die zweite Markierung ein Quencher ist, der damit interagiert.
  55. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 13, wobei für multiple Allele spezifische oder artspezifische Sonden verwendet werden, um zwischen Allelen oder Arten zu unterscheiden.
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Families Citing this family (1331)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5635347A (en) * 1986-04-30 1997-06-03 Igen, Inc. Rapid assays for amplification products
US5795762A (en) * 1986-08-22 1998-08-18 Roche Molecular Systems, Inc. 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases
US5466591A (en) * 1986-08-22 1995-11-14 Hoffmann-La Roche Inc. 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases
US5856088A (en) * 1989-07-11 1999-01-05 Gen-Probe Incorporated Detection of human immunodeficiency virus type 1
US6589734B1 (en) * 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
US7081226B1 (en) 1996-06-04 2006-07-25 University Of Utah Research Foundation System and method for fluorescence monitoring
US7273749B1 (en) * 1990-06-04 2007-09-25 University Of Utah Research Foundation Container for carrying out and monitoring biological processes
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
US6872816B1 (en) 1996-01-24 2005-03-29 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection kits
US5994069A (en) * 1996-01-24 1999-11-30 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages
US5846717A (en) 1996-01-24 1998-12-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
DE69233391D1 (de) * 1991-11-07 2004-09-02 Nanotronics Inc Hybridisierung von mit Chromophoren und Fluorophoren konjugierten Polynukleotiden zur Erzeugung eines Donor-Donor Energietransfersystems
US5567583A (en) * 1991-12-16 1996-10-22 Biotronics Corporation Methods for reducing non-specific priming in DNA detection
US6033854A (en) * 1991-12-16 2000-03-07 Biotronics Corporation Quantitative PCR using blocking oligonucleotides
US6033909A (en) * 1992-01-22 2000-03-07 Hoechst Aktiengesellschaft Oligonucleotide analogs, their preparation and use
IL104461A (en) * 1992-01-22 2001-05-20 Hoechst Ag Analogs of oligonucleotide, their preparation and pharmaceutical preparations containing them
US5646261A (en) * 1992-01-22 1997-07-08 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-derivatized oligonucleotide analogs with non-nucleotidic groupings, their preparation and use
JP3516953B2 (ja) * 1992-08-03 2004-04-05 アボツト・ラボラトリーズ エキソヌクレオリチック活性を用いた標的核酸の検出及び増幅
DE4239531A1 (de) * 1992-11-25 1994-05-26 Gabor Dr Igloi Reagenz zur Kupplung verschiedener Substanzen an Nukleinsäuren sowie Verfahren zu dessen Herstellung
US5843654A (en) * 1992-12-07 1998-12-01 Third Wave Technologies, Inc. Rapid detection of mutations in the p53 gene
US5614402A (en) * 1992-12-07 1997-03-25 Third Wave Technologies, Inc. 5' nucleases derived from thermostable DNA polymerase
US5541311A (en) * 1992-12-07 1996-07-30 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
US20060035257A1 (en) * 1992-12-07 2006-02-16 Dahlberg James E Cleavage of nucleic acids
US6673616B1 (en) * 1992-12-07 2004-01-06 Third Wave Technologies, Inc. Methods and compositions for characterizing nucleic acids
US6372424B1 (en) * 1995-08-30 2002-04-16 Third Wave Technologies, Inc Rapid detection and identification of pathogens
US5719028A (en) * 1992-12-07 1998-02-17 Third Wave Technologies Inc. Cleavase fragment length polymorphism
US5888780A (en) * 1992-12-07 1999-03-30 Third Wave Technologies, Inc. Rapid detection and identification of nucleic acid variants
US5422253A (en) * 1992-12-07 1995-06-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of site specific nucleic acid cleavage
US20060257885A1 (en) * 1993-01-05 2006-11-16 Gelfand David H Homogeneous assay system
JP3099853B2 (ja) * 1993-02-19 2000-10-16 株式会社日立製作所 核酸の測定試薬及び測定方法
AU686616B2 (en) 1993-03-26 1998-02-12 Gen-Probe Incorporated Detection of human immunodeficiency virus type 1
US5491086A (en) * 1993-05-14 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. Purified thermostable nucleic acid polymerase and DNA coding sequences from pyrodictium species
DE4344742A1 (de) * 1993-06-09 1994-12-15 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren
JPH0723800A (ja) * 1993-07-08 1995-01-27 Tanabe Seiyaku Co Ltd 核酸の検出方法
US6576419B1 (en) * 1993-07-23 2003-06-10 University Of Utah Research Foundation Assay procedure using fluorogenic tracers
ATE208658T1 (de) * 1993-07-28 2001-11-15 Pe Corp Ny Vorrichtung und verfahren zur nukleinsäurevervielfältigung
US5645801A (en) * 1993-10-21 1997-07-08 Abbott Laboratories Device and method for amplifying and detecting target nucleic acids
AU8073294A (en) * 1993-10-21 1995-05-08 Abbott Laboratories Apparatus and method for transfer of a fluid sample
US5925517A (en) * 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) * 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US6821727B1 (en) 1993-11-15 2004-11-23 Applera Corporation Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe
AU8102694A (en) * 1993-11-17 1995-06-06 Id Biomedical Corporation Cycling probe cleavage detection of nucleic acid sequences
EP0663447B1 (de) * 1993-12-28 2003-07-09 Eiken Chemical Co., Ltd. Verfahren für den Nachweis spezifischer Polynukleotiden
US6028190A (en) 1994-02-01 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Probes labeled with energy transfer coupled dyes
US5869255A (en) 1994-02-01 1999-02-09 The Regents Of The University Of California Probes labeled with energy transfer couples dyes exemplified with DNA fragment analysis
US5547861A (en) 1994-04-18 1996-08-20 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acid amplification
DE69519783T2 (de) * 1994-04-29 2001-06-07 Perkin Elmer Corp Verfahren und vorrichtung zur echtzeiterfassung der produkte von nukleinsäureamplifikation
NZ266724A (en) * 1994-05-23 1998-08-26 Biotronics Corp Method for detecting target nucleic acid and kit therefor; using primers with at least 5 consecutive nucleotides matching or blocking polymerase composition
CN1152946A (zh) * 1994-05-28 1997-06-25 特普尼尔医学有限公司 生产核酸的拷贝
US5773213A (en) * 1994-06-06 1998-06-30 Brigham & Women's Hospital Method for conducting sequential nucleic acid hybridization steps
US20070269799A9 (en) * 1994-06-22 2007-11-22 Zhang David Y Nucleic acid amplification methods
US5580730A (en) * 1994-08-19 1996-12-03 Olympus America, Inc. Enzyme digestion method for the detection of amplified DNA
US5491063A (en) * 1994-09-01 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes
WO1996015267A1 (en) * 1994-11-09 1996-05-23 Third Wave Technologies, Inc. Rapid detection and identification of nucleic acid variants and pathogens
US5512441A (en) * 1994-11-15 1996-04-30 American Health Foundation Quantative method for early detection of mutant alleles and diagnostic kits for carrying out the method
US5571673A (en) * 1994-11-23 1996-11-05 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes
US5786139A (en) * 1994-12-09 1998-07-28 Panvera Corporation Method and kit for detecting nucleic acid cleavage utilizing a covalently attached fluorescent tag
DE69528670T2 (de) * 1994-12-23 2004-03-11 Dade Behring Inc., Deerfield Nachweis von nukleinsäuren durch nuklease-katalysierte produktbildung
US6787304B1 (en) 1994-12-28 2004-09-07 Georgetown University Fluorometric assay for detecting nucleic acid cleavage
US20030165908A1 (en) * 1994-12-30 2003-09-04 Georgetown University Fluorometric assay for detecting nucleic acid cleavage
DE69535882D1 (de) * 1994-12-30 2008-12-18 Univ Georgetown Fluoreszenztest zum nachweis der spaltung einer nukleinsäure
CN1100258C (zh) 1995-02-02 2003-01-29 中外制药株式会社 以调节化学发光为手段分析被分析物的方法
US5801155A (en) * 1995-04-03 1998-09-01 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates
US6312894B1 (en) 1995-04-03 2001-11-06 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders
EP0826066B1 (de) * 1995-05-05 2000-09-13 The Perkin-Elmer Corporation Methoden and reagentien fuer die kombination einer pcr-amplifizierung mit einem hybridisierungs-assay
KR100463475B1 (ko) 1995-06-08 2005-06-22 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 자기성피그먼트
DE19520398B4 (de) * 1995-06-08 2009-04-16 Roche Diagnostics Gmbh Magnetisches Pigment
US5994063A (en) * 1995-06-23 1999-11-30 Metzker; Michael L. Substituted 4,4-difluoro-4-bora-3A,4A-diaza-s-indacene compounds for homogenous amplification/detection assays
US6027879A (en) * 1995-08-09 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe
KR970706902A (ko) * 1995-09-12 1997-12-01 로드릭 리차드 제이 Dna 증폭 및 검정 방법 및 장치(device and method for dna amplification and assay)
US5837442A (en) 1995-11-29 1998-11-17 Roche Molecular Systems, Inc. Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid
DE19548680A1 (de) * 1995-12-23 1997-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum quantitativen Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen
US6312893B1 (en) 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
US6027890A (en) 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
CA2243989A1 (en) * 1996-01-23 1997-07-31 Rapigene, Inc. Methods and compositions for detecting binding of ligand pair using non-fluorescent label
US6613508B1 (en) 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
US7122364B1 (en) 1998-03-24 2006-10-17 Third Wave Technologies, Inc. FEN endonucleases
US6913881B1 (en) 1996-01-24 2005-07-05 Third Wave Technologies, Inc. Methods and compositions for detecting target sequences
US6090606A (en) * 1996-01-24 2000-07-18 Third Wave Technologies, Inc. Cleavage agents
US5985557A (en) 1996-01-24 1999-11-16 Third Wave Technologies, Inc. Invasive cleavage of nucleic acids
US6875572B2 (en) 1996-01-24 2005-04-05 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection assays
US7527928B2 (en) * 1996-11-29 2009-05-05 Third Wave Technologies, Inc. Reactions on a solid surface
US20080160524A1 (en) * 1996-01-24 2008-07-03 Third Wave Technologies, Inc. Methods and Compositions for Detecting Target Sequences
US7432048B2 (en) * 1996-11-29 2008-10-07 Third Wave Technologies, Inc. Reactions on a solid surface
US7256020B2 (en) * 1996-11-29 2007-08-14 Third Wave Technologies, Inc. Methods and compositions for detecting target sequences
EP0904286A4 (de) * 1996-01-24 2004-01-14 Third Wave Tech Inc Invasive spaltung von nukleinsäuren
US6706471B1 (en) 1996-01-24 2004-03-16 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
US7195871B2 (en) * 1996-01-24 2007-03-27 Third Wave Technologies, Inc Methods and compositions for detecting target sequences
US5763184A (en) 1996-01-30 1998-06-09 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleotide sequence variation in the ABO glycosyltransferase gene
US5716784A (en) * 1996-02-05 1998-02-10 The Perkin-Elmer Corporation Fluorescence detection assay for homogeneous PCR hybridization systems
US5874216A (en) * 1996-02-23 1999-02-23 Ensys Environmental Products, Inc. Indirect label assay device for detecting small molecules and method of use thereof
DE69734576T2 (de) * 1996-03-01 2006-08-03 E.I. Dupont De Nemours And Co., Wilmington Methode zur vervielfältigung und zum nachweis eines gewünschten nukleinsäurefragments
CA2199213C (en) 1996-03-11 2007-04-17 John Wesley Backus Amplifying and detecting target nucleic acids using a post amplification incubation step
US7244622B2 (en) 1996-04-03 2007-07-17 Applera Corporation Device and method for multiple analyte detection
JP3898228B2 (ja) * 1996-04-12 2007-03-28 ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク 検出プローブ、キット及びアッセイ
WO1998010096A1 (en) * 1996-04-12 1998-03-12 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detection probes, kits and assays
US5955268A (en) * 1996-04-26 1999-09-21 Abbott Laboratories Method and reagent for detecting multiple nucleic acid sequences in a test sample
US5887385A (en) 1996-05-28 1999-03-30 Rite-Hite Holding Corporation Release mechanism for industrial doors
EP0912760B1 (de) * 1996-06-04 2005-11-09 University Of Utah Research Foundation Gerät und verfahren zur fluoreszenzmessung der dna-amplifikation
US5736333A (en) * 1996-06-04 1998-04-07 The Perkin-Elmer Corporation Passive internal references for the detection of nucleic acid amplification products
DE69735313T2 (de) * 1996-06-04 2006-11-02 University Of Utah Research Foundation, Salt Lake City Fluoreszenz-Donor-Akzeptor Paar
US6780982B2 (en) * 1996-07-12 2004-08-24 Third Wave Technologies, Inc. Charge tags and the separation of nucleic acid molecules
US6117635A (en) * 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US5866336A (en) * 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
DK0912767T3 (da) * 1996-07-16 2006-10-30 Gen Probe Inc Fremgangsmåde til sporing og forstærkning af nukleinsyresekvenser ved anvendelse af modificerede oligonukleotider med foröget targetspecifikt TM
US7070925B1 (en) 1996-07-16 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe
US5853990A (en) * 1996-07-26 1998-12-29 Edward E. Winger Real time homogeneous nucleotide assay
US6361940B1 (en) 1996-09-24 2002-03-26 Qiagen Genomics, Inc. Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity
US20050153373A1 (en) * 1996-10-31 2005-07-14 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US20050202499A1 (en) * 1996-10-31 2005-09-15 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US20030165971A1 (en) * 1996-10-31 2003-09-04 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
EP2374890B1 (de) 1996-11-29 2012-11-14 Third Wave Technologies, Inc. FEN-1-Endonucleasen, Mischungen und Spaltungsverfahren
US5840879A (en) * 1996-12-06 1998-11-24 Wang; Edge R. Reagents and solid supports for improved synthesis and labeling of polynucleotides
US20020137904A1 (en) * 1998-03-27 2002-09-26 Patricia A. Billing-Medel Reagents and methods useful for detecting diseases of the gastrointestinal tract
US20050208567A1 (en) * 1997-04-25 2005-09-22 Billing-Medel Patricia A Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
JP3948503B2 (ja) * 1997-08-01 2007-07-25 誠 鶴岡 蛍光偏光法による核酸の測定方法およびＶｅｒｏ毒素生産菌の検出方法
JP3174751B2 (ja) * 1997-09-30 2001-06-11 財団法人 東京都医学研究機構 リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｃｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ
DE19743518A1 (de) * 1997-10-01 1999-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Automatisierbare universell anwendbare Probenvorbereitungsmethode
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
AU1366299A (en) * 1997-10-27 1999-05-17 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons
AU741141B2 (en) 1997-11-04 2001-11-22 Roche Diagnostics Gmbh Specific and sensitive method for detecting nucleic acids
US6077669A (en) * 1997-11-04 2000-06-20 Becton Dickinson And Company Kit and method for fluorescence based detection assay
US6294326B1 (en) 1997-11-07 2001-09-25 Abbott Laboratories Analyte detection process using dual labeled probes
US6583168B1 (en) 1997-11-25 2003-06-24 Applera Corporation Sulfonated diarylrhodamine dyes
US8182991B1 (en) 1997-11-26 2012-05-22 Third Wave Technologies, Inc. FEN-1 endonucleases, mixtures and cleavage methods
DE19752898A1 (de) * 1997-11-28 1999-08-05 Centeon Pharma Gmbh Verfahren zum Nachweis hoher Vierenkonzentrationen im Blutplasma und/oder Blutserum mittels der Polymerasekettenreaktion
DE19755642B4 (de) * 1997-12-15 2005-03-10 Zlb Behring Gmbh Markierter Primer für die Polymerasekettenreaktion
ATE369439T1 (de) * 1997-12-15 2007-08-15 Csl Behring Gmbh Markierter primer, geeignet für die detektion von nukleinsäuren
JP4388694B2 (ja) * 1998-02-04 2009-12-24 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー 複数のアレル部位における増幅産物のゲノム型決定
WO1999040219A1 (en) * 1998-02-05 1999-08-12 Bavarian Nordic Research Institute A/S Quantification by inhibition of amplification
US6361942B1 (en) 1998-03-24 2002-03-26 Boston Probes, Inc. Method, kits and compositions pertaining to detection complexes
US5952202A (en) * 1998-03-26 1999-09-14 The Perkin Elmer Corporation Methods using exogenous, internal controls and analogue blocks during nucleic acid amplification
US6683173B2 (en) 1998-04-03 2004-01-27 Epoch Biosciences, Inc. Tm leveling methods
US6127121A (en) * 1998-04-03 2000-10-03 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides containing pyrazolo[3,4-D]pyrimidines for hybridization and mismatch discrimination
US7045610B2 (en) * 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6949367B1 (en) 1998-04-03 2005-09-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US7715989B2 (en) * 1998-04-03 2010-05-11 Elitech Holding B.V. Systems and methods for predicting oligonucleotide melting temperature (TmS)
GB9808145D0 (en) * 1998-04-17 1998-06-17 Zeneca Ltd Assay
US20030203394A1 (en) * 1998-05-04 2003-10-30 Yoav Eichen Detection of a target in a sample
DE19822108A1 (de) * 1998-05-12 2000-02-03 Schering Ag Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen in Produkten, insbesondere in Arzneimitteln und Kosmetika
US6468743B1 (en) 1998-05-18 2002-10-22 Conagra Grocery Products Company PCR techniques for detecting microbial contaminants in foodstuffs
DE19824535A1 (de) 1998-06-03 1999-12-09 Roche Diagnostics Gmbh Neue Rhodamin-Derivate und deren Verwendung
GB9812768D0 (en) * 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
ATE371022T1 (de) 1998-06-17 2007-09-15 Ge Healthcare Bio Sciences Fy7 polymerase
WO2000001850A2 (en) 1998-07-02 2000-01-13 Gen-Probe Incorporated Molecular torches
JP3437094B2 (ja) * 1998-07-03 2003-08-18 松下電器産業株式会社 多波長蛍光偏光法
US20040203078A1 (en) * 1998-07-22 2004-10-14 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Labeled complex, process for producing same and process for utilizing same
US6037130A (en) * 1998-07-28 2000-03-14 The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits
IL126776A (en) * 1998-10-27 2001-04-30 Technion Res & Dev Foundation A method of investing gold
US6492111B1 (en) * 1998-11-25 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. In situ binary synthesis of biologically effective molecules
US6441152B1 (en) * 1998-12-08 2002-08-27 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for the identification of nucleic acids electrostatically bound to matrices
EP1013775A1 (de) * 1998-12-21 2000-06-28 LUTZ, Hans Quantitative Polymerase-Kettenreaktion mittels fluorogenen Echtzeiterfassungssystem
US6432642B1 (en) * 1999-01-15 2002-08-13 Pe Corporation (Ny) Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection
DE19906169A1 (de) * 1999-02-08 2000-08-10 Bioinside Ges Fuer Biodiagnost Testkit und Verfahren zum quantitativen Nachweis von gentechnisch veränderter DNS in Lebensmitteln mittels fluoreszenzgekoppelter PCR
US7141417B1 (en) * 1999-02-25 2006-11-28 Thomas Jefferson University Compositions, kits, and methods relating to the human FEZ1 gene, a novel tumor suppressor gene
US6322980B1 (en) 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
US6514700B1 (en) * 1999-04-30 2003-02-04 Aclara Biosciences, Inc. Nucleic acid detection using degradation of a tagged sequence
US20040248150A1 (en) * 1999-04-02 2004-12-09 Sharat Singh Methods employing oligonucleotide-binding e-tag probes
GB9908437D0 (en) * 1999-04-13 1999-06-09 Minton Treharne & Davies Limit Methods of marking materials
US6573047B1 (en) 1999-04-13 2003-06-03 Dna Sciences, Inc. Detection of nucleotide sequence variation through fluorescence resonance energy transfer label generation
DE29906582U1 (de) * 1999-04-14 2000-09-21 Langenbach Guido Crashschutzvorrichtung
US20030235832A1 (en) * 2000-06-21 2003-12-25 Ahmed Chenna Multiplexed analysis by chromatographic separation of molecular tags
US6331393B1 (en) * 1999-05-14 2001-12-18 University Of Southern California Process for high-throughput DNA methylation analysis
US6180349B1 (en) 1999-05-18 2001-01-30 The Regents Of The University Of California Quantitative PCR method to enumerate DNA copy number
DE19923168A1 (de) 1999-05-20 2000-11-23 Roche Diagnostics Gmbh Neue Fluoreszenzfarbstoffe und ihre Verwendung als Fluoreszenzmarker
DE60040912D1 (de) * 1999-05-24 2009-01-08 Invitrogen Corp Ein verfahren zum entschützen markierter oligonukleotide
US6277607B1 (en) 1999-05-24 2001-08-21 Sanjay Tyagi High specificity primers, amplification methods and kits
US7097973B1 (en) 1999-06-14 2006-08-29 Alpha Mos Method for monitoring molecular species within a medium
WO2000079009A2 (en) 1999-06-22 2000-12-28 Invitrogen Corporation Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
EP1194535A4 (de) * 1999-06-23 2004-03-10 Genesource Inc Zerstörungsfreies, auf zellen basierendes testverfahren
US6750357B1 (en) 1999-06-25 2004-06-15 Syngen, Inc. Rhodamine-based fluorophores useful as labeling reagents
US6692834B1 (en) * 1999-06-28 2004-02-17 Medtronic, Inc. Method for coating implantable devices
US6830902B1 (en) * 1999-07-02 2004-12-14 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
US6339147B1 (en) 1999-07-29 2002-01-15 Epoch Biosciences, Inc. Attachment of oligonucleotides to solid supports through Schiff base type linkages for capture and detection of nucleic acids
US7169553B1 (en) 1999-08-30 2007-01-30 Roche Diagnostics, Gmbh 2-Azapurine compounds and their use
DE50001774D1 (de) 1999-09-29 2003-05-22 Tecan Trading Ag Maennedorf Thermocycler sowie Hebeelement für Mikrotiterplatte
GB9923144D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Socrates Biotech International Methods
US20030082616A1 (en) * 1999-10-15 2003-05-01 Hitachi, Ltd. Apparatus and method for analyzing nucleic acids and related genetic abnormality
US6272939B1 (en) 1999-10-15 2001-08-14 Applera Corporation System and method for filling a substrate with a liquid sample
US7662550B1 (en) 1999-10-22 2010-02-16 Phri Properties, Inc. Assays for short sequence variants
US7824859B2 (en) * 1999-10-29 2010-11-02 Cytyc Corporation Methods for detection of a target nucleic acid by forming a cleavage structure using an RNA polymerase
US6528254B1 (en) 1999-10-29 2003-03-04 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid sequence
US7534568B2 (en) 1999-10-29 2009-05-19 Hologic Inc. Methods for detection of a target nucleic acid by forming a cleavage structure with a cleavage resistant probe
US7838225B2 (en) * 1999-10-29 2010-11-23 Hologic, Inc. Methods for detection of a target nucleic acid by forming a cleavage structure using a reverse transcriptase
US6893819B1 (en) * 2000-11-21 2005-05-17 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US7381532B2 (en) * 1999-10-29 2008-06-03 Stratagene California Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
US7118860B2 (en) 1999-10-29 2006-10-10 Stratagene California Methods for detection of a target nucleic acid by capture
WO2001036442A1 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Jiuping Ji Simultaneous detection of hbv, hcv and hiv in plasma samples using a multiplex capture assay
PT1232502E (pt) * 1999-11-17 2006-05-31 Roche Diagnostics Gmbh Particulas de vidro magneticas, metodo para a sua preparacao e suas utilizacoes
US6660845B1 (en) 1999-11-23 2003-12-09 Epoch Biosciences, Inc. Non-aggregating, non-quenching oligomers comprising nucleotide analogues; methods of synthesis and use thereof
WO2001038585A2 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 The Regents Of The University Of California Polymer arrays and methods of using labeled probe molecules to identify and quantify target molecule expression
JP2003517309A (ja) 1999-12-02 2003-05-27 ディーエヌエー サイエンシーズ インコーポレーテッド 単一ヌクレオチドの変異及びジェノタイピングの決定方法
US7205105B2 (en) * 1999-12-08 2007-04-17 Epoch Biosciences, Inc. Real-time linear detection probes: sensitive 5′-minor groove binder-containing probes for PCR analysis
US6727356B1 (en) * 1999-12-08 2004-04-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
US20040081959A9 (en) * 1999-12-08 2004-04-29 Epoch Biosciences, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
US7250252B2 (en) * 1999-12-30 2007-07-31 David Aaron Katz Amplification based polymorphism detection
AU2001234595A1 (en) 2000-01-26 2001-08-07 University Of Cincinnati Detection of nucleic acid target sequences by electron paramagnetic resonance spectroscopy
DE10004147A1 (de) * 2000-01-31 2001-08-09 Gsf Forschungszentrum Umwelt Oligonukleotide zur spezifischen Amplifikation und zum spezifischen Nachweis von 16S-rRNA-Genen von Bakterien
US7169355B1 (en) * 2000-02-02 2007-01-30 Applera Corporation Apparatus and method for ejecting sample well trays
FI20000333A0 (fi) * 2000-02-16 2000-02-16 Jussi Nurmi Homogeeninen menetelmä polynukleotidin havaitsemiseksi
US7033763B2 (en) * 2000-02-23 2006-04-25 City Of Hope Pyrophosphorolysis activated polymerization (PAP)
ES2330408T3 (es) * 2000-02-23 2009-12-10 City Of Hope Polimerizacion activada por pirofosforolisis (pap): aplicacion en la amplificacion de un alelo especifico y en la determinacion de secuencias de acidos nucleicos.
US20030117705A1 (en) * 2000-02-25 2003-06-26 Cambridge Research & Instrumentation Inc. Fluorescence polarization assay system and method
EP1944310A3 (de) 2000-03-01 2008-08-06 Epoch Biosciences, Inc. Modifizierte Oligonukleotide zur Erkennung von Fehlanpassungen
EP1975256B1 (de) 2000-03-01 2012-07-11 Epoch Biosciences, Inc. Modifizierte Oligonukleotide zur Erkennung von Fehlanpassungen
JP2003527866A (ja) * 2000-03-23 2003-09-24 ルミジェン・インコーポレイテッド ポリヌクレオチド・キナーゼを検出する方法および標識としてのその使用
EP1950313A3 (de) 2000-03-27 2010-12-08 GlaxoSmithKline LLC Detektion von lebensfähigen Agenzien
US7998673B2 (en) * 2000-03-29 2011-08-16 Lgc Limited Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
US7211381B1 (en) 2000-04-04 2007-05-01 Abbott Laboratories β2 andrenergic polymorphism detection
US6593092B2 (en) 2000-04-04 2003-07-15 Abbott Laboratories Beta 2 adrenergic polymorphism detection
US20040067498A1 (en) * 2000-04-28 2004-04-08 Ahmed Chenna Detection of nucleic acid sequences by cleavage and separation of tag-containing structures
US7771929B2 (en) * 2000-04-28 2010-08-10 Monogram Biosciences, Inc. Tag library compounds, compositions, kits and methods of use
EP1349954B1 (de) * 2000-05-19 2011-01-26 Eragen Biosciences, Inc. Materialien und methoden zum nachweis von nukleinsäuren
US6355433B1 (en) 2000-06-02 2002-03-12 Dna Sciences, Inc. Determination of nucleotide sequence variations through limited primer extension
US6887664B2 (en) 2000-06-06 2005-05-03 Applera Corporation Asynchronous primed PCR
US6719949B1 (en) 2000-06-29 2004-04-13 Applera Corporation Apparatus and method for transporting sample well trays
GB0016836D0 (en) * 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (1)
AU2001269292A1 (en) * 2000-07-07 2002-01-21 Helen Lee Improved stability of hybridisation interactions in dipstick assays
CA2416631C (en) * 2000-08-03 2011-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses
US6358679B1 (en) * 2000-08-24 2002-03-19 Pe Corporation (Ny) Methods for external controls for nucleic acid amplification
AUPR050700A0 (en) * 2000-10-03 2000-10-26 Id+Plus Ltd Detection method
AU2001291513B2 (en) * 2000-10-03 2007-06-07 Id+Plus Ltd Nucleotide detection method
US6350580B1 (en) 2000-10-11 2002-02-26 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure
JP2002369700A (ja) * 2000-10-11 2002-12-24 Internatl Reagents Corp 核酸分析方法
WO2002033126A2 (en) * 2000-10-14 2002-04-25 Eragen Biosciences, Inc. Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases
NZ525336A (en) * 2000-10-20 2006-03-31 Expression Diagnostics Inc Leukocyte expression profiling
JP2002125687A (ja) * 2000-10-30 2002-05-08 Tosoh Corp Ｈｉｖ−１検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法
WO2002070755A2 (en) * 2000-11-15 2002-09-12 Third Wave Technologies, Inc. Fen endonucleases
US7309573B2 (en) * 2000-11-21 2007-12-18 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US7157232B2 (en) * 2000-12-13 2007-01-02 The Regents Of The University Of California Method to detect the end-point for PCR DNA amplification using an ionically labeled probe and measuring impedance change
US20020142336A1 (en) * 2001-02-02 2002-10-03 Genome Therapeutics Corporation Methods for determining a nucleotide at a specific location within a nucleic acid molecule
WO2002064833A1 (fr) * 2001-02-15 2002-08-22 Takara Bio Inc. Procede de detection de polymorphisme de nucleotide
EP1236804A1 (de) 2001-03-02 2002-09-04 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuren mittels einer Kontrolle
US6713620B2 (en) * 2001-03-28 2004-03-30 Council Of Scientific And Industrial Research Oligonucleotide primers for phosphotidyl inositol in bacillus cereus
US7532920B1 (en) 2001-05-31 2009-05-12 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Guidewire with optical fiber
US7329223B1 (en) * 2001-05-31 2008-02-12 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Catheter with optical fiber sensor
CA2348042A1 (en) 2001-06-04 2002-12-04 Ann Huletsky Sequences for detection and identification of methicillin-resistant staphylococcus aureus
US6905827B2 (en) * 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
US7026121B1 (en) * 2001-06-08 2006-04-11 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
WO2003002959A1 (en) * 2001-06-15 2003-01-09 Mj Research, Inc. Controller for a fluorometer
US9261460B2 (en) 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
US6514750B2 (en) 2001-07-03 2003-02-04 Pe Corporation (Ny) PCR sample handling device
EP1275735A1 (de) * 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Zusammensetzung und Methode zur 'Hot start' Nukleinsäureamplifizierung
WO2003052116A2 (en) * 2001-07-17 2003-06-26 Stratagene Methods for detection of a target nucleic acid using multi-subunit probes
US6852491B2 (en) 2001-09-04 2005-02-08 Abbott Laboratories Amplification and detection reagents for HIV-1
US6593091B2 (en) 2001-09-24 2003-07-15 Beckman Coulter, Inc. Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer
US6942836B2 (en) * 2001-10-16 2005-09-13 Applera Corporation System for filling substrate chambers with liquid
WO2003033741A1 (en) * 2001-10-16 2003-04-24 Aclara Biosciences, Inc. Universal e-tag primer and probe compositions and methods
AU2002366046A1 (en) 2001-10-19 2003-06-10 Proligo Llc Nucleic acid probes and methods to detect and/or quantify nucleic acid analytes
US20030165859A1 (en) * 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
CN1166422C (zh) * 2001-11-05 2004-09-15 北京源德生物医学工程股份有限公司 用于体外高能聚焦超声波治疗机的坐位架
DE10153829A1 (de) * 2001-11-05 2003-05-28 Bayer Ag Assay basierend auf dotierten Nanoteilchen
US20050053939A1 (en) * 2001-11-09 2005-03-10 Ahmed Chenna Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents
WO2003046208A2 (en) 2001-11-28 2003-06-05 Mj Bioworks Incorporated Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction
AU2002351187A1 (en) 2001-11-30 2003-06-17 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
US7223538B2 (en) * 2001-12-14 2007-05-29 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Post-synthesis labeling of nucleic acids, assays using nucleic acids that are labeled post-synthetically, single nucleotide polymorphism detection, and associated compounds and microarrays
US7198897B2 (en) * 2001-12-19 2007-04-03 Brandeis University Late-PCR
AU2003235767A1 (en) 2002-01-08 2003-07-24 Roche Diagnostics Gmbh Use of silica material in an amplification reaction
AU2003208959A1 (en) * 2002-01-30 2003-09-02 Id Biomedical Corporation Methods for detecting vancomycin-resistant microorganisms and compositions therefor
US20030186299A1 (en) * 2002-02-27 2003-10-02 Cogburn Larry A. Molecular markers for identification of fat and lean phenotypes in chickens
EP1340818A1 (de) * 2002-02-27 2003-09-03 Epigenomics AG Verfahren und Nukleinsäuren zur Analyse von Kolonkrebszellen
GB0205455D0 (en) 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
US7166478B2 (en) * 2002-03-12 2007-01-23 Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses
US9353405B2 (en) 2002-03-12 2016-05-31 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes
HUP0200981A3 (en) * 2002-03-14 2004-06-28 Genoid Kft Pcr reactions with hybridizing probes using primers with broad genotype-specificity for detection of human papilloma-viruses and typing amplificates by using specifically hybridizing oligonucleotides
JP4437193B2 (ja) * 2002-03-29 2010-03-24 独立行政法人産業技術総合研究所 核酸ライブラリー及びタンパク質ライブラリー
US7445893B2 (en) * 2002-04-12 2008-11-04 Primera Biosystems, Inc. Sampling method for amplification reaction analysis
US7081339B2 (en) * 2002-04-12 2006-07-25 Primera Biosystems, Inc. Methods for variation detection
US7745180B2 (en) 2002-04-24 2010-06-29 Hitachi Chemical Co., Ltd. Device and method for high-throughput quantification of mRNA from whole blood
JPWO2003100095A1 (ja) * 2002-05-08 2005-09-22 アークレイ株式会社 標的核酸の検出法
US20030219754A1 (en) * 2002-05-23 2003-11-27 Oleksy Jerome E. Fluorescence polarization detection of nucleic acids
US6896727B2 (en) * 2002-06-28 2005-05-24 Seh America, Inc. Method of determining nitrogen concentration within a wafer
WO2004003136A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Sention, Inc. Methods of detecting sequence differences
US20040023220A1 (en) * 2002-07-23 2004-02-05 Lawrence Greenfield Integrated method for PCR cleanup and oligonucleotide removal
FR2842827B1 (fr) * 2002-07-26 2004-10-22 Biocortech NOUVELLE METHODE D'ANALYSE D'ACIDE NUCLEIQUE ET SON UTILISATION POUR EVALUER LE DEGRE D'EDITION DE L'ARNm DU RECEPTEUR 5-HT2c
WO2004011625A2 (en) 2002-07-31 2004-02-05 University Of Southern California Polymorphisms for predicting disease and treatment outcome
AU2003236461B2 (en) 2002-08-29 2009-05-28 Epigenomics Ag Improved method for bisulfite treatment
EP1556325A4 (de) * 2002-09-20 2007-09-19 Integrated Dna Tech Inc Anthrachinonquencherfarbstoffe, verfahren zu deren herstellung und verwendung
US7245789B2 (en) * 2002-10-07 2007-07-17 Vascular Imaging Corporation Systems and methods for minimally-invasive optical-acoustic imaging
US7807802B2 (en) 2002-11-12 2010-10-05 Abbott Lab Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae
CA2506129C (en) 2002-11-15 2015-02-17 Idenix (Cayman) Limited 2'-branched nucleosides and flaviviridae mutation
FI113549B (fi) * 2002-11-19 2004-05-14 Mobidiag Oy Diagnostinen menetelmä hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien osoittamiseksi ja tunnistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen alukeseos
US20050089875A1 (en) * 2002-11-21 2005-04-28 Sention Inc. Quantitative analysis of expression profiling information produced at various stages of an amplification process
WO2004048397A2 (en) * 2002-11-22 2004-06-10 Roche Diagnostics Gmbh Detectable labeled nucleoside analogs and methods of use thereof
US20040248085A1 (en) * 2002-11-29 2004-12-09 Sang-Wha Lee General primers and process for detecting diverse genotypes of human papillomavirus by PCR
EP2031070B1 (de) 2002-12-04 2013-07-17 Life Technologies Corporation Multiplexverstärkung von Polynucleotiden
US7718361B2 (en) 2002-12-06 2010-05-18 Roche Molecular Systems, Inc. Quantitative test for bacterial pathogens
EP1426447A1 (de) * 2002-12-06 2004-06-09 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur Detection des pathogenen gram positiven Bacterien, Bvw. Staphylococcus, Enterococcus and Streptococcus
WO2004053155A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Roche Diagniostics Gmbh Multiplex assay detection of pathogenic organisms
US20060115819A1 (en) * 2002-12-06 2006-06-01 Sofie Claeys Detection, identification and differentiation of eubacterial taxa using a hybridization assay
US8206904B2 (en) 2002-12-18 2012-06-26 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids
US7851150B2 (en) 2002-12-18 2010-12-14 Third Wave Technologies, Inc. Detection of small nucleic acids
US7560231B2 (en) * 2002-12-20 2009-07-14 Roche Molecular Systems, Inc. Mannitol and glucitol derivatives
CA2511381A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-22 Stratagene California Compositions and methods for polynucleotide detection
JP5479663B2 (ja) 2002-12-20 2014-04-23 セレラ コーポレーション 心筋梗塞に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用
WO2004065550A2 (en) * 2003-01-17 2004-08-05 Eragen Biosciences, Inc. Nucleic acid amplification using non-standard bases
US7413855B2 (en) * 2003-01-29 2008-08-19 Roche Molecular Systems, Inc. Method for bisulfite treatment
JP2006522329A (ja) * 2003-03-07 2006-09-28 ラクセル・バイオサイエンシズ・リミテッド 酸素感受性プローブ
WO2004085670A2 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 Perkinelmer Las, Inc. Polarization detection
JP4782668B2 (ja) * 2003-03-31 2011-09-28 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 日本脳炎ウィルス血清グループのメンバーを包含する一定のフラビウィルスを検出するための組成物及び方法
JP4567673B2 (ja) 2003-04-01 2010-10-20 エラジェン バイオサイエンシズ インコーポレイテッド ポリメラーゼ阻害剤およびその使用方法
US7666361B2 (en) 2003-04-03 2010-02-23 Fluidigm Corporation Microfluidic devices and methods of using same
CA2463719A1 (en) * 2003-04-05 2004-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleotide analogs with six membered rings
WO2004094986A2 (en) * 2003-04-16 2004-11-04 Handylab, Inc. System and method for electrochemical detection of biological compounds
US20040214176A1 (en) * 2003-04-22 2004-10-28 Osborne James C. Multiplexed DNA assays using structure-specific endonucleases
US20060263813A1 (en) * 2005-05-11 2006-11-23 Expression Diagnostics, Inc. Methods of monitoring functional status of transplants using gene panels
US7892745B2 (en) * 2003-04-24 2011-02-22 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7148043B2 (en) 2003-05-08 2006-12-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Systems and methods for fluorescence detection with a movable detection module
DE602004007382T2 (de) 2003-05-20 2008-04-17 Bayer Pharmaceuticals Corp., West Haven Diaryl-harnstoffe für durch pdgfr vermittelte krankheiten
DE10327756B4 (de) * 2003-06-18 2005-12-29 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Verfahren zum Echtzeit-Quantifizieren einer Nukleinsäure
WO2005003373A2 (en) * 2003-06-26 2005-01-13 Proligo, Llc Fluorogenic nucleic acid probes including lna for methods to detect and/or quantify nucleic acid analytes
US20050233314A1 (en) * 2003-06-30 2005-10-20 National Health Research Institutes Sensitive and quantitative detection of pathogens by real-time nested PCR
GB0317592D0 (en) * 2003-07-26 2003-08-27 Astrazeneca Ab Method
KR101176191B1 (ko) 2003-07-29 2012-08-22 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤 약제 기인성 과립구 감소증 발증 리스크 판정법
EP1502961B1 (de) * 2003-08-01 2010-09-08 Roche Diagnostics GmbH Neues Format zur Detektion von Heissstart- und Echtzeit-Polymerasekettenreaktion
EP1502958A1 (de) * 2003-08-01 2005-02-02 Roche Diagnostics GmbH Neues Format zur Detektion von Heissstart- und Echtzeit-Polymerasekettenreaktion
US20050112634A1 (en) * 2003-09-19 2005-05-26 Woudenberg Timothy M. High density sequence detection methods and apparatus
AU2004277589A1 (en) * 2003-09-30 2005-04-14 Perkinelmer Las, Inc. Compositions and processes for genotyping single nucleotide polymorphisms
US7348146B2 (en) * 2003-10-02 2008-03-25 Epoch Biosciences, Inc. Single nucleotide polymorphism analysis of highly polymorphic target sequences
CA2482097C (en) * 2003-10-13 2012-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for isolating nucleic acids
US7901880B2 (en) 2003-10-21 2011-03-08 Orion Genomics Llc Differential enzymatic fragmentation
US20050130246A1 (en) * 2003-10-27 2005-06-16 Hossein Salimi-Moosavi Detecting human anti-therapeutic antibodies
PL1687609T3 (pl) * 2003-10-28 2015-05-29 Epoch Biosciences Inc Sondy fluoroscencyjne do wykrywania DNA przez hybrydyzację o ulepszonej czułości i niskim tle
EP1533618A1 (de) * 2003-11-04 2005-05-25 Ludwig-Maximilians-Universität München Methode zur Unterscheidung prognostisch definierbarer AML
US20070105118A1 (en) * 2003-11-04 2007-05-10 Martin Dugas Method for distinguishing aml subtypes with recurring genetic aberrations
WO2005043167A2 (en) * 2003-11-04 2005-05-12 Roche Diagnostic Gmbh Method for distinguishing aml subtypes with differents gene dosages
EP1530046A1 (de) * 2003-11-04 2005-05-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Methode zur Unterscheidung von AML Subtypen mit verändertem Karyotyp mit mittelmässiger Prognose
US20070099190A1 (en) * 2003-11-04 2007-05-03 Martin Dugas Method for distinguishing leukemia subtypes
US20070212688A1 (en) * 2003-11-04 2007-09-13 Martin Dugas Method For Distinguishing Cbf-Positive Aml Subtypes From Cbf-Negative Aml Subtypes
WO2005043168A2 (en) * 2003-11-04 2005-05-12 Roche Diagnostics Gmbh Method for distinguishing aml-specific flt3 length mutations from tkd mutations
EP1682900A2 (de) * 2003-11-04 2006-07-26 Roche Diagnostics GmbH Methode zur unterscheidung von t(11q23)/mll positiven leukemien von t(11q23)/mll negativen leukemien
US20070212687A1 (en) * 2003-11-04 2007-09-13 Martin Dugas Method For Distinguishing Mll-Ptd-Positive Aml From Other Aml Subtypes
WO2005045437A2 (en) * 2003-11-04 2005-05-19 Roche Diagnostics Gmbh Method for distinguishing immunologically defined all subtypes
US20050261841A1 (en) * 2003-11-07 2005-11-24 Shepard Donald F Physical geolocation system
CA2545807C (en) 2003-11-12 2013-01-08 Bayer Healthcare Llc Oligonucleotides and methods for detection of west nile virus
WO2005049849A2 (en) 2003-11-14 2005-06-02 Integrated Dna Technologies, Inc. Fluorescence quenching azo dyes, their methods of preparation and use
EP1689764B1 (de) * 2003-11-19 2013-01-02 AlleLogic Biosciences Corporation Mit mehreren fluorophoren markierte oligonukleotide
JP5649263B2 (ja) 2003-11-26 2015-01-07 セレラ コーポレーション 心臓血管障害および薬物応答に関連した遺伝子多型、それらの検出方法および用途
US20050244847A1 (en) * 2003-11-26 2005-11-03 Eppendorf Ag Methods and compositions for in vitro amplification of extrachromosomal nucleic acid
CA2494571C (en) * 2003-12-02 2010-02-09 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides containing molecular rods
US7501240B2 (en) 2003-12-02 2009-03-10 Roche Molecular Systems, Inc. Method for bisulfite treatment
US8647873B2 (en) 2004-04-27 2014-02-11 Viacyte, Inc. PDX1 expressing endoderm
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
US8586357B2 (en) 2003-12-23 2013-11-19 Viacyte, Inc. Markers of definitive endoderm
US7541185B2 (en) 2003-12-23 2009-06-02 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
MX2009009225A (es) 2003-12-23 2009-09-28 Cythera Inc Endodermo definitivo.
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
US7985585B2 (en) 2004-07-09 2011-07-26 Viacyte, Inc. Preprimitive streak and mesendoderm cells
EP1716249A2 (de) * 2003-12-31 2006-11-02 Applera Corporation, Applied Biosystems Group Quantitative amplifikation und bestimmung geringer anzahlen von zielpolynukleotiden
CN1910289B (zh) 2004-01-07 2012-05-23 日立化成研究中心公司 用于检测hiv的引物和探针
JP4969250B2 (ja) * 2004-02-06 2012-07-04 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ スペーサー領域を使用するプロテウス種の検出、同定、および区別
CA2791798C (en) * 2004-02-10 2016-08-16 F. Hoffmann-La Roche Ag New primers and probes for the detection of parvovirus b19
WO2005080596A1 (en) * 2004-02-19 2005-09-01 University College Cork - National University Of Ireland, Cork Detection of biologically active compounds
EP2208797A3 (de) 2004-03-01 2010-11-24 Applied Biosystems, LLC Verfahren, Zusammensetzungen und Kits für Polynukleotidamplifikation
WO2005092038A2 (en) * 2004-03-22 2005-10-06 The Johns Hopkins University Methods for the detection of nucleic acid differences
KR100906749B1 (ko) * 2004-03-25 2009-07-09 (주)바이오니아 인터컬레이팅 형광염료가 표지된 프로브를 이용한 핵산 증폭 측정 방법
JP4972541B2 (ja) * 2004-04-01 2012-07-11 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド 標識されたプローブおよび３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を用いた定量的増幅方法
EP1732614B1 (de) * 2004-04-08 2008-12-24 Sangamo Biosciences Inc. Zusammensetzungen zur behandlung von neuropathischen und neurodegenerativen erkrankungen
AU2005233583B2 (en) * 2004-04-08 2011-02-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating cardiac contractility
EP1746156B1 (de) 2004-04-26 2011-11-23 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Sonde und primer zum nachweis von tuberkelbazillen sowie verfahren zum nachweis von tuberkelbazillen beim menschen damit
US7939251B2 (en) * 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
EP2423327B1 (de) 2004-05-07 2014-01-08 Celera Corporation Genetischer Polymorphismus und Leberfibrose, Verfahren zur Erkennung und Verwendung davon
US20050255485A1 (en) * 2004-05-14 2005-11-17 Livak Kenneth J Detection of gene duplications
JP4545147B2 (ja) * 2004-05-17 2010-09-15 株式会社日立国際電気 基板処理装置及び半導体デバイス製造方法
JP2008503206A (ja) * 2004-05-25 2008-02-07 日立化成工業株式会社 癌感受性を測定する方法
US20060030037A1 (en) * 2004-05-28 2006-02-09 Victor Joseph Thermo-controllable high-density chips for multiplex analyses
US7575863B2 (en) * 2004-05-28 2009-08-18 Applied Biosystems, Llc Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
EP1754257B1 (de) 2004-06-07 2013-12-25 Fluidigm Corporation Optisches Linsensystem und Verfahren für mikrofluidische Einrichtungen
EP1609871A1 (de) * 2004-06-21 2005-12-28 Biolytix AG Verfahren und Kits zur Detektion, Identifizierung und Quantifizierung von Bacterien und Hefen in Lebensmitteln und Getränken.
EP2453024B1 (de) 2004-06-21 2017-12-06 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Differenziell exprimierte Gene und Leitungsbahnen bei bipolarer Störung und/oder schwerer depressiver Erkrankung
US20070154889A1 (en) * 2004-06-25 2007-07-05 Veridex, Llc Methods and reagents for the detection of melanoma
US20060216715A1 (en) * 2004-06-28 2006-09-28 Jun Nakayama Method of detecting cancer
US7745125B2 (en) 2004-06-28 2010-06-29 Roche Molecular Systems, Inc. 2′-terminator related pyrophosphorolysis activated polymerization
WO2006000647A1 (en) * 2004-06-29 2006-01-05 Wallac Oy Integrated non-homogeneous nucleic acid amplification and detection
US7776530B2 (en) * 2004-06-29 2010-08-17 Wallac Oy Integrated nucleic acid analysis
US7399614B2 (en) * 2004-06-30 2008-07-15 Applera Corporation 5-methylcytosine detection, compositions and methods therefor
US20060057611A1 (en) * 2004-06-30 2006-03-16 Applera Corporation Log-linear amplification
US20060115827A1 (en) 2004-07-01 2006-06-01 University Of Southern California Genetic markers for predicting disease and treatment outcome
TWI334885B (en) * 2004-07-05 2010-12-21 Food And Drug Administration Dept Of Health Primers, probes and reference plasmid for detection of meat
US20090232771A1 (en) 2004-07-13 2009-09-17 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method of controlling cell functions
DE502004007951D1 (de) * 2004-08-18 2008-10-09 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Messung einer Nukleinsäureamplifikation in Real Time beinhaltend die Positionierung eines Reaktionsgefässes relativ zu einer Detektionseinheit
EP1632578A1 (de) * 2004-09-03 2006-03-08 Roche Diagnostics GmbH Methode zur Dekontamination der DNA
WO2006029184A2 (en) * 2004-09-08 2006-03-16 Expression Diagnostics, Inc. Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders
EP1634965B1 (de) 2004-09-09 2010-01-20 Roche Diagnostics GmbH Echtzeit-PCR unter Zusatz von Pyrophosphatase
US20060051796A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Inga Boell Real time PCR with the addition of pyrophosphatase
EP1797881B1 (de) 2004-09-17 2009-04-15 Eisai R&D Management Co., Ltd. Medizinische zusammensetzung mit verbesserter stabilität und reduzierten gelierungseigenschaften
ATE494392T1 (de) * 2004-09-21 2011-01-15 Life Technologies Corp Zweifarbige echtzeit/endpunkt-quantifizierung von mikro-rnas (mirnas)
JP5210634B2 (ja) * 2004-09-30 2013-06-12 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ スペーサー領域を使用するセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出、同定および鑑別
US7166680B2 (en) * 2004-10-06 2007-01-23 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Blends of poly(ester amide) polymers
NZ554701A (en) * 2004-10-18 2010-03-26 Univ Brandeis Reagents and methods for improving reproducibility and reducing mispriming in PCR amplification
RU2460804C2 (ru) * 2004-10-18 2012-09-10 Брандейс Юнивесити Способ гомогенной детекции по меньшей мере одного продукта одноцепочечной амплификации
US20060147954A1 (en) * 2004-10-19 2006-07-06 Wallac Oy Novel probe and its use in bioaffinity assays
US20090011410A1 (en) * 2004-10-20 2009-01-08 Masato Mitsuhashi Method for tailoring administration of drugs by quantitation of mrna
AU2005299089B2 (en) 2004-10-21 2011-08-18 Eberhard Karls Universitaet Tuebingen KASPP (LRKK2) gene, its production and use for the detection and treatment of neurodegenerative disorders
CN100441696C (zh) * 2004-10-22 2008-12-10 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 肠出血性大肠杆菌o157：h7菌株的检测方法
US8133703B2 (en) 2004-10-27 2012-03-13 Ceoheid Closed-system multi-stage nucleic acid amplification reactions
CN102242196A (zh) 2004-10-28 2011-11-16 大塚制药株式会社 对干扰素治疗肾细胞癌反应的鉴定标记
ES2391744T3 (es) 2004-11-01 2012-11-29 George Mason University Composiciones y procedimientos para el diagnóstico de trastornos del colon
EP1809765A2 (de) * 2004-11-04 2007-07-25 Roche Diagnostics GmbH Klassifizierung von aml (akuter myeloider leukämie)
US20060105348A1 (en) * 2004-11-15 2006-05-18 Lee Jun E Compositions and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US20060275792A1 (en) * 2004-11-15 2006-12-07 Lee Jun E Enhancement of nucleic acid amplification using double-stranded DNA binding proteins
EP1666150B1 (de) 2004-11-20 2015-01-07 Roche Diagnostics GmbH Präparieren von Nucleinsäuren
US20080213762A1 (en) * 2004-12-08 2008-09-04 Takeshi Yamamoto Method of Gene Sequence Examination
AU2005314089B2 (en) * 2004-12-08 2011-03-03 Cedars-Sinai Medical Center Methods for diagnosis and treatment of Crohn's disease
US7842794B2 (en) 2004-12-17 2010-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae
US20060178507A1 (en) * 2004-12-30 2006-08-10 Berry & Associates, Inc. Fluorous oligonucleotide reagents and affinity purification of oligonucleotides
US20060252032A1 (en) * 2005-01-28 2006-11-09 Third Wave Technologies, Inc. Detection of human herpesviruses
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
ATE553122T1 (de) * 2005-02-28 2012-04-15 Sangamo Biosciences Inc Antiangiogene methoden und zusammensetzungen
US7521188B2 (en) * 2005-03-02 2009-04-21 The Regents Of The University Of Michigan Optical monitoring of cleaving enzyme activity
EP2348320B1 (de) 2005-03-10 2024-05-01 Gen-Probe Incorporated Verfahren und Systeme zur Erkennung mehrerer Fluoreszenzemissionssignale
CA2599576C (en) 2005-03-10 2015-09-15 Gen-Probe Incorporated Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes within samples
CA2600794C (en) 2005-03-11 2014-08-12 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with coronary heart disease, methods of detection and uses thereof
US20070026423A1 (en) * 2005-03-16 2007-02-01 Thomas Koehler Method and test kit for the detection of target nucleic acids
US7776567B2 (en) 2005-03-17 2010-08-17 Biotium, Inc. Dimeric and trimeric nucleic acid dyes, and associated systems and methods
US7601498B2 (en) 2005-03-17 2009-10-13 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection and associated technology
EP2518161A1 (de) 2005-03-18 2012-10-31 Fluidigm Corporation Verfahren zum Nachweis von mutierten Allelen
WO2006101913A2 (en) * 2005-03-18 2006-09-28 Eragen Biosciences, Inc. Methods for detecting multiple species and subspecies of neiserria
EP2415524A2 (de) 2005-03-30 2012-02-08 F. Hoffmann-La Roche AG Abgedichtete Vorrichtung
GB2424886A (en) 2005-04-04 2006-10-11 Dxs Ltd Polynucleotide primers against epidermal growth factor receptor and method of detecting gene mutations
US20060275798A1 (en) * 2005-04-04 2006-12-07 Steichen John C Detection of organisms using a media sachet and primer directed nucleic acid amplification
WO2006116721A1 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Hitachi Chemical Research Center, Inc. Ex vivo gene expression in whole blood as a model of assessment of individual variation to dietary supplements
EP1880021A2 (de) * 2005-05-02 2008-01-23 Stratagene California Oligonukleotidsonde/primerzusammensetzungen und verfahren zum nachweis von oligonukleotiden
EP2623597B1 (de) 2005-05-13 2014-10-01 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer und Sonde zur Verwendung bei der Erkennung von Mycobacterium kansasii und diesbezügliche Verfahren zur Erkennung von Mycobacterium kansasii
EP1907560B1 (de) * 2005-05-20 2013-01-23 Integrated DNA Technologies, Inc. Verbindungen und verfahren zur markierung von oligonukleotiden
US8362250B2 (en) 2005-05-24 2013-01-29 Enzo Biochem, Inc. Fluorescent dyes and compounds, methods and kits useful for identifying specific organelles and regions in cells of interest
US7569695B2 (en) * 2005-05-24 2009-08-04 Enzo Life Sciences, Inc. Dyes for the detection or quantification of desirable target molecules
US7737281B2 (en) * 2005-05-24 2010-06-15 Enzo Life Sciences, Inc. C/O Enzo Biochem, Inc. Purine based fluorescent dyes
US8357801B2 (en) 2005-05-24 2013-01-22 Enzo Life Sciences, Inc. Labeling of target molecules, identification of organelles and other applications, novel compositions, methods and kits
US8293472B2 (en) * 2005-06-07 2012-10-23 Luminex Corporation Methods for detection and typing of nucleic acids
US7741023B2 (en) * 2005-06-08 2010-06-22 Hitachi Chemical Co., Ltd. Method for predicting immune response to neoplastic disease based on mRNA expression profile in neoplastic cells and stimulated leukocytes
JP2008543288A (ja) * 2005-06-09 2008-12-04 エポック バイオサイエンシズ インコーポレーティッド プライマーに基づく改善された増幅法
US8053627B2 (en) * 2005-06-14 2011-11-08 University Of Chicago Methods for treating demyelination disorders
US7423194B2 (en) * 2005-06-14 2008-09-09 University Of Chicago Animal models for demyelination disorders
US7884260B2 (en) * 2005-06-14 2011-02-08 University Of Chicago Cell-based screen for agents useful for reducing neuronal demyelination or promoting neuronal remyelination
CA2611671C (en) 2005-06-15 2013-10-08 Callida Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
US20060292577A1 (en) * 2005-06-27 2006-12-28 Purdue Research Foundation Neoplasia-specific splice variants and methods
US20060292578A1 (en) 2005-06-28 2006-12-28 Weidong Zheng DNA polymerase blends and mutant DNA polymerases
US8067208B2 (en) 2005-06-30 2011-11-29 Roche Molecular Systems, Inc. Probes and methods for hepatitis C virus typing using multidimensional probe analysis
US9512483B2 (en) * 2005-07-09 2016-12-06 Lovelace Respiratory Research Institute Gene methylation as a biomarker in sputum
US20070020671A1 (en) * 2005-07-12 2007-01-25 Radtkey Ray R Method for detecting large mutations and duplications using control amplification comparisons to paralogous genes
US7977108B2 (en) * 2005-07-25 2011-07-12 Roche Molecular Systems, Inc. Method for detecting a mutation in a repetitive nucleic acid sequence
PT1907588E (pt) 2005-07-26 2013-10-09 Merck Sharp & Dohme Ensaios para determinação da resistência aos medicamentos da classe das equinocandinas
US9006240B2 (en) 2005-08-02 2015-04-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method for assay on the effect of vascularization inhibitor
WO2007019410A2 (en) * 2005-08-05 2007-02-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Mammalian obestatin receptors
EP1937834B1 (de) * 2005-09-01 2014-06-11 AusDiagnostics Pty Ltd. Verfahren zur amplifikation, quantifizierung und identifizierung von nukleinsäuren
EP1760465B1 (de) 2005-09-06 2010-06-23 Roche Diagnostics GmbH Vorrichtung mit komprimierbarer Matrix und homogenem Strömungsprofil
US7799530B2 (en) 2005-09-23 2010-09-21 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof
ATE519863T1 (de) * 2005-10-05 2011-08-15 Hoffmann La Roche Nicht-fluoreszente energieübertragung
EP2546360A1 (de) 2005-10-07 2013-01-16 Callida Genomics, Inc. Selbstangeordnete einzelne Molekülarrays und Verwendungen davon
US11834720B2 (en) 2005-10-11 2023-12-05 Geneohm Sciences, Inc. Sequences for detection and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) of MREJ types xi to xx
US7838221B2 (en) 2005-10-11 2010-11-23 Geneohm Sciences, Inc. Sequences for detection and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)
WO2007044974A2 (en) * 2005-10-12 2007-04-19 The Research Foundation Of State University Of New York Absolute pcr quantification
US20070084706A1 (en) * 2005-10-18 2007-04-19 Shuichi Takayama Microfluidic cell culture device and method for using same
US20070092904A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-26 Biogen Idec Ma Inc. Method for preparing limiting quantities of nucleic acids
US7781165B2 (en) 2005-10-19 2010-08-24 Roche Diagnostics Operations, Inc. Benzimidazolium compounds and salts of benzimidazolium compounds for nucleic acid amplification
AU2006304876B2 (en) 2005-10-21 2013-04-18 Regents Of The University Of California c-KIT oncogene mutations in melanoma
CA2528222A1 (en) * 2005-10-31 2007-04-30 Centre For Addiction And Mental Health Slc1a1 marker for anxiety disorder
US20100248220A1 (en) * 2005-11-07 2010-09-30 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Chlamydia Trachomatis Specific Oligonucleotide Sequences
WO2007059064A2 (en) 2005-11-12 2007-05-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fgf2-related methods for diagnosing and treating depression
WO2007120208A2 (en) * 2005-11-14 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Nanogrid rolling circle dna sequencing
ES2332139T3 (es) 2005-11-23 2010-01-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Polinucleotidos con mimetico de fosfato.
CA3046754A1 (en) 2005-11-29 2007-06-07 Cambridge Enterprise Limited Markers for breast cancer including refsnp_id 3817198
EP1798542A1 (de) 2005-12-19 2007-06-20 Roche Diagnostics GmbH Analytisches Verfahren und Gerät
EP1798650A1 (de) 2005-12-19 2007-06-20 Roche Diagnostics GmbH Analytisches Verfahren und Instrument
KR100652903B1 (ko) * 2005-12-21 2006-12-04 한국과학기술연구원 초흡수성 고분자를 함유한 제습제의 제조 방법 및 그 제조장치
US7981606B2 (en) * 2005-12-21 2011-07-19 Roche Molecular Systems, Inc. Control for nucleic acid testing
EP2613147B1 (de) 2006-01-17 2015-03-11 Somalogic, Inc. Multiplex-Analysen von Testproben
WO2007090397A2 (en) * 2006-02-06 2007-08-16 Aarhus Universitet Qtls for udder health characteristics in cattle
WO2007092538A2 (en) * 2006-02-07 2007-08-16 President And Fellows Of Harvard College Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis
WO2007090401A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Aarhus Universitet Calving characteristics
ES2364983T3 (es) * 2006-02-27 2011-09-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Reacción en cadena de polimerasa con arranque en caliente por secuestro de magnesio.
BRPI0708439A2 (pt) * 2006-03-01 2011-05-31 Perlegen Sciences Inc marcadores para vìcio
US9234247B2 (en) 2006-03-13 2016-01-12 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for detection of mutant gene
RU2394915C2 (ru) * 2006-03-24 2010-07-20 Александр Борисович Четверин Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления
US7790386B2 (en) * 2006-04-07 2010-09-07 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Neisseria gonorrhoeae specific oligonucleotide sequences
WO2008051290A2 (en) * 2006-04-07 2008-05-02 Xdx, Inc. Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity
US20070264694A1 (en) * 2006-04-07 2007-11-15 Eragen Biosciences, Inc. Use of non-standard bases and proximity effects for gene assembly and conversion of non-standard bases to standard bases during dna synthesis
EP2005175B1 (de) * 2006-04-07 2011-07-27 Hitachi Chemical Company, Ltd. ERHÖHTE EXPRESSION VON T-ZELLENREZEPTORVERMITTELTER TUMORNEKROSEFAKTORSUPERFAMILIE UND CHEMOKIN-MRNA IN PERIPHEREN BLUT LEUKOZYTEN BEI PATIENTEN MIT MORBUS& xA;CROHN
WO2007117589A2 (en) * 2006-04-07 2007-10-18 Hitachi Chemical Co., Ltd. Enhanced fc receptor-mediated tumor necrosis factor superfamily and chemokine mrna expression in peripheral blood leukocytes in patients with rheumatoid arthritis
WO2007123553A1 (en) * 2006-04-24 2007-11-01 Xiyu Jia Methods for detection of methylated dna
CA2650820C (en) 2006-04-28 2014-09-16 Igor Kutyavin Use of base-modified deoxynucleoside triphosphates to improve nucleic acid detection
EP2021510A2 (de) * 2006-04-28 2009-02-11 Biogen Idec MA Inc. Zusammensetzung und verfahren für den nachweis von cripto-3
US7989204B2 (en) 2006-04-28 2011-08-02 Viacyte, Inc. Hepatocyte lineage cells
WO2007127999A2 (en) * 2006-04-28 2007-11-08 Igor Kutyavin Use of products of pcr amplification carrying elements of secondary structure to improve pcr-based nucleic acid detection
US8900828B2 (en) 2006-05-01 2014-12-02 Cepheid Methods and apparatus for sequential amplification reactions
CN101432426B (zh) 2006-05-02 2012-09-19 和光纯药工业株式会社 胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的胞内分枝杆菌的检测方法
US20090298071A1 (en) * 2006-05-08 2009-12-03 Masato Mitsuhashi Method for testing drug sensitivity in solid tumors by quantifying mrna expression in thinly-sliced tumor tissue
US20070264639A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-15 Sigma Aldrich, Co. Identification of Echinacea and its imposters using genetic variations
US20070264638A1 (en) * 2006-05-10 2007-11-15 Sigma-Aldrich Co. Identification of ginseng and its imposters using genetic variations
WO2008070198A2 (en) 2006-05-17 2008-06-12 California Institute Of Technology Thermal cycling system
US8232091B2 (en) * 2006-05-17 2012-07-31 California Institute Of Technology Thermal cycling system
CN101443009A (zh) 2006-05-18 2009-05-27 卫材R&D管理有限公司 针对甲状腺癌的抗肿瘤剂
US7674924B2 (en) 2006-05-22 2010-03-09 Third Wave Technologies, Inc. Compositions, probes, and conjugates and uses thereof
WO2007140015A2 (en) 2006-05-26 2007-12-06 Althea Technologies, Inc Biochemical analysis of partitioned cells
US11001881B2 (en) 2006-08-24 2021-05-11 California Institute Of Technology Methods for detecting analytes
EP2017356B1 (de) 2006-06-06 2011-12-07 Gen-Probe Incorporated Markierte Oligonukleotide und ihre Verwendung in Nukleinsäureverstärkungsverfahren
US7759062B2 (en) * 2006-06-09 2010-07-20 Third Wave Technologies, Inc. T-structure invasive cleavage assays, consistent nucleic acid dispensing, and low level target nucleic acid detection
US8119352B2 (en) * 2006-06-20 2012-02-21 Cepheld Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times
EP1886727A1 (de) 2006-07-14 2008-02-13 Roche Diagnostics GmbH Vorrichtung zur Analyse
JP5286261B2 (ja) 2006-07-17 2013-09-11 ブランディーズ・ユニバーシティ 特殊化オリゴヌクレオチドならびに核酸の増幅および検出でのその使用
US7772390B1 (en) 2006-07-18 2010-08-10 The Regents Of The University Of California Lipid mediated nucleic acid synthesis
US11525156B2 (en) 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
WO2008014485A2 (en) 2006-07-28 2008-01-31 California Institute Of Technology Multiplex q-pcr arrays
US20080213902A1 (en) * 2006-08-04 2008-09-04 Ikonisys, Inc. Slide Holder for Staining Procedures
US7993832B2 (en) * 2006-08-14 2011-08-09 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders
WO2008021446A2 (en) * 2006-08-15 2008-02-21 Genetag Technology, Inc. Probe-antiprobe compositions and methods for dna or rna detection
US11560588B2 (en) 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
WO2008026748A1 (fr) 2006-08-28 2008-03-06 Eisai R & D Management Co., Ltd. Agent antitumoral pour cancer gastrique non différencié
EP1900824A1 (de) * 2006-09-14 2008-03-19 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öffentlichen Rechts Genexpressionsprofile zur Prognose, Diagnose und Therapie von Prostatakrebs und deren Verwendung
JP5560039B2 (ja) 2006-10-05 2014-07-23 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ハイスループット分析のための多機能のコード化された粒子
EP1914303A1 (de) * 2006-10-09 2008-04-23 Qiagen GmbH Thermus eggertssonii DNA Polymerasen
CA2915679C (en) 2006-10-20 2017-12-12 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis, methods of detection and uses thereof
GB0621864D0 (en) 2006-11-02 2006-12-13 Univ Manchester Assay for fungal infection
WO2008140484A2 (en) * 2006-11-09 2008-11-20 Xdx, Inc. Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus
US20080131880A1 (en) * 2006-11-22 2008-06-05 Bortolin Laura T PNA-DNA oligomers and methods of use thereof
US7902345B2 (en) * 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
US8133701B2 (en) * 2006-12-05 2012-03-13 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
EP1932913B1 (de) 2006-12-11 2013-01-16 Roche Diagnostics GmbH Nukleinsäureisolation mithilfe von Polidocanol und Derivaten davon
CN101200716B (zh) 2006-12-11 2012-08-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 使用聚多卡醇和衍生物的核酸分离
WO2008076375A2 (en) * 2006-12-13 2008-06-26 Autogenomics, Inc. Concurrent analysis of multiple patient samples using solid phase addressable multiplex test with high signal-to-noise ratio
KR101433208B1 (ko) 2006-12-13 2014-08-22 루미넥스 코포레이션 실시간으로 ｐｃｒ의 다중 분석을 위한 시스템과 방법
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
CN103397024B (zh) 2006-12-18 2015-11-25 和光纯药工业株式会社 鸟分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用它们检测鸟分枝杆菌的方法
JP2010512799A (ja) 2006-12-19 2010-04-30 ジーンオーム サイエンシーズ、インク． 黄色ブドウ球菌の検出およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の特定
ATE528286T1 (de) 2006-12-20 2011-10-15 Bayer Healthcare Llc 4-ä4-ä(ä3-tert-butyl-1-ä3-(hydroxymethyl)phenyl - 1h-pyrazol-5-ylücarbamoyl)-aminoü-3- chlorophenoxyü-n-methylpyridin-2-carboxamid als inhibitor der vegfr kinase zur behandlung von krebs
EP2118310B1 (de) * 2006-12-29 2013-03-06 Applied Biosystems, LLC Systeme und verfahren zum nachweis von nukleinsäuren
JP2010514450A (ja) * 2006-12-29 2010-05-06 アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド 核酸検出方法及びシステム
EP2126117A2 (de) * 2007-01-18 2009-12-02 University Of Southern California Für duale tki-therapie prädiktive genpoylmorphismen
JP2010516281A (ja) 2007-01-22 2010-05-20 ウェハージェン，インコーポレイテッド 高スループット化学反応用装置
CA2676796C (en) 2007-01-29 2016-02-23 Eisai R & D Management Co., Ltd. Composition for treatment of undifferentiated gastric cancer
EP2520668B1 (de) 2007-01-31 2014-12-24 Celera Corporation Molekulare Prognosesignatur zur Prognose entfernter Brustkrebsmetastasen und Anwendungen davon
BRPI0807826A2 (pt) 2007-02-02 2014-08-05 Genera Biosystems Ltd " geração de moléculas de ácido nucleico ".
WO2008098142A2 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for rhd typing, gender determination and nucleic acid quantification
US20100021917A1 (en) * 2007-02-14 2010-01-28 Cedars-Sinai Medical Center Methods of using genes and genetic variants to predict or diagnose inflammatory bowel disease
US20100190162A1 (en) * 2007-02-26 2010-07-29 Cedars-Sinai Medical Center Methods of using single nucleotide polymorphisms in the tl1a gene to predict or diagnose inflammatory bowel disease
WO2010039931A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Cedars-Sinai Medical Center Methods of using il17rd and il23-il17 pathway genes to diagnose crohn's disease
GB0703996D0 (en) * 2007-03-01 2007-04-11 Oxitec Ltd Nucleic acid detection
GB0703997D0 (en) * 2007-03-01 2007-04-11 Oxitec Ltd Methods for detecting nucleic sequences
DE102007013099A1 (de) 2007-03-14 2008-09-18 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren und Testkit zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP's
WO2008116150A2 (en) 2007-03-21 2008-09-25 Cedars-Sinai Medical Center Ileal pouch-anal anastomosis (ipaa) factors in the treatment of inflammatory bowel disease
US8652780B2 (en) 2007-03-26 2014-02-18 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
EP2574681B1 (de) 2007-03-28 2016-03-23 Signal Diagnostics System und Verfahren zur Hochauflösungsanalyse von Nucleinsäuren zur Detektion von Sequenzabweichungen
JP5191041B2 (ja) * 2007-04-05 2013-04-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 急速ワンステップｒｔ−ｐｃｒ
EP2147101A2 (de) 2007-04-06 2010-01-27 Virco BVBA Nachweistest für die viruslast von respiratory-syncytial-virus (rsv)
WO2008128198A2 (en) * 2007-04-12 2008-10-23 Usc Stevens - University Of Southern California Dna methylation analysis by digital bisulfite genomic sequencing and digital methylight
US9102986B2 (en) * 2007-04-13 2015-08-11 Abbott Molecular Inc. Primer and probe sequences for detecting Chlamydia trachomatis
CA2684570A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-30 Molecular Detection Inc. Methods, compositions and kits for detection and analysis of antibiotic-resistant bacteria
WO2008134569A2 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Cedars-Sinai Medical Center Diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease in the puerto rican population
US20110091872A1 (en) * 2007-05-04 2011-04-21 Myconostica Ltd Detecting triazole resistance in aspergillus
US20100144903A1 (en) * 2007-05-04 2010-06-10 Cedars-Sinai Medical Center Methods of diagnosis and treatment of crohn's disease
EP2148885A4 (de) * 2007-05-31 2010-12-15 Monsanto Technology Llc Sojabohnenpolymorphismen und verfahren zu ihrer genotypisierung
AU2008260029B2 (en) 2007-05-31 2015-02-12 Yale University A genetic lesion associated with cancer
AU2008261869B2 (en) 2007-06-08 2014-12-18 Biogen Ma Inc. Biomarkers for predicting anti-TNF responsiveness or non-responsiveness
JP5745842B2 (ja) 2007-06-19 2015-07-08 ストラトス ゲノミクス インコーポレイテッド 拡張によるハイスループット核酸配列決定
EP2191897B1 (de) 2007-06-21 2014-02-26 Gen-Probe Incorporated Instrument und Behälter zur Durchführung von Verfahren
DE102007029772B4 (de) 2007-06-22 2011-12-08 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren und Schnelltest zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen
US7635566B2 (en) 2007-06-29 2009-12-22 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
US9689031B2 (en) * 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
DK2069529T3 (da) 2007-07-17 2013-04-15 Somalogic Inc Fremgangsmåde til generering af aptamerer med forbedrede dissociationsrater
US20090023138A1 (en) * 2007-07-17 2009-01-22 Zila Biotechnology, Inc. Oral cancer markers and their detection
US20090181366A1 (en) * 2007-07-30 2009-07-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Internal positive control for nucleic acid assays
EP2952588A1 (de) 2007-08-06 2015-12-09 Orion Genomics, LLC Einzelnukleotid-polymorphismen zur bestimmung der allelspezifischen expression des igf2-gens
US20090263869A1 (en) 2007-08-27 2009-10-22 Lei Xi Methods and Compositions for PCR
US20090064361A1 (en) 2007-08-29 2009-03-05 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Haploid Mapping
WO2009032781A2 (en) 2007-08-29 2009-03-12 Sequenom, Inc. Methods and compositions for universal size-specific polymerase chain reaction
DE102007041864B4 (de) 2007-09-04 2012-05-03 Sirs-Lab Gmbh Verfahren zum Nachweis von Bakterien und Pilzen
ATE541946T1 (de) 2007-09-07 2012-02-15 Fluidigm Corp Verfahren und system zur bestimmung von genkopiezahlvarianten
JP2009077712A (ja) 2007-09-11 2009-04-16 F Hoffmann La Roche Ag Ｂ−Ｒａｆキナーゼ阻害剤に対する感受性についての診断試験
US7695963B2 (en) 2007-09-24 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods for increasing definitive endoderm production
GB2453173A (en) 2007-09-28 2009-04-01 Dxs Ltd Polynucleotide primers
WO2009053679A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Lgc Limited Oligonucleotides and uses thereof
EP2215209B1 (de) 2007-10-30 2018-05-23 Complete Genomics, Inc. Verfahren zur hochdurchsatz-sequenzierung von nukleinsäuren
WO2009059319A1 (en) 2007-11-01 2009-05-07 University Of Iowa Research Foundation Assessing susceptibility to vascular disorders
US8039212B2 (en) 2007-11-05 2011-10-18 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with liver fibrosis, methods of detection and uses thereof
WO2009061640A2 (en) * 2007-11-06 2009-05-14 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Hepatitis b virus (hbv) specific oligonucleotide sequences
CN101910415B (zh) * 2007-11-07 2015-02-25 不列颠哥伦比亚大学 微流体装置及其使用方法
JP5638244B2 (ja) 2007-11-09 2014-12-10 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 血管新生阻害物質と抗腫瘍性白金錯体との併用
BRPI0817166A2 (pt) 2007-11-16 2014-10-14 Du Pont "processo para preparação de uma amostra e processo para preparar uma amostra de alimento ou de bebida"
CA2705792A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Milan Radovich Vegf polymorphisms and anti-angiogenesis therapy
US9551026B2 (en) 2007-12-03 2017-01-24 Complete Genomincs, Inc. Method for nucleic acid detection using voltage enhancement
US20090197254A1 (en) * 2007-12-14 2009-08-06 Ming-Chou Lee Variant scorpion primers for nucleic acid amplification and detection
JP5503552B2 (ja) 2007-12-21 2014-05-28 バイオメリュー・エスエイ メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出
US20090186344A1 (en) * 2008-01-23 2009-07-23 Caliper Life Sciences, Inc. Devices and methods for detecting and quantitating nucleic acids using size separation of amplicons
JPWO2009099037A1 (ja) 2008-02-08 2011-05-26 和光純薬工業株式会社 クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法
WO2009103003A2 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Scanning fluorescent reader with diffuser system
US20090221620A1 (en) 2008-02-20 2009-09-03 Celera Corporation Gentic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof
KR20110011600A (ko) * 2008-02-20 2011-02-08 이와키, 코수케, 켄 폴리오마바이러스 검출
US20090215064A1 (en) * 2008-02-27 2009-08-27 Hitachi Chemical Co., Ltd. Quantitative assessment of individual cancer susceptibility by measuring dna damage-induced mrna in whole blood
AU2009223671B2 (en) * 2008-03-11 2014-11-27 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
BRPI0908748A2 (pt) 2008-03-15 2015-07-28 Hologic Inc Composições e métodos para análise de moléculas de ácido nucleico durante reações de amplificação
CA2658520C (en) 2008-03-19 2016-11-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acid amplification in the presence of modified randomers
CA2718137A1 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
EP2108699B1 (de) 2008-04-08 2014-06-25 F.Hoffmann-La Roche Ag Vorrichtung zur analytischen Verarbeitung und Detektion
US8206925B2 (en) * 2008-04-14 2012-06-26 Medical Diagnostic Laboratories, Llc Splice variants of human IL-23 receptor (IL-23R) mRNA and use of a delta 9 isoform in predicting inflammatory bowel diseases
US9249455B2 (en) * 2008-04-18 2016-02-02 Luminex Corporation Methods for detection and quantification of small RNA
US8669414B2 (en) 2008-04-24 2014-03-11 Monsanto Technology Llc Method to identify Asian soybean rust resistance quantitative trait loci in soybean and compositions thereof
US8911948B2 (en) * 2008-04-30 2014-12-16 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
US20090325169A1 (en) 2008-04-30 2009-12-31 Integrated Dna Technologies, Inc. Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers
WO2009140374A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Gen-Probe Incorporated Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences
EP2123360A1 (de) 2008-05-20 2009-11-25 F.Hoffmann-La Roche Ag Thermozyklierungsvorrichtung mit Thermozyklermodul mit Wärmeschutzschalter, Verfahren zur Kühlung eines Heizblocks in einem Thermozyklermodul einer Thermozyklierungsvorrichtung und Analysegerät
CN103224932A (zh) * 2008-05-28 2013-07-31 和光纯药工业株式会社 胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针检测胞内分枝杆菌的方法
US8208909B2 (en) 2008-06-02 2012-06-26 West Corporation System, apparatus and method for availing a mobile call of address information
EP2133434A1 (de) 2008-06-12 2009-12-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Verfahren zum Nachweis von Zielnukleinsäuren
IES20090467A2 (en) * 2008-06-13 2010-03-31 Nat Univ Ireland Ace2 as a target gene for the molecular identification of yeast and fungal species.
WO2009150156A1 (en) * 2008-06-13 2009-12-17 Riboxx Gmbh Method for enzymatic synthesis of chemically modified rna
EP2141246A1 (de) 2008-07-01 2010-01-06 Koninklijke Philips Electronics N.V. Spaltungslose Verfahren zur PCR-Erkennung mithilfe von SERRS
EP2733222A1 (de) 2008-07-09 2014-05-21 Celera Corporation Mit kardiovaskulären Krankheiten assoziierte, genetische Polymorphismen, Verfahren zum Nachweis und Verwendungen davon
EP2147981A1 (de) 2008-07-25 2010-01-27 Biotype AG Kit und Verfahren zur Auswertung der Detektionseigenschaften bei Verstärkungsreaktionen
CA2638458A1 (en) * 2008-07-31 2010-01-31 Spartan Bioscience Inc. Thermal recycling by positioning relative to fixed-temperature source
GB0909333D0 (en) 2009-06-01 2009-07-15 Fu Guoliang Multiplex amplification and detection
JP5367078B2 (ja) 2008-08-01 2013-12-11 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ｍＲＮＡ定量のための改善された溶解および逆転写
JP2012501642A (ja) * 2008-09-03 2012-01-26 クワンタムディーエックス・グループ・リミテッド バイオセンサを用いる核酸検出のための検知方策および方法
EP2318552B1 (de) 2008-09-05 2016-11-23 TOMA Biosciences, Inc. Verfahren zum stratifizieren und annotieren der behandlungsoptionen eines krebsmedikaments
US9250249B2 (en) 2008-09-08 2016-02-02 Enzo Biochem, Inc. Autophagy and phospholipidosis pathway assays
US9334281B2 (en) * 2008-09-08 2016-05-10 Enzo Life Sciences, Inc. Fluorochromes for organelle tracing and multi-color imaging
US7910720B2 (en) 2008-09-09 2011-03-22 Roche Diagnostics Operations, Inc. Polyanion for improved nucleic acid amplification
US20110171649A1 (en) * 2008-09-10 2011-07-14 Igor Kutyavin Detection of nucleic acids by oligonucleotide probes cleaved in presence of endonuclease v
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) * 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US9090948B2 (en) 2008-09-30 2015-07-28 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
CA2682439A1 (en) 2008-10-17 2010-04-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Cell monitoring and molecular analysis
CN105200097A (zh) * 2008-10-20 2015-12-30 霍夫曼-拉罗奇有限公司 改进的等位基因特异性扩增
US20110189685A1 (en) * 2008-10-22 2011-08-04 Cedars-Sinai Medical Center Methods of using jak3 genetic variants to diagnose and predict crohn's disease
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
CA2779197C (en) 2008-10-27 2021-06-29 Infraegis, Inc. Method of removing polymerase chain reaction (pcr) inhibitors from a sample using .beta.-cyclodextrin and activated charcoal coated with bentonite
SI2540843T1 (sl) 2008-11-05 2014-10-30 Genentech, Inc. Genetski polimorfizmi in starostna degeneracija makule
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
JP5798926B2 (ja) 2008-11-07 2015-10-21 シーケンタ インコーポレイテッド 配列解析によって病態をモニターする方法
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
CA2743211A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes
EP2463385B1 (de) 2008-11-13 2014-08-27 RiboxX GmbH Kit zur RNA-Detektion
US10669574B2 (en) 2008-11-18 2020-06-02 XCR Diagnostics, Inc. DNA amplification technology
US20110229471A1 (en) * 2008-11-26 2011-09-22 Cedars-Sinai Medical Center Methods of determining responsiveness to anti-tnf alpha therapy in inflammatory bowel disease
EP2373808B1 (de) 2008-12-09 2015-11-25 Oxitec Limited Verbesserte amplifikation auf taqman-sondenbasis
EP2955233A1 (de) 2008-12-19 2015-12-16 Life Technologies Corporation Proteinase K Inhibitore, Verfahren und Zusammensetzungen davon
CA2688174C (en) 2008-12-19 2018-08-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Dry composition of reaction compounds with stabilized polymerase
US9580752B2 (en) 2008-12-24 2017-02-28 Cedars-Sinai Medical Center Methods of predicting medically refractive ulcerative colitis (MR-UC) requiring colectomy
IT1397110B1 (it) * 2008-12-29 2012-12-28 St Microelectronics Rousset Microreattore autosigillante e metodo per eseguire una reazione
US8206929B2 (en) 2009-01-07 2012-06-26 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants
SG172965A1 (en) 2009-01-13 2011-08-29 Fluidigm Corp Single-cell nucleic acid analysis
EP2387627B1 (de) 2009-01-15 2016-03-30 Adaptive Biotechnologies Corporation Adaptive immunitätsprofilierung und verfahren zur erzeugung monoklonaler antikörper
AU2010208386B2 (en) 2009-01-27 2016-08-11 Qiagen Gaithersburg Thermophilic helicase dependent amplification technology with endpoint homogenous fluorescent detection
CA2751287A1 (en) 2009-02-06 2010-09-10 Yale University A snp marker of breast and ovarian cancer risk
EP2396429B1 (de) 2009-02-11 2015-05-27 Orion Genomics, LLC Kombinationen aus polymorphismen zur bestimmung von allelspezifischer igf2-expression
US9347092B2 (en) * 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
JP5457222B2 (ja) 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
US8039215B2 (en) 2009-03-10 2011-10-18 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay
EP2703501A1 (de) 2009-03-12 2014-03-05 Brandeis University Reagenzien und Verfahren für PCR
EP2408936A4 (de) * 2009-03-18 2013-01-30 Sequenom Inc Verwendung wärmestabiler endonukleasen zur herstellung von reportermolekülen
WO2010112033A2 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Østjysk Innovation A/S Method for estimating the risk of having or developing multiple sclerosis using sequence polymorphisms in a specific region of chromosome x
CA3018687C (en) 2009-04-02 2021-07-13 Fluidigm Corporation Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
CN202830041U (zh) * 2009-04-03 2013-03-27 Illumina公司 用于加热生物样本的设备
RU2612789C2 (ru) 2009-04-04 2017-03-13 Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. Способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма clostridium difficile
AU2010240092A1 (en) 2009-04-22 2011-12-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Probe set for identification of nucleotide mutation, and method for identification of nucleotide mutation
WO2010123625A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 University Of Southern California Cd133 polymorphisms predict clinical outcome in patients with cancer
EP2256215A1 (de) 2009-04-30 2010-12-01 Steffen Mergemeier Testsystem unter Verwendung einer Nukleaseaktivität einer Nukleinsäurepolymerase
AU2010242073C1 (en) 2009-04-30 2015-12-24 Good Start Genetics, Inc. Methods and compositions for evaluating genetic markers
EP2248915B1 (de) * 2009-05-05 2013-09-18 Qiagen GmbH Detektion mehrerer Nukleinsäuresequenzen in einer Reaktionskartusche
US20100299773A1 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selecting an improved plant
WO2010133972A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 Population Genetics Technologies Ltd Sorting asymmetrically tagged nucleic acids by selective primer extension
EP2267153A1 (de) 2009-05-26 2010-12-29 Université Claude Bernard Lyon 1 Identifizierung der Netrin-1-Rezeptor-unc5c-Genmutation bei festen Krebsen
EP3663750B1 (de) 2009-05-29 2021-11-03 Life Technologies Corporation Nukleinsäuregerüstpolymerpartikel und verfahren zur herstellung und verwendung
US20110237537A1 (en) * 2009-05-29 2011-09-29 Lombard Jay L Methods for assessment and treatment of mood disorders via single nucleotide polymorphisms analysis
US20120261274A1 (en) 2009-05-29 2012-10-18 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
US20100304391A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Lombard Jay L Methods for assessment and treatment of depression via utilization of single nucleotide polymorphisms analysis
US8355927B2 (en) 2010-11-05 2013-01-15 Genomind, Llc Neuropsychiatric test reports
US8776573B2 (en) 2009-05-29 2014-07-15 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
CA2765949C (en) 2009-06-25 2016-03-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of measuring adaptive immunity
EP2446056A2 (de) 2009-06-25 2012-05-02 Yale University Einzelnukleotidpolymorphismen im brca1-gen und krebsrisiko
IL206810A (en) * 2009-07-08 2015-07-30 Janssen Diagnostics Llc Methods for identifying melanoma and kits for using these methods
WO2011006119A2 (en) 2009-07-09 2011-01-13 The Scripps Research Institute Gene expression profiles associated with chronic allograft nephropathy
CA2805033A1 (en) 2009-07-14 2011-01-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods of increasing liver proliferation
AU2010276352B2 (en) 2009-07-22 2016-05-19 Qualicon Diagnostics, Llc Sequences and their use for detection and characterization of E. coli O157:H7
EP2789693B1 (de) 2009-08-13 2017-10-04 Life Technologies Corporation Amelogenin-SNP auf X-Chromosomen
EP2467479B1 (de) 2009-08-20 2016-01-06 Population Genetics Technologies Ltd Zusammensetzungen und verfahren für intramolekulare neuanordnung von nukleinsäuren
WO2011026030A1 (en) * 2009-08-31 2011-03-03 Mbio Diagnostics Corporation Integrated sample preparation and analyte detection
WO2011031377A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Helixis, Inc. Optical system for multiple reactions
WO2011030091A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Myconostica Limited Assay for candida species
KR101590175B1 (ko) 2009-09-24 2016-01-29 주식회사 씨젠 반복적 엑소핵산 절단 반응에 의한 타겟 핵산서열의 검출
EP2483425B1 (de) 2009-09-28 2016-08-24 Igor Kutyavin Verfahren und zusammensetzung zur nukleinsäureerkennung auf basis stabilisierter oligonukleotidsondenkomplexe
RU2577726C2 (ru) 2009-10-21 2016-03-20 Дженентек, Инк. Генетические полиморфизмы при возрастной дегенерации желтого пятна
WO2011050278A1 (en) * 2009-10-23 2011-04-28 Eragen Biosciences, Inc. Amplification primers with non-standard bases for increased reaction specificity
WO2011050938A1 (de) 2009-10-26 2011-05-05 Genovoxx Gmbh Konjugate von nukleotiden und methoden zu deren anwendung
EP2494066B1 (de) 2009-10-27 2017-04-05 Swift Biosciences, Inc. Bimolekulare primer
US8524450B2 (en) 2009-10-30 2013-09-03 Illumina, Inc. Microvessels, microparticles, and methods of manufacturing and using the same
CN102648293A (zh) 2009-10-30 2012-08-22 加利福尼亚大学董事会 黑素瘤中的gna11突变
US20120245041A1 (en) 2009-11-04 2012-09-27 Sydney Brenner Base-by-base mutation screening
KR20110050327A (ko) 2009-11-07 2011-05-13 주식회사 씨젠 Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출
BR112012011280A2 (pt) 2009-11-13 2019-09-24 Beckman Coulter Inc sistemas e metodos para detectar a presenca de um status biologico usando grafico
RU2012124051A (ru) 2009-11-13 2013-12-20 Бекман Каултер, Инк. Системы и способы для обнаружения наличия биологического признака с применением кластеризации
US20110117546A1 (en) * 2009-11-18 2011-05-19 Microfluidic Systems, Inc. Increase of signal sensitivity using dual probes in pcr reactions
US9133343B2 (en) 2009-11-30 2015-09-15 Enzo Biochem, Inc. Dyes and compositions, and processes for using same in analysis of protein aggregation and other applications
WO2011066589A1 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings Methods and systems for isolating, storing, and analyzing vesicles
EP4276190A3 (de) 2009-12-03 2023-12-27 Quest Diagnostics Investments Incorporated Verfahren zur diagnose bakterieller vaginose
US8614071B2 (en) 2009-12-11 2013-12-24 Roche Molecular Systems, Inc. Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers
US9238832B2 (en) 2009-12-11 2016-01-19 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids
WO2011084757A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 University Of Southern California Germline polymorphisms in the sparc gene associated with clinical outcome in gastric cancer
RU2551321C2 (ru) 2009-12-21 2015-05-20 Сиджен, Инк. Обнаружение мишени tsg-праймером
ES2577017T3 (es) 2009-12-22 2016-07-12 Sequenom, Inc. Procedimientos y kits para identificar la aneuploidia
US8877437B1 (en) 2009-12-23 2014-11-04 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection
WO2011085334A1 (en) 2010-01-11 2011-07-14 University Of Southern California Cd44 polymorphisms predict clinical outcome in patients with gastric cancer
CA2787027A1 (en) 2010-01-13 2011-07-21 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Detection of gastrointestinal disorders
US8940487B2 (en) * 2010-02-09 2015-01-27 UmiTaq Bio Methods and compositions for universal detection of nucleic acids
US20130053253A1 (en) 2010-02-22 2013-02-28 Population Genetics Technologies Ltd Region of Interest Extraction and Normalization Methods
US9128101B2 (en) 2010-03-01 2015-09-08 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Biomarkers for theranostics
WO2011107887A2 (en) 2010-03-02 2011-09-09 Population Genetic Technologies Ltd. Methods for replicating polynucleotides with secondary structure
WO2011118496A1 (ja) 2010-03-23 2011-09-29 和光純薬工業株式会社 クラミジア・トラコマティス検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミジア・トラコマティスの検出方法
JP5886828B2 (ja) 2010-03-26 2016-03-16 インテグレイテッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレイテッド 核酸のハイブリダイゼーションを強化する方法
US9506057B2 (en) 2010-03-26 2016-11-29 Integrated Dna Technologies, Inc. Modifications for antisense compounds
JP2013526852A (ja) 2010-04-06 2013-06-27 カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス 疾患に対する循環バイオマーカー
DE102010003781B4 (de) 2010-04-08 2012-08-16 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen
US20110250598A1 (en) 2010-04-12 2011-10-13 Ulrike Fischer Detergent free polymerases
WO2011128096A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Roche Diagnostics Gmbh Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
CN103079567A (zh) 2010-04-17 2013-05-01 拜尔健康护理有限责任公司 用于疾病和病症的治疗和预防的氟取代的ω-羧基芳基二苯脲的合成代谢产物
US20110269735A1 (en) 2010-04-19 2011-11-03 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with statin response and cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
EP2561090A1 (de) 2010-04-21 2013-02-27 Erik Berntorp Genetische faktoren im zusammenhang mit der entwicklung von inhibitoren bei hämophilie a
US8774494B2 (en) 2010-04-30 2014-07-08 Complete Genomics, Inc. Method and system for accurate alignment and registration of array for DNA sequencing
CA2798431C (en) 2010-05-06 2018-10-23 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9309565B2 (en) 2010-05-14 2016-04-12 Life Technologies Corporation Karyotyping assay
US8618253B2 (en) 2010-05-25 2013-12-31 Samsung Techwin Co., Ltd. Modified RNAse H and detection of nucleic acid amplification
US8628914B2 (en) * 2010-05-26 2014-01-14 Qiagen Gaithersburg, Inc. Quantitative helicase assay
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
WO2011150277A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Life Technologies Corporation Synthesis of 2', 3'-dideoxynucleosides for automated dna synthesis and pyrophosphorolysis activated polymerization
US9476101B2 (en) 2010-06-07 2016-10-25 Firefly Bioworks, Inc. Scanning multifunctional particles
WO2011154139A2 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Roche Diagnostics Gmbh Gene expression markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
EP2580353B1 (de) 2010-06-11 2015-07-29 Life Technologies Corporation Alternative nukleotidflüsse in verfahren zur sequenzierung durch synthese
EP2582803B1 (de) 2010-06-18 2015-02-25 Roche Diagnostics GmbH Dna polymerasen mit erhöhter unterscheidung von 3' fehlpaarungen
US8715991B2 (en) 2010-06-18 2014-05-06 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
ES2536978T3 (es) 2010-06-18 2015-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag ADN polimerasas con discriminación incrementada de no correspondencias 3'
EP2582808B1 (de) 2010-06-18 2015-04-22 Roche Diagniostics GmbH Dna polymerasen mit erhöhter unterscheidung von 3' fehlpaarungen
US8722378B2 (en) 2010-06-18 2014-05-13 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with increased 3′-mismatch discrimination
JP5926248B2 (ja) 2010-06-18 2016-05-25 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するｄｎａポリメラーゼ
JP5876479B2 (ja) 2010-06-18 2016-03-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 増大した３’末端ミスマッチ識別を有するｄｎａポリメラーゼ
US8722380B2 (en) 2010-06-18 2014-05-13 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with increased 3′-mismatch discrimination
US9096952B2 (en) 2010-06-24 2015-08-04 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for polynucleotide library production, immortalization and region of interest extraction
BR112012032462A2 (pt) 2010-06-25 2016-11-08 Eisai R&D Man Co Ltd agente antitumoral empregando compostos que, em combinação, têm efeito inibidor de quinase.
US20120009575A1 (en) 2010-06-30 2012-01-12 Life Technologies Corporation Inducible nucleic acid targets for detection of pathogens, methods and compositions thereof
WO2012003409A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Life Technologies Corporation Detection of listeria species in food and environmental samples, methods and compositions thereof
US9650629B2 (en) 2010-07-07 2017-05-16 Roche Molecular Systems, Inc. Clonal pre-amplification in emulsion
DE102010033107A1 (de) 2010-08-02 2012-02-02 Aj Innuscreen Gmbh Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen mittels Fluoreszenzlöschung
WO2012016936A1 (de) 2010-07-31 2012-02-09 Aj Innuscreen Gmbh Nachweis spezifischer nukleinsäuresequenzen mittels fluoreszenz - quenching
WO2012018964A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Life Technologies Corporation Detection of salmonella enterica subspecies enterica serovar enteritidis in food and environmental samples, methods and compositions thereof
EP2606343A4 (de) 2010-08-18 2017-08-16 Life Technologies Corporation Chemische beschichtung einer mikrovertiefung für eine elektrochemische detektionsvorrichtung
WO2012030856A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of xenotropic murine leukemia virus-related virus
US8557532B2 (en) 2010-08-30 2013-10-15 The University Of Utah Research Foundation Diagnosis and treatment of drug-resistant Ewing'S sarcoma
EP2896696B1 (de) 2010-09-07 2017-12-27 Integrated Dna Technologies, Inc. Modifikationen für Antisense-Verbindungen
US20120070829A1 (en) 2010-09-10 2012-03-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Size selection of dna for chromatin analysis
WO2012034130A2 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Qiagen Methods and compositions for nucleic acid detection
KR20130042033A (ko) * 2010-09-20 2013-04-25 주식회사 씨젠 단일-표지 고정화 프로브 및 엑소핵산 절단 활성을 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출
WO2012040403A1 (en) 2010-09-21 2012-03-29 Life Technologies Corporation Se33 mutations impacting genotype concordance
DK2623613T3 (en) 2010-09-21 2016-10-03 Population Genetics Tech Ltd Increasing the reliability of the allele-indications by molecular counting
WO2012038049A2 (en) 2010-09-22 2012-03-29 Roche Diagnostics Gmbh Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers
KR20130113447A (ko) 2010-09-24 2013-10-15 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 고정된 프라이머들을 이용하여 표적 dna의 직접적인 캡쳐, 증폭 및 서열화
WO2012040619A2 (en) 2010-09-24 2012-03-29 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for prognosing and/or detecting age-related macular degeneration
EP2625284B1 (de) 2010-10-04 2015-01-28 Roche Diagniostics GmbH Verfahren für zelllyse in einem rt-pcr-reaktionspuffer
CN103124796B (zh) 2010-10-04 2016-08-03 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于pcr反应缓冲液中的细胞裂解的方法
CN103124797B (zh) 2010-10-04 2015-04-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于在相同反应容器内的细胞裂解和pcr的方法
US10392726B2 (en) 2010-10-08 2019-08-27 President And Fellows Of Harvard College High-throughput immune sequencing
WO2012048341A1 (en) 2010-10-08 2012-04-12 President And Fellows Of Harvard College High-throughput single cell barcoding
US8725422B2 (en) 2010-10-13 2014-05-13 Complete Genomics, Inc. Methods for estimating genome-wide copy number variations
AR083497A1 (es) * 2010-10-21 2013-02-27 Riken Kit para detectar el virus de la leucemia bovina (blv), y uso del mismo
WO2012052758A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Astrazeneca Ab Response biomarkers for iap antagonists in human cancers
WO2012054639A2 (en) 2010-10-22 2012-04-26 T2 Biosystems, Inc. Nmr systems and methods for the rapid detection of analytes
KR20120042100A (ko) 2010-10-22 2012-05-03 주식회사 씨젠 이중표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출
US8563298B2 (en) 2010-10-22 2013-10-22 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
US8409807B2 (en) 2010-10-22 2013-04-02 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
GB201017978D0 (en) 2010-10-25 2010-12-08 Oxitec Ltd Multiplex amplification and detection
US20120108651A1 (en) 2010-11-02 2012-05-03 Leiden University Medical Center (LUMC) Acting on Behalf of Academic Hospital Leiden (AZL) Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis and statin response, methods of detection and uses thereof
DE102010052524A1 (de) 2010-11-22 2012-05-24 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in Echtzeit
EP2646569A1 (de) 2010-11-30 2013-10-09 Diagon Kft. Verfahren für nukleinsäurebasierte molekulardiagnostische bestimmung von keimzählungen und kit hierfür
EP2646576B1 (de) 2010-12-03 2015-10-28 Brandeis University Verfahren und kits zum nachweis von nukleinsäuremutanten bei wildtyp-populationen
WO2012087135A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Genetic markers specific for clostridium difficile ribotypes 027 (nap01/b1; rt 027) and 078 (nap7/8; rt 078) and their use
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
EP2659002B1 (de) 2010-12-27 2017-02-01 Abbott Molecular Inc. Quantifizierung von proben mit hohem titer mittels digitaler pcr
US9487838B2 (en) 2010-12-28 2016-11-08 Qiagen Hamburg Gmbh Oligonucleotide probe for the detection of adenovirus
EP2659408B1 (de) 2010-12-29 2019-03-27 Life Technologies Corporation Zeitverzerrtes hintergrundsignal für sequenzierung-mit-synthese-operationen
US20130060482A1 (en) 2010-12-30 2013-03-07 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for making base calls in nucleic acid sequencing
EP3582224A1 (de) 2010-12-30 2019-12-18 Life Technologies Corporation Modelle zur analyse von daten aus sequenzierung-mit-synthese-operationen
US10241075B2 (en) 2010-12-30 2019-03-26 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing
WO2012092461A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of identifying aphid resistant soybeans
MX352460B (es) 2011-01-11 2017-11-24 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto.
US20120208189A1 (en) 2011-01-14 2012-08-16 Life Technologies Corporation Methods for isolation, identification, and quantification of mirnas
ES2728743T3 (es) 2011-01-17 2019-10-28 Life Technologies Corp Flujo de trabajo para la detección de ligandos utilizando ácidos nucleicos
WO2012106288A2 (en) * 2011-01-31 2012-08-09 Primeradx, Inc. Methods of nucleic acid quantification and detection using anomalous migration
US9365897B2 (en) 2011-02-08 2016-06-14 Illumina, Inc. Selective enrichment of nucleic acids
WO2012107537A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Riboxx Gmbh Method for the detection of polynucleotide sequences
WO2012110061A1 (en) 2011-02-15 2012-08-23 Roche Diagnostics Gmbh Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
EP2675913B1 (de) 2011-02-15 2016-12-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Erkennung von methylierung in einer subpopulation von genomischer dna
US20140024590A1 (en) 2011-02-18 2014-01-23 Yale University KRAS-Variant And Endometriosis
US9512467B2 (en) 2011-03-10 2016-12-06 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for the selection and optimization of oligonucleotide tag sequences
US20140065615A1 (en) 2011-03-21 2014-03-06 Yale University The KRAS Variant and Tumor Biology
WO2012135053A2 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Integrated Dna Technologies, Inc. Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers
EP2691543B1 (de) 2011-03-29 2017-11-01 Seegene, Inc. Erkennung von zielnukleinsäuresequenzen durch pto-spaltung und verlängerungsabhängige spaltung
EP2508625A1 (de) 2011-04-05 2012-10-10 Université de Franche-Comté Echtzeit-Duplex-PCR für zur simultanen HPV16- und HPV18-Viruslastquantifizierung
WO2012138921A1 (en) 2011-04-08 2012-10-11 Life Technologies Corporation Phase-protecting reagent flow orderings for use in sequencing-by-synthesis
CA2831180C (en) 2011-04-11 2017-02-14 Keith Bauer Dna polymerases with improved activity
EP2700403B1 (de) 2011-04-18 2015-11-25 Eisai R&D Management Co., Ltd. Therapeutikum für tumor
DE102012008375A1 (de) 2011-04-27 2012-10-31 Genovoxx Gmbh Methoden und Komponenten zur Detektion von Nukleinsäureketten
WO2012149438A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
WO2012149193A2 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Monsanto Technology Llc Diagnostic molecular markers for seed lot purity traits in soybeans
AU2012249531B2 (en) 2011-04-29 2017-06-29 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
EP2704554B1 (de) 2011-05-02 2019-04-10 The Board of Regents of the University of Nebraska Pflanzen mit nutzeigenschaften und zugehörige verfahren
US9850524B2 (en) 2011-05-04 2017-12-26 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by PO cleavage and hybridization
WO2012150749A1 (en) * 2011-05-04 2012-11-08 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by po cleavage and hybridization
WO2012153153A1 (en) 2011-05-11 2012-11-15 Diagon Kft. Procedure for rapid determination of viruses using nucleic acid-based molecular diagnostics, and a kit for this purpose
US9034581B2 (en) 2011-05-26 2015-05-19 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of Staphylococcus aureus
EP2714937B1 (de) 2011-06-03 2018-11-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarker zur vorhersage und beurteilung des ansprechens von schilddrüsen- und nierenkrebspatienten auf lenvatinibverbindungen
WO2012170907A2 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Life Technologies Corporation Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points
US8980333B2 (en) 2011-06-08 2015-03-17 Life Technologies Corporation Development of novel detergents for use in PCR systems
WO2012171997A1 (en) 2011-06-14 2012-12-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for determining the expression level of a gene of interest including correction of rt-qpcr data for genomic dna-derived signals
WO2012178210A1 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Anitoa Systems, Llc Apparatus for amplification of nucleic acids
US9487824B2 (en) 2011-06-28 2016-11-08 Igor Kutyavin Methods and compositions for enrichment of nucleic acids in mixtures of highly homologous sequences
DE102011078342A1 (de) 2011-06-29 2013-01-03 Aj Innuscreen Gmbh Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit
JP6378085B2 (ja) 2011-07-28 2018-08-22 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 改善された活性を有するｄｎａポリメラーゼ
US9758837B2 (en) 2011-08-02 2017-09-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Sensitive and rapid method for Candidatus Liberibacter species detection
US8778843B1 (en) 2011-08-03 2014-07-15 Fry Laboratories, L.L.C. Semi-pan-protozoal by quantitative PCR
US8592156B2 (en) 2011-08-08 2013-11-26 Roche Molecular Systems, Inc. Predicting response to anti-CD20 therapy in DLBCL patients
EP4324935A2 (de) 2011-08-18 2024-02-21 Life Technologies Corporation Verfahren, systeme und computerlesbare medien zur herstellung von basenzuordnungen in der nukleinsäuresequenzierung
AU2012300985A1 (en) 2011-08-31 2014-02-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Responsiveness to angiogenesis inhibitors
MX2014002307A (es) 2011-08-31 2014-08-26 Hoffmann La Roche Metodo para predecir el riesgo de hipertension asociado a la terapia antiangiogenesis.
US10704164B2 (en) 2011-08-31 2020-07-07 Life Technologies Corporation Methods, systems, computer readable media, and kits for sample identification
EP2750495B1 (de) 2011-08-31 2019-02-27 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur aufrechterhaltung der festigkeit von wassermelonen
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
DK2756101T3 (en) 2011-09-15 2018-08-27 David A Shafer PROBLEMS: ANTISON DETAIL COMPOSITIONS FOR DETECTING HIGH OR SPECIFIC DNA OR RNA
JP6073897B2 (ja) 2011-09-16 2017-02-01 ギリアド ファーマセット エルエルシー Ｈｃｖを処置するための方法
EP2570487A1 (de) 2011-09-16 2013-03-20 Lexogen GmbH Verfahren zur Nukleinsäuretranskription
CA2848240C (en) 2011-09-16 2020-09-29 Lexogen Gmbh Nucleic acid transcription method
CN103930111A (zh) 2011-09-19 2014-07-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 包含c-met拮抗剂和b-raf拮抗剂的组合治疗
WO2013041577A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Vib Vzw Methods for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration
AU2012312169B2 (en) 2011-09-21 2016-01-14 Gen-Probe Incorporated Methods for amplifying nucleic acid using tag-mediated displacement
US9352312B2 (en) 2011-09-23 2016-05-31 Alere Switzerland Gmbh System and apparatus for reactions
CA2847943C (en) 2011-09-23 2017-08-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Use of g-clamp for improved allele-specific pcr
AU2012315852B2 (en) 2011-09-28 2018-03-01 Qualicon Diagnostics, Llc Sequences and their use for detection and characterization of STEC bacteria
CN104039978A (zh) * 2011-09-29 2014-09-10 露美内克丝公司 水解探针
US9416153B2 (en) 2011-10-11 2016-08-16 Enzo Life Sciences, Inc. Fluorescent dyes
US10501791B2 (en) 2011-10-14 2019-12-10 President And Fellows Of Harvard College Sequencing by structure assembly
CA2852665A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Good Start Genetics, Inc. Analysis methods
CA2853088C (en) 2011-10-21 2018-03-13 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
ES2791830T3 (es) 2011-10-28 2020-11-06 Univ California Mutaciones de FLT3 asociadas a resistencia a fármacos en pacientes con aml que tienen mutaciones activadoras en FLT3
CN103975061A (zh) 2011-10-31 2014-08-06 荣研化学株式会社 靶核酸的检测方法
US10837879B2 (en) 2011-11-02 2020-11-17 Complete Genomics, Inc. Treatment for stabilizing nucleic acid arrays
JP2014533111A (ja) 2011-11-09 2014-12-11 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ サルモネラ属の検出のための配列およびその使用
RU2014123166A (ru) 2011-11-23 2015-12-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Восприимчивость к ингибиторам ангиогенеза
US8889159B2 (en) 2011-11-29 2014-11-18 Gilead Pharmasset Llc Compositions and methods for treating hepatitis C virus
CN104053786B (zh) 2011-11-29 2017-06-06 生命技术公司 用于多重pcr的方法和组合物
WO2013081864A1 (en) 2011-11-29 2013-06-06 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
US9260714B2 (en) 2011-12-02 2016-02-16 Roche Molecular Systems, Inc. Suppression of non-specific amplification with high-homology oligonucleotides
CN103987844B (zh) 2011-12-08 2016-01-20 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有改进活性的dna聚合酶
ES2668448T3 (es) 2011-12-08 2018-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag ADN polimerasas con actividad mejorada
WO2013083262A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Roche Diagnostics Gmbh Dna polymerases with improved activity
EP3904536A1 (de) 2011-12-09 2021-11-03 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnose von lymphoid-malignität und nachweis minimaler resterkrankungen
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
US9115394B2 (en) 2011-12-22 2015-08-25 Roche Molecular Systems, Inc. Methods and reagents for reducing non-specific amplification
EP2794917B1 (de) 2011-12-23 2018-08-08 bioMérieux Nachweis von meca-varianten-stämmen von methicillin-resistentem staphylococcus aureus
WO2013101750A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of improving aphid resistance in soybeans
US9222115B2 (en) 2011-12-30 2015-12-29 Abbott Molecular, Inc. Channels with cross-sectional thermal gradients
US9194840B2 (en) 2012-01-19 2015-11-24 Life Technologies Corporation Sensor arrays and methods for making same
US9864846B2 (en) 2012-01-31 2018-01-09 Life Technologies Corporation Methods and computer program products for compression of sequencing data
US9515676B2 (en) 2012-01-31 2016-12-06 Life Technologies Corporation Methods and computer program products for compression of sequencing data
KR20130101952A (ko) 2012-02-02 2013-09-16 주식회사 씨젠 Ｐｔｏ 절단과 연장-의존적 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출
EP4361609A2 (de) 2012-02-03 2024-05-01 California Institute of Technology Signalkodierung und -dekodierung in multiplexierten biochemischen assays
WO2013123125A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 President And Fellows Of Harvard College Assembly of nucleic acid sequences in emulsions
WO2013124743A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 Population Genetics Technologies Ltd. Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement ii
EP3287531B1 (de) 2012-02-28 2019-06-19 Agilent Technologies, Inc. Verfahren zur befestigung einer zählersequenz an einer nukleinsäureprobe
US9045803B2 (en) 2012-02-29 2015-06-02 Abbott Molecular Inc. Hepatitis B virus typing and resistance assay
EP2820129A1 (de) 2012-03-02 2015-01-07 Sequenom, Inc. Verfahren und prozesse zur nichtinvasiven beurteilung genetischer variationen
WO2013131083A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Winthrop-University Hospital METHOD FOR USING PROBE BASED PCR DETECTION TO MEASURE THE LEVELS OF CIRCULATING DEMETHYLATED β CELL DERIVED DNA AS A MEASURE OF β CELL LOSS IN DIABETES
EP3372694A1 (de) 2012-03-05 2018-09-12 Adaptive Biotechnologies Corporation Festlegung von gepaarten immunrezeptorketten aus frequenzabgestimmten untereinheiten
CA2864523C (en) 2012-03-05 2019-02-05 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension assay
WO2013139860A1 (en) 2012-03-21 2013-09-26 Roche Diagnostics Gmbh Methods for assessing rna quality
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
AU2013243300B2 (en) 2012-04-05 2018-12-06 Oregon Health & Science University Gene expression panel for breast cancer prognosis
US10633707B2 (en) 2012-04-10 2020-04-28 Vib Vzw Markers for detecting microsatellite instability in cancer and determining synthetic lethality with inhibition of the DNA base excision repair pathway
US10294529B2 (en) 2012-04-10 2019-05-21 Life Sciences Research Partners Vzw Microsatellite instability markers in detection of cancer
US20150111769A1 (en) 2012-04-17 2015-04-23 Yamaguchi University Method for assessing endometrial cancer susceptibility
EP2653558B1 (de) 2012-04-18 2015-10-07 Roche Diagniostics GmbH Verfahren zur Erkennung von Nukleinsäuretargets mithilfe eines statistischen Klassifizierers
WO2013158281A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 T2 Biosystems, Inc. Compositions and methods for detection of candida species
CN107586832B (zh) 2012-05-08 2021-03-30 适应生物技术公司 用于测量和校准多重pcr反应中的扩增偏倚的组合物和方法
US9646132B2 (en) 2012-05-11 2017-05-09 Life Technologies Corporation Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US10077474B2 (en) 2012-05-29 2018-09-18 Abbott Molecular, Inc. Method of designing primers, method of detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs), method of distinguishing SNPs, and related primers, detectable oligonucleotides, and kits
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
US9628676B2 (en) 2012-06-07 2017-04-18 Complete Genomics, Inc. Imaging systems with movable scan mirrors
US9488823B2 (en) 2012-06-07 2016-11-08 Complete Genomics, Inc. Techniques for scanned illumination
EP3643793A1 (de) 2012-06-14 2020-04-29 Life Technologies Corporation Neuartige zusammensetzungen, verfahren und kits für polymerasekettenreaktionen (pcr)
US20130337442A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic loci associated with soybean cyst nematode resistance and methods of use
WO2013192100A1 (en) 2012-06-18 2013-12-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Methods and compositions for detecting jc virus
CA2878979C (en) 2012-07-13 2021-09-14 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
WO2014012107A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Life Technologies Corporation Human identifiation using a panel of snps
CN108875312A (zh) 2012-07-19 2018-11-23 哈佛大学校长及研究员协会 利用核酸存储信息的方法
CN104662172B (zh) 2012-08-03 2018-07-06 加州理工学院 Pcr中具有减少的硬件和要求的多重化和定量
US10993418B2 (en) 2012-08-13 2021-05-04 Life Genetics Lab, Llc Method for measuring tumor burden in patient derived xenograft (PDX) mice
US9957557B2 (en) 2012-08-13 2018-05-01 Life Genetics Lab, Llc Development of a highly sensitive quantification system for assessing DNA degradation and quality in forensic samples
US9982313B2 (en) 2012-08-17 2018-05-29 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of herpes simplex virus 1 and 2
US9139870B2 (en) 2012-08-30 2015-09-22 Gen-Probe Incorporated Multiphase nucleic acid amplification
US9914968B2 (en) 2012-09-26 2018-03-13 Cepheid Honeycomb tube
WO2014051076A1 (ja) 2012-09-28 2014-04-03 株式会社Ｂｎａ Ｂｎａクランプ法
ES2660027T3 (es) 2012-10-01 2018-03-20 Adaptive Biotechnologies Corporation Evaluación de la inmunocompetencia por la diversidad de los receptores de inmunidad adaptativa y caracterización de la clonalidad
US10329608B2 (en) 2012-10-10 2019-06-25 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for repeat sequencing
EP2722399A1 (de) 2012-10-18 2014-04-23 Roche Diagniostics GmbH Verfahren zur Vermeidung von Produkten mit hohem Molekulargewicht während einer Amplifikation
US9476089B2 (en) 2012-10-18 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of making oligonucleotide probes
EP2722397B1 (de) 2012-10-18 2017-12-13 F. Hoffmann-La Roche AG Test mit zwei Sonden zur Erkennung von heterogenen Amplikonpopulationen
ES2640570T3 (es) 2012-10-18 2017-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Ensayo de doble sonda para la detección de VHC
WO2014068072A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Institut Gustave-Roussy Identification, assessment and therapy of essential thrombocythemia with resistance to jak2 inhibitors
US9416405B2 (en) 2012-11-02 2016-08-16 Life Technologies Corporation Compositions, methods and kits for enhancing PCR specificity
US10314253B2 (en) 2012-12-04 2019-06-11 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for watermelon sex expression
ES2576128T3 (es) 2012-12-12 2016-07-05 The Broad Institute, Inc. Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
AU2013359199C1 (en) 2012-12-12 2021-06-17 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
SG11201504519TA (en) 2012-12-12 2015-07-30 Broad Inst Inc Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
WO2014093714A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for using oils for analysis and detection of molecules
BR112015009004A8 (pt) 2012-12-21 2021-07-20 Eisai R&D Man Co Ltd forma amorfa de derivado de quinolina e método de produção da mesma
JP6178430B2 (ja) 2012-12-27 2017-08-09 シージーン アイエヌシー Ｐｔｏ切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーションアッセイによるターゲット核酸配列の検出
BR112014011938B1 (pt) 2013-01-31 2021-03-16 Gilead Pharmasset Llc composição farmacêutica na forma de um comprimido com uma combinação de dose fixa de dois compostos antivirais, forma de dosagem farmacêutica compreendendo a referida composição e uso da referida composição
US9850515B2 (en) 2013-02-08 2017-12-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Affinity-based partition assay for detection of target molecules
US10000819B2 (en) 2013-02-21 2018-06-19 Qualicon Diagnostics Llc Sequences and their use for detection and characterization of E. coli O157:H7
AU2014200958B2 (en) 2013-02-25 2016-01-14 Seegene, Inc. Detection of nucleotide variation on target nucleic acid sequence
US20140249037A1 (en) 2013-03-04 2014-09-04 Fry Laboratories, LLC Method and kit for characterizing microorganisms
EP2964781B1 (de) 2013-03-08 2018-01-10 Roche Diagnostics GmbH Bluttest auf egfr-mutationen
US20140287417A1 (en) 2013-03-08 2014-09-25 Roche Molecular Systems, Inc. EGFR Blood Monitoring
CN105339505B (zh) 2013-03-12 2021-08-10 生命技术公司 基于通用报告体的基因分型方法和材料
US11060145B2 (en) 2013-03-13 2021-07-13 Sequenom, Inc. Methods and compositions for identifying presence or absence of hypermethylation or hypomethylation locus
US10106840B2 (en) 2013-03-13 2018-10-23 Seegene, Inc. Quantification of target nucleic acid using melting peak analysis
US20140296080A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Life Technologies Corporation Methods, Systems, and Computer Readable Media for Evaluating Variant Likelihood
US8778609B1 (en) 2013-03-14 2014-07-15 Good Start Genetics, Inc. Methods for analyzing nucleic acids
US9828629B2 (en) 2013-03-15 2017-11-28 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid target identification by structure based probe cleavage
US10294489B2 (en) 2013-03-15 2019-05-21 Board Of Trustees Of Southern Illinois University Soybean resistant to cyst nematodes
EP2925895B1 (de) 2013-03-15 2018-11-28 Avellino Lab USA, Inc. Verfahren zur verbesserten isolierung von genomischen dna-matrizen zum nachweis von allelen
US10119134B2 (en) 2013-03-15 2018-11-06 Abvitro Llc Single cell bar-coding for antibody discovery
CA2902167A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Abbott Molecular Inc. Method for amplification and assay of rna fusion gene variants, method of distinguishing same and related primers, probes, and kits
JP6441893B2 (ja) 2013-03-19 2018-12-19 ディレクティド・ジェノミクス・エル・エル・シー 標的配列の濃縮
CA2907866A1 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Genetag Technology, Inc. Dual probe:antiprobe compositions for dna and rna detection
AU2014241162A1 (en) 2013-03-27 2015-10-22 Cedars-Sinai Medical Center Mitigation and reversal of fibrosis and inflammation by inhibition of TL1A function and related signaling pathways
ES2693133T3 (es) 2013-04-01 2018-12-07 Genomictree, Inc. Método de amplificación de ácidos nucleicos usando cebador reactivo específico de alelo
WO2014172434A1 (en) 2013-04-16 2014-10-23 The Johns Hopkins University Diagnostic and prognostic test for sturge-weber syndrome, klippel-trenaunay-weber syndrome, and port-wine stains (pwss)
EP2992112B1 (de) 2013-04-22 2020-06-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Mutationen in pdgfrb und notch3 als ursachen für autosomale dominante infantile myofibromatose
EP2994559B1 (de) 2013-05-09 2020-07-08 Bio-rad Laboratories, Inc. Magnetischer immundigitaler pcr-test
ES2687968T3 (es) 2013-05-14 2018-10-30 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarcadores para pronosticar y evaluar la reactividad de sujetos con cáncer de endometrio a compuestos con lenvatinib
US10059999B2 (en) 2013-06-10 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Molecular markers associated with soybean tolerance to low iron growth conditions
WO2014204728A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
KR20160044457A (ko) 2013-06-17 2016-04-25 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 탠덤 안내 시스템, 방법 및 조성물의 전달, 조작 및 최적화
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
KR20160034901A (ko) 2013-06-17 2016-03-30 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작에 최적화된 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 이중 닉카아제 시스템, 방법 및 조성물
BR122021009076B1 (pt) 2013-06-17 2024-02-15 The Broad Institute Inc. Vetor viral contendo molécula(s) de ácido nucleico heterólogo, composição, uso e métodos do mesmo
WO2014205083A1 (en) * 2013-06-19 2014-12-24 Luminex Corporation Real-time multiplexed hydrolysis probe assay using spectrally identifiable microspheres
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
DE102013213279B4 (de) 2013-07-06 2024-03-28 Ist Innuscreen Gmbh Universelles Verfahren zur Detektion von diversen Analyten in Form von Nukleinsäuresequenzen
EP3022319B1 (de) 2013-07-15 2023-05-17 Seegene, Inc. Erkennung einer nukleinsäurezielsequenz durch pto-spaltung und erweiterungsabhängige immobilisierte oligonukleotidhybridisierung
EP4105236A1 (de) 2013-07-19 2022-12-21 Cedars-Sinai Medical Center Anti-tl1a (tnfsf15) antikörper zur behandlung von entzündlichen darmerkrankungen
MX2016000997A (es) 2013-07-25 2016-04-19 Dch Molecular Diagnostics Inc Metodos y composiciones para detectar contaminacion bacteriana.
US9926597B2 (en) 2013-07-26 2018-03-27 Life Technologies Corporation Control nucleic acid sequences for use in sequencing-by-synthesis and methods for designing the same
EA201690213A1 (ru) 2013-08-12 2016-07-29 Дженентек, Инк. Композиции и способ лечения связанных с комплементом состояний
US20160201116A1 (en) 2013-08-20 2016-07-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sequences and their use for detection of salmonella enteritidis and/or salmonella typhimurium
WO2015179773A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 The Scripps Research Institute Tissue molecular signatures of kidney transplant rejections
US10767188B2 (en) 2013-09-25 2020-09-08 Nutech Ventures Methods and compositions for obtaining useful plant traits
JP6532456B2 (ja) 2013-10-04 2019-06-19 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 終止化学を用いる配列決定における整相効果（ｐｈａｓｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ）をモデル化するための方法及びシステム
AU2014331828B2 (en) 2013-10-09 2020-05-14 Fluoresentric, Inc. Multiplex probes
PT3058106T (pt) 2013-10-17 2019-05-30 Camh Marcadores genéticos para aumento de peso induzido por antipsicóticos e métodos para a sua utilização
EP3058091B1 (de) 2013-10-18 2020-03-25 The Broad Institute, Inc. Räumliche und zelluläre kartographie von biomolekülen in situ durch hochdurchsatz-sequenzierung
KR101757473B1 (ko) 2013-10-18 2017-07-13 주식회사 씨젠 ｈＣＴＯ를 이용하는 ＰＴＯ 절단 및 연장 분석에 의한 고상에서의 타겟 핵산 서열 검출
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
CA2924277A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Institut De Cardiologie De Montreal Genotyping tests and methods for evaluating plasma creatine kinase levels
JP6742238B2 (ja) 2013-10-25 2020-08-19 ライフ テクノロジーズ コーポレーション Ｐｃｒシステムにおいて使用するための新規化合物及びその用途
US20160272997A1 (en) 2013-10-25 2016-09-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stem canker tolerant soybeans and methods of use
KR102293785B1 (ko) 2013-11-15 2021-08-26 아벨리노 랩 유에스에이, 인크. 안과 질환과 관련된 대립유전자의 멀티플렉스 검출 방법
WO2015075198A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 Orion Diagnostica Oy Detection of nucleic acids by strand invasion based amplification
NZ791803A (en) 2013-11-27 2023-02-24 Seminis Vegetable Seeds Inc Disease resistance loci in onion
DK3077539T3 (en) 2013-12-02 2018-11-19 Personal Genome Diagnostics Inc Procedure for evaluating minority variations in a sample
WO2015085063A1 (en) 2013-12-04 2015-06-11 Newleaf Symbiotics, Inc. Compositions and methods for improving lettuce production
WO2015085230A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Fusion polymerases
US9476853B2 (en) 2013-12-10 2016-10-25 Life Technologies Corporation System and method for forming microwells
AU2014361826A1 (en) 2013-12-12 2016-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR-Cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
US20150176060A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Roche Molecular Systems, Inc. Method For Coding Of Multiple PCR Reactions For Assay Recognition
US9637791B2 (en) 2013-12-20 2017-05-02 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplexed nucleic acid target identification by strucutre based probe cleavage
US9243289B2 (en) * 2013-12-23 2016-01-26 Roche Molecular Systems, Inc. Method for screening reagents used in PCR assays
RU2016134406A (ru) 2014-01-24 2018-03-01 Лэм Терапьютикс, Инк. Композиции апилимода и способы их применения
ES2873248T3 (es) 2014-02-08 2021-11-03 Hoffmann La Roche Métodos para tratar la enfermedad de Alzheimer
CN105531408B (zh) 2014-02-13 2019-09-10 生物辐射实验室股份有限公司 染色体构象划分产物捕获
CN106232827A (zh) 2014-02-21 2016-12-14 哈佛学院董事及会员团体 变构蛋白的从头设计
MX369780B (es) 2014-02-21 2019-11-21 Syngenta Participations Ag Loci geneticos asociados con una mayor fertilidad en el maiz.
NZ630710A (en) 2014-02-27 2016-03-31 Seminis Vegetable Seeds Inc Compositions and methods for peronospora resistance in spinach
JP6588919B2 (ja) 2014-02-28 2019-10-09 センター フォー アディクション アンド メンタル ヘルスＣｅｎｔｒｅ Ｆｏｒ Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ 抗精神病薬により誘導される体重増加の処置および予防のための組成物および方法
US20170292149A1 (en) 2014-03-05 2017-10-12 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
KR102207922B1 (ko) 2014-03-06 2021-01-26 삼성전자주식회사 반코마이신 저항성 엔테로코커스 특이적인 프라이머 세트, 그를 포함하는 조성물 및 시료 중 반코마이신 저항성 엔테로코커스 속 미생물을 검출하는 방법
EP3117011B1 (de) 2014-03-13 2020-05-06 Sequenom, Inc. Verfahren und prozesse zur nicht-invasiven beurteilung genetischer variationen
LT3119204T (lt) 2014-03-17 2020-09-10 Newleaf Symbiotics, Inc. Kompozicijos ir būdai, pagerinantys pomidorų augimą
WO2015147370A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures
US11390921B2 (en) 2014-04-01 2022-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs)
EP3125907A4 (de) 2014-04-01 2017-11-29 Cornell University Verwendung von doppelsträngiger dna in exosomen: neuartiger biomarker zur krebsdetektion
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US20150284786A1 (en) 2014-04-04 2015-10-08 Affymetrix, Inc. Compositions and Methods for Molecular Inversion Probe Assays
ES2777529T3 (es) 2014-04-17 2020-08-05 Adaptive Biotechnologies Corp Cuantificación de genomas de células inmunitarias adaptativas en una mezcla compleja de células
US20160053302A1 (en) 2014-04-22 2016-02-25 Roche Molecular Systems, Inc. Method for visual identification of pcr solutions for accurate reaction setup
EP3140421B8 (de) 2014-05-09 2020-05-06 Eurofins LifeCodexx GmbH Nachweis von aus einem spezifischen zelltyp stammender dna
EP2942401A1 (de) 2014-05-09 2015-11-11 Lifecodexx AG Nachweis von aus einem spezifischen Zelltyp stammender DNA
EP2942400A1 (de) 2014-05-09 2015-11-11 Lifecodexx AG Multiplex-Nachweis von DNA, die aus einem spezifischen Zelltyp herrührt
WO2015175530A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 Gore Athurva Methods for detecting aneuploidy
US11104951B2 (en) 2014-05-22 2021-08-31 The Scripps Research Institute Molecular signatures for distinguishing liver transplant rejections or injuries
GB2538006A (en) 2014-05-22 2016-11-02 Scripps Research Inst Gene expression profiles associated with sub-clinical kidney transplant rejection
US10443100B2 (en) 2014-05-22 2019-10-15 The Scripps Research Institute Gene expression profiles associated with sub-clinical kidney transplant rejection
EP3146076A4 (de) 2014-05-22 2018-05-09 The Scripps Research Institute Mit subklinischer nierentransplantatabstossung assoziierte genexpressionsprofile
WO2015185564A1 (en) * 2014-06-02 2015-12-10 Base4 Innovation Ltd Nucleotide polymorphism detection method
US10640833B2 (en) 2014-06-26 2020-05-05 University Of Florida Research Foundation, Inc. Rapid detection of infectious agents
CN107209188A (zh) 2014-06-27 2017-09-26 雅培制药有限公司 用于检测人Pegivirus 2 (HPgV‑2)的组合物和方法
US10316369B2 (en) 2014-06-27 2019-06-11 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and assays for male sterile watermelon
EP3167060B1 (de) 2014-07-10 2021-11-24 Fluoresentric, Inc. Dna-amplifikationstechnologie
EP3172332B1 (de) 2014-07-22 2020-10-14 Bio-rad Laboratories, Inc. Puffer zur verwendung mit polymerasen
CN106715718B (zh) 2014-07-24 2021-07-06 雅培分子公司 用于检测和分析结核分枝杆菌的组合物和方法
WO2016016157A1 (en) 2014-07-30 2016-02-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Genetic markers for predicting responsiveness to therapy with hdl-raising or hdl mimicking agent
ES2780904T3 (es) 2014-08-17 2020-08-27 Broad Inst Inc Edición genómica usando nickasas Cas9
US10175239B2 (en) 2014-08-18 2019-01-08 The Texas A&M University System Beta lactamase as biomarker for the specific detection of tuberculosis-complex bacteria
HRP20221047T1 (hr) 2014-08-28 2022-11-11 Eisai R&D Management Co., Ltd. Derivat kinolina visoke čistoće i postupak za njegovu proizvodnju
US11408024B2 (en) 2014-09-10 2022-08-09 Molecular Loop Biosciences, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
ES2727656T3 (es) 2014-09-15 2019-10-17 Abvitro Llc Secuenciación de alto rendimiento de banco de nucleótidos
WO2016048829A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 Good Start Genetics, Inc. Process control for increased robustness of genetic assays
CN107205353B (zh) 2014-09-26 2021-03-19 谱赛科美国股份有限公司 用于甜菊的单核苷酸多态性(snp)标志物
SG11201702416YA (en) 2014-09-30 2017-04-27 Genetic Technologies Ltd Methods for assessing risk of developing breast cancer
GB201417497D0 (en) 2014-10-03 2014-11-19 Convergence Pharmaceuticals Novel use
GB201417499D0 (en) 2014-10-03 2014-11-19 Convergence Pharmaceuticals Novel use
GB201417500D0 (en) 2014-10-03 2014-11-19 Convergence Pharmaceuticals Novel use
EP3005862A1 (de) 2014-10-10 2016-04-13 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Melonenpflanzen mit verbesserter krankheitstoleranz
WO2016061111A1 (en) 2014-10-13 2016-04-21 Life Technologies Corporation Methods, kits & compositions for determining gene copy numbers
US10676787B2 (en) 2014-10-13 2020-06-09 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer-readable media for accelerated base calling
EP3739062B1 (de) 2014-10-20 2023-08-16 Gen-Probe Incorporated Lyselösung roter blutkörperchen
EP3212790B1 (de) 2014-10-29 2020-03-25 Adaptive Biotechnologies Corp. Hochmultiplexierter gleichzeitiger nachweis von für adaptive gepaarte immunrezeptorheterodimere codierenden nukleinsäuren aus einer vielzahl von proben
KR102287811B1 (ko) 2014-10-31 2021-08-09 삼성전자주식회사 2개 표면을 결합시키는 방법 및 그에 의하여 제조된 구조체, 및 상기 구조체를 포함하는 미세유동 장치
CN107249638B (zh) 2014-11-07 2021-05-14 人工智能治疗公司 阿匹莫德用于治疗肾癌
US11708608B2 (en) 2014-11-10 2023-07-25 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for IL-33-mediated disorders
EP3218467A4 (de) 2014-11-13 2018-04-11 The Board of Trustees of the University of Illinois Biologisch manipulierte hyperfunktionale »super -helikasen
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
US9745618B2 (en) 2014-11-19 2017-08-29 Roche Molecular Systems, Inc. Photoblocked probes and methods for sequential detection of nucleic acids
US9920381B2 (en) 2014-12-02 2018-03-20 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detecting MECC-containing methicillin-resistant Staphylococcus aureus
JP2017537657A (ja) 2014-12-11 2017-12-21 ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド 標的配列の濃縮
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
EP3230451B1 (de) 2014-12-12 2021-04-07 The Broad Institute, Inc. Geschützte guide-rnas (pgrnas)
US9909169B2 (en) 2014-12-17 2018-03-06 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression
CA2970370A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 Massachusetts Institute Of Technology Crispr having or associated with destabilization domains
EP3271480B8 (de) 2015-01-06 2022-09-28 Molecular Loop Biosciences, Inc. Abtastung auf strukturelle varianten
US10337072B2 (en) 2015-01-08 2019-07-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Copy number detection and methods
CN107428818A (zh) 2015-01-29 2017-12-01 密西根州立大学校董会 隐藏多肽及其用途
US10421993B2 (en) 2015-02-11 2019-09-24 Paragon Genomics, Inc. Methods and compositions for reducing non-specific amplification products
CN107407685B (zh) 2015-02-20 2021-08-03 宝生物工程（美国)有限公司 快速精确分配、可视化和分析单个细胞的方法
PT3263106T (pt) 2015-02-25 2024-01-12 Eisai R&D Man Co Ltd Método para suprimir o amargor do derivado de quinolina
WO2016140717A1 (en) 2015-03-04 2016-09-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Combination of a pd-1 antagonist and a vegfr/fgfr/ret tyrosine kinase inhibitor for treating cancer
CN105936930A (zh) 2015-03-04 2016-09-14 松下知识产权经营株式会社 Dna检测方法和dna检测装置
CN105969655A (zh) * 2015-03-10 2016-09-28 松下知识产权经营株式会社 多个核酸靶标的分析方法
EP3271849B1 (de) 2015-03-17 2021-09-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nachweis von genomeditierung
US9708647B2 (en) 2015-03-23 2017-07-18 Insilixa, Inc. Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays
US9957393B2 (en) 2015-03-30 2018-05-01 Enzo Biochem, Inc. Monoazo dyes with cyclic amine as fluorescence quenchers
EP3277294A4 (de) 2015-04-01 2018-11-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Verfahren zur identifizierung von menschlichen kompatiblen t-zell-rezeptoren spezifisch für ein antigen-ziel
WO2016168174A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 The Translational Genomics Research Institute Predicting the occurrence of metastatic cancer using epigenomic biomarkers and non-invasive methodologies
CN104845967B (zh) 2015-04-15 2020-12-11 苏州新海生物科技股份有限公司 寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用
PL3289087T3 (pl) 2015-04-28 2021-11-02 Monsanto Technology Llc Sposoby i kompozycje dla wytwarzania brachitycznych roślin kukurydzy
US10415101B2 (en) 2015-04-30 2019-09-17 Monsanto Technology Llc Methods for producing canola plants with clubroot resistance and compositions thereof
EP3295345B1 (de) 2015-05-14 2023-01-25 Life Technologies Corporation Barcodesequenzen sowie zugehörige systeme und verfahren
JP6822974B2 (ja) 2015-05-29 2021-01-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ シトラコン酸無水物によって微生物を不活性化する方法
BR112017026193B1 (pt) 2015-06-05 2021-09-14 W.R. Grace & Co-Conn Adsorventes, método de produção dos adsorventes e uso dos adsorventes
CA3204746A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Newleaf Symbiotics, Inc. Antifungal methylobacterium compositions and methods of use
WO2016205233A2 (en) 2015-06-15 2016-12-22 Cepheid Integrated purification and measurement of dna methylation and co-measurement of mutations and/or mrna expression levels in an automated reaction cartridge
RU2729936C2 (ru) 2015-06-16 2020-08-13 Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. Противораковое средство
AU2016279077A1 (en) 2015-06-18 2019-03-28 Omar O. Abudayyeh Novel CRISPR enzymes and systems
WO2016205749A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
RU2600873C1 (ru) * 2015-06-24 2016-10-27 Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН" Способ идентификации нативных пар фрагментов днк или рнк, присутствующих в одних и тех же живых клетках
US10526664B2 (en) 2015-07-14 2020-01-07 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis
EP3124619B1 (de) 2015-07-31 2019-03-06 Menicon Co., Ltd Reagenzien, verfahren und kit zur glaukomdiagnose über hunderassen hinweg und innerhalb von hunderassen
PT3277842T (pt) 2015-08-17 2019-09-05 Kura Oncology Inc Métodos de tratamento de doentes com cancro usando inibidores da farnesiltransferase
US10767189B2 (en) 2015-08-18 2020-09-08 Monsanto Technology Llc Methods for producing cotton plants with enhanced drought tolerance and compositions thereof
US11028443B2 (en) 2015-08-31 2021-06-08 Showa Denko Materials Co., Ltd. Molecular methods for assessing urothelial disease
US10448595B2 (en) 2015-09-03 2019-10-22 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Downy mildew resistant lettuce plants
US9499861B1 (en) 2015-09-10 2016-11-22 Insilixa, Inc. Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification
US10858709B2 (en) 2015-09-10 2020-12-08 Monsanto Technology Llc Methods for producing corn plants with downy mildew resistance and compositions thereof
KR20180085717A (ko) 2015-09-24 2018-07-27 에이비비트로, 엘엘씨 친화성-올리고뉴클레오타이드 콘쥬게이트 및 그것의 사용
WO2018057051A1 (en) 2016-09-24 2018-03-29 Abvitro Llc Affinity-oligonucleotide conjugates and uses thereof
CN113774495A (zh) 2015-09-25 2021-12-10 阿布维特罗有限责任公司 用于对天然配对t细胞受体序列进行t细胞受体靶向鉴别的高通量方法
WO2017059132A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 The General Hospital Corporation Methods of treating and diagnosing disease using biomarkers for bcg therapy
EP3365441A1 (de) 2015-10-22 2018-08-29 The Broad Institute Inc. Crispr-enzyme des typs vi-b und systeme
WO2017075294A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
WO2017079442A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment
EP3168309B8 (de) 2015-11-10 2020-06-03 Eurofins LifeCodexx GmbH Nachweis von fötalen chromosomalen aneuploidien mittels dna-regionen mit unterschiedlicher methylierung zwischen dem fötus und der schwangeren frau
AU2016356474A1 (en) 2015-11-20 2018-06-21 Seegene, Inc. Method for calibrating a data set of a target analyte
US10391498B2 (en) 2015-12-11 2019-08-27 Spartan Bioscience Inc. Systems and methods for nucleic acid amplification
US11485998B2 (en) 2015-12-15 2022-11-01 Seegene, Inc. Signal extraction for a target nucleic acid sequence
EP3389362A4 (de) 2015-12-18 2019-08-07 Monsanto Technology LLC Verfahren zur herstellung von maispflanzen mit resistenz gegen den nordischen blattbrand und zusammensetzungen davon
US20190233814A1 (en) 2015-12-18 2019-08-01 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
CA3002670A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Donald Earl Kyle Genetic loci associated with reproductive growth phenotypes in soybean and methods of use
US10689689B2 (en) * 2015-12-28 2020-06-23 Roche Molecular Systems, Inc. Generic method for the stabilization of specific RNA
WO2017123696A1 (en) 2016-01-12 2017-07-20 Interleukin Genetics, Inc. Methods for predicting response to treatment
CA3011991A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 T2 Biosystems, Inc. Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods
CA3011901A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 T2 Biosystems, Inc. Nmr methods and systems for the rapid detection of bacteria
JP7007298B2 (ja) 2016-01-25 2022-02-10 バイオ―ラッド ヨーロッパ ゲーエムベーハー デジタル微生物学
US11773448B2 (en) 2016-01-28 2023-10-03 The University Of Melbourne Methods for assessing risk of developing colorectal cancer
EP3411819A4 (de) 2016-02-05 2019-10-23 Seegene, Inc. Verfahren zur reduzierung des rauschpegels eines datensatzes für einen zielanalyten
CA3004914A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic loci associated with brown stem rot resistance in soybean and methods of use
JP6611206B2 (ja) 2016-02-09 2019-11-27 栄研化学株式会社 標的核酸を検出する方法およびそれに用いる核酸プローブ
WO2017155858A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Insilixa, Inc. Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension
EP3426805B1 (de) 2016-03-11 2023-11-29 Roche Diagnostics GmbH Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis des zikavirus
CN109462996A (zh) 2016-03-17 2019-03-12 西达-赛奈医疗中心 通过rnaset2诊断炎性肠病的方法
RU2757416C2 (ru) 2016-04-06 2021-10-15 Лайф Текнолоджис Корпорейшн Композиции, способы и наборы для синтеза и обнаружения нуклеиновых кислот
WO2017180745A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 T2 Biosystems, Inc. Methods and systems for amplification in complex samples
AU2017253107B2 (en) 2016-04-19 2023-07-20 Massachusetts Institute Of Technology CPF1 complexes with reduced indel activity
AU2017257274B2 (en) 2016-04-19 2023-07-13 Massachusetts Institute Of Technology Novel CRISPR enzymes and systems
CN110382692A (zh) 2016-04-19 2019-10-25 博德研究所 新型crispr酶以及系统
WO2017184968A1 (en) 2016-04-22 2017-10-26 Kura Oncology, Inc. Methods of selecting cancer patients for treatment with farnesyltransferase inhibitors
WO2017189730A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment
JP2019515035A (ja) 2016-04-27 2019-06-06 ミラ ディーエックス， インコーポレイテッド Ｋｒａｓバリアントがん患者の免疫ベースの処置
EP3448998B1 (de) 2016-04-27 2020-06-03 Gen-Probe Incorporated Reagens für blutzelllyse
US10619205B2 (en) 2016-05-06 2020-04-14 Life Technologies Corporation Combinatorial barcode sequences, and related systems and methods
EP3455369B1 (de) 2016-05-12 2022-01-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Verfahren zur gleichzeitigen gepoolten genotypisierung
WO2017201315A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Roche Sequencing Solutions, Inc. Quantitative real time pcr amplification using an electrowetting-based device
US10612101B2 (en) 2016-05-27 2020-04-07 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of Mycoplasma genitalium
CN109154023B (zh) 2016-05-27 2022-09-20 豪夫迈·罗氏有限公司 用于检测阴道毛滴虫的组合物和方法
US20170351807A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Life Technologies Corporation Methods and systems for designing gene panels
WO2017213458A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Seegene, Inc. Methods for preparing tagging oligonucleotides
CN109477150B (zh) 2016-06-16 2023-03-31 生命技术公司 用于检测微生物的组合物、方法和试剂盒
EP3472354A4 (de) 2016-06-17 2020-01-01 California Institute of Technology Nukleinsäurereaktionen sowie zugehörige verfahren und zusammensetzungen
JP7267013B2 (ja) 2016-06-17 2023-05-01 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド Ｖｉ型ｃｒｉｓｐｒオルソログ及び系
US11155857B2 (en) 2016-06-27 2021-10-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for measuring RNA translation rates
US20210222164A1 (en) 2016-06-29 2021-07-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems having destabilization domain
KR102264865B1 (ko) 2016-06-30 2021-06-14 주식회사 씨젠 반응 분석용 형광 검출 장치
JP7075394B2 (ja) 2016-07-21 2022-05-25 タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド マルチウェルデバイスを用いたマルチｚ撮像及び分注
US10626454B2 (en) 2016-07-27 2020-04-21 SeqMatic, LLC Compositions and methods for nucleic acid amplification and analysis
AU2017301881A1 (en) 2016-07-29 2019-02-07 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing the presence or absence of replication competent virus
JP6999645B2 (ja) 2016-08-02 2022-02-04 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 核酸の増幅及び検出／定量の効率を改良するためのヘルパーオリゴヌクレオチド
US10837067B2 (en) 2016-08-11 2020-11-17 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for producing corn plants with resistance to late wilt
US11613777B2 (en) 2016-08-26 2023-03-28 Life Technologies Corporation Nucleic acid extraction and amplification controls and methods of use thereof
KR102468174B1 (ko) 2016-09-15 2022-11-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 멀티플렉스 pcr 수행 방법
US10487358B2 (en) 2016-09-23 2019-11-26 Grail, Inc. Methods of preparing and analyzing cell-free nucleic acid sequencing libraries
EP3516078A1 (de) 2016-09-23 2019-07-31 Life Technologies Corporation Zusammensetzungen und verfahren zur beurteilung der immunantwort
AU2017232187B2 (en) 2016-09-30 2023-11-09 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Xanthomonas resistant brassica oleracea plants
DE102016120124B8 (de) 2016-10-21 2018-08-23 Gna Biosolutions Gmbh Verfahren zum Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion und Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens
EA201991091A1 (ru) 2016-11-03 2019-11-29 Способы лечения пациентов со злокачественными новообразованиями с применением ингибиторов фарнезилтрансферазы
AU2017355732A1 (en) 2016-11-07 2019-05-09 Grail, Llc Methods of identifying somatic mutational signatures for early cancer detection
US10793923B2 (en) 2016-11-09 2020-10-06 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of BK virus
US11031099B2 (en) 2016-11-09 2021-06-08 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of sequence variants
KR102479432B1 (ko) 2016-12-12 2022-12-20 세페이드 자동화 반응 카트리지에서 DNA 메틸화의 통합 정제 및 측정 및 돌연변이 및/또는 mRNA 발현도의 동시 측정
JP2020503857A (ja) 2016-12-12 2020-02-06 セファイド 自動反応カートリッジにおける統合化イムノｐｃｒ及び核酸分析
WO2018111872A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Grail, Inc. Methods for tagging and amplifying rna template molecules for preparing sequencing libraries
US20190211377A1 (en) 2016-12-22 2019-07-11 Roche Molecular Systems, Inc. Cobra probes to detect a marker for epidemic ribotypes of clostridium difficile
US10982351B2 (en) 2016-12-23 2021-04-20 Grail, Inc. Methods for high efficiency library preparation using double-stranded adapters
KR102402712B1 (ko) 2016-12-29 2022-05-26 주식회사 씨젠 프라이머 다이머 형성을 감소시키고 증폭 효율을 증가시키는 방법
EP4112741A1 (de) 2017-01-04 2023-01-04 MGI Tech Co., Ltd. Schrittweise sequenzierung durch nichtmarkierte reversible terminatoren oder natürliche nukleotide
WO2018132459A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Paragon Genomics, Inc. Methods and compositions for reducing redundant molecular barcodes created in primer extension reactions
US10337070B2 (en) 2017-01-12 2019-07-02 Cardioforecast Ltd. Methods and kits for treating cardiovascular disease
TWI663974B (zh) 2017-02-21 2019-07-01 美商庫拉腫瘤技術股份有限公司 以法呢基轉移酶(farnesyltransferase)抑制劑治療癌症之方法
US9956215B1 (en) 2017-02-21 2018-05-01 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
US11248261B2 (en) 2017-03-08 2022-02-15 Etablissement Francais Du Sang RhD gene allele associated with a weak D phenotype and its uses
US20180265887A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Jacobs Farm Del Cabo Basil Plants With High Tolerance to Downy Mildew
CN110520543A (zh) 2017-03-29 2019-11-29 中美冠科生物技术（太仓）有限公司 确定胃癌对西妥昔单抗敏感性的系统和方法
WO2018183918A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Grail, Inc. Enhanced ligation in sequencing library preparation
US11584958B2 (en) 2017-03-31 2023-02-21 Grail, Llc Library preparation and use thereof for sequencing based error correction and/or variant identification
US11118222B2 (en) 2017-03-31 2021-09-14 Grail, Inc. Higher target capture efficiency using probe extension
US11572591B2 (en) 2017-04-26 2023-02-07 The Translational Genomics Research Institute Methods and assays for subtyping Staphylococcus aureus clonal complex 8 strains
EP3628056A4 (de) 2017-04-28 2021-03-03 Avellino Lab USA, Inc. Verfahren zum nachweis von allelen im zusammenhang mit keratokonus
CN108823287B (zh) 2017-04-28 2019-04-12 厦门大学 一种检测靶核酸序列的方法
WO2018213803A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Neon Therapeutics, Inc. Immunogenic neoantigen identification
US20190093155A1 (en) 2017-05-25 2019-03-28 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex Nucleic Acid Amplification Assay
WO2018218222A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Goldfless Stephen Jacob High-throughput polynucleotide library sequencing and transcriptome analysis
WO2018236548A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Inscripta, Inc. NUCLEIC ACID GUIDED NUCLEASES
US10760137B2 (en) 2017-07-18 2020-09-01 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of Babesia
AU2018308098A1 (en) 2017-07-24 2020-01-30 Quantum-Si Incorporated High intensity labeled reactant compositions and methods for sequencing
US10806730B2 (en) 2017-08-07 2020-10-20 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
WO2019032489A1 (en) 2017-08-07 2019-02-14 Kura Oncology, Inc. METHODS OF TREATING CANCER WITH FARNESYLTRANSFERASE INHIBITORS
WO2019045532A2 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Seegene, Inc. EVALUATION OF COMPONENT PERFORMANCE USING A PAIR OF DIMER FORMER PRIMERS
US20200263170A1 (en) 2017-09-14 2020-08-20 Grail, Inc. Methods for preparing a sequencing library from single-stranded dna
ES2915413T3 (es) 2017-09-27 2022-06-22 Abbott Molecular Inc Ensayo para la detección del virus de la hepatitis B (VHB)
RU2020114632A (ru) 2017-09-27 2021-10-28 ЭйАй ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. Терапевтические способы, относящиеся к ингибиторам hsp90
WO2019067973A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Grail, Inc. ENRICHMENT OF SHORT NUCLEIC ACID FRAGMENTS IN THE PREPARATION OF SEQUENCING LIBRARIES
EP3688188A4 (de) 2017-09-29 2021-06-16 Seegene, Inc. Detektion von zielnukleinsäuresequenzen durch pto-spaltung und erweiterungsabhängiger nicht-hybridisierungstest
WO2019063661A1 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Roche Diagnostics Gmbh COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DETECTION OF TRICHOMONAS VAGINALIS
US11021763B2 (en) 2017-10-03 2021-06-01 Abbott Molecular Inc. Assay for detecting hepatitis C virus (HCV)
ES2944360T3 (es) 2017-10-03 2023-06-20 Abbott Molecular Inc Ensayo para la detección del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
WO2019084055A1 (en) 2017-10-23 2019-05-02 Massachusetts Institute Of Technology CLASSIFICATION OF GENETIC VARIATION FROM UNICELLULAR TRANSCRIPTOMS
JP2021502825A (ja) 2017-11-13 2021-02-04 ライフ テクノロジーズ コーポレイション 尿路微生物検出のための組成物、方法、およびキット
US11332736B2 (en) 2017-12-07 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
US11648551B2 (en) 2017-12-12 2023-05-16 Essenlix Corporation Sample manipulation and assay with rapid temperature change
WO2019118925A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Grail, Inc. Methods for enriching for duplex reads in sequencing and error correction
US20190237161A1 (en) 2017-12-22 2019-08-01 Grail, Inc. Error removal using improved library preparation methods
US11242568B2 (en) 2017-12-29 2022-02-08 City Of Hope DNA methylation diagnostic test for breast cancer
MX2020006923A (es) 2018-01-05 2020-09-09 Seegene Inc Metodo para determinar la presencia o ausencia de m. tuberculosis, m. bovis y m. bovis bcg en una muestra.
US11015228B2 (en) 2018-01-09 2021-05-25 Abbott Molecular Inc. Assay for detecting Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, and Mycoplasma genitalium
MA51678A (fr) 2018-01-25 2020-12-02 Biogen Ma Inc Méthodes de traitement de l'amyotrophie musculaire
SG11202007070VA (en) 2018-01-30 2020-08-28 Life Technologies Corp Instruments, devices and consumables for use in a workflow of a smart molecular analysis system
CN111918972A (zh) 2018-01-31 2020-11-10 朱诺治疗学股份有限公司 评估存在或不存在有复制能力的病毒的方法和试剂
JP7418337B2 (ja) 2018-02-09 2024-01-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスト細胞媒介性炎症性疾患の治療法及び診断法
DE102018001586A1 (de) 2018-02-28 2019-10-17 Agct Gmbh Verfahren zur Detektion der Amplifikation einer Nukleinsäure mit verbesserter Spezifität
JP2021514637A (ja) 2018-02-26 2021-06-17 アーゲーツェーテー ゲーエムベーハーＡｇｃｔ Ｇｍｂｈ 特異性を改善した核酸を増幅する方法
US20190284609A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Luminex Corporation Fast, multiplex amplification of nucleic acids
EP3768832B1 (de) 2018-03-21 2023-11-29 F. Hoffmann-La Roche AG Dna-polymerasen zum effizienten und effektiven einbau von methylierten dntps
MA52655A (fr) 2018-03-30 2021-02-17 Incyte Corp Biomarqueurs pour maladie cutanée inflammatoire
JP7170062B2 (ja) 2018-04-20 2022-11-11 シージーン アイエヌシー サンプル内複数のターゲット核酸配列の検出のための方法及び装置
US20210239700A1 (en) 2018-05-04 2021-08-05 Abbott Laboratories Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products
US11268102B2 (en) 2018-05-16 2022-03-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Compositions and methods for identifying and selecting brachytic locus in solanaceae
CA3103442A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group b streptococcus nucleic acid
EP3820610A1 (de) 2018-07-12 2021-05-19 Luminex Corporation Systeme und verfahren zur durchführung variabler probenvorbereitung und analyseverfahren
GB201812192D0 (en) 2018-07-26 2018-09-12 Ttp Plc Variable temperature reactor, heater and control circuit for the same
CN112770776A (zh) 2018-07-30 2021-05-07 瑞德库尔有限责任公司 用于样品处理或分析的方法和系统
CA3106975A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of epstein-barr virus
US20210317429A1 (en) 2018-08-20 2021-10-14 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9
US20210324452A1 (en) 2018-09-06 2021-10-21 Hygiena, Llc Sequences and their use for detection and characterization of escherichia coli serotype o157:h7
WO2020053327A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Mutant dna polymerase(s) with improved strand displacement ability
CA3112651A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bordetella pertussis and bordetella parapertussis nucleic acid
EP3861347B1 (de) 2018-10-05 2022-12-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarker für eine kombinationstherapie mit lenvatinib und everolimus
US20210333281A1 (en) 2018-10-05 2021-10-28 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarkers for a therapy comprising a sorafenib compound
WO2020077135A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulating resistance to bcl-2 inhibitors
US11066404B2 (en) 2018-10-11 2021-07-20 Incyte Corporation Dihydropyrido[2,3-d]pyrimidinone compounds as CDK2 inhibitors
EP3874059A1 (de) 2018-10-29 2021-09-08 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Volllängen-rna-sequenzierung einer einzelzelle
SG11202104296TA (en) 2018-11-01 2021-05-28 Kura Oncology Inc Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
US20220017973A1 (en) 2018-12-03 2022-01-20 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of candida auris
KR20210104779A (ko) 2018-12-13 2021-08-25 디엔에이 스크립트 세포 및 생체분자 상의 직접 올리고뉴클레오타이드 합성
EP3898958A1 (de) 2018-12-17 2021-10-27 The Broad Institute, Inc. Crispr-assoziierte transposase-systeme und verfahren zu deren verwendung
AU2019403269A1 (en) 2018-12-18 2021-06-17 Grail, Llc Methods for detecting disease using analysis of RNA
CN113508182B (zh) 2018-12-18 2024-03-08 雅培分子公司 用于检测人乳头状瘤病毒(hpv)的测定
EP3899035A1 (de) 2018-12-20 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Nachweis einer zielnukleinsäure durch festphasenmolografie
JP2022515912A (ja) 2019-01-03 2022-02-22 ディーエヌエー スクリプト オリゴヌクレオチドセットのワンポット合成
AU2020208190B2 (en) 2019-01-15 2022-07-28 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green bean plants with improved disease resistance
EP3914603A1 (de) 2019-01-23 2021-12-01 Quantum-Si Incorporated Hochintensiv markierte reaktantzusammensetzungen und verfahren zur sequenzierung
KR102097721B1 (ko) 2019-01-24 2020-04-06 주식회사 시선바이오머티리얼스 태그서열 snp를 이용한 단일 검출 프로브 기반 다중 표적 검출방법
EP3924739A1 (de) 2019-02-12 2021-12-22 Biogen MA Inc. Biomarker von progressiver multifokaler leukoenzephalopathie
MA54947A (fr) 2019-02-15 2021-12-22 Incyte Corp Biomarqueurs de kinase 2 dépendant de la cycline et leurs utilisations
US11384083B2 (en) 2019-02-15 2022-07-12 Incyte Corporation Substituted spiro[cyclopropane-1,5′-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin]-6′(7′h)-ones as CDK2 inhibitors
WO2020180663A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Kura Oncology, Inc. Methods of treating cancer with farnesyltransferase inhibitors
TW202100520A (zh) 2019-03-05 2021-01-01 美商英塞特公司 作為cdk2 抑制劑之吡唑基嘧啶基胺化合物
JP2022525322A (ja) 2019-03-14 2022-05-12 インシリクサ， インコーポレイテッド 時間ゲート蛍光ベースの検出のための方法およびシステム
WO2020191102A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Type vii crispr proteins and systems
US11634782B2 (en) 2019-03-20 2023-04-25 Hygiena, Llc Quantification of microorganisms in samples and methods of determining quantification conditions thereof
CN113795253A (zh) 2019-03-29 2021-12-14 库拉肿瘤学公司 用法呢基转移酶抑制剂治疗鳞状细胞癌的方法
US11919904B2 (en) 2019-03-29 2024-03-05 Incyte Corporation Sulfonylamide compounds as CDK2 inhibitors
TW202102218A (zh) 2019-04-01 2021-01-16 美商庫拉腫瘤技術股份有限公司 以法呢基(farnesyl)轉移酶抑制劑治療癌症的方法
WO2020206046A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for cell therapy
WO2020205491A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Hygiena, Llc Sequences and their use for detection and characterization of genus cronobacter
US11447494B2 (en) 2019-05-01 2022-09-20 Incyte Corporation Tricyclic amine compounds as CDK2 inhibitors
US11440914B2 (en) 2019-05-01 2022-09-13 Incyte Corporation Tricyclic amine compounds as CDK2 inhibitors
CN113785073A (zh) 2019-05-02 2021-12-10 豪夫迈·罗氏有限公司 基于链分离温度利用dITP进行RNA靶标相比于DNA靶标的优先性/选择性扩增
US20220305001A1 (en) 2019-05-02 2022-09-29 Kura Oncology, Inc. Methods of treating acute myeloid leukemia with farnesyltransferase inhibitors
JP2022531881A (ja) 2019-05-07 2022-07-12 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｇｏｎｏｒｒｏｈｅａｅ）を検出するための組成物および方法
US20220235340A1 (en) 2019-05-20 2022-07-28 The Broad Institute, Inc. Novel crispr-cas systems and uses thereof
EP3980561A1 (de) 2019-06-06 2022-04-13 Sitokine Limited Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von lungen-, kolorektal- und brustkrebs
BR112021024853A2 (pt) 2019-06-14 2022-01-18 Seegene Inc Método implementado por computador para o desenvolvimento colaborativo de reagentes para a detecção de ácidos nucleicos-alvo
JP2022541331A (ja) 2019-07-25 2022-09-22 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー エプスタイン・バーウイルス（ｅｂｖ）を検出するための組成物および方法
US20220290246A1 (en) 2019-08-07 2022-09-15 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Single nucleotide polymorphisms and uses thereof
WO2021028469A1 (en) 2019-08-12 2021-02-18 Sitokine Limited Compositions and methods for treating cytokine release syndrome and neurotoxicity
US20230193259A1 (en) 2019-08-13 2023-06-22 Universidade De Santiago De Compostela Compounds and methods for the treatment of cancer
JP2023509260A (ja) 2019-08-14 2023-03-08 インサイト・コーポレイション Ｃｄｋ２阻害剤としてのイミダゾリルピリミジニルアミン化合物
WO2021037399A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for amplification and detection of hepatitis b virus rna, including hbv rna transcribed from cccdna
EP3569717A3 (de) 2019-08-28 2020-04-08 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Diagnostisches verfahren zur dedektion von dna und rna viren mittels polymerase kettenreaktion in einem beheizten reaktionsvolumen
WO2021041922A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
WO2021051135A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 AI Therapeutics, Inc. Pikfyve inhibitors for cancer therapy
JP2022548771A (ja) 2019-09-23 2022-11-21 ユニベルシテイト ゲント Ｓｔｒジェノタイピングのためのプローブおよび方法
SG10202008262UA (en) 2019-09-26 2021-04-29 Seminis Vegetable Seeds Inc Lettuce plants having resistance to nasonovia ribisnigri biotype nr:1
WO2021072439A1 (en) 2019-10-11 2021-04-15 Life Technologies Corporation Compositions and methods for assessing microbial populations
WO2021072232A1 (en) 2019-10-11 2021-04-15 Incyte Corporation Bicyclic amines as cdk2 inhibitors
US11441167B2 (en) 2019-11-20 2022-09-13 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing of bacteria and fungi
CN114787286A (zh) 2019-12-09 2022-07-22 豪夫迈·罗氏有限公司 双阳离子荧光染料
US11060141B1 (en) 2019-12-23 2021-07-13 Stilla Technologies Multiplex drop-off digital polymerase chain reaction methods
EP4081532A1 (de) 2019-12-23 2022-11-02 Abbott Laboratories Zusammensetzungen und verfahren zum detektieren von picobirnavirus
CN114867871A (zh) 2019-12-27 2022-08-05 豪夫迈·罗氏有限公司 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的组合物和方法
WO2021138325A1 (en) 2019-12-30 2021-07-08 Abbott Laboratories Compositions and methods for detecting bunyavirus
WO2021136752A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Quantitative pcr screening of inducible prophage from bacterial isolates
US20210292856A1 (en) 2020-02-18 2021-09-23 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods for detection of viral sequences
AU2021230341A1 (en) 2020-03-04 2022-10-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting SARS-CoV-2 nucleic acid
JP2023516789A (ja) 2020-03-09 2023-04-20 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 組換えベクター核酸の統合を定量化するための組成物及び方法
EP4118239A1 (de) 2020-03-09 2023-01-18 F. Hoffmann-La Roche AG Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis des schweren akuten respiratorischen syndroms coronavirus 2 (sars-cov-2), von influenza a und influenza b
JP2023516497A (ja) 2020-03-13 2023-04-19 メドイミューン・リミテッド Ｉｌ３３にリスクアレルを有する対象を治療するための治療方法
WO2021205013A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Sitokine Limited Compositions and methods for treating covid-19
US20230242971A1 (en) 2020-05-08 2023-08-03 Roche Sequencing Solutions, Inc. Removal of excess oligonucleotides from a reation mixture
US10941453B1 (en) 2020-05-20 2021-03-09 Paragon Genomics, Inc. High throughput detection of pathogen RNA in clinical specimens
AU2021281702A1 (en) 2020-05-27 2023-01-05 Genetic Technologies Limited Methods of assessing risk of developing a severe response to Coronavirus infection
EP4163397A1 (de) 2020-06-05 2023-04-12 Seegene, Inc. Probentransportkit zum nachweis von atemwegspathogenen und verfahren zum nachweis von atemwegspathogenen damit
AU2021204717A1 (en) 2020-07-15 2022-02-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green Bean Plants with Improved Disease Resistance
AU2021322710A1 (en) 2020-08-06 2023-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-2), influenza A, and influenza B
EP4204546A1 (de) 2020-08-31 2023-07-05 City of Hope Neue zelllinien, verfahren zur herstellung natürlicher killerzellen und verwendungen davon
CN116390646A (zh) 2020-10-12 2023-07-04 纽海姆有限公司 单性结实西瓜植物
US20240052391A1 (en) 2020-10-29 2024-02-15 Dna Script Enzymatic Synthesis of Polynucleotide Probes
JP2023547548A (ja) 2020-11-09 2023-11-10 ヌンヘムス ビー．ブイ． 単為結果性スイカ植物体
US20240003918A1 (en) 2020-11-30 2024-01-04 Enigma Biointelligence, Inc. Non-invasive assessment of alzheimer's disease
EP4256089A1 (de) 2020-12-04 2023-10-11 F. Hoffmann-La Roche AG Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von malaria
JP7209980B2 (ja) 2020-12-11 2023-01-23 東洋紡株式会社 Ｄｎａポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体
EP4267764A1 (de) 2020-12-22 2023-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Verfahren zur durchführung von multiplexierter echtzeit-pcr unter verwendung von grossen stokes-verschiebungsfluoreszenzfarbstoffen
US20220205020A1 (en) 2020-12-30 2022-06-30 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis
WO2022155588A2 (en) 2021-01-18 2022-07-21 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods for direct amplification from crude biological samples
WO2022159874A1 (en) 2021-01-25 2022-07-28 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences
JP2024505686A (ja) 2021-02-05 2024-02-07 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ｈｐｉｖ１－４）の検出のための組成物及び方法
US20220290221A1 (en) 2021-03-15 2022-09-15 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations
WO2022203748A1 (en) 2021-03-23 2022-09-29 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for variant-resistant detection of target viral sequences
WO2022233930A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detecting hepatitis delta virus by a dual-target assay
EP4337797A1 (de) 2021-05-14 2024-03-20 Gen-Probe Incorporated Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis von humaner adenovirus-nukleinsäure
EP4359561A1 (de) 2021-06-25 2024-05-01 F. Hoffmann-La Roche AG Verfahren zur durchführung von temperaturmultiplex-pcr mit erhöhter empfindlichkeit
KR20240029040A (ko) 2021-06-30 2024-03-05 넌헴스 비.브이. 변형된 dwarf14 유전자를 포함하는 수박 식물 및 식물 부분을 선택하는 방법
AU2022304654A1 (en) 2021-07-01 2023-12-14 Gen-Probe Incorporated Enzyme formulations and reaction mixtures for nucleic acid amplification
WO2023283452A2 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Cepheid High-level multiplexing reaction vessel, reagent spotting device and associated methods
FR3125824A1 (fr) 2021-07-30 2023-02-03 Bforcure Dispositif et procédé de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques
WO2023014729A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for detection of nucleic acid sequence loads
WO2023020938A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Nunhems B.V. Lettuce plant having delayed bolting
WO2023043280A1 (ko) 2021-09-17 2023-03-23 주식회사 씨젠 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
US20230121442A1 (en) 2021-10-06 2023-04-20 Johnson & Johnson Consumer Inc. Method of Quantifying Product Impact on Human Microbiome
WO2023069604A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for quantification of nucleic acid sequences using an internal quantitative standard
CA3229091A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Caribou Biosciences, Inc. Exonuclease-coupled real-time endonuclease activity assay
WO2023079032A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detection of malaria
WO2023089186A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detecting vana and/or vanb genes associated with multidrug resistance
WO2023104812A1 (en) 2021-12-09 2023-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Mass based detection of pcr amplicons
US20230193310A1 (en) 2021-12-10 2023-06-22 Seminis Vegetabe Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to downy mildew
WO2023122723A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 The Broad Institute, Inc. Panels and methods for diagnosing and treating lung cancer
WO2023118399A1 (en) 2021-12-24 2023-06-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved detection of lamp amplification products
US20230279004A1 (en) 2022-03-07 2023-09-07 Incyte Corporation Solid forms, salts, and processes of preparation of a cdk2 inhibitor
US20230348985A1 (en) 2022-03-21 2023-11-02 CarexDx, Inc. Methods for non-invasively monitoring organ health in cross-species transplantation
US11680293B1 (en) 2022-04-21 2023-06-20 Paragon Genomics, Inc. Methods and compositions for amplifying DNA and generating DNA sequencing results from target-enriched DNA molecules
US20230404003A1 (en) 2022-06-21 2023-12-21 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus
WO2023248185A1 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Mobidiag Oy Compact detection system
WO2024002924A2 (en) 2022-06-28 2024-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Fluorescent dyes with large stokes shift
WO2024003114A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Actome Gmbh Detection of biomolecules in single cells
WO2024006924A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Life Technologies Corporation Systems and methods for analyte detection from multiplexed assays
WO2024006927A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for detecting nucleic acids using intra-channel multiplexing
WO2024003332A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Controlling for tagmentation sequencing library insert size using archaeal histone-like proteins
WO2024003260A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis
WO2024015766A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Topogene Inc. Scalable, submicron-resolution replication of dna arrays
WO2024030985A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Abbott Laboratories Assays for detecting monkeypox virus
WO2024042042A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for detecting monkeypox virus
WO2024044352A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 The General Hospital Corporation Methods and compositions for prognosis and treatment of dilated cardiomyopathy and heart failure
WO2024054925A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences
WO2024081776A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Gen-Probe Incorporated Cellularity control for nucleic acid assays

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4318981A (en) * 1980-04-24 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Homogeneous specific binding assay employing an intramolecularly modulated photogenic enzyme substrate label
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
CA1219824A (en) † 1981-04-17 1987-03-31 David C. Ward Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US4711955A (en) * 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
CA1185177A (en) * 1981-07-17 1985-04-09 Larry E. Morrison Non-radiative energy transfer immunochemical technique
CA1190838A (en) * 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
CA1180647A (en) * 1981-07-17 1985-01-08 Cavit Akin Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
GB8311018D0 (en) * 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
US4743535A (en) * 1984-11-07 1988-05-10 Miles Inc. Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid
US4683194A (en) * 1984-05-29 1987-07-28 Cetus Corporation Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences
US4820630A (en) * 1984-11-23 1989-04-11 Digene Diagnostics, Incorporated Assay for nucleic acid sequences, particularly genetic lesions, using interactive labels
US4883750A (en) * 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
DK150841C (da) 1984-12-19 1988-07-11 Medicotest Systemer As Forbindelsesled til etablering af elektrisk forbindelse med en engangshudelektrode
ES8706823A1 (es) 1985-03-28 1987-06-16 Cetus Corp Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de al menos una secuencia especifica de acidos nucleicos en una muestra
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4780405A (en) * 1985-06-25 1988-10-25 Siska Diagnostics, Inc. Carbonic anhydrase inhibitor-tagged nucleic acid probes
SE450813B (sv) † 1985-07-23 1987-08-03 Volcano Int Medical Ab Kneskydd med festbara stoddelar
FR2586704B1 (fr) 1985-09-04 1987-12-18 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation et a un groupe chimique activable, leur synthese et leurs applications a titre de nucleases artificielles specifiques de sequences. centre national de la recherche scientifique (cnrs)
US5011769A (en) * 1985-12-05 1991-04-30 Meiogenics U.S. Limited Partnership Methods for detecting nucleic acid sequences
US4996143A (en) * 1985-12-23 1991-02-26 Syngene, Inc. Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization
CA1273552A (en) * 1985-12-23 1990-09-04 Michael J. Heller Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays
DE3785591T2 (de) 1986-01-10 1993-09-02 Amoco Corp Kompetitiver homogener test.
US4868103A (en) * 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
CA1284931C (en) † 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US4851331A (en) * 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase
GB8612087D0 (en) * 1986-05-19 1986-06-25 Ici Plc Hybridisation probes
JPS638396A (ja) * 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
CA1340806C (en) * 1986-07-02 1999-11-02 James Merrill Prober Method, system and reagents for dna sequencing
CA1338457C (en) * 1986-08-22 1996-07-16 Henry A. Erlich Purified thermostable enzyme
US4889818A (en) * 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4914210A (en) * 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
AU622426B2 (en) * 1987-12-11 1992-04-09 Abbott Laboratories Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
FR2627590A1 (fr) † 1988-02-24 1989-08-25 Ire Celltarg Sa Sonde d'acides nucleiques comportant un nucleotide terminal modifie chimiquement en 5(prime) (oh) en vue de son marquage non radioactif et procedes de preparation
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
JP2856804B2 (ja) * 1988-03-24 1999-02-10 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデイション 標識された相補的核酸プローブを開裂する触媒反応の補因子としての活性に基づく核酸配列検出のための触媒ハイブリッド形成系
JPH03504199A (ja) * 1988-05-10 1991-09-19 イー・アイ・デユポン・ド・ネモアース・アンド・コンパニー 迅速な核酸検出法
DE68928853T2 (de) † 1988-05-20 1999-08-05 Cetus Corp Befestigung von sequenzspezifischen proben
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US4997928A (en) * 1988-09-15 1991-03-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fluorescent reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5118801A (en) * 1988-09-30 1992-06-02 The Public Health Research Institute Nucleic acid process containing improved molecular switch
WO1990011372A1 (en) * 1989-03-21 1990-10-04 Collaborative Research, Inc. Multiplex dna diagnostic test
US5108892A (en) * 1989-08-03 1992-04-28 Promega Corporation Method of using a taq dna polymerase without 5'-3'-exonuclease activity
CA2035010C (en) * 1990-01-26 1996-12-10 Keith C. Backman Method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions
AU7268691A (en) * 1990-03-07 1991-09-12 Molecular Diagnostics, Inc. Ribonuclease scission chain reaction
US5210015A (en) * 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase

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Publication number Publication date
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