DE69130482T3

DE69130482T3 - Luciferase-zusammensetzungen und verfahren

Info

Publication number: DE69130482T3
Application number: DE69130482T
Authority: DE
Inventors: Keith V. Madison WOOD
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1990-09-10
Filing date: 1991-09-09
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2011-09-10
Also published as: ATE173298T1; DE69130482D1; US5650289A; DE69130482T2; EP0553234B1; EP0553234A4; ES2126576T5; US5283179A; ES2126576T3; JP2001224398A; JP3171595B2; AU8858391A; AU649289B2; US5814471A; GR3029352T3; DK0553234T4; JPH06500921A; EP0553234A1; WO1992004468A1; EP0553234B2

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft im allgemeinen Biolumineszenz. Insbesondere betrifft die Erfindung Methoden/Verfahren zur verbesserten Lichterzeugung aus der Aktivität von Käferluciferase und Zusammensetzungen zur Durchführung der Verfahren. Die Erfindung ist insbesondere geeignet für Assays und Test-Kits, die Luciferase als Reporter-Molekül oder Marker für die Quantifizierung von Produkten oder das Auftreten bestimmter biospezifischer Reaktionen verwenden.
Hintergrund der Erfindung
Die Verwendung von Reporter-Molekülen oder Markierungsstoffen zum qualitativen oder quantitativen Verfolgen molekularer Ereignisse ist wohlbekannt in Assays, die zur medizinischen Diagnose, zum Nachweis von Toxinen und anderen Stoffen in industriellen Umgebungen, und für die Grundlagenforschung und angewandte Forschung in Biologie, Biomedizin und Biochemie verwendet werden. Derartige Assays schließen Immunoassays, Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassays und Assays, in denen ein Reporter-Molekül infolge der Transkription von einem besonderen Promoter erzeugt wird, ein. Reporter-Moleküle oder Markierungsstoffe in derartigen Assay-Systemen schließen radioaktive Isotope, fluoreszente Agenzien, Enzyme und chemilumineszente Agenzien ein.
Unter den Assay-Systemen, in denen Chemilumineszenz ausgenutzt wird, um Ereignisse von Interesse zu verfolgen oder zu messen, sind diejenigen, in denen die Aktivität eines biolumineszenten Enzyms, einer Luciferase, gemessen wird. Jedoch ist die Verwendung von Luciferase-Assays wegen der kurzen Dauer und dem Muster der Lichtemission in den Assays nicht weit verbreitet. Bei Käferluciferasen ist diese Emission mit dem sehr schnellen Erreichen einer Peak-Intensität, beispielsweise einem Lichtblitz, gefolgt von einem langsameren, aber immer noch problematisch schnellen Abfall zu einer noch langsamer abfallenden "Steady-State"-Intensität von anfänglich annäherungsweise nur etwa 10% der Peak-Intensität, verbunden. Die kurze Dauer der intensiven Lichtemission erfordert normalerweise zur Herstellung der biolumineszenten Reaktionsmischung bei Durchführung des Assays spezialisierte Laborverfahren wie die schnelle Injektion des Enzyms in eine Substratlösung. Die Notwendigkeit, das während des "Blitzes" emittierte Licht zu messen, bleibt weiterhin ein Grund für experimentelle Schwierigkeiten. Es bleibt schwierig, selbst mit heutigen Luminometern, derartiges Licht genau zu messen.
Lichtemittierende Systeme sind aus vielen lumineszenten Organismen bekannt und isoliert worden, einschließlich bestimmter Bakterien, Protozoen, Coelenteraten, Mollusken, Fischen, Tausendfüßlern, Fliegen, Pilzen, Würmern, Krustazeen und Käfern, insbesondere den Feuerfliegen der Gattung Photinus, Photuris und Luciola und Knackkäfern ("click beetles") der Gattung Pyrophorus. In vielen dieser Organismen finden enzymatisch katalysierte Oxidoreduktionen statt, in denen die Änderung der freien Energie zur Anregung eines Moleküls in einen hohen Energiezustand benutzt wird. Bei der spontanen Rückkehr des angeregten Moleküls in den Grundzustand wird sichtbares Licht emittiert. Dieses emittierte Licht wird als "Biolumineszenz" bezeichnet.
Käferluciferasen, insbesondere die der Feuerfliegenart Photinus pyralis, dienen seit den frühesten Untersuchungen als Musterbeispiele für das Verständnis der Biolumineszenz. Die P. pyralis-Luciferase ist ein Enzym, das keine prosthetischen Gruppen oder festgebundene Metallionen zu haben scheint, und hat 550 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von ungefähr 60 000 Dalton; das Enzym steht dem Stand der Technik seit vielen Jahren in kristalliner Form zur Verfügung. Untersuchungen der molekularen Bestandteile im Mechanismus der Leuchtkäferluciferasen bei der Erzeugung von Biolumineszenz haben gezeigt, daß das Substrat der Enzyme Leuchtkäferluciferin ist, eine polyheterozyklische organische Säure, D-(–)-2-(6'-Hydroxy-2'-benzothiazolyl)-Δ²-thiazolin-4-carbonsäure (im folgenden, falls nicht anders angegeben, als "Luciferin" bezeichnet).
Die durch die Käferluciferase katalysierte Reaktion, die Biolumineszenz erzeugt (im folgenden der Einfachheit halber als "die Käferluciferase-Luciferin-Reaktion" bezeichnet) ist als zweistufiger Prozeß unter Beteiligung von Leuchtkäferluciferin, Adenosintriphosphat (ATP) und molekularem Sauerstoff beschrieben worden. In der Startreaktion reagieren das Luciferin und ATP zu Luciferyladenylat unter Eliminierung von anorganischem Pyrophosphat, wie in der folgenden Reaktionsgleichung angegeben: E + LH₂ + ATP + Mg²⁺ ⇒ E·LH₂-AMP + PP_i wobei E die Luciferase, LH₂ das Luciferin, Mg²⁺ ein Magnesiumion und PP_i Pyrophosphat bedeuten. Das Luciferyladenylat LH₂-AMP verbleibt fest an dem katalytischen Zentrum der Luciferase gebunden. Wenn diese Form des Enzyms molekularem Sauerstoff ausgesetzt wird, wird das enzymgebundene Luciferyladenylat zu Oxyluciferin (L=O) in einem elektronisch angeregten Zustand oxidiert. Das angeregte oxidierte Luciferin emittiert bei Rückkehr in den Grundzustand Licht, wie in der folgenden Reaktionsgleichung angegeben:
Für jedes Molekül des oxidierten Luciferins wird ein Lichtquantum emittiert. Der elektronisch angeregte Zustand des oxidierten Luciferins ist ein Zustand, der für die Luciferase-Luciferin-Reaktion einer Käferluciferase charakteristisch ist; die Farbe (und daher die Energie) des bei Rückkehr des oxidierten Luciferins in den Grundzustand emittierten Lichts wird durch das Enzym bestimmt, da verschiedene Käferarten mit demselben Luciferin Licht verschiedener Farbe emittieren.
Wenn die Lichtemission durch Injektion von ATP in ein Reaktionsgemisch, enthaltend Luciferase, Mg²⁺ und Luciferin, wobei alle Komponenten in der Nähe oder bei der Sättigungskonzentration vorliegen, gestartet wird, beobachtet man einen schnellen Intensitätsanstieg, gefolgt von einem schnellen Abfall in den ersten Sekunden, gefolgt von einem weiteren Abfall, der Stunden dauern kann. Von diesem Abfall in der Reaktionsgeschwindigkeit wird angenommen, daß er die Folge der Produktinhibierung ist.
Luciferase ist als Mittel für die Prüfung auf sehr geringe ATP-Konzentrationen verwendet worden; so geringe Konzentrationen wie 10^–16 Mol pro Liter ATP können mit Präparationen des Enzyms von hoher Qualität nachgewiesen werden. Die Luciferase-Luciferin-Reaktion ist hochspezifisch für ATP. Beispielsweise erzeugt Deoxy-ATP weniger als 2% des von ATP erzeugten Lichts, und andere Nucleosid-Triphosphate erzeugen weniger als 0.1%.
Die Kopplung der ATP-Konzentration mit der Aktivität anderer Enzyme hat es erlaubt, daß Luciferase ein biochemisches Reporter-Molekül für diese anderen Enzyme sowie für andere Verbindungen geworden ist.
Die Verfügbarkeit der Käferluciferasen zur Verwendung als Reporter-Moleküle in anderen Assays stellt kein Problem dar. Derartige Verwendungen werden jedoch durch die problematische Kinetik der Lichtemission in der Luciferase-Luciferin-Reaktion begrenzt. Ohne eine derartig problematische Kinetik aber hätten leicht verfügbare Käferluciferasen in Anwendungen wie Immunoassays, wie enzymgebundene immunosorbente Assays, in denen ein Enzym als Reporter-Molekül dient, und Nukleinsäurensonden-Hybridisierungsassays, in denen ein Enzym als Reporter-Molekül dient, eingesetzt werden können.
Über die Verfügbarkeit von kristallinen Luciferasen, die direkt aus den Leuchtorganen der Käfer isoliert werden, hinaus, sind cDNAs, die die Luciferasen von mehreren Käferarten kodieren (einschließlich, unter anderem, die Luciferase von P. pyralis (Leuchtkäfer), die vier Luciferaseisozyme von P. plagiaphthalamus (click beetle), die Luciferase von L. cruciata (Leuchtkäfer) und die Luciferase von L. lateralis) (de Wet et al., Molec. Cell. Biol. 7, 725–737 (1987); Masuda et al., Gene 77, 265–270 (1989); Wood et al., Science 244, 700–702 (1989); Europäische Patentanmeldung No. 0 353 464) verfügbar. Weiterhin sind die cDNAs, die die Luciferasen beliebiger anderer Käferarten, die Luciferasen erzeugen, kodieren, durch den Fachmann unter Verwendung bekannter Techniken leicht erhältlich (de Wet et al. Meth. Enzymol. 133, 3–14 (1986); Wood et al., Science 244, 700–702 (1989). Mit der die Käferluciferase kodierenden cDNA in der Hand ist es für den Fachmann ganz einfach, durch Isolierung aus Bakterien (z.B. E. coli), Hefe, Säugerzellen in Kultur und dergleichen, die zur Expression der cDNA transformiert worden sind, große Mengen der Luciferase in hochreiner Form herzustellen. Eine Reihe zellfreier Systeme, die seit kurzem für die Herstellung von Proteinen aus den sie kodierenden Nukleinsäuren verfügbar sind, können ebenfalls zur Herstellung von Käferluciferasen verwendet werden.
Ferner erlaubt die Verfügbarkeit von Käferluciferasen kodierenden cDNAs und die Fähigkeit zum schnellen Screening nach cDNAs, die die Luciferase-Luciferin-Reaktion katalysierenden Enzyme kodieren (siehe de Wet et al., Meth. Enz., supra, und Wood et al., Supra), dem Fachmann auch, mutante Luciferasen, welche katalytische Aktivität für die Erzeugung von Biolumineszenz durch die Luciferase-Luciferin-Reaktion bewahrt haben, herzustellen und in großen Mengen in reiner Form zu erhalten. Eine derartige mutante Luciferase wird eine Aminosäuresequenz aufweisen, die an einer oder mehreren Positionen von der Sequenz einer natürlich vorkommenden Käferluciferase abweicht. In der vorliegenden Offenbarung umfaßt die Bezeichnung "Käferluciferase" nicht nur natürlich in Käfern vorkommende Luciferasen, sondern auch die Mutanten derartiger natürlich vorkommender Luciferasen, die Aktivität für die Erzeugung von Biolumineszenz durch Katalyse der Luciferase-Luciferin-Reaktion bewahrt haben.
Die einfache Verfügbarkeit der die Käferluciferasen kodierenden cDNAs macht die Verwendung der Luciferasen als Reporter-Moleküle in Assays möglich, die eingesetzt werden, um die mit der Transkription und Translation verbundenen genetischen Ereignisse durch Kopplung der Expression einer derartigen cDNA, und folglich der Herstellung des Enzyms, an derartige genetische Ereignisse zu signalisieren, zu verfolgen oder zu messen.
Während die möglichen Verwendungen für Käferluciferasen als Reporter-Moleküle zunehmend an Bedeutung gewonnen haben und sehr vielfältig geworden sind, hat folglich die kurze Dauer und das Muster der durch die Enzyme hervorgerufenen Lichtemission ihre praktische Brauchbarkeit begrenzt. Es wäre wünschenswert, die Brauchbarkeit der Käferluciferasen als Reporter-Moleküle zu erhöhen, indem mit ihnen eine effizientere Lichterzeugung bewirkt wird, d.h. eine Lichterzeugung mit einer kontinuierlicheren (more nearly continuous), jedoch hohen Geschwindigkeit.
Ein Ansatz, das Problem der Kinetik der Luciferase-Luciferin-Reaktion und die damit verbundene Schwierigkeit, das während des Blitzes emittierte Licht genau zu messen, der eine gewisse Popularität erreicht hat, bestand darin, verschiedene Inhibitoren für das Enzym, von denen berichtet wird, daß sie den Blitz unterbinden oder die Lichterzeugung verlängern, zu verwenden. Ein derartiges Agens ist Arsenat. Arsenat verringert die Höhe des Blitzes und neigt dazu, die Lichtemission für eine gegebene ATP-Menge zu verlängern, verringert jedoch die Nachweisempfindlichkeit für ATP. Während Arsenat enthaltende Luciferase-Präparationen bis vor kurzem kommerziell erhältlich waren, wird die Verwendung derartiger Präparationen nicht länger bevorzugt. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, daß die Notwendigkeit einer derartigen Verwendung in einigen Anwendungen mit der Verwendung hochentwickelter Instrumente zur Lichtmessung vermieden werden kann.
Jedoch sind selbst mit derartig hochentwickelten Instrumenten spezialisierte Laborverfahren, wie ein Injektionsformat zum schnellen Mischen von Enzym und Substrat, noch erforderlich. Eine Verbesserung der Kinetik der Lichterzeugung für die enzymatische Reaktion, um die Notwendigkeit derartiger spezialisierter und unhandlicher Prozeduren zu vermeiden, würde die Nützlichkeit der Luciferasen als Reporter-Moleküle stark erweitern.
Neben Arsenatsalzen wird von einer Reihe weiterer Verbindungen berichtet, daß sie sich auf das Muster der Lichterzeugung aus der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion nachteilig auswirken. Phosphatsalze wurden zum gleichen Zweck wie die Arsenatsalze eingesetzt, wurden aber nicht bevorzugt, da bei Verwendung von Phosphatsalzen die erforderliche Gegenwart von Magnesiumionen in dem Assay-System zu der unerwünschten Ausfällung von Magnesiumphosphat führte.
Von dem Co-Faktor Coenzym A (CoA) ist berichtet worden, daß er das Muster der Lichtemission in der Luciferase-Luciferin-Reaktion beeinträchtigt. Airth et al., Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 27 (1958) S. 519–532, berichten, daß die Zugabe von CoA zu einem Leuchtkäferluciferin-Leuchtkäferluciferase-Reaktionsgemisch keine Auswirkung auf den anfänglichen Lichtintensitäts-Peak hat, daß die Lumineszenz jedoch während eines Zeitraums, der zu der Gesamtmenge an zugegebenem CoA proportional ist, auf einem höheren Niveau andauern wird. Airth et al. haben gezeigt, daß das insgesamt emittierte Licht in der Gegenwart von CoA größer ist als in seiner Abwesenheit.
Airth et al. berichten auch, daß Cystein und Glutathion die Lichtemission nicht anregen und, ohne Einzelheiten zu nennen, daß Hydroxylamin die Emission anregt und Thioethanolamin die Emission leicht anregt, in einer CoA ähnlichen Weise.
Die Lehre von Airth et al. betreffend die Auswirkung von CoA auf die Lichtemission aus der durch Käferluciferase katalysierten Reaktion von Luciferin, ATP und Sauerstoff ist zweifelhaft. Im Anschluß an den Bericht von Airth et al. erfolgte die Erklärung der Auswirkung von CoA auf Luciferase auf der Basis, daß die Inhibierung des Enzyms durch Dehydroluciferin, einer Verbindung, von der angenommen wird, daß sie eine wesentliche Verunreinigung des von Airth et al. und nachfolgenden Arbeitsgruppen, die das Luciferin aus Leuchtkäfern reinigten, verwendeten Luciferins darstellte, durch CoA verhindert wurde. Das in neuerer Zeit und heute eingesetzte Luciferin wird synthetisch hergestellt und ist als solches im wesentlichen frei von Dehydroluciferin. Synthetische Präparationen von Luciferin sind typischerweise mit weniger als 1 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 0,3 Gew.-% Dehydroluciferin, bezogen auf Luciferin, verunreinigt. Folglich würde man erwarten, daß CoA bei synthetisch hergestelltem Luciferin keine Auswirkung auf die Luciferase-Aktivität hat. Die Lehre von Airth et al. und nachfolgenden Arbeitsgruppen über die Anregung der Lichtemission mit Käferluciferase durch CoA (und anderen Verbindungen, die in der Literaturstelle Airth et al. erwähnt sind) ist bei den Anstrengungen, die praktische Anwendbarkeit von auf Luciferase-katalysierter Lichtemission basierenden Assays zu erweitern, mehr als 30 Jahre lang gänzlich ignoriert worden. Beispielsweise ist CoA niemals als Ersatz für Arsenat vorgeschlagen worden, ungeachtet der anerkannten Unerwünschtheit von Arsenat.
Es ist weiter berichtet worden, daß andere Sulfhydryl-Verbindungen zur Stabilität der Luciferasen während der Herstellung und der Lagerung der Enzyme beitragen. US 4,833,075 offenbart, daß Dithiothreitol (DTT) Luciferase-Aktivität auf einem Niveau von 50% in einer gealterten Photinus pyralis-Luciferase-Lösung aufrecht erhält, die ohne DTT nur 10% enzymatische Restaktivität, verglichen mit einer frisch hergestellten Luciferase-Lösung, aufweisen würde. US 4,614,712 beschreibt, daß bei Inaktivierung bakterieller Luciferase durch Bildung von Disulfid die Enzymaktivität durch Zugabe von DTT, β-Mercaptoethanol (β-ME) oder anderen reduzierenden Reagenzien wiederhergestellt werden kann. GB-A-2,026,156 offenbart die Verwendung reduzierender Reagenzien als Thiol-schützende Reagenzien, um die reaktiven Sulfhydrylgruppen des Enzyms zu stabilisieren. Ein ähnlicher Ansatz wurde von Hammerstedt (Anal. Biochem. (1973) 52 S. 449–455) verfolgt, der β-ME verwendete, um das Enzym für die automatische Analyse großer Zahlen ATP enthaltender Proben ausreichend zu stabilisieren. Obwohl sich Käferluciferasen und bakterielle Luciferasen in Struktur und Wirkungsweise unterscheiden, scheinen beide eine reaktive Sulfhydrylgruppe aufzuweisen, die gegen allgemeine Oxidation durch bestimmte Reduktionsmittel geschützt werden kann.
Es ist im Stand der Technik jedoch vermutet worden, daß Dithiothreitol (DTT) und ähnliche Thiolreagenzien bei Konzentrationen oberhalb 5 mM die durch Luciferasen katalysierte Lichtemission inhibieren würden.
Ein alternativer Ansatz wurde in der US-Patentanmeldung No. 4,246,340 verfolgt. Ein oder mehrere konkurrierende Luciferase-Inhibitoren, wie D-Luciferin-Analoga, wurden verwendet, um die Lichterzeugung aus der Luciferase-Luciferin-Reaktion zu verlängern und auf diese Weise experimentelle Analysen zu erleichtern.
Obwohl verschiedene Aspekte der Chemie der Luciferasen erkannt und untersucht worden sind, liefert der Stand der Technik wenig hinsichtlich praktischer Techniken für eine effektivere Lichterzeugung aus der Luciferase-Luciferin-Reaktion, um die Brauchbarkeit der resultierenden Lumineszenz als Nachweismethode zu vergrößern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verbesserungen in der Kinetik der Lichterzeugung in Käferluciferase-Luciferin-Reaktionen bereit und bringt verschiedene Entdeckungen bezüglich der Chemie einer derartigen Lichterzeugung mit sich. Die verbesserte Kinetik der Lichterzeugung ist verbunden mit einer Chemie, die die Produktinhibierung der Luciferase in der Luciferase-Luciferin-Reaktion verlangsamt oder verringert und die während der Katalyse der lichterzeugenden Reaktion stattfindende Inaktivierung der Luciferase verlangsamt.
Die verbesserte Kinetik ist zum Teil auch zurückzuführen auf zwei vorher unerkannte Zusammensetzungen: dem Thioester von CoA und Luciferin und dem Komplex aus CoA, Luciferase und oxidiertem Luciferin in seinem angeregten Zustand. Die Erfindung umfaßt diese Zusammensetzungen.
Es ist entdeckt worden, daß der Einschluß von CoA oder eines Thiolreagens wie DTT oder beidem in einem Käferluciferase-Luciferin-Reaktionsgemisch überraschende Verbesserungen in der Kinetik der Lichterzeugung aus der Reaktion und in der gesamten Lichtausbeute aus der Reaktion bereitstellt. Es ist ferner entdeckt worden, daß der Einschluß von CoA in eine Käferluciferase-Luciferin-Reaktionsmischung und das anschließende Unterwerfen der Mischung unter eine andere chemische oder physikochemische Bedingung, durch die die Peak-Intensität der Biolumineszenz aus der Reaktion in geringem Maße verringert wird, die vorteilhafte Wirkung hat, daß die Gesamtausbeute der Biolumineszenz aus der Reaktion erhöht wird. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung verbesserte Verfahren und Zusammensetzungen und Test-Kits zur Ausführung der Verfahren bereit für die Verwendung der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion und die dabei erzeugte Biolumineszenz zum Testen oder Prüfen von Proben auf das Vorhandensein einer Käferluciferase, auf genetische Ereignisse in derartigen Proben (beispielsweise von Zellen), die zur Erzeugung von Käferluciferase führen, auf das Vorhandensein von ATP oder auf chemische oder biochemische Ereignisse, die zur Erzeugung von ATP führen. In diesen Verfahren und mit diesen Zusammensetzungen und Test-Kits der Erfindung wird die Kinetik der Lichterzeugung aus der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion aufgrund eines reduzierten Verhältnisses der Peak-Intensität zu der Gesamtausbeute dieses Lichts und erhöhter Gesamtausbeute des Lichts, oder aufgrund einer Verringerung in der Geschwindigkeit, mit der die Intensität nach Erreichen der Peak-Intensität abfällt, verbessert.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß sie Käferluciferase-Luciferin-Reaktionen mit einer Kinetik der Lichterzeugung bereitstellt, in der der "Blitz", der die Reaktion nach dem Stand der Technik beeinträchtigt hat, deutlich verringert ist, aber deren gesamte Lichtausbeute deutlich, typischerweise um mehr als das 10-fache, gegenüber derartigen Reaktionen nach dem Stand der Technik erhöht ist. Derartige Verbesserungen in der Kinetik der Lichterzeugung und des gesamten in der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion erzeugten Lichts machen die Prüfung auf Luciferase oder auf ATP unter Verwendung von Luciferase deutlich einfacher und empfindlicher als mit den Verfahren nach dem Stand der Technik. Beispielsweise erfordern die Assays mit den Verfahren und Zusammensetzungen oder Test-Kits der vorliegenden Erfindung keine speziellen Verfahren, wie die schnelle Probeninjektion, oder spezielle Ausrüstung, wie hochentwickelte Luminometer, zur Messung des in dem schnellen Blitz herkömmlicher Luciferase-Luciferin-Reaktionen emittierten Lichtes.
Tatsächlich ist es unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen oder Kits der vorliegenden Erfindung jetzt möglich, Vorrichtungen, wie Szintillationszähler, die in Laboratorien bereits für andere Arten von Messungen zur Verfügung stehen, in Assays einzusetzen, die die Messung von in einer Käferluciferase-Luciferin-Reaktion erzeugtem Licht erfordern; dadurch könnte die Anwendung derartiger Assays in Wissenschaft und Technik deutlich erweitert werden, indem die Verwendung dieser Assays in Laboratorien, die nicht über Luminometer, aber über Szintillationszähler oder andere Vorrichtungen zur Messung von Lichterzeugung verfügen, erleichtert wird. Bisher wurde die Verwendung von Szintillationszählern in Assays, die die Messung von derartigem Licht erfordern, durch die Kinetik der Lichterzeugung aus der Luciferase-Luciferin-Reaktion ausgeschlossen.
Mit der vorliegenden Erfindung kann das volle Potential der Käferluciferasen als Marker oder Reporter-Moleküle in die Praxis umgesetzt werden.
Andere Vorteile und eine vollständigere Einschätzung der speziellen Adaptionen, Variationen der Zusammensetzung und physikalischen Eigenschaften werden durch ein Studium der folgenden, detaillierten Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Figuren der Zeichnungen gewonnen.
Die Hauptaspekte der von der Erfindung bereitgestellten Ergebnisse sind in den unabhängigen Ansprüchen 1, 14, 27, 33, 40 dargestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden in Verbindung mit den angefügten Zeichnungen beschrieben, wobei gleiche Bezeichnungen sich durchweg auf gleiche Elemente beziehen und in denen:
1 ein Graph ist, der die Lumineszenz infolge der Käferluciferase-Aktivität in Gegenwart und in Abwesenheit von Coenzym A vergleicht;
2 ein Graph ist, der die Lumineszenz infolge der Käferluciferase-Aktivität in Gegenwart und in Abwesenheit von Dithiothreitol vergleicht;
3a und 3b Graphen sind, die die Wirkung der Änderung der Dithiothreitol-Kon-zentration auf die Käferluciferase-Stabilität in Abwesenheit der Katalyse und während der Katalyse der Lichterzeugung durch die Käferluciferase-Luciferin-Reaktion veranschaulichen;
4 ein Graph ist, der die Lumineszenz infolge der Käferluciferase-Aktivität in Gegenwart von Coenzym A, Dithiothreitol und Rinderserumalbumin mit der Lumineszenz infolge einer derartigen Aktivität in Abwesenheit von Coenzym A, Dithiothreitol und Rinderserumalbumin vergleicht;
5 ein Graph ist, der die Lumineszenz in einem erfindungsgemäßen Assay mit der in einem herkömmlichen Assay nach dem Stand der Technik infolge der Käferluciferase-Aktivität in Extrakten aus Säugerzellen in Kultur, in denen die Luciferase durch Expression einer das Enzym kodierenden cDNA erzeugt wurde, vergleicht; und
6 ein Graph ist, der sowohl (1) die lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus der Käferluciferase-Konzentration und dem Logarithmus der Lichterzeugung in der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion in den erfindungsgemäß ausgeführten Assays und (2) die Empfindlichkeit derartiger Assays für den Nachweis der Käferluciferase veranschaulicht.
7 ein Graph ist, der die Auswirkung von 36 mM 2-Aminoethanol und die fehlende Auswirkung von 36 mM Ethanol auf die Lichterzeugung aus der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion, ausgeführt in der Gegenwart von CoA, veranschaulicht;
8 ein Graph ist, der die Auswirkungen verschiedener Phosphatkonzentrationen auf die Lichterzeugung aus der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion, ausgeführt in der Gegenwart von CoA, veranschaulicht. In dem Graph nimmt die Peak-Intensität bei zunehmender Phosphatkonzentration ab.
Ausführliche Beschreibung
In der folgenden Beschreibung erfolgen, sofern nicht anders angegeben, die Durchführung von Verfahrensschritten und die Konzentrationsmessungen bei Raumtemperatur (etwa 20°C bis etwa 25°C) und Atmosphärendruck.
Die Bezeichnung "Luciferase", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf natürlich vorkommende oder mutante Käferluciferase, sofern nicht anders angegeben. Die Luciferase kann, falls sie natürlich vorkommt, vom Fachmann in einfacher Weise aus dem Käfer selbst erhalten werden, insbesondere aus dessen Leuchtorgan. Falls die Luciferase natürlich vorkommt, oder eine Mutante einer natürlich vorkommenden Luciferase ist, die die Aktivität in der Luciferase-Luciferin-Reaktion bewahrt hat, kann sie in einfacher Weise aus einer Kultur von Bakterien, Hefe, Säugerzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen oder dergleichen, welche zur Expression einer die Luciferase kodierenden cDNA transformiert worden sind, oder aus einem zellfreien in vitro-System zur Herstellung der Luciferase aus einer Nukleinsäure, die diese kodiert, erhalten werden. Als Luciferase bevorzugt ist die des Leuchtkäfers Photinus pyralis.
Die Bezeichnung "Luciferin" ist obenstehend definiert worden.
In einem ihrer Aspekte ist die Erfindung ein Verfahren zur Feststellung des Vorhandenseins einer Käferluciferase in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie die Luciferase enthält, umfassend: (a) Herstellen mit einem aliquoten Teile dieser Probe einer Lösung enthaltend in Konzentrationen, die für die Aktivität der Luciferase in der Luciferase-Luciferin-Reaktion effektiv sind, Luciferin, Adenosintriphosphat, ein Thiolreagenz und Mg²⁺; und (b) Messung der Lumineszenz von der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt. Dieser erste Aspekt der Erfindung erfordert es einfach, einen Teil (beispielsweise einen aliquoten Teil) einer zu analysierenden Probe (beispielsweise ein Extrakt aus einer Säugerzellkultur, in deren Zellen die Luciferase exprimiert oder nicht exprimiert worden sein mag, falls ein eine derartige Expression kontrollierender Promoter aktiv bzw. inaktiv war) zu nehmen, den aliquoten Teil mit einer Lösung, in der die Luciferase, falls vorhanden, in der Luciferase-Luciferin-Reaktion aktiv sein wird, und die ein Thiolreagens umfaßt, zu vereinigen, und die Lösung (oder ein Teil derselben) zu messen, um festzustellen, ob Biolumineszenz in ihr erzeugt wird. Die Vereinigung des aliquoten Teils der Probe mit einer derartigen Lösung wird vorzugsweise, und üblicherweise, das einfache Lösen aller Komponenten des aliquoten Teils in der Lösung erfordern. In jedem Fall muß die Vereinigung derart erfolgen, daß Luciferase, falls in dem aliquoten Teil vorhanden, in der Lösung gelöst wird, in der die der Assay-Verfahren zugrundeliegende Reaktion stattfindet. Wie der Fachmann verstehen wird, wird dieses Verfahren der Erfindung als Assay-Verfahren üblicherweise mit geeigneten Kontrollsubstanzen oder Standards (beispielsweise wird eine Probe, die analysiert wird, parallel mit Lösungen ohne Luciferase und mit bekannten Luciferasekonzentrationen analysiert) durchgeführt, und das Verfahren kann mit geeigneten Standards zur Quantifizierung der Käferluciferase-Konzentration in einer Testprobe (d.h. eine Probe, die analysiert wird) angepaßt werden.
Wie nachfolgend festgestellt wird, kann wegen der verbesserten Kinetik der Lichterzeugung aus der Luciferase-Luciferin-Reaktion, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, die Assay-Methode der Erfindung für Luciferase das Enzym über einen Bereich von etwa 10^–18 M bis etwa 10^–6 M feststellen, wobei die untere Grenze lediglich durch das Rauschen selbst der besten verfügbaren Licht-detektierenden Apparate begrenzt wird.
Käferluciferasen unterscheiden sich etwas in den Bereichen der Bedingungen, des pH-Wertes, der Ionenstärke, der Temperatur, der ATP-Konzentration, der Magnesiumionen-Konzentration, der Luciferin-Konzentration und dergleichen, in denen sie in der Luciferase-Luciferin-Reaktion aktiv sind. Es ist dennoch für den Fachmann einfach, derartige Bereiche, und selbst optimale Bereiche, für jede besondere Käferluciferase festzustellen.
Dem Fachmann ist ebenso bewußt, daß andere als die oben besonders aufgeführten Zusammensetzungen in jedem Assay-Reaktionsgemisch vorhanden sind oder vorhanden sein können, um beispielsweise die Aktivität des Enzyms aufrechtzuerhalten oder zu verstärken, oder als Folge der Verfahren, die angewandt wurden, um den aliquoten Teil der Probe, der den Assay-Verfahren unterworfen wird, zu erhalten. Demgemäß werden typische Pufferagenzien, wie Tricin, HEPPS, HEPES, MOPS, Tris, Glycylglycin, ein Phosphatsalz oder dergleichen vorhanden sein, um den pH-Wert und die Ionenstärke aufrechtzuerhalten; ein proteinartiges Material, wie ein Serumalbumin von Säugetieren (vorzugsweise Rinderserumalbumin) oder Lactalbumin oder ein Ovalbumin, das die Aktivität der Luciferasen in der Luciferase-Luciferin-Reaktion verstärkt, kann vorhanden sein; EDTA oder CDTA (Cyclohexylendiamintetraacetat) oder dergleichen kann vorhanden sein, um die Aktivität von Metall enthaltenden Proteasen oder Phosphatasen zu unterdrücken, die in den Systemen (beispielsweise Zellen) vorhanden sein können, aus denen die zu prüfende Luciferase extrahiert worden ist, und die sich nachteilig auf die Luciferase oder das ATP auswirken können. Glycerol oder Ethylenglycol, die Luciferasen stabilisieren, können vorhanden sein. In ähnlicher Weise können Detergenzien oder oberflächenaktive Substanzen, insbesondere nicht ionische Detergenzien, wie diejenigen von Octoxynol (beispielsweise vertrieben unter der Handelsmarke "Triton X" von Rohm & Haas, wie Triton X-100) enthalten sein, typischerweise als Überreste, die in eine in einem erfindungsgemäßen Assay verwendete Lösung hineingetragen worden sind, einer Lösung, die zum Lysieren von Zellen verwendet wurde, aus denen Luciferase für den Assay extrahiert wird. Selbstverständlich sind Gegenionen für das Magnesium vorhanden; wie der Fachmann verstehen wird, können die chemische Identität und die Konzentrationen dieser Gegenionen in weiten Bereichen variieren, in Abhängigkeit von dem zur Bereitstellung des Magnesiumions verwendeten Magnesiumsalzes, dem eingesetzten Puffer, dem pH-Wert der Lösung, der zur Einstellung des pH-Wertes verwendeten Substanz (Säure und Base) und der in der Lösung aus anderen Quellen als dem Magnesiumsalz, dem Puffer, der zur Einstellung des pH-Wertes verwendeten Säure oder Base vorhandenen Anionen. In einem Verfahren können die Magnesiumionen als Carbonatsalz zugeführt werden, um die gewünschte Magnesiumionen-Konzentration in einer Lösung mit dem zu verwendenden Puffer (beispielsweise Tricin) bereitzustellen, und anschließend kann der pH-Wert der gepufferten Lösung durch Zugabe einer starken Säure, wie Schwefelsäure, eingestellt werden, was den Verlust des meisten Carbonats (und Bicarbonats) als Kohlendioxid und den Ersatz dieser Anionen durch Sulfat, Bisulfat, dem Tricinanion und möglicherweise auch anderen Arten von Anionen (in Abhängigkeit von anderen Substanzen (beispielsweise Phosphatsalze), die Anionen liefern und in der Lösung vorhanden sein können) zur Folge haben wird. Die Sauerstoffsättigung aus der Luft der Lösung, in der das Assay-Verfahren durchgeführt wird, ist für die Bereitstellung des in der Luciferase-Luciferin-Reaktion erforderlichen molekularen Sauerstoffs ausreichend. In jedem Fall liegt es im Bereich der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns, die Konzentrationen der verschiedenen Bestandteile in dem Assay-Reaktionsgemisch, einschließlich der oben in der Beschreibung des Verfahrens besonders aufgeführten Bestandteile, die für die Aktivität der Luciferase in der Luciferase-Luciferin-Reaktion effektiv sind, einfach festzustellen. Die für die verbesserte Kinetik der Lichterzeugung wesentliche Bestandteil ist das Thiolreagens außer CoA, vorliegend in Konzentrationen wie in den Ansprüchen angegeben.
Die in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung verwendeten Thiolreagenzien sind CoA oder Thiolreagenzien, bei denen es sich nicht um CoA handelt. Die Thiolreagenzien, bei denen es sich nicht um CoA handelt, sind Reagenzien, die eine freie Sulfhydrylgruppe aufweisen, die fähig ist, in einer mit Luft gesättigten wäßrigen Lösung unter Bedingungen der Temperatur, des pH-Wertes, der Ionenstärke, der chemischen Zusammensetzungen und dergleichen, bei denen die Luciferase-Luciferin-Reaktion stattfindet, als Reduktionsmittel wirksam zu sein. Von diesen Reagenzien ist Dithiothreitol bevorzugt. Unter anderen können β-Mercaptoethanol (β-ME), 2-Mercaptopropanol (jedes Enantiomer oder beide Enantiomere in jeder Kombination), 3-Mercaptopropanol, 2,3-Dithiopropanol und Glutathion eingesetzt werden.
Die Arten der Proben, die mit der erfindungsgemäßen Methode auf eine Luciferase geprüft werden können, umfassen unter anderem Proben, die eine Luciferase, die als Reporter-Molekül in einem Immunoassay verwendet worden war, einschließen, oder Proben, die eine Luciferase, die als Reporter-Molekül in einem Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassay verwendet worden war, einschließen. Wie in dem Immunoassays und Nukleinsäuresonden betreffenden Stand der Technik verstanden werden wird, wird die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung geprüfte Luciferase durch jede der zahlreichen, nach dem Stand der Technik bekannten Methoden an einen Antikörper oder eine Nukleinsäuresonde chemisch gebunden worden sein, die zum Nachweis eines Analyten in einem Immunoassay bzw. einem Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassay verwendet werden. Anschließend wird, ebenfalls unter Befolgung bekannter Verfahren, der luciferasemarkierte Antikörper oder die Nukleinsäuresonde mit der zu analysierenden Probe vereinigt worden sein, um an einen Analyten gebunden zu werden (beispielsweise ein Antigen oder ein Anti-Antigen Antikörper im Fall eines Immunoassays oder einer Ziel-Nukleinsäure im Fall eines Nukleinsäuresonde-Hybridisierungsassay), der nachgewiesen werden soll und in der Probe vorhanden sein könnte, und anschließend werden Luciferase-markierte Antikörper oder Nukleinsäuresonden, die nicht an den Analyten gebunden worden sind, von denjenigen, sofern vorhanden, die nicht gebunden worden sind, abgetrennt worden sein. Die erfindungsgemäß zu prüfende Probe wird von Luciferase sein, die Markierungsstoff an luciferasemarkiertem Antikörper oder Nukleinsäuresonde war, die an den Analyten derartiger Antikörper oder Sonden gebunden war. Die Luciferase kann an den markierten Antikörper oder die markierte Sonde während des erfindungsgemäßen Assays auf Luciferase chemisch gebunden bleiben oder, ebenfalls nach bekannten Methoden, von dem markierten Antikörper oder der markierten Nukleinsäuresonde vor dem erfindungsgemäßen Assay auf Luciferase abgetrennt worden sein. Immunoassays und Nukleinsäuresonden-Hybridisierungsassays, in denen Käferluciferase als Reporter-Molekül oder Markierungsstoff verwendet werden können, haben viele praktische Verwendungen und Verwendungen zu Forschungszwecken in Biologie, Biotechnologie und Medizin, einschließlich dem Nachweis von Pathogenen, dem Nachweis von genetischen Defekten, der Diagnose von Krankheiten und dergleichen.
Eine andere Art von Probe, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auf das Vorhandensein einer Luciferase geprüft werden kann, ist ein Extrakt von Zellen, in dem die Expression der Luciferase als Antwort geschieht auf die Aktivierung der Transkription von einem Promoter oder anderem transkriptionsregulierendem Element, die an ein DNA-Segment, welches die Luciferase kodiert, gebunden sind, oder als Ergebnis der Translation von RNA, die die Luciferase kodiert. In derartigen Zellen werden Luciferasen benutzt, in einer ähnlichen Weise wie andere Enzyme, wie Chloramphenicolacetyltransferase oder beta-Galactosidase, verwendet worden sind, um genetische Ereignisse, wie die Transkription oder die Regulation der Transkription, zu verfolgen. Derartige Verwendungen der Käferluciferasen sind in der Molekularbiologie und der Biomedizin von Wert und können beispielsweise beim Screening von Verbindungen nach therapeutischer Aktivität aufgrund von transkriptionsaktivierender oder transkriptionsunterdrückender Aktivität an bestimmten Promotern oder anderen Transkriptionsregulierenden Elementen eingesetzt werden.
In einem weiteren ihrer Aspekte bringt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von ATP mit sich. Dieses Verfahren folgt aus dem Aspekt der Erfindung, der das Verfahren zur Prüfung auf Luciferase einschließt, aufgrund der Tatsache, daß ATP für die Erzeugung der Biolumineszenz erforderlich ist und sich von der Methode zur Prüfung auf Luciferase nur dadurch unterscheidet, daß Käferluciferase und nicht ATP eine erforderliche Komponente in dem Assay-Reaktionsgemisch ist. Das Verfahren der Erfindung zur Feststellung des Vorhandenseins von Adenosintriphosphat in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie diese Verbindung enthält, umfaßt (a) die Herstellung mit einem aliquoten Teil dieser Probe einer Lösung, umfassend eine Käferluciferase, Luciferin, ein Thiolreagens und Mg²⁺, alle in Konzentrationen, die für die Aktivität der Luciferase in der Luciferase-Luciferin-Reaktion effektiv sind; und (b) Messung der Lumineszenz von der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt. Wie der Fachmann leicht erkennen wird, kann bei Durchführung des Verfahrens der Erfindung mit geeigneten Standards mit variierenden, bekannten ATP-Konzentrationen, zusammen mit Proben unbekannter ATP-Konzentration, dieses Verfahren an die Bestimmung der ATP-Konzentrationen in den Proben unbekannter Konzentration angepaßt werden. Das ATP in den Proben, die analysiert werden, kann aus einer Vielzahl von biochemischen Ereignissen oder Reaktionen stammen, beispielsweise Thrombozyten-Aggregation. Folglich kann dieses Verfahren der Erfindung zur Prüfung auf ATP verwendet werden, um Ereignisse oder Reaktionen, die ATP erzeugen, zu verfolgen.
Vorzugsweise wird das in den Verfahren (und Zusammensetzungen) der Erfindung verwendete Luciferin synthetisch hergestellt; sowohl CoA als auch ein Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, werden eingesetzt oder sind vorhanden; und in Zusammensetzungen der Erfindung, die Lösungen darstellen, ist CoA in einer Konzentration zwischen etwa 0,1 mM und etwa 1,0 mM vorhanden, und das Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, ist in einer Konzentration zwischen etwa 20 mM und 100 mM vorhanden.
In einem weiteren ihrer Aspekte bringt die Erfindung eine Zusammensetzung mit sich, die Käferluciferase, die fähig ist, die Luciferase-Luciferin-Reaktion zu katalysieren, CoA und ein Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, enthält. Derartige Zusammensetzungen sind vorzugsweise wäßrige Lösungen, können aber beispielsweise ein lyophilisiertes Gemisch der Komponenten sein. Mit "fähig, die Luciferase-Luciferin-Reaktion zu katalysieren" ist gemeint, daß entweder das Enzym in der Zusammensetzung, wie sie ist, die Reaktion katalysieren kann, oder daß die Zusammensetzung rekonstituiert, gelöst oder in anderer Weise chemisch oder physikalisch behandelt werden kann, so daß das Enzym aktiv wird, die Reaktion zu katalysieren. Wenn das Enzym irreversibel inaktiviert oder inhibiert wäre, wäre es nicht "fähig, die Luciferase-Luciferin-Reaktion zu katalysieren". Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen stellen eine spürbar verbesserte Kinetik der Lichterzeugung in der Luciferase-Luciferin-Reaktion bereit und werden in erfindungsgemäßen Assays, erfindungsgemäßen Test-Kits, Standards in erfindungsgemäßen Assays und Test-Kits, und bei der Herstellung von Assay-Gemischen und Test-Kits der Erfindung sowie von Standards zur Verwendung in den Mischungen und Kits verwendet. Wie an anderer Stelle der vorliegenden Beschreibung ausführlich beschrieben, können die Zusammensetzungen eine Reihe anderer Komponenten neben den unbedingt erforderlichen drei, einer Käferluciferase, die zu einer beschriebenen Aktivität fähig ist, CoA und einem Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, enthalten.
Die Erfindung bringt auch Test-Kits zur Durchführung der Assay-Verfahren der Erfindung mit sich. Derartige Kits umfassen in einem oder mehreren Behältern, üblicherweise geeignet verpackt, um die Verwendung in Assays zu erleichtern, Mengen verschiedener Zusammensetzungen, die für die Durchführung der erfindungsgemäßen Assays unerläßlich sind. Demgemäß wird es im Kit zur Prüfung auf Luciferase eine als "Luciferase-Luciferin-Reaktionszusammensetzung" bezeichnete Zusammensetzung geben, die zusätzlich zu Magnesiumionen, ATP und Luciferin, von denen wohlbekannt ist, daß sie für die Reaktion unerläßlich sind, auch ein Thiolreagens umfaßt. Eine derartige Zusammensetzung wird vorzugsweise sowohl CoA als auch ein Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, wie DTT, umfassen, und kann andere Komponenten enthalten, wie beispielsweise einen proteinartigen Verstärker der Luciferase-Aktivität (beispielsweise Rinderserumalbumin), EDTA oder CDTA, ein Phosphatsalz oder 2-Aminoethanol (siehe unten) oder einen Puffer, um eine Lösung mit einem pH-Wert und einer Ionenstärke, bei denen die Käferluciferase-Luciferin-Reaktion mit einer geeigneten Geschwindigkeit abläuft, bereitzustellen. Das Luciferin in dem Kit ist vorzugsweise synthetisch hergestellt. Wie angegeben, können die verschiedenen Komponenten vereinigt sein, beispielsweise in Lösung oder in einer lyophilisierten Mischung, in einem einzigen Behälter oder in verschiedenen Kombinationen (auch einzeln) in einer Mehrzahl von Behältern. In einem bevorzugten Kit zur Prüfung auf Luciferase in Zellen, in denen die Luciferase exprimiert wird, wird auch eine Lösung (oder die Bestandteile, um die Lösung herzustellen) enthalten sein, die geeignet ist, die Zellen unter Schutz (gegen die Wirkung der verschiedenen Enzyme, die während der Lysis freigesetzt werden) der Luciferase, die in den Zellen in einer aktiven Form oder in einer Form, die aktiviert werden kann, vorliegen kann, zu lysieren.
Die Test-Kits zur Prüfung auf ATP sind denjenigen zur Prüfung auf Luciferase ähnlich, außer daß derartige Kits eine Käferluciferase anstelle von ATP enthalten.
Die Test-Kits der Erfindung können auch, wie dem Fachmann wohlbekannt ist, verschiedene Kontrollsubstanzen und Standards enthalten, wie Lösungen bekannter Luciferase- oder ATP-Konzentrationen, solche eingeschlossen, die Luciferase oder ATP nicht enthalten (negative Kontrolle), um die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der unter Verwendung der Kits durchgeführten Assays sicherzustellen, und um quantitative Analysen der Proben auf die Analyten (beispielsweise Luciferase, ATP) der Kits zu erlauben.
In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung eine Verbesserung in Verfahren zur Prüfung auf das Vorhandensein von Stoffen (beispielsweise ATP, Stoffen, die die Produktion von ATP zur Folge haben, Luciferase) in einer Probe, wobei die Verfahren die Messung von in einer Käferluciferase-Luciferin-Reaktion erzeugtem Licht umfassen. Die Verbesserung umfaßt die Durchführung der Luciferase-Luciferin-Reaktion in der Gegenwart von CoA unter Bedingungen, die die Peak-Intensität der Lichterzeugung in der Reaktion um einen geringen Betrag verringern (beispielsweise zwischen etwa 3% und etwa 30% relativ zur Peak-Intensität in Abwesenheit derartiger Bedingungen). Dieser Aspekt der Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß eine Veränderung der Bedingungen, unter denen eine Luciferase-Luciferin-Reaktion in Gegenwart von CoA verläuft, so daß die Peak-Intensität der Lichterzeugung aus der Reaktion um einen kleinen Betrag verringert wird, einen Anstieg des gesamten in der Reaktion emittierten Lichtes zur Folge hat (d.h. wie durch Integration der Intensitäts/Zeit-Kurve gemessen). Dies ist insofern vorteilhaft, als es eine Abflachung der Intensitäts/Zeit-Kurve für das in der Reaktion erzeugte Licht mit sich bringt und dadurch die Messung des gesamten Licht-Outputs einfacher und genauer macht. Selbstverständlich wird in einer Serie von Reaktionssystemen, die gleich sind, außer daß die Peak-Intensitäten in unterschiedlichem Ausmaß verringert sind, weil die zur Verringerung der Peak-Intensitäten angewandte Bedingung, obwohl dieselbe Bedingung in jedem System angewandt wird, in unterschiedlichem Ausmaß verändert wird, eine stärkere Verringerung der Peak-Intensitäten erfordern, daß die Luciferase-Luciferin-Reaktion eine längere Zeit fortschreitet, bevor ein Anstieg im gesamten Licht-Output (gemessen durch Integration der Intensitäts/Zeit-Kurve ab Initiierung der Reaktion) erreicht wird, verglichen mit dem gesamten Output des Systems, in dem die Bedingung nicht angewandt wird, so daß die Peak-Intensität nicht reduziert wird; siehe beispielsweise 8. Eine Vielzahl von Bedingungen kann verändert werden, um den geringen Abfall in der Peak-Intensität hervorzurufen. Demgemäß kann beispielsweise der pH-Wert, die Ionenstärke oder die Temperatur der Reaktion auf Weisen, die für den Fachmann einfach zu ermitteln sind, und in Abhängigkeit von der speziellen eingesetzten Käferluciferase etwas variieren, geändert werden, so daß die Peak-Intensität verringert wird; oder verschiedene Stoffe, die Luciferase-Inhibitoren sind, können in geeigneten Konzentrationen in der Lösung, in der die Luciferase-Luciferin-Reaktion verlaufen soll, enthalten sein. Unter diesen Stoffen sind 2-Aminoethanol in einer Konzentration zwischen etwa 10 mM und etwa 100 mM, und Phosphate in einer Konzentration zwischen etwa 5 mM und etwa 60 mM (siehe 7 und 8). Die Verbesserung bezieht sich auch auf neue Verfahren der vorliegenden Erfindung, beispielsweise können 36 mM 2-Aminoethanol oder 25 mM Phosphat in einer Luciferase-Luciferin-Reaktion, in der nicht nur CoA, sondern auch ein Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, vorliegen, enthalten sein.
Die Mechanismen, von denen angenommen wird, daß sie der Erfindung zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden, und die Bezugnahme auf einen derartigen Mechanismus sollte nicht als Begrenzung des Umfangs der Erfindung aufgefaßt werden.
Es wurde entdeckt, daß CoA mit dem Enzym und elektronisch angeregtem Oxyluciferin während der Katalyse der Luciferase-Luciferin-Reaktion wechselwirkt und, als Folge dieser Wechselwirkung, die Produktinhibierung des Enzyms im Verlauf einer Luciferase-Luciferin-Reaktion verringert. (Oxyluciferin, das hierin auch als "oxidiertes Luciferin" bezeichnet wird, unterscheidet sich von Luciferin dadurch, daß es anstelle des Wasserstoffs und des Carboxylats an der 4-Position des Thiazolinrings in Luciferin einen Sauerstoff aufweist.) Demgemäß ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Komplex aus CoA, einer Käferluciferase und Oxyluciferin in seinem angeregten Zustand auf dem Enzym.
Die Existenz des CoA/Käferluciferase/angeregtes Oxyluciferin-Komplexes war bisher nicht bekannt. Derartige Komplexe treten in jeder Lösung, in der CoA, Luciferin, ATP, Sauerstoff und eine Käferluciferase in einer enzymatisch aktiven Form gemeinsam vorliegen, auf, einschließlich in vitro (beispielsweise in einer Lösung der Luciferase, die in einem Assay verwendet wird) und in den Zellen der Leuchtorgane der Käfer, in denen Biolumineszenz in der Luciferase-Luciferin-Reaktion erzeugt wird. In der vorliegenden Anmeldung wird beabsichtigt, den CoA/Enzym/angeregtes Oxyluciferin-Komplex einer Käferluciferase nur außerhalb der Umgebung, in der der Komplex in der Natur vorkommt, zu beanspruchen, d.h. außerhalb von Zellen, in denen die Luciferase in der Natur in dem Käfer vorkommt.
Es wurde gefunden, daß Käferluciferase die Bildung des Thioesters von CoA und Luciferin, Luciferyl-CoA katalysiert. Die Existenz dieser Verbindung war ebenso bisher nicht bekannt. Demgemäß ist dieser Thioester ein weiterer Aspekt der Erfindung.
Ähnlich wie der CoA/Käferluciferase/angeregtes Oxyluciferin-Komplex tritt Luciferyl-CoA in jeder Lösung, in der Luciferin, ATP, CoA und Käferluciferase in einer enzymatisch aktiven Form gemeinsam vorliegen, auf, einschließlich in vitro (beispielsweise in einer Lösung der Luciferase, die in einem Assay verwendet wird) und in den Zellen der Leuchtorgane der Käfer, in denen Biolumineszenz in der Luciferase-Luciferin-Reaktion erzeugt wird. Mit der vorliegenden Anmeldung wird beabsichtigt, Luciferyl-CoA nur außerhalb der Umgebung, in der die Verbindung in der Natur vorkommt, zu beanspruchen, d.h. außerhalb von Zellen, in denen eine Luciferase natürlich vorkommt. Luciferyl-CoA ist eine Verbindung, die zur Vermittlung der günstigen Auswirkungen von CoA auf die Kinetik der Lichterzeugung in der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion wichtig ist. Die Bildung des Thioesters ist an der Verringerung der Produktinhibierung in der Luciferase-Luciferin-Reaktion in Gegenwart von CoA beteiligt.
Das Schicksal von Luciferyl-CoA nach seiner Bildung bleibt unklar, aber es ist möglich, daß der Thioester an dem Enzym komplexiert verbleibt und das CoA im Verlauf der Katalyse der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion aus dem Thioester regeneriert wird.
Es wird angenommen, daß Thiolreagenzien, d.h. Substanzen, wie DTT oder β-ME oder dergleichen, mit freien Thiolgruppen, die als Reduktionsmittel fungieren, in irgendeiner Weise mit Käferluciferasen oder mit einem Produkt der Katalyse durch die Enzyme wechselwirken, während sie die Erzeugung von Lumineszenz katalysieren. Bezüglich der Wirkung derartiger Reagenzien auf die Luciferasen durch diese Wechselwirkung während der Katalyse scheint erst bei Konzentrationen Sättigung einzutreten, die um etwa das 10-fache bis etwa das 100-fache höher liegen als die Konzentration, bei der bezüglich der Wirkung von CoA Sättigung eintritt. Durch diese Wechselwirkung des Thiolreagens mit dem Enzym oder einem Produkt der Katalyse durch das Enzym während der Katalyse verlangsamt das Reagens die Inaktivierung des Enzyms von der Geschwindigkeit, mit der die Inaktivierung in Abwesenheit von Thiolreagens geschehen würde.
CoA ist sowohl ein Substrat des Enzyms mit einer spezifischen Bindungsstelle, der mit einer derartigen Rolle verbunden ist, als auch Thiolreagens mit den damit verbundenen, die Enzymaktivität stabilisierenden Eigenschaften. Mit CoA kann die Situation sogar noch schwieriger werden, da es möglich ist, daß in Verbindung mit der Verlangsamung der Geschwindigkeit der Produktinhibierung während der Luciferase-Luciferin-Reaktion CoA die Geschwindigkeit der Enzym-Inaktivierung, die während der Reaktion geschieht, erhöht. Bei einer Konzentration im Überschuß über die, die zur Sättigung der CoA-Substrat-Bindungsstelle während der Katalyse erforderlich ist, würde CoA dann auch wie andere Thiolreagenzien die Geschwindigkeit der Inaktivierung verlangsamen.
Bezüglich der Wirkung von CoA auf die Kinetik der Käferluciferase-Luciferin-Reaktionen tritt bei relativ niedrigen CoA-Konzentrationen zwischen etwa 0,1 mM und etwa 1 mM Sättigung ein, was ein typischer Bereich für die Sättigung der Bindung an ein Enzym durch ein Substrat ist.
Die Wirkung von Thiolreagenzien, bei denen es sich nicht um CoA handelt, auf die Kinetik der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion wird im Stand der Technik nicht vorgeschlagen. Bezüglich der Wirkung tritt zwischen etwa 30 mM und etwa 80 mM Sättigung ein, bei sehr viel höheren Konzentrationen als die 1 mM–5 mM, die im Stand der Technik vorgeschlagen werden, um Proteine vor der Inaktivierung während der Herstellung und Lagerung zu schützen und sehr viel höher als die 0,1 mM–1 mM, bei denen bezüglich der Wirkung von CoA auf eine derartige Kinetik Sättigung eintritt. Eine stabilisierende Wirkung der Thiolreagenzien ist nicht einfach eine Folge des Schutzes gegen Oxidation des Enzyms im allgemeinen, wie im Stand der Technik vorgeschlagen wird. Oberhalb 5 mM haben die Thiolreagenzien keine stabilisierende Wirkung auf das Enzym in Abwesenheit der Katalyse der Biolumineszenzreaktion, wie sie die Reagenzien haben würden, wenn die Stabilisierung einfach eine Folge des Schutzes im allgemeinen gegen die Oxidation der Gruppen auf dem Enzym wäre, aber sie stabilisieren das Enzym während eine derartige Katalyse abläuft.
Demgemäß stellt die Erfindung Luciferase-Zusammensetzungen zur Verfügung, in denen die Kinetik der Lichterzeugung in der Luciferase-Luciferin-Reaktion verbessert ist als Folge der verringerten Produktinhibierung oder verringerten Inaktivierung der Luciferase. Eine derartige Zusammensetzung ist eine wäßrige Lösung, enthaltend eine Käferluciferase, CoA zwischen etwa 0,1 mM und 1,0 mM und ein Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, zwischen etwa 10 mM und etwa 100 mM. Die Zusammensetzung kann auch andere Stoffe, wie ATP zwischen etwa 0,1 mM und 1,0 mM enthalten; Luciferin zwischen etwa 0,1 mM und 1,0 mM; Mg²⁺-Ionen zwischen etwa 2 mM und etwa 15 mM; Phosphationen, 2-Aminoethanol oder andere die Peak-Intensität verringernde Verbindungen in Konzentrationen, die für eine Verringerung der Peak-Intensität von bis zu etwa 30% effektiv sind; einen Puffer, wie Tricin, HEPPS, HEPES, MOPS, Tris, Glycylglycin, ein Phosphatsalz oder dergleichen, um den pH-Wert und die Ionenstärke der Lösung in Bereichen zu halten, in denen die Käferluciferase in der Luciferase-Luciferin-Reaktion aktiv ist; einen proteinartigen Verstärker der Luciferase-Aktivität, wie Säugerserumalbumin oder Lactalbumin oder ein Ovalbumin, vorzugsweise Rinderserumalbumin, zwischen etwa 10 μg/ml und 5 mg/ml; und EDTA oder CDTA zwischen etwa 0,1 mM und etwa 1 mM. Jedes Luciferin in einer derartigen Zusammensetzung der Erfindung ist vorzugsweise synthetisch.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren und Test-Kits zum Nachweis von ATP in Proben, von denen angenommen wird, daß sie die Verbindung enthalten, zur Verfügung. Diese Verfahren und Kits der Erfindung stützen sich auf Biolumineszenz aus einer Käferluciferase-Luciferin-Reaktion und setzen Zusammensetzungen ein, wobei erfindungsgemäß die Kinetik der Lichterzeugung aus einer derartigen Reaktion verbessert ist.
In Zusammensetzungen der Erfindung oder solchen, die in Verfahren der Erfindung verwendet werden, die wäßrige Lösungen sind und in denen Luciferin vorhanden ist, ist Luciferin typischerweise in einer Konzentration von etwa 0,1 mM bis etwa 1 mM, vorzugsweise etwa 1 mM vorhanden. In ähnlicher Weise liegt in derartigen Zusammensetzungen, in denen ATP vorhanden ist, die ATP-Konzentration im Bereich von etwa 0,1 mM bis etwa 5 mM, vorzugsweise bei etwa 0,5 mM. Wenn CoA in derartigen Zusammensetzungen der Erfindung oder in solchen, die in der Erfindung verwendet werden, vorhanden ist, die wäßrige Lösungen sind, liegt die Konzentration von CoA im Bereich von etwa 0,001 mM bis etwa 1 mM, vorzugsweise etwa 1 mM. In ähnlicher Weise ist die Konzentration von vorhandenem DTT von etwa 20 mM bis etwa 200 mM, vorzugsweise etwa 30 bis 40 mM, und diejenige von BSA beträgt von etwa 0,5 mg/ml bis etwa 5 mg/ml, vorzugsweise etwa 1 mg/ml.
Die Lumineszenz der Luciferin-Luciferase-Reaktion kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Luminometers, eines Szintillationszählers, eines Photomultiplier-Photometers oder eines Photoemulsionsfilms gemessen werden.
Um eine erfindungsgemäße Käferluciferase-Luciferin-Reaktion in einer Reaktionslösung zu starten, kann die Reaktionslösung einfach durch Mischen von (üblicherweise zwei) Lösungen oder durch Injektion einer Lösung in die andere, um ein sehr schnelles Mischen der beiden zu erreichen, hergestellt werden. Die erfindungsgemäße Verwendung von Thiolreagenzien erlaubt es, daß die Notwendigkeit eines Formats (Injektions-Format) zum schnellen Mischen in den meisten Fällen vermieden werden kann.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde durch eine Vielzahl von Versuchen getestet, die entworfen wurden, um die Lichterzeugung aus herkömmlichen Luciferase-Assay mit erfindungsgemäßen Assay-Verfahren zu vergleichen.
Die Wirkung von CoA auf die Lichterzeugung wurde verglichen mit der Lichterzeugung in seiner Abwesenheit. Der Co-Faktor wurde vor dem Mischen zu dem Enzym zugegeben. In diesen Tests wurden 100 μl einer Lösung, enthaltend 3 mM Luciferin, 3 mM ATP, mit oder ohne 3 mM CoA in einem Puffer, bestehend aus 25 mM Tricin, 7 mM Mg²⁺ und 1 mM EDTA in 200 μl einer Lösung, enthaltend 0,8 Nm Luciferase in demselben Puffer, wie oben stehend für die Luciferinlösung beschrieben, injiziert. In 1 ist die Lumineszenz von Luciferase in Gegenwart und in Abwesenheit von CoA dargestellt. Die Gesamtmenge des durch eine Reaktion emittierten Lichts wurde durch Integration der Intensität des exponentiellen Abfalls, der bis zu unendlicher Zeit extrapoliert wurde, abgeschätzt. Diese Daten zeigen, daß die Zugabe von CoA zu dem Assay-Gemisch eine größere anfängliche Lichtintensität mit einer geringeren anfänglichen Zerfallsgeschwindigkeit ergibt, und einen mehr als zweifachen Anstieg in der gesamten Lumineszenz. Derartige Daten sind unerwartet, insbesondere angesichts der Tatsache, daß synthetisches Luciferin eingesetzt wurde.
Die Wirkungen anderer Reagenzien, die Sulfhydrylgruppen besitzen, wurde getestet. In 2 ist die Lumineszenzkurve mit 33,3 mM in dem Assay-Gemisch vorhandenem DTT dargestellt. In diesem Test wurden 100 μl einer Lösung, enthaltend 3 mM Luciferin, 3 mM ATP und 100 mM DTT in dem gleichen Puffer, der in dem unmittelbar vorausgehenden Absatz für die Experimente mit CoA beschrieben ist, in 200 μl 0,8 nM Luciferase in dem gleichen Puffer injiziert. Die Kurve zeigt einen viel höheren "Steady-State", und die gesamte Lichterzeugung wurde um das 6,3-fache über diejenige bei Nichtvorhandensein von DTT gesteigert. Die Präinkubation von DTT mit dem Enzym wurde auch getestet. Die Zugabe von 10 mM DTT zu dem Enzym vor dem Assay ergab keinen signifikanten Anstieg in der Lichterzeugung. Die Ergebnisse mit anderen Thiolreagenzien sind denen ähnlich, die für DTT gefunden wurden.
Es wurden auch Tests durchgeführt, um die Art der Wirkung von DTT im Vergleich zu den schützenden Wirkungen von Thiolen, von denen im allgemeinen im Stand der Technik berichtet wird, zu testen. In diesen Tests wurden zwei 1000 μl-Lösungen hergestellt, enthaltend 20 mM Tricin bei einem pH-Wert von 7,8, 8 mM Mg²⁺, 0,13 mM EDTA, 0,53 mM ATP und 0,27 mM CoA; eine der Lösungen enthielt noch 5 mM DTT, während die andere 40 mM DTT enthielt. Ein gleich großer aliquoter Teil Luciferase wurde zu jeder Lösung gegeben. Zu verschiedenen Zeiten wurden 200 μl Lösung entfernt und Luciferin bis zu einer Konzentration von 0,47 mM zugegeben, um die Enzymaktivität zu starten. Der Zustand der Luciferaselösungen ist der gleiche wie die Reaktionsbedingungen, außer daß Luciferin nicht vorhanden ist, so daß eine Katalyse nicht ablaufen kann. Der Licht-Output wurde 10 Minuten lang gemessen. Die Ergebnisse sind in den 3a und 3b dargestellt. Aus diesen Ergebnissen können zwei Schlüsse gezogen werden – erstens ist die Stabilität der Enzymaktivität während der Katalyse stark verringert und zweitens erhöht der Anstieg der DTT-Konzentration über 5 mM nicht die Stabilität der Luciferase in Abwesenheit von Katalyse, aber erhöht die Stabilität während der Katalyse. Es ist wahrscheinlich, daß DTT auf verschiedene Arten auf das Enzym einwirkt, wenn es die Luciferase-Luciferin-Reaktion nicht katalysiert und wenn es die Reaktion katalysiert.
Es wurden auch Tests durchgeführt, um die Wirkungen anderer Zusatzstoffe zu testen. Beispielsweise erhöhte BSA die Lichtintensität um ungefähr 20%, änderte aber nicht die Zerfallsrate. Eine erhöhte anfängliche Lichtintensität wurde auch bei der Zugabe einer nicht ionischen oberflächenaktiven Substanz, Triton X-100, gefunden, jedoch gefolgt von einer erhöhten Zerfallsrate. Andere nicht ionische grenzflächenaktive Substanzen schienen eine nur geringe Wirkung auf die Enzymaktivität zu haben.
In 4 sind Lumineszenzkurven dargestellt, in denen eine Kombination aus CoA, DTT und BSA in dem Assay vorhanden waren, CoA allein in dem Assay vorhanden war und keine Zusätze zu dem herkömmlichen Assay erfolgten. Die kombinierte Wirkung von CoA, DTT und BSA hatte eine gesamte Lichterzeugung von mehr als dem 15-fachen derjenigen ohne Zusätze zur Folge.
Ein überraschendes Ergebnis des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist, daß ein Anstieg in der gesamten Lumineszenz um das 15- bis 17-fache über 10 Minuten bewirkt werden kann, verglichen mit der Lumineszenz in Abwesenheit des Thiolreagens und des Enzymstabilisators. Die kombinierte Wirkung dieser Agenzien verstärkt die Brauchbarkeit der Luciferasen als Reporter-Moleküle. Eine verbesserte Lichterzeugung erlaubt eine hochsensitive, schnelle Methode zum Nachweis von Produkten oder Ereignissen in bestimmten biospezifischen Reaktionen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, die nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung begrenzend aufgefaßt werden sollen.
BEISPIEL 1
Es wurde ein Kit zum Nachweis der Synthese von Luciferase in fremden Wirten hergestellt, der aus einem lysierenden Reagens und einem Assay-Reagens bestand. Das lysierende Reagens bestand aus 25 mM Tris-Phosphat bei pH 7,8, 10 Glycerol (das durch Ethylenglycol hätte ersetzt werden können), 1% Triton X-100 (Handelsmarke der Rohm & Haas Corp. für ein nichtionisches Detergens, das eine Octoxynol-Mischung mit einer mittleren Zahl von Ethylenyloxy (-CH₂CH₂O-)-Einheiten pro Molekül zwischen 9 und 10), 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 2 mM CDTA (Cyclohexylendiamintetraacetat) und 2 mM DTT. Das Assay-Reagens bestand aus 20 mM Tricin (N-tris(hydroxymethyl)methylglycin)-Puffer bei pH 7,8, 33,3 mM DTT, 8 mM Mg²⁺, 0,13 mM EDTA, 0,53 mM ATP, 0,47 mM Luciferin und 0,27 mM CoA.
Ein zellulärer Extrakt wurde aus NIH 3T3-Zellen gewonnen, enthaltend das Plasmid pRSVL, ein Plasmid enthaltend eine cDNA, die P. pyralis-Leuchtkäferluciferase kodiert, unter der Transkriptionskontrolle des 5'-LTR von proviraler DNA entsprechend dem Genom des Rous sarcoma-Virus. Die Zellen wurden bis zu etwa einem Drittel Konfluenz in einer 100 mm Petrischale wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann mit 10 μg Plasmid-DNA unter Verwendung der aus dem Stand der Technik. bekannten Calciumphosphat-Standardmethode transformiert und für weitere 48 Stunden wachsen gelassen.
Die kultivierten Zellen wurden unter Zugabe von 1 ml lysierendem Reagens bei Raumtemperatur für 2 bis 5 Minuten lysiert. Nach der Lysis wurden die Zelltrümmer durch kurzes Zentrifugieren, etwa 10 Sekunden, entfernt und der Überstand (d.h. die Lösung des zellulären Extrakts) wurde auf Luciferaseaktivität getestet.
Die Enzymaktivität wurde durch Mischen des zellulären Extrakts mit dem Assay-Reagens in einem Verhältnis zellulärer Extrakt:Assay-Reagens von zwischen etwa 1:5 und 1:25 getestet. Zur Durchführung des Mischvorgangs wurde keine Injektion verwendet.
Die Lumineszez der Zellextrakt-Luciferinreaktion in dem erfindungsgemäßen Assay wurde mit einem herkömmlichen Assay für Luciferaseaktivität verglichen. Der Vergleich wurde durchgeführt unter Verwendung eines Formats vom Typ einer Injektion zum Mischen, wie in den herkömmlichen Assays nach dem Stand der Technik erforderlich, obwohl der Assay der vorliegenden Erfindung keinen Injektionsvorgang erfordert. In diesen Vergleichen wurden 100 μl einer Lösung, enthaltend 0,8 mM CoA, 1,4 mM Luciferin, 1,5 mM ATP und 90 mM DTT in einem Puffer von 20 mM Tricin, 8 mM Mg²⁺, 0,13 mM EDTA, pH 7,8, in 220 μl einer Lösung, hergestellt durch Mischen von 20 μl zellulärem Extrakt mit 200 μl Puffer (20 mM Tricin, 8 mM Mg²⁺, 0,13 mM EDTA, pH 7,8) injiziert und die Lumineszenz unter Verwendung eines Standard-Luminometers (beispielsweise einem Turner Model 20 Luminometer) gemessen. Der herkömmliche Assay zu Vergleichszwecken, der eine Adaption des Assays ist, der in den ersten Berichten der Verwendung von Luciferase als einem Reporter-Molekül von genetischen Ereignissen, wie der Transkription, Mol. Cell. Biol. 7, 725–737 (1987), Sience 234, 856–859 (1986), veröffentlicht wurde, bestand aus dem Injizieren von 100 μl einer Lösung, enthaltend 0,67 mM Luciferin in einem Puffer von 25 mM Glycylglycin, 12 mM Mg²⁺, pH 7,8, in 200 μl einer Lösung, hergestellt durch Mischen von 20 μl zellulärem Extrakt mit 200 μl Puffer (25 mM Glycylglycin, 12 mM Mg²⁺, pH 7,8) mit 5,83 mM ATP.
In 5 sind die Ergebnisse dieser Tests dargestellt. In den Graphen in 5 ist die Intensität der Lumineszenz als Funktion der Zeit vom Injektionszeitpunkt aufgetragen. Die Ergebnisse zeigen, daß der Assay gemäß der vorliegenden Erfindung einen 10-fachen Anstieg im Licht-Output (d.h. der erzeugten Lumineszenz) gegenüber dem herkömmlichen Assay erzeugte, wenn der Output durch Integration der Intensitäts/Zeit-Kurve von 0 bis 60 Sekunden bestimmt wurde und einen 17-fachen Anstieg in der erzeugten Lumineszenz im Vergleich zu dem herkömmlichen Assay, wenn der Output in einer Integration der Intensitäts/Zeit-Kurve von 0 bis 5 Sekunden bestimmt wurde. Die Abwesenheit des scharfen Intensitäts-Peaks in dem erfindungsgemäßen Assay, verglichen mit dem herkömmlichen Assay, ist aus 5 ebenfalls ersichtlich.
Beispiel 2
Eine 1 mg/ml Luciferase-Vorratslösung wurde aus reiner, kristalliner P. pyralis-Luciferase in 10% Ammoniumsulfat und 10% Glycerin hergestellt. Luciferaselösungen, die für Reaktionszwecke verwendet wurden, wurden aus der Stocklösung durch 100-fache aufeinanderfolgende Verdünnungen in dem lysierenden Reagens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt. Von jeder Verdünnung wurden 20 μl (ohne Injektion) zu 200 μl des Assay-Reagens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, zugegeben und zur Messung der Lichtemission in ein Standard-Luminometer gegeben.
6 ist ein Plot des Logarithmus der erzeugten Lumineszenz (gemessen durch Integration der Lumineszenzintensität über 60 Sekunden) als Funktion des Logarithmus der Luciferasekonzentration für die verschiedenen Proben. Die Kurve in 6 zeigt eine ausgezeichnete Linearität über 8 Größenordnungen der Luciferasekonzentration. Die Luciferasekonzentration für den Datenpunkt in dem Graph von 6, der die niedrigste derartige Konzentration repräsentiert, ist 50-mal niedriger als die niedrigste Luciferasekonzentration, die in den sensitivsten Assays für Luciferase, von denen bisher berichtet worden ist, detektierbar ist. Eine derart hohe Sensitivität wird mit der vorliegenden Erfindung erreicht wegen des Anstiegs in der erzeugten Lumineszenz, verglichen mit den Systemen des Standes der Technik, und der „flachen" Kinetik, die die Wirkung des zufälligen Rauschens in der Vorrichtung zur Lichtmessung herauszumitteln erlaubt.
In dem Versuch, der in diesem Beispiel beschrieben ist, war die Kinetik der Lichterzeugung bei allen Luciferasekonzentrationen annähernd flach. Auch war die Varianz der Messungen bei jeder Konzentration (5 Wiederholungen) besser als 1,5%, außer bei der niedrigsten Konzentration, bei der das Signal zu Rausch-Verhältnis in dem Luminometer signifikant wurde. Dieser Genauigkeitsgrad ist gleich oder besser als derjenige, von dem im allgemeinen für Assays vom Injektionstyp nach dem Stand der Technik berichtet wird.
Basierend auf der Linearität, die von der Kurve in 6 wiedergegeben wird, der Präzision, mit der die Datenpunkte für die Kurve gemessen werden konnten, und dem Versuch über eine relativ konzentrierte Luciferaselösung (ungefähr 1 μM), von dem in Beispiel 4 berichtete wird, erstreckt sich der Anwendungsbereich der Luciferasekonzentrationen für die Assays der vorliegenden Erfindung von der niedrigsten, die lichtdetektierende Instrumente mit dem niedrigst möglichen Hintergrund detektieren können (gegenwärtig ungefähr 10^–18 bis 10^–17 M, oder etwa 200 Moleküle des Enzyms in einem 200 μl-Volumen Lösung) bis zu etwa 10 μM. Die Konzentration einer Luciferase wird in jeder Probe von praktischem Interesse ohne weiteres innerhalb dieses Bereichs liegen.
BEISPIEL 3
In diesem Beispiel werden die vorteilhaften Wirkungen, die eine geringfügige Reduzierung der Peak-Intensität der Lumineszenz aus der Reaktion auf die gesamte Lumineszenz aus einer Luciferase-Luciferin-Reaktion in Gegenwart von CoA hat, veranschaulicht.
7 veranschaulicht, daß der Einschluß des Luciferaseinhibitors 2-Aminoethanol bei 36 mM in einer Luciferase-Luciferin-Reaktionsmischung, die CoA enthält, die Peak-Intensität der Lumineszenz um etwa 12% verringert und die Lumineszenzausbeute, gemessen durch Integration der Lumineszenzintensität über mehr als 3 Minuten ab Start der Reaktion, erhöht.
In ähnlicher Weise zeigt 8, daß der Einschluß von Phosphat, welches ebenfalls ein Luciferaseinhibitor ist, in einer Luciferase-Luciferin-Reaktionsmischung, die CoA enthält, die Peak-Intensität der Lumineszenz (um einen Prozentsatz, der von der Phosphatkonzentration abhängig ist) reduziert, aber die Gesamtlumineszenz, gemessen durch Integration der Lumineszenzintensität über einen Zeitraum, der sich mit der Phosphation-Konzentration ändert, erhöht. Höhere Phosphatkonzentrationen setzen die Peak-Intensitäten in einem größeren Ausmaß herab und erfordern die Integration der Intensität über längere Zeiträume, um den Anstieg in der Gesamtlumineszenz offensichtlich zumachen.
Die Daten für die 7 und 8 wurden erhalten unter Verwendung der Methoden, die in Beispiel 1 beschrieben sind, wobei erfindungsgemäße Assays mit herkömmlichen Assays nach dem Stand der Technik für Luciferase in zellulären Extrakten verglichen wurden, außer daß 100 μl einer Lösung aus 0,8 mM CoA, 1,4 mM Luciferin, 1,5 mM ATP, 8 mM Mg²⁺, 0,13 mM EDTA, 5,5 mM DTT, 20 mM Tricin, pH 7,8, und zusätzlich (1) keine weitere Komponente oder (2) 110 mM 2-Aminoethanol oder (3) 110 mM Ethanol oder (4) 110 mM Ethanol, zusammen mit 30 mM, 75 mM oder 50 mM Natriumphosphat in 220 μl einer Lösung, hergestellt durch Mischen von 20 μl zellulärem Extrakt mit 200 μl Puffer (20 mM Tricin, 8 mM Mg²⁺, 0,13 mM EDTA, pH 7,8) injiziert wurden und die Lumineszenz unter Verwendung eines Standardluminometers gemessen wurde.
Wie in den 7 und 8 aufgezeigt, haben 36 mM Ethanol keine signifikante Wirkung auf die Erzeugung von Lumineszenz in der Luciferase-Luciferin-Reaktion in Gegenwart von CoA.
BEISPIEL 4
In diesem Beispiel wurden die Tatsachen gestützt, daß in der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion in Gegenwart von CoA (1) Luciferyl-CoA, der Thioester aus dem Carboxyl von Luciferin und dem Schwefel der Thiolgruppe von CoA, gebildet wird und (2) ein Komplex der Luciferase mit CoA und oxidiertem Luciferin in angeregtem Zustand ebenfalls gebildet wird.
Der Vergleich von Aminosäuresequenzen von Käferluciferasen mit denjenigen anderer Proteine enthüllt eine signifikante Homologie, und daher gemeinsame Vorfahrenschaft mit dem Pflanzenenzym 4-Coumarat:CoA-Ligase und dem Enzym langkettige Acyl-CoA-Synthetase. Hydropathy-Plots (Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982), Mittelung von 15 Rest-Werten für jeden Punkt), die die Luciferasen mit den anderen beiden Enzymen vergleichen, zeigen Ähnlichkeiten, wobei die Ähnlichkeit mit der 4-Coumarat:CoA-Ligase besonders bemerkenswert ist. Sowohl die 4-Coumarat:CoA-Ligase als auch die langkettige Acyl-CoA-Synthetase katalysieren die Bildung von Thioestern zwischen CoA und Carboxylgruppen ihrer jeweiligen Substrate. Bei beiden Enzymen reagiert ATP mit einem Substrat unter Bildung eines Acyl-AMP-Zwischenproduktes bei der Bildung des Thioesters. Wie oben angegeben, bildet Luciferase in ähnlicher Weise Luciferyladenylat aus ATP und Luciferin.
In den in den 50-iger Jahren durchgeführten Untersuchungen der Wirkung von CoA auf die Kinetik der Lichterzeugung in der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion wurde gezeigt, daß das nicht oxidierbare Luciferin-Analogon, Dehydroluciferin, einen Thioester, der durch seine Carboxylgruppe mit CoA gebunden war, bilden konnte.
Es wurde nun gefunden, daß die Aktivität von CoA bei der Beeinflussung der Kinetik der Lichterzeugung in der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion insbesondere durch seine Thiolgruppe vermittelt wird. DethioCoA ist mit CoA, das das Schwefelatom nicht aufweist, identisch. Wenn DethioCoA anstelle von CoA zu einer Luciferase-Luciferin-Reaktionsmischung zugegeben wurde, blieb die Wirkung auf die Kinetik der Lichterzeugung aus der Reaktion aus. Ferner wird der Anstieg der Lichterzeugung in einer derartigen Reaktion, der von CoA verursacht wird, spezifisch durch DethioCoA inhibiert. In reziproken Plots des reziproken Wertes des Anstiegs der Lichterzeugung als Funktion des reziproken Wertes der CoA-Konzentration mit und ohne DethioCoA bei einer konstanten Konzentration zeigt DethioCoA Aktivität als ein konkurrierender CoA-Inhibitor. Demgemäß werden DethioCoA und CoA an der Luciferase an derselben Stelle gebunden, aber DethioCoA, das die Thiolgruppe nicht aufweist, hat keine CoA-ähnliche Aktivität.
In den Versuchen, in denen die reziproken Plots erhalten wurden, wurden als Puffer für die Lumineszenz-Assays 30 mM Tricin, 8 mM Magnesiumcarbonat, 10 mM DTT, 0,2 mM EDTA, pH 7,8, eingesetzt. Kristalline P. pyralis-Luciferase, in 10 mg/ml in 10% Ammoniumsulfat und 50% Glycerin, wurde 10 000-fach in dem Puffer, den l0% (v/v) Glycerin und 1 mg/ml Rinderserumalbumin zugesetzt worden waren, verdünnt. Dann wurden für ein Assay 10 μl der Enzymlösung (1 μg/ml Enzym) mit 200 μl des Puffers gemischt; die Lumineszenz wurde durch Injektion von 100 μl Puffer, dem 3 mM Luciferin, 1,5 mM ATP und verschiedener Konzentrationen an CoA und DethioCoA (mit 3 mM DethioCoA: 0,012 mM, 0,06 mM, und 0,3 mM CoA; ohne DethioCoA; 0,012 mM, 0,06 mM, 0,03 mM CoA, und 1,0 mM CoA) zugesetzt waren, in die erhaltenen 210 μl gestartet. Die Lumineszenz wurde mit einem Turner Model 20-Luminometer gemessen.
Es wurde gefunden, daß die Gegenwart von CoA in einer Lösung, in der Licht durch eine Käferluciferase-Luciferin-Reaktion erzeugt wird, die Farbe des erzeugten Lichtes zu kürzeren Wellenlängen verschiebt. Die Farbe dieses Lichtes wird durch die Energiedifferenz zwischen enzymgebundenem, oxidiertem Luciferin im angeregten Zustand und enzymgebundenem, oxidiertem Luciferin im Grundzustand bestimmt. Die Verschiebung zu kürzeren Wellenlängen bedeutet, daß unter den Komplexen von oxidiertem Luciferin und Luciferase im Mittel diese Energiedifferenz durch CoA vergrößert wird. Damit eine derartige Erhöhung der Energie stattfinden kann, muß es einen Komplex des Enzyms mit CoA und oxidiertem Luciferen im angeregten Zustand geben, der einen Anstieg in dem Bruchteil, relativ zu demjenigen in Abwesenheit von CoA, von Komplexen des Enzyms mit angeregtem Oxyluciferen, in dem die Energiedifferenz zwischen dem angeregten und dem Grundzustand-Oxyluciferen höher ist, verursacht. Daß der Effekt von CoA in einem derartigen Komplex der ist, die Struktur des Luciferase-Oxyluciferen-Komplexes zu verändern, wäre im Einklang mit der oben festgestellten Beobachtung, daß Luciferasen mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen, und daher zumindest leicht unterschiedlichen dreidimensionalen Strukturen, beispielsweise von unterschiedlichen Käferarten, die Erzeugung von Biolumineszenz unterschiedlicher Farbe katalysieren.
Die Entdeckung, daß CoA die Wellenlänge des in der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion erzeugten Lichts verringert, wurde in dem folgenden Versuch mit P. pyralis-Luciferase gemacht. In diesen Vergleichen wurde eine erste Lösung hergestellt durch Mischen von 250 μl einer Lösung, enthaltend 0,8 mM CoA, 1,4 mM Luciferin, 1,5 mM ATP und 90 mM DTT in einem Puffer aus 20 mM Tricin, 8 mM Mg²⁺, 0,13 mM EDTA, pH 7,8, mit einer Lösung, die hergestellt worden war durch Mischen von 0,5 μl einer Lösung von P. pyralis-Luciferase (10 mg/ml in 10% Ammoniumsulfat, 50% Glycerin) mit 500 μl Puffer (20 mM Tricin, 8 mM Mg²⁺, 0,13 mM EDTA, pH 7,8). Eine zweite Lösung wurde auf die gleiche Weise, aber ohne CoA oder DTT hergestellt. Die ersten und zweiten Lösungen wurden mit dem Auge beobachtet, während Licht aus der Luciferase-Luciferin-Reaktion erzeugt wurde. Die erste Lösung wies eine leicht aber deutlich grünere Farbe als die zweite Lösung auf.

Claims

Methode zur Feststellung des Vorhandenseins von Käferluciferase in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie die Luciferase enthält, umfassend: a) Zumischung einer wäßrigen Lösung bestehend aus einem Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, Luciferin, Adenosintriphosphat und Mg²⁺, alle in Konzentrationen, die für die Aktivität der Luciferase in der Luciferase-Luciferin-Reaktion effektiv sind, und wobei die wäßrige Lösung keine Luciferase umfaßt, zu einem aliquoten Teil der Probe und b) Messung der Lumineszenz von der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, wobei die sich aus Schritt (a) ergebende Lösung ein Thiolreagens, wobei es sich nicht um CoA handelt, mit einer Konzentration oberhalb von 5 mM umfaßt.
Methode gemäß Anspruch 1, wobei in der sich aus Schritt (a) ergebenden Lösung das Thiolreagens, bei dem es sich nicht um ein CoA handelt, aus der Gruppe ausgewählt wird, die sich aus Dithiothreitol, Dithioerythritol, β-Mercaptoethanol, 2-Mercaptopropanol, 3-Mercaptopropanol, 2,3-Dithiopropanol und Glutathion zusammensetzt.
Methode gemäß Anspruch 2, wobei die Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, CoA umfaßt.
Methode gemäß Anspruch 3, wobei die Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, zusätzlich einen proteinartigen Verstärker der Luciferaseaktivität umfaßt.
Methode gemäß Anspruch 3, wobei das Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, Dithiothreitol ist.
Methode gemäß Anspruch 4, wobei das Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, Dithiothreitol ist und der Verstärker der Luciferaseaktivität Rinderserumalbumin ist.
Methode gemäß Anspruch 5, wobei in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, die Konzentration von CoA zwischen 0,1 mM und 1,0 mM liegt.
Methode gemäß Anspruch 6, wobei in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, die Konzentration von CoA zwischen 0,1 mM und 1,0 mM liegt und die Konzentration des Rinderserumalbumins zwischen 10 μg/ml und 5 mg/ml liegt.
Methode gemäß Anspruch 7, wobei in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, die Konzentration von ATP zwischen 0,1 mM und 1 mM liegt, die Konzentration des Luciferins zwischen 0,1 mM und 1 mM und die Konzentration des Mg²⁺ zwischen 2 mM und 15 mM liegt.
Methode gemäß Anspruch 8, wobei in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, die Konzentration von ATP zwischen 0,1 mM und 1 mM, die Konzentration von Luciferin zwischen 0,1 mM und 1 mM und die Konzentration von Mg²⁺ zwischen 2 mM und 15 mM liegt.
Methode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei der Käferluciferase um die Luciferase von P. pyralis handelt.
Methode gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die Konzentration von Dithiothreitol in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, zwischen 30 mM und 80 mM liegt.
Methode gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei der Käferluciferase um die Luciferase von P. pyralis handelt.
Verwendung eines Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, bei einer Konzentration zwischen 5 mM und 200 mM, zur Erweiterung der Kinetik der Lichterzeugung in der Käferluciferase-Luciferin-Reaktion bei einer Methode zur Feststellung von ATP in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie ATP enthält, umfassend: a) Zumischung einer wäßrigen Lösung bestehend aus dem Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, einer Käferluciferase, Luciferin und Mg²⁺, alle in Konzentrationen, die für die Aktivität der Luciferase in der Luciferase-Luciferin-Reaktion effektiv sind, zu einem aliquoten Teil der Probe und b) Messung der Lumineszenz von der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß Anspruch 14, wobei in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, das Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, aus der Gruppe ausgewählt wird, die sich aus Dithiothreitol, Dithioerythritol, β-Mercaptoethanol, 2-Mercaptopropanol, 3-Mercaptopropanol, 2,3-Dithiopropanol und Glutathion zusammensetzt.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß Anspruch 15, wobei die Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, CoA umfaßt.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß Anspruch 16, wobei die Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, zusätzlich einen proteinartigen Verstärker der Luciferaseaktivität umfaßt.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß Anspruch 16, wobei das Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, Dithiothreitol ist.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß Anspruch 17, wobei das Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, Dithiothreitol und der Verstärker für die Luciferaseaktivität Rinderserumalbumin ist.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß Anspruch 18, wobei in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, die Konzentration von CoA zwischen 0,1 mM und 1,0 mM liegt.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß Anspruch 19, wobei in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, die Konzentration des CoA zwischen 0,1 mM und 1,0 mM und die Konzentration des Rinderserumalbumins zwischen 10 μg/ml und 5 mg/ml liegt.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß Anspruch 20, wobei in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, die Konzentration von CoA zwischen 0,1 mM und 1 mM, die Konzentration von Luciferin zwischen 0,1 mM und 1 mM und die Konzentration von Mg²⁺ zwischen 2 mM und 15 mM liegt.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß Anspruch 21, wobei in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, die Konzentration von CoA zwischen 0,1 mM und 1 mM, die Konzentration von Luciferin zwischen 0,1 mM und 1,0 mM und die Konzentration von Mg²⁺ zwischen 2 mM und 15 mM liegt.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß einem der Ansprüche 14 bis 23, wobei es sich bei der Käferluciferase um die Luciferase von P. pyralis handelt.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß einem der Ansprüche 14 bis 23, wobei die Konzentration von Dithiothreitol in der Lösung, die sich aus Schritt (a) ergibt, zwischen 30 mM und 80 mM liegt.
Verwendung eines Thiolreagens gemäß Anspruch 25, wobei es sich bei der Käferluciferase um die Luciferase von P. pyralis handelt.
Wäßrige Lösung bestehend aus einer Käferluciferase, die in der Lage ist, die Luciferase-Luciferin-Reaktion zu katalysieren, einem Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, in einer Konzentration von zwischen 5 mM und 200 mM und CoA in einer Konzentration zwischen 0,1 mM und 1,0 mM.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 27, wobei das Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, Dithiothreitol in einer Konzentration zwischen 30 mM und 80 mM ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 28, die zusätzlich Rinderserumalbumin in einer Konzentration zwischen 10 μg/ml und 5 mg/ml umfaßt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 29, die zusätzlich 2-Aminoethanol in einer Konzentration von 5 mM bis 50 mM oder Phosphationen in einer Konzentration von 10 mM bis 60 mM umfaßt.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei es sich bei der Käferluciferase um die Luciferase von P. pyralis handelt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 31, die zusätzlich (1) Magnesiumionen in einer Konzentration zwischen 2 mM und 15 mM und (2) entweder eines oder beide Adenosin-Triphosphat(e) in einer Konzentration zwischen 0,1 mM und 1,0 mM und Luciferin in einer Konzentration zwischen 0,1 mM und 1,0 mM umfaßt.
Test-Kit zur Bestimmung des Vorhandenseins einer Käferluciferase in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie eine derartige Luciferase enthält, wobei das Test-Kit eine Luciferase-Luciferin-Reaktionszusammensetzung umfaßt, bei der es sich um eine wäßrige Lösung handelt, die ein Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, in einer Konzentration zwischen 5 mM und 200 mM, Adenosin-Triphosphat, Luciferin und Mg²⁺ umfaßt, wobei die Reaktionszusammensetzung frei von Luciferase ist.
Test-Kit gemäß Anspruch 33, wobei die wäßrige Lösung der Luciferase-Luciferin-Reaktionszusammensetzung ein anderes Thiolreagens als CoA zwischen 30 mM und 80 mM, Adenosin-Triphosphat zwischen 0,10 mM und 1,0 mM, Luciferin zwischen 0,1 mM und 1,0 mM und Magnesiumionen zwischen 2 mM und 15 mM umfaßt.
Test-Kit gemäß Anspruch 34, wobei das Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, Dithiothreitol ist.
Test-Kit gemäß Anspruch 33 zur Bestimmung der Gegenwart einer Käferluciferase in einer Probe einer Säugerzellenkultur, von der angenommen wird, daß sie eine derartige Luciferase enthält, wobei das Kit zusätzlich und getrennt von der Luciferase-Luciferin-Reaktionszusammensetzung eine Zusammensetzung für das Lysieren der Zellen umfaßt, wobei die lysierende Zusammensetzung eine wäßrige Lösung mit einem pH und einer Ionenstärke ist, bei der die Luciferase in der Luciferase-Luciferin-Reaktion aktiv ist, und ein nichtionisches Detergens in einer Konzentration zwischen 0,1% und 10% (Gew.-%), einen proteinartigen Verstärker für die Luciferase-Luciferin-Akti vität in einer Konzentration zwischen 0,1 mg/ml und 5 mg/ml, ein Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, in einer Konzentration zwischen 1 mM und 10 mM und Glycerol oder Ethylenglycol in einer Konzentration zwischen 1% und 50% (Vol.%) umfaßt.
Test-Kit gemäß Anspruch 34 zur Bestimmung des Vorhandenseins einer Käferluciferase in einer Probe einer Säugerzellenkultur, von der angenommen wird, daß sie eine derartige Luciferase enthält, wobei das Kit zusätzlich und getrennt von der Luciferase-Luciferin-Reaktionszusammensetzung eine Zusammensetzung für das Lysieren der Zellen umfaßt, wobei die lysierende Zusammensetzung eine wäßrige Lösung mit einem pH und einer Ionenstärke ist, bei der die Luciferase in der Luciferase-Luciferin-Reaktion aktiv ist, und ein nichtionisches Detergens, bei dem es sich um eine Octoxynol-Mischung mit einer Durchschnittszahl von Ethylenoxy-Einheiten pro Molekül zwischen 9 und 10, in einer Konzentration zwischen 0,1% und 10% (Vol.%) handelt, Rinderserumalbumin in einer Konzentration zwischen 0,1 mg/ml und 5 mg/ml, Dithiothreitol in einer Konzentration zwischen 1 mM und 10 mM und Glycerin oder Ethylenglycol in einer Konzentration zwischen 1% und 50% (Vol.%) umfaßt.
Test-Kit gemäß Anspruch 35 zur Bestimmung des Vorhandenseins einer Käferluciferase in einer Probe einer Säugerzellenkultur, von der angenommen wird, daß sie eine derartige Luciferase enthält, wobei das Kit zusätzlich und getrennt von der Luciferase-Luciferin-Reaktionszusammensetzung eine Zusammensetzung für das Lysieren der Zellen umfaßt, wobei die lysierende Zusammensetzung eine wäßrige Lösung mit einem pH und einer Ionenstärke ist, bei der die Luciferase in der Luciferase-Luciferin-Reaktion aktiv ist, und ein nichtionisches Detergens, bei dem es sich um eine Octoxynol-Mischung mit einer Durchschnittszahl von Ethylenoxy-Einheiten pro Molekül zwischen 9 und 10, in einer Konzentration zwischen 0,1% und 10% (Vol.%), Rinderserumalbumin in einer Konzentration zwischen 0,1 mg/ml und 5 mg/ml, Dithiothreitol in einer Konzentration zwischen 1 mM und 10 mM und Glycerol oder Ethylenglycol in einer Konzentration zwischen 1% und 50% (Vol.%) umfaßt.
Test-Kit gemäß einem der Ansprüche 33 bis 38, wobei es sich bei der Käferluciferase, die der Analyt des Kits ist, um die Luciferase von P. pyralis handelt.
Test-Kit zur Bestimmung des Vorhandenseins von Adenosin-Triphosphat in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie die Verbindung enthält, wobei das Kit eine wäßrige Lösung umfaßt, welche CoA zwischen 0,1 mM und 1,0 mM, eine Käferluciferase, ein Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, in einer Konzentration zwischen 30 mM und 80 mM, Luciferin zwischen 0,1 mM und 1,0 mM und Magnesiumionen zwischen 2 mM und 15 mM umfaßt.
Test-Kit gemäß Anspruch 40, wobei das Thiolreagens, bei dem es sich nicht um CoA handelt, Dithiothreitol ist.
Test-Kit gemäß Anspruch 40 oder 41, wobei es sich bei der Käferluciferase um die Luciferase von P. pyralis handelt.