DE69129421T3 - Interleukin 2 enthaltende rekombinante Immunkonjugate für die Therapie - Google Patents

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Description

  • 1. Einleitung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine auf Antikörperbasis, in denen ein Abschnitt eines Tumorzellen erkennenden Antikörpers mit dem Lymphokin IL-2 verbunden ist, womit ein Verfahren zur Erzeugung einer gezielten, amplifizierten Antitumor-Immmunreaktion bereitgestellt wird.
  • 2. Erfindungshintergrund
  • 2.1. Monoklonale Antikörper als diagnostische und therapeutische Reagenzien
  • Seit der Entwicklung der Zellfusionstechnik zur Herstellung monoklonaler Antikörper (Kohler und Milstein, 1975, Nature 256: 495) haben zahlreiche Forscher ungeheuer viele monoklonale Antikörper hergestellt, von denen viele zuvor unbekannte Antigene definieren. Gleichzeitig sind zahlreiche Techniken zur Erzeugung monoklonaler Antikörper entwickelt worden, so zum Beispiel die B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al, 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (Cole et al., 1985, in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc. S. 77–96).
  • Mittels Hybridomtechnologie können monoklonale Antikörper (Mak) entwickelt werden, die fast jede Determinante oder fast jedes Epitop zu erkennen vermögen. Die Eigenschaft, spezifisch bestimmte Zellen zu erkennen und an diese zu binden, hat die Entwicklung von Mak als diagnostische und therapeutische Reagenzien für eine Vielzahl von Erkrankungszuständen vorangetrieben. Man hat Mak erhalten, die vornehmlich auf Tumorzellen exprimierte Determinanten erkennen (Hellstrom et al, 1984 in "Monoclonal Antibodies and Cancer", Wright et. al. Marcel Dekker, Inc., N.Y., S. 31–47); diese werden zur Zeit klinisch im Hinblick auf Ihre Wirksamkeit als therapeutische Agenzien getestet.
  • 2.2 Verwendung monoklonaler Antikörper als Targeting-Agenzien
  • Die Fähigkeit monoklonaler Antikörper (Mak), Tumorgewebe zu lokalisieren, führte in dem Bemühen, spezifische Moleküle gezielt an Tumorstellen heranzuführen, zur Entwicklung von Mak, die an verschiedenartige Substanzen konjugiert sind (Hellstrom und Hellstrom, 1985, in "Monoclonal Antibodies for Tumor Detection and Drug Targeting," Baldwin et al. Ed., Academic Press, N.Y. S. 17–51). Es wurden Kopplungen durchgeführt, bei denen man Toxine, Wirkstoffe, Radionuklide und Enzyme zur Aktivierung von Prodrugs verwendete. Viele dieser Kopplungen beinhalten, dass die reaktive Einheit chemisch an eine gegebene Antikörperpräparation konjugiert wird; dieses Verfahren kann mühsam sein und Schwankungen unterliegen. (US-Patent Nr. 4,671,958 von Rodwell et al., angemeldet am 09. März 1982, erteilt am 09. Juni 1987).
  • Neuerdings verwendet man rekominante DNA-Techniken, um genetisch veränderte Immunglobinmoleküle herzustellen. Beispielsweise sind Techniken zur Herzustellung chimärer Antikörper entwickelt worden, die Regionen von Immunglobulinmolekülen unterschiedlichen Ursprungs kombinieren (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6581; Sahagan et al., 1986, J. Immunol. 137: 1066; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 214). Gewöhnlich kombinieren chimäre Antikörper eine antigenkombinierende Region (oder variable Region) nichtmenschlichen Ursprungs mit einer konstanten Region menschlichen Ursprungs.
  • Die Technologie chimärer Antikörper ist auf die Herstellung chimärer Moleküle, die Immunoglobulin- und Nichtimmunglobulinabschnitte beinhalten, ausgedehnt worden. Beispielsweise beschreibt die am 03. September 1985 angemeldete und am 13. März 1986 veröffentlichte Internationale Patentanmeldung PCT/GB85/00392 von Neuberger et al. die Herstellung chimärer Antikörper aus Fab-Staphylococcus aureus-Nuclease, Fab-myc, und Fab-Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (siehe auch Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604–608 und Williams und Neuberger, 1986, Gene 43: 319–324). Schnee et al. (1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 6904–6908) beschreibt die Konstruktion eines Hybridmoleküls, welches die variable Region eines Anti-Fibrin-Antikörpers und die katalytische β-Kette des Gewebeplasminogen-Aktivators beinhaltet.
  • Die EP-A-0 305 967 beschreibt tumortherapeutisch einsetzbare Konjugate, in denen ein Cytokin chemisch an ein Antikörpermolekül gekoppelt ist.
  • Die EP-A-0 350 230 beschreibt ein Immunkonjugat zur Krebsdiagnose und Krebstherapie, das einen Anti-I5A8-Antikörper beinhaltet, der chemisch an ein Lymphokin oder Cytokin konjugiert ist.
  • 3. Kurzfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein System zur Erzeugung eines Antikörperfusionsproteins nach Anspruch 1, welches bei der Herstellung rekombinanter Moleküle mit neuer, klinisch relevanter biologischer Aktivität brauchbar ist. Die erfindungsgemäßen Antikörperfusionsproteine können therapeutisch verwendet werden, um biologisch aktive Liganden an ein gewünschtes Gewebe abzugeben.
  • Das erfindungsgemäße Antikörperfusionsprotein umfasst einen biologisch aktiven Liganden, nämlich das Lymphokin Interleukin-2. Da Interleukin-2 die Lymphocytenproliferation induziert, kann ein fusionierter Antikörper, der Interleukin-2 (IL-2) gezielt an bösartiges oder infiziertes Gewebe heranführt, zu einer lokalen Verstärkung der Immunreaktion gegen das erkrankte Gewebe führen und dadurch die Zerstörung des infizierten oder bösartigen Gewebes erleichtern. Gemäß einer speziellen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein fusionierter Antikörper hergestellt, der eine variable Region des monokonalen Antitumorantigen-Antikörpers L6 und aktives IL-2 umfasst.
  • Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen betreffen die Verwendung des Fusionsproteins zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzung für die Behandlung von Tumoren und rekombinante DNA-Moleküle, die das Fusionsprotein codieren.
  • 4. Beschreibung der Figuren
  • 1: Diagramm zur Insertion von CH1 in pUC18-Vector.
  • 2: Diagramm zur Insertion von PF-4-cDNA in CH1, Hinge-tragenden Vector.
  • 3: Diagramm zur Insertion eines Konstrukts in einen Säuger-Expressionsvektor.
  • 4: Herstellung von PF-4/L6-Fusionsprotein durch Zellinien, die mit PF-4/L6-Expressionsvektor transfiziert sind, gemessen anhand der Reaktivität mit Anti-L6-Idiotyp-Antikörper.
  • 5: Inhibition der Bindung von Anti-PF-4-Antikörper an PF-4/L6-Fusionsprotein durch zunehmende Konzentrationen an freiem PF-4.
  • 6: Diagramm zur Strategie für die Erzeugung von IL-2/L6-Fusionsproteinen. (a) Insertion von IL-2-cDNA in pUC18-Vektor, der CH1 und 3'-nichttranslatierte Regionen (3'uT) aus dem Maus-Immunglobulingenlocus mit einfügten Hinge/Linker-Sequenzen enthält; (b) fertiger Expressionsvektor, der den SV40ori-Promoter und das neo-Resistenzgen beinhaltet.
  • 7: Genaue (a) Hinge- und (b) Hinge-Linker-Sequenzen.
  • 8: Verfahren zur Herstellung von IL-2-cDNA zum Klonieren.
  • 9: Mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifizierter, codierender Abschnitt von IL-2.
  • 10: Chimärer Leichtkettenvektor, der mit pIL-2/L6 cotransfiziert ist.
  • 5. Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein System zur Erzeugung therapeutischer Antikörperfusionsproteine. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung therapeutische Antikörperfusionsproteine sowie rekombinante DNA-Moleküle, die bei deren Herstellung verwendet werden. Zwecks einer klaren Offenbarung und nicht zur Beschränkung wird die genaue Beschreibung der Erfindung in die folgenden Abschnitte untergliedert:
    • (i) Konstruktion rekombinanter Gene, die Antikörperfusionsproteine codieren;
    • (ii) Expression von Antikörperfusionsproteinen; und
    • (iii) Brauchbarkeit der Erfindung
  • 5.1. Konstuktion rekombinanter Gene, die Antikörperfusionsproteine codieren
  • Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine auf Antikörperbasis umfassen (i) einen Abschnitt eines Immunglobulinmoleküls mit der Fähigkeit, das Fusionsprotein gegen eine Tumorzelle oder ein Tumor-assoziiertes Antigen zu richten, (ii) ein Interleukin-2-Molekül und eine modifizierte Version der Sequenzen aus der Hinge-Region von humanem IgG1, wie in Anspruch 1 definiert. Die das erfindungsgemäße Antikörperfusionsprotein codierenden, rekombinanten Gene können konstruiert werden, indem man eine beliebige dem molekularbiologischen Fachmann bekannte Technik verwendet; hierzu gehört die folgende, ohne darauf beschränkt zu sein.
  • Der Targeting-Abschnitt des Moleküls kann die gesamte oder einen Teil der variablen Region eines Immunglobulins beinhalten, welche ihrerseits aus Regionen bestehen kann, die durch ein V-Gen und/oder D-Gen und/oder J-Gen codiert werden. Die modifizierten Sequenzen aus der Hinge-Region sorgen für Flexibilität zwischen den globulären Domänen des Fusionsproteins auf Antikörperbasis. Ein funktionelles Hinge kann für den Erhalt der Targeting-Fähigkeit wichtig sein. Variable Regionen von Antikörpern, insbesondere von monoklonalen Antikörpern, die tumorspezifisch Antigene erkennen, können in erfindungsgemäßen Fusionsproteinen verwendet werden.
  • Zu den Liganden, die in die erfindungsgemäßen Fusionsproteine auf Antikörperbasis eingebaut werden können, zählt beispielsweise Interleukin-2 (Weil-Hillman et al., 1988, J. Biol. Response Mod. 7: 424).
  • Rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die das Immunglobulin oder Lymphokin codieren, können mit jedem dem Fachmann bekannten Verfahren (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) oder aus öffentlich zugänglichen Klonen erhalten werden. Eine Lymphokin codierende Nukleinsäure kann beispielsweise folgendermaßen erhalten werden. Eine bekanntermaßen den Faktor aktiv exprimierende Zellpopulation kann erhalten werden, und die gesamte zelluläre RNA kann daraus gewonnen werden. Die Aminosäuresequenz des Faktors kann dazu verwendet werden, die Sequenz des Nukleinsäureabschnittes des Faktors abzuleiten, um geeignete Oligonukleotid-Primer zu gestalten; alternativ können die Oligonukleotid-Primer aus bekannten, den Faktor codierenden Nukleinsäuresequenzen erhalten werden. Das Oligonukleotidfragment kann dann zusammen mit einer Reversen Transkriptase zur Herstellung von cDNA verwendet werden, die der faktorcodierenden Nukleotidsequenz entspricht (Okayama et al., 1987, Methods Enzymol. 154: 3–29). Die cDNA kann dann kloniert werden, und/oder Abschnitte der faktorcodierenden Region können dann aus dieser cDNA amplifiziert werden, indem man die Polymerase-Kettenreaktion und zweckmäßige Primersequenzen verwendet (Saiki et al., 1988, Science 24: 487–491).
  • Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann ein rekombinantes Vektorsystem geschaffen werden, um Sequenzen aufzunehmen, die den Liganden im korrekten Leserahmen mit der modifizierten Version der Hinge-Region gemäß Anspruch 1 codieren. Gemäß einer speziellen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das die CH1-Domäne von humanem IgG1 codierende Exon der konstanten Region als HindIII-PstI-Fragment in den Vektor pUC18 kloniert werden, woran die modifizierte Version humaner Hinge-Region-Sequenzen von humanem IgG1 angeschlossen werden kann, indem man standardisierte restriktionsenzymatische Techniken verwendet. In der modifizierten Version der humanen Hinge-Region sind die beiden Cysteinreste, die normalerweise die Disulfidbrückenbindung zwischen den Ketten vermitteln, durch Codons ersetzt, die für Prolin und Serin stehen, um dem Fusionsmolekül größere Flexibilität zu verleihen; gemäß dieser speziellen Ausführungsform kann die Sequenz der Hinge-Region EPKSCDKTHTPPPSPGRVVGGRA sein.
  • Darüber hinaus kann es wünschenswert sein, als Teil des rekombinanten Vektorsystems Nukleinsäuren miteinzubeziehen, die der 3'-flankierenden Region eines Immunglobulingens – RNA-Schnitt-/Polyadenylierungsstellen und stromabwärts gelegene Sequenzen eingeschlossen – entsprechen; gemäß einer speziellen erfindungsgemäßen Ausführungsform stellt diese Nukleotidsequenz die mRNA mit der 3'-nichttranslatierten Region der Sekretionsform des murinen Cμ-Gens zur Verfügung. Außerdem kann es wünschenswert sein, stromaufwärts der Antikörperfusionsprotein codierenden Sequenzen eine Signalsequenz vorzusehen, um die Sekretion des Fusionsmoleküls aus der mit dem rekombinanten Vektor transformierten Zelle zu erleichtern.
  • Nukleinsäuresequenzen, welche die verschiedenen Komponenten des erfindungsgemäßen Fusionsproteins auf Antikörperbasis codieren, können miteinander verbunden werden, indem man jede dem Fachmann bekannte Technik verwendet – restriktionsenzymatische Methoden und die Verwendung synthetischer Linker-Sequenzen eingeschlossen.
  • Um für eine adäquate Transkription des erfindungsgemäßen rekombinaten Konstruktes zu sorgen, kann vorzugsweise eine geeignete Promoter/Enhancer-Sequenz in den rekombinanten Vektor eingebaut werden. Zu den Promotern, die zur Expressionskontrolle des Fusionsproteins auf Antikörperbasis verwendet werden können, gehören die SV40-Früher-Promoter-Region (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 24: 304–310), der im "3' long terminal repeat" vom Rous-Sarkomvirus enthaltende Promoter (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787–797), der Herpes-Thimidinkinase-Promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 144–145), die regulatorischen Sequenzen des Metallthionin-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42); prokaryotische Expressionssysteme, wie der LAC- oder β-Laktamase-Promoter (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727–3731), oder der tac-λ-Phagen-Promoter (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21–25, siehe auch "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94); Pflanzen-Expressionsvektoren, welche die Nopalinsynthetase-Promoterregion (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209–213) oder den Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-RNA-Promoter (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871) enthalten, und der Promoter für das photosynthetische Enzym Ribulosebiphosphatcarboxylase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310: 115–120); Promoterelemente aus Hefe oder anderen Pilzen, wie der Gal-4-Promoter, der ADC(Alkohol-Dehydrogenase)-Promoter, der PGK(Phosphoglycerolkinase)-Promoter, der Alkalische-Phosphatase-Promoter und die folgenden tierischen transkriptionellen Kontrollregionen, die Gewebespezifität aufweisen und in transgenen Tieren verwendet worden sind: die in pankreatischen acinösen Zellen aktive Elastase I-Genkontrollregion (Swift et al., 1984, Cell 38: 639–646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399–409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425–515); die in pankreatischen Betazellen aktiven Insulingen-Enhancer oder -promotoren (Hanahan, 1985, Nature 31: 115–122), die in Lymphoidzellen aktiven Immunglobulin-Enhancer oder -Promotoren (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647–658; Adames et al., 1985, Naure 318: 533–538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444), die Cytomegalovirus-Früher-Promoter- und -Enhancerregionen (Boshart et al., 1985, Cell 41: 521–530), die in Testicular-, Brust-, Lymphoid- und Mastzellen aktive Kontrollregion des Maus-Brusttumorvirus (Leder et al., 1986, Cell 45: 485–495), die in Leber aktive Albumingen-Kontrollregion (Pinkert et al., 1987, Genes und Devel. 1: 268–276), die in Leber aktive Alpha-Fetoproteingen-Kontrollregion (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53–58); die in Leber aktive Alpha-1-Antitrypsingen-Kontrollregion (Kelsey et al, 1987, Genes und Devel. 1: 161–171), die in Myeloidzellen aktive Beta-Globingen-Kontrollregion (Mogram et al., 1985, Nature 31: 338–340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89–94); die in Oligodendrocytzellen im Gehirn aktive Kontrollregion des Gens für das Myelin-Basisches-Protein (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703–712); die im Skelettmuskel aktive Kontrollregion des Myosin-Leichtkette-2-Gens (Sani, 1985, Naure 314: 283–286) und die im Hypothalamus aktive Kontrollregion des Gens für das Gonadotrope-Freisetzungshormon (Mason et al., 1986, Science 234: 1372–1378).
  • Ein erfolgreicher Einbau von Fusionsgenkonstrukten auf Antikörperbasis kann durch drei allgemeine Ansätze nachgewiesen werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von "Marker"-Genfuktionen und (c) Expression insertierter Sequenzen. Bei dem ersten Ansatz kann das Vorhandensein eines in einen Expressionsvektor insertierten Fremdgens durch DNA-DNA-Hybridisierung nachgewiesen werden, indem man Sonden verwendet, die zu dem insertierten Antikörperfusionsprotein-Gen homologe Sequenzen beinhalten. Bei dem zweiten Ansatz kann die Identifizierung und Auswahl des rekombinanten Vektor/Wirt-Systems darauf gestützt werden, ob bestimmte auf die Insertion eines Fremdgens in den Vektor zurückgehende "Marker"-Genfunktionen (beispielsweise Thymidinkinaseaktivität, Antibiotikaresistenz, wie G418, Phenotyptransformation, Bildung von Einschlußkörpern in Baculovirus, etc.) vorhanden sind. Wird beispielsweise das Antikörperfusionsgen so insertiert, daß es die Markergensequenz des Vektors unterbricht, so können diejenigen Rekombinanten, die das insertierte Antikörperfusionsgen enthalten, anhand der nicht vorhandenen Markergenfunktion identifiziert werden. Bei dem dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren identifiziert werden, indem man das rekombinant exprimierte Produkt testet. Derartige Tests können beispielsweise auf die physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Antikörperfusions-Genproduktes in den unten beschriebenen biologischen Testsystemen gestützt werden.
  • Sobald ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül identifiziert und isoliert ist, können mehrere dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden, um es zu vermehren. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und geeignete Wachstumsbedingungen etabliert sind, können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und quantitativ hergestellt werden. Wie zuvor beschrieben gehören zu den verwendbaren Expressionsvektoren die folgenden Vektoren und deren Abkömmlinge, ohne darauf beschränkt zu sein: humane oder tierische Viren, wie Vacciniavirus, Adenovirus oder retrovirale Vektoren; Insektenviren wie Baculovirus; Hefevektoren; Bakteriophagen-Vektoren (z. B. Lambda), und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige zu nennen.
  • Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform können die Promoter/Enhancer- und 3'-regulatorischen Sequenzen allesamt von Immunglobulingenen abgeleitet werden.
  • 5.2. Expression von Antikörperfusionsproteinen
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte können in Wirtszellen mit der Fähigkeit, das Fusionsprotein auf Antikörperbasis zu exprimieren, eingebracht werden, indem man jedes dem Fachmann bekannte Verfahren anwendet; dazu gehören die Transformation (indem man beispielsweise DEAE-, Dextran- oder Kalziumphosphat-Techniken verwendet), die Transfektion, die Mikroinjektion, die Infektion, die Genkanone und die Elektroporation. Jeder Wirtszelltyp kann verwendet werden, vorausgesetzt die rekombinanten Nukleinsäuresequenzen des Fusionsproteins auf Antikörperbasis werden in diesem Zelltyp adäquat in mRNA transkribiert. Gemäß einer speziellen erfindungsgemäßen Ausführungsform können Maus-Myelomzellinien verwendet werden, die keine Immunglobuline produzieren, wie Sp2/0 oder Ag8.653. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte verwendet werden, um nichthumane transgene Tiere zu schaffen, welche die Fusionsproteine auf Antikörperbasis herzustellen vermögen. Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Lymphoidzelle. Gemäß einer speziellen erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Wirtszelle ein Hybridom, das von einer Immunglobulin-Leichtketten exprimierenden Variante mit Verlust der Schwerkette abgeleitet ist. Gemäß dieser Ausführungsform ist es besonders bevorzugt, dass das Ausgangshybridom die Quelle desjenigen monoklonalen Antikörpers ist, der die Immunglobulinabschnitte des Fusionsproteins auf Antikörperbasis beinhaltet. Somit kann die Leichtketten produzierende Zellinie, die von einem den monoklonalen Antikörper "X" produzierenden Hybridom abgeleitet ist, beispielsweise mit rekombinanter DNA transfiziert werden, die ein Fusionsprotein auf Antikörperbasis codiert, welches eine variable Region des monoklonalen Antikörpers "X" beinhaltet; das Fusionsprotein auf Antikörperbasis kann mit endogener Leichtkette kombinieren und dadurch die Antigenbindungsstelle des monoklonalen Antikörpers "X" neu bilden.
  • Alternativ können rekombinante Nukleinsäuren, die sowohl Fusionsprotein auf Antikörperbasis als auch entsprechende oder kompatible Immunglobulin-Leichtkette codieren, in eine Zellinie, die vorzugsweise lymphoiden Ursprungs ist, cotransfiziert werden. Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform können die Antikörperfusionsprotein codierenden Sequenzen in den Immunglobulinlocus einer Lymphoid-Zellinie durch homologe Rekombination eingesetzt werden, und zwar in Anlehnung an diejenigen Verfahren, die in der durch Bristol-Myers Comp. am 27. Oktober 1988 eingereichten EP-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 315 062, auf die in vollem Umfang Bezug genommen wird, angegeben sind.
  • Durch die Wirtszellen hergestellte Fusionsproteine auf Antikörperbasis können gewonnen werden, indem man jede dem Fachmann bekannte Technik verwendet; hierzu gehört die Affinitätschromtatographie, wobei Targetantigene oder Antikörper verwendet werden, die spezifisch für einen beliebigen Teil des Fusionsproteins sind, wie beispielsweise antiidiotypische Antikörper. Die Aktivität des fusionierten Lymphokins kann bestätigt werden, indem man biologische Tests verwendet, welche die Aktivität des Lymphokins nachweisen oder messen. Beinhaltet das Antikörperfusionsprotein IL-2, so kann das Vorhandensein von IL-2-Aktivität in Tests bestätigt werden, welche die T-Zellproliferation nachweisen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt dimere Immunglobulinmoleküle sowie monomere oder multimere Moleküle zur Verfügung, die Fusionproteine auf Antikörperbasis beinhalten.
  • 5.3 Brauchbarkeit der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Fusionsproteine auf Antikörperbasis zur Verfügung, die verwendet werden können, um IL-2 an spezifische Target-Zellen oder Target-Gewebe abzugeben.
  • Gemäß verschiedener erfindungsgemäßer Ausführungsformen kann ein Antikörperfusionsprotein Sequenzen variabler Regionen beinhalten, die ein tumorspezifisches Antigen erkennen. Gemäß einer speziellen erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Sequenzen der variablen Regionen von L6 abgeleitet, einem monoklonalen Antikörper, der mit einem Antigen reagiert, das auf humanen Nicht-Kleinzell-Lungenkarzinomen und einer Reihe anderer Karzinome, zu denen Brust- und Colonkarzinome zählen, vorkommt. Da das Antikörperfusionsmolekül, welches ein tumorspezifisches Antigen erkennt, auch IL-2 beinhaltet, kann es verwendet werden, um die Immunreaktion im Tumorzellgebiet zu verändern. Wie beispielsweise unten im Beispielabschnitt 7 gezeigt, behält ein IL-2 und die variable Region von L6 beinhaltendes Antikörperfusionsprotein IL-2-Aktivität. Das IL-2/L6-Fusionsprotein kann verwendet werden, um IL-2 gezielt an Tumorzellen heranzuführen; folglich werden aktivierte T-Zellen in der Nähe des Tumors zur Proliferation angeregt, wodurch die Antitumor-Immunreaktion verstärkt wird. Es ist anzumerken, dass derzeit eine Immuntherapie oftmals die systemische Verabreichung von Lymphokinen bei einer Konzentration mit sich bringt, welche die Antitumoraktivität wirksam boosten soll, die aber notwendigerweise Lymphocyten und Gewebe überall im Körper beeinflusst. Für den Fall des IL-2 können schwere und möglicherweise fatale klinische Reaktionen auftreten. Die vorliegende Erfindung bietet den Vorteil, die systemische Belastung durch das Lymphokin zu verringern; Antikörper-vermitteltes Targeting ermöglicht es, insgesamt weniger Lymphokin zu verabreichen und senkt erheblich die Lymphokinbelastung von nichttumorösem Gewebe, wodurch toxische Wirkungen minimiert werden.
  • Die Antikörperfusionsproteine können einem Patienten, der einer derartigen Behandlung bedarf, in jedem sterilen pharmazeutischen Träger verabreicht werden, mit dem die Löslichkeit und Aktivität des Proteins erhalten bleiben. Es kann wünschenswert sein, Antikörperfusionsproteine zusammen mit anderen Behandlungsmodalitäten zu verabreichen, so zum Beispiel Antikörper und/oder Antikörperfusionsproteine, die weitere Wachstumsfaktoren beinhalten.
  • 6. Beispiel: Konstruktion und Expression eines Plättchenfaktor-4/L6-Antikörperfusionsproteins mit Plättchenfaktor-4-Aktivität (nicht Teil der vorliegenden Erfindung)
  • 6.1. Materialien und Methoden
  • 6.1.1. Konstruktion einer Expressionskassette für eine Fusionsprotein auf Antikörperbasis
  • Es wurde ein rekombinantes Vektorsystem zur Aufnahme von Sequenzen geschaffen, die im korrekten Leserahmem mit der Hinge-Region der konstanten Region von humanem IgG1 die neue Proteinstruktur codierten. Zunächst wurde das Exon der konstanten Region, das die CH1-Domäne von humanem IgG1 codierte, als HindIII/PstI-Fragment in den Vektor pUC18 kloniert (1). Stromabwärts dieser Sequenzen wurde ein 1.6 kb PstI/KpnI-Fragment kloniert, das einen Abschnitt der 3'-flankierenden Region des murinen Cμ-Gens enthielt, welches diejenigen Schnitt/Polyadenylierungsstellen von RNA mit einbezog, die bei der Expression von mRNA, welche die sekretorische Form der IgM-Schwere-Kette codierte, verwendet wurden. Zwischen den beiden Fragmenten wurde ein Abschnitt des Vektor-Polylinkers für anschließende Einfügungen erhalten.
  • Es wurde ein Oligonukleotidpaar erzeugt, das bei Anlagerung eine modifizierte Version der Sequenzen für die humane Hinge-Region von humanem IgG1 codierte. Die beiden Cysteine, die normalerweise Disulfidbrücken zwischen den Schwerketten vermitteln, wurden durch Codons ersetzt, die für Prolin und Serin standen, und es wurden mehrere Aminosäuren an den C-Terminus angefügt, so daß die vollständige Sequenz der Hinge-Region EPKSCDKTHTPPPSPGRVVGGRA war. Das angelagerte Oligonukleotidpaar besaß einen PstI-kompatiblen Überhang am 5'-Ende, bezog die normale Spliceakzeptorstelle für das Hinge-Exon mitein und erhielt einen weiteren zum Verbinden mit zusätzlichen Oligonukleotiden am 3'-Ende geeigneten Überhang. Ein zweites Oligonukleotidpaar wurde so gestaltet, dass es mit dem ersten Set überlappte und kompatible Enden zur Ligation mit einem NcoI-Überhang zur Verfügung stellte.
  • 6.1.2 Insertion von Plättchenfaktor-4 codierenden Sequenzen in die Antikörperfusionsprotein-Kassette
  • Der humanen Plättchenfaktor-4 codierende cDNA-Klon (PF4) wurde im Leserahmen mit der Hinge-Region als NcoI/BamI-Fragment zur Ligation in die PstI/BamI-Stellen des Vektors mit den beiden Oligonukleotidpaaren am 5'-Ende verbunden (2). Das Fusionskonstrukt wurde dann in einen Vektor transferiert, der einen dominant selektierbaren Marker (NEO) zur Expression in Säugerzellen enthielt (3). Dann wurde stromaufwärts ein Gensegment insertiert, das eine variable Region der Schwerkette mit der gewünschten Spezifität kodierte.
  • 6.1.3 Expression des Plättchenfaktor-4/L6-Fusionsproteins
  • Das Konstrukt wurde in eine murine Myelomzellinie transfiziert, welche die chimäre Leichtkette exprimierte, und die Überstände wurden auf die Produktion von Schwer/Leicht-zusammengefügtem Protein gescreent, indem man antiidiotypische Antikörper verwendete, die für Determinanten der L6-V-Region spezifisch waren. Es wurden Klone etabliert, die im Test auf das Vorhandensein von zusammengefügter Schwer- und Leichtkette positiv waren.
  • 6.2 Resultate und Diskussion
  • Das erste Beispiel eines durch dieses Konzept erzeugten Immunglobulin-Fusionsproteins baute die Sequenz von humanem Plättchenfaktor-4 stromabwärts als Teil der chimären Schwerkette von L6 ein. Es wurde berichtet, dass Plättchenfaktor-4 mehrere interessante biolgische Aktivitäten aufweist, wozu die Bindung an Heparin, die Antagonisierung der Angiogenese, die Inhibierung der Entwicklung von Supressor-T-Lymphocyten, die Chemotaxis für inflammatorische Zellen, etc. gehören.
  • Für die beiden Klone sind die Wachstums- und Produktionscharakteristika (mit dem Id/Id-Test bestimmt) in 4 gezeigt. Einem Vergleich mit gereinigtem chimären L6 als Standard kann man entnehmen, dass erhebliche Mengen an Id-aufweisendem Protein produziert werden, wenn auch betont werden sollte, dass chimäres L6 ein bivalentes Molekül ist, das in diesem Test wahrscheinlich etwas anders reagiert als ein chimärer F(ab).
  • Man verwendete Kulturüberstände aus einer klonalen Zellinie, um die PF4-Natur des Schwerketten-Fusionsproteins zu etablieren. ELISA-Platten wurden mit Ziegen-Antisera beschichtet, die für humanen Plättchenfaktor-4 spezifisch waren (freundlicherweise von Dr. Karen Kaplan, Columbia University überlassen). Dann wurde Überstand aus dem produzierenden Klon in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an gereinigtem PF4-Protein (Sigma) oder lediglich Medium gemeinsam zugegeben. Anschließend wurde die Platte mit dem biotinylierten, antiidiotypischen 13B, der eine kombinatorische Determinante von L6 erkennt, und Avidin-HRP (TAGO) entwickelt. 5 zeigt eine Auftragung der prozentualen Inhibition des detektierbaren Signals gegen ansteigenden Mengen an PF4-Protein. Es wurde keine Inhibition bei Coinkubation mit chimärem L6-Protein beobachtet.
  • Da PF4 normalerweise an Heperin zu binden vermag, wurde diese biologische Aktivität für das zusammengesetzte Fusionsprotein bestimmt. Kulturüberstand oder Medium, mit chimärem L6-Protein versetzt, wurde an Heparin-Sepharose adsorbiert. Die Menge an zusammengesetztem Protein wurde mit einem Anti-Id-Test gemessen, der die Gegenwart von Leichtkette und kombinatorischer Determinanten erfordert (Fangantikörper 15B und biotinylierten Nachweisantikörper 14B). Die Konzentration vor und nach Inkubation mit Heparin-Sepharose ist in Tabelle 1 gezeigt.
  • TABELLE 1
    Figure 00130001
  • Es zeigte sich, dass mehr als 95% des zusammengefügten Ig-Fusionsproteins durch Heparain entfernt werden konnten, eine Eigenschaft, die nicht mit dem chimären L6-Molekül zusammenhängt. Mit einer FACS-Analyse konnte gleichermaßen gezeigt werden, daß das L6/PF4-Fusionsprotein an humane Tumorzellen band, wobei man Antisera verwendete, die für humanes Fab oder humanes PF4 spezifisch waren.
  • Diese Untersuchungen zeigen, dass das hier beschriebene Basiskonzept brauchbar ist, um Schwerketten-Fusionsproteine zu erzeugen, die duale Eigenschaften behalten und in vernünftigen Mengen exprimiert werden können.
  • 7. Beispiel: Konstruktion und Expression eines Interleukin-2/L6-Antikörperfusionsproteins mit Interleukin-2-Aktivität
  • 7.1 Materialien und Methoden
  • 7.1.1 Konstruktion eines Expressionsvektors für das IL-2-Antikörperfusionsprotein
  • Es wurde eine geringfügig abweichende Strategie zur Erzeugung von L6/IL-2-Fusionsprotein eingesetzt, siehe 6. Diese Konstrukte gingen von dem gleichen in 2 gezeigten pUC18C gamma_13'UT aus. Dieser Vektor wurde mit PstI und BamHI geöffnet, um drei DNA-Fragmente aufzunehmen. Bei dem ersten Fragment handelte es sich um ein Oligonukleotidpaar, das eine modifizierte Version der humanen Hinge-Region codierte, in welcher die Cysteine, die normalerweise intermolekulare Brücken zu einer anderen Schwerkette vermitteln, durch Codons ersetzt worden sind, die für Prolin und Serin standen (in 7 als Hinge gezeigt). Der zweite Abschnitt wurde durch ein weiteres Oligonukleotidpaar (Linkersequenz des IL-2-Hinge-Gens in 7) gebildet, das einen 5'-kompatiblen Überhang mit dem des Hinge-Paares und einen mit NcoI kompatiblen 3'-Überhang aufwies. Diese Restriktionsstelle schloss ein für Methionin stehendes Codon ein; sie wurde verwendet, um das PF4-Gens in bakterielle Expressionvektoren zu klonieren. Bei der dritten Komponente handelte es sich um dasjenige Segment, das die gewünschte Effektorfunktion (neues Gen in 6) mit einem NcoI-Überhang am 5'-Ende und einem BamHI-Überhang am 3'-Ende zur vollständigen Ligation in den Vektor codierte.
  • Es wurde ein weiteres Konstrukt geschaffen, indem man Oligonukleotide verwendete, die jedes der drei normalerweise in der Hinge-Region von humanem IgG1 vorhandenen Cysteine codierten, die aber ein Stopcodon unmittelbar im Anschluss an die Hinge-Sequenz aufwiesen (7 (Fab')2).
  • Jede zusammengesetzte Sequenz wurde dann als HindIII/EcoRI-Fragment in einen Vektor transferiert, der ein dominant selektierbares Gen (NEO) zur Transfektion in eukaryotische Zellen enthielt. Im Anschluss an diesen Schritt wurden stromaufwärts entweder das klonierte Fragment, das die variable Region der Schwerkette von L6 codierte, oder das 2.3 kb HindIII-Fragment, das zum direkten Gen-Targeting an den IgH-Locus verwendet wurde, kloniert.
  • Für den Fall des IL-2 wurde die codierende Region erzeugt, indem man die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendete. Die gesamte Ablauf ist in 8 dargestellt. Periphere Blutzellen aus normalen menschlichen Spendern wurden sechs Stunden mit Anti-CD3 und Anti-CD28 stimuliert, um innerhalb der Population die Produktion von IL-2-RNA durch die T-Zellen auszulösen. Die gesamte zelluläre RNA wurde dann aus diesen Zellen extrahiert, und eine Einzelstrang-cDNA-Kopie der IL-2-Message wurde erzeugt, indem man den in 8 gezeigten IL-2-3'-Primer verwendete. Der in 9 spezifizierte Abschnitt der IL-2-codierenden Region wurde aus dieser cDNA durch die Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, indem man die Primer IL-2-5' und IL-2-3' verwendete (8). Der 3'-Abschnitt jedes Primers war zur IL-2-Sequenz vollkommen homolog, während die 5'-Region jedes Primers einen Missmatch aufwiess, um eine NcoI-Stelle am 5'-Ende und eine BamHI-Stelle am 3'-Ende des fertigen Produktes mit einzubeziehen. Dieses PCR-Produkt wurde als stumpfendiges Fragment in die SmaI-Stelle von pUC19 zur Sequenzierung kloniert. Sobald die IL-2-Sequenz bestätigt war, wurde die codierende Region, wie oben beschrieben, als NcoI/BamHI-Fragment in das pUC18Cgamma_13'UT-Plasmid eingefügt.
  • 7.2. Resultate und Diskusion
  • 7.2.1. Expression von IL-2/L6-Antikörperfusionsprotein
  • Der L6/IL-2-Schwerketten-Fusionsvektor wurde zusammen mit dem in 10 gezeigten Vektor für chimäre Leichtkette entweder in die nicht Ig produzierende, murine Plasmacytomzellinie Ag8.653 oder Sp2/0 cotransfiziert. Zur Selektion verwendete man G418; resistente Zellpopulationen wurden auf die Produktion von Schwer- und Leichtkette getestet, indem man ein Paar antiidiotypischer Antikörper verwendete, wobei einer für die variable Region der Leichtkette von L6 spezifisch und der andere für die variable Region der Schwerkette von L6 spezifisch war. Für die weitere Untersuchung wurde ein einzelner Klon aus der Ag8-Transfektion (103A4) gewählt.
  • 7.2.2. Untersuchungen zur bifunktionellen Aktivität des Fusionsproteins
  • Kulturüberstände aus dieser Zellinie wurden verwendet, um die duale Funktionalität des Fusionsproteins in folgender Weise darzulegen. Die humanen Tumorzellen (1 × 104), die das L6-Antigen aufwiesen, wurden bestrahlt und entweder mit Medium, 20 μ/ml chimärem L6, 103A4-Überstand, Überstand plus 20 μ/ml murinem L6-Antikörper oder Überstand plus 20 μ/ml L6-antiidiotypischem 14B inkubiert. Die Zellen wurden 30 Minuten auf Eis inkubiert, gewaschen und dann mit 2 × 104 CTLL-2-Zellen, die als Reaktion auf IL-2 proliferieren, vermischt. Die Proliferation wurde als Funktion der 3H-Thymidinaufnahme mit folgenden Resultaten gemessen:
  • TABELLE II
    Figure 00160001

Claims (6)

  1. Rekombinantes Fusionsprotein auf Antikörperbasis, umfassend (i) einen Abschnitt eines Immunglobulinmoleküls mit der Fähigkeit, das Fusionsprotein gegen eine Tumorzelle oder ein Tumor-assoziiertes Antigen zu richten, (ii) ein Interleukin 2-Molekül, das zur Förderung der Lymphozytenproliferation befähigt ist, und (iii) eine modifizierte Version der Sequenzen aus der Hinge-Region von humanem IgG1, worin die beiden Cysteinreste, die normalerweise die Disulfidbrückenbindung zwischen den Ketten vermitteln, durch Prolin und Serin ersetzt sind, um dem Fusionsmolekül größere Flexibilität zu verleihen.
  2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei der Abschnitt des Immunglobulinmoleküls die Bindung des monoklonalen Antikörpers L6 kompetitiv inhibiert.
  3. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Abschnitt des Immunglobulinmoleküls die vom monoklonalen Antikörper L6 abgeleitete variable Region ist.
  4. Verwendung wenigstens eines Fusionsproteins auf Antikörperbasis nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung von Tumoren.
  5. Verwendung nach Anspruch 4 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Verstärkung einer Antitumor-Immunreaktion.
  6. Rekombinantes DNA-Molekül, das für ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
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