DE69027526T3

DE69027526T3 - Herstellung von proteinen mittels homologer rekombination

Info

Publication number: DE69027526T3
Application number: DE69027526T
Authority: DE
Inventors: Arthur I. Larchmont SKOULTCHI
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1989-11-06
Filing date: 1990-11-06
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2010-11-07
Also published as: CA2045175A1; ATE139574T1; GR3029328T3; US6015708A; GR3021105T3; NO912642L; DE69032809T2; EP0945515A2; KR100233781B1; ES2127458T3; JPH04505104A; US5981214A; SG88714A1; EP0452484B1; EP0747485A1; JP2001186897A; WO1991006667A1; ES2090297T5; DE69027526T2; WO1991006666A1

Description

Das Gebiet der vorliegenden Erfindung ist die Expression von Säugetierproteinen.
Die Entdeckung von Restriktionsenzymen, des Klonierens, des Sequenzierens, der Reversen Transkriptase und von monoklonalen Antikörpern hat dazu geführt, dass es außergewöhnliche Möglichkeiten zum Isolieren, Identifizieren und Manipulieren von Nukleinsäuresequenzen gibt. Als Ergebnis dieser Möglichkeiten sind zahlreiche Gene und ihre Transkriptionssteuerungselemente identifiziert und manipuliert worden. Die Gene sind verwendet worden, um große Mengen eines gewünschten Proteins in heterologen Wirten (bakteriellen und eukaryotischen Wirtszellensystemen) zu produzieren.
In vielen Fällen war das Verfahren zum Erhalten von Kodiersequenzen und Hervorrufen ihrer Expression langwierig und mühsam. Das Identifizieren der Kodiersequenz, entweder cDNA oder genomische DNA, war häufig mit der Konstruktion von Bibliotheken, Identifizierung von Fragmenten des offenen Leserahmens, Untersuchung der Flankiersequenzen und dergleichen verbunden. Bei Säugetiergenen, wo häufig Introns vorkommen, war die Kodierregion nur eine kleine Fraktion der gesamten mit dem Gen assoziierten Nukleinsäure. In anderen Fällen haben Pseudogene oder Genfamilien mit mehreren Mitgliedern die Möglichkeit verschleiert, ein bestimmtes Gen von Interesse zu isolieren. Dennoch gab es mit zunehmender Verbesserung der Techniken eine kontinuierliche Abfolge erfolgreicher Identifizierungen und Isolierungen von Genen von Interesse.
In vielen Fällen ist man primär an einer Quelle des Proteinprodukts interessiert. Der Zelltyp im Körper, der das Protein produziert, ist häufig eine inadäquate Quelle, da das Protein möglicherweise in geringen Mengen erzeugt wird, dieses nur in einer differenzierten Wirtszelle produziert werden kann, die nur schwer in Kultur zu züchten ist, oder die Wirtszelle, insbesondere eine menschliche Zelle, bei einem Kulturverfahren zur Herstellung des Produktes nicht wirtschaftlich oder effizient ist. Es gibt daher beträchtliches Interesse an der Entwicklung alternativer Techniken zur Herstellung von Proteinen von Interesse in Kultur mit Zellen, die eine wirtschaftliche und ef fiziente Produktion des gewünschten Proteins und, wenn möglich, einer geeignete Verarbeitung des Proteinproduktes ermöglichen.
Als Stand der Technik beschreiben Mansour et al., "Nature", 336:348-352 (1988), eine allgemeine Strategie zum Abzielen von Mutationen auf nichtselektierbare Gene. Weidle et al., "Gene", 66:193-203 (1988), beschreiben die Amplifikation von Gewebe-Plasminogenaktivator mit einem DHFR-Gen und den Verlust der Amplifikation in Abwesenheit von Selektionsdruck. Murnane und Yezzi, "Somatic Cell and Molecular Genetics", 14:273-286 (1988), beschreiben die Transformation einer menschlichen Zelllinie mit einem integrierten selektierbaren Genmarker, dem ein Transkriptionspromotor fehlt, mit Tandem-Duplikation und Amplifikation des Genmarkers. Thomas und Capecchi, "Cell", 51:503-512 (1987), beschreiben die stellengerichtete Mutagenese durch Abzielen auf Gene in aus Mausembryos stammenden Stammzellen. Song et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6820-6824 (1987), beschreiben die homologe Rekombination in menschlichen Zellen durch zweistufige Integration. Liskay et al., "Homologous Recombination between Repeated Chromosomal Sequences in Mouse Cells", Cold Spring Harbor, "Symp. Quant. Biol." 49:13-189 (1984), beschreiben die Integration von zwei unterschiedlichen Mutationen des gleichen Gens und die homologe Rekombination zwischen den mutanten Genen. Rubnitz und Subramani, "Mol. and Cell. Biol." 4:2253-2258 (1984), beschreiben das Minimalausmaß an Homologie, das für die homologe Rekombination in Säugetierzellen erforderlich ist. Kim und Smithies, "Nucl. Acids Res." 16:8887-8903 (1988), beschreiben einen Assay auf homologe Rekombination unter Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion.
Gemäß vorliegender Erfindung wird die Expression von Säugetierproteinen, die von Interesse sind, durch den Einsatz homologer Rekombination für die Integration eines amplifizierbaren Gens und anderer regulatorischer Sequenzen in der Nähe eines Gens von Interesse, ohne die Produktion eines geeigneten Transkripts zu unterbrechen, erreicht. Die Region, die das amplifizierbare Gen und das Gen von Interesse umfasst, kann amplifiziert und das Genom fragmentiert oder direkt oder indirekt zu einem Expressionswirt transferiert werden, um das Zielprotein zu exprimieren. Wenn sie nicht zuvor amplifiziert worden ist, wird die Zielregion dann amplifiziert, und die Zellpopulation auf Zellen gescreent, die das Zielprotein produzieren. Zellen, die das Zielprotein in hohen und reproduzierbaren Mengen produzieren, werden expandiert und zur Expression des Zielproteins verwendet.
In den Zeichnungen:
ist 1 eine schematische Darstellung von Plasmid pCG.1., die die Sequenz des modifizierten Polylinkers zeigt;
ist 2 eine schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid pCG.HR1;
ist 3 eine schematische Darstellung des Ergebnisses des Abzielens auf den EPO-Lokus durch homologe Rekombination mit der mit Notl geschnittenen aus pCG.HR1 stammenden DNA;
ist 4 eine schematische Darstellung des PCR-Amplifikationsfragments, das aus Zellen hergestellt wird, in denen ein homologes Rekombinationsereignis stattgefunden hat.
Im Speziellen werden Verfahren und Zusammensetzungen bereitgestellt, um Säugetierproteine von Interesse in Kultur zu produzieren. Beim Verfahren wird die homologe Rekombination in einer Wirtszelle eingesetzt, um ein amplifizierbares Gen in der Nähe eines Zielgens, das für das Protein von Interesse kodiert, zu integrieren. Die Region, die sowohl das amplifizierbare Gen als auch das Zielgen umfasst, wird als amplifizierbare Region bezeichnet. Die resultierenden, transformierten, primären Zellen können nun Bedingungen ausgesetzt werden, die bezüglich der Amplifikation selektiv sind, oder die Amplifikation kann daraufhin durchgeführt werden. Der Begriff "Transformieren" umfasst die Transformation, Transfektion, Transduktion, Konjugation, Fusion, Elektroporation und jegliche andere Technik, um DNA in eine lebensfähige Zelle einzubringen. Die Chromosomen oder die DNA der transformierten Zellen werden dann verwendet, um die amplifizierbare Region in das Genom sekundärer Expressionswirtszellen zu transferieren, wo die Zielregion, wenn sie zuvor nicht aus reichend oder überhaupt nicht amplifiziert worden ist, weiter amplifiziert wird. Die resultierenden Zelllinien werden auf die Produktion des Zielproteins gescreent und sekundäre Zelllinien bezüglich gewünschter Produktionsmengen ausgewählt, welche Zellen expandiert und für die Produktion des gewünschten Proteins in Kultur verwendet werden können.
Die primäre Zelle kann jede Säugetierzelle von Interesse sein, insbesondere Säugetierzellen, die sich in Kultur nicht leicht züchten lassen, im speziellen Primatenzellen, insbesondere menschliche Zellen, wobei die menschlichen Zellen normale Zellen einschließlich embryonaler oder neoplastischer Zellen, insbesondere normale Zellen, sein können. Als primäre Zellen können verschiedene Zelltypen eingesetzt werden, einschließlich von Fibroblasten, insbesondere diploiden Hautfibroblasten, Lymphozyten, Epithelzellen, Neuronen, Endothelzellen, oder anderen somatischen Zellen oder Keimzellen. Von besonderem Interesse sind Hautfibroblasten, die leicht vermehrt werden können, sodass eine große Anzahl normaler Zellen entsteht, embryonale Nierenzellen und dergleichen. Diese Zellen können das Gen von Interesse exprimieren oder nicht. In jenen Fällen, in denen das Zielgen induzierbar ist oder nur in bestimmten differentierten Zellen exprimiert wird, können Zellen ausgewählt werden, in denen das Zielgen exprimiert wird, was immortalisierte Zellen erfordern kann, die in Kultur gezüchtet werden können.
Es gibt eine Anzahl amplifizierbarer Gene, bei denen durch geeigneten Einsatz eines Selektionsmittels ein in das Genom integriertes Gen mit angrenzender Flankier-DNA amplifiziert wird. Amplifizierbare Gene sind Dihydrofolatreduktase, Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Primatenmetallothioneingene, Adenosindeaminase, Ornithindecarboxylase usw. Das amplifizierbare Gen weist Transkriptionssignale auf, die im sekundären oder Expressionswirt funktionell sind und im primären Wirt wünschenswerterweise funktionell sein sollen, insbesondere, wenn im primären Wirt Amplifikation eingesetzt wird oder das amplifizierbare Gen als Marker verwendet wird.
Bei den Zielgenen kann es sich um jedes Gen von Interesse handeln, und es ist bereits eine große Anzahl an Proteinen von Interesse identifiziert und isoliert worden, wobei die Liste ständig länger wird. Zu den Proteinen von Interesse gehören Zytokine, wie die Interleukine 1–10; Wachstumsfaktoren, wie EGF, FGF, PDGF und TGF; Somatotropine; Wachstumshormone; Koloniestimulierungsfaktoren, wie G-, M- und GM-CSF; Erythropoietin; Plasminogenaktivatoren, wie z.B. für Gewebe und Urin; Enzyme, wie Superoxiddismutase; Interferone; T-Zellenrezeptoren; Oberflächenmembranproteine, Insulin; Lipoproteine; α₁-Antitrypsin; CD-Proteine wie CD3, 4, 8, 19; Gerinnungsfaktoren, z.B. Faktor VIIIc und von Willebrands-Faktor; gerinnungshemmende Faktoren, wie Protein C; naturetischer Atrium-Faktor, Tumornekrosefaktor; Transportproteine; "Homing"-Rezeptoren; Addressine; regulatorische Proteine; usw.
Für die homologe Rekombination werden Konstrukte hergestellt, bei denen das amplifizierbare Gen an einer oder beiden Seiten von DNA, die homolog mit der DNA der Zielregion ist, flankiert ist. Die homologe DNA liegt im allgemeinen im Bereich von 100 kb, üblicherweise 50 kb, vorzugsweise etwa 25 kb, der transkribierten Region des Zielgens, mehr bevorzugt innerhalb von 2 kb des Zielgens. Mit Gen sind die Kodierregion und jene Sequenzen gemeint, die für die Transkription einer reifen mRNA erforderlich sind. Die homologe DNA kann die 5'-Stromauf-Region umfassen, die jegliche Enhancersequenzen, Transkriptionsinitiationssequenzen, die Region 5' von diesen Sequenzen oder dergleichen umfasst. Die homologe Region kann einen Abschnitt der Kodierregion umfassen, wo die Kodierregion nur aus einem offenen Leserahmen oder einer Kombination aus Exons und Introns besteht. Die homologe Region kann das gesamte Intron oder einen Abschnitt davon umfassen, wobei auch die Gesamtheit oder ein Abschnitt eines oder mehrerer Exons vorhanden sein kann. Alternativ dazu kann die homologe Region die 3'-Region umfassen, sodass der gesamte oder ein Abschnitt der Transkriptionsterminationsregion enthalten ist, oder die Region 3' von dieser Region. Die homologen Regionen können sich über das gesamte Zielgen oder einen Abschnitt davon erstrecken oder sich außerhalb des Zielgens befinden, das die gesamten oder einen Abschnitt der Transkriptionsregulationsregionen und/oder das Strukturgen umfasst. Größtenteils ist die homologe Sequenz an das amplifizierbare Gen proximal oder distal angefügt. Üblicherweise wird eine andere Sequenz als die Wildtypsequenz, die normalerweise mit dem Zielgen assoziiert ist, verwendet, um die homologe Sequenz an zumindest einer Seite des amplifizierten Gens von diesem zu trennen. Als Ergebnis der Manipulationen in Verbindung mit dem amplifizierbaren Gen kann ein bestimmter Abschnitt der Sequenz die mit dem amplifizierbaren Gen assoziierte 5'- oder 3'-Sequenz sein.
Die homologen Regionen, die das amplifizierbare Gen flankieren, müssen nicht mit jener Zielregion identisch sein, wo die in vitro-Mutagenese erwünscht ist. Beispielsweise kann es erwünscht sein, die Transkriptionsinitiationsregion für das Zielgen zu ändern, sodass ein Abschnitt der homologen Region Nukleotide umfassen kann, die sich von der Wildtyp-5'-Region des Zielgens unterscheiden. Alternativ dazu könnte das Einfügen einer Transkriptionsinitiationsregion, die sich von der Wildtypinitiationsregion unterscheidet, zwischen der Wildtypinitiationsregion und dem Strukturgen vorgesehen sein. Auf ähnliche Weise kann es gewünscht sein, verschiedene Mutationen in das Strukturgen einzubringen, sodass die homologe Region Fehlpaarungen umfasst, was zu einer Änderung des kodierten Proteins führt. Beispielsweise würde eine Signalleadersequenz im richtigen Leserahmen mit dem Zielgen eingefügt, um für die Sekretion des Zielproteinexpressionsproduktes zu sorgen. Alternativ dazu kann die 3'-Region geändert sein, z.B. die untranslatierte Region, die Polyadenylierungsstelle usw. des Zielgens. Daher kann durch homologe Rekombination dafür gesorgt werden, dass die Integrität des Zielgens beibehalten wird, sodass das Wildtypprotein unter der Transkriptionsregulation des Wildtyppromotors exprimiert wird, oder es kann eine Änderung in der Transkriptionsregulation, der Verarbeitung oder der Sequenz des Zielgens vorgesehen sein. In manchen Fällen kann es erwünscht sein, einen Enhancer in bezug auf die Transkriptionsinitiationsregion einzubringen, die beispielsweise durch Integration des amplifizierbaren Gens, das mit dem Enhancer assoziiert ist, in einer Region stromauf von der Transkriptionsinitationsregulationsregion oder in einem Intron oder sogar stromab vom Zielgen, bereitgestellt wird.
Um die vorliegenden Konstrukte herzustellen, ist es notwendig, jene Sequenz zu kennen, auf die sich die homologe Rekombination richtet. Es wird zwar berichtet, dass eine Sequenz aus 14 Basen, die zu einer Sequenz in einem Genom komplementär ist, für die homologe Rekombination sorgen kann, aber normalerweise haben die individuellen Flankierungssequenzen zumindest etwa 150 bp und können 12 kb oder mehr, üblicherweise nicht mehr als etwa 8 kb haben. Die Größe der Flankierungsregionen ist durch die Größe der bekannten Sequenz, die Anzahl jener Sequenzen im Genom, die Homologie mit der Integrationstelle aufweisen, durch die Tatsache, ob Mutagenese beteiligt ist, und das Ausmaß der Trennung der Regionen für die Mutagenese, die spezielle Integrationsstelle oder dergleichen bestimmt.
Die Integrationskonstrukte können auf herkömmliche Art hergestellt werden, bei der Sequenzen synthetisiert, aus natürlichen Quellen isoliert, manipuliert, kloniert, ligiert, und der in vitro-Mutagenese, Primer-Reparatur oder dergleichen unterzogen werden können. In verschiedenen Stufen können die aneinandergefügten Sequenzen kloniert und durch Restriktionsanalyse, Sequenzieren oder dergleichen analysiert werden. Üblicherweise wird das Konstrukt auf einem Kloniervektor getragen, der ein in einem prokaryotischen Wirt, z.B. E. coli, funktionelles Replikationssystem und einen Selektionsmarker, z.B. Biozidresistenz, Komplementierung an einen auxotrophen Wirt usw., umfasst. Es können auch andere funktionelle Sequenzen vorhanden sein, wie z.B. Polylinker, um das Einbringen und Ausschneiden des Konstrukts oder von Abschnitten davon zu erleichtern oder dergleichen. Es ist eine große Anzahl von Kloniervektoren erhältlich, wie z.B. pBR322, die pUC-Reihe usw.
Sobald das Konstrukt hergestellt ist, kann es dann für die homologe Rekombination im primären Zellziel verwendet werden. Es können verschiedene Techniken eingesetzt werden, um das Konstrukt in das Genom der primären Zelle zu integrieren, ohne dass es mit einem im primären Wirt funktionellen Replikationssystem verbunden wird. Siehe beispielsweise die US-PS-4.319.216 sowie die im Abschnitt über relevante Literatur genannten Literaturstellen. Alternativ dazu kann das Konstrukt in einen geeigneten Vektor eingefügt werden, der üblicherweise ein virales Replikationssystem aufweist, wie z.B. SV40, Rinderpapillomavirus, Adenovirus oder dergleichen. Der lineare DNA-Sequenzvektor kann auch einen selektierbaren Marker zum Identifizieren transfizierter Zellen aufweisen. Selektierbare Marker umfassen das neo-Gen, das die Selektion mit G418 ermöglicht, das Herpes tk-Gen zur Selektion mit HAT-Medium, das gpt-Gen mit Mykophenolsäure, Komplementierung eines auxotrophen Wirts usw.
Der Vektor kann zur stabilen Aufrechterhaltung im Wirt fähig sein oder nicht. Wenn der Vektor zur stabilen Aufrechterhaltung fähig ist, werden die Zellen auf homologe Integration des Vektors in das Wirtsgenom gescreent, wobei verschiedene Techniken zur Wiederherstellung ("curing") der Zellen eingesetzt werden können. Wenn der Vektor nicht zur stabilen Beibehaltung fähig ist, beispielsweise wenn ein temperaturempfindliches Replikationssystem eingesetzt wird, kann die Temperatur von der zulässigen Temperatur zur unzulässigen Temperatur geändert werden, sodass die Zellen vom Vektor befreit werden können. In diesem Fall können die Selektion nur jene Zellen überleben, in die das Konstrukt, welches das amplifizierbare Gen umfasst, und, falls vorhanden, der selektierbare Marker integriert sind.
Wenn ein selektierbarer Marker vorhanden ist, kann mit Hilfe dieses selektierbaren Markers hinsichtlich des Vorhandenseins des Konstrukts selektiert werden. Wenn der selektierbare Marker nicht vorhanden ist, kann mit dem amplifizierbaren Gen hinsichtlich des Vorhandenseins des Konstrukts selektiert werden. Für das neo-Gen oder das Herpes tk-Gen könnte ein Medium für das Wachstum der Transformanten mit etwa 0,1–1 g/ml G418 bzw. NAT-Medium eingesetzt werden. Wenn DHFR das amplifizierbare Gen ist, kann das selektive Medium etwa 0,01–0,25 μM Methotrexat enthalten.
Bei der Durchführung der homologen Rekombination wird die DNA in die primären Zellen eingebracht. Zu den Techniken, die eingesetzt werden können, gehören Kalziumphosphat/DNA-Copräzipitation, Mikroinjektion von DNA in den Kern, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, Transfektion, Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin usw., oder dergleichen. Verschiedene Techniken zum Transformieren von Säugetierzellen sind Keown et al., "Methods in Enzymology" (1989), Keown et al., "Methods and Enzymology" (1990) Band 185, S. 527–537, und Mansour et al., "Nature", 336:348-352 (1988) zu entnehmen.
Stromauf und/oder stromab vom Zielregionskonstrukt kann sich ein Gen befinden, das es ermöglicht, zu identifizieren, ob ein doppelter Crossover stattgefunden hat. Für diesen Zweck kann das Herpes simplex-Virus-Thymidinkinasegen eingesetzt werden, da das Vorhandensein des Thymidinkinasegens durch Verwendung von Nukleosidanalogen, wie Acyclovir oder Gancyclovir, aufgrund ihrer zytotoxischen Wirkungen auf Zellen, die ein funktionelles HSV-tk-Gen enthalten, detektiert werden kann. Das Nicht-Ansprechen auf diese Nukleosidanalogen weist auf das Fehlen der Thymidinkinase hin, und daher, wenn homologe Rekombination aufgetreten ist, darauf, dass auch ein doppelter Crossover stattgefunden hat.
Das Vorhandensein des Markergens, wie es Resistenz gegen ein Biozid oder das Wachstum in einem Medium, das bezüglich des Vorhandenseins des Markergens selektiv ist, zeigt, belegt das Vorhandensein und die Integration des Zielkonstrukts in das Wirtsgenom. Zu diesem Zeitpunkt muss keine weitere Selektion durchgeführt werden, da die Selektion im sekundären Expressionswirt erfolgt, wo die Expression des amplifizierten Zielgens detektiert werden kann. Falls gewünscht, kann durch den Einsatz von PCR und Sequenzieren der resultierenden amplifizierten DNA-Sequenzen ermittelt werden, ob homologe Rekombination aufgetreten ist. Falls gewünscht, kann zu diesem Zeitpunkt Amplifikation durchgeführt werden, indem die primären Zellen mit dem geeigneten Amplifizierungsreagens belastet werden, sodass Mehrfachkopien des Zielgens erhalten werden. Alternativ dazu kann die Amplifizierung bis zum Transfer zum sekundären Zellexpressionswirt warten.
Aus dem primären Rezipientenzellenstamm mit der entsprechenden Integration des Amplifikationsvektors werden DNA mit hohem Molekulargewicht, mehr als etwa 20 kb, vorzugsweise DNA mit über etwa 50 kb oder vorzugsweise Metaphasenchromosomen, hergestellt. Herstellungs- und Isolationstechniken werden von Nelson und Housman in "Gene Transfer" (Hrsg. R. Kucherlapati), Plenum Press, 1986, beschrieben. Die DNA kann dann auf die gleiche Weise wie oben beschrieben unter Einsatz der gleichen oder anderer Techniken, wie für die primären Zellen eingesetzt, in die sekundären Wirtsexpressionszellen eingebracht werden. Verschiedene Säugetierex pressionswirte sind erhältlich und können eingesetzt werden. Diese Wirte umfassen CHO-Zellen, Affennierenzellen, C127-Maus-Fibroblasten, 3T3-Maus-Zellen, Vero-Zellen usw. Wünschenswerterweise weisen die Wirte einen negativen Hintergrund für das amplifizierbare Gen oder ein Gen auf, das wesentlich weniger auf das Amplifizierungsmittel anspricht.
Die transformierten Zellen werden in selektivem Medium gezüchtet, das etwa 0,01-0,5 μM Methotrexat enthält, und, wenn ein anderer Marker, z.B. das neo-Gen, vorhanden ist, kann das Medium von etwa 0,1–1 mg/ml G418 enthalten. Die resistenten Kolonien werden isoliert und können dann in Hinblick auf das Vorhandensein des Konstrukts in angrenzender Position zum Zielgen analysiert werden. Das kann als Ergebnis des Nachweises von Expression des Zielgenprodukts erfolgen, wenn normalerweise ein negativer Hintergrund für das Zielgenprodukt, die Verwendung von PCR, Southern-Hybridisierung oder dergleichen gegeben ist.
Die das Konstrukt enthaltenden Zellen werden dann expandiert und der Selektion und Amplifikation mit Medien unterzogen, die progressiv höhere Konzentrationen des Amplifizierungsreagens enthalten, beispielsweise 0,5–200 μM Methotrexat für das DHFR-Gen, und können in jedem Selektionsschritt in Hinblick auf die Produktion des Zielprodukts analysiert werden. Die Expansion umfasst zumindest Duplikation und kann zu zumindest 5 Kopien, vorzugsweise 10 Kopien oder mehr, in einer Tandembeziehung führen. Somit wird die Proteinproduktion gegenüber der Expression aus einer einzelnen Kopie zumindest um das 1,5fache, üblicherweise zumindest um das 3fache, vorzugsweise zumindest um das 5fache, erhöht.
Die verschiedenen Klone können dann auf optimale stabile Produktion des Zielproduktes gescreent werden, und diese Klone können dann expandiert und kommerziell für die Produktion in Kultur verwendet werden. Auf diese Weise können hohe Ausbeuten eines Produktes erhalten werden, ohne dass es notwendig ist, die Botschaft ("message") zu isolieren und die verschiedenen Manipulationen durchzuführen, die mit genetischem Engineering oder Isolieren des genomischen Gens verbunden sind, wobei sehr große Gene umfassende Bemühungen auf dem Gebiet von Forschung und Entwicklung erfordern können.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung.
Experimenteller Teil
Zellen
Normale, menschliche, diploide Hautfibroblasten ("primärer Rezipient") werden in EEMEM-Medium vermehrt, das mit 20% fötalem Kalbserum ergänzt ist. Chinesische Hamster-Eierstock- (CHO-) DUKX-B11-Zellen mit Dihydrofolatreduktase- (DHFR-) Defizienz (Urlaub und Chasin, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 77:4216-4220 (1980) ("sekundärer Rezipient") werden in α-Medium vermehrt, das mit 10% dialysiertem fötalem Rinderserum ergänzt ist.
DNA-Vektor
Der Amplifikationsvektor wird aus pUC19 konstruiert (Yanisch-Perron et al., "Gene" 33:103-119 (1985)). Ein 1,8 kb-Haell-Fragment, das ein Hygromycin B-Phosphotransferasegen (hph) enthält, das durch den Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase(HSV tk-) Promotor gesteuert wird, wird aus pHyg durch Spaltung mit Haell und Gelelektrophorese isoliert (Sugden et al., "Mol. Cell. Biol." 5:410-413 (1985)). Synthetische Adaptoren werden an dieses Fragment angefügt, um die Haell-Enden in HindIII-Enden umzuwandeln, und das resultierende Fragment wird an mit Hindlll gespaltenes pUC19 angefügt. Das resultierende Plasmid pUCH enthält die Hygromycinkassette so, dass die Transkription von hph und β-Laktamase in entgegengesetzter Ausrichtung erfolgen. Ein 1,3 kb-Sall-Fragment, das ein von SV40-Transkriptionssignalen gesteuertes DHFR-Gen enthält, wird aus pTND durch Spaltung mit Sall und Gelelektrophorese isoliert (Connors et al., DNA 7:651-661 (1988)). Dieses Fragment wird an mit Sall gespaltenes pUCH ligiert. Das resultierende Plasmid pUCD enthält die DHFR-Kassette so, dass DHFR und in die gleiche Richtung transkribiert sind. Ein 1,76 kb-BamHI-Fragment vom Phagen F15 (Friezner Degen et al., "J. Biol. Chem." 261:6972-6985 (1986)), das zusätzlich zum ersten Exon und einem Teil des ersten Introns 1,45 kb DNA enthält, die den Transkriptionsstart von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) flankiert, wird nach BamHI-Spaltung durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wird nach der Spaltung des letzteren mit BamHI an pUCD angefügt. Beim resultierenden Plasmid pUCG ist der Promotor des t-PA-Fragments zu jenem der DHFR-Kassette entgegengesetzt ausgerichtet. Das t-PA-Fragment enthält eine einzelne NcoI-Stelle, die für pUCG nicht einzigartig ist. Eine teilweise NcoI-Spaltung wird durchgeführt und ein NotI-Linker eingefügt. Das resultierende Plasmid pCG enthält eine einzelne NotI-Stelle im t-PA-Fragment, die es ermöglicht, dass das Plasmid vor der Transformation der primären, menschlichen, diploiden Fibroblasten linearisiert wird, um die Frequenz der homologen Rekombination zu erhöhen (Kucherlapati et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 81:3153-3157 (1984)).
Herstellung primärer Rezipienten
Das mit Notl linearisierte Plasmid pCG wird durch Elektroporation unter Einsatz von 10 nM DNA in die primären Rezipienten eingefügt. Die resultierenden Zellen werden dann in selektivem Medium (EEMEM mit 200 μg/ml Hygromycin B) gezüchtet. Resistente Kolonien werden isoliert und durch PCR analysiert (Kim und Smithies, "Nucleic Acids Res." 16:8887-8903 (1988)), wobei als Primer die Sequenzen GCGGCCTCG-GCCTCTGCATA und CATCTCCCCTCTGGAGTGGA verwendet werden, um homologe Integranten von zufälligen zu unterscheiden. Die Amplifikation von Zell-DNA durch PCR unter Verwendung dieser beiden Primer ergibt nur dann ein Fragment mit 1,9 kb, wenn DNA von Zellen vorhanden ist, auf die korrekt abgezielt wurde. Zellen, die das DHFR-Gen in die t-PA-Region integriert umfassen, werden expandiert und als Quelle für Genmaterial zur Herstellung sekundärer Rezipienten verwendet.
Herstellung sekundärer Rezipienten
Metaphasenchromosomen werden aus Rezipienten hergestellt (Nelson et al., "J. Mol. Appl. Genet." 2:563-577 (1984)), die homologe Rekombination mit DHFR zeigen, und werden dann durch Kalziumphosphat-vermittelten Gentransfer in DHFRdefiziente CHO-Zellen übertragen (Nelson et al., "J. Mol. Appl. Genet." 2:563-577 (1984)). Die Zellen werden dann in selektivem Medium gezüchtet (α-Medium, das 200 μg/ml Hygromycin B enthält). Resistente Kolonien werden isoliert und auf Expression von menschlichem t-PA analysiert (Kaufman et al., "Mol. Cell. Biot." 5:1750-1759 (1985)). Die Zellklone werden dann in selektivem Medium gezüchtet, das progressiv höhere Methotrexatkonzentrationen enthält (0,02–80 μM, mit Schritten vierfacher Konzentrationszunahmen). Nach diesem Amplifikationsverfahren werden die Zellen geerntet, und der menschliche t-PA wird unter Einsatz eines ELISA-Assays mit einem monoklonalen Antikörper, der für t-PA spezifisch ist, analysiert (Weidle und Buckel, "Gene" 51:31-41 (1987)). Klone, die für höhere Expressionsmengen von t-PA sorgen, werden zur späteren Verwendung aufbewahrt.
Isolierung eines genomischen Klons, der Sequenzen zum Abzielen auf Erythrogoietin enthält
Ein Klon wurde durch Screening einer menschlichen genomischen Plazenta-DNA-Bibliothek (Clontech) in EMBL 3-SP6/T7 unter Verwendung von zwei Oligonukleotidsonden mit 36 bp, 5'-CTGGGTTGCTGAGTTCCGCAAAGTAGCTGGGTCTGG-3' und 5'-CGGGGGTCGGGGCTGTTATCTGCATGTGTGCGTGCG-3', zur mutmaßlichen Promotorregion von menschlichem Erythropoietin erhalten. Von diesem Klon wurden zwei Subklone in pSP72 erzeugt (Krieg und Melton (1987) "Meth. Enzymol." 155, 397-415), wobei einer ein 5 kb-BamHl-Hindlll-Fragment der Region stromauf von der Kodierregion von EPO (pTD.1) enthält und einer ein 5 kb Hindlll-BamHl-Fragment enthält, das für EPO (pTD.2) kodiert.
Konstruktion eines DNA-Fragments zum Abzielen auf Erythropoietin
Ein Plasmid pCG.1 wurde durch Ersetzen des Polylinker von pBluescript SK(-) (Stratagene) zwischen den SacI- und KpnI-Stellen mit einem synthetischen, doppelstrangigen 72 bp-DNA-Fragment konstruiert (1). Bezug nehmend auf 2 wurde in pCG.1 zwischen der Hindlll- und der Xbal-Stelle ein 678 bp-Fragment geklont, das den Enhancer und Promotor des unmittelbaren frühen Gens von menschlichem Zytomegalievirus (CMV, Boshart et al., (1985), "Cell" 41, 521–530) enthielt, das durch eine PCR-Amplifikation des Plasmids pUCH.CMV (Geschenk von M. Calos, Stanford U.) unter Verwendung der Oligonukleotidprimer 5'-CGCCAAGCTTGGCCATTGCAT-ACGTT-3' und 5'-GAGGTCTAGACGGTTCACTAAACGAGCTCT-3' erhalten wurde, um durch Engineering Hindlll- bzw. Xbal-Stellen an den Enden des resultierenden Fragments zu erhalten. Das resultierende Plasmid pCG.CMV wurde für weitere Konstruktionen verwendet.
Das 620 bp-BstEll-Xbal-Fragment aus pTD.2 wurde unter Verwendung eines BstEll-Xbal-Adapters an mit Xbal gespaltenes pCG.CMV angefügt, um das Plasmid pCG.CMV/EPO zu erzeugen, in dem die BstEll-Stelle des EPO-Fragments dem Promotorende des CMV-Fragments am nächsten ist. In pCG.CMV/EPO wurden nacheinander ein 1,94 kb-Fragment, das für Methotrexatresistenz kodiert, aus Plasmid pSV2dhfr (Subramani et al. (1981) "Mol. Cell. Biol." 1, 854–864) und ein 1,15 kb-Fragment, das für G418-Resistenz kodiert, aus dem Plasmid pMC1neo polyA (Thomas und Capecchi (1987) "Cell" 51, 503–512) geklont. Das neo-Gen wurde als Xhol-Sall-Fragment erhalten, und das dhfr-Gen wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer 5'-GGACGCGTGGATCCAGACATGATAAGATA-3' und 5'-GGA-CGCGTCAGCTGTGGAATGTGTGTCAG-3' erhalten, die dazu bestimmt waren, MluI-Stellen an den Enden des resultierenden Fragments anzufügen. Die neo- und dhfr-Gene wurden in die XhoI- bzw. die MluI-Stelle in pCG.CMV/EPO geklont, um die Plasmide pCG.CMV/EPO/DHFR und pCG.CMV/EPO/NEO/DHFR so zu ergeben, dass ihre Transkription in gleicher Ausrichtung erfolgt wie jene von CMV. Schließlich wurde das 5 kb-BamHI-Hindlll-Fragment aus pTD.1 über ClaI-Adaptoren an die ClaI-Stelle von pCG.CMV/EPO/Neo/DHFR angefügt, sodass pCG.HR1 entstand. In pCG.HR1 liegt das 5' 5 kb-EPO-Fragment in der gleichen Ausrichtung vor wie das 620 bp-BstEll-XbaI-Fragment bezogen auf den ursprünglichen Lambda-Klon.
Ein 9,54 kb-Fragment, welches das 5' 5kb-BamHl-Hindlll-EPO-Fragment, die dhfr- und G418-Marker, den CMV-Enhancer/Promotor und das 620 bp-BstEll-Xbal-EPO-Fragment enthält, kann von pCG.HR1 als ein NotI- oder Sacll-Fragment freigesetzt werden. Dieses NotI-Fragment kann für homologe Rekombination verwendet werden, da es so gestaltet ist, dass es als Omega-Struktur bei der Rekombination dient, wobei es 5 kb und 620 bp Homologie aufweist, um den Vorgang zu erleichtern (3).
Zur Elektroporation wurde die DNA zuerst mit Notl geschnitten, dann mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch Zugabe von Ethanol ausgefällt, bevor sie zentrifugiert wurde. Das resultierende DNA-Pellet wurde in einer Konzentration von 2 mg/ml in einem Volumen (10 μl) an 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (TE) erneut suspendiert.
Einbringen von DNA in Zellen
Transformierte, primäre, menschliche, embryonale 293-Nierenzellen (ATCC CRL 1573) wurden in Cellgro DMEM H16 (Mediatech) kultiviert, das mit 10 % Kalbserum, Glutamin (2 mM) und Penicillin (100 E/ml)/Streptomycin (0,1 mg/ml) ergänzt war, und bei 37°C in 5% CO₂ gezüchtet. Bei 90% Konfluenz wurden Zellen durch Trypsinisieren, Konzentrieren durch kurzes Zentrifugieren und erneutes Suspendieren in PBS mit 10⁷ Zellen/0,8 ml zur Elektroporation vorbereitet. Die Zellen wurden bei 4°C äquilibriert, und mit Notl gespaltene (wie oben beschrieben) DNA (50 μg) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde bei 960 μF und 260 V mit einem BioRad Gene Pulser elektroporiert und dann 10 min lang wieder geeist, bevor es auf einer 10 cm-Platte ausplattiert wurde. Nach 48-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Zellen von einer 10 cm-Platte gleichmäßig auf 5 24-Napf-Platten in Medien aufgeteilt, die G418 mit 0,6 mg/ml (tatsächliche Konzentration) enthielten. Unter diesen Elektroporationsbedingungen überleben nach 2 Wochen 4–10 Kolonien/Napf die Medikamentenselektion.
Nachweis homologer Rekombination durch PCR-Analyse
Unter Verwendung von mit Notl gespaltener DNA aus pCG.HR1 wird erfolgreiche homologe Rekombination durch Einfügen des 3,8 kb-Konstrukts am angestrebten EPO-Lokus erzielt, während gleichzeitig 1,2 kb genomische Sequenz gelöscht werden (3). PCR wird verwendet, um einzigartige Zielereignisse gegenüber zufälliger Integration der DNA nachzuweisen, wie schematisch in 4 dargestellt ist. Es werden zwei Primer synthetisiert, einer für das 3'-Ende von CMV und der andere für die Region 3' von der Xbal-Stelle, die für das 620 bp-BstEll-Xbal-Fragment in der Ziel-DNA verwendet wird. Ein homologer Rekombinationsvorgang erzeugt ein DNA-Ziel im Genom, aus dem diese Primer ein Amplifikationsprodukt mit 860 bp erzeugen.
Um das Zielereignis nachzuweisen, wurden Klonpools (aus den elektroporierten 293-Zellen) aus jeweils 4 Näpfen (was etwa 16 Kolonien darstellt) durch Trypsinisierung der Näpfe und unter Verwendung von 90% eines jeden Napfs für den Pool hergestellt. Die verbleibenden 10% eines jeden Napfs wurden dann erneut in den Napf gegeben. Genomische DNA wurde dann aus jedem Pool wie folgt hergestellt. Die Zellen in jedem Pool wurden durch 2-minütiges Zentrifugieren in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen pelletiert, erneut in PBS (20 μl) suspendiert und 1 h lang bei 37°C mit einer Lösung (400 μl) behandelt, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % SDS und RNase A (40 μg/ml) enthielt. Dann wurde Proteinase K (10 μl, 10 mg/ml) zugegeben, und die Proben 4 h lang bei 50°C inkubiert, bevor Extraktionen durch heftiges Vortexen mit Phenol/Chloroform (jeweils 200 μl), dann mit Chloroform (400 μl), Zugabe von Ethanol (800 μl) und 10-minütiges Zentrifugieren bei 25°C erfolgten. Die DNA-Pellets wurden mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und erneut in TE (20 μl) suspendiert. Durchschnittlich 40 μg genomische DNA wurde aus jeder Probe erhalten.
Etwa 1 μg von jeder Probe genomischer DNA wurde zur PCR-Analyse verwendet. Die DNA in einem TE-Volumen (10 μl) wurde vor der Zugabe von PCR-Gemisch (40 μl) 10 min lang gekocht. Die Reaktion (50 μl) enthielt 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25°C), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine, 0,1% Triton X-100, 200 μM dNTPs, jeweils 1 μM der Primer 5'-AAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3' und 5'-TGAGCGTGAGTTCTGTGGAATGTG-3', sowie 1,5 U Taq-DNA-Polymerase (Promega). Nach anfänglicher 3-minütiger Inkubation bei 94°C wurden die Proben 45 Zyklen 1-minütiger Denaturierung bei 94°C, 1,5-minütigem Annelieren bei 66°C und 2-minütiger Extension bei 72°C unterzogen. Am Ende der 45 Zyklen wurden die Proben weitere 5 Minuten lang bei 72°C inkubiert. Eine Teilmenge (20 μl) einer jeden Probe wurde auf einem 1% Agarosegel in TBE analysiert und mit Ethidiumbromid gefärbt. Von den aus 3 Elektroporationen analysierten 90 Pools wurden durch Ethidiumbro midfärbung zwei Proben identifiziert, die das Fragment mit korrekter Größe aufwiesen. Die DNA aus der PCR-Reaktion wurde gewonnen und einer Restriktionskartierung mit Xbal unterzogen. Das korrekte Amplifikationsprodukt sollte bei Behandlung mit Xbal zwei Fragmente, 669bp und 191 bp, ergeben. Die Proben der beiden Pools ergeben beide Fragmente mit den korrekten Größen. Außerdem weist die Probe von Pool 1 im ungeschnittenen Material andere Banden auf.
Nach dem oben beschriebenen Verfahren werden Metaphasenchromosomen aus den Rezipienten hergestellt, die homologe Rekombination mit DHFR aufweisen, und in CHO-Zellen mit DHFR-Defizienz transformiert. Nach dem Isolieren resistenter Kolonien und Analysieren auf Expression von EPO werden die Zellklone in selektivem Medium gezüchtet, das progressiv höhere Methotrexatkonzentrationen (0,02–80 μM) mit Schritten vierfacher Konzentrationszunahmen enthält. Die Zellen werden dann geerntet, geklont und auf die Produktion von EPO gescreent. Klone, die für eine zumindest zweifache Verstärkung der EPO-Produktion sorgen, werden isoliert.
Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Verfahren einen neuen Ansatz für die Expression einer großen Vielzahl von Säugetiergenen von Interesse liefert. Das Verfahren ist einfach, erfordert nur das Wissen über eine Sequenz mit etwa 300 bp oder mehr im Bereich eines Zielgens, und dann können im Wesentlichen herkömmliche Techniken eingesetzt werden, um die amplifizierbare Region auf einen Expressionswirt zu übertragen und das gewünschte Produkt in hoher Ausbeute zu produzieren.
Die obige Erfindung ist zwar zum Zweck des klaren Verständnisses durch Veranschaulichung und Beispiel detailliert beschrieben worden, Fachleuten wird jedoch im Lichte der Ausführungen der vorliegenden Erfindung klar sein, dass gewisse Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können.

Claims

Verfahren zur Produktion von Säugetierproteinen, umfassend: das Erzeugen von sekundären Säugetier-Expressionswirtszellen, die mehrere Kopien einer amplifizierbaren Region umfassen, die ein Zielgen umfasst, das zum sekundären Expressionswirt heterolog ist, und das Exprimieren eines Proteins von Interesse und eines amplifizierbaren Gens nach einem Verfahren, das Folgendes umfasst: das Transformieren von das Zielgen umfassenden primären Säugetierzellen mit einem Konstrukt, das ein amplifizierbares Gen und zumindest eine flankierende Region mit insgesamt zumindest etwa 150 bp umfasst, die mit einer DNA-Sequenz am Ort der kodierenden Region des Zielgens homolog ist, um für Amplifikation des Zielgens zu sorgen, wobei sich das amplifizierbare Gen an einer Stelle befindet, die die Expression des Zielgens nicht stört, wodurch das Konstrukt homolog in das Genom der primären Zellen integriert wird, um eine amplifizierbare Region zu definieren; das Selektieren bezüglich primärer Zellen, die das Konstrukt umfassen, anhand des amplifizierbaren Gens oder eines anderen im Konstrukt vorhandenen Markers; das Isolieren von DNA-Abschnitten dieses Genoms aus den primären Zellen, wobei die Abschnitte groß genug sind, um die gesamte amplifizierbare Region zu umfassen; das Transformieren der sekundären Expressionswirtszellen mit den primären Zell-DNA-Abschnitten und das Klonieren der transformierten sekundären Expressionswirtszellen, um Klone der sekundären Expressionswirtszellen zu erzeugen, die sich in diesen in den sekundären Expressionswirtszellen vorhandenen DNA-Abschnitten unterscheiden; das Selektieren von Klonen der sekundären Säugetier-Expressionswirtszellen, welche die amplifizierbare Region umfassen; das Züchten der sekundären Säugetier-Expressionswirtszellen, wodurch das Zielgen exprimiert und das Protein produziert wird; und das Amplifizieren der amplifizierbaren Region durch ein Amplifikationsmittel, wobei das Amplifizieren vor dem Isolieren oder nach der Selektion und vor dem Züchten erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin zumindest eine flankierende Region diese Homologie mit einer DNA-Sequenz innerhalb von 50 kb der kodierenden Region des Zielgens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Abschnitte Metaphasen-Chromosomen sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Abschnitte Restriktionsfragmente sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Konstrukt einen Biozid-Marker umfasst, der den primären Wirtszellen Resistenz gegen ein Biozid verleiht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Konstrukt weiters ein Markergen umfaßt, das von der amplifizierbaren Region durch eine homologe flankierende Region getrennt ist.
Verfahren zur Erzeugung von Zellen zur Expression eines heterologen Proteins in Kultur, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Transformieren von primären Säugetierzellen, die das Zielgen umfassen, mit einem Konstrukt, das ein amplifizierbares Gen und zumindest eine flankierende Region mit zumindest etwa 150 bp umfasst, die mit einer DNA-Sequenz innerhalb von 10 kb der kodierenden Region des Zielgens homolog ist, worin sich das amplifizierbare Gen an einer Stelle befindet, die die Expression des Zielgens nicht stört, wodurch das Konstrukt homolog in das Genom dieser primären Zellen integriert wird, um eine amplifi zierbare Region zu definieren, die das amplifizierbare Gen und das Zielgen im Genom umfasst; das Selektieren bezüglich primärer Zellen, die das Konstrukt umfassen, anhand des amplifizierbaren Gens oder eines anderen im Konstrukt vorhandenen Markers; das Isolieren von DNA-Abschnitten des Genoms aus den primären Zellen, wobei die Abschnitte groß genug sind, um die gesamte amplifizierbare Region zu umfassen; das Transformieren von sekundären Säugetier-Expressionswirtszellen mit den primären Zell-DNA-Abschnitten, worin die sekundären Expressionswirtszellen einer anderen Spezies angehören als die primären Wirtszellen, und das Klonieren der transformierten sekundären Expressionswirtszellen, um Klone der sekundären Expressionswirtszellen zu erzeugen, die sich in den in den sekundären Expressionswirtszellen vorhandenen DNA-Abschnitten unterscheiden; das Selektieren von Klonen der sekundären Säugetier-Expressionswirtszellen, welche die amplifizierbare Region umfassen; und das Amplifizieren der amplifizierbaren Region durch ein Amplifikationsmittel, worin das Amplifizieren entweder vor dem Isolieren oder nach dem Selektieren erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Amplifizieren mit den sekundären Expressionswirtszellen erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die primären Zellen menschliche Zellen sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die menschlichen Zellen diploide Fibroblastenzellen sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das amplifizierbare Gen ein Säugetier-DHFR-Gen ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das amplifizierbare Gen ein mutiertes DHFR-Gen mit einem höheren Km als das Wildform-Gen ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die sekundäre Wirtsexpressionszelle DHFR-Defizienz aufweist.