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Hintergrund der Erfindung
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Verschiedene
analytische Prozeduren und Vorrichtungen werden allgemein eingesetzt
in Durchflusstestvorrichtungen, um das Vorliegen und/oder die Konzentration
von Analyten zu bestimmen, welche in einer Testprobe vorhanden sein
können.
Beispielsweise setzen Immunoassays Mechanismen des Immunsystems ein,
in welchem Antikörper
erzeugt werden als Antwort auf das Vorliegen von Antigenen, welche
pathogen oder fremd für
den Organismus sind. Diese Antikörper
und Antigene, d.h. Immunoreaktanten, sind in der Lage, miteinander
zu binden, wodurch ein hochspezifischer Reaktionsmechanismus ausgelöst wird,
welcher verwendet werden kann, um das Vorliegen oder die Konzentration
dieses speziellen Antigens in einer biologischen Probe zu bestimmen.
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Es
gibt mehrere gut bekannte Immunoassayverfahren, welche Immunoreaktanten
einsetzen, gelabelt mit einer nachweisbaren Komponente, so dass
der Analyt analytisch nachgewiesen werden kann. Beispielsweise involvieren
Assays von "Sandwichtyp" typischerweise das
Mischen der Testprobe mit nachweisbaren Sonden, wie z.B. gefärbtem Latex
oder einem Radioisotop, welche mit einem spezifischen Bindungselement für den Analyten
konjugiert sind. Die konjugierten Sonden bilden Komplexe mit dem
Analyten. Diese Komplexe erreichen dann eine Zone von immobilisierten
Antikörpern,
wobei das Binden auftritt zwischen den Antikörpern und dem Analyten, um
sogenannte ternäre "Sandwichkomplexe" auszubilden. Die
Sandwich komplexe sind lokalisiert an der Zone zum Nachweis des
Analyten. Diese Technik kann eingesetzt werden, um quantitative oder
semi-quantitative Ergebnisse zu erhalten. Einige Beispiele solcher
Sandwichtyp-Assays werden beschrieben in
US-Patent
Nrn. 4,168,146 von Grubb et al., und
4,366,242 von Tom et al..
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Desweiteren
betrifft die internationale Anmeldung Nr.
WO 97/09620 ein Verfahren für die Bestimmung für Analyten
in einer Testprobe und offenbart die Verwendung von einer oder mehreren
Testzonen zum Nachweis des Analyten und einer oder mehreren Kalibrationszonen,
welche gelabelte Kalibratorwirksubstanzen aufnehmen. Die Signale,
assoziiert mit den unterschiedlichen Testzonen und den Kalibrationszonen,
werden verglichen, um auf das Vorliegen des Analyten zu bestimmen.
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Eine
alternative Technik ist der Assay vom "kompetitiven Typ". In einem Assay vom kompetitiven Typ ist
der Label typischerweise ein gelabelter Analyt oder ein Analyt-Analog,
welcher um die Bindung eines Antikörpers konkurriert mit einem
ungelabelten Analyt, der in einer Probe vorliegt. Kompetitive Assays
werden typischerweise verwendet zum Nachweis von Analyten, wie z.B.
Haptenen, wobei jedes Hapten monovalent ist und in der Lage ist,
nur ein Antikörpermolekül zu binden.
Beispiele von kompetitiven Immunoassayvorrichtungen werden beschrieben
in
US-Patent Nrn. 4,235601 von
Deutsch et al.,
4,442,204 von
Lotta, und
5,208,535 von
Buechler, et al.
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Viele
dieser Assays verlassen sich auf die Kalibration, um richtige und
bedeutsame Ergebnisse zur Verfügung
zu stellen, insbesondere bei semi-quantitativen und quantitativen
Nachweisen. Genauer gesagt können
entweder externe oder interne Kalibrationssysteme im allgemeinen
eingesetzt werden. In einem externen Kalibrationssystem kann eine
Standardkurve erhalten werden aus Standardproben, welche eine Serie
von einer bekannten Menge an Analyt enthalten und die Ergebnisse,
erhalten für
die Proben, werden dann verglichen mit der Standardkurve, um das
Vorliegen und/oder die Menge des Analyten in der Probe zu extrahieren. Das
externe Kalibrationsverfahren ist relativ einfach zu konzipieren
und einfach zu implementieren. Jedoch ist es häufig eine Überlagerung mit Variationen,
bedingt durch Umwelteinflüsse
und Batch-und-Batch-Durchläufen
unterzogen und daher nicht verlässlich.
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Herkömmliche
innere Kalibrationssysteme setzen andererseits typischerweise eine
Membran ein, welche eine Kalibrationszone aufweist und eine Nachweiszone,
auf welcher das einfache Reagenz, welches spezifisch für den Analyten
ist, immobilisiert ist. Leider ist die Fähigkeit der Kalibrationszone
einen verlässlichen und
akkuraten Vergleich mit der Nachweiszone zu realisieren, häufig begrenzt.
Darüber
sind innere Kalibrationszonen relativ teuer, was sie für bestimmte
Anwendungen unpraktisch machen.
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Es
existiert daher per se derzeit ein Bedürfnis für ein akkurates Kalibrationssystem
für Durchflusstestvorrichtungen,
welche akkurat und billig ist.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
Durchflusstestvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist die Durchflusstestvorrichtung
von Anspruch 1. In Übereinstimmung
mit einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Durchflusstestvorrichtung (beispielsweise
Sandwich, kompetitiv, etc.) offenbart, die in der Lage ist, das
Vorliegen oder die Menge eines Analyten, der in der Testprobe vor kommt,
nachzuweisen. Die Durchflusstestvorrichtung umfasst eine poröse Membran,
welches sich in Kommunikation befindet mit Nachweissonden und Kalibrationssonden, die
in der Lage sind, ein Detektionssignal zu erzeugen bzw. ein Kalibrationssignal.
Beispielsweise werden in einigen Ausführungsformen die Sonden aus
der Gruppe ausgewählt
bestehend aus Chromogenen, Katalysatoren, fluoreszierenden Verbindungen,
chemilumineszenten Verbindungen, Phosphoreszenzverbindungen, radioaktiven
Verbindungen, direkten visuellen Labeln, Liposomen und Kombinationen
davon. In einer speziellen Ausführungsform
enthalten die Sonden ein Latexmikropartikel.
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Die
poröse
Membran definiert eine Nachweis-/Kalibrationszone, innerhalb welcher
ein Polyelektrolyteinfangreagenz immobilisiert ist, das so konfiguriert
ist, dass es direkt an die Kombination der Nachweissonden und der
Kalibrationssonden bindet. Ein zweites Einfangreagenz, das ein spezifisches
Bindungselement für
den Analyten ist, kann eingesetzt werden. Die Detektions-/Kalibrationszone
ist in der Lage, ein Detektions- und Kalibrationssignal zu erzeugen,
so dass die Menge des Analyten in der Lage ist, das Nachweissignal,
das durch das Kalibrationssignal kalibriert ist, zu bestimmen.
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In Übereinstimmung
mit einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens
oder der Menge eines Analyten, der in einer Testprobe vorkommt,
in Anspruch 13 offenbart. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen
einer Durchflusstestvorrichtung. Eine Testprobe, welche den Analyten
enthält,
wird in Kontakt gebracht mit Nachweissonden und Kalibrationssonden,
die mit der Vorrichtung vorliegen. An einer Nachweis-/Kalibrationszone
werde die Intensität
des Nachweissignals und des Kalibrationssignals gemessen. Die Menge
des Analyten innerhalb der Testprobe ist proportional zur Intensität des Direktionssignals,
kalibriert durch die Intensität
des Kalibrationssignals.
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Andere
Merkmale und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in größeren Details
unten erläutert.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Eine
vollständige
und befähigende
Offenbarung der vorliegenden Erfindung, einschließend die
beste Art der Durchführung
davon, die sich an einen Fachmann auf dem Gebiet wendet, wird im
größeren Detail
im Rest der Beschreibung dargelegt, welcher auf die folgenden beigefügten Figuren
verweist, in welchen:
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1 eine
perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer Durchflusstestvorrichtung
der vorliegenden Erfindung ist;
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2 eine
grafische Illustration von einer Ausführungsform zur kovalenten Konjugation
eines Antikörpers
an carboxylierte Nanopartikel ist;
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3 eine
schematische Illustration einer Ausführungsform einer Durchflusstestvorrichtung
der vorliegenden Erfindung ist;
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4 eine
schematische Illustration einer anderen Ausführungsform einer Durchflusstestvorrichtung der
vorliegenden Erfindung ist;
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5 eine
schematische Illustration von noch einer anderen Ausführungsform
einer Durchflusstestvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist;
und
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6 eine
schematische Illustration einer weiteren Ausführungsform einer Durchflusstestvorrichtung der
vorliegenden Erfindung ist.
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Die
wiederholte Verwendung von Referenzziffern in der vorliegenden Beschreibung
und in den Zeichnungen ist dazu gedacht, die gleichen oder analoge
Merkmale oder Elemente der Erfindung zu repräsentieren.
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Detaillierte Beschreibung
von repräsentativen
Ausführungsformen
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Definitionen
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Analyt" im allgemeinen auf eine Substanz, welche
nachgewiesen werden soll. Beispielsweise können Analyten, Antigensubstanzen,
Haptene, Antikörper
und Kombinationen davon einschließen. Analyten schließen ein
Toxine, organische Verbindungen, Proteine, Peptide, Mikroorganismen,
Aminosäuren,
Nukleinsäuren,
Hormone, Steroide, Vitamine, Wirksubstanzen (einschließend diejenigen
verabreicht für
therapeutische Zwecke wie auch diejenigen verabreicht für verbotene
Zwecke), Wirksubstanz zwischen Verbindungen oder Abfallprodukte,
Bakterien, virale Partikel und Metabolite oder Antikörper von
irgendwelchen der oben genannten Substanzen. Spezifische Beispiele
einiger Analyte schließen Ferritin
ein; Kreatininkinase MIB (CK-MB); Digoxin; Phenytoin; Phenobarbitol;
Carbamazepin; Vancomycin; Gentamycin; Theophyllin; Valproinsäure; Quinidin;
luteinisierendes Hormon (LH); follikelstimulierendes Hormon (FSH);
Estradiol, Pro gesteron; C-reaktives Protein; Lipocaline; IgE Antikörper; Vitamin
B2 Mikroglobulin; glykosyliertes Hämoglobin (Gly. Hb); Kortisol;
Digitoxin; N-Acetylprocainamid (NAPA); Procainamid; Antikörper gegen
Rubella, wie z.B. Rubella-IgG und Rubella-IgM; Antikörper gegen
Toxoplasmose, wie z.B. Toxoplasmose IgG (Toxo-IgG) und Toxoplasmose
IgM (Toxo-IgM); Testosteron; Salicylate; Acetaminophen; Hepatitis
B-Virus Oberflächen-Antigen
(HbsAg); Antikörper
gegen das Hepatitis B Kern-Antigen, wie z.B. Anti-Hepatitis B Kern
Antigen IgG und IgM (Anti-HBC); menschliche Immunschwäche Virus
1 und 2 (HIV 1 und 2); menschliche T-Zell Leukämie Virus 1 und 2 (HTLV); Hepatitis
Be Antigen (HbeAg); Antikörper
gegen Hepatitis Be Antigen (Anti-Habe); Thyroid-stimulierendes Hormon
(TSH); Thyroxine (T4); totales Triiodothyronin (Total T3); freies Triiodothyronin
(freies T3); Karzinoecmbryo-Antigen (CEA); und alphafötales Protein
(AFP). Wirksubstanzen des Missbrauches und kontrollierte Substanzen
schließen
ein, sind jedoch nicht dazu gedacht, limitiert zu sein auf: Amphetamin;
Methamphetamin; Barbiturate, wie z.B. Amobarbital, Secobarbital,
Pentobarbital, Phenobarbital und Barbital; Benzodiazepin, wie z.B.
Librium und Valium; Cannabinoide, wie z.B. Haschisch und Marihuana;
Dokain; Fentanyl; LSD; Methaqualon; Opiate, wie z.B. Heroin, Morphin,
Kodein, Hydromorphon, Hydrocodon, Methadon, Oxycodon, Oxymorphon
und Opium; Phencyclidin; und Propoxyhen. Andere mögliche Analyten
können
beschrieben werden in
US-Patent
Nrn. 6,436,651 von Everhart, et al. und
4,366,241 von Tom et al..
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Testprobe" im allgemeinen auf ein Material, von
dem man glaubt, dass es den Analyten enthält. Die Testprobe kann direkt
erhalten werden, wie sie von der Quelle erhalten wird oder nach
einer Vorbehandlung, um den Charakter der Probe zu modifizieren.
Die Testprobe kann abgeleitet sein von irgendeiner biologischen
Quelle, wie z.B. der physiologischen Flüssigkeit, einschließend Blut, Saliva,
Augenlinsenflüssigkeit,
cerebrale spinale Flüssigkeit,
Schweiß,
Urin, Milch, Ascites-Flüssigkeit, Schleim,
synovialer Flüssigkeit,
peritonealer Flüssigkeit,
amniotischer Flüssigkeit
od. dgl., Die Testprobe kann vor der Verwendung behandelt werden,
wie z.B. durch Herstellung von Plasma aus Blut, Verdünnen von
viskosen Flüssigkeiten
und dergleichen. Verfahren zur Behandlung können Filtration, Destillation,
Konzentration, Inaktivierung von wechselwirkenden Komponenten, die
Zugabe der Reagenzien involvieren. Neben physiologischen Flüssigkeiten
können
andere Flüssigkeitsproben
verwendet werden, wie z.B. Wasser, Nahrungsmittelprodukte u. dgl.
für die
Durchführung
von Assays. Zur Umweltanalyse und Nahrungsmittelherstellung. Darüber hinaus
können
feste Materialien, von denen man glaubt, dass sie den Analyten enthalten,
als Testproben verwendet werden. In einigen Fällen kann es von Vorteil sein, eine
feste Testprobe zu modifizieren, um ein flüssiges Medium auszubilden oder
den Analyten freizusetzen.
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Detaillierte Beschreibung
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Nun
wird im Detail auf verschiedene Ausführungsformen der Erfindung
verwiesen, bzw. auf ein oder mehrere Beispiele, die unten dargelegt
sind. Jedes Beispiel wird auf dem Wege der Erläuterung der Erfindung präsentiert,
und soll die Erfindung nicht beschränken. Tatsächlich wird offensichtlich
für die
Fachleute auf dem Gebiet sein, dass verschiedene Modifikationen
und Variationen in der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden
können,
ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können Merkmale,
die illustriert werden oder als Teil einer Ausführungsform beschrieben werden,
in einer anderen Ausführungsform
eingesetzt werden, um noch eine weitere Ausführungsform zu erzielen. Folglich
ist beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung solche Modifikationen
und Variationen abdeckt, insofern sie sich innerhalb des Umfangs
der beigefügten
Ansprüche
befinden.
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Im
allgemeinen ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein inneres
selbst-kalibrierendes System für Durchflusstestvorrichtungen.
Insbesondere setzt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer
einzigen Nachweis-/Kalibrationszone ein, definiert durch eine poröse Membran
des Assays. Durchführen
der Signaldetektion und inneren Kalibration zur gleichen Zeit kann
in starkem Maße
die Nachweisverlässlichkeit
und Reproduzierbarkeit durch Eliminieren der Einflüsse von
Umweltfaktoren erhöhen,
wie z.B. von Temperatur, pH und instrumenteller Instabilität des Nachweissignals.
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Bezug
nehmend auf 1 wird nun beispielsweise eine
Ausführungsform
einer Durchflusstestvorrichtung, welche entsprechend der vorliegenden
Erfindung ausgebildet werden kann, in größerem Detail beschrieben. Wie
dargestellt wird enthält
die Vorrichtung 20 eine poröse Membran 23, optional
unterstützt
durch ein steifes Material 21. Im allgemeinen kann die
poröse
Membran 23 aus irgendeiner der Vielzahl von Materialien erstellt
werden, durch welche die Testprobe in der Lage ist, durchzudringen.
Beispielsweise können
die Materialien, welche verwendet werden, um die poröse Membran
auszubilden, natürliche,
synthetische oder natürlich
auftretende Materialien einschließen, welche synthetisch modifiziert
werden, sind aber nicht darauf beschränkt; Beispiele dafür sind Polysaccharide
(beispielsweise Cellulosematerialien, wie z.B. Papier und Cellulosederivate,
wie z.B. Celluloseacetat und Nitrocellulose); Silica; anorganische
Materialien, wie z.B. deaktiviertes Alumina, Kieselerde, MgSO4 oder ein anderes anorganisches, fein verteiltes
Material, welches einheitlich in einer porösen Polymermatrix verteilt
ist, mit Polymeren, wie z.B. Vinylchlorid, Vinylchloridpropylencopolymer und
Vinylchlorid-Vinylacetatcopolymer; Kleidung, sowohl natürlich auftretend
(beispielsweise Baumwolle) als auch synthetisch (beispielsweise
Nylon oder Rayon); poröse
Gele, wie z.B. Silicagel, Agarose, Dextran und Gelatine; Polymerfilme,
wie z.B. Polyacrylamid; und dergleichen. In einer speziellen Ausführungsform
wird die poröse
Membran 23 ausgebildet aus Nitrozellulose und/oder Polyester-Sulfon-Materialien.
Es sollte sich verstehen, dass der Begriff "Nitrozellulose" sich auf Salpetersäureester von Zellulose bezieht,
welche Nitrozellulose allein sein können oder ein gemischter Ester
von Salpetersäure
und anderen Säuren,
wie z.B. aliphatischen Karbonsäuren
mit von 1 bis 7 Kohlenstoffatomen.
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Die
Vorrichtung 20 kann auch ein dochtartiges Feld 28 einschließen. Das
dochtartige Feld (wicking pad) 28 nimmt im allgemeinen
Flüssigkeit
auf, welche durch die vollständige
poröse
Membran 23 gewandert ist. Wie im Stand der Technik wohl
bekannt ist, kann das dochtartige Feld 28 helfen, Kapillarkräfte voranzutreiben,
sowie den Flüssigkeitsfluss
durch die Membran 23.
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Um
den Nachweis eines Analyten innerhalb der Testprobe auszulösen, kann
ein Anwender direkt die Testprobe auf einen Abschnitt der porösen Membran 23 aufbringen,
durch welche sie dann wandern kann, um eine Nachweis-/Kallibrationszone 31 zu
erreichen (siehe Beschreibung unten). Alternativ kann die Testprobe zunächst auf
ein Probenaufnahmefeld (nicht gezeigt) aufgebracht werden, das in
flüssiger
Kommunikation mit der porösen
Membran 23 steht. Einige geeignete Materialien, die verwendet
werden können,
um das Probeaufnahmefeld auszubilden schließen ein, sind jedoch nicht
limitiert auf Nitrozellulose, Zellulose, poröse Polyethylenfelder und Glasfaserfilterpapier.
Falls gewünscht,
kann das Probenaufnahmefeld auch ein oder mehrere Vorrichtungsvorbehandlungs-Reagenzien
einschließen,
entweder diffusiv oder nicht diffusiv daran angebunden.
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In
der illustrierten Ausführungsform
wandert die Testverbindung vom Probeaufnahmefeld (nicht gezeigt)
zu einem Konjugatfeld 22, das in Kommunikation platziert
ist mit einem Ende des Probeaufnahmefeldes. Das Konjugatfeld 22 wird
aus einem Material gebildet, durch welches die Testprobe durchdringen
kann. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform das Konjugatfeld 22 aus
Glasfasern ausgebildet. Obwohl nur ein Konjugatfeld 22 dargestellt
ist, sollte sich verstehen, dass andere Konjugatfelder auch in der
vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
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Um
einen akkuraten Nachweis des Vorliegens oder der Abwesenheit eines
Analyten innerhalb der Testprobe zu ermöglichen, werden Sonden an verschiedenen
Stellen der Vorrichtung
20 angebracht. Wie im größeren Detail
unten beschrieben werden wird, werden Sonden sowohl für die Detektion
des Analyten als auch für
die Kalibration eingesetzt. Jegliche Substanz, die im allgemeinen
in der Lage ist, ein Signal zu erzeugen, das visuell nachweisbar
ist oder durch eine Instrumentenvorrichtung, kann als Sonde eingesetzt
werden. Verschiedene geeignete Substanzen können einschließen: Chromogene;
Katalysatoren; Fluoreszenzverbindungen; chemilumineszente Verbindungen,
phosphoreszente Verbindungen; radioaktive Verbindungen; direkte
visuelle Label, einschließend
kolloidale Metalle (beispielsweise Gold) und Nicht-Metallpartikel,
Farbstoff-Partikel, Enzyme oder Substrate oder organische Polymer-Latexpartikel;
Liposome oder andere Vesikel, welche Signal erzeugende Substanzen
einschließen;
und dergleichen. Beispielsweise werden einige Enzyme, die geeignet
sind zur Verwendung als Sonden, offenbart in
US-Patent Nr. 4,275,149 von Litman,
et al. Ein Beispiel eines Enzym-Substrat-Systems ist das Enzym-alkalische
Phosphatase und das Substrat Nitroblau-tetrazolium-5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat
oder ein Derivat oder Analog davon, oder das Substrat 4-Methylumbelliferylphosphat.
Andere geeignete Sonden können
beschrieben sein in
US-Patent
Nrn. 5,670,381 von Jou et al. und
5,252,459 von Tarcha, et al..
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In
einigen Ausführungsformen
können
die Sonden eine fluoreszierende Verbindung einschließen, welche
ein nachweisbares Signal erzeugt. Die fluoreszierenden Verbindungen
können
fluoreszierende Moleküle, Polymere,
Dendrimere, Partikel und dergleichen sein. Einige Beispiele geeigneter
fluoreszierender Moleküle schließen z.B.
ein, sind jedoch nicht limitiert auf: Fluoreszin, Europiumchelate,
Phycobiliprotein, Rhodamin und deren Derivate sowie Analoge. Eine
visuell nachweisbare, farbige Verbindung kann auch als Sonde verwendet werden,
wodurch eine direkte farbige Auslese des Vorliegens oder der Konzentration
des Analyten in der Probe zur Verfügung gestellt wird, ohne dass
eine Notwendigkeit besteht für
weitere signalerzeugende Reagenzien.
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Die
Sonden, wie oben beschrieben, können
allein oder zusammen mit einem Mikropartikel verwendet werden (hier
manchmal als "Bead" oder "Mikrobead") bezeichnet. Beispielsweise
können
natürlich
vorkommende Mikropartikel, wie z.B. Kerne, Mikroplasma, Plasmide,
Plastide, Säugetierzellen
(beispielsweise Erythrocyte Ghosts), Einzeller-Mikroorganismen (beispielsweise
Bakterien), Polysaccaride (beispielsweise Agarose) u. dgl. verwendet
wer den. Desweiteren können
auch synthetische Mikropartikel eingesetzt werden. Beispielsweise
werden in einer Ausführungsform
Latexmikropartikel, die gelabelt sind, mit einem fluoreszierenden oder
gefärbtem
Farbstoff eingesetzt. Obwohl jegliches Latexmikropartikel eingesetzt
werden kann in der vorliegenden Erfindung, werden die Latexmikropartikel
typischerweise aus Polystyrol, Butadien-Styrolen, Styrenacryl-Vinylterpolymere,
Polymethacrylat, Polyethylmethacrylat, Styren-Maleinanhydrid Copolymer,
Polyvinylacetat, Polyvinylpyridin, Polydivinylbenzen, Polybutylenterephthalat,
Acrylonitril, Vinylchloridacrylaten u. dgl. oder einem Aldehyd,
Carboxyl, Amino, Hydroxyl- oder Hydrazidderivaten davon hergestellt.
Andere geeignete Mikropartikel können
beschrieben werden in
US-Patent
Nrn. 5,670,381 von Jou, et al. und
5,252,459 von Tarcha, et al. Einige,
kommerziell verfügbare
Beispiele von geeigneten fluoreszierenden Partikeln schließen ein fluoreszierende
carboxylierte Mikrokugeln, verkauft von Molecular Probes, Inc. unter
dem Handelsnamen "FluoSphere" (Red 580/605) und "TransfluoSphere" (543/620), die auch
verkauft werden als "Texas
Red" und 5- bzw.
6-Carboxytetramethylrhodamin. Kommerziell verfügbare Beispiele geeigneter,
gefärbter
Latex-Mikropartikel schließen
caboxylierte Latex-Beads, verkauft von Bang's Laboratory, Inc. ein.
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Wenn
die Sonden Partikel sind, wie oben beschrieben, kann der mittlere
Durchmesser der Partikel im allgemeinen je nach Bedarf variieren,
abhängend
von den Faktoren, wie z.B. dem Typus des gewählten Partikel, der Porengröße der Membran
und der Membranzusammensetzung. Beispielsweise kann in einigen Ausführungsformen
der mittlere Durchmesser der speziellen Label von ungefähr 0,01 μm bis ungefähr 1000 μm reichen,
in einigen Ausführungsformen
von 0,01 μm
bis ungefähr
100 μm und
in einigen Ausführungsformen von
ungefähr
0,001 μm
bis ungefähr
10 μm. In
einer speziellen Ausführungsform
weisen die Partikel einen mittleren Durchmesser von ungefähr 0,1 bis
ungefähr
2 μm auf.
Im allgemeinen sind die Partikel substantiell sphärisch in
ihrer Form, obwohl andere Formen geeignet für die Verwendung in der vorliegenden
Erfindung sind, einschließend,
jedoch nicht limitiert auf plattenförmige Formen, stabförmige Formen,
lattenförmige
Formen, unregelmäßige Formen
etc. Wie von den Fachleuten auf dem Gebiet eingesehen werden wird,
kann die Zusammensetzung, Formgröße und/oder
Dichte der Partikel weithin variieren.
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Es
ist gewünscht,
die Sonden in gewisser Art und Weise zu modifizieren, so dass sie
leichter in der Lage sind, an den Analyten zu binden. Die Sonden
werden mit bestimmten spezifischen Bindungselementen modifiziert,
welche daran angebunden sind, um Sondenkonju gate auszubilden. Spezifische
Bindungselemente beziehen sich im allgemeinen auf ein Element eines
spezifischen Bindungspaares, d.h. zwei unterschiedliche Moleküle, wobei
eines der Moleküle
chemisch und/oder physikalisch an das zweite Molekül bindet.
Beispielsweise können
immunoreaktive spezifisch bindende Elemente der Antigene einschließen, Haptene,
Aptamere, Antikörper
und Komplexe davon, einschließend
diejenigen ausgebildet durch rekombinante DNA-Verfahren oder Peptid-Synthese.
Ein Antikörper
kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein, ein rekombinantes
Protein oder eine Mischung (Mischungen) oder ein Fragment (Fragmente)
davon, wie auch eine Mischung eines Antikörpers und anderer spezifischer
bindender Elemente. Die Details der Herstellung solcher Antikörper und
ihre eigenen zur Verwendung als spezifische Bindungselemente sind
den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt. Andere allgemeine spezifische
Bindungspaare schließen
ein, sind jedoch nicht limitiert auf Biotin und Avidin, Kohlenhydrate
und Lectine, komplementäre
Nukleotidsequenzen (einschließend
Sonden und einfangende Nukleinsäuresequenzen,
die in DNA-Hybridisierungsassays verwendet werden, um eine Ziel-Nukleinsäuresequenz
nachzuweisen), komplementäre
Peptidsequenzen, einschließend
diejenigen, ausgebildet durch rekombinante Verfahren, Effektor-
und Rezeptor-Moleküle,
Hormon- und hormonbindende Proteine, Enzym-Cofaktor und Enzyme,
Enzym-Inhibitoren und Enzyme und dergleichen. Desweiteren werden spezifische
Bindungspaare Elemente einschließen, welche Analoga der ursprünglichen
spezifischen Bindungselemente sind. Beispielsweise kann ein Derivat
oder Fragment des Analyten, d.h. ein Analyten-Analog, verwendet
werden, so lange, als es zumindest ein Epitop gemeinsam mit dem
Analyten aufweist.
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Die
spezifischen Bindungselemente können
im allgemeinen an die Sonden angebunden werden unter Verwendung
von irgendeiner einer Vielzahl von wohl bekannten Techniken. Beispielsweise
kann das kovalente Anbinden von spezifischen Elementen an Sonden
(beispielsweise Mikropartikel) realisiert werden unter Verwendung
von Carboxy-, Amino-, Aldehyd-, Bromoacetyl-, Iodoacetyl-, Thiol-,
Epoxy- und anderen reaktiven oder verbrückenden funktionellen Gruppen,
wie auch freien Radikalresten sowie Radikal-Cationen, durch welche
eine Proteinkopplungsreaktion realisiert werden kann. Eine Oberflächen-funktionelle
Gruppe kann auch eingebracht werden als ein funktionalisiertes Co-Monomer,
da die Oberfläche
des Mikropartikel eine relativ hohe Oberflächenkonzentrationen von polaren
Gruppen enthalten kann. Darüber
hinaus sind in bestimmten Stellen, obwohl Mikropartikelsonden häufig nach
der Synthese funktionalisiert werden, beispielsweise bei Poly-(Thiophenol),
die Mikro partikel in der Lage, direkt kovalent verbrückt zu werden
mit einem Protein, ohne dass eine weitere Modifikation notwendig
ist. Beispielsweise wird unter Verweis auf 2 eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung zur kovalenten Konjugation einer Sonde
illustriert. Wie dargestellt wird, ist der erste Schritt der Konjugation
die Aktivierung von Carboxylgruppen auf der Sondenoberfläche unter
Verwendung von Carbodiimid. In dem zweiten Schritt werden die aktivierten
Carbonsäuregruppen
umgesetzt mit einer Aminogruppe eines Antikörpers, um eine Amidbindung
auszubilden. Die Aktivierung und/oder Antikörperkopplung kann in einem
Puffer auftreten, wie z.B. Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)
(z.B. pH von 7,2) oder 2-(N-Morpholino) Ethansulfonsäure (MES)
(z.B. pH von 5,3). Wie dargestellt ist, können die resultierenden Sonden
dann beispielsweise mit Ethanolamin blockiert werden, um das Sondenkonjugat
auszubilden. Neben dem kovalenten Binden werden andere Anbindungstechniken,
wie z.B., physikalische Adsorption auch optional im Rahmen der vorliegenden
Erfindung eingesetzt.
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Nun
wird erneut auf 1 Bezug genommen; die Vorrichtung 20 enthält auch
die Detektions-/Kalibrationszone 31. Die Detektions-/Kalibrationszone 31 stellt
im allgemeinen eine einzelne abgetrennte Detektions-/Kalibrationsregion
zur Verfügung
(beispielsweise eine Linie, ein Punkt, etc.), so dass ein Anwender
akkurat die Konzentration eines speziellen Analyten innerhalb einer
Testverbindung an einer Stelle entlang der Vorrichtung bestimmen
kann. Beispielsweise wird in der illustrierten Ausführungsform
eine einzelne Linie eingesetzt.
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Darüber hinaus
kann die Linie in einer Richtung angeordnet werden, welche substantiell
senkrecht zum Fluss der Testvorrichtung durch die Vorrichtung 20 ist.
Desweiteren kann in einigen Ausführungsformen die
Linie in einer Richtung angeordnet sein, welche substantiell parallel
zum Fluss der Testprobe durch die Vorrichtung 20 ist.
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Die
Nachweis-/Kalibrationszone 31 enthält eine oder mehrere immobilisierte
Polyeelektrolyt-Einfangreagenzien,
die in der Lage sind, an Sonden zu binden und zwar entweder direkt
oder indirekt (d.h. an ein spezifisches Bindungselement, konjugiert
an die Sonde an einen Analyten, komplexiert mit der Sonde etc.).
In einigen Ausführungsformen
wird ein erstes immobilisiertes Einfangreagenz konfiguriert, um
an die Nachweissonden zu binden, während ein zweites Einfangreagenz
konfiguriert wird, um an die Kalibrationssonden zu binden. Die ersten
und zweiten immobilisierten Einfachreagenzien können die gleichen sein, oder
sie können
verschieden voneinander sein.
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Allgemein
gesagt können
verschiedene Typen an einfachen Reagenzien immobilisiert werden
innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31. Beispielsweise
kann in einer Ausführungsform
das Einfangreagenz identisch sein oder ausgebildet werden aus der
gleichen Klasse oder Kategorie von Materialien (beispielsweise Antikörper, Antigene,
Analoge davon, u.dgl.), wie die spezifischen Bindungselemente, die
verwendet werden, um Konjugate der Sonden auszubilden. Folglich
können
in dieser Ausführungsform
die Einfangreagenzien als eine stationäre Bindungsstelle für die Sonden
dienen, wenn sie an einen Analyten gebunden werden. Genauer gesagt,
kann der Analyt, wie z.B. ein Antikörper ein Antigen etc., zwei
Bindungsstellen aufweisen. Nach Erreichen der Detektions-/Kalibrationszone 31 und
Passieren durch das Konjugatfeld 22 wird eine dieser Bindungsstellen
durch das spezifisch bindene Element belegt, dass an die Sonde konjugiert
ist. Jedoch kann die freie Bindungsstelle des Analyten an das immobilisierte
Einfangreagenz binden.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann das immobilisierte Polyelektrolyt-Einfang-Reagenz ein Polyelektrolyt
sein, das an Sonden bindet und zwar direkt oder indirekt, durch
ionische Wechselwirkung. Beispielsweise kann der Polyelektrolyt
eine positive oder eine negative Nettoladung aufweisen, wie auch
eine Nettoladung, die allgemein neutral ist. Einige Beispiele von
Polyelektrolyten, die eine positive Nettoladung aufweisen, schließen ein,
sind jedoch nicht limitiert auf Polylysin (kommerziell verfügbar von
Sigma-Aldrich Chemical Co., Ltd. von St. Louis, Missouri), Polyethylenamin;
Epichlorohydrin-funktionalisierte Polyamine und/oder Polyamidoamine,
wie z.B. Poly(dimethylamin-Co-Epichlorhydrin); Polydiallyidimethyl-Ammoniumchlorid;
kationische Zellulosederivate, wie z.B. Zellulosecopolymdere oder
Zellulosederivate, aufgepfropft mit einem quaternären Ammonium-wasserlöslichen
Monomer; u. dgl.. In einer speziellen Ausführungsform können CelQuat® SC-230M
oder H-100 (verfügbar
von National Starch & Chemical,
Inc.), welche Zellulosederivate sind, die quaternäre Ammonium-wasserlösliches
Monomer enthalten, eingesetzt werden. Desweiteren sind einige geeignete
Beispiele von Polyelektrolyten, welche eine negative Nettoladung
aufweisen, solche, die Polyacrylsäuren einschließen, wie
z.B. Poly(ethylen-Co-Methacrylsäure,
Natriumsalz) u. dgl., aber nicht darauf limitiert sind. Es sollte
sich auch verstehen, dass andere Polyelektrolyte auch in der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden können,
wie z.B. amphiphile Polyelektrolyte (d.h. solche mit polaren und
nicht polaren Abschnitten). Beispielsweise schließen einige
Beispiele von geeigneten amphiphilen Polyelektrolyten Poly(stryryl-b-N-methyl
2-Vinyl Pyridiumiodid) und Poly(styryl-b-Acrylsäure) ein, sind jedoch nicht
limitiert darauf, wobei beide davon verfügbar sind von Polymer Source,
Inc. aus Dorval, Kanada.
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Obwohl
jegliches Polyelektrolyt im allgemeinen eingesetzt werden kann,
kann das Polyelektrolyt, ausgewählt
für spezielle
Anwendungen je nach Natur der Sonden variieren, je nach spezifischen
Bindungselementen, dem Analyt von Interesse, dem Typ der porösen Membran
u. dgl.. Insbesondere ermöglicht
die Ladungsverteilung des Polyelektrolyten, dass er an Substanzen
bindet, welche entgegengesetzte Ladungen aufweisen. Folglich sind
Polyelektrolyte, welche beispielsweise eine positive Ladung aufweisen,
häufig
besser ausgerüstet,
um mit Sonden zu binden, welche negativ geladen sind, wohingegen
Polyelektrolyte, welche eine negative Nettoladung aufweisen, häufig besser
ausgerüstet
sind, um an Sonden zu binden, welche positiv geladen sind. Folglich
ermöglicht
in solchen Fallen die ionische Wechselwirkung zwischen diesen Molekülen das erforderliche
Binden, so dass es innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31 auftritt.
Nichtsdestotrotz, können,
obwohl ionische Wechselwirkungen in erster Linie eingesetzt wird,
um das gewünschte
Binden zu erzielen, Polyelektrolyte auch mit Sonden binden, welche
eine ähnliche
Ladung aufweisen.
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Da
der Polyelektrolyt so konzipiert ist, dass er an Sonden bindet,
ist typischerweise gewünscht,
dass der Polyelektrolyt substantiell nicht diffusiv immobilisiert
ist auf der Oberfläche
der porösen
Membran 23. Folglich können
die Polyelektrolyte angewandt werden auf die poröse Membran 23 in solch
einer Art und Weise, dass die Polyelektrolyte nicht substantiell
in die Matrix der porösen
Membran 23 diffundieren. Insbesondere bilden die Polyelektrolyte
typischerweise eine ionische und/oder kovalente Bindung mit funktionellen
Gruppen aus, die auf der Oberfläche
der porösen
Membran 23 vorliegen, so dass sie darauf immobilisiert
verbleiben. Obwohl dies nicht notwendig ist, kann die Ausbildung
von kovalenten Bindungen zwischen den Polyelektrolyten und der porösen Membran 23 gewünscht sein,
um permanenter den Elektrolyten darauf zu immobilisieren.
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Beispielsweise
werden in einer Ausführungsform
die Monomere, welche eingesetzt werden, um den Polyelektrolyten
auszubilden, zunächst
in einer Lösung
ausgebildet und dann direkt auf die poröse Membran 23 aufgebracht.
Verschiedene Lösungsmittel
(beispielsweise organische Lösungsmittel,
Wasser etc.), können eingesetzt
werden, um die Lösung
auszubilden. Sobald sie aufgebracht wurden, wird die Polymerisierung
der Monomere ausgelöst
unter Verwendung von Hitze, Elektronenbestrahlung, freier Radikalpolymerisierung
u. dgl. In einigen Fällen
bilden, wenn die Monomere polymerisieren, diese kovalente Bindungen
mit bestimmen funktionellen Gruppen der porösen Membran 23 aus,
wodurch die resultierenden Polyelektrolyte darauf immobilisiert
werden. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform ein Ethylenaminmonomer
eine kovalente Bindung mit einer Carboxylgruppe ausbilden, die auf
der Oberfläche
von einigen porösen
Membranen vorliegt (beispielsweise Nitrozellulose).
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann der Polyelektrolyt ausgebildet werden vor der Anwendung auf die
poröse
Membran 23. Falls gewünscht,
kann der Polyelektrolyt zunächst
ausgebildet werden in eine Lösung unter
Verwendung von organischen Lösungsmitteln,
Wasser u. dgl.. Anschließend
wird die Polyelektrolytlösung
direkt auf die poröse
Membran 23 angewandt und anschließend getrocknet. Nach dem Trocknen
kann der Elektrolyt, wie oben beschrieben, eine Ionenbindung ausbilden
mit bestimmten funktionellen Gruppen, die auf der Oberfläche der
porösen
Membran 23 vorliegen, und eine Ladung aufweisen, die entgegengesetzt
zu derjenigen des Polyelektrolyten ist. Beispielsweise kann in einer
Ausführungsform
positiv geladenes Polyethylenamin eine Ionenbindung mit negativ
geladenen Carboxylgruppen ausbilden, die auf der Oberfläche von
einigen porösen
Membranen vorliegen (beispielsweise Nitrozellulose).
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Darüber hinaus
kann der Polyelektrolyt auch quer vernetzt sein mit einer porösen Membran
23 unter Verwendung
verschiedener wohl bekannter Techniken. Beispielsweise können in
einigen Ausführungsformen Epichlorhydrin-funktionalisierte
Polyamine und/oder Polyamidoamine eingesetzt werden als ein quer
vernetzbarer, positiv geladener Polyelektrolyt. Beispiele von diesen
Materialien werden beschrieben in
US-Patent
Nrn. 3,700,623 von Keim;
3,772,076 von
Keim; und
4,537,657 von
Keim, wobei davon ausgegangen wird, dass diese verkauft werden von
Hercules, Inc., Wilmington, Del. unter der Kymene
TM Handelsbezeichnung.
Beispielsweise sind Kymene
TM 450 und 2064
Epichlorhydrin-funktionalisierte Polyamine und/oder Polyamidoamin-Verbindungen,
welche Epoxidringe und quaternäre
Ammoniumgruppen enthalten, welche kovalente Bindungen mit Carboxylgruppen
ausbilden können,
die auf bestimmten Typen von porösen
Membranen (beispielsweise Nitrolzellulose) vorliegen und mit dem
Polymerrückgrat
der porösen
Membran beim Aushärten
quer vernetzen. In einigen Ausführungsformen
kann die Quervernetzungstemperatur von ungefähr 50°C bis ungefähr 120°C reichen und die Quervernetzungszeit
kann von ungefähr
10 bis ungefähr
600 Sekunden reichen.
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Obwohl
verschiedene Techniken für
nicht diffusive immoobilisierende Polyelektrolyte auf der porösen Membran 23 oben
beschrieben wurden, sollte sich verstehen, dass irgendwelche anderen
Techniken für
nicht diffusiv immobilisierende Polyelektrolyt-Verbindungen in der
vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Tatsächlich sind die oben genannten
Verfahren nur dazu gedacht, Beispiele für die Techniken darzustellen,
welche in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Beispielsweise
können
in einigen Ausführungsformen
bestimmte Verbindungen zu der Polyelektrolytlösung hinzugefügt werden,
welche substantiell die Diffusion von solchen Polyelektrolyten in
die Matrix der porösen
Membran 23 inhibieren können.
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Im
allgemeinen kann eine Vielzahl von Durchflussassay-Vorrichtungen
konstruiert werden entsprechend der vorliegenden Erfindung. In dieser
Hinsicht werden nun verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung im größeren Detail
beschrieben werden. Es sollte sich verstehen, dass jedoch die Ausführungsformen,
wie die unten diskutierten, exemplarisch sind und dass andere Ausführungsformen
durch die vorliegende Erfindung auch ins Auge gefasst sind. Beispielsweise
wird unter Verweis auf 3 eine spezielle Ausführungsform
gezeigt, in welcher Sonden 41 verwendet werden zum Nachweis
und Sonden 43 verwendet werden für die Kalibration. In dieser
Ausführungsform
werden die Detektionssonden 41 auf das Konjugatfeld 22 angewandt
und sind folglich in der Lage, durch die Vorrichtung 20,
(wie durch den gerichteten Pfeil L angezeigt), zu schließen, wenn
sie in Kommunikation mit der Testprobe platziert werden. Die Nachweissonden
(Detektionssonden) 41 werden konjugiert mit einem spezifischen
Bindungselement 90 für
einen Analyten A, so dass bei Kontakt mit dem Analyten A die Sonden 41 daran
binden, um Analyten/Sonden-Komplexe 49 auszubilden.
Die Analyten/Sonden-Komplexe 49 können dann durch die Vorrichtung 20 fließen, bis
sie die Detektions-/Kalibrationszone 31 erreichen.
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Innerhalb
der Detektions-/Kalibrationszone 31 wird ein Polyelektrolyt-Einfangreagenz
immobilisiert (nicht gezeigt) zum Binden an die Kalibrationssonden 43 durch
ionische Wechselwirkungen. In dieser Ausführungsform werden die Kalibrationssonden 43 auf
dem Polyelektrolyten immobilisiert, bevor die Testprobe angewandt
wird. Die Kalibrationssonde 43 kann beispielsweise einschließen Latex-Mikropartikel,
konjugiert mit einem spezifischen Bindungselement 91 (beispielsweise
Antikörper,
Antigene etc.). An der Detektions-/Kalibrationszone 31 können die
Analyt-Sondenkomplexe 49 an das spezifische Bindungselement 91 der
Kalibrationssonden 43 binden, um einen Sandwichkomplex 50 auszubilden.
Jegliche Art von ungebundenen Sonden 41 wird durch die
Detektions-/Kalibrationszone 31 fließen. Falls gewünscht, kann
die Menge des Polyelektrolyt-Einfangreagenzes predetermi niert werden,
so dass das Kalibrationssignal innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31 ihr
vollständiges
und vorherbestimmtes Potential für
die Signalintensität
erreicht. Das heißt,
die Menge der Sonden 43, welche abgeschieden werden, ist
vorherbestimmt, da die Menge des eingesetzten Polyelektrolyten auf
ein vorherbestimmtes und bekanntes Niveau gesetzt ist.
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Sobald
es möglich
ist, dass es sich vollständig
entwickelt, kann das Intensitätsniveau
der Sonden 43 verwendet werden, um das Intensitätsniveau
der Sonden 41 an der Detektions-/Kalibrationszone 31 zu kalibrieren,
um die Menge des Analyten zu bestimmen, die in der Testprobe vorliegt.
Dieser Kalibrationsschritt kann visuell erscheinen, unter Zuhilfenahme
einer Lesevorrichtung oder unter Verwendung anderer Techniken. Beispielsweise
kann eine Ausführungsform
der Sonden 41 und 43 gelabelt sein mit Fluoreszenz-erzeugenden Verbindungen,
so dass die Signalintensität
der Sonden 41 und 43 gemessen werden kann unter
Verwendung von konventionellen Techniken. Beispielsweise können in
einer Ausführungsform
die Sonden 41 und 43 angeregt werden mit der gleichen äußeren Probe.
In dieser Ausführungsform
liefert die Quelle Strahlung bei einer Anregungswellenlänge, wodurch
verursacht wird, dass die Sonden 41 Licht bei einer Wellenlänge emittieren, die
unterschiedlich ist von der Wellenlänge, emittiert durch die Sonden 43.
Dies ermöglicht,
dass die Sonden 41 und 43 getrennt voneinander
gemessen werden können.
Alternativ können
die Sonden 1 und 43 auch untereinander getrennt
gemessen werden unter Verwendung von getrennten äußeren Quellen.
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Allgemein
gesagt ist die Fluoreszenz das Ergebnis eines dreistufigen Prozesses,
welche in bestimmten Fluoreszenzverbindungen auftritt. Im ersten
Stadium wird die Energie durch eine äußere Quelle zugeführt, beispielsweise
durch eine Glühlampe
oder einen Laser und wird absorbiert durch die fluoreszierende Verbindung,
wodurch ein angeregter elektronischer Singulett-Zustand erzeugt
wird. In dem zweiten Stadium existiert der angeregte Zustand für eine begrenzte
Lebensdauer, über
weichen hinweg die fluoreszierende Verbindung konformatorischen
Veränderungen
unterzogen wird und auch einer Vielzahl von möglichen Wechselwirkungen mit
seiner molekularen Umgebung. Während
dieser Zeit wird die Energie des angeregten Zustandes teilweise abgeführt, was
zu einem relaxierten Zustand führt,
von welchem die Fluoreszenzemission ausgeht. Das dritte Stadium
ist das Fluoreszenz-Emissionsstadium, in welchem Energie emittiert
wird, was zur Rückkehr
der fluoreszierenden Verbindung in ihren Grundzustand führt. Die
Energie, die emittiert wird, ist geringer als die Anregungen aus
Energie (Licht oder Laser) und folglich von einer längeren Wellenlänge. Diese
Verschiebung oder der Unterschied an Energie oder Wellenlänge ermöglicht,
dass die Emissionsenergie nachgewiesen werden kann und von der Anregungsenergie
isoliert werden kann.
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Der
Fluoreszenznachweis setzt im allgemeinen Wellenlängenfilter ein, um die Emissionsphototonen von
den Anregungsphotonen zu isolieren, sowie einen Detektor, welcher
die Emissionsphotonen registriert und eine aufzeichenbare Ausgabe
erzeugt, üblicherweise
in Form eines elektrischen Signals oder eines fotografischen Bildes.
Es gibt im allgemeinen vier anerkannte Typen von Detektoren: Spektrofluorometer
und Mikroplatten-Lesegeräte;
Fluoreszenz-Mikroskope; Fluoreszenz-Scanner; und Durchfluss-Cytometer.
Ein geeigneter Fluoreszenz-Detektor für die Verwendung mit der vorliegenden
Erfindung ist ein FluoroLog III Spektrofluorometer, welches verkauft
wird durch SPEX Industries, Inc. of Edison, New Jersey.
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Obwohl
nicht notwendig, schließen
die Auswahlkriterien von speziell gewünschten Nachweis- und Kalibrationssonden-Paaren
das folgende ein: (1) wenig oder keinen spektralen Überlapp
für entweder
die Absorptionsspektren oder die Fluoreszenzspektren, so dass die
Emissionsintensitäten
separat voneinander gemessen werden können; (2) keine signifikanten
Fluoreszenz-Energietransfere zwischen den Nachweis- und Kalibrationssonden,
wenn sie in eine enge Nähe
gebracht werden, so dass sie voneinander unabhängig emittieren können; und
(3) relativ lange Emissionswellenlängen (beispielsweise mehr als
600 nm) so dass die Autofluoreszenz von biologischen Flüssigkeiten
einen minimalen Effekt auf die Fluoreszenzmessung nimmt.
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Desweiteren
können,
falls gewünscht,
Techniken, die als "zeitaufgelöste Fluoreszenz-Detektion" bekannt sind, in
der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zeitaufgelöste Fluoreszenz-Detektion
ist so konzipiert, dass Hintergrundsignale von der Emissionsquelle
oder von Streuprozessen (die vom Streuen der Anregungsstrahlung
resultieren) reduziert werden, dadurch, dass die Vorteile der Fluoreszenz-Charakteristiken bestimmter
fluoreszierender Materialien, wie z.B. Lanthanid-Chelaten von Europium
(Eu (III)) und Terbium (Tb (III)) ausgenutzt werden. Solche Chelate
können
stark rot-verschobene langlebige Emission von enger Bandbreite nach
Anregung des Chelats mit einer substantiell kürzeren Wellenlänge zeigen.
Typischerweise besitzt das Chelat eine stark ultraviolette Absorptionsbande
aufgrund eines Chromophors, der nahe an dem Lanthanid in den Molekülen lokalisiert
ist.
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Nachfolgend
auf die Lichtabsorption durch den Chromophor kann die Anregungsenergie
von dem angeregten Chromophor zum Lanthanid übertragen werden. Darauf folgt
die Fluoreszenzemissions-Charakteristik des Lanthaniden. Die Verwendung
einer pulsierten Anregung und einer gegateten Zeitdetektion, in
Kombination mit Emissionsfiltern von enger Bandbreite ermöglicht die
spezifische Detektion der Fluoreszenz nur aus dem Lanthaniden und
das Ausblenden von Emission anderer Spezies, die in der Probe vorliegen,
welche typischerweise kurzlebiger sind, oder kürzere Wellenlängenemission
haben. Andere zeitaufgelöste
Techniken zum Messen der Fluoreszenz werden geschrieben im
US-Patent Nr. 5,585,279 von
Davidson und
5,637,509 von
Hemila, et al.
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Unabhängig von
der Technik, die verwendet wird, um die Signalintensität der Sonden 41 und 43 zu messen,
wurde entdeckt, dass die Verwendung einer einzelnen Detektions-/Kalibrationszone 31 die
Detektions- und Kalibrationssonden 41 und 43 in
die Lage versetzen kann, dass sie an der gleichen Stelle der Vorrichtung 20 gemessen
werden können.
Dieser Ansatz, der "Einzelmessungsstelle" stellt einen einfachen
und attraktiven Ansatz für
Anwender der Assayvorrichtung zur Verfügung, insbesondere für diejenigen,
die konzipiert sind für
Heim- und Gesundheitsfragen-Anwendungen.
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An
der Detektions-/Kalibrationszone 31 kann die Menge des
Analyten von der Signalintensität
der Nachweissonden 41 sichergestellt werden, die durch
die Signalintensität
der Kalibrationssonden 43 kalibriert sind. Genauer gesagt,
wird die Gesamtmenge der Sonden 43 vorherbestimmt und ist
bekannt und kann folglich für
Kalibrationszwecke eingesetzt werden. Folglich ist die Menge von
Analyten in der Testprobe direkt proportional zu IS (Signalintensität der Sonde 41),
wohingegen die Signalintensität
der Sonden 43, IC, relativ konstant bleiben
sollte, unabhängig
vom Vorliegen des Analyten. Basierend auf der Intensitätsverteilung,
in welche dieser kalibrierte Wert fällt, kann der allgemeine Konzentrationsbereich
für den
Analyten bestimmt werden. Als ein Ergebnis kann Kalibration und
Probentests durchgeführt
werden unter ungefähr
den gleichen Bedingungen zur gleichen Zeit, wodurch verlässliche
quantitative Ergebnisse bereitgestellt werden mit zunehmender Sensitivität.
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Falls
gewünscht,
kann das Verhältnis
von IS zu IC geplottet
werden gegen die Analytenkonzentration für einen Bereich von bekannten
Analyten-Konzentrationen, um eine Kalibrationskurve zu erzeugen.
Um die Menge des Analyten in einer unbekannten Testprobe zu bestimmen,
kann das Signalverhältnis
dann in eine Analytenkonzentration konvertiert werden entsprechend
der Kalibrationskurve. Es sollte festgehalten werden, dass alternative mathematische
Beziehungen zwischen IS und IC aufgetragen
werden können
gegen die Analytenkonzentration, um die Kalibrationskurve zu erzeugen.
Beispielsweise kann in einer Ausführungsform der Wert von IS/(IS + IC) aufgetragen werden gegen die Analytenkonzentration
um die Kalibrationsgruppe zu erzeugen.
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Nun
wird unter Bezugnahme auf 4 eine weitere
Ausführungsform
gezeigt, in welcher die Sonden 41 zum Nachweis und die
Sonden 43 zur Kalibration eingesetzt werden. Die Detektionssonden 41 werden
auf das Konjugatfeld 22 angewandt und sind daher in der
Lage, durch die Vorrichtung 20 zu fließen, (wie durch den gerichteten
Pfeil L angezeigt wird), wenn sie in Kommunikation mit der Testprobe
platziert werden. Die Detektionssonden 41 sind konjugiert
mit einem spezifischen Bindungselement 40 für einen
Analyten A, so dass bei Kontakt mit dem Analyten A die Sonde 41 daran
bindet, um Analyt/-Sondenkomplexe 49 auszubilden. Die Analyt-/Sondenkomplexe 49 können dann
durch die Vorrichtung 20 fließen, bis sie die Detektions-/Kalibrationszone 31 erreichen.
Die Kalibrationssonden 43 sind immobilisiert innerhalb
der Detektions-/Kalibrationszone 31 über ein Polyelektrolyt-Einfangreagenz. Beispielsweise
können
die Kalibrationssonden 43 gelabelte Mikropartikel einschließen, Polymere
oder Moleküle,
welche an den Polyelektrolyt durch ionische Wechselwirkung binden.
Darüber
hinaus wird ein spezifisches Bindungselement 41 (beispielsweise
ein Antikörper,
Antigen etc.) auch separat immobilisiert innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31.
Basierend auf der Natur der Nachweissonden 41 binden weder
die Komplexe 49, noch ungebundene Sonden 41 an
das Polyelektrolyteinfangreagenz. Stattdessen binden die Analyt-/Sondenkomplexe 49 an
das spezifische Bindungselement 91, um Komplexe 50 auszubilden
und jegliche ungebundene Sonden 41 fließen durch die Detektions-/Kalibrationssonde 31.
Sobald die vollständige
Entwicklung ermöglicht
wird, kann das Identitätssignal
IS der Sonden 41 an der Detektions-/Kalibrationssonde 31 so
bestimmt werden, dass die Menge des Analyten, der in der Testprobe
vorliegt, berechnet werden kann. In dieser Ausführungsform ist die Menge des
Analyten in der Testprobe direkt proportional zu IS.
Darüber
hinaus kann das Identitätssignal
IC der Kalibrationssonden 43 auch
verwendet werden, um IS zu kalibrieren.
Beispielsweise kann das Verhältnis
von IS zu IC gegen
die Analyten-Konzentration über
einen Bereich von bekannten Analyten-Konzentrationen aufgetragen
werden, um eine Kalibrationskurve zu erzeugen. Nun wird auf 5 Bezug
genommen, in der noch eine weitere Ausführungsform gezeigt ist, in welcher
Sonden 41 zum Nachweis und Sonden 43 zu Kalibration
verwendet werden. Die Nachweissonden 41 und die Kalibrationssonden 43 werden
auf das Konjugatfeld 22 angewandt und sind folglich in der
Lage, durch die Vorrichtung 20 zu fließen (wie durch den gerichteten
Pfeil L angezeigt wird), wenn sie in Kommunikation mit der Testprobe
platziert werden. Die Detektionssonden 41 sind konjugiert
mit einem spezifischen Bindungselement 90 für einen
Analyten A, so dass bei Kontakt mit dem Analyten A die Sonden 41 daran
binden, um Analyten-/Sondenkomplexe 49 auszubilden. Die
Analyten-/Sondenkomplexe können
dann durch die Vorrichtung 20 fließen, bis sie die Detektions-/Kalibrationszone 31 erreichen.
Ein Polyelektrolyt ist innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31 immobilisiert
zum selektiven Binden mit den Kalibrationssonden 43 (beispielsweise
gelabelte Mikropartikel, Polymere oder Moleküle) durch ionische Interaktion.
Im einzelnen können
die Sonden 43 in ihrer Größe kleiner sein, als die Sonden 41,
so dass sie an der Detektions-/Kalibrationszone 31 vor
den Sonden 41 ankommen und alle Bindungsplätze bereitgestellt
durch den Polyelektrolyten belegen. Alternativ können die Ladungen der Sonden 41 und 43 so
sein, dass nur die Sonden 43 an den Polyelektrolyten binden.
In jedem Fall wird auch ein spezifisches Bindungselement 91 (beispielsweise
Antikörper,
Antigen, etc.) separat innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31 immobilisiert.
An der Detektions-/Kalibrationszone 31 können die
Analyt-/Sondenkomplexe 49 an das spezifische Bindungselement 91 binden,
um Komplexe 50 auszubilden. Jegliche nicht gebundene Sonden 41 werden
durch die Detektions-/Kalibrationszone 31 fließen. Sobald
es möglich
ist, dass es sich vollständig
entwickelt, kann das Intensitätssignal
IS der Sonden 41 an der Detektions-/Kalibrationszone 31 bestimmt
werden, um die Menge des Analyten, die in der Testprobe vorliegt, zu
berechnen. In dieser Ausführungsform
ist die Menge des Analyten in der Testprobe direkt proportional
zu IS. Darüber hinaus kann das Intensitätssignal
IC der Kalibrationssonden 43 auch
verwendet werden, um IS zu kalibrieren.
Beispielsweise kann das Verhältnis
von IS zu IC gegen
die Analytenkonzentration geplottet werden über einen Bereich von bekannten
Analytkonzentrationen, um eine Kalibrationskurve zu erzeugen.
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In
einigen Ausführungsformen
kann die Vorrichtung 20 zusätzliche Zonen enthalten, welche
hilfreich bei der Detektion des Analyten von Interesse sind. Beispielsweise
kann, wie in 6 gezeigt, die Vorrichtung 20 eine
Einfangzone 33 enthalten, welche stromaufwärts von
der Detektions-/Kalibrationszone 31 positioniert ist. Die
Einfangzone 33 enthält
ein erstes Einfangreagenz, das entweder spezifisch für die Detektions-
oder Kalibrationssonden ist. Beispielsweise werden in der illustrierten
Ausführungsform
Detektionssonden 41 auf das Konjugatfeld 22 aufgebracht
und sind folglich in der Lage, durch die Vorrichtung 20 zu
fließen,
wenn sie in Kommunikation mit der Testprobe platziert werden. Die
Testproben 41 können mit
einem spezifischen Bildungselement 90 für einen Analyten A konjugiert
werden, so dass der Kontakt mit dem Analyten A die Sonden 41 daran
binden, um Analyt-/Sondenkomplexe 49 auszubilden. Die Analyt-/Sondenkomplexe 49 können dann durch
die Vorrichtung 20 fließen, bis sie die Einfangzone 33 erreichen.
Spezifische Bindungselemente 91, wie z.B. ein Antikörper oder
Antigen, welche mit dem Analyten A korrespondiert, sind innerhalb
der Einfangzone 33 immobilisiert. Folglich können an
der Einfangzone 33 die Analyt-/Sondenkomplexe 49 an die spezifischen Bindungselemente 91 binden,
die darauf immobilisiert sind, um die Komplexe 50 auszubilden.
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Alle
ungebundenen Sonden 41 werden dann zur Detektions-/Kalibrationszone 31 fließen. In
dieser Ausführungsform
ist auf ein zweites Einfangreagenz (beispielsweise ein Polyelektrolyt)
immobilisiert innerhalb der Detektions-/Kalibrationszone 31,
die in der Lage ist, an alle ungebundenen Sonden 41 durch
ionische Wechselwirkung zu binden. Desweiteren können die Kalibrationssonden 43 auch
immobilisiert sein, auf dem zweiten Einfangreagenz innerhalb der
Detektions-/Kalibrationszone 31. Beispielsweise können die
Kalibrationssonden 43 Latex-Mikropartikel einschließen, die
auch an den Polyelektrolyten durch ionische Wechselwirkung binden.
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Sobald
es möglich
ist, dass es sich vollständig
entwickelt, kann das Intensitätssignal
IS der Sonden 41 an der Detektions-/Kalibrationszone 31 bestimmt
werden, um die Menge des Analyten, die in der Testprobe vorliegt,
zu bestimmen. In dieser Ausführungsform
ist die Menge des Analyten in der Testprobe indirekt proportional
zu IS. Darüber hinaus kann die Signalintensität IC der Kalibrationssonden 43 auch
verwendet werden, um IS zu kalibrieren.
Beispielsweise kann das Verhältnis
von IS zu IC aufgetragen
werden gegen die Analyt-Konzentration über einen
Bereich von bekannten Analyt-Konzentration, um eine Kalibrationskurve
zu erzeugen. Um die Menge des Analyten in einer unbekannten Testprobe
zu bestimmen, kann dann der Signalanteil in die Analyten-Konzentration
entsprechend der Kalibrationskurve konvertiert werden. Es sollte
festgehalten werden, als alternative mathematische Beziehungen zwischen
IC und IS gegen
die Analyten-Konzentration aufgetragen werden können, um die Kalibrationskurve
zu erzeugen.
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Obwohl
verschiedene Ausführungsformen
von Assay-Konfigurationen oben beschrieben wurden, sollte sich verstehen,
dass ein Assay der vorliegenden Erfindung im allgemeinen jegliche
Art von Konfiguration aufweisen kann, die gewünscht wird, um nicht alle Komponenten,
wie oben beschrieben, enthalten muss. Desweiteren können auch
andere wohl bekann te Komponenten von Assays, auf die hier nicht
spezifisch Bezug genommen wird, auch in der vorliegenden Erfindung
eingesetzt werden. Beispielsweise werden verschiedene Assay-Konfigurationen beschrieben
in
US-Patent-Nrn. 5,395,754 von
Lambotte, et al.;
5,670,381 von
Jou et al.: und
6,194,220 von
Malick, et al. Darüber
hinaus sollte sich auch verstehen, dass kompetitive Assays auch entsprechend
der vorliegenden Erfindung ausgebildet werden können. Techniken und Konfigurationen
von kompetitiven Assays sind den Fachleuten auf dem Gebiet auch
wohl bekannt.
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In
einem Beispiel kann die Durchflussvorrichtung 20, wie oben
beschrieben, und in 3 illustriert, leicht modifiziert
werden, um einen kompetitiven Assay auszubilden. In dieser Ausführungsform
können
die Detektionssonden 41 ein Analyt oder Analytanalog sein,
wohingegen die Kalibrationssonden 43 beispielsweise Latex-Mikropartikel
einschließen
können,
konjugiert mit einem spezifischen Bindungselement für den Analyt von
Interesse. Wenn die Testprobe aufgebracht wird, wandern die Detektionssonden
durch die poröse
Membran 23, bis sie die Detektions-Kalibrationszone 31 erreichen.
An der Zone 31 konkurrieren die Sonden 41 und jegliche
Art von Analyt A innerhalb der Testprobe, um das spezifische Bindungselement 91 (beispielsweise
Antikörper,
Antigen etc.). Jegliche ungebundene Sonden 41 werden durch
die Detektions-/Kalibrationszone 31 fließen. Diese
Ausführungsform
ist die Menge des Analyten in der Testprobe umgekehrt proportional
zu IS (Signalintensität der Sonden 41).
Falls gewünscht,
kann das Verhältnis
von IS zu IC (Signalintensität der Proben 43)
gegen die Analytkonzentration aufgetragen werden über einen
Bereich von bekannten Analytkonzentrationen, um eine Kalibrationskurve
zu erzeugen.
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Die
vorliegende Erfindung kann besser verstanden werden unter Verweis
auf die folgenden Beispiele.
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BEISPIEL 1
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Die
Fähigkeit
einer inneren Detektions-/Kalibrationszone der vorliegenden Erfindung,
einen Sandwich-Assay zu kalibrieren, wurde demonstriert. Anfangs
wurden HF-120 Membranproben, die porös waren, auf korrespondierende
Unterlagenkarten laminiert, welche eine Länge von ungefähr 30 cm
aufwiesen. Fluoreszentbeads (Kalibrationssonden) wurden erhalten
von Molecular Probes, Inc., und diese hatten eine Partikelgröße von 0,2 μm und Anregungs-/Emissionswellenlängen von
505/515 nm. Die Beads wurden gewaschen und gelagert in einem Speicherpuffer
bei 0,28 Gew.-%. 40 Mikroliter an fluoreszierender Bead-Lösung wur den gemischt
mit 10 Mikrolitern mit einer Polylysinlösung und auf die Membran abgestreift,
um die Detektions-/Kalibrationslinie auszubilden. Der monoklonale
Antikörper
CRP Mab 5804 mit einer Konzentration von 2,36 mg pro ml (erhalten
von Biogenesis, Inc.) wurde immobilisiert auf den porösen Membranproben,
um eine Einfanglinie auszubilden. Die Membranproben wurden anschließend für eine Stunde
bei einer Temperatur von 37°C getrocknet.
Ein dochtartiges Feld aus Zellulosefasern (Millipore Co.) wurde
an ein Ende der Membran angebunden und in 4 mm Streifen geschnitten.
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Die
halbstabförmigen
Proben wurden in verschiedene Mikrowells platziert, in welchen Mischungen
von fluoreszierenden Beads (Nachweissonde) und unterschiedliche
Konzentrationen von CRP-Antigenen enthalten waren. Die Menge der
fluoreszierenden Beads war die gleiche für jede Mischung, d.h. 4 mg.
Die fluoreszierenden Detektionsbeads wurden wie folgt ausgebildet.
Ursprünglich
wurde Polystyren-Beads mit funktionalisierten Carboxylgruppen (erhalten
von Molecular Probes, Inc.) bereitgestellt. Diese Beads hatten eine
Partikelgröße von 0,5 μm und Anregungs-/Emissionswellenlängen von
580/605 nm. 100 ml der Polystyren-Beads (2% Konzentration) wurden
2 × gewaschen
mit MES-Puffer und mit einer Zentrifuge abgetrennt. Die ausgefällten Beads
wurden erneut aufgelöst
in 100 ml an MES-Puffer
und gemischt mit 50 ml an MES-Puffer enthaltend 4 mg an Carbodiimid
(von Polysciences, Inc.). Die Mischung wurde bei Raumtemperatur
für 20
Minuten auf einem Schüttler
umgesetzt. Die aktivierten Beads wurden dann zweimal mit einem Borat-Puffer
gewaschen. Die aktivierten Beads wurden in 200 ml an Borat-Puffer
re-suspendiert und mit 15 ml an monoklonalem Antikörper von
C-reaktivem Protein (CRP Mab 5811 von Biogenesis, Inc.) vermischt
mit einer Konzentration von 6,4 mg pro Milliliter. Man ließ die Reaktion über Nacht
ablaufen mit einem Schüttler
bei Raumtemperatur. Die resultierende Reaktionsmischung wurde dann
mit 100 ml an Ethanolamin für
15 Minuten mit einem Schüttler vermischt.
Die überstehende
Lösung
wurde verworfen und die Beads wurden zweimal gewaschen mit einem PBS-Puffer
und bei 4°C
in einem Speicherpuffer gelagert, welche 0,1 molares PBS, 0,15 molare
NaCl, 1% BSA, 5% Glycerol und 0,1% NaN3 erzielt,
um in konjugierten Beads zu münden
von einer Konzentration von 4 mg/ml.
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Die
Fluoreszenz-Intensität
wurde dann gemessen bei der Detektions-/Kalibrationslinie unter
Verwendung eines Fluorolog III Spectrofluoremeter (SPEX industries;
Inc., Edison, NJ) in einem rechtwinkligen Modus. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 1 gezeigt, wobei I
S die
Signal intensität
repräsentiert
der Detektionssonden an der Detektionskalibrationslinie und I
C die Signalintensität der Kalibrationssonden und
der Detektionskalibrationslinie repräsentiert. Tabelle 1: Signal-Intensitätsergebnisse
| Analyt
(ng/ml) | IC | IS/IC |
| 0 | 400 | 1258 |
| 33 | 426 | 1068 |
| 66 | 450 | 971 |
| 189 | 470 | 860 |
| 378 | 50 | 822 |
| 756 | 470 | 564 |
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Wie
aus den Ergebnissen oben evident wird, bewegten sich, wenn kein
Analyt in der Probe vorlag, die Detektionssonden so, dass sie die
Einfanglinie überquerten
und sie wurden auf der Detektions-/Kalibrationslinie eingefangen.
Wenn der Analyt in der Probe vorlag, komplexierten die Detektionssonden
mit dem Analyten und wurden auf der Einfanglinie eingefangen, wobei
jegliche verbleibende Detektionssonden von der Detektions-/Kalibrationslinie
eingefangen wurden. Daher war die Intensität der Detektionssonden (IS) auf der Direktions /Kalibrationslinie
umgekehrt proportional zur Anaytenkonzentration, wohingegen die
Intensität
(IC) der Kalibrationssonden an der Detektions-/Kalibrationslinie
relativ konstant für
unterschiedliche Analytkonzentrationen blieb, d.h. ungefähr ~444 ± 27. Variationen
von IC traten vermutlich aufgrund von variierter
Umgebung, Assaybedingungen und instrumenteller Instabilität auf. Jedoch
ist zu erwarten, dass die Variation einen ähnlichen Effekt auf IS aufwies. Daher sollte IS/IC ein akkurates Ergebnis in diesem Fall liefern.
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BEISPIEL 2
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Die
Fähigkeit
einer inneren Detektions-/Kalibrationszone der vorliegenden Erfindung,
einen Sandwich-Assay zu kalibrieren, wurde demonstriert. Ursprünglich wurden
verschiedene poröse
HF 120 Membranproben auf korrespondierenden Unterlagenkarten laminiert,
welche eine Länge
von ungefähr
30 cm hatten. Fluoreszierende Polymere (Kalibrationssonden) wurden
dann wie folgt ausgebildet. Ursprünglich wurden 0,5 g an Polyacrylsäure (MW
= 450.000 D.P. = 6250) in 20 ml an Methanol aufgelöst. 3,8
mg an Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 1 ml an Methanol wurden zur
Lösung
hinzugegeben, um das Polyacrylsäure polymer
zu aktivieren. Die resultierende Lösung wurde für 30 Minuten
gerührt.
Eine Lösung
von fluoreszierendem Farbstoff wurde erstellt durch Auflösen von
10 mg von 5-(und-6)-((N-(5-Aminopentyl)amino)-carbonyltetramethylrhodamin
(Anregungs-/Emissionswellenlängen
von 544/590 Nanometer, Molecular Probes, Inc.) in 1 ml an Methanollösung. Die
Farbstofflosung wurde zur aktivierten Polyacrylsäurelösung hinzugegeben und gerührt. Die
Reaktion wurde für
weitere 24 Stunden fortgeführt
bei Raumtemperatur mit einer Aluminiumfolie, gewickelt um die Lösung. Nachdem
die Reaktion angehalten worden war, wurde Diethylether hinzugegeben,
um ein Präzipitat
auszubilden. Das Präzipitat
wurde zentrifugiert und in Ethanol aufgesogen, um jeglichen nicht
reagierten Fluoreszenzfarbstoff zu entfernen. Nach Entfernen der
Ethanollösung
wurde das verbleibende rote Gel an Luft getrocknet.
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Die
fluoreszierenden Polymere (Kalibrationssonden), wie oben beschrieben,
wurden dann in Wasser aufgelöst
und vermischt mit CelQuat® 100-H (ein Zellulose-basiertes
Polyelektrolytderivat verfügbar
von National Starch & Chemical,
Inc.). Diese Mischung wurde auf die Membran abgestreift, um eine
Detektions-/Kalibrationslinie auszubilden. Monoklonaler Antikörper CRP
Mab 5811 mit einer Konzentration von 6,4 mg pro ml (erhalten von
Biogenesis, Inc.) wurde immobilisiert auf den porösen Membranproben,
um eine Einfanglinie auszubilden. Die Membranproben wurden dann
für 1 Stunde
bei Raumtemperatur von 37°C
getrocknet. Ein dochtartiges Feld aus Zellulosefaser (Millipore
Co.) wurde an ein Ende der Membran angebunden und in 4 mm-Streifen
geschnitten.
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Die
halben Stabproben wurden in verschiedene Mikrowells eingebracht,
in welchen Mischungen von fluoreszierenden Beads (Detektionssonden)
und unterschiedliche Konzentrationen von CRP-Antigen enthalten waren.
Die Menge der fluoreszierenden Beads (Detektionssonden) war für jede Mischung
gleich, d.h. 4 Mikrogramm. Die fluoreszierenden Beads (Nachweissonden)
wurden wie folgt ausgebildet. Anfangs wurden Polystyrenbeads mit
funktionellen Carboxylgruppen (erhalten von Molecular Probes, Inc.)
vorgelegt. Die Beads wiesen eine Partikelgroße von 0,2 μm auf und Anregungs-/Emissions-Wellenlängen von
505/515 nm. 100 Mikroliter der Polystyrenbeads (2% Konzentration)
wurden zweimal mit MES-Puffer gewaschen und mit einer Mikrozentrifuge
abgetrennt. Die ausgefällten
Beads wurden re-suspendiert in 200 μl von MES-Puffer und mit 20 μl an MES-Puffer
vermischt, welcher 4,8 mg an Carbodiimid enthielt (von Polysciences,
Inc.). Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten in einem Schüttler umgesetzt.
Die aktivierten Beads wurden dann zweimal mit einem Boratpuffer
gewaschen. Die aktivierten Beads wurden re suspendiert in 200 μl an Boratpuffer
und mit 90 μl
an monoklonalen Antikörpern
von C-reaktivem
Protein re-suspendiert (CRP Mab 5804 von Biogenisis, Inc.) mit einer
Konzentration von 2,36 mg pro ml. Man ließ die Reaktion über Nacht
in einem Schüttler
bei Raumtemperatur weiterlaufen. Die resultierende Reaktionsmischung
wurde dann mit 100 μl
an Ethanolamid 15 Minuten mit einem Schüttler vermischt. Die überständige Lösung wurde
verworfen und die Beads wurden zweimal mit einem PBS-Puffer gewaschen
und bei 4°C
in einem Lagerpuffer gelagert, welcher 0,1 molares PBS, 0,15 molare
NaCl, 1% BSA, 5% Glycerol und 0,1% NaN3 enthielt,
um in konjugierten Beads von einer 4 mg/ml-Konzentration zu resultieren.
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Die
resultierende Intensität
wurde dann gemessen an der Detektions-/Kalibrationslinie unter Verwendung
eines Fluorolog III Spektrofluorometer (SPEX Industries, Inc., Edison,
NJ) mit einem rechtwinkligen Modus. Die Ergebnisse sind unten in
Tabelle 2 dargestellt, wobei I
S die Signalintensität der Nachweissonden
an der Detektions-/Kalibrationslinie repräsentiert und I
C die
Signalintensität
der Kalibrationssonden an der Detektions-/Kalibrationslinie. Tabelle 2: Signalintensitätsergebnisse
| Analyt
(ng/ml) | IC | IS/IC |
| 0 | 37 | 16622 |
| 5 | 42 | 13714 |
| 25 | 36 | 15111 |
| 50 | 34 | 14971 |
| 250 | 34 | 9529 |
| 500 | 33 | 7152 |
| 2500 | 34 | 1765 |
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Wie
durch die obigen Ergebnisse belegt wird, bewegten sich, wenn kein
Analyt in der Probe vorlag, die Detektionssonden und durchquerten
die Einganglinie und wurden eingefangen an der Detektions-/Kalibrationslinie.
Wenn der Analyt in der Probe vorlag, komplexierten die Detektionssonden
mit dem Analyten und wurden auf der Einfanglinie eingefangen, wobei
jegliche verbleibende Detektionssonden an der Detektions-/Kalibrationslinie
eingefangen wurden. Daher war die Intensität der Detektionssonden (IS) auf der Detektions-/Kalibrationslinie umgekehrt proportional
zur Analytenkonzentration, wohingegen die Intensität der Kalibrationssonden
an der Detektions-/Kalibrationslinie relativ konstant blieb für verschiedene
Analytkonzentrationen, d.h. ungefähr ~36 ± 6. Variationen von IC stammen ver mutlich aufgrund von veränderten
Umgebungen, Assaybedingungen und instrumentellen Instabilitäten. Jedoch
sollte diese Variation einen ähnlichen
Effekt auf IS haben. Daher sollte IS/IC ein akkurateres
Ergebnis in diesem Fall geliefert haben.
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Wenn
die Erfindung im Detail unter Verweis auf die spezifischen Ausführungsformen
davon beschrieben wurde, wird nach Aufbringen von Verständnis für das oben
Dargelegte anerkannt werden, dass die Fachleute auf dem Gebiet leicht Änderungen
dazu, Variationen dazu und Äquivalente
zu diesen Ausführungsformen ins
Auge fassen können.
Dementsprechend sollte der Umfang der vorliegenden Erfindung als
derjenige der beigefügten
Ansprüche
bewertet werden.